ES2433424T3

ES2433424T3 - Métodos y sistemas para predecir respuesta de células frente a un agente terapéutico

Info

Publication number: ES2433424T3
Application number: ES09791584T
Authority: ES
Inventors: Birgit Schoeberl; Brian Harms; Francis David Gibbons; Jonathan Basil Fitzgerald; Matthew David Onsum; Ulrik Nielsen; William Kubasek
Original assignee: Merrimack Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Merrimack Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2008-08-15
Filing date: 2009-08-17
Publication date: 2013-12-11
Anticipated expiration: 2029-08-17
Also published as: IL210865A; IL210865A0; EP2318548A2; CA2732658A1; MA32630B1; MX2011001764A; ECSP11010872A; HK1155782A1; US20170307631A1; NZ591137A; PE20120015A1; US20140127238A1; CR20110128A; US20110159513A1; BRPI0917871A2; EA022884B1; KR20110044905A; SV2011003840A; WO2010019952A3; CN102224255A

Abstract

Un anticuerpo anti-ErbB3 para su uso en un método para tratar un paciente que tiene un tumor neoplásico,comprendiendo dicho método administrar el anticuerpo anti-ErbB3 al paciente si el nivel de ErbB3 fosforilado(pErbB3) en una muestra del tumor obtenido a partir del paciente se determina que no es menor de 0,064 pg/μg deproteína total.

Description

Métodos y sistemas para predecir respuesta de células frente a un agente terapéutico

5 Antecedentes de la invención

Se han realizado avances considerables en el desarrollo de terapias dirigidas para el tratamiento de cáncer y otras enfermedades. Tales terapias dirigidas incluyen anticuerpos monoclonales que se unen a antígenos que se expresan específicamente o de forma preferente en células tumorales y fármacos de molécula pequeña que 10 interfieren específicamente con componentes específicos de rutas de señalización activas en células tumorales. Por ejemplo, cetuximab (Erbitux®) es un anticuerpo monoclonal que se dirige al receptor del factor del crecimiento epidérmico (EGFR, también conocido como ErbB1 o HER1) que se expresa en al menos determinados cánceres de colon y cánceres de cabeza y cuello. También, por ejemplo, imatinib (Gleevec®) es una molécula pequeña que se dirige a la tirosina quinasa BCR-Abl, que se expresa y actúa como un factor oncogénico, en determinadas leucemias

15 mieloides crónicas y es una variante anormal de una proteína celular benigna. Aunque tales terapias dirigidas han demostrado ser eficaces en algunos pacientes, el índice de respuesta nunca es del 100%. Por ejemplo, el índice de respuesta promedio para monoterapia de cetuximab es únicamente aproximadamente el 15-20% de pacientes, incluso cuando se sabe que los tumores expresan ErbB1 (EGFR). Por tanto, la expresión simple de ErbB1 (el antígeno al que se dirige el anticuerpo cetuximab) en un tumor no garantiza la sensibilidad a cetuximab.

20 Por lo tanto, aunque las terapias dirigidas son muy prometedoras, el índice de respuesta variable de los pacientes a tales terapias, combinado con los efectos secundarios asociados con tales terapias y el coste típico elevado de tales terapias, indica que los métodos para tratar pacientes que implican la predicción de cuáles pacientes son propensos a responder al tratamiento terapéutico y la administración del tratamiento únicamente a los pacientes que se predice

25 que responderán son altamente deseables. Un enfoque que se ha tomado ha sido tratar de identificar marcadores genéticos (por ejemplo, mutaciones o alelos) que se correlacionan con la sensibilidad a la terapia. En este enfoque, se determina el genotipo de una muestra de un paciente antes del tratamiento para determinar si el paciente porta un marcador o marcadores genéticos que son indicativos de sensibilidad a terapia. Otro enfoque que se ha adoptado es tratar de identificar biomarcadores de proteína que se correlacionan con sensibilidad a terapia. En este enfoque,

30 la expresión de proteína se determina en una muestra a partir del paciente antes del tratamiento para determinar si el paciente expresa uno más biomarcadores de proteína que son indicativos de sensibilidad a terapia.

Ambos enfoques mencionados anteriormente se pueden considerar enfoques de marcador “directo”, donde la presencia (o ausencia o nivel de expresión) del marcador o marcadores (por ejemplo, BCR-Abl o ErbB1) que se está 35 midiendo directamente se ha demostrado que se correlaciona con la sensibilidad o la no sensibilidad a la terapia. Además, ambos de estos enfoques dependen del uso de marcadores que son suficientemente estables en células de forma que los mismos se pueden medir o cuantificar de forma fiable en una muestra que se ha aislado a partir del paciente. Considerando que puede haber un lapso de tiempo considerable entre el momento en el que una muestra se aísla a partir de un paciente y el momento en el que el marcador o marcadores se miden en la muestra, tales

40 enfoques de marcador “directo” descritos anteriormente típicamente requieren el uso de marcadores genéticos o de proteína que no estén sujetos a degradación o alteración a lo largo del tiempo cuando las muestras se someten a procesamiento y manipulación convencional. Aunque se han identificado tales marcadores “directos” estables que son predictivos de sensibilidad a determinados agentes terapéuticos, no está claro si tales marcadores se pueden identificar para todos los agentes terapéuticos.

45 Se cree que los tumores se impulsan a crecer por una serie de rutas de señalización activadas por ligando, que habitualmente se activan por ligandos que se unen a sus receptores afines, induciendo la fosforilación del propio receptor así como también de quinasas cadena abajo, conduciendo a fosforilación adicional de componentes cadena abajo de la ruta. Estas quinasas desencadenen la supervivencia y proliferación celular. Por consiguiente, la

50 activación de la ruta de señalización conduce a alteración de componentes intracelulares, en particular fosforilación de proteína. La firma de fosforilación de los receptores expresados en tejido tumoral puede ayudar a identificar las rutas principales que impulsan la progresión de un tumor particular. Sin embargo, las fosfoproteínas pueden ser muy lábiles y la fosforilación puede disiparse rápidamente después de cirugía si la muestra de tejido no se congela inmediatamente y rápidamente (o, en algunos casos, si no se fija en formalina). Además, incluso cuando es posible

55 medir de forma fiable los niveles de una o más fosfoproteínas en una muestra de un tumor particular, el valor predictivo de la presencia o ausencia de cualquier fosfoproteína particular con respecto a la eficacia del tratamiento de un tumor de este tipo con cualquier agente terapéutico particular generalmente se desconoce. Por lo tanto, aunque los perfiles de fosfoproteína contienen información importante acerca de las rutas que impulsan la progresión tumoral, tales perfiles de fosfoproteína actualmente no se usan ampliamente como biomarcadores para

60 predecir la sensibilidad a tratamiento terapéutico.

Por consiguiente, se necesitan métodos nuevos para determinar los niveles de diversas fosfoproteínas y de uso de tales niveles y otras características de células tumorales para predecir la sensibilidad de tumores individuales frente a agentes terapéuticos particulares para mejorar la eficacia terapéutica y de coste de terapias contra el cáncer.

Sumario de la invención

En el presente documento se proporcionan métodos para predecir la sensibilidad de células, en particular células neoplásicas tales como células tumorales (por ejemplo, células de tumores benignos o células de tumores malignos) 5 y células malignas que no son células tumorales, frente a agentes terapéuticos y métodos para tratar pacientes que tienen tales tumores con agentes terapéuticos.

La invención proporciona un anticuerpo anti-ErbB3 para su uso en un método para tratar un paciente que tiene un tumor neoplásico, comprendiendo dicho método administrar el anticuerpo anti-ErbB3 al paciente si el nivel de ErbB3 fosforilado (pErbB3) en una muestra del tumor obtenida a partir del paciente se determina que no es menor de 0,064 pg/!g de proteína total.

En determinadas realizaciones, el tumor es un anticuerpo anti-ErbB3 para su uso en un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el tumor es un tumor maligno de un órgano seleccionado entre colon, pulmón, recto, vesícula 15 biliar, cerebro, médula espinal, mama, riñón, páncreas, estómago, hígado, hueso, piel, bazo, ovario, testículo, próstata y músculo.

El anticuerpo anti-ErbB3 puede comprender al menos uno de:

(i): un anticuerpo que tiene las secuencias de región variable de cadena pesada (VH) y región variable de cadena ligera (VL) como se muestra en SEC ID Nº: 1 y 2, respectivamente o un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de VH yVL mostradas en SEC ID Nº: 7-9 y 10-12, respectivamente;

(ii): un anticuerpo que tiene las secuencias de VH yVL mostradas en SEC ID Nº: 3 y 4, respectivamente o un

anticuerpo que comprende las secuencias de CDR de VH y VL mostradas en SEC ID Nº: 13-15 y 16-18, 25 respectivamente;

(iii) un anticuerpo que tiene las secuencias de VH yVL mostradas en SEC ID Nº: 5 y 6, respectivamente o un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR de VH y VL mostradas en SEC ID Nº: 19-21 y 22-24, respectivamente;

(iv): un anticuerpo que tiene las secuencias de VH yVL mostradas en SEC ID Nº: 25 y 26, respectivamente o un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR de VH y VL mostradas en SEC ID Nº: 27-29 y 30-32, respectivamente; y

(v): un anticuerpo que tiene las secuencias de VH yVL mostradas en SEC ID Nº: 33 y 34, respectivamente o un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR de VH y VL mostradas en SEC ID Nº: 35-37 y 38-40, respectivamente,

35 Preferentemente el anticuerpo anti-ErbB3 comprende un anticuerpo que tiene las secuencias de región variable de cadena pesada (VH) y de región variable de cadena ligera (VL) mostradas en SEC ID Nº: 1 y 2, respectivamente o un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de VH yVL mostradas en SEC ID Nº: 7-9 y 10-12, respectivamente.

En determinadas realizaciones, el nivel de pErbB3 en la muestra se determina que es no menor de 0,08 pg/!g, 0,096 pg/!g, 0,122 pg/!g, 0,128 pg/!g, 0,144 pg/!g o 0,16 pg/!g de proteína total.

En determinadas realizaciones, el nivel de ErbB3 en las células de muestra se determina inferencialmente midiendo los niveles de otros biomarcadores más estables y usando un método computarizado usando un sistema informático

45 para generar un modelo informático para calcular (en base a niveles reales medidos empíricamente de otros biomarcadores en las células de la muestra) un Estado de Activación de Red que determine, mediante simulación, los niveles de pErbB3 en las células de la muestra.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1A-1D son gráficos que muestran la inhibición del crecimiento de tumor de xenoinjerto mediante tratamiento con el anticuerpo Ab Nº 6. La Figura 1A muestra los resultados del modelo de tumor de xenoinjerto de MALME3M. La Figura 1B muestra los resultados del modelo de tumor de xenoinjerto de DU145. La Figura 1C muestra los resultados del modelo de

55 tumor de xenoinjerto de ADRr. La Figura 1D muestra los resultados del modelo de tumor de xenoinjerto de ACHN. La Figura 2 es un gráfico que representa la concentración de ErbB3 fosforilado (pErbB3) en tumores de xenoinjerto no tratados (en pg/!g de proteína total) frente a la Reducción del Índice de Crecimiento (%) observada para los xenoinjertos cuando se tratan con Ab Nº 6. Las Figuras 3A-3E son gráficos de barras que muestran el nivel de pErbB3 (Figura 3A) y AKT fosforilado (pAKT) (Figura 3B) en muestras de tumor de xenoinjerto de ACHN congeladas 0, 10, 30 o 60 minutos después de la disección del xenoinjerto y los niveles de ErbB1 (Figura 3C), ErbB2 (Figura 3D) y ErbB3 (Figura 3E) en muestras de tumor de xenoinjerto de EKVX congeladas 0, 10, 30 o 60 minutos después de disección de xenoinjerto. Las Figuras 4A-4D muestran un diagrama esquemático del proceso de conversión de un dibujo de una ruta de

65 señalización en un modelo informático. La Figura 4A muestra un dibujo de la ruta de señalización de ErbB que comprende ligandos y receptores ErbB diferentes. La Figura 4B muestra un conjunto de reacciones bioquímicas

que describen las interacciones de proteínas representadas en el dibujo. La Figura 4C muestra un conjunto de flujos obtenidos a partir del conjunto de reacciones bioquímicas. La Figura 4D muestra un conjunto de ecuaciones diferenciales ordinarias no lineales (EDO) en base a cinética de acción de masa que describen redes de traducción de señal. Las Figuras 5A-5B son gráficos que muestran los niveles de fosfo-ErbB3, fosfo-ErbB2, fosfo-ErbB1 y fosfo-AKT a lo largo del tiempo en células estimuladas con nueve concentraciones diferentes de heregulina (HRG) (Figura 5A) o betacelulina (Figura 5B) en células de cáncer ovárico ADRr. Los parámetros del modelo computacional se calibraron para los resultados de simulación (líneas continuas) para describir los datos experimentales (puntos). La Figura 6 es un gráfico de barras que muestra el resultado del análisis de sensibilidad local para identificar marcadores clave de activación de ErbB3. La Figura 7 es un gráfico que muestra los niveles calculados de pErbB3 en las líneas de células MALME3M, DU145, ADRr y ACHN. Las Figuras 8A-8B son gráficos que muestran el uso de valores de NAS para predecir la sensibilidad de 15 líneas celulares frente a tratamiento con Ab Nº 6, en base a valores de NAS de umbral establecidos a partir de las 4 líneas de células en entrenamiento (MALME3M, DU145, ADRr y ACHN). La Figura 8A es un gráfico de barras que representa niveles de pErbB3 simulados para las 19 líneas celulares, desde los niveles más altos hasta los niveles más bajos de pErbB3. La Figura 8B es un gráfico que clasifica las 19 líneas celulares desde el valor de NAS más alto hasta el más bajo, clasificándose las líneas celulares que tienen los valores de NAS por debajo de MALME3M como no respondedoras (NR), clasificándose las líneas celulares que tienen valores de NAS por encima de ADRr como respondedoras y las líneas celulares que tienen valores de NAS entre MALME3M y ADRr clasificándose como indeterminadas. Las Figuras 9A-9C son gráficos que muestran la inhibición de crecimiento de tumor de xenoinjerto mediante tratamiento con el anticuerpo Ab Nº 6. La Figura 9A muestra los resultados del modelo de tumor de xenoinjerto de IGROV1. La Figura 9B muestra los resultados del modelo de tumor de xenoinjerto de OVCAR8. La Figura 9C muestra los resultados del modelo de tumor de xenoinjerto de SKOV3. Las Figuras 10A-10D son gráficos en los cuales se representa el logaritmo de la concentración de un receptor ErbB frente al logaritmo de la concentración de uno o más de los otros receptores ErbB. Los valores de receptor se muestran para las líneas celulares clasificadas como respondedoras o no respondedoras a Ab Nº 6. La Figura 10A representa ErbB2 frente a ErbB1. La Figura 10B representa ErbB3 frente a ErbB1. La Figura 10C representa ErbB2 frente a ErbB3. La Figura 10D representa ErbB1 frente a ErbB2 frente a ErbB3. La Figura 11 muestra un gráfico en el cual la concentración de logaritmo de HRG se representa frente a la concentración de logaritmo de ErbB1. En el gráfico, se separan las líneas celulares respondedoras frente a no respondedoras ensayadas en los estudios de xenoinjerto. Las Figuras 12A-12C son gráficos en los cuales se representa el logaritmo de los niveles de expresión normalizados (en pg/!g, determinados por ELISA) de diferentes componentes de la ruta de señalización de ErbB en líneas de células de xenoinjerto y muestras de tumor humano. La Figura 12A representa ErbB2 frente a ErbB1. La Figura 12B representa ErbB4 frente a ErbB3. La Figura 12C representa HRG-∀1 frente a BTC. Las Figuras 13A-13D son gráficos que muestran los resultados de inmunohistoquímica cuantitativa (qlHC) para líneas de células de xenoinjerto y muestras de tumor humano. La Figura 13A muestra una curva normal de la línea celular para ErbB1. Las Figuras 13B, 13C y 13D son gráficos de barras que representan los valores de qlHC de ErbB1, ErbB2 y ErbB3, respectivamente, en las líneas celulares de xenoinjerto (barras rojas) y muestras de tumor humano (barras azules). La Figura 14 es un gráfico de barras que muestra el nivel de heterodímero ErbB 1:3 fosforilado integrado (cantidad de heterodímeros integrados en el tiempo por célula) calculado para ocho líneas celulares, lo que les separa en no respondedoras (MALME3M, BT474, IGROV1 y ADRr) y respondedoras (OVCAR8, SKOV3, DU145 y ACHN) frente a Ab Nº 6. Las Figuras 15A y 15B son diagramas de flujo que incluyen diversas etapas funcionales y actos que se pueden llevar a cabo durante la implementación de determinadas realizaciones de la invención. La Figura 16 es una realización de un entorno informático que se puede usar para implementar determinados aspectos de la invención. Las Figuras 17A-D son gráficos de curvas de inhibición para células tratadas con el anticuerpo biespecífico H3 x B1D2. Las Figuras 17A y 17B muestran las curvas de inhibición para niveles de pErbB3 y niveles de pAKT, respectivamente, en células OVCAR8. Las Figuras 17C y 17D muestran las curvas de inhibición para los niveles de pErbB3 y niveles de pAKT, respectivamente, en células OVCAR8 transfectadas con HER2/ErbB2 (células OVCAR8-HER2). La línea continua representa los datos simulados a partir del modelo computacional, mientras que los círculos representan los datos determinados experimentalmente. Los valores de CI50 simulados (DR50sim) y los valores de CI50 determinados experimentalmente (DR50datos) también se muestran. Las Figuras 18A-D son gráficos de curvas de inhibición de células tratadas con el anticuerpos biespecífico H3 x B1D2. Las Figuras 18A y 18B muestran las curvas de inhibición para los niveles de pErbB3 y niveles de pAKT, respectivamente, en células ADrR. La línea continua representa los datos simulados a partir del modelo computacional, mientras que los círculos representan los datos determinados experimentalmente. Los valores de CI50 simulados (DR50sim) y los valores de CI50 determinados experimentalmente (DR50datos) también se muestran. Las Figuras 18C y 18D muestran las curvas de inhibición simulada para los niveles de pErbB3 y los niveles de pAKT, respectivamente, en células ADrR con tratamiento simulado con ARNi de ErbB1.

Las Figuras 19A-C son gráficos de los índices de crecimiento relativo (ICR) determinados in vivo de un panel de células tumorales en un modelo de xenoinjerto tratadas con H3 x B1D2 representados frente a los niveles calculados de monómeros de ErbB2 (Figura 19A), homodímeros ErbB2:ErbB2 (Figura 19B) y heterodímeros ErbB2:ErbB3 (Figura 19C) en el panel de células tumorales en ausencia de H3 x B1D2.

5 Las Figuras 20A-B son gráficos de los índices de crecimiento relativo (ICR) determinados in vivo de un panel de células tumorales en un modelo de xenoinjerto tratadas con H3 x B1D2 representados frente a los niveles relativos calculados de heterodímeros ErbB2:ErbB3 (Figura 20A) y heterodímeros ErbB1:ErbB3 (Figura 20B) en el panel de células tumorales en ausencia y presencia simulada de H3 x B1D2. La Figura 21 proporciona representaciones gráficas de datos predichos (líneas de trazos) y reales (puntos de datos) de señalización de pErbB3 y pAKT inducida por HRG a partir de la línea de células que sobreexpresa ErbB2 BT474-M3 a dosis de HRG como se han indicado, como se detalla en el Ejemplo 11.

Descripción detallada

15 En el presente documento se describen métodos, sistemas y productos de programa informático en los cuales en el estado de activación de uno o más elementos (por ejemplo, ErbB3) en una o más rutas de señalización celular se determina a través del uso de marcadores indirectos en lugar de a través de medición directa de niveles de uno o más elementos. Tales mediciones indirectas se pueden usar para determinar el estado de activación de elementos en una ruta de señalización a través de simulación informática que modela la ruta de señalización. Utilizando los métodos descritos en el presente documento, esta información se puede usar posteriormente para predecir la sensibilidad de células frente a agentes terapéuticos y, por tanto, para seleccionar un tratamiento terapéutico para un paciente que tiene una enfermedad o trastorno (por ejemplo, cáncer).

A través del uso de los métodos descritos, se puede conseguir la determinación de una firma de fosforilación

25 ilustrativa de una muestra de células tumorales. Esto permite el uso de proteínas celulares fosforiladas como biomarcadores de sensibilidad frente a agentes terapéuticos sin la necesidad de medir directamente los niveles de tales fosfoproteínas en muestras de paciente, evitando de este modo los problemas potenciales asociados con la medición de fosfoproteína (por ejemplo, inestabilidad, no fiabilidad). Tales firmas de fosforilación determinadas por simulación se pueden usar para predecir de forma precisa la sensibilidad de las células frente a agentes terapéuticos antineoplásicos y, por lo tanto, se pueden usar para evitar administrar fármacos de cáncer al paciente que son ineficaces para tratar el cáncer del paciente. Además, los métodos desvelados permiten la simulación de los niveles de otros componentes lábiles dentro de una red celular, tales como homo y/o heterodímeros de receptores u homo y/o heterodímeros fosforilados, dentro de redes celulares, componentes que también se pueden usar para predecir la sensibilidad de células frente a agentes terapéuticos. Adicionalmente, los métodos desvelados permiten la

35 simulación del efecto de un agente terapéutico sobre componentes dentro de una red celular, lo cual también se puede usar para predecir la sensibilidad de células frente al agente terapéutico.

En determinados métodos, se miden los niveles de uno o más componentes celulares estables (tales como receptores de superficie celular, ligandos y similares) dentro de una red celular en una muestra de células (por ejemplo, células en una biopsia de tumor o un tumor resecado). En base a estas mediciones, se calcula un Estado de Activación de Red (o NAS) o un Estado de Inhibición de Red (NIS) para las células usando un modelo computacional (por ejemplo, un modelo computacional mecanicista) de una o más redes de transducción de señal. Por ejemplo, el NAS puede ser un valor numérico que representa el nivel calculado de una proteína fosforilada (que no se ha medido directamente) dentro de la red celular. Como alternativa, el NIS puede ser un valor numérico que

45 representa el nivel calculado de un componente dentro de la red celular en presencia simulada del agente terapéutico (en comparación con el nivel del componente en ausencia simulada del agente terapéutico). Mediante la comparación del NAS o NIS calculado con valores de control que representan los valores umbral de sensibilidad o no sensibilidad, se puede predecir si las células son propensas a responder al tratamiento terapéutico o no.

Por tanto se desvela el uso de marcadores “indirectos” de sensibilidad celular al tratamiento, donde el nivel de ese marcador “indirecto” (por ejemplo, una proteína fosforilada o dímero dentro de una ruta de señalización activada) no se mide directamente sino que se calcula o simula, en base a los niveles de otros componentes celulares que se miden directamente. Los métodos también pueden implicar el uso de algoritmos de clasificación estadística, por ejemplo en combinación con el cálculo de NAS o NIS.

55 En el contexto de la presente invención y como se ha descrito adicionalmente en la sección de ejemplos en el presente documento, se ha usado de forma satisfactoria un modelo computacional mecanicista de la ruta de señalización de ErbB para calcular los niveles de ErbB3 fosforilado (pErbB3), como un indicador de activación de la red celular de ErbB (o NAS) y los niveles de pErbB3 simulados demostraron predecir de forma precisa la sensibilidad de las líneas de células tumorales al tratamiento con un anticuerpo anti-ErbB3, Ab Nº 6, en un sistema de xenoinjerto in vivo. Adicionalmente, como se describe adicionalmente en la sección de ejemplos en el presente documento, se ha usado de forma satisfactoria un modelo computacional mecanicista de la ruta de señalización de ErbB para calcular los niveles relativos de heterodímero ErbB2/ErbB3 y heterodímero ErbB1/ErbB3 en la ausencia y presencia simulada de un agente terapéutico, como un indicador de inhibición de la red celular de ErbB (o NIS) y los niveles relativos simulados de heterodímeros ErbB2/ErbB3 y ErbB1/ErbB3 demostraron predecir de forma precisa la

65 sensibilidad de líneas de células tumorales al tratamiento con un anticuerpo biespecífico anti-ErbB3 x anti-ErbB2, H3 x B1D2, en un sistema de xenoinjerto in vivo.

De forma que la invención se pueda comprender más fácilmente, se definen en primer lugar determinados términos.

Como se usa en el presente documento, el término “agente terapéutico” tiene por objeto abarcar cualquiera y todos los compuestos que tienen una capacidad de disminuir o inhibir la gravedad de los síntomas de una enfermedad o

5 trastorno o aumentar la frecuencia y/o duración de los periodos sin síntomas o con síntomas reducidos en una enfermedad o trastorno o inhibir o prevenir el deterioro o discapacidad debido a una enfermedad o aflicción por trastorno o inhibir o retrasar la progresión de una enfermedad o trastorno o inhibir o retrasar la aparición de una enfermedad o trastorno o inhibir o prevenir la infección en una enfermedad o trastorno infeccioso. Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos incluyen moléculas orgánicas pequeñas, anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, agentes biológicos modificados por ingeniería genética de forma recombinante, compuestos de ARNi y similares.

Como se usa en el presente documento, un agente terapéutico que “se dirige a un componente dentro de una red celular” se refiere a un agente cuya actividad terapéutica se produce como resultado, al menos en parte, de que el

15 agente tenga un efecto directo o indirecto específico sobre la actividad de un componente dentro de una red celular. Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos que se dirigen a un componente dentro de una red celular incluyen el anticuerpo monoclonal cetuximab, que se une específicamente a ErbB1, dirigiéndose específicamente por tanto a ErbB1 dentro de la red celular de ErbB y gefitinib, una molécula pequeña que inhibe específicamente el dominio tirosina quinasa (TK) de ErbB1, dirigiéndose específicamente por tanto a ErbB1-TK dentro de la red celular de ErbB.

Como se usa en el presente documento, la expresión “Estado de Activación de Red” o “NAS” se refiere a un indicador, típicamente un valor numérico, que refleja o que corresponde al nivel de activación de una red celular. Un NAS típicamente se calcula usando un modelo computacional de la red celular. Un NAS puede representar, por 25 ejemplo, el nivel simulado de una o más proteínas fosforiladas dentro de una red celular. Aunque uno o más niveles de fosfoproteína son una realización preferida para el NAS (por ejemplo, nivel de pErbB3 como se describe adicionalmente en el Ejemplo 7 o nivel de homodímero o heterodímero de ErbB fosforilado, tal como nivel de heterodímero pErbB1/ErbB3 como se describe adicionalmente en el Ejemplo 10 o los niveles de quinasas cadena abajo tales como PI3K), otros componentes celulares dentro de una ruta de señalización activada pueden servir como un indicador o indicadores de activación de red y por tanto se pueden usar como el NAS, incluyendo pero sin limitación dimerización de receptor (homodímeros y heterodímeros, tales como niveles de homodímeros ErbB1/ErbB1 o ErbB2/ErbB2 o niveles de heterodímeros ErbB1/ErbB 2, ErbB1/ErbB 3, ErbB1/ErbB 4, ErbB2/ErbB 3

o ErbB2/ErbB 4), escisión de proteína, activación de factores de transcripción y activación de expresión génica. El Estado de Activación de Red de una célula, por ejemplo, una célula tumoral, es un indicador de la dependencia de la

35 célula de esa ruta de señalización, la cual se puede inhibir por un agente terapéutico que se dirige a esa ruta de señalización particular.

Como se usa en el presente documento, la expresión “Estado de Inhibición de Red” o “NIS” se refiere a un indicador, típicamente un valor numérico, que refleja o corresponde al nivel de inhibición de una red celular. Un NIS típicamente se calcula usando un modelo computacional de la red celular. Un NIS puede representar, por ejemplo, el nivel simulado de uno o más componentes dentro de una red celular en la presencia simulada de un agente terapéutico, en comparación con (o con relación a) el nivel o niveles simulados en la ausencia simulada del agente terapéutico. Por ejemplo, el NIS puede ser una proporción del nivel de uno o más componentes en la presencia simulada de un agente terapéutico y el nivel de ese uno o más componentes en la ausencia simulada del agente

45 terapéutico. Un ejemplo no limitante de un NIS es el nivel relativo calculado de uno o más homo o heterodímeros (tales como niveles relativos de heterodímeros ErbB2/3 y ErbB1/3) calculados en la ausencia y presencia simulada de un agente terapéutico (es decir, los niveles en presencia simulada del agente terapéutico en comparación con los niveles en ausencia simulada del agente terapéutico). Sin embargo, se apreciará que otros componentes celulares dentro de una ruta de señalización cuyos niveles se modulan por un agente terapéutico también pueden servir como un indicador o indicadores de inhibición de red y por tanto sus niveles se pueden usar como indicadores del NIS. El NIS de una célula y el NAS de una célula, por ejemplo, una célula tumoral, son indicadores del impacto del agente terapéutico sobre los componentes dentro de una ruta de señalización de la célula y pueden ser predictivos de sensibilidad de la célula a los efectos del agente terapéutico.

55 La expresión “modelo computacional de una red celular” se refiere a un modelo, tal como un programa informático, que traduce un diagrama de ruta biológica o dibujo (por ejemplo, un conjunto de interacciones de proteína pertinentes a un cáncer) en un conjunto de ecuaciones matemáticas susceptibles de simulación y análisis posterior. Determinada información (por ejemplo, concentraciones de ligando y/o proteína receptora, constantes de velocidad) se puede introducir en el modelo, que luego puede simular información adicional que puede no ser fácilmente medible (por ejemplo, niveles de fosfoproteína). Un Estado de Activación de Red (o NAS) o un Estado de Inhibición de Red (o NIS) de una red celular se puede calcular usando un modelo computacional de la red celular como se describe en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, el término “algoritmo” se refiere en general a un conjunto de instrucciones o

65 procedimientos o fórmulas, para llevar a cabo un método o resolver un problema. La expresión “algoritmo de clasificación estadística” se refiere a un algoritmo que define una relación estadística entre uno o más parámetros medibles o entradas, (por ejemplo, niveles de proteína medidos en una muestra de tejido) y un resultado particular o salida, (por ejemplo, sensibilidad a un agente terapéutico) de forma que se puede realizar una clasificación o predicción (por ejemplo, respondedoras frente a no respondedoras a un agente terapéutico).

5 Como se usa en el presente documento, el término “biomarcador” se refiere a una sustancia (por ejemplo, proteína, ARNm, alelo) dentro de o que se expresa por una célula, donde el biomarcador se correlaciona con la sensibilidad de la enfermedad a un tratamiento dado.

Como se usa en el presente documento, el término “biomarcador directo” se refiere a una sustancia (por ejemplo, proteína, ARNm, alelo) dentro de o expresada por una célula, donde el biomarcador directo se correlaciona con la sensibilidad de la enfermedad a un tratamiento dado y donde la presencia o nivel de esa sustancia se mide directamente en la célula para de ese modo predecir la sensibilidad de la enfermedad a un tratamiento dado.

Como se usa en el presente documento, el término “biomarcador indirecto” se refiere a una sustancia (por ejemplo,

15 proteína, ARNm, alelo) dentro de o expresada por, una célula, donde el biomarcador indirecto se correlaciona con la sensibilidad de la enfermedad a un tratamiento dado y donde la presencia o nivel de esa sustancia no se mide directamente en la célula, sino que se determina mediante medios indirectos, tal como mediante simulación usando un modelo computacional, para predecir de ese modo la sensibilidad de la enfermedad a un tratamiento dado.

Un “anticuerpo”, como se usa en el presente documento es una proteína que consiste en uno o más polipéptidos que comprenden dominios de unión codificados sustancialmente por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina, donde la proteína se une inmunoespecíficamente a un antígeno. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como también la miríada de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican

25 como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, las cuales a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Una unidad estructural de inmunoglobulina típica comprende un tetrámero que está compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena “ligera” (aproximadamente 25 kD) y una “pesada” (aproximadamente 50-70 kD). “VL” y VH” se refieren a estas cadenas ligera y pesada respectivamente.

Los anticuerpos incluyen inmunoglobulinas intactas así como también fragmentos de unión a antígeno de las mismas, los cuales se pueden producir mediante digestión con diversas peptidasas o sintetizarse de novo químicamente o usando tecnología de ADN recombinante. Tales fragmentos incluyen, por ejemplo, dímeros F (ab)2 y monómeros Fab. Los anticuerpos preferidos incluyen anticuerpos de cadena única (anticuerpos que existen como

35 una cadena polipeptídica única), más preferentemente anticuerpos Fv de cadena única (scFv) en los cuales una cadena VH y una VL se unen (directamente o a través de un enlazador peptídico) para formar un polipéptido continuo. 5.132.405 y 4.956.778).

“Inmunoespecífico” o “inmunoespecíficamente” se refieren a anticuerpos que se unen, a través de dominios sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina, a uno o más epítopos de una proteína de interés, pero que no reconocen ni se unen sustancialmente a otras moléculas en una muestra que contiene una población mixta de moléculas antigénicas. Típicamente, un anticuerpo se une a un antígeno afín con una Kd de al menos 50 nM, como se mide mediante un ensayo de resonancia de plasmón superficial o un ensayo de unión celular. El uso de tales ensayos se conoce bien en la técnica y se ilustra en el

45 Ejemplo 13, en el presente documento.

Un “anticuerpo anti-ErbB3” es un anticuerpo aislado que se une inmunoespecíficamente al ectodominio de ErbB3. Tal unión a ErbB3 muestra al menos una Kd de 50 nM medida mediante un ensayo de resonancia de plasmón superficial o un ensayo de unión celular. Se prefieren los anticuerpos anti-ErbB3 que inhiben la fosforilación mediada por ligando similar a EGF de ErbB3. Los ligandos similares a EGF incluyen EGF, TGF#, betacelulina, factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina, birregulina, epigen, epirregulina y anfirregulina, que típicamente se unen a ErbB1 e inducen heterodimerización de ErbB1 con ErbB3.

El término “biespecífico” como se usa en el presente documento se refiere una proteína que comprende dos sitios de

55 unión a antígeno, un primer sitio de unión que tiene una afinidad por un primer antígeno o epítopo y un segundo sitio de unión que tiene afinidad de unión por un segundo antígeno o epítopo diferente al primero.

Como se usa en el presente documento, el término “sujeto” o “paciente” incluye cualquier animal humano o no humano que tiene una enfermedad o trastorno para la cual se puede predecir la respuesta al tratamiento con un agente terapéutico usando los métodos de la invención, tal como un sujeto o paciente con un tumor. El término “animal no humano” incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, etc.

Muchos métodos descritos en el presente documento utilizan uno o más sistema o sistemas informáticos, tales como

65 ordenadores de fines especiales y de fines generales que incluyen diversos hardware informáticos, tales como dispositivos de entrada, dispositivos de salida, procesadores, medios de almacenamiento y otros componentes informáticos correspondientes.

También se describen en el presente documento medios de almacenamiento legibles por ordenador que tienen instrucciones ejecutables por ordenador o estructuras de datos almacenadas en los mismos (incluyendo las

5 instrucciones y estructuras de datos definidas en el presente documento, tales como los modelos computacionales mecanicistas, los niveles de proteína y biomarcador medidos, algoritmos de clasificación, estados de mutación y así sucesivamente) y que se configuran específicamente para implementar los procesos descritos y reivindicados en el presente documento. Tales medios de almacenamiento legibles por ordenador pueden ser cualquier medio disponible al que se pueda acceder por un ordenador de fines generales o fines especiales. A modo de ejemplo y sin limitación, tales medios de almacenamiento legibles por ordenador pueden comprender RAM, ROM, EEPROM, CD-ROM u otro almacenamiento de disco óptico, almacenamiento de disco magnético u otros dispositivos de almacenamiento magnético o cualquier otro medio que se pueda usar para almacenar medios de código de programa, módulos y software deseados en forma de instrucciones ejecutables por ordenador o estructuras de datos y a los que se puede acceder por un ordenador de fines generales o de fines especiales.

15 En algunos casos, los medios de transmisión también se pueden usar para portar las instrucciones ejecutables por ordenador, de forma que la presente invención también se extiende a aplicaciones, sistemas y otras realizaciones que incorporan medios de trasmisión que portan las instrucciones ejecutables por ordenador que se ejecutan para llevar a cabo uno o más de los procesos descritos en el presente documento. Cuando se transfiere información o se proporciona a lo largo de una red u otra conexión de comunicaciones (ya sea cableada, inalámbrica o una combinación de cableada e inalámbrica) a un ordenador, el ordenador considera de forma apropiada la conexión como un medio de transmisión legible por ordenador.

Las expresiones “instrucciones ejecutables por ordenador”, “instrucciones ejecutables”, “módulos” y “módulos

25 informáticos”, se usan algunas veces de forma intercambiable en el presente documento para hacer referencia al código de ordenador, estructuras de datos y software a los que se accede y que se ejecutan por uno o más procesadores informáticos y componentes de procesamiento de uno o más sistemas informáticos para implementar determinados procesos, como se describe dentro de este documento.

Aspectos adicionales con respecto a lo anterior y diversos aspectos adicionales de la presente divulgación se describen con mayor detalle en las siguientes sub-secciones, que no se han de interpretar como limitantes.

I. Modelos computacionales mecanicistas

35 Los modelos computacionales mecanicistas se pueden ver como descripciones matemáticas predictivas de las interacciones moleculares en una red de proteínas. Al menos en determinadas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento para predecir respuestas frente a agentes terapéuticos implican el uso de un modelo computacional mecanicista. Los modelos computacionales mecanicistas traducen un diagrama o dibujo de una ruta biológica (por ejemplo, un conjunto de interacciones de proteínas que se producen a lo largo de una ruta de transducción de señal, tal como una ruta pertinente para el cáncer) en un conjunto de ecuaciones matemáticas susceptibles de simulación y análisis posterior. Por tanto, la primera etapa en la construcción del modelo es la generación de una representación detallada de un diagrama o dibujo de la ruta biológica que incluye las proteínas y moléculas pertinentes implicadas en la ruta. Se tienen que tomar decisiones críticas con respecto a cuáles proteínas y moléculas se han de incluir, así como también las reacciones biológicas que las conectan. La información

45 disponible en la bibliografía científica acerca de cuáles proteínas y moléculas están implicadas en la ruta y cuáles reacciones biológicas las conectan se recoge y se usa en la generación de la representación de dibujo de la ruta biológica.

Una vez que la representación de dibujo de la ruta biológica se ha generado, esta información se traduce a un sistema de ecuaciones que representa las interacciones proteína-proteína dentro de la ruta, también denominado red celular. Los modelos computacionales que representan las redes de reacción bioquímica de redes de transducción de señal se basan en, por ejemplo, ecuaciones diferenciales ordinarias no lineales (EDO), modelos estocásticos, modelos lógicos booleanos o difusos o redes de petri. Estos se componen de ecuaciones diferenciales que requieren dos tipos de parámetros que se deben medir o estimar experimentalmente: número de especie inicial

55 (co,i para la especie ith) y las constantes de velocidad (kj para la velocidad jth). En las Figuras 4A-D se muestra un diagrama esquemático del proceso de construcción de un modelo computacional, que ilustra un diagrama de dibujo de la ruta de señalización de ErbB (Figura 4A), la producción de esta ruta en conjuntos de reacciones bioquímicas y flujos (Figuras 4B y 4C) y representación de las interacciones proteína-proteína mediante un conjunto de ecuaciones diferenciales (Figura 4D).

El modelo computacional típicamente se construye como un conjunto de instrucciones ejecutables escritas en un lenguaje de programación informática, por ejemplo utilizando el software Simbiology de MATLAB (The MathWorks, Natick, MA), opcionalmente junto con el software de modelado The Systems Biology Toolbox 2 para MATLAB (SBtoolbox2.org) o JACOBIAN (Numérica Technology, Cambridge, MA). Sin embargo, se contempla el desarrollo y 65 uso de modelos computacionales, construidos con software e interfaces diferentes a aquellos construidos con software e interfaces MATLAB o JACOBIAN. Se pueden utilizar modelos computacionales que se han construido

previamente por una fuente de terceros y descargado en el sistema informático que implementan otros aspectos de los métodos descritos.

Antes de la calibración de modelo, se especifican e introducen los valores de tantos parámetros como sea posible en

5 el sistema informático, en base a información a partir de la bibliografía científica, por ejemplo, niveles de proteína, afinidades de unión, constantes de velocidad de unión de ligandos a sus receptores afines. Los valores de parámetros que no están disponibles en la bibliografía científica se pueden obtener experimentalmente.

El modelo se “entrena” optimizando su salida frente a los datos obtenidos experimentalmente que se introducen en un sistema informático que realiza el entrenamiento. Mediante el ajuste del modelo a los datos experimentales, se selecciona el conjunto de parámetros de modelo óptimo. El proceso de calibración de modelo implica la modificación de las hipótesis y los estimados de parámetros. Para calibrar el modelo, en primer lugar se debe identificar un subconjunto de proteínas y parámetros que son especialmente importantes biológicamente para traducir un estímulo de ligando a un acontecimiento de señalización cadena abajo. Este proceso se denomina análisis de sensibilidad,

15 que, de forma más precisa, es una herramienta matemática que mide el cambio en una salida, tal como fosforilación de sustrato, en respuesta a cambios en las concentraciones de proteína y parámetros cinéticos dentro de la ruta. La sensibilidad completamente normalizada (sij(t)) de la ith observable ci(t) con respecto a un cambio en la constante de velocidad (kj) de jth viene dada por la siguiente ecuación:

A continuación se lleva a cabo la calibración de modelo mediante un sistema informático usando métodos de optimización locales y globales (tales como, pero sin limitación, Algoritmos Genéticos, hibridación simulada, optimización de Levenberg-Marquardt y así sucesivamente) que minimizan la distancia entre los datos

25 experimentales y los resultados de simulación mediante la variación de los parámetros y las concentraciones de proteína iniciales identificadas en el análisis de sensibilidad. El sistema informático se puede configurar para variar automáticamente los parámetros durante la calibración o para variar los parámetros únicamente como respuesta a entrada de usuario añadida incrementalmente.

En la bibliografía científica se han descrito varios modelos computacionales para diversas rutas de señalización (véanse, por ejemplo, Kholodenko, B. N. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 30169-30181; Schoeberl, B. et al. (2002) Nat. Biotech. 20: 370-375; Hayakeyama, M. et al. (2003) Biochem. J. 373: 451-463; Nielsen, U. B. y Schoeberl, B. (2005) IDrugs 8: 822-826; Schoeberl, B. et al. (2006) Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 1: 53-54; Schoeberl, B. et al. (2006) IBM J. Res. Dev. 50: 645; Fitzgerald, J. B. et al. (2006) Nat. Chem. Biol. 2: 458-466; Kholodenko, B. N.

35 (2007) Nat. Cell. Biol. 9: 324-330; Birtwistle, M. R. et al. (2007) Molecular Systems Biology 3: 144; Hinow, P. et al. (2007) Theoretical Biology and Medical Modelling 4: 14). Adicionalmente, la construcción y uso de modelos computacionales se revisa en Kholodenko, R. N. (2006) Nature Reviews: Mol Cell. Biol. 7: 165-176 y Kumar, N. et al. (2006) Drug Discovery Today 11: 806-811.

Uno de los modelos computacionales usados en determinados métodos descritos en el presente documento es un modelo de una ruta de señalización de ErbB. La construcción de un modelo computacional representativo de la ruta de señalización de ErbB se describe con detalle en el Ejemplo 4. Como se usa en el presente documento, la expresión “ruta de señalización de ErbB” tiene por objeto abarcar rutas de transducción de señal que se inician a través de la interacción de un ligando con un receptor de la familia de ErbB. Los componentes dentro de una ruta de

45 señalización de ErbB pueden incluir: (i) uno más ligandos, ejemplos de los cuales incluyen HRG, betacelulina (BTC), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina (HB-EGF), factor de crecimiento transformante alfa (TGF#), anfirregulina (AR), epigen (EPG) y epirregulina (EPR); (ii) uno o más receptores, ejemplos de los cuales incluyen ErbB1, ErbB2, ErbB3 y ErbB4; y (iii) quinasas, fosfatasas y sustratos intracelulares, ejemplos de los cuales incluyen fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K), fosfatidilinositol bifosfato (PIP2), fosfatidilinositol trifosfato (PIP3), fosfatasa y homólogo de tensina (PTEN), isozima de piruvato deshidrogenasa quinasa 1 (PDK1), AKT, RAS, RAF, MEK, la quinasa regulada por señal extracelular (ERK), proteína fosfatasa 2A (PP2A) y proteína tirosina quinasa SRC.

Otro modelo computacional usado en determinados métodos descritos en el presente documento es un modelo de

55 una ruta de señalización de IGF1R. Como se usa en el presente documento, la expresión “ruta de señalización de IGF1R” tiene por objeto abarcar rutas de transducción de señal que se inician a través de la interacción de un ligando con un receptor de la familia del factor de crecimiento de insulina 1. Los componentes dentro de una ruta de señalización de IGF1R pueden incluir: (i) uno o más ligandos, ejemplos de los cuales incluyen factor de crecimiento de insulina 1 (IGF1); (ii) uno o más receptores, ejemplos de los cuales incluyen IGF1R y el receptor de insulina; (iii) una o más proteínas de unión a IGF y (iv) quinasa y sustratos intracelulares, ejemplos de los cuales incluyen sustrato 2 del receptor de insulina (IRS2), PI3K, AKT, proteína relacionada con Bcl-2 BAD, RAS, RAF, MEK y proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK).

Otro modelo computacional usado en determinados métodos descritos en el presente documento es un modelo de una ruta de señalización de c-Met. Como se usa en el presente documento, la expresión “ruta de señalización de c-Met” tiene por objeto abarcar rutas de transducción de señal que se inician a través de la interacción de un ligando con una proteína tirosina quinasa receptora de c-Met. Los componentes dentro de una ruta de señalización de c-Met 5 pueden incluir: (i) uno o más ligandos, ejemplos de los cuales incluyen factor de crecimiento de hepatocitos (HGF);

(ii) uno o más receptores, ejemplos de los cuales incluyen la proteína tirosina quinasa receptora de c-Met; y (iii) quinasas y sustratos intracelulares, ejemplos de los cuales incluyen PI3K, proteína unida al factor de crecimiento 2 (GRB2), Src homólogo y proteína de colágeno (SHC), proteína tirosina quinasa SRC y proteína de armazón GAB1, así como también proteína RAS, RAF, MEK y proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK).

Aún otro modelo computacional usado en determinados métodos descritos en el presente documento es un modelo que comprende cualquier combinación de dos o más rutas de señalización de factor del crecimiento, tales como la señalización de receptor de IGR1R y ErbB, la señalización de receptor ErbB y la señalización de c-Met o la señalización de IGF1-R, ErbB y c-Met en combinación.

15 A pesar de la especificidad de los ejemplos anteriores, se apreciará que también se pueden incorporar otros modelos computacionales (por ejemplo, para rutas de señalización tales como TNF, IL-2, PDGF, FGF, TRAIL, integrinas, citoquinas y prácticamente cualquier otra ruta) y utilizarse mediante los métodos descritos en el presente documento.

La presencia de uno o más agentes terapéuticos se puede simular en el modelo computacional. Una representación computacional del agente o agentes terapéuticos se puede construir usando ecuaciones de reacción de acción de masas que describen la unión del agente o agentes a su diana celular o que de otra manera describen el efecto del agente o agentes sobre la ruta celular que se está modelando. Los parámetros para los acontecimientos de unión, u 25 otros efectos biológicos, se pueden obtener mediante mediciones experimentales directas, así como también mediante entrenamiento del modelo para que coincida con los datos del efecto del agente terapéutico sobre la célula. Por ejemplo, para agentes de anticuerpo, la asociación y disociación de la unión del anticuerpo a su antígeno diana se pueden determinar experimentalmente mediante métodos convencionales (tales como tecnología BIACore

o KinExA) y esos parámetros se pueden incorporar en el modelo computacional. Adicionalmente, por ejemplo, para agentes biespecíficos, se puede usar un parámetro de entrecruzamiento, como una medida del número de moléculas biespecíficas unidas a cada diana individual del biespecífico o a ambas dianas del biespecífico, como un parámetro de entrenamiento para el modelo computacional. El parámetro de entrecruzamiento se puede obtener tomando la afinidad de unión observada global (determinada mediante análisis FACS convencional) y ajustándola a una ecuación de unión logística convencional. Además de lo anterior, los parámetros adicionales que pueden ser

35 farmacéuticamente pertinentes para un agente terapéutico particular y que por tanto se han de representar en el modelo computacional, se conocen por los expertos.

Cuando el efecto de un agente terapéutico se tiene que representar en el modelo computacional, se puede modelar un agente único o se pueden modelar múltiples agentes en combinación para de esa forma simular el efecto de la terapia de combinación sobre las respuestas celulares. Por ejemplo, dos anticuerpos donde cada uno se une a antígenos diana diferentes se pueden representar en el modelo computacional o se pueden representar simultáneamente un anticuerpo que se dirige a una ruta de señalización particular (por ejemplo, una ruta de ErbB) y un inhibidor de molécula pequeña de la misma ruta de señalización (por ejemplo, una ruta de ErbB) en el modelo computacional para evaluar el efecto de tal terapia de combinación sobre la ruta de señalización en la célula.

II. Algoritmos de clasificación estadística

Los métodos descritos en el presente documento para predecir respuestas frente a agentes terapéuticos (por ejemplo, generando respuestas predichas frente a agentes terapéuticos con un ordenador) y los métodos para tratar pacientes que tienen tumores malignos implican el uso de uno o más algoritmos de clasificación estadística.

Un objetivo de un modelo estadístico es discernir una relación entre, por ejemplo, los niveles de proteína medidos en muestras de tejido, así como también los niveles de activación (por ejemplo, el Estado de Activación de Red o “NAS”) o los niveles de inhibición (por ejemplo, el Estado de Inhibición de Red o “NIS”) calculados mediante el

55 modelo bioquímico, por una parte y la respuesta del paciente frente a un agente terapéutico por otra. Por tanto, un algoritmo de clasificación estadística define una relación estadística entre uno o más parámetros medibles o entradas (por ejemplo, niveles de proteína medidos en una muestra de tejido, valores de NAS o NIS calculados) y un resultado particular o salida, (por ejemplo, sensibilidad a un agente terapéutico) de forma que se puede realizar una clasificación o predicción (por ejemplo, respondedores frente a no respondedores a un agente terapéutico). Por consiguiente, un modelo estadístico ayuda a identificar el umbral que divide a los respondedores y a los no respondedores y también ayuda a definir la incertidumbre alrededor del umbral definido.

Diversos tipos de sistemas clasificadores estadísticos se han descrito en la técnica y pueden ser adecuados para su uso en los métodos descritos, ejemplos no limitantes de los cuales incluyen análisis de componente principal (PCA), 65 regresión de mínimos cuadrados parciales (PLSR), PLSR trilineal, lógica difusa e inferencia Bayesiana, bosque aleatorio (RF), árbol de clasificación y regresión (C&RT), árbol impulsado, red neuronal (NN), máquina de soporte

vectorial (SVM), modelo detector de interacción automática de chi cuadrado general, árbol interactivo, Splines Adaptativas de Regresión, clasificador de aprendizaje de máquina y combinaciones de los mismos. Véase por ejemplo la Publicación PCT WO 2007/109571.

5 Para entrenar un algoritmo de clasificación estadística, en una realización preferida, para usar los términos de la técnica: la “máquina” o “sistema informático” (por ejemplo, ordenador) “aprende” la relación entre el nivel de expresión de la proteína y el estado de activación de red (NAS) con la respuesta real del paciente (por ejemplo, respondedor, no respondedor) mediante el examen de una serie de ejemplos de “entrenamiento” que se han aportado al ordenador por medio del “clasificador” (algoritmo estadístico). Este proceso se conoce como “aprendizaje supervisado”, ya que existe un conjunto de muestras para las cuales tanto la entrada (niveles de proteína, medidos y calculados) como la salida (por ejemplo, respuesta a un agente terapéutico) se conoce a priori. Una parte integral de la aplicación de un algoritmo de clasificación estadística es la selección de características informativas (siendo una característica cualquier nivel de proteína o nivel de activación de proteína medido o calculado), así como también la determinación del umbral óptimo para la puntuación producida por el algoritmo.

15 Generalmente se prefiere validar un algoritmo de clasificación estadística en un “conjunto de ensayo” separado de muestras, para los cuales se conoce el resultado, pero no se le desvela al clasificador. Mediante la comparación de predicciones con resultados conocidos, se puede medir el rendimiento. Cuando el número de muestras es pequeño, esto puede no ser práctico y se han establecido técnicas para evadir este requisito. La principal entre ellas es la validación cruzada, que se describe adicionalmente más adelante. El resultado de un clasificador es una puntuación que se puede traducir a una predicción de clase si se desea. En general, el proceso de entrenamiento de un clasificador también incluye métodos para determinar los umbrales óptimos.

Con el fin de ensayar la capacidad de realizar predicciones, el procedimiento general en la validación cruzada es

25 poner a un lado una parte de los datos (una fracción de las muestras) como “datos de entrenamiento” o el “conjunto de (datos) entrenamiento”; los datos restantes se denominan “conjunto de (datos) de ensayo”. Típicamente, este procedimiento se repite muchas veces, utilizando cada vez una fracción diferente de los datos para entrenamiento y ensayo. Un conjunto de entrenamiento más grande es claramente beneficioso (a mayor cantidad de ejemplos, mejor clasificador), pero también lo es un conjunto de ensayo grande (mientras mayor cantidad de predicciones se puedan verificar, más elevada será la confianza en predicciones futuras). Cuando el tamaño de la muestra es pequeño, este procedimiento se puede modificar de forma de que una muestra única se separa a un lado como datos de ensayo y el clasificador se entrena usando todas las muestras restantes. Se realiza una predicción en la muestra que se ha dejado fuera única. Esto se denomina “validación cruzada dejando uno fuera (leave-one-out)” (LOOCV) y está bien establecida en la técnica. Este procedimiento se repite para cada muestra dejada fuera a su vez. Una vez que todas

35 las predicciones se han realizado, se evalúa el rendimiento.

En los algoritmos de clasificación estadística usados en los métodos descritos, se pueden usar diversos parámetros

o características informativas o piezas de información, como los datos de entrada. Los ejemplos no limitantes de tales datos de entrada incluyen niveles de proteína de uno o más componentes de una red celular obtenidos a partir de una muestra celular, un Estado de Activación de Red (NAS) o Estados de Inhibición de Red (NIS) calculados usando un modelo computacional, el estado de mutación de una o más proteínas en la muestra celular, la edad del sujeto para el cual se está investigando la sensibilidad al tratamiento y el género del sujeto para el cual se está investigando la sensibilidad al tratamiento.

45 III. Medición de los niveles de componentes celulares en una muestra de células

En los métodos descritos en el presente documento para generar sensibilidad a tratamiento con un agente terapéutico predicha y para tratar a un paciente que tiene un tumor maligno, un procedimiento implica típicamente medir, en una muestra de células, los niveles de uno o más componentes de una red celular o, como alternativa, introducir los niveles medidos de uno o más componentes de una red celular, que se han obtenido a partir de mediciones tomadas a partir de una muestra de células, en un sistema informático. Por ejemplo, una muestra de un tumor se puede obtener mediante métodos convencionales a partir de un paciente con el tumor y los niveles de uno

o más componentes de una red celular se pueden medir en la muestra del tumor.

55 La entrada se puede introducir manualmente en el sistema informático. La entrada también se puede introducir automáticamente o descargarse al sistema informático, en algunos casos, tal como cuando se conectan dispositivos de medición computarizados al sistema informático que recibe y utiliza la entrada para implementar características de la invención. A este respecto, también se apreciará que cualquier información de medición y cualquier información de estado (por ejemplo, información de estado de mutación), así como también cualquier otro dato de tejido/paciente, descrito en este documento se puede obtener a través del uso de dispositivos computarizados que automáticamente obtienen y descargan la información de medición y estado a uno o más sistemas informáticos diferentes que usan los datos para llevar a cabo los procesos descritos.

Como se usa en el presente documento, el término “nivel” de un componente se refiere a la cantidad o

65 concentración del componente presente en una muestra. Los niveles de componentes se pueden medir usando cualquiera de una diversidad de técnicas bien conocidas. El nivel típicamente se determina midiendo los niveles de proteína, pero alternativamente el nivel se puede determinar en algunos casos midiendo los niveles de ARNm, lo cual puede estar seguido de conversión de los niveles de ARNm en niveles de proteína predichos. Los niveles de proteína (por ejemplo, monómeros, homodímeros o heterodímeros) se pueden medir usando una o más técnicas bien conocidas en la técnica, ejemplos no limitantes de las cuales incluyen separación de células activadas por

5 fluorescencia cuantitativa (qFACS), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA, Luminex), inmunohistoquímica (IHC), inmunohistoquímica cuantitativa (qlHC), métodos basados en proximidad (por ejemplo, métodos basados en transferencia de energía de resonancia de Forster, complementación de fluorescencia biomolecular (BiFC), VeraTag™ o DNA-Programmed Chemistry™ (DPC™)), espectrometría de masas, ensayo de Western (inmunotransferencia) y coinmunoprecipitación. Los niveles de proteína se pueden expresar como pg detectados de proteína/!g de proteína total.

Los niveles de proteína o de ARNm se pueden determinar en lisados celulares. Los lisados celulares se pueden preparar, por ejemplo, como se ha descrito con detalle en el Ejemplo 2. Además, los ejemplos ilustrativos del uso de ELISA para determinar los niveles de proteína se describen con detalle en los Ejemplos 2 y 4, un ejemplo ilustrativo

15 del uso de qFACS para determinar los niveles de proteína se describe con detalle en el Ejemplo 4 y un ejemplo ilustrativo de la medición de los niveles de ARNm y la conversión en niveles de proteína se describe con detalle en el Ejemplo 4 (para HRG-∀1).

La muestra de tumor puede ser, por ejemplo, una muestra de células frescas, una muestra congelada fresca o una muestra de tejido fijada. Para muestras de tejido de paciente, los bloques de tejido archivados se pueden acceder más fácilmente que las muestras congeladas frescas. Por tanto, en una realización preferida, se usa una muestra de tejido incrustada en parafina fijada con formalina (FFPE) y el nivel de los componentes (por ejemplo, ligandos, receptores) se puede determinar mediante inmunohistoquímica semicuantitativa (IHC) (descrita adicionalmente en el Ejemplo 9). Para convertir la información de IHC semicuantitativa en una concentración susceptible de introducirse

25 en un modelo computacional, se puede comparar un portaobjetos de control que contiene tapones celulares o xenoinjertos con niveles de expresión de receptor y/o ligando conocidos con la muestra del paciente. Además, los factores de conversión se pueden determinar para convertir un nivel de expresión obtenido en unidades sin dimensiones (por ejemplo, cantidades de proteína o ARNm) en un nivel de concentración que se puede introducir en un modelo computacional, descrito con mayor detalle en el Ejemplo 4 para los niveles de expresión de BTC y HRG.

Los niveles de ARNm de ligando y de proteína de ligando generalmente se correlacionan razonablemente bien. Por lo tanto, se puede usar qRT-PCR para determinar los niveles de expresión de ARNm en lisados celulares a partir de líneas de células tumorales y xenoinjertos así como también a partir de FFPE.

35 IV. Métodos para predecir respuestas a agentes terapéuticos

Se describen métodos para predecir la respuesta de células a tratamiento con un agente terapéutico que se dirige a un componente dentro de una red celular. Tales métodos comprenden generalmente los elementos indicados más adelante en Métodos Predictivos 1-5.

Método predictivo 1

(a) obtener mediciones de niveles de uno o más componentes de la red celular, midiendo el nivel o niveles

presentes en una muestra de las células de uno o más componentes de la red celular y 45 (b) aplicar un método implementado por ordenador que comprende:

(i): calcular un Estado de Activación de Red (NAS) o un Estado de Inhibición de Red (NIS) para las células usando un modelo computacional de la entrada de red celular con las mediciones; y

(ii): calcular y dar salida a una respuesta predicha de las células frente al tratamiento con el agente terapéutico basada, al menos en parte, en el NAS o el NIS calculados en (i).

Método predictivo 2

(a) medir, en una muestra de las células, los niveles de uno o más componentes de la red celular y 55 (b) aplicar un método implementado por ordenador que comprende:

(i): calcular un Estado de Activación de Red (NAS) o un Estado de Inhibición de Red (NIS) para las células usando un modelo computacional de la red celular;

(ii): aplicar un algoritmo de clasificación estadística; y

(iii) predecir la respuesta de las células frente a tratamiento con el agente terapéutico en base, al menos en parte, al resultado del algoritmo de clasificación estadística.

Método predictivo 3

65 a) un sistema informático que recibe, a través de un dispositivo de entrada, entrada que identifica los niveles de uno o más componentes en una red celular medidos en una muestra de las células;

b) el sistema informático que calcula un Estado de Activación de Red (NAS) o un Estado de Inhibición de Red (NIS) para las células usando un modelo computacional de la red celular; y c) el sistema informático que genera y a partir de entonces produce en un dispositivo de salida, una respuesta predicha de la célula frente al tratamiento con el agente terapéutico en base, al menos en parte, al NAS o el

5 NIS calculados en b).

Método predictivo 4

a) medir, en una muestra de las células, los niveles de uno o más componentes de la red celular; b) calcular un Estado de Activación de Red (NAS) o un Estado de Inhibición de Red (NIS) para las células usando un modelo computacional de la red celular; c) aplicar un algoritmo de clasificación estadística; y d) predecir la repuesta de las células al tratamiento con el agente terapéutico en base, al menos en parte, al resultado del algoritmo de clasificación estadística.

15 Método predictivo 5

a) un sistema informático que recibe, a través de un dispositivo de entrada, entrada que identifica los niveles de uno o más componentes en una red celular medidos en una muestra de las células; b) el sistema informático que calcula un Estado de Activación de Red (NAS) o un Estado de Inhibición de Red (NIS) para las células usando un modelo computacional de la red celular; c) el sistema información que aplica un algoritmo de clasificación estadística; y d) el sistema informático que genera y a partir de entonces produce en un dispositivo de salida, una respuesta predicha de las células al tratamiento con el agente terapéutico en base al resultado del algoritmo de

25 clasificación estadística.

Los métodos anteriores pueden, pero no necesitan, comprender adicionalmente tratar células o un paciente a partir del cual se obtienen las células, con un agente terapéutico, en base a la sensibilidad predicha de las células frente al agente terapéutico.

Los niveles del componentes o componentes detectados pueden servir para indicar la eficacia predicha de uno o más agentes terapéuticos específicos. En muchos casos, esto significa que si el componente o los componentes se detectan a un nivel (o a una proporción de concentración particular con relación a otros componentes especificados) que satisface un criterio de estar por encima (o en algunos casos por debajo) de un nivel de corte o proporción

35 predeterminado, entonces se predice que un agente terapéutico dado será eficaz y se administra al paciente y si el componente o los componentes se detectan a un nivel o proporción de concentración que no satisfacen el criterio con relación al nivel o proporción de corte predeterminado, entonces el agente terapéutico no se administra al paciente. Los niveles de corte apropiados se pueden establecer usando prácticas de rutina y como se describe en el presente documento.

Para predecir la respuesta de las células, los valores de NAS o NIS típicamente se calculan para una pluralidad de células respondedoras y células no respondedoras conocidas frente al agente terapéutico y estos valores a partir de las células respondedoras y las células no respondedoras conocidos se usan para establecer los valores de NAS o NIS de umbral, indicando sensibilidad o no sensibilidad frente al agente terapéutico (descrito adicionalmente en los

45 Ejemplos 7 y 10). Por tanto, la respuesta generada y/o predicha de las células al tratamiento se puede obtener en c) comparando el NAS o NIS calculado en b) con los valores de NAS o NIS de umbral, lo que indica sensibilidad o no sensibilidad al agente terapéutico.

Para aplicar el algoritmo de clasificación estadística, uno o más trozos de información se introducen en el algoritmo o el sistema informático incorpora uno o más trozos de información en el algoritmo. Por ejemplo, este procedimiento puede comprender introducir en el algoritmo uno o más trozos de información seleccionados entre (i) los niveles de uno o más componentes de la red celular; (ii) el NAS o NIS calculado (iii) el estado de mutación de uno o más genes en la muestra de las células; (iv) la edad del sujeto que se tiene que tratar con el agente terapéutico; (v) el género del sujeto que se tiene que tratar con el agente terapéutico; (vi) presencia o ausencia de receptor de estrógenos

55 (RE) en las células; (vii) presencia o ausencia de receptor de progesterona en las células; y (viii) presencia o ausencia de receptor de andrógenos en las células. Adicionalmente o como alternativa, la aplicación del algoritmo de clasificación estadística puede comprender el sistema informático que calcula el algoritmo después de introducir uno

o más trozos de información expuestos en (i)-(viii) anteriormente. Debido a que el algoritmo de clasificación estadística define una relación estadística entre la información de entrada y la sensibilidad de las células (por ejemplo, células tumorales) al tratamiento, la predicción de la respuesta de las células al tratamiento puede entonces basarse en el resultado del algoritmo de clasificación estadística.

Para los métodos predictivos y otros métodos descritos en el presente documento, una red celular preferida comprende una ruta de señalización de ErbB. El uno o más componentes medidos e introducidos en el sistema

65 informático en el método pueden comprender uno o más ligandos implicados en la ruta de señalización de ErbB. Los ejemplos no limitantes de tales ligandos incluyen HRG (incluyendo HRG-∀1, HRG-∀2, HRG-#, HRG-3 y HRG-4),

BTC, EGF, HB-EGF, TGF#, AR, EPG y EPR. Adicionalmente o como alternativa, el uno o más componentes medidos en el método pueden comprender uno o más receptores implicados en la ruta de señalización de ErbB. Los ejemplos no limitantes de tales receptores incluyen ErbB1, ErbB2, ErbB3 y ErbB4 (también conocidos en la técnica como HER1, HER2, HER3 y HER4, respectivamente). Tales receptores se pueden ensayar como entidades 5 individuales (ya sea que ocurran en monómeros, homodímeros o heterodímeros) y en determinadas realizaciones cada homodímero y heterodímero también se puede medir como un componente distinto e introducirse en el sistema informático. Por ejemplo, los componentes medidos pueden ser 1, 2, 3,4, 5 o 6 o más receptores, ligandos o ambos, elegidos entre ErbB1, ErbB2, ErbB3, ErbB4, HRG y BTC (por ejemplo, ErbB1 y HRG; o ErbB1, ErbB2 y ErbB3). Por ejemplo, en algunos métodos, el NAS calculado simula el nivel de homodímero ErbB2/ErbB2 o heterodímero

10 ErbB2/ErbB3 en ausencia del agente terapéutico. En otros de tales métodos, el NIS calculado simula el nivel de heterodímero ErbB2/ErbB3 o heterodímero ErbB1/ErbB3 en presencia del agente terapéutico en comparación con los niveles de heterodímero ErbB2/ErbB3 o heterodímero ErbB1/ErbB3 en ausencia del agente terapéutico.

En algunos de los métodos anteriores, el NAS calculado simula los niveles de una o más proteínas fosforiladas en la

15 ruta de señalización de ErbB3. Por ejemplo, el NAS que se calcula puede simular los niveles de pErbB3 en la muestra de las células. En realizaciones alternativas, el NAS que se calcula puede simular el nivel de un heterodímero ErbB1/ErbB3 fosforilado o un heterodímero ErbB2/ErbB3 fosforilado en la muestra de las células.

En un método descrito, el agente terapéutico comprende un anticuerpo anti-EGFR (anti-ErbB1), un ejemplo

20 ilustrativo del cual es el anticuerpo anti-ErbB1 cetuximab (Erbitux®, ImClone Systems). Otros ejemplos de anticuerpos anti-ErbB1 incluyen matuzumab, panitumumab; nimotuzumab y mAb 806 (Mishima, K. et al. (2001) Cancer Res. 61: 5349-5354). En otro método descrito, el agente terapéutico comprende un anticuerpo anti-ErbB2, un ejemplo ilustrativo del cual es trastuzumab (Herceptin®, Genentech).

25 La invención proporciona un agente terapéutico que comprende un anticuerpo anti-ErbB3 para su uso en un método para tratar un paciente que tiene un tumor neoplásico, comprendiendo dicho método administrar el anticuerpo anti-ErbB3 al paciente si el nivel de ErbB3 fosforilado (pErbB3) en una muestra del tumor obtenido a partir del paciente se determina que no es menor de 0,064 pg/!g de proteína total. En una realización preferida, el anticuerpo anti-ErbB3 comprende MM-121, que actualmente está siendo sometido a ensayos clínicos de Fase I. En una realización

30 preferida, el anticuerpo anti-ErbB3 comprende Ab Nº 6, descrito adicionalmente en el documento WO 2008/100624 y que tiene las secuencias de VH y VL de SEC ID Nº: 1 y 2, respectivamente. En otra realización, el anticuerpo anti-ErbB3 es un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR de VH y VL de Ab Nº 6 de SEC ID Nº: 7-9 (CDR1, 2, 3 de VH) y 10-12 (CDR1, 2, 3 de VL), respectivamente. Otros ejemplos de anticuerpos anti-ErbB3 incluyen Ab Nº 3, Ab Nº 14, Ab Nº 17 y Ab Nº 19, que se describen también adicionalmente en el documento WO 2008/100624 y que

35 tienen las secuencias de VH y VL de SEC ID Nº: 3 y 4, 5 y 6, 25 y 26 y 33 y 34, respectivamente. En otra realización, el anticuerpo anti-ErbB3 es un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR de VH y VL de Ab Nº 3 (SEC ID Nº: 13-15 y 16-18, respectivamente) o anticuerpo que comprende las secuencias de CDR de VH y VL de Ab Nº 14 (SEC ID Nº: 19-21 y 22-24, respectivamente) o anticuerpo que comprende las secuencias de CDR de VH y VL de Ab Nº 17 (SEC ID Nº: 27-29 y 30-32, respectivamente) o anticuerpo que comprende las secuencias de CDR de VH y VL de Ab

40 Nº 19 (SEC ID Nº: 35-37 y 38-40, respectivamente).

Otros ejemplos de anticuerpos anti-ErbB3 incluyen los anticuerpos 1B4C3 y 2D1D12 (U3 Pharma AG), los cuales se describen en la Publicación de Estados Unidos Nº 2004/0197332 y los anticuerpos monoclonales (incluyendo las versiones humanizadas de los mismos), tales como 8B8 descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.968.511.

45 En otra realización, el anticuerpo anti-ErbB3 es un anticuerpo biespecífico (por ejemplo, una proteína de fusión) que comprende un anticuerpo anti-ErbB3 enlazado a un segundo anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-ErbB2). Un ejemplo preferido de un anticuerpo biespecífico de este tipo es H3 x B1D2, cuya secuencia de aminoácido se expone en SEC ID Nº: 41. En este anticuerpo biespecífico, un anticuerpo de cadena única que se une a ErbB3,

50 denominado H3 (que tiene las CDR de VH y VL mostradas en SEC ID Nº: 42-44 y 45-47, respectivamente) se enlaza a un anticuerpo de cadena única que se une a ErbB2, denominado B1D2 (que tiene las CDR de VH y VL mostradas en SEC ID Nº: 48-50 y 51-53, respectivamente). Los componentes de anticuerpo del anticuerpo biespecífico H3 x B1D2 se describen adicionalmente en las Patentes de Estados Unidos Nº 7.332.585 y 7.332.580, así como también la Solicitud PCT PCT/US2006/023479 (publicada como el documento WO 2007/084181) y Solicitud PCT

55 PCT/US2007/024287 (publicada como el documento WO 2008/140493).

En aún otra realización, el agente terapéutico comprende dos o más anticuerpos anti-ErbB3, cada uno de los cuales se une a un epítopo diferente en ErbB3. Preferentemente, el agente terapéutico comprende tres anticuerpos anti-ErbB3, cada uno de los cuales se une a un epítopo diferente en ErbB3.

60 En otro método descrito, el agente terapéutico comprende un anticuerpo anti-ErbB4. En aún otro método descrito, el agente terapéutico comprende un inhibidor de pan-ErbB o un inhibidor de dimerización de HER. Un ejemplo de un inhibidor de dimerización de HER es el anticuerpo pertuzumab (también conocido como el anticuerpo 2C4), que se describe adicionalmente en Agus, D. B. et al. (2005) J. Clin. Oncol. 23: 2534-2543.

65 En aún otro método descrito, el agente terapéutico comprende uno o más inhibidores de molécula pequeña de una ruta de señalización de ErbB, cuyos ejemplos ilustrativos incluyen gefitinib (Iressa®), que está disponible en el mercado en AstraZeneca y Teva y lapatinib (Tykerb®), disponible en el mercado en GlaxoSmithKIine. Otros ejemplos de inhibidores de molécula pequeña de la ruta de señalización de ErbB incluyen Cl-1033 (PD 183805; Pfizer),

5 erlotinib HCL (OSI-774; Tarceva®; OSI Pharma); PKI-166 (Novartis); PD-158780; EKB-569; y Tirfostin AG 1478 (4(3-cloroanilino)-6, 7-dimetoxiquinazolina).

En otro método descrito, la red celular comprende una ruta de señalización de c-Met (factor de transición epitelial mesenquimal). En una realización, el uno o más componentes medidos y/o introducidos en a) pueden comprender uno o más ligandos implicados en la ruta de señalización de c-Met. Un ejemplo no limitante de un ligando de este tipo es el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF). Adicionalmente o como alternativa, el uno o más componentes medidos en a) puede comprender uno o más receptores implicados en la ruta de señalización de c-Met. Un ejemplo no limitante de un receptor de este tipo es la proteína tirosina quinasa receptora de c-Met.

15 En vista de lo anterior, los métodos predictivos descritos en el presente documento permiten la predicción de respuestas celulares, por ejemplo, predicción generada por ordenador de respuestas tumorales, frente a agentes terapéuticos que se dirigen a componentes dentro de la ruta de señalización de c-Met. El agente terapéutico puede comprender, por ejemplo, un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal) que se une a c-Met. Los ejemplos de tales anticuerpos anti-cMet incluyen AV299 (AVEO); AMG102 (Amgen) y 5D5 (OA-5D5; Genentech). Un ejemplo de un agente terapéutico que se dirige a la ruta de señalización de c-Met comprende un anticuerpo monoclonal biespecífico que comprende un anticuerpo anti-ErbB1 enlazado a un anticuerpo anti-cMet. Los ejemplos de tales anticuerpos biespecíficos se describen adicionalmente en las Publicaciones PCT WO 2005/117973 y WO 2006/091209. En otro método descrito, el agente terapéutico es un inhibidor de molécula pequeña de señalización de c-Met, cuyos ejemplos incluyen ARQ 197 (ArQuIe) y PHA665752 (Christensen, J. G. et al. (2003) Cancer Res.

25 63: 7345-7355).

En otro método descrito, la red celular comprende una ruta de señalización del receptor de factor de crecimiento de insulina 1 (IGF1R). El uno o más componentes medidos en a) pueden comprender uno o más ligandos implicados en la ruta de señalización de IGF1R. Un ejemplo no limitante de un ligando de este tipo es un factor del crecimiento de insulina 1 (IGF1). Adicionalmente o como alternativa, el uno o más componentes medidos en a) pueden comprender uno o más receptores implicados en la ruta de señalización de IGF1R. Un ejemplo no limitante de un receptor de este tipo es el receptor de IGF1R.

En vista de lo anterior, los métodos predictivos descritos en el presente documento permiten la predicción de

35 respuestas celulares, por ejemplo, predicción generada por ordenador de respuestas tumorales, frente a agentes terapéuticos que se dirigen a componentes dentro de la ruta de señalización de IGF1R. En tales métodos el agente terapéutico puede ser un anticuerpo que se une a IGF1R, cuyos ejemplos incluyen mAb391 (Hailey, J. et al. (2002) Mol. Cáncer. Ther. 1: 1349-1353); IMC-A12 (Imclone Systems, Inc.), 19D12 (Schering Plough), H7C10 (Goetsch, L. et al. (2005) Int. J. Cáncer 113: 316-328), CP751, 871 (Pfizer), SCV/FC (ImmunoGen, Inc.) y EM/164 (ImmunoGen, Inc.). El agente terapéutico puede ser un anticuerpo biespecífico que comprende un anticuerpo anti-IGF1R enlazado a un anticuerpo anti-ErbB3. Tales anticuerpos biespecíficos se describen adicionalmente en las Publicaciones PCT WO 2005/117973 y WO 2006/091209. En otro método descrito, el agente terapéutico es un inhibidor de molécula pequeña de IGF1R (por ejemplo, inhibidor de tirosina quinasa), cuyos ejemplos incluyen NVP-AEW541 (Novartis); NVP-ADW742 (Novartis); NVP-TAE226 (Novartis); BMS-536, 924 (Bristol-Myers Squibb); BMS-554, 417 (Bristol

45 Myers Squibb); ciclolignanos tales como picropodofilina (PPP) (Menu, E. et al. (2006) Blood 107: 655-660); y PQ401 (Gable, K. L et al. (2006) Mol. Cáncer Ther. 5: 1079-1086).

En aún otro método descrito, el agente terapéutico comprende una combinación de agentes terapéuticos, donde la combinación incluye al menos un agente que se dirige a un componente dentro de la ruta de señalización de ErbB, tal como una combinación de agentes que incluye al menos uno de los agentes de la ruta de ErbB descritos anteriormente. Por ejemplo, un agente de combinación puede comprender dos o más agentes que se dirigen a componentes dentro de la ruta de señalización de ErbB. Como alternativa, un agente de combinación puede comprender al menos un agente que se dirige a un componente dentro de la ruta de señalización de ErbB y al menos un agente que se dirige a un componente dentro de otra ruta de señalización, tal como una ruta de

55 señalización de c-Met o IGF1R.

En diversos métodos diferentes, la red celular comprende una combinación de dos o más rutas de señalización, tal como una ruta de señalización de ErbB en combinación con una ruta de señalización de c-Met o una ruta de señalización de ErbB en combinación con una ruta de señalización de IGF1R.

Los métodos predictivos descritos en el presente documento pueden comprender además un procedimiento para determinar, en la muestra de las células, el estado de mutación de uno o más genes en las células. Por ejemplo, el estado de mutación de al menos un gen seleccionado entre KRAS (homólogo del oncogén viral del sarcoma de la rata de Kirsten), PI3K y PTEN se pueden determinar. Adicionalmente o como alternativa, el método puede 65 comprender un sistema informático que recibe, a través de un dispositivo de entrada, entrada que identifica el estado de mutación de uno o más gentes en las células, tal como el estado de mutación de al menos un gen seleccionado

entre KRAS, PI3K y PTEN.

En los métodos predictivos, la red celular puede comprender una ruta de señalización de ErbB y a) comprende medir y/o introducir niveles medidos de BTC y AR y el método puede comprender además determinar el estado de

5 mutación o introducir el estado de mutación del gen KRAS. Como otro ejemplo, la red celular comprende una ruta de señalización de ErbB y a) comprende medir y/o introducir los niveles medidos de ErbB 1, ErbB2, ErbB3, HRG, BTC, AR, HB-EGF, EGF, TGF#, EPG y EPR y el método comprende además determinar el estado de mutación o introducir el estado de mutación, del gen KRAS. El NAS calculado en b) puede simular los niveles de una o más proteínas fosforiladas en la ruta de señalización de ErbB, simular los niveles de heterodímero ErbB1/ErbB3 fosforilado en la muestra de un tumor de un paciente o similar los niveles de heterodímero ErbB2/ErbB3 fosforilado en la muestra de un tumor de un paciente.

Dentro de determinados métodos descritos anteriormente, los valores de NAS o NIS calculados para cada una de una pluralidad de células respondedoras y células no respondedoras frente al agente terapéutico se usan para 15 establecer los valores de NAS o NIS de umbral, lo que indica sensibilidad o no sensibilidad al agente terapéutico. En otro métodos, la respuesta de las células frentes al tratamiento se predice comparando el NAS o NIS calculado en

(b): con los valores de NAS o NIS de umbral, indicando sensibilidad o no sensibilidad frente al agente terapéutico.

V.: Biomarcadores y métodos para predecir respuestas frente a inhibidores de la ruta de ErbB

En el presente documento también se describen biomarcadores directos que predicen la sensibilidad de las células (por ejemplo, células tumorales) frente al tratamiento con un agente terapéutico que se dirige a un componente de una red celular (por ejemplo, la ruta de señalización de ErbB). Tales biomarcadores se pueden identificar usando los modelos computacionales proporcionados en el presente documento. Los métodos para identificar tales

25 biomarcadores comprenden en general: (a) medir, en una muestra de células, los niveles de uno o más componentes de la red celular; y (b) aplicar un método implementado por ordenador que comprende: (i) el cálculo de niveles de uno o más componentes adicionales de la red celular usando un modelo computacional de la red celular; y (ii) identificar un componente de la red celular cuyo nivel calculado predice la respuesta de la célula frente al tratamiento con un agente terapéutico para de ese modo identificar el componente como un biomarcador para predecir la respuesta de las células frente al tratamiento con el agente terapéutico.

Determinados métodos para identificar un biomarcador para predecir la respuesta de las células frente al tratamiento con un agente terapéutico que se dirige a un componente dentro de una red celular comprenden:

35 a) un sistema informático que recibe, a través de un dispositivo de entrada, entrada que define niveles medidos de uno o más componentes de una red celular, medidos en una muestra de la célula; b) el sistema informático que calcula los niveles de uno o más componentes adicionales de la red celular usando un modelo computacional de la red celular; y c) el sistema informático que identifica un componente de la red celular cuyo nivel calculado predice la respuesta de las células frente a tratamiento con un agente terapéutico y de ese modo identificar el componente como un biomarcador para predecir una respuesta de las células frente a tratamiento con el agente terapéutico.

Por ejemplo, como se ilustra en el Ejemplo 10, un modelo computacional se puede usar para calcular los niveles de

45 uno o más componentes de una red celular (por ejemplo, la ruta de señalización de ErbB) para obtener uno o más valores de NAS (como una medida de activación de la red celular) y se puede determinar la correlación del NAS con la sensibilidad de las células frente al tratamiento con un agente terapéutico. Aquellos componentes de la red celular para los cuales los niveles calculados separan a las muestras en respondedoras y no respondedoras también se pueden usar posteriormente como biomarcadores directos para predecir la sensibilidad al tratamiento, en particular cuando esos componentes se pueden medir fácilmente mediante medios directos. Es decir, el enfoque de modelo computacional/NAS descrito en el presente documento se puede usar para identificar componente o componentes (calculados) que predicen la sensibilidad de células frente a tratamiento con un agente terapéutico y posteriormente un vez que el componente o los componentes se han identificado, los mismos se pueden medir directamente como biomarcadores directos para predecir la sensibilidad. Por ejemplo, el modelo computacional descrito en el presente

55 documento se usó para calcular los niveles de homo y heterodímeros de la ruta de señalización de ErbB y después esos dímeros que separan a las muestras en respondedoras y no respondedoras se pueden medir directamente como biomarcadores directos para predecir la sensibilidad frente al tratamiento tumoral.

Además, como se describe adicionalmente en el Ejemplo 8, se ha demostrado actualmente que la medición combinada del nivel de (i) HRG y (ii) al menos un receptor de la familia de ErbB (por ejemplo, ErbB1, ErbB2 y ErbB3) en una muestra de tumor estratifica de forma eficaz a los tumores en respondedores y no respondedores con respecto a la sensibilidad al tratamiento con un agente terapéutico que se dirige a un componente de una ruta de señalización de ErbB, tal como un anticuerpo anti-ErbB3 (por ejemplo, Ab Nº 6). Además, como se describe adicionalmente en el Ejemplo 10, los niveles de heterodímero de ErbB1/ErbB3 o niveles de heterodímero 65 ErbB1/ErbB3 fosforilado pueden servir como marcadores directos de sensibilidad frente a tratamiento con un agente terapéutico que se dirige a un componente de una ruta de señalización de ErbB, tal como un anticuerpo anti-ErbB3

(por ejemplo, Ab Nº 6). Además, como se ha descrito adicionalmente en el Ejemplo 12, los niveles de monómero ErbB2, homodímero ErbB2/ErbB2 y heterodímero ErbB2/ErbB3 estratifican de forma eficaz a los tumores en respondedores y no respondedores con respecto a la sensibilidad al tratamiento con un agente terapéutico que se dirige a un componente de una ruta de señalización de ErbB, tal como un anticuerpo biespecífico anti-ErbB3 x anti

5 ErbB2 (por ejemplo, H3 x B1D2).

Los métodos para predecir la respuesta de células a tratamiento con un agente terapéutico que se dirige a un componente de una ruta de señalización de ErbB pueden comprender:

(a): medir, en una muestra de células, los niveles de (i) HRG y (ii) al menos un receptor seleccionado entre ErbB1, ErbB2 y ErbB3; y

(b): predecir, usando un ordenador, la respuesta de las células frente a tratamiento con el agente terapéutico en base a los niveles medidos en (a), donde niveles elevados de HRG y el al menos un receptor, con relación a un control, predicen sensibilidad a tratamiento con el agente terapéutico.

15 En determinadas situaciones se miden los niveles de HRG y ErbB1. En otros casos, se miden los niveles de HRG y ErbB2 o se miden los niveles de HRG y ErbB3. En otras situaciones, se miden los niveles de HRG y al menos dos receptores seleccionados entre ErbB1, ErbB2 y ErbB3 o se miden los niveles de HRG, ErbB1, ErbB2 y ErbB3. En determinadas situaciones, la predicción se puede realizar de forma informática, usando un método que comprende:

(i): un sistema informático que recibe, a través de un dispositivo de entrada, entrada que identifica los niveles medidos de (i) HRG y (ii) al menos un receptor seleccionado entre ErbB1, ErbB2 y ErbB3, niveles que se han medido en una muestra de las células; y

(ii): el sistema informático que genera y a partir de entonces produce en un dispositivo de salida, una respuesta

25 predicha de las células frente a tratamiento con el agente terapéutico en base a los niveles medidos, donde niveles elevados de HRG y el al menos un receptor, con relación a un control, predicen sensibilidad al tratamiento con el agente terapéutico.

Los agentes terapéuticos preferidos para los cuales se predice la sensibilidad incluyen anticuerpos anti-ErbB3, más preferentemente Ab Nº 6 (que tienen secuencias de VH y VL como se muestra en SEC ID Nº: 1 y 2, respectivamente)

o un anticuerpo anti-ErbB3 que comprende las secuencias de CDR de VH y VL de Ab Nº 6, que se muestran en SEC ID Nº: 7-9 (CDR1, 2, 3 de VH) y 10-12 (CDR1, 2, 3 de VL), respectivamente.

Otros métodos para predecir la respuesta de células frente a tratamiento con un agente terapéutico que se dirige a 35 un componente de una ruta de señalización de ErbB comprenden:

(a): medir, en una muestra de las células, los niveles de uno o más de heterodímero ErbB1/ErbB3, monómeros ErbB2, homodímero ErbB2, heterodímero ErbB2/ErbB3, heterodímero ErbB1/ErbB3 fosforilado y heterodímero ErbB2/ErbB3 fosforilado y

(b): predecir, usando un ordenador, la respuesta de las células frente a tratamiento con el agente terapéutico en base a los niveles medidos en (a), donde una diferencia en el nivel de heterodímero ErbB1/ErbB3, monómeros ErbB2, homodímero ErbB2, heterodímero ErbB2/ErbB3, heterodímero ErbB1/ErbB3 fosforilado o heterodímero ErbB2/ErbB3 fosforilado, con relación a un control, predice la sensibilidad al tratamiento con el agente terapéutico.

45 La predicción se puede realizar informáticamente, usando un método que comprende:

(i): un sistema informático que recibe, a través de un dispositivo de entrada, entrada que identifica los niveles medidos de uno o más de heterodímero ErbB1/ErbB3, monómero ErbB22, homodímero ErbB2, heterodímero ErbB2/ErbB3, heterodímero ErbB1/ErbB3 fosforilado y heterodímero ErbB2/ErbB3 fosforilado, niveles que se han medido en una muestra de las células; y

(ii): el sistema informático que genera y a partir de entonces produce en un dispositivo de salida, una respuesta predicha de las células frente a tratamiento con el agente terapéutico en base a los niveles medidos, donde una diferencia en el nivel de heterodímero ErbB1/ErbB3, monómeros ErbB2, homodímero ErbB2/ErbB2,

55 heterodímero ErbB2/ErbB3, heterodímero ErbB1/ErbB3 fosforilado o heterodímero ErbB2/ErbB3 fosforilado, con relación a un control, predice la sensibilidad frente al tratamiento con el agente terapéutico.

Dentro de determinadas realizaciones de los métodos anteriores, los niveles medidos se introducen en un algoritmo de clasificación estadística y la respuesta de las células frente al tratamiento se predice en base al resultado del algoritmo. En tales métodos adicionales, se calcula un Estado de Activación de Red (NAS) o un Estado de Inhibición de Red (NIS) en base a los niveles medidos usando un modelo computacional de una red celular de ErbB; preferentemente, la respuesta de las células frente al tratamiento con el agente terapéutico se predice en base al valor de NAS o NIS calculado.

65 Dentro de determinadas realizaciones, los niveles medidos son niveles de monómero ErbB2, homodímero ErbB2:ErbB2 y/o heterodímero ErbB2:ErbB3 y el agente terapéutico es un anticuerpo biespecífico que comprende un anticuerpo anti-ErbB3 enlazado a un anticuerpo anti-ErbB2, como se ha descrito anteriormente.

Las células preferidas para su uso en los métodos anteriores son células tumorales, incluyendo aquellas mencionadas anteriormente. Las muestras incluyen tejido de tumor, aspirado con aguja fina, aspirado de pezón, 5 sangre completa, suero, plasma, linfa, saliva y orina o células tumorales eliminadas o en circulación aisladas de las mismas.

Será evidente que, como se ha indicado anteriormente, los niveles medidos son niveles de proteína (por ejemplo, monómeros, homodímeros o heterodímeros) o niveles de ARNm y generalmente se pueden determinar como se ha descrito anteriormente.

Cualquiera de los métodos anteriores puede, aunque no es necesario, comprender adicionalmente la selección de un régimen de tratamiento (por ejemplo, para el agente terapéutico) en base a la respuesta predicha de las células al tratamiento; y/o puede comprender además preparar el agente terapéutico para su uso en base a la respuesta

15 predicha.

En algunas situaciones, la diferencia en el nivel, con relación a un control, es un nivel elevado. Los métodos anteriores pueden, aunque no es necesario, comprender adicionalmente el tratar las células o un sujeto (paciente) a partir del cual se han obtenido las células, con un agente terapéutico, en base a la sensibilidad predicha de las células frente al agente terapéutico.

Para los métodos en los cuales se miden los niveles de heterodímero ErbB1/ErbB3 y/o heterodímero ErbB1/ErbB3 fosforilado, preferentemente el agente terapéutico para el cual se predice la sensibilidad es un anticuerpo anti-ErbB3, más preferentemente Ab Nº 6 (que tiene las secuencias de VH y VL como se muestran en la SEC ID Nº: 1 y 2,

25 respectivamente) o un anticuerpo anti-ErbB3 que comprende las secuencias de CDR de VH y VL de Ab Nº 6, que se exponen en SEC ID Nº: 7-9 (CDR1, 2, 3 de VH) y 10-12 (CDR1, 2, 3 de VL), respectivamente.

Para los métodos en los cuales se miden los niveles de monómero ErbB2, homodímero ErbB2/ErbB2 y/o heterodímero ErbB2/ErbB3, el agente terapéutico para el cual se predice la sensibilidad es preferentemente un anticuerpo biespecífico anti-ErbB3 x anti-ErbB2, más preferentemente anticuerpo biespecífico H3 x B1D2 (que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 41) o un anticuerpo biespecífico que comprende un anticuerpo anti-ErbB3 que comprende las CDR de H3 (SEC ID Nº: 42-44 y 45-47) enlazados a un anticuerpo anti-ErbB2 que comprende las CDR de B1D2 (SEC ID Nº: 48-50 y 51-53).

35 Los niveles de homo o heterodímeros receptores u homo o heterodímeros receptores fosforilados se pueden medir en las muestras de las células usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, tales homo o heterodímeros se pueden medir usando métodos de detección de dimerización tales como los descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 7.105.308, Patente de Estados Unidos Nº 7.255.999, Publicación de Estados Unidos Nº 20040229380 y Publicación de Estados Unidos Nº 20080187948. Estos métodos emplean pares de sondas (por ejemplo, anticuerpos), una es una sonda etiquetada y una es una sonda de escisión, donde cada sonda se une específicamente a un componente del dímero. La unión de las dos sondas al dímero da como resultado la escisión y liberación de la etiqueta molecular del complejo dimérico, proporcionando una medición de formación del complejo dimérico. Tales ensayos también se denominan en el presente documento métodos basados en proximidad, un ejemplo disponible en el mercado de los cuales es el sistema VeraTag™ (Monogram Biosciences). Como

45 alternativa, se pueden usar otros métodos conocidos en la técnica para cuantificar niveles de dímeros, incluyendo pero sin limitación coinmunoprecipitación de los componentes con el dímero y uso de otros métodos basados en proximidad tales como métodos basados en transparencia de energía de resonancia de Forster y complementación de fluorescencia biomolecular (BiFC) (descrito adicionalmente en, por ejemplo, Tao, R. H. y Maruyama, I. N. (2008)

J. Cell Sci. 121: 3207-3217).

En una realización de los métodos de biomarcador directo anteriores, los niveles medidos en a) se introducen en un algoritmo de clasificación estadística almacenado por un sistema informático y la respuesta de la célula frente al tratamiento se predice en base al resultado del algoritmo basado en cálculos y transformación de los datos en el sistema informático con el uso del algoritmo y niveles medidos. En otra realización, se calcula un Estado de

55 Activación de Red (NAS) o un Estado de Inhibición de Red (NIS) en base a los niveles medidos en a) usando un modelo computacional de una red celular de ErbB. La respuesta de las células al tratamiento con el agente terapéutico se puede predecir en base al menos en parte al valor de NAS o NIS calculado.

En diversas realizaciones, el agente terapéutico comprende cualquier combinación de uno o más de un anticuerpo anti-ErbB3, un anticuerpo anti-ErbB1, un anticuerpo anti-ErbB2, un anticuerpo anti-ErbB4, un inhibidor pan-ErbB, un inhibidor de dimerización de HER y un inhibidor de molécula pequeña de una ruta de señalización de ErbB, cada uno de los cuales se describe e ilustra anteriormente.

VI. Usos de los métodos en tratamiento

65 Los métodos descritos se pueden usar para predecir la eficacia de tratamiento para una amplia diversidad de trastornos en los cuales están disponibles agentes terapéuticos que se dirigen a uno o más componentes de una red celular implicada en el trastorno. Aún más, los métodos se pueden usar en la selección de régimen de tratamiento para un sujeto que sufre del trastorno, donde los métodos pueden comprender además tratar al sujeto de acuerdo con el régimen de tratamiento seleccionado, que puede comprender administra uno o más agentes terapéuticos al

5 sujeto. Los ejemplos no limitantes de trastorno incluyen cáncer, trastornos autoinmunes y trastornos inflamatorios.

Los métodos son particularmente útiles para predecir, por ejemplo, predecir computacionalmente, la respuesta de un tumor frente a tratamiento con un agente terapéutico, es decir, predecir la sensibilidad de un paciente que porta el tumor al tratamiento con un agente terapéutico. Los métodos predictivos se pueden usar con cualquier tumor que sea dependiente de la ruta de señalización que se modela en el método. Por ejemplo, en una realización, el método se usa con tumores que son dependientes de la ruta de señalización de ErbB (por ejemplo, la ruta de señalización de ErbB3). El método descrito también se puede usar con tumores que son dependientes de las rutas de señalización de c-Met o IGF1R. En una realización preferida, el tumor es un tumor de cáncer de colon. En otra realización preferida, el tumor es un tumor de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). En otra

15 realización, el tumor es un tumor sólido. En otra realización, el tumor es un tumor no sólido, tal como un sarcoma de células claras. En diversas realizaciones diferentes, el tumor puede ser, por ejemplo, un tumor de un tejido seleccionado entre pulmón, colon, recto, vesícula biliar, cerebro, médula espinal, mama, riñón, páncreas, estómago, hígado, hueso, piel, bazo, ovario, testículo, próstata, cabeza y cuello, tiroides y músculo. En aún otras realizaciones, el tumor es un tumor gástrico, un tumor de estómago o un tumor oral/de faringe.

Para conducir el método predictivo, una muestra de células, por ejemplo, células de tumor, se obtiene a partir del paciente. Por ejemplo, una muestra preferida del tumor es una muestra de tejido tumoral. Una muestra de tejido tumoral se puede obtener mediante métodos convencionales, tales como biopsia del tumor o resección quirúrgica del tumor. Se puede usar una muestra congelada fresca de tejido tumoral o, como alternativa, una muestra de tejido

25 incrustada en parafina y fijada en formalina (FFPE) también es adecuada para su uso. Otros tipos de muestras del tumor también pueden ser susceptibles de uso en los métodos, donde la muestra contiene células del tumor y/o componentes celulares secretados por el tumor. Los ejemplos no limitantes de otros tipos de muestras del tumor incluyen aspirado con aguja fina, aspirado de pezón, sangre completa, suero, plasma, linfa, saliva y orina o células tumorales eliminadas o en circulación aisladas a partir de las mismas.

En una realización preferida, la invención proporciona un método para predecir la respuesta de un paciente de cáncer al tratamiento con un agente terapéutico, donde el método se puede llevar a cabo fácilmente y rápidamente mediante un laboratorio de diagnóstico para proporcionar información rápida con respecto a la probabilidad de un tumor de un paciente de responder a un tratamiento terapéutico particular. En este método predictivo, una muestra 35 de tumor, tal como una muestra congelada fresca o una muestra de tejido archivada FFPE se obtiene a partir del paciente y los niveles de receptor/ligando del tumor se miden a través de inmunohistoquímica semicuantitativa (IHC). La elección del receptor o receptores y ligando o ligandos para medirse se basa en la red celular a la cual se dirige el agente terapéutico (por ejemplo, para la ruta de ErbB, se pueden medir los siguientes ligandos/receptores: HRG, BTC, ErbB1, ErbB2 y ErbB3). Las mediciones de IHC semicuantitativa posteriormente se convierten en concentraciones usando un portaobjetos de control, que contiene tapones celulares o xenoinjertos con niveles de expresión de receptor y ligando conocidos para compararse con la muestra del paciente. En determinadas situaciones, el estado de mutación de uno o más genes de interés (por ejemplo, PI3K, PTEN) se puede determinar en la muestra usando métodos de determinación de genotipo convencionales. A continuación, el conjunto de datos (concentraciones de ligando y receptor, estado de mutación de genes si se determina) se introduce en un modelo

45 computacional de la red celular de interés y se calcula un estado de activación de red (NAS). La predicción de sensibilidad frente al agente terapéutico puede entonces realizarse en base a la comparación del valor de NAS calculado con los valores de NAS de umbral para respondedores y no respondedores. El uso de una aplicación basada en web para introducir los datos de concentración de proteína y mutación en el modelo computacional, seguido por el resultado de NAS y la respuesta predicha, permite que un laboratorio de diagnóstico obtenga conocimiento casi instantáneo de la probabilidad del tumor de responder a tratamiento con el agente terapéutico.

Para cualquiera de los métodos predictivos descritos en el presente documento, después de que las respuestas de las células (por ejemplo, célula tumorales) al tratamiento con un agente terapéutico se ha predicho usando el método, el método puede comprender además seleccionar un régimen de tratamiento para el sujeto en base a la

55 respuesta predicha de las células (por ejemplo, células tumorales) al tratamiento. Por ejemplo, los métodos pueden comprender además que el sistema informático presente y recomiende de forma manual o automática y/o seleccione un régimen de tratamiento para el sujeto en base a la respuesta o respuestas predichas de forma informática de las células al tratamiento. Aún más, una vez que se ha recomendado o seleccionado un régimen de tratamiento en base a la sensibilidad predicha de las células, los métodos pueden comprender además tratar al sujeto de acuerdo con el régimen de tratamiento recomendado o seleccionado, lo cual puede comprender administrar uno o más agentes terapéuticos al sujeto.

En el presente documento también se describen kits para predecir la respuesta de células (por ejemplo, células tumorales) frente al tratamiento con un agente terapéutico que se dirige a un componente dentro de una red celular. 65 Un kit de este tipo comprende: a) un ensayo o ensayos para detectar los niveles de uno o más componentes de la red celular; b) instrucciones para calcular un Estado de Activación de Red (NAS) o Estado de Inhibición de Red

(NIS) de las células usando un modelo computacional de la red celular; y c) instrucciones para el uso del kit para predecir la respuesta de las células al tratamiento con el agente terapéutico. El kit puede comprender además instrucciones para aplicar un algoritmo de clasificación estadística para el cálculo del NAS o el NIS.

5 La red celular puede ser, por ejemplo, una ruta de señalización de ErbB, una ruta de señalización de c-Met o una ruta de señalización de IGF1R. El agente terapéutico puede ser, por ejemplo, cualquiera de los agentes terapéuticos descritos anteriormente que se dirigen a componentes dentro de cualquiera de estas rutas.

En una realización, los medios para detectar los niveles de uno o más componentes de la red celular es uno o más reactivos que permiten la detección de niveles de proteína del componente o componentes, tal como uno o más reactivos de anticuerpo. En otra realización, los medios para detectar los niveles de uno o más componentes de la red celular es uno o más reactivos que permiten la detección de niveles de ARNm del componente o componentes, tal como uno o más reactivos de ácido nucleico (por ejemplo, sondas de ácido nucleico, cebadores de PCR y similares). Tales reactivos para detección de niveles de proteína o ARNm de componentes celulares se conocen

15 bien por los expertos. Tales medios para detectar los niveles también pueden incluir dispositivos informáticos configurados para medir los niveles de proteína.

Los ensayos adecuados para la detección de los niveles de proteína de los componentes celulares incluyen los descritos en este documento, tales como la clasificación de células activadas por fluorescencia cuantitativa (qFACS), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA, Luminex), inmunohistoquímica (IHC), inmunohistoquímica cuantitativa (qlHC), espectrometría de masas y ensayo de Western (inmunotransferencia). Los ensayos adecuados para la detección de niveles de ARNm de los componentes celulares incluyen, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) y análisis de transferencia de Northern. Los medios para detectar los niveles de uno o más componentes de la red celular también pueden incluir, por ejemplo, tampones u otros reactivos para su

25 uso en un ensayo para la evaluación de los niveles del componente o componentes. El kit puede incluir instrucciones, (por ejemplo, instrucciones impresas, tales como una etiqueta o prospecto) para realizar el ensayo o ensayos para la detección de los niveles de uno o más componentes de la red celular.

Cuando la red celular es una ruta de señalización de ErbB, el kit puede incluir medios para detectar los niveles de uno o más componentes (por ejemplo, uno o más de receptores, homodímeros receptores, heterodímeros receptores y ligandos receptores) de una ruta de señalización de ErbB seleccionados entre ErbB1, ErbB2, ErbB3, ErbB4, HRG (incluyendo HRG-∀1), BTC, EGF, HB-EGF, TGF#, AR, EPG y EPR, preferentemente medios para detectar los niveles de al menos un receptor de la ruta de señalización de ErbB (por ejemplo, ErbB1, ErbB2, ErbB3, ErbB4) y al menos un ligando de ruta de señalización de ErbB (por ejemplo, HRG, BTC, EGF, HB-EGF, TGF#, AR,

35 EPG y EPR). Por ejemplo, el kit puede incluir medios para detectar los niveles de ErbB1, ErbB2, ErbB3, HRG y BTC, medios para detectar los niveles de ErbB1 y HRG, medios para detectar ErbB1, ErbB2 y ErbB3 o medios para detectar monómero ErbB2, homodímero ErbB2, heterodímero ErbB2/ErbB3 o heterodímero ErbB1/ErbB3.

Los medios para calcular el Estado de Activación de Red (NAS) o un estado de Inhibición de Red (NIS) para las células usando un modelo computacional de la red celular puede ser, por ejemplo, un producto de programa informático que contiene instrucciones ejecutables que cuando se ejecutan provocan que un procesador lleve a cabo operaciones para el cálculo de un NAS o NIS de las células. Como alternativa, los medios para calcular un NAS o NIS pueden ser, por ejemplo, un componente que permite que el usuario del kit se conecte con un servicio basado en Internet que desarrolla un programa informático que puede calcula un NAS o NIS para las células tras la entrada

45 mediante el usuario de información acerca de los niveles de uno o más componentes de la red celular en las células. Un componente de este tipo puede incluir, por ejemplo, una interfaz, una página web y/o una contraseña para permitir el acceso al servicio basado en Internet e instrucciones, por ejemplo, instrucciones impresas, para uso del servicio. Los sistemas informáticos y software establecidos en la técnica y descritos adicionalmente en el presente documento, se pueden adaptar para su uso en los kits de la invención. Los dispositivos informáticos y los componentes informáticos a los que se hace referencia en la Figura 16 también pueden incluir medios para calcular el NAS o NIS, tales como procesadores informáticos, dispositivos de medición y entrada, dispositivos de salida y así sucesivamente.

Las instrucciones de uso del kit para predecir la respuesta de las células a tratamiento con el agente terapéutico

55 pueden incluir instrucciones informáticas e interfaces informática, así como también publicaciones y manuales impresos. En algunos casos, el kit se empaca en conjunto. En otras realizaciones, los diversos componentes del kit se mantienen en emplazamientos dispares. Por ejemplo, algunos de los componentes se pueden mantener, almacenar o alojar en uno o más sistemas informáticos remotos y están únicamente disponibles a través de una conexión en red.

Preferentemente, los kits se diseñan para su uso con un sujeto humano, tal como un paciente humano que tiene un tumor. En tales casos, las células son típicamente células obtenidas a partir del paciente mediante biopsia o resección del tumor.

65 VIl. Métodos terapéuticos y kits En el presente documento se describen métodos para tratar a un paciente que tiene un tumor maligno. En general, tales métodos comprenden: obtener una muestra (por ejemplo una muestra de biopsia o resección) de un tumor del paciente; determinar el nivel de uno o más biomarcadores en la muestra y administrar un agente terapéutico al paciente si los niveles del biomarcador o biomarcadores en la muestra coinciden con un perfil predeterminado, por

5 ejemplo, el nivel de un biomarcador es mayor que un nivel mínimo. Tales métodos se aplican a cualquier tumor sólido. Las muestras de tumor adecuadas son como se han descrito anteriormente generalmente. En determinados métodos un biomarcador es una proteína receptora ErbB.

Determinados métodos comprenden: obtener una muestra del tumor, ensayar el nivel de pErbB3 en la muestra y posteriormente administrar al menos un agente terapéutico antineoplásico al paciente, donde, si el nivel de pErbB3 determinado en la muestra no es menor que un nivel mínimo que es el 25%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90%

o el 100% (preferentemente el 50%) del nivel de pErbB3 ensayado en un cultivo de células ACHN (células de cáncer renal, ATCC Nº CRL-1611) a continuación de cultivo durante aproximadamente 20-24 horas en medio sin suero, entonces el al menos un agente terapéutico antineoplásico administrado posteriormente al paciente comprende un

15 anticuerpo anti-ErbB3 y si el nivel de pErbB3 determinado en la muestra es menor que el nivel mínimo, entonces el al menos un agente terapéutico antineoplásico administrado posteriormente al paciente no comprende un anticuerpo anti-ErbB3. Los cultivos preferidos de células ACHN son aquellos que se han pasado no más de 9 veces, por ejemplo, células ACHN de 8 pases. En aspectos adicionales de tales realizaciones, el biomarcador es pErbB3, el agente terapéutico es un anticuerpo anti-ErbB3 y el nivel mínimo es el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90%

o el 100% del nivel observado en células tumorales a partir de un modelo de tumor de xenoinjerto de ACHN. En aspectos adicionales, el nivel mínimo es 0,064 pg/!g de proteína total, 0,08 pg/!g de proteína total, 0,096 pg/!g de proteína total, 0,122 pg/!g de proteína total, 0,128 pg/!g de proteína total, 0,144 pg/!g de proteína total o 0,16 pg/!g de proteína total.

25 En las realizaciones anteriores, el nivel de pErbB3 en la muestra puede, en algunos aspectos, determinarse mediante: a) medición de los niveles de al menos dos componentes de la ruta de señalización de ErbB3 en la muestra, b) cálculo de un Estado de Activación de Red (NAS) que estimula el nivel de pErbB3 en la muestra usando el nivel o niveles medidos en (a) introducidos en un modelo computacional de la ruta de señalización de ErbB3; y (c) la determinación a partir de los mismos del nivel de pErbB3 en la muestra. En determinadas realizaciones, los niveles de al menos tres, cuatro, cinco o seis componentes de la ruta de señalización de ErbB3 se detectan en (a). Los componentes adecuados de la ruta de señalización de ErbB3 incluyen, por ejemplo, ErbB1, ErbB2, ErbB3, ErbB4 (y homo y heterodímeros de las proteínas ErbB), HRG (por ejemplo, HRG-∀1), BTC, EGF, HB-EGF, TGF#, AR, EPG y EPR. Estos componentes se pueden ensayar como la proteína (por ejemplo, un monómero, un homodímero o un heterodímero) o cuando sea aplicable (por ejemplo, cuando el nivel total de la proteína se mide

35 independientemente del estado de fosforilación, pero no cuando se mide un nivel de fosfoproteína, por ejemplo, de un monómero, homodímero o heterodímero), como ARNm que codifica la proteína. Los ensayos apropiados se conocen bien en la técnica e incluyen los que se han descrito en el presente documento.

En aspectos adicionales, el método para determinar el nivel de pErbB3 comprende adicionalmente aplicar un algoritmo de clasificación estadística para generar el modelo computacional de la ruta de señalización de ErbB3 usado en el cálculo de NAS. En realizaciones adicionales, el NAS calculado simula los niveles de un heterodímero ErbB1/ErbB3 fosforilado y/o un heterodímero ErbB2/ErbB3 fosforilado en la muestra.

Los anticuerpos anti-ErbB3 para su uso dentro de la presente invención incluyen, pero sin limitación los anticuerpos

45 anti-ErbB3 desvelados en la Solicitud de Patente Internacional Nº PCT/US2008/002119, publicada como Publicación Internacional Nº WO 2008/100624, que se incorpora en el presente documento por referencia. Un anticuerpo particularmente preferido en la misma desvelado se conoce actualmente como MM-121, que actualmente está siendo sometido a ensayos clínicos de Fase I. Los anticuerpos anti-ErbB3 preferidos también incluyen los anticuerpo anti-ErbB3 descritos anteriormente. Otro anticuerpo anti-ErbB3 que se puede usar en los métodos desvelados en el presente documento es U3-1287 (AMG888) (U3 Pharma AG and Amgen), que actualmente se está sometiendo a ensayos clínicos de Fase I.

Los tumores susceptibles de tratamiento como se describe en el presente documento son generalmente como se ha descrito anteriormente. Los tumores ilustrativos son de un órgano seleccionado entre colon, pulmón, recto, vesícula

55 biliar, cerebro, médula espinal, mama, riñón, páncreas, estómago, hígado, hueso, piel, bazo, ovario, testículo, próstata y músculo. En algunos aspectos, se prefieren los tumores positivos ErbB3 o tumores positivos ErbB2 y ErbB3 (por ejemplo, tumores mamarios y tumores de cáncer de pulmón de células no pequeñas).

El agente terapéutico antineoplásico se puede administrar al paciente en cualquier forma adecuada. Típicamente, el agente terapéutico se proporciona en forma de una composición farmacéutica, que comprende el agente terapéutico en combinación con un vehículo fisiológicamente aceptable. Si se desea, también se pueden incluir otros ingredientes activos o inactivos dentro de la composición farmacéutica.

Como se usa en el presente documento, el término “fisiológicamente aceptable” significa aprobado por una agencia

65 reguladora de un gobierno federal o estatal (por ejemplo, la FDA de Estados Unidos o la EMEA) o enumerados en la Farmacopea de los Estados Unidos u otras farmacopeas reconocidas de forma general para uso en animales y más particularmente en seres humanos. El término “vehículo” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el cual se formula y se administra el agente terapéutico antineoplásico. Los vehículos fisiológicamente aceptables pueden ser líquidos estériles, tales como soluciones acuosas, que son vehículos preferidos para administración intravenosa u otra administración parenteral. Las soluciones salinas y soluciones de dextrosa y

5 glicerol acuosas son ejemplos de vehículos acuosos para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen, por ejemplo, almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua y etanol. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, agentes de tamponamiento de pH o conservantes.

Las composiciones farmacéuticas se pueden formular para cualquier manera o administración apropiada, incluyendo, por ejemplo, administración parenteral, intranasal, tópica, oral o local, tal como mediante un medio transdérmico, para tratamiento profiláctico y/o terapéutico. Los ejemplos de modos de administración farmacéuticos adecuados y vehículos se describen en “Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, A.R. Gennaro, ed.

15 Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, PA (21ª ed., 2005).

Comúnmente, las composiciones farmacéuticas usadas en los métodos proporcionados en el presente documento se administran por vía parenteral (por ejemplo, mediante inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea). Para administración parenteral, el agente terapéutico antineoplásico se puede suspender o disolver en el vehículo. Generalmente se prefiere un vehículo acuoso estéril, tal como agua, agua tamponada, solución salina o solución salina tamponada con fosfato. Adicionalmente, se pueden emplear aceites estériles fijos como un disolvente o medio de suspensión. Para este fin se puede emplear cualquier aceite fijo blando, incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Adicionalmente, ácidos grasos tales como ácido oleico se pueden usar en la preparación de composiciones inyectables. Las sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables también se pueden incluir para

25 aproximarse a condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste y tamponamiento de pH, agentes de ajuste de tonicidad, agentes de dispersión, agentes de suspensión, agentes humectantes, detergentes, conservantes, anestésicos locales y agentes de tamponamiento.

En una realización preferida, la composición farmacéutica se formula para administración intravenosa a un paciente (por ejemplo, un ser humano). Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante. Los ingredientes se pueden suministrar por separado o mezclados en conjunto en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado sin agua en un recipiente sellado herméticamente tal como una ampolla. Cuando la composición se tiene que administrar mediante infusión, la misma

35 se puede dispensar con una botella de infusión que contiene agua o solución salina de grado farmacéutico o estéril. Cuando la composición se administra mediante inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina de forma que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.

Las composiciones farmacéuticas se pueden esterilizar mediante técnicas de esterilización convencionales o las mismas se pueden esterilizar por filtración. Las soluciones acuosas estériles se pueden envasar para su uso como tales o liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con un vehículo acuoso estéril antes de la administración. El pH de una composición farmacéutica acuosa típicamente estará entre 3 y 11, más preferentemente entre 5 y 9 o entre 6 y 8 y más preferentemente entre 7 y 8, tal como 7 a 7,5.

45 El agente terapéutico generalmente está presente dentro de una composición farmacéutica a una concentración de forma que la administración de una dosis única a un paciente suministre una cantidad terapéuticamente eficaz. Una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad que da como resultado un beneficio para el paciente discernible, tal como un retardo o cese del crecimiento tumoral o preferentemente una reducción del tamaño tumoral. Las cantidades terapéuticamente eficaces están influidas por una diversidad de factores, incluyendo la actividad del agente terapéutico antineoplásico empleado; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el momento y la vía de administración; la velocidad de excreción; cualquier tratamiento simultáneo, tal como una combinación de fármaco; y el tipo y gravedad del daño de tejido en el paciente que está recibiendo el tratamiento. Las dosis óptimas se pueden establecer usando ensayos de rutina y procedimientos que se conocen bien en la técnica. En general, se prefieren las composiciones que proporcionan niveles de dosis que varían desde

55 aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal por día, por semana o una vez cada 2 semanas. Los ejemplos no limitantes de intervalos y regímenes de dosificación adecuados incluyen 2-50 mg/kg (peso corporal del sujeto) administrados una vez a la semana o dos veces a la semana o una vez cada tres días, una vez cada dos semanas o una vez cada tres semanas y 1-100 mg/kg administrado una vez a la semana o dos veces a la semana o una vez cada tres días o una vez cada dos semanas. En diversas realizaciones, un agente terapéutico se administra a una dosis de 3,2 mg/kg, 6 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg o 40 mg/kg con una frecuencia de una vez a la semana o dos veces a la semana o una vez cada tres días o una vez cada dos semanas o una vez cada tres semanas. Los intervalos de dosificación adicionales incluyen: 11000 mg/kg, 1-500 mg/kg, 1-400 mg/kg, 1-300 mg/kg y 1-200 mg/kg. Los programas de dosificación adecuados incluyen una vez cada tres días, una vez cada cinco días, una vez cada siete días (es decir, una vez a la semana),

65 una vez cada 10 días, una vez cada 14 días (es decir, una vez cada dos semanas), una vez cada 21 días (es decir, una vez cada tres semanas), una vez cada 28 días (es decir, una vez cada cuatro semanas) y una vez al mes.

Preferentemente, el agente terapéutico (por ejemplo, anticuerpo anti ErbB3) se administra a un paciente de acuerdo con las direcciones en la información de prescripción proporcionada por el fabricante o distribuidor del agente terapéutico.

5 También se describen kits para el uso en el tratamiento de pacientes que tienen un tumor maligno. Tales kits determinados comprenden típicamente: a) al menos un ensayo para detectar el nivel de al menos un componente de la ruta de señalización de ErbB3 en una muestra; y b) instrucciones para calcular un Estado de Activación de Red (NAS) que simula el nivel de pErbB3 usando un modelo computacional de la ruta de señalización de ErbB3 en el que se han introducido datos obtenidos a partir de al menos un ensayo. En determinadas realizaciones, tales kits

10 comprenden además instrucciones para aplicar un algoritmo de clasificación estadística. En determinadas realizaciones, el kit también comprende un anticuerpo anti-ErbB3. El ensayo típicamente comprende uno o más reactivos que permiten la detección de al menos un componente de proteína o al menos un componente de ARNm. En determinadas realizaciones, las instrucciones para calcular un NAS comprenden dirigir el uso de un producto de programa informático que contiene instrucciones ejecutables que cuando se ejecutan por un ordenador provocan

15 que un procesador lleve a cabo operaciones para el cálculo de un NAS; en tales realizaciones, el usuario se puede instruir para desarrollar el programa informático en un ordenador local o el usuario se puede instruir para conectarse con un servicio basado en Internet que desarrolla el programa informático de forma remota.

Dentro de realizaciones adicionales, se proporcionan kits que comprenden anticuerpos anti-ErbB3 e instrucciones

20 (por ejemplo, en forma de etiqueta, por ejemplo, un prospecto) que indican que el anticuerpo anti-ErbB3 se tiene que administrar al paciente si el nivel de pErbB3 en una biopsia tumoral del paciente excede un valor mínimo especificado y que el anticuerpo anti-ErbB3 no se tiene que administrar al paciente si el nivel de pErbB3 no excede el valor mínimo especificado. Por ejemplo, tales instrucciones pueden indicar que el anticuerpo anti-ErbB3 se tiene que administrar a un paciente que tiene un tumor maligno si el nivel de ErbB3 fosforilado determinado en la muestra

25 no es menor del 50% de un nivel de ErbB3 fosforilado medido en un cultivo de células de cáncer renal ACHN (ATCC Nº CRL-1611) después de cultivo durante aproximadamente 20-24 horas en medio sin suero; y que un anticuerpo anti-ErbB3 no se tiene que administrar a un paciente que tiene un tumor maligno si el nivel de ErbB3 fosforilado determinado en la muestra es menor del 50% del nivel de ErbB3 fosforilado medido en el cultivo de células de cáncer renal ACHN.

VIII. Realizaciones de Cálculo

Como se ha mencionado anteriormente y como debe ser fácilmente evidente a partir de la divulgación proporcionada en este documento, muchos de los métodos descritos utilizan uno o más sistemas informáticos para realizar los

35 diversos procesos descritos anteriormente, incluyendo, pero sin limitación, predecir respuestas de pacientes, generar tratamientos recomendados, identificar biomarcadores, cálculo de valores de NAS o NIS, obtención de modelos computacionales de rutas de señalización y así sucesivamente.

Las Figuras 15A y 15B ilustran diagramas de flujo de algunos de los procesos que se pueden realizar por uno o más

40 sistemas informáticos durante la implementación de determinadas realizaciones de la invención. Como se muestra, por ejemplo, sistemas informáticos se pueden utilizar para medir y/o recibir entrada de niveles medidos de componentes en una red celular de un tumor así como el estado de mutación de los genes tumorales. Los sistemas informáticos también se pueden usar para obtener modelos computacionales, que se pueden obtener, por ejemplo recibiendo, descargando, construyendo, modificando, entrenando y/o accediendo a modelos computacionales a

45 partir de fuentes locales y remotas.

Una vez que se ha obtenido un modelo computacional, uno o más sistemas informáticos calculan el NAS o el NIS de las células, tal como, por ejemplo, simulando los niveles pertinentes de proteínas, homodímeros y/o heterodimeros fosforilados en las células. El modelo computacional también se puede usar mediante el sistema informático para

50 identificar biomarcadores predictivos a través de la identificación de componentes pertinentes adicionales en la red celular en base a ajustes de usuario recibidos en el sistema informático.

El sistema informático también se puede usar para identificar algoritmos de clasificación estadística que se pueden recibir, construir y/o modificar mediante el sistema informático como parte del proceso de identificación en el que se

55 pueden usar en diversas combinaciones con los datos de NAS o NIS, otros datos de biomarcador y datos de paciente, para generar respuestas de pacientes predichas frente a los tratamientos y/o para generar y seleccionar tratamientos recomendados.

Aunque los elementos ilustrados en los diagramas de flujo de las Figuras 15A y 15B infieren una secuencia u

60 ordenamiento sugerido para llevar a cabo los procesos informáticos de la invención, se apreciará que los procesos ilustrados en las Figuras 15A y 15B también se pueden llevar a cabo en secuencias que tienen orden diferente. Por ejemplo, un tratamiento recomendado se puede identificar antes de generar el modelo computacional o calcular el NAS o NIS y que se puede usar en la construcción del modelo computacional. De forma similar, la medición de los niveles de proteína se puede producir antes de o posteriormente a la generación del modelo computacional.

65 También se apreciará que se pueden llevar a cabo procesos adicionales, tales como procesos para obtener información del paciente (por ejemplo, edad, género, historia clínica) y para rastrear resultados reales de tratamientos recomendados, así como también otros procesos.

5 También se apreciará que los sistemas informáticos pueden incluir uno o más sistemas informáticos diferentes, de diferentes tipos, así como en diferentes emplazamientos.

La Figura 16 ilustra un ejemplo de un sistema informático que se puede usar, por ejemplo, para llevar a cabo al menos algunos de los procesos ilustrados en las Figuras 15a y 15B, así como aquellos descritos a lo largo de este documento. Como se ilustra, el sistema informático incluye diversos dispositivos de entrada, dispositivos de salida, módulos informáticos, componentes de procesamiento y medios de almacenamiento. Los dispositivos de entrada pueden incluir teclados, dispositivos de ratón, touch pads, pantallas táctiles, micrófonos, así como cualquier otro dispositivo de entrada. Los dispositivos de salida pueden incluir altavoces, pantallas de visualización, dispositivos de impresión, interruptores, así como también otros dispositivos de salida. Los módulos informáticos incluyen los

15 diversos módulos necesarios para llevar a cabo la funcionalidad descrita en este documento, incluyendo módulos para recibir y construir modelos computacionales, módulos para calcular el NAS o NIS, módulos para identificar biomarcadores predictivos, módulos para obtener, reconocer y almacenar niveles medidos de componentes y para identificar y determinar estado de gen de mutación, módulos para identificar y aplicar algoritmos de clasificación estadística, módulos para generar respuestas predichas a los tratamientos, módulos para generar y seleccionar tratamientos recomendados, módulos de comunicaciones para conectarse con usuarios y uno o más dispositivos diferentes, así como también módulos para llevar a cabo los diversos procesos diferentes descritos en el presente documento.

El sistema informático también incluye uno o más procesadores y otros componentes de procesamiento necesarios

25 para ejecutar los módulos anteriores, así como medios de almacenamiento para almacenar los módulos anteriores, así como también las diversas estructuras de datos, modelos computacionales y otros datos descritos en el presente documento. Aunque los medios de almacenamiento se ilustran como que son locales al sistema informático, se apreciará que los medios de almacenamiento también pueden estar ubicados remotamente del sistema informático o únicamente parcialmente locales en el sistema informático. Por ejemplo, en algunos casos, los medios de almacenamiento representan un almacenamiento distribuido que se comparte entre una pluralidad de sistemas informáticos diferentes y que incluye espacio de almacenamiento localizado en una pluralidad de sistemas informáticos. Los medios de almacenamiento también pueden comprender cualquier combinación de memoria persistente y volátil.

35 La Figura 16 también ilustra que el sistema informático se puede conectar en red a uno o más dispositivos diferentes, incluyendo dispositivos de medición, ordenadores localizados de forma remota, servicios remotos y redes remotas. En algunos casos, uno o más de estos dispositivos diferentes llevan a cabo uno o más de los procesos descritos en este documento, de forma que la ejecución de algunos métodos se realiza en un entorno de red distribuido que implica múltiples sistemas y dispositivos informáticos distribuidos.

IX. Ejemplos

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

45 Ejemplo 1: Estudios de Eficacia de Xenoinjerto con Ab Nº 6: Conjunto de Datos de Entrenamiento

En este ejemplo, se usaron cuatro modelos de xenoinjerto para identificar líneas de células tumorales que respondían al tratamiento con el anticuerpo anti-ErbB3 Ab Nº 6. Los cuatro modelos de tumor de xenoinjerto estudiados representan diferentes indicaciones: MALME3M (línea de cáncer de melanoma; ATCC Nº HTB-64), ADRr (línea de células de cáncer ovárico; NCI-60, muestra cósmica ID Nº 905987), ACHN (línea de células de cáncer renal; ATCC Nº CRL-1611) y DU145 (línea de células de cáncer de próstata; ATCC Nº HTB-81). Como se describe con más detalle más adelante, los xenoinjertos de MALME3M y ADRr no mostraron una respuesta al tratamiento con Ab Nº 6, mientras que los xenoinjertos de ACHN y DU145 mostraron una respuesta frente al tratamiento con Ab Nº

6.

55 En los modelos de tumor de xenoinjerto, se implanta en el flanco derecho de ratones (ratones nu/nu: ratones hembra de 3-4 semanas de edad, deficientes en células T; exogámicos; antecedentes Albino; de Charles River Labs, Wilmington, MA) 3,5 x 106 -3 x 108 células/ratón (dependiendo de la línea celular) en 200 !l a través de inyección subcutánea. Los ratones se supervisan para crecimiento tumoral inicial. Se permite que las células tumorales crezcan durante varios días hasta que el volumen del tumor es aproximadamente 200 mm3. El volumen de tumor se calcula como V = (∃/6 (L x W2). Los ratones se tratan con el anticuerpo Ab Nº 6 a una dosis de 600 !g/inyección cada 3 días (qd3). Los ratones de control se tratan con solución salina tamponada con fosfato (PBS).

El volumen del tumor se mide durante 60-80 días. Los resultados (obtenidos usando los métodos descritos

65 anteriormente o variaciones menores de los mismos) del efecto del tratamiento de anticuerpo sobre el crecimiento tumoral se resumen en los gráficos mostrados en las Figuras 1A-1D, que demuestran que el tratamiento con Ab Nº 6 inhibió el crecimiento tumoral en los modelos de xenoinjerto de DU145 y ACHN, mientras que el tratamiento con Ab Nº 6 no inhibió el crecimiento tumoral (en comparación con el control de PBS) en los modelos de xenoinjerto de ADRr y MALME3M.

5 Como una medida de sensibilidad del tumor frente a Ab Nº 6, se determina el índice de crecimiento exponencial, el cual describía mejor los datos experimentales. Se usa la siguiente fórmula para describir el crecimiento exponencial.

V = Vo*exp(k*t)

donde V es el volumen del tumor en mm3, Vo es el volumen del tumor en tiempo cero, k es el índice de crecimiento exponencial y t es el tiempo en días.

Con el fin de comparar la reducción de crecimiento a través de diferentes estudios de xenoinjerto, se calcula un valor de Reducción de Índice de Crecimiento (RIC) para cada línea de células ensayada, el cual relaciona el Índice de

15 Crecimiento observado en presencia de Ab Nº 6 con el índice de crecimiento observado en el grupo de control de PBS usando la siguiente fórmula:

Reducción de Índice de Crecimiento = 1 – (Índice de Crecimiento Ab Nº 6 k Ab Nº 6) / (Índice de Crecimiento PBS kPBS)

Los valores de RIC de las cuatro líneas de células ensayadas (obtenidos usando los métodos descritos anteriormente o variaciones menores de los mismos) se resumen en la Tabla 1 más adelante. En el caso de una Reducción de Índice de Crecimiento negativa, el valor de RIC se ajusta a cero.

25 Tabla 1: Sumario de Reducción de Índice de Crecimiento Tumoral de Conjunto de Entrenamiento de Estudios de Xenoinjerto

Línea Celular: RIC [%]

MALME3M: 0

DU145: 72,6

ADRr: 0

ACHN: 28,0

Los resultados demuestran que los cuatro xenoinjertos muestran un intervalo de sensibilidad frente a tratamiento de Ab Nº 6, donde las células ADRr y MALME3M no muestran respuesta frente a tratamiento con Ab Nº 6, ACHN tiene una sensibilidad de rango medio y las células DU145 tienen la sensibilidad más alta al tratamiento de Ab Nº 6.

Ejemplo 2: Niveles de pERbB3 en Lisados de Línea de Células Tumorales se correlacionan con Sensibilidad a Ab Nº 6 en Xenoinjertos

35 En este ejemplo, la concentración de ErbB3 fosforilado (pErbB3) se midió in vivo en cada una de las cuatro líneas de células tumorales estudiadas en el Ejemplo 1, MALME3M, ADRr, DU145 y ACHN, en un estudio de farmacodinámica (PD) a corto plazo. El xenoinjerto de OvCAR8 también se incluyó en este experimento (este xenoinjerto muestra ser sensible al tratamiento con Ab Nº 6 en el Ejemplo 5 descrito más adelante).

Las células MALME3M, ADRr, DU145, OvCAR 8 y ACHN se desarrollan en cultivo y se recogen para implante (placas de 15 x 15 cm, confluencia %80%, Nº total de células = 2 -4 x 108) y se mantuvieron en hielo hasta el implante. Las células (aproximadamente 2 x 107 células/ratón) se implantan en 20 ratones (a través de inyección subcutánea, 200 !l de células/inyección/ratón) en el flanco derecho y después se permite que los ratones se recuperen mientras se supervisan para el crecimiento de tumor inicial. Los tumores se miden (L x A) mediante

45 medición con calibrador digital. Una vez que los ratones alcanzaron un volumen de tumor mayor de 100 mm3, los mismos se sometieron a eutanasia mediante asfixia con CO2 y los tumores de cada ratón se extirpan y se congelan rápidamente en nitrógeno líquido. Las muestras de tejidos tumorales congeladas se almacenan a -80 ºC para análisis bioquímico. La cantidad de ErbB3 fosforilado (pErbB3) en los lisados tumorales se determina mediante ELISA usando el kit de ELISA de pErbB3 de R&D Systems Human (Nº de Catálogo DYC1769). La preparación de la muestra y los protocolos de ELISA se describen con mayor detalle más adelante.

Para la preparación de la muestra y la extracción de proteína, en primer lugar los tumores congelados se pulverizan y transfieren a criotubos VWR de 2 ml pesados previamente (VWR International). Las muestras pulverizadas se pesan y los pesos se registran. Después del cálculo del peso de la muestra, se añade la cantidad apropiada de

55 tampón de lisis helado a cada tubo hasta una concentración final de 62 mg/ml. Las muestran se someten a agitación vorticial brevemente a velocidad baja y se incuban a 4 ºC con rotación.

El lisado tumoral crudo se transfiere posteriormente a Qiagen Qiashredder y se centrifuga a 12000 rpm durante 8 minutos para homogeneización adicional de las muestras. Después de la transferencia de los lisados aclarados en un tubo fresco, se extrae una pequeña cantidad de cada lisado para ensayo de proteína BCA. El resto del lisado se divide en alícuotas y se almacena a -80 ºC para análisis de ensayo de ELISA adicional.

Para cuantificar la proteína total usando un Kit de Ensayo de Proteína BCA (Pierce, Nº de Catálogo 23225), en

5 primer lugar se prepara una curva normal de 8 puntos de albúmina sérica bovina (BSA) usando la solución patrón de BSA de 2 mg/ml del kit de BCA, comenzando con la concentración de reserva de 2 mg/ml. Después de mezclar los reactivos A y B del kit (50:1) y preparar diluciones de 3 veces y 5 veces de lisado de tumoral de reserva con PBS, 20 !l de patrón de BSA o de muestra de lisado de tumor diluido y 160 !l de reactivo de trabajo se añaden a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. La placa se incuba a 37º Celsius durante 20 minutos. La DO562 se lee y la cantidad total

10 de proteína en los lisados tumorales se calcula usando la curva normal de BSA.

Para llevar a cabo el ELISA de pErbB3, diferentes anticuerpos de captura se diluyen con PBS hasta la concentración de trabajo recomendada por el kit (R&D Systems DYC1769). Después de recubrir placas de 96 pocillos negras (Nunc Maxisorb) con anticuerpos de captura diluidos, todas las placas se incuban a temperatura ambiente (TA)

15 durante una noche. Las placas después se lavan 3 veces con PBST (PBS + Tween-20 al 0,05%) en una lavadora de placa Bio Tek y se bloquean durante 2 horas a TA con 200 !l de BSA al 1% en PBST.

Las proteínas recombinantes para curvas normales se preparan con la concentración más elevada recomendada por el kit y diluciones de 2 veces para un total de 11 puntos. Las placas se lavan 3 veces con PBS y 100 !l de lisados

20 tumorales se añaden antes de incubar durante 2 horas a TA. Después, las placas se lavan 3 veces con PBST y se añaden 100 !l de anticuerpo de detección primaria, diluido hasta la concentración de trabajo en PBS/BSA al 0,1%/Tween-20 al 0,05%. Las placas se incuban adicionalmente a TA durante 2 horas. Finalmente, se añaden 100 !l del Sustrato Quimioluminiscente mezclado SuperSignal ELISA Pico (Pierce, Nº de Catálogo 37069) a cada pocillo antes de leer las placas.

25 La Figura 2 es un gráfico que representa la concentración de pErbB3 en los tumores de xenoinjerto no tratados (en pg/!g de lisado tumoral) frente a la Reducción del Índice de Crecimiento (%--obtenida usando los métodos descritos anteriormente o variaciones menores de los mismos) observada para los xenoinjertos cuando se trataban con Ab Nº

6. La Figura 2 demuestra que existe una buena correlación entre la Reducción del Índice de Crecimiento tumoral y

30 los niveles de pErbB3 constitutivos medidos en los estudios de farmacodinámica a corto plazo. Los xenoinjertos de MALME3M y ADRr, que no respondieron a tratamiento con Ab Nº 6, mostraron los niveles más bajos de pErbB3, mientras que los xenoinjertos de ACHN, OvCAR8 y DU145 que respondieron a tratamiento con Ab Nº 6, tenían niveles significativamente más elevados de pErbB3. Los resultados demuestran que los niveles de pErbB3 en las células tumorales se correlacionan bien con la sensibilidad de las células tumorales frente al tratamiento con

35 anticuerpo anti-ErbB3.

Ejemplo 3: Los Niveles de pErbB3 y pAKT disminuyen como una Función del Tiempo hasta la Congelación

En este ejemplo, se evaluó la estabilidad de pErbB3 y pAKT, así como también los niveles de expresión de ErbB1,

40 ErbB2 y ErbB3 en lisados tumorales como una función de tiempo después de la resurrección a partir del congelamiento del tumor.

Ratones con xenoinjerto de ACHN y EKVX no tratados se someten a eutanasia mediante asfixia con CO2 y los tumores se disecan y cortan en 4 trozos y se colocan en nitrógeno líquido en diferentes puntos de tiempo: 0 min, 10 45 min, 30 min y 60 min. Después se miden los niveles de pErbB3 y pAKT, así como los niveles de ErbB-3, en cada una de las muestras después de la congelación. Los resultados obtenidos usando los métodos descritos anteriormente o variaciones menores de los mismos se resumen en los gráficos de barras mostrados en las Figuras 3A-3E, con las Figuras 3A y 3B mostrando los niveles de pErbB3 y pAKT, respectivamente, en los lisados de ACHN y las Figuras 3C, 3D y 3E, mostrando los niveles de ErbB1, ErbB2 y ErbB23, respectivamente, en los lisados de

50 EKVX.

Como se muestra en las Figuras 3A y 3B, en las muestras de 10 minutos, ya había una disminución medible en los niveles de pErbB3 y pAKT en comparación con las muestras de 0 minutos. En las muestras de 30 minutos, se observó una disminución en la concentración del 40% para pErbB3 en comparación con el control (congelamiento 55 inmediato del tumor, muestra de 0 minutos) y se observó una disminución en la concentración del 20% para pAKT en comparación con el control. Por el contrario, en los lisados de células tumorales de EKVX y ACHN, los niveles totales de ErbB1-3 permanecieron constantes y no parecieron estar afectados por el tiempo para la congelación (véanse las Figuras 3C-3E). Por tanto, la inestabilidad observada de fosfoproteínas en muestras de tumor y la estabilidad observada de mediciones de proteína total demuestran la ventaja de calcular el nivel de fosforilación de

60 ErbB3, en lugar de medir directamente el nivel en un lisado de células tumorales. El nivel calculado de pErbB3 se denomina el Estado de Activación de Red (NAS) en los siguientes ejemplos usando un modelo computacional mecanicista construido como se ha descrito más adelante en el Ejemplo 4.

Ejemplo 4: Construcción y Entrenamiento de un Modelo Computacional Mecanicista de la Ruta de Señalización de ErbB

En el siguiente ejemplo, se describe la construcción de modelos bioquímicos computacionales mecanicistas de rutas de transducción de señal. En base a la bibliografía del conocimiento acerca de la señalización de ErbB, se desarrolló un modelo computacional mecanicista que comprende todas las interacciones proteína-proteína que describen la unión de ligando al receptor, dimerización, internalización de receptor y degradación, así como también la unión de la molécula adaptadora Gab1 que conduce a la activación de la cascada de PI3K. En la Figura 4A se representa un dibujo de la red de señalización de ErbB implementada. El modelo computacional es un conjunto de ecuaciones diferenciales ordinarias no lineales (EDO) que usan cinética de acción de masas. La Figura 4B muestra el conjunto de reacciones bioquímicas a partir de la ruta de señalización y la Figura 4C muestra un conjunto de flujos. Las reacciones bioquímicas y los flujos se traducen en un conjunto de EDO no lineales, ilustradas en la Figura 4D. En general, el estado de cambio de una concentración de proteína ci es igual a la velocidad de producción de la proteína vproducción menos la velocidad de consumo vconsumo de la proteína representada en la Ecuación 1.

dci (&vproducción ∋&vconsumo (Ec. 1)

dt

El modelo computacional usado para predecir las respuestas frente a Ab Nº 6 en los siguientes ejemplos consiste en la red de ErbB de mamífero que incluye los cuatro receptores (ErbB1-4) y la cascada de transducción de señal de Akt.

Los receptores ErbB son receptores de transmembrana de Tipo I de paso único con dominios de unión a ligando extracelulares, un dominio de tirosina quinasa intracelular y una cola citoplasmática que actúa como un andamio de señalización. ErbB1 y ErbB4 son completamente funcionales en la unión a ligando y actividad de tirosina quinasa pero ErbB2 no se une a ningún ligando conocido y funciona en lugar de ello como un amplificador se señal listo para dimerización (Klapper, L.N. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 4995-5000). ErbB3 tiene un dominio de quinasa invalidado (Guy, P.M. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8132-8136) y por lo tanto carece de actividad catalítica, en lugar de ello transduce señales cuando se fosforila por otros receptores ErbB. De los 13 ligandos de ErbB conocidos, BTC y HRG se han implementado como ligandos que inducían los niveles de fosforilación de ErbB23 más elevados. Los 13 ligandos de ErbB conocidos se pueden dividir en tres grupos: (i) aquellos que se unen específicamente a ErbB1, tales como EGF, factor del crecimiento transformante alfa (TGF#)y anfirregulina (AR), (ii) aquellos que muestran especificidad doble, uniéndose tanto a ErbB1 como a ErbB4, que incluyen BTC, HB-EGF, EPG y EPR y (iii) las neurregulinas (NRG), que caen en dos subgrupos: NGR1 (también conocido como GGF2, SMDF o HRG) que se une a ErbB3/ ErbB4, una proteína compartida también con NRG2 y NRG3/NRG4 que se une a ErbB4 en solitario. A continuación de la unión a ligando, los receptores dimerizan y experimentan transfosforilación en los restos en sus colas citoplasmáticas, creando de ese modo sitios de anclaje para moléculas adaptadoras que contienen SH2 tales como Shc, Grb2, GAP, Sos y PI3K. ErbB1 tiene al menos 20 sitios de fosforilación de tirosina en su cola citoplasmática, 12 de los cuales se han propuesto para acompañar a proteínas adaptadoras que contienen SH2 y enzimas (Schulze, W.X. et al. (2005) Mol. Syst. Biol. 1: 2005-2008). Otros receptores ErbB experimentan igualmente modificación pos-traduccional compleja. Los adaptadores asociados a receptor tales como Grb2 y PI3K activan RAS y en última insta activan ERK y AKT. AKT también se puede activar de una manera independiente de RAS a través de la unión directa de PI3K-p85 a sitios múltiples en ErbB3.

Aunque se han publicado varios modelos computacionales (véanse, por ejemplo, Kholodenko, B.N. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 30169-30181; Hatakeyama, M. et al. (2003) Biochem. J. 373: 451-463; Resat, H. et al. (2003) Biophys. J. 85: 730-743; Hendriks, B.S. et al. (2005) J. Biol. Chem. 280: 6157-6169); Sasagawa, S. et al. (2005) Nat. Cell. Biol. 7: 365-373; Birtwistle, M.R. et al. (2007) Molecular Systems Biology 3: 144), el modelo computacional usado en el presente documento es más exhaustivo e incluye los cuatro receptores ErbB y dos clases diferentes de ligandos (HRG y BTC) mientras que, sin embargo, mantiene el rigor de una formulación de acción de masas basada en reacciones elementales.

Siete hetero y homodímeros de ErbB que se han descrito en la bibliografía se implementaron en el modelo: ErbB1/1, ErbB1/2, ErbB1/3, ErbB1/4, ErbB2/2, ErbB2/3 y ErbB2/4. La mayoría de estos dímeros se activan mediante unión a ligando pero varios surgen a través de un proceso de “señalización lateral” (o dimerización secundaria) en el cual dímeros fosforilados de una manera dependiente de ligando se disocian en monómeros y después homo o heterooligomerizan con monómeros activados o inactivos para crear dímeros activos. El modelo computacional se entrenó con un conjunto de datos experimentales que permitieron la identificación de los dímeros que se forman en presencia de HRG o BTC usando la línea de células ADRr.

El modelo computacional se basa en ecuaciones diferenciales ordinarias no lineales, que requieren dos tipos de parámetros que se tienen que medir o estimar: número de especies iniciales y constantes de velocidad. Antes de la calibración del modelo, se especificaron los valores de tantos parámetros como fuera posible en base a información de bibliografía, por ejemplo, las constantes de unión de ligandos a sus receptores afines. Usando análisis qFACS, se cuantificaron los niveles de expresión de los receptores ErbB a través de todas las líneas celulares usadas en esta aplicación. Además, se usó ELISA para cuantificar los niveles de BTC y pErbB3. Adicionalmente, se determinaron los niveles de ARNm de HRG-∀1 en comparación con los niveles de ARNm en la línea de células ZR-75 (ATCC Nº CRL-1500). Los niveles de expresión de receptor y ligando, información que se usa en el modelo computacional, se resumen en la Tabla 2 más adelante. Las metodologías para obtener estos niveles de expresión se describen con

5 mayor detalle más adelante.

Las líneas celulares tumorales se obtienen en el Instituto Nacional del Cáncer. Todas las líneas celulares se cultivan como cultivos monocapa en una atmósfera humidificada de CO2 al 5%, el 95% de aire y 37 grados Celsius en medios completos: medio RPMI-1640 (Gibco), complementado con suero fetal de ternera al 10% (FCS) (Hyclone), L

10 glutamina 2 mM (Gibco) y unidades/ml de Pen-Strep (Gibco).

Los niveles de expresión de receptor se cuantifican usando el Kit Quantum Simply Cellular 816A (Bangs Laboratories), que permite la cuantificación de niveles de expresión de receptor mediante qFACS. El mismo contiene una serie de 4 poblaciones microesferas marcadas con cantidades variables de anti-IgG humana de cabra más una 15 población de blanco. La IgG conjugada a la superficie de las perlas es específica para las partes Fc de los anticuerpos de IgG. Las perlas se tiñen igual que las muestras de células y con el mismo anticuerpo. Cada una de las poblaciones diferentes de microesferas se une a una cantidad conocida del anticuerpo monoclonal marcado. Mediante la representación de la intensidad de fluorescencia de cada población frente a su valor de Capacidad de Unión al Anticuerpo asignado (CUA) se genera una curva de CUA convencional y la CUA de muestras de células

20 teñidas se determina fácilmente usando el software proporcionado por Bangs Laboratories (QuickCal v 2.3). Este programa tiene en cuenta la marca del instrumento usado, el voltaje para esa muestra y el fluorocromo usado.

Los niveles de expresión de BTC se miden mediante ELISA usando el Kit de Betacelulina humana de R&D Systems Dy261 DuoSet-IC. Una placa de 384 pocillos se recubre con 4 !g/ml de anticuerpo de captura. La placa de 384

25 pocillos se bloquea añadiendo 50 !l de BSA al 2%/PBS 1X (sin Tween-20) durante 1 hora y se prepara una curva normal recombinante. Después de lavar las placas, se añaden 16 !l de lisados celulares, así como también anticuerpo de detección Anti-Fosfo-Tirosina-HRP (peroxidasa de rábano picante), seguido por incubación durante 2 horas. Finalmente se añaden 20 !l de sustrato luminiscente Pico y las placas se leen espectrofotométricamente.

30 Ya que los ensayos disponibles en el mercado para medir los niveles de expresión de proteína HRG-∀1 no eran suficientemente sensibles para obtener datos fiables para las líneas celulares examinadas, los niveles de ARNm de HRG-∀1 se cuantificaron para las líneas celulares de interés. El ARN se aísla a partir de los lisados celulares usando el protocolo RNeasy Mini (74104 RNEASY KIT de QUIAGEN). Después convertir ARN aislado en ADNc y preparar una mezcla maestra para PCR cuantitativa (QPCR) usando la mezcla Maestra de Applied Biosystems 430443 7

35 Tagman, se desarrolla QPCR y se cuantifica la expresión de ARNm de HRG-∀1 con relación a los niveles de ARNm en células ZR75-1. Los cebadores de QPCR se adquieren en Applied Biosystems.

Los niveles de fosforilación de ErbB3 para las diferentes líneas celulares mostrados en la Tabla 2 se determinan usando el kit de ELISA de pErbB3 de R&O (Dyc1769-2 DuoSet-IC human phospho-ErbB3), usando los métodos

40 descritos anteriormente en el Ejemplo 2 o variaciones menores del mismo.

La Tabla 2 resume la información del nivel de expresión del receptor y ligando obtenida para las diferentes líneas celulares usando los métodos descritos anteriormente o variaciones menores del mismo, información que se usó en la construcción del modelo computacional de la ruta de señalización de ErbB. La columna 1 muestra el nombre de la

45 línea celular; la columna 2 muestra el tipo de tumor, las columnas 3-5 muestran el número de receptores por célula para ErbB1, ErbB2 y ErbB3, respectivamente; la columna 6 muestran los niveles de ARNm de HRG-∀1, expresados como las veces en comparación con los niveles de ARNm en células ZR-75; y las columnas 7 y 8 muestran la cantidad de BTC y pErbB3 presentes en las células expresadas como pg/célula.

50 Tabla 2: Resumen de Niveles de Expresión de Receptor y Ligando para las Líneas Celulares Usadas en Experimentos de Xenoinjerto

Línea Tipo de ErbB1 ErbB2 ErbB3 Veces de HRG b-1 BTC pErbB3 celular tumor en comparación con Nº /célula Nº /célula Nº ZR-75 pg/célula pg/célula /célula

ACHN renal 448283,5 45455,75 15200 2544,794306 3,34191 E-4,15E-05 05

ADRr mamario 177817,5 40792 33204,5 226 1,14529E-1,80E-05 08

DU145 próstata 437841,25 69068 19422 2,219138944 9,87522E-1,50E-04 06

IGROV1 ovárico 149031,25 158417,5 5355,25 0 2,61392E-ND 06

MALM melanoma 2914,2 56422 67367 0,438302861 6,71181E-7,90E-06 E3M 08 OVCAR8 ovárico 236156,75 53272,25 31812,75 343,3017338 5,8861E-07 ND SKOV3 ovárico 264132 1377660,5 13693,5 340 1,63191 E-ND

Para el entrenamiento del modelo computacional, se usó un conjunto de datos que comprende matrices de dosistiempo en las cuales se mide la fosforilación de ErbB1, ErbB2, ErbB3 y AKT en puntos de tiempo múltiples y a nueve concentraciones diferentes de estimulación con BTC o HRG en células ADRr mediante ELISA. Para estimulación de 5 las células, las células se siembran en 100 !l de medios completos a 35.000 células por pocillo en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos y se incuban durante una noche en una atmósfera humidificada de CO2 al 5%, aire al 95% y 37 grados Celsius. Las células después se cambian a medio sin suero: medio RPMI-1640 (Gibco) complementado con L-glutamina 2 mM (Gibco) y unidades/ml de Pen-Strep (Gibco). Las células en inanición se incuban en una atmósfera humidificada de CO2 al 5%, aire al 95% y 37 grados Celsius durante 20-24 horas antes de la estimulación. 10 Para los estudios de matriz de dosis-tiempo, las células se estimulan con ligando (BTC o HRG) a 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 20, 30, 60 y 120 minutos. A continuación de la estimulación con 9 concentraciones diferentes de HRG (0,038 nM-250 nM) y BTC (0-700 nM) para cada curso de tiempo, las células se colocan en hielo, se lavan con PBS frío, después se lisan en 30 !l de Tampón de Extracción de Proteína de Mamífero M-PER frío (Thermo Scientific, Nº Catálogo 78501) complementado con cóctel inhibidor de proteasa (Sigma-Aldrich, P2714), ortovanadato de sodio 1

15 mM (Sigma-Aldrich, S6508), pirofosfato de sodio 5 nM (Sigma-Aldrich, 221368), oxofenilarsina 50 !M (EMD Biosciences, 521000) y bpV 10 !M (phen) (EMD Biosciences, 203695).

Los niveles de fosforilación de proteína en las células estimuladas se miden mediante ELISA. Los anticuerpos de captura frente a ErbB1 (R&D Systems, AF231), ErbB2 (R&D Systems, MAB1129), ErbB3 (R&D Systems, MAB3481) 20 y AKT (Upstate 05-591MG) se incuban en placas de unión elevada de poliestireno de fondo plano negras de 384 pocillos (Coming, Nº de Catálogo 3708) durante una noche a temperatura ambiente. Las placas de ELISA se bloquean con albúmina sérica bovina al 2% (BSA) y solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante una hora y después se incuban con lisados diluidos en BSA al 2%, Tween-20 al 0,1% y PBS durante dos horas a temperatura ambiente. Entre cada incubación, las placas se lavan tres veces con Tween-20 al 0,05% en PBS. Los ELISA para 25 medir fosfo-ErbB1, ErbB2 y ErbB3 se incuban con anticuerpo monoclonal enlazado a peroxidasa de rábano picante (HRP) fosfotirosina (R&D Systems, HAM1676) durante dos horas. Los ELISA para medir fosfo-AKT se incuban con anticuerpo monoclonal anti-fosfo AKT de ratón específico de serina 473 primario (Cell Signaling Technologies, Nº de Catálogo 5102) durante 2 horas, después se incuban con Estreptavidina-HRP (R&D Systems, Nº de Catálogo DY998) durante 30 minutos. Todos los ELISA se visualizan con sustrato Quimioluminiscente SuperSignal ELISA

30 Pico (Pierce, Nº de Catálogo 37069) y la señal luminiscente se mide usando un luminómetro.

Los resultados (obtenidos usando los métodos descritos anteriormente o variaciones menores de los mismos) para el conjunto de datos de la fosforilación de la proteína en múltiples puntos de tiempo y nueve concentraciones diferentes de BTC o HRG se muestran en las Figuras 5A-5B, donde la Figura 5A muestra los niveles de fosfo-ErbB3,

35 fosfo-ErbB2, fosfo-ErbB3 y fosfo-AKT para células estimuladas con HRG y la Figura 5B muestra los niveles de fosfo-ErbB3, fosfo-ErbB2, fosfo-ErbB3 y fosfo-AKT para células estimuladas con BTC. Este conjunto de datos se usó para calibrar el modelo computacional de la ruta de señalización de ErbB de forma que los resultados de simulación (líneas) describen los datos experimentales (puntos) mostrados en las Figuras 5A-5B.

40 Más adelante se proporciona información adicional acerca del desarrollo de un modelo computacional de la red de señalización del receptor ErbB:

Estructura del Modelo

45 El modelo de red de señalización de receptor ErbB consiste en tres receptores (ErbB1, ErbB2, ErbB3), una fosfatasa receptora, fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K, que se une a los receptores) y componentes de la cascada de PI3K-AKT (fosfatidilinositol bisfosfato, PIP2, proteína quinasa dependiente de fosfoinositida, PDK1, PTEN suprimido del cromosoma 10, PTEN, serina, treonina proteína quinasa también conocida como proteína quinasa B, AKT, Proteína fosfatasa 2A, PP2A) (Véase la Tabla 8 más adelante). Se incluyeron dos ligandos de receptor ErbB: heregulina

50 (HRG1-∀) que se une a ErbB3 y ErbB4 (no incluido en el modelo debido que los niveles de expresión de ErbB4 eran muy difíciles de detectar en líneas celulares (véase Tabla 3 más adelante) y Betacelulina (BTC), que se une principalmente a ErbB1 (Beerli, R.R. y Hynes, N.E. (1996) J. Biol. Chem. 271: 6071-6076; Jones, J.T. et al. (1999) FEBS Lett. 447: 227-231). Las reacciones de cinética de acción de masas, enumeradas por completo en la Tabla 11 más adelante, se convirtieron en ecuaciones diferenciales ordinarias usando Matlab Simbiology 2.3 (Mathworks,

55 MA).

En el modelo se incluyeron dimerización, internalización, reciclaje y degradación inducida por ligando como se describe en la bibliografía para todos los homo-y heterodímeros (Hendriks, B.S. et al. (2003) J. Biol. Chem. 278: 23343-23351; Wang, Z. et al. (1999) Mol. Biol. Cell 10: 1621-1636). Las estabilidades de dímero receptor, usando la escala publicada en Shankaran, H. et al. (2008) Biochem. Biophys. Res. Commun. 371: 220-224, se

5 implementaron, donde la coexpresión de ErbB1 con ErbB2 o ErbB3 desvía la señalización a la superficie celular y retarda la regulación negativa de la señal y donde la coexpresión simultánea de ErbB1-3 conduce a una abundancia de heterodímeros ErbB2-ErbB3. Por lo tanto, los dímeros que contienen ErbB3 se internalizan y degradan más lentamente que los homodímeros de ErbB1 o heterodímeros ErbB1-ErbB2. La dimerización constitutiva también estaba incluida, aunque se asumió que los dímeros sin ligando no desencadenaban ninguna señalización cadena abajo (Yu, X. et al. (2002) Mol. Biol. Cell 13: 2547-2557) y que permanecían en la superficie celular. Los ligandos de ErbB se unen con afinidades diferentes a homo-y heterodímeros de ErbB (Teramura, Y. et al. (2006) EMBO J. 25: 4215-4222), pero con el fin de reducir el número de parámetros de cinética que se tienen que estimar y describir los datos experimentales con el modelo más sencillo posible, limitamos la afinidad de unión de los ligandos para homoy heterodímeros de ErbB a que fuera la misma.

15 Los receptores dimerizados experimentan fosforilación rápida y activan rutas cadena abajo a través de la unión de adaptadores de señalización a sitios de fosfotirosina en la cola citoplasmática del receptor (Yarden Y. y Sliwkowski,

M.X. (2001) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2: 127-137). Aquí, se implementó una cascada de PI3K-AKT simplificada, mediante lo cual PI3K se une directamente a heterodímeros unidos a ligando, activa PIP2, que forma un complejo con PDK1 y AKT, conduciendo a una fosforilación doble de dos etapas de AKT. ErbB3 tiene seis sitios de unión a PI3K, mientras que los otros receptores ErbB únicamente tienen uno (Wallasch, C. et al. (1995) EMBO J. 14: 42674275; Soltoff, S.P. et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14: 3550-3558). Aunque no se conoce si seis moléculas de PI3K se pueden unir simultáneamente a ErbB3, PI3K se activa 10-20 veces más fuertemente por ErbB3 (Fedi, P. et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14: 492-500) que por los otros receptores. También existe evidencia de que PI3K se une a 25 ErbB3 con mayor afinidad que a los otros receptores ErbB (Jones, R.B. et al. (2006) Nature 439: 168-174). Incorporamos estos fenómenos en el modelo y evitamos la complejidad combinatoria de incluir seis sitios de unión, imponiendo las siguientes estipulaciones sobre dímeros que contienen ErbB3: un índice de unión a PI3K potenciado; índice de unión de PIP2 a PI3K potenciado e índice de activación potenciado de PIP3. PIP2 no está presente en los endosomas (Haugh, J.M. (2002) Mol. Interv. 2: 292-307), por tanto, únicamente los dímeros de receptor unidos a membrana plasmática son capaces de activar PIP2 en el modelo. Las simulaciones iniciales aceleraron la activación de AKT muy lentamente, haciendo necesario desactivar casi completamente la AKT fosfatasa antes de la simulación e incorporar un bucle de retorno negativo mediante el cual AKT activa su propia fosfatasa, un fenómeno descrito en otros sitios (Camps, M. et al. (1998) Science 280: 1262-1265). La cascada de MAPK se omitió tanto por simplicidad como debido a nuestros hallazgos recientes de que la señalización de AKT es relativamente insensible a especies y

35 parámetros en la cascada de MAPK (Chen, W.W. et al. (2009) Mol. Syst. Biol. 5: 239); por lo tanto, la comunicación de MAPK-PI3K no es necesaria para describir la dinámica de señalización de AKT. Los valores de especies iniciales se midieron directamente (receptores ErbB, PDK1, AKT), se infirieron a partir de la bibliografía (Birtwistle, M.R. et al. (2007) Mol. Syst. Biol. 3: 144; Hatakeyama, M. et al. (2003) Biochem. J. 373: 451-453) o se ajustaron a valores no limitantes de la velocidad

Calibración de modelo

Muchos de los parámetros de velocidad de reacción se desconocen en el sistema celular estudiado y por lo tanto se tenían que estimar (véase la Tabla 10 más adelante). Para evitar la desviación del punto de partida, todos los 45 parámetros se ajustaron a los valores por defecto (Aldridge, B.B. et al. (2006) Nat. Cell. Biol. 8: 1195-1203). El número de parámetros estimados se limitó realizando la estimación en dos etapas: en primer lugar el modelo se calibró frente a los datos de fosforilación de receptor ErbB observados experimentalmente; en segundo lugar, los parámetros sensibles a fosforilación de AKT se optimizaron frente a los datos experimentales. Los valores estimados se aceptaron únicamente si los parámetros se limitaban en múltiples ejecuciones de parámetros usando un algoritmo genético con un tamaño de población de 50 y 25 generaciones (Mathworks, MA). Las constantes de velocidad de unión de ligando de HRG1-∀ y BTC se estimaron por separado usando Kd (Tzahar, E. et al. (1996) Mol. Cell. Biol. 16: 5276-5287; Singer, E. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276: 44266-44274; Jones, J.T. et al. (1999) FEBS Lett. 447: 227-231) y curvas de dosis respuesta iniciales para aproximarse a una velocidad de unión directa de 1 x

105M-1-1

spara ambos ligandos. Los análisis de sensibilidad (Mathworks, MA) se realizaron para identificar

55 parámetros que influyen de forma marcada sobre las actividades de fosforilación de ErbB1, ErbB2, ErbB3 y AKT con estimulación de HRG1-∀ o BTC (véase la Tabla 11 más adelante). Se permitió que cada parámetro variara por separado mientras el sistema se estimulaba con 1 nM de HRG1-∀ o BTC. Las sensibilidades normalizadas de cada especie se integraron a lo largo de la estimulación de dos horas y los parámetros con sensibilidades normalizadas e integradas mayores que un umbral arbitrario de 1000 se enumeran en la Tabla 11 más adelante. Como se ha mencionado anteriormente, la fosforilación de ErbB4 no se incluyó en la estimación de parámetros debido a que la línea celular estudiada tenía ErbB4 apenas detectable (véase la Tabla 3 más adelante). Las reacciones de ErbB4 se parametrizan de acuerdo con las reacciones de ErbB3.

Los perfiles de fosforilación de receptor ErbB eran sensibles a parámetros de dimerización, internalización, reciclaje

65 y degradación (las reacciones enzimáticas, disociación de dímeros y constantes de velocidad de fosfatasa no eran sensibles). Estos parámetros se ajustaron usando un conjunto de datos de alta densidad. Cada lectura se normalizó

a la activación máxima conseguida por cualquier ligando, conservando la potencia relativa de cada ligando. Las velocidades de dimerización de receptor ErbB se limitaron de forma estricta y se observaron relaciones de parámetros que igualaban a los hallazgos de la bibliografía: ErbB2 es el compañero de dimerización preferido para ErbB1 o ErbB3 (más notablemente con estimulación de heregulina). A partir de los datos disponibles, no fue posible 5 limitar las velocidades tanto de reciclaje como de internalización; por lo tanto las velocidades de reciclaje se ajustaron a 0,005 s-1 y únicamente las velocidades de internalización se ajustaron: las observaciones resultantes por lo tanto se aplican de forma igual a velocidades de reciclaje (a la inversa). Las velocidades de internalización variaron en base a estímulos de ligando, con los dímeros unidos a HRG1-∀ mostrando internalización mucho más lenta que homo-y heterodímeros unidos de BTC, una visión apoyada en otros lugares (Sorkin, A. y Goh, L.K. (2008) 10 Exp. Cell Res. 314: 3093-3106). Las velocidades de degradación también estaban bien limitadas, pero fueron similares para todos los dímeros, sugiriendo que las velocidades de degradación de dímero individual no son necesarias para explicar los datos observados. AKT fosforilado es sensible a muchos parámetros dentro de la cascada de PI3K y al nivel de receptor (véase la Tabla 11 más adelante). Por lo tanto, limitamos la calibración a parámetros de modelo que estaban en la cascada de PI3K-AKT y se entrenaron frente a los cursos de tiempo de

15 fosforilación de AKT mientras bloqueamos los valores de parámetros que ya estaban entrenados en los perfiles de receptor ErbB.

A continuación del entrenamiento de modelo, se llevó a cabo un ajuste local y manual de los parámetros para descifrar el impacto de cada parámetro, para determinar si eran posibles mejoras adicionales y para limitar los

20 parámetros a valores biológicamente plausibles. Para estandarización, los parámetros se redondearon y se condensaron a valores similares cuando se conservaban a través de un tipo de parámetro (como se ha explicado para las velocidades de degradación).

Implementación de inhibidor

25 Se incluyeron inhibidores de ErbB en el modelo usando la interpretación más sencilla de mecanismos de acción conocidos (véase la Tabla 12 más adelante): el anticuerpo monoclonal anti-ErbB3 Ab Nº 6 secuestra ErbB3 evitando la unión a ligando e induce la internalización y degradación; cetuximab secuestra ErbB1 y evita la unión a ligando; lapatinib inhibe la activación de receptores ErbB pero no la dimerización o unión a ligando; y pertuzumab bloquea la

30 dimerización de ErbB2. Para Ab Nº 6, se usaron las constantes de velocidad medidas mediante Kinexa y para los otros inhibidores se usaron las constantes de velocidad indicadas en la bibliografía (Wood, E.R. et al. (2004) Cancer Res. 64: 6652-6659; Patel, D. et al. (2007) Anticancer Res. 27: 3355-3366; Adams, C.W. et al. (2006) Cancer Immunol. Immunother. 55: 717-727) y enumeradas en la Tabla 13 más adelante; los parámetros de cetuximab se confirmaron experimentalmente mediante Kinexa.

35 En las Tablas 3-13 más adelante se expone información adicional diversa usada en el desarrollo del modelo computacional de la ruta de señalización de ErbB, de la forma siguiente:

Tabla 3: Expresión de receptor ErbB medida y estado de mutación para líneas celulares investigadas

Abundancia de ErbB (moléculas/célula)Nº: Estado de mutación*

línea celular: Tipo de tumor ErbB1 ErbB2 ErbB3 ErbB4 KRAS PI3K PTEN

ADRr: ovárico 177818 40792 33205 2094 ninguno ninguno ninguno

OvCAR8: ovárico 236157 53272 31813 ND ninguno ninguno ninguno

ACHN: renal 448284 45456 15200 2086 ninguno ninguno ninguno

MALME-3M: melanoma 2914 56422 67367 584 ninguno ninguno ninguno

DU145: próstata 437841 69068 19422 ND ninguno ninguno ninguno

ND -no detectable Nº -medido por qFACS * Sitio Web usado para determinar el estado de mutación de las líneas celulares investigadas http://www.sanger.ac.uk/perl/genetics/CGP/core_line_viewer?action=nci60_list

Tabla 4: Caracterización de curvas de dosis respuesta de fosforilación de ErbB1 para ligandos de unión a ErbB1 y HRG1- . pErbB1 NCI-ADRr % de estimulación a 5 min con relación al máximo

EGF: CE50 [nM] IC del 95% 6,0 2,5-14 100,0

HB-EGF: CE50 [nM] IC del 95% 21,0 12-38 87,0

Epigen: CE50 [nM] IC del 95% ND 12,0

pErbB1 NCI-ADRr % de estimulación a 5 min con relación al máximo

AR CE50 [nM] 37,0 95,0 IC del 95% 21-68

BTC CE50 [nM] 5,7 100,0 IC del 95% 2,3-14

TGFa CE50 [nM] 30,0 100,0 IC del 95% 10-87

Epirregulina CE50 [nM] ND 9,0 IC del 95%

HRG1-P CE50 [nM] ND 0,0 ND: no se pudo determinar IC: Intervalo de confianza del 95%

abla 5: Caracterización de curvas de dosis respuesta de fosforilación de ErbB2 para ligandos de unión a ErbB1 y HRG1-beta

pErbB2 NCI-ADRr % de estimulación a 5 min con relación al máximo

EGF CE50 [nM] 27,0 100,0 IC del 95% 15-51

HB-EGF CE50 [nM] 230,0 94,0 IC del 95% 74-730

Epigen CE50 [nM] ND 25,0 IC del 95%

AR CE50 [nM] ND 54,0 IC del 95%

BTC CE50 [nM] 27,0 94,0 IC del 95% 4-190

TGFa CE50 [nM] 41,0 36,0 IC del 95% 20-86

Epirregulina CE50 [nM] ND 18,0 IC del 95%

HRG1-P CE50 [nM] 7,0 43,0 IC del 95% 2,1-23

ND: no se pudo determinar IC: Intervalo de confianza del 95%

Tabla 6: Caracterización de curvas de dosis respuesta de fosforilación de ErbB3 para ligandos de unión a ErbB1 y HRG1-beta

pErB3 NCl-ADr % de estimulación a 5 min con relación al máximo

EGF CE50 [nM] ND 7,0 IC del 95%

HB-EGF CE50 [nM] ND 32,0 IC del 95%

Epigen CE50 [nM] ND 3,0 IC del 95%

AR CE50 [nM] 380,0 17,0 IC del 95% 240-600

BTC CE50 [nM] 100,0 35,0 IC del 95% 47-220

TGFa CE50 [nM] ND 9,0 IC del 95%

Epirregulina CE50 [nM] ND 22,0 IC del 95%

HRG1-P CE50 [nM] 9,9 100,0 IC del 95% 7,9-12

pErB3 NCl-ADr % de estimulación a 5 min con relación al máximo

ND: no se pudo determinar IC: Intervalo de confianza del 95%

Tabla 7: Caracterización de curvas de dosis respuesta de fosforilación de AKT para ligandos de unión a ErbB1 y HRG1-beta pAKT NCI-ADRr % de estimulación a 5 min con relación al máximo

EGF CE50 [nM] ND 26,0 IC del 95%

HB-EGF CE50 [nM] ND 20,0 IC del 95%

Epigen CE50 [nM] ND 11,0 IC del 95%

AR CE50 [nM] 0,0 28,0 IC del 95% 0,064-27

BTC CE50 [nM] ND 22,0 IC del 95%

TGFa CE50 [nM] ND 27,0 IC del 95%

Epirregulina CE50 [nM] ND 11,0 IC del 95%

HRG1-P CE50 [nM] 1,9 100,0 IC del 95% 0,23-17,1

ND: no se pudo determinar IC: Intervalo de confianza del 95%

Tabla 8: Cantidades iniciales de especies no cero en el modelo computacional Nombre Cantidad inicial Descripción adicional de especie

HRG variable Heregulina

BTC variable Betacelulina

E1 178000 ErbB1

E2 41000 ErbB2

E3 33000 ErbB3

RTKpasa 500000 receptor tirosina quinasa fosfatasa

PI3K 800000 fosfatidilinositol 3-quinasa

PIP2 700000 fosfatidilinositol bisfosfato

PTEN 350000 PTEN suprimido en cromosoma 10

PDK1 9500000 proteína quinasa dependiente de fosfoinositida

AKT 900000 Serina, treonina proteína quinasa también conocida como proteína quinasa B

PP2A 4000 proteína fosfatasa 2A (AKT fosfatasa)

PP2Aoff 64000 AKT fosfatasa inactiva

Tabla 9: Resumen de reacciones bioquímicas implementadas en el modelo computacional usando cinética de acción de masas con parámetros correspondientes

Definición de abreviaciones usadas: : indica un complejo de proteína, por ejemplo ligando unido a receptor _p indica que una proteína está fosforilada iy indica que una especie y está internalizada <-> indica una reacción reversible -> indica una reacción irreversible

Nombre Valor Unidades Descripción

Av Vmedia Vcell Num cells kf1 kr1: 6,0 x 1023 1,00 x 10-04 1,00 x 10-12 30000 5,00 x 10-11 0,001 litros litros moléculas-1 s-1 s-1 Número de Avogadro Volumen medio por pocillo Volumen celular Número de células por pocillo Unión de HRG a E3 o E4. Conversión de unidad calculada como le5M-1s-1 / (Vmedia*Av/Num_cells). Disociación de HRG de E3

kf2: 5,00 x 10-11 moléculas-1 s-1 Unión de HRG a dímeros E3:E2

kr2 kf3 kr3 kf4: 0,001 5,00 x 10-11 0,001 5,00 x 10-11 s-1 moléculas-1 s-1 s-1 moléculas-1 s-1 Disociación de HRG de dímeros E3:E2 Unión de BTC a E1 Disociación de BTC de E1 Unión de BTC a homodímeros E1

kf5: 5,00 x 10-11 moléculas-1 s-1 Unión de BTC a heterodímeros E1

kf7: 3,00 x 10-06 moléculas-1 s-1 Dimerización de E2 a HRG:E3

kr7: 0,001 s-1 Disociación de E2 a HRG:E3

kf10: 3,00 x 10-08 moléculas-1 s-1 Dimerización de E1 a HRG:E3

kf12 kr12: 4,20 x 10-09 0,001 moléculas-1 s-1 s-1 Dimerización -constitutiva y sin ligando Disociación -constitutiva y sin ligando

kf14: 1,70 x 10-05 moléculas-1 s-1 Dimerización de E1 a BTC:E1

Nombre: Valor Unidades Descripción

kr14: 0,001 s-1 Disociación de E1 a BTC:E1

kf16: 1,70 x 10-05 moléculas-1 s-1 Dimerización de BTC:E1 a BTC:E1

kr16: 0,001 s-1 Disociación de BTC:E1 a BTC:E1

kf19: 3,30 x 10-05 moléculas-1 s-1 Dimerización de E2 a BTC:E1

kr19: 0,001 s-1 Disociación de E2 o E3 a BTC:E1

kf23: 4,70 x 10-06 moléculas-1 s-1 Dimerización de E3 a BTC:E1

kf30: 1 s-1 Velocidad de autofosforilación enzimática de dímeros unidos a ligando

kf38: 5,00 x 10-06 moléculas-1 s-1 Unión de fosfatasa a receptor

kr38: 0,1 s-1 Disociación de fosfatasa a receptor

kf45: 1 s-1 Velocidad enzimática para desfosforilación de receptor

kf52: 3,00 x 10-06 moléculas-1 s-1 Unión de PI3K a dímeros que contienen E3

kr52: 0,1 s-1 Disociación de PI3K de dímeros que contienen E3

kf54: 7,50 x 10-07 moléculas-1 s-1 Unión de PI3K a dímeros que no contienen E3

kr54: 0,1 s-1 Disociación de PI3K de dímeros que no contienen E3

kf59 kr59: 5,00 x 10-06 0,1 moléculas-1 s-1 s-1 Unión de PIP2 a heterodímeros que contienen E3 Disociación de PIP2 de heterodímeros que contienen E3

kf61 kr61 kf66 kf68: 5,00 x 10-07 0,1 0,2 0,013 moléculas-1 s-1 s-1 s-1 s-1 Unión de PIP2 a heterodímeros que no contienen E3 Disociación de PIP2 de heterodímeros que no contienen E3 Velocidad de activación de PIP3 por dímeros que contienen E3 Velocidad de activación de PIP3 por dímeros que no contienen E3

kf73: 5,00 x 10-06 moléculas-1 s-1 Unión de PIP3 a PTEN

kr73: 0,1 s-1 Disociación de PIP3 de PTEN

Nombre: Valor Unidades Descripción

kf74: 0,1 s-1 Inactivación de PIP3 por PTEN

kf75: 2,60 x 10-04 moléculas-1 s-1 Unión de PIP3 a Akt o Akt p

kr75: 0,1 s-1 Disociación de PIP3 de Akt o Akt p

kf76: 6,70 x 10-05 moléculas-1 s-1 Unión de PDK1 a PIP3:Akt

kr76: 0,1 s-1 Disociación de PDK1 de PIP3:Akt

kf77: 1 s-1 Velocidad de fosforilación enzimática para Akt

kf78: 0,2 s-1 Disociación de PDK1 de PIP3

kf81: 1 s-1 Velocidad de fosforilación enzimática para Akt_p

kf82: 1,70 x 10-06 moléculas-1 s-1 Unión de PP2A a Akt fosforilado

kr82: 0,1 s-1 Disociación de PP2A de Akt fosforilado

kf83: 1,5 s-1 Desfosforilación y disociación de Akt

kf86: 8,30 x 10-09 moléculas-1 s-1 Unión de AKT_p_p a PP2Aoff

kr86: 0,5 s-1 Disociación de AKT_p_p de PP2Aoff

kf87 kf88 kr88 kf93: 0,1 0,1 0,005 0,005 s-1 s-1 s-1 s-1 Activación de PP2Aoff por AKT_p_p Velocidad de internalización para monómeros unidos a ligando o activos Velocidad de reciclaje de monómeros unidos a ligando o activos Velocidad de internalización para heterodímeros E2:E3 y homodímeros E2 unidos a HRG

kr93: 0,005 s-1 Velocidad de reciclaje para heterodímeros E2:E3 y homodímeros E2 unidos a HRG

kf98: 0,005 s-1 Velocidad de internalización para heterodímeros E1:E3 unidos a HRG

kr98: 0,005 s-1 Velocidad de reciclaje para heterodímeros E1:E3 unidos a HRG

kf107: 0,1 s-1 Velocidad de internalización para homodímeros E1 unidos a BTC

Nombre Valor Unidades Descripción

Velocidad de reciclaje para

kr107 0,005 s-1

homodímeros E1 unidos a BTC

Velocidad de internalización kf117 0,1 s-1 para heterodímeros E1 unidos a BTC

Velocidad de reciclaje para kr117 0,005 s-1 heterodímeros unidos a BTC que contienen E1

kf127 3,8 moléculas-1 s-1 Unión de HRG en el endosoma

kf129 3,8 moléculas-1 s-1 Unión de BTC en el endosoma

Velocidad de degradación de

kf185 0,002 s-1

ligando

Velocidad de degradación de

kf187 0,002 s-1

monómeros unidos a ligando

Velocidad de degradación de kf192 0,002 s-1 homo o heterodímeros unidos a ligando que contienen E2

Velocidad de degradación de kf201 0,002 s-1 heterodímeros unidos a ligando que contienen E1

Degradación de homodímeros

kf206 0,002 s-1

E1 unidos a ligando

Tabla 11: Parámetros sensibles de ErbB3, ErbB2, ErbB1 y AKT Sensibilidad de pErbB3 durante estimulación Sensibilidad de pErbB3 durante estimulación con Heregulina con Betacelulina

kf1 4799 kf5 3824

kr93 2163 kf23 2353

kf7 1902 kf3 1821

kr88 1277 kf12 1389

kr12 1192 kr12 -1343 kf187 -1137

kf12: -1111 kf14 -1742

kf187: -1136 kf14 -6462

kf88: -1907

kf93: -3122

kf192: -4452

Sensibilidad de pErbB2 durante: Sensibilidad de pErbB2 durante estimulación con Betacelulina

kf1: 4747 kf3 3878

kr93: 2245 kf19 3124

kf7: 2136 kf5 1060

kr88: 1267 kf14 -2768

kr12: 1155 kf14 -6515

kf12: -1071

48

kf88 -1892

kf93 -3239

kf192 -4617

Sensibilidad de pErbB1 durante Sensibilidad de pErbB1 durante estimulación estimulación con Heregulina con Betacelulina

kf10 6990 kf3 2847

kf1 6222 kf4 1044

kr12: 2224 kf14 -1665

kr98: 2174 kf206 -4983

kr88: 1616

kf187: -1423

kf12: -2189

kf88: -2414

kf98: -3155

kf14: -4457

kf7: -4469

Sensibilidad de pAKT durante estimulación Sensibilidad de pAKT durante estimulación con Heregulina con Betacelulina

kf66 6657 kf75 5462

kf75 5418 kf66 5395

kf1 4799 kr117 4420

kr93 3937 kf5 3250

kr73 2705 kr86 2854

kf7 2022 kr73 2726

kr86 1918 kf3 2351

kf78 1584 kf68 1815

kr88 1209 k23 1804

kr12 1127 kf78 1750

kf12 -1044 kr107 1024

Tabla 12: Esquema de implementación para Ab Nº 6, cetuximab, pertuzumab y lapatinib. Número de reacción Reacción Parámetro directo Parámetro inverso

Implementación de Ab Nº 6

Ab Nº 6_v1 Ab Nº 6 + E3 <-> [E3:Ab Nº 6] kfAb Nº 6_1 krAb Nº 6_1

Ab Nº 6_v2 [E3:Ab Nº 6] + E3 <-> [E3:Ab Nº 6:E3] kfAb Nº 6_2 krAb Nº 6_2

Ab Nº 6_v3 [E3:Ab Nº 6:E3] <-> [iE3:Ab Nº 6:E3] kfAb Nº 6_3 krAb Nº 6_3

Ab Nº 6_v4 [iE3:Ab Nº 6:E3] <-> [dE3:Ab Nº 6:E3] kfAb Nº 6_4

Implementación de cetuximab

Cetuximab_v1 Cetuximab + E1 <-> [E1:Cetuximab] kfCetuximab _1 krCetuximab _1

Número de reacción Reacción Parámetro directo Parámetro inverso Cetuximab_ v2 [E1:Cetuximab] + E1 <-> [E1:Cetuximab:E1] kfCetuximab _2 krCetuximab _2 Implementación de Pertuzumab Pertuzumab _v1 [Pertuzumab] + E2 <-> [E2:Pertuzumab] kfPertuzumab_1 krPertuzumab_1 Pertuzumab _v2 [E2:Pertuzumab] + E2 <-> [E2:Pertuzumab: E2] kfPertuzumab_2 krPertuzumab_2 Implementación de Lapatinib Lapatinib_v1 Lapatinib +E1 <-> [Lapatinib:E1] kfLapatinib_1 krLapatinib_1 Lapatinib_v2 Lapatinib + E2 <-> [Lapatinib:E2] kfLapatinib_2 krLapatinib_2 Lapatinib_v3 Lapatinib + [E1:E1] <-> [Lapatinib:E1:E1] kfLapatinib_3 krLapatinib_1 Lapatinib_v4 Lapatinib + [E1:E2] <-> [Lapatinib:E1:E2] kfLapatinib_3 krLapatinib_1 Lapatinib_v5 Lapatinib + [E1:E3] <-> [Lapatinib:E1:E3] kfLapatinib_1 krLapatinib_1 Lapatinib_v6 Lapatinib + [E2:E2] <-> [Lapatinib:E2:E2] kfLapatinib_4 krLapatinib_2 Lapatinib_v7 Lapatinib + [E2:E3] <-> [Lapatinib:E2:E3] kfLapatinib_2 krLapatinib_2 Lapatinib_v 8 Lapatinib + [Lapatinib:E1:E1] <-> [Lapatinib: E1:E1:Lapatinib] kfLapatinib_1 krLapatinib_1 Lapatinib_v 9 Lapatinib + [Lapatinib:E1:E2] <-> [Lapatinib: E1:E2:Lapatinib] kfLapatinib_1 kriapatinib_1 Lapatinib_v 10 Lapatinib + [Lapatinib:E2:E2] <-> [Lapatinib: E2:E2:Lapatinib] kfLapatinib_2 krLapatinib_2 Lapatinib_v 11 Lapatinib + [BTC:E1] <-> [Lapatinib:BTC:E1] kfLapatinib_1 krLapatinib_1 Lapatinib_v 12 Lapatinib + [BTC:E1:E1] <-> [Lapatinib:BTC: E1:E1] kfLapatinib_3 krLapatinib_1 Lapatinib_v 13 Lapatinib +[BTC:E1:E1:BTC] <-> [Lapatinib: BTC:E1:E1:BTC] kfLapatinib_3 krLapatinib_1 Lapatinib_v 14 Lapatinib + [BTC:E1:E2] <-> [Lapatinib:BTC: E1:E2] kfLapatinib_3 krLapatinib_1 Lapatinib_v 15 Lapatinib + [BTC:E1:E3] <-> [Lapatinib:BTC: E1:E3] kfLapatinib_1 krLapatinib_1 Lapatinib_v 16 Lapatinib + [E2:E3:HRG] <-> [Lapatinib:E2: E3:HRG] kfLapatinib_2 krLapatinib_2 Lapatinib_v 17 Lapatinib + [E1:E3:HRG] <-> [Lapatinib:E1: E3:HRG] kfLapatinib_1 krLapatinib_1 Lapatinib_v 18 Lapatinib + [Lapatinib:BTC:E1:E1] <-> [Lapatinib:BTC:E1:E1:Lapatinib] kfLapatinib_1 krLapatinib_1 Lapatinib_v 19 Lapatinib + [Lapatinib:BTC:E1:E1:BTC] <> [Lapatinib:BTC:E1:E1:BTC:Lapatinib] kfLapatinib_1 krLapatinib_1 Lapatinib_v 20 Lapatinib + [Lapatinib:BTC:E1:E2] <-> [Lapatinib:BTC:E1:E2:Lapatinib] kfLapatinib_1 krLapatinib_1 Lapatintb_v 21 [Lapatinib:E1] +E1 <-> [Lapatinib:E1:E1] kf12 kr12 Lapatinib_v22 [Lapatinib:E1] + E2 <-> [Lapatinib:E1:E2] kf 12 kr12

50

Número de reacción Reacción Parámetro directo Parámetro inverso

Lapatinib_v23 [Lapatinib:E1] + E3 <-> [Lapatinib:E1:E3] kf12 kr12

Lapatinib_v24 [Lapatinib:E2] + E1 <-> [Lapatinib:E1:E2] kf 12 kr12

Lapatinib_v25 [Lapatinib:E2] + E3 <-> [Lapatinib:E2:E3] kf 12 kr12

[Lapatinib:E1] + [Lapatinib:E1] <->

Lapatinib_v 26 kf 12 kr12

[Lapatinib: E1:E1:Lapatinib]

[Lapatinib:E1] + [Lapatinib:E2] <->

Lapatinib_v 27 kf 12 kr12

[Lapatinib: E1:E2:Lapatinib]

[Lapatinib:E2] + [Lapatinib:E2] <->

Lapatinib_v 28 kf 12 kr12

[Lapatinib: E2:E2:Lapatinib]

[Lapatinib:BTC:E1]+E1 <->

Lapatinib_v 29 kf14 kr14

[Lapatinib:BTC: E1:E1]

[Lapatinib:BTC:E1 + E2 <->

Lapatinib_v 30 kf19 kr19

[Lapatinib:BTC: E1:E2]

[Lapatinib:BTC:E1] + E3 <->

Lapatinib_v 31 kf23 kr19

[Lapatinib:BTC: E1:E3]

[Lapatinib:BTC:E1 + [BTC:E1] <->

Lapatinib_v 32 kf16 kr16

[Lapatinib: BTC:E1:E1:BTC]

[Lapatinib:BTC:E1] + [Lapatinib:BTC:E1 <

Lapatinib_v 33 kf16 kr16

> [Lapatinib:BTC:E1:E1:BTC:Lapatinib]

[Lapatinib:BTC:E1] + [Lapatinib:E2] <->

Lapatinib_v 34 kf19 kr19

[Lapatinib:BTC:E1:E2:Lapatinib]

[Lapatinib:E2] + [HRG:E3] <-> [Lapatinib:E2:

Lapatinib_v 35 kf7 kr7

E3:HRG]

[Lapatinib:E1 ] + [HRG:E3] <->

Lapatinib_v 36 kf 10 kr7

[Lapatinib:E1: E3:HRG]

Lapatinib_v [Lapatinib:E1] + BTC <-> [Lapatinib:BTC:E1] kf3 kr3

[Lapatinib:E1:E1 ] + BTC <->

Lapatinib_ v 38 kf4 kr3

[Lapatinib:BTC: E1:E1]

[Lapatinib:E1:E2] + BTC <-> [Lapatinib:BTC:

Lapatinib_ v 39 kf5 kr3

E1:E2]

[Lapatinib:E1:E3] + BTC <-> [Lapatinib:BTC:

Lapatinib_v 40 kf5 kr3

E1:E3]

[Lapatinib:BTC:E1:E1] + BTC <-> [Lapatinib:

Lapatinib_v 41 kf4 kr4

BTC:E1:E1:BTC]

[Lapatinib:E2:E3] + HRG <-> [Lapatinib:E2:

Lapatinib_v 42 kf2 kr1

E3:HRG]

Tabla 13: Valores de parámetro de inhibidor Nombre Valor Unidades Descripción

Vcell 1,0E-12 litros Volumen celular.

Volumen reducido de Vshell para 2º brazo de unión de IgG. Vshell = 4/3*pi*((Cell_radius + Cell_shellheight)^3cell-radius) Radio celular (VceH*3/(4*pi()))^(1/3) en decímetros. Altura de envuelta celular = 1e-7 decímetros. La altura de Vshell 4,8E-15 litros envuelta celular representa la distancia promedio entre los sitios de unión de anticuerpo.

Parámetros de MM-121

Nombre Valor Unidades Descripción

Unión de inhibidor Ab Nº 6 a ErbB3. Conversión de

kf Ab Nº 6_1: 7,15E-11 moléculas-1 s-1 unidades calculada como 1,43e5 M-1 s-1 /(Vmedia*Av/Num_cells). Número de células = 30.000 por

pocillo.

kr Ab Nº 6_1: 1,10E-04 s-1 Disociación de inhibidor Ab Nº 6 de ErbB3

kf Ab Nº 6_2: 4,96E-05 moléculas-1 s-1 Unión de inhibidor Ab Nº 6 a un segundo ErbB3. Avidez debida a reducción de volumen =kr Ab Nº

6_1*(Vmedia/Numcells)A/shell.

kr Ab Nº 6_2: 2,20E-04 s-1 Disociación de inhibidor Ab Nº 6 a partir de un segundo ErbB3 (2*krmm121_1)

kf Ab Nº 6_3: 5,56E-04 s-1 Velocidad de internalización para Ab Nº 6 unido a dos moléculas de ErbB3

kr Ab Nº 6_3: 5,00E-03 s-1 Velocidad de reciclaje para Ab Nº 6 unido a dos moléculas de ErbB3

kf Ab Nº 6_4: 2,00E-04 s-1 Degradación de especies unidas a Ab Nº 6

Parámetros de cetuximab

Unión de inhibidor cetuximab a ErbB1. Conversión de

kfCetuximab _1: 1,10E-10 moléculas-1 s-1 unidades calculada como 2,2e5 M-1 s-1

/(Vmedia*Av/Num_cells).

krCetuximab _1: 1,10E-03 s-1 Disociación de inhibidor cetuximab de ErbB1

Unión de inhibidor cetuximab a un segundo ErbB1.

Avidez debida a reducción de volumen =krCetuximab_1

kfCetuximab _2: 7,64E-05 moléculas-1 s-1 *(Vmedia/Numcells)/ Vshell.

krCetuximab _2: 2,20E-03 s-1 Disociación de inhibidor cetuximab cuando se une a dos moléculas de ErbB1 (2*krcetuximab_1)

Parámetros de Pertuzumab

Pertuzumab _1: 5,60E-11 moléculas-1 s-1 Unión de inhibidor pertuzumab a ErbB2. Conversión de unidades calculada como 1,12e5 M-1 s-1

/(Vmedia*Av/Num_cells).

krPertuzumab _1: 9,50E-04 s-1 Disociación de inhibidor pertuzumab de ErbB2

kfPertuzumab _2: 3,90E-05 moléculas-1 s-1 Unión de inhibidor pertuzumab a un segundo ErbB2. Avidez debida a reducción de volumen

=krPertuzumab_1*(Vmedia/Numcells)/ Vshell.

krPertuzumab _2: 1,90E-03 s-1 Disociación de inhibidor pertuzumab de un segundo ErbB2 (2*krpertuzumab_1).

Parámetros de Lapatinib

kfLapatinib_1: 6,40E-12 moléculas-1 s-1 Unión de inhibidor Lapatinib a ErbB1 o dímeros 1-3. Conversión de unidades calculada como 1,28e4 M-1 s-1 /(Vmedia*Av/Num_ cells).

krLapatinib_1: 3,83E-05 s-1 Disociación de inhibidor Lapatinib de ErbB1 o dímeros 13

kfLapatinib_2: 1,50E-12 moléculas-1 s-1 Unión de inhibidor Lapatinib a ErbB2 o dímeros 2-3. Conversión de unidades calculada como 2,95e3 M-1 s-1 /(Vmedia*Av/Num_ cells).

krLapatinib_2: 3,83E-05 s-1 Disociación de inhibidor Lapatinib de ErbB2 o dímeros 23.

kfLapatinib_3: 1,28E-11 moléculas-1 s-1 Unión de inhibidor Lapatinib a dímeros 1-1 o 1-2

kfLapatinib_4: 3,00E-12 moléculas-1 s-1 Unión de inhibidor Lapatinib a dímeros 2-2

Ejemplo 5: Selección de marcadores predictivos de activación de pErbB3

En este ejemplo, se identificó un conjunto de marcadores de proteína que son predictivos de activación de ErbB23, como se indica por pErbB3 usando el modelo computacional mecanicista de la ruta de señalización de ErbB que se 5 describió en el Ejemplo 4.

Como se demostró que el nivel de fosforilación de ErbB3 en el Ejemplo 2 estaba correlacionado con el índice de respuesta tumoral, se llevó a cabo un análisis de sensibilidad en el modelo computacional entrenado para identificar las proteínas clave que determinan el nivel de fosforilación de ErbB3.

10 En este análisis de sensibilidad local, las células se estimularon virtualmente in silico con HRG o BTC 0,4 nM, los cuales son ambos ligandos que activan la ruta de señalización de ErbB. La sensibilidad de pErbB3 con respecto a los siguientes receptores celulares, quinasas y otras proteínas se determinó: ErbB3, ErbB2, ErbB1, PI3K, PIP2, PTEN, PDK1, PP2A, AKT, RTKpasa y los ligandos (BTC y HRG).

15 El análisis de sensibilidad local es una herramienta matemática que mide los cambios en un resultado como respuesta a cambios en concentraciones de proteína y parámetros cinéticos dentro de la ruta. La sensibilidad completamente normalizada (sij(t)) de la ith observable ci(t) con respecto a un cambio en la constante de velocidad jth (kj) viene dada por la siguiente ecuación:

Posteriormente se llevó a cabo la calibración del modelo usando métodos de optimización locales y globales (Algoritmos Genéticos, hibridación simulada, optimización de Levenberg-Marquardt) que minimizaron la distancia

25 entre los datos experimentales y los resultados de simulación mediante la variación de los parámetros y las concentraciones de proteína iniciales identificadas en el análisis de sensibilidad.

Los resultados de los análisis de sensibilidad local se resumen en el gráfico de barras de la Figura 6. Los resultados indicaron que las siguientes cinco proteínas son el conjunto clave de marcadores que son predictivos de activación

30 de ErbB3 (por ejemplo, formación de pErbB3): ErbB1, ErbB2, ErbB3, HRG y BTC.

Ejemplo 6: Uso de un modelo computacional mecanicista para calcular niveles de pErbB3

En base a los resultados obtenidos en el Ejemplo 5, en los cuales ErbB1, ErbB2, ErbB3, HRG y BTC se identificaron

35 como los marcadores clave de predicción de pErbB3 usando el modelo computacional, se usaron las mediciones de los niveles de expresión de proteína representados en la Tabla 2 como entradas en el modelo computacional para calcular los niveles de pErbB3 para diferentes líneas de células tumorales.

La entrada de los niveles de expresión de BTC y HRG en el modelo computacional requirió la conversión de

40 unidades sin dimensiones o pg/!g en una concentración [M]. Por tanto, era necesario establecer los factores de conversión. Los factores de conversión que convirtieron los niveles de ARNm de HRG y los niveles de expresión de proteína de BTC en una concentración molar se extrapolaron en el rango lineal entre niveles de pErbB3 medidos experimentalmente y predichos. Para los valores medidos experimentalmente, se midieron los niveles de fosforilación de ErbB3 constitutivo (pg/!g) en las cuatro líneas celulares (MALME3M, DU145, ADRr y ACHN) en

45 suero fetal bovino al 10 % (FBS). Estos resultados medidos experimentalmente se muestran en el Ejemplo 4 en la Tabla 2, columna 7. Para el entrenamiento del factor de conversión de ligando, la señal de pErbB3 predicha normalizada integrada a lo largo del tiempo se representó frente al pErbB3 medido experimentalmente en FBS al 10% in vitro, usando un factor de conversión de BTC de 6,1 e-005 y un factor de conversión de ARNm de HRG de 3,1e-013. Los factores de conversión de ligando se entrenaron optimizando la relación lineal entre los niveles de

50 pErbB3 predicho y de pErbB3 constitutivo medido (mediante ELISA) en las líneas celulares ADRr, MALME3M, ACHN y DU145.

Por tanto, la activación de la ruta mediante HRG y BTC se simuló usando el modelo y el Estado de Activación de Red (NAS), como se ha indicado por los niveles de pErbB3 calculados, se obtuvo como el resultado. En este caso,

55 el NAS se definió como la cantidad de pErbB3 integrado en el tiempo simulada en el modelo a lo largo de las primeras dos horas de estimulación mediante HRG y BTC. Los resultados para los niveles de pErbB3 calculados se muestran en el gráfico de la Figura 7. El NAS simulado para células ADRr se estableció inicialmente como el umbral entre respondedoras y no respondedoras a tratamiento con Ab Nº 6, ya que de las cuatro líneas celulares ensayadas en los modelos de xenoinjerto, la línea de células ADRr fue no respondedora con el nivel de pErbB3 más elevado.

Ejemplo 7: Establecimiento de valores de umbral de NAS usando respuestas de xenoinjerto y sensibilidad predicha en base a umbrales de NAS

En este ejemplo, las respuestas de xenoinjerto para las cuatro líneas de células tumorales descritas en el Ejemplo 1

5 se combinaron con los valores de NAS (niveles de pErbB3 normalizados integrados en el tiempo) calculados como se ha descrito en el Ejemplo 6 para establecer valores de umbral de NAS para respondedoras a tratamiento con Ab Nº 6 y no respondedoras a tratamiento con Ab Nº 6.

Más específicamente, los valores de índice de reducción de crecimiento (IRC) determinados para las líneas celulares ADRr, ACHN, DU145 y MALME3 (descritos adicionalmente en el Ejemplo 1) se convirtieron en un resultado binario para entrenamiento de estratificación estableciendo “respondedora” como que tienen un nivel de pErbB3 que es mayor que el nivel de pErbB3 en células ADRr (es decir, un pErbB3 ) pErbB3 (ADRr)), donde “no respondedoras” se establecieron como que tienen un nivel de pErbB3 que es menor que el nivel de pErbB3 en células ADRr (es decir, un pErbB3 ∗ pErbB3 (ADRr)). Se ha de observar que esta no fue una predicción de modelo;

15 en lugar de ello, esto fue parte del proceso de entrenamiento de estratificación.

Para las cuatro líneas celulares, los valores de IRC determinados experimentalmente se representaron frente a los valores de NAS calculados (pErbB3 normalizado integrado en el tiempo). Los valores de IRC, en el eje x, se dividieron en las respondedoras (pErbB3 ) pErbB3 (ADRr)) y no respondedoras (pErbB3 ∗ pErbB3 (ADRr)). Los datos de entrenamiento de NAS (obtenidos como se ha descrito en el Ejemplo 4) permitieron la división del eje y de Estados de Activación de Red en tres categorías: Respondedoras Simuladas (“R Sim”), No Respondedoras Simuladas (“NR Sim”) e Indeterminadas Simuladas (“I Sim”). Dos líneas de células de xenoinjerto se caracterizaron mediante valores de reducción de índice de crecimiento de más del 20% (DU145, ACHN) y de estas, la línea de células DU145 tenía el Estado de Activación de Red más bajo. En consecuencia, el umbral para clasificar una línea

25 celular como una respondedora simulada se estableció en un Estado de Activación de Red mayor que o igual al nivel de ADRr. De forma similar, el xenoinjerto de línea de células MALME3 fue una no respondedora (pErbB3 ∗ pErbB3 (ADRr)) y, por lo tanto, los Estados de Activación de Red de las líneas celulares que son menores que el nivel de ADRr se clasificaron como No Respondedoras Simuladas. Los Estados de Activación de Red entre estos y los umbrales de ADRr y DU145 se clasifican como Indeterminadas Simuladas.

El Estado de Activación de Red, como se ha indicado mediante los niveles de pErbB3 calculados, se simuló para un panel de 15 líneas celulares para las cuales estaban disponibles las mediciones experimentales de HRG, BTC, ErbB1, ErbB2 y ErbB3. Los niveles de pErbB3 integrados calculados para las 15 células se representaron, junto con los niveles de las 4 líneas de células de entrenamiento, en el gráfico de barras mostrado en la Figura 8A, desde los 35 niveles más altos hasta los más bajos de pErbB3. Los valores de NAS calculados para estas 15 líneas celulares posteriormente se clasificaron frente a los valores de NAS determinados previamente para las 4 líneas de células en entrenamiento ADRr, ACHN, DU145 y MALME3M. Los resultados de NAS para las 19 líneas celulares en total se clasifican como se muestra en el gráfico de la Figura 8B. Los valores de NAS iguales o por debajo de la línea de células MALME3M se establecieron como no respondedoras simuladas (“NR Sim”), los valores de NAS entre los de las líneas de células MALME3M y DU145 se establecieron como indeterminados simulados (“I Sim”) y los valores de NAS iguales a o superiores a los de la línea de células DU145 se establecieron como respondedoras simuladas (“R Sim”). Por tanto, como se ilustra en la Figura 8B, se predijo que las líneas de células IGROV1 (NCI-60, muestra cósmica ID Nº 905968), MDA-MB-361 (ATCC Nº HTB-27), SKMEL-5 (ATCC Nº HTB-70), MDA-MB-231 (ATCC Nº HTB-26) y T47D (ATCC Nº HTB-133) eran no respondedoras simuladas, ya que sus valores de NAS calculados

45 estaban por debajo de los de MALME3M. Además, las líneas de células ZR75-1 (ATCC Nº CRL-1500), HOP92 (NCI60, muestra cósmica ID Nº 905973) y HOP62 (NCI-60, muestra cósmica ID Nº 905972) se predijo que eran indeterminadas simuladas, ya que sus valores de NAS calculados estaban entre los de ADRr y DU145. Finalmente, las líneas de células SKBR3 (ATCC Nº HTB-30), UACC62 (NCI-60, muestra cósmica ID Nº 905976), EKVX (NCI-60, muestra cósmica ID Nº 905970), BT474 (ATCC Nº HTB-20), SKOV3 (ATCC Nº HTB-77), OVCAR8 (obtenida en el Instituto Nacional del Cáncer, División de Tratamiento y Diagnóstico del Cáncer) y CAK11 (NCI-60, muestra cósmica ID Nº 905963) se predijo que eran respondedoras simuladas, ya que sus valores de NAS calculados eran mayores que los de ADRr.

Para ensayar estas predicciones de modelo, se llevaron a cabo tres estudios de xenoinjerto in vivo adicionales. Se

55 usaron las líneas de células IGROV1, OVCAR8 y SKOV3 en estudios de xenoinjerto conducidos como se ha descrito en el Ejemplo 1, donde ratones se trataron con 600 !g de Ab Nº 6 cada 3 días o con PBS como un control. Las respuestas de xenoinjerto, determinadas por cambios en volumen de tumor (en mm3) a lo largo del tiempo, seresumen en los gráficos de las Figuras 9A-9C. Nuevamente, los valores de Reducción de Índice de Crecimiento (RIC) para cada línea celular se calcularon usando la siguiente fórmula:

Reducción de Índice de Crecimiento = 1 -(Índice de Crecimiento Ab Nº 6)/(Índice de Crecimiento PBS)

Los valores de RIC para las cuatro líneas celulares ensayadas se resumen en la Tabla 14 más adelante:

Tabla 14: Resumen de la reducción de índice de crecimiento tumoral para conjunto predicho de estudios de xenoinjerto

Línea Celular: RIC [%]

IGROV1: 6,3

OVCAR8: 91,4

SKOV3: 19,6

5 Con respecto a la predicción de la sensibilidad a Ab Nº 6 para cada línea celular, en base a los criterios de que una respondedora de xenoinjerto tiene que tener un nivel de pErbB3 simulado mayor que el pErbB3 simulado de ADRr, el xenoinjerto de IGROV1 se categorizó como no respondedora, mientras que los xenoinjertos de OVCAR8 y SKOV3 se categorizaron como respondedoras.

10 Estos datos demuestran que las predicciones hechas en base a los valores de NAS calculados corresponden precisamente a la sensibilidad observada experimentalmente de las tres líneas de células de ensayo frente a tratamiento con Ab Nº 6 in vivo en los estudios de xenoinjerto. Más específicamente, la línea de células IGROV1 se predijo que era una no respondedora simulada en base a su valor de NAS calculado y se observó experimentalmente que era no respondedora en base a su valor de RIC. De forma similar, las líneas de células

15 OVCAR8 y SKOV3 se predijo que eran respondedoras simuladas en base a sus valores de NAS calculados y se observó experimentalmente que eran respondedoras en base a sus valores de RIC.

Por consiguiente, estos experimentos confirmaron la eficacia del modelo computacional y el valor de NAS calculado de niveles de pErbB3 normalizados integrados en el tiempo, como predictivos de sensibilidad frente a tratamiento

20 con Ab Nº 6 in vivo.

Ejemplo 8: Identificación de biomarcadores directos para sensibilidad a Ab Nº 6

En este ejemplo, los datos obtenidos a partir de las cuatro líneas celulares examinadas en los estudios de

25 xenoinjerto descritos en el Ejemplo 1 (ADRr, ACHN, DU154 y MALME3M) y las tres líneas celulares examinadas en los estudios de xenoinjerto descritos en el Ejemplo 7 (IGROV1, OVCAR8 y SKOV3) se examinaron adicionalmente para determinar si se podían identificar biomarcadores directos de sensibilidad a Ab Nº 6.

En primer lugar, se examinó si las concentraciones de receptor para ErbB1, ErbB2 y ErbB3 clasificaban de forma

30 eficaz los datos de xenoinjerto en respondedores y no respondedores. Como se ilustra en los gráficos de las Figuras 10A-10D (en los cuales se representa el logaritmo de la concentración de un receptor frente al logaritmo de la concentración de uno o más de los otros receptores), únicamente las mediciones de receptor ErbB1 parecían clasificar los datos de xenoinjerto en respondedores y no respondedores, mientras que ninguno de los otros receptores lo hacía.

35 A continuación, se examinó si la concentración de HRG en combinación con una concentración de receptor (por ejemplo, ErbB1, ErbB3) clasificaba de forma eficaz los datos de xenoinjerto en respondedores y no respondedores. Como se ilustra en el gráfico de la Figura 11 (en el cual se representa el logaritmo de la concentración de HRG frente al logaritmo de la concentración de ErbB1), estas dos mediciones de concentración, HRG y uno de los

40 receptores ErbB, fueron capaces de clasificar con precisión los datos de xenoinjerto en respondedores y no respondedores. Más específicamente, los datos de las tres no respondedoras MALME3, ADRr e IGROV1, eran separables de los datos de las seis respondedoras, permitiendo de ese modo la clasificación de no respondedoras frente a respondedoras.

45 Por consiguiente, los biomarcadores directos de sensibilidad de Ab Nº 6 se identificaron como HRG en combinación con uno de los receptores de la ruta de ErbB (por ejemplo, ErbB1, ErbB3).

La Tabla 15 más adelante resume las respondedoras y no respondedoras predichas para las líneas celulares estudiadas en el Ejemplo 7 usando los biomarcadores directos de Ab Nº 6 para realizar las predicciones. La 50 predicción determinada usando los biomarcadores directos se correspondía bien con las predicciones determinadas usando los valores de NAS (como se ha descrito en el Ejemplo 7). Por ejemplo, las líneas de células ACHN, DU145, OVCAR8 y SKOV3 se habían identificado previamente como respondedoras usando los valores de NAS y también se predijo que eran respondedoras usando los biomarcadores directos. De forma similar, las líneas de células ADRr, MALME3M e IGROV1 se habían identificado previamente como no respondedoras usando los valores de NAS y

55 también se predijo que eran no respondedoras usando los biomarcadores directos.

Tabla 15: Respondedoras y no respondedoras predichas usando los biomarcadores directos de Ab Nº 6

Respondedoras Intermedias No Respondedoras

ACHN SKBR3 ADRr

CAKI1 BT474 DU145 HOP92 EKVX IGROV1 HOP62 MALME3M

MDA-MB-231 MDA-MB-361 OVCAR8 SKMEL5 SKOV3 T47D

UACC62 ZR75-1

Al comparar los resultados del Ejemplo 7 usando el NAS para separar respondedoras de no respondedoras con los

5 resultados del Ejemplo 8 usando los biomarcadores directos para la separación, las únicas diferencias fueron para las líneas de células BT474, MDA-MB-231 y UACC62. No es sorprendente que existen algunas diferencias entre estos métodos de clasificación distintos. En esta situación, las líneas celulares en disputa se consideran respondedoras ya que, en el contexto de estratificación de pacientes, los falsos positivos son preferibles a los falsos negativos.

10 Ejemplo 9: Comparación de los niveles de expresión de proteína entre xenoinjertos y tumores humanos mediante ELISA y qlHC

En este ejemplo, se evaluaron las similitudes o diferencias en los perfiles de expresión de proteína observados en

15 xenoinjertos en comparación con los perfiles de expresión de proteína observados en tumores humanos. Esto se realizó para determinar si los niveles de proteína observados en los xenoinjertos eran comparables con los niveles de proteína observados en tumores humanos.

En un primer conjunto de experimentos, los niveles de expresión de proteína se miden mediante ELISA. Se preparan

20 lisados a partir de tumores congelados de forma inmediata de muestras de tumor humano o de xenoinjertos, como se ha descrito sustancialmente con detalle en el Ejemplo 2 y se analizan mediante ELISA para determinar niveles de proteína de ErbB1-4, HRG-∀1 y BTC, también como se ha descrito sustancialmente en el Ejemplo 2. Los resultados (obtenidos usando los métodos descritos anteriormente o variaciones menores de los mismos) se representan en los gráficos de de las Figuras 12A-12C. Los resultados demuestran que los valores obtenidos para los niveles de

25 proteína en las muestras de xenoinjerto están intercalados en gran medida con los valores obtenidos para los niveles de proteína en las muestras de tumor humano de origen de tejido diferente, indicando que los niveles de proteína observados en los xenoinjertos son comparables con los niveles de proteína observados en tumores humanos. En base a estos datos, se afirma que los umbrales de NAS determinados para la predicción de sensibilidad en xenoinjertos se pueden aplicar para predecir respondedoras usando muestras de tejido de tumor

30 humano.

Ya que las muestras de tejido congelado pueden ser difíciles de obtener en un entorno clínico, se llevó a cabo un segundo conjunto de experimentos usando técnicas de medición que permitían la cuantificación de proteína en muestras Incrustadas en Parafina y Fijadas en Formalina (FFPE). Más específicamente, se realizó 35 inmunohistoquímica cuantitativa (qlHC) usando el sistema QUA® (HistoRx, Inc., New Haven, CT). Usando inmunofluorescencia y un panel de línea celular con niveles de expresión de proteína representativos, se preparó una curva normal de línea celular. La curva normal de línea celular después permitió el retrocálculo del nivel de expresión de proteína en muestras de tumor y xenoinjertos. Los resultados se muestran en las Figuras 13A-13D. La Figura 13A muestra una curva normal de línea celular para ErbB1. Las Figuras 13B, 13C y 13D muestran gráficos de 40 barra que representan los valores de qlHC de ErbB1, ErbB2 y ErbB3, respectivamente, en las líneas de células de xenoinjerto (barras rojas) y en las muestras de tumor humano (barras azules). Los resultados de qIHC demostraron la similitud en los niveles de expresión de proteína entre las muestras de tumor humano y las muestras de xenoinjerto, que abarcan una amplia gama de niveles de expresión de proteína. Estos resultados apoyan nuevamente la afirmación de que los umbrales de NAS determinados para la predicción de sensibilidad en

45 xenoinjertos se pueden aplicar para predecir respondedoras usando muestras de tejido de tumor humano.

Ejemplo 10: Correlación de sensibilidad con heterodímeros fosforilados

En este ejemplo, niveles integrados de homo y heterodímeros de ErbB fosforilados se calcularon como valores de 50 NAS para determinar si los mismos se correlacionaban con sensibilidad a tratamiento con Ab Nº 6.

Se usó el mismo modelo computacional preparado como se ha descrito en el Ejemplo 4. Este modelo se generó en base a mediciones determinadas experimentalmente para los niveles de ErbB1, ErbB2, ErbB3, HRG-∀1 y BTC. Como se ha descrito en el Ejemplo 4, se implementaron siete hetero y homodímeros de ErbB que se habían descrito en la bibliografía en el modelo: ErbB1/1, ErbB1/2, ErbB1/3, ErbB1/4, ErbB2/2, ErbB2/3 y ErbB2/4. La mayoría de

5 estos dímeros se activan por unión a ligando pero varios surgen a través de un proceso de “señalización lateral” (o dimerización secundaria) en el cual los dímeros fosforilados en una manera dependiente de ligando se disocian en monómeros que después se homo o heterooligomerizan con monómeros activados o inactivados para crear dímeros activos. El modelo computacional se entrenó con un conjunto de datos experimentales que permitió la identificación de los dímeros que se forman en presencia de HRG o BTC usando la línea de células ADRr.

Por tanto, los niveles integrados de homo y heterodímeros fosforilados se calcularon como una medida del Estado de Activación de Red (NAS) para las siguiente líneas celulares: MALME3M, BT474, IGROV1, ADRr, OVCAR8, SKOV3, DU145 y ACHN. Como se muestra en el gráfico de la Figura 14, los niveles calculados de heterodímeros ErbB1/3 fosforilados (pErbB1: 3) separaron las ocho líneas celulares en no respondedoras (MALME3M, BT474,

15 IGROV1, ADRr) y respondedoras (OVCAR8, SKOV3, DU145 y ACHN) frente a Ab Nº 6. Esta separación en base a los niveles de pErbB1: 3 calculados se correlacionaba de forma idéntica con las no respondedoras y las respondedoras predichas determinadas usando los biomarcadores directos como se describen en el Ejemplo 8. Esta separación en base a los niveles de pErbB1: 3 calculados también se correlacionaba casi de forma idéntica con las no respondedoras y respondedoras predichas determinadas usando el nivel de pErbB3 calculado para el valor de NAS como se describe en el Ejemplo 7, con la única diferencia de que la línea de células BT474, que se había identificado como una no respondedora usando tanto los biomarcadores directos como los niveles de pErbB1: 3 calculados, pero que se había identificado como una respondedora usando los niveles de pErbB3 calculados.

Los niveles de dímeros ErbB1/1, ErbB1/2, ErbB1/3, ErbB1/4, ErbB2/2, ErbB2/3 y ErbB2/4 también se calcularon

25 usando el modelo computacional, pero ninguno de los niveles de ninguno de estos homo o heterodímeros separaron las líneas celulares en respondedoras y no respondedoras para tratamiento con Ab Nº 6. Por tanto, los resultados observados con los heterodímeros ErbB1/3 eran únicos entre los dímeros examinados.

Estos resultados demuestran que los niveles integrados de homo o heterodímero de ErbB fosforilado se pueden usar como el valor de NAS en los métodos predictivos de la invención y, más específicamente, que el nivel calculado de pErbB1: 3 es un valor de NAS preferido para predecir sensibilidad a tratamiento con Ab Nº 6. Estos resultados se interpretan como que significan que Ab Nº 6 es particularmente eficaz en cánceres con altos niveles de heterodímeros ErbB1:3 y, por lo tanto, que la medición directa de los niveles de heterodímeros ErbB1:3 totales o heterodímero pErbB1:3 también se puede usar como biomarcador directo para predecir la eficacia del tratamiento

35 con Ab Nº 6.

Ejemplo 11: Construcción y entrenamiento de un modelo computacional de los efectos de un agente terapéutico sobre la ruta de señalización de ErbB

En este ejemplo se usó el enfoque descrito en el Ejemplo 4 para construir un modelo computacional mecanicista para construir y entrenar un modelo de la ruta de señalización de ErbB y, además, para desarrollar una representación computacional del mecanismo mediante el cual un agente terapéutico particular inhibe la ruta de señalización.

45 El agente terapéutico usado en este ejemplo es el anticuerpo biespecífico H3 x B1D2 (cuya secuencia de aminoácidos se muestra en SEC ID Nº: 41 y que se describe adicionalmente en la Patente de Estados Unidos Nº 7.332.585, Patente de Estados Unidos Nº 7.332.580 y Solicitud PCT PCT/US2006/023479, publicada como documento WO 2007/084187 y Solicitud PCT PCT/US2007/024287, publicada como documento WO 2008/140493). Este anticuerpo biespecífico está compuesto de un anticuerpo de cadena única anti-ErbB3 enlazado a un anticuerpo de cadena única anti-ErbB2.

Se predijo que el agente H3 x B1D2 se dirigía preferentemente a tumores que sobreexpresan ErbB2. Por tanto, se construyó un modelo computacional de la ruta de señalización de ErbB en presencia de ErbB2 sobreexpresado usando los métodos y modelos descritos en el Ejemplo 4. El modelo incorporaba interacciones entre HRG y

55 receptores ErbB1, ErbB2 y ErbB3, conduciendo a tráfico de receptor y señalización intracelular cadena debajo de AKT, produciendo AKT fosforilado (pAKT). Las interacciones incluidas eran sustancialmente idénticas a aquellas encontradas en el modelo del Ejemplo 4. Por el contrario al modelo del Ejemplo 4, las reacciones relacionadas con el ligando BTC no se incluyeron en este modelo.

Este modelo se calibró para coincidir con los datos experimentales para la línea de células mamarias que sobreexpresan ErbB2 BT474-M3 (la línea celular se describe en, por ejemplo, Drummond et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11: 3392; Park et al. (2002) Clin. Cancer Res. 8: 1172; Kirpotin et al. (2006) Cancer Res. 66: 6732). La calibración del modelo dio como resultado únicamente diferencias menores en valores de parámetros en comparación con el modelo del Ejemplo 4. La diferencia más significativa fue una reducción en las velocidades de 65 internalización y degradación de receptor ErbB. Este cambio es consistente con los datos conocidos que sugieren que la sobreexpresión de ErbB2 reduce las velocidades de internalización/tráfico de otros receptores ErbB, tales

como ErbB1 (véase, poro ejemplo, Hendriks et al. (2003) J. Biol. Chem. 278: 23343-23351; Wang et al. (1999) Mol. Biol. Cell 10: 1621-1636; Haslekas et al. (2005) Mol. Biol. Cell 16: 5832-5842).

Para entrenar el modelo, se usó un conjunto de datos que comprendían matrices de dosis-tiempo en las cuales se 5 medía la fosforilación de ErbB1, ErbB2, ErbB3 y AKT en múltiples puntos de tiempo y a seis concentraciones diferentes de estimulación con HRG en células BT474-M3 mediante ELISA.

Para estimulación de las células, las células se siembran en pocillos duplicados con 1000 !l de medio completo a

150.000 células por pocillo en placas de cultivo de tejido de 12 pocillos (para ELISA de 96 medios pocillos) o en

10 placas duplicadas de 100 !l de medio completo a 20.000 células por pocillo en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos (para ELISA de 384 pocillos). Estas células se incuban durante una noche en una atmósfera humidificada de CO2 al 5%, el 95% de aire y 37 grados Celsius. Las células después se cambian a suero sin medio: medio RPMI1640 (Gibco) complementado con L-glutamina 2 mM (Gibco) y unidades/ml de Pen-Strep (Gibco). Las células en inanición se incuban en una atmósfera humidificada de CO2 al 5%, el 95% de aire y 37 grados Celsius durante 20-24

15 horas antes de la estimulación. Para estudios de matriz de dosis-tiempo, las dosis se estimulan con ligando (HRG) a 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 20, 30, 60 y 120 minutos. A continuación de la estimulación con seis concentraciones diferentes de HRG (0,098 nM-100 nM) para cada curso de tiempo, las células se colocan en hielo, se lavan con PBS frío, después se lisan en 100 !l para placas de 12 pocillos y 45 !l para placas de 96 pocillos en Tampón de Extracción de Proteína de Mamífero M-PER (Thermo Scientific, Nº de Catálogo 78501) complementado con cóctel inhibidor de

20 proteasa (Sigma-Aldrich, P2714), ortovanadato de sodio 1 mM (Sigma-Aldrich, S6508), pirofosfato de sodio 5 mM (Sigma-Aldrich, 221368), oxofenilarsina 50 !M (EMD Biosciences, 521000) y bpV (phen) 10 !M (EMD Biosciences, 203695).

Los niveles de fosforilación de proteína en las células estimuladas se miden mediante ELISA. ErbB1, ErbB2 y ErbB3

25 se miden usando los kits de R&D Systems Duoset IC (ErbB1 DYC1095-E, ErbB2 DYC1768-E, ErbB3 DYC1769-E). Los anticuerpos de captura frente a ErbB1 (R&D Systems, 841402), ErbB2 (R&D Systems, 841425), ErbB3 (R&D Systems, 841428) y AKT (Upstate, 05-591MG) se incuban en placas de 96 medios pocillos (Greiner, Nº de Catálogo 82050-046) o placas de 384 pocillos (Nunc Nº de Cat 40518) que son placas de unión elevada de poliestireno de fondo plano negras durante una noche a temperatura ambiente. Las placas de ELISA se bloquean con albúmina

30 sérica bovina al 2% (BSA) y solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante una hora y después se incuban con lisados diluidos en BSA al 2%, Tween-20 al 0,1% y PBS durante dos horas a temperatura ambiente. Entre cada incubación, las placas se lavan tres veces con Tween-20 al 0,05% en PBS. Los ELISA para medir fosfo-ErbB1, ErbB2 y ErbB3 se incuban con anticuerpo de Detección Anti-Fosfotirosina-HRP (R&D Systems, 841403) durante dos horas. Los ELISA para medir fosfo AKT se incuban con anticuerpo monoclonal anti-fosfo AKT de ratón específico de

35 serina 473 primario (Cell Signaling Technologies, Nº de Catálogo 5102) durante 2 horas, después se incuba con Estreptavidina-HRP (R&D Systems, Nº de Catálogo DY998) durante 20 minutos. Todos los ELISA se visualizan con Sustrato Quimioluminiscente SuperSignal ELISA Pico (Pierce, Nº de Catálogo 37069) y la señal de luminiscencia se mide usando un luminómetro.

40 Como se muestra en la Figura 21, el modelo coincidió con los datos de señalización de pErbB3 inducida por HRG en la línea de células que sobreexpresa ErbB2 BT474-M3 a todas las dosis de HRG examinadas experimentalmente. Adicionalmente, el modelo coincidió con los datos de señalización de pAKT inducida por HRG en células BT474-M3 a dosis de HRG de aproximadamente 5 nM e inferiores.

45 A continuación, se desarrolló una representación computacional del mecanismo mediante el cual H3 x B1D2 inhibe la señalización dependiente de HRG de la ruta de ErbB. La representación computacional del inhibidor se construyó usando ecuaciones de reacción de acción de masas que describen la unión del inhibidor a ErbB2 y ErbB3 e inhibición posterior de señalización inducida por HRG. Los parámetros para los acontecimientos de unión se obtuvieron mediante una combinación de medición directa (usando técnicas ampliamente conocidas en la técnica) y

50 entrenamiento computacional del modelo para igualar los datos para la inhibición de pErbB3 inducida por HRG en células mediante H3 x B1D2. En particular, el índice de asociación y el índice de disociación para la unión del brazo de cadena única H3 del anticuerpo biespecífico a ErbB3 y el índice de asociación y disociación para la unión del brazo de cadena único B1D2 del anticuerpo biespecífico a ErbB2 se determinaron experimentalmente mediante tecnología BIACore y KinExA convencional. Las reacciones y parámetros del modelo computacional de H3 x B 1 D2

55 aparecen en las Tablas 16a y 16b.

Tabla 16A Tabla 16B

Número de reacción Reacción: Parámetro directo Parámetro inverso

Implementación de H3 x B1D2

H3xB1D2_v1 E2 + (H3 x B1D2) <-> E2:(H3 x B1D2): h3xb1d2_kf1 h3xb1d2_kr1

H3xB1D2_v2 (H3 x B1D2) + E3 <-> (H3x B1 D2):E3: h3xb1d2_kf2 h3xb1d2_kr2

Número de reacción Reacción Parámetro directo Parámetro inverso

Implementación de H3 x B1D2

H3xB1D2_v3 E2 + (H3 x B1D2):E3 <-> E2:(H3 x B1D2) E3 h3xb1d2_kf3 h3xb1d2_kr1

H3xB1D2_v4 E2:(H3xB1D2) + E3 <-> E2:(H3xB1D2) E3 h3xb1d2_kf4 h3xb1d2_kr2

H3xB1D2_v5 E2:(H3 x B1D2) + E2:(H3 x B1D2) -> E2:E2 h3xb1d2_kf5

H3xB1D2_v6 E2:(H3xB1D2)+E2->E2:E2 h3xb1d2_kf5

H3xB1D2_v7 E2:(H3 x B1D2) + E2 p -> E2:E2_p h3xb1d2_kf5

H3xB1D2_v8 E2:(H3xB1D2) + E1 ->E1:E2 h3xb1d2_kf6

H3xB1D2_v9 E2:(H3xB1D2)+ E3->E2:E3 h3xb1d2_kf6

H3xB1D2_v10 E2 + (H3xB1D2):E3->E2:E3 h3xb1d2_kf6

H3xB1D2_v11 E2:(H3 x B1D2) + E3:HRG -> E2:E3:HRG h3xb1d2_kf7

H3xB1D2_v12 E2:(H3 x B1D2) + E3:HRG_p <-> E2:E3: HRG_p h3xb1d2_kf7

H3xB1D2_v13 E1 +(H3xB1D2):E3->E1:E3 h3xb1d2_kf8

**En este esquema de reacción, la cantidad de (H3 x B1D2) libre se mantiene constante.

Nombre Valor Unidades

Parámetros de H3 x B1D2

h3xb1d2_kf1 3,13E+04 (mol/l)-1 s-1

h3xb1d2_kr1 1,50E-04 s-1

h3xb1d2_kf2 3,50E+05 (mol/l)-1 s-1

h3xb1d2_kr2 2,20E-02 s-1

h3xb1d2_kf3 1,08E-06 (moléculas/célula)-1s-1

h3xb1d2_kf4 1,20E-05 (moléculas/célula)-1s-1

h3xb1d2_kf5 1,67E-08 (moléculas/célula)-1s-1

h3xb1d2_kf6 5,00E-08 (moléculas/célula)-1 s-1

h3xb1d2_kf7 5,00E-07 (moléculas/célula)-1s-1

h3xb1d2_kf8 5,00E-08 (moléculas/célula)-1s-1

5 El modelo se señalización de ErbB se combinó con el modelo de inhibidor y se usó para predecir los datos experimentales para la inhibición de señalización de pErbB3 y pAKT mediante H3 x B1D2. Los datos experimentales se generaron usando la misma metodología descrita anteriormente, con la excepción de que se añadieron concentraciones de H3 x B1D2 que variaban de 15 pM a 1 !M durante el ayuno de suero. Adicionalmente, los datos de inhibición se generaron usando un punto de tiempo de lisis de diez minutos después de estimulación con HRG 5

10 nM. El modelo recapituló de forma satisfactoria resultados experimentales que muestran que la CI50 de inhibición para H3 x B1D2 no cambió mucho en diferentes líneas celulares, pero el porcentaje de inhibición si cambió enormemente. Una causa principal del cambio del porcentaje de inhibición fue el nivel de expresión de ErbB2. Esto se demostró en experimentos donde ErbB2 se transfectó en la línea de células OVCAR8 para crear una línea de células que sobreexpresa ErbB2 (denominada OVCAR8-HER2). Las curvas de inhibición de pErbB3 y pAKT para

15 células OVCAR8 tratadas con H3 x B1D2 se compararon con las mismas curvas de inhibición para células OVCAR8-HER2 tratadas con H3 x B1D2. Los resultados se muestran en las Figuras 17A-D, donde las Figuras 17A y 17B muestran las curvas de inhibición para pErbB3 y pAKT, respectivamente, en células OVCAR8 tratadas con H3 x B1D2 (experimentalmente o simuladas en el modelo) y las Figuras 17C y 17D muestran las curvas de inhibición para pErbB3 y pAKT, respectivamente, en células OVCAR8-HER2 tratadas con H3 x B1D2 (experimentalmente o

20 simuladas en el modelo). Las CI50 para las células tratadas experimentalmente (“DR50datos”) y las células tratadas simuladas (“DR50sim”) también se muestran. Los datos muestran que niveles más elevados de expresión de ErbB2 dan como resultado un porcentaje de inhibición mayor mediante tratamiento con H3 x B1D2.

Además del papel principal de ErbB2 en la modulación del porcentaje de inhibición, se desveló un papel inesperado para ErbB1 mediante el modelo computacional. Este papel de ErbB1 se ilustró mediante una simulación que mostraba el efecto de añadir ARNi de ErbB1 a células ADRr, para simular la regulación negativa de ErbB1. Las células ADRr expresan únicamente niveles bajos de ErbB2 y mostraban un porcentaje pobre de inhibición mediante 5 H3 x B1D2 tanto en el modelo computacional como en los datos determinados experimentalmente. Estos datos se muestran en las Figuras 18A y 18B, que muestran las curvas de inhibición para pErbB3 y pAKT, respectivamente, en células ADRr tratadas con H3 x B1D2, experimentalmente o simuladas en el modelo. Las CI50 para las células tratadas experimentalmente (“DR50datos”) y las células tratadas simuladas (“DR50sim”) también se muestran. Sin embargo, la regulación negativa de la expresión de ErbB1 (mediante simulación de adición de ARNi) dio como

10 resultado un porcentaje de inhibición mayor en la simulación, como se muestra en las Figuras 18C y 18D, que muestran las curvas de inhibición para pErbB3 y pAKT, respectivamente, en células ADRr simuladas para tratamiento con ARNi de ErbB1 y H3 x B1D2. La implicación de los resultados a partir de la simulación de ARNi de ErbB1 es que la expresión de ErbB1 es un biomarcador de respuesta negativa para H3 x B1D2.

15 En resumen, el modelo computacional y los datos experimentales indicaron que existen dos mecanismos para modular de forma negativa la sensibilidad a H3 x B1D2 in vitro: (i) un nivel de ErbB2 insuficientemente elevado; y (ii) niveles de ErbB 1 elevados. Por el contrario, niveles elevados de expresión de ErbB2 y niveles bajos de expresión de ErbB1 se correlacionaban con sensibilidad aumentada a H3 x B1D2.

20 Ejemplo 12: Sensibilidad in vivo a tratamiento con H3 x B1D2 se correlaciona con sensibilidad predicha a partir de un modelo computacional

En este ejemplo, la sensibilidad in vivo de tumores frente a tratamiento con H3 x B1D2 se correlacionó con los niveles calculados de diversos componentes en la ruta de ErbB para identificar biomarcadores directos e indirectos

25 de sensibilidad a tratamiento con H3 x B1D2.

Para caracterizar la respuesta in vivo de tumores frente a tratamiento con H3 x B1D2, se ensayó un panel de líneas de células tumorales en un modelo de tumor de xenoinjerto tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. En los modelos de tumor de xenoinjerto, ratones (ratones nu/nu: ratones hembra de 4-5 semanas de edad, atímicos, desnudos,

30 antecedentes exogámicos; Albino; adquiridos en Charles River Labs, Wilmington, MA) se implantan en el flanco con 5 x 106 -2 x 107 células/ratón (dependiendo de la línea celular ) en 200 !l a través de inyección subcutánea. Los ratones se supervisan para crecimiento de tumor inicial. Se permite que los tumores crezcan durante varios días hasta que el volumen de tumor medio es aproximadamente 150-200 mm3. El volumen de tumor se calcula como V = (∃/6 (L x W2). Los ratones se tratan con el anticuerpo H3 x B1D2 a una dosis de 600 !g/inyección cada 3 días (q3d).

35 Los ratones de control se tratan con solución salina tamponada con fosfato (PBS) o con HSA de tipo silvestre (albúmina sérica humana). El volumen de tumor se mide durante 40-80 días.

Se examinaron las siguientes doce líneas de células tumorales: ACHN, ADRr, IGROV1, LS180, MIA PaCa2, ZR751, MDA-MB-361, ADrR-HER2 (células ADrR transfectadas para sobreexpresar HER2), NCI-N87, CALU-3, SKOV

40 3 y BT474-M3. Para el uso de estas líneas celulares en el modelo computacional, se determinaron experimentalmente los niveles de expresión de ErbB1, ErbB2 y ErbB3 en cada línea celular usando los métodos descritos anteriormente o variaciones menores de los mismos, cuyos resultados se muestran más adelante en la Tabla 17:

45 Tabla 17: Niveles de receptor ErbB

Línea celular ErbB1 ErbB2 ErbB3

ACHN 448284 45456 15200 ADrR 177818 40792 33205 BT474-M3 129436 1706601 49238 SKOV3 264132 1377661 13694 ZR75-1 37409 199132 39492 IGROV1 149031 158418 5355 OVCAR8 236157 53272 31813 MDA-MB-361 65855 371731 32981 NCI-N87 417753 1233479 34678 Calu-3 161357 1196976 30031 LS180 122520 143339 28841 MIAPaCa-2 138563 84865 5735 ADrR-HER2 271000 722000 34400

Los datos de control y tratamiento para los experimentos de xenoinjerto in vivo se ajustaron a curvas de crecimiento exponencial, usando la siguiente fórmula: V=Vo*exp(k*t) donde V es el volumen del tumor, Vo es el volumen del tumor en tiempo cero, k es el índice de crecimiento exponencial y t es el tiempo. La potencia de H3 x B1D2 para inhibir el crecimiento tumoral se representó como la proporción de índices de crecimiento exponencial de tratamiento y de control para cada línea celular ensayada. Esta proporción se denominó “índice de crecimiento relativo” (ICR) y se representa como:

ICR = kH3 x B1D2 / kcontrol

Un índice de crecimiento relativo (ICR) de 1 significaba que el agente no tenía efecto. Un ICR de 0 significaba que el agente detenía el crecimiento del tumor por completo. Un ICR negativo significaba que el agente provocaba regresión tumoral.

De las doce líneas celulares examinadas, únicamente BT474-M3 tenía un ICR negativo (es decir, H3 x B1D2 provocaba regresión tumoral únicamente en esta línea celular). Dos líneas celulares, IGROV1 y LS180, tenían valores de ICR mayores de 1, indicando que H3 x B1D2 no tenía ningún efecto sobre el crecimiento tumoral de estas

15 líneas celulares. Las nueve líneas celulares restantes tenían valores de ICR entre 0 y 1, indicando que H3 x B1D2 inhibía parcialmente el crecimiento tumoral de estas líneas celulares.

Los valores de ICR para las doce líneas celulares se representaron frente a niveles calculados por modelo de monómero ErbB2, homodímero ErbB2:ErbB2 y heterodímero ErbB2:ErbB3 en las líneas celulares en ausencia del inhibidor H3 x B1D2, en base a los niveles medidos de ErbB1, ErbB2 y ErbB3 en cada una de las líneas celulares. Los resultados se ilustran en las Figuras 19A-C, que muestran gráficos de los índices de crecimiento relativos (ICR) determinados in vivo para el panel de células tumorales en el modelo de xenoinjerto tratadas con H3 x B1D2 representados frente a los niveles calculados de monómeros ErbB2 (Figura 19A), homodímeros ErbB2:ErbB2 (Figura 19B) y heterodímeros ErbB2:ErbB3 (Figura 19C) en el panel de células tumorales en ausencia de H3 X

25 B1D2.

Los resultados en la Figura 19 muestran que existe una relación lineal entre ICR y los niveles calculados de monómeros ErbB2, homodímeros ErbB2:ErbB2 y heterodímeros ErbB2:ErbB3, En vista de esta observación, la medición directa de monómeros ErbB2, homodímeros ErbB2:ErbB2 y/o heterodímeros ErbB2:ErbB3 se puede usar como biomarcador directo de sensibilidad a H3 x B1D2. Además, la medición de ErbB1, ErbB2 y ErbB3 en una muestra de tumor se puede usar para calcular los niveles de homodímeros ErbB2:ErbB2 y/o heterodímeros ErbB2:ErbB3 para estratificar la sensibilidad de tumor frente a tratamiento con H3 x B1D2 (es decir, los niveles medidos de ErbB1, ErbB2 y ErbB3 se pueden usar como biomarcadores indirectos de sensibilidad a H3 x B1D2, que se usa para calcular los niveles de homodímeros ErbB2:ErbB2 y/o heterodímeros ErbB2:ErbB3). Por tanto, los

35 niveles calculados de, por ejemplo, homodímeros ErbB2:ErbB2 y/o heterodímeros ErbB2:ErbB3 se pueden usar como un valor de Estado de Activación de Red (NAS) tras lo cual se puede predecir la sensibilidad al tratamiento con H3 x B1D2.

Los valores de ICR para las doce líneas celulares también se representaron frente a los niveles relativos calculados (por ejemplo, proporción) de homodímero ErbB2:ErbB2 y heterodímero ErbB1:ErbB3 en las líneas celulares en ausencia y presencia simulada del inhibidor H3 x B1D2. Un nivel relativo más bajo indica que H3 x B1D2 puede inhibir de forma más potente la formación de esa especie de heterodímero. Los resultados se ilustran en las Figuras 20A-B, que muestran gráficos de los índices de crecimiento relativo (ICR) determinados in vivo para un panel de células tumorales en un modelo de xenoinjerto tratadas con H3 x B1D2 representados frente a los niveles relativos

45 calculados de heterodímeros ErbB2:ErbB3 (Figura 20A) y heterodímeros ErbB1:ErbB3 (Figura 20B) en el panel de células tumorales en presencia simulada de H3 x B1D2, en comparación con los niveles simulados de los heterodímeros en la ausencia simulada de H3 x B1D2.

Los resultados en la Figura 20 demuestran una correlación entre la capacidad del inhibidor de alterar los heterodímeros ErbB2:ErbB3 y ErbB1:ErbB3 y el índice de crecimiento relativo de los tumores. Es decir, las células tumorales (por ejemplo, células BT474-M3) en las cuales los niveles relativos calculados de heterodímero ErbB2:ErbB3 y ErbB1:ErbB3 son bajos en presencia simulada del inhibidor H3 x B1D2 (es decir, la alteración del heterodímero es elevada por el inhibidor) muestran valores de ICR bajos (indicando un efecto mayor del inhibidor sobre el crecimiento tumoral). Por el contrario, las células tumorales (por ejemplo, células ACHN) en las cuales los

55 niveles relativos calculados de heterodímero ErbB2:ErbB3 y ErbB1:ErbB3 son elevados en presencia simulada del inhibidor H3 x B1D2 (es decir, alteración de heterodímero es baja por el inhibidor) muestran valores de ICR más elevados (indicando un efecto menor del inhibidor sobre el crecimiento tumoral). Estos resultados demuestran que la simulación de la presencia del agente terapéutico en el modelo computacional de la ruta de señalización, en comparación con la ausencia simulada del agente terapéutico, permite la generación de un Estado de Inhibición de Red (NIS), en base a los niveles relativos de heterodímero ErbB2:ErbB3 o ErbB1:ErbB3 y este NIS se puede usar como un predictor de la sensibilidad de células tumorales frente al agente terapéutico in vivo.

Ejemplo 13: Medición de afinidad de unión (KD)

65 Las constantes de disociación de anticuerpos anti-ErbB se pueden medir usando cualquiera o ambas de dos técnicas independientes, un Ensayo de Resonancia de Plasmón Superficial y un ensayo de unión celular.

Ensayo de resonancia de plasmón superficial

El Ensayo de Resonancia de Plasmón Superficial se realiza como se ha descrito en Wassaf et al. (2006) Analytical Biochem., 351: 241-253. Una implementación preferida usa un instrumento BIACORE 3000 (GE Healthcare) que usa una proteína ErbB recombinante como el analito y el anticuerpo anti-ErbB como el ligando. El valor de KD se calcula en base a la fórmula KD = Kd/Ka.

Ensayo de unión celular

Un ensayo de unión celular se lleva a cabo usando células A-431 para unión de ErbB 1, células ZR-75-1 para unión de ErbB2 o células MALME-3M para unión de ErbB3 (todas de la ATCC). El ensayo se realiza sustancialmente de la forma siguiente.

Las células se desprenden con 2 ml de tripsina-EDTA + 2 ml de RMPI + EDTA 5 mM a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añade inmediatamente RPMI completo (10 ml) a las células tratadas con tripsina, se resuspenden suavemente y se centrifugan en una centrífuga de mesa Beckman a 1100 rpm durante 5 minutos. Las células se resuspenden en tampón de tinción BD (PBS + FBS al 2% + azida sódica al 0,1%, Becton Dickinson) a una concentración de 2 x 106 células por ml y alícuotas de 50 !l (1 x 105 células) se siembran en placas en una placa de titulación de 96 pocillos.

Se preparan 150 !l de solución de anticuerpo anti-ErbB 200 nM en tampón de tinción BD y se diluye en serie 2 veces en 75 !l de tampón de tinción BD. Las concentraciones del anticuerpo diluido variaban desde 200 nM hasta 0,4 nM. Alícuotas de 50 !l de las diferentes diluciones de proteína se añaden posteriormente directamente a los 50 !l de suspensión celular proporcionando las concentraciones finales del anticuerpo de 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12 nM, 6 nM, 3 nM, 1,5 nM, 0,8 nM, 0,4 nM y 0,2 nM.

Las células divididas en alícuotas en la placa de 96 pocillos se incuban con las diluciones de proteína durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador de plataforma y se lavan 3 veces con 300 !l del tampón de tinción BD. Posteriormente las células se incuban con 100 !l de anticuerpo secundario (por ejemplo, una dilución 1:750 de anti-IgG humana de cabra marcado con Alexa647 en tampón de tinción BD) durante 45 minutos en un agitador de plataforma en la habitación fría. Finalmente, las células se lavan dos veces, se sedimentan y se resuspenden en 250 !l de tampón de tinción BD + 0,5 !g/ml de yoduro de propidio. El análisis de 10.000 células se lleva a cabo en un citómetro de flujo FACSCALIBUR usando el canal FL4. Los valores de MFI y las concentraciones correspondientes del anticuerpo anti-ErbB se representan en el eje y, y eje x, respectivamente. La KD de la molécula se determina usando software GraphPad PRISM usando el modelo de unión de un sitio para una curva de regresión no lineal.

El valor de KD se calcula en base a la fórmula Y=Bmáx* X/ KD + X (Bmáx = fluorescencia a saturación. X= concentración de anticuerpo. Y = grado de unión).

LISTADO DE SECUENCIAS

110> MERRIMACK PHARMACEUTICALS, INC.

120> MÉTODOS, SISTEMAS Y PRODUCTOS PARA PREDECIR RESPUESTA DE CÉLULAS TUMORALES FRENTE A UN AGENTE TERAPÉUTICO Y TRATAR A UN PACIENTE DE ACUERDO CON LA RESPUESTA PREDICHA

130> MMJ-009PC

140> 141>

150> 61/170.367

151>

150> 61/208.206

151 >

150> 61/194.702

151>

150> 61/189.053 151>

160> 53

170> Patentln versión 3.5

<210> 1

<211> 119

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 10

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Polipéptido sintético"

15 <400> 1

<210>2 20 <211> 111

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 25 <221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Polipéptido sintético"

<400> 2 <210>3

<211> 118 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente 10 <223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Polipéptido sintético"

<400> 3

<210>4

<211> 110

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5 <220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Polipéptido sintético"

<400> 4 10

<210>5

<211> 122 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente 20 <223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Polipéptido sintético"

<400> 5 <210>6

<211> 106 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 6

<210>7 <211>5

5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente 10 <223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 7

15 <210>8

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 20

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

25 <400> 8

<210>9 30 <211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 9

<210> 10

<211> 14

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 10

<210> 11 <211>7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 11

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 12

<210> 13 <211>5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 13

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 14

<210> 15 <211>9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

25 <400> 15

<210> 16

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 16

<210> 17 <211>7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 17

55 <210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 18

<210> 19 <211>5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 19

<210> 20

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

35 <400> 20

<210> 21

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

45 <220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 21

<210>22

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 22

<210>23 <211>8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 23

<210>24 <211>9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 24

<210> 25

<211> 118

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Polipéptido sintético"

<400> 25 <210>26

<211> 108 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 26

<210> 27 <211>5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 27

15 <210>28

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 28 25

<210>29 <211>9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 29

<210> 30

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 30

<210>31 55 <211>7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 31

10 <210> 32 <211>9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 32 20

<210>33

<211> 119 25 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente 30 <223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Polipéptido sintético"

<400> 33

<210> 34

<211> 110

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5 <220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Polipéptido sintético"

<400> 34 10

<210> 35

<211>5 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente 20 <223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 35

25 <210>36

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 30

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

35 <400> 36 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 37

<210>38

<211> 14

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 38

<210> 39 <211>7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 39

<210>40

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 40 <210>41

<211> 1095 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 41

<210> 42 <211>5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 42

15 <210>43

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

25 <400> 43

<210>44 <211>9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 44

<210>45

<211> 14

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 45

<210>46 <211>7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 46

<210> 47

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético" 25

<400> 47

<210>48 <211>5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

35 <220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 48

<210>49

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 49

<210>50 <211>20

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 50

15 <210> 51

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 51 25

<210> 52 <211>7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 52

<210> 53 <211>11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota="Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético"

<400> 53

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un anticuerpo anti-ErbB3 para su uso en un método para tratar un paciente que tiene un tumor neoplásico, comprendiendo dicho método administrar el anticuerpo anti-ErbB3 al paciente si el nivel de ErbB3 fosforilado (pErbB3) en una muestra del tumor obtenido a partir del paciente se determina que no es menor de 0,064 pg/!g de proteína total.
2.

Un anticuerpo anti-ErbB3 para su uso en un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el tumor es un tumor maligno de un órgano seleccionado entre colon, pulmón, recto, vesícula biliar, cerebro, médula espinal, mama, riñón, páncreas, estómago, hígado, hueso, piel, bazo, ovario, testículo, próstata y músculo.
3.

Un anticuerpo anti-ErbB3 para su uso en un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde el anticuerpo anti-ErbB3 comprende al menos uno de:

(i)

un anticuerpo que tiene las secuencias de región variable de cadena pesada (VH) y región variable de cadena ligera (VL) mostradas en SEC ID Nº: 1 y 2, respectivamente o un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de VH y VL mostradas en SEC ID Nº: 7-9 y 10-12, respectivamente;

(ii)

un anticuerpo que tiene las secuencias de VH y VL mostradas en SEC ID Nº: 3 y 4, respectivamente o un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR de VH y VL mostradas en SEC ID Nº: 13-15 y 16-18, respectivamente;

(iii) un anticuerpo que tiene las secuencias de VH y VL mostradas en SEC ID Nº: 5 y 6, respectivamente o un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR de VH y VL mostradas en SEC ID Nº: 19-21 y 22-24, respectivamente;

(iv)

un anticuerpo que tiene las secuencias de VH y VL mostradas en SEC ID Nº: 25 y 26, respectivamente o un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR de VH y VL mostradas en SEC ID Nº: 27-29 y 30-32, respectivamente; y

(v)

un anticuerpo que tiene las secuencias de VH y VL mostradas en SEC ID Nº: 33 y 34, respectivamente o un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR de VH y VL mostradas en SEC ID Nº: 35-37 y 38-40, respectivamente.
4.

Un anticuerpo anti-ErbB3 para su uso en un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el anticuerpo anti-ErbB3 comprende un anticuerpo que tiene las secuencias de región variable de cadena pesada (VH) y región variable de cadena ligera (VL) mostradas en SEC ID Nº: 1 y 2, respectivamente o un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de VH y VL mostradas en SEC ID Nº: 7-9 y 10-12, respectivamente.
5.

Un anticuerpo anti-ErbB3 para su uso en un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el nivel de pErbB3 en la muestra se determina que es no menor de 0,08 pg/!g de proteína total.
6.

Un anticuerpo anti-ErbB3 para su uso en un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el nivel de pErbB3 en la muestra se determina que es no menor de 0,096 pg/!g de proteína total.
7.

Un anticuerpo anti-ErbB3 para su uso en un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el nivel de pErbB3 en la muestra se determina que es no menor de 0,122 pg/!g de proteína total.
8.

Un anticuerpo anti-ErbB3 para su uso en un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el nivel de pErbB3 en la muestra se determina que es no menor de 0,128 pg/!g de proteína total.
9.

Un anticuerpo anti-ErbB3 para su uso en un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el nivel de pErbB3 en la muestra se determina que es no menor de 0,144 pg/!g de proteína total.
10.

Un anticuerpo anti-ErbB3 para su uso en un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el nivel de pErbB3 en la muestra se determina que es no menor de 0,16 pg/!g de proteína total.
11.

Un anticuerpo anti-ErbB3 para su uso en un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 donde el tumor es un tumor maligno de mama.
12.

Un anticuerpo anti-ErbB3 para su uso en un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 donde el tumor es un tumor maligno de colon.
13.

Un anticuerpo anti-ErbB3 para su uso en un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 donde el tumor es un tumor maligno de pulmón.
14.

Un anticuerpo anti-ErbB3 para su uso en un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 donde el tumor es un tumor maligno de recto o páncreas.