ES2430827T3

ES2430827T3 - Preparación de organismos con crecimiento más rápido y/o rendimiento más alto

Info

Publication number: ES2430827T3
Application number: ES05771370T
Authority: ES
Inventors: Piotr Puzio; Agnes Chardonnens
Original assignee: Metanomics GmbH
Current assignee: BASF Metabolome Solutions GmbH
Priority date: 2004-07-31
Filing date: 2005-07-21
Publication date: 2013-11-21
Anticipated expiration: 2025-07-21
Also published as: WO2006013010A2; AU2005268943A1; US20100050296A1; EP1774004A2; WO2006013010A3; CN101001956A; CN104178511A; BRPI0514003A; CA2575127A1; JP2008507960A; CN103397050A; EP1774004B1; AU2005268943B2; CN101001956B

Abstract

Un método para preparar una planta con crecimiento más rápido y/o rendimiento incrementado y/o biomasa incrementada en comparación con una planta de referencia, método que comprende incrementar la actividad de SEQ ID NO: 2 en dicha planta o en una o más partes de la misma en comparación con un organismo de referencia, en donde la actividad del polipéptido de SEQ ID NO: 2 se incrementa introduciendo un polinucleótido en la planta, o en una o más partes de la misma, polinucleótido que codifica para un polipéptido de SEQ ID NO: 2 codificado por una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo consistente de: (a) molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido de la secuencia de codificación de acuerdo con SEQ ID NO: 1; (c) molécula de ácido nucleico cuya secuencia es derivable de una secuencia de polipéptido codificada por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con (a) o (b), debido a la degeneración del código genético; (d) molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido cuya secuencia es al menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido de SEQ ID NO: 2; o que comprende una secuencia complementaria de los mismos.

Description

Preparación de organismos con crecimiento más rápido y/o rendimiento más alto

La presente invención divulga un método para preparar una planta con un crecimiento más rápido y/o un rendimiento más alto en comparación con una planta de referencia, método que comprende incrementar en dicha planta o en una o más partes de la misma la actividad de SEQ ID NO: 2, en comparación con dicho organismo de referencia, por ejemplo sobre la base de incrementar la cantidad de SEQ ID NO: 1, ARN y/o SEQ ID NO: 2, polipéptidos, ventajosamente sobre la base de la expresión incrementada de SEQ ID NO: 1. La descripción divulga un método para preparar plantas, las cuales crecen más rápido o dan rendimientos más altos, método que comprende una actividad incrementada de SEQ ID NO: 2 en dichos organismos, y una planta cuya actividad de SEQ ID NO: 2 se incrementa así como el rendimiento o biomasa de la misma. Adicionalmente, la descripción también divulga una SEQ ID NO: 2, un polipéptido, un polinucleótido que codifica para la misma y células, plantas, microorganismos y animales útiles transformados con la misma y métodos para preparar productos químicos finos utilizando el asunto divulgado por la presente descripción.

Desde que las plantas útiles fueron cultivadas por primera vez, el incremento en el rendimiento en los cultivos, además de mejorar la resistencia a la tensión abiótica y biótica, ha sido la meta más importante cuando se cultivan nuevas variedades de plantas. Se usan medios tan diversos como arado, fertilización, irrigación, agentes de protección de cultivos, para nombrar unos pocos, para mejorar los rendimientos: Así, los cultivos tienen éxito en incrementar la recolección, por ejemplo, incrementando la fijación de las semillas, y también en la reducción de la pérdida de cultivos, por ejemplo obedeciendo a mal clima, por ejemplo, un clima que es demasiado seco, demasiado húmedo, demasiado caliente o demasiado frio, o debido a una infestación con plagas, tales como, por ejemplo, insectos, hongos o bacterias, complementándose unos con otros. A la vista de la población mundial en rápido crecimiento, un incremento sustancial en el rendimiento, sin extender las áreas económicamente arables, es absolutamente necesario con el fin de proveer alimentos suficientes y, al mismo tiempo, proteger otros espacios naturales existentes.

Los métodos de la genética clásica en el cultivo para el desarrollo de nuevas variedades con mejores rendimientos son complementados crecientemente por métodos genéticos. Así, se han identificado genes que son responsables de propiedades particulares tales como resistencia a tensión abiótica o biótica o control de la velocidad de crecimiento. Genes o productos genéticos interesantes de los mismos pueden ser regulados apropiadamente en las plantas útiles deseadas, por ejemplo, por mutación, (sobre) expresión o reducción/inhibición de tales genes o sus productos, con el fin de alcanzar el rendimiento deseado incrementado o una tolerancia más alta a la tensión.

Lo mismo se aplica a microorganismos y animales útiles, cuya crianza es primaria y especialmente relacionada de la misma forma con alcanzar una biomasa particular o un peso particular más rápidamente, además de una resistencia más alta a tensión biótica o abiótica.

Un ejemplo de estrategia que da como resultado un crecimiento de plantas mejor o más rápidas es incrementar la capacidad fotosintética de las plantas (US 6, 239,332 y DE 19940270). Esta metodología, sin embargo, es prometedora solamente si el rendimiento fotosintético de dichas plantas limita el crecimiento. Otra metodología es modular la regulación del crecimiento de las plantas influyendo en el control del ciclo celular (WO 01/31041, CA 2263067, WO 00/56905, WO 00/37645). Sin embargo, un cambio en la arquitectura de las plantas puede ser un efecto lateral indeseado de una intervención masiva en el control del crecimiento de una planta (WO 01/31041, CA 2263067). Otras metodologías pueden involucrar reguladores transcripcionales putativos como por ejemplo los reivindicados en WO 02/079403 o US 2003/013228. Tales reguladores transcripcionales se presentan frecuentemente en familias de genes, en las cuales los miembros de la familia podrían desplegar una conversación de entrecruzamiento significativa y/o control antagonista. Además la función de los factores de transcripción se basa en la presencia precisa de subsecuencias de reconocimiento en los organismos objetivo. Este hecho podría complicar la transferencia de resultados de especies modelo a organismos objetivos. A pesar de unas pocas metodologías prometedoras, hay aún no obstante una gran necesidad de proveer métodos para preparar organismos con crecimientos más rápidos y rendimientos más altos, en particular plantas y microorganismos, y de proveer tales organismos, en particular plantas y microorganismos.

Es un objeto de la presente invención proveer un método de esta clase para incrementar el rendimiento y/o crecimiento de las plantas.

Hemos encontrado que este objetivo se logra mediante el método inventivo descrito aquí y las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Consecuentemente, la descripción divulga un método para preparar una planta con una velocidad de crecimiento incrementada, esto es con un crecimiento más rápido y/o un rendimiento incrementado en comparación con un organismo de referencia, método que comprende incrementar en dicha planta o en una o más partes de la misma la actividad de SEQ ID NO: 2, en comparación con un organismo de referencia, por ejemplo sobre la base de incrementar la cantidad de polipéptidos de SEQ ID NO: 1, ARN y/o SEQ NO: 2.

La expresión incrementada de SEQ ID NO: 1, en Arabidopsis thaliana se ha encontrado que lleva a un crecimiento acelerado de las plantas y a un peso final incrementado y a una cantidad incrementada de semillas.

La SEQ ID NO: 2 ha sido descrita como una proteína de función no confirmada, la que podría estar involucrada en el metabolismo de la piridoxina y cuya expresión es inducida durante la fase estacionaria. (GenBank Accesion NO: PIR|S55081 para YMR095C) de Saccharomyces cerevisiae. Por lo tanto no se menciona una función clara en la anotación de la ORF. Sin embargo, una comparación por Blastp de la secuencia YMR095C (SEQ ID NO: 2) bajo condiciones estándar revela una homología significativa a SEQ ID NO: 4, 6, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 99, 101, 103, 105, 133 y 135.

Una sorpresa particular fue el hallazgo de que la expresión de SEQ ID NO: 1 de la levadura evolucionariamente distante Saccharomyces cerevisiae incrementa el crecimiento en Arabidopsis thaliana. Puede asumirse que SEQ ID NO: 1 es un gen conservado funcionalmente y que un incremento en la actividad de SEQ ID NO: 2 o de los homólogos específicos 4, 6, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 99, 101, 103, 105, 133 y 135 también lleva a crecimiento más rápido o a un rendimiento incrementado en un organismo de la misma forma como se ha observado de acuerdo con la invención para SEQ ID NO: 2 y en Arabidopsis. Presumiblemente, por lo tanto, la expresión transgénica de otros homólogos distantes de SEQ ID NO: 1 en un organismo también da como resultado el crecimiento más rápido y el rendimiento más alto observados.

En una divulgación, la descripción divulga un método para preparar un organismo, una célula, un tejido, por ejemplo una planta con velocidad de crecimiento incrementada, esto es con crecimiento más rápido y/o rendimiento incrementado, método que comprende incrementar en dicho organismo o en una o más partes del mismo la actividad de SEQ ID NO: 2, por ejemplo sobre la base de incrementar la cantidad de polipéptidos de SEQ ID NO: 1, ARN y/o SEQ ID NO: 2.

“Organismos” significa aquí cualquier organismo que no es un ser humano. Consecuentemente, el término se relaciona

con células procariotas y eucariotas, microorganismos, plantas superiores e inferiores, incluyendo musgos y algas, y con animales o células no humanos. El organismo puede ser unicelular o multicelular.

“Crecimiento incrementado”, “crecimiento más rápido” o “velocidad de crecimiento incrementada” significan aquí que el incremento en peso, por ejemplo de peso fresco, o en biomasa por unidad de tiempo es superior que el de una referencia, en particular del organismo de partida a partir del cual se prepara aquí el organismo no humano divulgado. Un crecimiento más rápido da como resultado preferiblemente un peso final más alto de dicho organismo no humano. Así, por ejemplo, un crecimiento más rápido hace posible alcanzar una etapa de desarrollo particular más temprana o prolongar el crecimiento en una etapa de desarrollo particular. Se da preferencia a alcanzar un peso final más alto.

Los términos “tipo silvestre”, “control” o “referencia” son intercambiables y pueden ser una célula o una parte de organismos tales como un organelo o un tejido, o un organismo, en particular un microorganismo o una planta, que no ha sido modificado o tratado de acuerdo con el método aquí descrito. Concordantemente, la célula o parte de organismos tales como un organelo o un tejido, o un organismo, en particular un microorganismo o una planta utilizada como el tipo silvestre, control o referencia corresponde a la célula, organismo o parte del mismo tanto como sea posible y está en cualquier otra propiedad excepto en el resultado del método divulgado aquí idéntico al asunto divulgado aquí como posible. Así, el tipo silvestre, control o referencia se trata de manera idéntica o tan idéntica como sea posible, estableciendo que solamente pueden ser diferentes condiciones o propiedades que no influyan adicionalmente en la calidad de la propiedad probada.

Preferiblemente, cualquier comparación se lleva a cabo bajo condiciones análogas. El término “condiciones análogas”

indica que todas las condiciones tales como, por ejemplo, condiciones de cultivo o crecimiento, condiciones de ensayo (tales como composición de un regulador, temperatura, sustratos, cepa del patógeno, concentraciones y similares) se mantienen idénticas entre los experimentos que se van a comparar.

La “referencia”, “control” o “tipo silvestre” es preferiblemente un sujeto, por ejemplo un organelo, una célula, un tejido, un organismo, en particular una planta o un microorganismo, que no ha sido modificado o tratado de acuerdo con el método aquí descrito divulgado aquí y que es en cualquier otra propiedad tan similar al asunto divulgado aquí como sea posible. La referencia, control o tipo silvestre es en su genoma, transcriptoma, proteoma o metaboloma tan similar como sea posible al sujeto de la presente invención. Preferiblemente, el término “referencia-”, “control-” o “tipo silvestre-“ organelo, -célula, -tejido u organismo, en particular planta, se relaciona con un organelo, células, tejido u organismo en particular planta o microorganismo, que es casi genéticamente idéntico al organelo, célula, tejido u organismo, en particular planta, o una parte de la misma, preferiblemente en 95%, son 98%, e incluso son 99.00%, en particular 99.10%, 99.30%, 99.50%, 99.70%, 99.90%, 99.99%, 99.999% o más. Lo más preferiblemente, la “referencia”, “control” o “tipo silvestre” es preferiblemente un sujeto, por ejemplo un organelo, una célula, un tejido, un organismo, el cual es genéticamente idéntico al organismo, célula, organelo, utilizado de acuerdo con el método divulgado excepto en que las moléculas de ácido nucleico o el producto genético codificado por ellas también de acuerdo con el método divulgado.

Preferiblemente, la referencia, control o tipo silvestre, difieren del sujeto de la presente invención solamente en la actividad celular del polipéptido divulgado aquí, por ejemplo como resultado de un incremento del nivel de la molécula de ácido nucleico divulgada aquí o un incremento en la actividad específica del polipéptido divulgado aquí, por ejemplo, por o en el nivel de expresión o actividad de una proteína que tiene una dicha actividad y sus causas bioquímicas o genéticas.

En el caso de que un control, referencia o tipo silvestre que difiere del sujeto de la presente invención solamente por no ser el sujeto del método de la invención pueden no ser provisto, un control, referencia o tipo silvestre puede ser un organismo en el cual la causa de la modulación de una actividad que confiere el incremento en el rendimiento o crecimiento o expresión de la molécula de ácido nucleico divulgada aquí como se describe aquí ha sido retrocedida o anulada, por ejemplo, anulando la expresión del producto genético resultante, por ejemplo, por inhibición antisentido, por inactivación del activador o agonista, por activación de un inhibidor o antagonista, por inhibición a través de la adición de anticuerpos inhibidores, agregando compuestos activos tales como hormonas, introduciendo mutantes dominantes negativos, etc. Una producción de un gen puede ser bloqueada por ejemplo introduciendo mutaciones inactivadoras de puntos que llevan a una inhibición de la actividad enzimática a una desestabilización o a una inhibición de la capacidad de enlazarse a cofactores, etc.

De acuerdo con lo anterior, un sujeto de referencia preferido es un sujeto de partida del presente método de la invención. Preferiblemente, la referencia y el objeto de la invención se comparan después de la estandarización y normalización, por ejemplo a la cantidad de ARN, ADN o proteína total o a la actividad o expresión de genes de referencia, tales como genes de mantenimiento, tales como la ubiquitina.

Existe una serie de mecanismos a través de los cuales una modificación en el polipéptido divulgado aquí puede afectar directa o indirectamente el rendimiento. Por ejemplo, el número de moléculas o la actividad específica del polipéptido divulgado aquí o la molécula de ácido nucleico divulgada aquí puede incrementarse. El incremento deseado en biomasa puede elaborarse por ejemplo incrementando el número de copias del gen codificador de proteína divulgado. Sin embargo, también es posible incrementar la expresión del gen que está presente de manera natural en los organismos, por ejemplo modificando la regulación del gen o incrementado la estabilidad del ARNm o del producto genético codificado por la molécula de ácido nucleico divulgada aquí.

De acuerdo con lo anterior, un sujeto de referencia preferido es el sujeto de partida del presente método inventivo. Preferiblemente, el sujeto de referencia y el inventivo se comparan después de la normalización, por ejemplo, con la cantidad de ARN total, ADN o proteína o actividad o expresión de los genes de referencia, como los genes de mantenimiento o mostrados en los ejemplos.

El incremento, descenso o modulación pueden ser constitutivos, por ejemplo, debido a una expresión estable, o transiente, por ejemplo, debido a una transformación transiente o a la adhesión temporal de un modulador como agonista o antagonista o inducible, por ejemplo, después de la transformación con un constructo inducible que porta las secuencias divulgadas y por agregación del inductor.

El término “incremento” o “descenso” de una actividad en una célula, tejido, organismo, por ejemplo planta o microorganismo, significa que la actividad global en dicho compartimiento es incrementada o disminuida, por ejemplo, como resultado de una expresión incrementada o disminuida del producto genético, la adición o reducción de un agonista o antagonista, la inhibición o activación de una enzima, o una modulación de la actividad específica del producto genético, por ejemplo como resultado de una mutación. Una mutación en el centro catalítico de una enzima divulgada puede modular la rata de rendimiento de la enzima, por ejemplo, un bloqueo del aminoácido esencial puede llevar a una actividad reducida o completamente bloqueada de la enzima. La actividad de una enzima divulgada aquí puede ser incrementada de tal manera que la rata de rendimiento se incremente o se mejore el enlazamiento de un cofactor. Al mejorar la estabilidad del ARNm de codificación o de la proteína se puede incrementar también la actividad de un producto genético. La estimulación de la actividad también está bajo el alcance del término “actividad incrementada”.

La actividad específica de una proteína divulgada o una proteína codificada por un polinucleótido divulgado o un casete de expresión de la invención puede probarse tal como se describe en los ejemplos. En particular, la expresión de dicha proteína en una célula, por ejemplo una planta, célula o un microorganismo y la detección de un incremento en el peso fresco, peso seco, número de semillas y/o peso de semillas en comparación con un control es una prueba fácil.

De acuerdo con lo anterior, el término “incremento” o “descenso” significa que la actividad específica así como la

cantidad de un compuesto, por ejemplo, de la proteína, ARNm o ADN divulgados, puede incrementarse o disminuirse.

El término “incremento” también significa que un compuesto o una actividad son introducidos en una célula de novo o que el compuesto o la actividad no han sido detectables. De acuerdo con lo anterior, en lo que sigue, el término

“incrementar” también comprende el término “generar” o “estimular”.

En general, una actividad de un producto genético en un organismo, en particular en una célula vegetal, una planta o un tejido vegetal o una parte del mismo puede incrementarse incrementando la cantidad del ARNm codificador específico o

la correspondiente proteína en dicho organismo o parte del mismo. “Cantidad de proteína o ARNm” se entiende con el

significado del número de moléculas del polipéptido o moléculas de ARNm divulgados en un organismo, un tejido, una célula o un compartimiento de una célula. “Incremento” en la cantidad de la proteína divulgada significa el incremento cuantitativo del número de moléculas de dicha proteína en un organismo, un tejido, una célula o un compartimiento celular o parte del mismo – por ejemplo por uno de los métodos descritos aquí más adelante – en comparación con un tipo silvestre, control o referencia.

El incremento en el número de moléculas asciende preferiblemente a al menos 1%, preferiblemente a más de 10%, más preferiblemente a 30% o más, especialmente de manera preferible a 50%, 100% o más, muy especialmente de manera preferible 500%, lo más preferiblemente a 1000% o más. Sin embargo, una expresión en novo también se ve como un objetivo divulgado aquí.

Una modificación, esto es un incremento o descenso pueden ser causados por factores endógenos o exógenos. Por ejemplo, un incremento en la actividad de un organismo o una parte del mismo pueden ser causadas por la adición de un producto genético o un precursor o un activador o un agonista al medio o a la nutrición o puede ser causado introduciendo dichos sujetos en un organismo, transiente o estable.

De acuerdo con lo anterior, en una divulgación, el método divulgado aquí comprende una o más de las siguientes etapas

a) estabilizar la proteína divulgada;

b) estabilizar la proteína divulgada que codifica el ARNm;

c) incrementar la actividad específica de la proteína divulgada;

d) expresar o incrementar la expresión de un factor de transcripción homólogo o artificial para la expresión de la proteína divulgada;

e) estimular la actividad de la proteína divulgada a través de factores de inducción exógena;

f) expresar un gen que codifica una proteína divulgada transgénica; y/o

g) incrementar el número de copias del gen de codificación de la proteína divulgada.

h) incrementar la expresión del gen que codifica la proteína divulgada por ejemplo por manipulación de la regulación endógena del gen a través de la mutagénesis dirigida lateral u otras técnicas.

En general, la cantidad de ARNm o de polipéptido en una célula o en un compartimiento de un organismo se correlaciona con la actividad de una proteína o enzima codificada en dicho volumen. Dicha correlación no siempre es lineal, la actividad en el volumen es dependiente de la estabilidad de las moléculas o la presencia de cofactores de activación o inhibición. Adicionalmente, las inhibiciones de producto y educto de las enzimas son bien conocidos. Sin embargo, la capacidad del polipéptido divulgado puede ser incrementada a través del incremento de la expresión del gen de codificación, en particular de una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia del polinucleótido divulgado, llevando particularmente a un incremento en la cantidad del polipéptido divulgado.

El incremento en el peso fresco, peso seco, peso en semillas y/o cantidad de semillas puede lograrse incrementando el nivel endógeno de la proteína divulgada. El nivel endógeno de la proteína divulgada puede ser incrementado por ejemplo modificando la regulación transcripcional o de traducción del polipéptido. Las secuencias reguladoras están enlazadas operativamente a la región de codificación de una proteína endógena y controla su transcripción y traducción

o la estabilidad o caída del ARNm de codificación o de la proteína expresada. Con el fin de modificar y controlar la expresión, el promotor, UTR, sitios de división, señales de procesamiento, sitios de poliadenilación, terminadores, potenciadores, sitios de modificación transcripcional o postraducción pueden cambiarse o enmendarse. Por ejemplo, el nivel de expresión de la proteína endógena puede ser modulado reemplazando el promotor endógeno con un promotor transgénico más fuerte o reemplazando el 3´ UTR endógeno con un 3´ UTR que provea más estabilidad sin enmendar la región de codificación. Adicionalmente, la regulación transcripcional puede ser modulada introduciendo un factor de transcripción artificial como se describe en los ejemplos. Más adelante se describen promotores, terminadores y UTR alternativos.

En una divulgación con respecto a los homólogos de SEQ ID NO: 2, en el método divulgado aquí la actividad de un polipéptido se incrementa comprendiendo o consistiendo de la siguiente secuencia de consenso:

En donde 20 o menos, por ejemplo 15 o 10, por ejemplo 9, 8, 7 o 6, 5 o 4, incluso 3, incluso 2, incluso 1, 0 de las posiciones de aminoácidos indicados por una letra mayúscula pueden ser reemplazados por una x.

5 En una divulgación no más de 5, por ejemplo 4, incluso 3 o 2, 1 o ninguna posición de aminoácidos indicada por una letra en mayúscula son/es reemplazada por una x.

En una divulgación 20 o menos, por ejemplo 15 o 10, por ejemplo 9, 8, 7 o 6, 5 o 4, incluso 3, incluso 2, incluso 1, 0 aminoácidos son insertados en la secuencia de consenso.

En una divulgación 20 o menos, por ejemplo 15 o 10, por ejemplo 9, 8, 7 o 6, 5 o 4, incluso 3, incluso 2, incluso 1, 0 10 aminoácidos representados por una x son eliminados de la secuencia de consenso.

La secuencia de consenso fue derivada de un alineamiento múltiple de las secuencias de Aeropyrum pernix, Arabidopsis thaliana (berro oreja de ratón), Archaeoglobus fulgidus, Ashbya gossypii (levadura) (Eremothecium gossypii), Bacillus cereus ATCC 10987, Bacillus circulans, Bacillus halodurans, Bacillus subtilis, Bifidobacterium longum, Brassica napus, Cercospora nicotianae, Clostridium acetobutylicum, Clostridium acetobutylicum, Corynebacterium 15 glutamicum (Brevibacterium flavum), Deinococcus radiodurans, Emericella nidulans (Aspergillus nidulans), glycine max, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Halobacterium sp. NRC-1, Hordeum vulgare, Listeria monocytogenes, Methanobacterium thermoautotrophicum, Methanococcus maripaludis, Methanopyrus kandleri, Methanosarcina acetivorans, Methanosarcina mazei (Methanosarcina frisia), Mycobacterium tuberculosis, Neurospora crassa, Oryza sativa (grupo cultivar japónica), Parachlamydia sp. UWE25, Pasteurella multocida, Pyrobaculum aerophilum, 20 Pyrococcus abyssi, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Streptomyces avermitilis, Suberites domuncula (esponja), Sulfolobus solfataricus, Sulfolobus tokodaii, Thermoplasma acidophilum, Thermoplasma volcanium, Thermotoga maritima, Thermus thermophilus HB27, Tropheryma whipplei (cepa TW08/27) (Bacilo de Whipple), Zea mays como se muestra en la figura 1. X indica un aminoácido dado. Se especifican aquellos aminoácidos en el

25 consenso que se conservan en al menos 80% de las secuencias de proteínas alineadas (80% de consenso).

En una divulgación con respecto a los homólogos de SEQ ID NO: 2, en el método divulgado aquí la actividad de un polipéptido se incrementa comprendiendo o consistiendo de las siguientes secuencias de consenso con base en el alineamiento de secuencias homólogas vegetales:

30 En donde 20 o menos, por ejemplo 15 o menos, por ejemplo 7, preferiblemente 4 o 3, 2, incluso 1, 0 de las posiciones de aminoácidos indicados por una letra en mayúscula puede ser reemplazada por una x. Por ejemplo, no más de una posición de aminoácido indicada por una letra mayúscula es reemplazada por una x.

La secuencia de consenso fue derivada de un alineamiento múltiple de las secuencias en plantas de Arabidopsis thaliana, canola, soja, cebada, arroz, maíz, como se muestra en la figura 2. X indica cualquier aminoácido dado. En este

35 caso se especifican aquellos aminoácidos que se conservan en casi 100% de las secuencias de proteínas de plantas alineadas (100% de consenso).

De acuerdo con lo anterior, en una divulgación, en el método divulgado aquí la actividad de un polipéptido que comprende uno o ambas de dichas secuencias de consenso nucleares se incrementa por lo mismo 10 o menos, por ejemplo 7, preferiblemente 4 o 3, 2, incluso 1, 0 de las posiciones de aminoácidos indicadas por una letra mayúscula que pueden ser reemplazados por una x. Por ejemplo, no más de una posición de aminoácido indicada por una letra mayúscula es reemplazada por una x.

La secuencia de consenso nuclear de los homólogos de SEQ ID NO: 2 de todos los organismos representa la parte esencial de la secuencia de consenso como sigue: (P/S)GGE(S/T)T o (G/A)(T/S)CAGX(I/V) o (V/A/I/C)XRNX(F/Y)GXQXXS(F/S) o FIR(A/S/G)P o

FHPE(UM/E) De acuerdo con lo anterior, en una divulgación, en el método divulgado aquí se incrementa la actividad del polipéptido que comprende una o más de dichas secuencias de consenso.

La secuencia de consenso nuclear de los homólogos de SEQ ID NO: 2 de plantas representa la parte esencial de la secuencia de consenso como sigue:

o GGQXLXGGLDCTVHRNFFGSQXQSFE o EGGXXTXRGXFIRAPA o VIVAVXQXNXLATAFHPELTXDXRWH De acuerdo con lo anterior, en una divulgación, en el método divulgado aquí se incrementa la actividad de un

polipéptido que comprende una o más de dichas secuencias de consenso nucleares de plantas homólogas.

El alineamiento múltiple fue llevado a cabo con el Software GenoMax Versión 3.4, InformatTM, InvitrogenTM life science software, U.S. Main Office, 7305 Executive Way, Frederick, MD 21704, USA con los siguientes parámetros:

Penalidad apertura de brecha: 10,0; Penalidad extensión de brecha: 0,05; Rango de penalidad de separación de brecha: 8; % identidad para retardo de alineación: 40; Matriz de sustitución de residuo: BLOSUM; Residuos hidrofílicos: G P S N D Q E K R; Pesaje de transición: 0,5; Opciones de cálculo de consenso: Fracción residual para consenso: 0,5.

Bajo el término “secuencia de consenso” se entienden las secuencias de consensos anteriores, secuencias nucleares, secuencias de consenso de plantas, secuencias de consenso de núcleos en plantas y en todas las variaciones descritas.

De acuerdo con lo anterior, en una divulgación, en el método divulgado aquí, la actividad de un polipéptido que comprende una o ambas de dichas secuencias nucleares se incrementa, por lo tanto 10 o menos, por ejemplo 7, 4 o 3, 2, o incluso 1, 0 de las posiciones de aminoácidos indicadas por una letra mayúscula pueden ser reemplazadas por una

x. Por ejemplo, no más de una posición de aminoácidos indicada por una letra mayúscula se reemplaza por una x.

Organismo de referencia significa preferiblemente el organismo de partida (tipo silvestre) antes de llevar a cabo el método de la invención o un organismo de control.

Si el organismo es una planta y no puede determinarse una línea de origen como referencia, la variedad que ha sido aprobada por la oficina de variedades vegetales Europea o Alemana en el momento de la solicitud y que tiene la homología genética más alta con la planta que se va a estudiar puede ser aceptada como referencia para determinar una actividad incrementada de SEQ ID NO: 2. Consecuentemente, una variedad vegetal que ya ha sido aprobada en el momento de la solicitud es por lo tanto de la misma forma una referencia adecuada o fuente para un organelo de referencia, una célula de referencia, un tejido de referencia o un órgano de referencia. La homología genética puede ser determinada a través de métodos que son bien conocidos para el experto en la técnica, por ejemplo, a través de análisis de huellas digitales, por ejemplo como se describe en Roldán-Ruíz, Theor. Appl. Genet., 2001, 1138-1150. Una planta o una variedad que tiene actividad de SEQ ID NO: 2, actividad y rendimiento incrementado o crecimiento más rápido, comparada, si es posible con una planta genéticamente idéntica, como se describe aquí, puede ser vista consecuentemente como una planta divulgada aquí. Cuando se ha apropiado, la actividad específica de SEQ ID NO: 2 puede ser reemplazada por la cantidad de proteína de SEQ ID NO: 1, ARNm o SEQ ID NO: 2, tal como se describe aquí. Métodos similares para determinar la relación genética de animales y microorganismos son suficientemente conocidos para el experto en la técnica, en particular para los expertos en sistematización.

Cuando se ha apropiado, los organismos, y en particular, las cepas mencionadas en los ejemplos sirven como organismos de referencia. En particular, las cepas de plantas mencionadas aquí sirven como organismos de referencia para las especies vegetales en particular en los casos raros, no pudiendo ser provista una referencia descrita anteriormente.

La línea de origen, que ha sido utilizada para llevar a cabo el método divulgado aquí es una referencia preferida.

Diversas cepas o variedades de una especie pueden tener diferentes cantidades o actividades de SEQ ID NO: 2. Las cantidades o actividades de SEQ ID NO: 2, en un compartimiento celular, organelo de una célula, célula, tejido, en órganos o en la planta completa pueden ser encontrados diferentes entre diferentes cepas o variedades. Sin embargo, obedeciendo a la observación sobre la cual se basa la invención, puede asumirse que el incremento, en particular en un extracto total del organismo, preferiblemente de la planta, en comparación con la cepa de partida respectiva o la variedad de partida respectiva o con la referencia antes mencionada, da como resultado un crecimiento más rápido y/o un rendimiento más alto. Sin embargo, también es concebible que incluso la actividad incrementada, por ejemplo debido a sobreexpresión, en órganos específicos puede causar el efecto deseado, esto es crecimiento más rápido y/o rendimiento más alto.

En lo que sigue, el término “incrementar” comprende la generación así como la estimulación de una propiedad.

Con el fin de determinar el “incremento en cantidad”, “incremento en la expresión”, “incremento en la actividad” o “incremento en masa”, esta propiedad se compara con la del organismo de referencia o partida, pero normalizada a un

valor definido. Por ejemplo, la expresión entre el organismo transgénico no humano y la referencia (tipo silvestre) se compara, normalizando, por ejemplo, a la cantidad de ARN total, ADN total o proteína o a la actividad o cantidad de ARNm de un gen particular (o producto genético), por ejemplo un gen de mantenimiento. El incremento de la masa o rendimiento involucra de la misma forma la comparación de los organismos modificados y de partida, pero con normalización a la planta individual o al rendimiento por hectárea, etc.

La actividad de SEQ ID NO: 2 es preferiblemente al menos 5%, más preferiblemente 10%, incluso más preferiblemente 20%, 30%, 50% o 100% superior a la del organismo de referencia. Lo más preferiblemente, la actividad es 200%, 500%

o 1000% o más, superior a la del organismo de referencia.

Obedeciendo a la actividad más alta de SEQ ID NO: 2, en particular obedeciendo a un incremento de 5% a 1000% en la actividad de SEQ ID NO: 2, preferiblemente obedeciendo a un incremento de 10% a 100%, el crecimiento es preferiblemente 5%, preferiblemente 10%, 20% o 30% más rápido. Más preferiblemente, el crecimiento es más rápido en 50%, 100%, 200% o 500% o más, en comparación con un organismo de referencia. También se da preferencia a incrementar la actividad de SEQ ID NO: 2 en 10%, 20%, 30% o de 50% a 100% y a un crecimiento más rápido de 10%, 20%, 30% o 50%.

Obedeciendo a la actividad más alta de SEQ ID NO: 2, en particular obedeciendo a un incremento de 5% a 1000% en la actividad de SEQ ID NO: 2, obedeciendo preferiblemente a un incremento de 10% a 100%, el rendimiento es preferiblemente 5%, preferiblemente 10%, 20% o 30% más alto. Más preferiblemente, el rendimiento es más alto en un 50%, 100%, 200% o 500% o más, en comparación con un organismo de referencia. Se da preferencia también a incrementar la actividad de SEQ ID NO: 2 en 10%, 20%, 30% o de 50% a 100% y a un rendimiento más alto de 10%, 20%, 30% o 50%.

“Crecimiento acelerado”, “crecimiento más rápido” o “velocidad de crecimiento incrementada” en plantas significan “crecimiento de la planta” más rápido, esto es, que el incremento en peso fresco en la fase vegetativa es superior al de la planta de referencia, en particular de la planta de partida a partir de la cual ha sido preparada la planta de la invención. Preferiblemente, el peso final de dicha planta es también superior al de la planta de referencia.

Para microorganismos o células, crecimiento más rápido se refiere a producción más alta de biomasa.

“Peso final” significa un peso logrado típicamente al final de una fase particular o la biomasa producida de un organismo. Para plantas, “peso final incrementado” significa preferiblemente el peso fresco más alto alcanzado al final de la fase de crecimiento, en comparación con el peso fresco de un organismo de referencia. Más específicamente, el peso final más alto puede ser debido a un rendimiento más alto, como se discutió anteriormente. Para microorganismos

o células “peso final incrementado” significa la cantidad de biomasa producida por dichos microorganismos o células en

la fase exponencial.

El término “rendimiento” significa de acuerdo con la invención que la biomasa o biomaterial adecuado para procesamiento posterior se ha incrementado. El término “procesamiento posterior” se refiere tanto a procesamiento

industrial como al uso instantáneo para piensos. Si el método se refiere a una planta, esta incluye células y tejidos vegetales, órganos y partes de plantas en todas sus formas físicas tales como semillas, hojas, fibras, raíces, tallos, embriones, callos, material de recolección, madera o tejido vegetal, tejido reproductivo y cultivos celulares que se derivan de la planta real y/o pueden ser utilizados para producir una planta de la invención. Se da preferencia a cualquier parte u órganos de plantas tales como hoja, rama, brote, flor, raíz, tubérculos, frutos, corteza, semilla, madera, etc. o a la planta completa. Las semillas comprenden cualquier parte de semillas tales como cubiertas de las semillas, células epidérmicas y de semillas o tejidos embrionarios. Se da preferencia en particular a los productos agrícolas recolectados, en particular frutos, semillas, tubérculos, frutas, raíces, cortezas u hojas o partes de las mismas.

Así, las plantas Arabidopsis que tienen expresión incrementada de SEQ ID NO: 2 no solamente alcanzan un peso definido significativamente más temprano que las plantas de referencia sino que también alcanzan un peso fresco, peso seco, peso de semillas y/o rendimiento más alto máximo superior.

Así, por ejemplo, el peso fresco de la Arabidopsis thaliana que tiene una expresión de SEQ ID NO: 2 incrementada se incrementa en un 15% a 53% en comparación con el tipo silvestre en experimentos de selección (experimento 1.1 o 1.2) y en 26% - 56% en experimentos de confirmación (bucles 1 o 2 de confirmación) en comparación con plantas tipo silvestre, cultivadas en el mismo experimento bajo condiciones idénticas. Los detalles pueden tomarse de la Tabla 1.

Si el método divulgado aquí se relaciona con un microorganismo, el término “rendimiento” significa tanto la biomasa

producida por dicho microorganismo, por ejemplo el caldo de fermentación, y las células en sí mismas. Si dicho microorganismo produce un producto particular adecuado para procesamiento posterior o aplicación directa, por ejemplo, los agentes químicos finos descritos más abajo, el método divulgado aquí por ejemplo incrementa la producción de dicho producto por microorganismo o por unidad de tiempo. “Incrementar la cantidad”, “incrementar la expresión”, “incrementar la actividad” o “incrementar la masa” significa en cada caso incrementar la propiedad particular en comparación con el tipo silvestre o una referencia, teniendo en cuenta las mismas condiciones de crecimiento. El tipo silvestre o referencia puede ser un compartimiento celular, un organelo de una célula, una célula, un tejido, un órgano o un organismo no humano, preferiblemente una planta, los cuales no han estado sometidos al método divulgado aquí pero los cuales de alguna otra forma han sido incubados bajo condiciones idénticas tanto como sea posible y que han sido comparados a producto preparados de acuerdo con la invención, con respecto a las características mencionadas aquí.

Un “incremento” también se puede referir a un compartimiento celular, un organelo de célula, una célula, un tejido, un

órgano o un organismo no humano, preferiblemente una planta, en referencia con el cual ha sido modificado, alterado, o manipulado de tal forma que es posible medirlo en una actividad incrementada de SEQ ID NO: 2 (producto de la cantidad de SEQ ID NO: 2 y la actividad relativa de la misma) como cantidad de SEQ ID NO: 2 (cantidad por compartimiento, órgano, célula, tejido, órgano y/o organismo no humano).

El incremento también puede ser afectado por factores endógenos u exógenos, por ejemplo, agregando SEQ ID NO: 2,

o un precursor o un activador del mismo a nutrientes o pienso animal. El incremento también puede ser llevado a cabo incrementando la expresión endógena o transgénica del gen que codifica para SEQ ID NO: 2, para un precursor o activador o incrementando la estabilidad de los factores antes mencionados. La acción fenotípica de un factor, en particular su actividad de SEQ ID NO: 2, puede ser determinada, por ejemplo en Arabidopsis, por expresión constitutiva, tal como se describió en los ejemplo, SEQ ID NO: 2, la actividad que significa una actividad como se describe más adelante.

Se da preferencia a un incremento en la actividad de SEQ ID NO: 2 en una célula, y se da más preferencia a la actividad que se ha incrementado en uno o más tejidos o uno o más órganos. Normalmente, el incremento en un organismo no humano abarca un incremento en uno o más tejidos o en uno o más órganos, y esto a su vez involucra el incremento en una célula, a menos que la proteína sea secretada. Una actividad más alta de SEQ ID NO: 2 en una célula puede ser causada, por ejemplo, por una actividad más alta en uno de los compartimientos celulares como se aparecen en la lista más adelante.

“Incrementar la cantidad”, “incrementar la expresión”, “incrementar la actividad” o “incrementar la masa” significa en

cada caso incrementar en una forma constitutiva o inducible, estable o transiente. Por ejemplo, el incremento también puede ser incrementado en una célula o en un tejido solamente en un momento particular, en comparación con la referencia, por ejemplo solamente en una etapa de desarrollo o solamente en una fase particular del ciclo celular.

El término “incremento” también se refiere a un incremento debido a cantidades diferentes, el cual puede ser causado por la respuesta a diferentes reactivos inductores tales como, por ejemplo, hormonas o señales bióticas o abióticas. Sin embargo la actividad también puede ser incrementada por el polipéptido de SEQ ID NO: 2, que interactúa con moduladores exógeno o endógenos los cuales actúan bien sea en una forma inhibidora o activadora.

“Actividad de SEQ ID NO: 2” de un polipéptido significa aquí preferiblemente que la expresión o actividad incrementadas de dicho polipéptido da como resultado un rendimiento más alto en peso fresco, peso seco, peso de semilla y/o rendimiento, y particularmente da como resultado una pluralidad de dichas características, aún más preferiblemente en todas de dichas características. Se divulgan adicionalmente polipéptidos que comprenden el consenso de polipéptido o la secuencia nuclear de consenso definida anteriormente, o codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo consistente de:

(a): una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de SE ID NO: 2 o lo codifica, por ejemplo, al menos la forma madura del polipéptido a la cual se representa en SEQ ID NO: 2;

(b): molécula de ácido nucleico que comprende, por ejemplo, al menos el polinucleótido maduro de la secuencia de codificación de acuerdo con SEQ ID NO: 1;

(c): molécula de ácido nucleico cuya secuencia es derivable a partir de una secuencias de polipéptidos codificada por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con (a) o (b), debido a la degeneración del código genético;

(d): molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2, cuya secuencia es al menos 20%, por ejemplo 35%, por ejemplo 45%, por ejemplo 60%, por ejemplo 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98% y 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con (a) a (c);

(e): molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2 que es derivado de un polipéptido de la secuencia SEQ ID NO: 2 codificado por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con (a) a (d) por sustitución, eliminación y/o adición de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por las moléculas de ácido nucleico (a) a (d);

(f): molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento o un epítopo o un motivo de consenso del polipéptido de SEQ ID NO: 2 codificado por cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con (a) a (e);

(g): molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que comprende la secuencia de una molécula de ácido nucleico obtenida por amplificación de por ejemplo un banco de ADNc microbiano o vegetal usando los cebadores en SEQ ID NO: 96 y 97, o de por ejemplo un banco genómico microbiano o vegetal utilizando los cebadores en SEQ ID NO: 96 y 97;

(h): molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2 el cual ha sido aislado con la ayuda de un anticuerpo monoclonal contra un polipéptido codificado por cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo a

(a): hasta (g); y

(i): molécula de ácido nucleico que es obtenible seleccionado de una librería apropiada bajo condiciones restrictivas y utilizando un sonda que comprende cualquiera de las secuencias desde (a) hasta (h) o un fragmento de al menos 15 nt, por ejemplo 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt o 500 nt del ácido nucleico mostrado en (a) a (h) y que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2;

(j): molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que incrementa el crecimiento o rendimiento que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2, con lo cual 20 o menos, por ejemplo 15 o 10, de las posiciones de aminoácidos indicadas pueden ser reemplazadas por una X y/o en donde 20 o menos, por ejemplo 15 o 10 de los aminoácidos se insertan o eliminan de la secuencia mostrada o mostrada en SEQ ID NO: 2, 107, 125 o 129, con lo cual

10 o menos, por ejemplo 7, de las posiciones de aminoácidos indicadas pueden ser reemplazadas por una X y/o con lo cual 10 o menos, por ejemplo 7, de los aminoácidos son insertados en o eliminados de la secuencia mostrada;

y que su actividad incrementada en un organismo no humano, en comparación con un organismo de referencia, preferiblemente en una planta, da como resultado un crecimiento más rápido y/o un rendimiento incrementado en comparación con un organismo de referencia, como se describió anteriormente. El polinucleótido por ejemplo es de origen vegetal y se origina a partir de un microorganismo procariota o eucariota, por ejemplo Saccharomyces sp. La planta preferiblemente crece más rápido o es más fuerte y/o tiene un rendimiento más alto, como se define más adelante.

“Incrementar la actividad de SEQ ID NO: 2” en un compartimiento celular, un organelo celular, una célula, un tejido, un órgano o un organismo no humano, preferiblemente una planta, preferiblemente significa “incrementar la actividad absoluta de SEQ ID NO: 2” esto es, independientemente de si esta es debida a más proteína o a proteína más activa en un compartimiento celular, un organelo celular, una célula, un tejido, un órgano o un organismo no humano en un compartimiento celular, organelo celular, una célula, un tejido, un órgano o un organismo no humano.

La actividad específica puede ser incrementada, por ejemplo, mutando el polipéptido, consecuencia de lo cual es un rendimiento más alto o un mejor enlazamiento de cofactores, por ejemplo. Al incrementar la estabilidad del polipéptido se incrementa, por ejemplo, la actividad por unidad, por ejemplo por volumen o por célula esto es, se previene una pérdida de actividad con el tiempo debido a la degradación de dicho polipéptido. Un ensayo in vitro para determinar la actividad específica de SEQ ID NO: 2, no es conocida aún para el especializado en la técnica.

La actividad específica de un polipéptido puede ser determinada como se describe en los ejemplos más adelante. Por ejemplo, puede ser posible expresar un SEQ ID NO: 1 potencial, en un organismo modelo y comparar la curva de crecimiento con la de una referencia bajo condiciones idénticas. Preferiblemente, un incremento en el crecimiento puede ser detectado ya a nivel celular, pero puede ser necesario observar un periodo vegetativo completo. Puede darse preferencia aquí al uso de una expresión en planta y a un sistema de ensayo para este propósito. Se encontró sorprendentemente así que la expresión constitutiva de las proteínas de levadura de SEQ ID NO: 2 en plantas también daba como resultado un crecimiento más rápido.

El término “incrementar” significa que una sustancia o una actividad, aquí proteína de SEQ ID NO: 2, ARN o SEQ ID

NO: 2, ADN o SEQ ID NO: 2, o actividad de SEQ ID NO: 2, por ejemplo, se introduce en un ambiente particular por primera vez o no ha sido detectada previamente en dicho ambiente, por ejemplo, por expresión transgénica de un ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 en un organismo no humano deficiente en SEQ ID NO: 2, y que la actividad o cantidad de sustancia de un ambiente particular se incremente en comparación con el estado original, por ejemplo por coexpresión transgénica de un gen de SEQ ID NO: 1 en un organismo que expresa SEQ ID NO: 2 o por toma de SEQ ID NO: 2 del ambiente. El término “incrementar” también comprende así la expresión de novo.

El “peso seco” de una célula vegetal, un organelo de célula vegetal, un tejido vegetal, una planta o una parte de la

misma significa el peso del material orgánico de la célula vegetal, el organelo de la célula vegetal, el tejido vegetal, la planta o la parte de la misma menos la cantidad de agua incluida en la célula vegetal, el organelo de la célula vegetal, el tejido vegetal, la planta o la parte de la misma.

En una realización de la invención el peso seco de una célula vegetal, un organelo de célula vegetal, un tejido vegetal, una planta o una parte de la misma que (sobre) expresa un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1, se incrementa en 1%, 2.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 50% o más en comparación con una planta tipo silvestre.

En otra realización de la invención el peso seco de una célula vegetal, un organelo de una célula vegetal, un tejido vegetal, una planta o una parte de la misma que (sobre)expresa un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1, se incrementa en 1%, 2.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 50% o más en comparación con el peso seco de una variedad seleccionada del grupo seleccionado de

(a): G. hirsutum IPK Accession Number GOS 6 (D 120), GOS 7 (ST 446), GOS 10 (D 1635), GOS 17 (D 4302), o GOS 21 (D 5553), o G. areysianum Deflers, o G. incanum (Schwartz) Hillc., o G. raimondii Ulbr., o G. stocksii Masters, o G. thurberi Tod., o G. tomentosum Nutt. o G. triphyllum Hochr., o Gossypium arboreum IPK Accession Number GOS 13 (D 1634), GOS 16 (D 4240), GOS 18 (D 4505), GOS 19 (D 4506), GOS 20 (D 4750), o GOS 12 (D 1329), o Gossypium barbadense, o Gossypium herbaceum; y

(b): Brassica napus variedad Mika, Brassica napus variedad Digger, Brassica napus variedad Artus, Brassica napus variedad Terra, Brassica napus variedad Smart, Brassica napus variedad Olivine, Brassica napus variedad Libretto, Brassica napus variedad Wotan, Brassica napus variedad Panther, Brassica napus variedad Express, Brassica napus variedad Oase, Brassica napus variedad Elan, Brassica napus variedad Ability, Brassica napus variedad Mohican; y

(c): Linum usitatissimum variedad Librina, Linum usitatissimum variedad Flanders, Linum usitatissimum variedad Scorpion, Linum usitatissimum variedad Livia, Linum usitatissimum variedad Lola, Linum usitatissimum variedad Taurus, Linum usitatissimum variedad Golda, Linum usitatissimum variedad Lirima, y

(d): Zea mays variedad Articat, Zea mays variedad NK Dilitop, Zea mays variedad Total, Zea mays variedad Oldham, Zea mays variedad Adenzo, Zea mays variedad NK Lugan, Zea mays variedad Liberal, Zea mays variedad Peso; y

(e): Glycine max variedad Oligata, Glycine max variedad Lotus, Glycine max variedad Primus, Glycine max variedad Alma Ata, Glycine max variedad OAC Vision, Glycine max variedad Jutro; y

(f): Helianthus annus variedad Helena, Helianthus annus variedad Flavia, Helianthus annus variedad Rigasol, Helianthus annus variedad Flores, Helianthus annus variedad Jazzy, Helianthus annus variedad Pegaso, Helianthus annus variedad Heliaroc, Helianthus annus variedad Salut RM; y

(g): Camelina sativa variedad Dolly, Camelina sativa variedad Sonny, Camelina sativa variedad Ligena, Camelina sativa variedad Calinka; y

(h): Sinapis alba variedad Martigena, Sinapis alba variedad Silenda, Sinapis alba variedad Sirola, Sinapis alba variedad Sito, Sinapis alba variedad Semper, Sinapis alba variedad Seco; y

(i): Carthamus tinctorius variedad Sabina, Carthamus tinctorius variedad HUS-305, Carthamus tinctorius variedad landrace, Carthamus tinctorius variedad Thori-78, Carthamus tinctorius variedad CR-34, Carthamus tinctorius variedad CR-81; y

(j): Brassica juncea variedad Vittasso, Brassica juncea variedad Muscon M-973, Brassica juncea variedad RAPD, Brassica juncea variedad Co.J.86, Brassica juncea variedad IAC 1-2, Brassica juncea variedad Pacific Gold; y

(k): Cocos nucifera L. varietes Maypan, Ceylon Tall, Indian Tall, Jamaica Tall, Malayan Tall, Java Tall, Laguna, KingCRIC 60, CRIC 65, CRISL 98, Moorock tall, Plus palm tall, San Ramon, Typica, Nana o Aurantiaca; y

(l): Triticum aestivum L. variedad Altos, Bundessortenamt file number 2646, Triticum aestivum L. variedad Bussard, número de archivo Bundessortenamt 1641, o Triticum aestivum L. variedad Centrum, número de archivo Bundessortenamt 2710; y

(m): Beta vulgaris variedad Dieck 13, CPVO número de archivo 19991828, Beta vulgaris variedad FD 007, CPCO número de archivo 20000506, o Beta vulgaris variedad HI 0169, CPVO número de archivo 20010315; y

(n): Hordeum vulgare variedad Dorothea, CPVO número de archivo 20031457, Hordeum vulgare variedad Colibri, CPVO número de archivo 20040122, Hordeum vulgare variedad Brazil, CPVO número de archivo 20010274, o Hordeum vulgare variedad Christina, CPVO número de archivo 20030277; y

(o): Secale cereale variedad Esprit, CPVO número de archivo 19950246, Secale cereale variedad Resonanz, Número de archivo CPVO 20040651, o Secale cereale variedad Ursus, Número de archivo CPVO 19970714; y

(p): Oryza sativa variedad Gemini, Número de archivo CPVO 20010284, Oryza sativa variedad Tanaro, Número de archivo CPVO 20020177, o Oryza sativa variedad Zeus, Número de archivo CPVO 19980388; y

(q): Solanum tuberosum L. variedades Linda, Nicola, Solara, Agria, Sieglinde, o Russet Burbank; y

(r): Arachis hypogaea subsp. fastigiata cultivar Valencia; y

(s): Arachis hypogaea subsp. hypogaea cultivar Virginia variedad ’Holland Jumbo’, ’Virginia A23-7’, o ’Florida 416’; y

(t): Arachis hypogaea subsp. hirsuta cultivar Peruvian runner variedad ’Southeastern Runner 56-15’, ’Dixie Runner’, o ’Early Runner’; y

(u): Arachis hypogaea subsp. vulgaris cultivar Spanish variedad ’Dixie Spanish’, ’Improved Spanish 2B’, o ’GFA Spanish’.

De acuerdo con el conocimiento del operario experimentado, la cantidad de ARN o polipéptido en una célula, un compartimiento, etc., se correlaciona regularmente con la actividad de una proteína en un volumen. Esta correlación no siempre es lineal, por ejemplo la actividad también depende de la estabilidad de las moléculas o de la presencia de cofactores de activación o inhibición. De la misma forma, son conocidas las inhibiciones del producto y el reactivo. La invención en la cual está basada la presente solicitud muestra una dependencia entre la cantidad de ARN de SEQ ID NO: 2 y el incremento en la cantidad de biomaterial, en particular peso fresco, número de hojas y rendimiento. Normalmente, la expresión incrementada de un gen da como resultado un incremento en la cantidad del ARNm de dicho gen y del polipéptido codificado, y también se muestra aquí en los ejemplos. Consecuentemente, una actividad incrementada dentro de un organelo, una célula, un tejido, un órgano o una planta puede esperarse cuando la cantidad de SEQ ID NO: 2 se incrementa allí. Lo mismo puede esperarse cuando la cantidad de SEQ ID NO: 2 se incrementa de manera diferente.

La cantidad de proteína de SEQ ID NO: 2, ARNm o SEQ ID NO: 2, en la planta o en las partes mencionadas, por ejemplo órganos, células, tejido u organelos, se incrementa por lo tanto. La cantidad también puede ser incrementada, por ejemplo, por expresión de novo o potenciada en las células de organismos no humanos, por estabilidad incrementada, degradación reducida o consumo (incrementado) desde el exterior.

En una divulgación, el método divulgado aquí se relaciona con un crecimiento muy rápido y/o rendimiento más alto de una planta. Consecuentemente, en una divulgación, el método divulgado aquí comprende incrementar la actividad de un polipéptido de SEQ ID NO: 2 codificado por un polinucleótido que comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico antes mencionadas (a) a (i) en una planta. Por ejemplo, el polinucleótido abarca cualquiera de las moléculas de ácido nucleico (a) a (c) antes mencionadas. Incluso se da más preferencia a incrementar la actividad de un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende cualquiera de las secuencias representadas en SEQ ID NO: 1, o que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido representado en SEQ ID NO: 2.

A continuación se describen homólogos. Así, un homólogo particularmente preferido a nivel de aminoácido es al menos 80%, aún más preferiblemente 90%, y lo más preferiblemente 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, idéntico a un polipéptido codificado de acuerdo con SEQ ID NO: 1, o representado en SEQ ID NO: 2, dándose de nuevo preferencia a un homólogo de una secuencia de aminoácidos codificada de acuerdo con SEQ ID NO: 1, o una secuencia de aminoácido representada en SEQ ID NO: 2. Si la divulgación presente se relaciona con una planta o con un método para incrementar el crecimiento o rendimiento en una planta, la actividad de SEQ ID NO: 2 en la planta se incrementa en comparación con el organismo de referencia en 5% o más, más preferiblemente 10%, aún más preferiblemente en 20%, 30%, 50% o 100%. Lo más preferiblemente, la actividad se incrementa en comparación con el organismo de referencia en 200%, 500% o 1000% o más.

Obedeciendo a la actividad más alta de SEQ ID NO: 2, en particular obedeciendo a un incremento de 5% a 1000% en la actividad de SEQ ID NO: 2 obedeciendo preferiblemente a un incremento de 10% a 100%, el crecimiento de la planta es preferiblemente 5%, preferiblemente 10%, 20% o 30% más rápido. Más preferiblemente, el crecimiento es más rápido en 50%, 100%, 200%, 500% o más, en comparación con un organismo de referencia. También se da preferencia a incrementar la actividad de SEQ ID NO: 2 en 10%, 20%, 30% o de 50% a 1000%, y a un crecimiento más rápido de 10%, 20%, 30% o de 50% a 200%.

Obedeciendo a la actividad más alta de SEQ ID NO: 2, en particular obedeciendo a un incremento de 5% a 1000% en la actividad de SEQ ID NO: 2, obedeciendo preferiblemente a un incremento de 10% a 100%, el rendimiento de la planta es preferiblemente 5%, preferiblemente 10%, 20% o 30%, más alto. Más preferiblemente, el rendimiento es más alto en 50%, 100%, 200% o 500% o más, en comparación con un organismo de referencia. También se da preferencia al incremento de la actividad de SEQ ID NO: 2 en 10%, 20%, 30% o de 50% a 100% y a un rendimiento más alto de 10%, 20%, 30% o 50%.

En otra divulgación, el método divulgado aquí se relaciona con un crecimiento más rápido y a una biomasa más alta en microorganismos. Sorprendentemente, la expresión de SEQ ID NO: 1 de la levadura Saccharomyces cerevisiae, lleva a un crecimiento más rápido en Arabidopsis y puede llevar a un rendimiento más alto. Obedeciendo a la naturaleza altamente conservada de SEQ ID NO: 2, de la actividad incrementada de SEQ ID NO: 2, en microorganismos o animales puede esperarse de la misma forma el resultado de un crecimiento más rápido, esto es en una rata más alta de división o en una rata de crecimiento más alta o debido a células más grandes. Consecuentemente, el método divulgado aquí comprende incrementar en un microorganismo, un animal o una célula la actividad de un polipéptido de SEQ ID NO: 2 codificado por un polinucleótido que comprende cualquiera de los ácidos nucleicos (a) a (i) antes mencionados. Por ejemplo, el polinucleótido comprende los ácidos nucleicos antes mencionados (a) a (c) o cualquiera de los homólogos de los mismos. Los homólogos preferidos se describen más adelante. Por ejemplo un homólogo particularmente preferido es al menos 80%, aún más preferiblemente 90% y los más preferiblemente 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a nivel del aminoácido con respecto a un polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 2.

En una divulgación, la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2 que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1, con lo cual 20 o menos, por ejemplo 15 o 10, de las posiciones de aminoácidos indicadas pueden ser reemplazadas por X y/o por lo cual 20 o menos, por ejemplo 15 o 10, del aminoácido son insertados en la secuencia mostrada, en donde 10 o menos, por ejemplo 7, de las posiciones de aminoácidos indicadas pueden ser reemplazadas por una X y/o en donde 10 o menos, por ejemplo 7, de los aminoácidos son insertados en o están ausentes de la secuencia mostrada.

En una divulgación, la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2 que comprende o consiste de un polipéptido que comprende la secuencia de consenso o de consenso nuclear de diferentes organismos definida anteriormente, y como se muestra en la figura 1, con lo cual 20 o menos, por ejemplo 15 o 10, por ejemplo 9, 8, 7 o 6, 5

o 4, incluso 3, incluso 2, incluso 1, 0 de las posiciones de aminoácidos indicadas por una letra mayúscula en la figura 1 pueden ser reemplazadas por una x y/o no más de 5, por ejemplo 4, incluso 3 o 2, 1 o ninguna posición de aminoácidos indicada por una letra mayúscula en la figura 1 son/es reemplazada por una x y/o 20 o menos, por ejemplo 15 o 10, por ejemplo 9, 8, 7 o 6, 5 o 4, incluso 3, incluso 2, incluso 1, 0 aminoácidos son insertados o ausentes de la secuencia de consenso.

En otra divulgación, la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2 que comprende o consiste de un polipéptido que comprende la secuencia de consenso de diferentes especies vegetales definida anteriormente por ejemplo, como se muestra en la figura 2, con lo cual 20 o menos, por ejemplo 15 o 10, por ejemplo 9, 8, 7 o 6, 5 o 4, incluso 3, incluso 2, incluso 1, 0 de las posiciones de aminoácidos indicadas por una letra mayúscula en la figura 2 pueden ser reemplazados por un x y/o no más de 5, por ejemplo 4, incluso 3 o 2, 1 o ninguna posición de aminoácidos indicada por una letra mayúscula en la figura 2 son/es reemplazada por una x y/o 20 o menos, por ejemplo 15 o 10, por ejemplo 9, 8, 7 o 6, 5 o 4, incluso 3, incluso 2, incluso 1, incluso 0 aminoácidos son insertados en o ausentes de la secuencia de consenso.

Obedeciendo a la homología de SEQ ID NO: 2 a una proteína involucrada en la biosíntesis de la vitamina B6, sin embargo, puede asumirse que es una proteína correspondiente la cual está involucrada directa o indirectamente en el metabolismo de la vitamina B6. Así sería posible determinar la actividad incrementada de la proteína de SEQ ID NO: 2 en una célula, un organelo, un compartimiento, un tejido, un órgano o un organismo no humano, en particular una planta, midiendo la actividad biosintética de la vitamina B6.

Aparte de esto, la actividad de SEQ ID NO: 2 puede ser determinada directamente a través de la medición de la cantidad de SEQ ID NO: 2, ARN o proteína de SEQ ID NO: 2. Así, una inmunoprecipitación Northern cuantitativa o PCR cuantitativo de los polinucleótidos divulgados descritos aquí puede determinar la cantidad de ARNm, por ejemplo en una célula o en un extracto total, y una inmunoprecipitación Western puede ser utilizada para comparar la cantidad de la proteína, por ejemplo en una célula o extracto total, con la de referencia. Métodos de esta clase son conocidos para la persona experimentada y han sido descritos extensamente, por ejemplo también en Sambrook Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989

o in Current Protocols, 1989 and updates, John Wiley & Sons, N. Y., o en otras fuentes citadas más adelante.

Un organismo no humano adecuado (organismo anfitrión) para la preparación en el método divulgado aquí es en principio un organismo no humano para el cual un crecimiento más rápido es útil y deseable, tal como, por ejemplo, microorganismos tales como levaduras, hongos o bacterias, plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas, musgos, algas y también animales útiles, como se listan más adelante.

El término “plantas” tal como se utiliza aquí, puede incluir plantas superiores, plantas inferiores, musgos y algas; sin embargo, en una realización preferida del método de la invención, el término “plantas” se relaciona con plantas superiores.

Ventajosamente, el método descrito aquí utiliza plantas que pertenecen al grupo de plantas útiles, como se lista más adelante. Aparte de la producción de alimento o comida para animales, las plantas preparadas de acuerdo con la invención pueden también ser utilizadas en particular para la preparación de productos químicos finos.

En una divulgación, el método divulgado aquí comprende incrementar la actividad del polipéptido de SEQ ID NO: 2, incrementando la actividad de al menos un polipéptido en dicho organismo o en una o más plantas del mismo, el cual es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo consistente de:

(aa) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2 o codifica, por ejemplo, al menos la forma madura del polipéptido que está representado en SEQ ID NO: 2;

(bb) molécula de ácido nucleico que comprende, por ejemplo, al menos el polinucleótido maduro de la secuencia de codificación de acuerdo con SEQ ID NO: 1;

(cc) molécula de ácido nucleico cuya secuencia es derivable de una secuencia de polipéptidos codificada por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con (aa) o (bb), debido a la degeneración del código genético;

(dd) molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido cuya secuencia es al menos 20%, por ejemplo 35%, más por ejemplo 45%, incluso más por ejemplo 60%, incluso más por ejemplo 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98% y 99%, idéntica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con (aa) a (cc);

(ee) molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es derivado de un polipéptido de SEQ ID NO: 2 codificado por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con (aa) a (dd), por ejemplo (aa) a (cc), por sustitución, eliminación y/o adición de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por las moléculas de ácido nucleico (aa) a (dd), por ejemplo (aa) a (cc);

(ff) molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento o un epítopo del polipéptido de SEQ ID NO: 2 codificado por cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con (aa) a (ee), por ejemplo (aa) a (cc);

(gg) molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que comprende la secuencia de una molécula de ácido nucleico obtenida por amplificación de por ejemplo un banco de ADNc microbiano o vegetal utilizando los cebadores en SEQ ID NO: 96 y 97, o de por ejemplo un banco genómico microbiano o vegetal utilizando los cebadores de SEQ ID NO: 96 y 97;

(hh) molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2 el cual es aislado con la ayuda de anticuerpos monoclonales usando un polipéptido codificado por cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con (aa) hasta (gg), por ejemplo (aa) a (cc); y

(ii): molécula de ácido nucleico la cual es obtenible por selección de una librería apropiada bajo condiciones restrictivas utilizando un sonda que comprende cualquiera de las secuencias de acuerdo con (aa) a (hh), por ejemplo (aa) a (cc), o un fragmento de al menos 15 nt, por ejemplo 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt o 500 nt, del ácido nucleico caracterizado en (aa) hasta (hh), por ejemplo (aa) a (cc), y el cual codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2; o

(jj) molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2 que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1, con lo cual 20 o menos, por ejemplo 15 o 10, de las posiciones de aminoácidos indicadas pueden ser reemplazadas por una X y/o con lo cual 20 o menos, por ejemplo 15 o 10, de los aminoácidos son insertados en la secuencia mostrada, o con lo cual 10 o menos, por ejemplo 7, de las posiciones de aminoácidos indicadas pueden ser reemplazadas por una X y/o con lo cual 10 o menos, por ejemplo 7, de los aminoácidos son insertados en o eliminados de la secuencia mostrada;

: o que comprende una secuencia complementaria de la misma.

En una divulgación, la actividad de las proteínas de SEQ ID NO: 2 se incrementa mediante

(a): incremento de la expresión de un polipéptido de SEQ ID NO: 2;

(b): incremento en la estabilidad de SEQ ID NO: 2, ARN o la proteína de SEQ ID NO: 2, por ejemplo de un polipéptido o polinucleótido como se describen en (a);

(c): incremento de la actividad específica de la proteína de SEQ ID NO: 2, por ejemplo de un polipéptido como se describe en (a) o se codifica por un polinucleótido descrito en (a);

(d): expresar un factor de transcripción natural o artificial capaz de incrementar la expresión de una función genética endógena de SEQ ID NO: 2, por ejemplo que comprende la secuencia de un polinucleótido descrito en (a); o

(e): agregar un factor exógeno que incrementa o induce la actividad de SEQ ID NO: 2 o la expresión de SEQ ID NO: 2 en el alimento o el medio, por ejemplo de un polinucleótido o polinucleótido descrito en (a).

En una realización, el método de la invención comprende incrementar la actividad del polipéptido de SEQ ID No: 2 introduciendo un polinucleótido en una planta, o en una o más partes de la misma, polinucleótido que codifica para un polipéptido de SEQ ID NO: 2 codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo consistente de:

(a): molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2;

(b): molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido de la secuencia de codificación de acuerdo con SEQ ID NO: 1;

(c): molécula de ácido nucleico cuya secuencia es derivable de una secuencia de polipéptido codificada por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con (a) a (b) debido a la degeneración del código genético;

(d): molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido cuya secuencia es al menos 80%, 90%, 95%, 97%, 98% y 99%, idéntica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido de SEQ ID NO:2;

: o que comprende una secuencia complementaria de la misma.

En organismos por ejemplo un microorganismo, o más preferiblemente una planta.

El término secuencia de “codificación” o “para codificar” significa de acuerdo con la invención tanto la secuencia codogénico y la secuencia complementaria o una referencia a estas, esto es tanto las secuencias de ADN como de ARN son vistas como codificadoras. Por ejemplo, un gen estructural codifica un ARNm a través de la transcripción y una proteína a través de la traducción, y una codificación MARN se traduce en una proteína. Algunas moléculas contienen la información que lleva a la secuencia de los polipéptidos codificados, esto es, codifican este último. Las modificaciones postranscripcionales o postraducción del ARN y los polipéptidos son suficientemente conocidas para los experimentados en la técnica y de la misma forma son incluidas.

Un “organismo o una o más partes del mismo” significa una célula, un compartimiento celular, un organelo, un tejido o un órgano de un organismo o un organismo no humano.

De acuerdo con la invención, “planta o una o más partes de la misma” significa una célula, un compartimiento celular, un organelo, un tejido, un órgano o una planta.

El término “ácido nucleico”, “molécula de ácido nucleico” y “polinucleótido” y también “polipéptido” y “proteína” se utilizan

aquí de manera sinónima.

En el método de la invención, “ácidos nucleicos” o “polinucleótidos” significan secuencias de ADN o ARN las cuales pueden ser de cadena sencilla o doble o pueden tener, cuando sea apropiado, bases nucleotídicas sintéticas, no naturales o modificadas las cuales pueden ser incorporadas en ADN o ARN.

Consecuentemente, la presente descripción también divulga un polinucleótido, el cual comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo consistente de:

(a): molécula de ácido nucleico que codifica, por ejemplo, al menos la forma madura del polipéptido como se representa en SEQ ID NO: 2, o comprende, al menos la forma madura de, el polinucleótido representado en SEQ ID NO: 1;

(b): molécula de ácido nucleico cuya secuencia es derivable de una secuencia de polipéptidos codificada por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con (a) debido a la degeneración del código genético;

(c): molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2 cuya secuencia es al menos 30%, por ejemplo 35%, más por ejemplo 45%, incluso más por ejemplo 60%, incluso más por ejemplo 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98% y 99%, idéntica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia representada en SEQ ID NO: 1, o que comprende la secuencia representada en SEQ ID NO: 1;

(d): molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es derivado de un polipéptido de SEQ ID NO: 2 codificado por un polinucleótido de acuerdo con (a) a (c) por sustitución, eliminación y/o adición de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por las moléculas de ácido nucleico (a) a (c), y que codifica SEQ ID NO: 2;

(e): molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento o un epítopo del polipéptido de SEQ ID NO: 2 codificado por cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con (a) a (d), por ejemplo (a) a (c) y que codifica una proteína que tiene actividad de SEQ ID NO: 2;

(f): molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que comprende la secuencia de una molécula de ácido nucleico obtenida por amplificación de un banco de ADNc vegetal utilizando los cebadores en SEQ ID NO: 96 y 97 o de por ejemplo un banco genómico microbiano o vegetal que utiliza los cebadores en SEQ ID NO: 96 y 97;

(g): molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2 el cual ha sido aislado con la ayuda de anticuerpos monoclonales contra un polipéptido codificado por cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con (a) a (f), por ejemplo (a) a (c) y que codifica una proteína que tiene actividad de SEQ ID NO: 2;

(h): molécula de ácido nucleico que es obtenible por selección de una librería apropiada bajo condiciones restrictivas utilizando un sonda que comprende cualquiera de las secuencias de acuerdo con (a) a (g) o un fragmento de al menos 15 nt, por ejemplo 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt o 500 nt, del ácido nucleico caracterizado en (a) a (g), por ejemplo

(a): a (c) y el cual codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2;

(i): molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2 que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1, con lo cual 20 o menos, por ejemplo 15 o 10, de las posiciones de aminoácidos indicadas pueden ser

reemplazadas por una X y/o con lo cual 20 o menos, por ejemplo 15 o 10, de los aminoácidos son insertados en la secuencia mostrada, o con lo cual 10 o menos, por ejemplo 7, de las posiciones de aminoácidos indicadas pueden ser reemplazadas por una X y/o con lo cual 10 o menos, por ejemplo 7, de los aminoácidos son insertados en o está ausentes de la secuencia mostrada;

: o la cadena complementaria de la misma, no comprendiendo dicho polinucleótido o dicha molécula de ácido nucleico de acuerdo con (a) a (i) la secuencia representada en SEQ ID NO: 1.

Por ejemplo, el polinucleótido divulgado aquí difiere de los polinucleótidos publicados previamente mostrados aquí en al menos un nucleótido, por ejemplo de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94. Por ejemplo, el polipéptido codificado difiere de los polipéptidos publicados previamente en al menos un aminoácido, por ejemplo de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95.

Las SEQ ID NO: 1 y 2 describen la secuencia de polipéptido (SEQ ID NO: 2) y de ácido nucleico (SEQ ID NO: 1) para el locus YMR095C de Saccharomyces cerevisiae, tal como se divulga por ejemplo bajo Accession PIR|S55081 para la YMR095c proteína and acces0sion GENESEQ_ADN|AAA14857 para la secuencia de ácido nucleico YMR095C.

En una divulgación, la descripción divulga adicionalmente un polinucleótido que codifica una polipéptido, por ejemplo derivado de plantas, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende cualquiera de SEQ ID NO: 52, 78, 90, 98, 100, 102, 104, 108, 118, 132 y 134 o seleccionados del grupo consistente de:

(a): molécula de ácido nucleico que codifica por ejemplo al menos la forma madura del polipéptido como se representa en SEQ ID NO: 53, 79, 91, 99, 101, 103, 105, 109, 119, 133 o 135 o comprende, por ejemplo, al menos la forma madura del polinucleótido representado en SEQ ID NO: 52, 78, 90, 98, 100, 102, 104, 108, 118, 132 o 134;

(c): molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido cuya secuencia es al menos 55%, por ejemplo 60%, más por ejemplo 70%, incluso más por ejemplo 80%, incluso más preferiblemente 90%, lo más preferiblemente 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia representada en SEQ ID NO: 52, 78, 90, 98, 100, 102, 104, 108, 118, 132 o 134; o que comprende la secuencia representada en SEQ ID NO: 52, 78, 90, 98, 100, 102, 104, 108, 118, 132 o 134;

(d): molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido cuya secuencia es al menos 90%, por ejemplo 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, idéntica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia representada en SEQ ID NO: 53, 79, 91, 99, 101, 103, 105, 109, 119, 133 o 135 o que comprende la secuencia representada en SEQ ID NO: 53, 79, 91, 99, 101, 103, 105, 109, 119, 133 o 135;

(e): molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido cuya secuencia es al menos 65%, más por ejemplo 70%, incluso más por ejemplo 80%, incluso más por ejemplo 90%, lo más por ejemplo 95%, 96%, 97%, 98% o 99%,idéntica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia representada en SEQ ID NO: 53, 79, 91, 99, 101, 103, 105, 109, 119, 133 o 135 o que comprende la secuencia representada en SEQ ID NO: 53, 79, 91, 99, 101, 103, 105, 109, 119, 133 o 135;

(f): molécula de ácido nucleico que modifica un polipéptido cuya secuencia es al menos 55%, más por ejemplo 70%, incluso más por ejemplo 80%, incluso más por ejemplo 90%, lo más por ejemplo 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, idéntica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia representada en SEQ ID NO: 53, 79, 91, 99, 101, 103, 105, 109, 119, 133 o 135 o que comprende la secuencia representada en SEQ ID NO: 53, 79, 91, 99, 101, 103, 105, 109, 119, 133 o 135;

(g): molécula de ácido nucleico que modifica un polipéptido cuya secuencia es al menos 35%, more por ejemplo 50%, 60% o 70%, incluso más por ejemplo 80%, incluso más por ejemplo 90%, lo más por ejemplo 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, idéntica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia representada en SEQ ID NO: 53, 79, 91, 99, 101, 103, 105, 109, 119, 133 o 135 o que comprende la secuencia representada en SEQ ID NO: 53, 79, 91, 99, 101, 103, 105, 109, 119, 133 o 135;

(h): molécula de ácido nucleico que modifica un polipéptido cuya secuencia es al menos 55%, por ejemplo 60%, más por ejemplo 70%, incluso más por ejemplo 80%, incluso más por ejemplo 90%, lo más por ejemplo 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia representada en SEQ ID NO: 53, 79, 91, 99, 101, 103, 105, 109, 119, 133 o 135 o que comprende la secuencia representada en SEQ ID NO: 53, 79, 91, 99, 101, 103, 105, 109, 119, 133 o 135;

(i): molécula de ácido nucleico que modifica un polipéptido cuya secuencia es al menos 90%, por ejemplo 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, idéntica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia representada en SEQ ID NO: 53, 79, 91, 99, 101, 103, 105, 109, 119, 133 o 135 o que comprende la secuencia representada en SEQ ID NO: 53, 79, 91, 99, 101, 103, 105, 109, 119, 133 o 135;

(j): molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es derivado de un polipéptido codificado por un polipéptido de acuerdo con (a) a (i) por sustitución, eliminación y/o adición de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificada por las moléculas de ácido nucleico (a) a (i);

(k): molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento o un epítopo del polipéptido codificado por cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con (a) a (j);

(l): molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que comprende la secuencia de una molécula de ácido nucleico obtenida por amplificación de una librería de ADNc microbiana o vegetal usando los cebadores en SEQ ID NO: 96 y 97, o de una biblioteca genómica por ejemplo microbiana o vegetal;

(m): molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2 el cual ha sido aislado con la ayuda de anticuerpos monoclonales contra un polipéptido codificado por cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con (a) a (l);

(n): molécula de ácido nucleico que es obtenible por selección de una biblioteca apropiada bajo condiciones de restricción usando una sonda que comprende cualquiera de las secuencias de acuerdo con (a) a (m) o un fragmento de al menos 15 nt, por ejemplo 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt o 500 nt, del ácido nucleico caracterizado en (a) a (m) y el cual codifica un polipéptido;

(o): molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2, con lo cual 20 o menos, por ejemplo 15 o 10, de las posiciones de aminoácidos indicadas pueden ser reemplazadas por una X y/o con lo cual 20 o menos, por ejemplo 15 o 10, de los aminoácidos son insertados en o están ausentes de la secuencia mostrada o mostrada en SEQ ID NO: 2, con lo cual 10 o menos, por ejemplo 7, de las posiciones de aminoácidos indicadas pueden ser reemplazadas por una X y/o con los cual 10 o menos, por ejemplo 7, de los aminoácidos son insertados en o están ausentes de la secuencia mostrada;

: o la cadena complementaria del mismo, por ejemplo dicho polinucleótido o dicha molécula de ácido nucleico de acuerdo con (a) a (o) que no comprende la secuencia representada en SEQ ID NO: 1, o la secuencia complementaria a la misma.

El polinucleótido puede ser ADN o ARN.

En principio, cualquier ácido nucleico que codifique para los polipéptidos con actividad de SEQ ID NO: 2 puede ser utilizado en el método divulgado aquí. En caso de preparación de plantas con biomasa más alta o rendimiento más alto, ventajosamente, dichos ácidos nucleicos son de plantas tales como algas, musgos o plantas superiores.

En el método divulgado aquí, una secuencia de ácido nucleico es seleccionada ventajosamente del grupo consistente de la secuencia SEQ ID NO: 52, 78, 90, 98, 100, 102, 104, 132, 134 o los derivados u homólogos descritos anteriormente de las mismas que codifican para polipéptidos los cuales tendrán actividad biológica de SEQ ID NO: 2. Estas secuencias son clonadas individualmente o en combinación, incluyendo con otros genes, en constructos de expresión.

Las secuencias de ácidos nucleicos de un organismo donante particular, que codifica para polipéptidos con actividad de SEQ ID NO: 2, son usualmente accesibles en general. Debe hacerse mención particular de bases de datos genéticas tales como la base de datos EMBL (Stoesser G. et al., Nucleic Acids Res. 2001, Vol 29, 17-21), la base de datos GenBank (Benson D.A. et al., Nucleic Acids Res. 2000, Vol. 28, 15-18) o la base de datos PIR (Barker W.C. et al., Nucleic Acids Res. 1999, Vol. 27, 39-43). Adicionalmente es posible utilizar bases de datos de genes específicas de organismos tales como, por ejemplo, ventajosamente la base de datos SGD (Cherry J. M. et al., Nucleic Acids Res. 1998, Vol. 26, 73-80) o la base de datos MIPS (Mewes H.W. et al., Nucleic Acids Res. 1999, Vol. 27, 44-48) para levaduras, la base de datos GenProtEC (http://web.bham.ac.uk/bcm4ght6/res.html) para E. coli, y la base de datos TAIR (Huala, E. et al., Nucleic Acids Res. 2001 Vol. 29(1), 102-5) o la base de datos MIPS para Arabidopsis.

Ventajosamente, la SEQ ID NO: 2 utilizada en el método y el organismo no humano empleado son del mismo origen o de un origen que es genéticamente tan cercano como sea posible, por ejemplo de la misma o de un tipo de especie muy cercanamente relacionada. Sin embargo, también puede utilizarse una SEQ ID NO: 2 sintética en un organismo no humano.

Puede ser ventajoso utilizar un gen que codifica una proteína divulgada aquí el cual no es derivado del organismo no humano, método en el cual debe llevarse a cabo para evitar los problemas de cosupresión en los cuales algunas veces se presentan cuando los genes están sobreexpresados en el organismo del cual son derivados.

El término “gen” significa de acuerdo con la invención una secuencia de ácidos nucleicos que comprende una sección genética codogénica y elementos reguladores. “Secciones genéticas codogénicas” significa de acuerdo con la invención una secuencia continua de ácidos nucleicos (“marco de lectura abierta, abreviado ORF). Dicho ORF puede contener ninguno, uno o más intrones los cuales están enlazados a través de sitios de empalme adecuados a los exones presentes en el ORF. Un ORF y sus elementos reguladores codifican, por ejemplo, genes estructurales que son traducidos en enzimas, transportadores, canales de iones, etc., por ejemplo o genes no estructurales tales como genes reguladores tales como la proteína Rho o Sigma, por ejemplo. Sin embargo, también pueden codificarse genes que no son traducidos en proteínas. Para expresión en un organismo no humano, una sección genética codogénica se expresa junto con elementos reguladores particulares tales como promotor, terminador, UTR, etc., por ejemplo. Los elementos reguladores pueden ser de origen homólogo o heterólogo. El gen, la sección de gen codogénico (ORF), secuencia reguladora están cubiertas por los términos ácido nucleico y polinucleótidos de aquí en adelante.

El término “expresión” significa transcripción y/o traducción de una sección de gen codogénico o gen. El producto resultante es usualmente un ARNm o una proteína. Sin embargo, los productos expresados también incluyen ARN tal como, por ejemplo, ARN reguladores o ribozimas. La expresión puede ser sistémica o local, por ejemplo restringida a tipo celulares particulares, tejido u órganos. La expresión incluye procesos en el área de transcripción que se relacionan especialmente con la transcripción de ARNr, ARNt y ARNm, a ARN de transporte y al procesamiento del transcripto. En el área de la biosíntesis de proteínas, especialmente en la biogénesis de ribosomas, la traducción, el control de traducción y las aminoasil-ARNt sintetasas están incluidas. Las funciones en área del procesamiento de proteínas se relacionan especialmente con el plegamiento y estabilización, con el direccionamiento, selección y translocación y con la modificación de proteínas, ensamblaje de complejos proteínicos y degradación proteolítica de proteínas.

Los productos de expresión de las secciones genéticas codogénicas (ORF) y sus elementos reguladores pueden ser caracterizados por su función. Ejemplos de estas funciones son aquellos en el área de metabolismo, energía, transcripción, síntesis de proteínas, procesamiento de proteínas, transporte celular y mecanismos de transporte, comunicación celular y transducción de señales, rescate celular, defensa celular y virulencia de células, regulación del ambiente celular e interacción de la célula con su ambiente, destino celular, elementos transponibles, proteínas virales y proteínas plásmido, control de organización celular, localización subcelular, regulación de la actividad proteínica, proteínas con función de enlazamiento o requerimiento de cofactor y transporte facilitado. Los genes con funciones

idénticas son agrupados juntos en “familias de genes funcionales”. De acuerdo con la invención la expresión de SEQ ID

NO: 1, da como resultado una rata de crecimiento incrementada.

Un polinucleótido usualmente incluye una secuencia no traducida, localizada en los extremos 3´y 5´de la región genética codificadora, para expresión: por ejemplo de 500 a 100 nucleótidos de la secuencia corriente arriba del extremo 5´ de la región de codificación y/o, por ejemplo de 200 a 20 nucleótidos de la secuencia corriente abajo del extremo 3´ del

código de la región del gen de codificación. Una molécula de ácido nucleico “aislada” es retirada de otras moléculas de ácidos nucleicos presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Un ácido nucleico “aislado” no tiene por ejemplo secuencias que flanqueen de manera natural el ácido nucleico en el ADN genómico del organismo a partir del cual se origina dicho ácido nucleico (por ejemplo, secuencias localizadas en los extremos 5´ y 3´ de dicho ácido nucleico). La molécula de ácido nucleico aislada de SEQ ID NO: 1 puede contener, por ejemplo, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb,

0.1 kb o 0 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean de manera natural la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula desde la cual se origina el ácido nucleico.

Las moléculas de ácido nucleico usadas en el presente método, por ejemplo una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de las moléculas de ácido nucleico usada en el método de la invención o en una parte del mismo, pueden ser aisladas utilizando técnicas estándar de biología molecular y la información de secuencia provista aquí. También es posible identificar, por ejemplo, una secuencia homóloga o regiones de secuencia homólogas conservadas al nivel del ADN o de aminoácidos con la ayuda de algoritmos comparativos. Estas regiones de secuencia pueden ser utilizadas como sondas de hibridación por medio de técnicas de hibridación estándar, como las descritas, por ejemplo, en Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, para aislar secuencias adicionales de ácidos nucleicos útiles en el método. Además, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia completa de SEQ ID NO: 1, o SEQ ID NO: 3, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92,94, 98, 100, 102 o 104 , 132 o 134, o de las otras moléculas de ácido nucleico utilizadas en el método divulgado aquí o una parte de las mismas puede aislarse mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) y prepararse de acuerdo con métodos conocidos. Es posible amplificar un ácido nucleico divulgado aquí de acuerdo con técnicas de amplificación por PCR estándar utilizando ADNc preparado por medio de transcripción reversa, o alternativamente, ADN genómico como plantilla y cebadores de oligonucleótidos adecuados. El ácido nucleico amplificado de esta manera puede ser clonado en un vector adecuado y caracterizado por medio de análisis de secuencia de ADN.

Ejemplos de homólogos de las moléculas de ácido nucleicos usados todos en el método divulgado aquí son variantes alélicas las cuales son al menos 30%, por ejemplo 40%, más por ejemplo 50%, 60%, 70%, 80% o 90% o incluso más por ejemplo 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más, idénticas a cualquiera de las secuencias de nucleótidos representadas en SEQ ID NO: 3, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92,94, 98, 100, 102 o 104 , 132 o 134. Las variantes alélicas incluyen en particular variantes funcionales que pueden ser obtenidas por eliminación, inserción o sustitución de nucleótidos desde/hacia/en la secuencia representada en SEQ ID NO: 3, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92,94, 98, 100, 102 o 104 , 132 o 134, pero con la idea de retener o incrementar la actividad de SEQ ID NO: 2 de las proteínas sintetizadas derivadas de las mismas. Las proteínas que aún poseen su actividad biológica o enzimática de SEQ ID NO: 2, también incluyen aquellas cuya actividad esencialmente no está reducida, esto es proteínas que tienen 5%, por ejemplo 20%, particularmente por ejemplo 30%, muy particularmente por ejemplo 40% o más de la actividad biológica original, en comparación con la proteína codificada por SEQ ID NO: 4, 6, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 99, 101, 103 o 105133 o 135.

Por ejemplo, sin embargo, la actividad homóloga se incrementa en comparación con la expresión heteróloga de SEQ ID NO: 1, en el organismo no humano particular.

Los homólogos de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92,94, 98, 100, 102 o 104 , 132 o 134 de las moléculas de ácido nucleico usadas en el método divulgado aquí también significan, por ejemplo, procariota o eucariota, esto es, por ejemplo homólogos bacterianos, animales, fúngicos y vegetales, secuencias truncadas, ADN o ARN de cadena sencilla o la secuencia de ADN codificadora y no codificadora.

Homólogos de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92,94, 98, 100, 102 o 104 , 132 o 134 de las moléculas de ácido nucleico usadas en el método divulgado aquí también incluyen derivadas tales como, por ejemplo, variantes de la secuencia de codificación o de las secuencias reguladoras, tales como, por ejemplo, promotor, UTR, potenciador, señales de división, señales de procesamiento, señales de poliadenilación, etc. Los derivados de las secuencias de nucleótidos indicados pueden ser modificados por una o más sustituciones de nucleótidos, por inserciones y/o eliminaciones, sin perturbar la funcionalidad o actividad, sin embargo. Adicionalmente es posible que la actividad de los derivados se incremente por modificación de su secuencia o que dichos derivados sean reemplazados completamente con más elementos activos, incluso aquellos de organismos heterólogos.

Con el fin de determinar el porcentaje de homología (= identidad) de dos secuencias de aminoácidos (por ejemplo cualquier a de las secuencias de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 99, 101, 103 o 105133 o 135 o de dos ácido nucleicos (por ejemplo cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92,94, 98, 100, 102 o 104 , 132, 134), las secuencias se comparan una con otra, por ejemplo alineando dicha secuencias o analizando ambas secuencias con la ayuda de programas de ordenador. Pueden introducirse brechas en la secuencia de una proteína o un ácido nucleico para producir un alineamiento óptimo con la otra proteína o el otro ácido nucleico. Se comparan entonces los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos. Cuando una posición en una secuencia es ocupada por el mismo residuo de aminoácido o el mismo nucleótido que en la posición correspondiente en la otra

secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esta posición (por ejemplo “homología” de aminoácido o ácido nucleico, como se utiliza aquí, es equivalente a “identidad” de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de homología entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (esto es % de homología = número de posiciones idénticas/número total de posiciones x 100). Los términos homología e identidad son utilizados aquí entonces como sinónimos.

“Identidad” entre dos proteínas o secuencias de ácido nucleicos significa identidad en la longitud completa, en particular la identidad llevada a cabo como se describe en los ejemplo.

Los parámetros estándar NCBI fueron utilizados para la comparación blastp de las secuencias de aminoácidos, i.e. usando los siguientes parámetros: "estática basada en composición" y "filtro de baja complejidad, "Expect":10, "Word Size":3, "Matrix": Blosum62 y "Coste de brecha": Existence :11 Extension: 1.

La identidad de diversas secuencias de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y 107 está indicada más adelante a manera de ejemplo para SEQ ID NO: 2 en la figura 3 y para SEQ ID NO: 107 en la figura 4.

Sin embargo, para la determinación del porcentaje de homología (= identidad) de dos o más aminoácidos o de dos o más secuencias de nucleótidos se han desarrollado varios otros programas de software para ordenador. La homología de dos o más secuencias puede ser calculada por ejemplo con el software fasta, el cual ha sido usado actualmente en la versión fasta 3 (W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), Improved Tools for Biological Sequence Comparison.PNAS 85:2444-2448; W. R. Pearson (1990) Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA, Methods in Enzymology 183:63 - 98; W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988) Improved Tools for Biological Sequence Comparison.PNAS 85: 2444- 2448; W. R. Pearson (1990); Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTAMethods in Enzymology 183:63 - 98). Otro programa útil para el cálculo de homologías de diferentes secuencias es el programa blast estándar, el cual está incluido en el software corriente Biomax (Biomax, Munich, República Federal de Alemania). Esto lleva desafortunadamente algunas veces a resultados subóptimos puesto que blast no siempre incluye secuencias completas del sujeto y la búsqueda. No obstante puesto que este programa es muy eficiente puede ser utilizado para la comparación de un enorme número de secuencias. Los siguientes parámetros se utilizan típicamente para tales comparaciones de secuencias:

-: p Program Name [String]; -d Database [String]; default = nr; -i Query File [File In]; default = stdin; -e Expectation value

(E) [Real]; default = 10.0; -m alignment view options: 0 = pairwise; 1 = query-anchored showing identities; 2 = queryanchored no identities; 3 = flat query-anchored, show identities; 4 = flat query-anchored, no identities; 5 = queryanchored no identities and blunt ends; 6 = flat query-anchored, no identities and blunt ends; 7 = XML Blast output; 8 = tabular; 9 tabular with comment lines [Integer]; default = 0; -o BLAST report Output File [File Out] Optional; default = stdout; -F Filter query sequence (DUST with blastn, SEG with others) [String]; default = T; -G Cost to open a gap (zero invokes default behavior) [Integer]; default = 0; -E Cost to extend a gap (zero invokes default behavior) [Integer]; default = 0; -X X dropoff value for gapped alignment (in bits) (zero invokes default behavior); blastn 30, megablast 20, tblastx 0, all others 15 [Integer]; default = 0; -I Show Gl’s in deflines [T/F]; default = F; - q Penalty for a nucleotide mismatch (blastn only) [Integer]; default = -3; -r Reward for a nucleotide match (blastn only) [Integer]; default = 1; -v Number of database sequences to show one-line descriptions for (V) [Integer]; default = 500; -b Number of database sequence to show alignments for (B) [Integer]; default = 250; -f Threshold for extending hits, default if zero; blastp 11, blastn 0, blastx 12, tblastn 13; tblastx 13, megablast 0 [Integer]; default = 0; -g Perfom gapped alignment (not available with tblastx) [T/F]; default = T; -Q Query Genetic code to use [Integer]; default = 1; -D DB Genetic code (for tblast[nx] only) [Integer]; default = 1; -a Number of processors to use [Integer]; default = 1; -O SeqAlign file [File Out] Optional; -J Believe the query defline [T/F]; default = F; -M Matrix [String]; default = BLOSUM62; -W Word size, default if zero (blastn 11, megablast 28, all others 3) [Integer]; default = 0; -z Effective length of the database (use zero for the real size) [Real]; default = 0; -K Number of best hits from a region to keep (off by default, if used a value of 100 is recommended) [Integer]; default = 0; -P 0 for multiple hit, 1 for single hit [Integer]; default = 0; -Y Effective length of the search space (use zero for the real size) [Real]; default = 0; -S Query strands to search against database (for blast[nx], and tblastx); 3 is both, 1 is top, 2 is bottom [Integer]; default = 3; -T Produce HTML output [T/F]; default = F; -I Restrict search of database to list of Gl’s [String] Optional; -U Use lower case filtering of FASTA sequence [T/F] Optional; default = F; -y X dropoff value for ungapped extensions in bits (0.0 invokes default behavior); blastn 20, megablast 10, all others 7 [Real]; default = 0.0; -Z X dropoff value for final gapped alignment in bits (0.0 invokes default behavior); blastn/megablast 50, tblastx 0, all others 25 [Integer]; default = 0; -R PSI-TBLASTN checkpoint file [File In] Optional; -n MegaBlast search [T/F]; default = F; -L Location on query sequence [String] Optional; -A Multiple Hits window size, default if zero (blastn/megablast 0, all others 40 [Integer]; default = 0; -w Frame shift penalty (OOF algorithm for blastx) [Integer]; default = 0; -t Length of the largest intron allowed in tblastn for linking HSPs (0 disables linking) [Integer]; default = 0.

Se alcanzan resultados de alta calidad utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch o de Smith y Waterman. Por lo tanto se prefieren los programas basados en dichos algoritmos. Ventajosamente las comparaciones de secuencias pueden hacerse con el programa PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151153) o preferiblemente con los programas Gap o BestFit, los cuales se basan respectivamente en los algoritmos de Needleman y Wunsch [J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970)] and Smith and Waterman [Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)]. Ambos programas son parte del paquete de software GCG [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991); Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 et SEQ]. Por lo tanto preferiblemente los cálculos para determinar los porcentajes de homología de secuencia se hacen con el programa Gap en el rango completo de las secuencias. Pueden usarse los siguientes ajustes estándar para la comparación de las secuencias de ácidos nucleicos: peso de brecha: 50, peso de longitud: 3, correspondencia promedio: 10.000, no correspondencia promedio: 0.000.

Las moléculas de ácido nucleico ventajosas para el método divulgado aquí pueden ser aisladas sobre la base de su homología con los ácidos nucleicos divulgados aquí utilizados en el método divulgado aquí usando las secuencias o una parte de las mismas como sonda de hibridación de acuerdo con técnicas de hibridación estándar bajo condiciones de hibridación restrictivas, como se describe también, por ejemplo, en US 2002/0023281. Es posible utilizar, por ejemplo, moléculas de ácido nucleico aisladas que tienen al menos 10, por ejemplo al menos 15, nucleótidos de longitud e hibridan bajo condiciones restrictivas con las moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92,94, 98, 100, 102 o 104 o 132, 134. El término “hibrida bajo por ejemplo condiciones restrictivas” tal como se utiliza aquí, pretende describir condiciones de hibridación y lavado bajo las cuales las secuencias de nucleótidos, que son al menos 20% idénticas una con otra

hibridan una con otra. El término “hibrida bajo condiciones restrictivas” tal como se utiliza aquí, pretende describir

condiciones de hibridación y lavado bajo las cuales las secuencias de nucleótidos que son 30%, pero por ejemplo 50%

o más, idénticas una a otra hibridan una con otra. Por ejemplo, las condiciones son tales que las frecuencias que son

60%, más por ejemplo 75% e incluso más por ejemplo al menos aproximadamente 85% o más, idénticas una a otra usualmente permanecen hibridada una a otra. La identidad de dos ácidos polinucleicos o aminoácidos puede ser determinada como se describe aquí. Estas condiciones de restricción son conocidas para la persona experimentadas en la técnica y pueden ser encontradas en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.15 6.3.6., o in Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Un ejemplo preferido no limitante de condiciones de hibridación restrictivas es una hibridación en 6 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguida por una

o más etapas de lavado en 0.2 x SSC, 0.1% de SDS a desde 50 hasta 65ºC. Es conocido para las personas

experimentadas en la técnica que estas condiciones de hibridación difieren dependiendo del tipo de ácidos nucleicos, en 10 particular con el contenido de AT o GC, o con la presencia de solventes orgánicos, con respecto a temperatura,

duración de lavado y concentración de sal de las soluciones de hibridación y la solución de lavado. Bajo “condiciones de hibridación estándar”, por ejemplo, la temperatura difiere entre 42ºC y 58ºC en regulador acuoso con una concentración de 0.1 a 5 x SSC (pH 7.2), dependiendo del tipo de ácido nucleico. Si está presente un solvente orgánico en el regulador antes mencionado, por ejemplo formamida al 50%, la temperatura bajo condiciones estándar es 15 aproximadamente 42ºC. Las condiciones de hibridación para híbridos ADN:ADN, por ejemplo, son 0.1 x SSC y 20ºC a 45ºC, por ejemplo entre 30ºC y 45ºC. Las condiciones de hibridación para híbridos de ADN:ARN, por ejemplo, son por ejemplo 0.1 x SSC y de 30ºC a 55ºC, por ejemplo entre 45ºC y 55ºC. Las temperaturas de hibridación mencionadas anteriormente se determinan, por ejemplo, para un ácido nucleico de aproximadamente 100 bp (= pares de bases) de longitud y con un contenido de G + C de 50% en ausencia de formamida. La persona experimentada sabe como

20 determinar las condiciones de hibridación requeridas sobre la base de libros de texto tales como los mencionados anteriormente o los siguientes libros de textos: Sambrook, "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames and Higgins (eds.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (eds.) 1991, "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford o "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, N. Y. (1989).

25 Algunos ejemplos de condiciones para hibridación de ADN (ensayos de inmunoprecipitación Southern) y etapas de lavado se muestran aquí a continuación:

(1) Condiciones de hibridación que pueden ser seleccionadas, por ejemplo, a partir de las siguientes condiciones:

a) 4X SSC at 65°C,

b) 6X SSC at 45°C,

30 c) 6X SSC, 100 mg/ml de ADN de esperma de pescado fragmentado desnaturalizado a 68°C,

d) 6X SSC, 0.5% de SDS, 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado a 68°C,

e) 6X SSC, 0.5% de SDS, 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado, 50% de formamida a 42°C,

f) formamida al 50%, 4X SSC a 42°C,

35 g) formamida al 50% (vol./vol.), albumina de suero bovino al 0.1%, Ficoll al 0.1%, polivinilpirrolidona al 0.1%, regulador de fosfato de sodio 50 mM pH 6.5, NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42°C,

h) 2X o 4X SSC a 50°C (condición de baja restricción), o

i) 30 a 40% de formamida, 2X o 4X SSC a 42°C (condición de baja restricción).

(2) Las etapas de lado pueden seleccionarse, por ejemplo, a partir de las siguientes condiciones:

40 a) NaCl 0.015 M /citrato de sodio 0.0015M /0.1% SDS a 50°C.

b) 0.1X SSC a 65°C.

c) 0.1X SSC, 0.5 % SDS a 68°C.

d) 0.1X SSC, SDS al 0.5%, formamida al 50% a 42°C.

e) 0.2X SSC, 0.1 % SDS at 42°C.

45 f) 2X SSC a 65°C (condición de baja restricción).

Adicionalmente, es posible identificar, comparando secuencias de proteínas homólogas a SEQ ID NO: 2, o proteínas de diversos organismos, regiones conservadas de las cuales a su vez pueden derivarse cebadores degenerados. Estos cebadores degenerados pueden ser utilizados adicionalmente por medio de PCR para amplificación de fragmentos de nuevos genes homólogos de otros organismos. Estos fragmentos pueden ser utilizados entonces como sondas de hibridación para aislar la secuencia genética completa. Alternativamente, las secuencias faltantes 5´ y 3´ pueden ser aisladas por medio de RACE-PCR. En este aspecto, se hace preferencia expresamente a las divulgaciones en US 2002/0023281 y en la literatura antes mencionada sobre métodos de bilogía molecular, en particular Sambrook, "Molecular Cloning" and "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons.

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para una proteína usada en el método divulgado aquí, proteína que es homóloga en particular a una secuencia de proteína de SEQ ID NO: 2, puede ser generada, por ejemplo, introduciendo una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótidos en una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, de tal manera que se introducen una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos en la proteína codificada. Las mutaciones pueden ser introducidas en cualquiera de las secuencias de las moléculas de ácidos nucleicos usadas en el método por medio de técnicas estándar tales como mutagénesis específica del sitio y mutagénesis mediada por PCR. Se da preferencia a la generación de sustituciones de aminoácidos conservadoras en

uno o más de los residuos de aminoácidos no esenciales predichos. En una “sustitución de aminoácidos conservadores”

el residuo de aminoácidos es reemplazado por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica Familias de residuos de aminoácidos con cadena lateral similares. Estas familias comprenden aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas, (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína) cadenas laterales no polares (por ejemplo alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con ramificación beta (por ejemplo treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Un residuo de aminoácido no esencial predicho es así reemplazado por ejemplo por otro residuo de aminoácido en la misma familia de cadenas laterales. Se da preferencia a llevar a cabo sustituciones “conservadoras” en las cuales el aminoácido reemplazado tiene una propiedad similar a la del aminoácido original, por ejemplo una sustitución de Asp for Glu, Asn parar Gln, Ile for Val, Ile para Leu, Thr para Ser.

En otra divulgación, las mutaciones pueden ser introducidas alternativamente de manera aleatoria a través de toda o parte de la secuencia de codificación, por ejemplo por mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes pueden ser seleccionados para la actividad descrita aquí con el fin de identificar mutantes que llevan, por ejemplo, a plantas con una velocidad de crecimiento incrementada, por ejemplo un crecimiento más rápido y/o un rendimiento más alto. Después de la mutagénesis, la proteína codificada puede ser expresada de manera recombinante, y la actividad de dicha proteína puede ser determinada utilizando los ensayos descritos aquí, por ejemplo.

Las moléculas de ácido nucleico usadas en el método divulgado aquí codifican para proteínas o partes de las mismas. Dichas proteínas o la proteína individual o partes de las mismas por ejemplo comprenden una de las secuencias de consenso o secuencias de consenso nuclear mostradas anteriormente, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos como lo mostrado en la figura 1 o 2, por lo cual 20 o menos, por ejemplo 15 o 10, por ejemplo 9, 8, 7 o 6, 5 o 4, incluso 3, incluso 2, incluso 1, 0 de las posiciones de aminoácidos indicadas por una letra mayúscula en la figura 1 o 2 pueden ser reemplazadas por un x y/o no más de 5, 4, incluso 3 o 2, una o ninguna posición de aminoácidos indicada por una letra mayúscula en la figura 1 o 2 son/es reemplazada por una x y/o 20 o menos, por ejemplo 15 o 10, por ejemplo 9, 8, 7 o 6, 5 o 4, incluso 3, incluso 2, incluso 1, 0 aminoácidos son insertados en o están ausentes de la secuencia de consenso o, la cual es suficientemente homóloga a una secuencia de aminoácidos de la secuencia SEQ ID NO: 2, 4, 6, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 99, 101, 103 o 105,133 o 135, de tal manera que dicha proteína o dicha parte de la misma retiene la actividad de SEQ ID NO: 2.

Por ejemplo, la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico o parte de la misma tiene su actividad biológica esencial la cual produce, entre otras cosas, que el organismo objetivo, por ejemplo la planta objetivo, exhiba una rata de crecimiento más alta o un crecimiento más rápido y así una producción más alta de biomasa y un rendimiento incrementado. Las regiones conservadas de una proteína pueden ser determinadas por comparaciones de secuencia de diversos homólogos o derivados de una proteína o de diversos miembros de una familia de proteínas. Además, los programas de ordenador que predicen la estructura de una proteína, obedeciendo a su secuencia y otras propiedades, son conocidos por las personas experimentadas en la técnica. Los estudios de enlazamiento de anticuerpos y estudios sobre la sensibilidad o hipersensibilidad de los dominios de proteínas con respecto a la digestión de la proteasa pueden ser usados de la misma forma para estudiar la estructura de un polipéptido o su localización en un ambiente particular, por ejemplo en una célula. Métodos adicionales de esta clase para caracterización de proteínas son conocidas por la persona experimentada en la técnica y están divulgados en la literatura descrita aquí, por ejemplo también en US 2002/0023281.

Por ejemplo, la parte usada de una proteína o un dominio es altamente conservada entre las secuencias descritas aquí, por ejemplo entre las secuencias de plantas, o secuencias animales, por ejemplo entre todas las secuencias.

“Actividad biológica esencial” de las proteínas o polipéptidos usados significa, como se discutió anteriormente, que dicha proteínas o polipéptidos poseen la actividad bilógica de SEQ ID NO: 2. La “actividad biológica de SEQ ID NO: 2” significa que la expresión del polipéptido en un organismo no humano da como resultado un crecimiento acelerado o un incremento en el rendimiento de 5% o más, en comparación con un organismo no humano que no expresa dicho polipéptido, o lo expresa en un grado inferior. Se da más preferencia a una aceleración del 10%, incluso más preferencia a 20%, la mayor preferencia a 50%, 100% o 200% o más. Un sistema de prueba para determinar la actividad biológica de una secuencia homóloga a SEQ ID NO: 2, que puede ser estudiado, es el fenotipo de expresión en Arabidopsis thaliana o, cuando sea apropiado, también (sobre) expresión en el organismo del cual se deriva el ácido nucleico homólogo.

La actividad celular o función de SEQ ID NO: 2, y sus homólogos no es conocida aún como se describió anteriormente y consecuentemente, en un sistema de ensayo in vitro probablemente no está disponible todavía. Presumiblemente, sin embargo, es posible que la persona experimentada en la técnica mida una actividad específica de SEQ ID NO: 2 de una proteína o polipéptido (sobre) expresando dicha proteína o polipéptido en una célula, preferiblemente en una célula deficiente, y comparándola con el fenotipo de una célula deficiente.

Las proteínas que pueden ser utilizadas ventajosamente en el método se derivan de organismos vegetales tales como algas o musgos o, especialmente de plantas superiores.

Consecuentemente, una realización del método de la invención comprende introducir un polinucleótido en una planta, o una o más partes de la misma, polinucleótido que codifica para un polipéptido de SEQ ID NO: 2. El polinucleótido que comprende preferiblemente un polinucleótido caracterizado por las reivindicaciones, en particular un polinucleótido que codifica una proteína con la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO: 2, o codifica un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico caracterizada por las reivindicaciones, en particular de acuerdo con SEQ ID NO: 1, o comprende cualquiera de estas secuencias de tal manera que se obtenga una planta transgénica con crecimiento más rápido, rendimiento más alto y/o tolerancia más alta al estrés. Se divulgan plantas que expresan cualquiera de las secuencias vegetales mencionadas aquí o sus homólogos vegetales. Como se mencionó, sin embargo, el ácido nucleico de levadura de SEQ ID NO: 1 también exhibe actividad de SEQ ID NO: 2 en plantas.

En una divulgación, la presente descripción divulga un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico divulgada aquí, por ejemplo confiriendo la actividad antes mencionada.

La presente descripción también divulga un método para la producción de un polipéptido divulgado aquí, siendo expresado el polipéptido en una célula vegetal transgénica de acuerdo con la invención.

En una divulgación, la molécula de ácido nucleico usada en el método para la producción de polipéptido se deriva de un microorganismo, con un organismo eucariota como célula huésped. En una divulgación el polipéptido es producido en una célula vegetal o en una planta con una molécula de ácido nucleico derivada de una procariota o un hongo o un alga u otros microorganismos pero no de una planta.

La persona experimentada sabe que la proteína y el ADN expresados en diferentes organismos difieren en muchos aspectos y propiedades, por ejemplo, metilación, degradación y modificación postraducción como por ejemplo glucosilación, fosforilación, acetilación, miristoilación, ribosilación de ADP, farmesilación, carboxilación, sulfatación, ubiquinación, etc., aunque tiene la misma secuencia de codificación. Por ejemplo, el control de la expresión celular de la proteína correspondiente difiere concordantemente en los microorganismos de control que controlan la actividad y expresión de una proteína endógena u otra proteína eucariota.

El polipéptido divulgado aquí es producido por ejemplo por técnicas de ADN recombinantes. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína es clonada en un vector (tal como se describió anteriormente), el vector es introducido en la célula anfitriona (como se describió anteriormente) y dicho polipéptido se expresa en la célula anfitriona. Dicho polipéptido puede ser aislado entonces de las células mediante un esquema de purificación apropiado utilizando técnicas de purificación de proteínas estándar. Como alternativa a la expresión recombinante, el polipéptido o péptido divulgados aquí pueden ser sintetizados químicamente utilizando técnicas estándar de síntesis de péptidos. Además, el polipéptido nativo puede ser aislado a partir de células (por ejemplo, células endoteliales), utilizando por ejemplo el anticuerpo divulgado aquí como se describió, el cual puede ser producido por técnicas estándar que utilizan el polipéptido divulgado aquí o un fragmento del mismo.

En una divulgación, la presente descripción divulga un polipéptido que comprende o consiste de una secuencia de polipéptido mostrada en SEQ ID No. 2 o un homólogo de la misma de 50%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 99.5% o más pero que por ejemplo no es consistente de la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2.

En una divulgación, la proteína divulgada aquí no comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2.

En una divulgación, la presente descripción divulga un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico divulgada aquí u obtenible por un método divulgado aquí. Dicho polipéptido confiere por ejemplo la actividad antes mencionada, en particular, el polipéptido confiere el incremento en el rendimiento o crecimiento tal como se describió aquí en una célula o un organismo o una parte del mismo después de incrementar la actividad celular, por ejemplo, incrementando la expresión o la actividad específica del polipéptido. En una divulgación, dicho polipéptido se distingue de la secuencia representada en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, por uno o más aminoácidos. En otra divulgación, dicho polipéptido divulgado aquí no consiste de la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95. En una divulgación, dicho polipéptido no consiste de la secuencia codificada por las moléculas de ácido nucleico mostradas en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94. En una divulgación, el polipéptido divulgado aquí se origina de una célula no vegetal, en particular de un microorganismo, y fue expresado en una célula vegetal. Los términos “proteína” y “polipéptido” utilizados en esta solicitud son intercambiables. “Polipéptido” se refiere a un polímero de aminoácidos (secuencia de aminoácidos) y no se refiere a una longitud específica de la molécula. Así péptidos y polipéptidos son incluidos dentro de la definición de polipéptido. Este término también se refiere a o incluye modificaciones postraducción del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Incluidos dentro de la definición están, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), polipéptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, ambas de origen natural y de origen no natural.

Por ejemplo, el polipéptido es aislado. Una proteína “aislada” o “purificada” o un polinucleótido o una porción biológicamente activa de los mismos es sustancialmente libre de material celular cuando se produce por técnicas de ADN recombinante o precursores químicos u otros agentes químicos cuando se sintetiza químicamente.

La expresión “sustancialmente libre de material celular” incluye preparaciones del polipéptido divulgado aquí en las

cuales la proteína está separada de componentes celulares de las células, en las cuales es producida de manera

natural o recombinante. En una divulgación, la expresión “sustancialmente libre de material celular” incluye preparaciones que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de “proteína contaminante”, más por ejemplo menos de aproximadamente 20% de “proteína contaminante”, aún más por ejemplo menos de aproximadamente 10% de “proteína contaminante”, y lo más por ejemplo menos de aproximadamente 5% de “proteína contaminante”. El término “proteína contaminante” se refiere a polipéptidos, los cuales no son polipéptidos divulgados aquí. Cuando el polipéptido divulgado aquí o una porción biológicamente activa del mismo es producido por vía recombinante, también está por ejemplo sustancialmente libre de medio de cultivo, esto es, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, más por ejemplo menos de aproximadamente 10%, y lo más por ejemplo

menos de aproximadamente 5% del volumen de la preparación de proteína. La expresión “sustancialmente libre de precursores químicos u otros agentes químicos” incluye preparaciones en las cuales el polipéptido divulgado aquí está separado de los precursores químicos u otros agentes químicos que están involucrados en la síntesis de la proteína.

Un polipéptido divulgado aquí puede participar en el método de la presente invención.

Adicionalmente, el polipéptido puede tener una secuencia de aminoácidos que es codificada por una secuencia de nucleótidos la cual hibrida, por ejemplo hibrida bajo condiciones restrictivas como se describió anteriormente, a una secuencia de nucleótidos del polinucleótido divulgado aquí. De acuerdo con lo anterior, el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos la cual es codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente 35%, 50% o 60% por ejemplo al menos aproximadamente 70%, más por ejemplo al menos aproximadamente 80%, 90%, 95%, y aún más por ejemplo al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más homóloga a una de las secuencias de aminoácidos del polipéptido divulgado aquí y mostrado aquí. El polipéptido preferido divulgado aquí posee por ejemplo al menos una de las actividades descritas aquí. Un polipéptido preferido divulgado aquí incluye una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que hibrida, hibrida bajo condiciones restrictivas, como se definió anteriormente.

La descripción también provee proteínas quiméricas o de fusión.

Tal como se utiliza aquí, una “proteína quimérica” o “proteína de fusión” comprende un polipéptido enlazado operativamente a un polipéptido que no confiere la actividad antes mencionada.

Con la proteína de fusión, el término “enlazado operativamente” pretende indicar que el polipéptido divulgado aquí y un

polipéptido que no pertenece a la invención se fusionan uno con otro de tal manera que ambas secuencias satisfacen la función propuesta adicta a la secuencia usada. El polipéptido fuera de la invención puede ser fusionado al terminal N o terminal C del polipéptido divulgado aquí. Por ejemplo, en una divulgación la proteína de fusión es proteína de fusión GST-LMRP en la cual las secuencias del polipéptido divulgado aquí se fusionan al terminal C de las secuencias GST. Tal las proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de los polipéptidos recombinantes divulgados aquí.

En otra divulgación, la proteína de fusión es un polipéptido divulgado aquí que contiene una secuencia de señales heterólogos en su terminal N. En ciertas células anfitrionas (por ejemplo, células anfitrionas de mamíferos) la expresión y/o secreción pueden ser incrementada a través del uso de una secuencia de señal heteróloga. Las secuencias de direccionamiento, son requeridas para direccionar el producto genético hacia un compartimiento específico de la célula (para una revisión véase Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285-423 y referencias citadas allí), por ejemplo en la vacuola, el núcleo, todos los tipos de plástidos, tales como aminoplastos, cloroplastos, cromoplastos, el espacio extracelular, las mitocondrias, el retículo endoplasmático, elaioplastos, peroxisomas, glicosomas y otros compartimientos de las células o extracelulares. Las secuencias, las cuales deben ser mencionadas en este contexto, son en particular, las secuencias de codificación del péptido de señalización o del péptido de transito que son conocidas per se. Por ejemplo, las secuencias de codificación del péptido de transito posibilitan el direccionamiento del producto de expresión hacia los plástidos de una células T vegetal que direcciona las secuencias también conocidas para eucariotas y a un grado menor para organismos procariotas y pueden estar enlazados operativamente de manera ventajosa con la molécula de ácido nucleico divulgada aquí para alcanzar una expresión en uno de dichos compartimientos o extracelular.

Por ejemplo, una proteína quimérica o de fusión divulgada aquí pueden ser producidas por técnicas estándar de ADN recombinante. Por ejemplo, fragmentos de ADN que codifican para las diferentes frecuencias de polipéptidos están ligados entre sí en marco de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo empleando términos con terminación roma o terminación escalonada para la ligación, digestión enzimática de restricción para proveer términos apropiados, llenado de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar uniones indeseables, y ligación enzimática. El gen de fusión puede ser sintetizado por técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, la amplificación por PCR de fragmentos genéticos puede ser llevada a cabo utilizando cebadores de ancla, lo cual da lugar a sobrantes complementarios entre dos fragmentos genéticos consecutivos los cuales pueden ser fusionados subsecuentemente y reamplificados para generar una secuencia genética quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Además, muchos vectores de expresión están disponibles comercialmente que codifican ya una unidad estructural de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST). El polinucleótido divulgado aquí puede ser clonado en tal vector de expresión de tal manera que la unidad estructural de fusión está enlazada en marco a la proteína codificada.

Adicionalmente, las simulaciones de plegamiento y rediseño por ordenador de motivos estructurales de la proteína divulgados aquí pueden ser llevadas a cabo utilizando programas de ordenador apropiados (Olszewski, Proteins 25 (1996), 286-299; Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995), 675-679). La modelación por ordenador del plegamiento de las proteínas puede ser utilizada para el análisis conformacional y energético de péptidos detallados y modelos de proteínas (Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995), 995-1012; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995), 37-45). Los programas apropiados pueden ser utilizados para la identificación de sitios interactivos del polipéptido divulgado aquí y sus sustratos o factores de enlazamiento u otras proteínas de interacción mediante búsquedas asistidas por ordenador para secuencias de péptidos complementarias (Fassina, Inmunomethods (1994), 114-120). Sistemas de ordenador apropiados adicionales para el diseño de proteínas y péptidos están descritos en la técnica anterior, por ejemplo en Berry, Biochem, Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann. N. Y. Acad. Sci. 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986) 5987-5991. Los resultados obtenidos del análisis por ordenador antes descritos pueden ser utilizados, por ejemplo, para la preparación de imitadores peptídicos de la proteína divulgada aquí o fragmentos de la misma. Tales análogos seudopeptídicos de la secuencia natural de aminoácidos de la proteína pueden imitar muy eficientemente la proteína original (Benkirane, J. Biol. Chem. 271 (1996), 33218-33224). Por ejemplo, la incorporación de residuos de aminoácidos Q aquirales fácilmente disponibles en una proteína divulgada aquí o un fragmento de la misma da como resultado la sustitución de enlaces amida por unidades polimetileno de una cadena alifática, proveyendo por lo tanto una estrategia conveniente para construir un imitador de péptidos (Banerjee, Biopolymers 39 (1996), 769-777).

Los análogos imitadores de péptidos superactivos de hormonas peptídicas pequeñas en otros sistemas se describen en la técnica anterior (Zhang, Biochem, Biophys. Res. Commun. 224 (1996), 327-331). Imitadores peptídicos apropiados de la proteína divulgada aquí también puede ser identificados por la síntesis de librerías combinacionales de imitación de péptidos a través de alquilación de amidas sucesivas y prueba de los compuestos resultantes, por ejemplo, en cuanto a sus propiedades de enlazamiento e inmunológicas. Métodos para la generación y usos de librerías combinacionales de imitación de péptidos se describen en la técnica anterior, por ejemplo, en Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234 and Domer, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715.

Adicionalmente, una estructura tridimensional y/o cristalográfica de la proteína divulgada aquí puede ser utilizada para el diseño de inhibidores de imitación de péptidos para la actividad biológica de la proteína divulgada aquí (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558).

Adicionalmente, una estructura tridimensional y/o cristalográfica de la proteína divulgada aquí y la identificación de sitios interactivos del polipéptido divulgado aquí y sus sustratos o factores de enlazamiento puede ser utilizada para el diseño de mutantes con enlazamiento modulado o actividades de retorno. Por ejemplo, el centro activo del polipéptido divulgado aquí puede ser modelado y los residuos de aminoácidos que participan en la reacción catalítica pueden ser modulados para incrementar o disminuir el enlazamiento del sustrato para inactivar el polipéptido. La identificación del centro activo y de los aminoácidos involucrados en la reacción catalítica facilita la selección de mutantes que tienen una actividad incrementada. En particular, la información acerca de los aminoácidos conservadores en las secuencias de consenso puede ayudar a modular la actividad.

“Transgénico” o “recombinante” significa de acuerdo con la invención, por ejemplo con respecto a una secuencia de ácidos nucleicos, a un casete de expresión (=constructo genético) o a un vector que comprende la secuencia de ácidos nucleicos divulgada aquí o a una planta transformada con las secuencias de moléculas de ácidos nucleicos, en casete de expresión o vector divulgados aquí, todas aquellas construcciones producidas por métodos genéticos, en los cuales

a) la secuencia de ácidos nucleicos utilizada en el método de la invención o

b) un control genético o secuencia reguladora enlazado funcionalmente a una secuencia de ácidos nucleicos usada en el método de la invención, por ejemplo un promotor, o

c) (a) y (b)

no están presentes en su ambiente natural genético o han sido modificados por métodos genéticos, siendo posiblemente dicha modificación, a manera de ejemplo, una sustitución, adición, eliminación, inversión o inserción de uno o más residuos de nucleótidos. Ambiente genético natural significa la localización genómica o cromosómica natural en el organismo fuente o la presencia en una librería genómica. En el caso de una librería genómica, se retiene por ejemplo el ambiente genético natural de la secuencia de ácidos nucleicos al menos parcialmente. El ambiente flanquea la secuencia de ácidos nucleicos al menos en un lado y su secuencia es de 0 o más bp, por ejemplo 50 bp, más por ejemplo de 100 a 500 bp, particularmente por ejemplo 1.000 bp o más, de longitud, aunque se han descrito también secuencias de 5.000 bp o más. Un casete de expresión de origen natural, por ejemplo la combinación de origen natural del promotor natural de la secuencia de ácidos nucleicos VAM7 de la proteína de morfogénesis vacuolar, se convierte en un casete de expresión transgénico cuando es alterada por métodos sintéticos (“artificiales”) no naturales, tales como por ejemplo mutagénesis. Se describen métodos correspondientes, por ejemplo, en US 5,565,350 o WO 00/15815.

Las funciones reguladoras de un casete de expresión tanto natural como artificial pueden ser alteradas indirectamente o en trans por factores de cambio que regulan dicho casete de expresión. Esto incluye, en particular, factores de transcripción homólogos, heterólogos y artificiales que influyen en la regulación.

Los vectores de clonación tal como se describen en detalle en la técnica anterior y aquí también pueden ser utilizados para la transformación. Los vectores y métodos adecuados para la transformación de plantas han sido publicados o citados, por ejemplo, en: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Ratón, Florida), chapter 6/7, pp. 71-119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, eds: Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, eds: Kung and R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225.

La transformación de microorganismos y eucariotas superiores se describen en numerosos libros de texto, por ejemplo,

en Sambrook, Molecular Cloning, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory and in “Current Protocols in Molecular Biology”,

John Wiley & Sons, N. Y. (1989).

Es posible expresar ácidos nucleicos homólogos o heterólogos, esto es, los organismos aceptadores y donantes pertenecen a la misma especie, cuando se ha apropiado a la misma variedad, o a diferentes especies, cuando se ha apropiado variedades. Sin embargo, transgénico también significa que los ácidos nucleicos divulgados aquí están localizados en su localización natural en el genoma de un organismo pero que la secuencia ha sido alterada en comparación con la secuencia natural y/o las secuencias reguladoras de las secuencias naturales han sido alteradas. Transgénico significa preferiblemente expresión de los ácidos nucleicos divulgados aquí en un sitio no natural en el genoma, esto es ocurre una expresión homóloga o, preferiblemente, heteróloga de dichos ácidos nucleicos.

El término “secuencias reguladoras” también incluye aquellas secuencias que controlan la expresión constitutiva de una

secuencia de nucleótidos en muchas especies en células anfitrionas y aquellas que controlan la expresión directa de la secuencia de nucleótidos solamente en células anfitrionas particulares bajo condiciones particulares. Las personas experimentadas aprecian que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la selección de la célula anfitriona que va a ser transformada, del grado de expresión de la proteína deseada, etc. La transcripción puede ser incrementada, por ejemplo, utilizando señales de transcripción fuertes tales como promotores y/o potenciadores o estabilizadores de ARNm, por ejemplo, por UTR particulares 5´ y/o 3´. Así, por ejemplo, las señales que llevan a una rata más alta de transcripción o a una ARNm más estable pueden ser sustituidas por señales endógenas. Además, sin embargo, también es posible potenciar la traducción mejorando, por ejemplo, el enlazamiento de ribosomas o la estabilidad del ARNm.

En principio, pueden utilizarse aquello promotores que son capaces de estimular la transcripción de genes en organismos tales como microorganismos, plantas o animales. Promotores adecuados que son funcionales en dichos organismo son bien conocidos. Pueden ser promotores constitutivos o inducibles. Los promotores adecuados pueden potenciar la expresión de desarrollo y/o específica para tejidos en eucariotas multicelulares, y así es posible utilizar ventajosamente promotores específicos para hojas, raíces, flores, semillas, guarda células o frutos en plantas. Secuencias reguladoras adicionales se describen más atrás y más adelante.

El término “transgénico” utilizado de acuerdo con la invención, también se refiere a la progenie de un organismo no humano transgénicos, por ejemplo una planta, por ejemplo las generaciones de plantas T1, T2, T3 y subsecuentes o las subsiguientes generaciones de plantas BC1, BC2, BC3. Así, las plantas transgénicas de la invención pueden ser cultivadas y cruzadas consigo mismas y con otros individuos con el fin de obtener plantas transgénicas adicionales de la invención. También es posible obtener plantas transgénicas por propagación vegetativa de células vegetales transgénicas.

La cantidad de expresión de un gen está regulada al nivel transcripcional o de traducción o con respecto a la estabilidad y degradación de un producto genético.

Las secuencias reguladoras se disponen usualmente corriente arriba (5´) con, dentro de y/o corriente abajo (3´) con respecto a un ácido nucleico en particular o a una sección del gen codogénico en particular. Controlan en particular la transcripción y/o traducción y también la estabilidad del transcripto de la sección genética codogénica, cuando se ha apropiado en cooperación con sistemas funcionales adicionales intrínsecos a la célula, tales como el aparato de biosíntesis de proteínas de la célula. Así es posible influenciar el promotor, UTR, sitios de división, señales de poliadenilación, terminadores, potenciadores, señales de procesamiento, modificaciones postranscripcionales y/o postraducción, etc., de acuerdo con el conocimiento de la persona experimentada con el fin de incrementar la expresión de una proteína endógena sin influenciar la secuencia de dicha proteína en sí misma.

Adicionalmente, la regulación transcripcional puede ser alterada específicamente introduciendo un factor de transcripción artificial, tal como se describe más adelante y en los ejemplo.

Las secuencias reguladoras están divulgadas, por ejemplo, en Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), o en Gruber; Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Ratón, Florida, eds.: Glick and Thompson, chapter 7, 89-108, incluyendo las referencias contenidas allí.

En general es posible, por ejemplo, por medio de análisis de promotores, identificar factores de transcripción endógena involucrados en la regulación transcripcional de un gen endógeno de SEQ ID NO: 1. La actividad incrementada de los reguladores positivos o de actividad más reducida o de los reguladores negativos puede incrementar la transcripción de un gen endógeno de SEQ ID NO: 1.

Adicionalmente, los métodos para alterar la expresión de genes por medio de factores de transcripción artificiales son conocidos por la persona experimentada.

Así, por ejemplo, una alteración en la expresión de un gen, en particular un gen que expresa SEQ ID NO: 2, puede alcanzarse modificando o sintetizando factores de enlazamiento de ADN específicos en particular tales como, por ejemplo, factores de transcripción de dedo de zinc. Estos factores se enlazan a regiones genómicas particulares de un gen objetivo endógeno, preferiblemente a las secuencias reguladoras, y pueden producir la activación o represión de dicho gen. El uso de tal método hace posible activar o reducir la expresión del gen endógeno, evitando una manipulación recombinante de la secuencia de dicho gen. Se describen métodos correspondientes, por ejemplo en Dreier B [(2001) J. Biol. Chem. 276(31): 29466-78 and (2000) J. Mol. Biol. 303(4): 489-502], Beerli RR (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(25): 14628-14633; (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4): 1495-1500 and (2000) J. Biol. Chem. 275(42): 32617-32627), Segal DJ and Barbas CF (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4(1): 34-39, Kang JS and Kim JS (2000) J. Biol. Chem. 275(12): 8742-8748, Kim JS, (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(8): 3616-3620, Klug A (1999) J. Mol. Biol. 293(2): 215-218, Tsai SY, (1998) Adv. Drug Deliv. Rev. 30(1-3): 23-31], Mapp AK (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(8): 3930-3935, Sharrocks AD (1997) Int. J. Biochem. Cell Biol. 29(12): 1371-1387 and Zhang L (2000) J. Biol. Chem. 275(43): 33850-33860.

Ejemplos de aplicación del método para modificación de la expresión genética en plantas están descritos, por ejemplo, en WO 01/52620, Ordiz MI, (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(20):13290-13295) o Guan (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(20): 13296-13301) y en los ejemplos mencionados más adelante.

En una divulgación, el método divulgado aquí comprende incrementar el número de copias de genes del polinucleótido utilizado en el método divulgado aquí y caracterizado aquí en la planta.

Ventajosamente, el método descrito aquí incrementa el número y tamaño de hojas, el número de frutos y/o el tamaño de los frutos de una planta cuya actividad de SEQ ID NO: 2 está incrementada, significando fruto cualquier producto recolectado de una planta, tal como por ejemplo, semillas, tubérculos, hojas, flores, corteza, frutos y raíces.

La planta preparada en el método de la invención tiene preferiblemente un peso fresco que se incrementa en 5%, más preferiblemente en 10%, incluso más preferiblemente en más de 15%, 20% o 30%. Incluso se da más preferencia a un incremento en rendimiento en 50% o más, por ejemplo en 75%, 100% o 200% o más.

El rendimiento de la planta preparada en el método de la invención se incrementa preferiblemente en al menos 5%, más preferiblemente en más del 10%, incluso más preferiblemente en más de 15%, 20% o 30%. Incluso se da más preferencia a un incremento en rendimiento en más de 50% o más, por ejemplo 75%, 100% o 200% o más.

En una divulgación adicional, la planta preparada en el método divulgado aquí es más tolerante a tensión abiótica o biótica.

En una divulgación, la descripción también divulga un método para preparar agentes químicos finos. El método comprende proveer una célula, un tejido o un organismo que tiene actividad incrementada de SEQ ID NO: 2 y cultivar dicha célula, dicho tejido o dicho organismo bajo condiciones que permiten la producción de los agentes químicos finos deseados en dicha célula, dicho tejido o dicho organismo. Se da preferencia a proveer en el método a una planta de la invención, un microorganismo divulgado aquí o un animal útil divulgado aquí.

Como se describió anteriormente, el incremento de la actividad de SEQ ID NO: 2 en un organismo no humano, en particular en plantas, da como resultado un incremento en el rendimiento y un crecimiento más rápido. Por ahora, sin embargo, se utilizan muchos organismos para producir agente químicos finos. La producción de agentes químicos finos actualmente es inimaginable sin microorganismos que producen moléculas no costosas y específicas, incluso complejas cuya síntesis química comprende muchas etapas de proceso y etapas de purificación. Así, agentes químicos finos tales como vitaminas y aminoácidos se producen industrialmente a gran escala de la misma forma que los compuestos farmacéuticos activos complejos, por ejemplo, factores de crecimiento, anticuerpos, y el término agentes químicos finos se entiende que incluye también estos compuestos activos de aquí en adelante. Las plantas son usadas ya de la misma forma para producir diversos agentes químicos finos tales como, por ejemplo, polímeros, por ejemplo, polihidroxialcanoides, vitaminas, aminoácidos azúcares, ácidos grasos, en particular ácidos grasos poliinsaturados, etc. Incluso se utilizan ya animales útiles para producir agentes químicos finos. Así, ya ha sido descrita la producción de anticuerpos u otros compuestos farmacéuticos activos en la leche de cabras o vacas.

En una divulgación particularmente preferida, el método divulgado aquí divulga consecuentemente un método en el cual la actividad de SEQ ID NO: 2 en un organismo no humano, por ejemplo una planta o un microorganismo, se incrementa y se modulan una o más rutas metabólicas de tal manera que se incrementa el rendimiento y/o eficiencia de la producción de uno o más agentes químicos finos.

Los términos producción y productividad son conocidos para la persona experimentada y comprenden incrementar la concentración de productos deseados (por ejemplo ácidos grasos, carotenoides, (poli) sacáridos, vitaminas, isoprenoides, lípidos, ácidos grasos (ésteres), y/o polímeros tales como polihidroxialcanoides y/o sus productos metabólicos u otros agentes químicos finos deseados como se describe aquí) dentro de un tiempo particular y en un volumen particular (por ejemplo kilogramo/hora/litro).

El término “agente químico fino” es conocido en la técnica e incluye moléculas que son producidas por un organismo no

humano y que se utilizan en diversas ramas de la industria tales como, por ejemplo, pero no restringiéndose a, la industria farmacéutica, la industria agrícola y la industria de cosméticos. Estos compuestos comprenden ácidos orgánicos tales como ácido tartárico, ácido itacónico y ácido diaminopimélico, polímeros o macromoléculas tales como, por ejemplo, polipéptidos, enzimas, anticuerpos, factores de crecimiento o fragmentos de los mismos, ácidos nucleicos, incluyendo ácidos polinucléicos, aminoácidos proteinogénicos y no proteinogénicos, bases de purina y pirimidina, nucleósidos y nucleótidos (como los descritos, por ejemplo, en Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, pp. 561-612, in Biotechnology vol. 6, Rehm et al., eds VCH: Weinheim y las referencias contenidas allí), lípidos, ácidos grasos saturados y no saturados (por ejemplo ácido araquidónico), dioles (por ejemplo propanodiol y butanodiol), carbohidratos (por ejemplo pentosas, hexosas, ácido hialurónico y trehalosa), compuestos aromáticos (por ejemplo amina aromática, vainillina e índigo), isoprenoides, prostaglandinas, triacilglicerol, colesterol, polihidroxialcanoides, vitaminas y cofactores (como se describe en Ullmann Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27, “Vitamins”, pp. 443-613 (1996) VCH: Weinheim Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asia, held on Sept. 1-3, 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press (1995)), enzimas y todos los otros agentes químicos descritos por Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 y las referencias indicadas allí. El término “agentes químicos finos”, tal como se utiliza aquí, incluye así también compuestos farmacéuticos que pueden ser producidos en

organismos, por ejemplo anticuerpos, factores de crecimiento, etc., o fragmentos de los mismos.

El término “aminoácido” es conocido en la técnica. Los aminoácidos comprenden las unidades estructurales fundamentales de todas las proteínas y por lo tanto son esenciales para las funciones celulares normales. Los aminoácidos proteinogénicos, de los cuales hay 20 tipos, sirven como unidades estructurales para las proteínas en las cuales están enlazados uno con otro por enlaces peptídicos, mientras que los aminoácidos no proteinogénicos (cientos de los cuales son conocidos) usualmente no se encuentran en las proteínas (véase Ullmann Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, “Vitamins”, pp. 57-97 VCH: Weinheim (1985)). Los aminoácidos pueden existir en la configuración D

o L, aunque los aminoácidos L son usualmente el único tipo encontrado en las proteínas de origen natural. Las rutas biosintéticas y de degradación de cada uno de los 20 aminoácidos proteinogénicos están bien caracterizadas tanto en células procariotas como eucariotas (véase, por ejemplo, Stryer, L. Biochemistry, 3rd edition, pp. 578-590 (1988)). Aparte de su función en la biosíntesis de proteínas, estos aminoácidos son agentes químicos interesantes como tales, y se ha encontrado que muchos tienen diversas aplicaciones en las industrias de alimentación humana, alimentación animal, química, cosmética, agrícola y farmacéutica. La lisina es un aminoácido importante no solo para la nutrición humana sino también para animales monogástricos tales como pollos y cerdos. El glutamato se utiliza más frecuentemente como aditivo saborizante (glutamato monosódico, MSG) y en otras formas en la industria de alimentos, tales como aspartato, fenilalanina, glicina y cisteína. La glicina, L-metionina y triptófano son usados todos en la industria farmacéutica. La glutamina, valina, leucina, isoleucina, histidina, arginina, prolina, serina y alanina se utilizan en la industria farmacéutica y en la industria cosmética. La treonina, triptófano y la D-/L- metionina se utilizan ampliamente como aditivos para piensos para animales (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids – technical production and use, pp. 466-502 in Rehm et al., (eds) Biotechnology vol. 6, chapter 14a, VCH: Weinheim). Se ha encontrado que estos aminoácidos son además adecuados como precursores para la síntesis de aminoácidos y proteínas sintéticos, tales como N-acetilcisteína, S-carboximetil-L-cisteína, (S)-5-hidroxitryptófano y otras sustancias descritas en Ullmann Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, pp. 57-97, VCH, Weinheim, 1985.

El término “vitaminas” es conocido en la técnica y comprenden nutrientes que son requeridos para el funcionamiento

normal de un organismo pero no pueden ser sintetizados por el organismo mismo. El grupo de vitaminas puede incluir cofactores y compuestos nutracéuticos.

El término “cofactor” comprende compuestos no proteináceos necesarios para la aparición de una actividad enzimática normal. Estos compuestos pueden ser orgánicos o inorgánicos; las moléculas cofactor divulgadas aquí son por ejemplo orgánicas.

El término “nutracéutico” comprende aditivos para alimentos que son promotores de la salud en plantas y animales, especialmente humanos. Ejemplos de tales moléculas son vitaminas, antioxidantes y de la misma forma ciertos lípidos (por ejemplo ácidos grasos poliinsaturados).

Las vitaminas, cofactores y nutracéuticos comprenden consecuentemente un grupo de moléculas que no pueden ser sintetizadas por los animales superiores los cuales por lo tanto tienen que consumirlos, aunque pueden ser sintetizados fácilmente por otros organismos tales como bacterias. Estas moléculas son moléculas bioactivas per se o precursores de sustancias bioactivas que sirven como portadores de electrones o productos intermediarios en un cierto de números de rutas metabólicas. Además de su valor nutricional, estos compuestos tienen un valor industrial sustancial como colorante, antioxidante y catalizadores u otros auxiliares de procesamiento. Para una revisión de la estructura, actividad y aplicaciones industriales de estos compuestos, véase, por ejemplo Ullmann Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", vol. A27, pp. 443-613, VCH: Weinheim, 1996. Los ácidos grasos poliinsaturados están descritos en particular en: Simopoulos 1999, Am. J. Clin. Nutr., 70 (3 Suppl):560-569, Takahata et al., Biosc. Biotechnol. Biochem, 1998, 62 (11):2079-2085, Willich and Winther, 1995, Deutsche Medizinische Wochenschrift, 120 (7):229 ff y las referencias contenidas allí.

El término “purina” o “pirimidina” comprende bases que contienen nitrógeno que forman parte de ácidos nucleicos, coenzimas y nucleótidos. El término “nucleótido” comprende las unidades estructurales fundamentales de las moléculas

de ácidos nucleicos, que comprenden una base que contiene nitrógeno, un azúcar de pentosa (el azúcar es ribosa en el caso del ARN y D-desoxirribosa en el caso del ADN) y ácido fosfórico. El término “nucleósido” comprende moléculas que sirven como precursores de nucleótidos pero no tienen, en contraste a los nucleótidos, unidades de ácido fosfórico. Es posible inhibir la síntesis de ARN y ADN inhibiendo la biosíntesis de estas moléculas o su movilización desde las moléculas de ácido nucleico; la inhibición direccionada de esta actividad en células de cáncer permite que la capacidad de las células tumorales para dividirse y replicarse se inhiba. Además, hay nucleótidos que no forman moléculas de ácido nucleico pero sirven como almacenes de energía (esto es AMP) o como coenzimas (esto es FAD Y NAD). Sin embargo, las bases de purina y pirimidina, nucleósidos y nucleótidos también tienen otros usos posibles: como productos intermediarios en la biosíntesis de diversos productos químicos finos (por ejemplo tiamina, S-adenosil metionina, folatos o riboflavinas), como portadores de energía para la célula (por ejemplo ATP o GTP) y como agentes químicos en sí mismo; se utilizan ordinariamente, potenciadores de sabor (por ejemplo IMP o GMP) o para muchas aplicaciones médicas (véase por ejemplo Kuninaka, A., (1996) "Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology" vol. 6, Rehm et al., eds. VCH: Weinheim, pp. 561-612). Las enzimas involucradas en el metabolismo de la purina, pirimidina, nucleósidos o nucleótidos también sirven crecientemente como objetivos contra los cuales se están desarrollando agentes químicos para protección de cultivos, incluyendo fungicidas, herbicidas e insecticidas.

Una célula contiene diferentes fuentes de carbono las cuales también están incluidas en el término “agentes químicos finos”, por ejemplo azúcares, tales como glucosa, fructosa, manosa, galactosa, ribosa, sorbosa, ribulosa, lactosa,

maltosa, sacarosa o refinosa, almidón o celulosa, alcoholes (por ejemplo metanol o etanol), alcanos, ácidos grasos, en particular ácidos grasos poliinsaturados y ácidos orgánicos tales como ácido acético o ácido láctico. Los azúcares pueden ser transportados por una multiplicidad de mecanismos a través de la membrana celular hacia la célula. La capacidad de las células para crecer y dividirse rápidamente en cultivo depende hasta un alto grado del nivel de capacidad de dichas células para absorber y utilizar moléculas ricas en energía tales como glucosa y otros azúcares. La trehalosa consiste de dos moléculas de glucosa enlazadas entre sí mediante un enlace α, α-1,1. Se utiliza ordinariamente en la industria de los alimentos como endulzante, como aditivo para alimentos secos o congelados y en bebidas. También, se utiliza en la industria farmacéutica, la industria cosmética y la industria de la biotecnología (véase, por ejemplo, Nishimoto et al., (1998) US-Patent NO 5 759 610; Singer, M.A. and Lindquist, S. Trends Biotech. 16 (1998) 460-467; Paiva, C.L.A. and Panek, A.D. Biotech Ann. Rev. 2 (1996) 293-314; y Shiosaka, M. J. Japan 172 (1997) 97102). La trehalosa es usada por enzimas de muchos microorganismos y es liberada de manera natural en el medio circundantes desde el cual puede ser aislada por métodos conocidos en la técnica.

La biosíntesis de dicha moléculas en organismos ha sido caracterizada de manera amplia, por ejemplo, en Ullmann Encyclopedia of Industrial Chemistry, VCH: Weinheim, 1996, e.g. chapter "Vitamins", vol. A27, pp. 443-613, Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A.S., Niki, E. and Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for free Radical Research - Asia, held on Sept. 1-3, 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press, Champaign, IL X, 374 S).

Consecuentemente, se divulga aquí un método para incrementar la producción de aceite de una planta.

Las plantas pueden ser utilizadas ventajosamente, por ejemplo, para la producción de ácidos grasos. Por ejemplo, los lípidos de almacenamiento en las semillas de plantas superiores se sintetizan a partir de ácidos grasos que tienen principalmente de 16 a 18 carbonos. Dichos ácidos grasos están localizados en los aceites de semillas de diversas especies vegetales. Se ha demostrado un incremento en SEQ ID NO: 2 en Arabidopsis en el que la producción de semilla se incremente en aproximadamente 30%. La producción de dichos aceites en plantas puede ser incrementada, por ejemplo, expresando polinucleótidos caracterizados aquí. Pueden utilizarse aceites vegetales, por ejemplo, como combustible o como material para diversos productos tales como, por ejemplo, plásticos, fármacos, etc. Pueden usarse ácidos grasos poliinsaturados particularmente de manera ventajosa en nutrición y piensos.

En una divulgación, dicho método divulgado aquí comprende preparar agentes químicos finos transformando el organismo no humano con uno o más polinucleótidos adicionales cuyos productos genéticos son parte de una de las rutas metabólicas antes mencionadas o cuyos productos genéticos están involucrados en la regulación de una de estas rutas metabólicas de tal manera que el organismo no humano produce los agentes químicos finos deseados o se incrementa la producción de un agente químico fino deseado. Ventajosamente, la expresión de los genes usados en el método junto con el incremento de la actividad de SEQ ID NO: 2 logra ventajosamente un incremento en la producción de dichos agentes químicos finos. Los genes que sirven para la producción de dichos agentes químicos finos son conocidos para la persona experimentada y han sido descritos en la literatura de muchas diferentes maneras.

La biosíntesis de dichos agentes químicos finos, por ejemplo de ácidos grasos, carotenoides, polisacáridos, vitaminas, isoprenoides, lípidos, ésteres grasos o polihidroxialcanoides y los productos metabólicos antes mencionados, en plantas tiene lugar frecuentemente en rutas metabólicas especiales de organelos celulares particulares. Consecuentemente, los polinucleótidos cuyos productos genéticos obran en una parte en estas rutas biosintéticas y que están localizados consecuentemente en dichos organelos especiales incluyen secuencias que codifican por péptidos de señalización correspondiente.

Pueden introducirse nucleótidos adicionales en la célula huésped, preferiblemente en una célula vegetal, con los constructos del gen, casetes de expresión, vectores, etc. descritos aquí. Los casetes de expresión, los constructos del gen, vectores, etc. de esta clase pueden ser introducidos por transformación simultánea y una pluralidad de casetes de expresión, constructos de gen, vectores, etc. individuales o, preferiblemente, combinando una pluralidad de genes, casetes de ORF o casetes de expresión en un constructo. También es posible utilizar una pluralidad de vectores con en cada caso una pluralidad de casetes de expresión para transformación introducirlos en la célula anfitriona.

Consecuentemente, los constructos genéticos, casetes de expresión, vectores, etc. descritos anteriormente para el método de la invención pueden mediar también el incremento o reducción de genes adicionales, además de incrementar la expresión en SEQ ID NO: 1.

Por lo tanto es ventajoso introducir en los organismos anfitriones y expresar en ellos genes reguladores tales como genes para inductores, represores o enzimas, los cuales, debido a su actividad, intervienen en la regulación de uno o más genes de una ruta biosintética. Estos genes pueden ser de origen heterólogo u homólogo. Adicionalmente, es posible introducir adicionalmente genes de biosíntesis para introducir agentes químicos finos de tal manera que la producción de dichos agentes químicos finos sea particularmente efectiva debido al crecimiento acelerado.

Para este propósito, los ácidos nucleicos antes mencionados pueden ser utilizados por la transformación de plantas, por ejemplo, con la ayuda de Agrobacterium, después de que han sido clonados en casetes de expresión de la invención, por ejemplo en combinación con moléculas de ácido nucleico que codifican otros polipéptidos. Los genes que codifican “otros polipéptidos” o “reguladores” pueden ser introducidos también en los organismos no humanos deseados en transformaciones independientes. Esto puede tener lugar antes o después de incrementar la actividad de SEQ ID NO: 2 en dicho organismo no humano. La cotransformación con un segundo constructo de expresión o vector y selección subsecuente del marcador apropiado también es posible.

En una realización, la invención se relaciona con un constructo genético, un casete de expresión o un vector que comprende una o más de las moléculas de ácido nucleico o polinucleótido tales como se definen en las reivindicaciones. Los casetes, constructos o vectores son preferiblemente adecuados para uso en el método y comprenden, por ejemplo, los polinucleótidos antes mencionados que codifican la actividad de SEQ ID NO: 2, preferiblemente enlazados funcionalmente a una o más señales reguladoras para mediar o incrementar la expresión genética en plantas.

Se incluyen dichos homólogos, derivados o análogos que están enlazados funcionalmente a una o más señales reguladoras o secuencias reguladoras, ventajosamente para incrementar la expresión genética.

Las secuencias reguladoras pretenden hacer posible la expresión direccionada de los genes y síntesis de las proteínas

codificadas. El término “secuencia reguladora” se define más arriba e incluye, por ejemplo, el terminador descrito,

señales de procesamiento, modificaciones postranscripcionales, postraducción, promotor, potenciador, UTR, sitios de división, señales de poliadenilación y otros elementos de control de la expresión conocidos para la persona experimentada y mencionados aquí.

Dependiendo del organismo anfitrión, por ejemplo, esto puede significar que el gen es expresado y/o sobreexpresado solamente después de la inducción o que se expresa y/o sobreexpresa inmediatamente. Ejemplos de estas secuencias reguladoras son secuencias a las cuales se enlazan los inductores o represores y regulan así la expresión del ácido nucleico. Además de estas nuevas secuencias reguladoras o en lugar de estas nuevas secuencias reguladoras, la regulación natural de dichas secuencias puede aún estar presente corriente arriba de los genes estructurales reales y, cuando sea apropiado, pueden haber sido modificados genéticamente de tal manera que la regulación natural haya sido desconectada y la expresión de los genes haya sido incrementada. Sin embargo, el casete de expresión (= constructo de expresión = constructo genético) puede también tener una estructura más simple, esto es, no se insertan señales reguladoras adicionales corriente arriba de la secuencia de ácido nucleico o derivados del mismo y el promotor natural con su regulación no es eliminado. En vez de esto, la secuencia reguladora natural es mutada de tal manera que la regulación no tiene lugar más y/o se incrementa la expresión del gen. Estos promotores modificados también pueden ser puestos en la forma de secuencias parciales (=promotor con partes de las secuencias de ácidos nucleicos divulgados aquí) solo corriente arriba del gen natural para incrementar la actividad. Además, el constructo genético

puede comprender ventajosamente también una o más secuencias “potenciadoras” funcionalmente enlazadas al

promotor, lo que hace posible la expresión incrementada de la secuencia de ácido nucleico. Secuencias ventajosas adiciónales tales como elementos reguladores adicionales o terminadores también pueden ser insertados en el extremo 3´ de las secuencias de ADN. Las secuencias de ácido nucleico divulgadas aquí que codifican preferiblemente para la actividad de SEQ ID NO: 2, pueden estar presentes en uno o más copias en el casete de expresión (= constructo genético). Una o más copias de los genes pueden estar presentes en el casete de expresión. Este constructo genético o los constructos genéticos pueden ser expresados juntos en el organismo anfitrión. Es posible para el constructo genético o los constructos genéticos ser insertados en uno o más vectores y estar presentes en forma libre en la célula

o además ser insertados en el genoma. En el caso de plantas, la integración en el genoma de plástidos o en el genoma celular puede haber tenido lugar. Los vectores de clonación se describen de manera amplia en la técnica anterior y aquí pueden ser utilizados para la transformación.

Se da preferencia a la introducción de secuencias de ácidos nucleicos usados en el método en un casete de expresión que posibilita que los ácidos nucleicos sean expresados en una planta.

Los casetes de expresión pueden ser usados en principio directamente para introducción en la planta o además ser introducidos en un vector.

En otra divulgación, la descripción también divulga las secuencias complementarias de dichos polinucleótidos divulgados aquí y también de un ácido polinucleico antisentido. Una molécula de ácido nucleico antisentido comprende, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la molécula de ácido nucleico “en sentido” que codifica una proteína, por ejemplo complementaria a la cadena de codificación de una molécula de ADNc de cadena doble o complementaria una secuencia de ARNm. El término molécula antisentido debería también abarcar moléculas de ARN de interferencia específicamente también moléculas de ARNi de horquilla, con o sin secuencias espaciadoras o enlazadoras entre las secuencias complementarias.

Consecuentemente, una molécula de ácido nucleico antisentido es capaz de formar puentes de hidrógeno con una molécula de ácido nucleico en sentido. La molécula de ácido nucleico en sentido puede ser complementaria a cualquiera de las cadenas codificadoras representadas aquí o solamente a una parte de la misma. Un oligonucleótido antisentido, por ejemplo, puede tener 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos de longitud. Una molécula de ácido nucleico antisentido puede ser preparada por síntesis química y ligación enzimática de acuerdo con métodos conocidos por la persona experimentada. Una molécula de ácido nucleico antisentido puede ser sintetizada químicamente utilizando nucleótidos de origen natural o nucleótidos modificados en diversas formas de manera que se incremente la estabilidad biológica de las moléculas o para potenciar la estabilidad física del dúplex que se forma entre el ácido nucleico antisentido y el ácido nucleico en sentido; es posible usar, por ejemplo, derivados fosforotiorato y nucleótidos sustituidos con acridina. Alternativamente, es posible preparar moléculas de ácidos nucleicos antisentido biológicamente utilizando vectores de expresión en los cuales se han clonado polinucleótidos cuya orientación es antisentido. La molécula de ácido nucleico antisentido también puede ser una molécula de ácido nucleico “α-anomérica”. Una molécula de ácido nucleico “α-anomérica” forma híbridos de doble cadena específicos con ARN complementario, en los cuales las cadenas corren paralelas una a otra, en contraste con las unidades β ordinarias. La molécula de ácido nucleico antisentido puede comprender 2-0-metilrribonucleótidos o análogos quiméricos de ARN-ADN. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser una ribozima. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas que tienen una actividad de ribonucleasa y son capaces de escindir ácido nucleicos de cadena sencilla con los cuales tienen una región de complementariedad, tales como ARNm, por ejemplo.

En otra divulgación, la descripción divulga el polipéptido codificado por el nucleótido divulgado aquí y un anticuerpo policlonal o monoclonal, por ejemplo un anticuerpo monoclonal, dirigido contra dicho polipéptido.

“Anticuerpos” significa, por ejemplo, anticuerpos policlonales, monoclonales, humanos o humanizados o recombinantes

o fragmentos de los mismos, anticuerpos de cadena sencilla o además anticuerpos sintéticos. Los anticuerpos divulgados aquí o fragmentos de los mismos significan en principio todas las clases de inmunoglobulina tales como IgM, IgG, IgD, IgE, IgA o sus subclases tales como las subclases IgG o mezclas de los mismos. Son adecuadas las IgG y sus subclases tales como, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgGM. Particularmente adecuados son los subtipos de IgG, IgG1 e IgG2b. Los fragmentos que pueden ser mencionados son cualquier fragmento de anticuerpo truncado o modificado que tiene uno o dos sitios de enlace complementarios al antígeno, tales como las unidades estructurales de anticuerpos que tienen un sitio de enlazamiento que corresponde al anticuerpo y está compuesto de una cadena ligera y una cadena pesada, tales como fragmentos Fv, Fab o F (ab´)2 o fragmentos de cadena sencilla. Son adecuados fragmentos de cadena doble truncados tales como Fv, Fab o F (ab´)2. Estos fragmentos pueden ser obtenidos, por ejemplo, bien sea enzimáticamente, escindiendo la unidad estructural Fc de los anticuerpos utilizando enzimas tales como papaína o pepsina, por medio de oxidación química o por medio de manipulación genética de los genes de anticuerpos. Los fragmentos no truncados manipulados genéticamente también pueden ser usados ventajosamente. Los anticuerpos o fragmentos pueden ser utilizados solos o en mezclas. Los anticuerpos también pueden ser parte de una proteína de fusión.

En otras divulgaciones, la presente descripción divulga un método para preparar un vector, el cual comprende insertar el polinucleótido divulgado aquí o el casete de expresión en un vector, y a un vector que comprende el polinucleótido divulgado aquí.

Preferiblemente el polinucleótido está enlazado funcionalmente a secuencias reguladoras que permiten la expresión en un anfitrión procariota o eucariota.

El término “vector”, tal como se utiliza aquí, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual esta enlazado. Un ejemplo de un tipo de vector es un “plásmido”, esto es un bucle de ADN circular de

cadena doble. Otro tipo de vector es un vector viral, siendo posible aquí ligar segmentos adicionales de ADN al genoma viral. Vectores particulares tales como, por ejemplo, vectores que tienen un origen de replicación pueden replicarse autónomamente en una célula anfitriona en la cual han sido introducidos. Otros vectores preferidos están integrados ventajosamente en el genoma de una célula huésped en la cual han sido introducidos y por lo tanto son replicados junto con el genoma anfitrión. Adicionalmente, vectores particulares pueden controlar la expresión de genes a los cuales están enlazados funcionalmente. Estos vectores se denominan aquí como “vectores de expresión”. Como se mencionó anteriormente, pueden replicarse de manera autónoma o ser integrados en el genoma anfitrión. Los vectores de

expresión adecuados para técnicas de recombinación de ADN están usualmente en la forma de plásmidos. “Plásmidos” y “vector” pueden ser utilizados como sinónimos en la presente descripción. Consecuentemente, la invención también comprende fagos, virus, por ejemplo SV40, CMV o TMV, transposones, elementos IS, fásmidos, fagémidos, cósmidos, ADN lineal o circular y otros vectores de expresión conocidos para la persona experimentada.

Los vectores de expresión recombinante utilizados ventajosamente en el método comprende los ácidos nucleicos divulgados aquí o el vector de expresión de la invención en una forma adecuada para la expresión de los ácidos nucleicos usados en una célula anfitriona, significando que los vectores de expresión recombinante comprenden una o más secuencias reguladoras que son seleccionadas sobre la base de las células huésped que se van a utilizar para la expresión y las cuales están enlazadas funcionalmente a la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar.

En un vector de expresión recombinante, “enlazado funcionalmente” significa que la secuencia de nucleótidos de interés está enlazada a la secuencia reguladora en la cual una forma en que esa expresión de dicha secuencia de nucleótidos es posible y que están enlazadas una a otra de tal manera que ambas secuencias satisfacen la función predicha atribuida a la secuencia (por ejemplo en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula anfitriona cuando se introduce el vector dentro de dicha célula anfitriona.

Los vectores de expresión recombinantes usados pueden ser diseñados especialmente para expresión en plantas. Por ejemplo, los genes que codifican SEQ ID NO: 1 pueden ser expresados en células bacterianas, células de insectos, etc. utilizando vectores de expresión de baculovirus, células de levadura y otras células fúngicas [de acuerdo con Romanos, (1992), Yeast 8:423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J., (1991), in J.W. Bennet & L.L. Lasure, eds, pp. 396-428: Academic Press: San Diego; y van den Hondel, C.A.M.J.J., (1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F, ed., pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge, in algae, e.g. according to Falciatore, 1999, Marine Biotechnology. 1 , 3:239-251, in ciliates, e.g. in Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Desaturaseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella, Stylonychia, o en el género Stylonychia lemnae, utilizando vectores de acuerdo con un método de transformación tal como el descrito en WO 98/01572, y preferiblemente en células de plantas multicelulares [véase Schmidt, R., (1988) Plant Cell Rep.: 583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Ratón, Florida, chapter 6/7, pp. 71-119 (1993); F.F. White, B. Jenes, Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, eds: Kung and R. Wu, Academic Press (1993), 128-43; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225, y las referencias en los documentos mencionados aquí. Células anfitrionas adecuadas también están discutidas en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede ser transcrito y traducido in vitro usando, por ejemplo, secuencias reguladoras de promotor T7 y T7 polimerasa.

Un casete de expresión vegetal o un vector correspondiente comprende preferiblemente secuencias reguladoras que son capaces de controlar la expresión genética en células vegetales y están enlazados funcionalmente al ORF de tal manera que cada secuencia su función. 0215

El casete de expresión está enlazado preferiblemente a un promotor adecuado que porta la expresión del gen en el tiempo correcto y en una forma específica para la célula o el tejido. Consecuentemente, secuencias reguladoras ventajosas para el método novedoso están presentes en los promotores vegetales CaMV/35S [Franck, Cell 21 (1980) 285-294, US 5,352,605], PRP1 [Ward, Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, PGEL1, OCS [Leisner, (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:2553], lib4, usp, mas [Comai (1990) Plant Mol Biol 15:373], STLS1, ScBV [Schenk(1999) Plant Mol Biol 39:1221, B33, SAD1 and SAD2 (flax promoter, [Jain, (1999) Crop Science, 39:1696) and nos [Shaw (1984) Nucleic Acids Res. 12:7831]. Los diversos promotores de ubiquitina de Arabidopsis [Callis (1990) J Biol Chem 265:12486; Holtorf (1995) Plant Mol Biol 29:637], pino, maíz [(Ubi1 y Ubi2), US 5,510,474; US 6,020,190 and US 6,054,574] o perejil [Kawalleck (1993) Plant Molecular Biology, 21:673] o promotores de faseolina pueden ser utilizados ventajosamente. Los promotores inducibles tales como los promotores descritos en EP-A-0 388 186 (inducible por bencilsulfonamida), Gatz, (1992) Plant J. 2:397 (inducible por tetraciclina), EP-A-0 335 528 (inducible por ácido abscísico) o WO 93/21334 (inducible por etanol o ciclohexanol) son de la misma forma ventajosos en este aspecto. Promotores vegetales adecuados adicionales son el promotor de la FBPasa citosólica o el promotor ST-LSI de la patata (Stockhaus, 1989, EMBO J. 8, 2445), el promotor de la fosforribosil-pirofosfato amidotransferasa de Glycine max (GenBank accession NO U87999), o el promotor específico de nodo en EP-A-0 249 676. Los promotores que hacen posible la expresión en tejidos específicos o muestran una expresión preferencial en ciertos tejidos también pueden ser adecuados. También son ventajosos promotores específicos para semillas tales como el promotor de USP pero también otros promotores tales como los promotores LeB4, DC3, SAD1, faseolina o napina. Promotores específicos para hojas como los descritos en DE-A 19644478 o promotores regulados por la luz tales como, por ejemplo, el promotor petE también están disponibles para la expresión de genes en plantas. Promotores ventajosos adicionales son promotores específicos de semillas que pueden ser utilizados para plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas y están descritos en US 5,608,152 (promotor napina de la semilla de colza), WO 98/45461 (promotor de oleosina de Arabidopsis), US 5,504,200 (promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris), WO 91/13980 (promotor de Bce4 de Brassica) y von Baeumlein, 1992, Plant J.,

2:233 (promotor LeB4 de leguminosa), siendo adecuados estos promotores para dicotiledóneas. Ejemplos de promotores adecuados para monocotiledóneas son los siguientes: promotor lpt-2- o lpt-1 de cebada (WO 95/15389 y WO 95/23230), promotor de hordeína de cebada, el promotor de ubiquitina del maíz y otros promotores adecuados descritos en WO 99/16890.

Con el fin de expresar secuencias heterólogas fuertemente en tantos tejidos como sea posible, en particular también en hojas, se da preferencia al uso, además de los diversos promotores antes mencionados, promotores vegetales de actina

o genes de ubiquitina, tales como, por ejemplo, el promotor de actina 1 del arroz. Otro ejemplo de promotores vegetales constitutivos son los promotores V-ATPasa de la remolacha de azúcar (WO 01/14572).

Es posible en principio utilizar todos los promotores naturales con sus secuencias reguladoras, tales como los mencionados anteriormente, para el nuevo método. Por lo tanto es posible y ventajoso utilizar promotores sintéticos adicionalmente o solos, particularmente sí median la expresión constitutiva. Ejemplos de promotores constitutivos sintéticos son el superpromotor (WO/95/14098) y los promotores derivados de cajas G (WO 94/12015).

Los genes vegetales también pueden ser expresados a través de un promotor inducible químicamente (véase una revisión en Gatz 1997, Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89-108). Los promotores inducibles químicamente son particularmente adecuados cuando se desea expresar genes en una forma específica en el tiempo. Ejemplos de tales promotores son un promotor inducible por ácido salicílico (WO 95/19443), un promotor inducible por tetraciclina (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404), un promotor inducible por etanol y EP-A 0338 186, EP-A 0 335 528, WO 97/06268. En principio también es posible la expresión específicamente en gimnospermas o angiospermas.

Los promotores que responden a condiciones de tensión biótica o abiótica también son promotores adecuados, por ejemplo en plantas el promotor del gen PRP1 inducido por patógenos (Ward, Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361), el promotor hsp80 inducible por calor del tomate (US 5,187,267), el promotor de alfa amilasa inducible por el frio en patata (WO 96/12814) o el promotor pinII inducible por heridas (EP-A-0 375 091).

Las señales de poliadenilación preferidas son suficientemente conocidas para la persona experimentada, por ejemplo para plantas derivadas de t-ADN de Agrobacterium tumefaciens, tales como el gen 3, conocido como octopina sintasa (gen ocs) del plásmido de pTiACH5 (Gielen, EM-BO J. 3 (1984) 835), el gen nos o equivalentes funcionales de los mismos. Otros terminadores conocidos que son activos funcionalmente en plantas también son adecuados.

Secuencias reguladoras adicionales que son expeditivas cuando sea apropiado incluye también secuencias que controlan el transporte/localización de los productos de expresión (direccionamiento). En relación con esto, debe hacerse relación particularmente a las secuencias de codificación de péptidos de señalización o péptidos de transito conocidas per se. Por ejemplo, es posible con la ayuda de secuencias de codificación de péptidos de tránsito guiar el producto de expresión hacia los plástidos de una célula vegetal. Consecuentemente, se da preferencia al uso de enlaces funcionales en casetes de expresión de genes vegetales en particular el direccionamiento de secuencias que son requeridas para guiar el producto genético a su compartimiento celular apropiado (véase una revisión en Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285 y referencias citadas allí), por ejemplo en la vacuola, el núcleo, cualquier clase de plástidos, como amiloplastos, cloroplastos, cromoplastos, el espacio extracelular, las mitocondrias, el retículo endoplasmático, cuerpos oleosos, peroxisomas y otros compartimientos de las células vegetales. Así, en particular las señales de direccionamiento al peroxisoma han sido descritas, por ejemplo, en Olsen LJ, Plant Mol Biol 1998, 38: 163189).

De acuerdo con lo anterior el constructo genético, el vector, el casete de expresión, etc., se construyen ventajosamente de tal manera que un promotor es seguido por un sitio de escisión adecuado del ácido nucleico que se va a expresar, por ejemplo en un polienlazante, y se localiza entonces un terminador, cuando sea apropiado, corriente abajo del polienlazante o del inserto. Está secuencia puede ser repetida varias veces, por ejemplo tres, cuatro o cinco veces, de tal manera que se combinan genes múltiples en un constructo y pueden ser introducidos de esta manera en la planta transgénica para su expresión. Ventajosamente, cada secuencia de ácido nucleico tiene su propio promotor y, cuando sea apropiado su propio terminador. En el caso de microorganismos capaces de procesar un ARN policistrónico, también es posible insertar una pluralidad de secuencias ácidos nucleicos corriente abajo de un promotor, y cuando sea apropiado, corriente arriba de un terminador. Es ventajosamente posible utilizar en el casete de expresión diferentes promotores. Puede utilizarse una secuencia de terminador diferente ventajosamente para cada gen.

El casete de expresión vegetal contiene preferiblemente secuencias enlazadas funcionalmente adicionales tales como potenciadores de la traducción, por ejemplo, la secuencia de sobreconducción que comprende la secuencia guía 5´ no traducida del virus mosaico del tabaco, que incrementa la relación proteína/ARN (Gallie, 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693).

Los vectores, casetes, moléculas de ácidos nucleicos, etc. que se van a introducir pueden ser introducidos en células procariotas o eucariotas a través de técnicas convencionales de transformación o transfección.

Los términos “transformación” y “transfección”, conjugación y transducción, tal como se utilizan aquí, pretenden incluir

una multiplicidad de métodos conocidos en la técnica anterior para introducir ácido nucleico foráneo (por ejemplo ADN) en una célula huésped, incluyendo coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, competencia natural, trasferencia mediada químicamente, electroporación o bombardeo con partículas. Los métodos adecuados para transformar o transfectar células anfitrionas, incluyendo células vegetales, pueden ser encontrados en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) y otros manuales de laboratorio tales como Methods in Molecular Biology, 1995, vol. 44, Agrobacterium protocols, eds: Gartland and Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey.

Así es posible que los ácidos nucleicos, constructos genéticos, casetes de expresión, vectores, etc., usados en el método sean integrados bien sea en el genoma del plástido o preferiblemente en el genoma nuclear de la célula anfitriona, después de la introducción en una célula vegetal o planta. La integración en el genoma puede ser aleatoria o puede ser llevada a cabo a través de recombinación de tal manera que la copia introducida reemplace el gen original, modulando por lo tanto la producción del compuesto deseado por la célula, o utilizando un gen en trans de tal manera que dicho gen está enlazado funcionalmente a la unidad de expresión funcional que comprende al menos una secuencia que garantiza la expresión de un gen y al menos una secuencia que garantiza la poliadenilación de un gen funcionalmente transcrito. Cuando se han apropiado, los ácidos nucleicos se transfieren a las plantas a través de casetes de multiexpresión o constructos para expresión multiparalela de genes. La secuencia de ácidos nucleicos puede ser introducida en la planta sin secuencias de ácidos nucleicos diferentes adicionales.

Como se describió anteriormente, la transferencia de genes foráneos del genoma de la planta se denomina como transformación. En este caso, los métodos descritos para la transformación y regeneración de plantas a partir de tejidos vegetales o células vegetales se utilizan para transformación transiente o estable. Métodos adecuados son transformación de protoplastos por consumo de ADN inducido por polietilén glicol, el método bioclástico que utiliza la pistola de genes – el método de “bombardeo con partículas”, electroporación, incubación de embriones secos en solución que contiene ADN, microinyección y transferencia genética mediada por Agrobacterium. Dichos métodos están descritos, por ejemplo, en B. Jenes, Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by S.D. Kung and R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 and in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225).

El constructo que se va a expresar está clonado preferiblemente en un vector que es adecuado para transformar Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo, como se describe aquí, por ejemplo pBin 19 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Las agrobacterias transformadas con tal vector pueden ser utilizadas entonces de manera conocida para la transformación de plantas, en particular plantas de cultivo, tales como, por ejemplo plantas de tabaco, por ejemplo bañando hojas lesionadas o piezas de hojas en una solución de agrobacterias y luego cultivar dicha hojas o piezas de hojas en un medio adecuado. La transformación de las plantas con Agrobacterium tumefaciens está descrita, por ejemplo, por Höfgen, Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 o está divulgada, entre otros, en F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by S.D. Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.

Los ácidos nucleicos, constructos genéticos, casetes de expresión, vectores, etc., usados en el método son verificados, cuando sea apropiado, y luego usados para la transformación de las plantas. Para este propósito, puede requerirse primero obtener los constructos, plásmidos, vectores, etc., a partir de un anfitrión intermediario. Por ejemplo, los constructos pueden ser aislados como plásmidos a partir de anfitriones bacterianos, siguiendo un aislamiento convencional de plásmidos. Se conocen numerosos métodos para transformar plantas. Puesto que la integración estable de ADN heterólogo en el genoma de las plantas es ventajosa de acuerdo con la invención, la transformación mediada por T-ADN, en particular, ha demostrado ser expeditiva y puede llevarse a cabo de una manera conocida per se. Por ejemplo, el constructo de plásmido generado de acuerdo con lo que se ha mencionado anteriormente puede ser transformado en agrobacterias competentes por medio de electroporación o choque térmico. En principio, la distinción que se hace aquí es entre la formación de vectores cointegrados por un lado y la transformación con vectores binarios. En la primera alternativa, los constructos del vector que comprenden la sección de gen codogénico no contienen ninguna secuencia de T-ADN, más bien los vectores cointegrados son formados en las bacterias por recombinación homóloga del constructo de vector con T-ADN. El T-ADN está presente en agrobacterias en forma de plásmidos Ti o Ri en los cuales los oncógenos han sido reemplazados convenientemente por ADN exógeno. Cuando se utilizan vectores binarios, estos pueden ser transferidos por medio de conjugación bacteriana o transferencia directa a las agrobacterias. Dichas agrobacterias comprenden ya convenientemente el vector que porta el gen vir (frecuentemente denominado como plásmido Ti (Ri) auxiliar). De manera expeditiva, pueden usarse uno o más marcadores, sobre la base de que la selección de agrobacterias transformadas y células vegetales transformadas es posible. El experimentado en la técnica conoce una multiplicidad de marcadores.

Se sabe acerca de la integración estable o transiente de ácidos nucleicos que, dependiendo del vector de expresión usado y la técnica de transfección usada, solamente una pequeña proporción de las células consume el ADN foráneo y, si se desea, lo integra en su genoma. Para identificación y selección de estos integrantes, usualmente se introduce un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo resistencia a un antibiótico) junto con el gen de interés en las células anfitrionas.

Los genes marcadores se usan ventajosamente para la selección para la introducción exitosa de ácidos nucleicos divulgados aquí en un organismo anfitrión, en particular en una planta. Estos genes marcadores hacen posible identificar la introducción exitosa de ácidos nucleicos divulgados aquí por un cierto número de principios diferentes, por ejemplo, por reconocimiento visual con ayuda de fluorescencia, luminiscencia o en el rango de longitud de onda de luz que es visible a los humanos, a través de una resistencia a herbicidas o antibióticos, a través de marcadores

“nutricionales” (auxotróficos) o marcadores antinutricionales, por ensayos enzimáticos o a través de fitohormonas.

Ejemplos de tales marcadores que pueden ser mencionados aquí son GFP (= verde fluorescente para proteína); el sistema luciferina/luciferasa; β-galactosidasa con sus sustratos coloreados, por ejemplo, X-Gal; resistencias a herbicidas, por ejemplo, a imidazolinona, glifosfato, fosfotricina o sulfonilurea; resistencia a antibióticos, por ejemplo, bleomicina, higromicina, estreptomicina, kanamicina, tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina o blasticidina, para mencionar solo unos pocos; marcadores nutricionales tales como utilización de manosa o xilosa o marcadores antinutricionales tales como resistencia a 2-desoxiglucosa. La lista representa una pequeña sección de marcadores posibles. Los marcadores de esta clase son bien conocidos para la persona experimentada.

Se prefieren marcadores diferentes, dependiendo del organismo y el método de selección. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen en plantas aquellos que confieren resistencia a un herbicida tal como glifosfato o glufosinato. Marcadores adecuados adicionales son, por ejemplo, marcadores que codifican genes que están involucrados en las rutas sintéticas de, por ejemplo, azúcares o aminoácidos, tales como, β-galactosidasa, ura3 o ilv2.

Los marcadores que codifican genes tales como luciferasa, gfp u otros genes de fluorescencia son de la misma forma adecuados. Estos marcadores pueden ser usados en mutantes en los cuales dichos genes no son funcionales porque, por ejemplo, han sido eliminados por medio de métodos convencionales. Además, los marcadores pueden ser introducidos en una célula anfitriona en el mismo vector que codifica para polipéptidos de SEQ ID NO: 2 u otros de las moléculas de ácido nucleico divulgadas descritas aquí, o pueden ser introducidos en un vector separado.

Puesto que los genes marcadores, especialmente el gen de resistencia a antibióticos y herbicidas, normalmente no se requieren más o son indeseados en la célula anfitriona transgénica después de la introducción exitosa de los ácidos nucleicos, se usan ventajosamente técnicas que hacen posible eliminar estos genes marcadores en el método de la invención para introducir los ácidos nucleicos. Un tal método es “cotransformación”. La cotransformación involucra el uso simultáneamente de dos vectores para transformación, un vector que aloja los ácidos nucleicos divulgados aquí y el segundo que aloja al gen marcador. Una proporción grande de los transformantes adquiere o contiene ambos vectores en el caso de las plantas (hasta 40% de los transformantes y más). Por lo tanto es posible eliminar genes marcadores de la planta transformada por cruzamiento. Un método adicional usa genes marcadores integrados en un transposon para la transformación junto con los ácidos nucleicos (“tecnología Ac/Ds”). En algunos casos (aproximadamente 10%), después de la transformación exitosa, el transposon salta del genoma de la célula anfitriona y se pierde. En un número adicional de casos, el transposon salta hacia otro sitio. En estos casos, es necesario cruzar de nuevo el gen marcador. Se han desarrollado técnicas microbiológicas que posibilitan o facilitan la detección de tales eventos. Un método

adicional ventajoso utiliza “sistemas de recombinación” los cuales tienen la ventaja de que es posible dispensar con cruzamiento externo. El sistema mejor conocido de esta clase es el sistema “Cre/Iox”. Cre1 es una recombinasa que

elimina las secuencias localizadas entre la secuencia IoxP. Si el gen marcador está integrado en la secuencia IoxP, es eliminado por medio de la Cre1 recombinasa después de la transformación exitosa. Sistemas de recombinasa adicionales son los sistemas HIN/HIX, FLP/FRT y REP/STB (Tribble et al., J.Biol. Chem., 275, 2000: 22255 - 22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553 - 566). La integración direccionada de las secuencias de ácido nucleico divulgadas aquí en el genoma vegetal también es posible en principio, pero menos preferida hasta ahora por la gran cantidad de trabajo involucrada. Estos métodos desde luego, son aplicables también a microorganismos tales como levaduras, hongos o bacterias.

Las agrobacterias transformadas con un vector de expresión de la invención pueden ser usadas de la misma forma en una manera conocida para transformar plantas tales como plantas de prueba tales como Arabidopsis o plantas de cultivo tales como, por ejemplo, cereales, maíz, avenas, centeno, cebada, trigo, soja, arroz, algodón, remolacha de azúcar, canola, girasol, linaza, cáñamo, patata, tabaco, tomate, zanahoria, paprika, colza, tapioca, casaba, raíz flecha, tagetes, alfalfa, lechuga y diversas especies de árboles, nueces y uvas, plantas de cultivo que contienen aceite tales como soja, cacahuete, planta de aceite de cástor, girasol, maíz, algodón, linaza, colza, coco, palma de aceite, cártamo (Carthamus tinctorius) o semilla de cacao u otras plantas mencionadas más adelante, por ejemplo, bañando las hojas lesionadas o piezas de hojas en una solución de agrobacterias y luego cultivando dichas hojas o piezas de hojas en un medio adecuado.

Las células vegetales genéticamente modificadas pueden ser regeneradas por cualquier método conocido para la persona experimentada. Métodos apropiados pueden ser encontrados en las publicaciones antes mencionadas por S.D. Kung and R. Wu, Potrykus o Höfgen and Willmitzer.

Si se desea, los constructos del plásmido pueden ser verificados de nuevo con respecto a identidad y/o integridad por medio de PCR o análisis de inmunoprecipitación Southern, antes de su transformación en agrobacterias. Normalmente se desea que las secciones genéticas codogénicas con las secuencias reguladoras enlazadas en los constructos del plásmido estén flanqueadas en uno o ambos lados por T-ADN. Esto es particularmente útil cuando las bacterias de las especies Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes se utilizan para la transformación. Las agrobacterias transformadas pueden ser cultivadas de una manera conocida per se y por lo tanto están disponibles para transformación conveniente de las plantas. Las plantas o partes de las plantas que se van a transformar se cultivan y proveen de manera convencional. Las agrobacterias pueden actuar sobre las plantas o partes de las plantas de maneras diferentes. Así es posible, por ejemplo, utilizar un cultivo de células o tejidos vegetales morfogénicos. Después de la transformación con T-ADN, las bacterias se eliminan usualmente mediante antibióticos y se induce la regeneración del tejido vegetal. Para este propósito se hace uso particular de hormonas vegetales adecuadas con el fin de promover la formación de brotes, después de la formación inicial de callos. Se da preferencia a llevarlo a cabo en una transformación de planta. Para este propósito, es posible exponer semillas de plantas, por ejemplo, a las agrobacterias

o inocular meristemas de plantas con agrobacterias. Se ha demostrado particularmente expeditivo el exponer la planta completa o al menos las flores primordiales a una suspensión de agrobacterias transformadas. El formador entonces crece adicionalmente hasta que se obtiene la semilla de la planta tratada (Clough and Bent, Plant. J. (1998) 16, 735). Para seleccionar plantas transformadas, el material vegetal obtenido de la transformación es sometido usualmente a condiciones selectivas de tal manera que las plantas transformadas puedan ser distinguidas de las plantas no transformadas. Por ejemplo, las semillas obtenidas de la forma descrita anteriormente pueden ser sembradas de nuevo y, después de crecimiento, sometidas a una selección adecuada por aspersión. Otra posibilidad es cultivar las semillas, si es necesario después de la esterilización, sobre placas de agar, utilizando un agente de selección adecuado, de tal manera que solamente las semillas transformadas sean capaces de crecer hasta convertirse en plantas.

La invención adicionalmente se relaciona con una célula vegetal que ha sido transformada de manera estable o transiente o transfectada con el vector de la invención o con el polinucleótido como se definió en las reivindicaciones.

En otra realización, la invención también se relaciona con una célula vegetal que contiene polinucleótido como se define en las reivindicaciones o el vector de la invención. En una realización preferida, la invención se relaciona en particular con un tejido vegetal o con una planta que tiene una cantidad incrementada de SEQ ID NO: 2, y/o contiene la célula vegetal de la invención. En una realización, la invención también se relaciona con un compartimiento de planta, un organelo de planta, una célula vegetal, un tejido vegetal o una planta que tiene una actividad incrementada de SEQ ID NO: 2 o una cantidad incrementada de polipéptido de SEQ ID NO: 2.

Las células anfitrionas que son adecuadas en principio para tomar el ácido nucleico divulgado aquí, el producto genético divulgado aquí o el vector de la invención, son células de cualquier organismo procariota o eucariota. Los organismos u organismos anfitriones adecuados para el ácido nucleico divulgado aquí, el casete de expresión o el vector son en principio cualquier organismo para el cual sea deseable un crecimiento más rápido y un rendimiento más alto, dándose preferencia, como se menciono, a plantas de cultivo.

Se divulgan adicionalmente organismos transgénicos transformados con el casete de expresión o vector de la invención y con células, cultivos celulares, tejidos, partes o material de propagación derivado de tales organismos.

Los términos “organismo anfitrión”, “célula anfitriona”, “organismo recombinante (anfitrión)”, “célula recombinante (anfitriona)”, “organismo transgénico (anfitrión)” y “célula transgénica (anfitriona)” se utilizan aquí de manera intercambiable. Estos términos se relacionan, desde luego, no solamente con el organismo anfitrión en particular o con la célula objetivo particular sino también con la progenie o progenie potencial de dichos organismos o células. Puesto que pueden presentarse ciertas modificaciones en generaciones subsecuentes, obedeciendo a mutación o a efectos ambientales, estas progenies no necesariamente son idénticas a las células originales pero están aún incluidas dentro del alcance del término tal como se utiliza aquí.

Ejemplos que deberían ser mencionados aquí son microorganismos tales como hongos, por ejemplo del género Mortierella, Saprolegnia o Pythium, bacterias, tales como, por ejemplo, el género Escherichia, levaduras tales como, por ejemplo el género Saccharomyces, cyanobacterias, cilados, algas o protozoos tales como, por ejemplo, dinoflagelados tales Crypthecodinium.

La velocidad de crecimiento incrementada de los microorganismos es particularmente ventajosa en combinación con la síntesis de productos de valor, por ejemplo en el método divulgado aquí para preparar productos químicos finos. Una divulgación ventajosa es así, por ejemplo, microorganismos los cuales (de manera natural) sintetizan cantidades relativamente grandes de vitaminas, azúcares, polímeros, aceites, etc. Ejemplos que pueden ser mencionados aquí son hongos, tales como, por ejemplo Mortierella alpina, Pythium insidiosum, levaduras tales como, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae y los microorganismos del género Saccharomyces, cianobacterias, ciliados, algas o protozoos tales como, por ejemplo, dinoflagelados tales como Crypthecodinium.

Células anfitrionas utilizables son mencionadas adicionalmente en: Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Cepas de expresión utilizables, por ejemplo aquellas que tienen actividad de proteasa relativamente baja, están descritas en: Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128.

Las proteínas se expresan usualmente en procariotas utilizando vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles, que controlan la expresión de proteínas de fusión o no fusión. Vectores de expresión de fusión típicos son entre otros, pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B., and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ). Ejemplos de vectores de expresión de no fusión inducibles adecuados de E. coli son entre otros, pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69:301-315) and pET 11 d [Studier, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60].

Otros vectores adecuados en organismos procariotas son conocidos para la persona experimentada y son, por ejemplo, en E. coli pLG338, pACYC184, la serie pBR tal como pBR322, la serie pUC tal como pUC18 o pUC19, la serie M113mp, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, lambda gt11 o pBdCl, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 o pIJ361, es Bacillus pUB110, pC194 o pBD214, en Corynebacterium pSA77 o pAJ667.

Sin embargo, se da preferencia a sistemas de expresión eucariota. En una divulgación adicional, el vector de la expresión es un vector de expresión en levadura. Ejemplos de vectores de expresión en la levadura S. cerevisiae incluyen pYeDesaturasec1 (Baldari (1987) Embo J. 6:229), pMFa (Kurjan (1982) Cell 30:933), pJRY88 (Schultz (1987) Gene 54:113), 2 micron, pAG-1, YEp6, YEp13, pEMBLYe23 and pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vectores y métodos para construcción de vectores adecuados para uso en otros hongos tales como hongos filamentosos incluyen los descritos en detalle en: van den Hondel, C.A.M.J.J. (1991) in: Applied Molecular Genetics of fungi, J.F. Peberdy, ed., pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge; o in: J.W. Bennet, ed., p. 396: Academic Press: San Diego]. Ejemplos de vectores en hongos son pALS1, pIL2 o pBB116 o en plantas pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 o pDH51.

Alternativamente, un producto de valor, por ejemplo los productos químicos finos mencionados, pueden ser expresados en células de insectos utilizando vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para expresión de proteínas en células de insectos cultivadas (por ejemplo, células Sf9) incluyen la serie pAc (Smith (1983) Mol. Cell Biol.. 3:2156) y la serie pVL (Lucklow (1989) Virology 170:31).

Los vectores antes mencionados ofrecen solamente una visión pequeña sobre posibles vectores adecuados. Plásmidos adicionales son conocidos para la persona experimentada y están descritos por ejemplo en: Cloning Vectors (eds Pouwels, P.H., et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018). Para sistemas de expresión adicionales adecuados para células procariotas y eucariotas, véase los capítulos 16 y 17 de Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 o Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989).

El microorganismo por ejemplo ha sido transformado de manera transiente o estable con un polinucleótido que comprende una molécula de ácido nucleico descrito aquí la cual es adecuada para el método tal como se divulga aquí.

En otra divulgación ventajosa divulgada aquí, es posible expresar, por ejemplo, un producto de valor o los producto químicos finos también en células vegetales unicelulares (tales como algas), véase Falciatore, 1999, Marine Biotechnology 1 (3): 239 y referencias citadas allí, y en células vegetales de plantas superiores (por ejemplo espermatofitos tales como cultivos), de tal manera que dichas plantas tengan actividad más alta de SEQ ID NO: 2, y, consecuentemente, una rata de crecimiento más alta. Ejemplos de vectores de expresión de plantas incluyen los descritos en detalle anteriormente o los de Becker, (1992), Plant Mol. Biol. 20:1195 and Bevan, (1984), Nucl. Acids Res. 12:8711; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, eds: Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, p. 15. Una revisión relativamente reciente de vectores binario de Agrobacterium puede encontrarse en Hellens, 2000, Trends in Plant Science, Vol. 5, 446.

Los organismos anfitriones que son usados ventajosamente son bacterias, hongos, levaduras o plantas, preferiblemente plantas de cultivo o partes de las mismas. Se da preferencia al uso de plantas, preferiblemente plantas en particular, y se hace especial mención a plantas útiles en agricultura tales como cereales y pastos, por ejemplo, Triticum spp., Zea mais, Hordeum vulgare, oats, Secale cereale, Oryza sativa, Pennisetum glaucum, Sorghum bicolor, Triticale, Agrostis spp., Cenchrus ciliaris, Dactylis glomerata, Festuca arundinacea, Lolium spp., Medicago spp., Alfalfa and Saccharum spp., legumbres y cultivos de leguminosas, e.g. Brassica juncea, Brassica napus, Brassica nigra, Sinapes alba, Glycine max, Arachis hypogaea, canola, planta de aceite de castor, coco, palma de aceite, coco, palma de dátil, Gossypium hirsutum, Cicer arietinum, Helianthus annuus, Lens culinaris, Linum usitatissimum, Sinapis alba, Trifolium repens, Carthamus tinctorius and Vicia narbonensis, cáñamo, vegetales, lechuga y frutas, por ejemplo, plátanos, uvas, Lycopersicon esculentum, espárragos, repollo, melones, kiwis, Solanum tuberosum, Solanum lypersicum, zanahorias, paprica, tapioca, mandioca, Beta vulgaris, cassava y achicoria, raíz de flechas, nueces y especies de uvas, árboles, por ejemplo especies de Coffea, Citrus spp., Eucalyptus spp., Picea spp., Pinus spp. y Populus spp., tabaco, plantas y árboles y flores medicinales, por ejemplo Tagetes.

Si las plantas se seleccionan como organismos donadores, dicha planta puede tener en principio cualquier relación filogenética con la planta receptora. Así la planta dónate y la planta receptora pueden pertenecer a la misma familia, género, especie, variedad o línea, lo cual da como resultado una homología creciente entre los ácidos nucleicos que se van a integrar y en las partes correspondientes del genoma de la planta receptora.

El organismo donante puede ser un hongo, preferiblemente Saccharomycetaceae, preferido en particular el Saccharomyces cerevisiae.

Plantas receptoras preferidas son particularmente plantas que pueden ser transformadas apropiadamente. Estas incluyen plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Puede hacerse mención particular de las plantas útiles en agricultura tales como cereales y pastos, por ejemplo Triticum spp., Zea mais, Hordeum vulgare, oats, Secale cereale, Oryza sativa, Pennisetum glaucum, Sorghum bicolor, Triticale, Agrostis spp., Cenchrus ciliaris, Dactylis glomerata, Festuca arundinacea, Lolium spp., Medicago spp. y Saccharum spp., cultivos de legumbres y leguminosas, e.g. Brassica juncea, Brassica napus, Glycine max, Arachis hypogaea, Gossypium hirsutum, Cicer arietinum, Helianthus annuus, Lens culinaris, Linum usitatissimum, Sinapis alba, Trifolium repens y Vicia narbonensis, vegetales y frutas, por ejemplo plátanos, uvas, Lycopersicon esculentum, espárragos, repollo, melones, kiwis, Solanum tuberosum, Beta vulgaris, cassava y achicoria, árboles, por ejemplo especies de Coffea, Citrus spp., Eucalyptus spp., Picea spp., Pinus spp. and Populus spp., plantas y árboles y flores medicinales. De acuerdo con una realización particular, la presente invención se relaciona con plantas transgénicas del género Arabidopsis, por ejemplo Arabidopsis thaliana y del género Oryza.

Después de la transformación, las plantas son regeneradas primero como se describió anteriormente y luego cultivadas y hechas crecer como es usual.

Los compartimientos de plantas, organelos de plantas, células vegetales, tejidos vegetales, o plantas de la invención se producen preferiblemente de acuerdo con el método de la invención o contienen el constructo genético descrito aquí o el vector descritos como se define en las reivindicaciones.

La presente invención también se relaciona con material vegetal transgénico derivable de una población de la invención de plantas transgénicas. Dicho material incluye células vegetales y ciertos tejidos, órganos y partes de plantas en cualquier forma fenotípica de la misma, tales como semillas, hojas, anteras, fibras, raíces, vellos radiculares, esquejes, embriones, callos, cotiledones, peciolos, material recolectado, tejido vegetal, tejido reproductivo y cultivos celulares, los cuales han sido derivados de las plantas transgénicas reales y/o pueden ser utilizados para producir la planta transgénica.

Se da preferencia a cualquier parte de planta u órganos de plantas tales como hojas, tallos, brotes, flor, raíces, tubérculos, frutos, corteza, madera, semillas, etc. o la planta completa. Las semillas incluyen en este aspecto todas las partes de las semillas tales como cubiertas de las semillas, células epidérmicas y de las semillas, endospermas o tejido embrionario. Se da preferencia en particular a productos recolectados, en particular frutos, semillas, tubérculos, frutos, cortezas u hojas o partes de las mismas.

En el método de la invención, plantas transgénicas también significan células vegetales, tejidos vegetales u órganos vegetales vistos como producto agrícola.

El biomaterial producido en el método, en particular de plantas que han sido modificadas por el método de la invención, puede ser comercializado directamente.

La invención de la misma forma se relaciona en una realización con material de propagación de una planta preparada de acuerdo con el método de la invención. El material de propagación significa cualquier material que pueda servir para sembrar o cultivar plantas, incluso puede tener, por ejemplo, otra función, por ejemplo como alimento.

“Crecimiento” también significa, por ejemplo, cultivar las células de plantas transgénicas, tejidos vegetales u órganos de plantas sobre un medio nutritivo o la planta completa o sobre un sustrato, por ejemplo, en hidrocultivo o en un campo.

La presente descripción también divulga el uso del polinucleótido usado en el método de la invención y caracterizado aquí, del constructo genético, del vector, de la célula vegetal o de la planta o del tejido vegetal o del material vegetal para preparar una planta con rendimiento incrementado.

En una divulgación, la descripción divulga el uso de un polipéptido de SEQ ID NO: 2 o del polinucleótido o polipéptido divulgado aquí para incrementar el rendimiento y/o incrementar el crecimiento de un organismo no humano en comparación con un organismo de partido.

Una divulgación adicional divulgada aquí es el uso de productos obtenidos por medio de dichos métodos, por ejemplo, biomaterial, en particular se mencionan materiales vegetales, en producto alimenticios, o productos para piensos para animales, nutrientes, cosméticos farmacéuticos. También es posible aislar sustancias utilizables comercialmente tales como productos químicos finos de las plantas o partes de plantas obtenidos por medio del método divulgado aquí.

Los ejemplos y figuras más adelante que no deben ser vistos como limitantes ilustran adicionalmente la presente invención.

En una divulgación adicional, la presente descripción divulga un método para la generación de un microorganismo, que comprende la introducción, en el microorganismo o partes del mismo, del constructo de expresión de la invención, o el vector de la invención o el polinucleótido divulgado aquí.

Los productos químicos finos obtenidos en el método son adecuados como materiales de partida para la síntesis de productos de valor adicionales. Por ejemplo, pueden ser utilizados en combinación uno con otro o solos para la producción de agentes farmacéuticos, alimentos, alimentos para animales o cosméticos. De acuerdo con lo anterior, la presente divulgación divulga un método para la producción de un agente farmacéutico, alimentos, alimentos para animales, nutrientes o cosméticos que comprende las etapas del método tal como se describen aquí incluyendo el aislamiento de productos químicos finos, en particular una composición de aminoácidos producida, por ejemplo, metionina producida si se desea y formulación del producto con un vehículo farmacéuticamente aceptable o formulación del producto en una forma aceptable para una aplicación en agricultura. Una divulgación adicional es el uso de productos químicos finos producidos en el método o de los organismos transgénicos en alimentos para animales, alimentos, medicinas, suplementos alimenticios, cosméticos o farmacéuticos.

Es ventajoso utilizar en el método divulgado aquí microorganismos transgénicos tales como hongos tales como los géneros Claviceps o Aspergillus o bacterias Gram-positiva tales como los géneros Bacillus, Corynebacterium, Micrococcus, Brevibacterium, Rhodococcus, Nocardia, Caseobacter o Arthrobacter o bacterias Gram-negativas tales como los géneros Escherichia, Flavobacterium o Salmonella o levaduras tales como los géneros Rhodotorula, Hansenula o Candida. Organismos particularmente ventajosos se seleccionan del grupo de los géneros Corynebacterium, Brevibacterium, Escherichia, Bacillus, Rhodotorula, Hansenula, Candida, Claviceps o Flavobacterium. Es particularmente ventajoso utilizar en el método divulgado aquí microorganismos seleccionados del grupo de géneros y especies consistentes de Hansenula anomala, Candida utilis, Claviceps purpurea, Bacillus circulans, Bacillus subtilis, Bacillus sp., Brevibacterium albidum, Brevibacterium album, Brevibacterium cerinum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium glutamigenes, Brevibacterium iodinum, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium linens, Brevibacterium roseum, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium sp., Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum,Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium glutamicum (= Micrococcus glutamicum), orynebacterium melassecola, Corynebacterium sp. o Escherichia coli, específicamente Escherichia coli K12 y sus cepas descritas.

El método divulgado aquí, cuando los organismos anfitriones son microorganismos, es ventajosamente llevado a cabo a una temperatura entre 0°C y 95°C, por ejemplo entre 10°C y 85°C, particularmente por ejemplo entre 15°C y 75°C, muy particularmente por ejemplo entre 15°C y 45°C. El pH se mantiene ventajosamente entre pH 4 y 12, por ejemplo entre pH 6 y 9, particularmente por ejemplo entre pH 7 y 8, durante esto. El método divulgado aquí puede ser operado por lotes, semilotes o de manera continua. Un resumen de métodos de cultivo conocidos se encuentra en el libro de textos de Chmiel (Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)). El medio de cultivo que se va a usar debe satisfacer los requerimientos de las cepas respectivas de manera adecuada. Descripciones de medios de cultivo para diversos microorganismos están presentes en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981). Estos medios, que pueden ser empleados como se divulga aquí incluyen, como se describió anteriormente, usualmente una o más fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas, vitaminas y/o elementos traza. Fuentes de carbono preferidas son azúcares tales como mono, di o polisacáridos. Ejemplos de fuentes de carbono muy buenas son glucosa, fructosa, manosa, galactosa, ribosa, sorbosa, ribulosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, almidón o celulosa. Los azúcares también pueden ser agregados a los medios a través de compuestos complejos tales como melazas, u otros subproductos de la refinación del azúcar. También puede ser ventajoso agregar mezclas de diversas fuentes de carbono. Otras fuentes de carbono posibles son aceites y grasas tales como, por ejemplo, aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y/o aceite de coco, ácidos grasos tales como, por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico y/o ácido linoleico, alcoholes y/o polialcoholes tales como, por ejemplo glicerol, metanol y/o etanol y/o ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético y/o ácido láctico. Las fuentes de nitrógeno son usualmente compuestos o materiales de nitrógeno orgánicos o inorgánicos, que contienen estos compuestos. Ejemplos de fuentes de nitrógeno incluyen amoniaco en forma líquida o gaseosa o sales de amonio tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio o nitrato de amonio, nitratos, urea, aminoácidos o fuentes de nitrógeno complejas tales como licor de maíz, torta de soja, proteína de soja, extracto de levadura, extracto de carne y otros. Las fuentes de nitrógeno pueden ser utilizadas de manera individual o como mezcla. Los compuestos de sal inorgánicos, que pueden estar presentes en los medios incluyen las sales de cloruro, fósforo y sulfato de calcio, magnesio, sodio, cobalto, molibdeno, potasio, manganeso, zinc, cobre y hierro. Para preparar compuestos químicos finos que contienen azufre, en particular aminoácidos, por ejemplo la metionina, es posible utilizar como fuente inorgánica de azufre compuestos que contienen azufre tales como, por ejemplo mercaptanos y tioles. Es posible utilizar como fuente de fósforo ácido fosfórico, hidrogenofosfato de potasio o hidrogenofosfato de dipotasio o las correspondientes sales que contienen sodio. Agentes quelantes pueden ser agregados al medio con el fin de mantener los iones metálicos en solución. Agentes quelantes adecuados particularmente incluyen dihidroxifenoles tales como catecol o protocatecuato, o ácidos orgánicos tales como ácido cítrico. Los medios de fermentación empleados tal como se divulgan aquí para cultivar microorganismos contienen normalmente también otros factores de crecimiento tales como vitaminas o promotores del crecimiento, los cuales incluyen, por ejemplo biotina, riboflavina, tiamina, ácido fólico, ácido nicotínico, pantetonato y piridoxina. Factores y sales de crecimiento se derivan frecuentemente de medios de componentes complejos de los medios tales como extractos de levadura, melazas, licor de maíz y similares. Precursores adecuados pueden además ser añadidos al medio de cultivo. La composición exacta de los compuestos del medio depende grandemente del experimento en particular y se escoge individualmente para cada caso específico. Información acerca de la optimización de los medios es obtenible en el libro de texto: "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (editors P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Los medios de cultivo también pueden ser comprados de proveedores comerciales tales como estándar 1 (Merck) o BHI (infusión cerebro corazón, DIFCO) y similares. Todos los componentes de los medios son esterilizados bien sea por calor (1.5 bar y 121°C durante 20 minutos) o por filtración esterilizante. Los componentes pueden ser esterilizados bien sea juntos o, si es necesario, separadamente. Todos los componentes de los medios pueden estar presentes en el inicio del cultivo u opcionalmente ser agregados de manera continua o lote a lote. La temperatura del cultivo normalmente esta entre 15ºC y 45ºC, por ejemplo a 25ºC hasta 40ºC, y puede mantenerse constante o cambiar durante el experimento. El pH del medio debería estar en el rango de 5 a 8.5, por ejemplo alrededor de 7. El pH del cultivo puede ser controlado utilizando el cultivo agregando compuestos básicos tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoniaco o amoniaco acuoso o compuestos ácidos tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. El espumado puede ser controlado empleando antiespumantes tales como, por ejemplo, ésteres de poliglicol de ácidos grasos. La estabilidad de los plásmidos puede ser mantenida agregando al medio sustancias adecuadas que tienen un efecto selectivo, por ejemplo antibióticos. Las condiciones aerobias se mantienen introduciendo oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno tales como, por ejemplo, aire ambiental hacia el cultivo. La temperatura del cultivo normalmente va de 20ºC a 45ºC y por ejemplo de 25ºC a 40ºC. El cultivo se continua hasta que la formación del producto deseado esta en un máximo. El objetivo se logra normalmente al cabo de 10 horas hasta 160 horas. Los caldos de fermentación obtenidos de esta manera, que contienen en particular productos químicos finos, tienen normalmente un contenido de materia seca de 7.5 a 25% en peso. La fermentación evitada por el azúcar es adicionalmente ventajosa, al menos al final, pero especialmente a al menos 30% del tiempo de fermentación. Esto significa que la concentración de azúcar utilizable en el medio de fermentación se mantiene en, o se reduce a, ≥ 0 a 3 g/l durante este tiempo. El caldo de fermentación es procesado entonces adicionalmente. Dependiendo de los requerimientos, la biomasa puede ser retirada completamente

o parcialmente por métodos de separación, tales como, por ejemplo, centrifugación, filtración, decantación o una combinación de estos métodos, a partir del caldo de fermentación o se deja completamente en él. El caldo de fermentación puede ser entonces espesado o concentrado por métodos conocidos, tales como, por ejemplo, con la ayuda de un evaporador rotatorio, un evaporador de película delgada, un evaporador de película que cae, por osmosis reversa o por nanofiltración. El caldo de fermentación concentrado puede entonces ser trabajado por secado por liofilización, secado por aspersión, secado por granulación u otros métodos.

Sin embargo, también es posible purificar los productos químicos finos producidos adicionalmente. Para este propósito, la composición que contiene el producto es sometida a una cromatografía sobre una resina adecuada, en cuyo caso el producto deseado o las impurezas son retenidas total o parcialmente en la resina de cromatografía. Estas etapas de cromatografía pueden ser repetidas si es necesario, utilizando las mismas o diferentes resinas de cromatografía. La persona experimentada esta familiarizada con la selección de resinas de cromatografía adecuadas y su uso más efectivo. El producto purificado puede ser concentrado por filtración o ultrafiltración y almacenado a una temperatura a la cual la estabilidad del producto es máxima.

La identidad y pureza en los compuestos aislados puede ser determinado por técnicas de la técnica anterior. Estas incluyen cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), métodos espectroscópicos, espectrometría de masas (MS), métodos de tinción, cromatografía de capa delgada, NIRS, ensayos enzimáticos o ensayos microbiológicos. Estos métodos analíticos están resumidos en Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32; y Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Vol. A27, VCH: Weinheim, pp. 89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp. 559-566, 575-581 and pp. 581587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 17.

En algún otro aspecto, la invención también se relaciona con partes recolectables y con material de propagación de las plantas transgénicas de acuerdo con la invención que bien contienen células vegetales transgénicas que expresan una molécula de ácido nucleico como se define en las reivindicaciones o que contienen células que muestran una actividad celular incrementada del polipéptido tal como se define en las reivindicaciones, por ejemplo, un nivel de expresión incrementado o una actividad más alta de la proteína.

Las partes recolectables en principio pueden ser cualquier parte útil de una planta, por ejemplo, flores, polen, plantones, tubérculos, hojas, tallos, frutas, semillas, raíces, etc. El material de propagación incluye, por ejemplo, semillas, frutos, cortes, plantones, tubérculos, raíces, etc.

La descripción divulga adicionalmente el uso de organismos transgénicos no humanos tal como se divulga aquí y de las células, cultivos celulares, partes – tales como, por ejemplo, raíces, hojas y similares como se menciono anteriormente en el caso de los organismos vegetales transgénicos – derivados de ellos, y con material de propagación transgénico tales como semillas o frutos y similares como se mencionó anteriormente, para la producción de productos alimenticios

o productos para piensos, agentes farmacéuticos o productos químicos finos.

De acuerdo con otra divulgación, la presente descripción divulga el uso de un organismo no humanos, por ejemplo, el microorganismo, la planta, célula vegetal o tejido vegetal, el vector, divulgado aquí para hacer ácidos grasos, carotenoides, isoprenoides, vitaminas, lípidos, ésteres cerosos, polisacáridos y/o polihidroxialcanoatos y/o sus productos de metabolismo, en particular, hormonas esteroidales, colesterol, prostaglandina, triacilgliceroles, ácidos biliares y/o cuerpos cetónicos que producen células, tejidos y/o plantas. Hay un cierto número de mecanismos mediante los cuales el rendimiento, producción y/o eficiencia de la producción de ácidos grasos, carotenoides, isoprenoides, vitaminas, ésteres cerosos, lípidos, polisacáridos y/o polhidroxialcanoatos, y/o sus productos de metabolismo, en particular, hormonas esteroidales, colesterol, triacilgliceroles, prostaglandina, ácidos biliares y/o cuerpos cetónicos o adicionalmente pueden ser afectados los productos químicos finos anteriormente definidos que incorporan tal proteína alterada. En el caso de las plantas, por ejemplo, el incremento en la expresión de la acetil-CoA que es la base paramucho productos, por ejemplo, ácidos grasos, carotenoides, isoprenoides, vitaminas, lípidos, polisacáridos. Ésteres cerosos, y/o polhidroxialcanoatos y/o sus productos de metabolismo, en particular, prostaglandina, hormonas esteroidales, colesterol, triacilgliceroles, ácidos biliares y/o cuerpos cetónicos en una células, puede ser posible incrementar la cantidad de los dichos compuestos producidos permitiendo así una mayor facilidad de recolección y purificación o en el caso de plantas un sometimiento más eficiente a partición. Adicionalmente, pueden ser requeridos uno o más de dichos productos de metabolismo, cantidades incrementadas de los cofactores, moléculas precursoras y compuestos intermediarios para las rutas biosintéticas apropiadas. Por lo tanto, incrementando el número y/o actividad de las proteínas transportadoras involucradas en la importación de nutrientes, tales como fuentes de carbono (por ejemplo azúcares), fuentes de nitrógeno (esto es, aminoácidos, sales de amonio), fosfato y azufre, puede ser posible mejorar la producción de acetil CoA y sus productos de metabolismo como se mencionó anteriormente, debido a la eliminación de cualquier limitación de suministro de nutrientes en el proceso biosintético. En particular, puede ser posible incrementar el rendimiento, producción y/o eficiencia de la producción de dichos compuestos, por ejemplo ácidos grasos, carotenoides, isoprenoides, vitaminas, ésteres cerosos, lípidos, polisacáridos y/o polihidroxialcanoatos, y/o sus productos de metabolismo, en particular, hormonas esteroidales, colesterol, prostaglandina, triacilgliceroles, ácidos biliares y/o moléculas de cuerpos cetónicos, etc., en plantas.

Se describe adicionalmente un método para la producción recombinante de agentes farmacéuticos o productos químicos finos en organismos anfitriones no humanos, en donde un organismo anfitrión es transformado por uno de los constructos de expresión antes descritos que comprenden uno o más genes estructurales que codifican el producto químico fino deseado o cataliza la biosíntesis del producto químico fino deseado, el organismo anfitrión transformado se cultiva, y el producto químico fino deseado es aislado a partir del medio de cultivo. Este método puede ser aplicado ampliamente a productos químicos finos tales como enzimas, vitaminas, aminoácidos, azúcares, ácidos grasos y saborizantes naturales sintéticos, sustancias aromáticas y colorantes o composiciones que los contienen. Especialmente se prefiere la producción adicional de aminoácidos, tocoferoles y tocotrienoles y carotenoides o compuestos que comprenden dichos compuestos. Los organismos anfitriones transformados son cultivados y los productos son recuperados a partir de los organismos anfitriones o del medio de cultivo por métodos conocidos para la persona experimentada o el organismo mismo sirve como suplemento alimenticio o de pienso. La producción de agentes farmacéuticos tales como, anticuerpos o vacunas, está descrita en Hood EE, Jilka JM. Curr Opin Biotechnol. 1999 Aug; 10(4):382-6; Ma JK, Vine ND. Curr Top Microbiol Immunol. 1999; 236:275-92.

En una divulgación, la presente descripción divulga un método para la identificación de un producto genético que confiere un incremento en el crecimiento o rendimiento en un organismo, que comprende las siguientes etapas:

a) poner en contacto, por ejemplo hibridar, las moléculas de ácido nucleico de una muestra, por ejemplo, células, tejidos, plantas o microorganismos o una librería de ácidos nucleicos, la cual puede contener un gen candidato que codifica un producto genético que confiere un incremento o crecimiento como se describió anteriormente después de la expresión, con el polinucleótido divulgado aquí;

b) identificar las moléculas de ácidos nucleicos que hibridan bajo condiciones restrictivas relajadas con el polinucleótido divulgado aquí y, opcionalmente, aislar el clon de ADNc de longitud completa o el clon genómico completo;

c) introducir las moléculas de ácido nucleico candidato en células anfitrionas, por ejemplo en una célula vegetal o un microorganismo;

d) expresar las moléculas de ácido nucleico identificadas en las células anfitrionas;

e) derivar, un organismo transgénico y probar la rata de crecimiento o rendimiento en las células anfitrionas; y

f) identificar la molécula de ácido nucleico y su producto genético cuya expresión confiere un incremento después de la expresión en comparación con el tipo silvestre.

Las condiciones de hibridación relajada son: Después de los procedimientos de hibridación estándar pueden llevarse a cabo etapas de lavado en condiciones de restricción baja a media usualmente con condiciones de lavado de 40 – 55ºC y condiciones de salinidad entre 2xSSC y 0.2xSSC con 0.1% de SDS en comparación con condiciones de lavado restrictivas como por ejemplo 60º-68ºC con 0.1 x SSC y 0.1% de SDS. Pueden encontrarse ejemplos adicionales en las referencias listadas anteriormente para las condiciones de hibridación restrictivas. Usualmente las etapas de lavado se repiten con restricción y longitud creciente hasta que se detecta una relación señal a ruido útil y depende de muchos factores tales como el objetivo, por ejemplo su pureza, contenido de GC, tamaño. Etc., la sonda, por ejemplo su longitud, si es una sonda de ARN o ADN, condiciones salinas, temperatura de lavado o hibridación, tiempo de lavado o hibridación etc.

En otra divulgación, la presente descripción divulga un método para la identificación de un producto genético que confiere un incremento en rendimiento o crecimiento en un organismo que comprende las siguientes etapas:

a) identificar moléculas de ácido nucleico de un organismo; las cuales pueden contener un gen candidato que codifica un producto genético que confiere un incremento en rata de crecimiento y/o rendimiento después de la expresión, el cual es al menos 20%, por ejemplo 25%, más por ejemplo 30%, incluso tienen 35%, 40% o 50%, incluso tienen 60%, 70% u 80%, tienen 90% o 95% o más de homología a la molécula de ácido nucleico divulgada aquí, por ejemplo a través de la búsqueda de homología en un banco de datos;

b) introducir las moléculas de ácido nucleico candidatas en células anfitrionas, por ejemplo en células vegetales o microorganismos, apropiados para producir productos de pienso o alimenticios o productos químicos finos;

c) expresar las moléculas de ácido nucleico identificadas en las células anfitrionas;

d) derivar el microorganismo y probar el rendimiento o crecimiento del organismo;

e) e identificar la molécula de ácido nucleico y su producto genético cuya expresión confiere un incremento en el rendimiento o crecimiento de la célula anfitriona después de la expresión en comparación con el tipo silvestre.

Las moléculas de ácido nucleico identificadas pueden ser utilizadas entonces de la misma manera que el polinucleótido divulgado aquí.

Adicionalmente, en una divulgación, la presente descripción divulga un método para la identificación de un compuesto que estimula el crecimiento o rendimiento de dicha planta que comprende de:

a) poner en contacto células que expresan el polipéptido divulgado aquí o su ARNm con un compuesto candidato bajo condiciones de cultivo de células;

b) probar un incremento en la expresión de dicho polipéptido o dicho ARNm;

c) comparar el nivel de expresión con una respuesta estándar hecha en ausencia de dicho compuesto candidato; con lo cual, una expresión incrementada sobre el estándar indica que el compuesto es estimulante del rendimiento o crecimiento.

Adicionalmente, en una divulgación, la presente descripción divulga un método para seleccionar agonistas de la actividad del polipéptido divulgado aquí:

a) poner en contacto células, tejidos, plantas o microorganismos que expresen el polipéptido divulgado aquí con un compuesto candidato o una muestra que comprende una pluralidad de compuestos bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido divulgado aquí;

b) probar el crecimiento, rendimiento o el nivel de expresión de un polipéptido en la célula, tejido, planta o microorganismo o los medios en los cuales, la célula, tejido, planta o microorganismo son cultivados o mantenidos; y

c) identificar un agonista o antagonista comparando el crecimiento o rendimiento o nivel de expresión del polipéptido medidos con un crecimiento, rendimiento o nivel de expresión de polipéptido estándar medidos en la ausencia de dicho compuesto candidato o una muestra que comprende dicha pluralidad de compuestos, con lo cual un nivel incrementado sobre el estándar indica que el compuesto o la muestra que comprende dicha pluralidad de compuestos es un agonista y un nivel disminuido sobre el estándar indica que el compuesto o la muestra que comprende dicha pluralidad de compuestos es un antagonista.

Adicionalmente, en una divulgación, la presente descripción divulga un proceso para la identificación de un compuesto que confiere crecimiento incrementado y/o producción en rendimiento en una planta o microorganismo, que comprende las etapas:

a) cultivar una célula o tejido o microorganismo o mantener una planta que expresa el polipéptido divulgado aquí o una molécula de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido y un sistema de lectura capaz de interactuar con el polipéptido bajo condiciones adecuadas que permite la interacción del polipéptido con dicho sistema de lectura en la presencia del compuesto o una muestra que comprende una pluralidad de compuestos y capaz de proveer una señal detectable en respuesta de enlazamiento de un compuesto a dicho polipéptido bajo condiciones que permiten la expresión de dicho sistema de lectura y el polipéptido divulgado aquí, y

b) identificar si el compuesto es un agonista efectivo detectando la presencia o ausencia de incremento de una señal producía por dicho sistema de lectura.

Dicho compuesto puede ser sintetizado químicamente o producido microbiológicamente y/o estar comprendido, por ejemplo, en muestras, por ejemplo extractos celulares de, por ejemplo, plantas, animales o microorganismos, por ejemplo patógenos. Adicionalmente, dicho compuesto puede ser conocido en la técnica pero hasta ahora no ser conocido como capaz de suprimir o activar el polipéptido divulgado aquí. La mezcla de reacción puede ser un extracto libre de células o puede comprender el cultivo celular o de tejidos. Parámetros adecuados para el método divulgado aquí son conocidos para la persona experimentada en la técnica y están descritos, por ejemplo, en general en Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, third edition (1994), en particular capítulo 17. Los compuestos pueden ser agregados, por ejemplo, a la mezcla de reacción, medio de cultivo, inyectados en la célula o asperjados sobre la planta.

Si una muestra que contiene un compuesto es identificada en el método divulgado aquí, entonces es posible aislar el compuesto de la muestra original identificada por contener el compuesto capaz de activar o incrementar, o se puede subdividir adicionalmente la muestra original, por ejemplo, si consiste de una pluralidad de compuestos diferentes, de tal manera que se reduzca el número de sustancias diferentes por muestra y se repite el método con las subdivisiones de la muestra original. Dependiendo de la complejidad de las muestras, las etapas descritas anteriormente pueden ser llevadas a cabo varias veces, por ejemplo hasta que la muestra identificada de acuerdo con el método divulgado aquí comprenda solamente un número limitado de o solamente una sustancia. Por ejemplo dicha muestra comprende sustancias de propiedades químicas y/o físicas similares, y lo más por ejemplo dichas sustancias son idénticas. Por ejemplo, el compuesto identificado de acuerdo con el método antes descrito o su derivado es formulado adicionalmente en una forma adecuada para la aplicación en una cría de plantas o cultivo de células y tejidos vegetales.

De los compuestos que pueden ser probados e identificados de acuerdo con el método divulgado aquí puede ser librerías de expresión, por ejemplo, librerías de expresión de ADNc, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, anticuerpos, compuestos orgánicos pequeños, hormonas, imitadores de péptidos, PNA o similares (Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell 79 (1994), 193-198 y referencias citadas en el mismo). Dichos compuestos también pueden ser derivados funcionales o análogos de inhibidores o activadores conocidos. Los métodos para la preparación de derivados y análogos químicos son bien conocidos para los experimentados en la técnica y están descritos por ejemplo, en Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N.Y. 10010 U.S.A. and Organic Synthesis, Wiley, New York, Estados Unidos. Adicionalmente, dichos derivados y análogos pueden ser probados en cuanto a sus efectos de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Adicionalmente, los imitadores de péptidos y el diseño ayudado por ordenador de derivados y análogos apropiados pueden ser usados, por ejemplo, de acuerdo con los métodos descritos anteriormente. Pueden emplearse células o tejidos en el método divulgado aquí por ejemplo en una célula anfitriona, célula vegetal o tejido vegetal de la invención descritos en las realizaciones de aquí en adelante.

Así, en una divulgación adicional la descripción divulga un compuesto obtenido o identificado de acuerdo con el método para identificar un agonista divulgado aquí siendo dicho compuesto un agonista del polipéptido divulgado aquí.

De acuerdo con lo anterior, en una divulgación, la presente descripción divulga adicionalmente un compuesto identificado por el método para identificar un compuesto divulgado aquí.

Dicho compuesto por ejemplo, es un homólogo del polipéptido divulgado aquí. Homólogos del polipéptido divulgado aquí pueden ser generados por mutagénesis, por ejemplo, mutación o truncación de un punto discreto del polipéptido divulgado por la presente descripción. Tal como se utiliza aquí, el término “homólogo” se refiere a una variante de la proteína, que actúa como una agonista de la actividad del polipéptido divulgado aquí. Un agonista de dicha proteína puede retener sustancialmente las mismas actividades biológicas, o un subconjunto del polipéptido divulgado aquí. En particular, dicho agonista confiere el incremento del nivel de expresión del polipéptido divulgado aquí y/o la expresión de dicho agonista en un organismo o parte del mismo confiere el incremento en crecimiento y/o rendimiento.

En una divulgación, la descripción divulga un anticuerpo que reconoce específicamente el compuesto agonista divulgado aquí.

La descripción divulga una composición de diagnóstico que comprende al menos uno de las moléculas de polinucleótidos, o ácidos nucleicos antes mencionadas, vectores, proteínas, anticuerpos o compuestos divulgados aquí y opcionalmente medios adecuados para la detección.

La composición de diagnóstico divulgada aquí es adecuada para el aislamiento de ARNm a partir de una célula y poner en contacto el ARNm así obtenido con una sonda que comprende una sonda de ácido nucleico como se describió anteriormente bajo condiciones de hibridación, detectando la presencia del ARNm hibridado a la sonda, y por lo tanto detectando la expresión de la proteína en la células. Métodos adicionales para detectar la presencia de una proteína divulgada por la presente descripción comprenden inmunotécnicas bien conocidas en el arte, por ejemplo, el ensayo de inmunosorbente enlazado a enzimas.

Adicionalmente, es útil usar las moléculas de ácido nucleico divulgadas aquí como marcadores moleculares o cebadores en mapeo por asociación o cruce de plantas especialmente cruce asistido por marcadores. En una divulgación preferida las moléculas de ácido nucleico divulgadas aquí pueden ser utilizadas en mapeo por asociación o cruce de plantas especialmente cruce de plantas asistido por marcadores para prueba directa o indirectamente relacionadas con el crecimiento o rendimiento de plantas. Por ejemplo el ácido nucleico divulgado aquí podría colocalizarse con una localización de ensayo cuantitativo para crecimiento y rendimiento. En este caso la cosegregación de diferentes variantes del ácido nucleico divulgado aquí y con diferencias en crecimiento o rendimiento podría permitir un cruce avanzado para estas pruebas probando la germinación de cruces para la presencia o ausencia de variantes favorables o desfavorables del ácido nucleico divulgado aquí. Los medios adecuados para la detección son bien conocidos para una persona experimentada en la técnica, por ejemplo, son conocidos reguladores y soluciones para pruebas de hibridación, por ejemplo, las soluciones y reguladores mencionados anteriormente, adicionalmente y medios para inmunoprecipitaciones Southern-, Western-, Northern-, etc., tal como se describen, por ejemplo en Sambrook et al..

En otra divulgación, la presente descripción divulga un kit que comprende la molécula de ácido nucleico, el vector, la célula anfitriona, el polipéptido, el ácido nucleico antisentido, el anticuerpo, la célula vegetal, la planta o tejido vegetal, la parte recolectable, el material de propagación y/o el compuesto o agonista identificado divulgado por el método divulgado aquí.

Los compuestos del kit divulgado aquí pueden ser empacados en contenedores tales como viales, opcionalmente con/en reguladores y/o solución. Si es apropiado, uno o más de dichos componentes pueden ser empacados en uno y el mismo contenedor. Adicional o alternativamente, uno o más de dichos componentes pueden ser adsorbidos a un soporte sólido, por ejemplo, un filtro de nitrocelulosa, una placa de vidrio, un chip, o una membrana de nylon o al pozo de una placa de microtitulación. El kit puede ser utilizado para cualquiera de los métodos y realizaciones aquí descritos, por ejemplo para la producción de células anfitrionas, plantas transgénicas, composiciones farmacéuticas, detección de secuencias homólogas, identificación de antagonistas o agonistas, como alimento o pienso o como suplemento de los mismos, como suplemento para el tratamiento de plantas etc.

Adicionalmente, el kit puede comprender instrucciones para el uso del kit para cualquiera de dichas realizaciones, en particular para el uso para producir organismos o partes de los mismos.

En una divulgación dicho kit comprende adicionalmente una molécula de ácido nucleico que codifica una o más de las proteínas antes mencionadas y /o un anticuerpo, un vector, una célula anfitriona, un ácido nucleico antisentido, una célula vegetal o un tejido vegetal o una planta.

En una divulgación posterior, la presente descripción divulga un método para la producción de una composición agrícola que provee la molécula de ácido nucleico, el vector del polipéptido divulgado aquí o que comprende las etapas del método divulgado aquí para la identificación de dicho compuesto, agonista o antagonista; y la formulación de la molécula de ácido nucleico, el vector de la invención o el agonista, o compuesto identificado de acuerdo con métodos y procesos divulgados aquí o con el uso de objetivos divulgados aquí en una forma aplicable como composición agrícola vegetal.

En otra divulgación, la presente descripción divulga un método para la producción de una composición agrícola que confiere crecimiento o rendimiento incrementado a una planta que comprende las etapas del método divulgado aquí; y formular el compuesto identificado en una forma aceptable como composición agrícola.

Bajo “aceptable como composición agrícola” se entiende que tal composición esta de acuerdo con las leyes que regulan

el contenido de fungicidas, nutrientes vegetales, herbicidas, etc. Por ejemplo, tal composición carece de cualquier riesgo para las plantas protegidas y los animales (incluidos humanos) alimentados con la misma.

La presente descripción también es pertinente a varias divulgaciones relativas a usos y métodos adicionales. El polinucleótido, polipéptido, homólogos de proteínas, proteínas de fusión, cebadores, vectores, células anfitrionas, descritos aquí pueden ser usados en uno o más de los siguientes métodos: identificación de plantas útiles para la producción de aminoácidos como se menciono y organismos relacionados; mapeo de genomas, identificación y localización de secuencias de interés; estudios evolutivos; determinación de regiones requeridas para funcionamiento, modulación de una actividad.

De manera ventajosa, el inhibidor de polipéptido divulgado aquí, identificado de forma análoga a la identificación de agonista, puede ser utilizado como herbicida. La inhibición del polipéptido divulgado aquí puede reducir el crecimiento de plantas. Por ejemplo, la aplicación del inhibidor en un campo es inhibir el crecimiento de plantas no deseadas si las plantas útiles que pueden sobreexpresar el polipéptido divulgado aquí pueden sobrevivir.

De acuerdo con lo anterior, los polinucleótidos divulgados aquí tienen una variedad de usos. Primero, pueden ser utilizados para identificar un organismo o un pariente cercano del mismo. También pueden ser utilizados para identificar la presencia de los mismos o de un pariente del mismo en una población mixta de microorganismo o plantas. Sondeando el ADN genómico extraído de un cultivo de una población única o mixta de plantas bajo condiciones restrictivas con una sonda que barra una región del gen divulgado aquí la cual es única para este, se puede establecer si está presente un organismo único en una población mixta.

Adicionalmente, el polinucleótido divulgado aquí puede ser suficientemente homólogo para las secuencias de especies relacionadas de tal forma que estas moléculas de ácido nucleico pueden servir como marcadores para la construcción de un mapa genómico en organismos relacionados.

Los polinucleótidos divulgados aquí también son útiles para estudios evolutivos y estructurales en proteínas. Comparando las secuencias de aquellos que codifican enzimas similares a partir de otros organismos, puede ser establecida la relación evolutiva de los organismos. De la misma forma, tal comparación permite establecer cuales regiones de la secuencia se conservan y cuáles no, lo cual puede ayudar en la determinación de aquellas regiones de la proteína que son esenciales para el funcionamiento de la enzima. Este tipo de determinación es de valor para los estudios de ingeniería en proteínas y puede dar una indicación de cuál de las proteínas pueden tolerar en términos de mutagénesis sin perder funciones.

Adicionalmente, el polinucleótido divulgado aquí, el polipéptido divulgado aquí, el constructo de ácido nucleico de la invención, los organismos divulgados, las células anfitrionas divulgadas, la planta, el tejido vegetal, la célula vegetal, o la parte de las mismas de la invención, el vector de la invención, el antagonista o el agonista identificados con el método divulgado aquí, el anticuerpo divulgado aquí, la molécula de antisentido divulgada aquí o la molécula de ácido nucleico identificada con el método divulgado aquí, pueden ser utilizados para la preparación de una composición agrícola.

Adicionalmente, el polinucleótido divulgado aquí, el polipéptido divulgado aquí, el constructo de ácido nucleico de la invención, el organismo divulgado, la célula anfitriona divulgada como la planta, el tejido vegeta, célula vegetal o la parte de las mismas de la invención, el vector de la invención, el antagonista o el agonista identificados con el método divulgado aquí, el anticuerpo divulgado aquí, la molécula de antisentido o de ARNi divulgada aquí o la molécula de ácido nucleico identificada con el método divulgado aquí, pueden ser utilizados para la identificación y producción de compuestos capaces de conferir una modulación de los niveles de rendimiento o crecimiento en un organismo o partes del mismo, por ejemplo para identificar y producir compuestos que confieren un incremento de los niveles o ratas de crecimiento y rendimiento en un organismo o partes del mismo, si dicho compuesto identificado es aplicado al organismo o parte del mismo, esto es, como parte de su alimento, o en los medios de crecimiento o cultivo.

Estas y otras realizaciones son divulgadas y abarcadas por la descripción y ejemplos de la presente invención. Literatura adicional concerniente a cualquiera de los métodos, usos y compuestos que van se van a emplear de acuerdo con la presente invención pueden ser obtenidos de bibliotecas públicas, utilizando por ejemplo dispositivos electrónicos.

Por ejemplo, la base de datos pública “Medline” puede ser utilizada disponible en el internet, por ejemplo bajo

hftp://www.ncbi. nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Bases de datos y direcciones adicionales, tales como hftp://www.ncbi.nlm.nih.gov/, hftp://www.infobiogen.fr/, hftp://www.fmi.ch/biology/research-tools.html, hftp://www.tigr.org/, son conocidas para la persona experimentada en la técnica pueden ser obtenidas utilizando, por ejemplo, hftp://www.lycos.com. Una revisión de información de patentes en biotecnología y un estudio de fuentes relevantes de información de patentes útiles para la búsqueda retrospectiva y para alertas actuales se da en Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.

Ejemplos

Ejemplo 1:

Amplificación y clonación de la levadura ORFs YMR095C

Al menos que se establezca otra cosa, se usan los métodos estándar de acuerdo con Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, are used. Las amplificaciones por PCR de ORF YMR095C, se llevo a cabo de acuerdo con el protocolo de Pfu Turbo ADN polymerase (Stratagene). La composición fue como sigue: 1x PCR buffer [20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 2 mM MgSO4, 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 0.1% Triton X-100, 0.1 mg/ml BSA], 0.2 mM d-thio-dNTP and dNTP (1:125), 100 ng de ADN genómico de Saccharomyces cerevisiae (cepa S288C; Research Genetics, Inc., ahora Invitrogen), 50 pmol de cebador de avance, 50 pmol de cebador reverso, 2.5 u de polimerasa Pfu Turbo ADN. Los ciclos de amplificación son como sigue:

1 ciclo de 3 minutos a 95°C, seguido por 36 ciclos de en cada caso 1 minuto a 95°C, 45 segundos a 50°C y 210 segundos a 72°C, seguido por un ciclo de 8 minutos a 72°C, luego 4°C.

Las siguientes secuencias de cebador fueron escogidas para la amplificación de los genes de Saccharomyces cerevisiae de acuerdo con SEQ ID NO: 1,:

Cebador de avance para YMR095C (SEQ ID NO>: 96):

5’- atgcacaaaa cccacagtac aatgt -3’

Cebador reverso para YMR095C (SEQ ID NO: 97): 5’- ttaattagaa acaaactgtc tgataaac -3’

Los amplicones fueron purificados subsecuentemente a través de columnas QIAquick de acuerdo con un protocolo estándar (Quiagen).

La restricción de ADN vector (30 ng) fue llevado a cabo con EcoRI y SmaI de acuerdo con el protocolo estándar, la

5 escisión EcoRI fue llenado de acuerdo con el protocolo estándar (MBI-Fermentas) y la reacción se detuvo agregando solución reguladora con alta salinidad. Los fragmentos del vector escindido fueron purificados a través de columnas Nucleobond de acuerdo con un protocolo estándar (Machery-Nagel). Se utilizo un vector binario que contenía un casete de selección (promotor, marcador de selección por ejemplo el gen bar o el gen AHAS, terminador) y un casete de expresión que comprende una secuencia promotora (ocs3mas) (Ni et al., The Plant Journal 1995, 7, 661-676), un

10 casete de clonación y un terminador constitutivo 0314-21 entre la secuencias de frontera de T-ADN. Diferente al casete de clonación, el vector binario no tiene sitios de escisión EcoRI y SmaI. Los vectores binarios que pueden ser utilizados aun conocidos para la persona experimentada, y puede encontrase una revisión sobre vectores binarios y su uso en Hellens, R., Mullineaux, P. and Klee H., (2000) "A guide to Agrobacterium binary vectors", Trends in Plant Science, Vol. 5 NO 10, 446-451. Dependiendo del vector usado, la clonación puedes ser llevada a cabo ventajosamente también

15 utilizando otras enzimas de restricción. Sitios de escisión ventajosos correspondientes pueden ser unidos a ORF usando cebadores correspondientes para amplificación por PCR.

Se mezclaron aproximadamente 30 ng del vector preparado y una cantidad definida de amplicon preparado y se ligaron agregando ligasa.

Los vectores ligados fueron transformados en el mismo recipiente de reacción agregando células competentes de E. coli

20 (cepa DH5alfa) e incubando a 1ºC durante 20 minutos, seguido por un choque térmico a 42ºC durante 90 segundos y enfriamiento a 4ºC. Esto fue seguido por adición de medio completo (SOC) e incubación a 37ºC durante 45 minutos. La mezcla completa fue sembrada entonces sobre una placa de agar que contenía antibióticos (seleccionada dependiendo del vector binario usado) y se incubo a 37ºC durante la noche.

Se verifico la clonación exitosa por amplificación con la ayuda de cebadores que se enlazaron corriente arriba y

25 corriente abajo del sitio de escisión de la restricción y se hizo así amplificación de la inserción posible. La amplificación fue llevada a cabo de acuerdo con el protocolo de la polimerasa Taq ADN (Gibco-BRL). La composición fue la que sigue: 1x regulador PCR [20 mM Tris-HCL (pH 8.4), 1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0.2 mM dNTP, 5 pmol de cebador de avance, 5 pmol de cebador reverso, 0.625 u de polimerasa Taq ADN].

Los ciclos de amplificación fueron como sigue: 1 ciclo de 5 minutos a 94ºC, seguido por 35 ciclos de en cada caso 15 30 segundos a 94ºC, 15 segundos a 66ºC y 5 minutos a 72ºC, seguido por un ciclo de 10 minutos a 72ºC, luego 4ºC.

Se verificaron varias colonias adicionalmente por digestiones de restricción y secuenciamiento y solamente una colonia para la cual se había identificado un producto de PCR del tamaño esperado en la orientación correcta fue usada posteriormente.

Una alícuota de esta colonia positiva fue transferida a un recipiente de reacción lleno con medio completo (LB) e

35 incubada a 37ºC durante la noche. El medio LB contenía un antibiótico para la selección del clon, el cual fue seleccionado de acuerdo con el vector binario usado y el gen de resistencia contenido en el mismo.

La preparación del plásmido fue llevada a cabo de acuerdo con las guías de protocolo estándar Quiaprep (Quiagen).

Ejemplo 2:

Transformación de plantas general

40 La transformación de plantas a través de transfecciones con Agrobacterium y la generación de plantas puede llevarse a cabo de acuerdo con métodos estándar, por ejemplo como se describe aquí o en Gelvin, Stanton B.; Schilperoort, Robert A, "Plant Molecular Biology Manual", 2nd Ed. - Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. - in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R.; Thompson, John E., "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology", Boca Raton : CRC Press, 1993. - 360 S., ISBN 0-8493-5164-2.

45 Las semillas de colza pueden ser transformadas por medio de transformación de cotiledones, por ejemplo de acuerdo con Moloney et al., Plant cell Report 8 (1989), 238-242; De Block et al., Plant Physiol. 91 (1989, 694-701).

Las sojas pueden ser transformadas, por ejemplo, de acuerdo con los métodos descritos en EP 0424 047, US 5,322,783

o in EP 0397 687, US 5,376,543, US 5,169,770.

Alternativamente, puede lograrse el consumo de ADN y una planta puede ser transformada también por bombardeo con partículas, mediación con polietilén glicol o a través de la técnica de “fibra de carburo de silicio”, en vez de transformación de plantas mediadas por Agrobacterium, véase por ejemplo, Freían and Walbot "The maize handbook" (1993) ISBN 3-540-97826-7, Springer Verlag New York.

Ejemplo 3:

Preparación de plantas que sobreexpresan ORF YMR095C.

Los respectivos constructos de plásmidos fueron transformados por medio de electroporación en la cepa agrobacteriana pGV3101 que contenía el plásmido pMP90 y las colonias fueron sembradas en medio TB (QBiogen, Alemania) que contenía los marcadores de selección kanamicina, gentamicina y rifampicina y se incubaron a 20ºC durante 2 días. Los antibióticos o los agentes de selección pueden ser seleccionados de acuerdo con el plásmido usado y con la cepa agrobacteriana compatible. Una revisión sobre plásmidos binarios y cepas de agrobacterias pueden encontrarse en Hellens, R., Mullineaux, P. and Klee H., (2000) "A guide to Agrobacterium binary vectors", Trends in Plant Science, Vol 5 NO 10, 446-451.

Se selecciono una colonia de la placa de agar con la ayuda de un palillo y se coloco en 3 ml de medio TB que contenía los antibióticos antes mencionados.

El precultivo creció en un incubador con agitación a 28ºC y 120 rpm durante 48 horas. Se usaron 400 ml del medio LB que contenía los antibióticos apropiados para el cultivo principal. El precultivo fue transferido al cultivo principal el cual creció a 28ºC y 120 rpm durante 18 horas. Después de centrifugación a 4000 rpm, la pella fue resuspendida en medio de infiltración (medio M & S con 10% de sacarosa). Se llenaron hasta la mitad placas (Piki Saat 80, verdes, provistas con un fondo de pantalla, 30 x 20 x 4.5 cm, de Wiesauplast, Kunststofftechnik, Alemania) con un sustrato GS 90 (suelo estándar, Werkverband E.V., Alemania). Las placas fueron regadas durante la noche con solución de Previcur al 0.05% (Previcur N, Aventis Crop-Science). La transformación de Arabidopsis se llevo a cabo siguiendo la transformación mediada por Agrobacterium Bechtold N. y Pelletier G. (1998) para plantas adultas de Arabidopsis thaliana por infiltración al vacío. Methods in Molecular Biology. 82:259-66 and Clough and Bent Clough, JC and Bent, AF. 1998 Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Aràbidopsis thaliana, Plant J. 16:735-743.

Semillas C24 de Arabidopsis thaliana (Nottingham Arabidopsis Stock Centre, UK; NASC Stock N906) fueron dispersadas sobre la placa, aproximadamente 1000 semillas por placa. Las placas fueron cubiertas con una cubierta y colocadas en las instalaciones de estratificación (8 h 110 mE, 5°C; 16 h oscuridad 6°C). Después de 5 horas, las placas fueron colocadas en el fitotron de día corto (8 h 130 mE, 22°C; 16 H oscuridad 20°C), donde permanecieron durante 10 días, hasta que se formaron las primeras hojas verdaderas. Los plantones fueron transferidos a macetas que contenían el mismo sustrato (macetas Teku, 10 cm de diámetro, serie LC, manufacturadas por Pöppelmann GmbH&Co, Alemania). Se colocaron nueve plantas en cada maceta. Las macetas fueron regresadas entonces al fitotron de día corto para que continuaran creciendo. Después de 10 días las plantas fueron transferidas a un gabinete de invernadero, 16 horas 340 µE a 22ºC y 8 horas de oscuridad a 20ºC, donde crecieron durante 10 días adicionales.

Las plantas de Arabidopsis de siete semanas de edad que habían apenas empezado a florecer fueron sumergidas durante 10 segundos en la suspensión agrobacteriana antes descrita la cual había sido tratada previamente con 10 µl de Silwett L77 (Crompton S.A., Osi Specialties, Suiza). El método está descrito en Bechtold N. y Pelletier G. (1998). Las plantas fueron colocadas subsecuentemente en una cámara húmeda durante 18 horas y las macetas fueron regresadas subsecuentemente al invernadero para que las plantas continuaran con su crecimiento. Las plantas permanecieron allí durante otras 10 semanas hasta que se recolectaron las semillas.

Dependiendo del marcador de resistencia usado para seleccionar las plantas transformadas, las semillas recolectadas fueron sembradas en un invernadero y sometidas a selección por aspersión o más, después de la esterilización, cultivadas sobre placas de agar con el agente de selección apropiado. En el caso de resistencia a BASTA®, las plántulas fueron asperjadas cuatro veces en un intervalo de 2 a 3 días con 0.02% de BASTA®. Después de aproximadamente 10-14 días, las plantas resistentes transformadas diferían distintivamente de los plantones muertos tipo silvestre y pudieron ser colocadas en macetas de 6 cm. Se dejo que las plantas transformadas obtuvieran semillas. Las semillas de las plantas transgénicas de A. thaliana fueron almacenadas en un congelador (a -20ºC).

Ejemplo 4:

Análisis de líneas que sobreexpresan SEQ ID NO: 1, por determinación del peso fresco

Se seleccionó una línea que sobreexpresa ARN de SEQ ID NO: 1. Para este propósito, se extrajo el ARN total de las plantas transgénicas de Arabidopsis de tres semanas de edad en busca del SEQ ID NO: 1. Para la hibridación, se fraccionaron por electroforesis 20 µg de ARN, se sembraron en membrana Hybond N (Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se hibridaron con una sonda específica para YMR095C. Se uso regulador Rothi-Hybri-Quick (Roth, Karlsruhe, Alemania) para hibridación y la zona fue marcada utilizando el sistema de marcación de Rediprime II ADN (Amersham Biosciences Europe GmbH Freiburg, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento de ADN para estas sondas se preparo por medio de un PCR estándar del ADN genómico de Arabidopsis y los cebadores:

5 5’- atgcacaaaa cccacagtac aatgt -3’(SEQ ID NO: 96)

y

5’- ttaattagaa acaaactgtc tgataaac -3’(SEQ ID NO: 97),

respectivamente.

Para análisis, las plantas fueron cultivadas en un fitotrón de Swalöf Weibull (Suecia) bajo las siguientes condiciones.

10 Después de la estratificación, las plantas de prueba fueron cultivadas a un ritmo de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad a 20ºC, una humedad de 60% y una concentración de CO2 de 400 ppm durante 22-23 días. Las fuentes de luz usadas fueron lámparas Powerstar HQI-T 250 W/D Daylight de Osram, lo cual genera luz de un espectro de color similar a la luz del sol con una intensidad de luz de 220 µE/m2/s-1.

En el día 24 después de la siembra, que corresponde a aproximadamente al día 17 después de la germinación, en cada

15 caso se estudiaron aproximadamente 40 plantas individuales tanto del tipo silvestre (WT) como de la línea que sobreexpresaba YMR095C (líneas 3318, 5194, 3325, 4803 y 9001 respectivamente). El peso fresco de las partes aéreas de las plantas de Arabidopsis de las líneas transgénicas del tipo silvestre (WT) fueron determinados inmediatamente después, utilizando una balanza de precisión. Las diferencias entre los resultados para las plantas silvestres y la línea transgénica más pesada fueron probadas en cuanto a su significado por medio de una prueba T

20 para cada línea.

Los resultados se representan en la Tabla 1.

Tabla 1: Verificación del incremento de biomasa de plantas de Arabidopsis transgénicas que sobreexpresan un gen de levadura en comparación con el tipo silvestre MC24. El análisis de biomasa fue llevado a cabo en diferentes experimentos (1.1 o 1.2) y luego se confirmo en bucles de confirmación (1 o 2).

Línea #: Nombre del gen Experimento 1 (peso en mg) Valor p de la prueba t Experimento 2 Bucle de confirmación (peso mg) Valor p de la prueba t

3318: YMR095C 317 mg ± 87 15% de incremento Experimento 1.2 p=0,003 424,75 mg ± 110,28 38% de incremento Bucle de confirmación 1 p=0,01

WT: - 186 mg ± 47 Experimento 1.1 276 mg ± 88 Experimento 1.2 307,15 mg ± 96,36 Bucle de confirmación 1 212,5 mg ± 48 Bucle de confirmación 2

Literatura:

Gibson, (1996) A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001 Lie, (1998) Advances in

quantitative PCR technology: 5’nuclease assays

Ejemplo 5

Sobreexpresión de SEQ ID NO: 1, en tabaco y canola

Para la transformación de canola (Brassica napus), se utilizaron peciolos de cotiledóneas e hipocotiledóneas de plantones a una edad de 5 a 6 días como explantes para el cultivo de tejidos y se transformaron como se describe, entre otros, en Babic et al. (1998, PlantCell Rep 17: 183-188). La variedad comercial Westar es la variedad estándar para la transformación pero pueden utilizarse también otras variedades. La secuencia que codifica la actividad de SEQ ID NO: 2 se clona en el casete de expresión de un vector binario que contiene un casete de selección de acuerdo con métodos moleculares estándar. Se describen clonaciones de ejemplo en otros lugares en los ejemplo y que son conocidas para las personas experimentada en la técnica.

La cepa agrobacteriana Agrobacterium tumefaciens que contiene LBA4404, la cual es transformada con el vector binario, se utiliza para la transformación. Se ha descrito ya una multiplicidad de vectores binarios para la transformación de plantas (entre otros, An, G. in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology vol. 44, pp. 47-62, Gartland KMA and Davey MR eds. Humana Press, Totowa, New Jersey). Muchos vectores binarios se derivan del vector binario pBIN19 el cual ha sido descrito por Bevan (Nucleic Acid Research. 1984. 12:8711-8721) y el cual comprende un casete de expresión para plantas que está flanqueado por la frontera izquierda y derecha del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. Un casete de expresión de planta comprende al menos dos componentes, un gen marcador de selección y un promotor adecuado capaz de regular la transcripción del ADNc o ADN genómico en células vegetales de la manera deseada. Una multiplicidad de genes marcadores de selección tales como genes de resistencia a antibióticos o de resistencia a herbicidas puede usarse, tal como, por ejemplo, un gen de Arabidopsis mutado el cual codifica una enzima AHAS mutada resistente a herbicidas (US 5,767,366 y US 6,225,105). De la misma manera, también es posible utilizar diferentes promotores para expresar el gen con actividad de SEQ ID NO: 2. Por ejemplo, una expresión constitutiva tal como es mediada por el promotor 34S (GenBank Accession NO: M59930 and X16673) o además una expresión específica de semillas puede ser deseada.

Las semillas de canola se esterilizan en etanol al 70% durante 2 minutos y luego en clorox al 30% que contiene una gota de Tween-20 durante 10 minutos, seguido por tres etapas de lavado con agua estéril.

Las semillas se incuban in vitro en un medio MS semiconcentrado sin hormonas, que contiene 1% de sacarosa, 0.7% de fitagar a 23ºC a un ritmo de 16/8 horas día/noche durante 5 días para la germinación. Los explantes de peciolo de cotiledónea fueron separados junto con los cotiledones de los plantones e inoculados con las agrobacterias sumergiendo el sitio del corte en la suspensión bacteriana. Los explantes fueron incubados entonces sobre medio MSBAP-3 que contenía 3 mg/l de BAP, 3% de sacarosa y 0.7% de fitagar a 23ºC y 16 horas de luz durante 2 días. Después de 2 días de cocultivo con la agrobacteria, lo explantes fueron transferidos a medio MSBAP-3 que contenía 3 mg/l de BAP, cefotaxina, carbenicilina o timentina (300 mg/l) durante 7 días y luego a medio MSBAP-3 que contenía cefotaxina, carbenicilina o timentina y un agente de selección hasta la regeneración de los brotes. Cuando los brotes tenían 5-10 mm de longitud, fueron cortados y transferidos a “medio de elongación de brotes” (MSBAP-0.5, que contenía 0.5 mg/l de BAP). Los brotes de aproximadamente 2 cm de longitud son transferidos entonces a medio para raíz (MS0) para inducción de raíces.

El material de la planta transgénica primaria es estudiado por medio de PCR para verificar la incorporación del T-ADN en el genoma. Se confirman entonces los resultados positivos por medio de análisis de inmunoprecipitación Southern.

Las plantas transgénicas confirmadas son probadas entonces en cuanto a un crecimiento más rápido y rendimiento más alto.

Cultivo estéril de plantas de tabaco

Las plantas de tabaco cultivadas bajo condiciones asépticas son propagadas in vitro colocando trozos de tallo de aproximadamente 1-2 cm de longitud y en cada caso con un internodio sobre medio estéril (medio Murashige y Skoog que contiene 2% de sacarosa y 0.7% de agar-agar) (Murashige, T. and Skoog, F. (1962) Physiol. Plant. 15:473-497). Las plantas crecen a 23°C, 200 µE y con un ritmo de 16 horas/8 horas de luz/oscuridad.

Después de 5 – 6 semanas de crecimiento, se cortan hojas de dichas plantas en piezas de aproximadamente 1 cm2 bajo condiciones estériles.

Cultivo bacteriano

Una colonia agrobacteriana transformada con el constructo para expresar una actividad de SEQ ID NO: 2 es seleccionada de una placa de agar con la ayuda de una punta plástica estéril la cual luego es transferida a aproximadamente 20 ml de medio líquido YEB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) que contiene los antibióticos relevantes. El volumen de dicho medio YEB se escoge como función del número de transformantes. Normalmente, 20 ml de cultivo bacteriano son suficientes para producir aproximadamente 80 plantas transgénicas de tabaco. El cultivo bacteriano se cultiva sobre un agitador a 200 rpm y 28ºC durante 1 día.

Al día siguiente, el cultivo bacteriano es retirado por centrifugación a 4000 rpm y tomado en medio líquido Murashige y Skoog.

Transformación

Las piezas de hojas son sumergidas brevemente en la suspensión bacteriana y cultivada sobre medio Murashige y Skoog (2% de sacarosa y 0.7% de agar-agar) en la oscuridad durante 2 días. Los explantes se transfirieron a medio MS que contenía antibióticos y hormonas correspondientes, tal como se describe en el método de Rocha-Sosa (Rocha-Sosa, M., Sonnewald, U., Frommer, W., Stratmann, M., Schell, J. and Willmitzer, L. 1998, EMBO J. 8: 23-29).

Las líneas transgénicas pueden ser analizadas entonces en cuanto a la expresión del transgen de SEQ ID NO: 2 por medio de análisis de inmunoprecipitación Northern. Por lo tanto es posible determinar un incremento en peso fresco y en el rendimiento de semillas de las líneas seleccionadas en comparación con el tipo silvestre.

Ejemplo 6

Diseño y expresión de un factor de transcripción sintético que se enlaza cerca al homólogo endógeno de SEQ ID NO: 2 y activación de la transcripción del mismo.

El ORF endógeno para SEQ ID NO: 1 o un ORF homólogo en otras especies de plantas también pueden ser activados introduciendo un activador específico sintético. Para este propósito, se construye un gen para una proteína de dedo de zinc quimérica la cual se enlaza a una región específica en la región reguladora del ORF de SEQ ID NO: 1 de su homólogo en otras plantas. La proteína de dedo de zinc artificial comprende un dominio de enlazamiento de ADN específico y un dominio de activación tal como, por ejemplo, el dominio VP16 del virus de Herpes simplex. La expresión de este activador quimérico en plantas da como resultado entonces la expresión específica del gen objetivo aquí, por ejemplo, SEQ ID NO. 118, el homólogo en Arabidopsis de YGL212w, o SEQ ID NO 102 un homólogo en maíz para SEQ ID 1 (YMR095C) o de otros homólogos de SEQ ID NO: 1, en otras especies vegetales. Los detalles experimentales pueden llevarse a cabo tal como se describe en WO 01/52620 o en Ordiz MI, (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, Vol. 99, Issue 20, 13290) o Guan, (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, Vol. 99, Issue 20, 13296).

Ejemplo 7

Identificación de una línea en la cual un promotor fuerte está integrado corriente arriba de homólogos de SEQ ID NO: 1 en plantas y así activa la expresión

Adicionalmente es posible una expresión ectópica fuerte del ORF deseado para integrar un promotor fuerte corriente arriba de dicho ORF. Para este propósito, se generó una población de plantas de Arabidopsis transgénicas en la cual fue integrado un vector que contiene el promotor mas bidireccional (Velten, 1984, EMBO J, 3, 2723), y la frontera izquierda del T-ADN. Dicho promotor permitió, a través de su promotor 2´, la transcripción del T-ADN a través de la frontera izquierda hacia el ADN genómico adyacente. El ADN genómico fue aislado entonces de las plantas individuales y reunido de acuerdo con un plan específico. El método de esta selección reversa para las integraciones de T-ADN en un sitio particular ha sido descrito en detalle por Krysan et al., (Krysan, 1999, The Plant Cell, Vol 11, 2283) y las referencias contenidas allí. Fueron identificadas las líneas en las cuales el T-ADN se ha integrado corriente arriba de los homólogos vegetales de los ORF de SEQ ID NO: 1. La expresión potenciada de los homólogos vegetales del SEQ ID NO: 1 en estas líneas, comparada con el tipo silvestre fue detectada por medio del análisis de inmunoprecipitación Northern.

Ejemplo 8

Identificación de genes homólogos en otras especies vegetales Las secuencias homólogas de otras plantas fueron identificadas por medio de herramientas de búsqueda en bases de datos especiales tales como en particular el algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul, 1990, J. Mol. Biol., 215, 403 and Altschul, 1997, Nucl. Acid Res., 25, 3389). Las comparaciones blastn y blastp fueron llevadas a cabo de manera estándar utilizando la matriz de clasificación BLOSUM-62 (Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10915). Se estudiaron las bases de datos NCBI GenBank así como tres librerías de etiquetas de secuencias expresadas (EST) de Brassica napus cv. "AC Excel", "Quantum" and "Cresor" (canola) y Oryza sativa cv. Nippon-Barre (arroz Japónica). La búsqueda identifico secuencias de aminoácidos y sus respectivas secuencias de ácidos nucleicos de varios organismos, los cuales son homólogas a SEQ ID NO: 2.

Ejemplo 9

Manipulación de plantas

Ejemplo 9a

Manipulación de plantas de ballico

Se utilizaron semillas de varias variedades diferentes de ballico como fuentes de explantes para transformación, incluyendo la variedad comercial Gunne de la compañía de semillas SvalofWeibull de la variedad Affinity. Las semillas son esterilizadas en superficies secuencialmente con Tween-20 al 1% durante 1 minuto, con lejía al 100% durante 60 minutos, tres enjuagues con 5 minutos cada uno con H2O desionizada y destilada, y luego se germino durante 3-4 días en un papel de filtro húmedo, estéril en oscuridad. Los plantones son esterilizados adicionalmente durante 1 minuto con Tween-20 al 1%, 5 minutos con lejía al 75% y se enjuagaron tres veces con ddH2O, cada uno 5 minutos.

Las semillas esterilizadas en superficie son colocadas en el medio de inducción de callos que contiene sales y vitaminas basales de Murashige y Skoog, 20 g/l de sacarosa, 150 mg/l de asparagina, 500 mg/l de hidrolizado de caseína, 3 g/l de fitagel, 10 mg/l de BAP y 5 mg/l de dicamba. Las plantas se incuban en la oscuridad a 25ºC durante 4 semanas para la germinación de las semillas y la inducción del callo embriogénico.

Después de 4 semanas en el medio de inducción de callo, los brotes y raíces de los plantones son cortados, el callo es transferido a un medio fresco, se mantiene el cultivo durante otras 4 semanas y luego se transfiere a un medio MSO a la luz durante 2 semanas. Se drenaron varias piezas de callo (11-17 semanas de edad) a través de un tamiz malla 10 y se colocaron sobre un medio de inducción de callo, o se cultivaron en 100 ml de medios de inducción de callo líquido para ballico (el mismo medio que para la inducción de callo con agar) en un matraz de 250 ml. El matraz es envuelto en hoja de aluminio y se agita a 175 rpm en la oscuridad a 23ºC durante 1 semana. Tamizando el medio de cultivo con un tamiz de malla 40 se recolectan las células. La fracción recolectada sobre el tamiz es sembrada y cultivada sobre medio de inducción de callo sólido de ballico durante 1 semana en la oscuridad a 25ºC. El callo luego es transferido y cultivado sobre medio MS que contiene 1% de sacarosa durante 2 semanas.

La transformación puede lograrse bien sea con Agrobacterium o con el método de bombardeo con partículas. Se crea un vector de expresión que contiene un promotor vegetal constitutivo y el ADNc del gen en un vector pUC. El plásmido de ADN se prepara a partir de células de E. coli con un kit Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se esparcen aproximadamente 2 g del callo embriogénico en el centro de un papel de filtro estéril sobre una caja de Petri. Se agrega una alícuota de MSO líquido con 10 g/l de sacarosa al papel de filtro. Se recubren partículas de oro (1.0 µm de tamaño) con plásmido de ADN de acuerdo con el método de Sanford et al., 1993 y se suministran al callo embriogénico con los siguientes parámetros: 500 mg de partículas y 2 mg de ADN por disparo, 1300 psi y una distancia objetivo de 8.5 cm desde la placa de detención a la placa del callo y un disparo por placa de callo.

Después del bombardeo, los callos son transferidos de vuelta al medio de desarrollo de callos fresco y se mantienen en la oscuridad a temperatura ambiente durante un periodo de 1 semana. El callo es transferido entonces a condiciones de crecimiento a la luz a 25ºC para iniciar la diferenciación del embrión con el agente de selección apropiado, por ejemplo, 250 nM de Arsenal, 5 mg/l PPT o 50 mg/l de kanamicina. Los brotes resistentes al agente de selección aparecen y una vez enraizados se transfieren al suelo.

Las muestras de las plantas transgénicas primarias (TO) son analizadas por PCR para confirmar la presencia de T-ADN. Estos resultados son confirmados por hibridación Southern en la cual el ADN se somete a electroforesis sobre un gel de agarosa al 1% y se transfiere a una membrana de nylon cargada positivamente (Roche Diagnostics). El kit PCR DIG Probe Synthesis (Roche Diagnostics) se utiliza para preparar una sonda marcada con digoxigenina por PCR, y se utiliza tal como lo recomienda el fabricante.

Las plantas de ballico transgénicas TO se propagan vegetativamente por corte de esquejes. Los esquejes trasplantados se mantienen en el invernadero durante 2 meses hasta que están bien establecidos. Los brotes son defoliados y se dejan crecer durante 2 semanas.

Ejemplo 9b

Plantas de soja manipuladas

La soja puede ser transformada de acuerdo con la siguiente modificación del método descrito en la Patente US 5, 164,310 de Texas A&M. Varias variedades comerciales de soja son propensas a la transformación por este método. El cultivar Jack (disponible de la Illinois Seed Foundation) se utiliza comúnmente para la transformación. Las semillas son esterilizadas por inmersión en etanol al 70% (v/v) durante 6 minutos y en lejía comercial al 25% (NaOCl) complementada con 0.1% de Tween (v/v) durante 20 minutos, seguida por un enjuague de 4 veces con agua doblemente destilada estéril. Al remover el radículo, el hipocotílo y el cotiledón de cada plantón se propagan plantones de siete días. Luego, el epicotílo con un cotiledón es transferido para un medio de germinación fresco en cajas de Petri y se incuba a 25ºC bajo un fotoperíodo de 16 horas (aproximadamente 100 µE-m-2s-1) durante tres semanas. Los nódulos axilares (aproximadamente 4 mm de longitud) son cortados de plantas de 3-4 semanas de edad. Los nódulos axilares son escindidos e incubados en cultivo LBA4404 de Agrobacterium.

Se han descrito muchos sistemas vectores binarios diferentes para la transformación de plantas (por ejemplo An, G. in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology vol. 44, pp. 47-62, Gartland KMA and MR Davey eds. Humana Press, Totowa, New Jersey). Muchos están basados en el vector pBIN19 descrito por Bevan (Nucleic Acid Research 1984. 12:8711-8721) que incluye un casete de expresión genético en plantas flanqueado por las secuencias frontera izquierda y derecha del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. Un casete de expresión genética vegetal consiste de al menos dos genes – un gen marcador de selección y un promotor de planta que regula la transcripción del ADNc o del ADN genómico del gen en prueba. Diversos genes marcadores de selección pueden ser utilizados como se describió anteriormente, utilizando el gen de Arabidopsis que codifica una enzima acetohidroxi ácido sintasa (AHAS) (Patente de los Estados Unidos 5, 767,366 y US 6, 225,105). De la misma forma, pueden usarse diversos promotores para regular el gen de prueba para proveer una regulación constitutiva, de desarrollo, de tejido o ambiental de la transcripción del gen tal como se describió anteriormente. En este ejemplo, se usa el promotor 34S (GenBank Accession M59930 and X16673) para proveer la expresión constitutiva del gen de prueba.

Después del tratamiento de cocultivo, los explantes se lavan y se transfieren a medios de selección suplementados con 500 mg/L de timentina. Los brotes son escindidos y colocados en un medio de elongación de brotes. Los brotes mayores de 1 cm son colocados sobre medio de enraizamiento durante 2 a 4 semanas antes de ser trasplantados al suelo.

Las plantas transgénicas primarias (TO) son analizadas por PCR para confirmar la presencia de T-ADN. Estos resultados son confirmados por hibridización Southern en la cual el ADN es sometido a electroforesis sobre un gel de agarosa al 1% y transferido a una membrana de nylon cargada positivamente (Roche Diagnostics). Se usa el kit PCR DIG Probe Synthesis kit (Roche Diagnostics) para preparar una sonda marcada con digoxigenina por PCR y se utiliza como lo recomienda el fabricante.

Ejemplo 9c

Manipulación de plantas de maíz

La transformación de maíz (Zea Mays L.) se lleva a cabo con una modificación del método descrito por Ishida et al. (1996. Nature Biotech 14745-50). La transformación es dependiente del genotipo de maíz y solamente genotipos específicos son propensos a la transformación y regeneración. La línea de cultivo interno A188 (University of Minnesota)

o híbridos con A188 como progenitores son buenas fuentes para material donante para la transformación (Fromm et al. 1990 Biotech 8:833-839), pero también otros fenotipos pueden resultar exitosos. Las mazorcas son recolectadas de plantas de maíz a aproximadamente 11 días después de la polinización (DAP) cuando la longitud de los embriones inmaduros es aproximadamente 1 a 1.2 mm. Los embriones inmaduros son cocultivados con Agrobacterium

tumefaciens que porta vectores “superbinarios” y las plantas transgénicas son recuperadas a través de organogénesis.

El sistema de vector binario de Japan Tobacco esta descrito en las Patentes WO 94/00977 y WO 95/06722. Los vectores pueden ser construidos como se describe. Pueden utilizarse diverso genes marcadores de selección incluyendo el gen de maíz que codifica una enzima acetohidroxi ácido sintasa (AHAS) (US 6, 025,541). De la misma forma, pueden utilizarse diversos promotores para regular el gen de prueba para proveer una regulación constitutiva, de desarrollo, tejido o ambiental de la transcripción del gen. En este ejemplo, se utiliza el promotor 34S (GenBank Accession numbers M59930 and X16673) para proveer la expresión constitutiva del gen de prueba.

Los embriones escindidos son cultivados sobre medio de inducción de callo, luego en medio de regeneración para maíz, que contiene imidazolinona como agente de selección. Las placas de Petri son incubadas a la luz a 25ºC durante 2-3 semanas, o hasta que se desarrollen los brotes. Los brotes verdes son transferidos desde cada embrión al medio de enraizamiento para maíz y se incuban a 25ºC durante 2-3 semanas, hasta que las raíces se desarrollen. Los brotes enraizados son trasplantados al suelo en el invernadero. Las semillas de T1 son producidas a partir de plantas que exhiben tolerancia a los herbicidas de imidazolinona y los cuales son positivos en PCR para los trasgenes.

La generación T1 de las inserciones localizadas individuales del T-ADN puede segregar el transgen en una relación 3:1. La progenie que contiene una o dos copias del transgen es tolerante al herbicida imidazolinona. Las plantas homocigóticas T2 pueden exhibir fenotipos similares que las plantas T1. Las plantas hibridas (progenie) F1 de plantas transgénicas homocigóticas y las plantas no transgénicas también pueden exhibir fenotipos similares implementados.

Ejemplo 9d

Plantas de trigo manipuladas

La transformación del trigo se lleva a cabo con el método descrito por Ishida et al. (1996 Nature Biotech, 14745-50. El cultivar Bobwhite (disponible de CYMMIT, México) se utiliza comúnmente en la transformación. Se cocultivan embriones inmaduros con Agrobacterium tumefaciens que portan vectores “superbinarios” y las plantas transgénicas se recuperan a través de organogénesis. El sistema de vector super binario de Japan Tobacco esta descrito en las Patentes WO 94/00977 y WO 95/06722. Los vectores son construidos como se describe. Pueden utilizarse diversos marcadores de selección incluyendo el gen de maíz que codifica una enzima acetohidroxi ácido sintasa (AHAS) mutada (US 6, 025,541). De la misma forma, pueden utilizarse diversos promotores para regular el gen en prueba para proveer regulación constitutiva, de desarrollo, de tejido o ambiental de la transcripción del gen. En este ejemplo, el promotor 34S (GenBank Accession numbers M59930 and X16673) puede utilizarse para proveer expresión constitutiva del gen en prueba.

Después de la incubación con Agrobacterium, los embriones son cultivados sobre medio de inducción de callo, luego medio de regeneración, que contiene imidazolinona como agente de selección. Las placas de Petri se incuban a la luz a 25ºC durante 2-3 semanas, o hasta que se desarrollen los brotes. Los brotes verdes son transferidos desde cada embrión a medio de enraizamiento y se incuban a 25ºC durante 2-3 semanas, hasta que se desarrollen las raíces. Los brotes enraizados son trasplantados al suelo en el invernadero. Las semillas T1 son producidas a partir de plantas que exhiben tolerancia a los herbicidas de imidazolinona y que son positivos en PCR para los trasgenes.

La generación T1 de inserciones de localización individual del T-ADN puede segregar el transgen en una relación 3:1. Aquella progenie que contiene una o dos copias del transgen es tolerante al herbicida imidazolinona. Las plantas homocigóticas T2 exhibieron fenotipos similares.

Ejemplo 9e

Manipulación de plantas de colza/canola

Los peciolos e hipocotílos de cotiledones de plantones jóvenes de 5-6 días de edad se utilizaron como explantes para el cultivo de tejidos y se transformaron de acuerdo con Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183-188. El cultivar comercial Westar (Agriculture Canada) es la variedad estándar utilizada para transformación, pero pueden utilizarse otras variedades.

La Agrobacterium tumefaciens LBA4404 que contiene un vector binario se utiliza para la transformación de la canola. Se han descrito muchos sistemas de vectores binarios diferentes para la transformación de plantas (por ejemplo An, G. in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology vol. 44, pp. 47-62, Gartland KMA and MR Davey eds. Humana Press, Totowa, New Jersey). Muchos se basan en el vector pBIN19 descrito por Bevan (Nucleic Acid Research, 1984.

12: 8711-8721) que incluye un casete de expresión genética vegetal flanqueado por las secuencias de frontera izquierda y derecha del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. Un casete de expresión genética vegetal consiste de al menos dos genes – un gen marcador de selección y un promotor de planta que regula la transcripción del ADNc o ADN genómico del gen de prueba. Pueden utilizarse diversos genes marcadores de selección incluyendo el gen Arabidopsis que codifica una enzima acetohidroxi ácido sintasa mutada (AHAS) (Patente de los Estados Unidos 5, 767,366 y US 6, 225,105). De la misma forma, pueden utilizarse diversos promotores para regular el gen de prueba para proveer la regulación constitutiva, de desarrollo, de tejido o ambiental de la transcripción del gen. En este ejemplo, puede usarse el promotor 34S (GenBank Accession M59930 and X16673) para proveer expresión constitutiva del gen de prueba.

Las semillas de canola se esterilizan en superficie en etanol al 70% durante 2 minutos, luego en clorox al 30% con una gota de Tween-20 durante 10 minutos, seguida por tres enjuagues con agua destilada esterilizada. Las semillas se hacen germinar entonces in vitro durante 5 días en medio MS de fuerza media sin hormonas, sacarosa al 1%, fitagar al 0.7% a 23ºC, 16 horas de luz. Los explantes de peciolo de cotiledón con el cotiledón unido son escindidos de los plantones in vitro, y luego son inoculados con Agrobacterium sumergiendo el extremo cortado del explante del peciolo en la suspensión bacteriana. Los explantes son cultivados entonces durante 2 días sobre medio MSBAP-3 que contiene 3 mg/l de BAP, 3% de sacarosa, 0.7% de fitagar a 23ºC, 16 horas de luz. Después de 2 días de cocultivo con Agrobacterium, los explantes de peciolo se transfieren a medio MSBAP-3 que contiene 3 mg/l de BAP, cefotaxima, carbenicilina, o timentina (300 mg/l) durante 7 días, y luego se cultivan sobre medio MSBAP-3 con cefotaxima, carbenicilina o timentina y agente de selección hasta la regeneración de los brotes. Cuando los brotes tienen de 5 a 10 mm de longitud, son cortados y transferidos a un medio de elongación de brotes (MSBAP-0.5, que contiene 0.5 mg/l de BAP). Los brotes de aproximadamente 2 cm de longitud son transferidos al medio de enraizamiento (MS0) para inducción de raíz.

Se analizan muestras de las plantas transgénicas primarias (To) por PCR para confirmar la presencia de T-ADN. Estos resultados son confirmados por hibridación Southern en la cual el ADN es sometido a electroforesis en un gel de agarosa al 1% y luego se transfiere a una membrana de nylon cargada positivamente (Roche Diagnostics). Se utiliza el kit PCR DIG Probe Synthesis (Roche Diagnostics) para preparar una sonda marcada con digoxigenina por PCR, y utilizada como lo recomienda el fabricante.

Ejemplo 9f

Manipulación de plantas de alfalfa

Un clon regenerante de alfalfa (Medicago sativa) es transformado utilizando el método de (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839-847). La regeneración y transformación de la alfalfa es dependiente del gen tipo y por lo tanto se requiere una planta en regeneración. Se han descrito métodos para obtener plantas en regeneración. Por ejemplo, pueden ser seleccionados del cultivar Rangelander (Agriculture Canada) o cualquier otra variedad de alfalfa comercial como lo describe Brown DCW and A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111-112. Alternativamente, la variedad RA3 (University of Wisconsin) ha sido seleccionada para el uso en cultivo de tejidos (Walker et al., 1978 Am J Bot 65:654-659).

Los explantes de peciolos son cocultivados con un cultivo durante la noche de Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839-847) o LBA4404 que contiene un vector binario. Se han descrito muchos sistemas de vectores binarios diferentes para transformación de plantas (por ejemplo An, G. in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology vol. 44, pp. 47-62, Gartland KMA and MR Davey eds. Humana Press, Totowa, New Jersey). Mucho se basan en el vector pBIN19 descrito por Bevan (Nucleic Acid Research. 1984. 12:8711-8721) que incluye un casete de expresión genético vegetal franqueado por las secuencias de frontera izquierda y derecha del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. Un casete de expresión genética vegetal consiste de al menos dos genes – un gen marcador de selección y un promotor de plantas que regula la transcripción del ADNc o del ADN genómico del gen de prueba. Pueden utilizarse diversos genes marcadores de selección incluyendo el gen Arabidopsis que codifica una enzima acetohidroxi ácido sintasa (AHAS) mutada (5, 767,366 y US 6, 225,105). De la misma forma, pueden utilizarse diversos promotores para regular el gen de prueba que provee la regulación constitutiva, de desarrollo, de tejido o ambiental de la transcripción genética. En este ejemplo, puede usarse el promotor 34S (GenBank Accession M59930 and X16673) para proveer la expresión constitutiva del gen de prueba.

Los explantes se cultivan durante 3 días en la oscuridad sobre medio de inducción de SH que contiene 288 mg/l de prolina, 53 mg/L de tioprolina, 4.35 g/L de K2SO4 y 100 µm de acetosiringinona. Los explantes son lavados en medio Murashige-Skoog de fuerza media (Murashige and Skoog, 1962), y sembrado sobre el mismo medio de inducción SH sin acetosiringinona pero con un agente de selección adecuado y un antibiótico adecuado para inhibir el crecimiento de Agrobacterium. Después de varias semanas, los embriones somáticos son transferidos a medio de desarrollo BOi2Y que no contiene reguladores de crecimiento, ni antibióticos, y 50 g/L de sacarosa. Los embriones somáticos son germinados subsecuentemente en medio Murashige-Skoog de fuerza media. Los plantones enraizados son transferidos a macetas y cultivados en un invernadero.

Las plantas transgénicas To son propagadas por cortes nodulares y enraizadas en medio de cultivo Turface. Las plantas son defoliadas y cultivadas hasta una altura de aproximadamente 10 cm (aproximadamente 2 semanas después de la defoliación).

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Metanomics GmbH

<120> PREPARACIÓN DE ORGANISMOS CON CRECIMIENTO MÁS RÁPIDO Y/O RENDIMIENTO MÁS ALTO

<130> AE 2003-0644

<140> PF 55769

<141> 2005-07-07

<160> 139

<170> PatentIN Nr. 3.1 & 3.4

<210> 1

<211> 675

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 1

10 <210> 2

<211> 224

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 2

<210> 3

<211> 591

<212> ADN 10 <213> Pyrococcus abyssi

<400> 3

<210> 4

<211> 196

<212> PRT

<213> Pyrococcus abyssi

<400> 4

<210> 5

<211> 582

<212> ADN

<213> Streptococcus pneumoniae

<400> 5 <210> 6

<211> 193

<212> PRT

<213> Streptococcus pneumoniae

<400> 6

<210> 7

<211> 256

<212> PRT

<213> Hordeum vulgare

<400> 7

<210> 8

<211> 567

<212> ADN

<213> Listeria monocytogenes 15 <400> 8

<210> 9

<211> 188

<212> PRT

<213> Listeria monocytogenes

<400> 9

<210> 10

<211> 561

<212> ADN

<213> Clostridium acetobutylicum

<400> 10 <210> 11

<211> 186

<212> PRT

<213> Clostridium acetobutylicum

<400> 11 <210> 12

<211> 597

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 12 <210> 13

<211> 198

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 13

10 <210> 14

<211> 561

<212> ADN

<213> Aeropyrum pernix

<400> 14

<210> 15 10 <211> 186

<212> PRT

<213> Aeropyrum pernix

<400> 15

<210> 16

<211> 612

<212> ADN

<213> Halobacterium sp. NRC-1

<400> 16

<210> 17

<211> 203

<212> PRT

<213> Halobacterium sp. NRC-1

<400> 17

<210> 18

<211> 591

<212> ADN

<213> Pyrococcus horikoshii

<400> 18

<210> 19

<211> 196

<212> PRT

<213> Pyrococcus horikoshii

<400> 19

<210> 20

<211> 597

<212> ADN

<213> Archaeoglobus fulgidus

<400> 20

<210> 21

<211> 198

<212> PRT

<213> Archaeoglobus fulgidus

<400> 21

<210> 22

<211> 579

<212> ADN

<213> Methanobacterium thermoautotrophicum

<400> 22 <210> 23

<211> 192

<212> PRT

<213> Methanobacterium thermoautotrophicum

<400> 23

<210> 24

<211> 528

<212> ADN

<213> Haemophilus influenzae

<400> 24

<210> 25

<211> 175

<212> PRT

<213> Haemophilus influenzae

<400> 25

<210> 26

<211> 591

<212> ADN

<213> Deinococcus radiodurans

<400> 26

<210> 27

<211> 196

<212> PRT

<213> Deinococcus radiodurans

<400> 27

<210> 28

<211> 591

<212> ADN

<213> Bacillus halodurans

<400> 28

<210> 29

<211> 196

<212> PRT

<213> Bacillus halodurans

<400> 29

10 <210> 30

<211> 567

<212> ADN

<213> Thermotoga maritima

<400> 30

<210> 31 10 <211> 188

<212> PRT

<213> Thermotoga maritima

<400> 31

<210> 32

<211> 603

<212> ADN

<213> Sulfolobus solfataricus

<400> 32

<210> 33

<211> 200

<212> PRT

<213> Sulfolobus solfataricus

<400> 33

<210> 34

<211> 669

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 34 <210> 35

<211> 222

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 35

<210> 36

<211> 591

<212> ADN

<213> Bacillus subtilis

<400> 36

<210> 37

<211> 196

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 37

<210> 38

<211> 705

<212> ADN

<213> Schizosaccharomyces pombe

<400> 38 <210> 39

<211> 234

<212> PRT

<213> Schizosaccharomyces pombe

<400> 39

<210> 40

<211> 570

<212> ADN

<213> Haemophilus ducreyi

<400> 40

<210> 41

<211> 189

<212> PRT

<213> Haemophilus ducreyi

<400> 41

<210> 42

<211> 606

<212> ADN

<213> Streptomyces avermitilis

<400> 42

<210> 43

<211> 201

<212> PRT

<213> Streptomyces avermitilis

<400> 43

<210> 44

<211> 567

<212> ADN

<213> Tropheryma whipplei (cepa TW08/27) (bacilo de Whipple)

<400> 44 <210> 45

<211> 188

<212> PRT

<213> Tropheryma whipplei (cepa TW08/27) (bacilo de Whipple)

<400> 45 <210> 46

<211> 558

<212> ADN

<213> Staphylococcus epidermidis

<400> 46 <210> 47

<211> 185

<212> PRT

<213> Staphylococcus epidermidis

<400> 47

<210> 48

<211> 639

<212> ADN

<213> Bifidobacterium longum

<400> 48

<210> 49

<211> 212

<212> PRT

<213> Bifidobacterium longum

<400> 49

<210> 50

<211> 573

<212> ADN

<213> Bacillus circulans

<400> 50

<210> 51

<211> 190

<212> PRT

<213> Bacillus circulans

<400> 51

<210> 52

<211> 1174

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana (berro de oreja de ratón)

<400> 52

<210> 53

<211> 255

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana (berro de oreja de ratón)

<400> 53 <210> 54

<211> 723

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum)

<400> 54 <210> 55

<211> 200

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum)

<400> 55 <210> 56

<211> 612

<212> ADN

<213> Methanosarcina mazei (Methanosarcina frisia)

<400> 56 <210> 57

<211> 203

<212> PRT

<213> Methanosarcina mazei (Methanosarcina frisia)

<400> 57

<210> 58

<211> 594

<212> ADN

<213> Pyrococcus furiosus

<400> 58

<210> 59

<211> 197

<212> PRT

<213> Pyrococcus furiosus

<400> 59

<210> 60

<211> 600

<212> ADN

<213> Methanosarcina acetivorans

<400> 60 <210> 61

<211> 199

<212> PRT

<213> Methanosarcina acetivorans

<400> 61

<210> 62

<211> 609

<212> ADN

<213> Methanopyrus kandleri

<400> 62

<210> 63

<211> 202

<212> PRT

<213> Methanopyrus kandleri

<400> 63

<210> 64

<211> 1262

<212> ADN

<213> Suberites domuncula (Esponja)

<400> 64

<210> 65

<211> 233

<212> PRT

<213> Suberites domuncula (Esponja)

<400> 65

<210> 66

<211> 615

<212> ADN

<213> Pyrobaculum aerophilum

<400> 66

<210> 67

<211> 204

<212> PRT

<213>: Pyrobaculum aerophilum 10 <400> 67

<210> 68

<211> 816

<212> ADN

<213> Emericella nidulans (Aspergillus nidulans)

<400> 68

<210> 69

<211> 271

<212> PRT

<213> Emericella nidulans (Aspergillus nidulans)

<400> 69

<210> 70

<211> 603

<212> ADN

<213> Sulfolobus tokodaii

<400> 70

<210> 71

<211> 200

<212> PRT

<213> Sulfolobus tokodaii

<400> 71

<210> 72

<211> 600

<212> ADN

<213> Thermoplasma volcanium

<400> 72

<210> 73

<211> 199

<212> PRT

<213> Thermoplasma volcanium

<400> 73

<210> 74

<211> 759

<212> ADN

<213> Neurospora crassa

<400> 74

<210> 75

<211> 252

<212> PRT

<213> Neurospora crassa

<400> 75

<210> 76

<211> 582

<212> ADN

<213> Pasteurella multocida

<400> 76

<210> 77

<211> 193

<212> PRT

<213> Pasteurella multocida

<400> 77

<210> 78

<211> 723

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana (berro de oreja de ratón)

<400> 78

<210> 79

<211> 240

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana (berro de oreja de ratón)

<400> 79

<210> 80

<211> 1574

<212> ADN

<213> Cercospora nicotianae

<400> 80

<210> 81

<211> 278

<212> PRT

<213> Cercospora nicotianae

<400> 81

<210> 82

<211> 612

<212> ADN

<213>: Thermoplasma acidophilum 10 <400> 82

<210> 83

<211> 203

<212> PRT

<213> Thermoplasma acidophilum

<400> 83 <210> 84

<211> 591

<212> ADN

<213> Bacillus cereus ATCC 10987

<400> 84 <210> 85

<211> 196

<212> PRT

<213> Bacillus cereus ATCC 10987

<400> 85 <210> 86

<211> 828

<212> ADN

<213> Ashbya gossypii (Levadura) (Eremothecium gossypii)

<400> 86 <210> 87

<211> 275

<212> PRT

<213> Ashbya gossypii (Levadura) (Eremothecium gossypii)

<400> 87 <210> 88

<211> 576

<212> ADN

<213> Thermus thermophilus HB27

<400> 88 <210> 89

<211> 191

<212> PRT

<213> Thermus thermophilus HB27

<400> 89 <210> 90

<211> 1047

<212> ADN

<213> Oryza sativa (grupo cultivar japonica)

<400> 90 <210> 91 <211> 255

<212> PRT

<213> Oryza sativa (grupo cultivar japonica)

<400> 91

10 <210> 92

<211> 594

<212> ADN

<213> Parachlamydia sp. UWE25

<400> 92

<210> 93

<211> 197

<212> PRT

<213> Parachlamydia sp. UWE25

<400> 93 <210> 94

<211> 564

<212> ADN

<213> Methanococcus maripaludis

<400> 94 <210> 95

<211> 187

<212> PRT

<213> Methanococcus maripaludis

<400> 95

<210> 96

<211> 25

5: <212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 96

atgcacaaaa cccacagtac aatgt: 25

<210> 97

10: <211> 28

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 97

ttaattagaa acaaactgtc tgataaac 28

15: <210> 98

<211> 714

<212> ADN

<213> Brassica napus

<400> 98

<210> 99

<211> 237

<212> PRT

<213> Brassica napus 10 <400> 99

<210> 100

<211> 765

<212> ADN

<213> Glycine max

<400> 100

<210> 101

<211> 254

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 101

<210> 102

<211> 768

<212> ADN

<213> zea mays

<400> 102 <210> 103

<211> 255

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 103

<210> 104

<211> 768

<212> ADN

<213> Hordeum vulgare

<400> 104

<210> 105

<211> 255

<212> PRT

<213> Hordeum vulgare

<400> 105

<210> 106

<211> 1264

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 106

<210> 107

<211> 316

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 107

<210> 108

<211> 975

<212> ADN

<213> oryza sativa

<400> 108

<210> 109

<211> 324

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 109

<210> 110

<211> 1160 10 <212> ADN

<213> Candida albicans

<400> 110 <210> 111

<211> 291

<212> PRT

<213> Candida albicans

<400> 111

<210> 112

<211> 1689

<212> ADN

<213>: Neurospora crassa 10 <400> 112

<210> 113

<211> 562

<212> PRT

<213> Neurospora crassa

<400> 113

<210> 114

<211> 925

<212> ADN

<213> Phytophthora infestans (hongo de la roya tardía de la patata)

<400> 114

<210> 115

<211> 248

<212> PRT

<213> Phytophthora infestans (hongo de la roya tardía de la patata).

<400> 115

<210> 116

<211> 795

<212> ADN

<213>: Neurospora crassa 10 <400> 116

<210> 117

<211> 264

<212> PRT

<213> Neurospora crassa

<400> 117

<210> 118

<211> 1134

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana (berro de oreja de ratón)

<400> 118

<210> 119

<211> 233

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana (berro de oreja de ratón)

<400> 119

<210> 120 10 <211> 1047

<212> ADN

<213> Ashbya gossypii (Levadura) (Eremothecium gossypii)

<400> 120

<210> 121

<211> 348

<212> PRT

<213> Ashbya gossypii (Levadura) (Eremothecium gossypii)

<400> 121

<210> 122

<211> 25

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 122

atggcagcta attctgtagg gaaaa: 25

5: <210> 123

<211> 26

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 123

10: tcaagcactg ttgttaaaat gtctag 26

<210> 124

<211> 348

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

15: <400> 124

<210> 125

<211> 115 20 <212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 125

5 <210> 126

<211> 24

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadería)

<400> 126 10 atgggtagtt tttgggacgc attc 24

<210> 127

<211> 27

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadería)

15 <400> 127 ttatctattt actttattgt cgggttc 27

<210> 128

<211> 987

<212> ADN 20 <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 128

<210> 129

<211> 328

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 129

<210> 130 10 <211> 25 <212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadería)

<400> 130 atggaaaaaa aacatgtcac tgtgc 25 5 <210> 131

<211> 25

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadería)

<400> 131 10 ctatgtatct tgcaggtatt ccata 25

<210> 132

<211> 989

<212> ADN

<213> Brassica napus 15 <220>

<221> CDS

<222> (63)..(830)

<400> 132 <210> 133

<211> 255

<212> PRT

<213> Brassica napus

<400> 133

<210> 134

<211> 1042

<212> ADN

<213> Glycine max 10 <220>

<221> CDS

<222> (61)..(825)

<400> 134

<210> 135

<211> 254

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 135

10 <210> 136

<211> 342

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220> 15 <221> CDS

<222> (1)..(342)

<400> 136

<210> 137

<211> 113

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae 10 <400> 137

<210> 138

<211> 25

<212> ADN 5 <213> Cebador

<400> 138 25 atgagcattc tatcatccac acaat 25

<210> 139

<211> 26 10 <212> ADN

<213> Primer

<400> 139 ttaactactt gagttttctt tccagc 26

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para preparar una planta con crecimiento más rápido y/o rendimiento incrementado y/o biomasa incrementada en comparación con una planta de referencia, método que comprende incrementar la actividad de SEQ ID NO: 2 en dicha planta o en una o más partes de la misma en comparación con un organismo de referencia,

en donde la actividad del polipéptido de SEQ ID NO: 2 se incrementa introduciendo un polinucleótido en la planta, o en una o más partes de la misma, polinucleótido que codifica para un polipéptido de SEQ ID NO: 2 codificado por una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo consistente de:

(a)

molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2;

(b)

molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido de la secuencia de codificación de acuerdo con SEQ ID NO: 1;

(c)

molécula de ácido nucleico cuya secuencia es derivable de una secuencia de polipéptido codificada por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con (a) o (b), debido a la degeneración del código genético;

(d)

molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido cuya secuencia es al menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido de SEQ ID NO: 2;

o que comprende una secuencia complementaria de los mismos.
2.

El método como se reivindica en la reivindicación 1, en donde un polinucleótido que codifica un polipéptido o actividad de SEQ ID NO: 2 endógeno está enlazado funcionalmente a secuencias reguladoras que producen una expresión incrementada del polipéptido de SEQ ID NO: 2.
3.

Un casete de expresión o un vector que comprende una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 1 (a) – (d) o la cadena complementaria del mismo,

en donde dicho casete de expresión o vector comprende secuencias reguladoras que son capaces de controlar la expresión genética en células vegetales, y el cual comprende un promotor vegetal seleccionado del grupo consistente de promotores específicos para semillas, promotores de ubiquitina en plantas, promotores de faseolina en plantas, promotores de plantas inducibles, promotor FBPasa citosólico, promotor ST-LSI de patata, promotor de la fosforribosilpirofosfato amidotransferasa de Glycine max, promotor específico de nodos, promotor de napina de colza, promotor de oleosina de Arabidopsis, promotor de Bce4 de Brassica, promotor de LeB4 de legumbres, promotor de lpt-2

o lpt-1 de cebada, promotor de hordeína de cebada, promotores de CaMV/35S, PRP1, lib4, usp, mas, STLS1, ScBV, B33, SAD1, SAD2 y nos.
4.

Una célula vegetal la cual ha sido transformada o transfectada de manera estable o transiente con el vector vegetal o el casete de expresión como se reivindica en el reivindicación 3.
5.

Un método para preparar una planta transgénica, célula vegetal, tejido vegetal, método que comprende introducir en el genoma de la misma el casete de expresión o el vector vegetal como se reivindica en la reivindicación 3.
6.

Una célula vegetal, la cual comprende el casete de expresión o el vector vegetal como se reivindica en la reivindicación 3.
7.

Un tejido vegetal o planta que tiene una cantidad incrementada de actividad de SEQ ID NO: 2 o de proteína que comprende la célula vegetal como se reivindica en la reivindicación 6.
8.

Semilla, tubérculo o material de propagación de una planta como se reivindica en la reivindicación 7, que comprende el casete de expresión o el vector vegetal como se reivindica en la reivindicación 3 o la célula vegetal como se reivindica en la reivindicación 6.
9.

Una célula vegetal, un organelo de célula vegetal, un tejido vegetal, una planta o una parte de la misma que (sobre) expresa un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1, en donde el peso seco se incrementa en 1%, 2,5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 50% o más en comparación con la planta tipo silvestre, y con lo cual el peso seco de la célula vegetal, el organelo de la célula vegetal, el tejido vegetal, la planta o la parte de la misma significa el peso del material orgánico de la célula vegetal, el organelo de la célula vegetal, el tejido vegetal, la planta o la parte de la misma menos la cantidad de agua incluida en la célula vegetal, el organelo de célula vegetal, el tejido vegetal, la planta o la parte de la misma.
10.

Una célula vegetal, un organelo de célula vegetal, un tejido vegetal, una planta o una parte de la misma, que (sobre)expresa un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1, en donde el peso seco es incrementado en 1%, 2,5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 50% o más en comparación con el peso seco de una variedad seleccionada del grupo consistente de

(a) G. hirsutum IPK Accession Number GOS 6 (D 120), GOS 7 (ST 446), GOS 10 (D 1635), GOS 17 (D 4302), o GOS 21 (D 5553), o G. areysianum Deflers,

o G. incanum (Schwartz) Hillc., o G. raimondii Ulbr., o G. stocksii Masters, o G. thurberi Tod., o G. tomentosum Nutt. o

G. triphyllum Hochr., o Gossypium arboreum IPK Accession Number GOS 13 (D 1634), GOS 16 (D 4240), GOS 18 (D 4505), GOS 19 (D 4506), GOS 20 (D 4750), o GOS 12 (D 1329), o Gossypium barbadense, o Gossypium herbaceum; y

(b)

Brassica napus variedad Mika, Brassica napus variedad Digger, Brassica napus variedad Artus, Brassica napus variedad Terra, Brassica napus variedad Smart, Brassica napus variedad Olivine, Brassica napus variedad Libretto, Brassica napus variedad Wotan, Brassica napus variedad Panther, Brassica napus variedad Express, Brassica napus variedad Oase, Brassica napus variedad Elan, Brassica napus variedad Ability, Brassica napus variedad Mohican; y

(c)

Linum usitatissimum variedad Librina, Linum usitatissimum variedad Flanders, Linum usitatissimum variedad Scorpion, Linum usitatissimum variedad Livia, Linum usitatissimum variedad Lola, Linum usitatissimum variedad Taurus, Linum usitatissimum variedad Golda, Linum usitatissimum variedad Lirima, y

(d)

Zea mays variedad Articat, Zea mays variedad NK Dilitop, Zea mays variedad Total, Zea mays variedad Oldham, Zea mays variedad Adenzo, Zea mays variedad NK Lugan, Zea mays variedad Liberal, Zea mays variedad Peso; y

(e)

Glycine max variedad Oligata, Glycine max variedad Lotus, Glycine max variedad Primus,Glycine max variedad Alma Ata, Glycine max variedad OAC Vision, Glycine max variedad Jutro; y

(f)

Helianthus annus variedad Helena, Helianthus annus variedad Flavia, Helianthus annus variedad Rigasol, Helianthus annus variedad Flores, Helianthus annus variedad Jazzy, Helianthus annus variedad Pegaso, Helianthus annus variedad Heliaroc, Helianthus annus variedad Salut RM; y

(g)

Camelina sativa variedad Dolly, Camelina sativa variedad Sonny, Camelina sativa variedad Ligena, Camelina sativa variedad Calinka; y

(h)

Sinapis alba variedad Martigena, Sinapis alba variedad Silenda, Sinapis alba variedad Sirola, Sinapis alba variedad Sito, Sinapis alba variedad Semper, Sinapis alba variedad Seco; y

(i)

Carthamus tinctorius variedad Sabina, Carthamus tinctorius variedad HUS-305, Carthamus tinctorius variedad landrace, Carthamus tinctorius variedad Thori-78, Carthamus tinctorius variedad CR-34, Carthamus tinctorius variedad CR-81; y

j) Brassica juncea variedad Vittasso, Brassica juncea variedad Muscon M-973, Brassica juncea variedad RAPD, Brassica juncea variedad Co.J.86, Brassica juncea variedad IAC 1-2, Brassica juncea variedad Pacific Gold; y

(k)

Cocos nucifera L. varietes Maypan, Ceylon Tall, Indian Tall, Jamaica Tall, Malayan Tall, Java Tall, Laguna, KingCRIC 60, CRIC 65, CRISL 98, Moorock tall, Plus palm tall, San Ramon, Typica, Nana o Aurantiaca; y

(l)

Triticum aestivum L. variedad Altos, Bundessortenamt file number 2646, Triticum aestivum L. variedad Bussard, Bundessortenamt file number 1641, o Triticum aestivum L. variedad Centrum, Bundessortenamt file number 2710; y

(m)

Beta vulgaris variedad Dieck 13, Número de archivo CPVO 19991828, Beta vulgaris variedad FD 007, CPCO file number 20000506, o Beta vulgaris variedad HI 0169, Número de archivo CPVO 20010315; y

(n)

Hordeum vulgare variedad Dorothea, Número de archivo CPVO 20031457, Hordeum vulgare variedad Colibri, Número de archivo CPVO 20040122, Hordeum vulgare variedad Brazil, Número de archivo CPVO 20010274, o Hordeum vulgare variedad Christina, Número de archivo CPVO 20030277; y

(o)

Secale cereale variedad Esprit, Número de archivo CPVO 19950246, Secale cereale variedad Resonanz, Número de archivo CPVO 20040651, o Secale cereale variedad Ursus, Número de archivo CPVO 19970714; y

(p)

Oryza sativa variedad Gemini, Número de archivo CPVO 20010284, Oryza sativa variedad Tanaro, Número de archivo CPVO 20020177, o Oryza sativa variedad Zeus, Número de archivo CPVO 19980388; y

(q)

Solanum tuberosum L. variedades Linda, Nicola, Solara, Agria, Sieglinde, o Russet Burbank; y

(r)

Arachis hypogaea subsp. fastigiata cultivar Valencia; y

(s)

Arachis hypogaea subsp. hypogaea cultivar Virginia variedad ’Holland Jumbo’, ’Virginia A23-7’, o ’Florida 416’; y

(t) Arachis hypogaea subsp. hirsuta cultivar Peruvian runner variedad ’Southeastern Runner 56-15’, ’Dixie Runner’, o 5 ’Early Runner’; y

(u)

Arachis hypogaea subsp. vulgaris cultivar Spanish variedad ’Dixie Spanish’, ’Improved Spanish 2B’, o ’GFA Spanish’;

(t)

Arachis hypogaea subsp. hirsuta cultivar Peruvian runner variedad ’Southeastern Runner 56-15’, ’Dixie Runner’, o ’Early Runner’; y

(u)

Arachis hypogae subsp. vulgaris cultivar Spanish variedad ’Dixie Spanish’, ’Improved Spanish 2B’, o ’GFA Spanish’;

10 y en donde el peso seco significa el peso del material orgánico de la célula vegetal, del organelo de la célula vegetal, del tejido vegetal, de la planta o la parte de la misma menos la cantidad de agua incluida en la célula vegetal, el organelo de la célula vegetal, el tejido vegetal, la planta o la parte de la misma.

Figura 1 Alineamiento de YMR095c y homólogos de diferentes organismos (incluido consenso de 100% de identidad)

Figura 2 Alineamiento de homólogos de YML095c de diferentes especies vegetales (incluida 100% de identidad de consenso)

Figura 3

Homólogos de YMR095c

ID

% identidad

(proteína)

DB Accession blastp

Figura 4 Homólogos de YGL212W

ID (proteína)

DB/Accesssion % identidad Blastp