ES2399341T3

ES2399341T3 - Método para preparar un producto a base de masa

Info

Publication number: ES2399341T3
Application number: ES05785569T
Authority: ES
Inventors: Lars Beier; Esben Peter Friis; Henrik Lundkvist
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2004-09-24
Filing date: 2005-09-23
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2025-09-23
Also published as: DK1794291T3; WO2006032281A3; US20130136823A1; AU2005287737A1; CA2610683C; EP1794291A2; US20080003341A1; AU2005287737B2; US20160081357A1; US20110305795A1; CA2610683A1; EP1794291B1; US9226510B2; WO2006032281A2; US9439442B2

Abstract

Método de preparación de una masa o un producto comestible a base de masa, que comprende la adición de unpolipéptido con actividad de alfa-amilasa maltogénica a la masa, donde la masa comprende al menos 10 % de sacarosa en peso, y el polipéptido: a) tiene una secuencia de aminoácidos que es como mínimo 70 % idéntica a la SEQ ID nº: 1, y b) comparado con SEQ ID nº: 1 comprende una alteración de aminoácidos que es sustitución o deleción de oinserción adyacente a I15; R18; K44; N86; T87; G88; Y89; H90; Y92; W93; F188; T189; D190; P191; A192; F194; L196; D329; N371; D372; P373; N375 o R376, y, c) tiene más del 20 % de actividad en 10 % de sacarosa, en comparación con su actividad en ausencia desacarosa.

Description

Método para preparar un producto a base de masa

LISTADO DE SECUENCIAS Y MICROORGANISMOS DEPOSITADOS

Listado de secuencias

[0001] La presente invención comprende un listado de secuencias.

Depósito de material biológico

[0002] Ninguno.

Campo de la invención

[0003] La presente invención se refiere al uso de amilasas de antiendurecimiento en la preparación de masa o productos comestibles a base de masa con un alto contenido en sacarosa.

Antecedentes de la invención

[0004] La US 3026205 describe un proceso de producción de dulces horneados y los productos resultantes de los mismos por alfa-amilasa.

[0005] La WO 9104669 describe el uso de una alfa-amilasa maltogénica para retardar el endurecimiento de los productos horneados tales como pan; la alfa-amilasa maltogénica descrita en ésta está comercialmente disponible bajo el nombre comercial de Novamyl® (producto de Novozymes A/S). La US 6162628 describe variantes de Novamyl y su uso para el mismo fin. Conforti et al: (J. Food Quality, Food and Nutrition, 1998, 21: 85-94) y Sternhagen et al: (Cereal Chemistry, 1994, 71; 560-563) divulgan el uso de alfa-amilasas bacterianas en masa con alto contenido en azúcar. Rosell et al: (J Agric Food Chem, 2001, 49; 2973-2977) divulga que Novamyl 1500 MG es seriamente inhibido por la sacarosa.

[0006] Las estructuras tridimensionales de Novamyl se publican en la US 6162628 y en el Protein Data Bank (banco de datos de proteínas, disponible en http://www.rcsb.org/pdb/) con identificadores 1QHO y 1QHP.

Resumen de la invención

[0007] Los inventores han encontrado que una masa con alto contenido en sacarosa (tal como una masa de pastel) tiende a inhibir la actividad de unas amilasas de antiendurecimiento tales como Novamyl, haciéndolas menos eficaces para prevenir el endurecimiento de productos a base de masa con alto contenido en sacarosa, tales como pasteles. Han encontrado que un buen efecto de antiendurecimiento en pasteles se puede conseguir usando una amilasa antiendurecimiento cuidadosamente seleccionada con propiedades determinadas y han identificado tales amilasas.

[0008] Analizando una estructura 3D de Novamyl, los inventores además encontraron que la sacarosa puede inhibir por unión en el sitio activo. Han encontrado que la sacarosa se acopla en el sitio activo de Novamyl diferentemente del sustrato o inhibidor en modelos publicados 1QHO y 1 QHP, y han usado este hallazgo para diseñar variantes tolerantes a la sacarosa.

[0009] Por consiguiente, la invención proporciona un método de preparación de masa o de un producto comestible a base de masa (p. ej. un producto horneado) añadiendo una amilasa antiendurecimiento tolerante a la sacarosa.

Descripción detallada de la invención

Alfa-amilasa maltogénica y acoplamiento de sacarosa

[0010] Una alfa-amilasa maltogénica (EC 3.2.1.133) con más del 70 % de identidad (particularmente más del 80 % o 90%, tal como al menos 95% o 96% o 97% o 98% o 99%) con la secuencia de Novamyl mostrada como SEQ ID nº: 1 se puede utilizar como enzima parental para diseñar variantes tolerantes a la sacarosa. La identidad de aminoácido se puede calcular como se describe en la US 6162628.

[0011] Para Novamyl (SEQ ID nº: 1), se puede utilizar una estructura 3D que incluya un sustrato o inhibidor como se describe en la US 6162628 o en el Protein Data Bank con el identificador 1QHO o 1 QHP. Alternativamente, se puede utilizar una variante de Novamyl, tal como una variante descrita en la US 6162628 o en esta especificación, por ejemplo la variante F188L +D261 G +T288P. Un estructura 3D de una variante se puede desarrollar a partir de la estructura de Novamyl por métodos conocidos, por ejemplo como se describe en T.L. Blundell et al., Nature, vol. 326, p. 347 ff (26 March 1987); J. Greer, Proteins: Structure, Function and Genetics, 7:317-334 (1990); o el ejemplo 1 de WO 9623874.

[0012] Los inventores encontraron que la sacarosa puede inhibir Novamyl por unión en el sitio activo. El acoplamiento de sacarosa en el sitio activo de Novamyl (usando el software versión GOLD 2.1.2, Cambridge Crystallographic Data Centre, 12 Union Road, Cambridge, CB2 1EZ, Reino Unido y la parte de proteína de la estructura de rayos X

5 1QHO.pdb) revela una configuración de enlace específico como único para sacarosa. Las coordenadas cartesianas para los átomos de sacarosa en esta configuración de unión, utilizando el sistema de coordenadas de la estructura de rayos X 1QHO.pdb se dan en la Fig. 1.

Ensayo de alfa-amilasa maltogénica

10 [0013] La actividad de una alfa-amilasa maltogénica se puede determinar usando un ensayo de actividad tal como el método MANU. Un MANU (Maltogenic Amylase Novo Unit, Novo Unidad de Amilasa Maltogénica) se define como la cantidad de enzima requerida para liberar un micromol de maltosa por minuto en una concentración de 10 mg de sustrato de maltotriosa por ml en 0,1 M de tampón de citrato en pH 5,0, 37°C durante 30 minutos.

15 Alteraciones de aminoácidos

[0014] La secuencia de aminoácidos de una alfa-amilasa maltogénica se puede alterar para reducir la inhibición de sacarosa. Los inventores encontraron que la alteración se pueden hacer en un residuo de aminoácidos con al menos un

20 átomo dentro de 4 Angstroms de cualquiera de los átomos de sacarosa cuando la molécula de sacarosa se acopla en la estructura 3D de la alfa-amilasa maltogénica. Usando la estructura de Novamyl 1QHO y el acoplamiento de sacarosa en la figura 1, los siguientes residuos de Novamyl están dentro de 4 A: K44; N86; Y89; H90; Y92; W93; F188; T189; D190; P191; A192; F194; D372; P373; R376.

25 [0015] Además, las siguientes posiciones se han identificado como importantes: I15; R81; T87; G88; L196; N371 o N375 de SEQ ID nº: 1.

[0016] La alteración puede ser una sustitución o deleción de uno o varios de los residuos seleccionados, o uno o más residuos (particularmente 1-4 residuos o 5-6 residuos) se pueden insertar adyacentes a un residuo seleccionado.

30 [0017] La sustitución puede ser con un residuo mayor o menor. Una sustitución para aumentar el tamaño del residuo puede disminuir el espacio obtenido por la molécula de sacarosa acoplada previniendo así la unión de sacarosa. Los residuos de aminoácidos se clasifican de la siguiente manera de menor a mayor: (un signo igual indica residuos con tamaños que son prácticamente indistinguibles):

[0018] La sustitución puede también ser tal como eliminar contactos con la molécula de sacarosa, en particular por movimiento o deleción de sitios potenciales de unión de hidrógeno o interacciones de Van der Waals.

40 [0019] La sustitución puede ser particularmente con otro residuo del mismo tipo donde el tipo es negativo, positivo, hidrofóbico o hidrofílico. Los residuos negativos son D,E, los residuos positivos son K/R, los residuos hidrofóbicos son A,C,F,G,I,L,M,P,V,W,Y, y los residuos hidrofílicos son H,N,Q,S,T.

[0020] Algunos ejemplos particulares de sustituciones son I15T/S/V/L, R18K, K44R/S/T/Q/N, N86Q/S/T, T87N/Q/S, 45 G88A/S/T, Y89W/F/H, H90W/F/Y/R/K/N/Q/M, W93Y/F/M/E/G/V/T/S, F188H/L/I/T/G/V, D190E/Q/G, A192S/T, F194S/L/Y, L196F, N371 K/R/F/Y/Q, D372E/Q/S/T/A y N375S/T/D/E/Q.

[0021] Ejemplos de deleciones son la deleción del residuo 191 o 192. Un ejemplo de una inserción es Ala insertada entre 192 y 193.

50 [0022] El polipéptido puede incluir otras alteraciones en comparación con Novamyl (SEQ ID nº: 1), por ejemplo alteraciones para aumentar la termoestabilidad, como se describe en la US 6162628.

Nomenclatura para alteraciones de aminoácidos

55 [0023] En esta especificación, se describe una sustitución de aminoácidos usando códigos de una sola letra, por ejemplo K44R. Las barras se utilizan para indicar alternativas, por ejemplo K44R/S/T/Q/N para indicar la sustitución de K44 con R o S, etc. P191* indica una deleción de P191. *192aA indica la inserción de una Ala después de A192. Las comas se utilizan para indicar alteraciones múltiples en la secuencia, por ejemplo F188L, D261G, T288P para indicar

60 una variante con tres sustituciones.

Propiedades de amilasa antiendurecimiento para su uso con sacarosa

[0024] La amilasa para el uso en la masa con alto contenido en sacarosa se puede seleccionar para que tenga 65 principalmente actividad de exo-amilasa. Más específicamente, la amilasa hidroliza la amilosa de modo que el peso

molecular medio de la amilosa después de 0,4-4 % de hidrólisis es más del 50 % (particularmente más del 75 %) del peso molecular antes de la hidrólisis.

[0025] Así, la amilasa puede hidrolizar amilosa (p. ej. amilosa de trigo o amilosa sintética) de modo que el peso molecular medio de la amilosa después de 0,4-4 % de hidrólisis (es decir, entre 0,4-4 % de hidrólisis del número total de enlaces) es más del 50 % (particularmente más del 75 %) del valor antes de la hidrólisis. La hidrólisis se puede conducir en un 1,7 % de solución de amilosa por peso en condiciones adecuadas (p. ej. 10 minutos a 60°C, pH 5,5), y la distribución de peso molecular antes y después de la hidrólisis se puede determinar por HPLC. La prueba se puede realizar como se describe en C. Christophersen et al., Starch 50 (1), 39-45 (1998).

[0026] Una exo-amilasa para el uso en masas con alto contenido en sacarosa puede tener un tolerancia al azúcar especifica. En comparación con su actividad en ausencia de sacarosa, la amilasa puede tener más del 20 % de actividad con 10 % de azúcar, más del 10 % de actividad con 20 % de sacarosa o más del 4 % de actividad con 40 % de sacarosa. La tolerancia al azúcar se puede determinar como se describe en los ejemplos.

[0027] La exo-amilasa puede tener actividad óptima en el rango de pH 4,5-8,5. Puede tener suficiente termoestabilidad para retener al menos 20 % (particularmente al menos 40 %) de actividad después de 30 minutos de incubación a 85°C en pH 5,7 (50 mM Na-acetato, 1 mM CaCl2) sin sustrato.

[0028] La exo-amilasa se puede adicionar a la masa en una cantidad correspondiente a 1-100 mg de proteína enzimática por kg de harina, particularmente 5-50 mg por kg.

[0029] La exo-amilasa puede ser no liquificante. Esto se puede determinar dejando actuar la exo-amilasa en un 1% de solución de almidón de trigo hasta que la reacción se complete, es decir, la adición de enzimas frescas no causa más degradación, y analizando los productos reactivos, por ejemplo por HPLC. Las condiciones de reacción típicas son, por ejemplo, 0,01 mg de enzima por ml de solución de almidón durante 48 horas. La exo-amilasa se considera no liquificante si la cantidad de almidón residual después de la reacción es al menos 20 % de la cantidad inicial de almidón.

[0030] La exo-amilasa puede tener actividad de alfa-amilasa maltogénica (EC 3.2.1.133). La exo-amilasa puede ser la amilasa descrita en DK PA 2004 00021 o puede ser una variante de Novamyl descrita en esta especificación.

Masa y producto comestible a base de masa

[0031] La masa puede tener un contenido de sacarosa por encima del 10% en peso, particularmente por encima del 20% o 30%, por ejemplo 30-40%. El contenido de harina es típicamente 25-35% en peso de los ingredientes totales. La masa puede estar hecha con una receta de pastel convencional, típicamente con harina de pastel, azúcar, grasa/aceite y huevos como ingredientes principales. Puede incluir otros ingredientes convencionales tales como emulsionantes, humectantes, gomas, almidón y levadura. Contiene generalmente ingredientes tales como harina de trigo blando, leche u otros líquidos, azúcar, huevos, leudantes químicos, extractos de sabor y especias, al igual que otros que pueden o no incluir grasa vegetal.

[0032] La masa se trata generalmente con calor, por ejemplo por horneado o fritura para preparar un producto comestible, tal como pasteles, incluyendo pastel de libra, pasteles de estrato blanco y amarillo, pasteles con chocolate y productos a base de cacao, pasteles de esponja, pasteles comida de ángel, pasteles de fruta y pasteles tipo espuma y donuts.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Tolerancia a la sacarosa de las variantes de Novamyl

[0033] La actividad amilasa de varios polipéptidos fue evaluada por incubación con comprimidos de Phadebas (producto

®

de Pharmacia) durante 15 minutos a 60°C en presencia de sacarosa en varias concentraciones (en % por peso). Los resultados se expresan en % del resultado sin azúcar:

Alteraciones en comparación con SEQ ID nº: 1: 0 % sacarosa 10 % sacarosa 20 % sacarosa 40 % sacarosa

Ninguna: 100 13 6 1,5

F188L,D261G,T288P: 100 27,5 14,5 6

F194S: 100 31,5 18,5 7,5

L196F: 100 69 42 23

D190G: 100 65 43 21

Ejemplo 2: Tolerancia a la sacarosa de las variantes de Novamyl

[0034] Un número de polipéptidos fueron evaluados como en el ejemplo 1. Los resultados se expresan como actividad con 10 % de sacarosa en % de la actividad sin sacarosa:

Alteraciones en comparación con SEQ ID nº: 1: Tolerancia al azúcar

Ninguna: 15

D261G,T288P: 24

F188L,D261 G,T288P: 35

T288P: 56

Y89F,D261G,T288P: 42

N86V, F188L,D261 G,T288P: 37

Y89F,F188L,D261 G,T288P: 38

Y89H,F188L,D261 G,T288P: 50

N86T, F188L,D261G,T288P: 49

F194S,D261G,T288P: 47

L196F: 65

D261G,T288P,D372V: 62

Q184H,N187D,F194Y: 47

D190G: 66

N86G,Y89M, F188L,D261G,T288P: 47

F188L,D190G,D261G,T288P: 68

A192Q,D261 G,T288P,S446A: 46

F188H: 49

P191*: 42

A192*: 51

A192*,G193*: 67

*192aA: 44

N86K,F252L,D261 G,T288P: 49

F194Y,L225S,D261 G,T288P: 49

F194L,D261 G,T288P: 54

F194S,D261 G,T288P,P642Q: 60

D261G,T288P,N375S: 58

F188T: 37

F188G: 36

F188V: 41

A192R,F194L,D261G,T288P,G469R: 60

A192G,D261G,T288P: 41

Y89F,D261G,T288P,1290V,N375S: 60

[0035] Las siguientes variantes también se consideran de interés en el contexto de la presente invención: 5

Alteraciones en comparación con SEQ ID nº: 1

I15T, N86K, P191S, D261G, T288P

I15T, P191 S, D261G, T288P

I15T, P191S, Y258F, D261 G, T288P, N375S, Y549C, Q648H

I15T, G153R, P191S, D261 G, T288P, N371K, K645R

Ejemplo 3: tolerancia a la sacarosa y termoestabilidad de amilasas

[0036] Las siguientes amilasas fueron evaluadas para termoestabilidad y tolerancia al azúcar: alfa-amilasa bacteriana de

®

B. amyloliquefaciens (BAN™, producto de Novozymes A/S), alfa-amilasa fúngica de A. oryzae (Fungamyl, producto de

®

Novozymes A/S), alfa-amilasa maltogénica con la secuencia de SEQ ID nº: 1 (Novamyl, producto de Novozymes A/S), una variante de Novamyl con SEQ ID nº: 1 con las sustituciones F188L +D261 G +T288P y alfa-amilasa bacteriana de

®

B. licheniformis (Termamyl, producto de Novozymes A/S).

Actividad de exo-amilasa

[0037] Las cinco amilasas fueron evaluadas para actividad de exo-amilasa como se ha descrito anteriormente. Los resultados muestran que Novamyl y la variante de Novamyl tuvieron actividad de exo-amilasa mediante esta prueba y las otras tres no.

Termoestabilidad

[0038] Cada amilasa se incubó a 85°C en pH 5,7 (50 mM Na-acetato, 1 mM CaCl2) sin sustrato y la actividad amilasa se midió después de 0, 15, 30 y 60 minutos de tratamiento térmico. Los resultados se expresan como actividad residual en % de la actividad inicial:

0: 15 30 60

BAN: 100 3 1 0

Fungamyl: 100 0 0 0

Novamyl: 100 51 29 13

Variante de: 100 64 48 54

Novamyl

Termamyl: 100 100 71 85

[0039] Los resultados muestran que la variante de Novamyl y Termamyl no se desactivaron por el tratamiento térmico. BAN y Fungamyl pierden toda su actividad después de 15 min mientras que Novamyl la pierde gradualmente con el tiempo de tratamiento térmico.

Tolerancia a la sacarosa [0040] El experimento se repitió en 10 % de solución de sacarosa. Los resultados se expresan como actividad residual en % de la actividad inicial sin sacarosa:

0 15 30 60 BAN 93 2 1 0 Fungamyl 31 0 0 0 Novamyl 7 6 1 3 Variante de 21 19 14 16 Novamyl Termamyl 116 112 97 82

[0041] Los resultados muestran que BAN y Termamyl no fueron inhibidos por el azúcar mientras que Fungamyl y la variante de Novamyl fueron un tanto inhibidos y Novamyl fue fuertemente inhibido por el azúcar. La combinación de azúcar y tratamiento de calor muestra que la variante de Novamyl y Termamyl podrían ser activos durante la cocción de pasteles. Termamyl y la variante de Novamyl cumplen el criterio de termoestabilidad y tolerancia al azúcar utilizado en esta invención.

5 Ejemplo 4: preparación de pasteles de esponja con amilasa

[0042] Se hicieron pasteles de esponja con adición de amilasa de la siguiente manera: BAN (0,83. 8,3 o 83 mg/kg harina), Novamyl (1,3 o 13 mg/kg harina) o la variante de Novamyl usada en el ejemplo 1 (1,10 o 100 mg/kg harina). Se hizo un pastel de control sin amilasa.

10 [0043] Los pasteles se hornearon según el método de pastel de sándwich de esponja de alta proporción (HRSSC, por su sigla en inglés). Después de la cocción, los pasteles se enfriaron durante 60-120 minutos, y los pasteles se almacenaron a temperatura ambiente en bolsas plásticas selladas llenas de nitrógeno hasta su análisis. Los pasteles se evaluaron los días 1, 3, 7 o 23.

15 [0044] Se realizó el análisis de perfil de textura (TPA, por su sigla en inglés) como se describe en Bourne M. C. (2002) 2. ed., Food Texture and Viscosity: Concept and Measurement. Academy Press. Los resultados mostraron que el aumento en la dureza era más lento al incrementar la dosificación de la variante de Novamyl. La adición de BAN o Novamyl tuvo sólo un ligero efecto y sólo en la dosificación más alta.

20 [0045] La cohesión de los pasteles disminuyó con el tiempo de almacenamiento. La adición de la variante de Novamyl retrasó esta disminución. La adición de BAN o Novamyl tuvo un ligero efecto y sólo en la dosificación más alta.

[0046] La movilidad del agua se caracterizó por RMN de campo bajo. La adición de la variante de Novamyl y BAN 25 aumentó la movilidad, indicando que las dos amilasas fueron capaces de mantener los pasteles más húmedos. Novamyl no tuvo prácticamente ningún efecto.

[0047] Una pequeña evaluación sensorial de blandura y humedad se realizó el día 13 en los 3 pasteles con la variante de Novamyl y el pastel de control. Los pasteles se evaluaron con respecto a tres parámetros: solidez, humedad y 30 preferibilidad. El control fue el más firme, el más seco y el menos preferido. Cuanto mayor fue la dosificación de la variante de Novamyl, el pastel fue menos firme (más blando), más húmedo y gustó más.

[0048] Una evaluación sensorial de panel grande se realizó el día 13. Fue una prueba de comparación pareada en la que un pastel de control se comparó con el pastel con la variante de Novamyl en la dosificación más alta. A un panel de

35 30 miembros se le plantearon dos preguntas (1) ¿qué pastel es más húmedo? y (2) ¿qué pastel es más fresco?. Todos los miembros del panel estuvieron de acuerdo en que el pastel con la variante de Novamyl era más húmedo y más fresco. La preferencia fue significativa a un nivel de importancia por encima del 99.999 %.

[0049] Para resumir, los datos muestran que la variante de Novamyl tuvo propiedades de antiendurecimiento y fue 40 capaz de mejorar la percepción de humedad y la humedad medida por RMN. Las otras dos amilasas tuvieron sólo un ligero efecto.

Ejemplo 5: pasteles de unidad de proporción alta

45 [0050] Se hicieron pasteles con adición de amilasa de la siguiente manera: BAN (0,83. 8,3 o 83 mg/kg harina) o la variante de Novamyl usada en el ejemplo 1 (1,10 o 100 mg/kg harina). Se hizo un pastel de control sin amilasa.

[0051] Los pasteles fueron horneados según el método de pastel de unidad de proporción alta (HRUC, por su sigla en inglés). Después de la cocción, los pasteles se enfriaron durante 60-120 minutos y los pasteles se almacenaron a 50 temperatura ambiente en bolsas plásticas selladas llenas de nitrógeno hasta su análisis. Los pasteles se evaluaron los días 7, 20 y 34 por los mismos métodos que en el ejemplo precedente.

[0052] El aumento en la dureza fue más lento con la variante de Novamyl en la dosificación más alta. La adición de BAN al pastel dio como resultado un pastel de bajo volumen y pastoso que dio pobres resultados en las mediciones de 55 dureza.

[0053] La adición de la variante de Novamyl retardó la reducción en la cohesión mientras que BAN no influyó nada en ésta.

60 [0054] La variante de Novamyl y BAN fueron capaces de mantener el pastel más húmedo que el control. Este aumento en la movilidad del agua libre podría parcialmente explicarse porque los pasteles con BAN y la variante de Novamyl pudieron retener el contenido de humedad.

[0055] Una pequeña evaluación sensorial en el día 34 mostró que el pastel con la variante de Novamyl en la dosificación 65 más alta fue claramente mejor que el pastel de control; éste era más húmedo y menos quebradizo.

[0056] Sobre todo, hubo un efecto de antiendurecimiento de la variante de Novamyl en la dosificación más alta, similar al efecto en los pasteles de esponja del ejemplo precedente. El endurecimiento de los pasteles de HRUC fue más lento que el de los pasteles de esponja, pero siguió siendo evidente que la variante de Novamyl tuvo un efecto de antiendurecimiento. El efecto de antiendurecimiento se vio con análisis de textura, RMN y evaluación sensorial. BAN

5 mostró efectos de antiendurecimiento en el HRUC, pero fue sensible a la sobredosificación que dio como resultado el desplome del pastel y un pastel pastoso.

Ejemplo 6: pastel de esponja

10 [0057] Se hicieron pasteles de esponja con adición de la amilasa de DK PA 2004 00021 en dosificaciones 0,5, 1, 2,5 y 20 mg/kg harina y un pastel de control sin amilasa.

[0058] La textura y la RMN se midieron en los días 1, 7 y 13. La adición de la amilasa redujo el aumento de la solidez, especialmente en las dosificaciones más altas. La amilasa también tuvo un efecto provechoso en la movilidad del agua, 15 que se correlacionó con la humedad del pastel.

[0059] Una evaluación de clasificación sensorial ciega realizada el día 14 mostró una clasificación según la dosificación, cuanto mayor fue la dosificación más húmedo y blando fue el pastel. El pastel más preferido fue el de dosificación más alta.

Ejemplo 7: procedimiento de cocción pastel de Tegral Allegro

Receta

25 [0060] Se utilizó la siguiente receta:

%

Tegral Allegro mix*: 100

Huevo entero pasteurizado: 50

Mantequilla: 50

Enzimas: Según la prueba. 0 o 25 mg/kg de harina

*comercialmente disponible de Puratos NV/SA, Groot-Bijgaarden, Bélgica

Procedimiento

30 [0061] Los ingredientes se midieron en un bol de mezclas y se mezclaron usando un mezclador industrial (p. ej. Bjørn AR 5 A Varimixer) con una velocidad de pala adecuada. Se vertieron 300 g de la masa en moldes. Los pasteles se hornean en un horno adecuado (p. ej. horno de piso Sveba Dahlin) durante 45 min. a 180 °C. Se dejaron enfriar los pasteles a temperatura ambiente durante 1 hora.

35 [0062] El volumen de los pasteles se determinó cuando los pasteles se hubieron enfriado utilizando el método de desplazamiento de semilla de colza. Los pasteles se embalaron con nitrógeno en bolsas plásticas selladas y se almacenaron a temperatura ambiente hasta su análisis.

[0063] Los pasteles se evaluaron los días 1, 7 y 14, se usaron dos pasteles en cada ocasión.

40 [0064] La cohesión y la dureza de los pasteles se evaluó con un analizador de textura y la movilidad de agua se caracterizó por RMN de campo bajo.

[0065] El análisis de perfil de textura (TPA) se realizó como se describe en Bourne M. C. (2002) 2. ed., Food Texture 45 and Viscosity: Concept and Measurement. Academic Press.

[0066] La movilidad del agua libre se determinó como describe P. L. Chen, Z. Long, R. Ruan and T. P. Labuza, Nuclear Magnetic Resonance Studies of water Mobility in Bread during Storage. Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 30, 178-183 (1997). La movilidad del agua libre se ha descrito en la bibliografía para correlacionarse con la humedad de la

50 miga de pan.

Resultado

[0067] En comparación con los pasteles sin adición de enzimas, el volumen de los pasteles no se ve afectado por la

55 adición de la enzima de referencia (SEQ ID n°.: 1) ni por la adición de variantes de ésta, es decir, los pasteles no se derrumbaron por la adición de enzima.

[0068] La cohesión de los pasteles disminuyó con el tiempo de almacenamiento. La adición de variantes de SEQ ID nº: 1 retardó esta disminución como se puede ver en la tabla 1.

Tabla 1: cambio en la cohesión [gs/gs] con tiempo de almacenamiento de pasteles con 25 mg de enzima de proteína por kg de harina

Enzima: Día 1 Día 7 Día 14

Sin enzima: 0,44 0,35 0,32

SEQ ID Nº:1: 0,43 0,38 0,36

F188L,D261 G,T288P: 0,46 0,42 0,41

Y89F,D261G,T288P: 0,45 0,43 0,39

N86G,Y89M, F188L,D261G,T288P: 0,44 0,42 0,38

T288P: 0,44 0,40 0,41

F194S,D261G,T288P: 0,47 0,43 0,42

D261G,T288P,D372V: 0,46 0,43 0,37

A192Q,D261 G,T288P,S446A: 0,44 0,42 0,39

A192R,F194L,D261G,T288P,G469R: 0,47 0,44 0,42

A192G,D261G,T288P: 0,46 0,42 0,39

N86K,F252L,D261 G,T288P: 0,45 0,41 0,39

F194L,D261 G,T288P: 0,45 0,42 0,42

F194S,D261 G,T288P,P642Q: 0,44 0,40 0,39

Y89F,D261G,T288P,I290V,N375S: 0,43 0,42 0,40

[0069] La movilidad del agua libre está en relación con la percepción de humedad de la miga del pastel, se reduce con

10 el tiempo. La adición de las variantes de Novamyl aumentó la movilidad en comparación con el control, indicando que las amilasas fueron capaces de mantener los pasteles más húmedos. Los resultados se catalogan en la tabla 2.

Tabla 2: cambio en la movilidad de agua libre [micros] con tiempo de almacenamiento de pasteles con 25 mg de enzima de proteína por kg harina 15

Enzima: Día 1 Día 7 Día 14

Sin enzima: 7077 5111 4175

SEQ ID Nº:1: 6990 5460 4583

F188L,D261 G,T288P: 7216 5624 4656

Y89F,D261G,T288P: 7085 6044 5151

N86G,Y89M, F188L,D261G,T288P: 7493 5349 5120

T288P: 7458 5785 4858

F194S,D261G,T288P: 7746 6373 5325

D261G,T288P,D372V: 7417 5517 4525

A192Q,D261G,T288P,S446A: 7357 5714 5041

A192R,F194L,D261G,T288P, G469R: 7549 5536 sin datos

A192G,D261G,T288P: 7546 5815 sin datos

N86K,F252L,D261 G,T288P: 7349 5295 4775

F194L,D261 G,T288P: 7773 6803 5750

F194S,D261 G,T288P,P642Q: 8152 5969 4971

Y89F,D261G,T288P,I290V,N375S: 7753 6175 4811

[0070] La dureza de los pasteles aumentó con el tiempo de almacenamiento. La adición de variantes de SEQ ID nº: 1 retardó este aumento en la dureza como se puede ver en la tabla 3.

Tabla 3: cambio en la dureza [g] con tiempo de almacenamiento de pasteles con 25 mg de enzima de proteína por kg harina

Enzima: Día 1 Día 7 Día 14

Sin enzima: 647 1060 1408

SEQ ID No:1: 677 997 1171

F188L,D261G,T288P: 683 951 1167

Y89F,D261G,T288P: 649 998 1160

N86G,Y89M, F188L,D261G,T288P: 630 844 1194

T288P: 719 1101 1098

F194S,D261G,T288P: 672 943 1061

D261G,T288P,D372V: 593 962 1344

A192Q,D261 G,T288P,S446A: 680 931 1159

A192R,F194L,D261G,T288P,G469R: 720 987 1209

A192G,D261G,T288P: 707 1024 1102

N86K,F252L,D261 G,T288P: 678 955 1248

F194L,D261G,T288P: 648 895 1050

F194S,D261G,T288P,P642Q: 674 1028 1316

Y89F,D261G,T288P,I290V,N375S: 602 731 827

5

LISTADO DE SECUENCIAS

10: [0071] <110> Novozymes A/S

<120> Variantes de alfa-amilasa maltogénica

15: <130> 10618.204-WO

<160> 1

20: <170> Versión de patentIn 3. 3 <210> 1 <211> 686 <212> PRT <213> Bacillus stearothermophilus

25: <400> 1

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método de preparación de una masa o un producto comestible a base de masa, que comprende la adición de un

polipéptido con actividad de alfa-amilasa maltogénica a la masa, donde la masa comprende al menos 10 % de sacarosa 5 en peso, y el polipéptido:

a) tiene una secuencia de aminoácidos que es como mínimo 70 % idéntica a la SEQ ID nº: 1, y b) comparado con SEQ ID nº: 1 comprende una alteración de aminoácidos que es sustitución o deleción de o inserción adyacente a I15; R18; K44; N86; T87; G88; Y89; H90; Y92; W93; F188; T189; D190; P191; A192;

10 F194; L196; D329; N371; D372; P373; N375 o R376, y, c) tiene más del 20 % de actividad en 10 % de sacarosa, en comparación con su actividad en ausencia de sacarosa.
2. Método según la reivindicación 1 donde la alteración es sustitución con un residuo de aminoácido mayor o menor. 15
3.

Método según la reivindicación 1 donde la alteración es inserción de 1-4 residuos de aminoácidos en el lado N- o Cdel residuo específico.
4.

Método según la reivindicación 1 donde el polipéptido comprende una sustitución I15T/S/V/L, R18K, K44R/S/T/Q/N,

20 N86Q/S/T, T87N/Q/S, G88A/S/T, Y89W/F/H, H90W/F/Y/R/K/N/Q/M, W93Y/F/M/E/G/V/T/S, F188H/L/I/T/G/V, D190E/Q/G, A192G/S/T/Q/R, F194S/L/Y, L196F, N371 K/R/F/Y/Q o D372E/Q/S/T/A, N375S, una deleción de 191 o 192

o una inserción de Ala después de 192.
5. Método según la reivindicación 1 donde el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID nº: 1 con uno de 25 los siguientes conjuntos de alteraciones:

Alteraciones comparadas con SEQ ID nº: 1

D261D,T288P

F188L,D261G,T288P

T288P

Y89F,D261 G,T288P

N86V, F188L,D261G,T288P

Y89F,F188L,D261 G,T288P

Y89H,F188L,D261G,T288P

N86T, F188L,D261G,T288P

F194S,D261G,T288P

L196F

D261G,T288P,D372V

Q184H,N187D,F194Y

D190G

N86G,Y89M, F188L,D261G,T288P

F188L,D190G,D261 G,T288P

A192Q,D261G,T288P,S446A

F188H

P191*

A192*

A192*,G193*

*192aA

N86K,F252L,D261 G,T288P

F194Y,L225S,D261G,T288P

F194L,D261G,T288P

F194S,D261 G,T288P,P642Q

D261G,T288P,N375S

F188T

F188G

F188V

A192R,F194L,D261 G,T288P,G469R

A192G,D261G,T288P

Y89F,D261G,T288P,I290V,N375S