ES2432532T3 - Inhibición de ARNi de la expresión alfa-ENaC - Google Patents

Inhibición de ARNi de la expresión alfa-ENaC Download PDF

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Abstract

Una composición que comprende un agente de iARN que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido,en donde: a. la cadena sentido comprende por lo menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena sentido de ND8496 (SEQ IDNO: 1511), y la cadena anti-sentido comprende por lo menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena anti-sentido deND8496 (SEQ ID NO: 1512); o b. la cadena sentido comprende por lo menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena sentido de ND8712 (SEQ IDNO: 1637), y la cadena anti-sentido comprende por lo menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena anti-sentido deND8712 (SEQ ID NO: 1638).

Description

DESCRIPCION�
1nhibicion de ARNi de la expresion alfa-ENaC
5 Campo Tecnico
La invencion se relaciona con el campo de transporte de iones de las vias respiratorias mediado por ENaC y composiciones y metodos para modular la expresion alfa-ENaC, y mas particularmente con la regulacion por disminucion de alfa-ENaC por oligonucleotidos por medio de interferencia de ARN que se administran localmente a los pulmones y el pasaje nasal por medio de administracion por inhalacion/intranasal, o se administran
10 sistemicamente, por ejemplo por medio de inyeccion intravenosaD
Antecedentes
La interferencia de ARN o quot;ARNiquot; es un termino acunado inicialmente por Fire y colaboradores para describir la observacion que el ARN de cadena doble (dsARN) puede bloquear la expresion genica cuando se introduce en gusanos (Fire et alD, Nature 391: 806-811, 1998)D El dsARN corto dirige la inactivacion post-transcripcional,
15 especifica de genes en muchos organismos, que incluyen vertebrados, y ha proporcionado una nueva herramienta para estudiar la funcion del genD Esta tecnologia se ha revisado numerosas veces recientemente, vease, por ejemplo Novina, CD0:, y Sharp, PD, Nature 2004, 430:161, y Sandy, PD, et alD, Biotechniques 2005, 39:215D
Las superficies mucosales en la interfaz entre el ambiente y el cuerpo han convertido una serie de mecanismos protectoresD Una forma principal de dicha defensa innata es limpiar estas superficies con liquidoD Normalmente, la 20 cantidad de la capa liquida sobre una superficie mucosal refleja el balance entre la secrecion liquida epitelial, que refleja frecuentemente la secrecion de aniones (Cl- y/o HCO3-) acoplada con agua (y un contra-ion de cationes), y la absorcion de liquido epitelial, que refleja frecuentemente la absorcion de Na+, acoplada con agua y contra aniones
-
(Cl- y/o HCO3)D Muchas enfermedades de las superficies mucosales estan provocadas por muy poco liquido protector en aquellas superficies mucosales creadas por un desequilibro entre la secrecion (muy poca) y absorcion 25 (relativamente mucha)D Los procesos de transporte de sal defectuosos que caracterizan estas disfunciones mucosales residen en la capa epitelial de la superficie mucosalD Un metodo para reponer la capa liquida protectora sobre las superficies mucosales es quot;re-balancearquot; el sistema al bloquear la absorcion del liquido mediada por canales de Na+D La proteina epitelial que media la etapa de limitar el indice de Na+ y la absorcion del liquido es el canal epitelial Na+ (ENaC)D Se posiciona alfa- ENaC en la superficie apical del epitelio, es decir la interfaz ambiental
30 de la superficie mucosalD La inhibicion de la absorcion del liquido mediada por Na+ mediada por alfa-ENaC puede lograr utilidad terapeuticaD Por lo tanto, subsiste una necesidad para el desarrollo de terapias efectivas para el tratamiento y prevencion de enfermedades o trastornos en los que estan implicados alfa-ENaC, por ejemplo fibrosis quistica en humanos y animales, y particularmente para terapias con alta eficienciaD Un prerequisito para alta eficiencia es que el ingrediente activo no se degrade muy rapidamente en un ambiente fisiologicoD
35 Li Tianbo et alD describe como la interferencia de ARN de alfa-ENaC inhibe la absorcion de fluido de pulmon de rata in vivo, Am Journal of Physiol Lung Cell Mol Physiol 290: L649-L660, 2006D
Resumen
En un segundo aspecto la presente invencion proporciona una composicion que comprende un agente de iARN que comprende una cadena sentido y una cadena anti-sentido, en donde:
40 aD la cadena sentido comprende por lo menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de N08496 (SEQ 10 NO: 1511), y la cadena anti-sentido comprende por lo menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena anti-sentido de N08496 (SEQ 10 NO: 1512); o
bD la cadena sentido comprende por lo menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de N08712 (SEQ 10 NO: 1637), y la cadena anti-sentido comprende por lo menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena anti-sentido de
45 N08712 (SEQ 10 NO: 1638)D
En un segundo aspecto la presente invencion proporciona una composicion que comprende un agente de iARN a alfa-ENaC, en donde el agente iARN comprende una cadena sentido y una cadena anti-sentido, en donde la cadena sentido comprende por lo menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de un agente de iARN seleccionado del grupo que consiste de N08496 (SEQ 10 NO: 1511) y N08712 (SEQ 10 NO: 1637), y en donde la cadena anti50 sentido comprende por lo menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena anti-sentido de un agente de iARN
seleccionado del grupo que consiste de N08496 (SEQ 10 NO:1512) y N08712 (SEQ 10 NO: 1638), la composicion comprende adicionalmente un ligando de receptor epitelialD
En un tercer aspecto la presente invencion proporciona una composicion que comprende un agente de iARN, como se describio aqui anteriormente, para uso en terapiaD
5 Las composiciones de la invencion, por ejemplo, las composiciones de agente iARN se pueden utilizar con cualquier dosificacion y/o formulacion descrita aqui, asi como tambien con cualquier ruta de administracion descrita aquiD
Los detalles de una o mas realizaciones de la invencion se establecen en los dibujos que acompanan y la descripcion delanteD Otras caracteristicas, objetos, y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de esta descripcion, los dibujos, y de las reivindicacionesD
10 En las Figuras:
Figura 1: Mapa de digestion de restriccion de la construccion pXoon para macaco de java a-EnaC clonadoD
Figura 2: La secuencia de A0N y proteinas del macaco de java alfa-EnaCD
Figura 3: Clonacion de los sitios de reconocimiento en el objetivo y fuera del objetivo predichos en la construccion de luciferasa dual AY535007D Los fragmentos consisten de 19nt del sitio objetivo predicho y 10 nt de la secuencia de
15 flanqueo en los extremos 5' y 3'D
0escripcion 0etallada
Para facilidad de exposicion el termino quot;nucleotidoquot; o quot;ribonucleotidoquot; se utiliza algunas veces en referencia a una o mas subunidades monomericas de un agente de ARND Se entendera que el uso del termino quot;ribonucleotidoquot; o quot;nucleotidoquot; aqui, en el caso de un ARN modificado o sustituto de nucleotido, tambien se puede referir a un
20 nucleotido modificado, o la unidad estructural de reemplazo sustituta, como se describe adicionalmente adelante, en una o mas posicionesD
Un quot;agente de ARNquot; como se utiliza aqui, es un ARN no modificado, ARN modificado, o sustituto de nucleosido, cada uno de los cuales se describe aqui o se conoce bien en la tecnica sintetica de ARND Mientras se describen numerosos ARN modificados y sustitutos de nucleosidos, los ejemplos preferidos incluyen aquellos que tienen mayor
25 resistencia a la degradacion de nucleasa que hace ARN no modificadosD Los ejemplos preferidos incluyen aquellos que tienen una modificacion de azucar 2', una modificacion en una saliente de cadena sencilla, preferiblemente una saliente de cadena sencilla 3', o, particularmente si una modificacion 5' de cadena sencilla incluye uno o mas grupos de fosfato o uno o mas analogos de un grupo de fosfatoD
Un quot;agente de iARNquot; (abreviatura para quot;agente ARN de interferenciaquot;) como se utiliza aqui, es un agente de ARN,
30 que puede regular por disminucion la expresion de un gen objetivo, por ejemp/o gen ENaC SCNN1AD Aunque no este limitado por la teoria, un agente de iARN puede actuar mediante uno o mas de una serie de mecanismos, que incluyen division post-transcripcional de un mARN objetivo algunas veces denominado en la tecnica como ARNi, o mecanismos pre-transcripcionales o pre-traduccionalesD
Un quot;agente de iARN dsquot; (abreviatura para quot;agente de iARN de cadena doblequot;), como se utiliza aqui, es un agente de
35 iARN que incluye mas de una, y preferiblemente dos, cadenas en las que la hibridacion intercadena puede formar una region de estructura de duplexD Una quot;cadenaquot; se refiere aqui a una secuencia contigua de nucleotidos (que incluyen nucleotidos que ocurren en forma no natural o modificados)D Las dos o mas cadenas pueden estar, o cada una forma parte de, moleculas separadas, o se pueden interconectar covalentemente, por ejemp/o, por un ligador, por ejemp/o, un ligador de polietilenglicol, para formar una moleculaD Por lo menos una cadena puede incluir una
40 region que es suficientemente complementaria a un ARN objetivoD 0icha cadena se denomina la quot;cadena antisentidoDquot; Una segunda cadena del agente de dsARN, que comprende una region complementaria a la cadena antisentido, se denomina la quot;cadena sentidoDquot; Sin embargo, un agente de iARN ds tambien se puede formar de una molecula de ARN unica que es por lo menos parcialmente auto-complementaria, que forma, por ejemp/o, una estructura de horquilla o de ojal, que incluyen una region duplexD La ultima se denomina aqui como ARN de horquilla
45 corta o shARND En dicho caso, el termino quot;cadenaquot; se refiere a una de las regiones de la molecula de ARN que es complementaria a otra region de la misma molecula de ARND
Aunque, en celulas de mamifero, los agentes de iARN ds largos pueden inducir la respuesta de interferon que es frecuentemente perjudicial, el agente de iARN ds corto no activa la respuesta de interferon, por lo menos no a un grado que sea perjudicial para la celula y/o anfitrion (Manche et alD, MolD CellD BiolD 12:5238, 1992; Lee et alD, Virology 50 199:491, 1994; Castelli et alD, JD ExpD MedD 186:967, 1997; Zheng et alD, RNA 10:1934, 2004; Heidel et alD, Nature BiotechnolD 22 1579)D Los agentes de iARN incluyen moleculas que son suficientemente cortas que no activan una
respuesta de interferon no especifica perjudicial en celulas de mamifero normalesD Sin embargo, la administracion de una composicion que incluye un agente de iARN (por ejemp/o, formulado como se describe aqui) a un sujeto se puede utilizar para reducir la expresion de alfa-ENaC en el sujeto, mientras elude la respuesta de interferonD Las moleculas que son suficientemente cortas que no activan una respuesta de interferon perjudicial se denominan
5 agentes de iARN o siARN aquiD Los quot;agentes de iARNquot; o quot;siARNquot; como se utiliza aqui, se refieren a un agente de iARN, por ejemp/o, un agente de iARN ds, que es suficientemente corto que no induce una respuesta de interferon perjudicial en un mamifero, y particularmente una celula de humano, por ejemp/o, tiene una region de duplex de menos de 60 pero preferiblemente menos de 50, 40, o 30 pares de nucleotidosD
Los agentes de iARN aislados descritos aqui, que incluyen agentes de iARN ds y agentes de iARN, pueden mediar
10 la expresion reducida de alfa-ENaC, por ejemp/o, mediante degradacion de ARND Para conveniencia, dicho ARN tambien se denomina como ARN que se va inactivarD 0icho acido nucleico tambien se denomina como quot;ARN objetivoquot;, algunas veces quot;molecula de ARN objetivoquot; o algunas veces quot;gen objetivoquot;D
Como se utiliza aqui, la frase quot;media ARNiquot; se refiere a la capacidad de un agente para inactivar, en una forma especifica de secuencia, un gen objetivoD quot;1nactivar un gen objetivoquot; significa el proceso por el que una celula que
15 contiene y/o expresa un cierto producto del gen objetivo cuando no esta en contacto con el agente, contendra y/o expresara por lo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, o 90 % menos de dicho producto de gen cuando se pone en contacto con el agente, cuando se compara con una celula similar que no se ha puesto en contacto con el agenteD 0icho producto del gen objetivo, por ejemplo, puede ser un ARN mensajero (mARN), una proteina, o un elemento reguladorD
20 Como se utiliza aqui, el termino quot;complementarioquot; se utiliza para indicar un grado suficiente de complementariedad de tal manera que ocurre union estable y especifica entre una molecula de ARN objetivo compuesta, por ejemp/o, mARN alfa-ENaCD La union especifica requiere un grado suficiente de complementariedad para evitar la union no especifica del compuesto oligomerico para las secuencias no objetivo bajo condiciones en las que se desea union especifica, es decir, bajo condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, o en el
25 caso de ensayos in vitro, bajo condiciones en las que se realizan los ensayosD Las secuencias no objetivo difieren normalmente de las secuencias objetivo en por lo menos 2, 3 o 4 nucleotidosD
Como se utiliza aqui, un agente de iARN es quot;suficientemente complementarioquot; a un ARN objetivo, por ejemp/o, un mARN objetivo (por ejemp/o, mARN alfa-ENaC) si el agente iARN reduce la produccion de una proteina codificada por el ARN objetivo en una celulaD El agente iARN tambien puede ser quot;exactamente complementarioquot; al ARN 30 objetivo, por ejemp/o, el ARN objetivo y el agente iARN hibrida, preferiblemente para formar un hibrido hecho exclusivamente de pares base Watson-Crick en la region de complementaridad exactaD Un agente de iARN quot;suficientemente complementarioquot; puede incluir una region interna (por ejemp/o, de por lo menos 10 nucleotidos) que es exactamente complementaria a un ARN alfa-ENaC objetivoD Mas aun, en algunas realizaciones, el agente iARN discrimina especificamente una diferencia de nucleotido unicoD En este caso, el agente iARN solo media ARNi si se
35 encuentra complementariedad exacta en la region (por ejemp/o, dentro de 7 nucleotidos de) la diferencia de nucleotido unicoD Los agentes de iARN preferidos se basaran en o consistiran de o comprenderan las secuencias sentido y antisentido proporcionadas en las Tablas 1A-10D
Como se utiliza aqui, quot;esencialmente identicoquot; cuando se utiliza se denomina a una primera secuencia de nucleotidos en comparacion con una segunda secuencia de nucleotidos significa que la primera secuencia de 40 nucleotidos es identica a la segunda secuencia de nucleotidos excepto para hasta uno, dos o tres sustituciones de nucleotidos (por ejemp/o, adenosina reemplazada por uracilo)D quot;Que retiene esencialmente la capacidad de inhibir la expresion alfa-ENaC en celulas humanas cultivadas,quot; como se utiliza aqui se denomina un agente de iARN no identico a pero derivado de uno de los agentes de iARN de las Tablas 1A-10 mediante eliminacion, adicion o sustitucion de nucleotidos, significa que el agente de iARN derivado posee una actividad inhibidora no menor de 20 45 % de la actividad inhibidora del agente iARN de las Tablas 1A-10 de la que se derivaD Por ejemplo, un agente de iARN derivado de un agente de iARN de las Tablas 1A-10 que disminuye la cantidad de mARN alfa-ENaC se presentan en celulas humanas cultivadas al 70 % lo que puede disminuir en si mismo la cantidad de mARN presente en celulas humanas cultivadas mediante por lo menos 50 % con el fin de ser considerado que retiene esencialmente la capacidad de inhibir la replicacion de alfa-ENaC en celulas humanas cultivadasD Opcionalmente, un agente de
50 iARN puede disminuir la cantidad de mARN alfa-ENaC presente en celulas humanas cultivadas en por lo menos 50 %D
Como se utiliza aqui, un quot;sujetoquot; se refiere a un organismo de mamifero que experimenta tratamiento de un trastorno mediado por alfa-ENaCD El sujeto puede ser cualquier mamifero, tal como una vaca, caballo, raton, rata, perro, cerdo, cabra, o un primateD En la realizacion preferida, el sujeto es un humanoD
55 0iseno y Seleccion de agentes de iARN
Como se utiliza aqui, quot;trastornos asociados con expresion alfa-ENaCquot; se refiere a cualquier estado biologico o patologico que (1) esta mediado por lo menos en parte por la presencia de alfa-ENaC y (2) cuyo resultado se puede efectuar al reducir el nivel del alfa-ENaC presenteD Los trastornos especificos asociados con expresion alfa-ENaC se indican adelanteD
La presente descripcion se basa en el diseno, sintesis y generacion de los agentes de iARN que dirigen alfa- ENaC y la demostracion de inactivacion del gen alfa-ENaC in vitro en celulas cultivadas despues de incubacion con un 5 agente de iARN, y el efecto protector resultante hacia trastornos mediados por alfa-ENaCD
Un agente de iARN se puede disenar racionalmente con base en informacion de secuencia y caracteristicas deseadasD Por ejemplo, un agente de iARN se puede disenar de acuerdo con la temperatura de fusion relativa del duplex candidatoD 0e manera general, el duplex tendria una temperatura de fusion inferior en el extremo 5' de la cadena anti-sentido que en el extremo 3' de la cadena anti-sentidoD
10 La presente descripcion proporciona composiciones que contienen siARN y/o shARN dirigidos a uno o mas transcriptos alfa-ENaCD
Para cualquier objetivo de gen particular que se seleccione, el diseno de los siARN o shARN para uso de acuerdo con la presente descripcion seguira preferiblemente ciertas directricesD Tambien, en muchos casos, el agente que se suministra a una celula de acuerdo con la presente descripcion puede experimentar una o mas etapas de
15 procesamiento antes de llegar a ser un agente supresor activo (vease adelante para discusion adicional); en dichos casos, aquellas personas medianamente versadas en la tecnica apreciaran que el agente relevante se disenara preferiblemente para incluir secuencias que pueden ser necesarias para su procesamientoD
Las enfermedades mediadas por disfuncion epitelial del canal de sodio, incluyen enfermedades asociadas con la regulacion de volumenes de fluido a traves de las membranas epitelialesD Por ejemplo, el volumen de liquido de la 20 superficie de las vias respiratorias es un regulador clave para depuracion mucociliar y el mantenimiento de la salud de los pulmonesD El bloqueo epitelial del canal de sodio promovera la acumulacion de fluidos en el lado mucosal del epitelio de las vias respiratorias promoviendo por lo tanto la depuracion de moco y evitando la acumulacion del moco y esputo en tejidos respiratorios (que incluyen vias respiratorias del pulmon)D 0ichas enfermedades incluyen enfermedades respiratorias, tal como fibrosis quistica, disquinesia ciliar primaria, bronquitis cronica, enfermedad 25 pulmonar obstructiva cronica (COP0), asma, infecciones del tubo respiratorio (agudas y cronicas; viricas y bacterianas) y carcinoma de pulmonD Enfermedades mediadas por bloqueo epitelial del canal de sodio tambien incluyen enfermedades diferentes a enfermedades respiratorias que se asocian con regulacion anormal de fluidos a traves del epitelio, implicando quizas la fisiologia anormal de los liquidos de superficie protectores en su superficie, por ejemplo, xerostomia (boca seca) o queratoconjuntivitis sire (ojos secos)D Adicionalmente, el bloqueo epitelial del
30 canal de sodio en el rinon se puede utilizar para promover diuresis e inducir por lo tanto un efecto hipotensivoD
El tratamiento puede ser sintomatico o profilacticoD
El asma incluye asma intrinseca (no alergica) y asma extrinseca (alergica), asma leve, asma moderada, asma severa, asma bronquitica, asma inducida por ejercicio, asma ocupacional y asma inducida luego de infeccion bacterianaD El tratamiento de asma tambien se entiende que abarca el tratamiento de sujetos, por ejemplo, de
35 menos de 4 o 5 anos de edad, que exhiben sintomas de respiracion sibilante y diagnosticos o diagnosticables como quot;lactantes sibilantesquot;, una categoria establecida de paciente de preocupacion medica importante y ahora frecuentemente identificado como asmaticos incipientes o de fase tempranaD (Para conveniencia esta afeccion asmatica particular se denomina como quot;sindrome de lactante sibilantequot;D)
La eficacia profilactica en el tratamiento de asma se evidenciara por frecuencia reducida o severidad de ataque
40 sintomatico, por ejemplo, de ataque broncoconstrictor o asmatico agudo, que mejora la funcion del pulmon o mejora la hiper-reactividad de las vias respiratoriasD Se puede evidenciar adicionalmente mediante requerimiento reducido por otro, terapia sintomatica, es decir, terapia para o que pretende restringir o abortar el ataque sintomatico cuando ocurre, por ejemplo, anti-inflamatorio (por ejemplo, corticosteroides) o broncodilatadorD El beneficio profilactico en asma puede, en particular, ser evidente en sujetos propensos a quot;depresion matutinaquot;D La quot;depresion matutinaquot; es un
45 sindrome asmatico reconocido, comun para un porcentaje sustancial de asmaticos y caracterizado por ataque de asma, por ejemplo, entre las horas de aproximadamente 4-6 am, es decir, en un periodo normalmente sustancialmente distante de cualquier terapia de asma sintomatica administrada previamenteD
La enfermedad pulmonar obstructiva cronica incluye bronquitis cronica o disnea asociada con esta, enfisema, asi como tambien exacerbacion de hiper-reactividad de las vias respiratorias posterior a otra terapia de farmaco, en
50 particular, otra terapia de farmaco inhaladaD La descripcion tambien es aplicable al tratamiento de bronquitis de cualquier tipo o genero que incluye, por ejemplo, bronquitis aguda, araquidica, catarral, croupus, cronica o ftinoideD
Con base en los resultados mostrados aqui, la presente descripcion proporciona agentes de iARN que reducen la expresion de alfa-ENaC en celulas cultivadas y en un sujeto, por ejemplo un mamifero, por ejemplo un humanoD Las Tablas 1A-10 proporcionan agentes de iARN de ejemplo que dirigen alfa-ENaC, con base en abreviaturas de nomenclatura estandar dadas en la Tabla AD
La Tabla 1A, Seq 1d NoDs 305-608, Tabla 1B y Tabla 10, Seq 1d NoDs 1519-1644 enumera los siARN que no comprenden modificaciones de nucleotidos excepto para un enlace fosforotioato entre el terminal 3' y las penultimas
5 timidinasD Las Seq 1ds restantes en las Tablas 1A-10 enumeran los siARN en donde todos los nucleotidos que comprenden bases pirimidina son nucleotidos modificados 2'-Ometil en la cadena sentido, y todas las uridinas en un contexto de secuencia de 5'-ua-3' asi como tambien todas las citidinas en un contexto de secuencia de o 5'-ca-3' son nucleotidos modificados 2'-O-metilo en la cadena anti-sentidoD
Con base en estos resultados, la descripcion proporciona especificamente un agente de iARN que incluye una
10 cadena sentido que tiene por lo menos 15 nucleotidos contiguos de las secuencias de la cadena sentido de los agentes proporcionados en las Tablas 1A-10, y una cadena anti-sentido que tiene por lo menos 15 nucleotidos contiguos de las secuencias anti-sentido de los agentes proporcionados en las Tablas 1A-10D
Los agentes iARN mostrados en las Tablas 1A-10 estan compuestos de dos cadenas de 19 nucleotidos de longitud que son complementarias o identicas a la secuencia objetivo, mas una saliente 3'-TTD La presente descripcion 15 proporciona agentes que comprenden por lo menos 15, o por lo menos 16, 17, o 18, o 19 nucleotidos contiguos de estas secuenciasD Sin embargo, mientras que estas longitudes pueden ser potencialmente optimas, no significa que los agentes de iARN se limiten a estas longitudesD El experto esta consciente que los agentes de iARN mas cortos o mas largos pueden ser de forma similar efectivos, en razon a que, dentro de ciertos rangos de longitud, la eficacia es mas bien una funcion de la secuencia de nucleotidos que la longitud de la cadenaD Por ejemplo, Yang, et alD, PNAS
20 99:9942-9947 (2002), demuestra eficacias similares para los agentes de iARN de longitudes entre 21 y 30 pares baseD Otros han mostrado inactivacion efectiva de genes mediante agentes de iARN hasta una longitud de aproximadamente 15 pares base (Byrom, et a/., quot;1nducing RNAi with siRNA Cocktails Generated by RNase 111quot; Tech Notes 10(1), Ambion, 1ncD, Austina, TX)D
Por lo tanto, es posible y se contempla seleccionar las secuencias proporcionadas en las Tablas 1A-10 una
25 secuencia parcial de entre 15 a 19 nucleotidos para la generacion de un agente de iARN derivado de una de las secuencias proporcionadas en las Tablas 1A-10D Alternativamente, uno puede agregar uno o varios nucleotidos a una de las secuencias proporcionadas en las Tablas 1A-10, o un agente que comprende 15 nucleotidos contiguos de uno de estos agentes, preferiblemente, pero no necesariamente, en tal una forma que los nucleotidos agregados son complementarios a la secuencia respectiva del gen objetivo, por ejemp/o, alfa-ENaCD Por ejemplo, los primeros
30 15 nucleotidos de uno de los agentes se pueden combinar con los 8 nucleotidos encontrados 5' a esta secuencia en mARN alfa-ENaC para obtener un agente con 23 nucleotidos en la cadena sentido y anti-sentidoD Todos dichos agentes de iARN derivados se incluyen en los agentes iARN, proporcionados que retienen esencialmente la capacidad de inhibir la replicacion alfa- ENaC en celulas humanas cultivadasD
La cadena anti-sentido de un agente de iARN debe ser igual a o por lo menos, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 25, 29, 40, o
35 50 nucleotidos de longitudD 0ebe ser igual a o menos de 60, 50, 40, o 30, nucleotidos de longitudD Los rangos preferidos tienen 15-30, 17 a 25, 19 a 23, y 19 a 21 nucleotidos de longitudD
La cadena sentido de un agente de iARN debe ser igual a o por lo menos 14, 15, 16 17, 18, 19, 25, 29, 40, o 50 nucleotidos de longitudD 0ebe ser igual a o menor de 60, 50, 40, o 30 nucleotidos de longitudD Los rangos preferidos son 15-30, 17 a 25, 19 a 23, y 19 a 21 nucleotidos de longitudD
40 La porcion de cadena doble de un agente de iARN debe ser igual a o por lo menos, 15, 16 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 29, 40, o 50 pares de nucleotidos de longitudD 0ebe ser igual a o menos de 60, 50, 40, o 30 pares de nucleotidos de longitudD Los rangos preferidos tienen 15-30, 17 a 25, 19 a 23, y 19 a 21 pares de nucleotidos de longitudD
0e manera general, los agentes iARN incluyen una region de suficiente complementariedad al mARN alfa-ENaC, y
45 son de suficiente longitud en terminos de nucleotidos, que el agente iARN, o un fragmento del mismo, pueden mediar la regulacion por disminucion del gen alfa-ENaCD No es necesario que haya complementariedad perfecta entre el agente iARN y el gen objetivo, pero la correspondencia puede ser suficiente para permitir que el agente iARN, o un producto de division del mismo, dirija la inactivacion especifica de secuencia, por ejemp/o, mediante division de ARNi de un mARN alfa-ENaCD
50 Por lo tanto, los agentes de iARN incluyen agentes que comprenden una cadena sentido y cadena anti-sentido cada una comprende una secuencia de por lo menos 16, 17 o 18 nucleotidos que es esencialmente identica, como se define adelante, una de las secuencias de las Tablas 1A-10, excepto que no mas de 1, 2 o 3 nucleotidos por cadena, respectivamente, se han sustituido por otros nucleotidos (por ejemp/o adenosina reemplazada por uracilo), mientras que retiene esencialmente la capacidad de inhibir la expresion alfa-ENaC en celulas humanas cultivadasD
55 Estos agentes por lo tanto poseeran por lo menos 15 nucleotidos identicos a una de las secuencias de las Tablas 1A-10, pero se introducen 1, 2 o 3 emparejamientos incorrectos base con respecto a la secuencia alfa-ENaC objetivo o entre la cadena sentido y anti-sentidoD Los emparejamientos incorrectos para la secuencia de ARN alfa-ENaC objetivo, particularmente en la cadena anti-sentido, son mas tolerados en las regiones terminales y si estan presentes estan preferiblemente en una region o regiones terminales, por ejemp/o, dentro de 6, 5, 4, o 3 nucleotidos
5 de un terminal 5' y/o 3', mas preferiblemente dentro de 6, 5, 4, o 3 nucleotidos del terminal 5' de la cadena sentido o el terminal 3' de la cadena anti-sentidoD La cadena sentido solo necesita ser suficientemente complementaria con la cadena anti-sentido para mantener el caracter de cadena doble general de la moleculaD
Se prefiere que las cadenas sentido y anti-sentido sean seleccionadas de tal manera que el agente iARN incluya una region no apareada o de cadena sencilla en uno o ambos extremos de la moleculaD Sin embargo, un agente de iARN 10 contiene las cadenas sentido y anti-sentido, preferiblemente pareadas por contener una saliente, por ejemp/o, una o dos salientes 5' o 3' pero preferiblemente una saliente 3' de 2-3 nucleotidosD La mayoria de realizaciones tendra una saliente 3'D Los agentes de iARN preferidas tendran salientes de cadena sencilla, preferiblemente salientes 3', de 1 a 4, o preferiblemente 2 o 3 nucleotidos, de longitud, en uno o ambos extremos del agente iARND Las salientes pueden ser el resultado de una cadena mayor que la otra, o el resultado de dos cadenas de la misma longitud que esta en
15 forma de etapasD Los nucleotidos no apareados que forman la saliente pueden ser ribonucleotidos, o pueden ser desoxiribonucleotidos, preferiblemente timidinaD Los extremos 5' preferiblemente se fosforilan, o pueden ser no fosforiladosD
Las longitudes preferidas para la region duplex tienen entre 15 y 30, mas preferiblemente 18, 19, 20, 21, 22, y 23 nucleotidos de longitud, por ejemp/o, en el rango de agentes de iARN discutido anteriormenteD Los agentes de iARN
20 pueden asemejarse en longitud y estructura a los productos procesados naturales 0icer de dsARN largosD Tambien se incluyen las realizaciones en las que las dos cadenas de los agentes de iARN se ligan, por ejemp/o, se ligan covalentementeD Las estructuras de horquilla, u otras estructuras de cadena sencilla que proporcionan la region de cadena doble requerida, y preferiblemente una saliente 3' tambien estan dentro de la descripcionD
Evaluacion de Agentes de iARN Candidatos
25 Como se indico anteriormente, la presente descripcion proporciona un sistema para identificar los siARN que son utiles como inhibidores de alfa-ENaCD 0ebido a esto, como se indico anteriormente, los shARN se procesan intracelularmente para producir los siARN que tienen porciones duplex con la misma secuencia que la estructura de tallo del shARN, el sistema es igualmente util para identificar los shARN que son utiles como inhibidores de alfa-ENaCD Para propositos de descripcion esta seccion se referira a los siARN, pero el sistema tambien abarca los
30 shARN correspondientesD Especificamente, la presente descripcion demuestra la preparacion exitosa de los siARN dirigidos para inhibir la actividad de alfa-ENaCD Las tecnicas y reactivos descritos aqui se pueden aplicar facilmente para disenar nuevos siARN potenciales, dirigidos a otros genes o regiones de gen, y probados para su actividad en la inhibicion la alfa- ENaC como se discute aquiD
En diversas realizaciones se pueden probar los inhibidores alfa-ENaC potenciales para la supresion de la expresion
35 endogena de alfa- ENaC al introducir los siARN candidatos en celulas (por ejemplo, mediante la administracion exogena o al introducir un vector o construccion que dirige la sintesis endogena de siARN en la celula), o en animales de laboratorio mediante administracion pulmonar o nasalD Alternativamente, se pueden probar inhibidores alfa-ENaC potenciales in vitro mediante co-transfeccion transitoria de los siARN candidatos junto con un plasmido de expresion alfa-ENaCD Luego se evalua la capacidad del siARN candidato para reducir los niveles de transcripto
40 objetivo y/o para inhibir o suprimir uno o mas aspectos o caracteristicas de actividad alfa-ENaC tal como diferencia potencial epitelial o la absorcion de fluidos de la superficie de las vias respiratoriasD
Las celulas o animales de laboratorio a las que se ha suministrado composiciones de siARN de la invencion (celulas/animales de prueba) se pueden comparar con celulas similares o comparables o animales de laboratorio que no han recibido la composicion de la invencion (celulas/animales de control, por ejemplo, celula/animales que no 45 han recibido siARN o un siARN de control tal como un siARN objetivo para un transcripto no endogeno tal como proteina fluorescente verde (GFP))D El fenotipo de transporte de iones de las celulas/animales de prueba se puede comparar con el fenotipo de celulas/animales de control, dado que el siARN de la invencion comparte la reactividad cruzada de la secuencia con el tipo de celula/especie de pruebaD La produccion de la proteina alfa-ENaC y la corriente de circuito corto (in vitro o ex vivo) se puede comparar en las celulas/animales de prueba con relacion a las 50 celulas/animales de controlD Otros indicios de actividad alfa-ENaC, que incluyen diferencia potencial epitelial ex vivo
o depuracion mucociliar in vivo o formacion de imagenes magnetica de cuerpo completo (MR1), se puede comparar de forma similarD 0e manera general, las celulas/animales de prueba y las celulas/animales de control serian de la misma especie y, para celulas, del tipo de celula similar o identicoD Por ejemplo, se pueden comparar celulas de la misma estirpe celularD Cuando la celula de prueba es una celula primaria, normalmente la celula de control tambien
55 seria una celula primariaD
Por ejemplo, la capacidad de un siARN candidato para inhibir la actividad de alfa-ENaC se puede determinar convenientemente al (i) suministrar el siARN candidato a las celulas (ii) evaluar los niveles de expresion de mARN alfa-ENaC con relacion a un gen de control endogenamente expresado (iii) comparar la corriente sensible amiloide en un modelo de celula in vitro producido en la presencia del siARN con la cantidad producida en la ausencia del siARND Este ultimo ensayo se puede utilizar para probar los siARN que dirigen cualquier transcripto objetivo que pueden influenciar la actividad alfa-ENaC indirectamente y no se limita a los siARN que dirigen los transcriptos que codifican las subunidades de canal ENaCD
5 La capacidad de un siARN candidato para reducir el nivel del transcripto objetivo se pueden evaluar al medir la cantidad del transcripto objetivo utilizando, por ejemplo, Northern blot, ensayos de proteccion de nucleasa, hibridacion de sonda, transcripcion inversa (RT)-PCR, RT-PCR en tiempo real, analisis de micromatriz, etcD La capacidad de un siARN candidato para inhibir la produccion de un polipeptido codificado por un transcripto objetivo (en el nivel transcripcional o post-transcripcional) se puede medir utilizando una variedad de metodos basados en
10 anticuerpo que incluyen, pero no se limitan a, Western blot, inmunoensayos, EL1SA, citometria de flujo, micromatrices de proteina, etcD En general, se puede utilizar cualquier metodo para medir la cantidad de transcripto objetivo o un polipeptido codificado por el transcripto objetivoD
En general, ciertos inhibidores de alfa-ENaC iARN preferidos reducen el nivel de transcripto objetivo por lo menos aproximadamente 2 veces, preferiblemente por lo menos aproximadamente 4 veces, mas preferiblemente por lo 15 menos aproximadamente 8 veces, por lo menos aproximadamente 16 veces, por lo menos aproximadamente 64 veces o a un grupo incluso mayor con relacion al nivel que estaria presente en la ausencia del inhibidor (por ejemplo, en una celula de control comparable que carece del inhibidor)D En general, ciertos inhibidores alfa-ENaC iARN preferidos inhiben la actividad del canal ENaC, de tal manera que la actividad es menor en una celula que contiene el inhibidor que en una celula de control que no contiene el inhibidor mediante por lo menos
20 aproximadamente 2 veces, preferiblemente por lo menos aproximadamente 4 veces, mas preferiblemente por lo menos aproximadamente 8 veces, por lo menos aproximadamente 16 veces, por lo menos aproximadamente 64 veces, por lo menos aproximadamente 100 veces, por lo menos aproximadamente 200 veces, o a un grado incluso mayorD
Ciertos inhibidores alfa-ENaC iARN preferidos inhiben la actividad de canal ENaC durante por lo menos 12 horas,
25 por lo menos 24 horas, por lo menos 36 horas, por lo menos 48 horas, por lo menos 60 horas, por lo menos 72 horas, por lo menos 96 horas, por lo menos 120 horas, por lo menos 144 horas o por lo menos 168 horas luego de la administracion del siARN e infeccion de las celulasD Ciertos inhibidores alfa-ENaC preferidos evitan (es decir, reducen los niveles no detectables) o reducen significativamente la actividad alfa-ENaC durante por lo menos 24 horas, por lo menos 36 horas, por lo menos 48 horas, o por lo menos 60 horas luego de la administracion del siARND
30 0e acuerdo con diversas realizaciones una reduccion significativa en la actividad de alfa-ENaC es una reduccion a menos de aproximadamente 90 % del nivel que ocurriria en la ausencia del siARN, una reduccion de menos de aproximadamente 75 % del nivel que ocurriria en la ausencia del siARN, una reduccion de menos de aproximadamente 50 % del nivel que ocurriria en la ausencia del siARN, una reduccion de menos de aproximadamente 25 % del nivel que ocurriria en la ausencia del siARN, o una reduccion de menos de
35 aproximadamente 10 % del nivel que ocurriria en la ausencia del siARND La reduccion en la actividad de alfa-ENaC se puede medir utilizando cualquier metodo adecuado que incluye, pero no se limita a, medicion de corriente del circuito corto de sensibilidad amiloide e in vitro, /a diferencia potencia/ epitelial ex vivo o in vivo de depuracion mucociliar o MR1 de cuerpo/pulmon completoD
Prueba de estabilidad, modificacion, y nuevo ensayo de agentes de iARN
40 Se puede evaluar un agente de iARN candidato con respecto a la estabilidad, por ejemp/o, su susceptibilidad a la division mediante una endonucleasa o exonucleasa, tal como cuando el agente iARN se introduce en el cuerpo de un sujetoD Se pueden emplear metodos para identificar sitios que son susceptibles a modificacion, particularmente division, por ejemp/o, division mediante un componente encontrado en el cuerpo de un sujetoD 0ichos metodos puede incluir el aislamiento e identificacion de fragmentos mas abundantes formados mediante degradacion del
45 agente de iARN candidato despues de su incubacion con medio biologico aislado in vitro, por ejemplo suero, plasma, esputo, fluido cerebroespinal, o celula o homogenatos de tejido, o despues de poner en contacto un sujeto con el agente de iARN candidato in vivo, identificando por lo tanto sitios propensos a divisionD 0ichos metodos estan, por ejemplo, sin limitacion, en la Publicacion de Solicitud de Patente 1nternacional NoD WO2005115481, presentada en Mayo 27, 2005D
50 Cuando se identifican sitios susceptibles a division, se puede disenar un agente de iARN adicional y/o sintetizar en donde el sitio de division potencial se hace resistente a division, por ejemp/o mediante la introduccion de una modificacion 2' en el sitio de division, por ejemp/o un grupo 2'-O-metiloD Este agente de iARN adicional se puede volver a probar para estabilidad, y este proceso se puede reiterar hasta que se encuentra que un agente de iARN exhibe la estabilidad deseadaD
55 Prueba In Vivo
Un agente de iARN identificado como que es capaz de inhibir la expresion genica alfa-ENaC se puede probar para funcionalidad in vivo en un modelo de animal (por ejemp/o, en un mamifero, tal como en raton, rata, conejillo de indias o primate)D Por ejemplo, el agente de iARN se puede administrar a un animal, y el agente iARN evaluado con respecto a su biodistribucion, estabilidad, y su estabilidad para inhibir la expresion alfa-ENaC o modular un proceso patologico o biologico mediado por lo menos en parte por alfa-ENaCD
El agente iARN se puede administrar directamente al tejido objetivo, tal como mediante inyeccion, o el agente iARN
5 se puede administrar al modelo de animal de la misma forma que se administraria a un humanoD Preferiblemente, el agente iARN se suministra las vias respiratorias del sujeto, tal como mediante administracion intranasal, inhalada o intratraquealD
El agente iARN tambien se puede evaluar para su distribucion intracelularD La evaluacion puede incluir determinar si el agente iARN se toma en la celulaD La evaluacion tambien puede incluir determinar la estabilidad (por ejemp/o, la
10 vida util) del agente iARND Se puede facilitar la evaluacion de un agente de iARN in vivo mediante el uso de un agente de iARN conjugado con un marcador trazable (por ejemp/o, un marcador fluorescente tal como fluoresceina; una etiqueta radioactiva, tal como 35S, 32P, 33P, o 3H; particulas de oro; o particulas de antigeno para inmunohistoquimica)D
El agente iARN se puede evaluar con respecto a su capacidad de regular por disminucion la expresion de alfa- alfa15 ENaCD Los niveles de expresion genica alfa-ENaC in vivo se pueden medir, por ejemplo, mediante hibridacion in situ,
o mediante el aislamiento de ARN del tejido antes de y luego de exposicion al agente iARND Cuando el animal necesita ser sacrificado con el fin de cosechar el tejido, un animal de control no tratado servira para comparacionD Se puede detectar el ARN alfa-ENaC mediante cualquier metodo deseado, que incluye pero no se limita a RT-PCR, northern blot, ensayo de A0N ramificado, o ensayo de proteccion de ARNasaD Alternativamente, o adicionalmente, la
20 expresion genica alfa-ENaC se puede supervisar al realizar analisis western blot o inmunotincion en extractos de tejido tratados con el agente iARND
Se pueden probar inhibidores alfa-ENaC potenciales utilizando cualquier variedad de modelos de animal que se han desarrolladoD Las composiciones que comprenden los siARN candidatos, construcciones o vectores capaces de dirigir la sintesis de dichos siARN dentro de una celula anfitriona, o celulas construidas por ingenieria o manipuladas 25 para contener los siARN candidatos se pueden administrar a un animalD Se evalua la capacidad de la composicion para suprimir la expresion alfa-ENaC y/o para modificar los fenotipos dependientes de ENaC y/o disminuir su severidad con relacion a animales que no reciben el inhibidor alfa-ENaC potencialD 0ichos modelos incluyen, pero no se limitan a, modelos de murino, rata, conejillo de indias, oveja y primate diferente a humano para fenotipos dependientes de ENaC, todos los cuales se conocen en la tecnica y se utilizan para probar la eficacia de los
30 terapeuticos potenciales alfa-ENaCD
Utilizando los sistemas inventados para identificar los agentes de iARN terapeuticos candidatos, los agentes terapeuticos adecuados se seleccionan de identificadores 0uplex N0-8302, N0-8332, N0-8348, N0-8356, N0-8357, N0-8373, N0-8381, N0-8396, N0-8450 y N0-8453, se selecciona mas adecuadamente de N0-8356, N0-8357 y N0-8396D
35 Quimica de iARN
Se describen aqui agentes de iARN aislada, por ejemp/o, agentes de ARN ds RNA que median ARNi para inhibir la expresion del gen alfa-ENaCD
Los agentes de ARN discutidos aqui incluyen ARN no modificado de otra forma asi como tambien ARN que se ha modificado, por ejemp/o, para mejorar la eficacia, y polimeros de sustituto de nucleosidosD El ARN no modificado se 40 refiere a una molecula en la que los componentes de acido nucleico, a saber azucares, bases, y unidades estructurales de fosfato, son iguales o esencialmente iguales a lo que ocurre en la naturaleza, preferiblemente cuando ocurren en forma natural en el cuerpo humanoD La tecnica se denomina rara o inusual, pero ocurren en forma natural, los ARN como ARN modificados, vease, por ejemp/o, Limbach et alD Nucleic Acids ResD 22: 21832196, 1994D 0ichos ARN ratos o inusuales, frecuentemente denominados ARN modificados (evidentemente debido a 45 que son normalmente el resultado de una modificacion post-transcripcional) estan dentro del termino ARN no modificado, como se utiliza aquiD El ARN modificado como se utiliza aqui se refiere a una molecula en la que uno o mas de los componentes de acido nucleico, a saber azucares, bases, y unidades estructurales de fosfato, son diferentes de las que ocurren en la naturaleza, preferiblemente diferentes de lo que ocurre en el cuerpo humanoD Aunque no se denominen como quot;ARN,quot; modificados estos por supuesto, debido a la modificacion, incluiran
50 moleculas que no son ARND Los sustitutos de nucleosido son moleculas en las que la estructura principal de ribofosfato se reemplaza con una construccion de no ribofosfato permitiendo a las bases presentadas en relacion espacial correcta tal como hibridacion sean sustancialmente similares a aquella vista con una estructura principal de ribofosfato, por ejemp/o, imitadores no cargados de la estructura principal de ribofosfatoD Ejemplos de lo anterior se discuten aquiD
Las modificaciones descritas aqui se pueden incorporar cualquier ARN de cadena doble y molecula similar a ARN descrita aqui, por ejemp/o, un agente de iARND Puede ser deseable modificar una o ambas cadenas sentido y antisentido de un agente de iARND Los acidos nucleicos son polimeros de subunidades o monomeros, muchas de las modificaciones descritas adelante ocurren en una posicion que se repite dentro de un acido nucleico, por ejemp/o, 5 una modificacion de una base, o una unidad estructural de fosfato, o el oxigeno no ligador de una unidad estructural de fosfatoD En algunos casos la modificacion ocurrira en todas las posiciones del sujeto en el acido nucleico pero en muchos, y de hecho en la mayoria, de los casos no ocurriraD Por via de ejemplo, solo puede ocurrir una modificacion en una posicion terminal 3' o 5', solo puede ocurrir en una region terminal, por ejemp/o en una posicion de nucleotido terminal o en los ultimos 2, 3, 4, 5, o 10 nucleotidos de una cadenaD Puede ocurrir una modificacion en una region de 10 cadena doble, una region de cadena sencilla, o en ambosD Por ejemplo, una modificacion de fosforotioato en una posicion O no ligadora solo puede ocurrir en uno o ambos terminales, solo puede ocurrir en regiones terminales, por ejemp/o, en una posicion en el nucleotido terminal o en los ultimos 2, 3, 4, 5, o 10 nucleotidos de una cadena, o puede ocurrir en regiones de cadena doble y de cadena sencilla, particularmente en el terminalD 0e forma similar, puede ocurrir una modificacion en la cadena sentido, cadena anti-sentido, o ambasD En algunos casos, la cadena
15 sentido y anti-sentido tendra las mismas modificaciones o la misma clase de modificaciones, pero en otros casos la cadena sentido y anti-sentido tendra diferentes modificaciones, por ejemp/o, en algunos casos puede ser deseable modificar solo una cadena, por ejemp/o la cadena sentidoD
0os objetivos primarios para la introduccion de las modificaciones en los agente de iARN es su estabilizacion hacia la degradacion en ambientes biologicos y la mejora de propiedades farmacologicas, por ejemp/o propiedades 20 farmacodinamicas, que se discuten adicionalmente adelanteD Otras modificaciones adecuadas para un azucar, base,
o estructura principal de un agente de iARN se describen en la Solicitud PCT NoD PCT/US2004/01193, presentada en Enero 16, 2004D Un agente de iARN puede incluir una base que no ocurre en forma natural, tal como las bases descritas en la Solicitud PCT NoD PCT/US2004/011822, presentada en Abril 16, 2004D Un agente de iARN puede incluir un azucar que no ocurre en forma natural, tal como una molecula de portador ciclica sin carbohidratoD Las
25 caracteristicas de ejemplo de azucares que no ocurren en forma natural para uso en agentes de iARN se describen en la Solicitud PCT NoD PCT/US2004/11829, presentada en Abril 16, 2003D
Un agente de iARN puede incluir un enlace de internucleotido (por ejemp/o, el enlace de fosforotioato quiral) util para aumentar la resistencia de nucleasaD Adicionalmente, o en la alternativa, un agente de iARN puede incluir un imitador de ribosa para el aumento de la resistencia de nucleasaD Los enlaces de internucleotidos de ejemplo e
30 imitadores de ribosa para aumento de la resistencia de nucleasa se describen en la Solicitud PCT NoD PCT/US2004/07070, presentada en Marzo 8, 2004D
Un agente de iARN puede incluir subunidades de monomero conjugados de ligando y monomeros para sintesis de oligonucleotidoD Los monomeros de ejemplo se describen en la Solicitud Estadounidense NoD 10/916,185, presentada en Agosto 10, 2004D
35 Un agente de iARN puede tener una estructura ZXY, tal como se describe en la Solicitud PCT NoD PCT/US2004/07070, presentada en Marzo 8, 2004D
Un agente de iARN se puede complejar con una unidad estructural amfipaticaD Las unidades estructurales amfipaticas de ejemplo para uso con agentes de iARN se describen en la Solicitud PCT NoD PCT/US2004/07070, presentada en Marzo 8, 2004D
40 En otra realizacion, el agente iARN se puede complejar a un agente de suministro que caracteriza un complejo modularD El complejo puede incluir un agente portador ligado a uno o mas de (preferiblemente dos o mas, mas preferiblemente todos los tres de): (a) un agente de condensacion (por ejemp/o, un agente capaz de atraer, por ejemp/o, unir, un acido nucleico, por ejemp/o, a traves de interaccion ionica o electroestatica); (b) un agente fusogenico (por ejemp/o, un agente capaz de fusionar y/o ser transportado a traves de una membrana celular); y (c)
45 un grupo objetivo, por ejemp/o, un agente objetivo de celula o tejido, por ejemp/o, una lectina, glucoproteina, lipido o proteina, por ejemp/o, un anticuerpo, que se une a un tipo celular especificoD Los agentes de iARN complejados a un agente de suministro se describen en la Solicitud PCT NoD PCT/US2004/07070, presentada en Marzo 8, 2004D
Un agente de iARN puede tener pares no canonicos, tal como entre las secuencias sentido y antisentido del duplex iARND Las caracteristicas de ejemplo de los agentes de iARN no canonicos se describen en la Solicitud PCT NoD
50 PCT/US2004/07070, presentada en Marzo 8, 2004D
Resistencia de nucleasa mejorada
Un agente de iARN, por ejemp/o, un agente de iARN que dirige alfa-ENaC, puede tener resistencia mejorada a las nucleasasD
Una forma de aumentar la resistencia es identificar los sitios de division y modificar dichos sitios para inhibir la division, como se describe en la Solicitud Estadounidense NoD 60/559,917, presentada en Mayo 4, 2004D Por ejemplo, los dinucleotidos 5'-ua-3', 5'-ca-3', 5'-ug-3', 5'-uu-3', o 5'-cc-3' pueden servir como sitios de divisionD En ciertas realizaciones, todas las pirimidinas de un agente de iARN llevan una modificacion 2' en la cadena sentido, la 5 cadena anti-sentido, o ambas cadenas, y el agente iARN por lo tanto tiene resistencia mejorada a las endonucleasasD Tambien se puede lograr resistencia mejorada de nucleasa al modificar el nucleotido 5', que resulta, por ejemplo, en por lo menos un dinucleotido 5'-uridina-adenina-3' (5'-ua-3') en donde la uridina es un nucleotido modificado 2'; por lo menos un dinucleotido 5'-citidina-adenina-3' (5'-ca-3'), en donde la 5'-citidina es un nucleotido modificado 2'; por lo menos un dinucleotido 5'-uridina-guanina-3' (5'-ug-3'), en donde la 5'-uridina es un nucleotido modificado 2'; por lo menos un dinucleotido 5'-uridina-uridina-3' (5'-uu-3'), en donde la 5'-uridina es un nucleotido modificado 2'; o por lo menos un dinucleotido 5'-citidina-citidina-3' (5'-cc-3'), en donde la 5'-citidina es un nucleotido modificado 2', como se describe en la Solicitud 1nternacional NoD PCT/US2005/018931, presentada en Mayo 27, 2005D El agente iARN puede incluir por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4 o por lo menos 5 de dichos dinucleotidosD En una realizacion particularmente preferida, el nucleotido 5' en todas la ocurrencias de los motivos de
15 secuencia 5'-ua-3' y 5'-ca-3' en la cadena sentido, la cadena anti-sentido, o ambas cadenas es un nucleotido modificadoD Preferiblemente, el nucleotido 5' en todas la ocurrencias de los motivos de secuencia 5'-ua-3', 5'-ca-3' y 5'-ug-3' en la cadena sentido, la cadena anti-sentido, o ambas cadenas es un nucleotido modificadoD Mas preferiblemente, todos los nucleotidos pirimidina en la cadena sentido son nucleotidos modificados, y el nucleotido 5' en todas la ocurrencias de los motivos de secuencia 5'-ua-3' y 5'-ca-3' en la cadena anti-sentido son nucleotidos modificados, o en donde la cadena anti-sentido no comprende ni un motivo 5'-ua-3' ni un motivo 5'-ca-3', en todas la ocurrencias del motivo de secuencia 5'-ug-3'D
Preferiblemente, el nucleotido modificado 2' incluye, por ejemplo, una unidad de ribosa modificada 2', por ejemp/o, el grupo 2'-hidroxilo (OH) se puede modificar o reemplazar con una serie de diferentes sutituyentes quot;oxiquot; o quot;desoxiquot;D
Ejemplos de modificaciones del grupo hidroxilo quot;oxiquot;-2' incluyen alcoxi o ariloxi (OR, por ejemp/o, R = H, alquilo,
25 cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo o azucar); polietilenglicoles (PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR; acidos nucleicos quot;bloqueadosquot; (LNA) en los que se conecta el hidroxilo 2', por ejemp/o, mediante un puente de metileno, para el carbono 4' del mismo azucar ribosa; O-AM1NA y aminoalcoxi, O(CH2)nAM1NA, (por ejemp/o, AM1NA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclil amino, arilamino, diaril amino, heteroaril amino, o diheteroaril amino, etileno diamina, poliamino)D Es de destacar que los oligonucleotidos que contienen solo el grupo metoxietilo group (MOE), (OCH2CH2OCH3, un derivado PEG), exhibe estabilidades de nucleasa comparables con aquellas modificadas con la modificacion robusta de fosforotioatoD
Las modificaciones quot;desoxiquot; incluyen hidrogeno (es decir azucares desoxiribosa, que son de relevancia particular a las porciones salientes parcialmente del ARN ds); halo (por ejemp/o, fluoro); amino (por ejemp/o NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diaril amino, heteroaril amino, diheteroaril amino, o aminoacido);
35 NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AM1NA (AM1NA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclil amino, arilamino, diaril amino, heteroaril amino, o diheteroaril amino), -NHC (O)R (R = alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo o azucar), ciano; mercapto; alquil-tio-alquilo; tioalcoxi; y alquilo, cicloalquilo, arilo, alquenilo y alquinilo, que se puede sustituir opcionalmente con por ejemp/o, una funcionalidad aminoD
Los sustituyentes preferidos son 2'-metoxietilo, 2'-OCH3, 2'-O-alilo, 2'-C- alilo, y 2'-fluoroD
La inclusion de azucares furanosa en la estructura principal de oligonucleotidos tambien puede reducir la division endonucleoliticaD Un agente de iARN se puede modificar adicionalmente al incluir un grupo cationico 3', o al invertir el nucleosido en el terminal 3' con un enlace 3'-3'D En otra alternativa, el terminal 3' se puede bloquear con un grupo aminoalquilo, por ejemp/o, un aminoalquilo dT 3' C5D Otros conjugados 3' pueden inhibir la division exonucleolitica 3'-5'D Aunque no este limitado por la teoria, un conjugado 3', tal como naproxeno o ibuprofeno, puede inhibir la
45 division exonucleolitica al bloquear estericamente la exonucleasa de union en el extremo 3' del oligonucleotidoD 1ncluso cadenas pequenas alquilo, grupos arilo, o conjugados heterociclicos o azucares modificados (0-ribosa, desoxiribosa, glucosa etcD) puede bloquear las exonucleasas 3'-5'-D
La division nucleolitica tambien se puede inhibir mediante la introduccion de modificaciones de ligador de fosfato, por ejemp/o, enlaces de fosforotioatoD Sin embargo, los agentes de iARN preferidos incluyen dimeros de nucleotido enriquecidos o puros para una forma quiral particular de un grupo de fosfato modificado que contiene un heteroatomo en una posicion de no puenteado ocupado normalmente por oxigenoD El heteroatomo puede ser S, Se, Nr2, o Br3D Cuando el heteroatomo es S, se prefiere el enlace Sp enriquecido o quiralmente puroD Enriquecido significa por lo menos 70, 80, 90, 95, o 99 % de la forma preferidaD Los enlaces de fosfato modificados son particularmente eficientes en inhibir la division exonucleolitica cuando se introduce cerca a las posiciones de terminal
55 5'- o 3', y preferiblemente las posiciones de terminal 5', de un agente de iARND
Los conjugados 5' tambien pueden inhibir la division exonucleolitica 5'-3'D Aunque no este limitado por la teoria, un conjugado 5', tal como naproxeno o ibuprofeno, puede inhibir la division exonucleolitica al bloquear estericamente la exonucleasa de la union al extremo 5' de oligonucleotidoD 1ncluso cadenas alquilo pequenas, grupos arilo, o conjugados heterociclicos o azucares modificados (0ribosa, desoxiribosa, glucosa etcD) puede bloquear 3'-5'exonucleasasD
Un agente de iARN puede tener aumento en la resistencia a nucleasas cuando un agente de iARN duplex incluye un nucleotido saliente de cadena sencilla en por lo menos un extremoD En realizaciones preferidas, el nucleotido 5 saliente incluye 1 a 4, preferiblemente 2 a 3, nucleotidos no apareadosD En una realizacion preferida, el nucleotido no pareado de la saliente de cadena sencilla que es directamente adyacente al par de nucleotido terminal contiene una base purina, y el par de nucleotido terminal es un par G-C, o por lo menos dos de los ultimos cuatro pares de nucleotidos complementarios son pares G-CD En realizaciones adicionales, el nucleotido saliente puede tener 1 o 2 nucleotidos no apareados, y en una realizacion de ejemplo el nucleotido saliente es 5'-gc-3'D En realizaciones
10 preferidas, el nucleotido saliente esta en el extremo 3' de la cadena anti-sentidoD En una realizacion, el agente iARN incluye el motivo 5'-cgc-3' en el extremo 3' de la cadena anti-sentido, de tal manera que se forma una saliente 2-nt 5'-gc-3'D
Sin embargo, un agente de iARN puede incluir modificaciones con el fin de inhibir la degradacion, por ejemp/o, mediante nucleasas, por ejemp/o, endonucleasas o exonucleasas, encontradas en el cuerpo de un sujetoD Estos 15 monomeros se denominan aqui como RMN, o Monomeros que promueven la Resistencia a la Nucleasa, las modificaciones correspondientes como modificaciones RMND En muchos casos estas modificaciones modularan otras propiedades del agente iARN tambien, por ejemp/o, la capacidad de interactuar con una proteina, por ejemp/o, una proteina de transporte, por ejemp/o, albumina de suero, o un elemento del R1SC, o la capacidad de la primera y segunda secuencias para formar un duplex con otro o para formar un duplex con otra secuencia, por ejemp/o, una
20 molecula objetivoD
Una o mas diferentes modificaciones de MRN se pueden introducir en un agente de iARN o en una secuencia de un agente de iARND Una modificacion de MRN se puede utilizar mas de una vez en una secuencia o en un agente de iARND
Las modificaciones de MRN incluyen algo que se puede poner solo en el terminal y otros que puede ir en cualquier
25 posicionD Algunas modificaciones de MRN pueden inhibir hibridacion de tal manera que es preferible utilizarlos solo en regiones terminales, y preferible no utilizarlos en el sitio de division o en la region de division de una secuencia que dirige una secuencia objetivo o gen, particularmente en la cadena anti-sentidoD Se pueden utilizar en cualquier parte en una cadena sentido, siempre que se mantenga suficiente hibridacion entre las dos cadenas del agente de iARN dsD En algunas realizaciones es deseable poner la MRN en el sitio de division o en la region de division de una
30 cadena sentido, ya que puede minimizar la inactivacion objetivoD
En la mayoria de casos, se distribuiran modificaciones MRN de forma diferente dependiendo de si estan comprendidas en una cadena sentido o cadena anti-sentidoD Si en una cadena anti-sentido, las modificaciones que interfieren con o inhiben la division endonucleasa no se deben insertar en la region que se somete a division mediada por R1SC, por ejemp/o, el sitio de division o la region de division (Como se describe en Elbashir et a/., 2001, 35 Genes and 0evD 15: 188, incorporado aqui mediante referencia)D La division del objetivo ocurre aproximadamente en la mitad de una cadena anti-sentido 20 o 21 nt, o aproximadamente 10 o 11 nucleotidos en la direccion 5' del primer nucleotido en el mARN objetivo que es complementario a la cadena anti-sentidoD Como se utiliza aqui el sitio de division se refiere a los nucleotidos en el lado del sitio de division, en el objetivo o en la cadena del agente iARN que la hibridaD La region de division significa los nucleotidos dentro de 1, 2, o 3 nucleotidos del sitio de division, en
40 cualquier direccionD
0ichas modificaciones se pueden introducir en las regiones terminales, por ejemp/o, en la posicion terminal o con 2, 3, 4, o 5 posiciones del terminal, de una cadena sentido o cadena anti-sentidoD
Ligandos Atados
Las propiedades de un agente de iARN, que incluyen sus propiedades farmacologicas, se pueden influenciar y
45 adaptar, por ejemplo, mediante la introduccion de ligandos, por ejemp/o /igandos atadosD Adicionalmente, las propiedades farmacologicas de un agente de iARN se pueden mejorar al incorporar un ligando en una formulacion del agente iARN cuando el agente iARN puede tener o tiene un ligando atadoD
Se puede atar una amplia variedad de entidades, por ejemp/o, ligandos, con un agente de iARN o utiliza con conjugado o aditivo de formulacion, por ejemp/o, para el portador de una subunidad de monomero conjugado con
50 ligandoD Los ejemplos se describen adelante en el contexto de una subunidad de monomero conjugado con ligando pero que solo se prefiere, las entidades se pueden acoplar en otros puntos a un agente de iARND
Las unidades estructurales preferidas son ligandos, que se acoplan, preferiblemente covalentemente, ya sea directamente o indirectamente, por medio de un amarre de intervencion al portadorD En realizaciones preferidas, el ligando se une al portador por medio de un amarre de intervencionD El ligando o ligando de amarre puede estar presente en el monomero conjugado con ligando cuando el monomero conjugado con ligando se incorpora en la cadena en crecimientoD En algunas realizaciones, el ligando se puede incorporar en una subnidad de monomero conjugada con ligando quot;precursoraquot; despues que se ha incorporado una subunidad de monomero conjugada con ligando quot;precursoraquot; se ha incorporado la cadena en crecimientoD Por ejemplo, un monomero que tiene, por ejemp/o,
5 un atadura que termina en amino, por ejemp/o, TAP-(CH2)nNH2 se puede incorporar en una cadena sentido o cadena anti-sentido en crecimientoD En una operacion posterior, es decir, despues de incorporacion de la subnidad de monomero precursor en la cadena, un ligando que tiene un grupo electrofilo, por ejemp/o, un ester pentafluorofenilo o grupo aldehido, se puede unir posteriormente al monomero conjugado con el ligando precursor al acoplar el grupo electrofilo del ligando con el grupo nucleofilo terminal del amarre de la subunidad de monomero conjugado con el ligando precursorD
En realizaciones preferidas, un ligando altera la distribucion, direccion o vida util de un agente de iARN en el que se incorporaD En realizaciones preferidas un ligando proporciona una afinidad mejorada para un objetivo seleccionado, por ejemp/o, molecula, celula o tipo de celula, compartimiento, por ejemp/o, un compartimiento celular o compartimiento de organo, tejido, organo o region del cuerpo, cuando, por ejemp/o, se compara con una especie
15 ausente de dicho ligandoD
Los ligandos preferidos pueden mejorar el transporte, hibridacion, y las propiedades de especificidad y tambien pueden mejorar la resistencia a la nucleasa del oligoribonucleotido resultante natural o modificado, o una molecula polimerica que comprende cualquier combinacion de monomeros descritos aqui y/o ribonucleotidos naturales o modificadosD
Los ligandos en general pueden incluir modificadores terapeuticos, por ejemp/o, para mejorar la absorcion; compuestos diagnosticos o grupos indicadores por ejemp/o, para supervisar la distribucion; agentes de entrecruzamiento; unidades estructurales que confieren resistencia a nucleasa; y nucleobases naturales o inusualesD Ejemplos generales incluyen moleculas lipofilas, lipidos, lectinas, esteroides (por ejemp/o, uvaol, hecigenina, diosgenina), terpenos (por ejemp/o, triterpenos, por ejemp/o, sarsasapogenina, Friedelina, acido litocolico derivado
25 de epifriedelanol), vitaminas, carbohidratos (por ejemp/o, un dextrano, pululan, chitina, chitosan, polimeros sinteticos (por ejemplo Oligo Lactato 15-mer) y naturales (por ejemplo de bajo y medio peso molecular), inulina, ciclodextrina o acido hialuronico), proteinas, aglutinantes a proteinas, moleculas que dirigen integrina, policationicos, peptidos, poliaminas, e imitadores de peptidoD Otros ejemplos incluyen acido folico o ligandos epiteliales de receptor, tal como transferinaD
El ligando puede ser una molecula que ocurre en forma natural o recombinante o sintetica, tal como un polimero sintetico, por ejemp/o, un acido poliamino sinteticoD Ejemplos de acidos poliamino incluyen polilisina (PLL), acido poli L-aspartico, acido poli L-glutamico, copolimero de anhidrido de estireno-acido maleico, copolimero de poli(L-lacturoco-glicolico), copolimero de divinil eter-anhidrido maleico, copolimero N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietilenglicol (PEG), alcohol polivinilico (PVA), poliuretano, poli(acido 2-etilacrilico), polimeros N-isopropilacrilamida, 35 o polifosfazinaD Ejemplo de poliaminas incluyen: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, seudopeptido-poliamina, poliamina de imitador de peptido, poliamina dendrimero, arginina, amidina, protamina, unidades estructurales cationicas, por ejemp/o, lipido cationico, porfirina cationica, sal cuaternaria de una poliamina,
o un peptido alfa helicoidalD
Los ligandos tambien pueden incluir grupos objetivo, por ejemp/o, un agente objetivo de tejido o celula, por ejemp/o, un tirotropina, melanotropina, proteina S de tensoactivo, carbohidrato mucina, un poliaminoacido glucosilado, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, o un peptido Arg-Gly-Asp (RG0) o imitador de peptido RG0D
Los ligandos pueden ser proteinas, por ejemp/o, glucoproteinas, lipoproteinas, por ejemp/o lipoproteina de baja densidad (L0L), o albuminas, por ejemp/o albumina de suero humano (HSA), o peptidos, por ejemp/o, moleculas que tienen una afinidad especifica para un co-ligando, o anticuerpos por ejemp/o, un anticuerpo, que se une a un tipo de
45 celula especifico tal como una celula de cancer, celula endotelial, o celula de huesoD Los ligandos tambien pueden incluir hormonas y receptores de hormonaD Estos tambien pueden incluir especies no peptidicas, tal como cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-glucosamina, mannosa multivalente, o fucosa multivalenteD
El ligando puede ser una sustancia, por ejemp/o, un farmaco, que puede aumentar la absorcion del agente iARN en la celula, por ejemplo, al interrumpir el citoesqueleto de la celula, por ejemp/o, al interrumpir los microtubulos de la celula, microfilamentos, y/o filamentos intermediosD El farmaco puede ser, por ejemplo, taxon, vincristina, vinblastina, citochalasina, nocodazol, japlakinolida, latrunculina A, faloidina, swinholida A, indanocina, mioservina, tetraciclinaD
En un aspecto, el ligando es un lipido o molecula con base en lipidoD 0icho lipido o molecula con base en lipido se une preferiblemente a la proteina de suero, por ejemp/o, albumina de suero humano (HSA)D Un ligando de union 55 HSA permite la distribucion del conjugado a un tejido objetivo, por ejemp/o, tejido de higado, que incluye celulas parenquimales del higadoD Otras moleculas que se pueden unir a HSA tambien se pueden utilizar como ligandosD Por ejemplo, se puede utilizar neproxina o aspirinaD Un lipido o ligando con base en lipido (a) puede aumentar la
resistencia a la degradacion del conjugado, (b) aumentar la direccion o transporte en una celula objetivo o membrana celular, y/o (c) se puede utilizar para ajustar la union a una proteina de suero, por ejemp/o, HSAD
Se puede utilizar un ligando con base en lipido para modular, por ejemp/o, controlar la union del conjugado al tejido objetivoD Por ejemplo, un lipido o ligando con base en lipido que se une a HSA mas fuertemente sera mas 5 probablemente dirigido al rinon y por lo tanto se limpia menos probablemente del cuerpoD
En una realizacion preferida, el ligando con base en lipido se une a HSAD Preferiblemente, se une a HSA con una afinidad suficiente de tal manera que el conjugado se distribuira preferiblemente a un tejido diferente a rinonD Sin embargo, se prefiere que la afinidad no sea tan fuerte que la union al ligando HSA no se pueda reversarD
En otro aspecto, el ligando es una unidad estructural, por ejemp/o, una vitamina o nutriente, que se toma por una
10 celula objetivo, por ejemp/o, una celula de proliferacionD Estos son particularmente utiles para tratar trastornos caracterizados por proliferacion celular indeseada, por ejemp/o, del tipo maligno o no maligno, por ejemp/o, celulas de cancerD Las vitaminas de ejemplo incluyen vitamina A, E, y KD Otras vitaminas de ejemplo incluyen las vitaminas B, por ejemp/o, acido folico, B12, riboflavina, biotina, piridoxal u otras vitaminas o nutrientes tomadas por las celulas de cancerD
15 En otro aspecto, el ligando es un agente de permeacion de celula, preferiblemente un agente de permeacion de celula helicoidalD Preferiblemente, el agente es amfipaticoD Un agente de ejemplo es un peptido tal como tat o antennapediaD Si el agente es un peptido, se puede modificar, que incluye un imitador peptidilo, invertomeros, enlaces no peptido o seudo-peptido, y uso de 0-aminoacidosD El agente helicoidal es preferiblemente un agente alfahelicoidal, que tiene preferiblemente una fase lipofila y lipofobaD El agente de permeacion de celula se puede unir
20 covalentemente al agente iARN o ser parte de un complejo de iARN-peptidoD
Modificaciones de 5'-Fosfato
En realizaciones preferidas, los agentes de iARN son 5' fosforilados o incluyen un analogo fosforilo en el terminal prima 5'D Las modificaciones de 5'-fosfato de la cadena anti-sentido incluyen aquellas que son compatibles con inactivacion de gen mediada por R1SCD Las modificaciones adecuadas incluyen: 5'-monofosfato ((HO)2(O)P-O-5'); 25 5'-difosfato ((HO)2(O)P-OP (HO)(O)-O-5'); 5'-trifosfato ((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); tapa 5'guanosina (7-metilado o no metilado) (7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); tapa 5'-adenosina (Appp), y cualquier estructura de tapa de nucleotido modificada o no modificada (N-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-OP(HO)(O)-O-5'); 5'-monotiofosfato (fosforotioato; (HO)2(S)P-O-5'); 5'-monoditiofosfato (fosforoditioato; (HO)(HS)(S)P-O-5'), 5'-fosforotiolato ((HO)2(O)P-S-5'); cualquier combinacion adicional de monofosfato
30 reemplazado con oxigeno/azufre, difosfato y trifosfatos (por ejemp/o 5'-alfa-tiotrifosfato, 5'-gamma-tiotrifosfato, etcD), 5'-fosforamidatos ((HO)2(O)P-NH-5', (HO)(NH2) (O)P-O-5'), 5'-alquilfosfonatos (R=alquil=metilo, etilo, isopropilo, propilo, etcD, por ejemp/o RP(OH)(O)-O-5'-, (OH)2(O)P-5'- CH2-), 5'-alquileterfosfonatos (R=alquileter=metoximetilo (MeOCH2-), etoximetilo, etcD, por ejemp/o RP(OH)(O)-O- 5'-)D
La cadena sentido se puede modificar con el fin de inactivar la cadena sentido y evitar la formacion de un R1SC
35 activo, reduciendo potencialmente por lo tanto los efectos objetivoD Esto se puede llevar a cabo una modificacion que evita la fosforilacion 5' de la cadena sentido, por ejemp/o, mediante modificacion con un ribonucleotido 5'-O-metilo (vease Nykanen et alD, (2001) ATP requirements and small interfering RNA structure in the interfering of RNA pathwayD Cell 107, 309-321D) Otras modificaciones que evitan la fosforilacion tambien se pueden utilizar, por ejemp/o, sustituyendo simplemente el 5'-OH por H a diferencia de OMeD Alternativamente, se puede agregar un
40 grupo de gran volumen al 5'-fosfato convirtiendolo en un enlace fosfodiesterD
Nucleobases No Naturales
Nitropirrolilo y nitroindolilo son nucleobases no naturales que son miembros de una clase de compuestos conocidos como bases universalesD Las bases universales son aquellos compuestos que se pueden reemplazar cualquiera de las cuatro bases que ocurren en forma natural sin afectar sustancialmente el comportamiento de fusion o actividad 45 del duplex de oligonucleotidoD En contraste para las interacciones de union de hidrogeno estabilizante asociado con nucleobases que ocurren en forma natural, se postula que los duplex de oligonucleotido que contienen nucleobases 3-nitropirrolilo se estabilizan unicamente mediante apilamiento de las interaccionesD La ausencia de las interacciones de union de hidrogeno significativas con nucleobases nitropirrolilo obvia la especificidad de una base complementaria especificaD Adicionalmente, diversos informes confirman que 4-, 5- y 6-nitroindolilo exhibe muy poca 50 especificidad para las cuatro bases naturalesD 0e forma interesante, un duplex de oligonucleotido que contiene 5nitroindolilo es mas estable que los oligonucleotidos correspondientes que contienen 4-nitroindolilo y 6-nitroindoliloD Los procedimientos para la preparacion de 1-(2'-O-metil-�-0-ribofuranosil)-5-nitroindol se describen en Gaubert, GD; Wengel, JD Tetrahedron Letters 2004, 45, 5629D Otras bases universales incluyen hipoxantinilo, isoinosinilo, 2-azainosinilo, 7-deaza-inosinilo, nitroimidazolilo, nitropirazolilo, nitrobenzimidazolilo, nitroindazolilo, aminoindolilo, 55 pirrolopirimidinilo, y derivados estructurales de los mismosD Para una discusion mas detallada, que incluye
procedimientos sinteticos, de nitropirrolilo, nitroindolilo, y otras bases universales mencionadas anteriormente vease Vallone et alD, Nucleic Acids Research, 27(17):3589-3596 (1999); Loakes et alD, JD MolD BioD, 270:426-436 (1997); Loakes et alD, Nucleic Acids Research, 22(20):4039-4043 (1994); Oliver et alD, Organic Letters, VolD 3(13): 1977-1980 (2001); Amosova et alD, Nucleic Acids Research, 25(10):1930-1934 (1997); Loakes et alD, Nucleic Acids Research,
5 29(12):2437-2447 (2001); Bergstrom et alD, JD AmD ChemD SocD, 117:1201-1209 (1995); Franchetti et alD, BiorgD MedD ChemD LettD 11:67-69 (2001); y Nair et alD, Nucelosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 20(4-7):735-738 (2001)D
El difluorotolil es una nucleobase no natural que funciona como una base universalD El difluorotolol es un isoester de la timidina nucleobase naturalD Pero a diferencia de la timina, el difluorotolil no muestra selectividad apreciable de cualquiera de las bases naturalesD Otros compuestos aromaticos que funciona como bases universales y son 10 susceptibles para la presente descripcion son 4- fluoro-6-metilbenzimidazol y 4-metilbenzimidazolD Adicionalmente, los derivados isocarbostirilil relativamente hidrofobos 3-metilo isocarboestirililo, 5-metilo isocarboestirililo, y 3-metil-7propinil isocarboestirilil son bases universales que provocan solo desestabilizacion ligera de los duplex de oligonucleotido comparado con la secuencia de oligonucleotidos que contiene solo bases naturalesD Otras nucleobases no naturales incluyen 7-azaindolilo, 6-metil-7-azaindolilo, imidizopiridinilo, 9-metil- imidizopiridinilo, 15 pirrolopirizinilo, isocarboestirililo, 7-propinil isocarboestirililo, propinil-7-azaindolilo, 2,4,5-trimetilfenilo, 4-metilindolilo, 4,6-dimetilindolilo, fenilo, naftalenilo, antracenilo, fenantracenilo, pirenilo, estilbenilo, tetracenilo, pentacenilo, y derivados estructurales de los mismosD Para una discusion mas detallada, que incluyen procedimientos sinteticos, de difluorotolilo, 4-fluoro-6-metilbenzimidazol, 4-metilbenzimidazol, y otras bases no naturales mencionadas anteriormente, vease: Schweitzer et alD, JD OrgD ChemD, 59:7238-7242 (1994); Berger et alD, Nucleic Acids Research, 20 28(15):2911-2914 (2000); Moran et alD, JD AmD ChemD SocD, 119:2056-2057 (1997); Morales et alD, JD AmD ChemD SocD, 121:2323-2324 (1999); Guckian et alD, JD AmD ChemD SocD, 118:8182-8183 (1996); Morales et alD, JD AmD ChemD SocD, 122(6):1001-1007 (2000); McMinn et alD, JD AmD ChemD SocD, 121:11585-11586 (1999); Guckian et alD, JD OrgD ChemD, 63:9652-9656 (1998); Moran et alD, ProcD NatlD AcadD SciD, 94:10506-10511 (1997); 0as et alD, JD ChemD SocD, Perkin TransD, 1:197-206 (2002); Shibata et alD, JD ChemD SocD, Perkin TransD, 1:1605-1611 (2001); Wu et alD, JD AmD
25 ChemD SocD, 122(32):7621-7632 (2000); O'Neill et alD, JD OrgD ChemD, 67:5869-5875 (2002); Chaudhuri et alD, JD AmD ChemD SocD, 117:10434-10442 (1995); y Patente Estadounidense NoD 6,218,108D
Transporte de agentes de iARN en las celulas
Sin desear estar vinculado con ninguna teoria, la similitud quimica entre los agente de iARN conjugados con colesterol y ciertos constituyentes de lipoproteinas (por ejemp/o colesterol, esteres colesterilo, fosfolipidos) puede 30 conducir a la asociacion de los agentes de iARN con lipoproteinas (por ejemp/o L0L, H0L) en sangre y/o la interaccion del agente iARN con componentes celulares que tienen una afinidad para colesterol, por ejemp/o componentes de la ruta de transporte de colesterolD Las lipoproteinas asi como tambien sus constituyentes se toman y se procesan por celulas mediante diversos mecanismos de transporte activo y pasivo, por ejemplo, sin limitacion, endocitosis del L0L unido al receptor L0L, endocitosis de L0L oxidado o de otra forma modificado a traves de 35 interaccion con receptor secuestrante A, la absorcion mediada por el receptor secuestrante B1 de colesterol H0L en el higado, pinocitosis, o transporte de colesterol a traves de las membranas mediante proteinas transportadoras ABC (casete de union ATP), por ejemp/o ABC-A1, ABC-G1 o ABC-G4D Por lo tanto, los agentes de iARN conjugados con colesterol pueden disfrutar de la absorcion facilitada por celulas que poseen dichos mecanismos de transporte, por ejemp/o celulas hepaticasD Como tal, la presente descripcion proporciona evidencia y metodos generales para
40 dirigir los agentes de iARN a las celulas que expresan ciertos componentes de superficie celular, por ejemp/o receptores, al conjugar un ligando natural para dicho componente (por ejemp/o colesterol) al agente iARN, o al conjugar una unidad estructural quimica (por ejemp/o colesterol) al agente iARN que se asocia con o se une a un ligando natural para el componente (por ejemplo L0L, H0L)D
Otras Realizaciones
45 Un agente de iARN, se puede producir en una celula in vivo, por ejemp/o, de plantillas de A0N exogenas que se suministran en la celulaD Por ejemplo, las plantillas de A0N se pueden insertar en vectores y utilizar como vectores de terapia de genD Los vectores de terapia de gen se pueden suministrar a un sujeto mediante, por ejemplo, inyeccion intravenosa, administracion local (Patente Estadounidense NoD 5,328,470), o mediante inyeccion estereotactica (vease, por ejemp/o, Chen et alD ProcD NatlD AcadD SciD USA 91:3054-3057, 1994)D La preparacion
50 farmaceutica del vector de terapia de gen puede incluir el vector de terapia de gen en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberacion lenta en la que se puede incorporar el vehiculo de suministro de genD Las plantillas de A0N, por ejemplo, pueden incluir dos unidades de transcripcion, una que produce un transcripto que incluye una cadena superior de un agente de iARN y una que produce un transcripto que incluye la cadena inferior de un agente de iARND Cuando las plantillas se transcriben, se produce el agente iARN, y se procesa en
55 fragmentos de agentes de iARN que median la inactivacion del genD
Formulacion
La presente descripcion tambien incluye composiciones y formulaciones farmaceuticas que incluyen compuestos de dsARND Las composiciones farmaceuticas se pueden administrar en una serie de formas dependiendo de si se desea tratamiento local o sistemico y luego el area que se va a tratarD La administracion puede ser topica, pulmonar, por ejemp/o, mediante inhalacion o insuflacion de polvos o aerosoles, que incluyen mediante nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidermico y transdermico, oral o parenteralD La administracion parenteral incluye inyeccion
o infusion intravenosa, intraarterial, subcutenea, intraperitoneal o intramuscular; o intracranial, por ejemplo, 5 administracion intratecal o intraventricularD
Las composiciones y formulaciones farmaceuticas para administracion topica pueden incluir parches transdermicos, unguentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, rociadores, liquidos y polvosD Los portadores farmaceuticos convencionales, bases acuosas, en polvo o aceitosos, los espesantes y similares pueden ser necesarios o deseablesD Tambien pueden ser utiles condones recubiertos, guantes y similaresD Las formulaciones topicas 10 preferidas incluyen aquellas en los que los dsARN estan en mezcla con un agente de suministro topico tal como lipidos, liposomas, acidos grasos, esteres de acidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensoactivosD Los lipidos y liposomas preferidos incluyen neutros (por ejemplo dioleoilfosfatidil etanolamina = 0OPE, dimiristoilfosfatidil colina = 0MPC, distearolifosfatidil colina) negativos (por ejemplo dimiristoilfosfatidil glicerol = 0MPG) y cationicos (por ejemplo dioleoiltetrametilaminopropilo = 0OTAP y dioleoilfosfatidil etanolamina = 0OTMA), por ejemplo bromuro 15 de (+/-)-N-(3-aminopropil)- N,N-dimetil-2,3-bis (dodeciloxi)-1-propanaminio = GAP-0LR1E)D Los 0sARN se pueden encapsular dentro de liposomas o pueden formar complejos de los mismos, en particular en liposomas cationicosD Alternativamente, se pueden complejar dsARN en lipidos, en particular en lipidos cationicosD Los acidos grasos y esteres preferidos incluyen pero no se limitan a acido araquidonico, acido oleico, acido eicosanoico, acido laurico, acido caprilico, acido caprico, acido miristico, acido palmitico, acido estearico, acido linoleico, acido linolenico,
20 dicaprato, tricaprato, monooleina, dilaurina, gliceril 1-monocaprato, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarnitina, una acilcolina, o un alquil ester C1-10 (por ejemplo isopropilmiristato 1PM), monoglicerido, diglicerido o la sal farmaceuticamente aceptable del mismoD Las formulaciones topicas se describen en detalle en la Solicitud de Patente Estadounidense SerD NoD 09/315,298 presentada en Mayo 20, 1999D
Las composiciones y formulaciones para administracion oral incluyen polvos o granulos, microparticulados,
25 nanoparticulados, suspensiones o soluciones en medio acuoso o no acuoso, capsulas, capsulas de gel, sobres, comprimidos o minicomprimidosD Pueden ser deseables espesantes, agentes aromatizantes, diluyentes, emulsificantes, auxiliares dispersantes o aglutinantesD Las formulaciones orales preferidas son aquellas en las que se administran los dsARN en conjunto con uno o mas mejoradores de penetracion, tensoactivos, y quelantesD Los tensoactivos preferidos incluyen acidos grasos y/o esteres o sales de los mismos, acidos biliares y/o sales de los
30 mismosD Los acidos biliares/sales preferidos incluyen acido chenodesoxicolico (C0CA) y acido ursodesoxichenodesoxicolico (U0CA), acido colico, acido dehidrocolico, acido desoxicolico, acido glucolico, acido glicolico, acido glicodesoxicolico, acido taurocolico, acido taurodesoxicolico, tauro-24,25-dihidro-fusidato de sodio y glicodihidrofusidato de sodioD Los acidos grasos preferidos incluyen acido araquidonico, acido undecanoico, acido oleico, acido laurico, acido caprilico, acido caprico, acido miristico, acido palmitico, acido estearico, acido linoleico,
35 acido linolenico, acido dicaprato, tricaprato, monooleina, dilaurina, gliceril 1-monocaprato, 1-dodecilazacicloheptan2-ona, una acilcarnitina, una acilcolina, o un monoglicerido, un diglicerido o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo (por ejemplo sodio)D Tambien se prefieren combinaciones de mejoradores de penetracion, por ejemplo, acidos grasos/sales en combinacion con acidos biliares/salesD Una combinacion particularmente preferida es la sal de sodio de acido laurico, acido caprico y U0CAD Los mejoradores de penetracion adicionales incluyen polioxietileno
40 9-lauril eter, polioxietileno-20-cetil eterD Los 0sARN se pueden suministrar de forma oral, en forma granular que incluye particulas secas rociadas, o complejar para formar micro o nanoparticulasD Los agentes de complejacion de 0sARN incluyen poli-aminoacidos; poliiminas; poliacrilatos; polialquilacrilatos, polioxetanos, polialquilcianoacrilatos; gelatinas cationizadas, albuminas, almidones, acrilatos, polietilenglicoles (PEG) y almidones; polialquilcianoacrilatos; poliiminas derivadas de 0EAE, polulanos, celulosas y almidonesD Particularmente los agentes complejantes
45 preferidos incluyen chitosan, N-trimetilchitosan, poli-L-lisina, polihistidina, poliornitina, polisperminas, protamina, polivinilpiridina, politiodietilaminometiletileno P(T0AE), poliaminoestireno (por ejemplo p-amino), poli(metilcianoacrilato), poli(etilcianoacrilato), poli(butilcianoacrilato), poli(isobutilcianoacrilato), poli(isohexilcinaoacrilato), 0EAE-metacrilato, 0EAE-hexilacrilato, 0EAE-acrilamida, 0EAE-albumina y 0EAEdextrano, polimetilacrilato, polihexilacrilato, poli(acido 0,L-lactico), acido poli(0L-lactic-co-glicolico (PLGA), alginato, y
50 polietilenglicol (PEG)D Las formulaciones orales para los dsARN y su preparacion se describen en detalle en la solicitud Estadounidense SerD NoD 08/886,829 (presentada en JulD 1, 1997), SerD NoD 09/108,673 (presentada en JulD 1, 1998), SerD NoD 09/256,515 (presentada en FebD 23, 1999), SerD NoD 09/082,624 (presentada en Mayo 21, 1998) y SerD NoD 09/315,298 (presentada en Mayo 20, 1999)D
Las composiciones y formulaciones para administracion parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir
55 soluciones acuosas esteriles que tambien pueden contener reguladores, diluyentes y otros aditivos adecuados tal como, pero no limitado a, mejoradores de penetracion, compuestos portadores y otros portadores y excipientes farmaceuticamente aceptablesD
Las composiciones farmaceuticas incluyen, pero no se limitan a, soluciones, emulsiones, y formulaciones que contienen liposomaD Estas composiciones se pueden generar de una variedad de componentes que incluyen, pero
60 no se limitan a, liquidos preformados, solidos auto-emulsificantes y semi-solidos auto-emulsificantesD Las formulaciones farmaceuticas, que pueden estar presentes convenientemente en forma de dosificacion unitaria, se pueden preparar de acuerdo con tecnicas convencionales bien conocidas en la industria farmaceuticaD 0ichas tecnicas incluyen la etapa de poner en contacto los ingredientes activos con los portadores o excipientes farmaceuticosD En general, las formulaciones se preparan al poner uniformemente e intimamente en contacto los
5 ingredientes activos con portadores liquidos o portadores solidos finamente divididos o ambos, y luego, si es necesario, formar el productoD
Las composiciones se pueden formular en cualquiera de muchas formas de dosificacion posibles tal como, pero no limitado a, comprimidos, capsulas, gel capsulas, jarabes liquidos, geles blandos, supositorios, y enemasD Las composiciones tambien se pueden formular como suspensiones en medio acuoso, no acuoso o mezclasD Las
10 suspensiones acuosas pueden contener adicionalmente sustancias que aumentan la viscosidad de la suspension que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextranoD La suspension tambien puede contener estabilizantesD
En una realizacion las composiciones farmaceuticas se pueden formular y utilizar como espumasD Las espumas farmaceuticas incluyen formulaciones tal como, pero no limitado a, emulsiones, microemulsiones, cremas, jaleas y
15 liposomasD Mientras sean similares en la naturaleza estas formulaciones varian en los componentes y la consistencia del producto finalD La preparacion de dichas composiciones y formulaciones se conoce de manera general por aquellos expertos en las tecnicas farmaceuticas y de formulacion y se pueden aplicar a la formulacion de las composicionesD
Emulsiones
20 Las composiciones se pueden preparar y formular como emulsionesD las emulsiones son normalmente sistemas heterogeneos de un liquido disperso en otro en la forma de gotas que exceden usualmente 0D1 mm de diametro (1dson, in Pharmaceutical 0osification Forms, Lieberman, Rieger and Banker (EdsD), 1988, Marcel 0ekker, 1ncD, New York, NDYD, volume 1, pD 199; Rosoff, in Pharmaceutical 0osification Forms, Lieberman, Rieger and Banker (EdsD), 1988, Marcel 0ekker, 1ncD, New York, NDYD, Volume 1, pD 245; Block in Pharmaceutical 0osification Forms,
25 Lieberman, Rieger and Banker (EdsD), 1988, Marcel 0ekker, 1ncD, New York, NDYD, volumen 2, pD 335; Higuchi et alD, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing CoD, Easton, PaD, 1985, pD 301)D Las emulsiones son frecuentemente sistemas bifasicos que comprenden dos fases inmiscibles en liquido mezcladas intimamente y dispersas entre siD En general, las emulsiones pueden ser de cualquier variedad de agua en aceite (w/o quot;por sus iniciales en inglesquot;) o aceite en agua (o/w quot;por sus iniciales en inglesquot;)D Cuando se divide finamente una fase acuosa
30 en y se dispersa como gotas diminutas en una fase aceitosa voluminosa, la composicion resultante se denomina una emulsion agua en aceite (w/o)D Alternativamente, cuando se divide finamente la fase aceitosa en y se dispersa como gotas diminutas en una fase acuosa voluminosa, la composicion resultante se denomina una emulsion aceite en agua (o/w)D Las emulsiones pueden contener componentes adicionales ademas de las fases dispersas, y el farmaco activo que pueden estar presentes como una solucion en la fase acuosa, fase aceitosa o en si mismo como una fase
35 separadaD Los excipientes farmaceuticos tal como emulsificantes, estabilizantes, tintes, y anti-oxidantes tambien pueden estar presentes en emulsiones segun se necesiteD Las emulsiones farmaceuticas tambien pueden ser multiples emulsiones que estan comprendidas de mas de dos fases tal como, por ejemplo, en el caso de emulsiones aceite en agua-en aceite (o/w/o) y agua-aceite en agua (w/o/w)D 0ichas formulaciones complejas proporcionan frecuentemente ciertas ventajas como no lo hacen las emulsiones binarias simplesD Multiples emulsiones en las que
40 las gotas de aceite individuales de una emulsion o/w encierran gotas de agua pequenas que constituyen una emulsion w/o/wD 0e forma similar un sistema de gotas de aceite encerradas en globulos de agua estabilizados en una fase continua aceitosa proporciona una emulsion o/w/oD
Las emulsiones se caracterizan por poca o ninguna estabilidad termodinamicaD Frecuentemente, la fase dispersa o discontinua de la emulsion se dispersa bien en la fase externa o continua y se mantiene en esa forma a traves de 45 medios emulsificantes o la viscosidad de la formulacionD Cualquiera de las fases de emulsion pueden ser un semisolido o un solido, como es el caso de bases de unguento estilo emulsion y cremasD Otros medios para estabilizar las emulsiones implican el uso de emulsificantes que se pueden incorporar en la fase de la emulsionD Los emulsificantes se pueden clasificar ampliamente en cuatro categorias: tensoactivos sinteticos, emulsificantes que ocurren en forma natural, bases de absorcion, y solidos finamente dispersos (1dson, in Pharmaceutical 0osificacion
50 Forms, Lieberman, Rieger and Banker (EdsD), 1988, Marcel 0ekker, 1ncD, New York, NDYD, volumen 1, pD 199)D
Los tensoactivos sinteticos, tambien conocidos agentes activos de superficie, han encontrado amplia aplicabilidad en la formulacion de emulsiones y se han revisado en la bibliografia (Rieger, in Pharmaceutical 0osification Forms, Lieberman, Rieger and Banker (EdsD), 1988, Marcel 0ekker, 1ncD, New York, NDYD, volume 1, pD 285; 1dson, in Pharmaceutical 0osification Forms, Lieberman, Rieger y Banker (EdsD), Marcel 0ekker, 1ncD, New York, NDYD, 1988, 55 volumen 1, pD 199)D Los tensoactivos son normalmente amfifilicos y comprenden una parte hidrofila y una parte hidrofobaD La relacion de la naturaleza hidrofila a la naturaleza hidrofoba del tensoactivo se ha denominado el balance hidrofilo/lipofilo (HLB) y es una herramienta valiosa en categorizar y seleccionar tensoactivos en la preparacion de formulacionesD Los tensoactivos se pueden clasificar en diferentes clases con base en la naturaleza
del grupo hidrofilo: no ionicos, anionicos, cationicos y amfotericos (Rieger, in Pharmaceutical 0osification Forms, Lieberman, Rieger and Banker (EdsD), 1988, Marcel 0ekker, 1ncD, New York, NDYD, volumen 1, pD 285)D
Los emulsificantes que ocurren en forma natural utilizados en formulaciones de emulsion incluyen lanolina, cera de abejas, fosfatidas, lecitina y acaciaD Las bases de absorcion poseen propiedades hidrofilas de tal manera que se 5 pueden tomar en agua para formar emulsiones w/o reteniendo aun sus consistencias semi-solidas, tal como lanolina anhidra y petrolato hidrofiloD Los solidos finamente divididos tambien se han utilizado como buenos emulsificantes especialmente en combinacion con tensoactivos y en preparaciones viscosasD Estas incluyen solidos inorganicos polares, tal como hidroxidos de metal pesados, arcillas no hinchables tal como bentonita, atapulgita, hectorita, caolina, montmorillonita, silicato de aluminio coloidal y silicato de aluminio y magnesio coloidal, pigmentos y solidos
10 no polares tal como triestearato de carbono o gliceriloD
Tambien se incluye una gran variedad de materiales no emulsificantes en formulaciones de emulsion y contribuyen a las propiedades de emulsionesD Estas incluyen grasas, aceites, ceras, acidos grasos, alcoholes grasos, esteres grasos, humectantes, coloides hidrofilos, conservantes y antioxidantes (Block, en Pharmaceutical 0osification Forms, Lieberman, Rieger and Banker (EdsD), 1988, Marcel 0ekker, 1ncD, New York, NDYD, volumen 1, pD 335; 1dson, en
15 Pharmaceutical 0osification Forms, Lieberman, Rieger and Banker (EdsD), 1988, Marcel 0ekker, 1ncD, New York, NDYD, volumen 1, pD 199)D
Los coloides o hidrocoloides hidrofilos incluyen gomas que ocurren en forma natural y polimeros sinteticos tal como polisacaridos (por ejemplo, acacia, agar, acido alginici, carragenano, goma guar, goma karaya, y tragacanto), derivados de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa y carboxipropilcelulosa), y polimeros sinteticos (por
20 ejemplo, carbomeros, eteres de celulosa, y polimeros carboxivinilo)D Estos se dispersan o hinchan en agua para formar soluciones coloidales que estabilizan las emulsiones al formar peliculas interfaciales fuertes alrededor de las gotas de fase dispersa y al aumentar la viscosidad de la fase externaD
0ebido a que las emulsiones contienen frecuentemente un numero de ingredientes tal como carbohidratos, proteinas, esteroles y fosfatidas que se pueden soportar facilmente por el crecimiento de microbios, estas 25 formulaciones incorporan frecuentementeD Los conservantes comunmente utilizados incluidos en las formulaciones de emulsion incluyen metil parabeno, propil parabeno, sales de amonio cuaternario, cloruro de benzalconio, esteres de acido p-hidroxibenzoico, y acido boricoD Los antioxidantes tambien se agregan comunmente a formulaciones de emulsion para evitar el deterioro de la formulacionD Los antioxidantes utilizados pueden ser secuestrantes de radicales libres tal como tocoferoles, alquil galatos, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, o agentes de
30 reduccion tal como acido ascorbico y metabisulfito de sodio, y sinergistas antioxidantes tal como acido citrico, acido tartarico, y lecitinaD
La aplicacion de formulaciones de emulsion por medio de las rutas dermatologicas, oral y parenteral y metodos para su fabricacion se han revisado en la bibliografia (1dson, en Pharmaceutical 0osification Forms, Lieberman, Riegeryand Banker (EdsD), 1988, Marcel 0ekker, 1ncD, New York, NDYD, volumen 1, pD 199)D Las formulaciones de 35 emulsion para el suministro oral se han utilizado ampliamente debido a la facilidad de la formulacion, asi como tambien eficacia desde un punto de vista de absorcion y biodisponibilidad (Rosoff, en Pharmaceutical 0osification Forms, Lieberman, Rieger and Banker (EdsD), 1988, Marcel 0ekker, 1ncD, New York, NDYD, volumen 1, pD 245; 1dson, en Pharmaceutical 0osification Forms, Lieberman, Rieger and Banker (EdsD), 1988, Marcel 0ekker, 1ncD, New York, NDYD, volumen 1, pD 199)D Los laxantes a base de aceite mineral, vitaminas solubles en aceite y las preparaciones
40 nutritivas altas en grasa estan entre los materiales que se han administrado comunmente oralmente como emulsiones o/wD
En una realizacion, las composiciones de dsARN y acidos nucleicos se formulan como microemulsionesD Una microemulsion se puede definir como un sistema de agua, aceite y amfifilo que es una solucion de liquido isotropica y termodinamicamente estable unica (Rosoff, en Pharmaceutical 0osification Forms, Lieberman, Rieger and Banker 45 (EdsD), 1988, Marcel 0ekker, 1ncD, New York, NDYD, volumen 1, pD 245)D Normalmente las microemulsiones son sistemas que se preparan al dispersar primero un aceite en una solucion tensoactiva acuosa y luego se agrega una cantidad suficiente de un cuarto componente, de manera general un alcohol de longitud de cadena intermedio para formar un sistema transparenteD Por lo tanto, tambien se han descrito microemulsiones como dispersiones isotropicamente claras, termodinamicamente estables, de dos liquidos inmiscibles que se estabilizan mediante 50 peliculas interfaciales de moleculas activas de superficie (Leung and Shah, in: Controlled Release of 0rugs: Polimers and Aggregate Systems, Rosoff, MD, EdD, 1989, VCH Publishers, New York, paginas 185-215)D Las microemulsiones comunmente se preparan por medio de una combinacion de tres a cinco componentes que incluyen aceite, agua, tensoactivo, co-tensoactivo y electrolitoD Si la microemulsion es del tipo agua en aceite (w/o) o un aceite en agua (o/w) es dependiente de las propiedades del aceite y tensoactivo utilizado y en la estructura y empaque geometrico
55 de las cabezas polares y colas de hidrocarburo de las moleculas de tensoactivo (Schott, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing CoD, Easton, PaD, 1985, pD 271)D
El metodo fenomenologico que utiliza diagramas de fase se ha estudiado extensamente y ha producido un conocimiento comprensivo, para un experto en la tecnica, de como formular microemulsiones (Rosoff, en Pharmaceutical 0osification Forms, Lieberman, Rieger and Banker (EdsD), 1988, Marcel 0ekker, 1ncD, New York, NDYD, volumen 1, pD 245; Block, en Pharmaceutical 0osification Forms, Lieberman, Rieger and Banker (EdsD), 1988, Marcel 0ekker, 1ncD, New York, NDYD, volumen 1, pD 335)D Comparado con emulsiones convencionales, las microemulsiones ofrecen la ventaja de solubilizar farmacos insolubles en agua en una formulacion de gotas
5 termodinamicamente estables que se forman espontaneamenteD
Los tensoactivos utilizados en la preparacion de microemulsiones incluyen, pero no se limitan a, tensoactivos ionicos, tensoactivos no ionicos, Brij 96, polioxietilen oleil eteres, esteres de acido graso poliglicerol, monolaurato de tetraglicerol (ML310), monooleato de tetraglicerol (M0310), monooleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (M0750), sequioleato de 10 decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (0A0750), solos o en combinacion con cotensoactivosD El cotensoactivo, usualmente un alcohol de cadena corta tal como etanol, 1-propanol, y 1-butanol, sirve para aumentar la fluidez interfacial al penetrar en la pelicula de tensoactivo y posteriormente crear una pelicula desordenada debido al espacio vacio generado entre las moleculas de tensoactivoD Las microemulsiones, sin embargo, se pueden preparar sin el uso de cotensoactivos y sistemas microemulsion auto-emulsificante libre de alcohol se conocen en la
15 tecnicaD La fase acuosa normalmente puede ser, pero no se limita a, agua, una solucion acuosa del farmaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceroles, propilenglicoles, y derivados de etilenglicolD La fase de aceite puede incluir, pero no se limita a, materiales tal como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, esteres de acido graso, mono, di, y tri-gliceridos de cadena media (C8-C12), esteres de acido graso de gliceril polioxietilado, alcoholes grasos, gliceridos poliglicolizados, gliceridos C8-C10 poliglicolizados saturados, aceites vegetales y aceite de siliconaD
20 Las microemulsiones son particularmente de interes desde el punto de vista de solubilizacion del farmaco y la absorcion mejorada de farmacosD Las microemulsiones basadas en lipido (o/w y w/o) se han propuesto para mejorar la biodisponibilidad oral de farmacos, que incluyen peptidos (Constantinides et alD, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, MethD FindD ExpD ClinD PharmacolD, 1993, 13, 205)D Las microemulsiones proporcionan ventajas de solubilizacion mejorada del farmaco, proteccion del farmaco de hidrolisis enzimatica, posible mejora de
25 la absorcion del farmaco debido a alteraciones inducidas por tensoactivo en fluidez de membrana y permeabilidad, facilidad de preparacion, facilidad de administracion oral sobre formas de dosificacion solidas, potencia clinica mejorada, y toxicidad reducida (Constantinides et alD, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et alD, JD PharmD SciD, 1996, 85, 138-143)D Frecuentemente las microemulsiones se pueden formar espontaneamente cuando sus componentes se ponen juntos hasta temperatura ambienteD Esto puede ser particularmente ventajoso cuando se
30 formulan farmacos termolabiles, peptidos o dsARND Las microemulsiones tambien son efectivas en el suministro transdermico de componentes activos en aplicaciones cosmeticas y farmaceuticasD Se espera que las composiciones y formulaciones de microemulsion facilitara aumento de la absorcion sistemica de dsARN y acidos nucleicos del tracto gastrointestinal, asi como tambien mejoran la captacion celular local de dsARN y acidos nucleicos dentro del tracto gastrointestinal, vagina, cavidad bucal y otras areas de administracionD
35 Los microemulsiones tambien pueden contener componentes y aditivos adicionales tal como monostearato de sorbitan (Grill 3), Labrasol, y mejoradores de penetracion para mejorar las propiedades de la formulacion y para mejorar la absorcion de los dsARN y acidos nucleicos de la presente invencionD Los mejoradores de penetracion utiles en las microemulsiones se pueden clasificar como que pertenecen a una de las cinco categorias amplias de tensoactivos, acidos grasos, sales biliares, agentes quelantes, y no tensoactivos no quelantes (Lee et alD, Critical
40 Reviews en Therapeutic 0rug Carrier Systems, 1991, pD 92)D Cada una de estas clases se ha discutido anteriormenteD
Liposomas
Se presentan muchas estructuras de tensoactivo organizadas a pesar de microemulsiones que se han estudiado y utilizado para la formulacion de farmacosD Estas incluyen monocapas, micelas, bicapas y vesiculasD Las vesiculas,
45 tal como liposomas, han atraido gran interes debido a su especificidad y la duracion de accion que ofrecen desde el punto de vista del suministro de farmacoD El termino quot;liposomaquot; significa una vesicula compuesta de lipidos amfifilicos dispuestos en una bicapa o bicapas esfericasD
Las liposomas son vesiculas unilamelares o multilamelares que tienen una membrana formada de un material lipofilo y un acuoso interiorD La porcion acuosa contiene la composicion que se va a suministrarD Las liposomas cationicas
50 poseen la ventaja de ser capaces de fusionarse a la pared celularD Las liposomas no cationicas, aunque no permiten fusionarse eficientemente con la membrana celular, se toman mediante macrofagos in vivoD
Con el fin de cruzar la piel de mamifero intacta, las vesiculas de lipido pueden pasar a traves de una serie de poros finos, cada uno con un diametro de menos de 50 nm, bajo la influencia de un gradiente transdermico adecuadoD Por lo tanto, es deseable utilizar una liposoma que es altamente deformable y capaz de pasar a traves de dichos poros
55 finosD
Las ventajas adicionales de liposomas incluyen; liposomas obtenidas de fosfolipidos naturales son biocompatibles y biodegradables; las liposomas pueden incorporar un amplio rango de farmacos solubles en agua y lipidos; las liposomas pueden proteger los farmacos encapsulados en sus compartimientos internos de metabolismo y degradacion (Rosoff, en Pharmaceutical 0osification Forms, Lieberman, Rieger and Banker (EdsD), 1988, Marcel 0ekker, 1ncD, New York, NDYD, volumen 1, pD 245)D Las consideraciones importantes en la preparacion de formulaciones liposoma son la carga de superficie de lipido, tamano de vesicula y el volumen acuoso de las
5 liposomasD
Las liposomas son utiles para la transferencia y el suministro de ingredientes activos al sitio de accionD 0ebido a que la membrana liposomica es estructuralmente similar a las membranas biologicas, cuando las liposomas se aplican a un tejido, las liposomas empiezan a combinarse con las membranas celulares y cuando progresa la combinacion de la liposoma y el progreso de la celula, los contenidos liposomicos se vacian en la celula en donde puede actuar el
10 agente activoD
Las formulaciones liposomicas han sido el foco de investigacion extensiva como el modo de suministro de muchos farmacosD Se presenta evidencia creciente para administracion topica, las liposomas presentan diversas ventajas sobre otras formulacionesD 0ichas ventajas incluyen efectos colaterales reducidos con alta absorcion sistemica del farmaco administrado, acumulacion aumentada del farmaco administrado en el objetivo deseado, y la capacidad de
15 administrar una amplia variedad de farmacos, hidrofilos e hidrofobos, en la pielD
0iversos informes han detallado la capacidad de los liposomas para suministrar agentes que incluyen A0N de alto peso molecular en la pielD Los compuestos que incluyen analgesicos, anticuerpos, hormonas y A0N de alto peso molecular se han administrado a la pielD La mayoria de aplicaciones resulta en la direccion de la epidermis superiorD
Las liposomas caen en dos clases ampliasD Las liposomas cationicas son liposomas cargadas positivamente que
20 interactuan con las moleculas de A0N cargadas negativamente para formar un complejo estableD El complejo de A0N/liposoma cargado positivamente se une a la superficie celular cargada negativamente y se internaliza en un endosomaD 0ebido al pH acido dentro del endosoma, las liposomas se rompen, liberando sus contenidos en el citoplasma de la celula (Wang et alD, BiochemD BiophysD ResDCommunD, 1987, 147, 980-985)D
Los liposomas que son sensibles a pH o cargados negativamente, atrapan el A0N a diferencia del complejo con
25 esteD 0ebido a que el A0N y el lipido se cargan de forma similar, ocurre repulsion a diferencia de formacion de complejoD No obstante, algo del A0N se atrapa dentro del acuoso interior de estas liposomasD Las liposomas sensibles a pH se han utilizado para suministrar A0N que codifica el gen quinasa timidina para las monocapas de la celula en el cultivoD La expresion del gen exogeno se detecta en las celulas objetivo (Zhou et alD, Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274)D
30 Un tipo principal de composicion liposomica incluye fosfolipidos diferentes a fosfatidilcolina derivada en forma naturalD Las composiciones de liposoma neutras, por ejemplo, se pueden formar de dimiristoil fosfatidilcolina (0MPC)
o dipalmitoil fosfatidilcolina (0PPC)D Las composiciones de liposoma anionicas de manera general se forman de dimiristoil fosfatidilglicerol, mientras que las liposomas fusogenicas anionicas se forman principalmente de dioleoil fosfatidiletanolamina (0OPE)D Otro tipo de composicion liposomica se forma de fosfatidilcolina (PC) tal como, por
35 ejemplo, PC de soja, y PC de huevoD Se forma otro tipo de mezclas de fosfolipido y/o fosfatidilcolina y/o colesterolD
0iversos estudios han probado el suministro topico de formulaciones de farmaco liposomico para la pielD La aplicacion de liposomas que contiene interferon para la piel de conejillo de indias que resulta en una reduccion de ulceras de herpes en la piel mientras suministra el interferon mediante otros medios (por ejemplo como una solucion
o como una emulsion) que son inefectivos (Weiner et alD, Journal of 0rug Targeting, 1992, 2, 405-410)D
40 Adicionalmente, un estudio adicional prueba la eficacia del interferon administrado como parte de una formulacion liposomica para la administracion de interferon utilizando un sistema acuoso, y concluye que la formulacion liposomica es superior a la administracion acuosa (du Plessis et alD, Antiviral Research, 1992, 18, 259-265)D
Los sistemas liposomicos no ionicos tambien se han examinado para determinar su utilidad en el suministro de farmacos a la piel, en particular sistemas que comprenden el tensoactivo no ionico y colesterolD Las formulaciones
45 liposomicas no ionicas que comprenden NovasomeDTMD 1 (gliceril dilaurato/colesterol/polioxietileno-10-estearil eter) y NovasomeDTMD 11 (gliceril diestearato/ colesterol/polioxietileno-10-estearil eter) se utilizan para suministrar ciclosporina-A en la dermis de piel de ratonD Los resultados indican que dichos sistemas liposomicos no ionicos son efectivos en facilitar el deposito de ciclosporina-A en diferentes capas de la piel (Hu et alD SDTDPDPharmaD SciD, 1994, 4, 6, 466)D
50 Las liposomas tambien incluyen liposomas quot;estericamente estabilizadasquot;, un termino que, como se utiliza aqui, se refiere a liposomas que comprenden uno o mas lipidos especializados que, cuando se incorpora en liposomas, resultan en tiempos de vida de circulacion mejorados con relacion a liposomas que carecen de lipidos especializadosD Ejemplos de liposomas estericamente estabilizados son aquellas en las que parte de la porcion de lipido que forma vesicula de la liposoma (A) comprende uno o mas glucolipidos, tal como monosialogangliosida
55 Gm1, o (B) se deriva con uno o mas polimeros hidrofilos, tal como una unidad estructural de polietilenglicol (PEG)D Aunque no este vinculado en ninguna teoria particular, se considera en la tecnica que, por lo menos para liposomas estericamente estabilizadas que contienen gangliosidas, esfingomielina, o lipidos derivados PEG, la vida util de circulacion mejorada de estas liposomas estericamente estabilizadas se deriva de una absorcion reducida en las celulas del sistema reticuloendotelial (RES) (Allen et alD, FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et alD, Cancer Research,
5 1993, 53, 3765)D
Se conocen en la tecnica diversos liposomas que comprenden uno o mas glucolipidosD Papahadjopoulos et alD (AnnD NDYD AcadD SciD, 1987, 507, 64) reporta la capacidad de monosialogangliosida Gm1, sulfato de galactocerebrosida y fosfatidilinositol para mejorar las vidas utiles de la sangre de liposomasD Estos hallazgos fueron expuestos por Gabizon et alD (ProcD NatlD AcadD SciD UDSDAD, 1988, 85, 6949)D Patente Estadounidense NoD 4,837,028 y WO
10 88/04924, ambos de Allen et alD, describe liposomas que comprenden (1) esfingomielina y (2) la gangliosida Gm1 o un ester de sulfato galactocerebrosidaD La Patente Estadounidense NoD 5,543,152 (Webb et alD) describe liposomas que comprenden esfingomielinaD Los liposomas que comprenden 1,2-sn-dimiristoilfosfat-idilcolina se describen en el documento WO 97/13499 (Lim et al)D
Se conocen en la tecnica muchos liposomas que comprenden lipidos derivados con uno o mas polimeros hidrofilos,
15 y metodos de preparacion de los mismosD Sunamoto et alD (BullD ChemD SocD JpnD, 1980, 53, 2778) describe liposomas que comprenden un detergente no ionico, 2C1215G, que contiene una unidad estructural PEGD 1llum et alD (FEBS LettD, 1984, 167, 79) observe que el recubrimiento hidrofilo de las particulas de poliestireno con glicoles polimericos resulta en vidas utiles en sangre significativamente mejoradasD Los fosfolipidos sinteticos modificados por la union de los grupos carboxilicos de polialquilenglicoles (por ejemplo, PEG) se describen por Sears (Patente
20 Estadounidense NosD 4,426,330 y 4,534,899)D Klibanov et alD (FEBS LettD, 1990, 268, 235) describe experimentos que demuestran que los liposomas que comprenden fosfatidiletanolamina (PE) derivados con PEG o estearato de PEG tienen aumentos significativos en la vida media de la circulacion sanguineaD Blume et alD (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) extiende dichas observaciones a otros fosfolipidos derivados de PEG, por ejemplo, 0SPE-PEG, formado de la combinacion de distearoilfosfatidiletanolamina (0SPE) y PEGD Las liposomas que tienen
25 unidades estructurales PEG covalentemente unidas en su superficie externa se describen en la Patente Europea NoD EP 0 445 131 B1 y WO 90/04384 de FisherD Las composiciones de liposoma que contienen 1-20 mol por ciento de PE derivado con PEG, y metodos de uso del mismo, se describen por Woodle et alD (Patente Estadounidense NosD 5,013,556 y 5,356,633) y Martin et alD (Patente Estadounidense NoD 5,213,804 y Patente Europea NoD EP 0 496 813 B1)D Las liposomas que comprenden una serie de otros conjugados de lipido-polimero se describen en el documento
30 WO 91/05545 y Patente Estadounidense NoD 5,225,212 (ambos de Martin et alD) y en el documento WO 94/20073 (Zalipsky et alD)D Las liposomas que comprenden lipidos de ceramida modificados con PEG se describen en el documento WO 96/10391 (Choi et al)D Patente Estadounidense NoD 5,540,935 (Miyazaki et alD) y Patente Estadounidense NoD 5,556,948 (Tagawa et alD) describe los liposomas que contienen PEG que se puede derivar adicionalmente con las unidades estructurales funcionales en sus superficiesD
35 Se conoce en la tecnica numero limitado de liposomas que comprenden acidos nucleicosD El documento WO 96/40062 de Thierry et alD describe metodos para encapsular acidos nucleicos de alto peso molecular en liposomasD La Patente Estadounidense NoD 5,264,221 de Tagawa et alD describe liposomas unidos a proteina y afirma que los contenidos de dichos liposomas pueden incluir dsARND La Patente Estadounidense NoD 5,665,710 de Rahman et alD describe ciertos metodos para encapsular oligodesoxinucleotidos en liposomasD El documento WO 97/04787 de
40 Love et alD describe liposomas que comprenden dsARN dirigidos al gen rafD
Las transfersomas son aun otro tipo de liposomas, y son agregados de lipidos altamente deformables que son candidatos atractivos para vehiculos de suministro de farmacoD Las transfersomas se pueden describir como gotas de lipido que son altamente deformables que son capaces de penetrar facilmente a traves de poros que son mas pequenos que la gotaD Las transfersomas son adaptables al ambiente en las que se utilizan, por ejemplo se auto
45 optimizan (adaptado a la forma de poros en la piel), autoreparacion, alcanza frecuentemente objetivos sin fragmentacion, y frecuentemente auto-cargaD Para hacer transfersomas es posible agregar activadores de borde de superficie, usualmente tensoactivos, a una composicion liposomica estandarD Las transfersomas se han utilizado para suministrar albumina de suero a la pielD El suministro mediado por transfersoma de albumina de suero se ha mostrado que es tan efectivo como una inyeccion subcutanea de una solucion que contiene albumina de sueroD
50 Los tensoactivos encuentran amplia aplicacion en formulaciones tal como emulsiones (que incluyen microemulsiones) y liposomasD La forma mas comun para clasificar y categorizar las propiedades de los muchos diferentes tipos de tensoactivos, natural y sintetico, es mediante el uso del balance hidrofilo/lipofilo (HLB)D La naturaleza del grupo hidrofilo (tambien conocido como el quot;liderquot;) proporciona los medios mas utiles para categorizar los diferentes tensoactivos utilizados en las formulaciones (Rieger, en Pharmaceutical 0osification Forms, Marcel
55 0ekker, 1ncD, New York, NDYD, 1988, pD 285)D
Si la molecula de tensoactivo no se ioniza, se clasifica como un tensoactivo no ionicoD Los tensoactivos no ionico encuentran amplia aplicacion en productos farmaceuticos y cosmeticos y se utilizan sobre un amplio rango de valores de pHD En general sus valores HLB varian de 2 a aproximadamente 18 dependiendo de su estructuraD Los tensoactivos no ionicos incluyen esteres no ionicos tal como esteres de etilenglicol, esteres de propilenglocol, gliceril esteres, poligliceril esteres, esteres sorbitan, esteres de sacarosa, y esteres etoxiladosD Las alcanolamidas no ionicas y eteres tal como etoxilados de alcohol graso, alcoholes propoxilados, y polimeros de bloque etoxilados/propoxilados tambien se incluyen en esta claseD Los tensoactivos de polioxietileno son los miembros mas populares de la clase de tensoactivo no ionicoD
5 Si la molecula de tensoactivo lleva una carga negativa cuando se disuelve o dispersa en agua, el tensoactivo se clasifica como anionicoD Los tensoactivos anionicos incluyen carboxilatos tal como jabones, acil lactilatos, acil amidas de aminoacidos, esteres de acido sulfurico tal como alquil sulfatos y alquil sulfatos etoxilados, sulfonatos tal como alquil benceno sulfonatos, acil isetionatos, acil tauratos y sulfosuccinatos, y fosfatosD Los miembros mas importantes de la clase de tensoactivo anionico son los alquil sulfatos y los jabonesD
10 Si la molecula de tensoactivo lleva una carga positiva cuando se disuelve o dispersa en agua, el tensoactivo se clasifica como cationicoD Los tensoactivos cationicos incluyen sales de amonio cuaternario y aminas etoxiladasD Las sales de amonio cuaternario son los miembros mas utilizados en esta claseD
Si la molecula de tensoactivo tiene la capacidad de llevar una carga positiva o negativa, el tensoactivo se clasifica como amfotericoD Los tensoactivos amfotericos incluyen derivados de acido acrilico, alquilamidas sustituidas, N
15 alquilbetainas y fosfatidasD
Se ha revisado el uso de tensoactivos en productos de farmaco, formulaciones y en emulsiones (Rieger, en Pharmaceutical 0osification Forms, Marcel 0ekker, 1ncD, New York, NDYD, 1988, pD 285)D
Mejoradores de penetracion
En una realizacion, la presente descripcion emplea diversos mejoradores de penetracion para afectar el suministro
20 eficiente de acidos nucleicos, particularmente dsARN, a la piel de los animalesD Estan presentes la mayor parte de los farmacos en la solucion en formas ionizadas y no ionizadasD Sin embargo, usualmente solo los farmacos lipofilos
o solubles en lipidos cruzan facilmente las membranas celularesD Se ha descubierto que incluso los farmacos no lipofilos pueden cruzar las membranas celulares si la membrana que se cruza se trata con un mejorador de penetracionD Ademas de ayudar a la difusion de farmacos no lipofilos a traves de las membranas celulares, los
25 mejoradores de penetracion tambien mejoran la permeabilidad de los farmacos lipofilosD
Los mejoradores de penetracion se pueden clasificar por pertenecer a una de las cinco categorias amplias, es decir, tensoactivos, acidos grasos, sales biliares, agentes quelantes, y no tensoactivos no quelantes (Lee et alD, Critical Reviews in Therapeutic 0rug Carrier Systems, 1991, pD92)D Cada una de las clases mencionadas anteriormente de mejoradores de penetracion se describe adelante en mayor detalleD
30 Tensoactivos: En relacion con la presente descripcion, los tensoactivos (o quot;agentes activos de superficiequot;) son entidades quimicas que, cuando se disuelven en una solucion acuosa, reducen la tension de la superficie de la solucion o la tension interfacial entre la solucion acuosa y otro liquido, con el resultado que se mejora la absorcion de los dsARN a traves de la mucosaD Ademas de sales biliares y acidos grasos, estos mejoradores de penetracion incluyen, por ejemplo, lauril sulfato de sodio, polioxietileno-9-lauril eter y polioxietileno-20-cetil eter) (Lee et alD,
35 Critical Reviews in Therapeutic 0rug Carrier Systems, 1991, pD92); y emulsiones perfluoroquimicas, tal como FC-43 (Takahashi et alD, JD PharmD PharmacolD, 1988, 40, 252)D
Acidos grasos: 0iversos acidos grasos y sus derivados que actuan como mejoradores de penetracion incluyen, por ejemplo, acido oleico, acido laurico, acido caprico (acido n-decanoico), acido miristico, acido palmitico, acido estearico, acido linoleico, acido linolenico, acido dicaprato, tricaprato, monooleina (1-monooleoil-rac-glicerol),
40 dilaurina, acido caprilico, acido araquidonico, glicerol 1-monocaprato, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, acilcarnitinas, acilcolinas, alquil esteres C1 -C10 de los mismos (por ejemplo, metilo, isopropilo y t-butilo), y mono- y di-gliceridos de los mismos (es decir, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etcD) (Lee et alD, Critical Reviews in Therapeutic 0rug Carryier Systems, 1991, pD92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic 0rug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et alD, JD PharmD PharmacolD, 1992, 44, 651-654)D
45 Sales biliares: La funcion fisiologica de la bilis incluye la facilitacion de la dispersion y absorcion de lipidos y vitaminas solubles en grasa (Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th EdD, Hardman et alD EdsD, McGraw-Hill, New York, 1996, ppD 934-935)D 0iversas sales biliares naturales, y sus derivados sinteticos, actuan como mejoradores de penetracionD Sin embargo el termino quot;sales biliaresquot; incluye cualquiera de los componentes que ocurren en forma natural de bilis asi como tambien cualquiera
50 de sus derivados sinteticosD Las sales biliares incluyen, por ejemplo, acido colico (o su sal de sodio farmaceuticamente aceptable, colato de sodio), acido dehidrocolico (dehidrocolato de sodio), acido desoxicolico (desoxicolato de sodio), acido glucolico (glucolato de sodio), acido glicolico (glicocolato de sodio), acido glicodesoxicolico (glicodesoxicolato de sodio), acido taurocolico (taurocolato de sodio), acido taurodesoxicolico (taurodesoxicolato de sodio), acido chenodesoxicolico (chenodesoxicolato de sodio), acido ursodesoxicolico (U0CA), tauro-24,25-dihidro-fusidato de sodio (ST0HF), glicodihidrofusidato de sodio y polioxietileno-9-lauril eter (POE) (Lee et alD, Critical Reviews in Therapeutic 0rug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 1n: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th EdD, Gennaro, edD, Mack Publishing CoD, Easton, PaD, 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic 0rug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et alD, JD PharmD ExpD
5 TherD, 1992, 263, 25; Yamashita et alD, JD PharmD SciD, 1990, 79, 579-583)D
Agentes Quelantes: Los agentes quelantes, se pueden definir como compuestos que retiran los iones metalicos de solucion al formar complejos, con el resultado que se mejora la absorcion de los dsARN a traves de la mucosaD Con respecto a su uso como mejoradores de penetracion, los agentes quelantes tienen la ventaja agregada de tambien servir como inhibidores 0Nasa, ya que la mayoria de nucleasas de A0N caracterizadas requieran un ion de metal 10 divalente para catalisis y asi se inhiben mediante agentes quelantes (Jarrett, JD ChromatogrD, 1993, 618, 315-339)D Los agentes quelantes incluyen pero no se limitan a etilenodiaminatetraacetato de sodio (E0TA), acido citrico, salicilatos (por ejemplo, salicilato de sodio, 5-metoxisalicilato y homovanilata), derivados N-acilo de colageno, derivados lauret-9 y N-amino acilo de beta-dicetonas (enaminas) (Lee et alD, Critical Reviews in Therapeutic 0rug Carrier Systems, 1991, pagina 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic 0rug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33;
15 Buur et alD, JD Control RelD, 1990, 14, 43-51)D
No tensoactivos no quelantes: Como se utiliza aqui, los compuestos que mejoran la penetracion de no tensoactivo no quelante se pueden definir como compuestos que demuestran la actividad insignificante como agentes quelantes
o como tensoactivos pero que no obstante mejoran la absorcion de los dsARN a traves de la mucosa alimentaria (Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic 0rug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33)D Esta clase de mejoradores de
20 penetracion incluyen, por ejemplo, ureas ciclicas no saturada, derivados 1-alquil-y 1-alquenilazaciclo-alcanona (Lee et alD, Critical Reviews in Therapeutic 0rug Carrier Systems, 1991, pagina 92); y agentes anti-inflamatorios no esteroides tal como diclofenaco sodio, indometacina y fenilbutazona (Yamashita et alD, JD PharmD PharmacolD, 1987, 39, 621-626)D
Los agentes que mejoran la adsorcion de los dsARN en el nivel celular tambien se puede agregar a las
25 composiciones farmaceuticas y otras composicionesD Por ejemplo, lipidos cationicos, tal como lipofectina (Junichi et al, Patente Estadounidense NoD 5,705,188), derivados glicerol cationicos, y moleculas policationicas, tal como polilisina (Lollo et alD, Solicitud PCT WO 97/30731) y otros peptidos, tambien se conocen por mejorar la absorcion celular de los dsARND
Se pueden utilizar otros agentes para mejorar la penetracion de los acidos nucleicos administrados, que incluyen
30 glicoles tal como etilenglicol y propilenglicol, pirroles tal como 2-pirrol, azonas, y terpenos tal como limoneno y mentonaD
Portadores
Ciertas composiciones tambien incorporan compuestos portadores en la formulacionD Como se utiliza aqui, quot;compuesto portadorquot; o quot;portadorquot; se puede referir a un acido nucleico, o analogo del mismo, que es inerte (es decir, 35 no poseen actividad biologica per se) pero se reconoce como un acido nucleico mediante procesos in vivo que reducen la biodisponibilidad de un acido nucleico que tiene actividad biologica al, por ejemplo, degradar el acido nucleico biologicamente activo o promueve su retiro de circulacionD La co-administracion de acido nucleico y un compuesto portador, normalmente con un exceso de la ultima sustancia, puede resultar en una reduccion sustancial de la cantidad de acido nucleico recuperada en el higado, rinon u otros reservorios extracirculatorios,
40 presumiblemente debido a competicion entre el compuesto portador y el acido nucleico para un receptor comunD Por ejemplo, la recuperacion parcialmente de un dsARN fosforotioato en tejido hepatico se puede reducir cuando se coadministra con acido poliinosinico, sulfato de dextrano, acido policitidico o acido 4-acetamido-4'isotiociano-estilbeno2,2'-disulfonico (Miyao et alD, Antisense ResD 0evD, 1995, 5, 115-121; Takakura et alD, Antisense & NuclD Acid 0rug 0evD, 1996, 6, 177-183D
45 Excipientes
En contraste a un compuesto portador, un quot;portador farmaceuticoquot; o quot;excipientequot; es un solvente farmaceuticamente aceptable, agente de suspension o cualquier otro vehiculo farmacologicamente inerte para suministrar uno o mas acidos nucleicos a un animalD El excipiente puede ser liquido o solido y se selecciona, con la forma de administracion planeada en mente, con el fin de proporcionar el volumen, consistencia deseados, etcD, cuando se 50 combina con un acido nucleico y los otros componentes de una composicion farmaceutica dadaD Los portadores farmaceuticos tipicos incluyen, pero no se limitan a, aglutinantes (por ejemplo, almidon de maiz pregelatinizado, povidona o hidroxipropil metilcelulosa, etcD); rellenos (por ejemplo, lactosa y otros azucares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etil celulosa, poliacrilatos o hidrogen fosfato de calcio, etcD); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, silice, dioxido de silice coloidal, acido estearico, estearatos metalicos, aceites
55 vegetales hidrogenados, almidon de maiz, polietilenglicoles, benzoato de sodio, acetato de sodio, etcD); agentes desintegrantes (por ejemplo, almidon, glicolato almidon de sodio, etcD); y agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato de sodio, etcD)D
El excipiente organico o inorganico farmaceuticamente aceptable adecuado para administracion no parenteral que no reacciona perjudicialmente con acidos nucleicos tambien se puede utilizar para formular las composicionesD Los portadores farmaceuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones de sal, alcoholes, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, acido silicico, parafina viscosa,
5 hidroximetilcelulosa, povidona y similaresD
Formulaciones para administracion topica de acidos nucleicos puede incluir soluciones acuosas esteriles o no esteriles, soluciones no acuosas en solventes comunes tal como alcoholes, o soluciones de los acidos nucleicos en bases de aceite liquidas o solidasD Las soluciones tambien pueden contener reguladores, diluyentes y otros aditivos adecuadosD Se pueden utilizar excipientes organicos o inorganicos farmaceuticamente aceptables adecuados para
10 administracion no parenteral que no reaccionan en forma perjudicial con acidos nucleicosD
Los excipientes farmaceuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones de sal, alcohol, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, acido silicico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, povidona y similaresD
Composiciones farmaceuticas para el suministro al tubo respiratorio
15 Otro aspecto proporciona el suministro de agentes de iARN al tubo respiratorio, particularmente para el tratamiento de fibrosis quisticaD El tubo respiratorio incluye las vias respiratorias superiores, que incluyen bucofaringe y laringe, seguido por las vias respiratorias inferiores, que incluyen la traquea seguido por bifurcaciones en los bronquios y bronquiolosD Las vias respiratorias superior e inferior se denominan las vias respiratorias conductivasD Los bronquiolos terminales que dividen los bronquiolos respiratorios que luego conducen a la ultima zona respiratoria, los
20 alveolos, o pulmon profundoD El epitelio de las vias respiratorias conductivas es el objetivo primario de aerosoles terapeuticos inhalados para el suministro de agentes de iARN tal como agentes de iARN alfa-ENaCD
Las composiciones de suministro pulmonar se pueden suministrar mediante inhalacion por el paciente mediante una dispersion de tal manera que la composicion, preferiblemente el agente iARN, dentro de la dispersion puede alcanzar el pulmon cuando esta, por ejemplo, se puede absorber facilmente a traves de la region alveolar
25 directamente en la circulacion de la sangreD El suministro pulmonar puede ser efectivo para suministro sistemico y para suministro localizado para tratar enfermedades de los pulmonesD
Se puede lograr suministro pulmonar mediante diferentes metodos, que incluyen el uso de formulaciones nebulizadas, aerosolizadas, micelulares y con base en polvo seco; la administracion mediante inhalacion puede ser oral y/o nasalD El suministro se puede lograr con nebulizadores liquidos, inhaladores con base en aerosol, y 30 dispositivos de dispersion de polvo secoD Se prefieren dispositivos de dosis medidaD Uno de los beneficios de utilizar un atomizador o inhalador es que el potencial para contaminacion se minimiza debido a que los dispositivos estan auto-contenidosD Los dispositivos de dispersion de polvo seco, por ejemplo, el suministro de farmaco se puede formular facilmente como polvosD Una composicion de iARN se puede almacenar establemente como polvos liofilizados o secos por rociado por si mismos o en combinacion con portadores de polvo adecuadosD El suministro
35 de una composicion para inhalacion puede estar mediado por un elemento del periodo de dosificacion que puede incluir un temporizador, un contador de dosis, dispositivo para medir el tiempo, o un indicador de tiempo que cuando se incorpora en el dispositivo permite seguimiento de la dosis, supervision de cumplimiento, y/o activacion de dosis para un paciente durante la administracion del medicamento en aerosolD
Ejemplos de dispositivos farmaceuticos para suministro de aerosol incluyen inhaladores de dosis medida (M01),
40 inhaladores de polvo seco (0P1), y nebulizadores de chorro de aireD Los sistemas de suministro de ejemplo mediante inhalacion que se pueden adaptar facilmente para el suministro de agentes de iARN al sujeto se describen en, por ejemplo, Patente Estadounidense NosD 5,756,353; 5,858,784; y solicitudes PCT WO98/31346; WO98/10796; WO00/27359; WO01/54664; WO02/060412D Otras formulaciones en aerosol que se pueden utilizar para suministrar los agentes de iARN se describen en la Patente Estadounidense NosD 6,294,153; 6,344,194; 6,071,497, y solicitudes
45 PCT WO02/066078; WO02/053190; WO01/60420; WO00/66206D Adicionalmente, los metodos para suministrar los agentes de iARN se pueden adaptar de aquellos utilizados en suministrar otros oligonucleotidos (por ejemplo, un oligonucleotido anti-sentido) mediante inhalacion, tal como se describe en Templin et alD, Antisense Nucleic Acid 0rug 0ev, 2000, 10:359-68; Sandrasagra et alD, Expert Opin Biol Ther, 2001, 1:979-83; Sandrasagra et alD, Antisense Nucleic Acid 0rug 0ev, 2002, 12:177-81D
50 El suministro de los agentes tambien puede implicar la administracion de los asi llamados quot;pro-farmacosquot;, es decir formulaciones o modificaciones quimicas de una sustancia terapeutica que requiere alguna forma de procesamiento
o transporte mediante sistemas innatos para el organismo del sujeto para liberar la sustancia terapeutica, preferiblemente en el sitio en donde se desea su accion; esta ultima realizacion se puede utilizar en conjunto con el suministro al tubo respiratorio, pero tambien junto con otras realizaciones de la presente descripcionD Por ejemplo,
55 los pulmones humanos pueden retirar o degradar rapidamente los aerosoles depositados divididos hidroliticamente durante periodos que varian de minutos a horasD En las vias respiratorias superiores, el epitelio ciliado contribuye a la quot;escalera mucociliarquot; mediante el cual las particulas se arrastran desde las vias respiratorias hacia la bocaD Pavia, 0D, quot;Lung Mucociliary Clearance,quot; in Aerosols and the Lung: Clinical and Experimental Aspects, Clarke, SD WD y Pavia, 0D, EdsD, Butterworths, London, 1984D En los pulmones profundos, los macrofagos alveolares son capaces de fagocitosar las particulas pronto despues de su depositoD Warheit et alD Microscopy ResD TechD, 26: 412-422 (1993); y Braina, JD 0D, quot;Physiology and Pathophysiology of Pulmonary Macrophages,quot; in The Reticuloendothelial System, SD
5 MD Reichard y JD Filkins, EdsD, Plenum, NewD YorkD, ppD 315-327, 1985D
En realizaciones preferidas, particularmente cuando se desea dosificacion sistemica con el agente iARN, los agente de iARN en aerosol se formulan como microparticulasD Las microparticulas tienen un diametro de entre 0D5 y diez micras pueden penetrar los pulmones, pasando a traves de la mayoria de barreras naturalesD Se requiere un diametro de menos de diez micras para eludir la garganta; se requiere un diametro de 0D5 micras o mas para evitar
10 ser exhaladoD
Otros Componentes
Las composiciones pueden contener adicionalmente otros componentes adjuntos encontrados convencionalmente en las composiciones farmaceuticas, en sus niveles de uso establecidos en la tecnicaD Sin embargo, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales adicionales, compatibles, farmaceuticamente activos tal como, por 15 ejemplo, antipruriticos, astringentes, anestesicos locales o agentes anti-inflamatorios, o pueden contener materiales adicionales utiles en formular fisicamente diversas formas de dosificacion de las composiciones de la presente invencion, tal como tintes, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espesantes y estabilizantesD Sin embargo, dichos materiales, cuando se agregan, no deben interferir indebidamente con las actividades biologicas de los componentes de las composicionesD Las formulaciones se pueden esterilizar y, si se
20 desea, mezclar con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsificantes, sales para influenciar la presion osmotica, reguladores, colorantes, aromatizantes y/o sustancias aromaticas y similares que no interactuan perjudicialmente con los acidos nucleicos de la formulacionD
Las suspensiones acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspension que incluye, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextranoD La suspension tambien puede contener
25 estabilizantesD
Ciertas realizaciones proporcionan combinaciones y composiciones farmaceuticas que contienen (a) uno o mas agentes de dsARN y (b) uno o mas de otros agentes terapeuticos que funcionan mediante un mecanismo de interferencia no ARND
0e acuerdo con lo anterior, la descripcion incluye una combinacion de un iARN con una sustancia de farmaco anti
30 inflamatoria, broncodilatadora, de antihistamina, anti-tusiva, antibiotica o 0Nasa, dicho bloqueador epitelial del canal de sodio y dicha sustancia de farmaco esta en la misma o diferente composicion farmaceuticaD
Los antibioticos adecuados incluyen antibioticos macrolida, por ejemplo, tobramicina (TOB1T)D
Las sustancias de farmaco de 0Nasa adecuadas incluyen dornasa alfa (PulmozymeT), una solucion altamente purificada de desoxiribonucleasa 1 humana recombinante (rh0Nasa), que divide selectivamente el A0ND Se utiliza
35 dornasa alfa para tratar fibrosis quisticaD
Otras combinaciones utiles de bloqueadores del canal de sodio epitelial con farmacos anti-inflamatorias son aquellas con antagonistas de receptores quimioquina, por ejemplo, CCR-1, CCR-2, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9 y CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCRS, particularmente antagonistas CCR-5, tal como antagonistas Schering-Plough SC-351125, SCH-55700 y SCH-0; antagonistas Takeda, tal como cloruro de N-[[4
40 [[[6,7-dihidro-2-(4-metil-fenil)-5H-benzo-ciclohepten-8-il]carbonil]amino]fenil]-metil]tetrahidro-N,N-dimetil-2H-piran-4aminio (TAK-770); y antagonistas CCR-5 descritos en USP 6,166,037 (particularmente las reivindicaciones 18 y 19), documento WO 00/66558 (particularmente la reivindicacion 8), documento WO 00/66559 (particularmente la reivindicacion 9), documento WO 04/018425 y documento WO 04/026873D
Los farmacos anti-inflamatorios adecuados incluyen esteroides, en particular, glucocorticosteroides, tal como
45 budesonida, beclametasona dipropionato, fluticasona propionato, ciclesonida o mometasona furoato, o esteroides descritos en los documentos WO 02/88167, WO 02/12266, WO 02/100879, WO 02/00679 (especialmente aquellos de los Ejemplos 3, 11, 14, 17, 19, 26, 34, 37, 39, 51, 60, 67, 72, 73, 90, 99 y 101), documentos WO 03/35668, WO 03/48181, WO 03/62259, WO 03/64445, WO 03/72592, WO 04/39827 y WO 04/66920; agonistas del receptor glucocorticoide no esteroides, tal como aquellos descritos en los documentos 0E 10261874, WO 00/00531, WO
50 02/10143, WO 03/82280, WO 03/82787, WO 03/86294, WO 03/104195, WO 03/101932, WO 04/05229, WO 04/18429, WO 04/19935 y WO 04/26248; antagonistas LT04, tal como montelukast y zafirlukast; inhibidores P0E4, tal como cilomilast (Ariflo® GlaxoSmithKline), Roflumilast (Byk Gulden), V-11294A (Napp), BAY19-8004 (Bayer), SCH-351591 (Schering-Plough), Arofilina (Almirall Prodesfarma), P0189659 / P0168787 (Parke-0avis), AW0- 12281 (Asta Medica), C0C-801 (Celgene), SelC10(TM) CC-10004 (Celgene), VM554/UM565 (Vernalis), T-440
(Tanabe), KW-4490 (Kyowa Hakko Kogyo), y aquellos descritos en los documentos WO 92/19594, WO 93/19749, WO 93/19750, WO 93/19751, WO 98/18796, WO 99/16766, WO 01/13953, WO 03/104204, WO 03/104205, WO 03/39544, WO 04/000814, WO 04/000839, WO 04/005258, WO 04/018450, WO 04/018451, WO 04/018457, WO 04/018465, WO 04/018431, WO 04/018449, WO 04/018450, WO 04/018451, WO 04/018457, WO 04/018465, WO 5 04/019944, WO 04/019945, WO 04/045607 y WO 04/037805; antagonistas del receptor adenosina A2B tal como aquellos descritos en el documento WO 02/42298; y agonistas de adrenoceptor beta-2, tal como albuterol (salbutamol), metaproterenol, terbutalina, salmeterol fenoterol, procaterol, y especialmente, formoterol, carmoterol y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, y compuestos (en forma libre o sal o solvato) de la formula (1) del documento WO 0075114, preferiblemente compuestos de los Ejemplos de los mismos, especialmente indacaterol y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, asi como tambien compuestos (en forma libre o de sal o solvato) de la formula (1) del documento WO 04/16601, y tambien los compuestos de los documentos EP 1440966, JP 05025045, WO 93/18007, WO 99/64035, USP 2002/0055651, WO 01/42193, WO 01/83462, WO 02/66422, WO 02/70490, WO 02/76933, WO 03/24439, WO 03/42160, WO 03/42164, WO 03/72539, WO 03/91204, WO 03/99764, WO 04/16578, WO 04/22547, WO 04/32921, WO 04/33412, WO 04/37768, WO 04/37773, WO
15 04/37807, WO 04/39762, WO 04/39766, WO 04/45618, WO 04/46083, WO 04/80964, WO 04/108765 y WO 04/108676D
Los farmacos broncodilatadores adecuados incluyen agentes anticolinergicos o antimuscarinicos, en particular, bromuro de ipratropio, bromuro de oxitropio, sales de tiotropio y CHF 4226 (Chiesi), y glicopirrolato, pero tambien aquellos descritos en los documentos EP 424021, USP 3,714,357, USP 5,171,744, WO 01/04118, WO 02/00652, WO 02/51841, WO 02/53564, WO 03/00840, WO 03/33495, WO 03/53966, WO 03/87094, WO 04/018422 y WO 04/05285D
Los farmacos anti-inflamatorios y broncodilatadores duales adecuados incluyen antagonistas agonistas/muscarinicos de adrenoceptor beta- dual 2 tal como aquellos descritos en los documentos USP 2004/0167167, WO 04/74246 y WO 04/74812D
25 Las sustancias de farmaco de antihistamina adecuados incluyen clorhidrato de cetirizina, acetaminofen, clemastina fumarato, prometazina, loratidina, desloratidina, difenhidramina y clorhidrato de fexofenadina, activastina, astemizol, azelastina, ebastina, epinastina, mizolastina y tefenadina, asi como tambien aquellos descritos en los documentos JP 2004107299, WO 03/099807 y WO 04/026841D
Otras combinaciones de agentes utiles con farmacos anti-inflamatorios son aquellos con antagonistas de receptores quimioquina, por ejemplo, CCR-1, CCR-2, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9 y CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, particularmente antagonistas CCR-5, tal como antagonistas Schering-Plough SC-351125, SCH- 55700 y SCH-0; antagonistas Takeda, tal como cloruro de N-[[4-[[[6,7-dihidro-2-(4metilfenil)-5H-benzo-ciclohepten-8-il] carbonil]amino]fenil]-metil]tetrahidro-N,N-dimetil-2H-piran-4-amin-io (TAK-770), y antagonistas CCR-5 descritos en el documento USP 6,166,037 (particularmente las reivindicaciones 18 y 19),
35 documento WO 00/66558 (particularmente la reivindicacion 8), documento WO 00/66559 (particularmente la reivindicacion 9), documento WO 04/018425 y documento WO 04/026873D
Tambien se pueden seleccionar otros agentes terapeuticos adicionales utiles del grupo que consiste de moleculas de union de citoquina, particularmente anticuerpos de otras citoquinas, en particular una combinacion con un anticuerpo anti-1L4, tal como se describe en el documento PCT/EP2005/00836, un anticuerpo anti-1gE, tal como Xolair®, un anticuerpo anti-1L31, un anticuerpo anti-1L31R, un anticuerpo anti-TSLP, un anticuerpo del receptor anti-TSLP, un anticuerpo anti-endoglina, un anticuerpo anti-1L1b o un anticuerpo anti-1L13, tal como se describe en el documento WO05/007699D
Se pueden utilizar dos o mas compuestos combinados en una formulacion unica, en forma separada, concomitantemente o secuencialmenteD
45 La toxicidad y eficacia terapeutica de dichos compuestos se puede determinar mediante procedimientos farmaceuticos estandar en cultivos de celulas o animales experimentales, por ejemplo, para determinar el L050 (la dosis letal a 50% de la poblacion) y el E050 (la dosis terapeuticamente efectiva en 50% de la poblacion)D La relacion de dosis entre los efectos toxicos y terapeuticos es el indice terapeutico y se puede expresar como la relacion L050/E050D Se prefieren compuestos que exhiben altos indices terapeuticosD
Los datos obtenidos de ensayos de cultivos de celulas y estudios de animal se pueden utilizar para formular un rango de dosificacion para uso en humanosD La dosificacion de composiciones se posiciona de manera general dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen el E050 con poca o sin toxicidadD La dosificacion puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificacion empleada y la ruta de administracion utilizadaD Para cualquier compuesto utilizado en el metodo de la descripcion, se puede estimar la dosis 55 terapeuticamente efectiva inicialmente de ensayos de cultivo celularD Se puede formular una dosis en modelos de animal para alcanzar un rango de concentracion de plasma circulante del compuesto o, cuando sea apropiado, del producto de polipeptido de una secuencia objetivo (por ejemplo, que logra una concentracion reducida del
polipeptido) que incluye el 1C50 (es decir, la concentracion del compuesto de prueba que alcanza una inhibicion de sintomas maxima media) como se determina en el cultivo celularD 0icha informacion se puede utilizar para determinar mas exactamente las dosis utiles en humanosD Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatografia liquida de alto desempenoD
5 Ademas de su administracion individualmente o como una pluralidad, como se discutio anteriormente, los dsARN se pueden administrar en combinacion con otros agentes conocidos efectivos en el tratamiento de trastornos relacionados con ENaCD En cualquier evento, el medico que administra puede ajustar la cantidad y el tiempo de administracion de dsARN sobre la base de los resultados observados utilizando mediciones estandar de eficacia conocida en la tecnica o se describen aquiD
10 Metodos de Tratamiento y Rutas de Suministro
Una composicion que incluye un agente de iARN, por ejemp/o, un agente de iARN que dirige alfa-ENaC, se puede a un sujeto mediante una variedad de rutas para lograr suministro local al sitio de accion o suministro sistemico al sujetoD Las rutas de ejemplo incluyen administracion local directa al sitio de tratamiento, tal como los pulmones y el pasaje nasal asi como tambien suministro intravenoso, nasal, oral, y ocularD Los medios preferidos para administrar
15 los agentes de iARN es a traves de la administracion directa a los pulmones y el pasaje nasal es una solucion liquida, de aerosol o nebulizadaD
Las formulaciones para inhalacion o administracion parenteral se conocen bien en la tecnicaD 0icha formulacion puede incluir soluciones acuosas esteriles que tambien pueden contener reguladores, diluyentes y otros aditivos adecuadosD Para uso intravenoso, la concentracion total de solutos se debe controlar para hacer la preparacion
20 isotonicaD
Los compuestos activos descritos aqui se administran preferiblemente a los pulmones o el pasaje nasal de un sujeto mediante cualesquier medios adecuadosD Los compuestos activos se pueden administrar al administrar una suspension en aerosol de particulas respirables comprendidas del compuesto activo o compuestos activos, que el sujeto inhalaD El compuesto activo se puede aerosolizar en una variedad de formas, tal como, pero no limitado a,
25 inhalantes de polvo seco, inhalantes de dosis medida, o suspensiones liquido/liquidoD Las particulas respirables pueden ser liquidas o solidasD Las particulas pueden contener opcionalmente otros ingredientes terapeuticos tal como amilorida, benzamil o fenamil, con el compuesto seleccionado incluido en una cantidad efectiva para inhibir la reabsorcion de agua de secreciones mucosas de las vias respiratorias, como se describe en la Patente Estadounidense NoD 4,501,729D
30 La composicion farmaceutica particulada se puede combinar opcionalmente con un portador para ayudar en la dispersion o el transporteD Se puede mezclar un portador adecuado tal como un azucar (es decir, lactosa, sacarosa, trehalosa, mannitol) con el compuesto o compuestos activos en cualquier relacion adecuada (por ejemplo, una relacion de 1 a 1 en peso)D
Las particulas comprendidas del compuesto activo deben incluir particulas de tamano respirable, es decir, particulas
35 de un tamano suficientemente pequeno para pasar a traves de la boca o nariz y laringe luego de inhalacion y en los bronquios y alveolos de los pulmonesD En general, son respirables las particulas varian de aproximadamente 1 a 10 micras de tamano (mas particularmente, menos de aproximadamente 5 micras de tamano)D Las particulas de tamano no respirable que se incluyen en el aerosol se tienden a depositar en la garganta y se tragan, y la cantidad de particulas no respirables en el aerosol se minimiza preferiblementeD Para administracion nasal, se prefiere un
40 tamano de particula en el rango de 10-500 uM para asegurar la retencion en la cavidad nasalD
Las composiciones farmaceuticas liquidas del compuesto activo para producir un aerosol se pueden preparar al combinar el compuesto activo con un vehiculo adecuado, tal como agua libre de pirogeno esterilD Las soluciones salinas hipertonicas utilizadas son preferiblemente soluciones libres de pirogeno, esteriles, que comprenden de uno a quince por ciento (en peso) de la sal fisiologicamente aceptable, y mas preferiblemente de tres a siete por ciento
45 en peso de la sal fisiologicamente aceptableD
Los aerosoles de particulas liquidas que comprenden el compuesto activo se pueden producir mediante cualesquier medios adecuados, tal como con un nebulizador a chorro impulsado por presion o un nebulizador ultrasonicoD Vease, por ejemplo, Patente Estadounidense NoD 4,501,729D Los nebulizadores son dispositivos comercialmente disponibles que transforman soluciones o suspensiones del ingrediente activo en un rocio de aerosol terapeutico por
50 medio de aceleracion de gas comprimido, normalmente aire u oxigeno, a traves de un orificio venturi angosto o por medio de agitacion ultrasonicaD
Las formulaciones adecuadas para uso en nebulizadores consisten del ingrediente activo en un portador liquido, el ingrediente activo que comprende hasta 40 % p/p de la formulacion, pero preferiblemente menos de 20 % p/pD El portador es normalmente agua (y mas preferiblemente agua libre de pirogenos, esteril) o una solucion alcoholica acuosa diluida, preferiblemente hecha isotonica, pero puede ser hipertonica con fluidos corporales mediante de la adicion de, por ejemplo, cloruro de sodioD Los aditivos opcionales incluyen conservantes si la formulacion no se hace esteril, por ejemplo, metil hidroxibenzoato, antioxidantes, agentes aromatizantes, aceites volatiles, agentes reguladores y tensoactivosD
5 Los aerosoles de particulas solidas que comprenden el compuesto activo se pueden producir de otra forma con cualquier generador de aerosol de particulado solidoD Los generadores de aerosol para administrar terapeuticos particulados solidos a un sujeto producen particulas que son respirables y generan un volumen de aerosol que contienen una dosis medida predeterminada de un terapeutico en un indice adecuado para administracion a un humanoD Un tipo ilustrativo de generador en aerosol particulado solido es un insufladorD Las formulaciones
10 adecuadas para administracion mediante insuflacion incluyen polvos finamente desmenuzados que se pueden suministrar por medio de un insuflador o puestos en la cavidad nasal en la forma de una inhalacionD En el insuflador, el polvo (por ejemplo, una dosis medida del mismo efectiva para llevar a cabo los tratamientos descritos aqui) esta contenido en capsulas o cartuchos, normalmente hechos de gelatina o plastico, que se perforan o se abren in situ y el polvo suministrado por aire aspirado a traves del dispositivo luego de inhalacion o por medio de una bomba
15 operada manualmenteD El polvo empleado en el insuflador consiste unicamente del ingrediente activo o de una mezcla de polvo que comprende el ingrediente activo, un diluyente de polvo adecuado, tal como lactosa, y un tensoactivo opcionalD El ingrediente activo normalmente comprende de 0D1 a 100 p/p de la formulacionD
Un segundo tipo de generador en aerosol ilustrativo comprende un inhalador de dosis medidaD Los inhaladores de dosis medida son dispensadores en aerosol presurizados, normalmente que contienen una formulacion de 20 suspension o solucion del ingrediente activo en un propulsor licuificadoD 0urante el uso estos dispositivos descargan la formulacion a traves de una valvula adaptada para suministrar un volumen medido, normalmente de 10 a 200 ul, para producir un rociador de particula fino que contiene el ingrediente activoD Los propulsores adecuados incluyen ciertos compuestos de clorofluorocarbono, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano y mezclas de los mismosD La formulacion puede contener adicionalmente uno o mas co
25 solventes, por ejemplo, etanol, tensoactivos, tal como acido oleico o trioleato de sorbitan, antioxidantes y agentes aromatizantes adecuadosD
Se puede incorporar un agente de iARN en las composiciones farmaceuticas adecuadas para administracionD Por ejemplo, las composiciones pueden incluir una o mas especies de un agente de iARN y un portador farmaceuticamente aceptableD Como se utiliza aqui la frase quot;portador farmaceuticamente aceptablequot; pretende incluir 30 cualquiera y todos los solventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y que retrasan la absorcion, y similares, compatibles con la administracion farmaceuticaD El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas se conoce bien en la tecnicaD Excepto en la medida que cualquier medio o agente convencional es incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composicionesD Tambien se pueden incorporar compuestos activos complementarios en las
35 composicionesD
Se puede proporcionar administracion por el sujeto o por otra persona, por ejemplo, un cuidadorD Un cuidador puede ser cualquier entidad involucrada con el suministro de cuidado al humano: por ejemplo, un hospital, hospicio, consultorio medico, clinica ambulatoria; un trabajador de la salud tal como un medico, una enfermera u otro profesional; o un conyuge o tutor, tal como un familiarD Se puede proporcionar el medicamento en dosis medidas o
40 en un dispensador que suministra una dosis medidaD
El termino quot;cantidad terapeuticamente efectivaquot; es la cantidad presente en la composicion que se necesita para proporcionar el nivel deseado de farmaco en el sujeto que se va a tratar para dar la respuesta fisiologica anticipadaD
El termino quot;cantidad fisiologicamente aceptablequot; es aquella cantidad suministrada a un sujeto para proporcionar el efecto paliativo o curativo deseadoD
45 El termino quot;portador farmaceuticamente aceptablequot; significa que el portador se puede colocar en los pulmones sin efectos toxicologicos adversos significativos en los mismosD
El termino quot;co-administracionquot; se refiere a administrar a un sujeto dos o mas agentes, y en particular dos o mas agentes de iARND Los agentes pueden estar contenidos en una unica composicion farmaceutica y ser administrados al mismo tiempo o los agentes pueden estar contenidos en una formulacion separada y administrada en serie a un
50 sujetoD Siempre y cuando se puedan detectar los dos agentes en el sujeto al mismo tiempo, se dice que los dos agentes se van a coadministrarD
Los tipos de excipientes farmaceuticos que son utiles como portadores incluyen estabilizadores tales como albumina de suero humano (HSA), agentes de volumen tales como carbohidratos, aminoacidos y polipeptidos; ajustadores o reguladores de pH; sales tales como cloruro de sodio; y similaresD Estos portadores pueden estar en una forma
55 cristalina o amorfa o pueden ser una mezcla de las dosD Los agentes de volumen que son particularmente valiosos incluyen carbohidratos compatibles, polipeptidos, aminoacidos o combinaciones de los mismosD Los carbohidratos adecuados incluyen monosacaridos tales como galactosa, 0-manosa, sorbosa, y similares; disacaridos, tales como lactosa, trehalosa, y similares; ciclodextrinas, tales como 2-hidroxipropil-DbetaD-ciclodextrina; y polisacaridos, tales como rafinosa, maltodextrinas, dextranos, y
5 similares; alditoles, tales como manitol, xilitol, y similaresD Un grupo preferido de carbohidratos incluye lactosa, trehalosa, rafinosa maltodextrinas, y manitolD Los polipeptidos incluyen aspartamoD Los aminoacidos incluyen alanina y glicina, siendo preferida la glicinaD
Los ajustadores o reguladores de pH adecuados incluyen sales organicas preparadas a partir de bases y acidos organicos, tales como citrato de sodio, ascorbato de sodio, y similares; se prefiere citrato de sodioD
10 0osificacion
Se puede administrar un agente de iARN en una dosis menor de aproximadamente 75 mg por kg de peso corporal, o menor de aproximadamente 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2, 1, 0D5, 0D1, 0D05, 0D01, 0D005, 0D001, o 0D0005 mg por kg de peso corporal, y menor de 200 nmol de agente de iARN (por ejemplo, aproximadamente 4D4 x 1016 copias) por kg de peso corporal, o menor de 1500, 750, 300, 150, 75, 15, 7D5, 1D5, 0D75, 0D15, 0D075, 0D015, 0D0075, 0D0015,
15 0D00075, 0D00015 nmol de agente de iARN por kg de peso corporalD La dosis unitaria, por ejemplo, se puede administrar mediante inyeccion (por ejemplo, intravenosa o intramuscular, intratecalmente, o directamente en un organo), una dosis inhalada, o una aplicacion topicaD
La dosificacion puede ser una cantidad efectiva para tratar o evitar una enfermedad o trastornoD Se puede proporcionar profilacticamente o como el principal o una parte de un protocolo de tratamientoD
20 En una realizacion, la dosis unitaria se administra menos frecuentemente de una vez al dia, por ejemplo, menos de cada 2, 4, 8 o 30 diasD En otra realizacion, la dosis unitaria no se administra con una frecuencia (por ejemplo, no una frecuencia regular)D Por ejemplo, se puede administrar la dosis unitaria una unica vezD En razon a que el agente de iARN mediado por inactivacion puede persistir durante varios dias despues de administrar la composicion de agente de iARN, en muchos casos, es posible administrar la composicion con una frecuencia de menos de una vez por dia,
25 o, para algunos casos, solo una vez para el regimen terapeutico completoD
En una realizacion, se administra a un sujeto una dosis inicial de un agente de iARN, por ejemplo, un agente de doble cadena de iARN, o agente de siARN, (por ejemplo, un precursor, por ejemplo, un agente de iARN mas grande que se puede procesar en un agente de siARN, o un A0N que codifica un agente de iARN, por ejemplo, un agente de iARN de doble cadena, o agente de siARN, o precursor del mismo)D La dosis o dosis de mantenimiento son 30 generalmente menores que la dosis inicial, por ejemplo, menos de la mitad de la dosis inicialD Un regimen de mantenimiento puede incluir tratar el sujeto con una dosis o dosis que varian de 0D01 a 75 mg/kg de peso corporal por dia, por ejemplo, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2, 1, 0D5, 0D1, 0D05, 0D01, 0D005, 0D001, o 0D0005 mg por kg de peso corporal por diaD Las dosis de mantenimiento se administran preferiblemente no mas de una vez cada 5, 10, o 30 diasD Adicionalmente, el regimen de tratamiento puede durar un periodo de tiempo que variara dependiendo de la 35 naturaleza de la enfermedad particular, su severidad y la condicion general del pacienteD En las realizaciones preferidas se puede suministrar la dosificacion no mas de una vez por dia, por ejemplo, no mas de una vez por 24, 36, 48, o mas horas, por ejemplo, no mas de una vez cada 5 u 8 diasD Luego de tratamiento, se puede monitorear al paciente para cambios en su condicion y para el alivio de los sintomas del estado de la enfermedadD La dosificacion del compuesto se puede aumentar en el evento en que el paciente no responda de forma significativa a los niveles
40 de dosificacion actuales, o se puede reducir la dosis si se observa un alivio de los sintomas del estado de la enfermedad, si ha disminuido el estado de la enfermedad o si se observan efectos secundarios no deseadosD
Se puede administrar la dosis efectiva en una dosis unica o en dos o mas dosis, segun se desee o se considere apropiado en las circunstancias especificasD Si se desea facilitar las infusiones repetidas o frecuentes, puede ser aconsejable la implantacion de un dispositivo de administracion, por ejemplo, una bomba, endoprotesis
45 semipermanente (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intracisternal o intracapsular), o reservorioD
0espues de un tratamiento exitoso, puede ser deseable hacer que el paciente se someta a terapia de mantenimiento para evitar la recurrencia del estado de enfermedad, en donde el compuesto se administra en dosis de mantenimiento, que varian desde 0D001 g hasta 100 g por kg de peso corporal (vease documento US 6,107,094)D
La concentracion de la composicion de agente de iARN es una cantidad suficiente para que sea efectiva en tratar o
50 evitar un trastorno o para regular una condicion fisiologica en los humanosD La concentracion o cantidad de agente de iARN administrada dependera de los parametros determinados para el agente y el metodo de administracion, por ejemplo, nasal, bucal o pulmonarD Por ejemplo, las formulaciones nasales tienden a requerir concentraciones mucho mas bajas de algunos ingredientes con el fin de evitar la irritacion o ardor de los pasajes nasalesD A veces es deseable diluir una formulacion oral hasta 10-100 veces con el fin de proporcionar una formulacion nasal adecuadaD Ciertos factores pueden influir la dosificacion requerida para tratar efectivamente un sujeto, que incluyen pero no se limitan a la severidad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o edad del sujeto, y otras enfermedades presentesD Tambien se apreciara que la dosificacion efectiva de un agente iARN tal como un siARN utilizado para el tratamiento puede aumentar o disminuir en el transcurso de un tratamiento particularD Los cambios en la dosificacion pueden resultar y ser evidentes a partir de los resultados de los ensayos de diagnosticoD Por ejemplo, se puede monitorear el sujeto despues de administrar una composicion de agente de iARND Con base en la informacion del monitoreo, se puede administrar una cantidad adicional de la composicion de agente de iARND
La dosificacion depende de la gravedad y capacidad de respuesta de la condicion de la enfermedad que se va a tratar, con el curso de tratamiento que dura desde varios dias hasta varios meses, o hasta que se efectua una cura o se logra una disminucion del estado de enfermedadD Se pueden calcular programas de dosificacion optimos a partir de mediciones de la acumulacion del farmaco en el cuerpo del pacienteD Las personas medianamente versadas pueden determinar facilmente dosificaciones optimas, metodologias de dosificacion e indices de repeticionD Las dosificaciones optimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de compuestos individuales, y de manera general se pueden estimar sobre la base de los EC50 encontrados por ser efectivos en modelos animales in vitro e in vivo como se describio anteriormenteD Los agentes de iARN como se describe aqui pueden ser utiles en el tratamiento y (cuando sea apropiado) en la prevencion de una cualquiera de las siguientes enfermedades/trastornos, fibrosis quistica, sindrome de Liddles, insuficiencia renal, hipertension, desequilibrios de electrolitosD
En particular, en algunas realizaciones, los agentes de iARN se pueden utilizar para tratar y/o evitar manifestaciones clinicas adversas de estas enfermedades/trastornosD
La invencion se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos, que no se deben interpretar como limitantesD
EJEMPLOS
Fuente de los reactivos
Cuando la fuente de un reactivo no se proporciona especificamente aqui, dichos reactivos se pueden obtener a partir de cualquier proveedor de reactivos para biologia molecular en un estandar de calidad/pureza para su aplicacion en biologia molecularD
Ejempeo�1:�Seeecci6n�ee�secuencias
Con el fin de identificar siARN terapeuticos para modular en forma descendente la expresion de la subunidad alfa del canal de sodio epitelial ENaC (a-ENaC), se definen los grupos de deteccion con base en un analisis bioinformaticoD Los factores clave para el diseno del grupo de deteccion tienen especificidad predicha de los siARN contra el transcriptoma de las especies pertinentesD Para la identificacion de siARN alfa-ENaC y un sistema de entrega eficiente se utiliza un metodo de tres vertientes: se seleccionan ratas como la especie de prueba para impulsar la eficacia de la inactivacion in vivo despues de suministro intratraqueal, se seleccionan conejillos de indias como el organismo modelo de la enfermedad para demostrar que la reduccion de mARN alfa-ENaC resulta en un efecto funcional medibleD La molecula de siARN terapeutica tiene que objetivar el alfa-ENaC humano, asi como tambien la secuencia alfa-ENaC de por lo menos una especie toxicologia importante, en este caso, macaco de la indiaD
El analisis inicial de la secuencia de mARN alfa-ENaC importante revela pocas secuencias que se pueden identificar que cumplen los requerimientos de especificidad y al mismo tiempo el mARN alfa-ENaC objetivo en todas las especies pertinentesD Por lo tanto, se decide disenar grupos de deteccion independientes para el siARN terapeutico y para las moleculas sustitutas que se van a probar en el modelo de enfermedad relevante (Tablas 1A, 1B, 1C y 10)D
Todos los siARN reconocen la secuencia de alfa-ENaC humana, cuando se selecciona un sistema de cultivo de celulas humanas para determinacion de la actividad in vitro (H441, vease adelante)D Por lo tanto todos los siARN se pueden utilizar para objetivar el mARN alfa-ENaC humano en una configuracion terapeuticaD
Se disenan los grupos de deteccion terapeuticos para contener solo las secuencias de siARN que son totalmente complementarias a las secuencias alfa- ENaC humanas y de macaco de la indiaD
0iseno y seleccion in silico de siARN que dirige alfa-ENaC (SCNN1A)
Se lleva a cabo e diseno de siARN para identificar siARN para los cuatro grupos previamente definidos (vease anteriormente)
a) quot;grupo de deteccion inicialquot; b) quot;grupo de deteccion extendidaquot;
c) quot;Grupo sustituto in vivo de rataquot;
d) quot;Grupo sustituto in vivo de conejillo de indiasquot;
Grupo de deteccion inicial
5 El objetivo de la seleccion in silico de un grupo de deteccion inicial es identificar los siARN que objetivan especificamente el alfa-ENaC humano, asi como tambien su ortologo de macaco de la indiaD El mARNm objetivo humano (NM 001038D4) se descarga de los recursos de NCB1 (http://wwwDncbiDnlmDnihDgov/entrez/queryDfcgi?CM0=search&0B=nucleotide) durante el procedimiento de seleccion de siARN completoD Con el fin de identificar el ortologo alfa- ENaC macaco de la india (Macaca mulatta), se utiliza la
10 secuencia humana en una busqueda blastn en el Baylor College of Medicine (http://wwwDhgscDbcmDtmcDedu/blast/?organism=Mmulatta) contra Mmulatta contigs desde el 2004 10 01D Todas las regiones de acierto se extraen y montan por la herramienta de montaje CAP para generar una primera secuencia de montajeD Adicionalmente, se realiza una busqueda BLAST con la secuencia humana en UCSC (http://genomeDucscDedu/cgi-bin/hgBlat?command=start&org=Rhesus&db=rheMac2&hgsid=84859356) contra
15 macaco de la india congelado 12 de marzo 2005D El acierto de andamio 84554 se descarga y utiliza junto con la primera secuencia de montaje por CAP para generar la secuencia de consenso final para alfa-ENaC de macaco de la indiaD
Luego de la extraccion de todas las secuencias superpuestas 19mero fuera del mARN humano, se identifican 19meros conservados que tienen secuencias identicas en la secuencia de consenso ensamblada de macaco de la
20 indiaD Esas secuencias de 19mero se definen como el grupo de secuencias de siARN con reactividad cruzada de macaco de la india-humano (sentido), representado por 1185 19merosD
Las secuencias antisentido correspondientes se generan y prueban para especificidad en humanosD Por esto, su potencial predicho para interactuar con los mARN objetivo irrelevantes (fuera de objetivos potenciales) se toma como parametroD Las secuencias con bajo potencial fuera de objetivo se definen como preferibles y se predice que son
25 mas especificasD
Para una seleccion adicional, los siARN candidatos se clasifican de acuerdo con su potencial predicho para interactuar con otras secuencias anfitrionas (aqui, sin limitacion, humanas)D Se asume que los siARN con bajo potencial fuera de objetivo son mas especificos in vivoD Para predecir el potencial fuera de objetivo especifico de siARN, se hacen los siguientes supuestos:
30 1) se puede deducir el potencial fuera de objetivo de una cadena a partir del numero y distribucion de los emparejamientos incorrectos para un fuera de objetivo
2) el fuera de objetivo mas importante, es decir el gen que se predice tiene la probabilidad mas alta de ser inactivado debido a la tolerancia de los emparejamientos incorrectos, determina el potencial fuera de objetivo de la cadena
3) las posiciones 2 a 9 (conteo de 5' hasta 3') de una cadena (region semilla) pueden contribuir mas al potencial
35 fuera de objetivo que el resto de la secuencia (es decir, region del sitio de division y sin semilla) (Haley, BD, and Zamore, PD0D, Nat Struct Mol BiolD 2004, 11:599)D
4) las posiciones 10 y 11 (contando 5' a 3') de una cadena (region de sitio de division) pueden contribuir mas al potencial fuera de objetivo que la region sin semilla (es decir las posiciones 12 a 18, contando 5' a 3')
5) las posiciones 1 y 19 de cada cadena no son relevantes para interacciones fuera de objetivo
40 6) el potencial fuera de objetivo se puede expresar por la clasificacion fuera de objetivo de los fuera de objetivo mas relevantes, calculado con base en el numero y posicion de los emparejamientos incorrectos de la cadena a la region mas homologa en el gen fuera de objetivo considerando los supuestos 3 a 5
7) asumir el aborto potencial de la actividad de sentido de cadena mediante modificaciones internas introducidas, solo sera relevante el potencial fuera de objetivo de la cadena antisentido
45 Para identificar genes potencial fuera de objetivoes, las secuencias antisentido 19mero se someten a una busqueda de homologia en contra de las secuencias de mARN humanas disponibles para el publico, que se supone representan el transcriptoma comprehensivo humanoD
Para este proposito, las busquedas fastA (version 3D4) se realizan con todas las secuencias 19mero contra una base de datos RefSeq humana (disponible la version de ftp://ftpDncbiDnihDgov/refseq/ el 18 de noviembre, 2005)D La busqueda FastA se ejecuta con los parametros de valores pares -30 f - g 30 con el fin de tener en cuenta la homologia sobre la longitud completa de la 19mero sin espaciosD Adicionalmente, con el fin de asegurar el listado de
5 todos los aciertos fuera de objetivo pertinentes en el archivo de salida fastA se utiliza el parametro E - 15000D
La busqueda da como resultado una lista de potenciales fuera de objetivo de cada secuencia de entrada enumerados por homologia de secuencia descendente sobre la 19mero completaD
Para clasificar los potenciales fuera de objetivo de acuerdo con los supuestos 3 a 5, y con esto identificar el gen fuera de objetivo mas relevante y su clasificacion fuera de objetivo, los archivos de salida fastA se analizan mediante
10 una secuencia de comandos perlD
La secuencia de comandos extrae las siguientes propiedades fuera de objetivo para cada secuencia de entrada 19mero y cada gen fuera del objetivo para calcular la clasificacion fuera de objetivo:
Numero de emparejamientos incorrectos en region sin semilla
Numero de emparejamientos incorrectos en region semilla
15 Numero de emparejamientos incorrectos en la region del sitio de division
La calificacion fuera de objetivo se calcula al considerar los supuestos de 3 a 5 como sigue:
Calificacion fuera de = numero de emparejamientos incorrectos de semilla * 10
objetivo
+
numero de emparejamientos incorrectos de sitio de division * 1D2
+
numero de emparejamientos incorrectos sin semilla * 1,
El gen fuera de objetivo mas relevante para cada secuencia de 19mero se define como el gen con la calificacion fuera de objetivo mas bajaD 0e acuerdo con lo anterior, la calificacion fuera de objetivo mas baja se define como representativa para el potencial fuera de objetivo de cada siARN, representado por la secuencia antisentido 19mero
20 analizadaD
El potencial fuera de objetivo calculado se utiliza como parametro de clasificacion (descendente por calificacion fuera de objetivo) con el fin de generar una clasificacion para todas las secuencias de siARN con reactividad cruzada de macaco de la india-humanoD
Una calificacion fuera de objetivo de 3 o mas se define como requisito previo para la seleccion de siARN, mientras
25 que se excluyen todas las secuencias que contienen 4 o mas G en una fila (secuencias poli-G), lo que lleva a seleccion de un total de 152 siARN que objetivan ENAC alfa de humano y de macaco de la india (vease Tabla 1a)D
Grupo de deteccion extendida
El objetivo de la seleccion in silico del grupo de deteccion extendida es identificar todos los siARN que se dirigen a alfa- ENaC humano adicionales con suficiente especificidad, que se excluyen del grupo inicial debido a la falta de
30 reactividad cruzada con macaco de la indiaD Se toman las secuencias restantes del grupo de 19meros derivadas de alfa- ENaC que no se han analizado anteriormente y se generan las secuencias antisentido correspondientesD El gen fuera de objetivo mas relevante y sus calificaciones fuera de objetivo correspondientes se calculan como se describe en la seccion quot;Grupo de deteccion inicial quot;D
Para determinar la reactividad cruzada para el raton y conejillo de indias (Cavia porcellus/cobya), las secuencias
35 alfa- ENaC de estas especies se descargan de la base de datos de nucleotidos NCB1 1 (numeros de acceso NM 011324D1 y AF071230 (longitud completa)/0Q109811 (cds parcial), respectivamente)D Las dos secuencias del conejillo de 1ndias se utilizan para generar una secuencia de consenso alfa-ENaC de conejillo de 1ndiasD Se prueba cada secuencia de 19mero humana para presencia en las secuencias de raton y conejillo de 1ndiasD Las secuencias positivas se asignan al grupo de secuencias de siARN de reaccion cruzada humano-raton (sentido), o secuencias de
40 siARN de reaccion cruzada humano-conejillo de indias (sentido)D 0espues de la exclusion de todas las secuencias de poli-G, las secuencias se seleccionan con calificaciones de fuera de objetivo de 3 o mas, asi como tambien aquellas con calificaciones fuera de objetivo de 2D2 o 2D4 y reactividad cruzada a raton, macaco de la india o conejillo de indiasD El numero total de siARN en el grupo de deteccion extendida es 344 (vease Tabla 1b)D
Grupo sustituto in vivo de rata
El objetivo de la seleccion in silico del grupo sustituto in vivo de rata es identificar todos los siARN que objtivan alfa- ENaC humano y de rata con suficiente especificidad en rataD Para la identificacion de siARN de reaccion cruzada humano-rata, la secuencia de mARN de alfa-ENaC de rata se descarga de la base de datos de nucleotidos NCB1
5 (numero de acceso, NM 031548D2), y se prueban todas las secuencias fuera del grupo de 19mers humanos para presencia en la secuencia de la rata, que representa el grupo de secuencias de siARN de reaccion cruzada humano -rata (sentido)D
Se generan las secuencias antisentido correspondientes y se ensayan para especificidad en rataD Para ello, el gen fuera de objetivo mas importante, en la rata y sus calificaciones fuera de objetivo correspondientes se calculan como
10 se describe en la seccion quot; Grupo de deteccion inicialquot; utilizando el grupo de mARN de rata (base de datos RefSeq) en lugar de las transcripciones humanasD 0espues de la exclusion de todas las secuencias de poli-G, se genera una clasificacion que considera la calificacion fuera de objetivo de rata en primera prioridad y la calificacion fuera de objetivo humano en segunda prioridadD Se seleccionan finalmente aquellas 48 secuencias de la parte superior de la lista que representan el grupo sustituto in vivo de rata (vease Tabla 1c)D
15 Grupo sustituto de conejillo de 1ndias in vivo
El objetivo de la seleccion in silico del grupo sustituto de conejillo de 1ndias in vivo es identificar todos los siARN que objetivan alfa-ENaC de humano y conejillo de 1ndias que no se han seleccionado en los grupos anterioresD Los siARN restantes del grupo determinado previamente de secuencias de siARN reaccion cruzada de humano-conejillo de indias (sentido) se clasifican de acuerdo a las calificaciones fuera de objetivo de humanoD Se seleccionan las
20 mejores 63 secuencias (que excluyen las secuencias poli-G), que representan el grupo sustituto de conejillo de 1ndias in vivo (ver Tabla 1d)D
Ejempeo 2: Sintesis ee�si�RN
Sintesis de nucleotidos que comprenden bases naturales
Como los siARN de los grupos de deteccion son todos potencialmente destinados para administracion in vivo, se
25 sintetizan siARN con una estrategia de modificacion que protege los siARN de la degradacion por endo-y exonucleasas en un ambiente biologicoD En esta estrategia, los extremos 3' de ambas cadenas se protegen de una actividad 3' -gt; 5'- exonucleotidica mediante un enlace de fosforotioato entre las dos ultimas nucleobases en el extremo 3'D Con el fin de inhibir la degradacion de endo-nucleolitica de siARN se reemplazan todas las pirimidinas en la cadena sentido del siARN con el ribonucleotido modificado 2'-O-metil correspondienteD Para reducir el numero de
30 modificaciones en la cadena antisentido, que es la cadena mas activa y por lo tanto mas sensible a modificaciones, solo modificamos las pirimidinas en el contexto de los sitios de division de nucleasa principales identificados previamente con los grupos 2'-O-metiloD Los sitios de division principales son los siguientes dos motivos de secuencia: 5'-UA-3' y 5'-CA-3'D
Ya que tambien se ha considerado utilizar siARN en formulaciones que potencialmente protegen los ARN del
35 ambiente biologico nucleolitico en el pulmon, tambien se sintetiza el mismo grupo de siARN y sin ninguna proteccion de la degradacion endonucleoliticaD
Mientras que la fuente de un reactivo no se da especificamente aqui, dicho reactivo se puede obtener de cualquier proveedor de reactivos para la biologia molecular en un estandar de calidad/pureza para aplicacion en la biologia molecularD
40 Los ARN de cadena simple se producen mediante sintesis en fase solida en una escala de 1 mmol usando un sintetizador Expedite 8909 (Applied Biosystems, Applera 0eutschland GmbH, 0armstadt, Alemania) y vidrio de porocontrolado (CPG, 500A, Proligo Biochemie GmbH, Hamburgo, Alemania) como soporte solidoD El ARN y ARN que contienen nucleotidos 2'-O-metilo se generan mediante sintesis en fase solida que emplea las fosforamiditas correspondientes y fosforamiditas 2'-O-metilo, respectivamente (Proligo Biochemie GmbH, Hamburgo, Alemania)D
45 Estos bloques de construccion se incorporan en sitios seleccionados dentro de la secuencia de la cadena de oligorribonucleotidos utilizando quimica de fosforamidita de nucleosido estandar, descrita en in Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, SDLD et alD (EdrsD), John Wiley & Sons, 1ncD, New York, NY, USAD Se introducen enlaces de fosforotioato mediante el reemplazo de la solucion oxidante de yodo con una solucion del reactivo de Beaucage (Chruachem Ltd, Glasgow, Reino Unido) en acetonitrilo (1%)D Se obtienen reactivos auxiliares adicionales
50 de Mallinckrodt Baker (Griesheim, Alemania)D
La desproteccion y purificacion de los oligo-ribonucleotidos crudos mediante HPLC de intercambio anionico se llevan a cabo de acuerdo con procedimientos establecidosD Los rendimientos y las concentraciones se determinan mediante absorcion UV de una solucion de los respectivos ARN en una longitud de onda de 260 nm utilizando un fotometro espectral (0U 640B, Beckman Coulter GmbH, Unterschlei�heim, Alemania)D Se genera ARN de doble cadena al mezclar una solucion equimolar de cadenas complementarias en regulador de hibridacion (fosfato de sodio 20 mM, pH 6D8, cloruro de sodio 100 mM), se calienta en un bano de agua a 85-90quot; C durante 3 minutos y se enfria hasta temperatura ambiente durante un periodo de 3 a 4 horasD La solucion de ARN hibridada se diluye a una
5 concentracion de 50 Imoles de doble cadena ARN/L y se almacena a -20quot; C hasta usoD
Ejempeo 3: �prueba�si�RN �in vitro
La capacidad de los agentes de iARN para inhibir la expresion de alfa-ENaC se prueba en estirpes celulares humanas in vitro, o in vivo en ratasD El agente de iARN se transfecta en las celulas, por ejemplo, mediante transfeccion, se deja actuar en las celulas durante un tiempo determinado, por ejemplo, 24 horas, y se determinan
10 los niveles de mARN de alfa-ENaC mediante analisis de A0N ramificadoD Alternativamente, el agente de iARN se administra in vivo a traves de la ruta intratraqueal y la inhibicion de la expresion mARN alfa-ENaC se determina mediante analisis de A0N ramificado en el organo objetivoD Complementando estos ensayos directos, hemos probado la inhibicion de la expresion genica objetivo mediante agentes de iARN para el mARN alfa- ENaC recombinante expresado en celulas anfitrionas de mamiferoD
15 Estirpes celulares
Se obtienen celulas H441 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC -Numero: HTB -174, LCG Promochem GmbH, Wesel, Alemania) y se cultivan en medio RPM1 1640, 10% de suero de ternero fetal, 100 U de penicilina/100 Ig/ml de estreptomicina, L-glutamina2 mM, Hepes 10 nM y piruvato de sodio 1 mM (todos de Biochrom AG, Berlin, Alemania) a 37quot; C bajo una atmosfera de 5% de CO2/95% de aireD
20 Se obtienen celulas epiteliales bronquiales humanas primarias de Cambrex (Cat # CC-2540) y se cultivan de forma rutinaria en medio BEGM con SingleQuots (Cambrex Cat # CC-3170 menos tri-yodotreonina)D Para polarizacion y crecimiento en la interfaz aire-liquido las celulas se cultivan en una mezcla 01:01 de BEGM: 0MEM complementado con 4D5 g/L de 0-glucosa (Gibco BRL Cat # 41965-039) y complementado con SingleQuots (Cambrex Cat # CC4175), como anteriormente pero menos la triyodotreonina y alicuotas GA1000 y en la presencia de 50 Ig/ml de
25 gentamicina (Gibco BRL Cat # 10131-015)D Como las celulas se mantienen en medio libre de suero, se utiliza solucion de neutralizacion de tripsina durante las etapas de pasaje (Cambrex Cat # CC- 5002)D Para la polarizacion y cultivo en la interfaz aire-liquido se cultivan las celulas en soportes de policarbonato semipermeable (0D4 micras) (Coming Costar CatD # 3407 # 3460) y se cultivan a 37quot; C bajo una atmosfera 5% de CO2/95% de aireD
Se cultivan celulas de rinon de mono verde africano Cos- 1 (ATCC # CRL -1650) en MEM de 0ulbecco, 4D5 g/L de
30 glucosa, 10% de suero bovino fetal, L-glutamina 2 mM, 1D5 g/L de bicarbonato de sodio (Gibco BRL), penicilina 100 U/100 Ig/mL de estreptomicinaD
Ejempeo 3.1: �Detecci6n�in �vitro �para�eeterminaci6n IC50 ee�si�RN aefa-�ENaC �activo�en��441
Un dia antes de transfeccion, se induce expresion ENAC -alfa en celulas H441 (ATCC -Numero: HTB -174, LCG Promochem GmbH, Wesel, Alemania) al agregar 100 nM de dexamtasonaD 0irectamente antes de transfeccion, se 35 siembran celulas a 1D5 x 104 celulas/pozo en placas de 96 pozos (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania) en 75 Il de medio de crecimiento (medio RPM1 1640, 10% de suero fetal bovino, 100 U de penicilina/100 Ig/ml de estreptomicina, L-glutamina 2 mM, Hepes 10 nM y piruvato de sodio 1 mM, todos de Biochrom AG, Berlin, Alemania)D Las transfecciones se realizan por cuadruplicadoD Para cada pozo 0D5 Il de Lipofectamine 2000 (1nvitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania) se mezclan con 12 IL de Opti-MEM (1nvitrogen) y se incuban durante 15
40 min hasta temperatura ambienteD Para la concentracion de siARN es 50 nM en volumen de transfeccion de 100 IL, se mezclan 1 IL de IM de siARN 5 con 11D5 IL de Opti-MEM por pozo, combinado con la mezcla de Lipofectamine 2000-Opti-MEM y se incuban de nuevo durante 15 minutos hasta temperatura ambienteD Se aplican completamente complejos de siARN-Lipofectamine 2000 (25 IL cada uno por pozo) a las celulas y estas se incuban durante 24 horas a 37quot; C y 5% de CO2 en un incubador humidificado (Heraeus GmbH, Hanau)D
45 Se cosechan las celulas al aplicar 50 IL de mezcla de lisis (contenido del kit de QuantiGene 0NA de Genospectra, Fremont, EEDUUD) a cada pozo que contenia 100 IL de medio de crecimiento y se lisan a 53° C durante 30 minD Posteriormente, 50 IL de los lisados se incuban con grupos de sonda especificos para ENaC-alfa humano y GAP0H humano (vease adelante secuencia de mediciones de sonda) y se procede de acuerdo con el protocolo del fabricante para QuantiGeneD Al final se mide la quimioluminiscencia en una Luz Victor2 (Perkin Elmer, Wiesbaden,
50 Alemania) como RLU (unidades de luz relativas) y los valores obtenidos con las mediciones de sonda hENaC se normalizan a los valores de GAP0H respectivos para cada pozoD Los valores obtenidos con los siARN dirigidos contra ENaC-alfa se relacionan con el valor obtenido con un siARN no especifico (dirigido contra el HCV), que se establece en 100%D La expresion residual en porcentaje de alfa-ENaC para ejemplos de siARN se muestra en las Tablas 1A- 10D
Los siARN efectivos de la deteccion se caracterizan adicionalmente por las curvas de respuesta de dosisD Las transfecciones de curvas de respuesta de dosis se realizan en las siguientes concentraciones: 100 nM, 16D7 nM, 2D8 nM, 0D46 nM, 77 picoM, 12D8 picoM, 2D1 picoM, 0D35 picoM, 59D5 fM, 9D9 fM y se simula (sin siARN) y se diluyen con Opti-MEM a una concentracion final de 12D5 IL de acuerdo con el protocolo anteriorD El analisis de datos se realiza utilizando Microsoft Excel con el software XL -fit 4D2 incorporado (10BS, Guildford, Surrey, Reino Unido) y aplicando el numero de modelo sigmoidal 606D Grupos de sonda: alfa- ENaC humano: Nombre Miembros Funcion Secuencia SEQD1D0DNO: FPL hENAC001 D235D255DCE CE gtctgtccagggtttccttccTTTTTctcttggaaagaaagt 1645 hENAC002 D274D293DCE CE actgccattcttggtgcagtTTTTTctcttggaaagaaagt 1646 hENAC003 D344D367DCE CE ctctcctggaagcaggagtgaataTTTTTctcttggaaagaaagt 1647 hENAC004 D391D411DCE CE gccgcggatagaagatgtaggTTTTTctcttggaaagaaagt 1648 hENAC005 D501D521DCE CE gcacttggtgaaacagcccagTTTTTctcttggaaagaaagt 1649 hENAC006 D539D560DCE CE agcagagagctggtagctggtcTTTTTctcttggaaagaaagt 1650 hENAC007 D256D273DLE LE cgccataatcgcccccaaTTTTTaggcataggacccgtgtct 1651 hENAC008 D368D390DLE LE cacagccacactccttgatcatgTTTTTaggcataggacccgtgtct 1652 hENAC009 D412D431DLE LE acagtactccacgttctgggTTTTTaggcataggacccgtgtct 1653 hENAC010 D455D477DLE LE ggagcttatagtagcagtaccccTTTTTaggcataggacccgtgtct 1654 hENAC011 D522D538DLE LE acgctgcatggcttccgTTTTTaggcataggacccgtgtct 1655 hENAC012 D561D580DLE LE gagggccatcgtgagtaaccTTTTTaggcataggacccgtgtct 1656 hENAC013 D214D234DBL BL Tcatgctgatggaggtctcca 1657 hENAC014 D294D318DBL BL Ggtaaaggttctcaacaggaacatc 1658 hENAC015 D319D343DBL BL Cacacctgctgtgtgtactttgaag 1659 hENAC016 D432D454DBL BL Caggaactgtgctttctgtagtc 1660 hENAC017 D478D500DBL BL Gtggtctgaggagaagtcaacct 1661 hENAC018 D581D599DBL BL Ccattcctgggatgtcacc 1662 GAP0H humano: Nombre Miembros Funcion Secuencia SEQD1D0DNO: FPL
hGAP001 AF261085D252D271DCE CE gaatttgccatgggtggaatTTTTTctcttggaaagaaagt 1663 hGAP002 AF261085D333D352DCE CE ggagggatctcgctcctggaTTTTTctcttggaaagaaagt 1664
(continuacion)
Nombre Miembros Funcion Secuencia SEQD1D0DNO: FPL hGAP003 AF261085D413D431DCE CE ccccagccttctccatggtTTTTTctcttggaaagaaagt 1665 hGAP004 AF261085D432D450DCE CE gctcccccctgcaaatgagTTTTTctcttggaaagaaagt 1666 hGAP005 AF261085D272D289DLE LE agccttgacggtgccatgTTTTTaggcataggacccgtgtct 1667 hGAP006 AF261085D290D310DLE LE gatgacaagcttcccgttctcTTTTTaggcataggacccgtgtct 1668 hGAP007 AF261085D311D332DLE LE agatggtgatgggatttccattTTTTTaggcataggacccgtgtct 1669 hGAP008 AF261085D353D372DLE LE gcatcgccccacttgattttTTTTTaggcataggacccgtgtct 1670 hGAP009 AF261085D373D391DLE LE cacgacgtactcagcgccaTTTTTaggcataggacccgtgtct 1671 hGAP010 AF261085D451D472DLE LE ggcagagatgatgacccttttgTTTTTaggcataggacccgtgtct 1672 hGAP011 AF261085D392D412DBL BL Ggtgaagacgccagtggactc 1673 Los 1C50 para los ejemplos de siARN se muestran en la Tabla 2A y 2BD
Ejempeo 3.2: �tenuaci6n�aefa-ENaC transitoria en�un moeeeo�ee epiteeio�bronquiae �humano�primario:
Se colocan en placas celulas epiteliales bronquiales humanas (referencia de donante 4F1499) en placas de 24 5 pozos a 1x105 celulas por pozo en 0D5 mL de medio de crecimiento un dia antes de transfeccionD Las celulas son 70% confluentes en el dia de transfeccion de siARND
Cada siARN se vuelve a suspender en 100 nM en 1 mL de Optimem 1 (1nvitrogen) y en un tubo separado, Lipofectamine 2000 (1nvitrogen) se diluye hasta 6 IL/mL en Optimem, dando una cantidad suficiente para la transfeccion de cuatro repeticiones en una placa de 24 pozosD 0espues de 5 minutos hasta temperatura ambiente,
10 las mezclas se combinan para dar la concentracion final deseada de siARN 50 nM y 3 IL/mL de Lipofectamine 2000D La mezcla de transfeccion se incuba durante otros 20 minutos hasta temperatura ambiente y 420 IL del complejo de siARN/reactivo se agrega a cada pozo segun lo dictado por el diseno experimentalD Las placas se agitan suavemente para asegurar la mezcla completa y despues se incuban a 37quot; C en un incubador a 5% de CO2/95% de aire durante 4 horasD Posteriormente, la mezcla de transfeccion se aspiro y las celulas se vuelven a las condiciones
15 normales de cultivo durante 20 horas adicionalesD
Se preparan lisados celulares para el analisis de A0N ramificadoD Se prepara una mezcla de medio: regulador de lisis 2:1 (Panomics) y se lisan las celulas en 200 IL a 53quot; C durante 30 minutosD 0espues de una comprobacion visual para la lisis completa, los lisados celulares se almacenan a -80quot; C para posterior analisisD El analisis de A0N ramificado se realiza como se describio anteriormente, con la expresion de alfa-ENaC normalizada contra GAP0HD
20 El protocolo de analisis de A0N ramificado utilizado difiere del anterior solamente en que 20 IL de la muestra se aplica a cada pozo en este casoD
La Tabla 2C muestra la expresion de alfa-ENaC en HBEC primario para los ejemplos siARND
Ejempeo 3.3: Inhibici6n in vitro ee expresi6n genica aefa-EnaC ee macaco ee java ee ea ineia ceonaea expresaea�ex6genamente�para �agentes�i�RN seeeccionaeos�en�ceeueas �Cos-1
25 Clonacion de la secuencia alfa-ENaC de macaco de java
Secuencias de cebadores para amplificacion de 5' -UTR y C0S (los nucleotidos mostrados en parentesis corresponden a secuencias de cA0N a-ENaC de Macaca mulatta (macaco de la india),): P745: 5'- CTCCATGTTCTGCGGCCGCGGATAGAAG-3' (nt 1427) (SEQD1D0DNO:1674) P733: 5'- CCGGCCGGCGGGCGGGCT-3' (nt 1) (SEQD1D0DNO:1675)
P734: 5-CTCCCCAGCCCGGCCGCT-3' (nt 17) (SEQD1D0DNO:1676)
P735: 5'- GGCCGCTGCACCTGTAGGG-3' (nt 28) (SEQD1D0DNO:1677)
Secuencias de cebador para amplificacion de C0S y 3'-UTR:
P737: 5'- ATGGAGTACTGTGACTACAGG-3' (nt 1422) (SEQD1D0DNO:1678)
5 P740: 5'- TTGAGCATCTGCCTACTTG-3' (nt 3113) (SEQD1D0DNO:1679)
Secuencias de cebador para amplificacion de la parte interna de C0S:
P713: 5'- 5'-ATGGATGATGGTGGCTTTAACTTGCGG-3' (nt 1182) (SEQD1D0DNO:1679)
P715: 5'- 5'-TCAGGGCCCCCCCAGAGG-3' (nt 2108) (SEQD1D0DNO:1680)
Se compra ARN total pulmonar de macaco de java (Macaca fascicularis) (# R1534152-Cy-BC) de Biocat (Alemania)D
10 La sintesis de cA0N se realiza utilizando el Sistema de Sintesis de Primera Cadena SuperScript 111 (1nvitrogen)D La sintesis de cA0N se realiza utilizando ya sea hexameros aleatorios o cebadores oligo dTD Adicionalmente, el A0Nc de primera cadena de pulmon de macaco de java tambien se compra de Biocat/# C1534160-Cy-BC)D Para amplificacion por PCR, se utiliza el kit PCR Advantage 2 (# K1910-1, Clontech)D La amplificacion de 5'-UTR y partes de los C0S se realiza utilizando P745 y una mezcla equimolar de P733, P734 y P735D Para la amplificacion por PCR
15 de los C0S y 3'-UTR, se utilizan cebadores P737 y P740D Se utilizan cebadores P713 y P715 para la amplificacion de partes de los C0SD
Todos los productos de PCR se analizan por electroforesis en gel de agarosa y luego se clonan en el vector pCR2D1 utilizando el kit de clonacion TOPO TA (1nvitrogen) en bacterias TOP10D Los clones luego se recogen y se aisla el A0N utilizando el kit de Miniprep QiagenD 0espues de digestion de restriccion de enzima con EcoR1 y el analisis por
20 electroforesis en gel de agarosa, el A0N de los clones correctos se somete a secuenciacionD
Las secuencias luego se alinean con la secuencia de cA0N de a-ENaC de macaco de la india, y las secuencias de los clones individuales se alinean entre siD El cA0N alfa-ENaC de macaco de java de longitud completa luego se clona mediante digestion de la parte 5' (5'-UTR y C0S, clon 55) con EcoR 1 y Not 1, la digestion de la parte media del C0S por Not 1 y BstE 11 (clon 15), y la parte 3' (C0S y 3'-UTR) por BstE 11 y EcoR V (clon 80)D Los fragmentos de 25 A0N digeridos luego se clonan en pcA0N3D1, digerido con EcoR 1 y EcoR VD El cA0N alfa-ENaC de macaco de java de longitud completa en pc0NA3D1 luego, se somete a secuenciacion de longitud completa (1ngenetix, Viena, Austria)D La secuencia de cA0N alfa-ENaC de macaco de java corresponde a los nt 28 a 3113 de la secuencia cA0N alfa-ENaC de macaco de la indiaD Por ultimo, el cA0N alfa-ENaC cinomolgo luego se extirpa de alfa-ENaC de macaco de java de pc0NA3D1 mediante digestion con BamH 1 y EcoR V y se subclona en el vector de pXOOND El
30 mapa del plasmido se ilustra en la Figura 1D La Figura 2 representa la secuencia de proteina (SEQD1D0DNO: 1681) y A0N (SEQD1D0DNO: 1682) de alfa-ENaC de macaco de javaD
Transfecciones:
Se siembran celulas COS-1 a 6x104 celulas/pozo en placas de 24 pozos cada una en 0D5 mL de medio de crecimientoD Un dia despues de la siembra las celulas se co-transfectan con el plasmido de expresion alfa-ENaC
35 pXOON de macaco de java y el siARN indicadoD Para cada pozo 4ng de plasmido de expresion alfa-ENaC, y 600 ng de plasmido portador (pNFAT-luc) se co-transfectan con el siARN relevante (concentracion final de 45 nM) utilizando reactivo de transfeccion de gen X-treme (Roche) a 3D75 IL/pozo en un volumen total de 720 IL/pozo de Opti-MEM (1nvitrogen) como se describe adelanteD
Las transfecciones se realizan por triplicado para cada muestraD Se preparan mezclas maestras de siARN/plasmido
40 (cada una para pozos de 3D5) como sigue: 14 ng de plasmido de expresion alfa-ENaC, 2D1 Ig de plasmido portador y 112 pmoles de siARN relevante en un volumen total de 210 IL (Opti-MEM)D Una mezcla maestra de lipidos se prepara para toda la transfeccion (105 IL de lipidos mas 1575 IL de Opti-MEM para ocho muestras de transfeccion por triplicado)D El plasmido/siARN y el lipido se mezclan en igual volumen para dar un volumen total de 420 IL de mezcla de transfeccion por triplicado de la muestra (3D5 x)D Luego de incubacion de 20 minutos hasta temperatura
45 ambiente, se agrega 120 IL de la mezcla de transfeccion relevante a cada pozo de celulas en un volumen de transfeccion final de 720 IL (Opti-MEM)D Las celulas se transfectan durante 24 horas a 37quot; C y 5% de CO2 en un incubador humidificado (Heraeus GmbH, Hanau, Alemania) y se cosechan para el analisis de A0N ramificadoD
Los lisados celulares se preparan para analisis de A0N ramificadoD Se prepara una mezcla de medio: regulador de lisis 2:1 (Panomics) y se lisan las celulas en 200 IL a 53quot; C durante 30 minutosD 0espues de una comprobacion 50 visual para la lisis completa, los lisados celulares se almacenan a -80quot; C para analisis posteriorD El analisis de A0N
ramificado se realiza como se describio anteriormente, con expresion cino alfa-ENaC normalizada contra eGFP a partir del plasmido de expresionD El protocolo de analisis de A0N ramificado utilizado difiere del anterior solo en que 20 IL de la muestra se aplica a cada pozo en este casoD
Mediciones de sonda:
Alfa-ENaC de macaco de java:
eGFP: La Tabla 2C muestra la expresion alfa- ENaC en especies de macaco de java para ejemplos de siARND
Ejempeo 3.4�Detecci6n�ee �ineucci6n ��ee interfer6n-a
Para evaluar la capacidad de siARN para estimular la liberacion de interferon-a (1FNa), el siARN se incuba con las
5 celulas mononucleares de sangre periferica recien purificadas (PBMC) in vitro durante 24 horasD El siARN se agrega directamente a PBMC, o primero se compleja con un agente de transfeccion de lipidos (Geneporter 2 o Lipofectamine 2000 o agente de transfeccion 0OTAP) y posteriormente se incuba con PBMCD Como controles positivos para induccion de 1FNa, las secuencias de control no modificados se incluyen 01 A 2216 y 01 A 5167D
01 A 2216: es una molecula de A0N antisentido de cadena sencilla
10 5'-dGsdGsdGdGdGdAdCdGdAdTdCdGdTdCdGsdGsdGsdGsdGsdG-3' (SEQD1D0DNO:1707)
01 A 5167 es un siRNA conjugado con colesterol
5'-GUCAUCACACUGAAUACCAAU-s-chol-3'3'-CsAsCAGUAGUGUGACUUAUGGUUA-5' (SEQD1D0DNO:1708)
0espues de 24 horas, el 1FNa se mide por EL1SAD El nivel basal de 1FNa se determina para las celulas no tratadas y siempre esta muy cerca de un control de solo aguaD La adicion de agente de transfeccion solo proporciona poco o 15 ningun aumento de los niveles de 1FNaD Los oligonucleotidos estimulantes conocidos se agregan a las celulas, ya
sea directamente o en presencia de transfectante, y se observan los aumentos esperados de 1FNaD Esta configuracion permite determinar la estimulacion de 1FNa en PBMC humano mediante siARN (u otros oligonucleotidos)D
Aislamiento de PBMC humano: una fraccion concentrada de leucocitos (capa leucocitaria) se obtiene del Banco de
5 Sangre Suhl, 1nstituto de Medicina de Transfusion, AlemaniaD Estas celulas son negativas a una variedad de patogenos, incluyendo el V1H, el HCV, y otrosD La capa leucocitaria se diluye 1:1 con PBS, se agrega a un tubo que contiene Ficoll, y se centrifuga durante 20 minutos a 2200 rpm para permitir el fraccionamientoD Esto se sigue por la eliminacion de la capa turbia de celulas blancas de la sangre y se transfiere a un tubo con PBS fresco y de Ficoll, que se centrifuga durante 15 minutos a 2200 rpmD La capa turbia de celulas blancas de la sangre se retira de nuevo,
10 se transfiriere a medio de cultivo RPM1 1640 y se centrifuga durante 5 minutos a 1,200 rpm para sedimentar las celulas blancas de la sangreD Las celulas se vuelven a suspender en medio RPM1, se sedimentan como anteriormente, y se vuelve a suspender en medio con 10% de FCS a 1 x 106/mLD
Medicion de interferon-a: Las celulas en cultivo se combinan, ya sea con 500 nM (o 1 IM) de oligonucleotidos en Optimem o 133 nM de oligonucleotidos en GP2 o Lipofectamine2000 o agente de transfeccion 0OTAP durante 24
15 horas a 37quot; CD El interferon-a se mide con kit EL1SA instantaneo Bender Med Systems (Viena, Austria) de acuerdo con las instrucciones del fabricanteD
La seleccion de secuencias terapeuticas lideres se basa en un nivel de induccion 1FNa de menos de 15% del control positivoD
Ejempeo 3.5�Determinaci6n ee�estabieieae�ee si�RN�en�ee�esputo�ee �pacientes�con CF
20 Se recolectan muestras de esputo por el 0rD Ahmet Uluer, Hospital de Ninos de BostonD 0espues de la recoleccion, las muestras de esputo se tratan con antibioticos y se irradian con UV para reducir el contenido bacterianoD Para determinar la estabilidad de siARN en las muestras de esputo, los siARN se incuban en 30 IL de esputo en una concentracion de 5 IM a 37quot; C durante los tiempos indicadosD La reaccion se termina mediante adicion de proteinasa K y las muestras se incuban a 42quot; C durante otros 20 minutosD Se agrega una molecula de ARN 40-mer
25 hecha de L-nucleotidos (quot;Spiegelmerquot;) resistente a la degradacion de nucleasa y sirve como estandar de calibracionD Las muestras se filtran a traves de una membrana de 0D2 mm para eliminar los residuos restantesD Las muestras se analizan por HPLC de intercambio ionico desnaturalizante en una columna 0NAPac PA 200 (0ionex) a pH 11D0 utilizando un gradiente de perclorato de sodio para la elucionD Los siARN y productos de degradacion se cuantifican medianate determinacion del area bajo el pico para cada muestraD La concentracion se normaliza a la concentracion
30 en las muestras no incubadasD
La seleccion de las secuencias terapeuticas lideres (N08356, N08357 y N08396) se basa en una estabilidad in vitro observada en esputo CF con una vida media de mas de 60 minutosD
Ejempeo 3.6 Comprobaci6n cruzaea ee secuencias terapeuticas eieeres contra poeimorfismos conocieos en ee�gen �SCNN1� humano
35 Para excluir polimorfismos conocidos de los sitios de destino de los candidatos lideres, se comprueban secuencias de siARN lideres contra la base de datos polimorfismo de un solo nucleotido NCB1 (SNP) (http://wwwDncbiDnlmDnihDgov/entrez/queryDfcgi? CM0=search&0B=snp)D 0e los 10 polimorfismos de exon conocidos en el gen SCNN1A humano, ninguno se muestra por estar presente en los sitios objetivo de cualquiera de los 10 candidatos terapeuticos lideres mas potentesD
40 Ejempeo 3.7: �Perfie�in�vitro�ee�eas 5�principaees�secuencias�fuera ee�objetivo�preeichas
Una lista de alineaciones para cada secuencia se clasifica por homologia en la region 19-merD Las secuencias fuera de objetivo se clasifican con base en el numero y posicion de los emparejamientos incorrectos de acuerdo con los criterios descritos en el ejemplo 1D Las 5 secuencias fuera de objetivo principales se identifican para cada una de las secuencias terapeuticas lideres (N08356, N08357 y N08396)D Las secuencias en y fuera de objetivo se clonan 45 individualmente en un sistema indicador de luciferasa dualD Cada fragmento clonado abarca 19 nucleotidos objetivo, ademas de 10 nucleotidos que flanquean la region, en 5' y 3' de la secuencia objetivoD Los fragmentos se clonan en un sitio de clonacion multiple 3' a la secuencia de luciferasa de Renilla, bajo el control de un promotor SV40D La actividad de cada siARN contra las secuencias en y fuera de objetivo se determina mediante fluorescencia relativa de la luciferasa de Renilla objetivo de la luciferasa de luciernaga, esta ultima se controla independientemente por el 50 promotor HSV-TKD 1nicialmente, se realizan transfecciones en celulas COS-7 a una concentracion de siARN de 50 nMD Se toman lecturas de luciferasa 24 h post-transfeccionD En esta alta concentracion de siARN, no se observa atenuacion de mas del 30% contra cualquier secuencia fuera de objetivo para cualquiera de los tres siARN lideresD Se demuestra la actividad contra la secuencia en objetivo con una reduccion relativa en la actividad de luciferasa de Renilla de aproximadamente 80%D Tambien se generan curvas 1C50 para cada siARN contra la secuencia en
objetivo y se controlan con las secuencias fuera de objetivo identificadas anteriormenteD Para cada siARN lider, el 1C50 en objetivo en este ensayo indicador fue del orden de magnitud similar (10-50 pM) al 1C50 obtenido contra el objetivo endogeno en H441 (Ejemplo 3D3) lo que indica que para N08356, N08357 y N08396, la potencia contra la secuencia en objetivo es, por lo menos, 1000-5000 veces mayor que para cualquiera de las secuencias fuera de
5 objetivo predichasD
Ejempeo 3.�: �Perfiees ee�genotoxicieae
1D 0eterminacion de la citotoxicidad: La citotoxicidad se determina al utilizar un contador de celulas para la evaluacion del numero de celulas de cultivoD
2D Se sabe bien que las pruebas de concentraciones citotoxicas in vitro puede inducir efectos genotoxicos, tales
10 como la formacion de micronucleosD Por lo tanto, se considera que el aumento del numero de celulas que contienen micronucleos que aparecen en los conteos de celulas de alrededor de 50% o menos (en comparacion con el control negativo en paralelo) estan relacionados con la citotoxicidad si hay un aumento dependiente de dosis en las celulas micronucleadas ya se puede observar en concentraciones que muestran moderada toxicidad a lo sumoD El analisis de una concentracion que muestra al menos el 50% de reduccion en el conteo de celulas se requiere por las
15 directrices que regulan ensayos de celulas de mamifero in vitro (directrices OEC0 e 1CH para la conduccion de las pruebas de aberracion cromosomica)D Adicionalmente, los protocolos de OC0E requieren pruebas de compuestos no toxicos que incluyan por lo menos una concentracion de la precipitacion (siempre que no excedan 10 mM o 5 mg/ml, el que sea menor)D 0ado que la prueba de micronucleos in vitro tiene por objeto predecir el resultado de los ensayos reguladores, es decir, la prueba de aberraciones cromosomicas in vitro, el protocolo para la prueba de
20 micronucleos in vitro se disena para cumplir con los requisitos para estas pruebasD
3D Sistema de prueba: las celulas TK6 se transfectan con virus Ebstein-Barr y se inmortalizan las celulas (origen linfoblastoide humano derivada del bazo)D La determinacion del potencial clastogenico y/o aneugenico en la prueba de micronucleos in vitro con celulas TK6 con/sin homogenato de higado S9 (2%) de ratas macho (Aroclor 1254pretratado)D Tiempo de tratamiento: 20 h (-S9), 3 horas (+ S9)D Tiempo de muestreo: 24 horas despues del inicio del
25 tratamiento de 3 horas, 48 horas despues del inicio del tratamiento de 20 horasD Para cada sustancia se analizan por lo menos tres concentraciones (2 cultivos por concentracion) y 2000 celulas por concentracionD
4D El efecto de induccion de micronucleos para una concentracion probada se considera positivo si la frecuencia de celulas micronucleadas es
� gt; = 2% y muestran por lo menos una duplicacion del valor de control de solvente concurrente, o
30 � � 2% y muestran por lo menos un aumento de 3 veces sobre el valor de control de solvente concurrenteD
5D Para concluir se ha de tener en cuenta un experimento que es positivo, la relacion de dosis-efecto positiva y la citotoxicidadD
6D
7D Resumen: Las secuencias terapeuticas lideres N08396, N08356, N08357 no inducen aumento en el numero de
35 celulas que contienen micronucleos despues de un tratamiento de 20 horas sin activacion metabolica, ni despues del tratamiento de 3 horas con o sin S9D No se puede analizar la concentracion citotoxica hasta el limite de las pruebas de 5 mg/mlD
Ejempeo 3.��Eficacia�funcionae�in�vitro�en��441: �ND�3�6
Con el fin de demostrar la eficacia funcional in vitro del siARN lider contra alfa-ENaC, se transfectan celulas H441
40 con siARN y se preparan para analisis de camara Ussings de transporte de ionesD Para la transfeccion, las celulas H441 se comlocan en placas en matraces T25 a 2 x 106 celulas por matraz de medio de cultivo complementado con dexametasona 200 nMD Las celulas en cada matraz se transfectan con cualquier N08396 o un siARN de control no dirigido a siARN 30 nM y 4 mL/mL de Lipofectamine 2000 en un volumen total de 5 mL (medio libre de suero)D Un dia despues de transfeccion, las celulas se colocan en placas en insertos Snapwell de 1 cm2 en confluencia (2 x 105
45 celulas por inserto) para minimizar el tiempo necesario para la diferenciacion y la formacion de uniones estrechas y suministradas con medio en las camaras apicales y basolateralesD 0espues de un dia adicional de cultivo, el medio apical se elimina y se reemplaza el medio basolateral, tomando por lo tanto las celulas al cultivo de interfaz aireliquido (AL1)D Las celulas se mantienen en AL1 durante otros seis dias antes de analisis de transporte de ionD
8D Para el analisis funcional en camaras Ussings, los insertos Snapwell se montan en camaras de 0ifusion Verticales
50 (Costar) y se banan con solucion de Ringer continuamente gasificada (5% de CO2 en O2; pH 7D4) mantenida a 37quot; C que contiene: 120 mM de NaCl, 25 mM de NaHCO3, 3D3 mm de KH2PO4, 0D8 mM de K2HPO4, 1D2 mM de CaCl2, 1D2 mM de MgCl2 y 10 mM de glucosaD La osmolaridad de solucion se determina en el intervalo de 280 y 300 mosmol/kg de H2OD Las celulas se afianzan con voltaje a 0 mV (modelo EVC4000; WP1)D La resistencia transepitelial (RT) se mide al aplicar un pulso de 1 o 2 mV a intervalos de 30 s, o utilizando la diferencia de potencial inicial a traves de las celulas y la corriente inicial medida, y luego calcular RT por la ley de OhmD Los datos se registran utilizando una
5 estacion de trabajo PowerLab (A01nstruments)D Luego se registra el tratamiento de siARN de las caracteristicas basales de las celulas y la corriente de corto circuito sensible a amilorida (1SC luego de aplicacion de 10 IM de amilorida, solo parte apical)D La actividad del canal ENaC en cada cultivo se determina por la 1SC sensible a amilorida en cada casoD
9D 0espues de ensayo, las celulas en los insertos individuales se someten a lisis para analisis de ARND Un
10 atenuacion de 75 % en el nivel de ARN en el momento del ensayo (N08396 en comparacion con el control no dirigido) se correlaciona con una atenuacion funcional de la corriente sensible a amilorida de aproximadamente 30% (N08396 en comparacion con el control no dirigido)D
Las secuencias de acido nucleico se representan adelante, utilizando la nomenclatura estandar, y especificamente las abreviaturas de la Tabla AD
15 Tabla A: Abreviaturas de monomeros de nucleotido utilizados en la representacion de acidos nucleicosD Se entendera que estos monomeros, cuando estan presentes en un oligonucleotido, se enlazan mutuamente por enlaces 5'-3'-fosfodiesterD
�breviaturaa
Nucee6tieos
A
adenosina-5'-fosfato
C
citidina-5'-fosfato
G
guanosina-5'-fosfato
T
2'-desoxi-timidina-5'-fosfato
U
uridina-5'-fosfato
c
2'-O-metilcitidina-5'-fosfato
u
2'-O-metiluridina-5'-fosfato
Ts
2'-desoxi-timidina -5'-fosforotioato
Tabla 1AD siARN seleccionados en un grupo de deteccion inicial (siARN reactivos cruzados de alfa ENaC de humano-macaco de la india)D Se identifica un total de 152 secuencias de iARN como un grupo de deteccion inicial, ambos con (cadenas de secuencia 1-304) y sin (cadenas secuencia 305-608) modificaciones de estructuraD Se disenan secuencias de iARN para que sean completamente complementarias a las secuencias alfa-ENaC de macaco de la india, de acuerdo con los criterios de diseno descritos en la seccion de ejemplosD Se muestra el porcentaje de expresion residual de alfa-ENaC en dos experimentos de transfeccion de dosis unica independientes (refierase a la seccion de ejemplos para los metodos utilizados)
Tabla 1BD siARN seleccionados en un grupo de deteccion extendido (siARN solo humanos)D Se identifican 344 secuencias de iARN adicionales y se disenan secuencias de iARN para que sean completamente complementarias a las secuencias alfa-ENaC humanas, de acuerdo con los criterios de diseno descritos en la seccion de ejemplosD Todos los siARN enumerados en este grupo de deteccion solo se modifican con un enlace fosforotioato en el extremo 3' entre los nucleotidos 20 y 21 de cada cadenaD Se muestra el porcentaje de expresion residual de alfa-ENaC en un ensayo de transfeccion de dosis unica (refierase a la seccion de ejemplos para los metodos utilizados)
Tabla 1CD siARN seleccionados en un conjunto sustituto de rata in vivo (siARN reactivos cruzados de humano-rata)D Se identifica un grupo de deteccion de 48 secuencias de iARN alfa-ENaC de reaccion cruzada de humano y rataD Se muestra el porcentaje de expresion residual de alfa-ENaC en dos experimentos de transfeccion de dosis unica independientes (refierase a la seccion de ejemplos para los metodos utilizados)
Tabla 10D siARN seleccionados en un conjunto sustituto de conejillo de indias in vivo (siARN de reaccion cruzada de humano-conejillo de indias)D Se identifica un grupo de deteccion de 63 secuencias de iARN alfa-ENaC de reaccion cruzada de humano y conejillo de indias y se sintetizan, ambas con (cadenas de secuencia 1393-1518) y sin (cadenas de secuencia 1519-1644) modificaciones de estructuraD Se muestra el porcentaje de expresion residual de alfa-ENaC en dos experimentos de transfeccion de dosis unica independientes (refierase a la seccion de ejemplos para los metodos utilizados)
Tabla 2A: Concentracion en 50 % de inhibicion (1C50) para agentes de iARN de ejemplo de la Tabla 1A (continuacion)
1C50 [nM]
1C50 [nM]
1er 0RC en
2do 0RC en
10 0uplex
H441 H441
N08294
0D1949 0D0468
N08295
0D1011 0D0458
N08299
0D5986 0D5638
N08302
0D0144 0D0134
N08313
0D0315 0D0124
N08320
0D0796 0D0078
N08331
0D0213 0D0158
N08332
0D0205 0D0089
N08343
0D0523 0D0293
N08348
0D0156 0D0182
N08356
0D0241 0D0099
N08357
0D0054 0D0032
N08363
0D1186 0D0337
N08368
0D0487 0D1209
N08371
0D0811 0D0911
N08372
0D0584 0D0425
N08373
0D0066 0D0165
N08375
0D1176 0D1187
N08380
0D6817 0D5747
N08381
0D0037 0D0041
N08383
0D0275 0D1257
N08384
0D0357 0D0082
N08391
0D0260 0D0349
1C50 [nM] 1C50 [nM] 10 0uplex 1er 0RC en 2do 0RC en N08392 0D3831 0D4775 N08396 0D0023 0D0052 N08403 0D0808 0D0759
Tabla 2B: Concentracion a 50 % de inhibicion (1C50) y para agentes de iARN de ejemplo de la Tabla 10 1C50 1C50 [nM]
[nM] 2do
1er 0RC
0RC 10 0uplex en H441 en 441 N08441 0D6738 0D8080 N08443 0D0346 0D0263 N08449 0D0120 0D0067 N08450 0D0257 0D0106 N08451 0D1320 0D0931 N08453 0D0079 0D0033 N08489 0D1640 0D1593 N08496 0D0387 0D0185
Tabla 2C: % de actividad del ARNi de ejemplo hacia la inhibicion de la expresion genica de alfa-ENaC en los
ensayos descritos en el Ejemplo 3 1dentificador % de expresion de alfa-ENaC en HBEC Expresion alfa-EnaC de 0uplex primario (% de control) 50nM siARN Macaco de java (% de
control) 45nM siARN No transfectado 77D2n/a No dirigido 100 93D3 Control Control Negativo (alfa-ENaC n/a 100
No cino) N08449
N0-8302 30D2 57
(continuacion)
1dentificador 0uplex
% de expresion de alfa-ENaC en HBEC primario (% de control) 50nM siARN Expresion alfa-EnaC Macaco de java (% control) 45nM siARN de de
N0-8332
24D7 54D3
N0-8348
40D1 56D2
N0-8356
36D6 55D8
N0-8357
29D6 50D4
N0-8373
30D4 53D8
N0-8381
32D5 40D4
N0-8396
34D1 46D3
N0-8450
45D9 78D9
N0-8453
30D1 55D3

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1D Una composicion que comprende un agente de iARN que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, en donde:
    aD la cadena sentido comprende por lo menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de N08496 (SEQ 10 NO: 1511), y la cadena anti-sentido comprende por lo menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena anti-sentido de N08496 (SEQ 10 NO: 1512); o
    bD la cadena sentido comprende por lo menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de N08712 (SEQ 10 NO: 1637), y la cadena anti-sentido comprende por lo menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena anti-sentido de N08712 (SEQ 10 NO: 1638)D
    2D La composicion de la reivindicacion 1, en donde la cadena anti-sentido tiene 30 o menos nucleotidos de longitud, y en donde la cadena sentido y la cadena anti-sentido forman una region duplex de 15 a 30 pares de nucleotidos de longitudD
    3D La composicion de la reivindicacion 1, en donde la cadena anti-sentido y la cadena sentido tienen cada uno 19 a 23 nucleotidos de longitudD
    4D La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente iARN comprende una modificacion que provoca que el agente iARN tiene aumento de la estabilidad en una muestra biologicaD
    5D La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente iARN comprende un fosforotioato o un nucleotido modificado 2'D
    6D La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente iARN comprende:
    por lo menos un dinucleotido 5'-uridina-adenina-3' (5'-ua-3'), en donde la uridina es un nucleotido modificado 2'; por lo menos un dinucleotido 5'-uridina-guanina-3' (5'-ug-3'), en donde la 5'-uridina es un nucleotido modificado 2'; por lo menos un dinucleotido 5'-citidina-adenina-3' (5'-ca-3'), en donde la 5'-citidina es un nucleotido modificado 2'; o por lo menos un dinucleotido 5'-uridina-uridina-3' (5'-uu-3'), en donde la 5'-uridina es un nucleotido modificado 2'D
    7D La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente iARN comprende una modificacion 2' seleccionada del grupo que consiste de: 2'-desoxi, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-metilo, 2'-O-metoxietilo (2'-O-MOE), 2'-O-aminopropilo (2'-O-AP), 2'-Odimetilaminoetilo (2'-O-0MAOE), 2'-O-dimetilaminopropilo (2'-O-0MAP), 2'-O-dimetilaminoetiloxietilo (2'-O-0MAEOE), y 2'-O-N-metilacetamido (2'-O-NMA)D
    8D La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente iARN comprende un extremo romoD
    9D La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente iARN comprende un nucleotido saliente que tiene 1 a 4 nucleotidos no apareadosD
    10D La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente iARN comprende un nucleotido saliente en el extremo 3' de la cadena anti-sentido del agente iARND
    11D La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente iARN es N08496 (SEQ 10 NOs: 1511 y 1512)D
    12D La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente iARN es N08712 (SEQ 10 NOs: 1637 y 1638)D
    13D La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente iARN se liga a uno o mas de compuesto diagnostico, grupo indicador, agente de entrecruzamiento, unidad estructural que confiere resistencia a nucleasa, nucleobase natural o inusual, molecula lipofila, colesterol, lipido, lectina, esteroide, uvaol, hecigenina, diosgenina, terpeno, triterpeno, sarsasapogenina, Friedelina, acido litocolico derivado con epifriedelanol, vitamina, carbohidrato, dextrano, pululan, chitina, chitosan, carbohidrato sintetico, Oligo Lactato 15-mer, polimero natural, polimero de bajo o de medio peso molecular, inulina, ciclodextrina, acido hialuronico, proteina, agente de union a proteina, molecula que dirige integrina, policationico, peptido, poliamina, imitador de peptido, y/o transferrinaD
    14D Una composicion que comprende un agente de iARN a alfa-ENaC, en donde el agente iARN comprende una cadena sentido y una cadena anti-sentido, en donde la cadena sentido comprende por lo menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de un agente de iARN seleccionado del grupo que consiste de N08496 (SEQ 10 NO: 1511) y N08712 (SEQ 10 NO: 1637), y en donde la cadena anti-sentido comprende por lo menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena anti-sentido de un agente de iARN seleccionado del grupo que consiste de N08496 (SEQ 10 NO: 1512) y N08712 (SEQ 10 NO: 1638), la composicion comprende adicionalmente un ligando de receptor epitelialD
    15D La composicion de la reivindicacion 14, en donde el ligando de receptor epitelial es (i) transferrina o (ii) acido 5 folicoD
    16D La composicion de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 14 para uso en terapiaD
    17D La composicion de la reivindicacion 1 o reivindicacion 14 para uso en tratar una enfermedad mediada por disfuncion del canal de sodio epitelial seleccionado de: fibrosis quistica, disquinesia ciliar primaria, bronquitis cronica, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COP0), asma, infecciones del tubo respiratorio, carcinoma de pulmon,
    10 sindrome de Liddles, hipertension, insuficiencia renal, y desequilibrio de electrolitosD
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