ES2432643T3 - Inhibición de la expresión de la alfa-ENaC por medio de ARNi - Google Patents

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Abstract

Una composición que comprende un agente de ARNi que contiene una cadena sentido y una cadena antisentido,en donde: a. la cadena sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena sentido de ND8453 (SEQ ID NO:1425 ), y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena antisentido de ND8453 (SEQ m NO: 1426 ), o b . la cadena sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena sentido de ND8489 (SEQ ID NO:1497), y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena antisentido de ND8489 (SEQ m NO: 1498); o c . la cadena sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena sentido de ND8456 (SEQ ID NO:1431), y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleótidos de la cadena antisentido de ND8456 (SEQ IDNO: 1432).

Description

5 Campo tecnico
La invencion se refiere al campo del transporte ionico a traves de las vias respiratorias mediado por ENaC, y a las composiciones y metodos para modular la expresion de alfa-ENaC, y mas particularmente, con la subregulacion de alfa-ENaC mediante oligonucleotidos por medio de la interferencia del ARN, que se administran localmente a los pulmones y al pasaje nasal por medio de administracion por inhalacion/intranasal, o se administran en forma
10 sistemica, por ejemplo, mediante inyeccion intravenosa.
Antecedentes
El ARN de interferencia, o quot;ARNiquot; es un termino inicialmente acunado por Fire y colaboradores para describir la observacion de que el ARN bicatenario (ARNbc) puede bloquear la expresion genica cuando se introduce en gusanos (Fire et al., Nature 391: 806 - 811, 1998). El ARNbc corto dirige el silenciamiento post-transcripcional
15 especifico del gen en muchos organismos, incluyendo vertebrados, y ha proporcionado una nueva herramienta para estudiar la funcion del gen. Esta tecnologia ha sido revisada numerosas veces recientemente; vease, por ejemplo, Novina, C. D., y Sharp, P., Nature 2004, 430: 161, y Sandy, P., y colaboradores, Biotechniques 2005, 39: 215.
Las superficies mucosas en la interfase entre el medio ambiente y el cuerpo, han desarrollado una cantidad de mecanismos de proteccion. Una forma principal de tal defensa innata, es limpiar estas superficies con liquido. 20 Tipicamente, la cantidad de la capa de liquido sobre una superficie mucosa refleja el equilibrio entre la secrecion liquida epitelial, que refleja con frecuencia la secrecion de aniones (Cl- y/o HCO3-) acoplada con agua (y un contraion cationico), y la absorcion del liquido epitelial, que con frecuencia refleja la absorcion de Na+, acoplada con agua y
-
un contra-anion (Cl- y/o HCO3). Muchas enfermedades de las superficies mucosas son causadas por tener muy poco liquido protector sobre estas superficies mucosas, creado por un desequilibrio entre la secrecion (muy poca) y 25 la absorcion (relativamente alta). Los procesos defectuosos de transporte de sales que caracterizan estas disfunciones de las mucosas residen en la capa epitelial de la superficie mucosa. Un enfoque para reponer la capa protectora de liquido sobre las superficies mucosas es quot;reequilibrarquot; el sistema, por medio el bloqueo de Ia absorcion de liquido mediada por el canal de Na+. La proteina epitelial que media la etapa limitante de la velocidad de la absorcion de Na+ y de liquido es el canal epitelial de Na+ (ENaC). El alfa-ENaC se coloca sobre la superficie apical 30 del epitelio, es decir, Ia interfase entre el medio ambiente y la superficie mucosa. La inhibicion de la absorcion de liquido mediada por Na+ mediada por alfa-ENaC puede tener utilidad terapeutica. Por consiguiente, existe la necesidad de desarrollar terapias efectivas para el tratamiento y la prevencion de enfermedades o de trastornos en donde este implicado la alfa-ENaC, por ejemplo, fibrosis quistica en seres humanos y animales, y en particular para terapias con una alta eficiencia. Un requisito previo para una alta eficiencia es que el ingrediente activo no se
35 degrade muy rapidamente en un medio ambiente fisiologico.
Li Tianbo y colaboradores, describe como la interferencia del ARN de alfa-ENaC inhibe la absorcion de fluido en el pulmon de rata in vivo, Am Journal of Physiol Lung Cell Mol Physiol 290: L649 - L660, 2006.
Resumen
En un primer aspecto, la presente invencion proporciona una composicion que comprende un agente de ARNi que 40 incluye una cadena sentido y una cadena antisentido, en donde:
a. la cadena sentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de ND8453 (SEQ m NO: 1425 ), y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena antisentido de ND8453 ( SEQ m NO: 1426 ), o
b . la cadena sentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de ND8489 (SEQ m NO:
45 1497), y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena antisentido de ND8489 ( SEQ m NO: 1498); o
c . la cadena sentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de ND8456 (SEQ ID NO: 1431), y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleotidos de la cadena antisentido de ND8456 (SEQ ID NO: 1432).
En un segundo aspecto, la presente invencion proporciona una composicion que comprende un agente de ARNi para la alfa - ENaC, en donde el agente de ARNi comprende una cadena sentido y una cadena antisentido,
en donde la cadena sentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de un agente de ARNi seleccionado del grupo que consiste de ND8453 (SEQ ID NO: 1425), ND8489 (SEQ m NO: 1497), y ND8456 (SEQ ID NO: 1431), y
en donde la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena antisentido de un agente de ARNi seleccionado del grupo que consiste de ND8453 (SEQ ID NO: 1426); ND8489 (SEQ ID NO: 1498), y ND8456 (SEQ m NO: 1432),
la composicion comprende ademas un ligando receptor helicoidal.
En un tercer aspecto, la presente invencion proporciona una composicion que comprende un agente de ARNi como se describio en la presente invencion invencion anteriormente para uso en terapia.
Las composiciones de la invencion, por ejemplo, las composiciones del agente de ARNi pueden ser usadas con cualquier dosis y/o formulacion descrita en la presente invencion invencion, asi como con cualquier ruta de administracion descrita en la presente invencion invencion.
Los detalles de una o mas formas de realizacion de la invencion se exponen en los dibujos acompanantes y la descripcion mas adelante. Otras caracteristicas, objetivos, y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de esta descripcion, de los dibujos, y de las reivindicaciones.
En las Figuras:
Figura 1: Mapa de digestion de restriccion de la construccion pXcon para a-EnaC del cinomologo clonado.
Figura 2: Secuencia de ADN y de la proteina de alfa-ENaC de mono cinomologo.
Figura 3: Clonacion de los sitios de reconocimiento predichos en el objetivo y fuera del objetivo en la construccion del reportero de Iuciferasa dual AY535007. Los fragmentos consisten en 19 nucleotidos del sitio objetivo predicho, y 10 nucleotidos de la secuencia de flanqueo en ambos extremos 5' y 3'.
Descripcion detallada
Para mayor facilidad de exposicion, el termino quot;nucleotidoquot; o quot;ribonucleotidoquot; se utiliza algunas veces en la presente invencion invencion con referencia a una o mas subunidades monomericas de un agente de ARN. Se entendera que el uso del termino quot;ribonucleotidoquot; o quot;nucleotidoquot; en la presente invencion invencion puede, en el caso de un ARN modificado o de un sustituto de nucleotido, referirse tambien a un nucleotido modificado, una fraccion de reemplazo sustituta, como se describe adicionalmente mas adelante, en una o mas posiciones.
Un quot;agente de ARNquot;, como se utiliza en la presente invencion invencion, es un ARN no modificado, un ARN modificado, o un sustituto de nucleosido, cada uno de los cuales se describe en la presente invencion invencion o es bien conocido en la tecnica de sintesis de ARN. Aunque se describen numerosos ARN modificados y sustitutos de nucleosidos, los ejemplos preferidos incluyen aquellos que tienen una mayor resistencia a la degradacion de la nucleasa que los ARN no modificados. Los ejemplos preferidos incluyen aquellos que tienen una modificacion del azucar 2', una modificacion en una saliente monocatenaria, preferiblemente una saliente monocatenaria 3', o, particularmente si la cadena monocatenaria es una modificacion 5' que incluye uno o mas grupos fosfato, o uno o mas analogos de un grupo fosfato.
Un quot;agente de ARNiquot; (abreviatura para quot;agente de ARN de interferenciaquot;), como se utiliza en la presente invencion invencion, es un agente de ARN que puede subregular la expresion de un gen objetivo, por ejemplo un gen SCNN1A para ENaC. Aunque sin animo de cenirnos a ninguna teoria en particular, un agente de ARNi puede actuar mediante uno o mas de una cantidad de mecanismos, incluyendo escision posterior a la transcripcion de un ARNm objetivo algunas veces denominado en la tecnica como ARNi, o mecanismos previos a la transcripcion o previos a la traduccion.
Un quot;agente de ARNi bcquot; (abreviatura para quot;agente de ARNi bicatenarioquot;), como se utiliza en la presente invencion invencion, es un agente de ARNi que incluye mas de una, y preferiblemente dos cadenas, en donde la hibridacion entre cadenas puede formar una region de estructura duplex. Una quot;cadenaquot; se refiere en Ia presente invencion a una secuencia contigua de nucleotidos (incluyendo nucleotidos que no se presenten naturalmente o modificados). Las dos o mas cadenas pueden ser, o cada una puede formar parte de moleculas separadas, o se pueden interconectar
de una manera covalente, por ejemplo mediante un enlazador, por ejemplo un enlazador de polietilenglicol, para formar una molecula. Al menos una cadena puede incluir una region que sea suficientemente complementaria con un ARN objetivo. Tal cadena se denomina como Ia quot;cadena antisentidoquot;. Una segunda cadena del agente de ARNbc, que comprende una region complementaria con la cadena antisentido, se denomina Ia quot;cadena sentidoquot;. Sin embargo, tambien se puede formar un agente de ARNi bc a partir de una sola molecula de ARN que sea al menos parcialmente auto-complementaria, formando, por ejemplo, una estructura de horquilla o de manija, incluyendo unaregion duplex. Estas ultimas se denominan en la presente invencion invencion como los ARN cortos de horquilla o ARNsh. En este caso, el termino quot;cadenaquot; se refiere a una de las regiones de la molecula de ARN que es complementaria a la otra region de la misma molecula de ARN.
Aunque, en celulas de mamifero, los agentes de ARNi bc largos pueden inducir la respuesta de interferon, que con frecuencia es nociva, los agentes de ARNi bc cortos no desencadenan la respuesta del interferon, al menos no hasta un grado en que sea perjudicial para Ia celula y/o para el huesped (Manche y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 12: 5238, 1992; Lee y colaboradores, Virology 199: 491, 1994; Castelli y colaboradores, J. Exp. Med. 186: 967, 1997; Zheng y colaboradores, RNA 10: 1934, 2004; Heidel y colaboradores, Nature Biotechnol. 22 1579). Los agentes de ARNi de la presente invencion incluyen moleculas que son suficientemente cortas para no desencadenar una respuesta de interferon no especifica nociva en celulas de mamifero normales. Por consiguiente, la administracion de una composicion que incluya un agente de ARNi (por ejemplo, formulada como se describe en la presente invencion invencion) a un sujeto, se puede utilizar para disminuir la expresion del alfa-ENaC en el sujeto, mientras que evita una respuesta del interferon. Las moleculas que son suficientemente cortas para no desencadenar una respuesta del interferon nocivo, se denominan como agentes de ARNi corto o los ARNi corto en la presente invencion invencion. quot;Agente de ARNi cortoquot; o quot;ARNi cortoquot;, como se utiliza en la presente invencion invencion, se refiere a un agente de ARNi, por ejemplo, un agente de ARNi bc, que es suficientemente corto para no inducir una respuesta de interferon perjudicial en una celula de mamifero, y en particular de un ser humano, por ejemplo, tiene una region duplex de menos de 60, pero preferiblemente de menos de 50, 40, o 30 pares de nucleotidos.
Los agentes de ARNi aislados descritos en la presente invencion, incluyendo los agentes de ARNi bc y los agentes de ARNi corto, pueden mediar Ia expresion disminuida de alfa-ENaC, por ejemplo, mediante la degradacion del ARN. Por conveniencia, este ARN tambien se denomina en la presente invencion como el ARN que se va a silenciar. Este acido nucleico tambien se denomina como un quot;ARN objetivoquot;, algunas veces quot;molecula de ARN objetivoquot;, o algunas veces quot;gen objetivoquot;.
Como se utiliza en Ia presente invencion, la frase quot;ARNi mediaquot;, se refiere a la capacidad de un agente para silenciar, de una manera especifica para la secuencia, un gen objetivo. quot;Silenciamiento de un gen objetivoquot; significa el proceso mediante el cual una celula que contiene y/o que expresa cierto producto del gen objetivo cuando no esta en contacto con el agente, contendra y/o expresara al menos el 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, o el 90% menos de ese producto genetico cuando se pone en contacto con el agente, en comparacion con una celula similar que no se haya puesto en contacto con el agente. Tal producto del gen objetivo, por ejemplo, puede ser un ARN mensajero (ARNm), una proteina, o un elemento regulador.
Como se utiliza en la presente invencion, el termino quot;complementarioquot; se utiliza para indicar un grado suficiente de complementariedad, de tal manera que se presenta un enlace estable y especifico entre un compuesto y una molecula de ARN objetivo, por ejemplo ARNm para alfa-ENaC. El enlace especifico requiere de un grado suficiente de complementariedad para evitar el enlace no especifico del compuesto oligomerico con las secuencias no objetivo bajo condiciones en donde se desea el enlace especifico, es decir, por ejemplo, bajo condiciones fisiologicas en el caso de los ensayos in vivo o del tratamiento terapeutico, o en el caso de los ensayos in vitro, bajo condiciones en las que se llevan a cabo los ensayos. Las secuencias no objetivo tipicamente difieren de las secuencias objetivo en al menos 2, 3, o 4 nucleotidos.
Como se utiliza en la presente invencion, un agente de ARNi es quot;suficientemente complementarioquot; con un ARN objetivo, por ejemplo, un ARNm objetivo (por ejemplo, ARNm para alfa-ENaC), si el agente de ARNi reduce la produccion de una proteina codificada por el ARN objetivo en una celula. EI agente de ARNi tambien puede ser quot;exactamente complementarioquot; con el ARN objetivo, por ejemplo, el ARN objetivo y el agente de ARNi se hibridan, preferiblemente para formar un hibrido hecho exclusivamente de pares de bases de Watson-Crick en la region de complementariedad exacta. Un agente de ARNi quot;suficientemente complementarioquot; puede incluir una region interna (por ejemplo, de al menos 10 nucleotidos), que sea exactamente complementaria con un ARN para alfa-ENaC objetivo. Mas aun, en algunas formas de realizacion, el agente de ARNi discrimina especificamente una diferencia de un solo nucleotido. En este caso, el agente de ARNi solamente media el ARNi si se encuentra una complementariedad exacta en Ia region (por ejemplo, dentro de 7 nucleotidos) la diferencia de un solo nucleotido. Los agentes de ARN preferidos se basaran en, o consistiran en, o comprenderan, las secuencias sentido y antisentido proporcionadas en las Tablas 1A - 1D.
Como se utiliza en la presente invencion, quot;esencialmente identicaquot;, cuando se utiliza para referirse a una primera secuencia de nucleotidos en comparacion con una segunda secuencia de nucleotidos, significa que la primera
secuencia de nucleotidos es identica a Ia segunda secuencia de nucleotidos, excepto por hasta una, dos, o tres sustituciones de nucleotidos (por ejemplo, adenosina reemplazada por uracilo). quot;Que retiene esencialmente la capacidad para inhibir la expresion de alfa-ENaC en celulas humanas cultivadasquot;, como se utiliza en Ia presente invencion para referirse a un agente de ARNi no identico a, pero derivado de, uno de los agentes de ARNi de las Tablas 1A -1D, mediante supresion, adicion, o sustitucion de nucleotidos, significa que el agente de ARNi derivado posee una actividad inhibidora no menor del 20% de la actividad inhibidora del agente de ARNi de las Tablas 1A 1D de donde se derivo. Por ejemplo, un agente de ARNi derivado a partir de un agente de ARNi de las Tablas 1A 1D, que disminuye la cantidad del ARNm para alfa-ENaC presente en las celulas humanas cultivadas en un 70%, puede por si mismo disminuir la cantidad de ARNm presente en celulas humanas cultivadas en al menos un 50%, para que se considere como esencialmente retenedor de la capacidad para inhibir la replicacion del alfa-ENaC en celulas humanas cultivadas. Opcionalmente, un agente de ARNi puede disminuir Ia cantidad del ARNn para alfa-ENaC presente en las celulas humanas cultivadas, en al menos un 50%.
Como se utiliza en Ia presente invencion, un quot;sujetoquot; se refiere a un organismo de mamifero que experimenta el tratamiento para un trastorno mediado por alfa-ENaC. El sujeto puede ser cualquier mamifero, tal como una vaca, caballo, raton, rata, perro, cerdo, cabra, o un primate. En la forma de realizacion preferida, el sujeto es un humano.
Diseno y seleccion de agentes de ARNi
Como se utiliza en la presente invencion, quot;trastornos asociados con la expresion de alfa-ENaCquot; se refiere a cualquier estado biologico o patologico que (1) es mediado al menos en parte por la presencia de alfa-ENaC, y (2) cuyo resultado pueda ser afectado por la reduccion del nivel de alfa-ENaC presente. Los trastornos especificos asociados con la expresion de alfa-ENaC se mencionan mas adelante.
La presente divulgacion se basa en el diseno, sintesis, y generacion de agentes de ARNi que se dirigen al alfa-ENaC, y en la demostracion del silenciamiento del gen para alfa-ENaC in vitro en celulas cultivadas despues de la incubacion con un agente de ARNi, y en el efecto protector resultantes para los trastornos mediados por alfa-ENaC.
Un agente de ARNi puede ser disenado racionalmente con base en Ia informacion de secuencia y en las caracteristicas deseadas. Por ejemplo, un agente de ARNi se puede disenar de acuerdo con la temperatura de fusion relativa del duplex candidato. En terminos generales, el duplex debe tener una temperatura de fusion mas baja en el extremo 5' de la cadena antisentido que en el extremo 3' de la cadena antisentido.
La presente divulgacion proporciona composiciones que contienen ARNi corto(s) y/o shARN(s) dirigidos hacia una o mas transcripciones de alfa-ENaC.
Para cualquier objetivo genetico particular que se seleccione, el diseno de los ARNi corto o los shARN para uso de acuerdo con la presente divulgacion preferiblemente seguira ciertos lineamientos. Tambien, en muchos casos, el agente que se suministre a una celula de acuerdo con la presente invencion, puede someterse a uno o mas etapas de procesamiento antes de convertirse en un agente supresor activo (vease mas adelante para una discusion adicional); en tales casos, aquellas personas ordinariamente capacitadas en este campo apreciaran que el agente relevante preferiblemente se disenara para incluir secuencias que puedan ser necesarias para su procesamiento.
Las enfermedades mediadas por la disfuncion del canal de sodio epitelial incluyen las enfermedades asociadas con la regulacion de los volumenes de fluido a traves de las membranas epiteliales. Por ejemplo, el volumen de liquido superficial de las vias respiratorias es un regulador clave de la eliminacion mucociliar y del mantenimiento de la salud del los pulmones. El bloqueo del canal de sodio epitelial promovera Ia acumulacion de fluido sobre el lado mucoso del epitelio de las vias respiratorias, promoviendo de esta manera la eliminacion de moco, e impidiendo Ia acumulacion de moco y de esputo en los tejidos respiratorios (incluyendo las vias respiratorias pulmonares). Estas enfermedades incluyen enfermedades respiratorias, tales como fibrosis quistica, disquinesia ciliar primaria, bronquitis cronica, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COPD), asma, infecciones del tracto respiratorio (agudas y cronicas; virales y bacterianas), y carcinoma pulmonar. Las enfermedades mediadas por el bloqueo del canal de sodio epitelial tambien incluyen enfermedades diferentes de las enfermedades respiratorias que estan asociadas con la regulacion anormal de fluido a traves del epitelio, tal vez involucrando una fisiologia anormal de los liquidos superficiales protectores sobre su superficie, por ejemplo xerostomia (boca seca) o queratoconjuntivitis sire (ojo seco). Adicionalmente, el bloqueo del canal de sodio epitelial en el rinon se podria utilizar para promover la diuresis y de esta manera inducir un efecto hipotensivo.
El tratamiento puede ser sintomatico o profilactico.
El asma incluye asma tanto intrinseca (no alergica) como asma extrinseca (alergica), asma leve, asma moderada, asma severa, asma bronquitica, asma inducida por el ejercicio, asma ocupacional, y asma inducida en seguida de infeccion bacteriana. Tambien se debe entender que el tratamiento de asma abarca el tratamiento de sujetos, por ejemplo, de menos de 4 o 5 anos de edad, que exhiban sintomas de sibilancia, y que sean diagnosticados o puedan
ser diagnosticados como quot;bebes con sibilanciaquot;, una categoria de paciente establecida de importante preocupacion medica y ahora identificada con frecuencia como de asmaticos incipientes o en fase temprana. (Para mayor conveniencia, esta condicion asmatica particular es denominada como quot;sindrome de bebe con sibilanciaquot;).
La eficiencia profilactica en el tratamiento de asma sera evidenciada por una frecuencia o severidad reducida del ataque sintomatico, por ejemplo de ataque asmatico agudo o broncoconstrictor, mejoria en la funcion pulmonar, o mejor hiperreactividad de las vias respiratorias. Ademas se puede evidenciar por un requerimiento reducido de otra terapia sintomatica, es decir, terapia para, o pretendida para restringir o abortar un ataque sintomatico cuando se presente, por ejemplo antiinflamatorio (por ejemplo, corticosteroide) o broncodilatador. El beneficio profilactico en asma, en particular, puede ser evidente en los sujetos susceptibles al quot;ahogamiento matutinoquot;. El quot;ahogamiento matutinoquot; es un sindrome asmatico reconocido, comun a un porcentaje sustancial de asmaticos, y caracterizado por ataque de asma, por ejemplo entre las horas de aproximadamente de las 4 y las 6 am, es decir, en un momento por lo regular sustancialmente distante de cualquier terapia para el asma sintomatica previamente administrada.
La enfermedad pulmonar obstructiva cronica incluye bronquitis cronica o disnea asociada con la misma, enfisema, asi como exacerbacion de la hiperreactividad de las vias respiratorias como consecuencia de otra terapia con farmacos, en particular otra terapia con farmacos inhalados. La invencion tambien es aplicable al tratamiento de bronquitis de cualquier tipo o genesis, incluyendo, por ejemplo, bronquitis aguda, araquidica, catarral, cruposa, cronica, ftinoide.
Con base en los resultados mostrados en la presente invencion, la presente divulgacion proporciona agentes de ARNi que reducen la expresion de alfa-ENaC en celulas cultivadas y en un sujeto, por ejemplo un mamifero, por ejemplo un ser humano. Las Tablas 1A - 1D proporcionan ejemplos de agentes de ARNi que se dirigen al alfa-ENaC, con base en las abreviaturas de la nomenclatura estandar suministradas en la Tabla A.
La Tabla 1A, SEQ ID NOs: 305 -608, la Tabla 1B, y la Tabla 1D, SEQ lD NOs: 1519 -1644, enlistan los ARNi corto que no incluyen modificaciones de nucleotidos, excepto por un enlace fosforotioato entre el terminal 3' y las penultimas timidinas. Las SEQ ID restantes en las Tablas 1A - 1D enlistan los ARNi corto en donde todos los nucleotidos que contienen bases de pirimidina son nucleotidos modificados por 2'-O-metilo en la cadena sentido, y todas las uridinas en un contexto de secuencia de 5'-ua-3', asi como todas las citidinas en un contexto de secuencia de 5'-ca-3', son nucleotidos modificados por 2'-O-metilo en la cadena antisentido.
Con base en estos resultados, la invencion proporciona especificamente un agente de ARNi que incluye una cadena sentido que tiene al menos 15 nucleotidos contiguos de las secuencias de la cadena sentido de los agentes proporcionados en las Tablas 1A -1D, y una cadena antisentido que tiene al menos 15 nucleotidos contiguos de las secuencias antisentido delos agentes proporcionados en las Tablas 1A -1D.
Los agentes de ARNi mostrados en las Tablas 1A -1D se componen de dos cadenas de 19 nucleotidos de longitud, las cuales son complementarias o identicas a la secuencia objetivo, mas una 3'-TT que sobresale. La presente invencion proporciona agentes que comprenden al menos 15, o al menos 16, 17 o 18, o 19 nucleotidos contiguos a partir de estas secuencias. Sin embargo, aunque estas longitudes pueden ser potencialmente optimas, los agentes de ARNi no pretenden limitarse a estas longitudes. La persona experta esta bien consciente de que agentes de ARNi mas cortos o mas largos pueden ser similarmente efectivos, debido a que, dentro de ciertos intervalos de longitud, la eficacia es mas bien una funcion de la secuencia de nucleotidos que de la longitud de la cadena. Por ejemplo, Yang, y colaboradores, PNAS 9929942-9947 (2002,), demostraron eficacias similares para agentes de ARNi de longitudes entre 21 y 30 pares de bases. Otros han demostrado un silenciamiento efectivo de genes mediante agentes de ARNi bajando hasta una longitud de aproximadamente 15 pares de bases (Byrom, y colaboradores, quot;lnducing RNAi with siRNA Cocktails Generated by RNase lllquot; Tech Notes 10 (1), Ambion, lnc., Austin, TX).
Por consiguiente, es posible y es contemplado seleccionar a partir de las secuencias proporcionadas en las Tablas 1A -1D, una secuencia parcial entre 15 y 19 nucleotidos para la generacion de un agente de ARNi derivado apartir de una de las secuencias proporcionadas en las Tablas 1A - 1D. De una manera alternativa, se pueden anadir uno o varios nucleotidos a una de las secuencias proporcionadas en las Tablas 1A - 1D, o un agente que contenga 15 nucleotidos contiguos a partir de uno de estos agentes, preferiblemente, pero no necesariamente, de tal forma que los nucleotidos agregados sean complementarios con la respectiva secuencia del gen objetivo, por ejemplo, alfa-ENaC. Por ejemplo, los primeros 15 nucleotidos a partir de uno de los agentes se pueden combinar con los 8 nucleotidos que se encuentran 5' con esta secuencia en el ARNm para alfa-ENaC, para obtener un agente con 23 nucleotidos en las cadenas sentido y antisentido. Todos estos agentes de ARNi derivados se incluyen en ios agentes de ARNi, siempre y cuando retengan esencialmente Ia capacidad para inhibir la replicacion de alfa-ENaC en celulas humanas cultivadas.
La cadena antisentido de un agente de ARNi debe ser igual a, o de al menos, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 25, 29, 40, o 50 nucleotidos de longitud. Debe ser igual a, o menor de 60, 50, 40, o 30 nucleotidos de longitud. Los intervalos
preferidos son de 15 a 30, de 17 a 25, de 19 a 23, y de 19 a 21 nucleotidos de longitud.
La cadena sentido de un agente de ARNi de ser igual, o de al menos 14, 15,16,17,18, 19, 25, 29,40, o 50 nucleotidos de longitud. Debe ser igual a, o menor de 60, 50, 40, o 30 nucleotidos de longitud. Los intervalos preferidos son de 15 a 30, de 17 a 25, de 19 a 23, y de 19 a 21 nucleotidos de longitud.
La porcion bicatenaria de un agente de ARNi debe ser iguala, o de al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 29, 40, o 50 pares de nucleotidos de longitud. Debe ser igual a, o menor de 60, 50, 40, o 30 pares de nucleotidos de longitud. Los intervalos preferidos son de 15 -30, de 17 a 25, de 19 a 23, y de 19 a 21 pares de nucleotidos de longitud.
En general, los agentes de ARNi incluyen una region de suficiente complementariedad para el ARNm para alfa-ENaC, y son de una longitud suficiente en terminos de nucleotidos, para que el agente de ARNi, o un fragmento del mismo, pueda mediar la subregulacion del gen para alfa-ENaC. No es necesario que exista una complementariedad perfecta entre el agente de ARNi y el gen objetivo, pero la correspondencia debe ser suficiente para hacer posible que el agente de ARNi, o un producto de disociacion del mismo, dirija el silenciamiento especifico de la secuencia, por ejemplo, mediante la disociacion del ARNi de un ARNm para alfa-ENaC.
Por consiguiente, los agentes de ARNi incluyen los agentes que comprenden una cadena sentido y una cadena antisentido, cada una comprendiendo una secuencia de al menos 16, 17, o 18 nucleotidos, que sea esencialmente identica, como se define mas adelante, a una de las secuencias de las Tablas 1A -1D, excepto que no mas de 1, 2,
o 3 nucleotidos por cadena, respectivamente, hayan sido sustituidos por otros nucleotidos (por ejemplo, adenosina reemplazada por uracilo), mientras que retengan esencialmente Ia capacidad para inhibir Ia expresion de alfa-ENaC en celulas humanas cultivadas. Estos agentes poseen por lo tanto al menos 15 nucleotidos identicos a una de las secuencias de las Tablas 1A -1D, pero se introducen 1, 2, o 3 faltas de correspondencia de bases con respecto ya sea a la secuencia de alfa-ENaC objetivo, o bien entre las cadenas sentido y antisentido. Las faltas de correspondencia con Ia secuencia de ARN para alfa-ENaC objetivo, en particular en la cadena antisentido, son mas toleradas en las regiones terminales, y si estan presentes, preferiblemente en una region o regiones terminales, por ejemplo dentro de 6, 5, 4, o 3 nucleotidos de un terminal 5' y/o 3', mas preferiblemente dentro de 6, 5, 4, o 3 nucleotidos del terminal 5' de la cadena sentido, o del terminal 3' de la cadena antisentido. La cadena sentido solamente necesita ser suficientemente complementaria con Ia cadena antisentido para mantener el caracter bicatenario global de Ia molecula.
Se prefiere que las cadenas en sentido y antisentido se escojan de tal manera que el agente de ARNi incluya una sola cadena o region no apareada en uno o ambos extremos de la molecula. Por consiguiente, un agente de ARNi contiene cadenas sentido y antisentido, preferiblemente emparejadas para contener una saliente, por ejemplo, una o dos salientes 5' o 3', pero preferiblemente una saliente 3' de 2 -3 nucleotidos. La mayoria de las formas de realizacion tendran una saliente 3'. Los agentes de ARNi corto preferidos tendran salientes monocatenarias, preferiblemente salientes 3', de 1 a 4, o preferiblemente de 2 o 3 nucleotidos de longitud, en uno o en ambos extremos del agente de ARNi. Las salientes pueden ser el resultado de que una cadena sea mas larga que la otra, o el resultado de que dos cadenas de la misma longitud esten escalonadas. Los nucleotidos no emparejados que forman la saliente puede ser ribonucleotidos, o pueden ser desoxirribonucleotidos, preferiblemente timidina. Los extremos 5' preferiblemente estan fosforilados, o pueden no estar fosforilados.
Las longitudes preferidas para la region duplex estan entre 15 y 30, mas preferiblemente de 18, 19, 20, 21, 22, y 23 nucleotidos de longitud, por ejemplo, en el intervalo del agente de ARNi corto discutido anteriormente. Los agentes de ARNi corto pueden parecerse en longitud y estructura a los productos procesados naturales Dicer de los ARN bc largos. Las formas de realizacion en donde se enlazan las dos cadenas del agente de ARNi corto, por ejemplo, donde se enlazan de una manera covalente, tambien estan incluidas. Las estructuras de cadena de horquilla, u otras monocatenarias, que proporcionan la region bicatenario preferida, y preferiblemente una saliente 3', tambien estan dentro de la invencion.
Evaluacion de los agentes de ARNi candidatos
Como se anoto anteriormente, la presente invencion proporciona un sistema para identificar los ARNi corto que son utiles como inhibidores de alfa-ENaC. Ya que, como se observo anteriormente, los shARN se procesan en forma intracelular para producir los ARNi corto que tienen porciones duplex con la misma secuencia que la estructura del tronco del shARN, el sistema es igualmente util para identificar los shARN que son utiles como inhibidores de alfa-ENaC. Para propositos de descripcion, esta seccion se referira a los ARNi corto, pero el sistema tambien abarca los shARN correspondientes. Especificamente, la presente invencion demuestra la preparacion exitosa de los ARNi corto destinados a inhibir la actividad de alfa-ENaC. Las tecnicas y reactivos descritos en la presente invencion se pueden aplicar facilmente para disenar nuevos ARNi corto potenciales, dirigidos a otros genes o regiones geneticas, y probados para determinar su actividad en la inhibicion del alfa-ENaC, como se discute en la presente invencion.
En diferentes formas de realizacion, los inhibidores potenciales de alfa-ENaC se pueden probar para determinar la supresion de la expresion endogena de alfa-ENaC, mediante la introduccion de ARNi corto candidato(s) en las celulas (por ejemplo, mediante administracion exogena, o mediante la introduccion de un vector o construccion que dirija la sintesis endogena del ARNi corto en la celula), o en animales de laboratorio, mediante administracion pulmonar o nasal. Alternativamente, los inhibidores potenciales de alfa-ENaC se pueden probar in vitro mediante la cotransfeccion transitoria de el(los) ARNi corto candidato(s), junto con un plasmido de expresion de alfa-ENaC. Se evalua entonces la capacidad de el(los) ARNi corto candidato(s) para reducir los niveles de transcripcion objetivo y/o para inhibir o suprimir uno o mas aspectos o caracteristicas de la actividad del alfa-ENaC, tales como la diferencia de potencial epitelial o la absorcion de fluido superficial de las vias respiratorias.
Se pueden comparar celulas o animales de laboratorio a los que se les ha suministrado las composiciones de ARNi corto de la invencion (celulas/animales de prueba), con celulas o animales de laboratorio similares o comparables que no hayan recibido la composicion de la invencion (celulas/animales de control, por ejemplo celulas/animales que no hayan recibido ni ARNi corto ni ARNi corto de control, tal como un ARNi corto dirigido a una transcripcion no endogena, tal como la proteina fluorescente verde (GFP)). El fenotipo de transporte de iones de las celulas/animales de prueba, se puede comparar con el fenotipo de las celulas/animales de control, siempre y cuando el ARNi corto de la invencion comparta la reactividad cruzada de secuencia con los tipos/especies de celulas de prueba. La produccion de la proteina de alfa-ENaC y la corriente de corto circuito (in vitro o ex vivo) se pueden comparar en las celulas/animales de prueba en relacion con las celulas/animales de control. De forma similar, se pueden comparar otros indicios de la actividad de alfa-ENaC, incluyendo la diferencia de potencial epitelial ex vivo, o la eliminacion mucociliar in vivo, o la formacion de imagenes de resonancia magnetica (MRI) del cuerpo completo. En terminos generales, las celulas/animales de prueba y las celulas/animales de control serian de la misma especie, y, para las celulas, de un tipo de celula similar o identico. Por ejemplo, se podrian comparar las celulas de la misma linea celular. Cuando la celula de prueba es una celula primaria, tipicamente la celula de control tambien seria una celula primaria.
Por ejemplo, la capacidad de ARNi corto candidato para inhibir la actividad de alfa-ENaC se puede determinar de una forma conveniente mediante (i) el suministro del ARNi corto candidato a las celulas, (ii) la evaluacion de los niveles de expresion del ARNm para alfa-ENaC en relacion con un gen de control expresado en forma endogena,
(iii) Ia comparacion de la corriente sensible a Ia amilorida en un modelo celular in vitro producido en la presencia del ARNi corto con la cantidad producida en ausencia del ARNi corto. Este ultimo ensayo se puede utilizar para probar los ARNi corto que se dirijan a cualquier transcripto objetivo que pueda tener influencia sobre la actividad de alfa-ENaC indirectamente, y no se limita a los ARNi corto que se dirigen a los transcriptos que codifican las subunidades del canal de ENaC.
La capacidad de un ARNi corto candidato para reducir el nivel de transcripto objetivo se puede evaluar midiendo la cantidad del transcripto objetivo, utilizando, por ejemplo, transferencias tipo Northern, ensayos de proteccion de nucleasa, hibridacion de sondas, PCR de transcripcion inversa (RT), RT-PCR en tiempo real, analisis de microarreglos, etc. La capacidad de un ARNi corto candidato para inhibir la produccion de un polipeptido codificado por el transcripto objetivo (ya sea al niveI transcripcional o post-transcripcional) se puede medir empleando una variedad de enfoques basados en anticuerpos, incluyendo, pero sin limitarse a, transferencias tipo Western, inmunoensayos, ELISA, citometria de flujo, microarreglos de proteina, etc. En general, se puede emplear cualquier metodo para medir la cantidad de transcripto objetivo, o bien de un polipeptido codificado por el transcripto objetivo.
En general, ciertos inhibidores de Alfa-ENaC por medio de ARNi preferidos reducen el nivel de transcripto objetivo al menos aproximadamente 2 veces, preferiblemente al menos aproximadamente 4 veces, mas preferiblemente al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 16 veces, al menos aproximadamente 64 veces, o inclusive hasta un mayor grado en relacion con el nivel que estaria presente en ausencia del inhibidor (por ejemplo, en una celula de control comparable que carezca del inhibidor). En general, ciertos inhibidores de Alfa-ENaC por medio de ARNi preferidos inhiben la actividad del canal de ENaC, de tal manera que la actividad es mas 'baja en una celula que contenga al inhibidor que en una celula de control que no contenga al inhibidor por al menos aproximadamente dos veces, al menos aproximadamente cuatro veces, mas preferiblemente al menos aproximadamente ocho veces, al menos aproximadamente dieciseis veces, al menos aproximadamente 64 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 200 veces, o inclusive hasta un mayor grado.
Ciertos inhibidores preferidos de alfa-ENaC por medio de ARNi inhiben la actividad del canal de ENaC durante al menos 12 horas, al menos 24 horas, al menos 36 horas, al menos 48 horas, al menos 60 horas, al menos 72 horas, al menos 96 horas, al menos 120 horas, al menos 144 horas, o al menos 168 horas, luego de la administracion del ARNi corto y de la infeccion de las celulas. Ciertos inhibidores preferidos de alfa-ENaC previenen (es decir, reducen hasta niveles indetectables), o reducen de una manera significativa la actividad de alfa-ENaC durante al menos 24 horas, al menos 36 horas, al menos 48 horas, o al menos 60 horas luego de la administracion del ARNi corto. De acuerdo con diferentes modalidades de la invencion, una reduccion significativa en la actividad de alfa-ENaC, es una reduccion hasta aproximadamente menos del 90% del nivel que se presentaria en ausencia del ARNi corto, una reduccion hasta aproximadamente menos del 75 del nivel que se presentaria en ausencia del ARNi corto, una
reduccion de aproximadamente menos del 50% del nivel que se presentaria en ausencia del ARNi corto, una reduccion de aproximadamente menos del 25% del nivel que se presentaria en ausencia del ARNi corto, o una reduccion hasta aproximadamente menos del 10% del nivel que se presentaria en ausencia del ARNi corto. La reduccion en la actividad de alfa-ENaC se puede medir utilizando cualquier metodo adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a la medicion de la corriente de corto circuito de la sensibilidad a la amilorida in vitro, la diferencia del potencial epitelial ex vivo o in vivo en la eliminacion mucociliar en el MRl pulmonar/de todo el cuerpo.
Prueba de estabilidad, modificacion, y nueva prueba de agentes de ARNi
Un agente de ARNi candidato se puede evaluar con respecto a la estabilidad, por ejemplo su susceptibilidad a la disociacion mediante una endonucleasa o exonucleasa, tal como cuando se introduce el agente de ARNi en el cuerpo de un sujeto. Se pueden emplear metodos para identificar los sitios que sean susceptibles a la modificacion, en particular a la disociacion, por ejemplo a la disociacion mediante un componente que se encuentra en el cuerpo de un sujeto. Tales metodos pueden incluir el aislamiento y la identificacion de los fragmentos mas abundantes formados por la degradacion del agente de ARNi candidato despues de su incubacion con medios biologicos aislados in vitro, por ejemplo suero, plasma, esputo, fluido cerebroespinal, u homogenatos celulares o tisulares, o despues de poner en contacto a un sujeto con el agente de ARNi candidato in vivo, identificando de esta manera los sitios susceptibles a la disociacion. Estos metodos se encuentran, por ejemplo, sin limitacion, en Ia publicacion de la solicitud de patente internacional No WO 2005115481, presentada el 27 de mayo de 2005.
Cuando se identifican los sitios susceptibles a la disociacion, se puede disenar y/o sintetizar un agente de ARNi adicional, en donde el sitio de disociacion potencial se haga resistente a la disociacion, por ejemplo, mediante la introduccion de una modificacion 2' en el sitio de la disociacion, por ejemplo, un grupo 2'-O-metilo. Este agente de ARNi adicional se puede volver a probar para determinar su estabilidad, y este proceso se puede repetir hasta encontrar un agente de ARNi que exhiba la estabilidad deseada.
Prueba in vivo
Un agente de ARNi identificado como capaz de inhibir la expresion del gen para alfa-ENaC, se puede probar para determinar su funcionalidad in vivo en un modelo animal (por ejemplo, en un mamifero, tal como en un raton, rata, cobayo, o primate). Por ejemplo, el agente de ARNi se puede administrar a un animal, y el agente de ARNi se puede evaluar con respecto a su biodistribucion, estabilidad, y a su capacidad para inhibir la expresion de alfa-ENaC, o para modular un proceso biologico o patologico mediado al menos en parte por alfa-ENaC.
El agente de ARNi se puede administrar directamente al tejido objetivo, tal como mediante inyeccion, o el agente de ARNi se puede administrar al modelo animal de la misma forma en que se administraria a un ser humano. Preferiblemente, el agente de ARNi se suministra a las vias respiratorias del sujeto, tal como mediante administracion intranasal, inhalada, o intratraqueal.
El agente de ARNi tambien se puede evaluar para determinar su distribucion intracelular. La evaluacion puede incluir la determinacion de si el agente de ARNi fue absorbido dentro de la celula. La evaluacion tambien puede incluir determinar la estabilidad (por ejemplo, la vida media) del agente de ARNi. La evaluacion de un agente de ARNi in vivo se puede facilitar mediante el uso de un agente de ARNi conjugado con un marcador rastreable (por ejemplo, un marcador fluorescente, tal como fluoresceina; un marcador radioactivo, tal como 35S, 32P, 33P, o 3H; particulas de oro; o particulas de antigeno para inmunohistoquimica).
El agente de ARNi se puede evaluar con respecto a su capacidad para subregular la expresion de alfa-ENaC. Los niveles de expresion del gen para alfa-ENaC in vivo se pueden medir, por ejemplo, mediante hibridacion in situ, o mediante el aislamiento del ARN a partir del tejido antes y despues de la exposicion al agente de ARNi. Cuando el animal necesita ser sacrificado con el objeto de cosechar el tejido, un animal de control no tratado servira para la comparacion. El ARN para alfa-ENaC se puede detectar mediante cualquier metodo deseado, incluyendo, pero sin limitarse a, RT-PCR, transferencia tipo Northern, ensayo de ADN ramificado, o ensayo de proteccion de ARNasa. Alternativamente, o adicionalmente, se puede monitorear la expresion del gen para alfa-ENaC llevando a cabo el analisis de transferencia tipo Western, o inmunocoloracion sobre extractos de tejido tratados con el agente de ARNi.
Los inhibidores potenciales de alfa-ENaC se pueden probar empleando una variedad de modelos animales que se han desarrollado. Se pueden administrar a un animal composiciones que comprendan ARNi corto candidato(s), construcciones o vectores capaces de dirigir la sintesis de tales ARNi corto dentro de una celula huesped, o celulas modificadas o manipuladas por ingenieria genetica para contener los ARNi corto candidatos. Se evalua la capacidad de la composicion para suprimir la expresion de alfa-ENaC, y/o para modificar los fenotipos dependientes de ENaC, y/o para disminuir su severidad en relacion con los animales que no hayan recibido el inhibidor potencial de alfa-ENaC. Estos modelos incluyen, pero no se limitan a, modelos de murido, rata, cobayo, oveja, y primates no humanos para los fenotipos dependientes de ENaC, todos los cuales son conocidos en la tecnica, y se utilizan para probar Ia eficacia de los productos terapeuticos potenciales de alfa-ENaC.
Utilizando los sistemas inventados para Ia identificacion de los agentes terapeuticos candidatos de ARNi corto, se seleccionan los agentes terapeuticos adecuados a partir de los identificadores Duplex ND-8302, ND-8332, ND-8348, ND-8356, ND-8357, ND-8373, ND-8381, ND-8396, ND-8450, y ND-8453, mas adecuadamente seleccionados a partir de ND-8356, ND-8357 y ND-8396.
Quimica del ARNi
En la presente invencion se describen agentes de ARNi aislados, por ejemplo los agentes de ARN bc, que median el ARNi para inhibir la expresion del gen para alfa-ENaC.
Los agentes de ARN discutidos en la presente invencion incluyen o bien el ARN no modificado, asi como el ARN que ha sido modificado, por ejemplo, para mejorar la eficacia, y polimeros de sustitutos de nucleosidos. Un ARN no modificado se refiere a una molecula en donde los componentes del acido nucleico, es decir, azucares, bases, y fracciones de fosfato, son los mismos o esencialmente los mismos que aquellos que se presentan en la naturaleza, preferiblemente como se presentan naturalmente en el cuerpo humano. En el estado del arte se denomima como raro o inusual, pero de origen natural, los ARN como los ARN modificados; vease, por ejemplo, Limbach y colaboradores, Nucleic Acids Res. 22: 2183 -2196, 1994. Tales ARN raros o inusuales, a menudo denominados como ARN modificados (aparentemente debido a que son tipicamente el resultado de una modificacion posterior a la transcripcion), estan dentro del termino de ARN no modificado, como se utiliza en la presente invencion. El ARN modificado, como se utiliza en la presente invencion, se refiere a una molecula en donde uno o mas de los componentes del acido nucleico, es decir, azucares, bases, y fracciones de fosfato, son diferentes de aquellos que se presentan en la naturaleza, preferiblemente diferentes de aquellos que se presentan en el cuerpo humano. Aunque se denominan como quot;ARNquot; modificados, desde luego, debido a la modificacion, incluyen moleculas que no son ARN. Los sustitutos de nucleosidos son moleculas en donde la estructura base de ribofosfato es reemplazada con una construccion que no es ribofosfato, que permite que las bases se presenten en la relacion espacial correcta, de tal modo que la hibridacion es sustancialmente similar a la que se ve con una estructura base de ribofosfato, por ejemplo, mimeticos no cargados de la estructura principal de ribofosfato. Los ejemplos de lo anterior se discuten en Ia presente invencion.
Las modificaciones descritas en la presente invencion se pueden incorporar en cualquier ARN bicatenario y molecula del tipo ARN descrita en la presente invencion, por ejemplo un agente de ARNi. Puede ser deseable modificar una o ambas de las cadenas antisentido y sentido de un agente de ARNi. Debido a que los acidos nucleicos son polimeros de subunidades o monomeros, muchas de las modificaciones descritas mas adelante se presentan en una posicion que se repite dentro de un acido nucleico, por ejemplo una modificacion de una base, o una fraccion de fosfato, o el oxigeno no enlazante de una fraccion de fosfato. En algunos casos, la modificacion se presentara en todas las posiciones objetivo en el acido nucleico, pero en muchos, y de hecho en la mayoria de los casos, no Io haran. A manera de ejemplo, una modificacion solamente puede presentarse en una posicion terminal 3' o 5', solamente puede presentarse en una region terminal, por ejemplo, en una posicion sobre un nucleotido terminal, o en los ultimos 2, 3, 4, 5, o 10 nucleotidos de una cadena. Una modificacion puede presentarse en una region bicatenaria, o en una region monocatenaria, o en ambas. Por ejemplo, una modificacion de fosforotioato en una posicion de O no enlazante, solamente puede presentarse en uno o ambos terminales, y solamente puede presentarse en las regiones terminales, por ejemplo en una posicion sobre un nucleotido terminal, o en los ultimos 2, 3, 4, 5, o 10 nucleotidos de una cadena, o puede presentarse en las regiones bicatenarias y monocatenarias, en particular en los terminales. De una manera similar, puede presentarse una modificacion sobre la cadena sentido, sobre la cadena antisentido, o sobre ambas. En algunos casos, las cadenas sentido y antisentido tendran las mismas modificaciones o la misma clase de modificaciones, pero en otros casos, las cadenas sentido y antisentido tendran diferentes modificaciones, por ejemplo, en algunos casos puede ser deseable modificar solamente una cadena, por ejemplo la cadena sentido.
Dos objetivos primordiales para la introduccion de las modificaciones en los agentes de ARNi es su estabilizacion hacia Ia degradacion en los medios ambientes biologicos, y la mejora de las propiedades farmacologicas, por ejemplo las propiedades farmacodinamicas, las cuales se discuten adicionalmente mas adelante. Otras modificaciones adecuadas a un azucar, base, o estructura base de un agente de ARNi, son descritas en la Solicitud PCT No. PCT/US2004/01193, presentada el 16 de enero de 2004. Un agente de ARNi puede incluir una base que no sea de origen natural, tales como las bases descritas en la Solicitud PCT No. PCT/US2004/011822, presentada el 16 de abril de 2004. Un agente de ARNi puede incluir un azucar que no se de origen natural, tal como una molecula portadora ciclica que no sea un carbohidrato. Las caracteristicas que sirven de ejemplo de los azucares que no son de origen natural para utilizarse en los agentes de ARNi, se describen en la Solicitud PCT No. PCT/US2004/11829, presentada el 16 de abril de 2003.
Un agente de ARNi puede incluir un enlace entre nucleotidos (por ejemplo, el enlace fosforotioato quiral), util para aumentar la resistencia a Ia nucleasa. Ademas, o en forma alternativa, un agente de ARNi puede incluir un mimetico de ribosa para una mayor resistencia a la nucleasa. Los ejemplos de enlaces entre nucleotidos y los mimeticos de ribosa para una mayor resistencia a la nucleasa, se describen en la Solicitud PCT No. PCT/US2004/07070,
presentada el 8 de marzo de 2004.
Un agente de ARNi puede incluir subunidades de monomeros conjugados con Iigando y monomeros para la sintesis de oligonucleotidos. Los monomeros de ejemplo se describen en la Solicitud de los Estados Unidos No. 10/916.185, presentada el 10 de agosto de 2004.
Un agente de ARNi puede tener una estructura ZXY, tal como se describe en la Solicitud PCT No. PCT/US2004/07070, presentada el 8 de marzo de 2004.
Un agente de ARNi puede formar un complejo con una fraccion anfipatica. Los ejemplos de fracciones anfipaticas de para ser utilizadas con los agentes de ARNi se describen en la Solicitud PCT No. PCT/US2004/07070, presentada el 8 de marzo de 2004.
En ora forma de realizacion, el agente de ARNi puede formar complejo con un agente de suministro que proporcione un complejo modular. El complejo puede incluir un agente portador enlazado con uno o mas de (preferiblemente dos
o mas, mas preferiblemente los tres de): (a) un agente de condensacion (por ejemplo, un agente capaz de atraer, por ejemplo enlazar, un acido nucleico, por ejemplo a traves de interacciones ionicas o electrostaticas); (b) un agente fusogenico (por ejemplo, un agente capaz de fusionarse y/o de ser transportado a traves de una membrana celular); y (c) un grupo direccionador, por ejemplo, un agente direccionador a celulas o tejidos, por ejemplo una Iectina, glicoproteina, Iipido, o proteina, por ejemplo un anticuerpo, que se enlace con un tipo de celula especificado. Los agentes de ARN que forman complejo con un agente de suministro se describen en la Solicitud PCT No. PCT/US2004/07070, presentada el 8 de marzo de 2004.
Un agente de ARNi puede tener apareamientos no canonicos, tales como entre las secuencias sentido y antisentido del duplex de ARNi. Las caracteristicas que sirven de ejemplo de agentes de ARNi no canonicos se describen en Ia Solicitud PCT No. PCT/US2004/07070, presentada el 8 de marzo de 2004.
Mejor resistencia a la nucleasa
Un agente de ARNi, por ejemplo un agente de ARNi que elija como objetivo al alfa-ENaC, puede tener una mejor resistencia a las nucleasas.
Una forma de aumentar la resistencia es identificar los sitios de disociacion, y modificar tales sitios para inhibir la disociacion, como se describe en la Solicitud de los Estados Unidos No. 60/559.917, presentada el 4 de mayo de 2004. Por ejemplo, los dinucleotidos 5'-ua-3', 5'-ca-3', 5'-ug-3', 5'-uu-3', o 5'-cc-3', pueden servir como sitios de disociacion. En ciertas formas de realizacion, todas las pirimidinas de un agente de ARNi portan una modificacion 2' ya sea en la cadena sentido, en la cadena antisentido, o en ambas cadenas, y, por consiguiente, el agente de ARNi tiene una mejor resistencia a las endonucleasas. Tambien se puede lograr una mejor resistencia a la nucleasa mediante la modificacion del nucleotido 5', dando como resultado, por ejemplo, al menos un dinucleotido de 5'uridina-adenina-3' (5'-ua-3'), en donde la uridina es un nucleotido modificado en 2'; al menos un dinucleotido de 5'citidina-adenina-3' (5'-ca-3'), en donde la 5'-citidina es un nucieotido modificado en 2'; al menos un dinucleotido de 5'-uridina-guanina-3' (5'-ug-3'), en donde la 5'-uridina es un nucleotido modificado en 2'; al menos un dinucleotido de 5'-uridina-uridina-3' (5'-uu-3'), en donde la 5'-uridina es un nucleotido modificado en 2'; o al menos un dinucleotido de 5'-citidina-citidina-3' (5'-cc-3'), en donde la 5'-citidina es un nucleotido modificado en 2', como se describe en ia Solicitud Internacional No. PCT/US2005/O18931, presentada ei 27 de mayo de 2005. El agente de ARNi puede incluir al menos 2, al menos 3, al menos 4, o al menos 5 de tales dinucleotidos. En una forma de realizacion particularmente preferida, el nucleotido 5' en todas las apariciones de los motivos de secuencias 5'-ua-3' y 5'-ca-3', ya sea en la cadena sentido, en la cadena antisentido, o en ambas cadenas, es un nucleotido modificado. Preferiblemente, el nucieotido 5' en todas las apariciones de los motivos de secuencia 5'-ua-3', 5'-ca-3', y 5'-ug-3', ya sea en la cadena sentido, en la cadena antisentido, o en ambas cadenas, es un nucleotido modificado. Mas preferiblemente, todos los nucleotidos de pirimidina en la cadena sentido son nucleotidos modificados, y el nucleotido 5' en todas las apariciones de los motivos de secuencia 5'-ua-3' y 5'-ca-3' en la cadena antisentido, son nucleotidos modificados, o en donde la cadena antisentido no incluye ni un motivo 5'-ua-3' ni 5'-ca-3', en todas las apariciones del motivo de secuencia 5'-ug-3'.
Preferiblemente, los nucleotidos modificados en 2' incluyen, por ejemplo, una unidad de ribosa modificada en 2', por ejemplo se puede modificar o reemplazar el grupo 2'-hidroxilo (OH) con un numero de diferentes sustituyentes quot;oxiquot;
o quot;desoxiquot;.
Los ejemplos de las modificaciones del grupo hidroxilo quot;oxiquot;-2' incluyen alcoxi o ariloxi (OR, por ejemplo R = H, alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo o azucar); polietilenglicoles (PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR; acidos nucieicos quot;bloqueadosquot; (LNA), en los cuales el hidroxilo 2' se conecta, por ejemplo, mediante un puente de metileno, con el carbono 4' del mismo azucar de ribosa; O-AMINA y aminoalcoxi, O(CH2)nAMINA, (por ejemplo, AMINA = NH2; aIquiIamino, diaIquilamino, heterocicIilamino, arilamino, diarilamino, heteroariIamino, o diheteroariIamino, etilen
diamina, poliamino). Vale la pena observar que los oligonucleotidos que contienen solamente el grupo metoxietilo (MOE), (OCH2CH2OCH3, un derivado de PEG), exhiben estabilidades de nucleasa comparables a aquellas modificadas con la modificacion robusta de fosforotioato.
Las modificaciones quot;desoxiquot; incluyen hidrogeno (es decir, azucares de desoxirribosa, que son de una relevancia particular para las porciones que sobresalen de los ARN bc parciales); halogeno (por ejemplo, fluor), amino (por ejemplo, NH2; aIquiIamino, diaIquilamino, heterociclilo, arilamino, diarilamino, heteroarilamino, diheteroariIamino, o aminoacido); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINA (AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterocicIilamino, arilamino, diarilamino, heteroariIamino, o diheteroarilamino), NHC(O)R (R = alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, o azucar), ciano; mercapto; alquil-tio-alquilo; tioalcoxi; y alquilo, cicloalquilo, arilo, alquenilo, y alquinilo, que pueden estar opcionalmente sustituidos, por ejemplo, con una funcion amino.
Los sustituyentes preferidos son 2'-metoxietilo, 2'-OCH3, 2'-O-alilo, 2'-C-aIiIo, y 2'-fluor.
La inclusion de los azucares de furanosa en la estructura base del oligonucleotido tambien puede disminuir la disociacion endonucleolitica. Un agente de ARNi se puede modificar adicionalmente mediante la inclusion de un grupo cationico 3', o invirtiendo el nucleosido en el terminal 3' con un enlace 3'-3'. En otra forma de realizacion alternativa, el terminal 3' se puede bloquear con un grupo aminoalquilo, por ejemplo, un aminoalquilo dT de 5 carbonoa 3'. Otros conjugados de 3' pueden inhibir la disociacion exonucleolitica de 3'-5'. Aunque sin querer cenirese a ninguna teoria en particular, un conjugado de 3', tal como naproxeno o ibuprofeno, puede inhibir Ia disociacion exonucleolitica mediante el bloqueo esterico de Ia exonucleasa para que no se enlace con el extremo 3' del oligonucleotido. Inclusive pequenas cadenas de alquilo, grupos arilo, o conjugados heterociclicos, o azucares modificados (D-ribosa, desoxirribosa, glucosa, etc.) pueden bloquear las exonucleasas de 3'-5'.
La disociacion nucleolitica tambien se puede inhibir mediante la introduccion de modificaciones del enlazador de fosfato, por ejemplo enlaces fosforotioato. Por consiguiente, los agentes de ARNi preferidos incluyen dimeros de nucleotidos enriquecidos o puros para una forma quiral particular de un grupo fosfato modificado que contenga un heteroatomo en una posicion que no sea de formacion de puente normalmente ocupada por el oxigeno. El heteroatomo puede ser S, Se, Nr2, o Br3. Cuando el heteroatomo es S, se prefiere el enlace Sp quiralmente puro o enriquecido. Enriquecido significa al menos 70, 80, 90, 95, o 99% de la forma preferida. Los enlaces fosfato modificados son particularmente eficientes para inhibir la disociacion exonucleolitica cuando se introducen cerca de las posiciones de los terminales 5' o 3', y preferiblemente las posiciones del terminal 5', de un agente de ARNi.
Los conjugados de 5' tambien pueden inhibir la disociacion exonucleolitica de 5'-3'. Aunque sin querer cenirnos a ninguna teoria en particular, un conjugado de 5', tal como naproxeno o ibuprofeno, puede inhibir la disociacion exonucleolitica mediante el bloqueo esterico de la exonucleasa para que no se enlace con el extremo 5' del oligonucleotido. Inclusive las cadenas de alquilo pequenas, los grupos arilo, o los conjugados heterociclicos o azucares modificados (D-ribosa, desoxirribosa, glucosa, etc.) pueden bloquear las exonucleasas de 3'-5'.
Un agente de ARNi puede tener una mayor resistencia a las nucleasas cuando un agente de ARNi duplex incluye un nucleotido bicatenario que sobresale en al menos un extremo. En las formas de relizacion preferidas, el nucleotido que sobresale incluye de 1 a 4, preferiblemente de 2 a 3 nucleotidos no apareados. En una forma de realizacion preferida, el nucleotido no apareado de la cadena monocatenaria que pende que esta directamente adyacente al par de nucleotidos terminales, contiene una base de purina, y el par de nucleotidos terminales es un par G-C, o al menos dos de los ultimos cuatro pares de nucleotidos complementarios son pares de G-C. En las forma de realizacion adicionales, el nucleotidos que sobresale puede tener 1 o 2 nucleotidos no apareados, y en la forma de realizacion que sirve de ejemplo, el nucleotido que sobresale es 5'-gc-3'. En forma de realizacion preferidas, el nucleotido qu sobresale esta sobre el extremo 3' de la cadena antisentido. En una forma de realizacion, el agente de ARNi incluye el motivo 5'-cgc-3' sobre el extremo 3' de la cadena antisentido, de tal manera que se forma una cadena que sobresale de dos nucleotidos 5'-gc-3'.
Por consiguiente, un agente de ARNi puede incluir modificaciones para inhibir la degradacion, por ejemplo, mediante nucleasas, por ejemplo endonucleasas o exonucleasas, que se encuentran en el cuerpo de un sujeto. Estos monomeros se denominan en Ia presente invencion como NRM, o monomeros que promueven la resistencia a la nucleasa, y las modificaciones correspondientes como modificaciones de NMR. En muchos casos, estas modificaciones modularan tambien otras propiedades del agente de ARNi, por ejemplo, la capacidad para interactuar con una proteina, por ejemplo una proteina de transporte, por ejemplo albumina de suero, o un miembro del RISC, o la capacidad de la primera y de la segunda secuencias para formar un duplex entre si, o para formar un duplex con otra secuencia, por ejemplo una molecula objetivo.
Se pueden introducir una o mas modificaciones diferentes de NRM en un agente de ARNi, o en una secuencia de un agente de ARNi. Una modificacion de NRM se puede utilizar mas de una vez en una secuencia o en un agente de ARNi.
Las modificaciones de NRM incluyen algunas que se pueden colocar solamente en el terminal, y otras que pueden ir en cualquier posicion. Algunas modificaciones de NRM pueden inhibir la hibridacion, de tal manera que es preferible utilizarlas solamente en las regiones terminales, y preferiblemente no utilizarlas en el sitio de disociacion o en la region de disociacion de una secuencia que dirija una secuencia objetivo o gen, en particular sobre la cadena antisentido. Se pueden utilizar en cualquier parte en la cadena sentido, siempre y cuando se mantenga suficiente hibridacion entre las dos cadenas del agente de ARNi bc. En algunas formas de realizacion, es deseable poner el NRM en el sitio de disociacion o en la region de disociacion de una cadena sentido, debido a que puede minimizar el silenciamiento fuera del objetivo.
En la mayoria de los casos, las modificaciones de NRM se distribuiran en forma diferente, dependiendo de si estan comprendidas sobre una cadena sentido o antisentido. Si estan sobre una cadena antisentido, no se deben insertar modificaciones que interfieran con, o que inhiban la disociacion con endonucleasa, en la region que sea sometida a disociacion mediada por RISC, por ejemplo el sitio de disociacion o la region de disociacion (como se describe en Elbashir y colaboradores, 2001, Genes and Dev. 15: 188, que se incorpora a la presente como referencia). La disociacion del objetivo ocurre aproximadamente en la mitad de una cadena antisentido de 20 o 21 nucleotidos, o aproximadamente 10 u 11 nucleotidos en direccion 5' del primer nucleotido sobre el ARNm objetivo que es complementario con la cadena antisentido. Como se utiliza en la presente invencion, el sitio de disociacion se refiere a los nucleotidos sobre cualquier lado del sitio de disociacion, sobre el objetivo o sobre la cadena del agente de ARNi que se hibrida con el. La region de disociacion significa los nucleotidos dentro de 1, 2, o 3 nucleotidos del sitio de disociacion, en cualquier direccion.
Tales modificaciones se pueden introducir en las regiones terminales, por ejemplo en la posicion terminal, o con 2, 3, 4, o 5 posiciones del terminal, de una cadena sentido o antisentido.
Ligandos atados
Se puede influir o confeccionar a la medida las propiedades de un agente de ARNi, incluyendo sus propiedades farmacologicas, por ejemplo, mediante la introduccion de Iigandos, por ejemplo Iigandos atados. Ademas, las propiedades farmacologicas de un agente de ARNi se pueden mejorar mediante la incorporacion de un Iigando en una formulacion del agente de ARNi, cuando el agente de ARNi tiene o no tiene un Iigando atado.
Se pueden atar una amplia variedad de entidades, por ejemplo ligandos, a un agente de ARNi, o se pueden utilizar como un conjugado o aditivo de una formulacion, por ejemplo, con el portador de una subunidad monomerica conjugada con el Iigando. Mas adelante se describen ejemplos en el contexto de una subunidad monomerica conjugada con Iigando, pero que es solamente la preferida, y las entidades se pueden acoplar en otros puntos con un agente de ARNi.
Las fracciones preferidas son Iigandos, los cuales se acoplan, preferiblemente de una manera covalente, ya sea directa o indirectamente, por medio de una atadura que intervenga con el portador. En las formas de realizacion preferidas, el Iigando se une al portador por medio de una atadura interviniente. El Iigando, o el Iigando atado, pueden estar presentes sobre el monomero conjugado con ligando, cuando el monomero conjugado con Iigando se incorpora en la cadena en crecimiento. En algunas formas de realizacion, se puede incorporar el Iigando en una subunidad monomerica conjugada con Iigando quot;precursorquot;, despues de que la subunidad monomerica conjugada con Iigando quot;precursorquot; se haya incorporado en la cadena en crecimiento. Por ejemplo, se puede incorporar un monomero que tenga, por ejemplo, una atadura terminada en amino, por ejemplo, TAP-(CH2)nNH2, en una cadena sentido o antisentido en crecimiento. En una operacion posterior, es decir, despues de la incorporacion de la subunidad monomerica precursora en la cadena, se puede unir posteriormente un Iigando que tenga un grupo electrofilico, por ejemplo un grupo ester o aldehido de pentafluorofeniIo, al monomero conjugado con Iigando precursor, mediante el acoplamiento del grupo electrofilico del Iigando con el grupo nucleofilico terminal de la atadura de la subunidad monomerica conjugada con Iigando precursor.
En formas de realizacion preferidas, un Iigando altera la distribucion, direccionamiento, o tiempo de vida de un agente de ARNi en el cual se incorpore. En formas de realizacion preferidas, un Iigando proporciona una mejor afinidad por un objetivo seleccionado, por ejemplo una molecula, celula, o tipo de celula, compartimiento, por ejemplo un compartimiento celular o de un organo, tejido, organo, o region del cuerpo, por ejemplo, como se compara con una especie ausente tal como un Iigando.
Los ligandos preferidos pueden mejorar las propiedades de transporte, hibridacion, y especificidad, y tambien pueden mejorar la resistencia a la nucleasa del oligorribonucleotido natural o modificado resultante, o de una molecula polimerica que comprenda cualquier combinacion de monomeros descritos en la presente invencion, y/o ribonucleotidos naturales o modificados.
Los ligandos en general pueden incluir modificadores terapeuticos, por ejemplo para mejorar la absorcion; compuestos de diagnostico o grupos reporteros, por ejemplo, para monitorear la distribucion; agentes de
entrecruzamiento; fracciones que confieran resistencia a Ia nucleasa; y nucleobases naturales o inusuales. Los ejemplos generales incluyen moleculas Iipofilicas, lipidos, lectinas, esteroides (por ejemplo, uvaol, hecigenina, diosgenina), terpenos (por ejemplo, triterpenos, por ejemplo sarsasapogenina, Friedelin, acido Iitocolico derivado de epifriedelanol), vitaminas, carbohidratos (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosano, polimeros sinteticos (por ejemplo, Oligo Lactato de 15 mer) y naturales (por ejemplo, de peso molecular bajo y medio), inulina, ciclodextrina, o acido hialuronico), proteinas, agentes enlazantes de proteinas, moleculas destinadas a la integrina, policationicos, peptidos, poliaminas, e imitaciones de peptidos. Otros ejemplos incluyen ligandos receptores de celulas epiteliales o de acido folico, tales como transferrina.
El ligando puede ser una molecula de origen natural o reoombinante o sintetica, tal como un polimero sintetico, por ejemplo un poliaminoacido sintetico. Los ejemplos de poliaminoacidos incluyen polilisina (PLL), poliacido L-aspartico, poliacido L-glutamico, copolimero de estireno-anhidrido de acido maleico, copolimero de poli(L-lactico-co-glicolado), copolimero de diviniIeter -anhidrido maleico, copolimero de N-(2-hidroxipropiI)metacriIamida (HMPA), polietilen glicol (PEG), poIivinlI alcohol (PVA), poIiuretano, poli(acido 2-etiIacrilico), polimeros de N-isopropilacrilamida, o polifosfazina. Los ejemplos de poliaminas incluyen: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, poliamina pseudopeptidica, poliamina peptidomimetica, poliamina de dendrimero, arginina, amidina, protamina, fracciones cationicas, por ejemplo lipido catlonico, porfirina cationica, sal cuaternaria de una poliamina, o un peptido alfa helicoidal.
Los ligandos tambien pueden incluir grupos de direccionamiento, por ejemplo un agente de direccionamiento a una celula o tejido, por ejemplo una tirotropina, melanotropina, proteina A tensoactiva, carbohidrato de mucina, un poIiaminoacido glicosilado, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, o un peptido de Arg-Gly-Asp (RGD), o un mimetico de peptido RGD.
Los ligandos pueden ser proteinas, por ejemplo glicoproteinas, Iipoproteinas, por ejemplo Iipoproteina de baja densidad (LDL), o albuminas, por ejemplo, albumina de suero humano (HSA), o peptidos, por ejemplo moleculas que tengan una afinidad especifica por un coligando, o anticuerpos, por ejemplo un anticuerpo que se enlace con un tipo de celula especificado, tal como una celula cancerosa, una celula endotelial, o una celula osea. Los ligandos tambien pueden incluir hormonas y receptores de hormonas. Tambien pueden incluir especies no peptidicas, tales como cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-glucosamina, manosa multivalente, o fucosa multivalente.
El ligando puede ser una sustancia, por ejemplo un farmaco, que pueda aumentar la absorcion del agente de ARNi dentro de Ia celula, por ejemplo mediante la alteracion del citoesqueleto de la celula, por ejemplo mediante la alteracion de los microtubulos, microfilamentos, y/o filamentos intermedios de la celula. El farmaco puede ser, por ejemplo, taxon, vincristina, vinblastina, citocalasina, nocodazol, japlaquinolida, latrunculina A, faloidina, swinholida A, indanocina, mioservina, tetraciclina.
En un aspecto, el Iigando es un lipido, o una molecula a base de lipido. Tal molecula de lipido o a base de lipido preferiblemente se enlaza con una proteina de suero, por ejemplo albumina de suero humano (HSA). Un Iigando que se enlaza con HSA permite la distribucion del conjugado con un tejido objetivo, por ejemplo tejido de higado, incluyendo celulas parenquimales del higado. Otras moleculas que pueden enlazar HSA tambien se pueden utilizar como Iigandos. Por ejemplo, se pueden utilizar neproxina o aspirina. Un lipido o Iigando basado en lipido puede (a) aumentar la resistencia a la degradacion del conjugado, (b) aumentar el direccionamiento o el transporte hacia una celula o membrana celular objetivo, y/o (c) se puede utilizar para ajustar el enlazamiento con una proteina de suero, por ejemplo HSA.
Un Iigando a base de lipido se puede utilizar para modular, por ejemplo para controlar el enlazamiento del conjugado con un tejido objetivo. Por ejemplo, un lipido o un Iigando a base de lipido que se enlaza con HSA mas fuertemente, tendra menos posibilidades de dirigirse hacia el rinon, y por consiguiente, menos probabilidades de ser eliminado del cuerpo.
En una forma de realizacion preferida, el Iigando a base de lipido se enlaza con HSA. Preferiblemente, se enlaza con HSA con una afinidad suficiente para que el conjugado se distribuya preferiblemente hacia un tejido que no sea el rinon. Sin embargo, se prefiere que la afinidad no sea tan fuerte como para que no se pueda revertir el enlace del Iigando de HSA.
En otro aspecto, el Iigando es una fraccion, por ejemplo una vitamina o un nutriente, que es absorbido por una celula objetivo, por ejemplo una celula en proliferacion. Estos son particularmente utiles para el tratamiento de los trastornos caracterizados por una proliferacion celular indeseada, por ejemplo del tipo maligno o no maligno, por ejemplo celulas cancerosas. Los ejemplos de vitaminas incluyen vitamina A, E, y K. Otros ejemplos de vitaminas incluyen las vitaminas B, por ejemplo acido folico, B12, riboflavina, biotina, piridoxal, u otras vitaminas o nutrientes absorbidos por las celulas cancerosas.
En otro aspecto, el Iigando es un agente de permeacion celular, preferiblemente un agente de permeacion celular helicoidal. Preferiblemente, el agente es anfipatico. Un ejemplo de agente es un peptido, tal como tat o antenapedia. Si el agente es un peptido, se puede modificar, incluyendo un mimetico de peptidilo, invertomeros, enlaces no peptidicos o pseudo-peptidicos, y el uso de D-aminoacidos. El agente helicoidal preferiblemente es un agente alfahelicoidal, que preferiblemente tiene una fase lipofilica y una fase Iipofobica. El agente de permeacion celular se puede enlazar covalentemente al agente de ARNi, o puede ser parte de un complejo de ARNi-peptido.
Modificaciones de fosfato 5'
En formas de realizacion preferidas, los agentes de ARNi estan 5' fosforilados, o incluyen un analogo de fosforilo en el terminal principal 5'. Las modificaciones del fosfato 5' de la cadena antisentido incluyen aquellas que son compatibles con el silenciamiento del gen mediado por RISC. Las modificaciones adecuadas incluyen: 5'monofosfato ((HO)2(O)P-O-5'); 5'-difosfato ((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'; 5'-trifosfato ((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-OP(HO)(O)-O-5'); tapa de 5'-guanosina (7-metilada o no metilada) (7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O5'); tapa de 5'-adenosina (Appp), y cualquier estructura de tapa de nucleotido modificada o no modificada (N-O-5'(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-monotiofosfato (fosforotioato; (HO)2(S)P-O-5'); 5'-monoditiofosfato (fosforoditioato; (HO)(HS)(S)P-O-5'); 5'-fosforotiolato ((HO)2(O)P-S-5'); cualquier combinacion adicional de monofosfato, difosfato, y trifosfato reemplazados por oxigeno/azufre (por ejemplo, 5'-alfa-tiotrifosfato, 5'-gammatiotrifosfato, etc.), 5'-fosforamidatos ((HO)2(O)P-NH-5', (HO)(NH2)(O)P-O-5'), 5'-aIquiIfosfonatos (R = alquilo = metilo, etilo, isopropilo, propilo, etc., por ejemplo RP(OH)(O)-O-5'-, (OH)2(O)P-5'-CH2-); 5'-alquileterfosfonatos (R = aIquileter = metoximetilo (MeOCH2-), etoximetilo, etc., por ejemplo, RP(OH)(O)-O-5'-).
La cadena sentido se puede modificar con el objeto de inactivar la cadena sentido y prevenir la formacion de un RISC activo, reduciendo de esta manera potencialmente los efectos fuera del objetivo. Esto se puede lograr mediante una modificacion que impida la fosforiIacion 5' de la cadena sentido, por ejemplo mediante Ia modificacion con un ribonucleotido de 5'-O-metilo (vease, Nykanen y colaboradores, (2001) ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell 107, 309 -321). Tambien se pueden emplear otras modificaciones que impidan la fosforilacion, por ejemplo simplemente sustituyendo el 5'-OH por H en lugar de O-Me. Alternativamente, se puede agregar un grupo voluminoso grande al 5'-fosfato, convirtiendolo en un enlace de fosfodiester.
Nucleobases no naturales
El nitropirrolilo y el nitroindolilo son nucleobases no naturales que son miembros de una clase de compuestos conocidos como bases universales. Las bases universales son aquellos compuestos que pueden reemplazar a cualquiera de las cuatro bases que se presentan naturalmente, sin afectar sustancialmente el comportamiento de fusion o Ia actividad del duplex de oligonucleotidos. En contraste con la estabilizacion, las interacciones de enlazamiento de hidrogeno asociadas con las nucleobases de origen natural, se postula que los duplexes de oligonucleotidos que contienen nucleobases de 3-nitropirrolilo se estabilizan exclusivamente mediante las interacciones de apilacion. La ausencia de interacciones de enlace de hidrogeno significativas con las nucleobases de nitropirrolilo obvia la especificidad para una base complementaria especifica. Ademas, diferentes reportes confirman que el 4-, 5-, y 6-nitroindolilo exhiben muy poca especificidad por las cuatro bases naturales. De manera muy interesante, un duplex de oligonucleotido que contenga 5-nitroindolilo es mas estable que los oligonucleotidos correspondientes que contienen 4-nitroindolilo y 6-nitroindolilo. Los procedimientos para la preparacion de 1-(2'-Ometil-�-D-ribofuranosil)-5-nitroindol se describen en Gaubert, G.; Wengel, J. Tetrahedron Letters 2004, 45, 5629. Otras bases universales incluyen hipoxantinilo, isoinosinilo, 2-aza-inosinilo, 7-desaza-inosinilo, nitroimidazolilo, nitropirazolilo, nitrobencimidazolilo, nitroindazolilo, aminoindolilo, pirrolopirimidinilo, y los derivados estructurales de los mismos. Para una discusion mas detallada, incluyendo los procedimientos sinteticos, de nitropirrolilo, nitroindolilo, y otras bases universales mencionadas anteriormente, vease Vallone y colaboradores, Nucleic Acids Research, 27(17): 3589 - 3596 (1999); Loakes y colaboradores, J. Mol. Bio., 270: 426 -436 (1997); Loakes y colaboradores, Nucleic Acids Research, 22(20): 4039 -4043 (1994); Oliver y colaboradores, Organic Letters, Vol. 3(13): 1977 -198O (2001); Amosova y colaboradores, Nucleic Acids Research, 25(10): 1930 -1934 (1997); Loakes y colaboradores, Nucleic Acids Research, 29(12): 2437 - 2447 (2001); Bergstrom y colaboradores, J. Am. Chem. Soc., 117: 1201 - 1209 (1995); Franchetti y colaboradores, Biorg. Med. Chem. Lett. 11: 67 - 69 (2001); y Nair y colaboradores, Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 20(4 - 7): 735 - 738 (2001).
El difluorotolilo es una nucleobase no natural que funciona como una base universal. El difluorotolilo es un isostero de la nucleobase natural timina. Pero a diferencia de la timina, el difluorotolilo no muestra una selectividad apreciable por cualquiera de las bases naturales. Otros compuestos aromaticos que funcionan como bases universales y que son susceptibles para la presente invencion son 4-fluoro-6-metilbencimidazol y 4-metilbencimidazol. Ademas, los derivados de isocarboestirilo relativamente hidrofobicos de 3-metiI isocarboestirilo, 5-metil isocarboestirilo, y 3-metiI7-propinil isocarboestirilo son bases universales que provocan solamente una ligera desestabilizacion de los duplexes de oligonucleotidos, en comparacion con la secuencia del oligonucleotido que contiene solamente bases naturales. Otras nucleobases no naturales incluyen 7-azaindolilo, 6-metil-7-azaindolilo, imidizopiridinilo, 9-metil
imidizopiridlnilo, pirroIopirizinilo, isocarboestirilo, 7-propinil isocarboestirilo, propiniI-7-azaindolilo, 2,4,5-trimetil-fenilo, 4-metilindolilo, 4,6-dimetiIindolilo, fenilo, naftalenilo, antracenilo, fenantracenilo, pirenilo, estilbenilo, tetracenilo, pentacenilo, y los derivados estructurales de los mismos. Para una discusion mas detallada, incluyendo los procedimientos sinteticos, de difluorotolilo, 4-fIuoro-6-metiIbencimidazol, 4-metilbencimidazol, y otras bases no naturales mencionadas anteriormente, vease: Schweitzer y colaboradores, J. Org. Chem., 59: 7238 -7242 (1994); Berger y colaboradores, Nucleic Acids Research, 28(15): 2911 -2914 (2000); Moran y colaboradores, J. Am. Chem. Soc., 119: 2056 -2057 (1997); Morales y colaboradores, J. Am. Chem. Soc., 121: 2323 -2324 (1999); Guckian y colaboradores, J. Am. Chem. Soc., 118:8182-8183 (1996); Morales y colaboradores, J. Am. Chem. Soc., 122(6): 1001 -1007 (2000); McMinn y colaboradores, J. Am. Chem. Soc., 121: 11585 -11586 (1999); Guckian y colaboradores, J. Org. Chem., 63: 9652 -9656 (1998); Moran y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 10506 10511 (1997); Das y colaboradores, J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1: 197 -206 (2002); Shibata y colaboradores, J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1: 1605 -1611 (2001); Wu y colaboradores, J. Am. Chem. Soc., 122(32): 7621 -7632 (2000); O'Neill y colaboradores, J. Org. Chem., 67: 5869 -5875 (2002); Chaudhuri y colaboradores, J. Am. Chem. Soc., 117: 10434 - 10442 (1995); y la Patente de los Estados Unidos No. 6.218.108.
Transporte de agentes de ARNi dentro de las celulas
Sin querer cenirse a ninguna teoria en particular, la similitud quimica entre los agentes de ARNi conjugados con colesterol y ciertos constituyentes de las Iipoproteinas (por ejemplo, colesterol, colesteril esteres, fosfolipidos), puede conducir a la asociacion de los agentes de ARNi con Iipoproteinas (por ejemplo, LDL, HDL) en la sangre, y/o a la interaccion del agente de ARNi con los componentes celulares que tienen afinidad por el colesterol, por ejemplo los componentes de Ia ruta de transporte de colesterol. Las Iipoproteinas, asi como sus constituyentes, son absorbidas y procesadas por las celulas mediante diferentes mecanismos de transporte activo y pasivo, por ejemplo, sin limitacion, mediante endocitosis del LDL enlazado con el receptor de LDL, endocitosis de las LDL oxidadas o bien modificadas, a traves de la interaccion con el receptor depurador A, la absorcion de colesterol HDL en el higado mediada por el receptor depurador B1, pinocitosis, o transporte de colesterol a traves de las membranas mediante las proteinas transportadoras de ABC (casete de enlazamiento de ATP), por ejemplo ABC-A1, ABC-G1 o ABC-G4. Por consiguiente, los agentes de ARNi conjugados con colesterol podrian disfrutar de una absorcion facilitada por parte de las celulas que poseen estos mecanismos de transporte, por ejemplo las celulas del higado. Como tal, la presente invencion proporciona evidencia y metodos generales para dirigir agentes de ARNi hacia las celulas que expresan ciertos componentes de la superficie celular, por ejemplo receptores, mediante la conjugacion de un Iigando natural para tal componente (por ejemplo, colesterol) con el agente de ARNi, o mediante la conjugacion de una fraccion quimica (por ejemplo, colesterol) con el agente de ARNi que se asocia con, o que se enlaza con un Iigando natural para el componente (por ejemplo, LDL, HDL).
Otras formas de realizacion
Un agente de ARNi, puede ser producido en una celula in vivo, por ejemplo, a partir de plantillas de ADN exogeno, que se suministran dentro de la celula. Por ejemplo, las plantillas de ADN se pueden insertar en los vectores, y se pueden utilizar como vectores de terapia genica. Los vectores de terapia genica se pueden suministrar a un sujeto, por ejemplo, mediante inyeccion intravenosa, administracion local (Patente de los Estados Unidos No. 5.328.470), o mediante inyeccion estereotactica (vease, por ejemplo, Chen y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 91: 3054 3057, 1994). La preparacion farmaceutica del vector de terapia genica puede incluir al vector de terapia genica en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberacion lenta en donde se incruste el vehiculo de suministro genico. Las plantillas de ADN, por ejemplo, pueden incluir dos unidades de transcripcion, una que produzca una transcripcion que incluya la cadena superior de un agente de ARNi, y una que produzca una transcripcion que incluya la cadena inferior de un agente de ARNi. Cuando se transcriben las plantillas, se produce el agente de ARNi, y se procesa en fragmentos de agente de ARNi corto que median el silenciamiento genico.
Formulacion
La presente invencion tambien incluye composiciones farmaceuticas y formulaciones que incluyen a los compuestos de ARN bc de la invencion. Las composiciones farmaceuticas se pueden administrar en una cantidad de formas, dependiendo de si se desea el tratamiento local o sistemico, y del area que se vaya a tratar. La administracion puede ser topica, pulmonar, por ejemplo mediante inhalacion o insuflacion de polvos o aerosoles, incluyendo mediante un nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidermica, y transdermica, oral o parenteral. La administracion parenteral incluye inyeccion o infusion intravenosa, intra-arterial, subcutanea, intraperitoneal, o intramuscular; o administracion intracraneal, por ejemplo intratecal o intraventricular.
Las composiciones farmaceuticas y formulaciones para administracion topica pueden incluir parches transdermicos, unguentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, liquidos, y polvos. Pueden ser necesarios o deseables los vehiculos farmaceuticos convencionales, acuosos, en polvo, o bases oleosas, espesantes, y similares. Tambien pueden ser utiles condones recubiertos, guantes, y similares. Las formulaciones topicas preferidas incluyen aquellas en donde los ARN bc estan en mezcla con un agente de suministro topico, tal como lipidos, Iiposomas,
acidos grasos, esteres de acidos grasos, esteroides, agentes quelantes, y tensoactivos. Los lipidos y Iiposomas preferidos incluyen los neutros (por ejemplo, dioleoilfosfatidiletanolamina = DOPE, dimiristoilfosfatidilcolina = DMPC, diestearoiIfosfatidilcolina), los negativos (por ejemplo, dimiristoilfosfatidiI glicerol = DMPG), y los calionicos (por ejemplo, dioIeoiItetrametiIaminopropilo = DOTAP, y dioleoilfosfatidiI etanolamina = DOTMA), por ejemplo bromuro de (+/-)-N-(3-amino-propil)-N,N-dimetiI-2,3-bis-(dodeciloxi)-1-propanaminio = GAP-DLRIE). Los ARN bc de la invencion se pueden encapsular dentro de Iiposomas, o pueden formar complejos con los mismos, en particular con los Iiposomas cationicos. De una manera alternativa, los ARN bc pueden formar complejos con lipidos, en particular con los lipidos cationicos. Los acidos grasos y esteres preferidos incluyen, pero no se limitan a, acido araquidonico, acido oleico, acido eicosanoico, acido laurico, acido caprilico, acido caprico, acido miristico, acido palmitico, acido estearico, acido Iinoleico, acido linolenico, dicaprato, tricaprato, monooleina, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1dodeciI-azacicIoheptan-2-ona, una acilcarnitina, una aciIcolina, o un ester de alquilo de 1 a 10 atomos de carbono (por ejemplo, miristato de isopropilo, IPM), monoglicerido, diglicerido, o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos. Las formulaciones topicas se describen con detalle en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos con numero de serie 09/315.298, presentada el 20 de mayo de 1999.
Las composiciones y formulaciones para administracion oral incluyen polvos o granulos, microparticulas, nanoparticulas, suspensiones, o soluciones en agua o en medios no acuosos, capsulas, capsulas de gel, pastillas, tabletas, o minitabletas. Pueden ser deseables los espesantes, agentes saborizantes, diluyentes, emulsionantes, auxiliares de dispersion, o aglutinantes. Las formulaciones orales preferidas son aquellas en donde los ARN bc se administran junto con uno o mas potenciadores de penetracion, tensoactivos, y quelantes. Los tensoactivos preferidos incluyen acidos grasos y/o esteres o sales de los mismos, acidos biliares y/o sales de los mismos. Los acidos/sales biliares preferidos incluyen acido quenodesoxicolico (CDCA), y acido ursodesoxiquenodesoxicolico (UDCA), acido colico, acido deshidrocolico, acido desoxicolico, acido glucolico, acido glicolico, acido glicodesoxicolico, acido taurocolico, acido taurodesoxicolico, tauro-24,25-dihidro-fusidato de sodio, y gIicodihidrofusidato de sodio. Los acidos grasos preferidos incluyen acido araquidonico, acido undecanoico, acido oleico, acido Iaurico, acido caprilico, acido caprico, acido miristico, acido palmitico, acido estearico, acido Iinoleico, acido Iinolenico, dicaprato, tricaprato, monooleina, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2ona, una aciIcarnitina, una acilcolina, o un monoglicerido, un diglicerido o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos (por ejemplo, de sodio). Tambien se prefieren las combinaciones de potenciadores de penetracion, por ejemplo acidos grasos / sales en combinacion con acidos biliares / sales. Una combinacion particularmente preferida es la sal sodica del acido Iaurico, del acido caprilico, y UDCA. Otros potenciadores de penetracion incluyen lauril eter de poIioxietiIeno-9, cetiI eter de poIioxietileno-20. Los ARN bc se pueden suministrar en forma oral, en una forma granular, incluyendo las particulas secadas por pulverizacion, o pueden formar complejos para formar micro o nanoparticulas. Los agentes formadores de complejos de ARN bc incluyen los poli-aminoacidos; poliiminas; poliacrilatos; polialquilacrilatos; polioxetanos, polialquilcianoacrilatos; gelatinas cationizadas, albuminas, almidones, acrilatos, polietilenglicoles (PEG), y almidones; polialquilcianoacrilatos; poliiminas derivadas de DEAE, polulanos, celulosas, y almidones. Los agentes formadores de complejos particularmente preferidos incluyen quitosano, Ntrimetilquitosano, poIi-L-Iisina, polihistidina, poIiornitina, poIiesperminas, protamina, poliviniIpiridina, poIitiodietiIaminometiletileno P(TDAE), poliaminoestireno (por ejemplo, p-amino), poli(metilcianoacrilato), poli(etiIcianoacrilato), poli(butilcianoacrilato), poli(isobutiIcianoacrilato), poli(isohexilcianoacrilato), DEAE-metacrilato, DEAE-hexilacrilato, DEAE-acriIamida, DEAE-albumina, y DEAE-dextrano, polimetilacrilato, polihexilacrilato, poli(acido D,L-lactico), poli(acido DL-lactico-co-glicolico (PLGA), alginato, y polietilenglicol (PEG). Las formulaciones orales para ARN bc y su preparacion se describen con detalle en las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos con serial No. 08/886.829 (presentada el 1 de julio de 1997), con serial No. 09l108.673 (presentada el 1 de julio de 1998), con serial No. 09/256.515 (presentada el 23 de febrero de 1999), con serial No. 09/082.624 (presentada el 21 de mayo de 1998), y con serial No. 09/315.298 (presentada el 20 de mayo de 1999).
Las composiciones y formulaciones para administracion parenteral, intratecal, o intraventricular, pueden incluir soluciones acuosas esteriles, las cuales tambien pueden contener reguladores del pH, diluyentes, y otros aditivos adecuados, tales como, pero sin limitarse a, potenciadores de penetracion, compuestos portadores, y otros vehiculos o excipientes farmaceuticamente aceptables.
Las composiciones farmaceuticas incluyen, pero no se limitan a, soluciones, emulsiones, y formulaciones que contienen Iiposomas. Estas composiciones se pueden generar a partir de una variedad de componentes que incluyen, pero no se limitan a, liquidos preformados, solidos auto-emulsionantes, y semisolidos auto-emulsionantes.
Las formulaciones farmaceuticas de la presente invencion, las cuales convenientemente se pueden presentar en una forma de dosificacion unitaria, se pueden preparar de acuerdo con las tecnicas convencionales bien conocidas en la industria farmaceutica. Tales tecnicas incluyen la etapa de poner en asociacion los ingredientes activos con el(los) vehiculo(s) o excipientes farmaceuticos. En general, las formulaciones se preparan poniendo en asociacion uniforme e intima a los ingredientes activos con vehiculos liquidos o vehiculos solidos finamente divididos o ambos, y entonces, si es necesario, se le da forma al producto.
Las composiciones se pueden formular en cualquiera de muchas posibles formas de dosificacion, tales como, pero
sin limitarse a, tabletas, capsulas, capsulas de gel, jarabes liquidos, geles blandos, supositorios, y enemas. Las composiciones de la presente invencion tambien se pueden formular como suspensiones en medios acuosos, no acuosos, o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener ademas sustancias que aumenten la viscosidad de la suspension, incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, y/o dextrano. La suspension tambien puede contener estabilizantes.
En una forma de realizacion, las composiciones farmaceuticas se pueden formular y utilizar como espumas. Las espumas farmaceuticas incluyen formulaciones tales como, pero sin limitarse a, emulsiones, microemulsiones, cremas, jaleas, y Iiposomas. Aunque son basicamente de una naturaleza similar, estas formulaciones varian en los componentes y en la consistencia del producto final. La preparacion de estas composiciones y formulaciones es en general conocida por los expertos en Ia tecnica farmaceutica y de formulacion, y se pueden aplicar a la formulacion de las composiciones.
Emulsiones
Las composiciones se pueden preparar y formular como emulsiones. Las emulsiones son tipicamente sistemas heterogeneos de un liquido dispersado en otro en la forma de gotas que normalmente exceden a un diametro de 0,1 !m (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, lnc., Nueva York, N. Y., Volumen 1, pagina 199; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, lnc., Nueva York, N. Y., Volumen 1, pagina 245; Block en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, lnc., Nueva York, N. Y., Volumen 2, pagina 335; Higuchi y colaboradores, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, pagina 301). Las emulsiones son con frecuencia sistemas bifasicos que comprenden dos fases liquidas inmiscibles intimamente mezcladas y dispersadas una en la otra. En general, las emulsiones pueden ser de Ia variedad de agua en aceite (a/ac) o de aceite en agua (ac/a). Cuando una fase acuosa se divide finamente y se dispersa como gotas diminutas en una fase oleosa en mayor volumen, la composicion resultante se denomina como una emulsion de agua en aceite (a/ac). De una manera alternativa, cuando una fase oleosa se divide finamente y se dispersa como gotas diminutas en una fase acuosa en mayor volumen, la composicion resultante se denomina como una emulsion de aceite en agua (ac/a). Las emulsiones pueden contener componentes adicionales ademas de las fases dispersadas, y el farmaco activo que puede estar presente como una solucion ya sea en la fase acuosa, la fase oleosa, o por si mismo como una fase separada. Tambien pueden estar presentes excipientes farmaceuticos, tales como emulsionantes, estabilizantes, colorantes, y antioxidantes en las emulsiones, segun sea necesario. Las emulsiones farmaceuticas tambien pueden ser emulsiones multiples que cuenten con mas de dos fases, tales como, por ejemplo, en el caso de las emulsiones de aceite en agua en aceite (ac/a/ac) y de agua en aceite en agua (a/ac/a). Estas formulaciones complejas con frecuencia proporcionan ciertas ventajas que no proporcionan las emulsiones binarias simples. Las emulsiones multiples en donde las gotitas de aceite individuales de una emulsion de aceite en agua encierran a las pequenas gotitas de agua, constituyen una emulsion de agua/aceite/agua. De la misma forma, un sistema de gotitas de aceite encerradas en globulos de agua estabilizados en una fase continua oleosa, proporciona una emulsion de aceite/agua/aceite.
Las emulsiones se caracterizan por poca o ninguna estabilidad termodinamica. Con frecuencia, la fase dispersada o discontinua de la emulsion se dispersa bien en la fase externa o continua, y se mantiene en esta forma a traves del medio de los emulsionantes o de la viscosidad de la formulacion. Cualquiera de las fases de la emulsion puede ser un semisolido o un solido, como es el caso de las bases de unguentos y cremas estilo emulsion. Otros medios para estabilizar las emulsiones implican el uso de emulsionantes, que se pueden incorporar en cualquier fase de la emulsion. Los emulsionantes se pueden clasificar en forma amplia en cuatro categorias: tensoactivos sinteticos, emulsionantes de origen natural, bases de absorcion, y solidos finamente dispersados (ldson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., Volumen 1, pagina 199).
Los tensoactivos sinteticos, tambien conocidos como agentes activos de superficie, han encontrado una amplia aplicabilidad en al formulacion de emulsiones, y han sido revisados en la literatura (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., Volumen 1, pagina 285; ldson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., 1988, Volumen 1, pagina 199). Los tensoactivos son tipicamente anfifllicos, y comprenden una porcion hidrofilica y una porcion hidrofoba. La proporcion de la naturaleza hidrofilica con respecto a la hidrofoba del tensoactivo se ha denominado como el equilibrio hidrofilico/Iipofilico (HLB), y es una valiosa herramienta en la categorizacion y seleccion de los tensoactivos en Ia preparacion de formulaciones. Los tensoactivos se pueden clasificar en diferentes clases con base en la naturaleza del grupo hidrofilico: no ionicos, anionicos, cationicos, y anfotericos (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, lnc., Nueva York, N. Y., Volumen 1, pagina 285).
Los emulsionantes de origen natural utilizados en las formulaciones en emulsion incluyen lanolina, cera de abejas, fosfatidos, lecitina, y acacia. Las bases de absorcion poseen propiedades hidrofilicas tales que pueden absorber
agua para formar emulsiones de agua en aceite y todavia retener sus consistencias semisolidas, tales como lanolina anhidra y vaselina hidrofilica. Tambien se han utilizado solidos finamente divididos como buenos emulsionantes, especialmente en combinacion con tensoactivos y en preparaciones viscosas. Estos incluyen solidos inorganicos polares, tales como hidroxidos de metales pesados, arcillas que no se hinchan, tales como bentonita, atapulgita, hectorita, caolin, montmorillonita, silicato de aluminio coloidal, y silicato de magnesio y aluminio coloidal, pigmentos, y solidos no polares, tales como carbono o triestearato de glicerilo.
Tambien se incluye una gran variedad de materiales no emulsionantes en las formulaciones en emulsion, y contribuyen a las propiedades de las emulsiones. Estos incluyen grasas, aceites, ceras, acidos grasos, alcoholes grasos, esteres grasos, humectantes, coloides hidrofilicos, conservantes, y antioxidantes (Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, lnc., Nueva York, N. Y., Volumen 1, pagina 335; ldson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, lnc., Nueva York, N. Y., Volumen 1, pagina 199).
Los coloides hidrofilicos o hidrocoloides incluyen gomas de origen natural, y polimeros sinteticos, tales como polisacaridos (por ejemplo, acacia, agar, acido alginico, carragenano, goma guar, goma de karaya, y tragacanto), derivados de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa y carboxipropilcelulosa), y polimeros sinteticos (por ejemplo, carbomeros, eteres de celulosa, y polimeros de carboxivinilo). Estos se dispersan o se hinchan en agua para formar soluciones coloidales que estabilizan las emulsiones mediante la formacion de peliculas interfaciales fuertes alrededor de las gotitas en fase dispersa, y aumentando la viscosidad de la fase externa.
Debido a que las emulsiones con frecuencia contienen una cantidad de ingredientes, tales como carbohidratos, proteinas, esteroles, y fosfatidos, que pueden soportar facilmente el crecimiento de microbios, estas formulaciones con frecuencia incorporan conservantes. Los conservantes comunmente utilizados incluidos en las formulaciones en emulsion incluyen metiI parabeno, propil parabeno, sales de amonio cuaternario, cloruro de benzalconio, esteres de acido p-hidroxibenzoico, y acido borico. Los antioxidantes tambien se agregan comunmente a las formulaciones en emulsion para prevenir el deterioro de Ia formulacion. Los antioxidantes utilizados pueden ser depuradores de radicales libres tales como tocoferoles, galatos de alquilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, o agentes reductores, tales como acido ascorbico y metabisuifito de sodio, y sinergistas de antioxidantes, tales como acido citrico, acido lartarico, y Iecitina.
La aplicacion de las formulaciones en emulsion por medio de las vias dermatologica, oral, y parenteral, y los metodos para su fabricacion, se han revisado en la literatura (ldson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., Volumen 1, pagina 199). Las formulaciones en emulsion para suministro oral se han utilizado muy ampliamente, debido a su facilidad de formulacion, asi como a la eficacia desde el punto de vista de la absorcion y la biodisponibilidad (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., Volumen 1, pagina 245; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York,
N. Y., Volumen 1, pagina 199). Los Iaxantes con base en aceite mineral, las vitaminas solubles en aceite, y las preparaciones nutritivas altas en grasas, estan entre los materiales que se han administrado comunmente de forma oral como emulsiones de aceite en agua.
En una forma de realizacion, las composiciones de los ARN bc y acidos nucleicos, se formulan como microemulsiones. Una microemulsion se puede definir como un sistema de agua, aceite, y anfifilo, que es una sola solucion liquida opticamente isotropica y termodinamicamente estable (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., Volumen 1, pagina 245). Tipicamente, las microemulsiones son sistemas que se preparan dispersando en primer lugar un aceite en una solucion tensoactiva acuosa, y luego se agrega una cantidad suficiente de un cuarto componente, en general un alcohol de una longitud de cadena intermedia, para formar un sistema transparente. Por consiguiente, las microemulsiones tambien se han descrito como dispersiones termodinamicamente estables e isotropicamente transparentes de dos liquidos inmiscibles que se estabilizan mediante peliculas interfaciales de moleculas de actividad superficial (Leung y Shah, en: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Editor, 1989, VCH Publishers, Nueva York, paginas 185 -215). Las microemulsiones comunmente se preparan mediante una combinacion de tres a cinco componentes que incluyen aceite, agua, tensoactivo, cotensoactivo, y electrolito. El que la microemulsion sea del tipo de agua en aceite (a/ac) o de aceite en agua (ac/a) depende de las propiedades del aceite y del tensoactivo utilizados, y de la estructura y empaquetamiento geometrico de las cabezas polares y de las colas hidrocarbonadas de las moleculas de tensoactivo (Schott, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing .Co., Easton, Pa., 1985, pagina 271).
El enfoque fenomenologico que utiliza diagramas de fases se ha estudiado extensamente, y ha producido un conocimiento exhaustivo, para un experto en la materia, de la manera en la que se formulan las microemulsiones (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., Volumen 1, pagina 245; Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., Volumen 1, pagina 335). Comparando con las emulsiones
convencionales, las microemulsiones ofrecen la ventaja de solubilizar los farmacos insolubles en agua en una formulacion de gotitas termodinamicamente estables que se forman de una manera espontanea.
Los tensoactivos utilizados en la preparacion de microemulsiones incluyen, pero no se limitan a, tensoactivos ionicos, tensoactivos no ionicos, Brij 96, oleil eteres de polioxietileno, esteres de acidos grasos de poliglicerol, monolaurato de tetraglicerol (ML310), monooleato de tetraglicerol (MO310), monooleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (MO750), sesquiolato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DAO750), solos o en combinacion con cotensoactivos. El cotensoactivo, usualmente un alcohol de cadena corta, tal como etanol, 1-propanol, y 1-butanol, sirve para aumentar la fluidez interfacial mediante su penetracion en la pelicula del tensoactivo, y en consecuencia, para crear una pelicula desordenada debido al espacio vacio entre las moleculas del tensoactivo. Sin embargo, las microemulsiones se pueden preparar sin el uso de cotensoactivos, y en la tecnica se conocen sistemas en microemulsion auto-emulsionantes exentas de alcohol. La fase acuosa puede ser tipicamente, pero no se limita a, agua, una solucion acuosa del farmaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceroles, polietilenglicoles, y derivados de etilen glicol. La fase oleosa puede incluir, pero no se limita a, materiales tales como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, esteres de acidos grasos, mono, di, y trigliceridos de cadena mediana (de 8 a 12 atomos de carbono), esteres de acidos grasos de glicerilo polioxietilados, alcoholes grasos, gliceridos poliglicolizados, gliceridos de 8 a 10 atomos de carbono poliglicolizados saturados, aceites vegetales, y aceite de silicona.
Las microemulsiones son particularmente interesantes desde el punto de vista de la solubilizacion del farmaco y de la mejor absorcion de los farmacos. Las microemulsiones con base en lipido (tanto de aceite en agua como de agua en aceite) han sido propuestas para mejorar la biodisponibilidad oral de los farmacos, incluyendo peptidos (Constantinides y colaboradores, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385 -1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. PharmacoI., 1993, 13, 205). Las microemulsiones tienen la ventaja de una mejor solubilizacion del farmaco, proteccion del farmaco de la hidrolisis enzimatica, posible mejora de la absorcion del farmaco debido a las alteraciones inducidas por el tensoactivo en la fluidez y permeabilidad de la membrana, facilidad de preparacion, facilidad de administracion oral sobre las formas de dosificacion solidas, mejor potencia clinica, y toxicidad reducida (Constantinides y colaboradores, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho y colaboradores, J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138 -143). Con frecuencia las microemulsiones pueden formarse de una manera espontanea cuando se juntan sus componentes a temperatura ambiente. Esto puede ser particularmente conveniente cuando se formulan farmacos termolabiles, peptidos, o los ARN bc. Las microemulsiones tambien han sido efectivas en el suministro transdermico de componentes activos tanto en aplicaciones cosmeticas como farmaceuticas. Se espera que las composiciones y formulaciones en microemulsion faciliten Ia mayor absorcion sistemica de los ARN bc y de los acidos nucleicos del tracto gastrointestinal, asi como que mejoren Ia absorcion celular local de los ARN bc y de los acidos nucleicos dentro del tracto gastrointestinal, la vagina, la cavidad bucal, y otras areas de administracion.
Las microemulsiones tambien pueden contener componentes y aditivos adicionales, tales como monoestearato de sorbitan (Grill 3), Labrasol, y potenciadores de penetracion, para mejorar las propiedades de la formulacion, y para mejorar la absorcion de los ARN bc y de los acidos nucleicos de la presente invencion. Los potenciadores de penetracion utilizados en las microemulsiones se pueden clasificar como pertenecientes a una de cinco amplias categorias: tensoactivos, acidos grasos, sales biliares, agentes quelantes, y no tensoactivos no quelantes (Lee y colaboradores, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pagina 92). Cada una de estas clases se ha discutido anteriormente.
Liposomas
Existen muchas estructuras tensoactivas organizadas ademas de las microemulsiones que se han estudiado y utilizado para la formulacion de farmacos. Estas incluyen monocapas, micelas, bicapas, y vesiculas. Las vesiculas, tales como los Iiposomas, han atraido un gran interes, debido a su especificidad y a la duracion de accion que ofrecen desde el punto de vista del suministro de farmacos. El termino quot;Iiposomaquot; significa una vesicula compuesta de lipidos anfifilicos configurados en una bicapa o bicapas esfericas.
Los Iiposomas son vesiculas unilamelares o multilamelares que tienen una membrana formada a partir de un material Iipofilico, y un interior acuoso. La porcion acuosa contiene a la composicion que se va a suministrar. Los Iiposomas cationicos poseen la ventaja de ser capaces de fusionarse con la pared celular. Los Iiposomas no cationicos, aunque no son capaces de fusionarse tan eficientemente con la membrana celular, son absorbidos por los macrofagos in vivo.
Con el objeto de cruzar la piel intacta del mamifero, las vesiculas de lipido deben pasar a traves de una serie de poros finos, cada uno con un diametro menor de 50 nm, bajo la influencia de un gradiente transdermico adecuado. Por consiguiente, es deseable utilizar un Iiposoma que sea altamente deformable, y que sea capaz de pasar a traves de estos poros tan finos.
Las ventajas adicionales de los Iiposomas incluyen: los liposomas obtenidos a partir de fosfolipidos naturales son
biocompatibles y biodegradables; los Iiposomas pueden incorporar un amplio rango de farmacos solubles en agua y en lipido; los Iiposomas pueden proteger a los farmacos encapsulados en sus compartimientos internos del metabolismo y la degradacion (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., Volumen 1, pagina 245). Las consideraciones importantes en Ia preparacion de formulaciones de Iiposomas son la carga superficial de lipido, el tamano de vesicula, y el volumen acuoso de los Iiposomas.
Los Iiposomas son utiles para la transferencia y suministro de ingredientes activos al sitio de accion. Debido a que Ia membrana liposomal es estructuralmente similar a las membranas biologicas, cuando se aplican Iiposomas a un tejido, los Iiposomas empiezan a fusionarse con las membranas celulares, y a medida que progresa la fusion del Iiposoma y la celula, se vacia el contenido Iiposomal al interior de la celula, en donde puede actuar el agente activo.
Las formulaciones liposomales han sido el foco de una extensa investigacion como el modo de suministro de muchos farmacos. Existe una evidencia creciente de que, para la administracion topica, los Iiposomas presentan varias ventajas sobre otras formulaciones. Estas ventajas incluyen efectos secundarios reducidos relacionados con la alta absorcion sistemica del farmaco administrado, mayor acumulacion del farmaco administrado en el objetivo deseado, y la capacidad para administrar una amplia variedad de farmacos, tanto hidrofilicos como hidrofobicos, a la piel.
Varios reportes han detallado la capacidad de los Iiposomas para suministrar agentes, incluyendo ADN de alto peso molecular, a la piel. Los compuestos que incluyen analgesicos, anticuerpos, hormonas, y los ADN de alto peso molecular, han sido administrados a la piel. La mayoria de las aplicaciones dieron como resultado el direccionamiento a la epidermis superior.
Los Iiposomas caen en dos amplias clases. Los Iiposomas cationicos son Iiposomas positivamente cargados que interactuan con las moleculas de ADN negativamente cargadas para formar un complejo estable. El complejo de ADN/liposoma positivamente cargado se enlaza con la superficie celular negativamente cargada y se internaliza en un endosoma. Debido al pH acido dentro del endosoma, los Iiposomas se rompen, liberando su contenido en el citoplasma celular (Wang y colaboradores, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980 - 985).
Los Iiposomas que son sensibles al pH, o que estan negativamente cargados, atrapan el ADN en lugar de formar un complejo con el. Debido a que tanto el ADN como el lipido estan similarmente cargados, se presenta el rechazo en lugar de la formacion de complejo. No obstante, algo de ADN es atrapado dentro del interior acuoso de estos liposomas. Los liposomas sensibles al pH se han utilizado para suministrar ADN que codifica el gen de la timidina quinasa a las monocapas celulares en cultivo. La expresion del gen endogeno se detecto en las celulas objetivo (Zhou y colaboradores, Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269 - 274).
Un tipo importante de composicion liposomal incluye fosfolipidos diferentes de la fosfatidilcolina derivada en forma natural. Las composiciones de liposomas neutras, por ejemplo, se pueden formar a partir de dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC), o de dipalmitoiI fosfatidiIcolina (DPPC). Las composiciones de liposomas anionicos generalmente se forman a partir de dimiristoil fosfatidilgIicerol, mientras que los liposomas fusogenicos anionicos se forman primordialmente a partir de dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE). Otro tipo de composicion liposomal se forma a partir de fosfatidilcolina (PC), tal como, por ejemplo, PC de soja y PC de huevo. Otro tipo se forma a partir de mezclas de fosfolipido y/o fosfatidiIcolina y/o colesterol.
Varios estudios han evaluado el suministro topico de formulaciones de farmacos liposomales a la piel. La aplicacion de liposomas que contienen interferon a Ia piel del cobayo, dieron como resultado una reduccion de las llagas provocadas por herpes de la piel, mientras que el suministro de interferon por otros medios (por ejemplo, como una solucion o como una emulsion) fue inefectivo (Weiner y colaboradores, Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405 410). Ademas, un estudio adicional probo la eficacia del interferon administrado como parte de una formulacion Iiposomal, en comparacion con la administracion de interferon utilizando un sistema acuoso, y concluyo que Ia formulacion liposomal fue superior a Ia administracion acuosa (du Plessis y colaboradores, Antiviral Research, 1992, 18, 259 - 265).
Tambien se han examinado los sistemas Iiposomaies no ionicos para determinar su utilidad en el suministro de farmacos a la piel, en particular los sistemas que contienen tensoactivo no ionico y colesterol. Las formulaciones Iiposomaies no ionicas que contienen Novasome™ I (dilaurato de gliceriIo / coIesterol / estearil eter de polioxietileno10), y Novasome™ II (diestearato de gIicerilo / colesteroI / estearil eter de polioxietiIeno-10), se usaron para suministrar ciclosporina A a la dermis de la piel del raton. Los resultados indicaron que estos sistemas Iiposomales no ionicos fueron efectivos para facilitar el deposito de ciclosporina A en diferentes capas de la piel (Hu y colaboradores, S. T. P. Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466).
Los Iiposomas tambien incluyen liposomas quot;estericamente estabiIizadosquot;, un termino que, como se utiliza en la presente invencion, se refiere a los Iiposomas que comprenden uno o mas lipidos especializados que, cuando se
incorporan en Iiposomas, dan como resultado mejores tiempos de vida en la circulacion en relacion con los Iiposomas que carecen de estos lipidos especializados. Los ejemplos de los Iiposomas estericamente estabilizados son aquellos en donde parte de la porcion de Iipido que forma la vesicula del Iiposoma (A) comprende uno o mas glicolipidos, tales como monosialogangliosido Gm1, o (B) forma un derivado con uno o mas polimeros hidrofilicos, tales como una fraccion de polietilen glicol (PEG). Aunque sin querer cenirnos a ninguna teoria en particular, se piensa en la tecnica que, al menos para los Iiposomas estericamente estabilizados que contienen gangliosidos, esfingomielina, o lipidos derivados de PEG, la mejor vida media en circulacion de estos Iiposomas estericamente estabilizados se deriva de una absorcion reducida en las celulas del sistema reticuloendotelial (RES) (Allen y colaboradores, FEBS Letters, 1987, 223, 42;Wu y colaboradores, Cancer Research, 1993, 53, 3765).
Se conocen en el estado del arte diferentes Iiposomas que contienen uno o mas glicolipidos. Papahadjopoulos y colaboradores (Ann. N. Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) reportaron la capacidad del monosialogangliosido Gm1, el sulfato de galactocerebrosido y fosfatidilinositol, para mejorar las vidas medias en sangre de los Iiposomas. Estos hallazgos fueron expuestos por Gabizon y colaboradores, (Proc. Natl. Acad. Sci. EUA., 1988, 85, 6949). La Patente de los Estados Unidos No. 4.837.028 y la Publicacion Internacional No. WO 88/04924, ambas de Allen y colaboradores, dan a conocer Iiposomas que comprenden (1) esfingomielina, y (2) el gangliosido Gm1 o un ester de sulfato de galactocerebrosida. La Patente de los Estados Unidos No. 5.543.152 (Webb y colaboradores) da a conocer Iiposomas que contienen esfingomielina. Los Iiposomas que contienen 1,2-sn-dimiristoilfosfatidiIcolina se dan a conocer en la Publicacion Internacional No. WO 97/13499 (Lim y colaboradores).
Muchos Iiposomas que comprenden lipidos que forman derivados con uno o mas polimeros hidrofilicos, y los metodos para su preparacion, se conocen en el arte. Sunamoto y colaboradores (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) describieron liposomas que comprenden un detergente no ionico, 2C121543, que contiene una fraccion de PEG. lllum y colaboradores (FEBS Lett., 1984, 167, 79) observaron que el recubrimiento hidrofilico de las particulas de poliestireno con glicoles polimericos da como resultado vidas medias en sangre significativamente mejoradas. Los fosfolipidos sinteticos modificados mediante la union de grupos carboxilicos de polialquilen glicoles (por ejemplo, PEG) son descritos por Sears (Patentes de los Estados Unidos Nos. 4.426.330 y 4.534.899). Klibanov y colaboradores (FEBS Lett., 1990, 268, 235) describieron experimentos que demuestran que los liposomas que comprenden fosfatidil etanolamina (PE) que forman derivados con PEG o con estearato de PEG, tienen incrementos significativos en las vidas medias en la circulacion sanguinea. Blume y colaboradores (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) extendieron estas observaciones hasta otros fosfolipidos derivados de PEG, por ejemplo DSPE-PEG, formado a partir de Ia combinacion de diestearoilfosfatidiIetanolamina (DSPE) y PEG. Los liposomas que tienen fracciones de PEG covalentemente enlazadas sobre su superficie externa se describen en la Patente Europea No. EP 0 445 131 B1 y en Ia Publicacion Internacional No. WO 90/04384 de Fisher. Las composiciones de liposomas que contienen del 1 al 20% en moles de PE que forma derivado con PEG, y los metodos para su utilizacion, son descritas por Woodle y colaboradores (Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.013.556 y 5.356.633) y Martin y colaboradores (Patente de los Estados Unidos No. 5.213.801 y Patente Europea No. EP 0 496 813 B1). Los liposomas que comprenden una cantidad de otros conjugados de lipido-polimero se dan a conocer en la Publicacion Internacional No. WO 91/05545 y en la Patente delos Estados Unidos No. 5.225.212 (ambas de Martin y colaboradores), y en la Publicacion internacional No. WO 94/20073 (ZaIipsky y colaboradores). Los liposomas que contienen lipidos de ceramida modificados por PEG se describen en la Publicacion Internacional No. WO 96/10391 (Choi y colaboradores). La Patente de los Estados Unidos No. 5.540.935 (Miyazaki y colaboradores) y la Patente de los Estados Unidos No. 5.556.948 (Tagawa y colaboradores) describen liposomas que contienen PEG, que se pueden formar derivados adicionalmente con fracciones funcionales sobre sus superficies.
En la tecnica se conoce un numero limitado de liposomas que comprenden acidos nucleicos. La Publicacion Internacional No. WO 96/40062 a Thierry y colaboradores, da a conocer metodos para encapsular acidos nucleicos de alto peso molecular en liposomas. La Patente de los Estados Unidos No. 5.264.221 de Tagawa y colaboradores, da a conocer liposomas enlazados con proteinas, y asevera que el contenido de estos liposomas puede incluir ARN bc. La Patente de los Estados Unidos No. 5.665.710 de Rahman y colaboradores, describe ciertos metodos para encapsular oligodesoxinucleotidos en liposomas. La Publicacion internacional No. WO 97/04787 de Love y colaboradores, da a conocer liposomas que comprenden ARN bc dirigidos al gen raf.
Los transfersomas son incluso otro tipo de liposomas, y son agregados de lipido altamente deformables que son candidatos atractivos para los vehiculos de suministro de farmacos. Los transfersomas se pueden describir como gotitas de lipido que son tan altamente deformables que son facilmente capaces de penetrar a traves de los poros que sean mas pequenos que la gotita. Los transfersomas se pueden adaptar al medio ambiente en el que se utilicen, por ejemplo, son auto-optimizantes (adaptables a la forma de los poros de Ia piel), auto-reparadores, con frecuencia alcanzan sus objetivos sin fragmentacion, y con frecuencia se auto-cargan. Para elaborar los transfersomas, es posible agregar activadores del borde de la superficie, usualmente tensoactivos, a una composicion Iiposomal estandar. Los transfersomas se han utilizado para suministrar albumina de suero a la piel. El suministro de albumina de suero mediado por transfersomas ha demostrado ser tan efectivo como la inyeccion subcutanea de una solucion que contenga albumina de suero.
Los tensoactivos encuentran una amplia aplicacion en formulaciones tales como emulsiones (incluyendo microemulsiones) y Iiposomas. La manera mas comun de clasificar y ordenar las propiedades de muchos tipos diferentes de tensoactivos, tanto naturales como sinteticos, es mediante el uso del equilibrio hidrofilico/lipofilico (HLB). La naturaleza del grupo hidrofilico (tambien conocido como la quot;cabezaquot;) proporciona el medio mas util para categorizar los diferentes tensoactivos utilizados en las formulaciones (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms Marcel Dekker, lnc., Nueva York, N. Y., 1988, pagina 285).
Si la molecula de tensoactivo no esta ionizada, se clasifica como un tensoactivo no ionico. Los tensoactivos no ionicos encuentran una amplia aplicacion en los productos farmaceuticos y cosmeticos, y son utiles sobre un amplio rango de valores de pH. En general, sus valores de HLB estan en el intervalo desde 2 hasta aproximadamente 18, dependiendo de su estructura. Los tensoactivos no ionicos incluyen esteres no ionicos, tales como esteres de etilenglicol, esteres de propilenglicol, esteres de glicerilo, esteres de poliglicerilo, esteres de sorbitan, esteres de sacarosa, y esteres etoxilados. Las alcanolamidas y los eteres no ionicos, tales como etoxilatos de alcohol graso, alcoholes propoxilados, y copolimeros en bloque etoxilados/propoxilados, tambien se incluyen en esta clase. Los tensoactivos de polioxietileno son los miembros mas populares de la clase de tensoactivos no ionicos.
Si Ia molecula de tensoactivo lleva una carga negativa cuando se disuelve o se dispersa en agua, el tensoactivo se clasifica como anionico. Los tensoactivos anionicos incluyen carboxilatos, tales como jabones, Iactilatos de acilo, acil-amidas de aminoacido, esteres de acido sulfurico tales como sulfatos de alquilo y sulfatos de alquilo etoxilados, sulfonatos tales como sulfonatos de alquil-benceno, y cetionatos de acilo, tauratos de acilo y sulfosuccinatos, y fosfatos. Los miembros mas importantes de Ia clase de tensoactivos anionicos son los sulfatos de alquilo y los jabones.
Si la molecula de tensoactivo lleva una carga positiva cuando se disuelve o se dispersa en agua, el tensoactivo se clasifica como cationico. Los tensoactivos actionicos incluyen sales de amonio cuaternario y aminas etoxiladas. Las sales de amonio cuaternario son los miembros mas utilizados de esta clase.
Si la molecula de tensoactivo tiene la capacidad para portar ya sea una carga positiva o negativa, el tensoactivo se clasifica como anfoterico. Los tensoactivos anfotericos incluyen derivados de acido acrilico, alquil-amidas sustituidas, N-alquiI-betainas, y fosfatidos.
El uso de tensoactivos en productos farmacologicos, formulaciones, y en emulsiones, ha sido revisado (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., 1988, pagina 285).
Potenciadores de penetracion
En una forma de realizacion, la presente invencion emplea diferentes potenciadores de penetracion para efectuar el suministro eficiente de acidos nucleicos, en particular ARN bc, a la piel de animales. La mayoria de los farmacos estan presentes en solucion tanto en la forma ionizada como no ionizada. Sin embargo, usualmente solo los farmacos solubles en lipido o lipofilicos cruzan facilmente las membranas celulares. Se ha descubierto que inclusive los farmacos no lipofilicos pueden cruzar las membranas celulares, si la membrana que se va a cruzar se trata con un potenciador de penetracion. Ademas, para ayudar a la difusion de los farmacos no lipofilicos a traves de las membranas celulares, los potenciadores de la penetracion tambien mejoran la permeabilidad de los farmacos lipofilicos.
Los potenciadores de penetracion se pueden clasificar como pertenecientes a una de cinco amplias categorias, es decir, tensoactivos, acidos grasos, sales biliares, agentes quelantes, y no tensoactivos no quelantes (Lee y colaboradores, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pagina 92). Cada una de las clases anteriormente mencionadas de potenciadores de penetracion se describen a continuacion con mayor detalle.
Tensoactivos: En relacion con la presente invencion, los tensoactivos (o quot;agentes de actividad superficialquot;) son entidades quimicas que, cuando se disuelven en una solucion acuosa, reducen la tension superficial de la solucion,
o la tension interfacial entre la solucion acuosa y otro liquido, con el resultado de que se mejora la absorcion de los ARN bc a traves de la mucosa. Ademas, de las sales biliares y los acidos grasos, estos potenciadores de penetracion incluyen, por ejemplo, IauriI-sulfato de sodio, lauril-eter de poIioxietiIeno-9, y cetiI-eter de polioxietileno20 (Lee y colaboradores, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pagina 92); y emulsiones perfluoroquimicas, tales como FC-43 (Takahashi y colaboradores, J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
Acidos grasos: Diferentes acidos grasos y sus derivados que actuan como potenciadores de penetracion incluyen, por ejemplo, acido oleico, acido Iaurico, acido caprico (acido n-decanoico), acido miristico, acido palmitico, acido estearico, acido linoleico, acido linolenico, dicaprato, tricaprato, mono-oleina (1-mono-oleoiI-rac-glicerol), dilaurina, acido caprilico, acido araquidonico, 1-monocaprato de glicerol, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, aciIcarnitinas, aciIcolinas, esteres de alquilo de 1 a 10 atomos de carbono de las mismas (por ejemplo, metilo, isopropilo, y terbutilo), y mono y di-gliceridos de los mismos (es decir, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato,
linoleato, etc.) (Lee y colaboradores, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carryier Systems, 1991, pagina 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1 -33; E1 Hariri y colaboradores, J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651 - 654).
Sales biliares: El papel fisiologico de la bilis incluye facilitar la dispersion y absorcion de lipidos y vitaminas solubles en grasa (Brunton, Capitulo 38, en: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9na Edicion, Hardman y colaboradores, Editores, McGraw-Hill, Nueva York, 1996, paginas 934 -935). Diferentes sales biliares naturales, y sus derivados sinteticos, actuan como potenciadores de la penetracion. Por consiguiente, el termino quot;sales biliaresquot; incluye cualquiera de los componentes de la bilis, asi como cualquiera de sus derivados sinteticos. Las sales biliares incluyen, por ejemplo, acido colico (o su sal sodica farmaceuticamente aceptable, colato de sodio), acido deshidrocolico (deshidrocolato de sodio), acido desoxicolico (desoxicolato de sodio), acido glucolico (glucolato de sodio), acido glicolico (glicolato de sodio), acido glicodesoxicolico (glicodesoxicolato de sodio), acido taurocolico (taurocolato de sodio), acido taurodesoxicolico (taurodesoxicolato de sodio), acido quenodesoxicolico (quenodesoxicolato de sodio), acido ursodesoxicolico (UDCA), tauro-24,25-dihidro-fusidato de sodio (STDHF), glicodihidrofusidato de sodio, y laurileter de polioxietileno-9 (POE) (Lee y colaboradores, Critical Reviews ln Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pagina 92; Swinyard, Capitulo 39, en: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ava Edicion, Gennaro, editor, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, paginas 782 -783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1 -33; Yamamoto y colaboradores, J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita y colaboradores, J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579 - 583).
Agentes quelantes: Los agentes quelantes, pueden definirse como compuestos que remueven los iones metalicos de la solucion, mediante Ia formacion de complejos con los mismos, con el resultado de que se mejora la absorcion de los ARN bc a traves de la mucosa. Con respecto a su uso como potenciadores de penetracion, los agentes quelantes tienen la ventaja adicional de servir tambien como inhibidores de ADNasa, debido a que la mayoria de las nucleasas de ADN caracterizadas requieren de un ion metalico divalente para la catalisis, y son por lo tanto, inhibidas por los agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogn, 1993, 618, 315 -339). Los agentes quelantes incluyen, pero no se limitan a, etilendiaminatetraacetato disodico (EDTA), acido citrico, salicilatos (por ejemplo, salicilato de sodio, 5-metoxisalicilato, y homovanilato), derivados de N-acilo de colageno, Iaureth-9, y derivados de N-aminoacilo de las beta-dicetonas (enaminas) (Lee y colaboradores, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pagina 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1 - 33; Buur y colaboradores, J. Control Rel., 1990, 14, 43 -51).
No tensoactivos no quelantes: Como se utiliza en la presente invencion, los compuestos potenciadores de penetracion no tensoactivos no quelantes se pueden definir como los compuestos que demuestran una actividad insignificante como agentes quelantes o como tensoactivos, pero que no obstante, mejoran la absorcion de los ARN bc a traves de la mucosa alimentaria (Muranishi, Critical Reviews ln Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1 33). Esta clase de potenciadores de la penetracion incluyen, por ejemplo, ureas ciclicas insaturadas, derivados de 1alquiI- y 1-aIqueniIazacicloalcanona (Lee y colaboradores, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pagina 92); y agentes anti-inflamatorios no esteroideos, tales como diclofenaco sodico, indometacina y fenilbutazona (Yamashita y colaboradores, J. Pharm. PharmacoI., 1987, 39, 621 - 626).
Los agentes que mejoran la absorcion de los ARN bc al nivel celular, tambien se pueden agregar a las composiciones farmaceuticas y a otras composiciones. Por ejemplo, tambien se sabe que los lipidos cationicos, tales como lipofectina (Junichi y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 5.705.188), los derivados de glicerol cationicos, y las moleculas policationicas, tales como polilisina (Lollo y colaboradores, Solicitud PCT No. WO 97/30731), y otros peptidos, mejoran la absorcion celular de los ARN bc.
Se pueden utilizar otros agentes para mejorar la penetracion de los acidos nucleicos administrados, incluyendo glicoles, tales como etilenglicol y propilenglicol, pirroles, tales como 2-pirrol, azonas, y terpenos tales como limoneno y mentona.
Portadores
Ciertas composiciones tambien incorporan compuestos portadores en la formulacion. Como se utiliza en la presente invencion, quot;compuesto portadorquot; o quot;portadorquot; puede referirse a un acido nucleico o analogo del mismo, que sea inerte (es decir, no posee actividad biologica por si mismo), pero que es reconocido como un acido nucleico por los procesos in vivo que reducen la biodisponibilidad de un acido nucleico que tenga actividad biologica, por ejemplo, mediante la degradacion del acido nucleico biologicamente activo, o promoviendo su remocion de la circulacion. La co-administracion de un acido nucleico y un compuesto portador, tipicamente con un exceso de la ultima sustancia, puede dar como resultado una reduccion sustancial de la cantidad de acido nucleico recuperado en el higado, rinon, u otros depositos extracirculatorios, presumiblemente debido a la competencia entre el compuesto portador y el acido nucleico por un receptor comun. Por ejemplo, la recuperacion de un ARN bc parcialmente de fosforotioato en el tejido hepatico, se puede reducir cuando se co-administra con acido poli-inosinico, sulfato de dextrano, acido policitidico, o acido 4-acetamido-4'-isotiociano-estilben-2,2'-disulfonico (Miyao y colaboradores, Antisense Res. Dev.,
1995, 5, 115 - 121; Takakura y colaboradores, Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177 - 183.
Excipientes
En contraste con un compuesto portador, un quot;portador farmaceuticoquot; o quot;excipientequot; es un solvente, agente de suspension, o cualquier otro vehiculo farmacologicamente inerte, farmaceuticamente aceptable, para suministrar uno
o mas acidos nucleicos a un animal. El excipiente puede ser liquido o solido, y se selecciona, teniendo en mente la planeacion de la administracion, para proporcionar el volumen, consistencia, etc., deseados, cuando se combine con un acido nucleico y los otros componentes de una composicion farmaceutica dada. Los portadores farmaceuticos tipicos incluyen, pero no se limitan a, agentes aglutinantes (por ejemplo, almidon de maiz previamente gelatinizado, poIiviniIpirrolidona o hidroxipropilmetiIceIuIosa, etc.); rellenos (por ejemplo, lactosa y otros azucares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etiI-celulosa, poliacrilatos, o fosfato acido de calcio, etc.); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, silice, dioxido de silicio coloidal, acido estearico, estearatos metalicos, aceites vegetales hidrogenados, almidon de maiz, polietilenglicoles, benzoato de sodio, acetato de sodio, etc.); desintegrantes (por ejemplo, almidon, glicolato sodico de almidon, etc.); y agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio, etc.).
Los excipientes organicos o inorganicos farmaceuticamente aceptables adecuados para administracion no parenteral, que no reaccionan perjudicialmente con los acidos nucleicos, tambien se pueden utilizar para formular las composiciones. Los portadores farmaceuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones salinas, alcoholes, polietilengicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, acido silicico, parafina viscosa, hidroxi-metiI-celulosa, polivinil-pirrolidona y similares.
Las formulaciones para administracion topica de los acidos nucleicos pueden incluir soluciones acuosas esteriles y no esteriles, soluciones no acuosas en solventes comunes tales como alcoholes, o soluciones de los acidos nucleicos en bases oleosas liquidas o solidas. Las soluciones tambien pueden contener reguladores del pH, diluyentes, y otros aditivos adecuados. Se pueden utilizar excipientes organicos o inorganicos farmaceuticamente aceptables adecuados para administracion no parenteral, que no reaccionen perjudicialmente con los acidos nucleicos.
Los excipientes farmaceuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones salinas, alcohol, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, acido silicico, parafina viscosa, hidroximetiIcelulosa, poIiviniIpirrolidona, y similares.
Composiciones farmaceuticas para el suministro al tracto respiratorio
Otro aspecto proporciona el suministro de agentes de ARNi al tracto respiratorio, en particular para el tratamiento de fibrosis quistica. El tracto respiratorio incluye las vias respiratorias superiores, incluyendo la orofaringe y la laringe, seguidas por las vias respiratorias inferiores, las cuales incluyen la traquea, seguida por las bifurcaciones en los bronquios y los bronquiolos. Las vias respiratorias superiores e inferiores se denominan como las vias respiratorias conductoras. Los bronquiolos terminales se dividen entonces en los bronquiolos respiratorios, que luego conducen hasta la zona respiratoria final, los alveolos, o el pulmon profundo. El epitelio de las vias respiratorias conductoras es el objetivo primario de los aerosoles terapeuticos inhalados, para el suministro de los agentes de ARNi, tales como los agentes de alfa-ENaC por medio de ARNi.
Las composiciones de suministro pulmonar se pueden suministrar mediante inhalacion por el paciente, de una dispersion, de tal manera que la composicion, preferiblemente el agente de ARNi, dentro de la dispersion, pueda alcanzar al pulmon en donde puede, por ejemplo, ser facilmente absorbida a traves de la region alveolar directamente dentro de la circulacion sanguinea. El suministro pulmonar puede ser efectivo tanto por suministro sistemico como por suministro localizado con el fin de tratarenfermedades de los pulmones.
El suministro pulmonar se puede lograr mediante diferentes enfoques, incluyendo el uso de formulaciones nebulizadas, en aerosol, micelares, y con base en polvo seco; la administracion mediante inhalacion puede ser oral y/o nasal. El suministro se puede lograr con nebulizadores liquidos, inhaladores basados en aerosol, y dispositivos de dispersion de polvo seco. Se prefieren los dispositivos dosificadores. Uno de los beneficios de utilizar un atomizador o inhalador, es que se minimiza el potencial de contaminacion, debido a que los dispositivos estan autocontenidos. Los dispositivos de dispersion de polvo seco, por ejemplo, suministran los farmacos que pueden ser facilmente formulados como polvos secos. Una composicion de ARNi se puede almacenar en forma estable como polvos liofilizados o secados por pulverizacion por si mismos, o en combinacion con portadores adecuados en polvo. El suministro de una composicion para inhalacion puede ser mediada por un elemento de tiempo de dosificacion, el cual puede incluir un cronometro, un contador de dosis, un dispositivo medidor de tiempo, o un indicador de tiempo que, cuando se incorpora en el dispositivo, hace posible el rastreo de la dosis, el monitoreo del cumplimiento y/o el disparo de la dosis a un paciente durante la administracion del medicamento en aerosol.
Los ejemplos de los dispositivos farmaceuticos para suministro en aerosol incluyen inhaladores dosificadores (MDl), inhaladores de polvo seco (DPI), y nebulizadores de chorro de aire. Los ejemplos de sistemas de suministro mediante inhalacion que se pueden adaptar facilmente para el suministro de los agentes de ARN objetivo se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.756.353 y 5.858.784; y en las Solicitudes del PCT No. WO 98/31346; WO 98/10796; WO 00/27359; WO 01/54664; WO 02/060412. Otras formulaciones en aerosol que se pueden utilizar para suministrar los agentes de ARNi se describen en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6.294.153; 6.344.194; 6.071.497, y en las Solicitudes PCT Nos. WO 02/066078; WO 02/053190; WO 01/60420; WO 00/66206. Ademas, los metodos para suministrar los agentes de ARN se pueden adaptar a partir de aquellos empleados en el suministro de otros oligonucleotidos (por ejemplo, un oligonucleotido antisentido) mediante inhalacion, tal como se describe en Templin y colaboradores, Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2000, 10: 359 -68; Sandrasagra y colaboradores, Expert Opin Biol Ther, 2001, 1: 979 - 83; Sandrasagra y colaboradores, Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2002, 12: 177 - 81.
EI suministro de los agentes tambien puede involucrar Ia administracion de los denominados quot;pro-farmacosquot;, es decir, formulaciones o modificaciones quimicas de una sustancia terapeutica que requiera de alguna forma de procesamiento o transporte mediante los sistemas innatos del organismo sujeto para liberar la sustancia terapeutica, preferiblemente en el sitio en donde se desee su accion; esta ultima forma de realizacion se puede utilizar junto con el suministro al tracto respiratorio, pero tambien junto con otras formas de realizacion de la presente divulgacion. Por ejemplo, los pulmones humanos pueden remover o degradar rapidamente los aerosoles depositados hidroliticamente disociables durante periodos en el intervalo desde minutos hasta horas. En las vias respiratorias superiores, el epitelio ciliado contribuye al quot;excalador mucociliarquot;, mediante el cual las particulas son barridas de las vias respiratorias hacia la boca. Pavia, D., quot;Lung Mucociliary Clearancequot;, en Aerosols and the Lung: Clinical and Experimental Aspects, Clarke, S. W. y Pavia, ll, Editores, Butterworths, Londres, 1984. En los pulmones profundos, los macrofagos alveolares son capaces de fagocitosar las particulas tan pronto se depositan. Warheit y colaboradores, Microscopy Res. Tech., 26: 412 - 422 (1993); y Brain, J. D., quot;Physiology and Pathophysiology of Pulmonary Macrophagesquot;, en The Reticuloendothelial System, S. M. Reichard y J. Filkins, Editores, Plenum, Nueva York, paginas 315 - 327,1985.
En formas de realizacion preferidas, en particular en donde se desee una dosificacion sistemica con el agente de ARNi, los agentes de ARNii en aerosol se formulan como microparticulas. Las microparticulas que tienen un diametro de entre 0,5 y 10 micras, pueden penetrar los pulmones, pasando a traves de la mayoria de las barreras naturales. Se requiere un diametro de menos de 10 micras para evitar la garganta; se requiere un diametro de 0,5 micras o mas para evitar ser exhaladas.
Otros componentes
Las composiciones pueden contener adicionalmente otros componentes auxiliares convencionalmente encontrados en las composiciones farmaceuticas, en sus niveles de uso establecidos en la tecnica. Por consiguiente, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales farmaceuticamente activos compatibles adicionales, tales como, por ejemplo, antipruriticos, astringentes, anestesicos locales, o agentes anti-inflamatorios, o pueden contener materiales adicionales utiles en la formulacion fisica de diferentes formas de dosificacion de las composiciones de la presente invencion, tales como colorantes, agentes saborizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espesantes, y estabilizantes. Sin embargo, estos materiales, cuando se anaden no deben interferir indebidamente con las actividades biologicas de los componentes de las composiciones. Las formulaciones se pueden esterilizar, y si se desea se pueden mezclar con agentes auxiliares, por ejemplo lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influenciar la presion osmotica, reguladores del pH, colorantes, saborizantes y/o sustancias aromaticas y similares, que no interactuen de una manera perjudicial con el(los) acido(s) nucleico(s) de la formulacion.
Las suspensiones acuosas pueden contener sustancias que aumenten Ia viscosidad de la suspension, incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa sodica, sorbitol y/o dextrano. La suspension tambien puede contener estabilizantes.
Ciertas formas de realizacion proporcionan combinaciones farmaceuticas y composiciones que contienen: (a) uno o mas agentes de ARN bc, y (b) uno o mas agentes terapeuticos diferentes que funcionen mediante un mecanismo de interferencia que no sea de ARN.
De conformidad con lo anterior, la invencion incluye una combinacion de un ARNi con una sustancia farmacologica anti-inflamatoria, broncodilatadora, anti-histaminica, anti-tusiva, antibiotica, o de ADNasa, estando dicho bloqueador del canal de sodio epitelial y dicha sustancia farmacologica en la misma o en diferente composicion farmaceutica.
Los antibioticos adecuados incluyen antibioticos de macrolidos, por ejemplo tobramicina (TOBI™).
Las sustancias farmacologicas adecuadas de ADNasa incluyen dornasa alfa (PulmozymeTM), una solucion altamente
purificada de desoxiribonucleasa I humana recombinante (rhADNasa), que disocia selectivamente el ADN. La dornasa alfa se utiliza para tratar fibrosis quistica.
Otras combinaciones utiles de bloqueadores del canal de sodio epitelial con farmacos anti-inflamatorios, son aquellas con antagonistas de los receptores de quimioquina, por ejemplo, CCR-1, CCR-2, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9, y CCR-10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, particularmente antagonistas de CCR-5, tales como antagonistas de Schering-Plough SC-351125, SCH-55700 y SCH-D; los antagonistas Takeda, tales como cloruro de N-[[4-[[[6,7-dihidro-2-(4-metil-feniI)-5H-benzo-ciclohepten-8-il]carbonil]amino]feniI]metiI]tetrahidro-N,N-dimetil-2H-piran-4-aminio (TAK-770); y antagonistas de CCR-5 descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 6.166.037 (particularmente en las reivindicaciones 18 y 19), en la Publicacion internacional No. WO 00/66558 (particularmente en la reivindicacion 8), en la Publicacion internacional No. WO 00/66559 (en particular en la reivindicacion 9), en la Publicacion internacional No. WO 04/018425, y en la Publicacion internacional No. WO 04/026873.
Los farmacos anti-inflamatorios adecuados incluyen esteroides, en particular glucocorticosteroides, tales como budesonida, dipropionato de beclametasona, propionato de fluticasona, ciclesonida, o furoato de mometasona, o los esteroides descritos en Ias Publicaciones Internacionales Nos. WO 02/88167, WO 02/12266, WO 02/100879, WO 02/00679 (especialmente aquellos de los Ejemplos 3, 11, 14, 17, 19, 26, 34, 37, 39, 51, 60, 67, 72, 73, 90, 99 y 101), WO 03/35668, WO 03/48181, WO 03/62259, WO 03/64445, WO 03/72592, WO 04/39827 y WO 04/66920; agonistas del receptor glucocorticoide no esteroideos, tales como aquellos descritos en el documento DE 10261874, en las Publicaciones internacionales Nos. WO 00/00531, WO 02/10143, WO 03/82280, WO 03/82787, WO 03/86294, WO 03/104195, WO 03/101932, WO 04/05229, WO 04/18429, WO 04/19935 y WO 04/26248; antagonistas de LTD4, tales como montelukast y zafirlukast; inhibidores de PDE4, tales como cilomilast (Ariflo® GIaxoSmithKIine), Roflumilast (Byk Gulden), V-11294A (Napp), BAY19-8004 (Bayer), SCH-351591 (Schering-Plough), Arofilina (Almirall Prodesfarma), PD189659/PD168787 (Parke-Davis), AWD-12-281 (Asta Medica), CDC-801 (Celgene), SeICID(TM) CC-10004 (Celgene), VM5541UM565 (VernaIis), T-440 (Tanabe), KW-4490 (Kyowa Hakko Kogyo), y aquellos que se dan a conocer en las Publicaciones Internacionales Nos. WO 92/19594, WO 93/19749, WO 93/19750, WO 93/19751, WO 98/18796, WO 99/16766, WO 01/13953, WO 03/104204, WO 03/104205, WO 03/39544, WO 04/000814, WO 04/000839, WO 04/005258, WO 04/018450, WO 04/018451, WO 04/018457, WO 04/018465, WO 04/018431, WO 04/018449, WO 04/018450, WO 04/018451, WO 04/018457, WO 04/018465, WO 04/019944, WO 04/019945, WO 04/045607 y WO 04/037805; antagonistas del receptor de adenosina A2B, tales como los descritos en la Publicacion internacional WO 02/42298; y agonistas del adrenoceptor beta-2, tales como albuterol (salbutamol), metaproterenol, terbutalina, salmeterol, fenoterol, procaterol, y especialmente, formoterol, carmoterol, y las sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, y los compuestos (en forma libre o de sal o de solvato) de Formula (l) de la Publicacion internacional WO 00/75114, preferiblemente los compuestos de los ejemplos de la misma, en especial indacaterol y las sales farmaceuticamente aceptables del mismo, asi como los compuestos (en forma libre o de sal o de solvato) de la Formula (l) de la Publicacion internacional WO 04/16601, y tambien los compuestos de los documentos EP 1440966, JP 05025045, WO 93/18007, WO 99/64035, USP 200210055651, WO 01/42193, WO 01/83462, WO 02/66422, WO 02/70490, WO 02/76933, WO 03/24439, WO 03/42160, WO 03/42164, WO 03/72539, WO 03/91204, WO 03/99764, WO 04/16578, WO 04/22547, WO 04/32921, WO 04/33412, WO 04/37768, WO 04/37773, WO 04/37807, WO 04/39762, WO 04/39766, WO 04/45618, WO 04/46083, WO 04/80964, WO 04/108765 yWO 04/108676.
Los farmacos broncodilatadores adecuados incluyen agentes anticolinergicos o antimuscarinicos, en particular bromuro de ipratropio, bromuro de oxitropio, sales de tiotropio y CHF 4226 (Chiesi), y glicopirrolato, pero tambien los que se describen en os documentos EP 424021, USP 3.714.357, USP 5.171.744, WO 01/04118, WO 02/00652, WO 02/51841, WO 02/53564, WO 03/00840, WO 03/33495, WO 03/53966, WO 03/87094, WO 04/018422 y WO 04/05285.
Los farmacos anti-inflamatorios y broncodilatadores duales adecuados incluyen al antagonistas del adrenoceptor beta-2/antagonistas muscarinicos, tales como aquellos divulgados en los documentos USP 2004/0167167, WO 04/74246 y WO 04/74812.
Las sustancias armacologicas anti-histaminicas adecuadas incluyen clorhidrato de cetirizina, acetaminofen, fumarato de clemastina, prometazina, loratidina, desloratidina, difenhidramina, y clorhidrato de fexofenadina, activastina, astemizol, azelastina, evastina, epinastina, mizolastina y tefenadina, asi como los que se dan a conocer en los documentos JP 2004107299, WO 03/099807 yWO 04/026841.
Otras combinaciones utiles de agentes con farmacos anti-inflamatorios son aquellas con antagonistas de receptores de quimiocina, por ejemplo, CCR-1, CCR-2, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9 y CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, particularmente los antagonistas de CCR-5 tales como los antagonistas Schering-Plough SC-351125, SCH-55700 y SCH-D; los antagonistas Takeda, tales como cloruro de N-[[4-[[[6,7dihidro-2-(4-metil-feniI)-5H-benzo-ciclohepten-B-iH-carbonill-amino]feniI]metill-tetrahidro-N,N-dimetiI-2H-piran-4 aminio (TAK-770), y los antagonistas de CCR-S descritos en la Patente de los Estados Unidos No. USP 6.166.037
(en particular en las reivindicaciones 18 y 19), en la Publicacion internacional WO 00/66558 (en particular en la reivindicacion 8), en Ia Publicacion internacional WO 00/66559 (en particular en la reivindicacion 9), y en las Publicaciones Internacionales WO 04/018425 y WO 04/026873.
Otros agentes terapeuticos adicionales utiles tambien se pueden seleccionar a partir del grupo que consiste en las moleculas enlazadoras de citoquina, particularmente anticuerpos de otras citoquinas, en particular una combinacion con un anticuerpo anti-IL4, tal como se describe en el documento PCT Numero PCT/EP2005/00836, un anticuerpo anti-lgE, tal como XoIair®, un anticuerpo anti-lL31, un anticuerpo anti-IL31R, un anticuerpo anti-TSLP, un anticuerpo receptor anti-TSLP, un anticuerpo anti-endoglina, un anticuerpo anti-IL1b, o un anticuerpo anti-IL13, tal como se describen en la Publicacion internacional WO 05/007699.
Se pueden utilizar dos o mas compuestos combinados juntos en una sola formulacion, en forma separada, en forma concomitante o en forma secuencial.
La toxicidad y la eficacia terapeutica de estos compuestos se pueden determinar mediante procedimientos farmaceuticos estandar en cultivos celulares o en animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50% de la poblacion) y Ia ED50 (la dosis terapeuticamente efectiva en el 50% de la poblacion). La proporcion de dosis entre los efectos toxicos y terapeuticos es el indice terapeutico, y se puede expresar como Ia relacion LD50/ED50. Se prefieren los compuestos que exhiban altos indices terapeuticos.
Los datos obtenidos a partir de los ensayos de cultivo celular y de los estudios con animales, se pueden utilizar en la formulacion de un intervalo de dosificacion para uso en humanos. La dosificacion de las composiciones de la invencion esta generalmente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen Ia ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo, dependiendo de la forma de dosificacion empleada y de la via de administracion utilizada. Para cualquier compuesto utilizado en el metodo de la invencion, la dosis terapeuticamente efectiva se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Una dosis se puede formular en modelos animales para lograr un intervalo de concentracion en plasma circulante del compuesto, o, cuando sea apropiado, del producto de polipeptido de una secuencia objetivo (por ejemplo, para alcanzar una concentracion reducida del polipeptido) que incluya la lC50 (es decir, Ia concentracion del compuesto de prueba que logre una inhibicion media-maxima de los sintomas), como se determina en cultivo celular. Esta informacion se puede utilizar para determinar mas precisamente las dosis utiles en seres humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatografia liquida de alto rendimiento.
Ademas a su administracion individualmente o como una pluralidad, como se discutio anteriormente, los ARN bc se pueden administrar en combinacion con otros agentes conocidos efectivos en el tratamiento de trastornos relacionados con ENaC. En cualquier caso, el medico que administre puede ajustar la cantidad y el tiempo de administracion del ARN bc con base en los resultados observados utilizando medidas de eficacia estandar conocidas en la tecnica o descritas en la presente invencion.
Metodos de tratamiento y vias de suministro
Una composicion que incluya un agente de ARNi, por ejemplo un agente de ARNi que se dirija al alfa-ENaC, se puede suministrar a un sujeto mediante una variedad de vias para alcanzar el suministro local en el sitio de accion, o para el suministro sistemico al sujeto. Los ejemplos de vias incluyen la administracion local directa en el sitio de tratamiento, tal como en los pulmones o en el pasaje nasal, asi como el suministro intravenoso, nasal, oral y ocular. Los medios preferidos para administrar los agentes de ARNi son a traves de la administracion directa a los pulmones y al pasaje nasal como una solucion liquida, en aerosol o nebulizada.
Las formulaciones para inhalacion o para administracion parenteral son bien conocidas enel arte. Esta formulacion puede incluir soluciones acuosas esteriles, las cuales tambien pueden contener reguladores del pH, diluyentes y otros aditivos adecuados. Para uso intravenoso, la concentracion total de los solutos debe controlarse para hacer que la preparacion sea isotonica.
Los compuestos activos dados a conocer en la presente invencion, preferiblemente se administran a el(los) pulmon(es) o al pasaje nasal de un sujeto por cualquier medio apropiado. Los compuestos activos se pueden administrar mediante la administracion de una suspension en aerosol de particulas respirables que contienen el compuesto activo o los compuestos activos, los cuales son inhalados por el sujeto. El compuesto activo puede formar un aerosol en una variedad de formas, tales como, pero sin limitarse a, inhalantes de polvo seco, inhaladores con dosificador o suspensiones liquido/liquido. Las particulas respirables pueden ser liquidas o solidas. Las particulas opcionalmente pueden contener otros ingredientes terapeuticos, tales como amilorida, benzamil o fenamil, con el compuesto seleccionado incluido, en una cantidad efectiva para inhibir la reabsorcion de agua desde las secreciones mucosas de las vias respiratorias, como se describe en la Patente de los Estados Unidos No.
4.501.729.
La composicion farmaceutica en particulas opcionalmente se puede combinar con un portador para ayudar a la dispersion o al transporte. Se puede mezclar un portador adecuado, tal como un azucar (es decir, lactosa, sacarosa, trehalosa, manitol) con el compuesto o los compuestos activos, en cualquier proporcion adecuada (por ejemplo, una proporcion en peso de 1 a 1).
Las particulas abarcadas por el compuesto activo deben incluir particulas de un tamano respirable, es decir, particulas de un tamano suficientemente pequeno para pasar a traves de la boca o la nariz y la laringe despues de su inhalacion y en los bronquios y los alveolos de los pulmones. En general, las particulas en el intervalo de tamanos de aproximadamente 1 a 10 micras (mas particularmente, de un tamano menor de aproximadamente 5 micras) son respirables. Las particulas de un tamano no respirable que se incluyan en el aerosol, tienden a depositarse en la garganta y a ser tragadas, y la cantidad de particulas no respirables en el aerosol de preferencia se minimiza. Para la administracion nasal, se prefiere un tamano de particulas en el intervalo de 10 a 500 micras, para asegurar la retencion en la cavidad nasal.
Las composiciones farmaceuticas liquidas del compuesto activo para producir un aerosol se pueden preparar mediante la combinacion del compuesto activo con un vehiculo adecuado, tal como agua esteril libre de pirogenos. Las soluciones salinas hipertonicas utilizadas son preferiblemente soluciones esteriles libres de pirogenos, que comprenden del uno a quince por ciento (en peso) de la sal fisiologicamente aceptable y mas preferiblemente de tres a siente por ciento en peso de la sal fisiologicamente aceptable.
Los aerosoles de particulas liquidas que comprendan al compuesto activo, se pueden producir por cualquier medio adecuado, tal como con un nebulizador a chorro a presion o un nebulizador ultrasonico. Vease, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 4.501.729. Los nebulizadores son dispositivos comercialmente disponibles que transforman las soluciones o suspensiones del ingrediente activo en una niebla de aerosol terapeutica, ya sea por medio de aceleracion de gas comprimido, tipicamente aire u oxigeno, a traves de un orificio venturi angosto, o por medio de agitacion ultrasonica.
Las formulaciones adecuadas para utilizarse en los nebulizadores consisten del ingrediente activo en un portador liquido, comprendiendo el ingrediente activo hasta el 40% p/p de la formulacion, pero preferiblemente menos del 20% p/p. El portador es tipicamente agua (y mas preferiblemente agua esteril libre de pirogenos) o una solucion alcoholica acuosa diluida, preferiblemente hecha isotonica, pero puede ser hipertonica con los fluidos corporales mediante la adicion, por ejemplo, de cloruro de sodio. Los aditivos opcionales incluyen conservantes si la formulacion no se hace esteril, por ejemplo, hidroxibenzoato de metilo, antioxidantes, agentes saborizantes, aceites volatiles, agentes reguladores del pH y tensoactivos.
De la misma manera, los aerosoles de particulas solidas que comprenden al compuesto activo, se pueden producir con cualquier generador de aerosol terapeutico de particulas solidas. Los generadores de aerosol para administrar compuestos terapeuticos solidos en particulas a un sujeto, producen particulas que son respirables y generan un volumen de aerosol que contiene una dosis medida previamente determinada de un producto terapeutico, en una proporcion adecuada para la administracion a seres humanos. Un tipo ilustrativo de un generador de aerosol de particulas solidas es un insuflador. Las formulaciones adecuadas para administracion mediante insuflacion incluyen polvos finamente triturados que pueden suministrarse por medio de un insuflador o que pueden llevarse hasta la cavidad nasal en forma de un aspirado. En el insuflador, el polvo (por ejemplo, una dosis medida del mismo efectiva para llevar a cabo los tratamientos descritos en la presente invencion) esta contenido en capsulas o cartuchos, tipicamente hechas de gelatina o de plastico, que se perforan o se abren in situ, y se suministra el polvo mediante el aire aspirado a traves del dispositivo despues de la inhalacion o por medio de una bomba operada manualmente. El polvo empleado en el insuflador consiste ya sea exclusivamente del ingrediente activo o bien en una mezcla en polvo que comprenda al ingrediente activo, un diluyente de polvo adecuado, tal como lactosa, y un tensoactivo opcional. El ingrediente activo tipicamente comprende de 0,1 a 100% p/p de la formulacion.
Un segundo tipo de generador de aerosol ilustrativo comprende un inhalador on dosificador. Los inhaladores con dosificador son dispensadores en aerosol presurizados, que contienen tipicamente una formulacion en suspension o en solucion del ingrediente activo en un propelente licuado. Durante su uso, estos dispositivos descargan la formulacion a traves de una valvula adaptada para suministrar un volumen medido, tipicamente de 10 a 200 microlitros, para producir un aerosol en particulas finas que contiene al ingrediente activo. Los propelentes adecuados incluyen ciertos compuestos de clorofIuorocarbono, por ejemplo dicIorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano y mezclas de los mismos. La formulacion puede contener adicionalmente uno o mas co-solventes, por ejemplo, etanol, tensoactivos, tales como acido oleico, o trioleato de sorbitan, agentes antioxidantes y saborizantes adecuados.
Se puede incorporar un agente de ARNi en composiciones farmaceuticas adecuadas para su administracion. Por ejemplo, las composiciones pueden incluir una o mas especies de un agente de ARNi, y un portador farmaceuticamente aceptable. Como se utiliza en la presente invencion, a expresion quot;portador farmaceuticamente aceptablequot; pretende incluir cualquiera y todos los solventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes
antibacterianos y contra hongos, agentes isotonicos y que retrasan la absorcion, y similares, compatibles con la administracion farmaceutica. El uso de estos medios y agentes para las sustancias farmaceuticamente activas es bien conocido en el arte. Excepto en la medida en que el medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones. Tambien se pueden incorporar en las composiciones, compuestos activos complementarios.
La administracion puede ser efectuada por el sujeto o por otra persona, por ejemplo, un cuidador. Un cuidador puede ser cualquier entidad involucrada en proporcionar cuidado al ser humano: por ejemplo, un hospital, hospicio, consultorio medico, clinica de pacientes externos; un trabajador del cuidado de la salud, tal como un doctor, enfermera, u otro practicante; o una esposa o tutor, tal como un padre. El medicamento se puede proporcionar en dosis medidas, o en un dosificador que suministre una dosis medida.
El termino quot;cantidad terapeuticamente efectivaquot; es la cantidad presente en Ia composicion que se necesita para proporcionar el nivel deseado de farmaco al sujeto que se este siendo tratando, para suministrar la respuesta fisiologica anticipada.
EI termino quot;cantidad fisiologicamente efectivaquot; es la cantidad suministrada a un sujeto para suministrar el efecto paliativo o curativo deseado.
El termino quot;portador farmaceuticamente aceptablequot; significa que el portador puede ser llevado hasta los pulmones sin efectos toxicologicos adversos significativos sobre los pulmones.
El termino quot;coadministracionquot; se refiere a la administracion a un sujeto de dos o mas agentes, y en particular dos o mas agentes de ARNi. Los agentes pueden estar contenidos en una sola composicion farmaceutica, o se pueden administrar al mismo tiempo, o los agentes pueden estar contenidos en una formulacion separada, y se pueden administrar en serie al sujeto. Siempre que los dos agentes se puedan detectar en el sujeto al mismo tiempo, se dice que los dos agentes son coadministrados.
Los tipos de excipientes farmaceuticos que son utiles como portadores incluyen estabilizantes, tales como albumina de suero humano (HSA), agentes de carga tales como carbohidratos, aminoacidos y polipeptidos; ajustadores o reguladores del pH; sales, tales como cloruro de sodio; y similares. Estos vehiculos pueden estar en una forma cristalina o amorfa, o pueden ser una mezcla de los dos.
Los agentes de carga que son particularmente valiosos incluyen carbohidratos compatibles, polipeptidos, aminoacidos, o combinaciones de los mismos. Los carbohidratos adecuados incluyen monosacaridos, tales como galactosa, D-manosa, sorbosa, y similares; disacaridos, tales como lactosa, trehalosa, y similares; ciclodextrinas, tales como 2-hidroxipropil-beta-ciclodextrina; y polisacaridos, tales como rafinosa, maltodextrinas, dextranos, y similares; alditoles, tales manitol, xilitol, y similares. Un grupo preferido de carbohidratos incluye lactosa, trehalosa, rafinosa, maltodextrinas, y manitol. Los polipeptidos adecuados incluyen aspartame. Los aminoacidos incluyen alanina y glicina, siendo preferida la glicina.
Los ajustadores o reguladores del pH adecuados incluyen sales organicas preparadas a partir de acidos y bases organicos, tales como citrato de sodio, ascorbato de sodio, y similares; se prefiere el citrato de sodio.
Dosificacion
Un agente de ARNi se puede administrar en una dosis unitaria aproximadamente menor a 75 mg por kg de peso corporal, o aproximadamente menor a 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, o 0.0005 mg por kg de peso corporal, y menor de 200 nmoles de agente de ARNi (por ejemplo, aproximadamente 4,4 x 1016 copias) por kg de peso corporal, o menor de 1.500, 750, 300, 150, 75, 15, 7.5, 1.5, 0.75, 0.15, 0.075, 0.015, 0.0075, 0.0015, 0.00075, 0.00015 nmoles de agente de ARNi por kg de peso corporal. La dosis unitaria, por ejemplo, se puede administrar mediante inyeccion (por ejemplo, intravenosa o intramuscular, intratecal, o directamente en un organo), una dosis inhalada, o una aplicacion topica.
La dosificacion puede ser una cantidad efectiva para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno. Se puede suministrar en forma profilactica, o como la parte principal una parte de un protocolo de tratamiento.
En una forma de realizacion, Ia dosis unitaria se administra con menos frecuencia que una vez al dia, por ejemplo menos de cada 2, 4, 8, o 30 dias. En otra forma de realizacion, la dosis unitaria no se administra con una frecuencia (por ejemplo, no tiene una frecuencia regular). Por ejemplo, la dosis unitaria se puede administrar una sola vez. Debido a que el silenciamiento mediado por el agente de ARNi puede persistir durante varios dias despues de la administracion de la composicion del agente de ARNi, en muchos casos, es posible administrar la composicion con una frecuencia de menos de una vez al dia, o para algunas instancias, solamente una vez para todo el regimen
terapeutico.
En una forma de realizacion, se administra a un sujeto una dosis inicial, y una o mas dosis de mantenimiento de un agente de ARNi, por ejemplo un agente de ARNi bicatenario, o un agente de ARNi corto (por ejemplo, un precursor, por ejemplo un agente de ARNi mas grande que se pueda procesar hasta un agente de ARNi corto, o un ADN que codifique un agente de ARNi, por ejemplo un agente de ARNi bicatenario, o un agente de ARNi corto, o un precursor de los mismos). La dosis o las dosis de mantenimiento generalmente son mas bajas que la dosis inicial, por ejemplo menos de la mitad de la dosis inicial. Un regimen de mantenimiento puede incluir el tratamiento del sujeto con una dosis o unas dosis en el intervalo de 0,01 a 75 mg/kg de peso corporal al dia, por ejemplo de 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, o 0.0005 mg por kg de peso corporal al dia. Las dosis de mantenimiento preferiblemente se administran no mas de una vez cada 5, 10, o 30 dias. Ademas, el regimen de tratamiento puede durar un periodo de tiempo que variara dependiendo de la naturaleza de la enfermedad particular, de su severidad, y de la condicion general del paciente. En las formas de realizacion preferidas, la dosificacion se puede suministrar no mas de una vez al dia, por ejemplo no mas de una vez cada 24, 36, 48, o mas horas, por ejemplo, no mas de una vez cada 5 u 8 dias. Despues del tratamiento, se puede monitorear al paciente para ver los cambios en su condicion, y el alivio de los sintomas del estado de enfermedad. La dosificacion del compuesto se puede aumentar en el caso en que el paciente no responda de una manera significativa a los niveles de dosificacion actuales, o se puede disminuir la dosis si se observa un alivio de los sintomas del estado de enfermedad, si se ha reducido el estado de enfermedad, o si se observan efectos secundarios indeseados.
La dosis efectiva se puede administrar en una sola dosis o en dos o mas dosis, como se desee o como se considere apropiado de acuerdo con las circunstancias especificas. Si se desea facilitar las infusiones repetidas o frecuentes, puede ser recomendable el implante de un dispositivo de suministro, por ejemplo una bomba, una canula intraluminal semipermanente (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intracisternal, o intracapsular), o un deposito.
Despues de un tratamiento exitoso, puede ser deseable hacer que el paciente se someta a la terapia de mantenimiento para prevenir la recurrencia del estado de enfermedad, en donde el compuesto de la invencion se administra en dosis de mantenimiento en el intervalo de 0,001 g a 100 g por kg de peso corporal (vease la Patente de los Estados Unidos No. 6.107.094).
La concentracion de la composicion del agente de ARNi es una cantidad suficiente para ser efectiva en el tratamiento o en la prevencion de un trastorno, o para regular una condicion fisiologica en seres humanos. La concentracion o la cantidad del agente de ARNi administrada dependera de los parametros administrados para el agente, y del metodo de administracion, por ejemplo nasal, bucal, o pulmonar. Por ejemplo, las formulaciones nasales tienden a requerir concentraciones mucho mas bajas de algunos ingredientes con el objeto de evitar irritacion o quemadura de los pasajes nasales. Algunas veces es recomendable diluir una formulacion oral de 10 a 100 veces, con el objeto de proporcionar una formulacion nasal adecuada.
Ciertos factores pueden tener influencia sobre la dosificacion requerida para tratar efectivamente a un sujeto, incluyendo, pero sin limitarse a, la severidad de la enfermedad o del trastorno, los tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Tambien se apreciara que la dosificacion efectiva de un agente de ARNi, tal como un ARNi corto utilizado para el tratamiento, puede aumentar o disminuir durante el transcurso de un tratamiento particular. Pueden resultar cambios en la dosificacion y llegar a ser evidentes a partir de los resultados de los ensayos de diagnostico. Por ejemplo, se puede monitorear el sujeto despues de la administracion de una composicion de agente de ARNi. Con base en la informacion del monitoreo, se puede administrar una cantidad adicional de la composicion del agente de ARNi.
La dosificacion depende de Ia severidad y respuesta de la enfermedad o condicion que se vaya a tratar, durando el curso de tratamiento desde varios dias hasta varios meses, o hasta que se efectue una cura o se logre una disminucion del estado de enfermedad. Se pueden calcular programas de dosificacion optima a partir de mediciones de la acumulacion de farmaco en el cuerpo del paciente. Las personas ordinariamente capacitadas en el arte pueden determinar facilmente las dosificaciones optimas, las metodologias de dosificacion, y los indices de repeticion. Las dosificaciones optimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de los compuestos individuales, y en general se pueden estimar con base en las EC50 que se encontro que eran efectivas en los modelos animales in vitro e in vivo, como se describio anteriormente.
Los agentes de ARNi como se describe en la presente invencion, pueden ser utiles en el tratamiento, y (cuando sea apropiado) en la prevencion de cualquiera de las siguientes enfermedades/trastornos:
Fibrosis quistica, sindrome de Liddles, insuficiencia renal, hipertension, desequilibrios de electrolitos.
En particular, en algunas formas de realizacion, los agentes de ARNi de la invencion se pueden utilizar para tratar y/o prevenir las manifestaciones clinicas adversas de estas enfermedades/trastornos.
La invencion se ilustra ademas mediante los siguientes ejemplos, los cuales no deben interpretarse como una limitacion adicional.
Ejemplos
Fuente de los reactivos
Cuando no se suministre la fuente de un reactivo especificamente, este reactivo se puede obtener con cualquier proveedor de reactivos para biologia molecular, con una calidad/pureza estandar para aplicaciones en biologia molecular.
Ejemplo�1: Seleccion de secuencias
Con el objeto de identificar los ARNi corto terapeuticos para disminuir la expresion de la subunidad alfa del canal de sodio epitelial ENaC (a-ENaC), se definieron grupos de cribado basandose en un analisis bioinformatico. Los operadores clave para el diseno de los grupos de cribado fueron la especificidad predicha de los ARNi corto contra el transcriptoma de las especies relevantes. Para la identificacion de los ARNi corto para alfa-ENaC, y un sistema de suministro eficiente, se utilizo un enfoque de tres puntos: se selecciono la rata como la especie de prueba para abordar la eficacia del silenciamiento in vivo despues del suministro intratraqueal; se selecciono el cobayo como el organismo modelo de la enfermedad para demostrar que la reduccion del ARNm para alfa-ENaC da como resultado un efecto funcional mensurable. La molecula de ARNi corto terapeutica tiene que dirigirse al alfa-ENaC humano, asi como a la secuencia de alfa-ENaC de al menos una especie toxicologicamente relevante; en este caso, el mono Rhesus.
El analisis inicial de la secuencia relevante del ARNm para alfa-ENaC, revelo que se pueden identificar pocas secuencias que satisfagan los requerimientos de especificidad, y al mismo tiempo el ARNm objetivo para alfa-ENaC en todas las especies relevantes. Por consiguiente, se decidio disenar grupos de cribado independientes para el ARNi corto terapeutico y para las moleculas sustitutas que se fueran a probar en el modelo de enfermedad relevante (Tablas 1A, 1B, 1C y 1D).
Todos los ARNi corto reconocen la secuencia del alfa-ENaC humano, debido a que se selecciono un sistema de cultivo celular humano para Ia determinacion de la actividad in vitro (H441, vease mas adelante). Por consiguiente, todos los ARNi corto se pueden utilizar para dirigirse al ARNm para alfa-ENaC humano en un escenario terapeutico.
Los grupos de cribado terapeuticos se disenaron para contener solamente secuencias de ARNi corto que sean completamente complementarias con las secuencias de alfa-ENaC humano y de mono Rhesus.
Diseno y seleccion in silico de ARNi corto que se dirigen al alfa-ENaC (SCNN1A)
Se llevo a cabo el diseno del ARNi corto para identificar los ARNi corto para los cuatro grupos previamente definidos (vease mas arriba).
a) quot;Conjunto de cribado inicialquot;.
b) quot;Conjunto de cribado extendidoquot;.
c) quot;Conjunto sustituto in vivo para rataquot;.
d) quot;Conjunto sustituto in vivo para cobayoquot;.
Conjunto de cribado inicial
El objetivo para la seleccion in silico de un conjunto de cribado inicial, fue identificar los ARNi corto que se dirigieran especificamente al alfa-ENaC humano, asi como a su ortologo de mono Rhesus. El ARNm objetivo humano NM 001038.4) se descargo del recurso del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nihgov/entrezlquery.fcgi?CMD=search&DB=nucleotide) durante el procedimiento de seleccion completo de ARNi corto. Con el objeto de identificar el ortoiogo de alfa-ENaC de Rhesus (Macaca mulatta), se utilizo la secuencia humana en una busqueda con blastn en el Baylor College of Medicine (http://www.hgsc.bcm,tmc.edu/blast/?organism=Mmulatta) contra los contigos de Mmulatta a partir de 2004 10 01. Todas las regiones encontradas se extrajeron y se ensamblaron mediante la herramienta de ensamble CAP para generar una primera secuencia de ensamble. Ademas, se llevo a cabo una busqueda con BLAST con la secuencia humana en UCSC (httpz/lgenome.ucsc.edu/cgibin/hgBIat?command=start&org=Rhesus&db=rheMac2&hgsid=84859356) contra Rhesus
congelada el 12 de marzo de 2005. EI encuentro del andamiaje 84554 se descargo y se utilizo junto con la primera secuencia de ensamble mediante CAP, para generar la secuencia en consenso final para el alfa-ENaC de Rhesus.
En seguida de la extraccion de todas las secuencias de 19 mer traslapadas fuera del ARNm humano, se identificaron los 19 mer conservados que tenian secuencias identicas en la secuencia en consenso ensamblada de Rhesus. Estas secuencias de 19 mer se definieron como la reserva de secuencias de ARNi corto (sentido) de reactividad cruzada de humano-Rhesus, representadas por 1185 de 19 mers.
Se generaron las secuencias antisentido correspondientes y se probaron para determinar su especificidad en seres humanos. Para esto, se tomo como parametro su potencial predicho para interactuar con los ARNm objetivo irrelevantes (potencial fuera del objetivo), que se tomo como un parametro. Las secuencias con un bajo potencial fuera del objetivo se definieron como preferibles, y se predijo que eran mas especificas.
Para una seleccion adicional, los ARNi corto candidatos se clasificaron de acuerdo con su potencial predicho para interactuar con otras secuencias huesped (aqui, sin limitacion, un ser humano). Se asumio que los ARNi corto con un bajo potencial fuera del objetivo eran mas especificos in vivo. Para predecir el potencial fuera del objetivo especifico del ARNi corto, se hicieron las siguientes suposiciones:
1) El potencial fuera del objetivo de una cadena se puede deducir a partir del numero y de la distribucion de los malos emparejamientos con un fuera de objetivo;
2) EI fuera de objetivo mas relevante, que es el gen que se predijo que tiene la mas alta probabilidad de ser silenciado debido a la tolerancia de malos emparejamientos, determina el potencial fuera del objetivo de la cadena;
3) Las posiciones 2 a 9 (contando de 5' a 3') de una cadena (region de siembra) pueden contribuir mas al potencial fuera del objetivo que el resto de la secuencia (es decir, Ia region que no es de siembra y del sitio de disociacion) (Haley, B., y Zamore, P. D., Nat. Struct. Mol Biol. 2004, 11: 599);
4) Las posiciones 10 y 11 (contando de 5' a 3') de una cadena (region del sitio de disociacion) pueden contribuir mas al potencial fuera del objetivo que la region que no es de siembra (es decir, las posiciones 12 a 18, contando de 5' a 3');
5) Las posiciones 1 y 19 de cada cadena no son relevantes para las interacciones fuera del objetivo;
6) El potencial fuera del objetivo se puede expresar mediante el puntaje fuera de objetivo del fuera de objetivo mas relevante, calculado con base en el numero y en la posicion de malos emparejamientos de la cadena, con la region mas homologa en el gen fuera del objetivo, considerando las suposiciones 3 a 5;
7) Suponiendo un fracaso potencial de la actividad de la cadena sentido mediante las modificaciones internas introducidas, solamente sera relevante el potencial fuera del objetivo de la cadena antisentido.
Para identificar los genes potenciales fuera del objetivo, se sometieron las secuencias antisentido de 19 mer a una busqueda de homologias contra las secuencias de ARNm humanas publicamente disponibles, que se supone que representaban el transcriptoma exhaustivo humano.
Para este proposito, se llevaron a cabo busquedas con fastA (version 3.4) con todas las secuencias de 19 mer contra una base de datos RefSeq humana (version disponible en ftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq/ el 18 de noviembre de 2005). La busqueda con fastA se realizo con parametros-valores-pares -f 30 -g 30 con el proposito de tomar en consideracion la homologia sobre la longitud completa de las 19 mer sin ninguna brecha. Ademas, con el fin de asegurar el listado de todos los encuentros fuera del objetivo relevantes en el archivo producido por fastA, se utilizo el parametro -E 15000.
La busqueda dio como resultado un listado de fuera del objetivo potenciales para cada secuencia de entrada enlistada por homologia de secuencia descendente sobre la de 19 mer completa.
Con el fin de clasificar todos los fuera del objetivo potenciales de acuerdo con las suposiciones 3 a 5, y mediante esto identificar el gen fuera del objetivo mas relevante y su puntaje fuera del objetivo, se analizaron los archivos producidos por fastA mediante un guion perl.
EI guion extrajo las siguientes propiedades fuera del objetivo para cada secuencia introducida de 19 mer y para cada gen fuera del objetivo, para calcular el puntaje fuera del objetivo:
Numero de malos emparejamientos en la region que no es de siembra.
Numero de malos emparejamientos en la region de siembra.
Numero de malos emparejamientos en la region del sitio de disociacion.
El puntaje fuera del objetivo se calculo considerando las suposiciones 3 a 5 como sigue:
Puntaje fuera del objetivo = Numero de malos emparejamientos de siembra * 10.
+
numero de malos emparejamientos del sitio de disociacion * 1,2.
+
numero de malos emparejamientos que no son de siembra * 1.
EI gen fuera del objetivo mas relevante para cada secuencia de 19 mer se definio como el gen con el puntaje fuera del objetivo mas bajo. De acuerdo con lo anterior, el puntaje fuera del objetivo mas bajo se definio como el representativo del potencial fuera del objetivo de cada ARNi corto, representado por la secuencia antisentido de 19 mer analizada.
Se utilizo el potencial fuera del objetivo calculado como el parametro de seleccion (descendente por el puntaje fuera del objetivo), con el proposito de generar una clasificacion para todas las secuencias de ARNi corto de reactividad cruzada de humano-Rhesus.
Un puntaje fuera del objetivo de tres o mas se definio como un requisito previo para la seleccion de ARNi corto, mientras que todas las secuencias que contenian cuatro o mas de G en una fila (secuencias poli-G) fueron excluidas, conduciendo a la seleccion de un total de 152 ARNi corto que se dirigen al alfa-ENaC humano y de Rhesus (vease la Tabla 1a).
Conjunto de cribado extendido
El objetivo para la seleccion in silico del conjunto de cribado extendido, fue identificar todos los ARNi corto adicionales que se dirigen al alfa-ENaC humano con suficiente especificidad, que se excluyeron del grupo inicial debido a la perdida de reactividad cruzada con Rhesus. Se tomaron las secuencias restantes de la reserva de 19 mers derivadas a partir del alfa-ENaC humano que no se han analizado antes, y se generaron las secuencias antisentido correspondientes. El gen fuera del objetivo mas relevante y sus correspondientes puntajes fuera del objetivo, se calcularon como se describe en la seccion del quot;conjunto de cribado inicialquot;.
Para la determinacion de la reactividad cruzada con el raton y el de cobayo (Cavia porcel/usicobya), se descargaron las secuencias de alfa-ENaCde estas especiesde labase de datosde nucleotidosdel NCBI 1 (numerosdeacceso NM 011324.1 y AF071230 (longitud completa)/DQ109811 (cds parcial), respectivamente). Las dos secuencias de cobayo se utilizaron para generar una secuencia en consenso de alfa-ENaC de cobayo. Se probo cada secuencia de 19 mer humana para determinar su presencia en las secuencias de raton y de cobayo. Las secuencias positivas se asignaron a la reserva de secuencias de ARNi corto (sentido) de reactividad cruzada de humano-raton, o de las secuencias de ARNi corto (sentido) de reactividad cruzada de humano-cobayo. Despues de la exclusion de todas las secuencias de poli-G, se seleccionaron las secuencias con puntajes fuera del objetivo de 3 o mas, asi como aquellas con puntajes fuera del objetivo de 2,2 o de 2,4 y reactividad cruzada con raton, Rhesus, o cobayo. El numero total de ARNi corto en la reserva de cribado extendida fue de 344 (vease la Tabla 1b).
Conjunto sustituto de rata in vivo
El objetivo de la seleccion in silico del conjunto sustituto de rata in vivo fue identificar todos los ARNi corto que se dirigieran al alfa-ENaC humano y de rata con suficiente especificidad en rata. Para la identificacion de los ARNi corto de reactividad cruzada de humano-rata, se descargo la secuencia de ARNm para alfa-ENaC de rata de la base de datos de nucleotidos del NCBI (numero de acceso NM 031548.2), y todas las secuencias fuera de la reserva de 19 mers humanas se analizaron para determinar la presencia en la secuencia de rata, que representaba la reserva de las secuencias de ARNi corto (sentido) de reactividad cruzada de humano-rata.
Se generaron las secuencias antisentido correspondientes, y se probaron para determinar su especificidad en rata. Para esto, se calcularon el gen fuera del objetivo mas relevante en rata y sus correspondientes puntajes fuera del objetivo, como se describe en la seccion del quot;conjunto de cribado inicialquot;, utilizando el conjunto de ARNm (base de datos RefSeq) en lugar de los transcriptos humanas. Despues de Ia exclusion de todas las secuencias poli-G, se genero una clasificacion, considerando el puntaje fuera del objetivo de rata en primera prioridad, y el puntaje fuera del objetivo humano con segunda prioridad. Las 48 secuencias desde la parte superior de la lista fueron finalmente seleccionadas, representando al conjunto sustituto de rata in vivo (vease la Tabla 1c).
Conjunto sustituto de cobayo in vivo
El objetivo de la seleccion in silico del conjunto sustituto de cobayo in vivo, fue identificar todos los ARNi corto que se dirigieran al alfa-ENaC humano y de cobayo, que no se hubieran seleccionado en grupos anteriores. Los ARNi corto restantes del conjunto previamente determinado de las secuencias de ARNi corto (sentido) de reactividad cruzada de humano-cobayo, se clasificaron de acuerdo con los puntajes fuera del objetivo humanos. Se seleccionaron las 63 secuencias superiores (excluyendo las secuencias poli-G), que representaban el conjunto sustituto de cobayo in vivo (vease la Tabla 1d).
Ejemplo 2: Sintesis de ARNi corto
Sintesis de los nucleotidos que comprenden bases naturales
Debido a que los ARNi corto de los conjuntos de cribado son todos potencialmente pretendidos para administracion in vivo, se sintetizaron los ARNi corto con una estrategia de modificacion que protege a los ARNi corto de la degradacion por las endo y exonucleasas, en un medio ambiente biologico. En esta estrategia, se protegen los extremos 3' de ambas cadenas de una actividad exonucleolitica 3' -gt; 5', mediante un enlace fosforotioato entre las dos ultimas nucleobases en el extremo 3'. Con el objeto de inhibir la degradacion endonucleolitica del ARNi corto, todas las pirimidinas en la cadena sentido del ARNi corto fueron reemplazadas con el ribonucleotido modificado por 2'-O-metilo correspondiente. Para reducir el numero de modificaciones en la cadena antisentido, que es la cadena mas activa, y por consiguiente, mas sensible a las modificaciones, solamente se modificaron las pirimidinas en el contexto de los sitios de disociacion de la nucleasa principal previamente identificada con los grupos 2'-O-metiIo. Los sitios de disociacion principales son los siguientes dos motivos de secuencia: 5'-UA-3' y 5'-CA-3'.
Debido a que tambien se ha considerado utilizar los ARNi corto en formulaciones que protejan potencialmente a los ARNs del medio ambiente biologico nucleolitico en el pulmon, tambien se sintetizo el mismo conjunto de los ARNi corto sin proteccion alguna de la degradacion endonucleolitica.
Cuando la fuente de un reactivo no se suministra especificamente en la presente invencion, este reactivo se puede obtener con cualquier proveedor de reactivos para biologia molecular, con un estandar de calidad / pureza para aplicacion en biologia molecular.
Los ARN monocatenarios se produjeron mediante sintesis en fase solida a una escala de 1 !mol, utilizando un sintetizador Expedite 8909 (Applied Biosystems, Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Alemania), y vidrio de poros controlados (CPG, 500 Angstroms, Proligo Biochemie GmbH, Hamburgo, Alemania) como el soporte solido. El ARN, y el ARN que contenia los nucleotidos de 2'-O-metilo, se generaron mediante sintesis en fase solida, empleando las fosforamiditas y las fosforamiditas de 2'-O-metilo correspondientes, respectivamente (Proligo Biochemie GmbH, Hamburgo, Alemania). Estos bloques de construccion se incorporaron en los sitios seleccionados dentro de la secuencia de la cadena del oligorribonucleotido, utilizando quimica de fosforamidita de nucleosido convencional, tal como se describe en Current Protocols in Nucleic acid chemistry, Beaucage, S. L. y colaboradores (Editores), John Wiley Sons, Inc., Nueva York, NY, EUA. Los enlaces de fosforotioato se introdujeron mediante el reemplazo de la solucion oxidante de yodo, con una solucion del reactivo de Beaucage (Chruachem Ltd., Glasgow, Reino Unido) en acetonitrilo (al 1%). Otros reactivos auxiliares se obtuvieron a traves de Mallinckrodt Baker (Griesheim, Alemania).
La desproteccion y purificacion de los oIigorribonucleotidos sin procesar mediante HPLC de intercambio de aniones se llevaron a cabo de acuerdo con los procedimientos establecidos. Los rendimientos y las concentraciones se determinaron mediante absorcion ultravioleta de una solucion del ARN respectivo, a una longitud de onda de 260 nm, utilizando un fotometro espectral (DU 640B, Beckman Coulter GmbH, Unterschlei heim, Alemania). Se genero el ARN bicatenario mezclando una solucion equimolar de cadenas complementarias en el regulador de hibridacion (fosfato de sodio 20 mM, pH 6,8; cloruro de sodio 100 mM), se calento en un bano de agua a 85 -900 C durante 30 minutos, y se enfrio a temperatura ambiente durante un periodo de 3 a 4 horas. La solucion de ARN hibridado se diluyo hasta una concentracion de 50 !moles de ARN bicatenario / L, y se almaceno a -200 C hasta su uso.
Ejemplo 3: Ensayo del ARNi corto in vitro
Se probo la capacidad de los agentes de ARNi para inhibir la expresion de alfa-ENaC en lineas celulares humanas in vitro, o en ratas in vivo. El agente de ARNi se transfecta en las celulas, por ejemplo, mediante transfeccion, se deja actuar sobre las celulas durante cierto tiempo, por ejemplo 24 horas, y se determinan los niveles de ARNm para alfa-ENaC mediante analisis de ARN ramificado. Alternativamente, el agente de ARNi se administra in vivo a traves de la via intratraqueal, y se determina la inhibicion de la expresion del ARNm para alfa-ENaC mediante el analisis del ADN ramificado sobre el organo objetivo. Complementando estos ensayos directos, se analizo Ia inhibicion de la expresion del gen objetivo por los agentes de ARNi para el ARNm para alfa-ENaC expresado en forma recombinante en celulas huesped de mamifero.
Lineas celulares
Se obtuvieron celulas H441 de la American Type Culture Collection (ATCC Numero: HTB-174, LCG Promochem GmbH, Wesel, Alemania), y se cultivaron en RPMI 1640, suero fetal de ternero al 10%, 100 u de penicilina / 100 !g/mL de estreptomicina, L-glutamina 2 mM, Hepes 10 mM, y piruvato de sodio 1 mM (todos de Biochrom AG, Berlin, Alemania) a 370C, bajo una atmosfera del 5% de CO2 / 95% de aire atmosferico.
Las celulas epiteliales bronquiales humanas primarias se obtuvieron a traves de Cambrex (Cat # CC-2540), y se cuitivaron rutinariamente en un medio BEGM con SingleQuots (Cambrex Cat # CC-3170 sin tri-yodotreonina). Para la polarizacion y el crecimiento en la interfase aire-liquido, se cultivaron las celulas en una mezcla en proporcion 1:1 de BEGM:DMEM complementado con 4,5 g/L de D-Glucosa (Gibco BRL Cat # 41965-039), y se complementaron con SingleQuots (Cambrex Cat # CC-4175), como anteriormente, pero sin la tri-yodotreonina y las alicuotas de GA1000, y en presencia de 50 !g/mL de Gentamicina (Gibco BRL Cat # 10131-015). Debido a que las celulas se mantuvieron en un medio libre de suero, se utilizo la solucion de neutralizacion de tripsina durante las etapas de pasada (Cambrex Cat # CC-5002). Para la polarizacion y el cultivo en la interfase aire-liquido, se cultivaron las celulas sobre soportes de policarbonato semipermeables (0,4 micras) (Corning Costar Cat # 3407 #3460), y se cuitivaron todo el tiempo a 370 C bajo una atmosfera del 5% de CO2 / 95% de aire.
Las celulas de rinon de mono verde africano Cos-1 (ATCC # CRL-1650) se cuitivaron en MEM de Dulbecco, 4,5 g/L de glucosa, suero bovino fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, 1,5 g/L de bicarbonato de sodio (Gibco BRL), 100 unidades de penicilina/100 !g/mL de estreptomicina.
Ejemplo 3.1: Cribadi in vitro para la determinacion de los ARNi corto para alfa-ENaC activos y de lC50 en H441
Un dia antes de la transfeccion, se indujo la expresion de alfa-ENaC en celulas H441 (ATCC Numero: HTB-174, LCG Promochem GmbH, Wesel, Alemania), mediante la adicion de 100 nM de dexametasona. Directamente antes de la transfeccion, se sembraron las celulas a razon 1,5 x 104 celulas/pozo, en placas de 96 pozos (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania) en 75 !L de medio de cultivo (RPMI 1640, suero fetal de ternera al 10%, 100 unidades de penicilina/100 !g/mL de estreptomicina, L-glutamina 2 mM, Hepes 10 nM, y piruvato de sodio 1 mM, todos de Biochrom AG, Berlin, Alemania). Las transfecciones se llevaron a cabo por cuadruplicado. Para cada pozo, se mezclaron 0,5 !L de Lipofectamina 2000 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania) con 12 !L de Opti-MEM (Invitrogen), y se incubo durante 15 minutos a temperatura ambiente. Para la concentracion del ARNi corto con una concentracion de 50 nM en el volumen de transfeccion de 100 !L, se mezclo 1 !L de un ARNi corto 5 !M con 11,5 !L de Opti-MEM por pozo, se combino con la mezcla de Lipofectamina 2000-Opti-MEM, y nuevamente se incubo durante 15 minutos a temperatura ambiente. Los complejos de ARNi corto -Lipofectamina 2000 se aplicaron completamente (25 microlitros cada vez por pozo) a las celulas, y se incubaron las celulas durante 24 horas a 370C y CO2 al 5% en una incubadora humidificada (Heraeus GmbH, Hanau).
Se cosecharon las celulas mediante la aplicacion de 50 !L de mezcla de lisis (contenido del kit QuantiGene bDNA de Genospectra, Fremont, EUA) a cada pozo que contenia 100 !L de medio de cultivo, y se Iisaron a 530C durante 30 minutos. Despues, se incubaron 50 !L de los Iisados con conjuntos de sondas especificos para alfa-ENaC humana y GAPDH humano (para las secuencias de los conjuntos de sondas, vease mas abajo), y se procedio de acuerdo con el protocolo del fabricante para QuantiGene. AI final, se midio Ia quimiluminiscencia en un Victor2-Light (Perkin Elmer, Wiesbaden, Alemania) como la RLU (unidades relativas de luz), y se normalizaron los valores obtenidos con el conjunto de sondas hENaC con los valores respectivos de GAPDH para cada pozo. Los valores obtenidos con los ARNi corto dirigidos contra alfa-ENaC se relacionaron con el valor obtenido con un ARNi corto no especifico (dirigido contra HCV), que se fijo en el 100%. El porcentaje de expresion residual de alfa-ENaC para los ejemplos de ARNi corto, se muestra en las Tablas 1A - 1D.
Los ARNi corto efectivos del cribado, se caracterizaron adicionalmente mediante curvas de respuesta a la dosis. Se llevaron a cabo transfecciones de curvas de respuesta a la dosis con las siguientes concentraciones: 100 nM, 16,7 nM, 2,8 nM, 0,46 nM, 77 picoM, 12,8 picoM, 2,1 picoM, 0,35 picoM, 59,5 fM, 9,9 fM y simulado (sin ARNi corto), y se diluyeron con Opti-MEM hasta una concentracion final de 12,5 !L, de acuerdo con el protocolo anterior. El analisis de datos se llevo a cabo utilizando el complemento de software de Microsoft Excel, XL-fit 4.2 (IDBS, Guildford, Surrey, Reino Unido), y aplicando el numero de modelo sigmoidal 606.
Conjuntos de Sondas:
alfa-ENaC humana:
Nombre FPL Miembros Funcion Secuencia SEQ
ID NO: hENAC001 .235.255.CE CE gtctgtccagggtttccttccTTTTTctcttggaaagaaagt 1645 hENAC002 .274.293.CE CE actgccattcttggtgcagtTTTTTctcttggaaagaaagt 1646 hENAC003 .344.367.CE CE ctctcctggaagcaggagtgaataTTTTTctcttggaaagaaagt 1647 hENAC004 .391.411.CE CE gccgcggatagaagatgtaggTTTTTctcttggaaagaaagt 1648 hENAC005 .501.521.CE CE gcacttggtgaaacagcccagTTTTTctcttggaaagaaagt 1649 hENAC006 .539.560.CE CE agcagagagctggtagctggtcTTTTTctcttggaaagaaagt 1650 hENAC007 .256.273.LE LE cgccataatcgcccccaaTTTTTaggcataggacccgtgtct 1651 hENAC008 .368.390.LE LE cacagccacactccttgatcatgTTTTTaggcataggacccgtgtct 1652 hENAC009 .412.431.LE LE acagtactccacgttctgggTTTTTaggcataggacccgtgtct 1653 hENAC010 .455.477.LE LE ggagcttatagtagcagtaccccTTTTTaggcataggacccgtgtct 1654 hENAC011 .522.538.LE LE acgctgcatggcttccgTTTTTaggcataggacccgtgtct 1655 hENAC012 .561.580.LE LE gagggccatcgtgagtaaccTTTTTaggcataggacccgtgtct 1656 hENAC013 .214.234.BL BL Tcatgctgatggaggtctcca 1657 hENAC014 .294.318.BL BL Ggtaaaggttctcaacaggaacatc 1658 hENAC015 .319.343.BL BL Cacacctgctgtgtgtactttgaag 1659 hENAC016 .432.454.BL BL Caggaactgtgctttctgtagtc 1660 hENAC017 .478.500.BL BL Gtggtctgaggagaagtcaacct 1661 hENAC018 .581.599.BL BL Ccattcctgggatgtcacc 1662 hGAP001 AF261085.252.271.CE CE gaatttgccatgggtggaatTTTTTctcttggaaagaaagt 1663 hGAP002 AF261085.333.352.CE CE ggagggatctcgctcctggaTTTTTctcttggaaagaaagt 1664 hGAP003 AF261085.413.431.CE CE ccccagccttctccatggtTTTTTctcttggaaagaaagt 1665 hGAP004 AF261085.432.450.CE CE gctcccccctgcaaatgagTTTTTctcttggaaagaaagt 1666 hGAP005 AF261085.272.289.LE LE agccttgacggtgccatgTTTTTaggcataggacccgtgtct 1667 hGAP006 AF261085.290.310.LE LE gatgacaagcttcccgttctcTTTTTaggcataggacccgtgtct 1668 hGAP007 AF261085.311.332.LE LE agatggtgatgggatttccattTTTTTaggcataggacccgtgtct 1669 hGAP008 AF261085.353.372.LE LE gcatcgccccacttgattttTTTTTaggcataggacccgtgtct 1670 hGAP009 AF261085.373.391.LE LE cacgacgtactcagcgccaTTTTTaggcataggacccgtgtct 1671 hGAP010 AF261085.451.472.LE LE ggcagagatgatgacccttttgTTTTTaggcataggacccgtgtct 1672 hGAP011 AF261085.392.412.BL BL Ggtgaagacgccagtggactc 1673
Las lC50 para los ejemplos de ARNi corto se muestran en las Tablas 2A y 2B.
Ejemplo 3.2: Desactivacion genetica transitoria de alfa-ENaC en un modelo epitelial bronquial humano primario
Se sembraron celulas epiteliales bronquiales humanas (referencia del donador 4F1499) en placas de 24 pozos a 5 razon de 1 x 105 celulas por pozo, en 0,5 mL de medio de cultivo, 1 dia antes de la transfeccion. Las celulas eran 70% confluentes el dia de la transfeccion del ARNi corto.
Cada ARNi corto se volvio a suspender a razon de 100 nM en 1 miL de Optimem 1 (Invitrogen), y en un tubo separado, se diluyo Lipofectamina 2000 (lnvitrogen) a razon de 6 !L/mL en Optimem, produciendo una cantidad suficiente para la transfeccion de cuatro replicas en una placa de 24 pozos. Despues de 5 minutos a temperatura 10 ambiente, se combinaron las mezclas para obtener la concentracion final deseada de ARNi corto 50 nM y 3 !L/mL de Lipofectamina 2000. Se incubo la mezcla de transfeccion durante 20 minutos adicionales a temperatura ambiente, y se agregaron 420 !L del complejo de ARNi corto/reactivo a cada pozo, de acuerdo con el diseno experimental. Se sacudieron suavemente las placas para asegurar una mezcla completa, y luego se incubaron a 370 C en una incubadora con 5% de CO2 / 95% de aire durante 4 horas. Posteriormente, se aspiro la mezcla de
15 transfeccion, y se regresaron las celulas a las condiciones de cultivo normales durante 20 horas adicionales.
Se prepararon los lisados celulares para el analisis de ADN ramificado. Se preparo una mezcla en proporcion 2:1 de medio:amortiguador de lisis (Panomics), y se lisaron las celulas en 200 !L a 530C durante 30 minutos. Despues de una verificacion visual para determinar la lisis completa, se almacenaron los lisados celulares a -800C para el siguiente analisis. El analisis de ADN ramificado se llevo a cabo como se describio anteriormente, con la expresion
20 de alfa-ENaC normalizada contra GAPDH. El protocolo de analisis de ADN ramificado utilizado difiere del anterior solamente en que se aplicaron 20 !L de muestra a cada pozo en este caso.
La Tabla 2C muestra la expresion de alfa-ENaC en HBEC primario para los ejemplos de ARNi corto.
Ejemplo 3.3: Inhibicion in vitro de la expresion del gen para alfa-ENaC cinomolgo clonado expresado en forma exogena, para los agentes de ARNi seleccionados, en celulas Cos-1
Clonacion de la secuencia de alfa-ENaC de cinomolgo
Las secuencias cebadoras para la amplificacion de la 5'-UTR y las CDS (los nucleotidos mostrados entre parentesis corresponden a la secuencia de cADN para a-ENaC de Macaca mulatta (mono Rhesus)):
P745: 5'- CTCCATGTTCTGCGGCCGCGGATAGAAG-3' (nt 1427) (SEQ ID NO: 1674)
P733: 5'- CCGGCCGGCGGGCGGGCT-3' (nt 1) (SEQ ID NO: 1675)
P734: 5-CTCCCCAGCCCGGCCGCT-3' (nt 17) (SEQ ID NO: 1676)
P735: 5'- GGCCGCTGCACCTGTAGGG-3' (nt 28) (SEQ ID NO: 1677)
Las secuencias cebadoras para la amplificacion de CDS y 3'-UTR:
P737: 5'- ATGGAGTACTGTGACTACAGG-3' (nt 1422) (SEQ ID NO: 1678)
P740: 5'- TTGAGCATCTGCCTACTTG-3' (nt 3113) (SEQ ID NO: 1679)
Las secuencias cebadoras para la amplificacion de la parte interna de CDS:
P713: 5'- 5'-ATGGATGATGGTGGCTTTAACTTGCGG-3' (nt 1182) (SEQ ID NO: 1679)
P715: 5'- 5'-TCAGGGCCCCCCCAGAGG-3' (nt 2108) (SEQ ID NO: 1680)
El ARN total de pulmon de cinomolgo (Macaca fascicularis) (# R1534152-Cy-BC) se adquirio a traves de BioCat (Alemania). La sintesis del ADNc se llevo a cabo utilizando el Sistema de Sintesis de la Primera Cadena SuperScript III (lnvitrogen). La sintesis del ADNc se llevo a cabo utilizando ya sea hexameros aleatorios o bien cebadores de oligo dT. Ademas, el ADNc de Ia primera cadena de pulmon de cinomolgo tambien se adquirio a traves de BioCat (# C1534160-Cy-BC). Para la amplificacion por PCR, se utilizo el kit Advantage 2 PCR (# K1910-1, Clontech). La amplificacion de la 5'-UTR y de partes de Ia CDS, se realizo utilizando P745 y una mezcla equimolar de P733, P734, y P735. Para Ia amplificacion por PCR de la CDS y Ia 3'-UTR, se utilizaron los cebadores P737 y P740. Se utilizaron los cebadores P713 y P715 para la amplificacion de partes de la CDS.
Todos los productos de la PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa, y luego se clonaron en el vector pCR2.1 utilizando el kit de clonacion TOPO TA (lnvitrogen) en bacterias TOP10. Luego se recogieron los clones, y se aislo el ADN utilizando el kit Qiagen Miniprep. Despues de la digestion con enzima de restriccion EcoR/, y del analisis mediante electroforesis en gel de agarosa, se sometio el ADN de los clones correctos a secuenciacion.
Se alinearon luego las secuencias con Ia secuencia de ADNc para alfa-ENaC de mono Rhesus, y se alinearon las secuencias de los clones individuales entre si. Luego se clono la longitud completa del ADNc para alfa-ENaC de cinomolgo mediante digestion de Ia parte 5' (5'-UTR y CDS, clon 55) con EcoR l y Not l, digestion de la parte media de la CDS con Not l y BstE // (clon 15), y la parte 3' (CDS y 3'-UTR) mediante BstE /l y EcoR V (clon 80). Los fragmentos de ADN digeridos se subclonaron entonces en pcDNA3.1, digerido con EcoR / y EcoR V. El ADNc de longitud completa para alfa-ENaC de cinomologo en pcDNA3.1 se sometio entonces a secuenciacion de longitud completa (lngenetix, Viena, Austria). La secuencia del ADNc para alfa-ENaC de cinomolgo corresponde a los nucleotidos 28 a 3113 de la secuencia de ADNc para alfa-ENaC de Rhesus. Finalmente, se separo luego el ADNc para alfa-ENaC de cinomolgo del alfa-ENaC de cinomoIgo pcDNA3.1 mediante digestion con BamH l y EcoR V, y se subclono en el vector pXOON. El mapa del plasmido se ilustra en la Figura 1. La Figura 2 describe la secuencia de proteina (SEQ ID NO: 1681) y del ADN (SEQ ID NO: 1682) del alfa-ENaC de cinomolgo.
Transfecciones:
Se sembraron las celulas Cos-1 a razon de 6 x 104 celulas/pozo, en placas de 24 pozos cada una, en 0,5 mL de medio de cultivo. Un dia despues de la siembra, se cotransfectaron las celulas con el plasmido de expresion de alfa-ENaC de cinomolgo pXOON, y el ARNi corto indicado. Para cada pozo, se cotransfectaron 4 ng de plasmido de expresion de alfa-ENaC y 600 ng de plasmido portador (pNFAT-luc) con el ARNi corto relevante (concentracion final de 45 nM), utilizando el reactivo de transfeccion genica X-treme (Roche) a razon de 3.75 !L/pozo, en un volumen total de 720 !L/pozo de Opti-MEM (Invitrogen) como se describe a continuacion.
Las transfecciones se llevaron a cabo por triplicado para cada muestra. Se prepararon mezclas maestras de plasmido/ARNi corto (cada una para 3,5 pozos) de la siguiente forma: 14 ng de plasmido de expresion de alfa-ENaC, 2,1 !g de plasmido portador, y 112 pmoles del ARNi corto relevante, en un volumen total de 210 !L (Opti-MEM). Se preparo una mezcla maestra de lipido para la transfeccion completa (105 !L de lipido mas 1575 !L de Opti-MEM 5 para ocho muestras de transfeccion por triplicado). Se mezclaron el plasmido/ARNi corto y el lipido en un volumen igual, para producir un volumen total de 420 !L de mezcla de transfeccion por muestra triplicada (3,5 veces). Despues de una incubacion de 20 minutos a temperatura ambiente, se agregaron 120 !L de Ia mezcla de transfeccion relevante a cada pozo de celulas, en un volumen de transfeccion final de 720 !L (opti-MEM). Se transfectaron las celulas durante 24 horas a 370 C y CO2 al 5% en una incubadora humidificada (Heraeus GmbH, 10 Hanau, Alemania), y se las cosecho para el analisis del ADN ramificado.
Se prepararon Iisados celulares para el analisis del ADN ramificado. Se preparo una mezcla en proporcion de 2:1 de medio:amortiguador de lisis (Panomics), y se lisaron las celulas en 200 !L a 530C durante 30 minutos. Despues de una verificacion visual para comprobar la lisis completa, se almacenaron los Iisados celulares a -800C para el siguiente analisis. El analisis del ADN ramificado se llevo a cabo como se describio anteriormente, con la expresion
15 de alfa-ENaC de cinomolgo normalizada contra eGFP del plasmido de expresion. El protocolo de analisis de ADN ramificado empleado difiere del anterior solamente en que se aplicaron 20 !L de muestra a cada pozo en este caso.
Conjunto de sondas:
Alfa-ENaC de cinomologo Nombre FLP Funcion Secuencia SEQ ID NO:
cyENa001 CE cgccgtgggctgctgggTTTTTctcttggaaagaaagt 1683 cyENa002 CE ggtaggagcggtggaactcTTTTTctcttggaaagaaagt 1684 cyENa003 CE cagaagaactcgaagagctctcTTTTTctcttggaaagaaagt 1685 cyENa004 CE cccagaaggccgtcttcatTTTTTctcttggaaagaaagt 1686 cyENa005 LE ggtgcagagccagagcactgTTTTTctcttggaaagaaagt 1687 cyENa006 LE gtgccgcaggttctgggTTTTTaggcataggacccgtgtct 1688 cyENa007 LE gatcagggcctcctcctcTTTTTaggcataggacccgtgtct 1689 cyENa008 LE ccgtggatggtggtattgttgTTTTTaggcataggacccgtgtct 1690 cyENa009 LE gcggttgtgctgggagcTTTTTaggcataggacccgtgtct 1691 cyENa0010 LE ttgccagtacatcatgccaaaTTTTTaggcataggacccgtgtct 1692 cyENa0011 BL acaccaggcggatggcg 1693
eGFP:
Nombre FLP
EGFP001 EGFP002 EGFP003 EGFP004 EGFP005 EGFP006 EGFP007 EGFP008 EGFP009 EGFP010 EGFP011 EGFP012 EGFP013 Funcion CE CE CE CE LE LE LE LE LE LE BL BL BL Secuencia
ggcacgggcagcttgcTTTTTctcttggaaagaaagt ggtagcggctgaagcactgTTTTTctcttggaaagaaagt cctggacgtagccttcgggTTTTTctcttggaaagaaagt ccttgaagaagatggtgcgctTTTTTctcttggaaagaaagt cgaacttcacctcggcgcTTTTTtcttggaaagaaagt ccttcagctcgatgcggtTTTTTctcttggaaagaaagt gtcacgagggtgggccagTTTTTaggcataggacccgtgtct cacgccgtaggtcagggtgTTTTTaggcataggacccgtgtct gtgctgcttcatgtggtcggTTTTTaggcataggacccgtgtct tcaccagggtgtcgccctTTTTTaggcataggacccgtgtct cggtggtgcagatgaacttca catggcggacttgaagaagtc cgtcctccttgaagtcgatgc SEQ ID NO: 1694 1695 1696 1697 1698 1699 1700 1701 1702 1703 1704 1705 1706
La Tabla 2C muestra la expresion de alfa-ENaC en especies cinomologas para los ejemplos de ARNi corto.
20 Ejemplo 3.4: Cribado para la induccion del interferon-a
Con el fin de evaluar la capacidad del ARNi corto para estimular la liberacion del interferon- a (lFNa), se incubo ARNi corto con celulas mononucleares de sangre periferica recien purificadas (PMBC) in vitro durante 24 horas. Se anadio el ARNi corto ya sea directamente a las PMBC, o primero se formo un complejo con un agente de transfeccion de
lipido (agente de transfeccion GenePorter 2 o Lipofectamina 2000 o DOTAP), y posteriormente se incubo con las PMBC. Como los controles positivos para la induccion de lFNa, se incluyeron las secuencias de control no modificadas Dl A 2216 y DI A 5167.
DI A 2216: es una molecula de ADN antisentido monocatenaria.
5'-dGsdGsdGdGdGdAdCdGdAdTdCdGdTdCdGsdGsdGsdGsdGsdG-B' (SEQ ID NO: 1707).
DI A 5167 es un ARNi corto conjugado con colesterol.
5'-GUCAUCACACUGAAUACCAAU-s-chol -3'
3'-CsAsCAGUAGUGUGACUUAUGGUUA-5' (SEQ ID NO: 1708)
Despues de 24 horas, se midio el IFNa mediante ELISA. Se determino el nivel basal de lFNa para las celulas no tratadas, y siempre estuvo muy cerca del control que solamente tenia agua. La adicion del agente de transfeccion solo no produjo incremento o muy poco de los niveles de lFNa. Se agregaron oligonucleotidos estimuladores conocidos a las celulas, ya sea directamente, o bien en Ia presencia de transfectante, y se observaron los incrementos esperados del lFNa. Esta disposicion permite determinar la estimulacion de IFNa en las PBMC humanas mediante el ARNi corto (u otros oligonucleotidos).
Aislamiento de las PBMC humanas: Se obtuvo una fraccion concentrada de leucocitos (recubrimiento esponjoso) en el Blood Bank Suhl, Institute for Transfusion Medicine, Alemania. Estas celulas eran negativas para una variedad de patogenos, incluyendo VIH, HCV, y otros. El recubrimiento esponjoso se diluyo en proporcion 1:1 con PBS, se lo agrego a un tubo que contenia Ficoll, y se centrifugo durante 20 minutos a 2.200 rpm para permitir el fraccionamiento. Esto fue seguido por la remocion de la capa turbia de globulos blancos, y se la transfirio a un tubo con PBS fresco y Ficoll, que se centrifugo durante 15 minutos a 2.200 rpm. Se removio nuevamente la capa turbia de globulos blancos, se la transfirio a un medio de cultivo de RPMI 1640, y se centrifugo durante 5 minutos a 1.200 rpm para precipitar los globulos blancos. Se resuspendieron las celulas en RPMI, se precipito como anteriormente, y resuspendio en el medio con FCS al 10% hasta 1 x 105 /mL.
Medicion de interferon-a: Se combinaron las celulas en cultivo ya sea con oligonucleotido 500 nM (o 1 !M) en Optimem, o bien con oligonucleotido 133 nM en GP2 o en Lipofectamina 2000 o en agente de transfeccion DOTAP durante 24 horas a 370C. Se midio el interferon-a se midio con el kit ELISA instantaneo Bender Med Systems (Viena, Austria) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
La seleccion de las secuencias terapeuticas lider se baso en un nivel de induccion de lFNa de menos del 15% del control positivo.
Ejemplo 3.5: Determinacion de la estabilidad del ARNi corto en el esputo de pacientes con fibrosis quistica
Las muestras de esputo fueron recolectadas por el Dr. Ahmet Uluer, Children's Hospital Boston. Despues de la recoleccion, se trataron las muestras de esputo con antibiotico, y se irradiaron con ultravioleta para reducir el contenido bacteriano. Con el objeto de determinar la estabilidad del ARNi corto en las muestras de esputo, se incubaron los ARNi corto en 30 !L de esputo en una concentracion de 5 !M a 370C durante los periodos indicados. La reaccion se termino mediante la adicion de proteinasa K, y se incubaron las muestras a 420 C durante otros 20 minutos. Se agrego una molecula de ARN de 40 mer elaborada a partir de nucleotidos L (quot;Spiegelmerquot;) resistente a la degradacion por la nucleasa, y sirvio como estandar de calibracion. Las muestras se filtraron a traves de una membrana de 0,2 !m para remover el desecho restante. Las muestras se analizaron mediante HPLC de intercambio de iones desnaturalizante sobre una columna DNAPac PA 200 (Dionex) a un pH de 11,0 utilizando un gradiente de perclorato de sodio para la elucion. Los ARNi corto y los productos de la degradacion se cuantificaron mediante Ia determinacion del area debajo del pico para cada muestra. La concentracion se normalizo hasta la concentracion en las muestras no incubadas.
La seleccion de las secuencias terapeuticas lider (ND8356, ND8357, y ND8396) se baso en una estabilidad in vitro observada en el esputo con fibrosis quistica con una vida media superior a 60 minutos.
Ejemplo 3.6: Verificacion cruzada de las secuencias terapeuticas lider contra los polimorfismos conocidos en el gen SCNN1A humano
Con el fin de excluir los polimorfismos conocidos de los sitios objetivo de los candidatos lider, se verificaron las secuencias de ARNi corto lider contra la base de datos de polimorfismos de un solo nucleotido (SNP) del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/iquery.fcgi?CMD=search&DB=snp). De los 10 polimorfismos de exones
conocidos en el gen SCNN1A humano, ninguno mostro estar presente en los sitios objetivo de cualquiera de los 10 candidatos terapeuticos lider mas potentes.
Ejemplo 3.7: Perfilacion in vitro de las 5 secuencias principales predichas fuera del objetivo
Se selecciono una lista de alineaciones para cada secuencia mediante homologia sobre la region de 19 mer. Se califico a las secuencias fuera del objetivo con base en el numero y en la posicion de los malos emparejamientos de acuerdo con los criterios descritos en el Ejemplo 1. Se identificaron las 5 secuencias principales fuera del objetivo para cada una de las secuencias terapeuticas lider (ND8356, ND8357, y ND8396). Las secuencias en y fuera del objetivo se clonaron individualmente en el sistema reportero doble de luciferasa. Cada fragmento clonado abarco los 19 nucleotidos objetivo ademas de la region de flanqueo de 10 nucleotidos, tanto 5' como 3' de la secuencia objetivo. Se clonaron los fragmentos en multiples sitios de clonacion 3' con Ia secuencia de luciferasa de Renilla, bajo el control de un promotor SV40. La actividad de cada ARNi corto contra ambas secuencias en y fuera del objetivo se determino mediante la fluorescencia relativa de la luciferasa objetivo de Renilla con la luciferasa de luciernaga, siendo esta ultima controlada independientemente por el promotor HSV-TK. Inicialmente, se llevaron a cabo las transfecciones en celulas COS-7 con una concentracion de ARNi corto de 50 nM. Las lecturas de luciferasa se tomaron a las 24 horas despues de la transfeccion. Con esta alta concentracion de ARNi corto, no se observo ninguna desactivacion genetica de mas del 30% contra cualquier secuencia fuera del objetivo para cualquiera de los tres ARNi corto lider. La actividad contra la secuencia en el objetivo se demostro con una reduccion relativa en la actividad de luciferasa de Renilla de aproximadamente el 80%. Tambien se generaron las curvas de IC50 para cada ARNi corto contra la secuencia en el objetivo, y se controlaron con las secuencias fuera del objetivo identificadas anteriormente. Para cada ARNi corto lider, las IC50 en el objetivo en este ensayo reportero, fueron de un orden de magnitud similar (de 10 a 50 pM) a las IC50 obtenidas contra el objetivo endogeno en H441 (Ejemplo 3.3), indicando que para ND8356, ND8357, y ND8396, la potencia contra la secuencia en el objetivo fue al menos de 1.000 a 5.000 veces mas alta que para cualquiera de las secuencias predichas fuera del objetivo.
Ejemplo 3.8: Perfilacion de genotoxicidad
1.
Determinacion de la citotoxicidad: La citotoxicidad se determino utilizando un contador de celulas para la evaluacion del numero de celulas en cultivo.
2.
Es bien sabido que la prueba de las concentraciones citotoxicas in vitro puede inducir a efectos genotoxicos, tales como la formacion de micronucleos. Por consiguiente, se considero que cantidades crecientes de celulas que contenian micronucleos que aparecian en los recuentos celulares de alrededor del 50% o menos (comparado con el control negativo concurrente) estaban relacionados con la citotoxicidad, si no se podia observar ya un incremento dependiente de la dosis en las celulas micronucleadas con concentraciones que mostraran una toxicidad moderada cuando mucho. Se requiere el analisis de una concentracion que muestre al menos 50% de reduccion en el recuento de celulas por los lineamientos que regulan los ensayos celulares de mamifero in vitro (OECD, y los lineamientos de ICH para la conduccion de la prueba de aberracion de cromosomas). Ademas, los protocolos de OECD requieren de la prueba de compuestos no toxicos para incluir al menos una concentracion precipitante (siempre que esta no exceda de 10 mM o 5 mg/mL, lo que sea mas bajo). Debido a que la prueba de micronucleos in vitro tiene como objetivo predecir el resultado de los ensayos reguladores, es decir, la prueba de aberracion cromosomica in vitro, el protocolo para la prueba de micronucleos in vitro se diseno para satisfacer los requerimientos para estas pruebas.
3.
Sistema de prueba: Las celulas TK6 son celulas transfectadas con el virus de Epstein-Barr y celulas inmortalizadas (origen Iinfoblastoide humano derivado del bazo). Determinacion del potencial clastogenico y/o aneugenico en la prueba de micronucleos in vitro con celulas TK6 con/sin homogenato de higado S9 (2%) de ratas macho (previamente tratadas con Aroclor 1254). Tiempo de tratamiento: 20 horas (-S9), 3 horas (+S9). Tiempo de muestreo: 24 horas despues del inicio del tratamiento de 3 horas, 48 horas despues del inicio del tratamiento de 20 horas. Para cada sustancia, se analizaron al menos tres concentraciones (2 cultivos por concentracion), y 2.000 celulas por concentracion.
4.
El efecto inductor de micronucleo para una concentracion probada se considero positivo si la frecuencia de las celulas micronucleadas era:
•
gt; 2%, y mostraba al menos una duplicacion del valor de control de solvente concurrente, O
•
lt; 2% y mostraba al menos un aumento de tres veces sobre el valor de control de solvente concurrente.
5.
Para concluir que un experimento es positivo, se tiene que tomar en cuenta Ia relacion dosis-efecto y Ia citotoxicidad.
6.
7. Resumen: Las secuencias terapeuticas lider ND8396, ND8356, ND8357 no indujeron mayores numeros de celuias conteniendo micronucleos despues del tratamiento durante 20 horas sin activacion metabolica, ni despues del tratamiento de 3 horas con o sin S9. No se pudo analizar ninguna concentracion citotoxica hasta el limite de prueba de 5 mg/mL.
Ejemplo 3.9: Eficacia funcional in vitro en H441:ND8396
Con el objeto de demostrar la eficacia funcional in vitro del ARNi corto lider contra alfa-ENaC, se transfectaron las celulas H441 con el ARNi corto, y se prepararon para el analisis de la camara Ussings de transporte de iones. Para la transfeccion, se sembraron en placa las celulas H441 en matraces T25 a razon de 2x106 celulas por matraz, en un medio de cultivo complementado con dexametasona 200 mM. Se transfectaron las celulas de cada matraz ya sea con ND8396, o bien con un ARNi corto de control no de direccionamiento, en ARNi corto 30 nM y 4 mL/mL de Lipofectamina 2000 en un volumen total de 5 mL (medio sin suero). Un dia despues de la transfeccion, se sembraron en placa las celulas sobre insertos Snapwell de 1 cm2 hasta confluencia (2 x 105 celulas por inserto), para minimizar el tiempo requerido para Ia diferenciacion y la formacion de uniones apretadas, y se suministraron con el medio tanto en la camara apical como en la camara basolateral. Despues de un dia de cultivo adicional, se removio el medio apical, y se reemplazo el medio basolateral, llevando de esta manera a las celulas al cultivo de interfase aire-Iiquido (ALI). Las celulas se mantuvieron en la ALI durante 6 dias adicionales antes del analisis de transporte de iones.
8.
Para el analisis funcional en las camaras Ussings, se montaron los insertos Snapyvell en Camaras de Difusion Vertical (Costar), y se banaron con solucion de Ringer continuamente gasificada (CO2 al 5% en O2; pH 7,4) mantenida a 370C, conteniendo: NaCl 120 mM, NaHCO3 25 mM, KH2PO4 3,3 mM, K2HPO4 0,8 mM, CaCI2 1,2 mM, MgCl2 1,2 mM, y glucosa 10 mM. Se determino la osmlolaridad de la solucion dentro del intervalo de 280 a 300 mosmoles/kg de H2O. Se sujetaron las celulas al voltaje a 0 mV (modelo EVC4000; WPI). Se midio la resistencia transepitelial (RT) aplicando un pulso de 1 o 2 mV a intervalos de 30 s, o utilizando la diferencia de potencial inicial a traves de las celulas y la corriente inicial medida, y luego se calculo Ia RT mediante Ia ley de Ohm. Se registraron los datos utilizando una estacion de trabajo PowerLab (ADlnstruments). Despues del tratamiento con el ARNi corto, se registraron las caracteristicas basales de las celulas, y la corriente de corto circuito sensible a la amilorida (ISC en seguida de la aplicacion de amilorida 10 !M; lado apical solamente). Se determino la actividad del canal de ENaC en cada cultivo mediante la lSC sensible a la amilorida en cada caso.
9.
En seguida del ensayo, se lisaron las celulas sobre los insertos individuales para el analisis del ARN. Una desactivacion genetica del 75% al nivel del ARN en el momento del ensayo (ND8396, comparado con el control sin direccionamiento) se correlaciono con una desactivacion genetica funcional de la corriente sensible a amilorida de aproximadamente el 30% (ND8396 comparado con el control sin direccionamiento).
Las secuencias de acido nucleico se representan a continuacion utilizando la nomenclatura estandar, y especificamente las abreviaturas de la Tabla A.
Tabla A: Abreviaturas de monomeros de nucleotidos utilizados en la representacion de la secuencia de acido nucleico. Se entendera que estos monomeros, cuando estan presentes en un oligonucleotido, estan mutuamente enlazados por enlaces de fosfodiester 5'-3'.
Abreviatura a
Nucleotido(s)
A
adenosina-5'-fosfato
C
citidina-5'-fosfato
G
guanosina-5'-fosfato
T
2'-desoxi-timidina-5'-fosfato
U
uridina-5'-fosfato
c
2'-0-metilcitidina-5'-fosfato
u
2'-0-metiluridina-5'-fosfato
Ts
2'-desoxi-timidina-5'-fosforotioato
Tabla 1A: ARNi corto seleccionados en el conjunto de cribado inicial (ARNi corto de reactividad cruzada de alfa-ENaC de humano-Rhesus). Se identificaron un total de 152 secuencias de ARNi como un conjunto de cribado inicial, tanto con (cadenas de secuencias 1-304) como sin (cadenas de secuencias 305-608) modificacion de la estructura base. Las secuencias de ARNi se disenaron para ser completamente complementarias para ambas secuencias de alfa-ENaC humana y de mono Rhesus, de acuerdo con los criterios de diseno descritos en la seccion de ejemplos. Se muestra el porcentaje de expresion residual de alfa-ENaC en dos experimentos de transfeccion de una sola dosis independientes (haga referencia a la seccion de ejemplos para verlos metodos empleados).
ID del Duplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1er cribado 50 nM en H441; MV SD 2do cribado 50 nM en H441 SD
ND8285
1 AGcccGuAGcGuGGccuccTsT 2 GGAGGCcACGCuACGGGCUTsT 92% 4% 114% 15%
ND8286
3 ccGGGuAAuGGuGcAcGGGTsT 4 CCCGUGcACcAUuACCCGGTsT 60% 1% 84% 4%
ND8287
5 AuGcuAucGcGAcAGAAcATsT 6 UGUUCUGUCGCGAuAGcAUTsT 27% 2% 35% 3%
ND8288
7 uGcuAucGcGAcAGAAcAATsT 8 UUGUUCUGUCGCGAuAGcATsT 23% 1% 32% 4%
ND8289
9 GcccGuuuAuGuAuGcuccTsT 10 GGAGcAuAcAuAAACGGGCTsT 64% 2% 93% 8%
ND8290
11 GcccGuAGcGuGGccuccATsT 12 UGGAGGCcACGCuACGGGCTsT 83% 2% 115% 5%
ND8291
13 ccGGAAAuuAAAGAGGAGcTsT 14 GCUCCUCUUuAAUUUCCGGTsT 54% 2% 79% 10%
ND8292
15 ccGAAGGuuccGAAGccGATsT 16 UCGGCUUCGGAACCUUCGGTsT 40% 1% 54% 8%
ND8293
17 GcAAuucGGccuGcuuuucTsT 18 GAAAAGcAGGCCGAAUUGCTsT 41% 2% 51% 4%
ND8294
19 GGcGAAuuAcucucAcuucTsT 20 GAAGUGAGAGuAAUUCGCCTsT 19% 1% 25% 5%
ND8295
21 GcGAAuuAcucucAcuuccTsT 22 GGAAGUGAGAGuAAUUCGCTsT 19% 5% 20% 1%
ND8296
23 AAccAGGcGAAuuAcucucTsT 24 GAGAGuAAUUCGCCUGGUUTsT 92% 4% 115% 19%
ND8297
25 GGuAAuGGuGcAcGGGcAGTsT 26 CUGCCCGUGcACcAUuACCTsT 79% 2% 104% 14%
ND8298
27 cucAcGAuGGcccucGGuGTsT 28 cACCGAGGGCcAUCGUGAGTsT 61% 3% 97% 14%
ND8299
29 GcuccGAAGGuuccGAAGCTsT 30 GCUUCGGAACCUUCGGAGCTsT 16% 2% 19% 3%
ND8300
31 GccGAuAcuGGucuccAGGTsT 32 CCUGGAGACcAGuAUCGGCTsT 50% 5% 55% 5%
ND8301
33 ccGAuAcuGGucuccAGGcTsT 34 GCCUGGAGACcAGuAUCGGTsT 53% 2% 65% 6%
ND8302
35 uGcuGuuGcAccAuAcuuuTsT 36 AAAGuAUGGUGcAAcAGcATsT 19% 1% 25% 3%
ID del Duplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1er cribado 50 nM en H441; MV SD 2do cribado 50 nM en H441 SD
ND8303
37 AAcGGucuGucccuGAuGcTsT 38 GcAUcAGGGAcAGACCGUUTsT 90% 3% 96% 11%
ND8304
39 uuAAcuuGcGGccuGGcGuTsT 40 ACGCcAGGCCGcAAGUuAATsT 97% 3% 101% 11%
ND8305
41 GcuGGuuAcucAcGAuGGcTsT 42 GCcAUCGUGAGuAACcAGCTsT 73% 2% 78% 7%
ND8306
43 uuAcucAcGAuGGcccucGTsT 44 CGAGGGCcAUCGUGAGuAATsT 91% 7% 93% 6%
ND8307
45 GAAGccGAuAcuGGucuccTsT 46 GGAGACcAGuAUCGGCUUCTsT 71% 3% 73% 6%
ND6308
47 GAuAcuGGucuccAGGccGTsT 48 CGGCCUGGAGACcAGuAUCTsT 86% 1% 90% 9%
ND8309
49 AuAcuGGucuccAGGccGATsT 50 UCGGCCUGGAGACcAGuAUTsT 71% 5% 70% 8%
ND8310
51 cAAcGGucuGucccuGAuGTsT 52 cAUcAGGGAcAGACCGUUGTsT 80% 2% 84% 9%
ND8311
53 uuuAAcuuGcGGccuGGcGTsT 54 CGCcAGGCCGcAAGUuAAATsT 95% 2% 107% 15%
ND8312
55 uAcucAcGAuGGcccucGGTsT 56 CCGAGGGCcAUCGUGAGuATsT 44% 2% 97% 9%
ND8313
57 uuucGGAGAGuAcuucAGcTsT 58 GCUGAAGuACUCUCCGAAATsT 14% 2% 16% 2%
ND8314
59 GcAGAcGcucuuuGAccuGTsT 60 cAGGUcAAAGAGCGUCUGCTsT 55% 4% 58% 5%
ND8315
61 cuAcAucuucuAuccGcGGTsT 62 CCGCGGAuAGAAGAUGuAGTsT 20% 3% 26% 4%
ND8316
63 AGGcGAAuuAcucucAcuuTsT 64 AAGUGAGAGuAAUUCGCCUTsT 24% 1% 25% 2%
ND8317
65 ccGcuucAAccAGGucuccTsT 66 GGAGACCUGGUUGAAGCGGTsT 62% 5% 64% 4%
ND8318
67 cAAccGcAuGAAGAcGGccTsT 68 GGCCGUCUUcAUGCGGUUGTsT 54% 6% 54% 4%
ND8319
69 AuGAAGAcGGccuucuGGGTsT 70 CCcAGAAGGCCGUCUUcAUTsT 44% 4% 44% 6%
ND8320
71 AGcAcAAccGcAuGAAGAcTsT 72 GUCUUcAUGCGGUUGUGCUTsT 15% 1% 16% 1%
ND8321
73 ucGAGuuccAccGcuccuATsT 74 uAGGAGCGGUGGAACUCGATsT 85% 5% 89% 13%
ND8322
75 cuGcuucuAccAGAcAuAcTsT 76 GuAUGUCUGGuAGAAGcAGTsT 46% 4% 44% 3%
ND8323
77 GAGGGAGuGGuAccGcuucTsT 78 GAAGCGGuACcACUCCCUCTsT 60% 7% 56% 3%
ID del Duplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1er cribado 50 nM en H441; MV SD 2do cribado 50 nM en H441 SD
ND8324
79 ccuuuAuGGAuGAuGGuGGTsT 80 CcACcAUcAUCcAuAAAGGTsT 83% 9% 82% 1%
ND8325
81 uGAGGGAGuGGuAccGcuuTsT 82 AAGCGGuACcACUCCCUcATsT 77% 6% 72% 2%
ND8326
83 ccuGcAAccAGGcGAAuuATsT 84 uAAUUCGCCUGGUUGcAGGTsT 41% 4% 44% 7%
ND8327
85 GGccuGGcGuGGAGAccucTsT 86 GAGGUCUCcACGCcAGGCCTsT 101% 5% 95% 4%
ND8328
87 uGcuuuucGGAGAGuAcuuTsT 88 AAGuACUCUCCGAAAAGcATsT 36% 1% 29% 2%
ND8329
89 cccGuAGcGuGGccuccAGTsT 90 CUGGAGGCcACGCuACGGGTsT 52% 1% 51% 2%
ND8330
91 ccGuAGcGuGGccuccAGcTsT 92 GCUGGAGGCcACGCuACGGTsT 86% 9% 84% 3%
ND8331
93 ccAGGcGAAuuAcucucAcTsT 94 GUGAGAGuAAUUCGCCUGGTsT 15% 2% 13% 1%
ND8332
95 GAAAcuGcuAuAcuuucAATsT 96 UUGAAAGuAuAGcAGUUUCTsT 10% 1% 10% 1%
ND8333
97 GcccGGGuAAuGGuGcAcGTsT 98 CGUGcACcAUuACCCGGGCTsT 83% 6% 82% 4%
ND8334
99 cccGGGuAAuGGuGcAcGGTsT 100 CCGUGcACcAUuACCCGGGTsT 56% 4% 71% 10%
ND8335
101 cGGGuAAuGGuGcAcGGGcTsT 102 GCCCGUGcACcAUuACCCGTsT 42% 3% 91% 8%
ND8336
103 GGGuAAuGGuGcAcGGGcATsT 104 UGCCCGUGcACcAUuACCCTsT 65% 5% 71% 7%
ND8337
105 uAAuGGuGcAcGGGcAGGATsT 106 UCCUGCCCGUGcACcAUuATsT 46% 3% 46% 4%
ND8338
107 cuGGuuAcucAcGAuGGccTsT 108 GGCcAUCGUGAGuAACcAGTsT 74% 5% 79% 10%
ND8339
109 GuuAcucAcGAuGGcccucTsT 110 GAGGGCcAUCGUGAGuAACTsT 85% 6% 92% 8%
ND8340
111 uGucAcGAuGGucAcccucTsT 112 GAGGGUGACcAUCGUGAcATsT 85% 4% 74% 5%
ND8341
113 uGcuccGAAGGuuccGAAGTsT 114 CUUCGGAACCUUCGGAGcATsT 37% 2% 32% 3%
ND8342
115 uccGAAGGuuccGAAGccGTsT 116 CGGCUUCGGAACCUUCGGATsT 60% 4% 47% 5%
ND8343
117 uuccGAAGccGAuAcuGGuTsT 118 ACcAGuAUCGGCUUCGGAATsT 15% 1% 13% 2%
ND8344
119 AGccGAuAcuGGucuccAGTsT 120 CUGGAGACcAGuAUCGGCUTsT 49% 3% 41% 3%
ID del Duplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1er cribado 50 nM en H441; MV SD 2do cribado 50 nM en H441 SD
ND8345
121 cuuGGuAcuGccucuGAAcTsT 122 GUUcAGAGGcAGuACcAAGTsT 55% 2% 47% 4%
ND8346
123 cucccGuAGcAcAcuAuAATsT 124 UuAuAGUGUGCuACGGGAGTsT 67% 3% 57% 5%
ND8347
125 ucccGuAGcAcAcuAuAAcTsT 126 GUuAuAGUGUGCuACGGGATsT 29% 1% 26% 3%
ND8348
127 uGcAccAuAcuuucuuGuATsT 128 uAcAAGAAAGuAUGGUGcATsT 17% 1% 15% 3%
ND8349
129 uuGcccGuuuAuGuAuGcuTsT 130 AGcAuAcAuAAACGGGcAATsT 68% 2% 50% 4%
ND8350
131 uGcccGuuuAuGuAuGcucTsT 132 GAGcAuAcAuAAACGGGcATsT 59% 8% 44% 6%
ND8351
133 GGAcccuAGAccucuGcAGTsT 134 CUGcAGAGGUCuAGGGUCCTsT 86% 11% 82% 2%
ND8352
135 ccuAGAccucuGcAGcccATsT 136 UGGGCUGcAGAGGUCuAGGTsT 69% 7% 79% 3%
ND8353
137 uGGcAuGAuGuAcuGGcAATsT 138 UUGCcAGuAcAUcAUGCcATsT 58% 4% 52% 4%
ND8354
139 uAcuGGcAAuucGGccuGcTsT 140 GcAGGCCGAAUUGCcAGuATsT 101% 4% 100% 4%
ND8355
141 AAuucGGccuGcuuuucGGTsT 142 CCGAAAAGcAGGCCGAAUUTsT 49% 1% 43% 6%
ND8356
143 cuGcuuuucGGAGAGuAcuTsT 144 AGuACUCUCCGAAAAGcAGTsT 17% 3% 16% 1%
ND8357
145 uucGGAGAGuAcuucAGcuTsT 146 AGCUGAAGuACUCUCCGAATsT 13% 3% 16% 2%
ND8358
147 AGcAGAcGcucuuuGAccuTsT 148 AGGUcAAAGAGCGUCUGCUTsT 73% 9% 71% 5%
ND8359
149 cuuGcAGcGccuGAGGGucTsT 150 GACCCUcAGGCGCUGcAAGTsT 57% 9% 64% 7%
ND8360
151 uGGcuuuAAcuuGcGGccuTsT 152 AGGCCGcAAGUuAAAGCcATsT 102% 12% 106% 10%
ND8361
153 GcuuuAAcuuGcGGccuGGTsT 154 CcAGGCCGcAAGUuAAAGCTsT 83% 5% 62% 8%
ND8362
155 uAAcuuGcGGccuGGcGuGTsT 156 cACGCcAGGCCGcAAGUuATsT 119% 2% 115% 6%
ND8363
157 AccuuuAcccuucAAAGuATsT 158 uACUUUGAAGGGuAAAGGUTsT 17% 3% 13% 2%
ND8364
159 GGuuAcucAcGAuGGcccuTsT 160 AGGGCcAUCGUGAGuAACCTsT 104% 9% 117% 17%
ND8365
161 cAcGAuGGcccucGGuGAcTsT 162 GUcACCGAGGGCcAUCGUGTsT 140% 13% 100% 9%
ID del Duplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del primer cribado 50 nM en H441; MV SD 2do cribado 50 nM en H441 SD
ND8366
163 AGAuGcuAucGcGAcAGAATsT 164 UUCUGUCGCGAuAGcAUCUTsT 46% 2% 70% 6%
ND8367
165 AcGAuGGucAcccuccuGuTsT 166 AcAGGAGGGUGACcAUCGUTsT 85% 6% 128% 10%
ND8368
167 cuccGAAGGuuccGAAGccTsT 168 GGCUUCGGAACCUUCGGAGTsT 12% 2% 18% 1%
ND8369
169 AAGGuuccGAAGccGAuAcTsT 170 GuAUCGGCUUCGGAACCUUTsT 63% 7% 114% 19%
ND8370
171 GGuAcuGccucuGAAcAcuTsT 172 AGUGUUcAGAGGcAGuACCTsT 36% 3% 71% 6%
ND8371
173 AGcuuuGAcAAGGAAcuuuTsT 174 AAAGUUCCUUGUcAAAGCUTsT 17% 1% 21% 1%
ND8372
175 uuuGAcAAGGAAcuuuccuTsT 176 AGGAAAGUUCCUUGUcAAATsT 16% 2% 26% 4%
ND8373
177 uGAcAAGGAAcuuuccuAATsT 178 UuAGGAAAGUUCCUUGUcATsT 12% 1% 22% 5%
ND8374
179 cccGuAGcAcAcuAuAAcATsT 180 UGUuAuAGUGUGCuACGGGTsT 41% 2% 75% 3%
ND8375
181 cAcuAuAAcAucuGcuGGATsT 182 UCcAGcAGAUGUuAuAGUGTsT 17% 1% 26% 2%
ND8376
183 uuGcuGuuGcAccAuAcuuTsT 184 AAGuAUGGUGcAAcAGcAATsT 45% 4% 69% 6%
ND8377
185 GuAcuGGcAAuucGGccuGTsT 186 cAGGCCGAAUUGCcAGuACTsT 60% 6% 120% 8%
ND8378
187 uucGGccuGcuuuucGGAGTsT 188 CUCCGAAAAGcAGGCCGAATsT 57% 5% 86% 11%
ND8379
189 ccuGcuuuucGGAGAGuAcTsT 190 GuACUCUCCGAAAAGcAGGTsT 43% 5% 50% 3%
ND8380
191 GcuuuucGGAGAGuAcuucTsT 192 GAAGuACUCUCCGAAAAGCTsT 16% 2% 24% 2%
ND8381
193 cuuuucGGAGAGuAcuucATsT 194 UGAAGuACUCUCCGAAAAGTsT 12% 1% 16% 3%
ND8382
195 cAAccucAAcucGGAcAAGTsT 196 CUUGUCCGAGUUGAGGUUGTsT 33% 2% 39% 3%
ND8383
197 cuAccAGAcAuAcucAucATsT 198 UGAUGAGuAUGUCUGGuAGTsT 13% 1% 23% 6%
ND8384
199 cuGucGAGGcuGccAGAGATsT 200 UCUCUGGcAGCCUCGAcAGTsT 11% 1% 18% 3%
ND8385
201 AAAcuGcuAuAcuuucAAuTsT 202 AUUGAAAGuAuAGCAGUUUTsT 48% 8% 64% 11%
ND8386
203 GGcuuuAAcuuGcGGccuGTsT 204 cAGGCCGcAAGUuAAAGCCTsT 55% 7% 70% 8%
ID del Duplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1er cribado 50 nM en H441; MV SD 2do cribado 50 nM en H441 SD
ND8387
205 cuuuAAcuuGcGGccuGGcTsT 206 GCcAGGCCGcAAGUuAAAGTsT 40% 11% 87% 14%
ND8388
207 AGGuGuGuAuucAcuccuGTsT 208 cAGGAGUGAAuAcAcACCUTsT 45% 3% 41% 5%
ND8389
209 AcGAuGGcccucGGuGAcATsT 210 UGUcACCGAGGGCcAUCGUTsT 43% 2% 60% 9%
ND8390
211 cuGAAcAcucuGGuuucccTsT 212 GGGAAACcAGAGUGUUcAGTsT 33% 2% 48% 11%
ND8391
213 cuAuAAcAucuGcuGGAGuTsT 214 ACUCcAGcAGAUGUuAuAGTsT 16% 1% 17% 4%
ND8392
215 GcAccAuAcuuucuuGuAcTsT 216 GuAcAAGAAAGuAUGGUGCTsT 19% 1% 22% 4%
ND8393
217 uGucuAGcccAucAuccuGTsT 218 cAGGAUGAUGGGCuAGAcATsT 69% 3% 92% 15%
ND8394
219 AGGAcccuAGAccucuGcATsT 220 UGcAGAGGUCuAGGGUCCUTsT 94% 5% 86% 13%
ND8395
221 ccAccGcuccuAccGAGAGTsT 222 CUCUCGGuAGGAGCGGUGGTsT 55% 1% 65% 6%
ND8396
223 uAccGAGAGcucuucGAGuTsT 224 ACUCGAAGAGCUCUCGGuATsT 11% 1% 11% 1%
ND8397
225 AAcAuccuGucGAGGcuGcTsT 226 GcAGCCUCGAcAGGAUGUUTsT 90% 7% 72% 11%
ND8398
227 GAAccuuuAcccuucAAAGTsT 228 CUUUGAAGGGuAAAGGUUCTsT 22% 2% 25% 4%
ND8399
229 GGuuccGAAGccGAuAcuGTsT 230 cAGuAUCGGCUUCGGAACCTsT 93% 9% 89% 9%
ND8400
231 AAGccGAuAcuGGucuccATsT 232 UGGAGACcAGuAUCGGCUUTsT 35% 2% 42% 9%
ND8401
233 ucuAGcccAucAuccuGcuTsT 234 AGcAGGAUGAUGGGCuAGATsT 95% 8% 95% 14%
ND8402
235 cGGcGccAuccGccuGGuGTsT 236 cACcAGGCGGAUGGCGCCGTsT 81% 8% 89% 17%
ND8403
237 uuuucGGAGAGuAcuucAGTsT 238 CUGAAGuACUCUCCGAAAATsT 13% 1% 13% 1%
ND8404
239 GAGAGuAcuucAGcuAcccTsT 240 GGGuAGCUGAAGuACUCUCTsT 71% 3% 100% 10%
ND8405
241 GAcGcucuuuGAccuGuAcTsT 242 GuAcAGGUcAAAGAGCGUCTsT 84% 5% 92% 13%
ND8406
243 uGuGuAuucAcuccuGcuuTsT 244 AAGcAGGAGUGAAuAcAcATsT 78% 2% 89% 8%
ND8407
245 AAcAAcAAGAGAAAuGGAGTsT 246 CUCcAUUUCUCUUGUUGUUTsT 66% 3% 88% 21%
ID del Duplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1er cribado 50 nM en H441; MV SD 2do cribado 50 nM en H441 SD
ND8408
247 AuuGAAGGAuGuGcAGGGcTsT 248 GCCCUGcAcAUCCUUcAAUTsT 25% 1% 36% 6%
ND8409
249 ucucAGAGccGcccAAAcuTsT 250 AGUUUGGGCGGCUCUGAGATsT 18% 1% 24% 2%
ND8410
251 AAAcAcAAccAAGGGuAcATsT 252 UGuACCCUUGGUUGUGUUUTsT 21% 1% 35% 2%
ND8411
253 uAcccGuGcccucAcAGAGTsT 254 CUCUGUGAGGGcACGGGuATsT 57% 2% 67% 4%
ND8412
255 uAGcAcAcuAuAAcAucuGTsT 256 cAGAUGUuAuAGUGUGCuATsT 30% 2% 41% 1%
ND8413
257 GGuGuGuAuucAcuccuGcTsT 258 GcAGGAGUGAAuAcAcACCTsT 73% 1% 90% 9%
ND8414
259 cAuGAucAAGGAGuGuGGcTsT 260 GCcAcACUCCUUGAUcAUGTsT 65% 2% 67% 5%
ND8415
261 AcucAcGAuGGcccucGGuTsT 262 ACCGAGGGCcAUCGUGAGUTsT 96% 6% 95% 6%
ND8416
263 GGAGcuuuGAcAAGGAAcuTsT 264 AGUUCCUUGUcAAAGCUCCTsT 24% 1% 28% 4%
ND8417
265 AuAcccGuGcccucAcAGATsT 266 UCUGUGAGGGcACGGGuAUTsT 54% 1% 62% 2%
ND8418
267 GGAGuGGccAAAGucAAcATsT 268 UGUUGACUUUGGCcACUCCTsT 93% 2% 86% 11%
ND8419
269 AAcuAcAAAAccAAuucuGTsT 270 cAGAAUUGGUUUUGuAGUUTsT 101% 5% 108% 19%
ND8420
271 uGcuGGAGuGuuGcuGuuGTsT 272 cAAcAGcAAcACUCcAGcATsT 29% 1% 26% 1%
ND8421
273 AGGucuccuGcAAccAGGcTsT 274 GCCUGGUUGcAGGAGACCUTsT 95% 10% 91% 17%
ND8422
275 cuuuGGcAuGAuGuAcuGGTsT 276 CcAGUAcAUcAUGCcAAAGTsT 86% 3% 84% 6%
ND8423
277 cAucuGcAcccucAAucccTsT 278 GGGAUUGAGGGUGcAGAUGTsT 82% 11% 73% 4%
ND8424
279 cGAcuGcAccAAGAAuGGcTsT 280 GCcAUUCUUGGUGcAGUCGTsT 70% 8% 69% 7%
ND8425
281 AAAAcAcAAccAAGGGuAcTsT 282 GuACCCUUGGUUGUGUUUUTsT 95% 6% 106% 12%
ND8426
283 cAucuGcuGGAGuGuuGcuTsT 284 AGcAAcACUCcAGcAGAUGTsT 30% 2% 37% 1%
ND8427
285 ccuAcAucuucuAuccGcGTsT 286 CGCGGAuAGAAGAUGuAGGTsT 42% 6% 30% 1%
ND8428
287 GccuAcAucuucuAuccGcTsT 288 GCGGAuAGAAGAUGuAGGCTsT 65% 7% 54% 3%
ID del Duplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1er cribado 50 nM en H441; MV SD 2do cribadon 50 nM en H441 SD
ND8429
289 GAGuGGuAccGcuuccAcuTsT 290 AGUGGAAGCGGuACcACUCTsT 95% 11% 86% 19%
ND8430
291 GGuAccGcuuccAcuAcAuTsT 292 AUGuAGUGGAAGCGGuACCTsT 111% 19% 96% 14%
ND8431
293 GuGGuAccGcuuccAcuAcTsT 294 GuAGUGGAAGCGGuACcACTsT 98% 13% 52% 26%
ND8432
295 GAAuuAcucucAcuuccAcTsT 296 GUGGAAGUGAGAGuAAUUCTsT 111% 21% 73% 27%
ND8433
297 AAuuAcucucAcuuccAccTsT 298 GGUGGAAGUGAGAGuAAUUTsT 109% 22% 105% 7%
ND8434
299 uAcucucAcuuccAccAccTsT 300 GGUGGUGGAAGUGAGAGuATsT 106% 23% 95% 7%
ND8435
301 AGuGGuAccGcuuccAcuATsT 302 uAGUGGAAGCGGuACcACUTsT 109% 18% 102% 9%
ND8436
303 GGGcAAcuucAucuucGccTsT 304 GGCGAAGAUGAAGUUGCCCTsT 109% 18% 107% 14%
ND-8501
305 AGCCCGUAGCGUGGCCUCCTsT 306 GGAGGCCACGCUACGGGCUTsT 84% 14% 69% 3%
ND-8502
307 CCGGGUAAUGGUGCACGGGTsT 308 CCCGUGCACCAUUACCCGGTsT 41% 6% 30% 2%
ND-8503
309 AUGCUAUCGCGACAGAACATsT 310 UGUUCUGUCGCGAUAGCAUTsT 11% 2% 10% 2%
ND-8504
311 UGCUAUCGCGACAGAACAATsT 312 UUGUUCUGUCGCGAUAGCATsT 15% 2% 10% 0%
ND-8505
313 GCCCGUUUAUGUAUGCUCCTsT 314 GGAGCAUACAUAAACGGGCTsT 23% 3% 16% 1%
ND-8506
315 GCCCGUAGCGUGGCCUCCATsT 316 UGGAGGCCACGCUACGGGCTsT 32% 3% 22% 1%
ND-8507
317 CCGGAAAUUAAAGAGGAGCTsT 318 GCUCCUCUUUAAUUUCCGGTsT 35% 4% 24% 1%
ND-8508
319 CCGAAGGUUCCGAAGCCGATsT 320 UCGGCUUCGGAACCUUCGGTsT 19% 2% 13% 1%
ND-8509
321 GCAAUUCGGCCUGCUUUUCTsT 322 GAAAAGCAGGCCGAAUUGCTsT 12% 1% 8% 1%
ND-8510
323 GGCGAAUUACUCUCACUUCTsT 324 GAAGUGAGAGUAAUUCGCCTsT 21% 2% 18% 1%
ND-8511
325 GCGAAUUACUCUCACUUCCTsT 326 GGAAGUGAGAGUAAUUCGCTsT 12% 2% 8% 1%
ND-8512
327 AACCAGGCGAAUUACUCUCTsT 328 GAGAGUAAUUCGCCUGGUUTsT 99% 11% 79% 5%
ND-8513
329 GGUAAUGGUGCACGGGCAGTsT 330 CUGCCCGUGCACCAUUACCTsT 61% 6% 42% 4%
ID del Duplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1er cribado 50 nM en H441; MV SD 2do cribado 50 nM en H441 SD
ND-8514
331 CUCACGAUGGCCCUCGGUGTsT 332 CACCGAGGGCCAUCGUGAGTsT 94% 11% 70% 4%
ND-8515
333 GCUCCGAAGGUUCCGAAGCTsT 334 GCUUCGGAACCUUCGGAGCTsT 18% 2% 17% 2%
ND-8516
335 GCCGAUACUGGUCUCCAGGTsT 336 CCUGGAGACCAGUAUCGGCTsT 14% 1% 12% 1%
ND-8517
337 CCGAUACUGGUCUCCAGGCTsT 338 GCCUGGAGACCAGUAUCGGTsT 42% 5% 33% 2%
ND-8518
339 UGCUGUUGCACCAUACUUUTsT 340 AAAGUAUGGUGCAACAGCATsT 10% 1% 9% 0%
ND-8519
341 AACGGUCUGUCCCUGAUGCTsT 342 GCAUCAGGGACAGACCGUUTsT 60% 7% 52% 8%
ND-8520
343 UUAACUUGCGGCCUGGCGUTsT 344 ACGCCAGGCCGCAAGUUAATsT 82% 25% 77% 18%
ND-8521
345 GCUGGUUACUCACGAUGGCTsT 346 GCCAUCGUGAGUAACCAGCTsT 36% 4% 34% 7%
ND-8522
347 UUACUCACGAUGGCCCUCGTsT 348 CGAGGGCCAUCGUGAGUAATsT 105% 21% 113% 21%
ND-8523
349 GAAGCCGAUACUGGUCUCCTsT 350 GGAGACCAGUAUCGGCUUCTsT 24% 2% 18% 2%
ND-8524
351 GAUACUGGUCUCCAGGCCGTsT 352 CGGCCUGGAGACCAGUAUCTsT 30% 5% 25% 3%
ND-8525
353 AUACUGGUCUCCAGGCCGATsT 354 UCGGCCUGGAGACCAGUAUTsT 12% 1% 11% 2%
ND-8526
355 CAACGGLJCUGUCCCUGAUGTsT 356 CAUCAGGGACAGACCGUUGTsT 24% 7% 24% 2%
ND-8527
357 UUUAACUUGCGGCCUGGCGTsT 358 CGCCAGGCCGCAAGUUAAATsT 122% 6% 107% 9%
ND-8528
359 UACUCACGAUGGCCCUCGGTsT 360 CCGAGGGCCAUCGUGAGUATsT 78% 6% 84% 7%
ND-8529
361 UUUCGGAGAGUACUUCAGCTsT 362 GCUGAAGUACUCUCCGAAATsT 87% 18% 80% 17%
ND-8530
363 GCAGACGCUCUUUGACCUGTsT 364 CAGGUCAAAGAGCGUCUGCTsT 14% 2% 13% 0%
ND-8531
365 CUACAUCUUCUAUCCGCGGTsT 366 CCGCGGAUAGAAGAUGUAGTsT 20% 4% 18% 3%
ND-8532
367 AGGCGAAUUACUCUCACUUTsT 368 AAGUGAGAGUAAUUCGCCUTsT 25% 5% 18% 1%
ND-8533
369 CCGCUUCAACCAGGUCUCCTsT 370 GGAGACCUGGUUGAAGCGGTsT 30% 11% 22% 2%
ND-8534
371 CAACCGCAUGAAGACGGCCTsT 372 GGCCGUCUUCAUGCGGUUGTsT 33% 4% 23% 1%
ID del Duplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1er cribado 50 nM en H441; MV SD 2do cribado 50 nM en H441 SD
ND-8535
373 AUCAAGACGGCCUUCUGGGTsT 374 CCCAGAAGGCCGUCUUCAUTsT 114% 12% 84% 15%
ND-8536
375 AGCACAACCGCAUGAAGACTsT 376 GUCUUCAUGCGGUUGUGCUTsT 18% 1% 16% 3%
ND-8537
377 UCGAGUUCCACCGCUCCUATsT 378 UAGGAGCGGUGGAACUCGATsT 25% 0% 26% 3%
ND-8538
379 CUGCUUCUACCAGACAUACTsT 380 GUAUGUCUGGUAGAAGCAGTsT 12% 1% 13% 2%
ND-8539
381 GAGGGAGUGGUACCGCUUCTsT 382 GAAGCGGUACCACUCCCUCTsT 43% 1% 47% 14%
ND-8540
383 CCUUUAUGGAUGAUGGUGGTsT 384 CCACCAUCAUCCAUAAAGGTsT 61% 5% 60% 8%
ND-8541
385 UGAGGGAGUGGUACCGCUUTsT 386 AAGCGGUACCACUCCCUCATsT 36% 5% 35% 5%
ND-8542
387 CCUGCAACCAGGCGAAUUATsT 388 UAAUUCGCCUGGUUGCAGGTsT 19% 2% 16% 1%
ND-8543
389 GGCCUGGCGUGGAGACCUCTsT 390 GAGGUCUCCACGCCAGGCCTsT 28% 7% 20% 2%
ND-8544
391 UGCUUUUCGGAGAGUACUUTsT 392 AAGUACUCUCCGAAAAGCATsT 22% 5% 17% 1%
ND-8545
393 CCCGUAGCGUGGCCUCCAGTsT 394 CUGGAGGCCACGCUACGGGTsT 25% 3% 22% 2%
ND-8546
395 CCGUAGCGUGGCCUCCAGCTsT 396 GCUGGAGGCCACGCUACGGTsT 62% 5% 57% 9%
ND-8547
397 CCAGGCGAAUUACUCUCACTsT 398 GUGAGAGUAAUUCGCCUGGTsT 23% 11% 16% 2%
ND-8548
399 GAAACUGCUAUACUUUCAATsT 400 UUGAAAGUAUAGCAGUUUCTsT 9% 3% 3% 0%
ND-8549
401 GCCCGGGUAAUGGUGCACGTsT 402 CGUGCACCAUUACCCGGGCTsT 87% 9% 92% 14%
ND-8550
403 CCCGGGUAAUGGUGCACGGTsT 404 CCGUGCACCAUUACCCGGGTsT 19% 12% 14% 1%
ND-8551
405 CGGGUAAUGGUGCACGGGCTsT 406 GCCCGUGCACCAUUACCCGTsT 68% 11% 73% 3%
ND-8552
407 GGGUAAUGGUGCACGGGCATsT 408 UGCCCGUGCACCAUUACCCTsT 30% 6% 33% 2%
ND-8553
409 UAAUGGUGCACGGGCAGGATsT 410 UCCUGCCCGUGCACCAUUATsT 29% 3% 31% 1%
ND-8554
411 CUGGUUACUCACGAUGGCCTsT 412 GGCCAUCGUGAGUAACCAGTsT 74% 15% 66% 8%
ND-8555
413 GUUACUCACGAUGGCCCUCTsT 414 GAGGGCCAUCGUGAGUAACTsT 91% 21% 88% 10%
ID del Duplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1er cribado 50 nM en H441; MV SD 2do cribado 50 nM en H441 SD
ND-8556
415 UGUCACGAUGGUCACCCUCTsT 416 GAGGGUGACCAUCGUGACATsT 72% 4% 76% 12%
ND-8557
417 UGCUCCGAAGGUUCCGAAGTsT 418 CUUCGGAACCUUCGGAGCATsT 51% 2% 59% 18%
ND-8558
419 UCCGAAGGUUCCGAAGCCGTsT 420 CGGCUUCGGAACCUUCGGATsT 109% 11% 77% 13%
ND-8559
421 UUCCGAAGCCGAUACUGGUTsT 422 ACCAGUAUCGGCUUCGGAATsT 46% 20% 33% 6%
ND-8560
423 AGCCGAUACUGGUCUCCAGTsT 424 CUGGAGACCAGUAUCGGCUTsT 15% 6% 10% 1%
ND-8561
425 CUUGGUACUGCCUCUGAACTsT 426 GUUCAGAGGCAGUACCAAGTsT 16% 3% 12% 3%
ND-8562
427 CUCCCGUAGCACACUAUAATsT 428 UUAUAGUGUGCUACGGGAGTsT 14% 6% 10% 1%
ND-8563
429 UCCCGUAGCACACUAUAACTsT 430 GUUAUAGUGUGCUACGGGATsT 43% 11% 36% 4%
ND-8564
431 UGCACCAUACUUUCUUGUATsT 432 UACAAGAAAGUAUGGUGCATsT 17% 6% 13% 3%
ND-8565
433 UUGCCCGUUUAUGUAUGCUTsT 434 AGCAUACAUAAACGGGCAATsT 84% 2% 103% 12%
ND-8566
435 UGCCCGUUUAUGUAUGCUCTsT 436 GAGCAUACAUAAACGGGCATsT 69% 25% 93% 4%
ND-8567
437 GGACCCUAGACCUCUGCAGTsT 438 CUGCAGAGGUCUAGGGUCCTsT 29% 8% 33% 2%
ND-8568
439 CCUAGACCUCUGCAGCCCATsT 440 UGGGCUGCAGAGGUCUAGGTsT 18% 2% 19% 1%
ND-8569
441 UGGCAUGAUGUACUGGCAATsT 442 UUGCCAGUACAUCAUGCCATsT 19% 3% 20% 5%
ND-8570
443 UACUGGCAAUUCGGCCUGCTsT 444 GCAGGCCGAAUUGCCAGUATsT 86% 15% 83% 16%
ND-8571
445 AAUUCGGCCUGCUUUUCGGTsT 446 CCGAAAAGCAGGCCGAAUUTsT 19% 3% 24% 4%
ND-8572
447 CUGCUUUUCGGAGAGUACUTsT 448 AGUACUCUCCGAAAAGCAGTsT 8% 2% 12% 2%
ND-8573
449 UUCGGAGAGUACUUCAGCUTsT 450 AGCUGAAGUACUCUCCGAATsT 27% 3% 40% 5%
ND-8574
451 AGCAGACGCUCUUUGACCUTsT 452 AGGUCAAAGAGCGUCUGCUTsT 15% 0% 19% 4%
ND-8575
453 CUUGCAGCGCCUGAGGGUCTsT 454 GACCCUCAGGCGCUGCAAGTsT 35% 1% 40% 4%
ND-8576
455 UGGCUUUAACUUGCGGCCUTsT 456 AGGCCGCAAGUUAAAGCCATsT 47% 3% 53% 8%
ID del Duplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1er cribado 50 nM en H441; MV SD 2do cribado 50 nM en H441 SD
ND-8577
457 GCUUUAACUUGCGGCCUGGTsT 458 CCAGGCCGCAAGUUAAAGCTsT 20% 2% 25% 5%
ND-8578
459 UAACUUGCGGCCUGGCGUGTsT 460 CACGCCAGGCCGCAAGUUATsT 75% 7% 82% 4%
ND-8579
461 ACCUUUACCCUUCAAAGUATsT 462 UACUUUGAAGGGUAAAGGUTsT 14% 2% 17% 3%
ND-8580
463 GGUUACUCACGAUGGCCCUTsT 464 AGGGCCAUCGUGAGUAACCTsT 63% 5% 70% 11%
ND-8581
465 CACGAUGGCCCUCGGUGACTsT 466 GUCACCGAGGGCCAUCGUGTsT 56% 2% 50% 5%
ND-8582
467 AGAUGCUAUCGCGACAGAATsT 468 UUCUGUCGCGAUAGCAUCUTsT 18% 1% 18% 1%
ND-8583
469 ACGAUGGUCACCCUCCUGUTsT 470 ACAGGAGGGUGACCAUCGUTsT 48% 3% 52% 6%
ND-8584
471 CUCCGAAGGUUCCGAAGCCTsT 472 GGCUUCGGAACCUUCGGAGTsT 18% 2% 20% 5%
ND-8585
473 AAGGUUCCGAAGCCGAUACTsT 474 GUAUCGGCUUCGGAACCUUTsT 26% 2% 28% 1%
ND-8586
475 GGUACUGCCUCUGAACACUTsT 476 AGUGUUCAGAGGCAGUACCTsT 12% 1% 12% 1%
ND-8587
477 AGCUUUGACAAGGAACUUUTsT 478 AAAGUUCCUUGUCAAAGCUTsT 17% 2% 18% 2%
ND-8588
479 UUUGACAAGGAACUUUCCUTsT 480 AGGAAAGUUCCUUGUCAAATsT 78% 5% 73% 2%
ND-8589
481 UGACAAGGAACUUUCCUAATsT 482 UUAGGAAAGUUCCUUGUCATsT 14% 1% 16% 1%
ND-8590
483 CCCGUAGCACACUAUAACATsT 484 UGUUAUAGUGUGCUACGGGTsT 9% 1% 11% 2%
ND-8591
485 CACUAUAACAUCUGCUGGATsT 486 UCCAGCAGAUGUUAUAGUGTsT 18% 2% 20% 2%
ND-8592
487 UUGCUGUUGCACCAUACUUTsT 488 AAGUAUGGUGCAACAGCAATsT 23% 2% 25% 8%
ND-8593
489 GUACUGGCAAUUCGGCCUGTsT 490 CAGGCCGAAUUGCCAGUACTsT 66% 3% 62% 4%
ND-8594
491 UUCGGCCUGCUUUUCGGAGTsT 492 CUCCGAAAAGCAGGCCGAATsT 97% 7% 86% 8%
ND-8595
493 CCUGCUUUUCGGAGAGUACTsT 494 GUACUCUCCGAAAAGCAGGTsT 11% 2% 14% 3%
ND-8596
495 GCUUUUCGGAGAGUACUUCTsT 496 GAAGUACUCUCCGAAAAGCTsT 12% 1% 17% 2%
ND-8597
497 CUUUUCGGAGAGUACUUCATsT 498 UGAAGUACUCUCCGAAAAGTsT 11% 1% 14% 2%
ID del Duplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del primer cribado 50 nM en H441; MV SD 2do cribado 50 nM en H441 SD
ND-8598
499 CAACCUCAACUCGGACAAGTsT 500 CUUGUCCGAGUUGAGGUUGTsT 15% 2% 16% 2%
ND-8599
501 CUACCAGACAUACUCAUCATsT 502 UGAUGAGUAUGUCUGGUAGTsT 17% 1% 18% 2%
ND-8600
503 CUGUCGAGGCUGCCAGAGATsT 504 UCUCUGGCAGCCUCGACAGTsT 17% 0% 16% 1%
ND-8601
505 AAACUGCUAUACUUUCAAUTsT 506 AUUGAAAGUAUAGCAGUUUTsT 28% 1% 26% 1%
ND-8602
507 GGCUUUAACUUGCGGCCUGTsT 508 CAGGCCGCAAGUUAAAGCCTsT 21% 2% 18% 1%
ND-8603
509 CUUUAACUUGCGGCCUGGCTsT 510 GCCAGGCCGCAAGUUAAAGTsT 81% 2% 69% 6%
ND-8604
511 AGGUGUGUAUUCACUCCUGTsT 512 CAGGAGUGAAUACACACCUTsT 47% 4% 40% 1%
ND-8605
513 ACGAUGGCCCUCGGUGACATsT 514 UGUCACCGAGGGCCAUCGUTsT 40% 6% 35% 2%
ND-8606
515 CUGAACACUCUGGUUUCCCTsT 516 GGGAAACCAGAGUGUUCAGTsT 60% 2% 75% 4%
ND-8607
517 CUAUAACAUCUGCUGGAGUTsT 518 ACUCCAGCAGAUGUUAUAGTsT 17% 1% 24% 3%
ND-8608
519 GCACCAUACUUUCUUGUACTsT 520 GUACAAGAAAGUAUGGUGCTsT 10% 1% 15% 3%
ND-8609
521 UGUCUAGCCCAUCAUCCUGTsT 522 CAGGAUGAUGGGCUAGACATsT 62% 2% 75% 12%
ND-8610
523 AGGACCCUAGACCUCUGCATsT 524 UGCAGAGGUCUAGGGUCCUTsT 61% 5% 73% 10%
ND-8611
525 CCACCGCUCCUACCGAGAGTsT 526 CUCUCGGUAGGAGCGGUGGTsT 21% 2% 29% 5%
ND-8612
527 UACCGAGAGCUCUUCGAGUTsT 528 ACUCGAAGAGCUCUCGGUATsT 13% 1% 22% 3%
ND-8613
529 AACAUCCUGUCGAGGCUGCTsT 530 GCAGCCUCGACAGGAUGUUTsT 57% 2% 70% 4%
ND-8614
531 GAACCUUUACCCUUCAAAGTsT 532 CUUUGAAGGGUAAAGGUUCTsT 13% 3% 16% 2%
ND-8615
533 GGUUCCGAAGCCGAUACUGTsT 534 CAGUAUCGGCUUCGGAACCTsT 18% 1% 24% 2%
ND-8616
535 AAGCCGAUACUGGUCUCCATsT 536 UGGAGACCAGUAUCGGCUUTsT 19% 1% 25% 2%
ND-8617
537 UCUAGCCCAUCAUCCUGCUTsT 538 AGCAGGAUGAUGGGCUAGATsT 93% 3% 101% 3%
ND-8618
539 CGGCGCCAUCCGCCUGGUGTsT 540 CACCAGGCGGAUGGCGCCGTsT 85% 4% 99% 4%
ID del Duplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del primer cribado 50 nM en H441; MV SD 2do cribado 50 nM en H441 SD
ND-8619
541 UUUUCGGAGAGUACUUCAGTsT 542 CUGAAGUACUCUCCGAAAATsT 63% 2% 77% 3%
ND-8620
543 GAGAGUACUUCAGCUACCCTsT 544 GGGUAGCUGAAGUACUCUCTsT 26% 1% 30% 4%
ND-8621
545 GACGCUCUUUGACCUGUACTsT 546 GUACAGGUCAAAGAGCGUCTsT 17% 2% 19% 3%
ND-8622
547 UGUGUAUUCACUCCUGCUUTsT 548 AAGCAGGAGUGAAUACACATsT 49% 3% 58% 11%
ND-8623
549 AACAACAAGAGAAAUGGAGTsT 550 CUCCAUUUCUCUUGUUGUUTsT 74% 7% 70% 4%
ND-8624
551 AUUGAAGGAUGUGCAGGGCTsT 552 GCCCUGCACAUCCUUCAAUTsT 85% 6% 87% 12%
ND-8625
553 UCUCAGAGCCGCCCAAACUTsT 554 AGUUUGGGCGGCUCUGAGATsT 53% 3% 51% 6%
ND-8626
555 AAACACAACCAAGGGUACATsT 556 UGUACCCUUGGUUGUGUUUTsT 17% 2% 18% 2%
ND-8627
557 UACCCGUGCCCUCACAGAGTsT 558 CUCUGUGAGGGCACGGGUATsT 58% 3% 55% 3%
ND-8628
559 UAGCACACUAUAACAUCUGTsT 560 CAGAUGUUAUAGUGUGCUATsT 64% 3% 64% 15%
ND-8629
561 GGUGUGUAUUCACUCCUGCTsT 562 GCAGGAGUGAAUACACACCTsT 25% 3% 23% 2%
ND-8630
563 CAUGAUCAAGGAGUGUGGCTsT 564 GCCACACUCCUUGAUCAUGTsT 32% 2% 28% 2%
ND-8631
565 ACUCACGAUGGCCCUCGGUTsT 566 ACCGAGGGCCAUCGUGAGUTsT 96% 1% 88% 4%
ND-8632
567 GGAGCUUUGACAAGGAACUTsT 568 AGUUCCUUGUCAAAGCUCCTsT 14% 1% 14% 2%
ND-8633
569 AUACCCGUGCCCUCACAGATsT 570 UCUGUGAGGGCACGGGUAUTsT 21% 2% 16% 1%
ND-8634
571 GGAGUGGCCAAAGUCAACATsT 572 UGUUGACUUUGGCCACUCCTsT 21% 3% 16% 1%
ND-8635
573 AACUACAAAACCAAUUCUGTsT 574 CAGAAUUGGUUUUGUAGUUTsT 49% 5% 37% 3%
ND-8636
575 UGCUGGAGUGUUGCUGUUGTsT 576 CAACAGCAACACUCCAGCATsT 27% 3% 21% 2%
ND-8637
577 AGGUCUCCUGCAACCAGGCTsT 578 GCCUGGUUGCAGGAGACCUTsT 62% 8% 61% 4%
ND-8638
579 CUUUGGCAUGAUGUACUGGTsT 580 CCAGUACAUCAUGCCAAAGTsT 66% 6% 52% 8%
ND-8639
581 CAUCUGCACCCUCAAUCCCTsT 582 GGGAUUGAGGGUGCAGAUGTsT 50% 7% 40% 4%
ID del Duplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1er cribado 50 nM en H441; MV SD 2do cribado 50 nM en H441 SD
ND-8640
583 CGACUGCACCAAGAAUGGCTsT 584 GCCAUUCUUGGUGCAGUCGTsT 67% 6% 54% 5%
ND-8641
585 AAAACACAACCAAGGGUACTsT 586 GUACCCUUGGUUGUGUUUUTsT 14% 2% 14% 1%
ND-8642
587 CAUCUGCUGGAGUGUUGCUTsT 588 AGCAACACUCCAGCAGAUGTsT 13% 2% 13% 1%
ND-8643
589 CCUACAUCUUCUAUCCGCGTsT 590 CGCGGAUAGAAGAUGUAGGTsT 15% 4% 13% 0%
ND-8644
591 GCCUACAUCUUCUAUCCGCTsT 592 GCGGAUAGAAGAUGUAGGCTsT 14% 3% 11% 1%
ND-8645
593 GAGUGGUACCGCUUCCACUTsT 594 AGUGGAAGCGGUACCACUCTsT 16% 0% 20% 1%
ND-8646
595 GGUACCGCUUCCACUACAUTsT 596 AUGUAGUGGAAGCGGUACCTs 12% 0% 14% 1%
ND-8647
597 GUGGUACCGCUUCCACUACTsT 598 GUAGUGGAAGCGGUACCACTsT 42% 4% 44% 3%
ND-8648
599 GAAUUACUCUCACUUCCACTsT 600 GUGGAAGUGAGAGUAAUUCTsT 10% 1% 11% 3%
ND-8649
601 AAUUACUCUCACUUCCACCTsT 602 GGUGGAAGUGAGAGUAAUUTsT 105% 10% 102% 8%
ND-8650
603 UACUCUCACUUCCACCACCTsT 604 GGUGGUGGAAGUGAGAGUATsT 55% 6% 54% 8%
ND-8651
605 AGUGGUACCGCUUCCACUATsT 606 UAGUGGAAGCGGUACCACUTsT 57% 6% 59% 12%
ND-8652
607 GGGCAACUUCAUCUUCGCCTsT 608 GGCGAAGAUGAAGUUGCCCTsT 47% 12% 36% 7%
� l 1�� RN � o o�sele o os�e �el� o j o� e� o�e e o� RN � o o� m os�sol me e .�Se e o �344�se e s� e� RN o les� se
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�e los�los�m� o os�emple os .
ID del Duplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1er cribado 50 nM en H441; MV SD
ND10445
609 CUGCGGCUAAGUCUCUUUUTsT 610 AAAAGAGACUUAGCCGCAGTsT 94% 8%
ND10446
611 AUCGCGACAGAACAAUUACTsT 612 GUAAUUGUUCUGUCGCGAUTsT 13% 2%
ND10447
613 UCGCGACAGAACAAUUACATsT 614 UGUAAUUGUUCUGUCGCGATsT 18% 1%
ND10448
615 CCCGUUUAUGUAUGCUCCATsT 616 UGGAGCAUACAUAAACGGGTsT 41% 1%
ND10449
617 CCCGGGUAAGUAAAGGCAGTsT 618 CUGCCUUUACUUACCCGGGTsT 23% 1%
ND10450
619 GGUACCCGGAAAUUAAAGATsT 620 UCUUUAAUUUCCGGGUACCTsT 14% 2%
ND10451
621 GCUAUCGCGACAGAACAAUTsT 622 AUUGUUCUGUCGCGAUAGCTsT 24% 2%
ND10452
623 UAUCGCGACAGAACAAUUATsT 624 UAAUUGUUCUGUCGCGAUATsT 12% 1%
ND10453
625 UGCGGCUAAGUCUCUUUUUTsT 626 AAAAAGAGACUUAGCCGCATsT 46% 3%
ND10454
627 GGCGAUUAUGGCGACUGCATsT 628 UGCAGUCGCCAUAAUCGCCTsT 14% 0%
ND10455
629 AUGUCUAGCCCAUCAUCCUTsT 630 AGGAUGAUGGGCUAGACAUTsT 12% 2%
ID de Duplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1er cribado 50 nM en H441; MV SD
ND10456
631 CUACAGGUACCCGGAAAUUTsT 632 AAUUUCCGGGUACCUGUAGTsT 28% 2%
ND10457
633 CCGUCGAGCCCGUAGCGUGTsT 634 CACGCUACGGGCUCGACGGTsT 27% 3%
ND10458
635 CGCGACAGAACAAUUACACTsT 636 GUGUAAUUGUUCUGUCGCGTsT 39% 7%
ND10459
637 AGGUACCCGGAAAUUAAAGTsT 638 CUUUAAUUUCCGGGUACCUTsT 30% 3%
ND10460
639 CAUGCACGGGUUUCCUGCCTsT 640 GGCAGGAAACCCGUGCAUGTsT 95% 6%
ND10461
641 AGCUUGCGGGACAACAACCTsT 642 GGUUGUUGUCCCGCAAGCUTsT 94% 8%
ND10462
643 ACUGCGGCUAAGUCUCUUUTsT 644 AAAGAGACUUAGCCGCAGUTsT 13% 2%
ND10463
645 CAUCCCUUAGAACCCUGCUTsT 646 AGCAGGGUUCUAAGGGAUGTsT 18% 1%
ND10464
647 ACCCGGGUAAGUAAAGGCATsT 648 UGCCUUUACUUACCCGGGUTsT 41% 1%
ND10465
649 GAUUAUGGCGACUGCACCATsT 650 UGGUGCAGUCGCCAUAAUCTsT 23% 1%
ND10466
651 CUCGGACAAGCUCGUCUUCTsT 652 GAAGACGAGCUUGUCCGAGTsT 14% 2%
ND10467
653 GCGAUUAUGGCGACUGCACTsT 654 GUGCAGUCGCCAUAAUCGCTsT 24% 2%
ID de Duplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1er cribado 50 nM en H441; MV SD
ND10468
655 AAUUACACCGUCAACAACATsT 656 UGUUGUUGACGGUGUAAUUTsT 12% 1%
ND10469
657 AACUGCCGUUGAUGUGUGGTsT 658 CCACACAUCAACGGCAGUUTsT 46% 3%
ND10470
659 AACUGCGGCUAAGUCUCUUTsT 660 AAGAGACUUAGCCGCAGUUTsT 14% 0%
ND10471
661 CCGCUGAUAACCAGGACAATsT 662 UUGUCCUGGUUAUCAGCGGTsT 12% 2%
ND10472
663 AAGGGUACACGCAGGCAUGTsT 664 CAUGCCUGCGUGUACCCUUTsT 28% 2%
ND10473
665 CCGGGUAAGUAAAGGCAGATsT 666 UCUGCCUUUACUUACCCGGTsT 27% 3%
ND10474
667 CCCAUACCAGGUCUCAUGGTsT 668 CCAUGAGACCUGGUAUGGGTsT 39% 7%
ND10475
669 AUUAUGGCGACUGCACCAATsT 670 UUGGUGCAGUCGCCAUAAUTsT 30% 3%
ND10476
671 AUGCACGGGUUUCCUGCCCTsT 672 GGGCAGGAAACCCGUGCAUTsT 95% 6%
ND10477
673 CUAGCCCUCCACAGUCCACTsT 674 GUGGACUGUGGAGGGCUAGTsT 43% 7%
ND10478
675 CAGGUACCCGGAAAUUAAATsT 676 UUUAAUUUCCGGGUACCUGTsT 11% 1%
ND10479
677 AAUACAGCUCCUUCACCACTsT 678 GUGGUGAAGGAGCUGUAUUTsT 30% 3%
���������������
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unicadel 1ercribado 50 nM en H441;MV SD
ND10480
679 CACGGGUUUCCUGCCCAGCTsT 680 GCUGGGCAGGAAACCCGUGTsT 19% 1%
ND10481
681 GGACUGAAUCUUGCCCGUUTsT 682 AACGGGCAAGAUUCAGUCCTsT 14% 2%
ND10482
683 CGUUUAUGUAUGCUCCAUGTsT 684 CAUGGAGCAUACAUAAACGTsT 15% 1%
ND10483
685 GGGUACUGCUACUAUAAGCTsT 686 GCUUAUAGUAGCAGUACCCTsT 11% 0%
ND10484
687 UCGGUGUUGUCUGUGGUGGTsT 688 CCACCACAGACAACACCGATsT 65% 5%
ND10485
689 AAACUGCCGUUGAUGUGUGTsT 690 CACACAUCAACGGCAGUUUTsT 73% 6%
ND10486
691 GCGAAACUUGGAGCUUUGATsT 692 UCAAAGCUCCAAGUUUCGCTsT 8% 1%
ND10487
693 GGCCCGUCGAGCCCGUAGCTsT 694 GCUACGGGCUCGACGGGCCTsT 26% 3%
ND10488
695 GCGACAGAACAAUUACACCTsT 696 GGUGUAAUUGUUCUGUCGCTsT 10% 2%
ND10489
697 GCGACGGCUUAAGCCAGCCTsT 698 GGCUGGCUUAAGCCGUCGCTsT 50% 1%
ND10490
699 GACCCGGGUAAGUAAAGGCTsT 700 GCCUUUACUUACCCGGGUCTsT 74% 1%
ND10491
701 UUGAUCAGUCCGCCUUCUCTsT 702 GAGAAGGCGGAGUGAUCAATsT 80% 7%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica delprimer cribado50 nM enH441; MV SD
ND10492
703 UCUAGCCCUCCACAGUCCATsT 704 UGGACUGUGGAGGGCUAGATsT 69% 4%
ND10493
705 GUUUCACCAAGUGCCGGAATsT 706 UUCCGGCACUUGGUGAAACTsT 23% 3%
ND10494
707 CUCAACUCGGACAAGCUCGTsT 708 CGAGCUUGUCCGAGUUGAGTsT 45% 6%
ND10495
709 CAACUCGGACAAGCUCGUCTsT 710 GACGAGCUUGUCCGAGUUGTsT 23% 3%
ND10496
711 ACCCGGAAAUUAAAGAGGATsT 712 UCCUCUUUAAUUUCCGGGUTsT 13% 2%
ND10497
713 CCCGGAAAUUAAAGAGGAGTsT 714 CUCCUCUUUAAUUUCCGGGTsT 19% 1%
ND10498
715 CACCACUCUCGUGGCCGGCTsT 716 GCCGGCCACGAGAGUGGUGTsT 94% 11%
ND10499
717 CGUCGAGCCCGUAGCGUGGTsT 718 CCACGCUACGGGCUCGACGTsT 13% 1%
ND10500
719 GCUUGCGGGACAACAACCCTsT 720 GGGUUGUUGUCCCGCAAGCTsT 49% 2%
ND10501
721 GAAUCAACAACGGUCUGUCTsT 722 GACAGACCGUUGUUGAUUCTsT 18% 2%
ND10502
723 GGGCGAUUAUGGCGACUGCTsT 724 GCAGUCGCCAUAAUCGCCCTsT 8% 1%
ND10503
725 CGAUUAUGGCGACUGCACCTsT 726 GGUGCAGUCGCCAUAAUCGTsT 17% 1%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unicadel 1ercribado50 nM enH441; MV SD
ND10504
727 UCUGCUGGUUACUCACGAUTsT 728 AUCGUGAGUAACCAGCAGATsT 38% 4%
ND10505
729 CUAUCGCGACAGAACAAUUTsT 730 AAUUGUUCUGUCGCGAUAGTsT 9% 1%
ND10506
731 CAAUUACACCGUCAACAACTsT 732 GUUGUUGACGGUGUAAUUGTsT 11% 1%
ND10507
733 ACCGUCAACAACAAGAGAATsT 734 UUCUCUUGUUGUUGACGGUTsT 9% 1%
ND10508
735 CUCCUCGGUGUUGUCUGUGTsT 736 CACAGACAACACCGAGGAGTsT 78% 5%
ND10509
737 GGAGGUAGCCUCCACCCUGTsT 738 CAGGGUGGAGGCUACCUCCTsT 18% 1%
ND10510
739 GGAGAGGUUUCUCACACCATsT 740 UGGUGUGAGAAACCUCUCCTsT 13% 1%
ND10511
741 CUGCCGUUGAUGUGUGGAGTsT 742 CUCCACACAUCAACGGCAGTsT 19% 2%
ND10512
743 UGCCGUUGAUGUGUGGAGGTsT 744 CCUCCACACAUCAACGGCATsT 82% 4%
ND10513
745 AGAUGGGUAAGGGCUCAGGTsT 746 CCUGAGCCCUUACCCAUCUTsT 24% 1%
ND10514
747 AGAACAGUAGCUGAUGAAGTsT 748 CUUCAUCAGCUACUGUUCUTsT 15% 0%
ND10515
749 GCGGCUAAGUCUCUUUUUCTsT 750 GAAAAAGAGACUUAGCCGCTsT 13% 1%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unicadel 1ercribado50 nM enH441; MV SD
ND10516
751 CCUAAGAAACCGCUGAUAATsT 752 UUAUCAGCGGUUUCUUAGGTsT 6% 0%
ND10517
753 GAAACCGCUGAUAACCAGGTsT 754 CCUGGUUAUCAGCGGUUUCTsT 13% 0%
ND10518
755 AACCGCUGAUAACCAGGACTsT 756 GUCCUGGUUAUCAGCGGUUTsT 42% 2%
ND10519
757 ACCGCUGAUAACCAGGACATsT 758 UGUCCUGGUUAUCAGCGGUTsT 11% 1%
ND10520
759 CCAAGGGUACACGCAGGCATsT 760 UGCCUGCGUGUACCCUUGGTsT 19% 1%
ND10521
761 CAAGGGUACACGCAGGCAUTsT 762 AUGCCUGCGUGUACCCUUGTsT 12% 0%
ND10522
763 AGGGUACACGCAGGCAUGCTsT 764 GCAUGCCUGCGUGUACCCUTsT 23% 1%
ND10523
765 GUACACGCAGGCAUGCACGTsT 766 CGUGCAUGCCUGCGUGUACTsT 27% 1%
ND10524
767 AGGCAUGCACGGGUUUCCUTsT 768 AGGAAACCCGUGCAUGCCUTsT 14% 0%
ND10525
769 GGCAUGCACGGGUUUCCUGTsT 770 CAGGAAACCCGUGCAUGCCTsT 18% 3%
ND10526
771 ACGGGUUUCCUGCCCAGCGTsT 772 CGCUGGGCAGGAAACCCGUTsT 30% 1%
ND10527
773 GAGCAGACCCGGGUAAGUATsT 774 UACUUACCCGGGUCUGCUCTsT 24% 2%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unicadel 1ercribado50 nM enH441; MV SD
ND10528
775 AGCAGACCCGGGUAAGUAATsT 776 UUACUUACCCGGGUCUGCUTsT 24% 2%
ND10529
777 GGGUAAGUAAAGGCAGACCTsT 778 GGUCUGCCUUUACUUACCCTsT 39% 3%
ND10530
779 AGCCUCAUACCCGUGCCCUTsT 780 AGGGCACGGGUAUGAGGCUTsT 82% 5%
ND10531
781 GUGAACGCUUCUGCCACAUTsT 782 AUGUGGCAGAAGCGUUCACTsT 13% 1%
ND10532
783 AAAUUGAUCACUCCGCCUUTsT 784 AAGGCGGAGUGAUCAAUUUTsT 18% 2%
ND10533
785 AAUUGAUCACUCCGCCUUCTsT 786 GAAGGCGGAGUGAUCAAUUTsT 19% 0%
ND10534
787 GCCUUGCGGUCAGGGACUGTsT 788 CAGUCCCUGACCGCAAGGCTsT 12% 1%
ND10535
789 CUUGCGGUCAGGGACUGAATsT 790 UUCAGUCCCUGACCGCAAGTsT 11% 0%
ND10536
791 UUGCGGUCAGGGACUGAAUTsT 792 AUUCAGUCCCUGACCGCAATsT 12% 0%
ND10537
793 AUGUAUGCUCCAUGUCUAGTsT 794 CUAGACAUGGAGCAUACAUTsT 21% 1%
ND10538
795 AGCAAGUAGGCAGGAGCUCTsT 796 GAGCUCCUGCCUACUUGCUTsT 19% 1%
ND10539
797 CAGCCCAUACCAGGUCUCATsT 798 UGAGACCUGGUAUGGGCUGTsT 27% 2%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1ercribado50 nM enH441; MV SD
ND10540
799 CAGCCGUCGCGACCUGCGGTsT 800 CCGCAGGUCGCGACGGCUGTsT 44% 4%
ND10541
801 GGGCCCGUCGAGCCCGUAGTsT 802 CUACGGGCUCGACGGGCCCTsT 71% 6%
ND10542
803 CGUAGCGUGGCCUCCAGCUTsT 804 AGCUGGAGGCCACGCUACGTsT 84% 9%
ND10543
805 GGUGAGGGAGUGGUACCGCTsT 806 GCGGUACCACUCCCUCACCTsT 108% 8%
ND10544
807 AAAGUACACACAGCAGGUGTsT 808 CACCUGCUGUGUGUACUUUTsT 140% 7%
ND10545
809 CCAGGUUGACUUCUCCUCATsT 810 UGAGGAGAAGUCAACCUGGTsT 18% 2%
ND10546
811 UGUUUCACCAAGUGCCGGATsT 812 UCCGGCACUUGGUGAAACATsT 31% 2%
ND10547
813 UGCUGGUUACUCACGAUGGTsT 814 CCAUCGUGAGUAACCAGCATsT 144% 10%
ND10548
815 UCCUCGGUGUUGUCUGUGGTsT 816 CCACAGACAACACCGAGGATsT 106% 14%
ND10549
817 AGGUAGCCUCCACCCUGGCTsT 818 GCCAGGGUGGAGGCUACCUTsT 74% 15%
ND10550
819 GCCGUUGAUGUGUGGAGGGTsT 820 CCCUCCACACAUCAACGGCTsT 26% 4%
ND10551
821 GAUGGGUAAGGGCUCAGGATsT 822 UCCUGAGCCCUUACCCAUCTsT 22% 1%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unicadel 1ercribado50 nM enH441; MV SD
ND10552
823 CCCAACUGCGGCUAAGUCUTsT 824 AGACUUAGCCGCAGUUGGGTsT 18% 2%
ND10553
825 CCAAGCGAAACUUGGAGCUTsT 826 AGCUCCAAGUUUCGCUUGGTsT 16% 1%
ND10554
827 GGGUACACGCAGGCAUGCATsT 828 UGCAUGCCUGCGUGUACCCTsT 19% 2%
ND10555
829 UGCACGGGUUUCCUGCCCATsT 830 UGGGCAGGAAACCCGUGCATsT 28% 2%
ND10556
831 CUCCUCUAGCCUCAUACCCTsT 832 GGGUAUGAGGCUAGAGGAGTsT 109% 8%
ND10557
833 UCCUCUAGCCUCAUACCCGTsT 834 CGGGUAUGAGGCUAGAGGATsT 117% 7%
ND10558
835 UCUAGCCUCAUACCCGUGCTsT 836 GCACGGGUAUGAGGCUAGATsT 128% 9%
ND10559
837 UUCAUACCUCUACAUGUCUTsT 838 AGACAUGUAGAGGUAUGAATsT 52% 4%
ND10560
839 UCUACAUGUCUGCUUGAGATsT 840 UCUCAAGCAGACAUGUAGATsT 15% 2%
ND10561
841 AUAUUUCCUCAGCCUGAAATsT 842 UUUCAGGCUGAGGAAAUAUTsT 15% 2%
ND10562
843 AACUCCUAUGCAUCCCUUATsT 844 UAAGGGAUGCAUAGGAGUUTsT 14% 1%
ND10563
845 GCAUCCCUUAGAACCCUGCTsT 846 GCAGGGUUCUAAGGGAUGCTsT 20% 1%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1ercribado50 nM enH441; MV SD
ND10564
847 UGAUCACUCCGCCUUCUCCTsT 848 GGAGAAGGCGGAGUGAUCATsT 67% 7%
ND10565
849 UGUAAGUGCCUUGCGGUCATsT 850 UGACCGCAAGGCACUUACATsT 17% 2%
ND10566
851 CCUUGCGGUCAGGGACUGATsT 852 UCAGUCCCUGACCGCAAGGTsT 14% 1%
ND10567
853 AAUCUUGCCCGUUUAUGUATsT 854 UACAUAAACGGGCAAGAUUTsT 13% 2%
ND10568
855 CCGUUUAUGUAUGCUCCAUTsT 856 AUGGAGCAUACAUAAACGGTsT 19% 6%
ND10569
857 UGUAUGCUCCAUGUCUAGCTsT 858 GCUAGACAUGGAGCAUACATsT 87% 13%
ND10570
859 CAUGUCUAGCCCAUCAUCCTsT 860 GGAUGAUGGGCUAGACAUGTsT 33% 4%
ND10571
861 AGUAGGCAGGAGCUCAAUATsT 862 UAUUGAGCUCCUGCCUACUTsT 11% 1%
ND10572
863 CCUACAGGUACCCGGAAAUTsT 864 AUUUCCGGGUACCUGUAGGTsT 22% 3%
ND10573
865 CCCGUCGAGCCCGUAGCGUTsT 866 ACGCUACGGGCUCGACGGGTsT 23% 1%
ND10574
867 GCGGUGAGGGAGUGGUACCTsT 868 GGUACCACUCCCUCACCGCTsT 30% 1%
ND10575
869 UUAUGGCGACUGCACCAAGTsT 870 CUUGGUGCAGUCGCCAUAATsT 77% 6%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unicadel 1ercribado 50 nM en H441;MV SD
ND10576
871 CUAUAAGCUCCAGGUUGACTsT 872 GUCAACCUGGAGCUUAUAGTsT 11% 1%
ND10577
873 UAUAAGCUCCAGGUUGACUTsT 874 AGUCAACCUGGAGCUUAUATsT 42% 8%
ND10578
875 AGGUUGACUUCUCCUCAGATsT 876 UCUGAGGAGAAGUCAACCUTsT 13% 3%
ND10579
877 CUGGGCUGUUUCACCAAGUTsT 878 ACUUGGUGAAACAGCCCAGTsT 19% 6%
ND10580
879 AACAAUUACACCGUCAACATsT 880 UGUUGACGGUGUAAUUGUUTsT 13% 1%
ND10581
881 UGGGUAAGGGCUCAGGAAGTsT 882 CUUCCUGAGCCCUUACCCATsT 20% 3%
ND10582
883 GGGUAAGGGCUCAGGAAGUTsT 884 ACUUCCUGAGCCCUUACCCTsT 22% 3%
ND10583
885 CACCCAACUGCGGCUAAGUTsT 886 ACUUAGCCGCAGUUGGGUGTsT 22% 10%
ND10584
887 ACCCAACUGCGGCUAAGUCTsT 888 GACUUAGCCGCAGUUGGGUTsT 22% 5%
ND10585
889 CCAACUGCGGCUAAGUCUCTsT 890 GAGACUUAGCCGCAGUUGGTsT 14% 2%
ND10586
891 CUUGGAUCAGCCAAGCGAATsT 892 UUCGCUUGGCUGAUCCAAGTsT 15% 1%
ND10587
893 GCCAAGCGAAACUUGGAGCTsT 894 GCUCCAAGUUUCGCUUGGCTsT 17% 2%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1ercribado50 nM enH441; MV SD
ND10588
895 UCCUAAGAAACCGCUGAUATsT 896 UAUCAGCGGUUUCUUAGGATsT 11% 2%
ND10589
897 GCAUGCACGGGUUUCCUGCTsT 898 GCAGGAAACCCGUGCAUGCTsT 24% 8%
ND10590
899 UGUUACUUAGGCAAUUCCCTsT 900 GGGAAUUGCCUAAGUAACATsT 48% 10%
ND10591
901 CUAGGGCUAGAGCAGACCCTsT 902 GGGUCUGCUCUAGCCCUAGTsT 58% 10%
ND10592
903 CUCUAGCCUCAUACCCGUGTsT 904 CACGGGUAUGAGGCUAGAGTsT 34% 5%
ND10593
905 UUAGAACCCUGCUCAGACATsT 906 UGUCUGAGCAGGGUUCUAATsT 14% 1%
ND10594
907 UGUGAACGCUUCUGCCACATsT 908 UGUGGCAGAAGCGUUCACATsT 15% 0%
ND10595
909 AUUGAUCACUCCGCCUUCUTsT 910 AGAAGGCGGAGUGAUCAAUTsT 43% 1%
ND10596
911 UCACUCCGCCUUCUCCUGGTsT 912 CCAGGAGAAGGCGGAGUGATsT 90% 5%
ND10597
913 GCGGUCAGGGACUGAAUCUTsT 914 AGAUUCAGUCCCUGACCGCTsT 11% 0%
ND10598
915 GGUCAGGGACUGAAUCUUGTsT 916 CAAGAUUCAGUCCCUGACCTsT 13% 1%
ND10599
917 GUAUGCUCCAUGUCUAGCCTsT 918 GGCUAGACAUGGAGCAUACTsT 28% 3%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1ercribado50 nM enH441; MV SD
ND10600
919 CCAUGUCUAGCCCAUCAUCTsT 920 GAUGAUGGGCUAGACAUGGTsT 12% 1%
ND10601
921 GAUCGAGUUCCACCGCUCCTsT 922 GGAGCGGUGGAACUCGAUCTsT 17% 1%
ND10602
923 GGACUCUAGCCCUCCACAGTsT 924 CUGUGGAGGGCUAGAGUCCTsT 41% 4%
ND10603
925 UCACCACUCUCGUGGCCGGTsT 926 CCGGCCACGAGAGUGGUGATsT 83% 3%
ND10604
927 CAGCUUGCGGGACAACAACTsT 928 GUUGUUGUCCCGCAAGCUGTsT 21% 1%
ND10605
929 CAUCUUCUAUCCGCGGCCCTsT 930 GGGCCGCGGAUAGAAGAUGTsT 26% 2%
ND10606
931 AUAAGCUCCAGGUUGACUUTsT 932 AAGUCAACCUGGAGCUUAUTsT 15% 1%
ND10607
933 CUGCUGGUUACUCACGAUGTsT 934 CAUCGUGAGUAACCAGCAGTsT 85% 8%
ND10608
935 GAACAAUUACACCGUCAACTsT 936 GUUGACGGUGUAAUUGUUCTsT 13% 1%
ND10609
937 AUUACACCGUCAACAACAATsT 938 UUGUUGUUGACGGUGUAAUTsT 12% 0%
ND10610
939 CUGUGGUUCGGCUCCUCGGTsT 940 CCGAGGAGCCGAACCACAGTsT 53% 2%
ND10611
941 GAAGUGCCUUGGCUCCAGCTsT 942 GCUGGAGCCAAGGCACUUCTsT 24% 3%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1ercribado50 nM enH441; MV SD
ND10612
943 GAUCAGCCAAGCGAAACUUTsT 944 AAGUUUCGCUUGGCUGAUCTsT 12% 0%
ND10613
945 AGAAACCGCUGAUAACCAGTsT 946 CUGGUUAUCAGCGGUUUCUTsT 12% 1%
ND10614
947 UGAUAACCAGGACAAAACATsT 948 UGUUUUGUCCUGGUUAUCATsT 7% 1%
ND10615
949 CACGCAGGCAUGCACGGGUTsT 950 ACCCGUGCAUGCCUGCGUGTsT 12% 0%
ND10616
951 GCUCUCCAGUAGCACAGAUTsT 952 AUCUGUGCUACUGGAGAGCTsT 9% 1%
ND10617
953 CAGACCCGGGUAAGUAAAGTsT 954 CUUUACUUACCCGGGUCUGTsT 55% 3%
ND10618
955 AGACCCGGGUAAGUAAAGGTsT 956 CCUUUACUUACCCGGGUCUTsT 72% 8%
ND10619
957 AUCACUCCGCCUUCUCCUGTsT 958 CAGGAGAAGGCGGAGUGAUTsT 63% 6%
ND10620
959 CACUCCGCCUUCUCCUGGGTsT 960 CCCAGGAGAAGGCGGAGUGTsT 28% 1%
ND10621
961 AACUAGACUGUAAGUGCCUTsT 962 AGGCACUUACAGUCUAGUUTsT 23% 1%
ND10622
963 UAUGCUCCAUGUCUAGCCCTsT 964 GGGCUAGACAUGGAGCAUATsT 98% 2%
ND10623
965 CCCGAUGUAUGGAAACUGCTsT 966 GCAGUUUCCAUACAUCGGGTsT 11% 1%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1ercribado50 nM enH441; MV SD
ND10624
967 GUACUGCUACUAUAAGCUCTsT 968 GAGCUUAUAGUAGCAGUACTsT 19% 1%
ND10625
969 AGCGUGACCAGCUACCAGCTsT 970 GCUGGUAGCUGGUCACGCUTsT 49% 2%
ND10626
971 ACAAUUACACCGUCAACAATsT 972 UUGUUGACGGUGUAAUUGUTsT 8% 0%
ND10627
973 AUGCUCCUCUGGUGGGAGGTsT 974 CCUCCCACCAGAGGAGCAUTsT 76% 5%
ND10628
975 AACAGUAGCUGAUGAAGCUTsT 976 AGCUUCAUCAGCUACUGUUTsT 22% 1%
ND10629
977 CUGACUCCCGAGGGCUAGGTsT 978 CCUAGCCCUCGGGAGUCAGTsT 34% 2%
ND10630
979 GUGCAACCAGAACAAAUCGTsT 980 CGAUUUGUUCUGGUUGCACTsT 10% 1%
ND10631
981 UGCAACCAGAACAAAUCGGTsT 982 CCGAUUUGUUCUGGUUGCATsT 48% 4%
ND10632
983 CUUCAAAGUACACACAGCATsT 984 UGCUGUGUGUACUUUGAAGTsT 20% 1%
ND10633
985 CAGCGUGACCAGCUACCAGTsT 986 CUGGUAGCUGGUCACGCUGTsT 35% 1%
ND10634
987 AGAACAAUUACACCGUCAATsT 988 UUGACGGUGUAAUUGUUCUTsT 14% 0%
ND10635
989 GAUAACCAGGACAAAACACTsT 990 GUGUUUUGUCCUGGUUAUCTsT 11% 1%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1ercribado50 nM enH441; MV SD
ND10636
991 ACAACCAAGGGUACACGCATsT 992 UGCGUGUACCCUUGGUUGUTsT 17% 1%
ND10637
993 CCCAGCGACGGCUUAAGCCTsT 994 GGCUUAAGCCGUCGCUGGGTsT 27% 2%
ND10638
995 CUCCCGAGGGCUAGGGCUATsT 996 UAGCCCUAGCCCUCGGGAGTsT 23% 1%
ND10639
997 UAGAACCCUGCUCAGACACTsT 998 GUGUCUGAGCAGGGUUCUATsT 35% 2%
ND10640
999 CCUGGGCUGUUUCACCAAGTsT 1000 CUUGGUGAAACAGCCCAGGTsT 14% 1%
ND10641
1001 GGAUCAGCCAAGCGAAACUTsT 1002 AGUUUCGCUUGGCUGAUCCTsT 16% 3%
ND10642
1003 AAGAAACCGCUGAUAACCATsT 1004 UGGUUAUCAGCGGUUUCUUTsT 17% 1%
ND10643
1005 ACCAAGGGUACACGCAGGCTsT 1006 GCCUGCGUGUACCCUUGGUTsT 37% 4%
ND10644
1007 GUAGCACAGAUGUCUGCUCTsT 1008 GAGCAGACAUCUGUGCUACTsT 13% 3%
ND10645
1009 UUUCAUACCUCUACAUGUCTsT 1010 GACAUGUAGAGGUAUGAAATsT 88% 8%
ND10646
1011 CCAACCAUCUGCCAGAGAATsT 1012 UUCUCUGGCAGAUGGUUGGTsT 16% 2%
ND10647
1013 GUCAGGGACUGAAUCUUGCTsT 1014 GCAAGAUUCAGUCCCUGACTsT 16% 3%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1ercribado50 nM enH441; MV SD
ND10648
1015 AGCAUGAUCAAGGAGUGUGTsT 1016 CACACUCCUUGAUCAUGCUTsT 50% 7%
ND10649
1017 GCAGCGUGACCAGCUACCATsT 1018 UGGUAGCUGGUCACGCUGCTsT 40% 6%
ND10650
1019 CAGCUCUCUGCUGGUUACUTsT 1020 AGUAACCAGCAGAGAGCUGTsT 56% 5%
ND10651
1021 GUUCGGCUCCUCGGUGUUGTsT 1022 CAACACCGAGGAGCCGAACTsT 68% 5%
ND10652
1023 GCAGAUGCUCCUCUGGUGGTsT 1024 CCACCAGAGGAGCAUCUGCTsT 26% 5%
ND10653
1025 AGGAAGUUGCUCCAAGAACTsT 1026 GUUCUUGGAGCAACUUCCUTsT 18% 2%
ND10654
1027 AACGCUUCUGCCACAUCUUTsT 1028 AAGAUGUGGCAGAAGCGUUTsT 18% 1%
ND10655
1029 CACCUGGGCUGUUUCACCATsT 1030 UGGUGAAACAGCCCAGGUGTsT 17% 2%
ND10656
1031 AAGCCAUGCAGCGUGACCATsT 1032 UGGUCACGCUGCAUGGCUUTsT 27% 3%
ND10657
1033 CGAGGGCUAGGGCUAGAGCTsT 1034 GCUCUAGCCCUAGCCCUCGTsT 30% 1%
ND10658
1035 GGAAACCCUGGACAGACUUTsT 1036 AAGUCUGUCCAGGGUUUCCTsT 14% 1%
ND10659
1037 GUAGCUGAUGAAGCUGCCCTsT 1038 GGGCAGCUUCAUCAGCUACTsT 19% 1%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del1er cribado50 nM enH441; MV SD
ND10660
1039 UCUUUUUCCCUUGGAUCAGTsT 1040 CUGAUCCAAGGGAAAAAGATsT 88% 4%
ND10661
1041 CUCCAGUAGCACAGAUGUCTsT 1042 GACAUCUGUGCUACUGGAGTsT 10% 1%
ND10662
1043 CCAAAAUUGAUCACUCCGCTsT 1044 GCGGAGUGAUCAAUUUUGGTsT 25% 3%
ND10663
1045 CAGACCACCUGGGCUGUUUTsT 1046 AAACAGCCCAGGUGGUCUGTsT 24% 2%
ND10664
1047 CCCUUCCCAACUAGACUGUTsT 1048 ACAGUCUAGUUGGGAAGGGTsT 15% 2%
ND10665
1049 CGCAGCCGUCGCGACCUGCTsT 1050 GCAGGUCGCGACGGCUGCGTsT 45% 2%
ND10666
1051 UUCUCACACCAAGGCAGAUTsT 1052 AUCUGCCUUGGUGUGAGAATsT 25% 2%
ND10667
1053 CACCACCAUCCACGGCGCCTsT 1054 GGCGCCGUGGAUGGUGGUGTsT 35% 3%
ND10668
1055 CCAUUACUUUUGUGAACGCTsT 1056 GCGUUCACAAAAGUAAUGGTsT 19% 4%
ID del Duplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1er cribado 50 nM en H441; MV SD Dosis unica del 2do cribado 50 nM en H441; MV SD
ND10669
1057 CCAAGAACAGUAGCUGAUGTsT 1058 CAUCAGCUACUGUUCUUGGTsT 23% 4% 16% 2%
ND10670
1059 AGGAGAGGUUUCUCACACCTsT 1060 GGUGUGAGAAACCUCUCCUTsT 18% 3% 17% 1%
ND10671
1061 AUCAUCCUGCUUGGAGCAATsT 1062 UUGCUCCAAGCAGGAUGAUTsT 33% 3% 24% 2%
ND10672
1063 GCAUCACAGAGCAGACGCUTsT 1064 AGCGUCUGCUCUGUGAUGCTsT 29% 2% 27% 4%
ND10673
1065 AGGAGGUAGCCUCCACCCUTsT 1066 AGGGUGGAGGCUACCUCCUTsT 63% 6% 61% 3%
ND10674
1067 ACAACCGCAUGAAGACGGCTsT 1068 GCCGUCUUCAUGCGGUUGUTsT 94% 2%
ND10675
1069 GCAUGAAGACGGCCUUCUGTsT 1070 CAGAAGGCCGUCUUCAUGCTsT 20% 2% 18% 1%
ND10676
1071 GUCACGAUGGUCACCCUCCTsT 1072 GGAGGGUGACCAUCGUGACTsT 66% 5% 60% 4%
ND10677
1073 CCCUGCUCAGACACCAUUATsT 1074 UAAUGGUGUCUGAGCAGGGTsT 15% 3% 18% 1%
ND10678
1075 UCACGAUGGUCACCCUCCUTsT 1076 AGGAGGGUGACCAUCGUGATsT 80% 6% 70% 4%
ND10679
1077 UCAACCUCAACUCGGACAATsT 1078 UUGUCCGAGUUGAGGUUGATsT 20% 3% 21% 1%
ND10680
1079 UGACCAGCUACCAGCUCUCTsT 1080 GAGAGCUGGUAGCUGGUCATsT 88% 22% 77% 5%
ND10681
1081 GAUGGCCCUCGGUGACAUCTsT 1082 GAUGUCACCGAGGGCCAUCTsT 88% 18% 60% 4%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1er cribado50 nM enH441; MV SD Dosis unica del 2do cribado50 nM en SD
ND10682
1083 GCUUUGACAAGGAACUUUCTsT 1084 GAAAGUUCCUUGUCAAAGCTsT 19% 7% 14% 2%
ND10683
1085 CGAUACUGGUCUCCAGGCCTsT 1086 GGCCUGGAGACCAGUAUCGTsT 27% 5% 27% 2%
ND10684
1087 UCUGGAUGUCUUCCAUGCCTsT 1088 GGCAUGGAAGACAUCCAGATsT 92% 13% 89% 3%
ND10685
1089 CAGGACCCUAGACCUCUGCTsT 1090 GCAGAGGUCUAGGGUCCUGTsT 58% 14% 50% 2%
ND10686
1091 GACCCUAGACCUCUGCAGCTsT 1092 GCUGCAGAGGUCUAGGGUCTsT 27% 2%
ND10687
1093 ACCCUAGACCUCUGCAGCCTsT 1094 GGCUGCAGAGGUCUAGGGUTsT 21% 1%
ND10688
1095 CAGCCCACGGCGGAGGAGGTsT 1096 CCUCCUCCGCCGUGGGCUGTsT 55% 4%
ND10689
1097 CUCUUCGAGUUCUUCUGCATsT 1098 UGCAGAAGAACUCGAAGAGTsT 13% 3%
ND10690
1099 UUGGCAUGAUGUACUGGCATsT 1100 UGCCAGUACAUCAUGCCAATsT 16% 2%
ND10691
1101 GGCAUGAUGUACUGGCAAUTsT 1102 AUUGCCAGUACAUCAUGCCTsT 13% 1%
ND10692
1103 UGUACUGGCAAUUCGGCCUTsT 1104 AGGCCGAAUUGCCAGUACATsT 45% 2%
ND10693
1105 ACUGGCAAUUCGGCCUGCUTsT 1106 AGCAGGCCGAAUUGCCAGUTsT 38% 3%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1ercribado50 nM enH441; MV SD
ND10694
1107 GGCAAUUCGGCCUGCUUUUTsT 1108 AAAAGCAGGCCGAAUUGCCTsT 10% 1%
ND10695
1109 CAAUUCGGCCUGCUUUUCGTsT 1110 CGAAAAGCAGGCCGAAUUGTsT 12% 1%
ND10696
1111 UCGGAGAGUACUUCAGCUATsT 1112 UAGCUGAAGUACUCUCCGATsT 12% 1%
ND10697
1113 CAACAUCCUGUCGAGGCUGTsT 1114 CAGCCUCGACAGGAUGUUGTsT 35% 7%
ND10698
1115 CAUCCUGUCGAGGCUGCCATsT 1116 UGGCAGCCUCGACAGGAUGTsT 26% 6%
ND10699
1117 UGCUGCAACCAGGCGAAUUTsT 1118 AAUUCGCCUGGUUGCAGGATsT 28% 6%
ND10700
1119 GGAAACUGCUAUACUUUCATsT 1120 UGAAAGUAUAGCAGUUUCCTsT 7% 2%
ND10701
1121 ACGGUCUGUCCCUGAUGCUTsT 1122 AGCAUCAGGGACAGACCGUTsT 28% 7%
ND10702
1123 GGUCUGUCCCUGAUGCUGCTsT 1124 GCAGCAUCAGGGACAGACCTsT 33% 2%
ND10703
1125 GGCCCGGGUAAUGGUGCACTsT 1126 GUGCACCAUUACCCGGGCCTsT 47% 10%
ND10704
1127 CAGGAUGAACCUGCCUUUATsT 1128 UAAAGGCAGGUUCAUCCUGTsT 59% 2%
ND10705
1129 GAUGAACCUGCCUUUAUGGTsT 1130 CCAUAAAGGCAGGUUCAUCTsT 77% 7%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1ercribado50 nM enH441; MV SD
ND10706
1131 GGUGGCUUUAACUUGCGGCTsT 1132 GCCGCAAGUUAAAGCCACCTsT 47% 8%
ND10707
1133 GUGGCUUUAACUUGCGGCCTsT 1134 GGCCGCAAGUUAAAGCCACTsT 17% 2%
ND10708
1135 UUGCGGCCUGGCGUGGAGATsT 1136 UCUCCACGCCAGGCCGCAATsT 52% 3%
ND10709
1137 UGCGGCCUGGCGUGGAGACTsT 1138 GUCUCCACGCCAGGCCGCATsT 81% 4%
ND10710
1139 GCGGCCUGGCGUGGAGACCTsT 1140 GGUCUCCACGCCAGGCCGCTsT 57% 4%
ND10711
1141 CAGGUGUGUAUUCACUCCUTsT 1142 AGGAGUGAAUACACACCUGTsT 24% 2%
ND10712
1143 GUGUAUUCACUCCUGCUUCTsT 1144 GAAGCAGCtAGUGAAUACACTsT 20% 1%
ND10713
1145 GGCCCUCGGUGACAUCCCATsT 1146 UGGGAUGUCACCGAGGGCCTsT 40% 3%
ND10714
1147 GAUGCUAUCGCGACAGAACTsT 1148 GUUCUGUCGCGAUAGCAUCTsT 24% 2%
ND10715
1149 ACUACAAAACCAAUUCUGATsT 1150 UCAGAAUUGGUUUUGUAGUTsT 19% 2%
ND10716
1151 CAAUUCUGAGUCUCCCUCUTsT 1152 AGAGGGAGACUCAGAAUUGTsT 35% 3%
ND10717
1153 CUCUGUCACGAUGGUCACCTsT 1154 GGUGACCAUCGUGACAGAGTsT 41% 4%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1ercribado50 nM enH441; MV SD
ND10718
1155 CUGCUCCGAAGGUUCCGAATsT 1156 UUCGGAACCUUCGGAGCAGTsT 16% 3%
ND10719
1157 AGGUUCCGAAGCCGAUACUTsT 1158 AGUAUCGGCUUCGGAACCUTsT 16% 2%
ND10720
1159 GUUCCGAAGCCGAUACUGGTsT 1160 CCAGUAUCGGCUUCGGAACTsT 21% 2%
ND10721
1161 CGAAGCCGAUACUGGUCUCTsT 1162 GAGACCAGUAUCGGCUUCGTsT 16% 1%
ND10722
1163 AAGAUUGAAGGAUGUGCAGTsT 1164 CUGCACAUCCUUCAAUCUUTsT 25% 2%
ND10723
1165 GAUUGAAGGAUGUGCAGGGTsT 1166 CCCUGCACAUCCUUCAAUCTsT 26% 1%
ND10724
1167 UGCCUCUGAACACUCUGGUTsT 1168 ACCAGAGUGUUCAGAGGCATsT 45% 3%
ND10725
1169 CCUCUGAACACUCUGGUUUTsT 1170 AAACCAGAGUGUUCAGAGGTsT 15% 2%
ND10726
1171 GACAAGGAACUUUCCUAAGTsT 1172 CUUAGGAAAGUUCCUUGUCTsT 105% 14%
ND10727
1173 CAGGACAAAACACAACCAATsT 1174 UUGGUUGUGUUUUGUCCUGTsT 32% 5%
ND10728
1175 AACACAACCAAGGGUACACTsT 1176 GUGUACCCUUGGUUGUGUUTsT 60% 13%
ND10729
1177 UUGAACUUGGGUGGGAAACTsT 1178 GUUUCCCACCCAAGUUCAATsT 23% 8%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1ercribado50 nM inH441; MV SD
ND10730
1179 UGAACUUGGGUGGGAAACCTsT 1180 GGUUUCCCACCCAAGUUCATsT 18% 4%
ND10731
1181 ACCCGUGCCCUCACAGAGCTsT 1182 GCUCUGUGAGGGCACGGGUTsT 19% 1%
ND10732
1183 ACUAUAACAUCUGCUGGAGTsT 1184 CUCCAGCAGAUGUUAUAGUTsT 17% 5%
ND10733
1185 AUCUGCUGGAGUGUUGCUGTsT 1186 CAGCAACACUCCAGCAGAUTsT 119% 20%
ND10734
1187 CUGCUGGAGUGUUGCUGUUTsT 1188 AACAGCAACACUCCAGCAGTsT 58% 13%
ND10735
1189 CUAGCCCAUCAUCCUGCUUTsT 1190 AAGCAGGAUGAUGGGCUAGTsT 20% 6%
ND10736
1191 CUCUGGAUGUCUUCCAUGCTsT 1192 GCAUGGAAGACAUCCAGAGTsT 28% 8%
ND10737
1193 AGCAGGACCCUAGACCUCUTsT 1194 AGAGGUCUAGGGUCCUGCUTsT 36% 2%
ND10738
1195 UUCGAGUUCUUCUGCAACATsT 1196 UGUUGCAGAAGAACUCGAATsT 13% 1%
ND10739
1197 CACCAUCCACGGCGCCAUCTsT 1198 GAUGGCGCCGUGGAUGGUGTsT 13% 2%
ND10740
1199 CCACGGCGCCAUCCGCCUGTsT 1200 CAGGCGGAUGGCGCCGUGGTsT 44% 4%
ND10741
1201 CAGCACAACCGCAUGAAGATsT 1202 UCUUCAUGCGGUUGUGCUGTsT 23% 3%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1ercribado50 nMen H441;MV SD
ND10742
1203 CCUUUGGCAUGAUGUACUGTsT 1204 CAGUACAUCAUGCCAAAGGTsT 12% 1%
ND10743
1205 AUCCUGUCGAGGCUGCCAGTsT 1206 CUGGCAGCCUCGACAGGAUTsT 14% 3%
ND10744
1207 UCUCCUGCAACCAGGCGAATsT 1208 UUCGCCUGGUUGCAGGAGATsT 12% 1%
ND10745
1209 UGCAACCAGGCGAAUUACUTsT 1210 AGUAAUUCGCCUGGUUGCATsT 45% 5%
ND10746
1211 ACCUCCAUCAGCAUGAGGATsT 1212 UCCUCAUGCUGAUGGAGGUTsT 82% 7%
ND10747
1213 GCGACUGCACCAAGAAUGGTsT 1214 CCAUUCUUGGUGCAGUCGCTsT 82% 19%
ND10748
1215 ACCAAGAAUGGCAGUGAUGTsT 1216 CAUCACUGCCAUUCUUGGUTsT 54% 18%
ND10749
1217 UGGUUACUCACGAUGGCCCTsT 1218 GGGCCAUCGUGAGUAACCATsT 45% 7%
ND10750
1219 AGAAAUGGAGUGGCCAAAGTsT 1220 CUUUGGCCACUCCAUUUCUTsT 11% 3%
ND10751
1221 GGAGCUGAACUACAAAACCTsT 1222 GGUUUUGUAGUUCAGCUCCTsT 15% 3%
ND10752
1223 CCUCUGUCACGAUGGUCACTsT 1224 GUGACCAUCGUGACAGAGGTsT 18% 5%
ND10753
1225 AGAUUGAAGGAUGUGCAGGTsT 1226 CCUGCACAUCCUUCAAUCUTsT 26% 3%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1ercribado50 nM enH441; MV SD
ND10754
1227 GAGCUUUGACAAGGAACUUTsT 1228 AAGUUCCUUGUCAAAGCUCTsT 14% 2%
ND10755
1229 CUUUGACAAGGAACUUUCCTsT 1230 GGAAAGUUCCUUGUCAAAGTsT 50% 8%
ND10756
1231 UCAGACACCAUUACUUUUGTsT 1232 CAAAAGUAAUGGUGUCUGATsT 32% 4%
ND10757
1233 AGCACACUAUAACAUCUGCTsT 1234 GCAGAUGUUAUAGUGUGCUTsT 11% 2%
ND10758
1235 GCACAACCGCAUGAAGACGTsT 1236 CGUCUUCAUGCGGUUGUGCTsT 34% 3%
ND10759
1237 ACUGCUUCUACCAGACAUATsT 1238 UAUGUCUGGUAGAAGCAGUTsT 11% 1%
ND10760
1239 GAAGACGGCCUUCUGGGCATsT 1240 UGCCCAGAAGGCCGUCUUCTsT 16% 2%
ND10761
1241 AAGACGGCCUUCUGGGCAGTsT 1242 CUGCCCAGAAGGCCGUCUUTsT 58% 21%
ND10762
1243 ACAUCAACCUCAACUCGGATsT 1244 UCCGAGUUGAGGUUGAUGUTsT 14% 3%
ND10763
1245 UGGAAGGACUGGAAGAUCGTsT 1246 CGAUCUUCCAGUCCUUCCATsT 109% 29%
ND10764
1247 ACAUCCUGUCGAGGCUGCCTsT 1248 GGCAGCCUCGACAGGAUGUTsT 101% 13%
ND10765
1249 CAACCAGGCGAAUUACUCUTsT 1250 AGAGUAAUUCGCCUGGUUGTsT 19% 5%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1ercribado50 nM enH441; MV SD
ND10766
1251 CAGGCGAAUUACUCUCACUTsT 1252 AGUGAGAGUAAUUCGCCUGTsT 24% 4%
ND10767
1253 AGCAGAAUGACUUCAUUCCTsT 1254 GGAAUGAAGUCAUUCUGCUTsT 40% 8%
ND10768
1255 AUGAUGGUGGCUUUAACUUTsT 1256 AAGUUAAAGCCACCAUCAUTsT 85% 8%
ND10769
1257 AGAACCUUUACCCUUCAAATsT 1258 UUUGAAGGGUAAAGGUUCUTsT 22% 4%
ND10770
1259 CCUUUACCCUUCAAAGUACTsT 1260 GUACUUUGAAGGGUAAAGGTsT 21% 4%
ND10771
1261 GAGCCUGUGGUUCGGCUCCTsT 1262 GGAGCCGAACCACAGGCUCTsT 28% 1%
ND10772
1263 UGGUACUGCCUCUGAACACTsT 1264 GUGUUCAGAGGCAGUACCATsT 58% 4%
ND10773
1265 CUCAUACCCGUGCCCUCACTsT 1266 GUGAGGGCACGGGUAUGAGTsT 15% 2%
ND10774
1267 CCGUAGCACACUAUAACAUTsT 1268 AUGUUAUAGUGUGCUACGGTsT 24% 6%
ND10775
1269 CGUAGCACACUAUAACAUCTsT 1270 GAUGUUAUAGUGUGCUACGTsT 21% 4%
ND10776
1271 GCAGGACCCUAGACCUCUGTsT 1272 CAGAGGUCUAGGGUCCUGCTsT 25% 4%
ND10777
1273 GCCUGCUUUUCGGAGAGUATsT 1274 UACUCUCCGAAAAGCAGGCTsT 18% 4%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1ercribado50 nMen H441;MV SD
ND10778
1275 GGGCCCGGGUAAUGGUGCATsT 1276 UGCACCAUUACCCGGGCCCTsT 16% 2%
ND10779
1277 CAACAACAAGAGAAAUGGATsT 1278 UCCAUUUCUCUUGUUGUUGTsT 17% 0%
ND10780
1279 GCUGUUGCACCAUACUUUCTsT 1280 GAAAGUAUGGUGCAACAGCTsT 14% 1%
ND10781
1281 CUACCGAGAGCUCUUCGAGTsT 1282 CUCGAAGAGCUCUCGGUAGTsT 24% 3%
ND10782
1283 ACCUGCCUUUAUGGAUGAUTsT 1284 AUCAUCCAUAAAGGCAGGUTsT 115% 10%
ND10783
1285 UUGACAAGGAACUUUCCUATsT 1286 UAGGAAAGUUCCUUGUCAATsT 16% 1%
ND10784
1287 GCUGGAGUGUUGCUGUUGCTsT 1288 GCAACAGCAACACUCCAGCTsT 12% 1%
ND10785
1289 UCGGUGACAUCCCAGGAAUTsT 1290 AUUCCUGGGAUGUCACCGATsT 28% 1%
ND10786
1291 GCUGCCCAGAAGUGCCUUGTsT 1292 CAAGGCACUUCUGGGCAGCTsT 15% 2%
ND10787
1293 AGUACACACAGCAGGUGUGTsT 1294 CACACCUGCUGUGUGUACUTsT 12% 1%
ND10788
1295 CAAGUGCCGGAAGCCAUGCTsT 1296 GCAUGGCUUCCGGCACUUGTsT 94% 2%
Tabla 1C: Los ARNi corto seleccionados en el conjunto sustituto in vivo (ARNi corto de reactividad cruzada de humano-rata con la mas alta especificidad en rata). Se identifico un conjunto de cribado de 48 secuencias de alfa-ENaC por medio de ARNi de reactividad cruzada de humano y rata. Se muestra el porcentaje de expresion residual de alfa-ENaC en dos experimentos de transfeccion independientes de una sola dosis (remitase a la seccion de ejemplos para ver los metodos empleados).
ID del Duplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1er cribado 50 nM en H441; MV SD 2do cribado 50nM en H441 SD
ND-9201
1297 uGuGcAAccAGAAcAAAucTsT 1298 GAUUUGUUCUGGUUGcAcATsT 8% 1% 8% 1%
ND-9202
1299 uuuAuGGAuGAuGGuGGcuTsT 1300 AGCcACcAUcAUCcAuAAATsT 80% 9% 82% 6%
ND-9203
1301 GccuuuAUGGAUGAuGGuGTsT 1302 CACcAUcAUCcAuAAAGGCTsT 76% 8% 76% 2%
ND-9204
1303 cACAAccGcAuGAAGAcGGTsT 1304 CCGUCUUcAUGCGGUUGUGTsT 73% 18% 57% 3%
ND-9205
1305 AccGcAuGAAGAcGGccuuTsT 1306 AAGGCCGUCUUcAUGCGGUTsT 35% 3% 37% 2%
ND-9206
1307 AGGAcuGGAAGAucGGcuuTsT 1308 AAGCCGAUCUUCcAGUCCUTsT 17% 3% 16% 3%
ND-9207
1309 GAAGGAcuGGAAGAucGGcTsT 1310 GCCGAUCUUCcAGUCCUUCTsT 96% 18% 81% 5%
ND-9208
1311 GGAcuGGAAGAucGGcuucTsT 1312 GAAGCCGAUCUUCcAGUCCTsT 58% 6% 57% 3%
ND-9209
1313 AGuuccAccGcuccuAccGTsT 1314 CGGuAGGAGCGGUGGAACUTsT 85% 8% 94% 4%
ND-9210
1315 GAcuGGAAGAucGGcuuccTsT 1316 GGAAGCCGAUCUUCcAGUCTsT 79% 5% 82% 2%
ND-9211
1317 cGcAuGAAGAcGGccuucuTST 1318 AGAAGGCCGUCUUcAUGCGTsT 50% 1% 51% 1%
ND-9212
1319 GccAGuGGAGccuGuGGuuTsT 1320 AACcAcAGGCUCcACUGGCTsT 26% 3% 23% 2%
ND-9213
1321 uGccuuuAuGGAuGAuGGuTsT 1322 ACcAUcAUCcAuAAAGGcATsT 77% 5% 76% 4%
ND-9214
1323 uccuGuccAAccuGGGcAGTsT 1324 CUGCCcAGGUUGGAcAGGATsT 74% 9% 83% 6%
ND-9215
1325 AGGGAGuGGuAccGcuuccTsT 1326 GGAAGCGGuACcACUCCCUTsT 79% 6% 89% 4%
ND-9216
1327 GGcuGuGccuAcAucuucuTsT 1328 AGAAGAUGuAGGcAcAGCCTsT 11% 1% 13% 1%
ND-9217
1329 GAAAuuAAAGAGGAGcuGGTsT 1330 CcAGCUCCUCUUUAAUUUCTsT 84% 14% 78% 5%
ND-9218
1331 AcuGGAAGAucGGcuuccATsT 1332 UGGAAGCCGAUCUUCcAGUTsT 50% 4% 55% 3%
ND-9219
1333 ccuGuccAAccuGGGcAGcTsT 1334 GCUGCCcAGGUUGGAcAGGTsT 78% 6% 85% 5%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1ercribado50 nMen H441; MV SD 2do cribado50nM en H441 SD
ND-9220
1335 ccuGccuuuAuGGAuGAuGTsT 1336 cAUcAUCcFuAAAGGcAGGTsT 76% 5% 77% 9%
ND-9221
1337 AAccGcAuGAAGAcGGccuTsT 1338 AGGCCGUCUUcAUGCGGUUTsT 79% 8% 66% 3%
ND-9222
1339 uGuccAAccuGGGcAGccATsT 1340 UGGCUGCCcAGGUUGGAcATsT 70% 4% 57% 4%
ND-9223
1341 GuccAAccuGGGcAGccAGTsT 1342 CUGGCUGCCcAGGUUGGACTsT 95% 10% 76% 4%
ND-9224
1343 AAAuuAAAGAGGAGcuGGATsT 1344 UCcAGCUCCUCUUuAAUUUTsT 83% 6% 69% 2%
ND-9225
1345 GGAAGGAcuGGAAGAucGGTsT 1346 CCGAUCUUCcAGUCCUUCCTsT 41% 2% 30% 2%
ND-9226
1347 GuGAGGGAGuGGuACCGcuTsT 1348 AGCGGuACcACUCCCUcACTsT 21% 1% 17% 0%
ND-9227
1349 AcuuucAAuGAcAAGAAcATsT 1350 UGUUCUUGUcAUUGAAAGUTsT 13% 1% 10% 0%
ND-9228
1351 ucAAuGAcAAGAAcAAcucTsT 1352 GAGUUGUUCUUGUcAUUGATsT 36% 2% 28% 0%
ND-9229
1353 cuuuAuGGAuGAuGGUGGcTsT 1354 GCcACcAUcAUCcAuAAAGTsT 24% 1% 20% 1%
ND-9230
1355 GccuGGcGuGGAGAccuccTsT 1356 GGAGGUCUCcACGCcAGGCTsT
ND-9231
1357 uGGcGuG-GAGAccuccAucTsT 1358 GAUGGAGGUCUCcACGCcATsT 45% 4% 35% 2%
ND-9232
1359 GAGuuccAccGcuccuAccTsT 1360 GGuAGGAGCGGUGGAACUCTsT 89% 4% 86% 8%
ND-9233
1361 cAGAGcAGAAuGAcuucAuTsT 1362 AUGAAGUcAUUCUGCUCUGTsT 21% 1% 17% 0%
ND-9234
1363 uucAcuccuGcuuccAGCATsT 1364 UCCUGGAAGcAGGAGUGAATsT 85% 4% 74% 6%
ND-9235
1365 ucAcuccuGcuuccAGGAGTsT 1366 CUCCUGGAAGcAGGAGUGATsT
ND-9236
1367 cuGuGcAAccAGAACAAAuTsT 1368 AUUUGUUCUGGUUGcAcAGTsT 23% 1% 17% 2%
ND-9237
1369 cuGcAAcAAcAccAccAucTsT 1370 GAUGGUGGUGUUGUUGcAGTsT 34% 2% 27% 2%
ND-9238
1371 uGuGGcuGuGccuAcAucuTsT 1372 AGAUGuAGGcAcAGCCACATsT 86% 4 % 73% 10%
ND-9239
1373 uGGcuGuGccuAcAucuucTsT 1374 GAAGAUGuAGGcAcAGCcATsT 68% 6% 53% 4%
ND-9240
1375 cuGuccAAccuGGGcAGccTsT 1376 GGCUGCCcAGGUUGGAcAGTsT 80% 5% 73% 9%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1er cribado50 nMen H441; MV SD 2do cribado50nM en H441 SD
ND-9241
1377 cccuGcuGuccAcAGuGAcTsT 1378 GUcACUGUGGAcAGcAGGGTsT 83% 5% 71% 5%
ND-9242
1379 GcAGccAGuGGAGccuGuGTsT 1380 cAcAGGCUCcACUGGCUGCTsT 105% 9% 90% 5%
ND-9243
1381 uucAAuGACAAGAAcAAcvTsT 1382 AGUUGUUCUUGUcAUUGAATsT 23% 3% 21% 1%
ND-9244
1383 cuGccuuuAuGGAuGAuGGTsT 1384 CcAUcAUCcAuAAAGGcAGTsT 74% 6% 64% 7%
ND-9245
1385 AAuGAcAAGAAcAAcuccATST 1386 UGGAGUUGUUCUUGUcAUUTsT 21% 1% 21% 1%
ND-9246
1387 uGGGcAGccAGuGGAGccuTsT 1388 AGGCUCcACUGGCUGCCcATsT 83% 3% 73% 2%
ND-9247
1389 cuccuGuccAAccuGGGcATsT 1390 UGCCcAGGUUGGAcAGGAGTsT 86% 3% 84% 1%
ND-9248
1391 GGcGuGGAGAccuccAucATsT 1392 UGAUGGAGGUCUCcACGCCTsT 92% 4% 88% 3%
Tabla 1D: Los ARNi corto seleccionados en el conjunto sustituto de cobayo in vivo (ARNi corto de reactividad cruzada de humano-cobayo). Se identifico un conjunto de cribado de 63 secuencias de ARNi para alfa-ENaC de reactividad cruzada de humano y cobayo, y se sintetizaron, tanto con (cadenas de secuencias 1393 - 1518) como sin (cadenas de secuencias 1519 - 1644) modificacion de la estructura base. Se muestra el porcentaje de expresion residual de alfa-ENaC en dos experimentos de transfeccion de una sola dosis independientes (referirse a la seccion de ejemplos para ver los metodos empleados).
ID del Duplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1er cribado 50 nM en H441; MV SD 2do cribado 50 nM en H441 SD
ND8437
1393 AAucGGAcuGcuucuAccATsT 1394 UGGuAGAAGcAGUCCGAUUTsT 48% 7% 46% 5%
ND8438
1395 AucGGAcuGcuucuAccAGTsT 1396 CUGGuAGAAGCAGUCCGAUTsT 85% 5% 93% 13%
ND8439
1397 AAAucGGAcuGcuucuAccTsT 1398 GGuAGAAGcAGUCCGAUUUTsT 36% 3% 42% 6%
ND8440
1399 ucGGAcuGcuucuAccAGATsT 1400 UCUGGuAGAAGcAGUCCGATsT 45% 3% 50% 4%
ND8441
1401 AccAGAAcAAAucGGAcuGTsT 1402 cAGUCCGAUUUGUUCUGGUTsT 23% 3% 24% 6%
ND8442
1403 ccAGAAcAAAucGGAcuGcTsT 1404 GcAGUCCGAUUUGUUCUGGTsT 50% 6% 39% 9%
ND8443
1405 cAGAAcAAAucGGAcuGcuTsT 1406 AGcAGUCCGAUUUGUUCUGTsT 22% 2% 24% 1%
ND8444
1407 cuucGccuGccGcuucAAcTsT 1408 GUUGAAGCGGcAGGCGAAGTsT 111% 6% 109% 4%
ND8445
1409 uGGuAccGcuuccAcuAcATsT 1410 UGuAGUGGAAGCGGuACcATsT 84% 7% 97% 13%
ND8446
1411 AucuucGccuGccGcuucATsT 1412 UGAAGCGGcAGGCGAAGAUTsT 90% 3% 121% 13%
ND8447
1413 uucGccuGccGcuucAAccTsT 1414 GGUUGAAGCGGcAGGCGAATsT 92% 2% 105% 17%
ND8448
1415 cAcccucAAucccuAcAGGTsT 1416 CCUGuAGGGAUUGAGGGUGTsT 79% 3% 90% 13%
ND8449
1417 AGAAcAAAucGGAcuGcuuTsT 1418 AAGcAGUCCGAUUUGUUCUTsT 11% 0% 17% 3%
ND8450
1419 GAAcAAAucGGAcuGcuucTsT 1420 GAAGcAGUCCGAUUUGUUCTsT 21% 1% 30% 5%
ND8451
1421 cGGAcuGcuucuAccAGAcTsT 1422 GUCUGGuAGAAGcAGUCCGTsT 24% 2% 32% 5%
ND8452
1423 AGccucAAcAucAAccucATsT 1424 UGAGGUUGAUGUUGAGGCUTsT 51% 3% 57% 4%
ND8453
1425 GccucAAcAucAAccucAATsT 1426 UUGAGGUUGAUGUUGAGGCTsT 16% 1% 26% 3%
ND8454
1427 GucAGccucAAcAucAAccTsT 1428 GGUUGAUGUUGAGGCUGACTsT 62% 5% 68% 6%
ND8455
1429 ucAGccucAAcAucAAccuTsT 1430 AGGUUGAUGUUGAGGCUGATsT 77% 4% 87% 6%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1ercribado50 nMen H441; MV SD 2do cribado50 nMen H441 SD
ND8456
1431 cAGccucAAcAucAAccucTsT 1432 GAGGUUGAUGUUGAGGCUGTsT 34% 2% 51% 8%
ND8457
1433 GGAGcuGGAccGcAucAcATsT 1434 UGUGAUGCGGUCcAGCUCCTsT 26% 2% 17% 1%
ND8458
1435 GuAccGcuuccAcuAcAucTsT 1436 GAUGuAGUGCT AAGCGGuACTsT 101% 9% 99% 11%
ND8459
1437 ccGcuuccAcuAcAucAAcTsT 1438 GUUGAUGuAGUGGAAGCGGTsT 85% 8% 80% 6%
ND8460
1439 cGcuuccAcuAcAucAAcATsT 1440 UGUUGAUGuAGUGGAAGCGTsT 56% 6% 48% 3%
ND8461
1441 uuccAcuAcAucAAcAuccTsT 1442 GGAUGUUGAUGuAGUGGAATsT 77% 5% 82% 7%
ND8462
1443 uGGGcAAcuucAucuucGcTsT 1444 GCGAAGAUGAAGUUGCCcATsT 21% 0% 36% 6%
ND8463
1445 GcAAcuucAucuucGccuGTsT 1446 cAGGCGAAGAUGAAGUUGCTsT 80% 4% 84% 13%
ND8464
1447 cAAcuucAucuucGccuGcTsT 1448 GcAGGCGAAGAUGAAGUUGTsT 101% 1% 102% 14%
ND8465
1449 AAcuucAucuucGccuGccTsT 1450 GGcAGGCGAAGAUGAAGUUTsT 100% 4% 95% 12%
ND8466
1451 AcuucAucuucGccuGccGTsT 1452 CGGcAGGCGAAGAUGAAGUTsT 51% 4% 49% 5%
ND8467
1453 cuucAucuucGccuGccGcTsT 1454 GCGGcAGGCGAAGAUGAAGTsT 95% 5% 89% 4%
ND8468
1455 ucAucuucGccuGccGcuuTsT 1456 AAGGGGcAGGCGAAGAUGATsT 91% 4% 85% 6%
ND8469
1457 cAucuucGccuGccGcuucTsT 1458 GAAGCGGcAGGCGAAGAUGTsT 66% 4% 55% 4%
ND8470
1459 ucuucGccuGccGcuucAATsT 1460 UUGAAGCGGcAGGCGAAGATsT 97% 2% 99% 11%
ND8471
1461 cGccuGccGcuucAAccAGTsT 1462 CUGGUUGAAGCGGcAGGCGTsT 96% 4% 100% 7%
ND8472
1463 GccuGccGcuucAAccAGGTsT 1464 CCUGGUUGAAGCGGcAGGCTsT 90% 4% 82% 5%
ND8473
1465 AuuAcucucAcuuccAccATsT 1466 UGGUGGAAGUGAGAGuAAUTsT 81% 3% 72% 4%
ND8474
1467 uuAcucucAcuuccAccAcTsT 1468 GUGGUGGAAGUGAGAGuAATsT 72% 2% 76% 9%
ND8475
1469 AcucucAcuuccAccAcccTsT 1470 GGGUGGUGGAAGUGAGAGUTsT 90% 3% 97% 4%
ND8476
1471 ucuGcAcccucAAucccuATsT 1472 uAGGGAUUGAGGGUGcAGATsT 61% 1% 63% 3%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1ercribado50 nMen H441; MV SD 2do cribado50 nMen H441 SD
ND8477
1473 cuGcAcccucAAucccuAcTsT 1474 GuAGGGAUUGAGGGUGcAGTsT 74% 3% 73% 1%
ND8478
1475 uGcAcccucAAucccuAcATsT 1476 UGuAGGGAUUGAGGGUGcATsT 98% 4% 85% 1%
ND8479
1477 AcccucAAucccuAcAGGuTsT 1478 ACCUGuAGGGAUUGAGGGUTsT 55% 5% 48% 3%
ND8480
1479 cccucAAucccuAcAGGuATsT 1480 uACCUGuAGGGAUUGAGGGTsT 20% 1% 14% 1%
ND8481
1481 ccucAAucccuAcAGGuAcTsT 1482 GuACCUGuAGGGAUUGAGGTsT 40% 2% 31% 3%
ND8482
1483 AAccAGAAcAAAucGGAcuTsT 1484 AGUCCGAUUUGUUCUGGUUTsT 57% 2% 52% 0%
ND8483
1485 AAcAAAucGGAcuGcuucuTsT 1486 AGAAGcAGUCCGAUUUGUUTsT 102% 5% 86% 12%
ND8484
1487 AcAAAucGGAcuGcuucuATsT 1468 uAGAAGcAGUCCGAUUUGUTsT 40% 2% 28% 3%
ND8485
1489 cAAAucGGAcuGcuucuAcTsT 1490 GuAGAAGcAGUCCGAUUUGTsT 41% 4% 38% 2%
ND8486
1491 GcAcccucAAucccuAcAGTsT 1492 CUGuAGGGAUUGAGGGUGCTsT 91% 7% 94% 4%
ND8487
1493 ccucAAcAucAAccucAAcTsT 1494 GUUGAGGUUGAUGUUGAGGTsT 46% 2% 37% 3%
ND8488
1495 cucAAcAucAAccucAAcuTsT 1496 AGUUGAGGUUGAUGUUGAGTsT 48% 2% 39% 3%
ND8489
1497 ucAAcAucAAccucAAcucTsT 1498 GAGUUGAGGUUGAUGUUGATsT 17% 1% 17% 1%
ND8490
1499 uAccGcuuccAcuAcAucATsT 1500 UGAUGuAGUGGAAGCGGuATsT 90% 5% 74% 8%
ND8491
1501 AccGcuuccAcuAcAucAATsT 1502 UUGAUGuAGUGGAAGCGGUTsT 103% 5% 91% 15%
ND8492
1503 GcuuccAcuAcAucAAcAuTsT 1504 AUGUUGAUGuAGUGGAAGCTsT 85% 5% 71% 10%
ND8493
1505 cuuccAcuAcAucAAcAucTsT 1506 GAUGUUGAUGuAGUGGAAGTsT 60% 5% 45% 3%
ND8494
1507 uccAcuAcAucAAcAuccuTsT 1508 AGGAUGUUGAUGuAGUGGATsT 33% 3% 41% 3%
ND8495
1509 ccAcuAcAucAAcAuccuGTsT 1510 cAGGAUGUUGAUGuAGUGGTsT 60% 5% 55% 2%
ND8496
1511 cuGGGcAAcuucAucuucGTsT 1512 CGAAGAUGAAGUUGCCcAGTsT 18% 0% 20% 0%
ND8497
1513 GGcAAcuucAucuucGccuTsT 1514 AGGCGAAGAUGAAGUUGCCTsT 76% 1% 77% 2%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1ercribado50 nMen H441; MV SD 2do cribado50 nM enH441 SD
ND8498
1515 uucAucuucGccuGccGcuTsT 1516 AGCGGcAGGCGAAGAUGAATsT 65% 4% 74% 12%
ND8499
1517 ucGccuGccGcuucAAccATsT 1518 UGGUUGAAGCGGcAGGCGATsT 86% 5% 77% 3%
ND-8653
1519 AAUCGGACUGCUUCUACCATsT 1520 UGGUAGAAGCAGUCCGAUUTsT 16% 2% 20% 3%
ND-8654
1521 AUCGGACUGCUUCUACCAGTsT 1522 CUGGUAGAAGCAGUCCGAUTsT 54% 8% 67% 11%
ND-8655
1523 AAAUCGGACUGCUUCUACCTsT 1524 GGUAGAAGCAGUCCGAUUUTsT 25% 4% 28% 2%
ND-8656
1525 UCGGACUGCUUCUACCAGATsT 1526 UCUGGUAGAAGCAGUCCGATsT 12% 2% 17% 1%
ND-8657
1527 ACCAGAACAAAUCGGACUGTsT 1528 CAGUCCGAUUUGUUCUGGUTsT 33% 3% 35% 1%
ND-8658
1529 CCAGAACAAAUCGGACUGCTsT 1530 GCAGUCCGAUUUGUUCUGGTsT 27% 3% 30% 2%
ND-8659
1531 CAGAACAAAUCGGACUGCUTsT 1532 AGCAGUCCGAUUUGUUCUGTsT 15% 1% 22% 3%
ND-8660
1533 CUUCGCCUGCCGCUUCAACTsT 1534 GUUGAAGCGGCAGGCGAAGTsT 69% 17% 75% 10%
ND-8661
1535 UGGUACCGCUUCCACUACATsT 1536 UGUAGUGGAAGCGGUACCATsT 16% 2% 20% 3%
ND-8662
1537 AUCUUCGCCUGCCGCUUCATsT 1538 UGAAGCGGCAGGCGAAGAUTsT 19% 2% 25% 4%
ND-8663
1539 UUCGCCUGCCGCUUCAACCTsT 1540 GGUUGAAGCGGCAGGCGAATsT 90% 4% 97% 10%
ND-8664
1541 CACCCUCAAUCCCUACAGGTsT 1542 CCUGUAGGGAUUGAGGGUGTsT 19% 2% 25% 3%
ND-8665
1543 AGAACAAAUCGGACUGCUUTsT 1544 AAGCAGUCCGAUUUGUUCUTsT 13% 1% 22% 2%
ND-8666
1545 GAACAAAUCGGACUGCUUCTsT 1546 GAAGCAGUCCGAUUUGUUCTsT 11% 2% 18% 2%
ND-8667
1547 CGGACUGCUUCUACCAGACTsT 1548 GUCUGGUAGAAGCAGUCCGTsT 13% 1% 16% 2%
ND-8668
1549 AGCCUCAACAUCAACCUCATsT 1550 UGAGGUUGAUGUUGAGGCUTsT 17% 4% 21% 3%
ND-8669
1551 GCCUCAACAUCAACCUCAATsT 1552 UUGAGGUUGAUGUUGAGGCTsT 13% 1% 21% 3%
ND-8670
1553 GUCAGCCUCAACAUCAACCTsT 1554 GGUUGAUGUUGAGGCUGACTsT 43% 11% 27% 3%
ND-8671
1555 UCAGCCUCAACAUCAACCUTsT 1556 AGGUUGAUGUUGAGGCUGATsT 90% 17% 53% 13%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1ercribado50 nMen H441; MV SD 2do cribado50 nMen H441 SD
ND-8672
1557 CAGCCUCAACAUCAACCUCTsT 1558 GAGGUUGAUGUUGAGGCUGTsT 17% 3% 11% 3%
ND-8673
1559 GGAGCUGGACCGCAUCACATsT 1560 UGUGAUGCGGUCCAGCUCCTsT 25% 3% 18% 3%
ND-8674
1561 GUACCGCUUCCACUACAUGTsT 1562 GAUGUAGUGGAAGCGGUACTsT 21% 4% 16% 4%
ND-8675
1563 CCGCUUCCACUACAUCAACTsT 1564 GUUGAUGUAGUGGAAGCGGTsT 25% 4% 19% 3%
ND-8676
1565 CGCUUCCACUACAUCAACATsT 1566 UGUUGAUGUAGUGGAAGCGTsT 16% 3% 14% 1%
ND-8677
1567 UUCCACUACAUCAACAUCCTsT 1568 GGAUGUUGAUGUAGUGGAATsT 110% 19% 97% 9%
ND-8678
1569 UGGGCAACUUCAUCUUCGCTsT 1570 GCGAAGAUGAAGUUGCCCATsT 50% 8% 40% 5%.
ND-8679
1571 GCAACUUCAUCUUCGCCUGTsT 1572 CAGGCGAAGAUGAAGUUGCTsT 19% 3% 17% 2%
ND-8680
1573 CAACUUCAUCUUCGCCUGCTsT 1574 GCAGGCGAAGAUGAAGUUGTsT 25% 2% 23% 2%
ND-8681
1575 AACUUCAUCUUCGCCUGCCTsT 1576 GGCAGGCGAAGAUGAAGUUTsT 104% 7% 85% 10%
ND-8682
1577 ACUUCAUCUUCGCCUGCCGTsT 1578 CGGCAGGCGAAGAUGAAGUTsT 91% 8% 63% 9%
ND-8683
1579 CUUCAUCUUCGCCUGCCGCTsT 1580 GCGGCAGGCGAAGAUGAAGTsT 88% 6% 58% 6%
ND-8684
1581 UCAUCUUCGCCUGCCGCUUTsT 1582 AAGCGGCAGGCGAAGAUGATsT 76% 3% 64% 4%
ND-8685
1583 CAUCUUCGCCUGCCGCUUCTsT 1584 GAAGCGGCAGGCGAAGAUGTsT 15% 1% 18% 3%
ND-8686
1585 UCUUCGCCUGCCGCUUCAATsT 1586 UUGAAGCGGCAGGCGAAGATsT 109% 22% 31% 3%
ND-8687
1587 CGCCUGCCGCUUCAACCAGTsT 1588 CUGGUUGAAGCGGCAGGCGTsT 90% 21% 49% 2%
ND-8688
1589 GCCUGCCGCUUCAACCAGGTsT 1590 CCUGGUUGAAGCGGCAGGCTsT 43% 9% 24% 7%
ND-8689
1591 AUUACUCUCACUUCCACCATsT 1592 UGGUGGAAGUGAGAGUAAUTsT 27% 4% 19% 2%
ND-8690
1593 UUACUCUCACUUCCACCACTsT 1594 GUGGUGGAAGUGAGAGUAATsT 109% 7% 85% 8%
ND-8691
1595 ACUCUCACUUCCACCACCCTsT 1596 GGGUGGUGGAAGUGAGAGUTsT 93% 11% 87% 12%
ND-8692
1597 UCUGCACCCUCAAUCCCUATsT 1598 UAGGGAUUGAGGGUGCAGATsT 31% 12% 17% 2%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1ercribado50 nMen H441; MV SD 2do cribado50 nMen H441 SD
ND-8693
1599 CUGCACCCUCAAUCCCUACTsT 1600 GUAGGGAUUGAGGGUGCAGTsT 41% 25% 31% 4%
ND-8694
1601 UGCACCCUCAAUCCCUACATsT 1602 UGUAGGGAUUGAGGGUGCATsT 75% 25% 43% 3%
ND-8695
1603 ACCCUCAAUCCGUACAGGUTsT 1604 ACCUGUAGGGAUUGAGGGUTsT 65% 26% 25% 5%
ND-8696
1605 CCCUCAAUCCCUACAGGUATsT 1606 UACCUGUAGGGAUUGAGGGTsT 18% 2% 13% 1%
ND-8697
1607 CCUCAAUCCCUACAGGUACTsT 1608 GUACCUGUAGGGAUUGAGGTsT 16% 4% 13% 2%
ND-8698
1609 AACCAGAACAAAUCGGACUTsT 1610 AGUCCGAUUUGUUCUGGUUTsT 40% 2% 30% 2%
ND-8699
1611 AACAAAUCGGACUGCUUCUTsT 1612 AGAAGCAGUCCGAUUUGUUTsT 56% 4% 45% 3%
ND-8700
1613 ACAAAUCGGACUGCUUCUATsT 1614 UAGAAGCAGUCCGAUUUGUTsT 18% 3% 12% 1%
ND-8701
1615 CAAAUCGGACUGCUUCUACTsT 1616 GUAGAAGCAGUCCGAUUUGTsT 15% 2% 15% 4%
ND-8702
1617 GCACCCUCAAUCCCUACAGTsT 1618 CUGUAGGGAUUGAGGGUGCTsT 53% 4% 46% 20%
ND-8703
1619 CCUCAACAUCAACCUCAACTsT 1620 GUUGAGGUUGAUGUUGAGGTsT 25% 6% 26% 9%
ND-8704
1621 CUCAACAUCAACCUCAACUTsT 1622 AGUUGAGGUUGAUGUUGAGTsT 30% 8% 37% 26%
ND-8705
1623 UCAACAUCAACCUCAACUCTsT 1624 GAGUUGAGGUUGAUGUUGATsT 55% 1% 50% 10%
ND-8706
1625 UACCGCUUCCACUACAUCATsT 1626 UGAUGUAGUGGAAGCGGUATsT 36% 7% 31% 7%
ND-8707
1627 ACCGCUUCCACUACAUCAATsT 1628 UUGAUGUAGUGGAAGCGGUTsT 23% 5% 27% 10%
ND-8708
1629 GCUUCCACUACAUCAACAUTsT 1630 AUGUUGAUGUAGUGGAAGCTsT 16% 4% 24% 12%
ND-8709
1631 CUUCCACUACAUCAACAUCTsT 1632 GAUGUUGAUGUAGUGGAAGTsT 62% 3% 74% 27%
ND-8710
1633 UCCACUACAUCAACAUCCUTsT 1634 AGGAUGUUGAUGUAGUGGATsT 45% 8% 41% 1%
ND-8711
1635 CCACUACAUCAACAUCCUGTsT 1636 CAGGAUGUUGAUGUAGUGGTsT 23% 4% 27% 10%
ND-8712
1637 CUGGGCAACUUCAUCUUCGTsT 1638 CGAAGAUGAAGUUGCCCAGTsT 34% 4% 26% 5%
ND-8713
1639 GGCAACUUCAUCUUCGCCUTsT 1640 AGGCGAAGAUGAAGUUGCCTsT 30% 3% 23% 2%
ID delDuplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis unica del 1ercribado50 nMen H441; MV SD 2do cribadon50 nMen H441 SD
ND-8714
1641 UUCAUCUUCGCCUGCCGCUTsT 1642 AGCGGCAGGCGAAGAUGAATsT 90% 14% 85% 14%
ND-8715
1643 UCGCCUGCCGCUUCAACCATsT 1644 UGGUUGAAGCGGCAGGCGATsT 23% 2% 20% 4%
Tabla 2A: Concentracion en una inhibicion del 50% (IC50) para los agentes de ARNi de ejemplo de la Tabla 1A.
IC50 [nM] IC50 [nM]
1er DRC en 2do DRC en
ID del Duplex H441 H441
ND8294 0,1949 0,0468 ND8295 0,1011 0,0458 ND8299 0,5986 0,5638 ND8302 0,0144 0,0134 ND8313 0,0315 0,0124 ND8320 0,0796 0,0078 ND8331 0,0213 0,0158 ND8332 0,0205 0,0089 ND8343 0,0523 0,0293 ND8348 0,0156 0,0182 ND8356 0,0241 0,0099 ND8357 0,0054 0,0032 ND8363 0,1186 0,0337 ND8368 0,0487 0,1209 ND8371 0,0811 0,0911 ND8372 0,0584 0,0425 ND8373 0,0066 0,0165 ND8375 0,1176 0,1187 ND8380 0,6817 0,5747 ND8381 0,0037 0,0041 ND8383 0,0275 0,1257 ND8384 0,0357 0,0082 ND8391 0,0260 0,0349 ND8392 0,3831 0,4775 ND8396 0,0023 0,0052 ND8403 0,0808 0,0759
Tabla 2B: Concentracion en una inhibicion del 50% (lC50) y para los agentes de ARNi de ejemplo de la Tabla 1D.
ID del Duplex
ND8441 ND8443 ND8449 ND8450 ND8451 ND8453 ND8489 ND8496
IC50 [nM]
1er DRC en
H441
0,6738 0,0346 0,0120 0,0257 0,1320 0,0079 0,1640 0,0387
IC50 [nM]
2do DRC en
H441
0,8080 0,0263 0,0067 0,0106 0,0931 0,0033 0,1593 0,0185
Tabla 2C: Porcentaje de actividad del ARNi de ejemplo hacia la inhibicion de la expresion del gen para alfa-ENaC en
los ensayos descritos en el Ejemplo 3.
Identificador del duplex
% de expresion de alfa- Expresion de alfa-ENaC
ENaC en HBEC primario (%
de cinomologo (% de
de control) ARNi corto 50 nM
control) ARNi corto 45nM
No transfectado
77,2 n/a
Control no direccionado
100 93,3
Control negativo (sin alfa-ENaC de cinomologo) ND8449
n/a 100
ND-8302
30,2 57
ND-8332
24,7 54,3
ND-8348
40,1 56,2
ND-8356
36,6 55,8
ND-8357
29,6 50,4
ND-8373
30,4 53,8
ND-8381
32,5 40,4
ND-8396
34,1 46,3
ND-8450
45,9 78,9
ND-8453
30,1 55,3

Claims (17)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una composicion que comprende un agente de ARNi que contiene una cadena sentido y una cadena antisentido, en donde:
    a. la cadena sentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de ND8453 (SEQ ID NO: 1425 ), y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena antisentido de ND8453 ( SEQ m NO: 1426 ), o
    b . la cadena sentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de ND8489 (SEQ ID NO: 1497), y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena antisentido de ND8489 ( SEQ m NO: 1498); o
    c . la cadena sentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de ND8456 (SEQ ID NO: 1431), y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleotidos de la cadena antisentido de ND8456 (SEQ ID NO: 1432).
  2. 2.
    La composicion de la reivindicacion 1, en donde la cedena sentido es de 30 o menos nucleotidos de longitud, y en donde la cadena sentido y la cadena antisentido forman una region duplex de 15 a 30 pares de nucleotidos de longitud.
  3. 3.
    La composicion de la reivindicacion 1, en donde la cedena antisentido y la cadena sentido son cada una de 19 a 23 nucleotidos de longitud.
  4. 4.
    La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente de ARNi comprende una modificacion que provoca que el agente de ARNi tenga una mayor estabilidad en una muestra biologica.
  5. 5.
    La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente de ARNi comprende un fosforotioato o un nucleotido modificado en 2'.
  6. 6.
    La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente de ARNi comprende:
    al menos un dinucleotido de 5'-uridina-adenina-3' (5'-ua-3'), en donde la uridina es un nucleotido modificado en 2'; al menos un dinucleotido de 5'-uridina-guanina-3' (5'-ug-3'), en donde la 5'-uridina es un nucleotido modificado en 2'; al menos un dinucleotido de 5'-citidina-adenina-3' (5'-ca-3'), en donde la 5'-citidina es un nucleotido modificado en 2'; o al menos un dinucleotido de 5'-uridina-uridina-3' (5'-uu-3'), en donde la 5'-uridina es un nucleotido modificado en 2'.
  7. 7.
    La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente de ARNi comprende una modificacion 2' seleccionada a partir del grupo que consiste en: 2'-desoxi, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-metiio, 2'-O-metoxi-etilo (2'-O-MOE), 2'-O-aminopropilo (2'-O-AP), 2'-O-dimet�I-amino-etiio (2'-O-DMAOE), 2'-O-dimetil-amino-propilo (2'-O-DMAP), 2'-O-dimetiIamino-etiIoxi-etiio (2'-O-DMAEOE), y 2'-O-N-metiI-acetamido (2'-O-NMA).
  8. 8.
    La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente de ARNi comprende un extremo romo.
  9. 9.
    La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente de ARNi comprende un nucleotido que sobresale que tiene de 1 a 4 nucleotidos no emparejados.
  10. 10.
    La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente de ARNi comprende un nucleotido que sobresale en el extremo 3' de la cadena antisentido del agente de ARNi.
  11. 11.
    La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente de ARNi es ND8453 (SEQ ID NOs: 1425 y 1426).
  12. 12.
    La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente de ARNi es ND8489 (SEQ ID NOs: 1497 y 1498).
  13. 13.
    La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente de ARNi es ND8456 (SEQ ID NOs: 1431 y SEQ ID NO: 1432).
  14. 14.
    La composicion de la reivindicacion 1, en donde el agente de ARNi esta ligado a uno o mas compuestos de diagnostico, grupo reportero, agente de entrecruzamiento; fraccion que confiera resistencia a Ia nucleasa, nucleobase natural o inusual, molecula Iipofilica, colesterol, lipido, lectina, esteroide, uvaol, hecigenina, diosgenina, terpeno, triterpeno, sarsasapogenina, Friedelina, acido Iitocolico derivado de epifriedelanol, vitamina, carbohidrato, dextrano, pululano, quitina, quitosano, carbohidrato sintetico, Oligo Lactato de 15 mer, polimero natural, polimero de
    peso molecular bajo o medio, inulina, ciclodextrina, o acido hialuronico, proteina, agente enlazante de proteina, molecula destinada a la integrina, policationico, peptido, poliamina, imitacion de peptido, y/o transferrina.
  15. 15.
    Una composicion que comprende un agente de ARNi para alfa-ENaC, en donde el agente de ARNi comprende una cadena sentido y una cadena antisentido,
    5 en donde la cadena sentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena sentido de un agente de ARNi seleccionado del grupo que consiste de ND8453 (SEQ ID NO: 1425), ND8489 ( SEQ ID NO: 1497), y ND8456 ( SEQ ID NO: 1431), y
    en donde la cadena sentido comprende al menos 19 nucleotidos contiguos de la cadena antisentido de un agente de ARNi seleccionado del grupo que consiste de ND8453 (SEQ ID NO: 1426); ND8489 (SEQ ID NO: 1498), y ND8456
    10 (SEQ ID NO: 1432),
    la composicion comprende ademas un ligando del receptor epitelial.
  16. 16.
    La composicion de la reivindicacion 15, en donde el ligando del receptor epitelial es (i) transferrina, o (ii) acido folico.
  17. 17.
    La composicion de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 15 para uso en terapia.
    15 18. La composicion de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 15 para uso en el tratamiento de una enfermedad mediada por disfuncion del canal de sodio epitelial seleccionada de: fibrosis quistica, discinesia ciliar primaria, bronquitis cronica, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COPD), asma, infeccion del tracto respiratorio, carninoma pulmonar, sindrome de Liddles, hipertension, insuficiencia renal y desequilibrio de electrolitos.
    � � �2�
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