ES2413804T3 - Inhibición mediada por ARNi de estados relacionados con factor de necrosis tumoral-alfa - Google Patents

Inhibición mediada por ARNi de estados relacionados con factor de necrosis tumoral-alfa Download PDF

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Abstract

Un ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleotides, en donde el ARN de interferenciatiene como diana un ARNm que corresponde a una cualquiera de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 14- SEQ IDNO: 58, y SEQ ID NO: 155- SEQ ID NO: 201, para su uso en el tratamiento o la prevencion de un estadoocular relacionado con TNFa en un sujeto que lo necesita, en donde dicho estado es ojo seco, conjuntivitisalergica o inflamed& ocular.

Description

InhibiciOn mediada por ARNi de estados relacionados con factor de necrosis tumoral-a Campo de la invention La presente invenciOn se refiere al campo de composiciones de ARN de interferencia para silenciar el factor de 5 necrosis tumoral-a (TNFa) silenciando el ARNm del receptor de TNF de superficie celular 1 de TNFa. (TNFR1), o el ARNm de la enzima convertidora de TNFa (TACE/ADAM17). El silenciamiento de tales dianas de TNFa es ntil para el tratamiento de pacientes que tienen un estado relacionado con TNFa o corren el riesgo de desarrollar un estado de este tipo. Antecedentes de la invencion 10 La inflamaci6n se trata generalmente con un regimen antiinflamatorio convendonal que incluye esteroides y/o farmacos anfiinflamatorios no esteroideos (AINE). La conjuntivitis alergica, inflamacion ocular, dermatitis, rinitis y asma se han tratado histOricamente con un regimen de antihistaminicos orates, intranasales o tOpicos ademas de o esteroides orales o intranasales. Normalmente, un tratamiento sistemico requiere que se administren concentraciones superiores del compuesto farmacologico para proporcionar una concentraci6n eficaz para alcanzar 15 elsifio de tratamiento necesario Se sabe que los compuestos antihistaminicos tienen actividad en el sistema nervioso central; la somnolencia y el secado de las membranas mucosas son un efecto secundario corn& del uso de antihistaminicos. Los AINE y esteroides tienen posibles efectos secundarios incluyendo aumento de la presion intraocular, catarata, glaucoma o queratitis ulcerativa peritonea. El ojo seco, tambien conocido como conjunfivitis seca o queratoconjunfivitis seca, es un trastorno oftalmoldgico 20 comOn que implica descomposici6n de la pelicula de lagnmas preocular, dando como resultado la deshidrataciOn de superficie externa expuesta del ojo. Hasta la fecha, el ojo seco se ha tratado con administraci6n t6pica de disoluciones de lagrimas adificiales. Algunas de estas disoluciones contienen sustancias mucomimeticas para reemplazar o reponer temporalmente la capa de mucina en pacientes deficientes en mucina. Se ha propuesto el uso de metilprednisolona en un tratamiento de "pulso" a corto plazo para tratar empeoramientos del ojo seco. Se 25 requiere que la terapia de "pulso" propuesta evite complicaciones asociadas con la terapia con esteroides tradicional para estados inflamatorios tales como presiOn intraocular aumentada y formacion de cataratas. La citocina TNFa es una diana para la terapia antiinflamatoria de ojo seco y uveitis. En un modelo de conejo de ojo seco inducido por inflamacion de las glandulas lagrimales, se han logrado a inhibici6n de la pigmentaci6n de la cornea y la restauracion de tiempo de ruptura lagrimal mediante la modulacion especifica de los niveles de TNFa. de 30 lasuperficial ocular. La terapia de ojo seco resulto inhibiendo la sintesis de TNFa (RDP58) o neutralizando especificamente TNFa usando un anticuerpo monoclonal (REMICADEO) o un receptor soluble (ENBREL®). Cada uno de estos tratamientos dirigidos a TNFa dio como resultado niveles de eficacia obtenidos con esteroides antiinflamatorios oculares tOpicos. La publicacion de patente estadounidense 2005/0227935, publicada el 13 de octubre de 2005, concedida a 35 McSwiggen eta/. se refiere a inhibition mediada por ARN de interferencia de TNF y la expresiOn genica del receptor de TNF. Sin embargo, dicha publicaciOn no ensena ninguna de las secuencias diana particulares para la interferencia de ARN tal como se proporciona en el presente documento. Lindstedt etal.2005 (The British Journal of Ophtalmology 89(5):533-536) describen la inhibition de TNFa mediante anticuerpos y el uso de tales anticuerpos en el tratamiento de inflamacion ocular 40 Las realizaciones de la presente invencidin abordan la necesidad en la tecnica de tratamientos adicionales para el ojo seco y la inflamaci6n y proporcionan terapias alternativas para los mismos. Sumario de la invencion La presente invenci6n proporciona intervenciOn, prevencion o tratamiento altamente potente y eficaz de un estado ocular relacionado con TNFa sin efectos secundarios asociados a AINE o esteroides, en el que dicho estado ocular 45 relacionado con TNFa es ojo seco, conjuntivitis alergica o inflamaciOn ocular. En un aspecto, la invencien incluye tratar a un sujeto que tiene un estado ocular relacionado con TNFa o que corre el riesgo de desarrollar un estado ocular relacionado con TNFa administrando ARN de interferencia que silencia la expresion del ARtstrn de TACE o ARNm de TNFR1, interfiriendo asi con el procesamiento proteolitico del precursor para TNFa, o interfiriendo con la union de TNFa a su receptor de superficie celular, respectivamente, atenuando de ese modo la actividad de TNFa e 50 impidiendo una cascada de acontecimientos relacionados con apoptosis e inflamacidn, en el que dicho estado ocular relacionado con TNFa es ojo seco, conjuntivitis alergica o inflamaciOn ocular. Tal como se describe en el presente documento, estado relacionado con TNFa incluye estados tales como ojo seco y estados infiamatorios relacionados con TNFa. Tal como se describe adicionalmente en el presente documento, estado inflamatorio relacionado con TNFa incluye estados tales como inflamacien ocular, conjuntivitis alergica, 2
dermatitis, rinitis y asma, por ejemplo, e incluye los cambios celulares que resultan de la actividad de TNFa que conduce directa o indirectamente al estado inflamatorio relacionado con TNFa. Un estado relacionado con TNFa incluye particularmente estados oculares relacionados con TNFa tales como ojo seco, conjuntivitis alérgica e inflamación ocular. El ARN de interferencia descrito en el presente documento proporciona el silenciamiento de las
5 dianas de TNFa ARNm de TACE o ARNm de TNFRl mientras que se evitan efectos secundarios no deseados debidos a agentes no específicos.
En el presente documento se describe un método de atenuación de la expresión del ARNm de TACE de un sujeto. El método comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad eficaz de ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y un portador farmacéuticamente aceptable,
10 comprendiendo el ARN de interferencia una región de al menos 13 nucleótidos contiguos que tiene una complementariedad de secuencia de al menos el 90% con, o una identidad de secuencia de al menos el 90% con, los 13 penúltimos nucleótidos del extremo 3' de un ARNm que corresponde a una cualquiera de SEO ID NO: 3, SEO ID NO: 14 -SEO ID NO: 58 y SEO ID NO: 155 -SEO ID NO: 201. La expresión de ARNm de TACE se atenúa de ese modo.
15 En el presente documento se describe también el tratamiento de un estado relacionado con TNFa en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad eficaz de ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos, y un portador farmacéuticamente aceptable, en el que el ARN de interferencia comprende una región de al menos 13 nucleótidos contiguos que tiene una complementariedad de secuencia de al menos el 90% con, o una identidad de secuencia de al menos el 90% con,
20 los 13 penúltimos nucleótidos del extremo 3' de un ARNm que corresponde a una cualquiera de SEO ID NO: 3, SEO ID NO: 14 -SEO ID NO: 58 y SEO ID NO: 155 -SEO ID NO: 201. El estado relacionado con TNFa se trata de ese modo.
En el presente documento se describe además un método de atenuación de la actividad de TNFa de un sujeto atenuando la expresión de ARNm de TACE o ARNm de TNFRl del sujeto, que comprende administrar al sujeto una 25 composición que comprende una cantidad eficaz de ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y un portador farmacéutica mente aceptable y el ARN de interferencia comprende una hebra de nucleótidos sentido, una hebra de nucleótidos antisentido y una región de complementariedad contigua al menos casi perfecta de al menos 19 nucleótidos en el que la hebra antisentido se hibrida en condiciones fisiológicas con una parte del ARNm que corresponde a SEO ID NO: 1 que comprende el nucleótido 297, 333, 334, 335, 434, 470,
493, 547, 570, 573, 618, 649, 689, 755, 842, 844, 846, 860, 878, 894, 900, 909, 910, 913, 942, 970, 984, 1002, 1010, 1053, 1064, 1137, 1162, 1215, 1330, 1334, 1340, 1386, 1393, 1428, 1505, 1508, 1541, 1553, 1557, 1591, 1592, 1593, 1597, 1604, 1605, 1626, 1632, 1658, 1661, 1691 , 1794, 1856, 1945, 1946, 1947, 1958, 2022, 2094, 2100, 2121, 2263, 2277, 2347, 2349, 2549, 2578, 2595, 2606, 2608, 2629, 2639, 2764, 2766, 2767, 2769, 3027, 3028, 3261, 3264, 3284, 3313, 3317, 3332 ó 3337 o en el que la hebra antisentido se hibrida en condiciones
35 fisiológicas con una parte del ARNm que corresponde a SEO ID NO: 2 que comienza en el nucleótido 124, 328, 387, 391, 393, 395, 406, 421, 423, 444, 447, 455, 459, 460, 467, 469, 470, 471, 475, 479, 513, 517, 531, 543, 556, 576, 587, 588, 589, 595, 601, 602, 611, 612, 651, 664, 667, 668, 669, 677, 678, 785, 786, 788, 791, 792, 804, 813, 824, 838, 843, 877, 884, 929, 959, 960, 961 , 963, 964, 965, 970, 973, 974, 1000, 1002, 1013, 1026, 1053, 1056, 1057, 1058, 1161, 1315, 1318, 1324, 1357, 1360, 1383, 1393, 1420, 1471, 1573, 1671, 2044, 2045, 2046, 2047, 2048,
40 2089, 2090, 2091, 2092 ó 2098. La expresión de ARNm de TACE se atenúa cuando la hebra antisentido se hibrida con una parte del ARNm que corresponde a SEO ID NO: 1 tal como se mencionó anteriormente. La expresión de ARNm de TNFRl se atenúa cuando la hebra antisentido se hibrida con una parte del ARNm que corresponde a SEO ID NO: 2 tal como se mencionó anteriormente.
En el presente documento se describe además el tratamiento de un estado relacionado con TNFa en un sujeto que
lo necesita, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad eficaz de ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos, y un portador farmacéuticamente aceptable, comprendiendo el ARN de interferencia una hebra de nucleótidos sentido, una hebra de nucleótidos antisentido y una región de complementariedad contigua al menos casi perfecta de al menoS 19 nucleótidos; en el que la hebra antisentido se hibrida en condiciones fisiológicas con una parte del ARNm que corresponde a SEO ID NO: 1 que
50 comprende el nucleótido 297, 333, 334, 335, 434, 470, 493, 547, 570, 573, 618, 649, 689, 755, 842, 844, 846, 860, 878, 894, 900, 909, 910, 913, 942, 970, 984, 1002, 1010, 1053, 1064, 1137, 1162, 1215, 1330, 1334, 1340, 1386, 1393, 1428, 1505, 1508, 1541, 1553, 1557, 1591 , 1592, 1593, 1597, 1604, 1605, 1626, 1632, 1658, 1661, 1691, 1794, 1856, 1945, 1946, 1947, 1958, 2022, 2094, 2100, 2121, 2263, 2277, 2347, 2349, 2549, 2578, 2595, 2606, 2608, 2629, 2639, 2764, 2766, 2767, 2769, 3027, 3028, 3261 , 3264, 3284, 3313, 3317, 3332 ó 3337. El estado
55 relacionado con TNFa se trata de ese modo.
En el presente documento se describe además el tratamiento de un estado ocular relacionado con TNFa en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad eficaz de ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos, y un portador farmacéuticamente aceptable, comprendiendo el ARN de interferencia una hebra de nucleótidos sentido, una hebra de nucleótidos antisentido y 60 una región de complementariedad contigua al menos casi perfecta de al menos 19 nucleótidos; en el que la hebra antisentido se hibrida en condiciones fisiológicas con una parte del ARNm que corresponde a SEO ID NO: 2 que
comprende el nucleótido 124, 328, 387, 391 , 393, 395, 406, 421, 423, 444, 447, 455, 459, 460, 467, 469, 470, 471, 475, 479, 513, 517, 531, 543, 556, 576, 587, 588, 589, 595, 601, 602, 611, 612, 651, 664, 667, 668, 669, 677, 678, 785, 786, 788, 791 , 792, 804, 813, 824, 838, 843, 877, 884, 929, 959, 960, 961 , 963, 964, 965, 970, 973, 974, 1000, 1002, 1013, 1026, 1053, 1056, 1057, 1058, 1161, 1315, 1318, 1324, 1357, 1360, 1383, 1393, 1420, 1471, 1573, 1671 , 2044, 2045, 2046, 2047, 2048, 2089, 2090, 2091, 2092 ó 2098. El estado relacionado con TNFa se trata de ese modo.
También podría administrarse al sujeto un segundo ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos en una realización adicional; comprendiendo el segundo ARN de interferencia una hebra de nucleótidos sentido, una hebra de nucleótidos antisentido y una región de complementariedad al menos casi perfecta de al menos 19 nucleótidos en el que la hebra antisentido del segundo ARN de interferencia se hibrida en condiciones fisiológicas con una parte del ARNm que corresponde a SEO ID NO: 1 que comprende un nucleótido tal como se mencionó anteriormente, o en el que la hebra antisentido se hibrida en condiciones fisiológicas con una parte del ARNm que corresponde a SEO ID NO: 2 que comienza en el nucleótido 124, 328, 387, 391, 393, 395, 406, 421, 423, 444, 447, 455, 459, 460, 467, 469, 470, 471, 475, 479, 513, 517, 531, 543, 556, 576, 587, 588, 589, 595, 601, 602, 611, 612, 651, 664, 667, 668, 669, 677, 678, 785, 786, 788, 791, 792, 804, 813, 824, 838, 843, 877, 884, 929, 959, 960, 961, 963, 964, 965, 970, 973, 974, 1000, 1002, 1013, 1026, 1053, 1056, 1057, 1058, 1161, 1315, 1318, 1324, 1357, 1360, 1383, 1393, 1420, 1471, 1573, 1671, 2044, 2045, 2046, 2047, 2048, 2089, 2090, 2091, 2092 ó 2098.
Cuando un primer ARN de interferencia selecciona como diana SEO ID NO: 1, el segundo ARN de interferencia puede seleccionar como diana o bien SEO ID NO: 1 o bien SEO ID NO: 2, ya la inversa, cuando un primer ARN de interferencia selecciona como diana SEO ID NO: 2, el segundo ARN de interferencia puede seleccionar como diana
o bien SEO ID NO: 1 o bien SEO ID NO: 2. Tal como se describe adicionalmente en el presente documento, pueden administrarse, un tercero, cuarto o más ARN de interferencia.
En el presente documento se describe también el tratamiento de un estado relacionado con TNFa en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una molécula de ARNip bicatenario que regula por disminución la expresión de un gen de TACE mediante interferencia de ARN, en el que cada hebra de la molécula de ARNip tiene independientemente de aproximadamente 19 a aproximadamente 27 nucleótidos de longitud; y una hebra de la molécula de ARNip comprende una secuencia de nucleótidos que tiene complementariedad sustancial con un ARNm correspondiente al gen de TACE, de manera que la molécula de ARNip dirige la escisión del ARNm mediante interferencia de ARN.
En el presente documento se describe también el tratamiento de un estado ocular relacionado con TNFa en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una molécula de ARNip bicatenario que regula por disminución la expresión de un gen de TNFR1 mediante interferencia de ARN, en el que cada hebra de la molécula de ARNip tiene independientemente de aproximadamente 19 a aproximadamente 27 nucleótidos de longitud; y una hebra de la molécula de ARNip comprende una secuencia de nucleótidos que tiene complementariedad sustancial con un ARNm correspondiente al gen de TNFR1 de manera que la molécula de ARNip dirige la escisión del ARNm mediante interferencia de ARN.
En el presente documento se describe además un método de atenuación de la expresión del ARNm de TACE del sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad eficaz de un ARN de interferencia monocatenario y un portador farmacéuticamente aceptable. El ARN de interferencia monocatenario tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y se hibrida en condiciones fisiológicas con una parte del ARNm que corresponde a SEO ID NO: 1 que comprende el nucleótido 297, 333, 334, 335, 434, 470, 493, 547, 570, 573, 618, 649, 689, 755, 842, 844, 846, 860, 878, 894, 900, 909, 910, 913, 942, 970, 984, 1002, 1010, 1053, 1064, 1137, 1162, 1215, 1330, 1334, 1340, 1386, 1393, 1428, 1505, 1508, 1541, 1553, 1557, 1591, 1592, 1593, 1597, 1604, 1605, 1626, 1632, 1658, 1661, 1691, 1794, 1856, 1945, 1946, 1947, 1958, 2022, 2094, 2100, 2121, 2263, 2277, 2347, 2349, 2549, 2578, 2595, 2606, 2608, 2629, 2639, 2764, 2766, 2767, 2769, 3027, 3028, 3261, 3264, 3284, 3313, 3317, 3332 ó 3337, y el ARN de interferencia tiene una región de complementariedad contigua al menos casi perfecta con la parte hibridante del ARNm correspondiente a SEO ID NO: 1. La expresión de ARNm de TACE se atenúa de ese modo.
En el presente documento se describe además una composición que comprende un ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos, y que comprende una secuencia de nucleótidos que corresponde a una cualquiera de SEO ID NO: 3, SEO ID NO: 14 -SEO ID NO: 58 y SEO ID NO: 155 -SEO ID NO: 201, o un complemento de las mismas; y un portador farmacéuticamente aceptable.
En el presente documento se describe también una composición que comprende un ARN de interferencia que consiste esencialmente en una secuencia de nucleótidos que corresponde a una cualquiera de SEO ID NO: 59 SEO ID NO: 69, SEO ID NO: 71 -SEO ID NO: 92 y SEO ID NO: 94 -SEO ID NO: 154, o un complemento de las mismas; y un portador farmacéuticamente aceptable.
En el presente documento se describe también el uso de cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento en la preparación de un medicamento para atenuar la expresión de ARNm de TACE o de ARNm de TNFR1 como método de atenuación de la actividad de TNFa y de ese modo tratar un estado relacionado con TNFa tal como se expone en el presente documento.
Breve descripción de las figuras
Con el fin de que se ilustre la manera en que se obtienen los objetos mencionados anteriormente y otras ventajas de la invención, se hará una descripción más particular de la invención brevemente descrita anteriormente con referencia a realizaciones especificas de la misma, que se ilustran, en los dibujos adjuntos. Entendiendo que estos dibujos sólo representan realizaciones t1picas de la invención y por tanto no deben considerarse limitativos de su alcance, la invención se describirá con detalle y especificidad adicionales a través del uso de los dibujos adjuntos en los que:
La figura 1 proporciona una inmunotransferencia de tipo Western para TNFR1 de células GTM-3 transfectadas con ARNip de TNFR1 n.' 1, n.' 2, n.' 3 y n.' 4, y un ARNip control libre de RISC, cada uno a 10 nM, 1 nM y 0,1 nM; un ARNip control que no selecciona como diana (NTC2) a 10 nM; y un control de tampón (-ARNip). Las flechas indican las posiciones de las bandas de TNFR1 de 55 kDa y de actina de 42 kDa.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se define mediante las reivindicaciones.
Las siguientes definiciones y explicaciones pretenden y están pensadas para controlar cualquier interpretación futura a menos que se modifique clara e in equivoca mente en los siguientes ejemplos o cuando la aplicación del significado haga que cualquier interpretación carezca de sentido o carezca esencialmente de sentido. En casos en los que la interpretación del término haga que carezca de sentido o carezca esencialmente de sentido, la definición deberá tomarse del diccionario Webster, 3' edición.
Tal como se usa en el presente documento, todos los porcentajes son porcentajes en peso, a menos que se indique lo contrario.
Tal como se usa en el presente documento y a menos que se indique lo contrario, los términos "un" y "una" se toman para querer decir "uno", "al menos uno" o "uno o más".
El término "ojo seco", también conocido como conjuntivitis seca o queratoconjuntivitis seca, es un trastorno oftalmológico común que implica descomposición de la pelicula de lágrimas preocular, dando como resultado deshidratación de la superficie externa expuesta dE> ojo.
El término "inflamación ocular", tal como se usa en el presente documento, incluye por ejemplo iritis, uveitis, epiescleritis, escleritis, queratitis, endoftalmitis, blefaritis y estados inflamatorios iatrogénicos.
El término "conjuntivitis alérgica", tal como se usa en el presente documento, se refiere a inflamación de la conjuntiva que es la membrana delicada que reviste los párpados y cubre la superficie expuesta de la esclerótica. El término "conjuntivitis alérgica" incluye, por ejemplo, queratoconjuntivitis atópica, conjuntivitis papilar gigante, conjuntivitis de la fiebre del heno, conjuntivitis alérgica perenne y queratoconjuntivitis vernal.
La expresión "una región de al menos 13 nucleótidos contiguos que tiene una complementariedad de secuencia de al menos el 90% con, o una identidad de secuencia de al menos el 90% con, los 13 penúltimos nucleótidos del extremo 3' de un ARNm que corresponde a uno cualquiera de (un identificador de secuencia)" permite una única sustitución de nucleótidos. Dos sustituciones de nucleótidos (es decir, 11/13 = 85% de identidad/complementariedad) no se incluyen en tal expresión.
El término "porcentaje de identidad" describe el porcentaje de nucleótidos contiguos en una primera molécula de ácido nucleico que son los mismos que en un conjunto de nucleótidos contiguos de la misma longitud en una segunda molécula de ácido nucleico. El término "porcentaje de complementariedad" describe el porcentaje de nucleótidos contiguos en una primera molécula de ácido nucleico que pueden experimentar apareamiento de bases en el sentido de Watson-Crick con un conjunto de nucleótidos contiguos en una segunda molécula de ácido nucleico.
Tal como se usa en el presente documento, el término "hibridación" significa y se refiere a un procedimiento en el que ácidos nucleicos monocatenarios con secuencias de bases complementarias o casi complementarias interaccionan para formar complejos unidos por puentes de hidrógeno denominados híbridos. Las reacciones de hibridación son sensibles y selectivas. In vi/ro, la especificidad de hibridación (es decir, rigurosidad) se controla por ejemplo mediante las concentraciones de sal o forrnamida en las disoluciones de prehibridación e hibridación y mediante la temperatura de hibridación; tales procedimientos se conocen bien en la técnica. En particular, se aumenta la rigurosidad reduciendo la concentración de sal, aumentando la concentración de formamida o elevando la temperatura de hibridación.
Por ejemplo, pueden producirse condiciones de alta rigurosidad a formamida a aproximadamente el 50% a de 37°C a 42°C. Pueden producirse condiciones de rigurosidad reducida a formamida a aproximadamente del 35% al 25% a de 30'C a 35'C. Se proporcionan ejemplos de condiciones de rigurosidad para la hibridación en Sambrook, J., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbar Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Los ejemplos adicionales de condiciones de hibridación rigurosas incluyen NaCI 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, 50'C o 70'C durante 12-16 horas seguido por lavado, o hibridación a 70'C en 1XSSC o 50'C en 1XSSC, formamida al 50% seguido por lavado a 70'C en 0,3XSSC, o hibridación a 70'C en 4XSSC o 50'C en 4XSSC, formamida al 50% seguido por lavado a 67'C en 1XSSC. La temperatura para la hibridación es de aproximadamente 5-1 0'C menos que la temperatura de fusión (T m) del híbrido en el que T m se determina para híbridos entre 19 y 49 pares de bases de longitud usando el siguiente cálculo: T m 'C = 81,5 + 16,6(log1o[Na+]) + 0,41 (% de G+C) -(600/N) en la que N es el número de bases en el híbrido, y [Na+] es la concentración de iones sodio en el tampón hibridación.
Las secuencias de ácido nucleico mencionadas en el presente documento se escriben en una dirección de 5' a 3' a menos que se indique lo contrario. El término "ácido nucleico", tal como se usa en el presente documento, se refiere a o bien ADN o bien ARN o bien una forma modificada de los mismos que comprende las bases de purina o pirimidina presentes en el ADN (adenina "A", citosina "C", guanina "G", timina 'T) o en el ARN (adenina "A", citosina "C", guanina "G", uracilo "U"). Los ARN de interferencia proporcionados en el presente documento pueden comprender bases "T", particularmente en los extremos 3', aún cuando las bases UT" no se produzcan de manera natural en el ARN. "Ácido nucleico" incluye los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" y puede hacer referencia a una molécula monocatenaria o una molécula bicatenaria. Una molécula bicatenaria se forma mediante apareamiento de bases de Watson-Crick entre bases A y T, bases C y G, Y entre bases A y U. Las hebras de una molécula bicatenaria pueden tener complementariedad parcial, sustancial o completa entre sí y formarán un híbrido dúplex, cuya fuerza de unión depende de la naturaleza y el grado de complementariedad de la secuencia de bases.
Una secuencia de ARNm se deduce fácilmente a partir de la secuencia de la secuencia de ADN correspondiente. Por ejemplo, SEO ID NO: 1 proporciona la secuencia de la hebra sentido del ADN que corresponde al ARNm para TACE. La secuencia de ARNm es idéntica a la secuencia de la hebra sentido del ADN reemplazándose las bases "1" por bases "U". Por tanto, se conoce la secuencia de ARNm de TACE a partir de SEO ID NO: 1 y se conoce el ARNm de TNFR1 a partir de SEO ID NO: 2.
La interferencia de ARN (ARNi) es un procedimiento mediante el que se usa ARN bicatenario (ARNbc) para silenciar la expresión génica. Sin querer restringirse a la teoría, la ARNi comienza con la escisión de ARNbc más largos en ARN de interferencia pequeños (ARNip) mediante una enzima similar a ARNasa 111, Dicer. Los ARNip son ARNbc que tienen habitualmente de aproximadamente 19 a 28 nucleótidos, o de 20 a 25 nucleótidos, o de 21 a 22 nucleótidos de longitud y a menudo contienen proyecciones en 3' de 2 nucleótidos, y extremos terminales de fosfato en 5' e hidroxilo en 3'. Una hebra del ARNip se incorpora en un complejo de ribonucleoproteína conocido como complejo silenciador inducido por ARN ("RNA-induced silencing complex", RICS). El RISC usa esta hebra de ARNip para identificar moléculas de ARNm que son al menos parcialmente complementarias a la hebra de ARNip incorporada, y entonces escinde estos ARNm diana o inhibe su traducción. Por tanto, la hebra de ARNip que se incorpora al RISC se conoce como hebra guía o hebra antisentido. La otra hebra del ARNip, conocida como hebra pasajera o hebra sentido, se elimina del ARNip y es al menos parCialmente homóloga al ARNm diana. Los expertos en la técnica reconocerán que, en principio, cualquier hebra de un ARNip puede incorporarse al RISC y funcionar como hebra guía. Sin embargo, el diseño de ARNip (por ejemplo, disminución de la estabilidad del dúplex de ARNip en el extremo 5' de la hebra guía deseada) puede favorecer la incorporación de la hebra guía deseada al RISC.
La escisión mediada por RISC de ARNm que tienen una secuencia al menos parcialmente complementaria a la hebra guía conduce a un aumento en el nivel en estado estacionario de ese ARNm y de la proteína correspondiente codificada por este ARNm. Alternativamente, RISC también puede disminuir la expresión de la proteína correspondiente mediante represión de la traducción sin escisión del ARNm diana. Otras moléculas de ARN y moléculas similares a ARN también pueden interaccionar con RISC y silenciar la expresión génica. Los ejemplos de otras moléculas de ARN que pueden interaccionar con RISC incluyen ARN en horquilla pequeños (ARNhp), ARNip monocatenarios, microARN (mAR Ni) y dúplex de Dicer-sustrato de 27 meros. El término "ARNip" tal como se usa en el presente documento se refiere a un ARN de interferencia bicatenario a menos que se indique lo contrario. Los ejemplos de moléculas similares a ARN que pueden interaccionar con RISC incluyen moléculas de ARN que contienen uno o más nucleótidos químicamente modificados, uno o más desoxirribonucleótidos y/o una o más uniones distintas de fosfodiéster. Para los fines de la presente discusión, todas las moléculas de ARN o similares a ARN que pueden interaccionar con RISC y participar en los cambios mediados por RISC en la expresión génica se denominarán "ARN de interferencia". Por tanto, los ARNip, ARNhp, mARNi y dúplex de Dicer-sustrato de 27 meros son subconjuntos de "ARN de interferencia".
El ARN de interferencia de las realizaciones de la invención parece actuar de manera catalítica para escindir el ARNm diana, es decir, el ARN de interferencia puede efectuar la inhibición del ARNm diana en cantidades subestequiométricas. En comparación con terapias antisentido, se requiere significativamente menos ARN de interferencia para proporcionar un efecto terapéutico en tales condiciones de escisión.
La presente invención se refiere al uso de ARN de interferencia para inhibir la expresión del receptor de superficie celular de TNFa receptor 1 de TNFa (TNFR1) o la enzima convertidora de TNFa (TACE/ADAM17, denominada en el presente documento "TACE"), cuya inhibición reduce la actividad del factor de necrosis tumoral-a (TNFa). La unión de TNFa a su receptor de superficie celular, receptor 1 de TNF (TNFR1), activa una cascada de señalización que afecta a una variedad de respuestas celulares incluyendo apoptosis e inflamación. El propio TNFa se expresa inicialmente como un precursor inactivo, unido a la membrana. La liberación de la forma activa de TNFa de la superficie celular requiere el procesamiento proteolitico del precursor mediante la enzima convertidora de TNFa (TACE/AOAM17), un miembro de la familia de 'desintegrina A y metaloproteasa' (AOAM).
Según la presente invención, la inhibición de la expresión de ARNm de TNFR1, ARNm de TACE o los ARNm tanto de TNFR1 como TACE reduce eficazmente la acción de TNFa. Además, los ARN de interferencia expuestos en el presente documento proporcionados exógenamente o expresados endógena mente son particularmente eficaces en el silenciamiento de ARNm de TNFR1 o ARNm de TACE.
ARNm de enzima convertidora de factor de necrosis tumoral-a (TACElADAM17): La base de datos GenBank proporciona la secuencia de AON para TACE con el número de registro NM_003183, proporcionada en la "lista de secuencias" como SEO ID NO: 1. SEO ID NO: 1 proporciona la secuencia de la hebra sentido del AON que corresponde al ARNm que codifica para TACE (con la excepción de bases "T" por bases "U"). La secuencia codificante para TACE es de desde los nucleótidos 184 -2658.
Equivalentes de la secuencia de ARNm de TACE mencionada anteriormente son formas de corte y empalme alternativas, formas alélicas, isoenzimas o un cognado de las mismas. Un cognado es un ARNm de enzima convertidora de factor de necrosis tumoral-a de otra especie de mamlfero que es homólogo a SEO ID NO: 1 (es decir, un ortólogo).
ARNm de receptor 1 de factor de necrosis tumoral (TNFR1): La base de datos GenBank proporciona la secuencia de AON para TNFR1 con el número de registro NM_001065, proporcionada en la "lista de secuencias" como SEO ID NO: 2. SEO ID NO: 2 proporciona la secuencia de la hebra sentido del AON que corresponde al ARNm que codifica para TNFR1 (con la excepción de bases "T" por bases "U"). La secuencia codificante para TNFR1 es de desde los nucleótidos 282 -1649.
Equivalentes de la secuencia de ARNm de TNFR1 mencionada anteriormente son formas de corte y empalme alternativas, formas alélicas, isoenzimas o un cognado de las mismas. Un cognado es un ARNm de receptor 1 de factor de necrosis tumoral de otras especies de mamíferos que es homólogo a SEO ID NO: 2 (es decir, un ortólogo).
Atenuación de la expresión de un ARNm: La expresión, "atenuación de la expresión de un ARNm", tal como se usa en el presente documento, significa la administración o expresión de una cantidad de ARN de interferencia (por ejemplo, un ARNip) para reducir la traducción del ARNm diana en proteína, o bien a través de la escisión del ARNm
o bien a través de la inhibición directa de la traducción. La reducción en la expresión del ARNm diana o la proteína correspondiente se denomina comúnmente "inactivación" ("knock-down") y se notifica en relación con los niveles presentes tras la administración o expresión de un ARN control que no selecciona como diana (por ejemplo, un ARNip control que no selecciona como diana). Se contempla en las realizaciones del presente documento la inactivación de la expresión de una cantidad incluyendo y entre el 50% yel 100%. Sin embargo, no es necesario que se logren tales niveles de ¡nactivación para los fines de la presente invención. En una realización, se administra un único ARN de interferencia que selecciona como diana el ARNm de TACE o ARNm de TNFR1. En otras realizaciones, se administran dos o más ARN de interferencia que seleccionan como diana el ARNm de TACE o ARNm de TNFR1. En realizaciones adicionales, los ARN de interferencia que seleccionan como diana cada uno del ARNm de TACE y ARNm de TNFR1 se administran en combinación o en un intervalo de tiempo de modo que tengan efectos solapantes.
La inactivación se evalúa comúnmente midiendo los niveles de ARNm usando amplificación por reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) o midiendo los niveles de protelna mediante inmunotransferencia de tipo Westem o ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELlSA). El análisis del nivel de proteínas proporciona una evaluación de tanto la escisión del ARNm así como de la inhibición de la traducción. Las técnicas adicionales para medir la inactivación incluyen hibridación de la disolución de ARN, protección de nucleasas, hibridación de tipo Northern, monitorización de la expresión génica con un microalineamiento, unión a anticuerpos, radioinmunoanálisis y análisis de células activadas por fluorescencia.
La inhibición de TACE o TNFR1 también puede determinarse in vitro evaluando los niveles de ARNm diana o los niveles de proteínas diana en, por ejemplo, células epiteliales de córnea humana tras la transfección de ARN de interferencia de TACE o TNFR 1 tal como se describe más adelante.
La inhibición de la actividad de TNFa debida a la inhibición de la expresión del ARNm de TACE o de la expresión del ARNm de TNFR1 también se infiere en un ser humano o mamlfero observando una mejora en un sintoma del estado relacionado con TNFa tal como mejora en síntomas relacionados con ojo seco, conjuntivitis alérgica, inflamación ocular, dermatitis, rinitis o asma. Una mejora en cualquiera de los síntomas de ojo seco, edema, picazón, inflamación o tolerancia a exposiciones ambientales, por ejemplo, es indicativo de la inhibición de la actividad de TNFa.
ARN de interferencia: En una realización de la invención, el ARN de interferencia (por ejemplo, ARNip) tiene una hebra sentido y una hebra antisentido, y las hebras sentido y antisentido comprenden una región de complementariedad contigua al menos casi perfecta de al menos 19 nucleótidos. En una realización adicional de la invención, el ARN de interferencia (por ejemplo, ARNip) tiene una hebra sentido y una hebra antisentido, y la hebra antisentido comprende una región de complementariedad contigua al menos casi perfecta de al menos 19 nucleótidos con una secuencia diana del ARNm de TACE o ARNm de TNFR1, y la hebra sentido comprende una
5 región de identidad contigua al menos casi perfecta de al menos 19 nucleótidos con una secuencia diana del ARNm de TACE o ARNm de TNFR1, respectivamente. En una realización adicional de la invención, el ARN de interferencia comprende una región de al menos 13, 14, 15, 16, 17 ó 18 nucleótidos contiguos que tiene porcentajes de complementariedad de secuencia con o que tiene porcentajes de identidad de secuencia con los penúltimos 13, 14, 15, 16, 17 ó 18 nucleótidos, respectivamente, del extremo 3' de la secuencia diana correspondiente dentro de un ARNm.
La longitud de cada hebra del ARN de interferencia comprende de 19 a 49 nucleótidos, y puede comprender una longitud de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 ó 49 nucleótidos.
La hebra antisentido de un ARNip es el agente activo de guiado del ARNip porque la hebra antisentido se incorpora
15 al RISC, permitiendo asi que el RISC identifique los ARNm diana con complementariedad al menos parcial con la hebra de ARNip antisentido para la escisión o represión de la traducción.
Tal como se describe en el presente documento, se seleccionan secuencias diana de ARN de interferencia (por ejemplo, secuencias diana de ARNip) dentro de una secuencia de ARNm diana usando herramientas de diseño disponibles. Los ARN de interferencia que corresponden a una secuencia diana de TACE o TNFR1 se someten a prueba entonces mediante transfección de células que expresan el ARNm diana seguido por la evaluación de la inactivaci6n tal como se describió anteriormente.
Se proporcionan técnicas para seleccionar secuencias diana para ARNip por Tuschl, T. et al., "The siRNA User Guide", revisado el 6 de mayo de 2004, disponible en la página web de la Universidad Rockefeller; por el boletín técnico n.' 506, "siRNA Oesign Guidelines", Ambion Inc. en la página web de Ambion; y por otras herramientas de
25 diseño basadas en Internet en, por ejemplo, las páginas web de Invitrogen, Oharmacon, Integrated ONA Technologies, Genscript o Proligo. Los parámetros de búsqueda iniciales pueden incluir contenidos en G/C de entre el 35% y el 55% y longitudes de ARNip de entre 19 y 27 nucleótidos. La secuencia diana puede estar ubicada en la región codificante o en las regiones no traducidas en 5' o 3' de los ARNm.
Se presenta una realización de una secuencia diana de AON de 19 nucleótidos para ARNm de TACE en los nucleótidos de 297 a 315 de SEO ID NO: 1:
5'-GCTCTCAGACTACGATATI-3' SEO ID NO: 3.
Un ARNip de la invención para seleccionar como diana una secuencia de ARNm correspondiente de SEO ID NO: 3 y que tiene hebras de 21 nucleótidos y una proyección en 3' de 2 nucleótidos es:
5'-GCUCUCAGACUACGAUAUUNN-3 SEO ID NO: 4
3'-NNCGAGAGUCUGAUG CUAUAA-5' SEO ID NO: 5.
Cada residuo "N" puede ser cualquier nucleótido (A, C, G, U, T) o nucleótido modificado. El extremo 3' puede tener varios residuos "N" entre e incluyendo 1, 2, 3, 4, 5 Y 6. Los residuos "N" en cualquier hebra pueden ser el mismo residuo (por ejemplo, UU, AA, CC, GG o TI) o pueden ser diferentes (por ejemplo, AC, AG, AU, CA, CG, CU, GA, GC, GU, UA, UC o UG). Las proyecciones en 3' pueden ser iguales o pueden ser diferentes. En una realización, ambas hebras tienen una proyección UU en 3'.
Un ARNip de la invención para seleccionar como diana una secuencia de ARNm correspondiente de SEO ID NO: 3 y que tiene hebras de 21 nucleótidos y una proyección UU en 3' en cada hebra es:
5'-GCUCUCAGACUACGAUAUUUU-3' SEO ID NO: 6
3'-UUCGAGAGUCUGAUGCUAUAA-5' SEO ID NO: 7.
45 El ARN de interferencia también puede tener una proyección en 5' de nucleótidos o puede tener extremos romos. Un ARNip de la invención para seleccionar como diana una secuencia de ARNm correspondiente de SEO ID NO: 3 y que tiene hebras de 19 nucleótidos y extremos romos es:
5'-GCUCUCAGACUACGAUAUU-3' SEO ID NO: 8
3'-CGAGAGUCUGAUGCUAUAA-5' SEO ID NO: 9.
Las hebras de un ARN de interferencia bicatenario (por ejemplo, un ARNip) pueden conectarse para formar una estructura en horquilla o en tallo-bucle (por ejemplo, un ARNhp). Un ARNhp de la invención que selecciona como diana una secuencia de ARNm correspondiente de SEO ID NO: 3 y que tiene una región de tallo bicatenaria de
19 pb Y una proyección UU en 3' es:
NNN
I \
S'-GCUCUCAGACUACGAUAUU N
3 '-UUCGAGAGUCUGAUGCUAUAA N SEO 1:D NO: 10.
\ I
NNN
N es un nucleótido A, T, C, G, U, o una forma modificada conocida por un experto habitual en la técnica. El número de nucleótidos N en el bucle es un número entre e incluyendo de 3 a 23, o de 5 a 15, o de 7 a 13, o de 4 a 9, o de 9 a 11, o el número de nucleótidos N es 9. Algunos de los nucleótidos en el bucle pueden estar implicados en interacciones de pares de bases con otros nucleótidos en el bucle. Los ejemplos de secuencias de oligonucleótidos que pueden usarse para formar el bucle incluyen 5'·UUCAAGAGA·3' (Brummelkamp, T.R. el al. (2002) Science 296: 550) y 5'·UUUGUGUAG-S' (Castanotto, D. el al. (2002) RNA 8:1454). Un experto en la técnica reconocerá que el oligonucleótido de cadena sencilla resultante forma una estructura en tallo-bucle o en horquilla que comprende una región bicatenaria que puede interaccionar con la maquinaria de ARNi.
La secuencia diana de ARNip identificada anteriormente puede extenderse en el extremo 3' para facilitar el diseño de dúplex de Dicer-sustrato de 27 meros. La extensión de la secuencia diana de ADN de 19 nucleótidos (SEO ID NO: 3) identificada en la secuencia de ADN de TACE (SEO ID NO: 1) en 6 nucleótidos produce una secuencia diana de ADN de 25 nucleótidos presente en los nucleótidos de 297 a 321 de SEO ID NO: 1:
5' -GCTCTCAGACTACGA TA TTCTCTCT-3' SEO ID NO: 11.
Un dúplex de D¡cer-sustrato de 27 meros de la invención para seleccionar como diana una secuencia de ARNm correspondiente de SEO ID NO: 11 es:
5' -GCUCUCAGACUACGAUAUUCUCUCU-3' SEO ID NO: 12
3'-UUCGAGAGUCUGAUGCUAUAAGAGAGA-5' SEO ID NO: 13.
Los dos nucleótidos en el extremo 3' de la hebra sentido (es decir, los nucleótidos CU de SEO ID NO: 12) pueden ser desoxinucleótidos para un procesamiento potenciado. El diseño del dúplex de Dicer-sustrato de 27 meros a partir de secuencias diana de 19-21 nucleótidos, tal como se proporciona en el presente documento, se trata adicionalmente por la página web de Integrated DNA Technologies (IDT) y por Kim, D. -H. el al., (febrero de 2005) Nature Biotechnology 23:2; 222-226.
Cuando se producen ARN de interferencia mediante síntesis química, la fosforilación en la posición 5' del nucleótido en el extremo 5' de una o ambas hebras (cuando están presentes) puede potenciar la eficacia del ARNip y la especificidad del complejo RISC unido pero no se requiere puesto que la fosforilación puede producirse intracelularmente.
La tabla 1 enumera ejemplos de secuencias diana de ADN de TACE de SEO ID NO: 1 a partir de las que se diseñan ARNip de la presente invención de una manera tal como se expuso anteriormente. TACE codifica para la enzima convertidora de factor de necrosis tumoral-u, tal como se indicó anteriormente.
Tabla 1. Secuencias diana de TACE para ARNip
n,O de nucleótido de inicio
Secuencia diana de TACE
con referencia a SEO ID SEO ID NO:
NO: 1
'
'
-
.
última base, es decir, la base próxima a la base en 3'. Las penúltimas 13 bases de una secuencia de ácido nucleico escrita en una dirección de 5' a 3' son las últimas 13 bases de una secuencia próxima a la base en 3' y que no incluyen la base en 3', De manera similar, las penúltimas 14, 15, 16, 17 ó 18 bases de una secuencia de ácido nucleico escrita en una dirección de 5' a 3' son las últimas 14, 15, 16, 17 ó 18 bases de una secuencia, respectivamente, próximas a la base en 3' y que no incluyen la base en 3',
Tal como se describe en el presente documento, la región de nucleótidos contiguos es una región de al menos 13 nucleótidos contiguos que tienen una complementariedad de secuencia de al menos el 90% con, o una identidad de secuencia de al menos el 90% con, los 13 penúltimos nucleótidos del ex1remo 3' de un ARNm correspondiente a la secuencia identificada por cada identificador de secuencia.
Tal como se describe en el presente documento, la región de nucleótidos contiguos es una región de al menos 14 nucleótidos contiguos que tiene una complementariedad de secuencia de al menos el 85% con, o una identidad de secuencia de al menos el 85% con, los 14 penúltimos nucleótidos del extremo 3' de un ARNm correspondiente a la secuencia identificada por cada identificador de secuencia. En una expresión de este tipo se incluyen dos sustituciones de nucleótidos (es decir, 12/14 = 86% de identidad/complementariedad),
Tal como se describe adicionalmente en el presente documento, la región de nucleótidos contiguos es una región de al menos 15, 16, 17 ó 18 nucleótidos contiguos que tiene una complementariedad de secuencia de al menos el 80% con, o una identidad de secuencia de al menos el 80% con, los 14 penúltimos nucleótidos del extremo 3' de un ARNm correspondiente a la secuencia del identificador de secuencia, En una expresión de este tipo se incluyen tres sustituciones de nucleótidos.
La secuencia diana en los ARNm que corresponden a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 puede estar en las regiones no traducidas en 5' o 3' del ARNm así como en la región codificante del ARNm.
Una o ambas de las hebras del ARN de interferencia bicatenario pueden tener una proyección en 3' de desde 1 hasta 6 nucleótidos, que pueden ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una mezcla de los mismos. Los nucleótidos de la proyección no forman pares de bases. En una realización de la invención, el ARN de interferencia comprende una proyección en 3' de TI o UU. En otra realización de la invención, el ARN de interferencia comprende al menos un extremo romo. Los extremos terminales tienen habitualmente un grupo fosfato en 5' o un grupo hidroxilo en 3'. En otras realizaciones, la hebra antisentido tiene un grupo fosfato en 5', Y la hebra sentido tiene un grupo hidroxilo en 5'. Todavía en otras realizaciones, los extremos terminales se modifican adicionalmente mediante adición covalente de otras moléculas o grupos funcionales.
Las hebras sentido y antisentido del ARNip bicatenario pueden estar en una formación de dúplex de dos hebras individuales tal como se describió anteriormente o pueden ser una única molécula en la que las regiones de complementariedad forman pares de bases y están unidas covalentemente por un bucle en horquilla de modo que se forma una única hebra. Se cree que la horquilla se escinde intracelularmente mediante una proteína denominada Dicer formando un ARN de interferencia de dos moléculas de ARN que forman pares de bases individuales.
Los ARN de interferencia pueden diferir del ARN que se produce de manera natural mediante la adición, deleción, sustitución o modificación de uno o más nucleótidos. Puede unirse material distinto de nucleótidos al ARN de interferencia, o bien en el extremo 5', el extremo 3' o bien internamente. Tales modificaciones se diseñan comúnmente para aumentar la resistencia a nucleasas de los ARN de interferencia, para mejorar la captación celular, para potenciar el direccionamiento celular, para ayudar al rastreo del ARN de interferencia, para mejorar adicionalmente la estabilidad, o para reducir el potencial de activación de la ruta de interferones. Por ejemplo, los ARN de interferencia pueden comprender un nucleótido de purina en los extremos de las proyecciones. La conjugación de colesterol al extremo 3' de la hebra sentido de una molécula de ARNip por medio de un ligador pirrolidina, por ejemplo, también proporciona estabilidad a un ARNip.
Las modificaciones adicionales incluyen una molécula de biotina en el extremo 3' terminal, un péptido que se sabe que tiene propiedades de penetración en células, una nanopartícula, un peptidomimético, un colorante fluorescente
o un dendrímero, por ejemplo.
Los nucleótidos pueden modificarse en su parte de base, en su parte de azúcar o en la parte de fosfato de la molécula y funcionan en realizaciones de la presente invención. Las modificaciones incluyen sustituciones con grupos alquilo, alcoxilo, amino, desaza, halo, hidroxilo, tiol, o una combinación de los mismos, por ejemplo. Los nucleótidos pueden sustituirse con análogos con mayor estabilidad tal como reemplazar un ribonucleótido por un desoxirribonucleótido, o tener modificaciones de azúcar tales como grupos 2'-OH reemplazador por grupos 2'-amino, grupos 2'-0-metilo, grupos 2'-metoxietilo, o un puente de 2'-0, 4'-C-metileno, por ejemplo. Los ejemplos de un análogo de purina o pirimidina de nucleótidos incluyen una xantina, una hipoxantina, una azapurina, una metiltioadenina, 7-desaza-adenosina y nucleótidos modificados con O y N. El grupo fosfato del nucleótido puede modificarse sustituyendo uno o más de los oxígenos del grupo fosfato por nitrógeno o por azufre (fosforotioatos). Las modificaciones son útiles, por ejemplo, para potenciar la función, para mejorar la estabilidad o permeabilídad, o para dirigir la localización o el direccionamiento.
Puede haber una región o regiones de la hebra de ARN de interferencia antisentido que no sea(n) complementaria(s) a una parte de SEO ID NO: 1 o SEO ID NO: 2. Las regiones no complementarias pueden estar en los extremos 3', 5' o ambos de una región complementaria o entre dos regiones complementarias.
Pueden generarse ARN de interferencia exógenamente mediante síntesis química, mediante transcripción in vitro o mediante escisión de ARN bicatenario más largo con Dicer u otra nucleasa apropiada con actividad similar. Los ARN 5 de interferencia sintetizados químicamente, producidos a partir de fosforamiditas de ribonucleósidos protegidos usando un sintetizador de ADN/ARN convencional, pueden obtenerse de proveedores comerciales tales como Ambion Inc. (Austin, TX), Invitrogen (Carlsbad, CA) o Dharmacon (Lafayette, COjo Los ARN de interferencia se purifican mediante extracción con un disolvente o resina, precipitación, electroforesis, cromatografía o una combinación de los mismos, por ejemplo. Alternativamente, puede usarse ARN de interferencia con poca, si acaso
10 alguna purificación, para evitar pérdidas debido al procesamiento de muestras.
También pueden expresarse endógenamente ARN de interferencia a partir de vectores de expresión virales o de plásmido o de casetes de expresión mínimos, por ejemplo, fragmentos generados por PCR que comprenden uno o más promotores y un molde o moldes apropiados para el ARN de interferencia. Los ejemplos de vectores de expresión a base de plásmidos disponibles comercialmente para ARNhp incluyen los miembros de la serie pSilencer 15 (Ambion, Austin, TX) y pCpG-siRNA (InvivoGen, San Diego, CA). Pueden derivarse vectores virales para la expresión de ARN de interferencia a partir de una variedad de virus incluyendo adenovirus, virus adenoasociados, lentivirus (por ejemplo, VIH, VIF y VAlE) Y virus del herpes. Los ejemplos de vectores virales disponibles comercialmente para la expresión de ARNhp incluyen pSilencer adeno (Ambion, Austin, TX) y pLenti6/BLOCK-iT ™DEST (Invitrogen, Carlsbad, CA). La selección de vectores virales, los métodos para expresar el ARN de 20 interferencia a partir del vector y los métodos de administración del vector viral están dentro de la experiencia habitual de un experto en la técnica. Los ejemplos de kits para la producción de casetes de expresión de ARNhp generados por PCR incluyen Silencer Express (Ambion, Austin, TX) y siXpress (Minis, Madison, WI). Puede administrarse un primer ARN de interferencia mediante expresión in vivo a partir de un primer vector de expresión que puede expresar el primer ARN de interferencia y puede administrarse un segundo ARN de interferencia
25 mediante expresión in vivo a partir de un segundo vector de expresión que puede expresar el segundo ARN de interferencia, o pueden administrarse ambos ARN de interferencia mediante expresión in vivo a partir de un único vector de expresión que puede expresar ambos ARN de interferencia.
Pueden expresarse ARN de interferencia a partir de una variedad de promotores eucariotas conocidos por los expertos haMuales en la técnica, incluyendo promotores poi 111, tales como los promotores U6 o HI, o promotores poi 30 11, tales como el promotor de citomegalovirus. Los expertos en la técnica reconocerán que estos promotores también pueden adaptarse para permitir una expresión inducible del ARN de interferencia.
Hibridación en condiciones fisiológicas: En determinadas realizaciones de la presente invención, una hebra antisentido de un ARN de interferencia se hibrida con un ARNm in vivo como parte del complejo RISC.
Por ejemplo, pueden producirse condiciones de alta rigurosidad a formamida a aproximadamente el 50% a de 37'C
35 a 42'C. Pueden producirse condiciones de rigurosidad reducida a formamida a aproximadamente del 35% al 25% a de 30'C a 35'C. Se proporcionan ejemplos de condiciones de rigurosidad para la hibridación en Sambrook, J., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Los ejemplos adicionales de condiciones de hibridación rigurosas incluyen NaCI 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, 50'C o 70'C durante 12-16 horas seguido por lavado, o hibridación a 70'C en 1XSSC o 50'C en 1XSSC,
40 formamida al 50% seguido por lavado a 70'C en 0,3XSSC, o hibridación a 70'C en 4XSSC o 50'C en 4XSSC, forma mida al 50% seguido por lavado a 67'C en 1 XSSC. La temperatura para la hibridación es de aproximadamente 5-10'C menos que la temperatura de fusión (T m) del híbrido en el que la T m se determina para híbridos entre 19 y 49 pares de bases de longitud usando el siguiente cálculo: T m 'C = 81,5 + 16,6(log1O[Na+]) + 0,41 (% de G+C) -(600/N) en el que N es el número de bases en el híbrido y [Na+] es la concentración de iones sodio en el tampón hibridación.
45 El ensayo de hibridación in vitro descrito anteriormente proporciona un método de prediCCión de si la unión entre un ARNip candidato y una diana tendrá especificidad. Sin embargo, en el contexto del complejo RISC, también puede producirse escisión especifica de una diana con una hebra antisentido que no demuestra alta rigurosidad para la hibridación in vitro.
ARN de interferencia monocatenario: Tal como se mencionó anteriormente, los ARN de interferencia funcionan en última instancia como hebras únicas. Se ha encontrado que el ARN de interferencia monocatenario (mc) efectúa el silenciamiento del ARNm, aunque menos eficazmente que el ARN bicatenario. Por tanto, las realizaciones de la presente invención también proporcionan la administración de un ARN de interferencia mc que se hibrida en condiciones fisiológicas con una parte de SEO ID NO: 1 o SEO ID NO: 2 y tiene una región de complementariedad contigua al menos casi perfecta de al menos 19 nucleótidos con la parte hibridante de SEO ID NO: 1 o SEO ID NO: 55 2, respectivamente. El ARN de interferencia mc de la tabla 1 o tabla 2 tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos tal como para el ARN de interferencia bc mencionado anteriormente. El ARN de interferencia mc tiene un fosfato en 5' o se fosforila in situ o in vivo en la posición 5'. El término "fosforilado en 5'" se usa para describir, por ejemplo, polinucleótidos u oligonucleótidos que tienen un grupo fosfato unido mediante enlace éster al hidroxilo C5 del azúcar (por ejemplo, ribosa, desoxirribosa o un análogo de las mismas) en el extremo 5' del polinucleótido u oligonucleótido.
Se sintetizan ARN de intenerencia mc químicamente o mediante transcripción in vitro o se expresan endógenamente a partir de vectores o casetes de expresión tal como para ARN de interferencia bc. Pueden añadirse grupos fosfato en 5' mediante una cinasa, o un fosfato en 5' puede ser el resultado de escisión por nucleasas de un ARN. La administración es tal cama para el ARN de interferencia bc. En una realización, se administran ARN de interferencia mc que tienen extremos protegidos y modificaciones resistentes a nucleasas para el silenciamiento. Los ARN de intenerencia mc pueden secarse para su almacenamiento o disolverse en una disolución acuosa. La disolución puede contener tampones o sales para inhibir el apareamiento o para la estabilización.
ARN de interferencia en horquilla: Un ARN de interferencia en horquilla es una única molécula (por ejemplo, una única cadena de oligonucleótido) que comprende tanto las hebras sentido como antisentido de un ARN de interferencia en una estructura en tallo-bucle o en horquilla (por ejemplo, un ARNhp). Por ejemplo, pueden expresarse ARNhp a partir de vectores de ADN en los que los oligonucleótidos de ADN que codifican para una hebra de ARN de interferencia sentido se unen a los oligonucleótidos de ADN que codifican para la hebra de ARN de intenerencia antisentido complementariamente inversa mediante un espaciador pequeño. Si es necesario para el vector de expresión elegido, pueden añadirse nucleótidos y T terminales en 3' que forman sitios de restricción. El transcrito de ARN resultante se pliega de nuevo sobre sí mismo para formar una estructura en tallo-bucle.
Modo de administración: El ARN de interferencia puede administrarse por ejemplo mediante aerosol, administración bucal, dérmica, intradérmica, por inhalación, intramuscular, intranasal, intraocular, intrapulmonar, intravenosa, intraperitoneal, nasal, ocular, oral, ótica, parenteral, en parche, subcutánea, sublingual, tópica o transdérmica.
La administración puede ser directamente al ojo mediante administración al tejido ocular tal como administración periocular, conjuntiva, por debajo de la cámara de Tenon, intracameral, intravítrea, intraocular, subretiniana, subconjuntival, retrobulbar, intracanalicular o supracoroidal; mediante inyección, mediante aplicación directa al ojo usando un catéter u otro dispositivo de colocación tal como un gránulo retiniano, inserto intraocular, supositorio o un implante que comprende un material poroso, no poroso o gelatinoso; mediante pomadas o gotas oculares tópicas; o mediante un dispositivo de liberación lenta en el fondo del saco o implantado adyacente a la esclerótica (transesclerótica) o dentro del ojo. La inyección intracameral puede ser a través de la córnea hacia la cámara anterior para permitir que el agente alcance la malla trabecular. La inyección intracanalicular puede ser en los canales calectores venosos que drenan el canal de Schlemm o en el canal de Schlemm.
La administración puede ser directamente al oído mediante, por ejemplo, pomadas o gotas éticas tópicas, dispositivos de liberación lenta en el oído o implantados adyacentes al oldo. La administración local incluye las vías de administración ótica, intramuscular, al interior de la cavidad timpánica e inyección intracoclear. Además, pueden administrarse agentes al oído interno mediante la colocación de Gelfoam, o producto adherente y absorbente similar, empapados con el ARN de intenerencia frente a la membrana de comunicación del oído medio/interno o estructura adyacente.
La administración puede ser directamente a los pulmones, mediante, por ejemplo, una preparación aerosol izada, y mediante inhalación por medio de un inhalador o un nebulizador, por ejemplo.
Los modos de administración adicionales incluyen comprimidos, píldoras y cápsulas, todos los cuales pueden formularse por un experto habitual en la técnica.
Sujeto: Un sujeto que necesita tratamiento para un estado relacionado con TNFa o que corre el riesgo de desarrollar un estado relacionado con TNFa es un ser humano u otro mamífero que tiene un estado inflamatorio relacionado con TNFa o tiene aja seco o corre el riesgo de desarrollar un estado inflamatorio relacionado con TNFa u ojo seco. Un estado inflamatorio relacionado con TNFa incluye, por ejemplo, conjuntivitis alérgica, inflamación ocular, dermatitis, rinitis o asma asociada con una actividad no deseada o in apropiada de TNFa tal como se menciona en el presente documento.
Estructuras oculares asociadas con un estado relacionado con TNFa pueden incluir el aja, la retina, la coroides, el cristalino, la córnea, la malla trabecular, el iris, el nervio óptico, la papila óptica, la esclerótica, la cámara acuosa, la cámara vítrea, el cuerpo ciliar o un segmento posterior, por ejemplo.
Un sujeto también puede ser una célula ocular, cultivo celular, órgano o un tejido u órgano ex vivo.
Formulaciones y dosificación: Las formulaciones farmacéuticas comprenden ARN de interferencia, o sales de los mismos, de la invención hasta un 99% en peso mezclados con un medio portador fisiológicamente aceptable tal como agua, tampón, solución salina, glicina, ácido hialurónico, manitol y similares.
Los ARN de intenerencia de la presente invención se administran como disoluciones, suspensiones o emulsiones. Los siguientes son ejemplos de posibles formulaciones realizadas por esta invención.
Cantidad en % en peso ARN de interferencia hasta el 99; 0,1-99; 0,1 -50;
0,5 -10,0
Hidroxipropilmetilcelulosa
0,5
Cloruro de sodio
0,8
Cloruro de benzalconio
0,01
EDTA
0,01
NaOH/HCI
c.s.p pH 7,4
Agua purificada (libre de ARNasa)
C.S.p 100 mi
Cantidad en % en peso ARN de interferencia hasta el 99; 0,1-99; 0,1 -50; 0,5 -10,0 Solución salina tamponada con fosfato 1,0 Cloruro de benzalconio 0,01 Polisorbato 80 Agua purificada (libre de ARNasa) c.s.p hasta el 100%
ARN de interferencia Fosfato de sodio monobásico Fosfato de sodio dibásico (anhidro)
Cantidad en % en peso hasta el 99; O. 1-99; 0,1 -50; 0,5 -10,0 0,05 0,15
Cloruro de sodio EDTA de disodio Cremophor EL Cloruro de benzalconio HCI ylo NaOH Agua purificada (libre de ARNasa)
0,75 0,05 0,1 0,01 pH 7,3-7,4 c.s.p hasta el 100%
Cantidad en % en peso
ARN de interferencia
hasta el 99; 0,1-99; 0,1 -50; 0,5 -10,0
Solución salina tamponada con fosfato
1,0
Hidroxipropil-p-ciclodextrina
4,0
Agua purificada (libre de ARNasa)
c.s.p hasta el 100%
Generalmente, una cantidad eficaz de los ARN de interferencia de realizaciones de la invención da como resultado una concentración extracelular en la superficie de la célula diana de desde 100 pM hasta 1000 nM, o desde 1 nM hasta 400 nM, o desde 5 nM hasta aproximadamente 100 nM, o de aproximadamente 10 nM. La dosis requerida para alcanzar esta concentración local variará dependiendo de varios factores incluyendo el método de administración, el sitio de administración, el número de capas de células entre el sitio de administración y la célula o tejido diana, si la administración es local o sistémica, etc. La concentración en el sitio de administración puede ser considerablemente superior que en la superficie de la célula o tejido diana. Se administran composiciones tópicas a la superficie del órgano diana de una a cuatro veces al día, o en un programa de administración extendido tal como diariamente, semanalmente, bisemanal mente, mensualmente o más largo, según el criterio rutinario de un médico experto. El pH de la formulación es de aproximadamente pH 4-9, o de pH 4,5 a pH 7,4.
Se espera que el tratamiento terapéutico de pacientes con los ARNip dirigidos contra ARNm de TACE o ARNm de TNFR1 sea beneficioso con respecto a tratamientos con moléculas pequeñas aumentando la duración de la acción, permitiendo de ese modo una dosificación menos frecuente y un mayor cumplimiento del paciente.
Una cantidad eficaz de una formulación puede depender de factores tales como la edad, la raza y el sexo del sujeto, la gravedad del estado relacionado con TNFa, la tasa de recambio proteínaltranscrito génico diana, la potencia del ARN de interferencia y la estabilidad del ARN de interferencia, por ejemplo. En una realización, el ARN de interferencia se administra por via tópica a un órgano diana y alcanza un tejido que contiene ARNm de TACE o ARNm de TNFR1 a una dosis terapéutica mejorando de ese modo un proceso relacionado con TNFa.
Portadores aceptables: Un portador aceptable se refiere a los portadores que provocan como máximo, de poca a ninguna irritación ocular, proporcionan conservación adecuada si es necesario y administran uno o más ARN de interferencia de la presente invención en una dosificación homogénea. Un portador aceptable para la administración de ARN de interferencia de realizaciones de la presente invención incluye los reactivos de transfección basada en lipidos catiónicos TranslT"-TKO (Mirus Corporation, Madison, WI), LlPOFECTIN®, Lipofectamine, OLlGOFECTAMINE™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) o DHARMAFECT ™ (Dharmacon, Lafayette, CO); policationes tales como polietilenimina; péptidos catiónicos tales como Tat, poliarginina o penetratina (péptido Antp); o liposomas. Los liposomas se forman a partir de lipidos que forman vesiculas convencionales y un esterol, tal como colesterol, y pueden incluir por ejemplo una molécula de direccionamiento tal como un anticuerpo monoclonal que tiene afinidad de unión por antígenos de superficie de células endoteliales. Además, los liposomas pueden ser liposomas pegilados.
Los ARN de interferencia pueden administrarse en disolución, en suspensión o dispositivos de administración bioerosionables o no bioerosionables. Los ARN de interferencia pueden administrarse solos o como componentes de conjugados definidos, covalentes. Los ARN de interferencia también pueden complejarse con lipidos catiónicos, péptidos catiónicos o polímeros cati6nicos; complejarse con proteínas, proteínas de fusión o dominios de proteínas con propiedades de unión a ácido nucleico (por ejemplo, protamina); o encapsularse en nanoparticulas. Puede lograrse una administración especifica de tejido o célula mediante la inclusión de un resto de direccionamiento apropiado tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
Para administración oftálmica, ática o pulmonar, puede combinarse un ARN de interferencia con conservantes, codisolventes, tensioactivos, potenciado res de la viscosidad, potenciadores de la penetración, tampones, cloruro de sodio o agua pulmonar, óptica y oftalmológicamente aceptables para formar una suspensión O disolución acuosa, estéril. Pueden prepararse formulaciones de disolución disolviendo el ARN de interferencia en un tampón acuoso isotónico fisiológicamente aceptable. Además, las disoluciones pueden incluir un tensioactivo aceptable para ayudar en la disolución del inhibidor. Pueden añadirse agentes de formación de viscosidad, tales como hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, metilcelulosa, polivinilpirrolidona o similares a las composiciones de la presente invención para mejorar la retención del compuesto.
Con el fin de preparar una formulación de pomada estéril, se combina el ARN de interferencia con un conservante en un vehiculo apropiado, tal como aceite mineral, lanolina líquida o vaselina blanca. Pueden prepararse formulaciones de gel estériles suspendiendo el ARN de interferencia en una base hidrófila preparada a partir de la combinación de, por ejemplo, CARBOPOL®-940 (BF Goodrich, Charlotte, NC), o similares, según métodos conocidos en la técnica. Puede usarse VISCOAT" (Al con Laboratories, Inc., Fort Worth, TX) para inyección intraocular, por ejemplo. Otras composiciones de la presente invención pueden contener agentes potenciado res de la penetración tales como Cremephor y TWEEN® 80 (monolaurato de polioxietilensorbitano, Sigma Aldrich, SI. Louis, MO), en caso de que el ARN de interferencia sea menos penetrante en el órgano o tejido de interés.
Kits: También se describe en el presente documento un kit que incluye reactivos para atenuar la expresión de un ARNm tal como se menciona en el presente documento en una célula. El kit contiene un vector de expresión de ARNhp o un ARNip. Para vectores de expresión de ARNhp no virales y ARNip, el kit también puede contener un reactivo de transfección u otro vehiculo de administración adecuado. Para vectores de expresión de ARNhp virales, el kit puede contener el vector viral y/o los componentes necesarios para la producción del vector viral (por ejemplo, una línea celular de empaquetamiento así como un vector que comprende el molde del vector viral y vectores auxiliares adicionales para el empaquetamiento). El kit también puede contener vectores de expresión de ARNhp o ARNip control negativo o pOSitivo (por ejemplo, un ARNip control que no selecciona como diana o un ARNip que selecciona como diana Un ARNm no relacionado). El kit también puede contener reactivos para evaluar la reducción del gen diana previsto (por ejemplo, cebadores y sondas para PCR cuantitativa para detectar el ARNm diana y/o anticuerpos contra la proteína correspondiente para inmunotransferencias de tipo Western). Alternativamente, el kit puede comprender una secuencia de ARNip o una secuencia de ARNhp y los materiales e instrucciones necesarios para generar el ARNip mediante transcripción in vitro o para construir un vector de expresión de ARNhp.
Se describe además una combinación farmacéutica en forma de kit que incluye, en combinación empaquetada, un medio portador adaptado para recibir un medio de envase en confinamiento estrecho con el mismo y un primer medio de envase que incluye una composición de ARN de interferencia y un portador aceptable. Tales kits pueden incluir además, si se desea, uno o más de diversos componentes de kit farmacéuticos convencionales, tales como,
5 por ejemplo, envases con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, envases adicionales, etc., tal como resultará fácilmente evidente para los expertos en la técnica. También pueden incluirse en el kit instrucciones impresas, o bien como prospectos o bien como etiquetas, que indican las cantidades de los componentes que van a administrarse, directrices para su administración, y/o directrices para el mezclado de los componentes.
La capacidad del ARN de interferencia de TACE o TNFR1 para in activar los niveles de la expresión de TACE o TNFR1 endógena en, por ejemplo, células epiteliales de córnea humana, se evalúa in vilro tal como sigue. Se siembran en placa células epiteliales de córnea humana transformadas, por ejemplo, la línea celular CEPI-17 (Oflord el al. (1999) Invest Ophthalmol Vis ScL 40:1091-1101), 24 h antes de su transfección en medio de queratinocitos KGM (Cambrex, East Rutherford, NJ). Se realiza la transfección usando DharmaFECT ™ 1 (Dharmacon, Lafayette, COl según las instrucciones del fabricante a concentraciones de ARN de interferencia de TACE o TNFR1 que
15 oscilan entre 0,1 nM -100 nM. Se usan ARN de interferencia control que no seleccionan como diana y ARN de interferencia de lamina A/C (Dharmacon) como controles. Se evalúan los niveles de ARNm diana mediante qPCR 24 h tras la transfección usando, por ejemplo, cebadores directos e inversos TAOMAN® y un conjunto de sondas que abarcan el sitio diana (Applied Siosystems, Foster City, CA). Pueden evaluarse los niveles de proteina diana aproximadamente 72 h tras la transfección (tiempo real dependiente de la tasa de recambio de proteina) mediante inmunotransferencia tipo Western, por ejemplo. Los expertos en la técnica conocen bien técnicas convencionales para el aislamiento de proteinas y/o ARN a partir de células cultivadas. Para reducir la probabilidad de efectos no especificos, inespecificos, se usa la concentración más baja posible de ARN de interferencia de TACE o TNFR 1 que produce el nivel deseado de ¡nactivación en una expresión de gen diana.
Ejemplo 1
25 ARN de interferencia para silenciar especifica mente TNFR1 en células GTM-3
El presente estudio examina la capacidad del ARN de interferencia de TNFR1 para ireducir los niveles de expresión de proteina TNFR1 endógena en células GTM-3 cultivadas.
Se logró la transfección de células GTM-3 (Pang, LH. el al. 1994. Curro Eye Res. 13:51-63) usando concentraciones in vilro convencionales (0,1-10 nM) de ARNip de TNFR1, ARNip libre de RISC control (pi) n.' 1 o ARNip que no selecciona como diana control(pi) n.' 2 (NTC2) y reactivo de transfección DHARMAFEC n.' 1 (Dharmacon, Lafayette, COl. Se disolvieron todos los ARNip en tampón de ARNip 1X, una disolución acuosa de KCI 20 mM, HEPES 6 mM (pH 7,5), MgCl, 0,2 mM. Las muestras control incluían un control de tampón en el que se reemplazó el volumen de ARNip por un volumen igual de tampón de ARNip 1X (-ARNip). Se llevaron a cabo inmunotransferencias de tipo Western usando un anticuerpo anti-TNFR1 (Santa Cruz Siotechnology, Santa Cruz, CA) para evaluar la
35 expresión de proteína TNFR1. Los ARNip de TNFR1 son ARN de interferencia bicatenarios que tienen especificidad por las siguientes dianas: TNFR1ip n.' 1 selecciona como diana la secuencia CAAAGGAACCUACUUGUAC (SEO ID NO: 202) a partir de la que se deriva SEO ID NO: 96; TNFR1 ip n.' 2 selecciona como diana la secuencia GAGCUUGAAGGAACUACUA (SEO ID NO: 203) a partir de la que se deriva SEO ID NO: 97; TNFR1 ip n.' 3 selecciona como diana la secuencia CACAGAGCCUAGACACUGA (SEO ID NO: 204) a partir de la que se deriva SEO ID NO: 98; TNFR1ip n.' 4 selecciona como diana la secuencia UCCAAGCUCUACUCCAUUG (SEO ID NO: 205) a partir de la que se deriva SEO ID NO: 99. Tal como se muestra mediante los datos en la figura 1, los ARNip de TNFR1ip n.' 1, TNFR1ip n.' 2 y TNFR1ip n.' 3 redujeron significativamente la expresión de proteína TNFR1 a las concentraciones de 10 nM y 1 nM en relación con los ARNip control, pero presentaban una eficacia reducida a 0,1 nM. Los ARNip de TNFR1ip n.' 2 y TNFR1ip n.' 3 eran particularmente eficaces. El ARNip de TNFR1ip n.' 4 también mostró una reducción dependiente de la concentración en la expresión de proteína TNFR1 tal como se esperaba.
Lista de secuencias
<110> Yanni, John M.
Chatterton, Jon E.
Senchyna, Diane Michelle
Gamache, Daniel A.
Miller, Steven T.
<120>Inhibición mediada por ARNi de estados relacionados con factor de necrosis tumoral alfa <130> 45263-P019WO
<160> 205 5
<170> Patentln versión 3.3
<210> 1
<211> 3572 10 <212> ADN
<213>Homo sapiens
<400> 1
acctgcactt ctq_c<;¡t cqa9CCt99c q<;¡ta'1aatet teeea<;¡taqq o09cqeqoqa 60 qoq&aaaq&q qatt'1a9909 eta090é999 o09atooo<;¡t cctcccccqa tqt'1a'1oaqt 120 tt.tceqa..a.c occqtcaqqc '1aa99Ot'1eo o&'1a'1&qgt'1 qa<;¡tcq<;¡taq ,,_ooqoq 180 aao.. t'1aqqc a<;¡tetoteot attcct'laec &<¡cqtq<;¡ttc ctttcqtqct 99Oqccqc'la 240 ectoo09at'l acccq99Ol:l: cqqeecccac ea'la'1aete'l aqaa'lett'la ttottt'1ote 300 tcaqaetacq atattctete tttatot .... t ateca'1eaqe atteq<;¡taa'l aa.aa'laqat 360 "taca'1actt oaaeacatqt aqaaacacta etaacttttt caqetttqaa aa99catttt 420 aa.attatacc t'1&catcaaq tactqa.cqt ttttc&caaa atttcaaq<;¡t c<;¡tq<;¡t'l<;¡t'l 480 '1.tq<;¡t•••• acqaaa'ilC9á <;¡taoaetqta .... t09Clan aettctteac t09&eacqt'l 540 <;¡tt99tqa'lc ot'lactotaq nttotaqcc oaeataa'laq at'latqat<;¡t tataatcaqa 600 ateaaeacaq at_coga atataacata 'lagccacttt naqattt<;¡t taatqatacc 660 aaaqacaaaa qaatqttaqt ttataaatct q ... q .. tatCil aq .... t<;¡ttte acqtttqca'l 720 tctccaaaaq tqtqt'l<;¡tta ttt .... a .. qt'l '1at .. at'1aaq aqttqotccc aaaa'lqgtta 780
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taatatqqet atteataatt ct<Ulqactaa tgctctctaq a.aac c:taacc aactac:etta 3300
cagtqaggqc tatacatqgt aqccagttga atttatqqaa tctac:c:aact gtttaqqgcc 3360
ctqatttqet qqqcagtttt tctqtatttt ataagtatct tcatgtatce ctqttaetqa 3420
taggqataca tqctcttaqa aaatteacta ttqqctqqqa gtqgtqgcte atqcctgtaa 3480
tcccaqeact tqqaqaqqet qaqgttqcqc cactacaata caqcctqqgt qaeaqagtga 3540
qactctqcat caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 3572
<210> 2
<211> 2236 5 <212> ADN
<213> Horno sapiens
<400> 2
yctgttqeaa cactqcctca ctcttcccct OCC4ccttCt ctcccctcct ctctqettta 60 attttctcaq aattctctqq actqaqqctc cagttctqqc ctttgqqqtt caagatoact 120 qqqaccaq'lC cgtqatctct atqccoqagt otoaacocto aactqtcacc coaaqqca ct 180 tqqqacgtcc tqqacaqacc qaqtcccqqq aaqccccaqc act'lCcqctq ecacac:tqcc 240 ctqaqcccaa atqqqqqagt qaqaqqccat aqctqtctqq catqqqcctc tccaccgtqc 300 ctqacctqct qctqccactq gtgotcctqq aqctgttqqt qqqaatatac occtcaqqgq 360 ttattqqact qqtccctcac ctaqqqqaca qqqaqaaqaq aqatagtqtq tgtccccaaq 420 qaaaatatat ceaacoteaa aataat tcqa tttqctgtac caagtqccac aaaqqaacct 4ao act tgtacaa tqactgtcca qqcccqqqqc aqqatacqqa ctqcaqqq"q tqtqaqaqcq 540 qctccttc"c cqcttc"9'a" aaccacetca qacactqcct caqctqetcc aaatqccqaa 600 aqqaaatqqq tcaqqtqqaq atctcttctt ycacaqtqqa ccqqqac&cc qtgtgtqqct 660 qcaqqaag"" ccagtaccqq cattattgya gtqaaaacct tttccaqtqc ttca"ttqca 720
qcetetqcet oaatqqqaee gtqcaeetct cotqceaqqa 9aaacaqaaa accgtgtqca 780 c:c:tqceatqe aqqtttettt ctaaqaqa&& .. eq .. gtqtgt etectgtagt .... etqta .. qa 840 aaaqectoqa gtqeacqaaq ttqtqcctae eeeaqattqa qaatqttaaq qqeactqaqq 900 actcaqqcac caeaqtqctq ttqeccet9IJ teattttett tqqtetttqe cttttatcec 960 teetetteat tqqtttaatq tatcqctace aacqqtqqaa qtee.aqcte tacteeattq 1020 tttqtqqqaa atc:qacaeet qaaaaaqa9IJ qqqaqcttqa aqqaactaet actaaqcccc 1080 tqqccccaaa cccaaqette ac¡t.cccactc cagqc:ttcac ccccaeectq qqctteagtc 1140 ecgtqeecaq ttecacctte acctccaqct ccacctatae ceccqgtqae tqteeeaact 1200 ttqcqqctcc ccqcaqaqaq c¡¡tqqcaccac: cctatcaqqq qqctqaecce atecttqcqa 1260 caqcectcqc ctc:cqaceee atecccaaco ccettcaqaa qtqqqaqqac aqcqceeaca 1320 aqccaeaqaq cctaqacact qatqaeeccq cq"cqetqta eqecqtqqtq qaqaacc¡¡tqc 1380
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<210> 3 5 <211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia diana
<400> 3 qctctcaqac
taco;¡atatt 19
<210> 4 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Hebra sentido con NN en 3'
<220> <221> misc_ARN <222> (1) .. (19) <223> ribonucleótidos
<220> <221> misc_feature <222> (20) .. (21) <223> cualquiera, A, T/U, e, G
<400> 4 qcueucaqac
uaeqauauun n 21
<210> 5 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Hebra antisentido con NN en 3'
<220> <221> misc_ARN
27
<222>(1) .. (19)
<223>ribonucleótidos
<220> 5 <221> misc_feature
<222>(20) .. (21)
<223>cualquiera, A, T/U, e, G
<400>5
aallaucquaq ucuqaqaqcn n 21
<210>6 <211>21
<212>ARN 15 <213> Artificial
<220>
<223>Hebra sentido
20 <400> 6
qcucucaqac uacqauauuu u 21
<210>7 <211>21
<212>ARN
<213>Artificial
<220>
<223>Hebra antisentido 30
<400>7
aauaucquaq ucuqaqaqcu u 21
<210>8 35 <211>19
<212>ARN
<213> Artificial
<220> <223> Hebra sentido
<400> 8 9cucucaqac
uacqauauu 19
<210> 9 <211>19 <212> ARN <213> Artificial
<220> <223> Hebra antisentido
<400> 9 aauaucguaq ucuqaqaqc
19
<210> 10 <211>48 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Dúplex en horquilla con bucle
<220> <221> misc_ARN <222> (1) .. (19) <223> ribonucleótidos
<220> <221> misc_feature <222> (20) .. (27) <223> cualquiera, A, T/U, e, G
29
<220>
<221>misc_feature
<222>(28) .. (48)
<223>ribonucleótidos
<400>10
qcucucaqac uacqauauun nnnnnnnaau aucquaqucu qaqaqcuu 48
<210>11 <211>25
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Hebra sentido
<400>11
goucucaqac u.cqauauuc ucucu 25
<210>12 <211>25
<212>ARN
<213>Artificial
<220>
<223>Hebra sentido
<400>12
qcucuoagac uacq8uauuc uCUCU 25
<210>13
<211>27
<212>ARN
<213>Artificial
30
<220> <223> Hebra antisentido
5
<400> 13 agaqagaaua ucquaqucug aqaqcuu 27
10
<210> 14 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223>Secuencia diana
15
<400> 14 ceagcaqcat tcgqtaaqa 19
20
<210> 15 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
25
<220> <223> Secuencia diana <400> 15
cagcagcatt
<210>16 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
35 <223> Secuencia diana
<400>16
aqeaqoattc
qqtaaqaaa
5
<210> 17 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
10
<220> <223> Secuencia diana
<400>17 aqaqatctac
aqac:ttc:aa 19
15
<210> 18 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
20
<220> <223> Secuencia diana
25
<400> 18 qaaagcqaqt <210> 19 <211>19 <212> ADN <213> Artificial aoaotqtaa 19
<220>
<223>Secuencia diana
<400>19
c:catgaaqaa eacqtqtaa 19
<210>20
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>20 \Jaa\Jaacacc¡ tqtaaatta 19
<210>21 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>21
atcatCIJctt ctaca\Jata
<210>22 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>22 aqaqcaa.ttt a.qctttqa.t 19
<210>23 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana 5
<400>23
'1gttt'1ac'1a '1cacaaac¡a 19
<210>24 10 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220> 15 <223> Secuencia diana
<400>24
t'1atccc;¡qat c;¡qtetagea 19
20 <210> 25
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>25
gegateaaga gaaeaataa 19
<210>26 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial 35
<220>
<223>Secuencia diana
<400> 26 geagtaaaea
ateaateta U
<210> 27 <211>19 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 27 eaatetataa
qaeeattga 19
<210>28 <211> 19 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 28 t:ttcaagaae
gcaqcaata U
<210> 29 <211> 19 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400>29
ttcaagaaeg eagcaataa U
<210>30
<211>19 5 <212> ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana 10
<400>30 teaagaaego aqeaataaa 19
<210>31 15 <211> 19
<212>ADN
<213>Artificial
<220> 20 <223> Secuencia diana
<400>31 toatgtatct 'laacaacga 19
<210>32 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial
30 <220>
<223>Secuencia diana
<400>32
acagcqaetq eaegttgaa 19
<210>33
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
5 <220>
<223>Secuencia diana
<400>33
qattaatqct acttqcaaa 19 10
<210>34 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial 15
<220>
<223>Secuencia diana
<400>34 ctqqagtcct qtqcatqta 19
<210>35 <211>19
<212>
ADN 25 <213> Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>35 tqqaqteetq tgcatqtaa 19
<210>36 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<210>43 <211>19
<212>
ADN 5 <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 36 qqaqtcctqt
qcatqtaat 19
<210>37 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 37 catqtaatqa
aactqacaa 19
<210> 38 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 38 ctatqtcqat yctqaacaa
U
<210> 39 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 39 caaatqtqaq
aaacqaqta 19
<210> 40 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 40 qcatcqqttc
qcattatca 19
<210>41 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223>Secuencia diana
<400> 41 atcqqttcqc
attatcaaa 19
<210> 42 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 42 ccaac¡tcatt
tqaqqatct 19
<220>
<223>Secuencia diana
10 <400> 43
ceqgtcacca qaagtqaaa 19
<210>44
<211>19 15 <212> ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana 20
<400>44
aaaqgctqcc tcctttaaa 19
<210>45 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>45
tttaaactqc aqcgtcaqa 19
<210>46 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>46
agatgc:tQ1;Jt c:atgtgttt 19
<210>47 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>47
atgc:t<¡gtca tgtgtttga 19
<210>48
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>48
tgct<¡gtcat gtgtttgaa 19
<210>49
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
41
<220> <223> Secuencia diana
5
<400> 49 etgqteatqt qtttqaaet 19
10
<210> 50 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
15
<400> 50 tqtaatqaae eqetqaata 19
20
<210>51 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 51 qtaatqaaee
qetqaatat 19
30
<210> 52 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
35
<220> <223> Secuencia diana
<400>52
ctaaqactaa tqctcteta
<210>53 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>53
&qactaatqc tctctaqaa
<210>54 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>54
cctaaccacc taccttaca
<210>55 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>55
tacatqqtaq ccaqttqaa
<210> 56 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 56 tqqtagccaq
ttqaattt .. 19
<210> 57 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 57 tttatqqaat
ctaccaact U
<210> 58 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 58 w .... tctacc
aactqttta
<210> 59 <211> 19 <212> ADN
44
<213>Artificial
5
<220> <223> Secuencia diana <400> 59 accaggccqt gatctctat 19
10
<210> 60 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
15
<220> <223> Secuencia diana
<400> 60 aattcqattt qctgtacca
19
20
<210> 61 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
25
<220> <223> Secuencia diana
<400> 61 tcc¡atttqct gtaccaagt
19
<210>62 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400> 62 acaaagqaac otaottgta
19
<210> 63 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 63 qaaoctactt qtaoaatqa
19
<210> 64 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 64 ctacttqtao
aatqactqt U
<210> 65 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 65
46
tqtqaqageq
getccttca 19
<210> 66 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 66 tcaqqtqqaq
atctcttct 19
<210> 67 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 67 caqqtqqaqa
tctcttctt 19
<210> 68 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 68 aq"accaqta
ccgqcatta 19
<210> 69
47
<211>19
<212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 69 qaacc:agtac
clJ<1c&ttat 19
<210> 70 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 70 aaecagtacc
qqcattatt 19
<210> 71 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 71 ccqqcattat
tqqaqtqaa 19
<210>72 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
48
<220> <223> Secuencia diana
<400> 72 cqqcattatt
qqaQtq&.aa U
<210> 73 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 73 aqcctqqagt
qcacqaaQt 19
<210> 74 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 74 ctcctcttca
ttqQtttaa U
<210> 75 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
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<210>76 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>76 qtttaatqta tcqctacca 19
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<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>77 tttaatqtat coctaccaa 19
<210>78 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>78
aqtccaag:ct ctactccat
<210>79 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>79
qaqcttqa"9 qaactacta
<210>80
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>80
cttqaaqqa& ctactac:ta
<210>81
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>81
t.tqaaqqaac tactactaa
<210>82
<211>19
<212>ADN <220>
<213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 82 acaaqccaoa
qaqcctaqa 19
<210> 83 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 83 tqt&cqccqt
qqtqq&qaa 19
<210> 84 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 84 ccqttqeqct
qq&&\JVaat 19
<210> 85 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
52
<223> Secuencia diana
<400> 85 tctaaqqacc
gtcctqc:qa 19
<210> 86 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 86 ctaataqaaa cttqqcact
19
<210> 87 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 87 taataqaaac
ttqqcactc 19
<210> 88 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
53
<400> 88
aataqaaact tqqcactcc
<210> 89
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia diana
<400> 89
atac;¡aaactt qqcactcct
<210> 90
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia diana
<400> 90
taqaaacttq qcactcctq
<210> 91
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia diana
<400> 91
ataqcaaqct qaactqtcc
<210>92 <213>Artificial
<211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 92 taqcaaqctc¡
aactqtcct 19
<210> 93 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 93 aqca&qctqa actqtccta
l!J
<210> 94 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 94 qcaac¡ctqaa
ctqtcctaa 19
<210> 95 <211>19 <212> ADN
55
5
<220> <223> Secuencia diana <400> 95 tqaactgtcc taaqqcaqq 19
10
<210> 96 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
15
<220> <223> Secuencia diana
<400> 96 caaaoqaacc
tacttgtac 19
20
<210> 97 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
25
<220> <223> Secuencia diana
<400> 97 qaqcttqaaq
qaactacta 19
<210>98
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
5 10
<400> 98 cacaqaqcct aqacactga <210> 99 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Secuencia diana 19
15
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20
<210>100 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400>100
t'19a<,Jctqtt
<210>101
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>101
qacaqqqaqa aqaqaqata
<210> 102 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 102 qqqaqaaqaq
aqataqtqt U
<210> 103 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 103 qaqaaqaqaq
ataqtqtqt 19
<210> 104 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 104 qaaqaqaqat
aqtqtqtqt 19
<210> 105
58
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
5 <220>
<223>Secuencia diana
<400>105
qtqtqtqtcc ccaaqqaaa 19 10
<210> 106 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial 15
<220>
<223>Secuencia diana
<400>106
qililaatiltat ccaccctca 19
20 <210>107
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
30 <400> 107
ilaatatatcc aecctcaaa 19
<210>108
<211>19 35 <212> ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>108
etqtaeeaaq tqecaeaaa
<210>109 <211>19
<212>AON
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>109 aecaaqtqee aeaaaqqaa 19
<210>110 <211>19
<212>AON
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>110 eeaaqtqeeaeaaaqqaae 19
<210> 111
<211> 19
<212> AON
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia diana
<400> 111
ccacaaaqqaacctacttq
U
<210> 112
<211>19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia diana
<400> 112
caaaqqaacc tactt9tac
19
<210>113
<211>19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia diana
<400> 113
aaaqqllllcct actt9taca
19
<210> 114
<211>19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia diana
<400> 114
qatacqqact qC&qqqa9t
19
<210>115 <211>19 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400>115 cgqactqcaq qqaqtqtqa
19
<210> 116 <211>19 <212>AON <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 116 tccttcaecq cttcaqaaa
<210> 117 <211>19 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 117 eaqaaaacca cctcaqaca
19
<210>118 <211>19
<212> ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>118 tqcctcaqct qctccaaat 19
<210>119 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>119 eteeaaatqa cqaaaqqaa 19
<210>120 <211>19
<212> ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>120 tccaaatqccqaaaqqaaa 19
<210>121
<211> 19
<212>ADN
<213>Artificial
63
<220> <400>124 <210> 128 <213>Artificial
<223> Secuencia diana
<400> 121 ccaaatqccq
aaaqqaaat. 19
<210> 122 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 122 qeeqaaaqqa
aat'19<)tca 19
<210> 123 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 123 aqqa .... tqqq tcaq<)tqq ..
19
<210> 124 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
64
gqaaatgqqt
c:aQqtggag 19
<210> 125 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 125 qtgtgtgget
geagqaac¡a 19
<210> 126 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 126 99aaqaaec:a
qtaC:Q9gea U
<210> 127 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 127 eeatc¡eaqqt
ttetttc:ta 19
<211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 128 catqeaqqtt
tctttctaa 19
<210> 129 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 129 t<¡caqgtttc
tttctaa<¡a U
<210> 130 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 130 aqgtttcttt
ctaagaqaa U
<210> 131 <211> 19 <212> ADN
<220> <223> Secuencia diana
<400> 131 qqtttctttc
taaqaqaaa 19
<210> 132 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 132 aqaq&a&acq aqtqtqtct
19
<210> 133 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 133 qaqtqtqtct
cctqtagta 19
<210> 134 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>134
ctqtaqtaac tqt..aq ...... 19
5 <210>135 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial 10
<220>
<223>Secuencia diana
<400>135
aqaaaaqcct qqaqtqcac 19
15 <210>136
<211>19
<212>ADN 20 <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia diana
<400>136
ttqaqaatqt taaqqqcac 19
<210>137
<211>19 30 <212> ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana 35
<400>137
tgttaagggc
actgaggac 19
<210> 138 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 138 ggtcattttc
tttggtctt 19
<210> 139 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 139 cctcctcttc
attggttta 19
<210> 140 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 140 tcctcttcat
tggtttaat 19
<210> 141
69
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
5 <220>
<223>Secuencia diana
<400>141
ctcttcattq qtttaatqt 19
<210>142 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial 15
<220>
<223>Secuencia diana
<400>142 tcttcattqq tttaatqta 19
20 <210>143
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>143
cttcattqqt ttaatqtat 19
<210>144 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial <220>
<223>Secuencia diana
<400>144
tccaaqcl:ct actccattq
<210>145
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>145
ctccattqtt tqtqgqa...
<210>146 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223> Secuencia diana
<400>146
qqqaaatcqa c:acctgaaa
<210>147
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>147
tqaaqqaact actactaaq
<210>148
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>148
acctccaqct cc:acctata
<210>149
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>149
=0808a9= acaqaqcct
<210>150 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>150
acqccqtqqt qqaqaacqt
U
<210>151 <211>19
<212>ADN 5 <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia diana
10 <400> 151
qqaaqqaatt c<¡tqcggcg 19
<210>152
<211>19 15 <212> ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana 20
<400>152 tqaqcqaeea cqaqatcqa 19
<210>153 25 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223> Secuencia diana
<400>153
qcgaqqeqca ataeaqeat
35 <210>154 <211>19
<212>ADN <220>
<213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 154 tgqqetqcet
gqagqaeat
<210> 155 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 155 eateaaqtac
tqaacqttt 19
<210>156 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 156 tcqtqqtqqt
qqatqqtaa U
<210> 157 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<223>Secuencia diana
<400>157
qaaaqc'1aqt acactqtaa 19
5 <210>158
<211>19
<212>ADN 10 <213> Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
15 <400> 158
qaqcctqact ctaqqqttc 19
<210> 159
<211>19 20 <212> ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana 25
<400>159
ccacataaqa '1atqatgat U
<210>160
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana <220>
<400> 160 c,.¡'aaqaqa¡'
qa¡'qa¡,qtt 19
5
<210> 161 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
10
<220> <223> Secuencia diana
<400> 161 cqaa¡'ataac
ataqaqcca 19
15
<210> 162 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
20
<220> <223> Secuencia diana
25
<400> 162 qt¡'aatqa¡' ... Cc&&&qaca <210>163 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial 19
<223>Secuencia diana
<400>163
ctqaaqatat caaq&atqt 19
<210>164
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>164
atqaagaqtt qctcooaaa
<210>165 <211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>165
atgaaqaaca cqtqtaaat
<210>166
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>166
aattattgqt gqtagoaqa
<210>167 <211>19
<212>ADN
U
U
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia diana
<400> 167
atcatc9ctt ctaca9ata
<210> 168
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial <400>173
<220> <223> Secuencia diana
<400> 168 atacatqqqc
a9aqqqqaa 19
<210> 169 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 169 999C"'9a999 q...a9aqaqt
19
<210> 170 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<223> Secuencia diana
<400> 170 gqaaqaqaqt
acaact/lCl a 19
<210> 171 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 171 qaagaqaqta
caactacaa 19
<210> 172 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 172 gagagtacaa
et:aeaaatt U
<210> 173 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
gctaattqae aqaqttqat 19
<210>174
<211>19 5 <212> ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana 10
<400>174 cqqaacactt catqqqata 19
<210>175
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220> 20 <223> Secuencia diana
<400>175
qqataatqca qqttttaaa l!/
25 <210> 176
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
30 <220>
<223>Secuencia diana
<400>176
aQ'actataail atacac;rata 19
<210>177
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>177
q .... tac .. qat aqaqcaqat 19
<210>178
<211>19
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia diana
<400>178
qqtaaaacct qqtqaaaaq
<210>179
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400> 179
qtgaaaagca ctacaacat 19
<210> 180
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial <220>
<223> Secuencia diana
<400>180
qaqqaaqcat ctaaaqttt
<210>181
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>181
tatqqqaact cttqqatta
<210>182
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>182
tqacgaqeac aaaqaatta
<210>183
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400> 183 qcaeaaaqaa
ttatqgtaa 19
5
<210> 184 <211> 19 <212> AON <213> Artificial
10
<220> <223> Secuencia diana
<400> 184 \1Qttacaact catqaattq
19
20
<210> 185 <211> 19 <212> AON <213> Artificial <220> <223> Secuencia diana
25
<400> 185 actcataaat taacacata 19
30
<210> 186 <211> 19 <212> AON <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 186
gt99cqatcll cqllqaacll"
<210> 187 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 187 ctaeaaqaee attqaaaqt
<210> 188 <211>19 <212>ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 188 qaaeqcaqea
ataaaqttt u
<210> 189 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 189 qeaataaaqt
ttqtgqqaa 19
<210> 190 <211>19
<212>ADN
<213> Artificial
5
<220> <223> Secuencia diana
<400> 190 caataaagtt tgtonqaac
19
10
<210>191 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
15
<220> <223> Secuencia diana
20
<400> 191 qa9'9<Jt9'1&t <210> 192 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial qaaqqaqaa 19
<220>
<223>Secuencia diana
<400>192
9'1atqaagqa qaagaqtqt 19
<210>193
<211>19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223> Secuencia diana
5
<400> 193 gcatcatqta tctgaaaa.a 19
10
<210>194 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
15
<400> 194 caggaaatgc tgaagatga 19
20
<210> 195 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400>195
gaatggcaaa tqtgagaaa 19
<210>196 30 <211> 19
<212>ADN
<213>Artificial
<220>
<223>Secuencia diana
<400>196
qqatgtaatt qaaeqattt
<210> 197 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 197 gtqqataaqa aattqqata
19
<210> 198 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 198 qqataaac:aq tatqaatc:t
19
<210> 199 <211>19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400> 199 cctttaaact
qc:aqcqtc:a 19
<210>200
5
<211> 19 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Secuencia diana
10
<400> 200 cgtqttgaca. gcaaa.gaaa 19
15
<210> 201 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
20
<400> 201 gcaaagaaac agagtgcta 19
25
<210> 202 <211> 19 <212> ARN <213> Artificial
<220> <223> Secuencia diana
<400>202
caaaqgaacc uacuuguac
<210>203 <211>19
<212>ARN
<213>Artificial
<220>
<223> Secuencia diana 5
<400> 203
qageuugaag gaacuacua
<210> 204 10 <211> 19
<212> ARN
<213> Artificial
<220> 15 <223> Secuencia diana
<400>204
cacaqaqccu agacacuga 19
20 <210> 205
<211> 19
<212> ARN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia diana
<400> 205
uccaa9Cucu acuccauuq 19
30 667,668,669,677,678,785,786,788,791,792,804,813, 824,838,843,877,884,929,959,960,961, 963,964,965,970,973,974,1000,1002,1013,1026, 1053, 1056, 1057, 1058, 1161, 1315, 1318, 1324, 1357,1360,1383,1393,1420,1471,1573,1671,2044, 2045, 2046, 2047, 2048, 2089, 2090, 2091 6 2092 para su uso en el tratamiento o la prevención de un estado ocular relacionado con TNFa en un sujeto que lo necesita, en donde dicho estado es ojo seco, conjuntivitis alérgica o inflamación ocular.

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos, en donde el ARN de interferencia
    tiene como diana un ARNm que corresponde a una cualquiera de SEO ID NO: 3, SEO ID NO: 14 -SEO ID
    NO: 58, y SEO ID NO: 155 -SEO ID NO: 201, para su uso en el tratamiento o la prevención de un estado
    5
    ocular relacionado con TNFa en un sujeto que lo necesita, en donde dicho estado es ojo seco, conjuntivitis
    alérgica o inflamación ocular.
  2. 2.
    Un ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos, comprendiendo el ARN de
    interferencia: una hebra de nucle6tidos sentido, una hebra de nucleótidos antisentido y una regi6n de
    complementariedad contigua al menos casi perfecta de al menos 19 nucle6tidos; en donde la hebra
    antisentido hibrida en condiciones fisiológicas con una parte del ARNm que corresponde a SEO ID NO: 1
    que comprende el nucle6tido 297, 333, 334, 335, 434, 470, 493, 547, 570, 573, 618, 649, 689, 755, 842,
    844,846,860,878,894,900,909,910,913,942,970,984, 1002, 1010, 1053, 1064, 1137, 1162, 1215,
    1330, 1334, 1340, 1386, 1393, 1428, 1505, 1508, 1541, 1553, 1557, 1591, 1592, 1593, 1597, 1604, 1605,
    1626,1632,1658,1661,1691,1794,1856,1945,1946,1947, 1958,2022,2094,2100,2121,2263,2277,
    15
    2347,2349,2549,2578,2595,2606,2608,2629,2639, 2764, 2766, 2767, 2769, 3027, 3028, 3261, 3264,
    3284, 3313, 3317, 3332 ó 3337; para su uso en el tratamiento o la prevención de un estado ocular
    relacionado con TNFa en un sujeto que lo necesita, en donde dicho estado es ojo seco, conjuntivitis
    alérgica o inflamación ocular.
  3. 3.
    Un ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos, comprendiendo el ARN de
    interferencia: una hebra de nucleótidos sentido, una hebra de nucle6tidos antisentido y una regi6n de
    complementariedad contigua al menos casi perfecta de al menos 19 nucle6tidos; en donde la hebra
    antisentido hibrida en condiciones fisiológicas con una parte del ARNm que corresponde a SEO ID NO: 2
    que comienza en el nucleótido 124, 328, 387, 391,393, 395, 406, 421,423,444,447,455,459,460,467,
    469,470,471,475,479,513,517,531,543,556,576,587, 588, 589, 595, 601, 602, 611, 612, 651, 664,
    El ARN de interferencia para su uso según la reivindicación 2, que comprende además un segundo ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucle6tidos y que comprende: una hebra de nucle6tidos sentido, una hebra de nucleótidos antisentido y una región de complementariedad al menos casi perfecta de al menos 19 nucleótidos; en donde la hebra antisentido del segundo ARN de interferencia hibrida en condiciones fisiológicas con una parte del ARNm que corresponde a SEO ID NO: 2 que comprende el
    nucleótido 124, 328, 387, 391, 393, 395, 406, 421, 423, 444, 447, 455, 459, 460, 467, 469, 470, 471, 475, 479,513,517,531,543,556,576,587,588,589,595,601, 602, 611, 612, 651, 664, 667, 668, 669, 677, 678, 785, 786, 788, 791, 792, 804, 813, 824, 838, 843, 877, 884, 929, 959, 960, 961, 963, 964, 965, 970, 973,974, 1000, 1002, 1013, 1026, 1053, 1056, 1057, 1058, 1161, 1315, 1318, 1324, 1357, 1360, 1383, 1393, 1420, 1471, 1573, 1671, 2044, 2045, 2046, 2047, 2048, 2089, 2090, 2091 62092.
  4. 5. El ARN de interferencia para su uso según la reivindicaci6n 3, que comprende además un segundo ARN de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y que comprende: una hebra de nucle6tidos sentido, una hebra de nucleótidos antisentido y una región de complementariedad al menos casi perfecta de al menos 19 nucle6tidos; en donde la hebra antisentido del segundo ARN de interferencia hibrida en condiciones fisiol6gicas con una parte del ARNm que corresponde a SEO ID NO: 2 que comprende el
    nucleótido 297, 333, 334, 335, 434, 470, 493, 547, 570, 573, 618, 649, 689, 755, 842, 844, 846, 860, 878, 894,900,909,910,913,942,970,984, 1002, 1010, 1053, 1064, 1137, 1162, 1215, 1330, 1334, 1340, 1386,1393,1428,1505,1508,1541,1553,1557,1591, 1592, 1593, 1597, 1604, 1605, 1626, 1632, 1658, 1661,1691,1794,1856,1945,1946,1947,1958,2022, 2094, 2100, 2121, 2263, 2277, 2347, 2349, 2549, 2578,2595,2606,2608,2629,2639,2764,2766,2767, 2769, 3027, 3028, 3261, 3264, 3284, 3313, 3317, 3332 ó 3337, en donde el ARN de interferencia es para su administraci6n al ojo del sujeto.
  5. 6. El ARN de interferencia para su uso según la reivindicaci6n 2 ó 3, en donde la hebra de nucle6tidos sentido y la hebra de nucle6tidos antisentido están conectadas por una hebra de nucle6tidos en bucle.
    Una molécula de ARNip bicatenario que regula por disminución la expresión de un gen de TACE mediante interferencia de ARN, en donde: cada hebra de la molécula de ARNip tiene independientemente de
    aproximadamente 19 a aproximadamente 27 nucle6tidos de longitud; y una hebra de la molécula de ARNip comprende una secuencia de nucle6tidos que tiene complementariedad sustancial con un ARNm correspondiente al gen de TACE de manera que la molécula de ARNip dirige la escisión del ARNm mediante interferencia de ARN para su uso en el tratamiento o la prevención de un estado ocular relacionado con TNFa en un sujeto que lo necesita, en donde dicho estado es ojo seco, conjuntivitis alérgica o inflamación ocular.
  6. 8.
    Una molécula de ARNip bicatenario que regula por disminución la expresión de un gen de TNFR1 mediante interferencia de ARN, en la que: cada hebra de la molécula de ARNip tiene independientemente de aproximadamente 19 a aproximadamente 27 nucleótidos de longitud; y una hebra de la molécula de ARNip comprende una secuencia de nucleótidos que tiene complementariedad sustancial con un ARNm correspondiente al gen de TNFR1 de manera que la molécula de ARNip dirige la escisión del ARNm mediante interferencia de ARN, para su uso en el tratamiento o la prevención de un estado ocular
    relacionado con TNFa en un sujeto que lo necesita, en donde dicho estado es ojo seco, conjuntivitis alérgica o inflamación ocular.
  7. 9.
    Un ARN de interferencia monocatenario que tiene una longitud de 19 a 49 nUcleótidos, en donde el ARN de interferencia monocatenario híbrida en condiciones fisiológicas con una parte del ARNm que corresponde a SEO ID NO: 1 que comprende el nucleótido 297, 333, 334, 335, 434, 470, 493, 547, 570, 573, 618, 649, 689, 755, 842, 844, 846, 860, 878, 894, 900, 909, 910, 913, 942, 970, 984, 1002, 1010, 1053, 1064, 1137, 1162,1215,1330,1334,1340,1386,1393,1428,1505, 1508, 1541, 1553, 1557, 1591, 1592, 1593, 1597, 1604,1605,1626,1632,1658,1661,1691,1794,1856, 1945, 1946, 1947, 1958,2022,2094,2100,2121, 2263, 2277, 2347, 2349, 2549, 2578, 2595, 2606, 2608, 2629, 2639, 2764, 2766, 2767, 2769, 3027, 3028, 3261, 3264, 3284, 3313, 3317, 3332 ó 3337, y el ARN de interferencia tiene una región de complementariedad contigua al menos casi perfecta con la parte hibridante del ARNm correspondiente a SEO ID NO: 1, para su uso en el tratamiento o la prevención de un estado ocular relacionado con TNFa en un sujeto que lo necesita, en donde dicho estado es ojo seco, conjuntivitis alérgica o inflamación ocular.
  8. 10.
    El ARN de interferencia para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el ARN de interferencia se administra mediante expresión in vivo desde un vector de expresión que puede expresar el ARN de interferencia.
  9. 11.
    El ARN de interferencia para su uso según la reivindicación 3, en donde el ARN de interferencia se administra mediante un vector de expresión que puede expresar el ARN de interferencia in vivo, yen donde cada hebra de la molécula de ARNip tiene independientemente de aproximadamente 19 nucleótidos a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud, o de aproximadamente 19 nucleótidos a aproximadamente 21 nucleótidos de longitud.
  10. 12.
    El ARN de interferencia para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 10 Y 11, en donde el ARN de interferencia es un ARNhp o un ARNip.
    "TI
    eC'
    e:
    TNFR1ip n.o 3
    TNFR1ip n.o 4
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