ES2410906T3 - Procedimiento de producción de alfa-santaleno - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de producción de α-santaleno que comprende a) poner en contacto FPP (farnesil pirofosfato) con al menos un polipéptido que tiene una actividad α-santalenosintasa y que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 50% idéntica a SEC ID Nº: 1; b) opcionalmente, aislar el α-santaleno producido en la etapa a).

Description

Procedimiento de producción de alfa-santaleno

Campo técnico

La presente invención proporciona un procedimiento de producción de !-santaleno, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto al menos un polipéptido con farnesil pirofosfato (FPP). En particular, dicho procedimiento puede llevarse a cabo in vitro o in vivo para producir !-santaleno, un compuesto muy útil en los campos de la perfumería y los aromatizantes. La presente invención también proporciona la secuencia de aminoácidos de un polipéptido útil en el procedimiento de la invención. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la invención y un vector de expresión que contiene dicho ácido nucleico también son parte de la presente invención. Un organismo huésped no humano o una célula transformada para usarse en el procedimiento de producir !-santaleno también son un objeto de la presente invención.

Técnica anterior

Los terpenos se encuentran en la mayoría de los organismos (microorganismos, animales y vegetales). Estos compuestos se componen de cinco unidades de carbono llamadas unidades de isopreno y se clasifican por el número de estas unidades presentes en su estructura. Por lo tanto los monoterpenos, sesquiterpenos y diterpenos son terpenos que contienen 10, 15 y 20 átomos de carbono respectivamente. Los sesquiterpenos, por ejemplo, se encuentran ampliamente en el reino vegetal. Muchas moléculas de sesquiterpeno se conocen por sus propiedades saporíferas y de fragancia y sus efectos cosméticos, medicinales y antimicrobianos. Se han identificado más de 300 hidrocarburos de sesquiterpenos y 3000 sesquiterpenoides y se identifican muchas estructuras nuevas cada año. Se usan como fuente de terpenos extractos vegetales obtenidos por diferentes medios tales como destilación por vapor o extracción de disolvente. Las moléculas de terpeno se usan con frecuencia tal cual, pero en algunos casos se usan reacciones químicas para transformar los terpenos en otras moléculas de alto valor.

La producción biosintética de terpenos implica enzimas llamadas terpeno sintasas. Hay prácticamente una infinitud de sesquiterpenos sintasas presentes en el reino vegetal, que usan todas el mismo sustrato (farnesil pirofosfato, FPP) pero que tienen diferentes perfiles de producto. Se han clonado genes y ADNc que codifican sesquiterpeno sintasas y se han caracterizado las enzimas recombinantes correspondientes. La biosíntesis de terpenos en plantas y otros organismos se ha estudiado exhaustivamente y no se detalla adicionalmente en el presente documento, pero se hace referencia a Dewick, Nat. Prod. Rep., 2002, 19, 181-222, que revisa el estado de la técnica de las rutas biosintéticas del terpeno.

!-santaleno es una molécula de sesquiterpeno de origen natural. El isómero (+) puede usarse como material de partida para la síntesis química o la biosíntesis de (Z)-(+)-!-santalol, que es un constituyente importante del aceite de sándalo. El aceite de sándalo es un ingrediente de perfumería importante obtenido por destilación del duramen de especies de Santalum. El sándalo también se usa en gran medida para inciensos y medicina tradicional. El aceite contiene 90% de alcoholes de sesquiterpeno. (Z)-(+)-!-santalol y (Z)-(-)-∀-santalol representan los constituyentes principales (respectivamente 45-47% y 20-30%) y son principalmente responsables del olor balsámico y de madera dulce típico del aceite de sándalo. Otros constituyentes tales como epi-∀-santalol y trans-!-bergamotol también están presentes y pueden contribuir a la importancia del sándalo.

En general, el precio y disponibilidad de extractos naturales vegetales depende de la abundancia, producción de aceite y origen geográfico de las plantas. Además, la disponibilidad y calidad de los extractos naturales depende en gran medida del clima y otras condiciones locales que conducen a variabilidad de un año a otro, haciendo el uso de dichos ingredientes en perfumería de alta calidad muy difícil o incluso imposible algunos años. Debido a la sobreexplotación de los recursos naturales, dificultades de cultivo, crecimiento lento de las plantas de Santalum, la disponibilidad de materia prima de sándalo se ha reducido drásticamente durante las últimas décadas. Por lo tanto, sería una ventaja proporcionar una fuente de (Z)-(+)-!-santalol, que esté menos sujeta a fluctuaciones de disponibilidad y calidad. No está disponible hasta la fecha una síntesis química de los constituyentes de sesquiterpeno de sándalo. Sería por lo tanto de gran interés una ruta bioquímica que condujera a la síntesis de (+)-!-santaleno, que podría después usarse para producir (Z)-(+)-!-santalol. Dada la dificultad para controlar la producción de sesquiterpeno en especies de Santalum, se han buscado fuentes vegetales alternativas.

El sesquiterpeno de tipo santalano, y particularmente sesquiterpenos con el esqueleto de !-santalano, se ha identificado en varias especies vegetales. Se ha indicado que Clausena lansium, una planta de la familia Rutaceae contiene grandes cantidades de sesquiterpenos de santalano en las hojas. Zhao y colaboradores (Zhao y col, Z. Naturforsch, 2004, 59c, 153-156) han analizado las hojas de C. lansium de China y han detectado la presencia de !santalol y ∀-santalol. El análisis de las hojas de C. lansium de Cuba ha revelado la presencia de (Z)-!-santalol, epi-∀santalol, (Z)-∀-santalol y (E)-∀-santalol (Pino y col., J. Essent. Oil Res., 2006, 18, 139-141). Sorprendentemente el análisis de diferentes partes de C. lansium de origen tailandés no mostró la presencia de sesquiterpenos con esqueletos de santalano (Chokeprasert y col, Journal of Food Composition and Analysis, 2007, 20(1), 52-56).

Una sesquiterpeno sintasa capaz de sintetizar al menos un sesquiterpeno bicíclico y/o tricíclico que tiene un esqueleto de carbono de santalano, el ácido nucleico correspondiente y un procedimiento de producción de dichos compuestos que tienen un esqueleto de carbono de santalano, se desvelan en la solicitud de patente Internacional WO 2006/134523. Se citan (+)-epi-∀-santaleno, (-)-∀-santaleno, (+)-∀-santaleno, (+)-!-santaleno y (-)-!-santaleno como ejemplos de compuestos que tienen un esqueleto de carbono de santalano. No obstante, la sesquiterpeno sintasa proporcionada en los ejemplos no produce !-santaleno. Solamente se produce epi-∀-santaleno. Las propiedades de este compuesto son muy diferentes de las del !-santaleno. En particular, epi-∀-santaleno no es de interés en la síntesis de (Z)-(+)-!-santalol. Además, la sesquiterpeno sintasa desvelada en el documento WO 2006/134523 comparte solamente el 37% de identidad con la secuencia de la invención.

También se han encontrado terpenos sintasas que tienen un cierto porcentaje de identidad de secuencia con la secuencia de la !-santaleno sintasa de la presente invención en las bases de datos de secuencias. No obstante, el porcentaje de identidad entre las sesquiterpeno sintasas conocidas y el polipéptido de la invención es muy bajo. La secuencia proteica más cercana a la (+)-!-santaleno sintasa de la invención es una (E)-∀-farneseno sintasa de Citrus junos (Nº de referencia del NCBI AAK54279; Maruyama y col, Biol. Pharm. Bull., 2001, 24(10), 1171-1175) que comparte del 67 al 68% de identidad de secuencia de aminoácidos con la !-santaleno sintasa de la invención.

Además de la diferencia entre las secuencias en sí mismas, también debe indicarse que la estructura y las propiedades de los productos sintetizados por la enzima anteriormente mencionada son muy diferentes de las de !santaleno. En particular (E)-∀-farneseno no es adecuado como un material de partida para la síntesis de (Z)-(+)-!santalol, que es un ingrediente muy útil en el campo de la perfumería.

Se desvela una !-santaleno sintasa en el documento WO 2008/142318. Este documento no se ha publicado a la fecha de la presente solicitud de prioridad. Describe una enzima capaz de catalizar la transformación de Z,Z-farnesil pirofosfato a !-santaleno. Por lo tanto la reacción catalizada por la enzima de la técnica anterior es diferente de la catalizada por la sintasa de la presente invención, que comienza a partir de E,E-farnesil pirofosfato. Además, la !santaleno sintasa de la invención comparte solamente el 23,8% de identidad de secuencia con la descrita en el documento WO 2008/142318.

A pesar de estudios exhaustivos de la ciclación de terpenos, el aislamiento y caracterización de las terpeno sintasas es aún difícil, particularmente en plantas, debido a su baja abundancia, sus patrones de expresión con frecuencia transitorios, y la complejidad de purificarlas a partir de las mezclas de resinas y compuestos fenólicos en tejidos en los que se expresan.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar procedimientos para preparar (+)-!-santaleno de una manera económica, como se ha indicado anteriormente. En consecuencia, la presente invención tiene el objetivo de producir (+)-!-santaleno teniendo a la vez pocos residuos, un procedimiento más eficaz con respecto a energía y recursos y reduciendo a la vez la dependencia de combustibles fósiles. Es un objetivo adicional proporcionar enzimas capaces de sintetizar !-santaleno, que sea útil como ingrediente de perfumería y/o aroma.

Abreviaturas Usadas

pb par de bases kb kilobase BSA albúmina de suero bovino DMAPP dimetilalil difosfato ADN ácido desoxirribonucleico ADNc ADN complementario dT desoxi timina dNTP desoxi nucleótido trifosfato DTT ditiotreitol FPP farnesil pirofosfato CG cromatografía gaseosa idi isopentenil difosfato isomerasa IPP isopentenil difosfato IPTG isopropil-D-tiogalacto-piranósido LB caldo de lisogenia MOPSO ácido 3-(N-morfolino)-2-hidroxipropanosulfónico EM espectrometría de masas mvaK1 mevalonato quinasa mvaK2 mevalonato difosfato quinasa RMN resonancia magnética nuclear PCR reacción en cadena de la polimerasa

RMCE Intercambio de casetes mediado por recombinasa

3’-/5’-RACE amplificación rápida de extremos 3’ y 5’ de ADNc

ARN ácido ribonucleico

ARNm ácido ribonucleico mensajero

Descripción de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento para producir de forma biosintética !-santaleno de una manera económica, fiable y reproducible.

Una “sesquiterpeno sintasa” o un “polipéptido que tiene una actividad sesquiterpeno sintasa”, se entiende en el presente documento como un polipéptido capaz de catalizar la síntesis de una molécula de sesquiterpeno o de una mezcla de moléculas de sesquiterpeno del precursor de terpeno acíclico FPP.

Como una “!-santaleno sintasa” o como un “polipéptido que tiene una actividad !-santaleno sintasa”, los inventores entienden en el presente documento un polipéptido capaz de catalizar la síntesis de !-santaleno, en forma de cualquiera de sus estereoisómeros o una mezcla de los mismos, comenzando a partir de FPP. !-santaleno puede ser el único producto o puede ser parte de una mezcla de sesquiterpenos.

Como una “(+)-!-santaleno sintasa” o como un “polipéptido que tiene una actividad (+)-!-santaleno sintasa” los inventores entienden en el presente documento capaz de catalizar la síntesis de (+)-!-santaleno comenzando a partir de FPP. (+)-!-santaleno puede ser el único producto o puede ser parte de una mezcla de sesquiterpenos. La (+)-!santaleno sintasa es un ejemplo particular de !-santaleno sintasa.

La capacidad de un polipéptido para catalizar la síntesis de un sesquiterpeno particular (por ejemplo (+)-!-santaleno) puede confirmarse de forma sencilla realizando el ensayo enzimático como se detalla en el Ejemplo 4.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, FPP está en la forma de (2E,6E)-FPP.

De acuerdo con la presente invención, se pretende que los polipéptidos también incluyan polipéptido truncados siempre que mantengan su actividad sesquiterpeno sintasa como se define en cualquiera de las realizaciones anteriores y que compartan al menos el porcentaje de identidad definido con el correspondiente fragmento de SEC ID Nº: 1.

Como se pretende posteriormente en el presente documento, “una secuencia de nucleótidos obtenida modificando SEC ID Nº: 2” abarca cualquier secuencia que se haya obtenido cambiando la secuencia de SEC ID Nº: 2 usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, introduciendo cualquier tipo de mutación tal como mutaciones de deleción, inserción o sustitución. Se citan ejemplos de dichos procedimientos en la parte de la descripción relativa a los polipéptidos variantes y los procedimientos para prepararlos.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias peptídicas o nucleotídicas está en función del número de aminoácidos o restos de nucleótidos que son idénticos en las dos secuencias cuando se ha generado un alineamiento de estas dos secuencias. Los restos idénticos se definen como restos que son iguales en las dos secuencias en una posición dada del alineamiento. El porcentaje de identidad de secuencia, como se usa en el presente documento, se calcula a partir del alineamiento óptimo tomando el número de restos idénticos entre dos secuencias, dividiéndolo por el número total de restos en la secuencia más corta y multiplicando por 100. El alineamiento óptimo es el alineamiento en el que el porcentaje de identidad es el mayor posible. Pueden introducirse huecos en una o más secuencias en una o más posiciones del alineamiento para obtener el alineamiento óptimo. Estos huecos se tienen en cuenta después como restos no idénticos para el cálculo del porcentaje de identidad de secuencia.

Puede conseguirse alineamiento con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos o ácido nucleico de diversas maneras usando programas de ordenador y por ejemplo programas de ordenador públicamente disponibles en Internet. Preferentemente, el programa BLAST (Tatiana y col, FEMS Microbiol Lett., 1999, 174: 247-250, 1999) ajustado a los parámetros por defecto, disponible del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI) en http://www.nc-bi.nlm.nih.gov/BLAST/bl2seq/wblast2.cgi, puede usarse para obtener un alineamiento óptimo de secuencias peptídicas o nucleotídicas y para calcular el porcentaje de identidad de secuencia.

Un objeto de la presente invención es por lo tanto un procedimiento de producción de !-santaleno que comprende

a) poner en contacto FPP con al menos un polipéptido que tenga una actividad !-santaleno sintasa y que

comprende una secuencia de aminoácidos al menos 50% idéntica a SEC ID Nº: 1;

b) opcionalmente, aislar el !-santaleno producido en la etapa a).

De acuerdo con una realización preferida, el procedimiento es un procedimiento de producción de !-santaleno como un producto principal. De acuerdo con una realización aún más preferida, el !-santaleno representa al menos el 60%, preferentemente al menos el 80%, preferentemente al menos el 90%, preferentemente al menos el 92% del producto

producido por el procedimiento de la invención.

De acuerdo con una realización más preferida, el procedimiento es un procedimiento de producción de (+)-!santaleno y el polipéptido que tiene una actividad !-santaleno sintasa tiene una actividad (+)-!-santaleno sintasa.

De acuerdo con una realización aún más preferida, el procedimiento es un procedimiento de producción de (+)-!santaleno como un producto principal. De acuerdo con una realización más preferida, (+)-!-santaleno representa al menos el 60%, preferentemente al menos el 80%, preferentemente al menos el 90%, preferentemente al menos el 92% de los productos producidos por el procedimiento de la invención.

El procedimiento puede llevarse a cabo in vitro así como in vivo, como se explicará en detalle posteriormente.

El polipéptido para poner en contacto con FPP in vitro puede obtenerse mediante extracción de cualquier organismo que lo exprese, usando tecnologías de extracción de enzimas o proteínas convencional. Si el organismo huésped es un organismo unicelular o célula que libera el polipéptido de la invención al medio de cultivo, el polipéptido puede simplemente recogerse del medio de cultivo, por ejemplo mediante centrifugación, opcionalmente seguido de etapas de lavado y resuspensión en soluciones de tampón adecuadas. Si el organismo o célula acumula el polipéptido dentro de sus células, el polipéptido puede obtenerse por rotura o lisis de las células y extracción adicional del polipéptido del lisado celular.

El polipéptido que tiene una actividad !-santaleno sintasa, en una forma aislada o junto con otras proteínas, por ejemplo en un extracto proteico en bruto obtenido de células o microorganismos cultivados, puede después suspenderse en una solución de tampón a pH óptimo. Si es adecuado, pueden añadirse sales, BSA y otros tipos de cofactores enzimáticos para optimizar la actividad enzimática. Se describen condiciones apropiadas en más detalle en los Ejemplos más adelante.

El FPP precursor puede después añadirse a la suspensión o solución, que después se incuba a temperatura óptima, por ejemplo entre 15 y 40 ºC, preferentemente entre 25 y 35 ºC, más preferentemente a 30 ºC. Después de la incubación, el !-santaleno producido puede aislarse de la solución incubada por procedimientos de aislamiento convencionales, tales como extracción de disolvente y destilación, opcionalmente después de la retirada de los polipéptidos de la solución.

De acuerdo con otra realización preferida, el procedimiento de cualquiera de las realizaciones anteriormente descritas se lleva a cabo in vivo. En este caso, la etapa a) comprende cultivar un organismo o célula huésped no humano capaz de producir FPP y transformado para expresar al menos un polipéptido que comprenda una secuencia de aminoácidos al menos 50% idéntica a SEC ID Nº: 1 y que tenga una actividad !-santaleno sintasa, en condiciones que conduzcan a la producción de !-santaleno.

De acuerdo con una realización más preferida, el procedimiento comprende además, antes de la etapa a), transformar un organismo o célula no humano capaz de producir FPP con al menos un ácido nucleico que codifique un polipéptido que comprenda una secuencia de aminoácidos al menos 50% idéntica a SEC ID Nº: 1 y que tenga una actividad !santaleno sintasa, de modo que dicho organismo exprese dicho polipéptido.

Estas realizaciones de la invención son particularmente ventajosas puesto que es posible llevar a cabo el procedimiento in vivo sin aislar previamente el polipéptido. La reacción se produce directamente dentro del organismo

o célula transformada para expresar dicho polipéptido.

De acuerdo con una realización particular de la invención, el al menos un ácido nucleico que codifica la !-santaleno sintasa comprende una secuencia de nucleótidos al menos 50%, preferentemente al menos 55%, preferentemente al menos 60%, preferentemente al menos 65%, preferentemente al menos 70%, preferentemente al menos 75%, preferentemente al menos 80%, preferentemente al menos 85%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95% y aún más preferentemente al menos 98% idéntica a SEC ID Nº: 2 o el complemento de la misma. De acuerdo con una realización más preferida, dicho ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº: 2 o el complemento de la misma. En una realización aún más preferida, dicho ácido nucleico consiste en SEC ID Nº: 2 o el complemento de la misma.

De acuerdo con una realización más preferida, el al menos un ácido nucleico usado en cualquiera de las realizaciones anteriores comprende una secuencia de nucleótidos que se ha obtenido modificando SEC ID Nº: 2. De acuerdo con una realización aún más preferida, dicho al menos un ácido nucleico consiste en una secuencia de nucleótidos que se ha obtenido modificando SEC ID Nº: 2.

De acuerdo con otra realización, el al menos un ácido nucleico se aísla de Clausena lansium.

Se pretende que el organismo o célula “exprese” un polipéptido, siempre que el organismo o célula se transforme para albergar un ácido nucleico que codifique dicho polipéptido, este ácido nucleico se transcriba a ARNm y el polipéptido se encuentre en el organismo o célula huésped. El término “expresar” abarca “expresar de forma heteróloga” y “sobreexpresar”, refiriéndose este último a niveles de ARNm, polipéptidos y/o actividad enzimática por encima de la que se mide en un organismo o célula no transformado. Una descripción más detallada de

procedimientos adecuados para transformar un organismo o célula huésped no humano se describirá posteriormente o en la parte de la memoria descriptiva que está dedicada a dichos organismos o células huésped no humanos transformados como objetos específicos de la presente invención y en los ejemplos.

Se entiende que un organismo o célula particular es “capaz de producir FPP” cuando produce FPP de forma natural

o cuando no produce FPP de forma natural pero se transforma para producir FPP, antes de la transformación con un ácido nucleico como se ha descrito en el presente documento o junto con dicho ácido nucleico. Los organismos o células transformados para producir una cantidad mayor de FPP que el organismo o célula de origen natural también están abarcados por los “organismos o células capaces de producir FPP”. Ya se conocen en la técnica procedimientos para transformar organismos, por ejemplo microorganismos, de modo que produzcan FPP. Dichos procedimientos pueden por ejemplo hallarse en la bibliografía, por ejemplo en las siguientes publicaciones Martin, V. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., y Keasling, J. D. Nat Biotechnol., 2003, 21(7), 796-802 (transformación de E. coli); Wu, S., Schalk, M., Clark, A., Miles, R. B., Coates, R., y Chappell, J., Nat Biotechnol., 2006, 24 (11), 14411447 (transformación de plantas); Takahashi, S., Yeo, Y., Greenhagen, B. T., McMullin, T., Song, L., Maurina-Brunker, J., Rosson, R., Noel, J., Chappell, J, Biotechnology and Bioengineering, 2007, 97(1), 170-181 (transformación de levadura).

Para llevar a cabo la invención in vivo, el organismo o célula huésped se cultiva en condiciones que conduzcan a la producción de !-santaleno. En consecuencia, si el huésped es una planta transgénica, se proporcionan condiciones de crecimiento óptimas, tales como condiciones de luz, agua y nutrientes óptimas, por ejemplo. Si el huésped es un organismo unicelular, las condiciones que conducen a la producción de !-santaleno pueden comprender adición de cofactores adecuados al medio de cultivo del huésped. Además, puede seleccionarse un medio de cultivo, para maximizar la síntesis de !-santaleno. Se describen condiciones de cultivo óptimas de una manera más detallada en los siguientes Ejemplos.

Los organismos huésped no humanos adecuados para llevar a cabo el procedimiento de la invención in vivo pueden ser cualquier organismo multicelular o unicelular no humano. En una realización preferida, el organismo huésped no humano usado para llevar a cabo la invención in vivo es una planta, un procariota o un hongo. Puede usarse cualquier planta, procariota u hongo. Son plantas particularmente útiles las que producen de forma natural grandes cantidades de terpenos. En una realización más preferida, la planta se selecciona de la familia de Solanaceae, Poaceae, Brassicaceae, Fabaceae, Madvaceae, Asteraceae o Lamiaceae. Por ejemplo, la planta se selecciona de los géneros Nicotiana, Solanum, Sorghum, Arabidopsis, Brassica (colza), Medicago (alfalfa), Gossypium (algodón), Artemisia, Salvia y Mentha. Preferentemente, la planta pertenece a la especie de Nicotiana tabacum.

En una realización más preferida el organismo huésped no humano usado para llevar a cabo el procedimiento de la invención in vivo es un microorganismo. Puede usarse cualquier microorganismo pero de acuerdo con una realización aún más preferida dicho microorganismo es una bacteria o levadura. Más preferentemente, dicha bacteria es E. coli y dicha levadura es Saccharomyces cerevisiae.

Algunos de estos organismos no producen FPP de forma natural. Para que sea adecuado llevar a cabo el procedimiento de la invención, estos organismos tienen que transformarse para producir dicho precursor. Pueden transformarse antes de la modificación con el ácido nucleico descrito de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores o simultáneamente, como se ha explicado anteriormente.

También pueden usarse células eucariotas superiores aisladas, en lugar de organismos completos, como huéspedes para llevar a cabo el procedimiento de la invención in vivo. Las células eucariotas adecuadas pueden ser cualquier célula no humana, pero son preferentemente células vegetales o fúngicas.

De acuerdo con una realización preferida, el al menos un polipéptido que tiene una actividad !-santaleno sintasa usado en cualquiera de las realizaciones anteriormente descritas o codificado por el ácido nucleico usado en cualquiera de las realizaciones anteriormente descritas comprende una secuencia de aminoácidos al menos 55%, preferentemente al menos 60%, preferentemente al menos 65%, preferentemente al menos 70%, preferentemente al menos 75%, preferentemente al menos 80%, preferentemente al menos 85%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95% y aún más preferentemente al menos 98% idéntica a SEC ID Nº: 1. De acuerdo con una realización más preferida, dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 1. En una realización aún más preferida, dicho polipéptido consiste en SEC ID Nº: 1.

De acuerdo con otra realización preferida, el al menos un polipéptido que tiene una actividad !-santaleno sintasa usado en cualquiera de las realizaciones anteriormente descritas o codificado por el ácido nucleico usado en cualquiera de las realizaciones anteriormente descritas comprende una secuencia de aminoácidos que es una variante de SEC ID Nº: 1 obtenida por ingeniería genética. En otros términos, dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que se ha obtenido modificando SEC ID Nº:

2. De acuerdo con una realización más preferida, el al menos un polipéptido que tiene una actividad !-santaleno sintasa usado en cualquiera de las realizaciones anteriormente descritas o codificado por el ácido nucleico usado en cualquiera de las realizaciones anteriormente descritas consiste en una secuencia de aminoácidos que es una variante de SEC ID Nº: 1 obtenida por ingeniería genética, es decir una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que se ha obtenido modificando SEC ID Nº: 2.

Como se usa en el presente documento, se pretende que el polipéptido sea un fragmento polipeptídico o peptídico que abarque las secuencias de aminoácidos identificadas en el presente documento, así como polipéptidos truncados o variantes, siempre que mantengan su actividad como se ha definido anteriormente y que compartan al menos el porcentaje definido de identidad con el fragmento correspondiente de SEC ID Nº: 1.

Son ejemplos de polipéptidos variantes, proteínas de origen natural que resultan de acontecimientos de corte y empalme de ARNm alternativos o de escisión proteolítica de los polipéptidos descritos en el presente documento. Las variaciones atribuibles a la proteólisis incluyen, por ejemplo diferencias en los extremos N o C tras la expresión en diferentes tipos de células huésped, debido a la retirada proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de los polipéptidos de la invención. Los polipéptidos codificados por un ácido nucleico obtenido por mutación natural o artificial de un ácido nucleico de la invención, como se describen posteriormente, también están abarcados por la invención.

También pueden usarse en los procedimientos de la invención variantes polipeptídicas que resulten de una fusión de secuencias peptídicas adicionales en los extremos amino y carboxilo terminal. En particular dicha fusión puede potenciar la expresión de los polipéptidos, ser útil en la purificación de la proteína o mejorar la actividad enzimática del polipéptido en un ambiente o sistema de expresión deseado. Dichas secuencias peptídicas adicionales pueden ser péptidos señal, por ejemplo. En consecuencia, la presente invención abarca procedimientos que usan polipéptidos variantes, tales como los obtenidos por fusión con otros oligo o polipéptidos y/o los que están unidos a péptidos señal. También pueden usarse provechosamente en los procedimientos de la invención polipéptidos que resulten de una fusión con otra proteína funcional, tal como otra proteína de la ruta de biosíntesis de terpenos.

De acuerdo con otra realización, el al menos un polipéptido que tiene una actividad !-santaleno sintasa usado en cualquiera de las realizaciones anteriormente descritas o codificado por el ácido nucleico usado en cualquiera de las realizaciones anteriormente descritas se aísla de Clausena lansium.

Una herramienta importante para llevar a cabo el procedimiento de la invención es el polipéptido en sí mismo. Un polipéptido que tenga una actividad !-santaleno sintasa y que comprenda una secuencia de aminoácidos al menos 50% idéntica a SEC ID Nº: 1 es por lo tanto otro objeto de la presente invención.

De acuerdo con una realización preferida, el polipéptido es capaz de producir !-santaleno como un producto principal. De acuerdo con una realización aún más preferida, es capaz de producir una mezcla de sesquiterpenos en la que !-santaleno representa al menos el 60%, preferentemente al menos el 80%, preferentemente al menos el 90%, preferentemente al menos el 92% de los sesquiterpenos producidos.

De acuerdo con una realización más preferida, el polipéptido tiene una actividad (+)-!-santaleno sintasa.

De acuerdo con una realización aún más preferida, el polipéptido es capaz de producir (+)-!-santaleno como un producto importante. De acuerdo con una realización aún más preferida, es capaz de producir una mezcla de sesquiterpenos en la que (+)-!-santaleno representa al menos el 60%, preferentemente al menos el 80%, preferentemente al menos el 90%, preferentemente al menos el 92% de los sesquiterpenos producidos.

De acuerdo con una realización preferida, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos 55%, preferentemente al menos 60%, preferentemente al menos 65%, preferentemente al menos 70%, preferentemente al menos 75%, preferentemente al menos 80%, preferentemente al menos 85%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95% y aún más preferentemente al menos 98% idéntica a SEC ID Nº: 1. De acuerdo con una realización más preferida, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 1. De acuerdo con una realización aún más preferida, el polipéptido consiste en SEC ID Nº: 1.

De acuerdo con otra realización preferida, el al menos un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es una variante de SEC ID Nº: obtenida por ingeniería genética. En otros términos, dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que se ha obtenido modificando SEC ID Nº: 2. De acuerdo con una realización más preferida, el al menos un polipéptido que tiene una actividad !-santaleno sintasa consiste en una secuencia de aminoácidos que es una variante de SEC ID Nº: 1 obtenida por ingeniería genética, es decir una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que se ha obtenido modificando SEC ID Nº: 2.

De acuerdo con otra realización, el polipéptido se aísla de Clausena lansium.

Como se usa en el presente documento, se pretende que el polipéptido sea un fragmento polipeptídico o peptídico que abarque las secuencias de aminoácidos identificadas en el presente documento, así como polipéptidos truncados

o variantes, siempre que mantengan su actividad como se ha definido anteriormente y que compartan al menos el porcentaje de identidad definido con el fragmento correspondiente de SEC ID Nº: 1.

Son ejemplos de polipéptidos variantes proteínas de origen natural que resultan de acontecimientos de corte y empalme de ARNm alternativos o de escisión proteolítica de los polipéptidos descritos en el presente documento. Las variaciones atribuibles a la proteólisis incluyen, por ejemplo, diferencias en los extremos N o C tras la expresión en diferentes tipos de células huésped, debido a la retirada proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de los

polipéptidos de la invención. Los polipéptidos codificados por un ácido nucleico obtenido por mutación natural o artificial de un ácido nucleico de la invención, como se describe posteriormente, también están abarcados por la invención.

Las variantes polipeptídicas resultantes de una fusión de secuencias peptídicas adicionales en los extremos amino y carboxilo terminales también están abarcadas por los polipéptidos de la invención. En particular dicha fusión puede potenciar la expresión de los polipéptidos, ser útil en la purificación de la proteína o mejorar la actividad enzimática del polipéptido en un ambiente o sistema de expresión deseado. Dichas secuencias peptídicas adicionales pueden ser péptidos señal, por ejemplo. En consecuencia, la presente invención abarca variantes de los polipéptidos de la invención, tales como los obtenidos mediante fusión con otros oligo o polipéptidos y/o los que están unidos a péptidos señal. Los polipéptidos resultantes de una fusión con otra proteína funcional, tal como otra proteína de la ruta de biosíntesis de terpeno también están abarcados por los polipéptidos de la invención.

Como se ha mencionado anteriormente, el ácido nucleico que codifica el polipéptido de la invención es una herramienta útil para modificar organismos o células huésped no humanos que se pretenden usar cuando el procedimiento se lleva a cabo in vivo.

Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriormente descritas es por lo tanto también un objeto de la presente invención.

De acuerdo con una realización preferida, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos al menos 50%, preferentemente al menos 55%, preferentemente al menos 60%, preferentemente al menos 65%, preferentemente al menos 70%, preferentemente al menos 75%, preferentemente al menos 80%, preferentemente al menos 85%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95% y aún más preferentemente al menos 98% idéntica a SEC ID Nº: 2 o el complemento de la misma. De acuerdo con una realización más preferida, el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº: 2 o el complemento de la misma. De acuerdo con una realización aún más preferida, el ácido nucleico consiste en SEC ID Nº: 2 o el complemento de la misma.

De acuerdo con otra realización, el ácido nucleico se aísla de Clausena lansium.

Puede definirse que el ácido nucleico de la invención incluye polímeros desoxirribonucleotídicos o ribonucleotídicos en forma mono o bicatenaria (ADN y/o ARN). También debería entenderse que la expresión “secuencia de nucleótidos” comprende una molécula polinucleotídica o una molécula oligonucleotídica en forma de un fragmento separado o como un componente de un ácido nucleico mayor. Los ácidos nucleicos de la invención también abarcan ciertas secuencias de nucleótidos aisladas incluyendo las que están sustancialmente sin material endógeno contaminante. El ácido nucleico de la invención puede estar truncado, siempre que codifique un polipéptido abarcado por la presente invención, como se ha descrito anteriormente.

De acuerdo con una realización más preferida, el al menos un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores comprende una secuencia de nucleótidos que se ha obtenido modificando SEC ID Nº: 2. Preferentemente dicho ácido nucleico consiste en una secuencia de nucleótidos que se ha obtenido modificando SEC ID Nº: 2.

Los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia obtenida por mutación de SEC ID Nº: 2 o el complemento de la misma están abarcados por la invención, siempre que las secuencias que comprenden compartan al menos el porcentaje de identidad definido con los fragmentos correspondientes de SEC ID Nº: 2 o con el complemento de los mismos y siempre que codifiquen un polipéptido que tenga una actividad !-santaleno sintasa, como se ha definido en cualquiera de las realizaciones anteriores. Las mutaciones pueden ser cualquier tipo de mutaciones de estos ácidos nucleicos, tales como mutaciones puntuales, mutaciones de deleción, mutaciones de inserción y/o mutaciones de desplazamiento de fase. Puede prepararse un ácido nucleico variante para adaptar su secuencia de nucleótidos a un sistema de expresión específico. Por ejemplo, se sabe que los sistemas de expresión bacterianos expresan más eficazmente polipéptidos si los aminoácidos están codificados por un codón preferido. Debido a la degeneración del código genético, en la que más de un codón puede codificar el mismo aminoácido, múltiples secuencias de ADN pueden codificar el mismo polipéptido, abarcándose todas estas secuencias de ADN por la invención.

Otra herramienta importante para transformar organismos o células huésped adecuados para llevar a cabo el procedimiento de la invención in vivo es un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de acuerdo con cualquier realización de la invención. Dicho vector es por lo tanto también un objeto de la presente invención.

Un “vector de expresión” como se usa en el presente documento incluye cualquier vector recombinante lineal o circular incluyendo pero sin limitación vectores virales, bacteriófagos y plásmidos. El experto en la materia es capaz de seleccionar un vector adecuado de acuerdo con el sistema de expresión. En una realización, el vector de expresión incluye el ácido nucleico de la invención unido operativamente a al menos una secuencia reguladora, que controla la transcripción, traducción, inicio y terminación, tal como un promotor de la transcripción, operador o potenciador, o un sitio de unión ribosómico ARNm y, opcionalmente, incluyendo al menos un marcador de selección. Las secuencias de nucleótidos están “unidas operativamente” cuando la secuencia reguladora está relacionada funcionalmente con el ácido nucleico de la invención.

Los vectores de expresión de la presente invención pueden usarse en los procedimientos para preparar un organismo y/o célula huésped transformado genéticamente, en organismos y/o células huésped que albergan los ácidos nucleicos de la invención y en los procedimientos para producir o preparar polipéptidos que tengan una actividad !santaleno sintasa, como se desvela adicionalmente posteriormente.

Los organismos y células huésped no humanos recombinantes transformados para albergar al menos un ácido nucleico de la invención de modo que exprese o sobreexprese de forma heteróloga al menos un polipéptido de la invención también son herramientas muy útiles para llevar a cabo el procedimiento de la invención. Dichos organismos y células huésped no humanos son por lo tanto otro objeto de la presente invención.

Un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriormente descritas puede usarse para transformar los organismos y células huésped no humanos y el polipéptido expresado puede ser cualquiera de los polipéptidos anteriormente descritos.

Los organismos huésped no humanos de la invención pueden ser cualquier organismo multicelular o unicelular no humano. En una realización preferida, el organismo huésped no humano es una planta, un procariota o un hongo. Cualquier planta, procariota u hongo es adecuado para transformarse de acuerdo con la presente invención. Son plantas particularmente útiles las que producen de forma natural altas cantidades de terpenos. En una realización más preferida, la planta se selecciona de la familia de Solanaceae, Poaceae, Brassicaceae, Fabaceae, Malvaceae, Asteraceae o Lamiaceae. Por ejemplo, la planta se selecciona de los géneros Nicotiana, Solanum, Sorghum, Arabidopsis, Brassica (colza), Medicago (alfalfa), Gossypium (algodón), Artemisia, Salvia y Mentha. Preferentemente, la planta pertenece a la especie de Nicotiana tabacum.

En una realización más preferida el organismo huésped no humano es un microorganismo. Cualquier microorganismo es adecuado para la presente invención, pero de acuerdo con una realización aún más preferida dicho microorganismo es una bacteria o levadura. Más preferentemente, dicha bacteria es E. coli y dicha levadura es Saccharomyces cerevisiae.

También pueden transformarse células eucariotas superiores aisladas, en lugar de organismos completos. Como células eucariotas superiores los inventores entienden en el presente documento cualquier célula eucariota no humana excepto células de levadura. Las células eucariotas superiores preferidas son células vegetales o células fúngicas.

El término “transformado” se refiere al hecho de que el huésped se sometió a ingeniería genética para comprender una, dos o más copias de cada uno de los ácidos nucleicos requeridos en cualquiera de las realizaciones anteriormente descritas. Preferentemente el término “transformado” se refiere a huéspedes que expresan de forma heteróloga los polipéptidos codificados por el ácido nucleico con el que se transforman, así como que sobreexpresan dichos polipéptidos. En consecuencia, en una realización, la presente invención proporciona un organismo transformado, en el que los polipéptidos se expresan en mayor cantidad que en el mismo organismo no transformado de este modo.

Existen varios procedimientos conocidos en la técnica para la creación de organismos o células huésped transgénicos tales como plantas, hongos, procariotas o cultivos de células eucariotas superiores. Se describen vectores de clonación y expresión apropiados para su uso con huéspedes celulares bacterianos, fúngicos, de levadura, vegetales y mamíferos, por ejemplo, en Pouwels y col., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, Elsevier, Nueva York y Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Están disponibles para los expertos en la materia vectores de clonación y expresión para plantas superiores y/o células vegetales en particular. Véase por ejemplo Schardl y col. Gene 61: 1-11, 1987.

Los expertos en la materia están familiarizados con procedimientos para transformar organismos o células huésped para que alberguen ácidos nucleicos transgénicos. Para la creación de plantas transgénicas, por ejemplo, los procedimientos actuales incluyen: electroporación de protoplastos vegetales, transformación mediada por liposomas, transformación mediada por agrobacterium, transformación mediada por polietilenglicol, bombardeo de partículas, microinyección de células vegetales y transformación usando virus.

En una realización, el ADN transformado se integra en un cromosoma de un organismo y/o célula huésped no humano de modo que resulte un sistema recombinante estable. En la práctica de la invención puede usarse cualquier procedimiento de integración cromosómica conocido en la técnica, incluyendo pero sin limitación intercambio de casetes mediado por recombinasa (RMCE), inserción cromosómica específica de sitio viral, adenovirus e inyección pronuclear.

Para llevar a cabo el procedimiento de producción de !-santaleno in vitro, como se ha expuesto anteriormente en el presente documento, es muy ventajoso proporcionar un procedimiento para preparar al menos un polipéptido que tenga una actividad !-santaleno sintasa como se ha descrito en cualquier realización de la invención. Por lo tanto, la invención proporciona un procedimiento para producir al menos un polipéptido de acuerdo con cualquiera realización de la invención que comprende:

a) cultivar un organismo o célula huésped no humano transformado con el vector de expresión de la invención, de modo que albergue un ácido nucleico de acuerdo con la invención y exprese o sobreexprese un polipéptido de la invención;

b) aislar el polipéptido del organismo o célula huésped no humano cultivado en la etapa a).

De acuerdo con una realización preferida, dicho procedimiento comprende además, antes de la etapa a), transformar un organismo o célula huésped no humano con el vector de expresión de la invención, de modo que albergue un ácido nucleico de acuerdo con la invención y exprese o sobreexprese el polipéptido de la invención.

Puede usarse un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriormente descritas.

Puede llevarse a cabo transformación y cultivo del organismo o célula huésped no humano como se ha descrito anteriormente para el procedimiento de producir !-santaleno in vivo. La etapa b) puede realizarse usando cualquier técnica bien conocida en este campo para aislar un polipéptido particular de un organismo o célula.

Una “variante polipeptídica” como se menciona en el presente documento significa un polipéptido que tiene una actividad !-santaleno sintasa y que es sustancialmente homólogo del polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferente de la codificada por cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de la invención debido a una o más deleciones, inserciones o sustituciones.

Las variantes pueden comprender secuencias sustituidas de forma conservativa, lo que significa que un resto de aminoácido dado se reemplaza por un resto que tenga características fisioquímicas similares. Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen sustitución de un resto alifático por otro, tal como Ile, Val, Leu o Ala entre sí, o sustituciones de un resto polar por otro, tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn. Véase Zubay, Biochemistry, 1983, Addison-Wesley Pub. Co. Los efectos de dichas sustituciones pueden calcularse usando matrices de puntuación de sustitución tales como PAM-120, PAM-200 y PAM-250 como se analiza en Altschul, J. Mol. Biol., 1991, 219, 555-565. Se conocen bien otras de dichas sustituciones conservativas, por ejemplo sustituciones de regiones completas que tienen características de hidrofobicidad similares.

También están abarcadas por la invención variantes peptídicas de origen natural. Son ejemplos de dichas variantes proteínas que resultan de acontecimientos de corte y empalme de ARNm alternativos o de escisión proteolítica de los polipéptidos descritos en el presente documento. Las variaciones atribuibles a proteólisis incluyen, por ejemplo diferencias de los extremos N o C tras expresión en diferentes tipos de células huésped, debido a la retirada proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de los polipéptidos codificados por las secuencias de la invención.

Pueden usarse variantes de los polipéptidos de la invención para obtener por ejemplo actividad enzimática potenciada

o reducida deseada, regioquímica o estereoquímica modificada, o utilización de sustrato o distribución de producto alterada, afinidad por el sustrato aumentada, especificidad mejorada para la producción de uno o más compuestos deseados, velocidad aumentada de la reacción enzimática, mayor actividad o estabilidad en un ambiente específico (pH, temperatura, disolvente, etc.) o nivel de expresión mejorado en un sistema de expresión deseado. Puede realizarse un mutante dirigido o variante por cualquier procedimiento conocido en la técnica. Pueden obtenerse variantes y derivados de polipéptidos nativos aislando variantes de origen natural, o la secuencia de nucleótidos de variantes, de otra o la misma línea o especie vegetal, o mediante mutaciones de programación artificial de secuencias de nucleótidos que codifiquen los polipéptidos de la invención. Pueden conseguirse alteraciones de la secuencia de aminoácidos por cualquiera de varios procedimientos convencionales.

Pueden usarse variantes polipeptídicas resultantes de una fusión de secuencias peptídicas adicionales en los extremos amino y carboxilo terminal de los polipéptidos de la invención para potenciar la expresión de los polipéptidos, ser útil en la purificación de la proteína o mejorar la actividad enzimática del polipéptido en un ambiente

o sistema de expresión deseado. Dichas secuencias peptídicas adicionales pueden ser péptidos señal, por ejemplo. En consecuencia, la presente invención abarca variantes de los polipéptidos de la invención, tales como los obtenidos por fusión con otros oligo o polipéptidos y/o los que están unidos a péptidos señal. El polipéptido de fusión abarcado por la invención también comprende polipéptidos de fusión resultantes de una fusión u otras proteínas funcionales, tales como otras proteínas de la ruta de biosíntesis de terpeno.

Por lo tanto, en una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar un polipéptido variante que tenga una actividad !-santaleno sintasa, como se ha descrito en cualquiera de las realizaciones anteriores, y comprende las etapas de:

(a)

seleccionar un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las realizaciones expuestas anteriormente;

(b)

modificar el ácido nucleico seleccionado para obtener al menos un ácido nucleico mutante;

(c)

transformar células huésped y organismos unicelulares con la secuencia de ácido nucleico mutante para expresar un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico mutante;

(d)

explorar el polipéptido con respecto a al menos una propiedad modificada; y

(e)

opcionalmente, si el polipéptido no tiene actividad !-santaleno sintasa variante deseada, repetir las etapas de procedimiento (a) a (d) hasta que se obtenga un polipéptido con una actividad !-santaleno sintasa variante deseada;

(f)

opcionalmente, si se identificó un polipéptido que tenía una actividad !-santaleno sintasa variante deseada en la etapa (d), aislar el ácido nucleico mutante correspondiente obtenido de la etapa (c).

De acuerdo con una realización preferida, el polipéptido variante preparado es capaz de producir !-santaleno como un producto principal. De acuerdo con una realización aún más preferida, es capaz de producir una mezcla de sesquiterpenos en la que !-santaleno representa al menos el 60%, preferentemente al menos el 80%, preferentemente al menos el 90%, preferentemente al menos el 92% de los sesquiterpenos producidos.

De acuerdo con una realización más preferida, el polipéptido variante preparado tiene una actividad (+)-!-santaleno sintasa.

De acuerdo con una realización aún más preferida, el polipéptido variante preparado es capaz de producir (+)-!santaleno como un producto principal. De acuerdo con una realización aún más preferida, es capaz de producir una mezcla de sesquiterpenos en la que (+)-!-santaleno representa al menos el 60%, preferentemente al menos el 80%, preferentemente al menos el 90%, preferentemente al menos el 92% de los sesquiterpenos producidos.

En la etapa (b), puede crearse un gran número de secuencias de ácido nucleico mutantes, por ejemplo por mutagénesis aleatoria, mutagénesis específica de sitio o combinación de ADN. Los procedimientos detallados de combinación génica se encuentran en Stemmer, DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci U S A., 1994, 91(22): 10747-1075. En resumen, la combinación de ADN se refiere a un procedimiento de recombinación aleatoria de secuencias conocidas in vitro que implica al menos dos ácidos nucleicos seleccionados para recombinación. Por ejemplo pueden introducirse mutaciones en loci particulares sintetizando oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueados por sitios de restricción que permiten la ligación con fragmentos de la secuencia nativa. Después de la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución o deleción de aminoácidos deseada. Como alternativa, pueden emplearse procedimientos de mutagénesis específicos de sitio dirigidos por oligonucleótidos para proporcionar un gen alterado en el que los codones predeterminados pueden alterarse por sustitución, deleción o inserción.

En consecuencia, el polipéptido que comprende SEC ID Nº: 1 puede recombinarse con cualquier otro ácido nucleico que codifique sesquiterpeno sintasa, por ejemplo aislados de un organismo distinto de Clausena lansium. Por lo tanto, pueden obtenerse y separarse ácidos nucleicos mutantes, que pueden usarse para transformar una célula huésped de acuerdo con procedimientos convencionales, por ejemplo tales como se desvelan en los presentes ejemplos.

En la etapa (d), el polipéptido obtenido en la etapa (c) se explora con respecto a al menos una propiedad modificada, por ejemplo una actividad enzimática modificada deseada. Los ejemplos de actividades enzimáticas deseadas, para las que puede explorarse un polipéptido expresado, incluyen actividad enzimática potenciada o reducida, como se mide por el valor KM o Vmáx, regioquímica o estereoquímica modificada y utilización de sustratos o distribución de productos alterada. La exploración de la actividad enzimática puede realizarse de acuerdo con procedimientos familiares para los expertos en la materia y los desvelados en los presentes ejemplos.

La etapa (e) proporciona la repetición de las etapas de procedimiento (a)-(d), que pueden realizarse preferentemente en paralelo. En consecuencia, creando un número significativo de ácidos nucleicos mutantes, muchas células huésped pueden transformarse con diferentes ácidos nucleicos mutantes al mismo tiempo, permitiendo la exploración posterior de un número elevado de polipéptidos. Las posibilidades de obtener un polipéptido variante deseado pueden por lo tanto aumentar a la discreción del experto en la materia.

Todas las publicaciones mencionadas en la presente solicitud se incorporan por referencia para desvelar y describir los procedimientos y/o materiales en relación con los que se citan en las publicaciones.

Descripción de los dibujos

Figura 1: Secuencias de aminoácidos deducidas de los fragmentos de sesquiterpeno sintasas obtenidos de la secuenciación de la biblioteca de C. lansium y alineadas con la secuencia de aminoácidos de sesquiterpeno sintasa con el Nº de referencia de NCBI AAK54279. Figura 2: Comparación de los perfiles de producto obtenidos de E,E-FPP con las proteínas recombinantes Cont2-1, Cont2B_22, Cont2B_26 y Cont2B 29. El análisis se realizó mediante CG-EM y se muestran los cromatogramas iónicos totales. Figura 3: Identificación de !-santaleno por comparación del espectro de masas del pico en el tiempo de retención de 12,63 minutos y el espectro de masas de un patrón auténtico de !-santaleno.

Realizaciones específicas de la invención o Ejemplos

La invención se describirá ahora en más detalle mediante los siguientes Ejemplos.

Ejemplo 1

Material vegetal y construcción de biblioteca de ADNc

Se obtuvieron semillas de Clausena lansium (wampee) de granjeros localizados en la provincia de Hainan en China y particularmente en la ciudad de FuShan (Condado de ChengMai) y la ciudad de Yongxing (Ciudad de Haikou). Las

semillas se hicieron germinar y las plantas se cultivaron en un invernadero.

Se recogieron hojas jóvenes (de 1 a 2 cm de longitud) y se usaron para la construcción de una biblioteca de ADNc. Se extrajo ARN total de las hojas usando el Reactivo de ARN Vegetal Concert™ de Invitrogen (Carlsbad, CA) y el ARNm se purificó mediante cromatografía de afinidad de oligodT-celulosa usando el Kit de aislamiento de ARNm FastTrack® 2.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se construyó una biblioteca de ADNc de este ARNm y usando el Kit de amplificación de ADNc Marathon™ (Clontech, Mountain View, CA).

Ejemplo 2

Secuenciación paralela masiva de la biblioteca de ADNc de hoja de C. lansium

Los inventores usaron la tecnología de secuenciación paralela masiva de fragmentos de ADN pequeños desarrollada por Illumina (San Diego, California) para obtener información de secuencia de la biblioteca de ADNc completa preparada a partir de hojas pequeñas de wampee. Esta técnica de secuenciación usa una química de secuenciación basada en terminador reversible y los aparatos Estación de Grupos y Secuenciador Genómico desarrollados por Solexa e Illumina (www.illumina.com).

La biblioteca de ADNc (1 #g) se cargó en primer lugar en un gel de agarosa y se escindieron las bandas correspondientes a un tamaño entre 1,5 y 3 Kb, se eluyeron y se usaron para la secuenciación. Este enriquecimiento de tamaño evita la dilución de la biblioteca por algunos ADNc que codifican proteínas implicadas en el metabolismo primario (tales como por ejemplo la ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa) que están presentes con frecuencia en alta proporción en una biblioteca realizada a partir de tejidos vegetales y especialmente tejidos verdes. Los ADNc diana, que codifican sesquiterpeno sintasas, típicamente tienen un tamaño entre 1,8 y 2,5 Kb y están incluidos por lo tanto en la biblioteca de tamaño enriquecido.

La tecnología y equipamiento Illumina se preparó en Fasteris SA (Ginebra, Suiza) y se realizó la preparación de la muestra de ADN y la secuenciación por Fasteris SA. La biblioteca de ADNc se trató usando el Kit de Preparación de Muestras Genómicas (Illumina). Brevemente, el ADN se fragmenta por nebulización, los extremos se reparan para generar extremos romos, se ligan adaptadores a los extremos de los fragmentos de ADN y los fragmentos de ADN modificados por adaptador se amplifican por PCR. Después de controlar la calidad de la biblioteca por electroforesis en gel, se realiza la generación de los grupos de ADN en la celda de flujo y la reacción de secuenciación en los equipamientos de Estación de Grupos y Secuenciador Genómico. Usando esta tecnología, se obtuvieron 1,9 millones de secuencias cortas (lecturas) de al menos 35 bases.

El software Edena (Dr David Hernandez, Genomic Research Laboratory, Hospitales de la Universidad de Ginebra, Ginebra, Suiza, resultado no publicado) se usó para volver a ensamblar las secuencias contiguas. Las cinco últimas bases se retiraron en primer lugar de cada lectura debido a posibles incorporaciones erróneas debido a la menor fidelidad en los últimos ciclos del procedimiento de secuenciación. Se generaron varios conjuntos de contig (secuencias contiguas). Para cada conjunto, se conservaron los contig de longitud mínima de 50 bases. En primer lugar se ajustaron los parámetros del programa informático para permitir el ensamblaje con un solapamiento mínimo de 25 bases e identidad estricta (100%) o no estricta (emparejamiento erróneo de 2 bases). Se generaron por lo tanto dos conjuntos de 3634 y 3756 contig respectivamente. Se generó otro conjunto de 4540 contig permitiendo el ensamblaje con un mínimo de 18 bases y solapamiento no estricto. Las secuencias de los contig se usaron para buscar homología con terpeno sintasas en bases de datos de proteínas públicamente disponibles usando el algoritmo Blastx (Altschul y col, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). De los tres conjuntos de contig, se seleccionaron 14, 15 y 14 contig. A lo largo del análisis de las secuencias obtenidas de la biblioteca de ADNc de Clausena lansium, se observó homología de secuencia fuerte con secuencias de especies de cítricos, una observación coherente con la relación filogenética de Clausena lansium y especies de Cítricos (pertenecientes ambas a la familia Rutaceae). Por lo tanto, se usó el software Eland (Illumina) para buscar en lecturas no ensambladas identidad de secuencia de ADN con sesquiterpeno sintasas de cítrico (Nº de Referencia de NCBI CQ813507, CQ813505, CQ813508, CQ813506). A partir de este análisis, se seleccionaron 117 lecturas.

Los contig y las lecturas seleccionados se procesaron después usando el programa CAP (Huang, Genomics 14(1), 18-25, 1992) y se generaron nuevos contig. Después de la confirmación de homología de secuencia con sesquiterpeno sintasas, se conservaron 17 contig de longitud de 30 a 436 bases (véase SEC ID Nº: 3 a 19). Las secuencias deducidas se alinearon con una secuencia de sesquiterpeno sintasa de cítrico (la beta-farneseno sintasa de C. junos, Nº de referencia de NCBI AAK54279) para mapear su posición relativa a lo largo de una secuencia de sesquiterpeno sintasa de longitud completa y evaluar el número de ADNc de sesquiterpeno diferentes presentes (Figura 1). Se diseñó un conjunto de oligonucleótidos específicos de 6 de los 19 contig que surgen supuestamente de ADNc de sesquiterpeno sintasas diferentes.

Ejemplo 3

Amplificación de ADNc de sesquiterpeno sintasas de longitud completa

Los cebadores específicos de sesquiterpeno sintasas deducidos a partir de la secuenciación paralela masiva (Ejemplo 2) se usaron en combinación con cebadores adaptadores de ADNc en amplificaciones de PCR de tipo

3’/5’RACE. Las amplificaciones se realizaron usando la biblioteca de ADNc de C. lansium, preparada como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1, y la Mezcla de Polimerasa Advantage® 2 (Clontech) después del protocolo del Kit de Amplificación de ADNc Marathon™ (Clontech, Mountain View, CA). Las condiciones de termociclación fueron las siguientes: 1 minuto a 94 ºC, 32 ciclos de 1 minuto a 94 ºC y 3 minutos a 68 ºC, y 3 minutos a 68 ºC.

Usando el cebador FS2 cont2 F1 (SEC ID Nº: 20), se obtuvo una secuencia de ADN de 1049 pb. El análisis de las secuencias de varios clones obtenidos a partir de esta amplificación mostró que estaban presentes dos variantes de secuencia (Cont2 RACE F1 (SEC ID Nº: 23) y Cont2_RACE_F2 (SEC ID Nº: 25)) con 96% de identidad de secuencia. Cada una de las dos secuencias correspondía al extremo 3’ de un ADNc de sesquiterpeno sintasa y contenía una región codificante de 735 pb. Las dos secuencias de aminoácidos deducidas (SEC ID Nº: 24 y 26) tuvieron 92% de identidad de secuencia entre sí. Con el cebador FS2_cont2_R1 (SEC ID Nº: 21), se amplificó un fragmento de 1101 pb (Cont2_RACE_R, SEC ID Nº: 27)) que contenía el codón de partida y que codificaba los 349 aminoácidos N terminales del sesquiterpeno correspondiente al contig2. El alineamiento de las dos secuencias del 3’RACE (Cont2_RACE_F1 y Cont2_RACE_F2, SEC ID Nº: 23 y 25) con la secuencia del 5’RACE (cont2_RACE_R, SEC ID Nº: 27) mostró un solapamiento de 132 bases. En esta región solapante, las secuencias Cont2_RACE_F2 y Cont2_RACE_R (SEC ID Nº: 25 y 27) eran casi idénticas (una diferencia de una única base) mientras que se observaron diferencias de 9 bases entre las secuencias de Cont2_RACE_F1 y Cont2_RACE_R (SEC ID Nº: 23 y 27). Por lo tanto se usaron las secuencias Cont2_RACE_F2 (SEC ID Nº: 25) y Cont2_RACE_R (SEC ID Nº: 27) para reconstituir una secuencia de ADNc de longitud completa (Cont2_RACE_1, SEC ID Nº: 28) que codificaba una proteína de 551 aminoácidos (SEC ID Nº: 29).

Con el cebador FS2_Cont10_F (SEC ID Nº: 22) se obtuvieron dos secuencias de 1342 pb (Cont10_RACE_Fa y Cont10_RACE_Fb, SEC ID Nº: 30 y 31) que mostraban diferencias significativas (67 pb, que representa el 95% de la identidad de secuencia de ADN) y que sugerían la presencia de dos ADNc de sesquiterpeno sintasas estrechamente relacionados. Las dos secuencias contenían una región codificante de 1135 pb. Resulta interesante que la secuencia de Cont10_RACE_Fa (SEC ID Nº: 30) era 99,9% idéntica a la secuencia de Cont2_RACE_F2 (SEC ID Nº: 25, una diferencia de solamente 1 base en el alineamiento de 1 Kb) y la secuencia de Cont10_RACE_Fb (SEC ID Nº: 31) era 99% idéntica a la secuencia de Cont2_RACE_F1 (SEC ID Nº: 23, diferencia de solamente 8 bases en el alineamiento de 1 Kb), lo que sugiere por lo tanto que los fragmentos de ADN amplificados con los cebadores Cont2 y Cont10 permitían amplificaciones a partir de dos secuencias relacionadas sin verdadera diferenciación. Se diseñaron dos cebadores (Cont2_inicio (SEC ID Nº: 32) y Cont2_parada (SEC ID Nº: 33)), que son específicos de las regiones de los codones de inicio y de parada de las secuencias del 5’RACE y el 3’RACE de los fragmentos cont2 y cont10, para amplificar simultáneamente los dos o más ADNc de longitud completa correspondientes. El cebador Cont2_inicio (SEC ID Nº: 32) se extendió con la secuencia CACC para permitir la inserción directa en el plásmido pET101/D-TOPO (Invitrogen). La amplificación se realizó en primer lugar usando la Mezcla de Polimerasa Advantage® 2 (Clontech). Cada mezcla de PCR contenía, en un volumen total de 50 #l, 5 #l de Tampón de PCR Advantage® 2, dNTP 200 #M, 200 nM de cada cebador oligonucleotídico, 5 #l de ADNc diluido 100 veces y 1 #l de Mezcla de Polimerasa Advantage® 2. Las condiciones de termociclación fueron las siguientes: 2 minutos a 95 ºC; 35 ciclos de 30 segundos a 95 ºC, 30 segundos a 60 ºC y 4 minutos a 72 ºC; y 10 minutos a 72 ºC. Se realizó después un segundo ciclo de amplificación usando 5 #l del producto de PCR purificado del primer ciclo de amplificación y usando la ADN polimerasa Pfu (Promega), en un volumen final de 50 #l que contenía 5 #l de tampón 10X de ADN polimerasa Pfu, 200 #M de cada dNTP, 0,4 #M de cada cebador directo e inverso, 2,9 unidades de ADN polimerasa Pfu. Las condiciones de termociclación fueron idénticas a las condiciones usadas en el primer ciclo. Los productos de PCR purificados se ligaron en el vector pET1001/D-TOPO siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Se seleccionaron varios clones y después de secuenciar el inserto, se observaron algunas variaciones en las secuencias. Se seleccionaron los siguientes clones: Cont2-1 (SEC ID Nº: 2), Cont2B_22 (SEC ID Nº: 38), Cont2B_26 (SEC ID Nº: 39) y Cont2B_29 (SEC ID Nº: 40). Las secuencias de las proteínas codificadas por estos clones se proporcionan en SEC ID Nº: 1 y 41 a 43, respectivamente.

Ejemplo 4

Expresión heteróloga y actividades enzimáticas de las sesquiterpeno sintasas recombinantes.

Los plásmidos pET101 con Cont2_1 (SEC ID Nº: 2), Cont2B_22 (SEC ID Nº: 38), Cont2B_26 (SEC ID Nº: 39) y Cont2B_29 (SEC ID Nº: 40) preparados como se ha descrito en el Ejemplo 3 se usaron para transformar células E. coli Bl21(DE3). Se usaron colonias individuales de células transformadas para inocular 5 ml de medio LB. Después de 5 a 6 horas de incubación a 37 ºC, el cultivo se transfirió a un incubador a 20 ºC y se dejó durante 1 hora para equilibrado. Después se indujo expresión de la proteína mediante la adición de IPTG 1 mM y el cultivo se incubó durante una noche a 20 ºC. Al día siguiente, las células se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en 0,1 volúmenes de MOPSO 50 mM pH 7, glicerol al 10%, DTT 1 mM y se lisaron por sonicación. El extracto se aclaró por centrifugación (30 minutos a 20.000 g) y el sobrenadante que contenía la proteína soluble se usó para experimentos adicionales.

El extracto de proteína en bruto se usó para evaluar la actividad enzimática. El ensayo enzimático se realizó en un tubo de vidrio sellado con Teflón usando de 50 a 100 #l de extracto proteico en un volumen final de 1 ml de MOPSO 50 mM pH 7, glicerol al 10% complementado con DTT 1 mM, MgCl2 20 mM y E,E-farnesil difosfato (FPP) purificado de 50 a 200

#M (preparado como se describe en Keller y Thompson, J. Chromatogr 645(1), 161-167, 1993). El tubo se incubó de 18 a 24 horas a 30 ºC y los productos enzimáticos se extrajeron dos veces con un volumen de pentano. Después de concentración en un flujo de nitrógeno, el extracto se analizó por CG y se confirmó la identidad de los productos mediante CG-EM basándose en la concordancia de los índices de retención y espectros de masas de patrones auténticos. El análisis de CG-EM se realizó en un sistema de CG de Hewlett-Packard Serie 6890 equipado con un detector de ionización de llama usando una columna capilar SPB-1 de diámetro interno de 0,25 mm por 30 m (Supelco, Bellefonte, PA). El gas portador fue He a un flujo constante de 1,5 ml/minuto. La temperatura inicial del horno fue de 80 ºC seguido de un gradiente de 10 ºC/minuto hasta 280 ºC. Los espectros se registraron a 70 eV con una tensión multiplicadora de electrones de 2200V.

El ensayo reveló la formación de (+)-!-santaleno como un producto principal (92,7% de los sesquiterpenos totales producidos) y cantidades traza de cinco sesquiterpenos adicionales que representaban del 4,8 al 0,95% de los productos enzimáticos. (+)-!-santaleno se identificó con análisis CG-EM por coincidencia del espectro de masas y del índice de retención con los valores publicados (Joulain, D., y König, W. A. The Atlas of Spectral Data of Sesquiterpene Hydrocarbons, EB Verlag, Hamburgo, 1998). La identificación de (+)-!-santaleno se confirmó adicionalmente por 1H RMN, 13C RMN y mediante medición de la rotación óptica. Para producir suficientes cantidades para estas mediciones, el ensayo enzimático descrito anteriormente se aumentó de escala hasta 1 l. Los productos enzimáticos se extrajeron con un volumen igual de pentano, se concentraron y la fracción de hidrocarburos de sesquiterpeno (5,5 mg) se purificó mediante filtración en una columna de sílice corta. Se proporcionan en la Figura 2 datos espectrales obtenidos con Cont2_1.

El espectro de RMN se registró en un espectrómetro Bruker-Avance-500. Los datos de RMN son los siguientes:

1H RMN (500,13 MHz, CDCl3): ∃ 0,82 (s, 2H), 0,83 (s, 3H), 0,99 (s, 3H), 1,00-1,08 (m, 2H), 1,08-1,26 (m, 2H), 1,57-1,63 (m, 6H), 1,68 (s, 3H), 5,12 (t 3 q, J = 7,2, 1,4 Hz, 1H)

13C RMN (125,76 MHz, CDCl3) : ∃ 10,7 (q), 17,5 (q), 19,6 (d), 23,3 (t), 25,7 (q), 27,4 (s), 31,0 (t), 31,5 (t), 34,6 (t), 38,2 (d), 45,9 (s), 125,5 (d), 130,8 (s);

El hecho de que se produjera el estereoisómero (+)- !-santaleno se ha demostrado midiendo la rotación óptica (como

se mide en un polarímetro Perkin-elmer 241):

Ejemplo 5

Producción in vivo de (+)-!-santaleno en E. coli

El uso de la santaleno sintasa de C. lansium para la producción in vivo de sesquiterpenos en células de E. coli se evaluó co-expresando la sesquiterpeno sintasa con una FPP sintasa y las enzimas de una ruta biosintética de cuatro etapas que permitía la conversión de mevalonato a FPP. Los genes de la ruta de mevalonato se organizaron en un único operón y codificaban una mevalonato quinasa (mvaK1), una fosfomevalonato quinasa (mvaK2), una mevalonato difosfato descarboxilasa (MvaD) y una isopentenil difosfato isomerasa (idi), convirtiendo todas las enzimas mevalonato exógeno en isopentenil difosfato (IPP) y dimetilalil difosfato (DMAPP), los dos sustratos de la FPP sintasa. La co-expresión de esta ruta de mevalonato parcial se usó para aumentar la cantidad de FPP intracelular disponible para la sesquiterpeno sintasa y de este modo las cantidades de sesquiterpeno producido.

El gen de FPP sintasa de levadura (número de Referencia J05091) se amplificó a partir de ADN genómico de S. cerevisiae usando los cebadores FPPy NcoI (SEC ID Nº: 34) y FPPy-Eco (SEC ID Nº: 35). El ADN genómico se aisló de S. cerevisiae usando el Kit Maxi de ARN/ADN de Qiagen (Qiagen AG, Basilea, Suiza). La PCR se realizó con la ADN polimerasa Pfu (Promega AG, Dubendorf, Suiza) en un volumen final de 50 #l que contenía 0,4 #l de cada cebador, dNTP 200 #M, 0,5 #l de ADN polimerasa, 5 #l de ADN genómico de S. cerevisiae. Las condiciones de ciclación de PCR fueron las siguientes: 90 segundos a 95 ºC; 28 ciclos de 45 segundos a 95 ºC, 30 segundos a 54 ºC y 4 minutos a 72 ºC; 10 minutos a 72 ºC. El ADN amplificado se ligó como fragmento NdeI-EcoRI en el primer sitio de clonación múltiple (MCS1) del plásmido pACYCDuet-1 (Novagen, Madison, WI) que proporciona el plásmido pACYCDuet-FPP que alberga el gen de FPP bajo el control de un promotor T7.

Se amplificó un operón que contenía los genes que codifican mvaK1, mvaK2, MvaD e idi a partir de ADN genómico de Streptococcus pneumoniae (ATCC BAA-334, LGC Standards, Molsheim, Francia) con los cebadores MVA-up1inicio (SEC ID Nº: 36) y MVA-up2-parada (SEC ID Nº: 37). La PCR se realizó usando la ADN polimerasa PfuUltra™ II Fusion HS (Stratagene, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, Estados Unidos). La composición de la mezcla de PCR fue de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las condiciones de termociclación fueron 2 minutos a 95 ºC; 30 ciclos de 20 segundos a 95 ºC, 20 segundos a 58 ºC y 90 segundos a 72 ºC; y 3 minutos a 72 ºC. El fragmento de 3,8 Kb se purificó en un gel de agarosa y se ligó usando el Kit de Clonación de PCR In-Fusion™ Dry-Down (Clontech Laboratories) en el segundo MCS del plásmido pACYCDuet-FPPs digerido con NdeI y XhoI que proporciona el plásmido pACYCDuet-4506. Las secuencias de los dos insertos se secuenciaron completamente para excluir cualquier mutación.

Se transformaron células E. coli BL21 Star™ (DE3) (Invitrogen, Carlsbad, CA) con los plásmidos pET101-cont2 1 (SEC ID Nº: 2) preparados como se ha descrito en el Ejemplo 3 y con el plásmido pACYCDuet-4506. Las células transformadas se seleccionaron en placas de LB-agarosa de carbenicilina (50 #g/ml) y cloranfenicol (34 #g/ml). Se usaron colonias individuales para inocular 5 ml de medio LB líquido complementado con los mismos antibióticos. El 5 cultivo se incubó durante una noche a 37 ºC. Al día siguiente se inocularon 2 ml de medio TB complementado con los mismos antibióticos con 0,2 ml del cultivo de una noche. Después de 6 horas de incubación a 37 ºC, el cultivo se enfrió a 28 ºC y se añadió IPTG 1 mM, mevalonato 2 mg/ml (preparado disolviendo mevalonolactona (Sigma) en NaOH 0,5 N a una concentración de 1 g/ml e incubando la solución durante 30 minutos a 37 ºC) y 0,2 ml de decano a cada tubo. Los cultivos se inocularon durante 48 horas a 28 ºC. Los cultivos se extrajeron después dos veces con dos

10 volúmenes de etil-acetato, la fase orgánica se concentró a 500 #l y se analizó mediante CG-EM como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 4. En estas condiciones las células produjeron (+)-!-santaleno a 250 mg/l de cultivo en 48 horas.

Este ejemplo muestra que una célula E. coli transformada con una !-santaleno sintasa, como se ha definido en la presente invención, es capaz de producir !-santaleno. Las otras enzimas con las que se transforma la célula E. coli

15 no son esenciales para la producción de !-santaleno. De hecho !-santaleno también se produce cuando se transforma una célula E. coli solamente con la !-santaleno sintasa, pero en cantidades menores. Las otras enzimas con las que se transforma la célula E. coli se añaden con el único fin de aumentar la cantidad de precursor disponible para la !-santaleno sintasa.

LISTADO DE SECUENCIAS 20

<110> Firmenich SA

<120> Procedimiento de producción de (+)-alfa-santaleno

<130> 7280 25

<160> 43

<170> PatentIn versión 3.5

30 <210> 1

<211> 551

<212> PRT

<213> Clausena lansium

35 <400> 1

<210> 2

<211> 1656

<212> ADN

<213> Clausena lansium

<400> 2

<210> 3

<211> 211

<212> ADN

<213> Clausena lansium

<400> 3

<210> 4

<211> 436

<212> ADN 15 <213> Clausena lansium

<400> 4 <210> 5

<211> 71 5 <212> ADN

<213> Clausena lansium

<400> 5

<210> 6

<211> 133

<212> ADN 15 <213> Clausena lansium

<400> 6

20

<210> 7

<211> 172

<212> ADN

<213> Clausena lansium

25

<400> 7

30 <210> 8

<211> 73

<212> ADN

<213> Clausena lansium

35 <400> 8

5

<210> 9 <211> 46 <212> ADN <213> Clausena lansium

10 15

<400> 9 actgcttttc ctgtggcttt aattgagaga cctttcaata tcgcac <210> 10 <211> 47 <212> ADN <213> Clausena lansium <400> 10 cacttcttat gcgaattctc aatcttacgc gcgttataga tgtcatt 46 47

20

<210> 11 <211> 44 <212> ADN <213> Clausena lansium

25

<400> 11 ccagaaggaa ctcggtgaca tttcaaggtg gtggaaagaa ttag 44

30

<210> 12 <211> 42 <212> ADN <213> Clausena lansium

<400> 12 gcatggaatg agttccggaa acaagtttca aatgcctgga ag

42

35

<210> 13 <211> 39 <212> ADN <213> Clausena lansium

40

<400> 13 taatcgtgct gaacaaatta atcatgctct cgactgtcc 39

45

<210> 14 <211> 38 <212> ADN <213> Clausena lansium

50 55

<400> 14 aagtatgaag atggctacac tcattctgca gttgtgct <210> 15 <211> 38 <212> ADN <213> Clausena lansium <400> 15 ttttagatga agcaattgtt ttcacgacca ctcacctt 38 38

60

<210> 16 <211> 37 <212> ADN <213> Clausena lansium

<400> 16 cctggaagga tataaacgag gagtgcctac gcccaac

37

5

<210> 17 <211> 30 <212> ADN <213> Clausena lansium

<400> 17 acaccttttg ttggcatggg agacattgta

30

15

<210> 18 <211> 30 <212> ADN <213> Clausena lansium

<400> 18 gagggcacgt tgcctcaagc gtagagtgtt

30

<210> 19 <211> 30 <212> ADN <213> Clausena lansium

25

<400> 19 cgactgctta ggcagcaagg atttaaggtt 30

<210> 20 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial

35

<220> <223> Cebador <400> 20 cttgagaccc tcgtagatga tacatttgac g 31

<210> 21 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial

45

<220> <223> Cebador

<400> 21 gtatgatctt ccttcctttg ccagttcttc c

31

<210> 22 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial

55

<220> <223> Cebador

<400> 22 gatgaagcaa ttgttttcac gaccactcac c

31

65

<210> 23 <211> 1049 <212> ADN <213> Clausena lansium <400> 23

<210> 24 5 <211> 245

<212> PRT

<213> Clausena lansium

<400> 24 10

<210> 25

<211> 906

<212> ADN

<213> Clausena lansium

<400> 25

<210> 26

<211>

245 <212> PRT 15 <213> Clausena lansium

<400> 26

<210> 27

<211> 1101

<212> ADN

<213> Clausena lansium

<400> 27

<210> 28

<211> 1875

<212> ADN

<213> Clausena lansium

<400> 28

<210> 29

<211> 551

<212> PRT

<213> Clausena lansium

<400> 29

<210> 30

<211>

1368 5 <212> ADN

<213> Clausena lansium

<220>

<221>

misc_feature 10 <222> (1346)..(1346)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221>

misc_feature 15 <222> (1357)..(1357)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221>

misc feature 20 <222> (1362)..(1362)

<223> n es a, c, g o t

<400> 30

<210> 31

<211> 1372 5 <212> ADN

<213> Clausena lansium

<220>

<221>

misc_feature 10 <222> (1356) .. (1356)

<223> n es a, c g o t

<220>

<221>

misc_feature 15 <222> (1366)..(1366)

<223> n es a, c g o t

<400> 31 <210> 32

<211> 31 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador 10

<400> 32 caccatgtca actcaacaag tttcatcaga g 31

<210>

33 15 <211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<210>

39 5 <211> 1656

<220> <223> Cebador

5

<400> 33 actttaatcg tcaagcttaa cggggtc 27

10

<210> 34 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Cebador

15

<400> 34 ctagccatgg cttcagaaaa agaaattagg 30

20

<210> 35 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial

25

<220> <223> Cebador <400> 35 ccggaattcc tatttgcttc tcttgtaaac tttgttcaag 40

30

<210> 36 <211> 42 <212> ADN <213> Artificial

35

<220> <223> Cebador

<400> 36 aaggagatat acatatgaca aaaaaagttg gtgtcggtca gg

42

40

<210> 37 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial

45

<220> <223> Cebador

50 55

<400> 37 ctttaccaga ctcgagttac gcctttttca tctgatcctt tgc <210> 38 <211> 1656 <212> ADN <213> Clausena lansium <400> 38 43

<212> ADN

<213> Clausena lansium

<400> 39 10

<210> 40

<211> 1656

<212> ADN

<213> Clausena lansium

<400> 40

<210> 41

<211> 551

<212> PRT

<213> Clausena lansium

<400> 41

<210> 42

<211> 551

<212> PRT

<213> Clausena lansium

<400> 42

<210> 43

<211> 551

<212> PRT

<213> Clausena lansium

<400> 43

Claims (51)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un procedimiento de producción de !-santaleno que comprende

   a) poner en contacto FPP (farnesil pirofosfato) con al menos un polipéptido que tiene una actividad !-santaleno sintasa y que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 50% idéntica a SEC ID Nº: 1; b) opcionalmente, aislar el !-santaleno producido en la etapa a).

2. 2.

   El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa a) comprende cultivar un organismo o célula huésped no humano capaz de producir FPP y transformado para expresar al menos un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 50% idéntica a SEC ID Nº: 1 y que tiene una actividad !-santaleno sintasa, en condiciones que conducen a la producción de !-santaleno.

3. 3.

   El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el procedimiento comprende además, antes de la etapa a), transformar un organismo o célula huésped no humano capaz de producir FPP con al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 50% idéntica a SEC ID Nº: 1 y que tiene una actividad !-santaleno sintasa, de modo que dicho organismo exprese dicho polipéptido.

4. 4.

   El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el al menos un ácido nucleico que codifica la !-santaleno sintasa comprende una secuencia de nucleótidos al menos 50%, preferentemente al menos 70%, preferentemente al menos 90% idéntica a SEC ID Nº: 2 o el complemento de la misma.

5. 5.

   El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº: 2 o el complemento de la misma.

6. 6.

   El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el ácido nucleico consiste en SEC ID Nº: 2 o el complemento de la misma.

7. 7.

   El procedimiento de la reivindicación 3 o 4, en el que el al menos un ácido nucleico usado en cualquiera de las realizaciones anteriores comprende una secuencia de nucleótidos que ha sido obtenida modificando SEC ID Nº: 2 o el complemento de la misma.

8. 8.

   El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que el organismo huésped no humano es una planta, un procariota o un hongo.

9. 9.

   El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que el organismo huésped no humano es un microorganismo, preferentemente una bacteria o una levadura.

10. 10.

    El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicha bacteria es E. coli y dicha levadura es Saccharomyces cerevisiae.

11. 11.

    El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que la célula huésped no humana es una célula vegetal o una fúngica.

12. 12.

    El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, de producción de !-santaleno como un producto principal.

13. 13.

    El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el !-santaleno representa al menos el 60%, preferentemente al menos el 80%, preferentemente al menos el 90% de los sesquiterpenos obtenidos.

14. 14.

    El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, de producción de (+)-!-santaleno y en el que el polipéptido que tiene una actividad !-santaleno sintasa tiene una actividad (+)-!-santaleno sintasa.

15. 15.

    El procedimiento de la reivindicación 14, en el que se obtiene (+)-!-santaleno como un producto principal.

16. 16.

    El procedimiento de la reivindicación 15, en el que (+)-!-santaleno representa al menos el 60%, preferentemente al menos el 80%, preferentemente al menos el 90% de los sesquiterpenos obtenidos.

17. 17.

    El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el al menos un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos 70%, preferentemente al menos 90% idéntica a SEC ID Nº: 1.

18. 18.

    El procedimiento de la reivindicación 17, en el que el al menos un polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 1.

19. 19.

    El procedimiento de la reivindicación 18, en el que el al menos un polipéptido consiste en SEC ID Nº: 1.

20. 20.

    El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o 7 a 17, en el que el al menos un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que ha sido obtenida modificando SEC ID Nº: 1.

21. 21.

    Un polipéptido que tiene una actividad !-santaleno sintasa y que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 50% idéntica a SEC ID Nº: 1.

22. 22.

    El polipéptido de la reivindicación 21, en el que dicho polipéptido es capaz de producir !-santaleno como un producto principal.

23. 23.

    El polipéptido de la reivindicación 22, en el que dicho polipéptido es capaz de producir una mezcla de sesquiterpenos en la que !-santaleno representa al menos el 60%, preferentemente al menos el 80%, preferentemente al menos el 90% de los sesquiterpenos producidos.

24. 24.

    El polipéptido de la reivindicación 21, en el que dicho polipéptido tiene una actividad (+)-!-santaleno sintasa.

25. 25.

    El polipéptido de la reivindicación 24, en el que dicho polipéptido es capaz de producir (+)-!-santaleno como un producto principal.

26. 26.

    El polipéptido de la reivindicación 25, en el que dicho polipéptido es capaz de producir una mezcla de sesquiterpenos en la que (+)-!-santaleno representa al menos el 60%, preferentemente al menos el 80%, preferentemente al menos el 90% de los sesquiterpenos producidos.

27. 27.

    El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos 70%, preferentemente al menos 90% idéntica a SEC ID Nº: 1.

28. 28.

    El polipéptido de la reivindicación 27, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 1.

29. 29.

    El polipéptido de la reivindicación 28, en el que dicho polipéptido consiste en SEC ID Nº: 1.

30. 30.

    El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 21 a 27, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que ha sido obtenida modificando SEC ID Nº: 1.

31. 31.

    Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 30.

32. 32.

    El ácido nucleico de la reivindicación 31, que comprende una secuencia de nucleótidos al menos 50%, preferentemente al menos 70%, preferentemente al menos 90% idéntica a SEC ID Nº: 2 o el complemento de la misma.

33. 33.

    El ácido nucleico de la reivindicación 32, que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº: 2 o el complemento de la misma.

34. 34.

    El ácido nucleico de la reivindicación 33, que consiste en SEC ID Nº: 2 o el complemento de la misma.

35. 35.

    El ácido nucleico de la reivindicación 31 o 32, que comprende una secuencia de nucleótidos que se ha obtenido modificando SEC ID Nº: 2 o el complemento de la misma.

36. 36.

    Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35.

37. 37.

    El vector de expresión de la reivindicación 36, en forma de un vector viral, un bacteriófago o un plásmido.

38. 38.

    El vector de expresión de la reivindicación 36 o 37, que incluye el ácido nucleico de la invención unido operativamente al menos a una secuencia reguladora que controla la transcripción, inicio o terminación de la traducción, tal como un promotor transcripcional, operador o potenciador o un sitio de unión ribosómico de ARNm y, opcionalmente, que incluye al menos un marcador de selección.

39. 39.

    Un organismo o célula huésped no humano transformado para albergar al menos un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35, de modo que exprese de forma heteróloga o sobreexprese al menos un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 30.

40. 40.

    El organismo huésped no humano de la reivindicación 39, en el que dicho organismo huésped no humano es una planta, un procariota o un hongo.

41. 41.

    El organismo huésped no humano de la reivindicación 39, en el que dicho organismo huésped no humano es un microorganismo, preferentemente una bacteria o levadura.

42. 42.

    El organismo huésped no humano de la reivindicación 41, en el que dicha bacteria es E. coli y dicha levadura es Saccharomyces cerevisiae.

43. 43.

    La célula eucariota superior de la reivindicación 39, en la que dicha célula eucariota superior es una célula vegetal o una célula fúngica.

44. 44.

    Un procedimiento de producción de al menos un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones

    21 a 30 que comprende

    a) cultivar un organismo o célula huésped no humano transformado con el vector de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38, de modo que albergue un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35 y exprese o sobreexprese un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 30; b) aislar el polipéptido del organismo o célula huésped no humano cultivado en la etapa a).

45. 45.

    El procedimiento de la reivindicación 44, que comprende además, antes de la etapa a), transformar un organismo o célula huésped no humano con el vector de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38, de modo que albergue un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35 y exprese o sobreexprese el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 21 a 30.

46. 46.

    Un procedimiento de preparaación de un polipéptido variante que tiene actividad !-santaleno sintasa que comprende las etapas de:

    (a)

    seleccionar un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35;

    (b)

    modificar el ácido nucleico seleccionado para obtener al menos un ácido nucleico mutante;

    (c)

    transformar células u organismos unicelulares huésped con la secuencia de ácido nucleico mutante para expresar un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico mutante;

    (d)

    explorar el polipéptido con respecto a al menos una propiedad modificada; y

    (e)

    opcionalmente, si el polipéptido no tiene actividad !-santaleno sintasa variante deseada, repetir las etapas de procedimiento (a) a (d) hasta que se obtenga un polipéptido con una actividad !-santaleno sintasa variante deseada;

    (f)

    opcionalmente, si se identificó un polipéptido que tenía una actividad !-santaleno sintasa variante deseada en la etapa (d), aislar el ácido nucleico mutante correspondiente obtenido en la etapa (c).

47. 47.

    Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 46, en el que el polipéptido variante preparado es capaz de producir !-santaleno como un producto principal.

48. 48.

    Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 47, en el que el polipéptido variante preparado es capaz de producir una mezcla de sesquiterpenos en la que !-santaleno representa al menos el 60%, preferentemente al menos el 80%, preferentemente al menos el 90% de los sesquiterpenos producidos.

49. 49.

    Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 46, en el que el polipéptido variante preparado tiene una actividad (+)-!-santaleno sintasa.

50. 50.

    Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 49, en el que el polipéptido variante preparado es capaz de producir (+)-!-santaleno como un producto principal.

51. 51.

    Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 50, en el que el polipéptido variante preparado es capaz de producir una mezcla de sesquiterpenos en la que (+)-!-santaleno representa al menos el 60%, preferentemente al menos el 80%, preferentemente al menos el 90% de los sesquiterpenos producidos.