ES2436267T3

ES2436267T3 - Análogos sintéticos manósidos fosfatidil-mio-inositol con actividad inhibidora de la respuesta inflamatoria

Info

Publication number: ES2436267T3
Application number: ES09765996T
Authority: ES
Inventors: Valerié QUESNIAUX RYFFEL; Olivier Martin; Sophie Front
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite d Orleans UFR de Sciences
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite d Orleans UFR de Sciences
Priority date: 2008-05-23
Filing date: 2009-05-20
Publication date: 2013-12-30
Anticipated expiration: 2029-05-20
Also published as: JP5535202B2; EP2280986A2; WO2009153434A2; FR2931480B1; FR2931480A1; WO2009153434A3; CA2724767A1; JP2011520946A; US8846880B2; US20110224162A1; WO2009153434A8; EP2280986B1

Abstract

Compuesto de la fórmula general (I): en la que:- R1 y R2 representan, independientemente el uno del otro, un átomo de hidrógeno, un radical alquilo C1 -C20, un radical acilo C1 - C20, siendo entendido siempre y cuando uno de los sustituyentes R1 o R2 seaun átomo de hidrógeno, el otro 25 sustituyente sea diferente al de hidrógeno; - Z1 y Z2 representan, independientemente el uno del otro, un átomo de hidrógeno, al menos un azúcarseleccionado del grupo formado por manosa, glucosa, galactosa siendo entendido siempre y cuandouno de los sustituyentes Z1 o Z2 sea un átomo de hidrógeno, el otro sustituyente sea diferente al dehidrógeno; - Q representa a - OP (O)2O -, - OCO2 -, NHCO2 -, NHCONH -; - Y representa un átomo de hidrógeno, un radical hidroxilo, un radical alcoxi en C1 - C6 - (CH2)n - OHdonde n es un número entero igual a 1, 2 o 3, siendo entendido siempre y cuando Y sea un radicalhidroxilo; y Z1 y Z2 no representen a los dos grupos de un átomo de hidrógeno; -A representa -- CH2 -; - X representa un átomo de hidrógeno; - o A y X forman un enlace para conducir a un ciclo de 6 eslabones en el que - A representa un - CH-, - X representa un - CH2 -, - CH (OH) -, un átomo de oxígeno, un -NR3 - en el que R3 es unátomo de hidrógeno, un radical alquilo en C1 - C6 o un radical acilo en C1 - C20,siendo entendido siempre y cuando - A y X formen un enlace para conducir a un ciclo de 6 eslabones, - X >= - CH (OH) -, - Y >= - OH, y - Z1 y Z2 representen, independientemente el uno del otro, al menos un azúcar seleccionado delgrupo formado por manosa, glucosa y galactosa el ciclo de 6 miembros tenga una configuración mioinositol con Z1 o Z2 en posición 1 yrepresenten, al menos un azúcar, sabiendo que "alquilo" se refiere a un radical carbonadolineal, ramificado o cíclico, saturado o insaturado, eventualmente sustituido, que comprende 1 a20 átomos de carbono, sabiendo que "acilo" se refiere a un radical - COR- en el que R- es un radical alquilo tal y comose ha definido anteriormente, sabiendo que "alcoxi" se refiere a un radical - OR- en el que R- es un radical alquilo tal y comose ha definido anteriormente; o una de sus sales farmacéuticamente aceptables; sabiendo que "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a las sales preparadas conácidos o bases no tóxicas.

Description

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos derivados sintéticos de fosfatidil – mioinositol manósidos (denominado en adelante PIM), a su procedimiento de preparación y utilización en la prevención o al tratamiento de una enfermedad asociada a la sobreexpresión de citoquinas o de quimioquinas, en particular TNF y / o IL – 12.

La invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende al menos un derivado sintético de PIM.

En la descripción a continuación, las referencias entre corchetes [ ] remiten a la lista de referencias presentada al final del documento.

Estado de la técnica

La inhibición de la expresión de las citoquinas proinflamatorias como el TNF y la interleucina 12p40 (denominada en adelante como IL – 12) involucradas en las numerosas respuestas inflamatorias, constituye una necesidad médica real.

Las indicaciones relacionadas con la expresión de estas citoquinas incluyen enfermedades inflamatorias, alérgicas y autoinmunes como la artritis reumatoide, la enfermedad de Crohn, la esclerosis múltiple, la psoriasis, la diabetes mellitas, el lupus eritematoso, el choque séptico y las inflamaciones pulmonares y agudas.

Las moléculas utilizadas normalmente en estas indicaciones son esteroides. Numerosos agentes bloqueantes como el TNF (anticuerpos o receptores solubles) se han comercializado desde el 2000. Cuatro tipos de moléculas inhiben la secreción de la IL – 12 cuyos anticuerpos son objeto de la patente / solicitud de patente [1].

Sin embargo, los esteroides tienen efectos secundarios que limitan la aplicación. Los anticuerpos monoclonales

o receptores solubles son proteínas costosas que requieren inyecciones subcutáneas. Además, estos anticuerpos pueden tener efectos no deseables en la resistencia a las infecciones, como se ha demostrado para los anticuerpos anti TNF que pueden inducir la reactivación de la tuberculosis latente. El ácido hialurónico descrito como inhibidor de la producción de la IL – 12, tiene un peso molecular muy elevado, no está molecularmente definido y es difícilmente sintetizable [2].

Existe por tanto una necesidad médica real para encontrar nuevos inhibidores de citoquinas proinflamatorias como el TNF y la IL – 12 que palie estos defectos.

Los fosfatidil – mioinositol manósido (denominados en adelante PIM), son los precursores de lipoglicanos complejos como, por ejemplo, los lipoarabinomananos (LAM) y los lipomananos (LM), extraídos de las paredes de las micobacterias. Según su estructura, los PIM pueden tener diferentes actividades inmunomoduladoras.

Los PILAM, proceden de una especie avirulenta de rápido crecimiento como las M. smegmatis, moléculas proinflamatorias que estimulan la producción del TNF y de la IL – 12. En cambio, los LAM cubiertos con residuos de manosilo (ManLAM), proceden de las micobacterias de lento crecimiento como las M. tuberculosis y la M. bovis BCG, moléculas antiinflamatorias capaces de inhibir la producción de la IL – 12 y el TNF y capaces de aumentar la producción de la IL – 10 por las células dendríticas o por las líneas monocíticas. [8].

Los PILAM, estimulan los macrófagos a través de los receptores Toll-like (TLR) – 2, receptores implicados en la inmunidad innata y estimulan la vía de señalización del NF – kB [9]. Se atribuyen los efectos antiinflamatorios de ManLAM a su enlace con los receptores de manosa [10] o a DC-SIGN [11].

Los LM, precursores biosintéticos de los LAM, están compuestos por un esqueleto de hidratos de carbono con un núcleo constituido de D – manosa y un punto de anclaje de fosfatidilinositol manósido (denominado en adelante PIM) en el extremo reducido manana del dicho núcleo. Los LM están desprovistos del dominio D – arabinano y de cofias encontradas en los LAM [12]. Los LM son proinflamatorios pero los inventores han descrito recientemente que los LM de diferentes orígenes bacterianos, incluyendo a la M. bovis BCG, la M. tuberculosis, la M. chelonae y la M. Kansasii, también presentan importantes propiedades antiinflamatorias [13]. En particular, los LM tri-y tetra – acilados de Mycobacterium bovis BCG inducen a la estimulación de los macrófagos y la expresión de citoquinas proinflamatorias a través de TLR2, de TLR4 y de la proteína adaptadora MyD88 [14], mientras que los LM diacilados y, hasta un cierto nivel los LM triacilados, inhiben la producción de las citoquinas inflamatorias por los macrófagos estimulados a través de la vía TLR4, independientemente de la TLR2 [15]. Por lo tanto, el grado de acilación influye en el efecto modulador de los LM de M. bovis. Los autores propusieron que la acilación diferencial de los LM de la pared miobacteriana puede representar un medio adicional para regular la respuesta inflamatoria del huésped.

Los PIM son moléculas de bajo peso molecular (aproximadamente 1.000 – 2.500) generalmente con 1 a 4 cadenas aciladas, un residuo fosfatidil – mioinositol y 1 a 6 residuos de manosa. Por lo tanto, los PIM naturales pueden presentarse en diferentes formas con un número variable de residuos de manosa y acilo.

Entre los PIM naturales, los fosfatidil – mioinositol dimanósido (denominado en adelante PIM2) y fosfatidil – mioinositol hexamanósido (denominado en adelante PIM6) son los más comunes en la Mycobacterium bovis BCG y en la Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Se muestra en la Figura 1 un ejemplo de estructura de PIM6 en su estado natural. Se tiene en cuenta que en estas estructuras naturales, los residuos de manosilo son transportados por el D

– mioinositol en las posiciones 2 y 6.

Se han atribuido recientemente numerosas funciones a los PIM.

Se ha demostrado que los PIM son los agonistas de TLR2 [3] y son reconocidos por las células T CD4-CD8-α / β humanas en el contexto de las células que presentan antígenos que expresan CD1b [4]. Se estableció la interacción de la alta afinidad entre las proteínas CDb1 y las cadenas laterales aciladas de PIM2 [5]. La fracción fosfatilidinositol parece desempeñar un papel central en el proceso de enlace de los PIM a las proteínas CD1b. Por otra parte, se ha demostrado que los PIM2 pueden aumentar el reclutamiento de células NKT ( Natural Killer T cells), que desempeñan un papel crucial en la respuesta granulomatosa [6], [7].

Se ha descubierto que las cepas de Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium tuberculosis H37Rv y Mycobacterium smegmatis 607 contenían esencialmente dos familias de PIM, los dimanósidos (PIM2) y hexamanósidos (PIM6) [7]. Se observan PIM1, PIM3, PIM4 y PIM5 en cantidades reducidas que sugieren que estos son los intermediarios biosintéticos. Se sintetizan los PIM a partir del fosfatilidinositol por adición secuencial de residuos de manosa en posiciones específicas. Se conocen ahora los tres genes que codifican las manosil transferasas implicadas en la adición de tres primeras unidades de α – Manp. La etapa de iniciación, catalizada por la enzima pimA [16], consiste en la transferencia de un residuo α – Manp al mioinositol del fosfatilidinositol para formar PIM1. La adición de un segundo residuo α – Manp al – inositol del fosfatilidinositol para formar PIM2 , está catalizado por la enzima pimB [17]. La elongación se produce gracias al pimC [18] para crear PIM3 por adición de un tercer residuo α –Manp.

Se han purificado y caracterizado diferentes formas aciladas de PIM, en particular las de PIM2 y PIM6 [7]. Se han descrito cuatro principales formas aciladas (mono – o tetra – aciladas) para PIM2 y PIM6 (AC1 -a AC4 – PIM2 y PIM6 ; véase la Tabla 1). Se ha puesto igualmente en evidencia su actividad biológica consistente en la estimulación de macrófagos para producir citoquinas.

Tabla 1: Formas principales aciladas de PIM6 puestas en evidencia M. bovis BCG.

Se ha determinado la abundancia relativa de las diferentes especies para cada forma acilada a partir de la integración de las señales monoisotópicas correspondientes [19].

Los inventores han mostrado previamente que PIM2 y PIM6 inducen una activación reducida de macrófagos para secretar TNF por TLR2 y el adaptador MyD88, cualquiera que sea su estructura acilada [7], [19].

Sin embargo, como los PIM son los precursores de LM, y en vista de la reciente demostración de los inventores, según la cual el LM diacilado y triacilado posee un efecto antiinflamatorio fuerte, han determinado que, algunos PIM naturales, incluyendo los PIM6 di – y tri – acilados, son los inhibidores de la liberación por los

macrófagos de citoquina proinflamatoria. Este trabajo es objeto de la solicitud de patente francesa Nº 06 / 10136 publicada el 20 de noviembre de 2006 con el número FR 2908658.

Se han descrito las síntesis totales de PIM2 y PIM6 [20]. Los inventores ya han realizado la síntesis de los PIM1 diacilados y han mostrado la inhibición de la liberación de citoquinas proinflamatorias.

Como se ha indicado anteriormente, existe una necesidad médica real para descubrir nuevos inhibidores de citoquinas proinflamatorias como el TNF y la IL – 12 para paliar los defectos, inconvenientes y obstáculos de los inhibidores del trabajo anterior como los esteroides o los anticuerpos monoclonales.

Los derivados sintéticos de PIM pueden constituir una alternativa interesante para responder a esta necesidad.

Así pues, existe por lo tanto, una necesidad real de nuevos derivados sintéticos de PIM que sean a la vez fáciles de sintetizar, de aplicar y que posean un bajo coste, que tengan propiedades inhibidoras de la expresión de citoquinas proinflamatorias o incluso superiores a los inhibidores del trabajo anterior.

Descripción de la invención

La presente invención tiene precisamente como objetivo responder a esta necesidad proporcionando nuevos compuestos de fórmula general. (I):

en la que:

•: Z1 y Z2 representan, independientemente el uno del otro, un átomo de hidrógeno, al menos un azúcar seleccionado del grupo formado por manosa, glucosa, y galactosa siendo entendido siempre y cuando uno de los sustituyentes Z1 o Z2 sea un átomo de hidrógeno y el otro sustituyente sea diferente al de hidrógeno;

•: Q representa a – OP (O)2O -, -OCO2 -, NHCO2 -, NHCONH -;

•: Y representa un átomo de hidrógeno, un radical hidroxilo, un radical alcoxi en C1 –C6 – (CH2)n –OH donde n es un número entero igual a 1, 2 o 3, siendo entendido siempre y cuando Y sea un radical hidroxilo; y Z1 y Z2 no representen a los dos grupos de un átomo de hidrógeno;

•: A representa –-CH2 -;

•: X representa un átomo de hidrógeno; • o A y X forman una enlace para conducir a un ciclo de 6 eslabones en el que

! A representa un – CH-, ! X representa un -CH2 -, -CH (OH) -, un átomo de oxígeno, un –NR3 – en el que R3 es un átomo de hidrógeno, un radical alquilo en C1 –C6 o un radical acilo en C1 –C20, siendo entendido siempre y cuando ! A y X formen un enlace para conducir a un ciclo de 6 eslabones, ! X =-CH (OH) -, ! Z1 y Z2 representen, independientemente el uno del otro, al menos un azúcar seleccionado del grupo formado por manosa, glucosa y galactosa el ciclo de 6 miembros tenga una configuración mioinositol con Z1 o Z2 en posición 1 y representen, al menos un azúcar o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

En el contexto de la invención, se entiende por mioinositol la siguiente estructura con numeración indicada según las recomendaciones de la International Union of Biochemistry (1988).

15 Según un método de realización de la invención, los compuestos de la invención en los que A y X forman un enlace para conducir a un ciclo de 6 eslabones, pueden tener la fórmula (Ia)

35 en la que:

•: A representa –-CH -;

•: X representa un – CH2 -, -CH (OH) -, un átomo de oxígeno, un –NR3 – en el que R3 es un átomo de hidrógeno, un radical alquilo en C1 –C6 o un radical acilo en C1 –C20,

siendo entendido siempre y cuando

45 ! X =-CH (OH) -, ! Y = -OH, y ! Z1 y Z2 representen, independientemente el uno del otro, al menos un azúcar seleccionado del grupo

formado por manosa, glucosa y galactosa el ciclo de 6 miembros tenga una configuración mioinositol con Z1

o Z2 en posición 1 y representen,

al menos un azúcar o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

Un ejemplo de este método de realización puede ser un compuesto en el que A y X forman un enlace para conducir a un ciclo de 6 eslabones en el que 55

•: R1 y R2 representan, independientemente uno del otro, un radical acilo en C1 – C20;

•: Z1 representa un átomo de hidrógeno;

•: Z2 representa la manosa;

•: Q representa a – OP (O)2O -;

•: A representa –-CH -;

•: X representa un -CH (OH) -,

•: Y representa un radical hidroxilo;

•: El ciclo de 6 eslabones tiene una configuración mioinositol con Z1 o Z2 en posición 1

65 o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

Otro ejemplo de este método de realización puede ser un compuesto en el que A y X forman un enlace para conducir un ciclo de 6 eslabones, dicho compuesto puede ser un compuesto en el que

•: R1 y R2 representan, independientemente el uno del otro, un radical acilo en C1 – C20

•: Z1 representa la manosa;

•: Z2 representa un átomo de hidrógeno;

•: Q representa a – OP (O)2O -;

•: A representa –-CH -;

•: X representa un -CH (OH) -,

•: Y representa un radical hidroxilo;

•: El ciclo de 6 eslabones tiene una configuración mioinositol con Z1 en posición 1 • o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

Cuando A y X forman un enlace para conducir un ciclo de 6 eslabones, los compuestos de la invención pueden igualmente ser, por ejemplo, compuestos en los que:

•: R1 y R2 son aquellos definidos anteriormente;

•: Q representa a – OP (O)2O -;

•: A representa –-CH -;

•: X representa un -CH (OH) -,

•: Y representa un radical hidroxilo;

•: Z1 y Z2 representan, independientemente el uno del otro, al menos un azúcar seleccionado del grupo formado por manosa, glucosa y galactosa el ciclo de 6 miembros tiene una configuración mioinositol con Z1 o Z2 en posición 1 y representan,

al menos un azúcar o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

Siempre, en el caso donde A y X forman un enlace para conducir a un ciclo de 6 eslabones, los compuestos de la invención pueden aún ser, por ejemplo, compuestos en los que

•: R1 y R2, Z1 y Z2 Q e Y son aquellos definidos anteriormente;

•: Q representa a – OP (O)2O -;

•: A representa –-CH -;

•: X representa un –NR3 – en el que R3 es un átomo de hidrógeno, un radical alquilo en C1 – C6 o un radical acilo en C1 – C20,

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

Según otro método de realización de la invención, los compuestos de la invención pueden tener la fórmula (Ib)

en la que:

•: A representa –-CH2-;

•: X representa un átomo de hidrógeno o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

Se ha observado inesperadamente que los derivados sintéticos de los PIM según la invención permiten separar la propiedad de estos derivados para actuar como agonista de los receptores TLRs implicados en la respuesta inmunitaria y por lo tanto separar la actividad pro y antiinflamatoria de estos nuevos PIM.

Por una parte, los derivados de PIM según la invención tienen bajo peso molecular (aproximadamente 1.000). Están bien definidos molecularmente y su síntesis es más fácil que la de los PIM naturales. Por otra parte, no son citotóxicos.

5 Además, estos derivados poseen una actividad inmunomoduladora al menos comparable, preferiblemente mayor a la de los PIM naturales.

El término “alquilo” referido en la presente invención, es un radical de carbono lineal, ramificado o cíclico, saturado o insaturado, opcionalmente sustituido, que comprende de 1 a 20 átomos de carbono, por ejemplo de 1 a

10 15 átomos de carbono, por ejemplo de 1 a 6 átomos de carbono. Como dato orientativo, se pueden citar los radicales metilo, etilo, propilo, butilo, isobutilo, ventilo, hexilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecanilo, tridecanilo, tetradecanilo, pentadecanilo, hexadecanilo, heptadecanilo, octadecanilo, nonadecanilo, eicosanoilo y sus isómeros ramificados.

15 El término “acilo” referido en la presente invención, es un radical – COR´ en el que R´ es un radical alquilo tal y como se ha definido anteriormente. El grupo acilo puede igualmente significar grupo tuberculesteárico.

El término “ alcoxi” referido en la presente invención, es un radical -OR´ en el que R´ es un radical alquilo tal y como se ha definido anteriormente. 20

En el contexto de la presente invención, el término “sales farmacéuticamente aceptables” comprenden las sales preparadas con ácidos o bases no tóxicas, en función de los sustituyentes presentes en los compuestos. Cuando los compuestos de la invención poseen funciones ácidas, las sales correspondientes pueden obtenerse por adición de una base orgánica o inorgánica en el compuesto con una forma neutralizada en presencia eventualmente

25 de un disolvente en su forma preferente inerte. Pueden ser ejemplos de sales de adición, las sales de sodio, potasio, calcio, amonio, amino (orgánico) o magnesio. Cuando los compuestos de la invención poseen funciones básicas, las sales pueden obtenerse por adición de un ácido orgánico o inorgánico eventualmente en un disolvente en su forma preferente inerte. Pueden ser ejemplos de sales de adición de ácido inorgánico las sales derivadas de ácido clorhídrico, bromhídrico, nítrico, carbónico, monohidrógeno carbónico, fosfórico, monohidrógeno fosfórico,

30 dihidrógeno fosfórico, sulfúrico, monohidrógeno sulfúrico e iodhídrico. Pueden ser ejemplos de sales de adición de ácido orgánico, las sales derivadas de ácido acético, propiónico, isobutírico, maléico, malónico, benzóico, succínico, subérico, fumárico, láctico, mandélico, ftálico, bencensulfónico, p – tolilsulfónico, cítrico, tartárico, metansulfónico. Están también representadas por esta invención, las sales de aminoácidos como el arginato, y sales de ácidos orgánicos como los ácidos glucurónico o galacturónico.

35 Los compuestos de la fórmula general (I), (Ia) y (Ib) pueden estar en una forma racémica o enriquecida en un enantiómero o enriquecida en un estereoisómero.

Uno de los compuestos preferidos de la invención es el compuesto de la fórmula (Ia) que presenta la siguiente 40 estructura (isoPIM1 – C16C18):

60 La invención se refiere también al procedimiento para preparar compuestos según la invención como los definidos anteriormente, en el que:

a) se condensa un derivado di – O – acilado o di – O – alquilado del glicerol de la fórmula (III) 65

en la que 10 • G = OH o NH2

en la que 25

•: J = OH o NH,

•: K = P – Obn, P(O)n o C = O,

•: L = grupo saliente

30 b) el intermediario (IV) se condensa con un derivado de poliol o un aminopoliol de la fórmula general (V)

en la que

• G = OH o NH2, 50 • Z3 y Z4, representan independientemente el uno del otro, un hexopiranosa con configuración mano, glico

o galacto y llevan los grupos protectores de acetilo o metoxiacetilo o un grupo bencilo, siendo entendido siempre que al menos uno de los grupos Z3 y Z4 represente un azúcar protegido.

• R4 representa un grupo protector seleccionado del grupo que contiene un grupo bencilo o un radical

alcoxiacetilo en C1 – C6, 55

o se condensa el intermedio (IV) con un compuesto cíclico de la fórmula general (VI)

15 en la que

• G = OH o NH2,

• Y2 = H o un grupo – OR4 o un grupo – (CH2)n OR4 en el que R4 tienen las mismas definiciones que 20 anteriormente

• X2 = -CH2 , -CHOR 4, – NR3, u O en el que R3 es un átomo de hidrógeno, un radical alquilo en C1 – C6 o un radical acilo en C1 – C20 y R4 representa un grupo protector, como un grupo bencilo o un radical alcoxiacetilo en C1 – C6

25 eventualmente en presencia de un agente de acoplamiento;

c) eventualmente, se somete el compuesto obtenido de la etapa b) a una reacción de oxidación para dar un

45 en la que

•: J y J´ = OH o NH

•: M = P (O) OBn o C = O

• Z3 Z4, R1, R2, R4 tienen las mismas definiciones que anteriormente 50

o un compuesto de la fórmula general (VIII)

en la que

• J y J´ = OH o NH

• M = P (O) OBn o C = O 5 • X2 Y2, Z3, R1, R2 R4 tienen las mismas definiciones que anteriormente

d) se somete el producto de la fórmula general (VII) o de la fórmula general (VIII) a una desprotección en dos etapas que consiste primero en el tratamiento con una alquilamina seleccionada del grupo formado por t – butilamina para cortar selectivamente los grupos acetilos o metoxiacetilos para luego someter los productos desacilados a una hidrogenación catalítica para eliminar los grupos bencilos.

Como ejemplo de agente de fosfitilación, se pueden citar la clorobis (diisopropilamina) fosfina, la benciloxidiclorofosfina, la bis (benciloxi) – N, N – dietilaminofosfina y compuestos relacionados.

15 Como ejemplo de agente de fosforilación, se pueden citar el difenilclorofosfato, el dibencilo fosforocloridato, el xililenoclorofosfato y compuestos relacionados.

Como agente de carbonización, se pueden citar el carbonildiimidazol, el trifosgeno y los compuestos relacionados.

Por “grupo protector” se refiere a un grupo que permite la transformación de un grupo funcional en un grupo que será inerte en las condiciones de reacción seleccionadas para evitar las reacciones secundarias si se producen en la siguiente síntesis. Como tal se puede citar, por ejemplo, al grupo bencilo, al grupo t – butildimetilsililo, al grupo acetilo o al grupo metoxiacetilo.

25 Por “grupo saliente” se refiere a un grupo susceptible de ser sustituido por un reactivo nucleófilo como por ejemplo, los haluros o los tosilatos.

En el contexto de la presente invención, “agente de acoplamiento o agente de enlace” se refiere a un agente que permite la condensación de un derivado de ácido fosfórico o de un ácido carboxílico con un alcohol o un amino para formar los enlaces de ésteres o de amidas correspondientes. Como tal, se pueden citar por ejemplo, la diciclohexilcarbodiimida (DCC) y la N – etil N – dimetilamino – propilcarbodiimida (EDCI).

En un método de realización de la invención, los compuestos de la fórmula (I) en la que Q representa – OP (O) 35 2O, pueden igualmente prepararse según un procedimiento en el que:

a) se condensa un derivado di – O – acilado o di – O – alquilado del glicerol de la fórmula (IX)

en la que R1 y R2 tienen las mismas definiciones que anteriormente con un agente de fosfitilación para dar un intermediario de la fórmula (X)

en la que L = grupo saliente b) entonces se condensa al intermediario con un derivado de un poliol de la fórmula general (XI)

15 en la que

• R4 representa un grupo protector seleccionado del grupo que contiene un grupo bencilo o un radical alcoxiacetilo en C1 – C6,

o un compuesto cíclico de la fórmula general (XII) 25

en la que

• Y2 = H o un grupo – OR4 o un grupo – (CH2)n OR4 en el que R4 tiene la misma definición que

anteriormente y n puede tomar los valores de 1 a 3 45 • X2 = -CH2 , -CHOR 4, – NR3, u O en el que R3 y R4 tienen la misma definición que anteriormente

• en presencia de un agente de acoplamiento seleccionado del grupo formado por 1H – tetrazol

c) A continuación se somete el fosfito intermediario a una reacción de oxidación para dar un compuesto de la

65 en la que Z3 Z4, R1, R2 R4 tienen las mismas definiciones que anteriormente 15

o un compuesto de la fórmula general (XIV)

en la que X2 Y2, Z3, Z4, R1 R2 tienen las mismas definiciones que anteriormente d) A continuación se someten los compuestos (XIII) y (XIV) obtenidos en la etapa c) a una desprotección en dos etapas que consiste primero en el tratamiento con una alquilamina como la t – butilamina para cortar selectivamente los grupos acetilos o metoxiacetilos para luego someter los productos desacilados a una hidrogenación catalítica para eliminar los grupos bencilos.

Otro objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto según la invención tal y como se define anteriormente y cualquier excipiente farmacéuticamente aceptable.

La composición según la invención puede comprender, además, componentes muy conocidos por los expertos en el campo farmacéutico, como los agentes estabilizantes, agentes emulsionantes, agentes de tonicidad, agentes conservadores, colorantes, excipientes, aglutinantes y lubricantes particularmente.

La composición farmacéutica según la invención puede utilizarse para prevenir o tratar los trastornos o enfermedades inflamatorias o autoinmunes.

Otro objeto de la invención consiste en la utilización de una composición descrita anteriormente para la fabricación de un medicamento destinado a la prevención o al tratamiento de una enfermedad asociada a la sobreexpresión de citoquinas o de quimioquinas, particularmente de TNF y / o de la IL – 12 en un sujeto.

Por sujeto se refiere a un mamífero, preferiblemente un humano.

La enfermedad asociada a la sobreexpresión de citoquinas o quimioquinas, particularmente del TNF y / o de la IL – 12 comprende:

A) Las enfermedades inmunes o autoinmunes seleccionadas del grupo formado por la artritis reumatoide, la diabetes mellitas, el lupus eritematoso sistémico o la enfermedad de Basedow. B) El rechazo del injerto. C) Las infecciones virales y / o parasitarias. D) Los choques resultantes de una infección crónica o aguda de origen bacteriano, viral y / o parasitario. E) Las enfermedades inflamatorias seleccionadas del grupo formado por las enfermedades crónicas (sarcoidosis, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn) y las enfermedades inflamatorias vasculares (síndrome de desfibrinación, arteriosclerosis, enfermedad de Kawazaki). F) Enfermedades neurodegenerativas seleccionadas del grupo formado por las enfermedades desmielinizantes (esclerosis múltiple y mielitis transversa aguda), las enfermedades extrapiramidales y la cerebelosas (lesiones del sistema corticoespinal o los trastornos de los ganglios basales). G) Las patologías malignas que implican tumores secretores de TNF o que implican al TNF, seleccionadas del grupo formado por leucemia (aguda, mielocítica, linfocítica o mielodisplásica crónica), linfoma (de Hodgkin

o maligno (Burkitt)). H) Hepatitis inducida por alcohol.

La invención se refiere además a la utilización de un compuesto como el que se ha definido anteriormente para la fabricación de un medicamento destinado para la prevención o el tratamiento de una enfermedad asociada a la sobreexpresión de citoquinas o de quimioquinas, particularmente del TNF y / o de la IL – 12, dicha enfermedad comprende:

A) Las enfermedades inmunes o autoinmunes seleccionadas del grupo formado por la artritis reumatoide, la diabetes mellitas, el lupus eritematoso sistémico o la enfermedad de Basedow. B) El rechazo del injerto.

C) Las infecciones virales y / o parasitarias. D) Los choques resultantes de una infección crónica o aguda de origen bacteriano, viral y / o parasitario. E) Las enfermedades inflamatorias seleccionadas del grupo formado por las enfermedades inflamatorias y las enfermedades inflamatorias vasculares.

5 F) Enfermedades neurodegenerativas seleccionadas del grupo formado por las enfermedades desmielinizantes, las enfermedades extrapiramidales y la cerebelosas. G) Las patologías malignas que implican tumores secretores de TNF o que implican al TNF, seleccionadas del grupo formado por leucemia y linfoma. H) Hepatitis inducida por alcohol.

En su forma preferente, dicho medicamento se destina a la prevención o al tratamiento de una enfermedad inflamatoria en el sujeto.

Dicho medicamento puede administrarse por inyección (vía intravenosa, intramuscular, subcutánea,

15 intracutánea, etc), por vía nasal, oral, transdérmica o por inhalación. Dependiendo del modo de administración, dicho medicamento puede prepararse como soluciones, emulsiones, comprimidos, polvos, pomadas, lociones, geles, supositorios o aerosoles.

En dicho medicamento, la concentración del compuesto de la fórmula (I) o su sal farmacéuticamente aceptable no es limitante y está comprendida preferiblemente entre el 0,1 % y el 100 % (p / p) y más preferiblemente entre el 0,5 % y el 20 %.

Resultarán evidentes otras ventajas de la invención para los expertos en la disciplina con la lectura de los ejemplos descritos a continuación y por las figuras que los acompañan. 25

Breve descripción de las figuras

∀ La Figura 1 representa una estructura de PIM6 natural que comprende tres grupos acilos cuya cadena alquila es lineal y en C16 y un grupo acilo cuya cadena alquila está ramificada y en C19.

∀ -Las Figuras 2a, 2b y 2c representan el esquema sintético del compuesto del ejemplo 1 isoPIM1PIM1 – 2C16 (SFPIM91; Figura 2a), del compuesto del ejemplo 2 isoPIM1-C16C18 (SFPIM219; Figura 2b) y los compuestos de los ejemplos 3 y 4 PIM – 2 -mimNCOCF 3 (SFPIM324 – t4) y PIM – 2 – mimNH (SFPIM324 – t8) (Figura 2c).

∀ La Figura 3 representa la inhibición de la expresión de TNF por los macrófagos primarios estimulados con LPS en presencia de la forma “isómero” de PIM1 isoPIM1PIM1-2C16 (SFPIM91), si se compara con los PIM naturales 35 Ac2PIM6, y el PIM1 sintético (SFPIM135), valorados en 1,3 y 10 μg / mL. ∀ La Figura 4 representa la ausencia de citotoxicidad del isoPIM1PIM1-2C16 (SFPIM91), valorados en 1,3 y 10 μg / mL.

∀ La Figura 5 representa la inhibición de la expresión de la IL – 6 por los macrófagos primarios estimulados al LPS con o sin IFN – γ, en presencia del isoPIM1PIM1 – 2C16 (SFPIM91) si se compara con los PIM naturales Ac2PIM6 y Ac2PIM6 y el PIM1 sintético (SFPIM135) en 10 μg / mL.

∀ La Figura 6 representa la inhibición de la expresión de la IL – 12p40 por los macrófagos primarios estimulados con LPS en presencia del isoPIM1PIM1 – 2C16 (SFPIM91) si se compara con los PIM naturales Ac2PIM6 y Ac3PIM3 y el PIM1 sintético (SFPIM135) en 1 μg / mL. ∀ La Figura 7 representa la inhibición de la expresión de KC por los macrófagos estimulados con LPS en

45 presencia de PIM1 sintético (SFPIM135) y del isoPIM1PIM1 – 2C16 (SFPIM91) en 10 μg / mL. ∀ La Figura 8 representa la inhibición por el PIM1 sintético (SFPIM135) y del isoPIM1PIM1 – 2C16 (SFPIM91 de la respuesta de las vías respiratorias a una administración local de endotoxina. La abreviatura “AUC” significa área bajo la curva. ∀ La Figura 9 representa la inhibición por el PIM1 sintético (SFPIM135) y del isoPIM1PIM1 – 2C16 (SFPIM91) del reclutamiento de células inflamatorias, principalmente de neutrófilos en el espacio bronco alveolar en respuesta a la endotoxina. ∀ La Figura 10 representa la inhibición por el PIM1 sintético (SFPIM135) y del isoPIM1PIM1 – 2C16 (SFPIM91) de la secreción de quimioquina KC que participa en el reclutamiento de los neutrófilos en el lavado bronco alveolar en respuesta a la endotoxina.

55 ∀ La Figura 11 representa la inhibición por el PIM1 sintético (SFPIM135) y del isoPIM1PIM1 – 2C16 (SFPIM91) de la secreción de TNF en el lavado bronco alveolar en respuesta a la endotoxina. ∀ La Figura 12 representa la inhibición de la expresión de TNF por los macrófagos primarios estimulados con LPS en presencia de la forma “isómero” de PIM1isoPIM1 –C16C18 (SFPIM219) valorado en 1,3 y 10 μg / mL. ∀ La Figura 13 representa la ausencia de citotoxicidad del isoPIM1 –C16C18 (SFPIM219) valorado en 1,3 y 10 μg / mL. ∀ La Figura 14 representa la inhibición de la expresión de la IL – 12p40 por los macrófagos primarios estimulados con LPS en presencia de la forma “isómero” de PIM1isoPIM1 –C16C18 (SFPIM219) valorado en 1,3 y 10 μg / mL. ∀ La Figura 15 representa la inhibición de la expresión de TNF por los macrófagos primarios estimulados con LPS en presencia de PIM1 sintético (SFPIM135), isoPIM1 –C16C18 (SFPIM219) y los compuestos PIM – 2

65 mimNCOCF 3 (SFPIM324 – t2) y PIM – 2 – mimNH (SFPIM324 – t8), valorados en 1,3, 10 y 30 μg / mL.

∀ La Figura 16 representa la viabilidad de los macrófagos primarios estimulados con LPS en presencia de PIM1

sintético (SFPIM135), isoPIM1 –C16C18 (SFPIM219) y los compuestos PIM – 2 -mimNCOCF 3 (SFPIM324 – t2)

y PIM – 2 – mimNH (SFPIM324 – t8), valorados en 1,3, 10 y 30 μg / mL. ∀ La Figura 17 representa la inhibición de la expresión de la IL – 12p40 por los macrófagos primarios estimulados

con LPS en presencia de PIM1 sintético (SFPIM135), isoPIM1 –C16C18 (SFPIM219) y los compuestos PIM – 2 –

mimNCOCF 3 (SFPIM324 – t2) y PIM – 2 – mimNH (SFPIM324 – t8), valorados en 1,3, 10 y 30 μg / mL.

EJEMPLOS

Disolventes y reactivos

El diclorometano (CH2CL2) y el tolueno se destilan en atmósfera de argón en CaH2, el tetrahidrofurano (THF) se destila en atmósfera de argón en sodio y benzofenoma. El dietiléter se destila en atmósfera de argón en CaH2 y se conserva entre 0 – 4 ºC en argón en tamices moleculares 4Å. Los otros disolventes utilizados proceden del fabricante Carlo – Erba.

Resonancia Magnética Nuclear (RMN)

Se llevan a cabo los espectros 1H y 13C en un dispositivo Bruker DPX250 o en un dispositivo Bruker AV400. Los desplazamientos químicos (δ) de los espectros RMN 1H se calibran según el testigo tetrametilsilano (TMS) por un valor de δ 0,00 ppm. Los δ de los espectros RMN 13C se calibran en el valor de referencia del disolvente tal y como se describe en Gottlieb et al, J. Org. Chem., 1997, 62, 7512. Los espectros 31P se realizan en un dispositivo Bruker AV400 y se calibran según una referencia externa que contiene un 80 % de ácido fosfórico (H3PO4) (δ = 0,00 ppm). Los espectros 19F se registran en un dispositivo Bruker AV400 equipado con una sonda multinuclear automática y se calibran según una referencia externa que contienen BF3 eterato (δ = 0,00 ppm). Se realizaron las mediciones a 25º C en tubos de 5 mm de diámetro. Los espectros se realizan en disolventes deuterados del fabricante Aldrich o SDS.

Cromatografía

Las cromatografías en capa fina (CCF) se realizan en placas de aluminio “ TLC Silica gen 60F254” de Merck. Los compuestos se describen en una lámpara de UV y / o se mojan en un revelador de ácido fosfomolíbdico en ácido sulfúrico y etanol tras un calentamiento con una pistola térmica. Las cromatografías en columna se realizan en gel de sílice (Silica gel 60 (40 – 63 μm) de Merck.

Espectrometría de masas

Masa ESI: Se analizaron las muestras en un espectrómetro Perkin Elmer Sciex API 300 en disolventes de calidad “para análisis”. Masa de alta resolución: Se analizaron las muestras en el centro de medidas físicas de la Universidad Blaise Pascal en Aubière.

EJEMPLO 1:

1) Síntesis del isoPIM1 – 2C16 (SFPIM91):

Dimetilacetal del L – alcanfor (compuesto 2, Figura 2a)

SFPIM – 97

Preparación según Lindberg et al. Tetrahedron, 2002, 58, 1387 – 1398 [24]. El ácido sulfúrico H2SO4 (194 μL) se añadió a una solución de L – alcanfor comercial (> 95 % Fluka) (20 g, 0,131 mol) en una mezcla de trimetil ortoformiato (95 mL, 0,908 mol, 6,9 eq) y metanol (20 mL). Tras 48 h de agitación, la mezcla se neutralizó por la adición de metóxido de sodio (NaOMe) (400 mg) y se evaporaron los disolventes. Se recogió el residuo por destilación al vacío (25 mbar) a 125 ºC para dar lugar al compuesto 2 (21 g, 81 %) en forma de líquido incoloro. Espectro de 1H RMN conforme.

1, 2 –O – (L –1, 7, 7 –trimetilbiciclo [2, 2, 1] hept – 6 – ilideno) – D – mioinositol (compuesto 3, Figura 2a)

SFPIM – 10

Preparación según Lindberg et al. Tetrahedron, 2002, 58, 1387 – 1398 [24]. El ácido sulfúrico H2SO4 (173 μl) se añadió a una solución del compuesto 2 (8,06 g, 0,041 mol, 2,4 eq) y a mioinositol comercial > 99 % (Aldrich) (3,1 g, 0,0017 mol) en dimetil sulfóxido (DMSO) (34 ml). La mezcla resultante se agitó 3 h a 75 ºC, después se neutralizó por adición de Et3N (1 mL) y se concentró al vacío a 80 ºC. Se añadieron al residuo del DMSO (3 ml), cloroformo (CHCL3) (52 ml), metanol (MeOH) (3,2 ml), agua (H2O) (1 ml) y ácido p – toluensulfónico (APTS) (11, 6 mg). La

mezcla de reacción se agitó durante 18 h, después se neutralizó por la adición de Et3N (0,4 ml). El precipitado así formado se filtró mediante vidrio sinterizado y se lavó con CHCl3 (2 x 40 ml). El producto bruto se volvió a cristalizar en metanol (MeOH) (que contiene 0,1 % Et3N ) para dar el compuesto 3 (1,738 g, 32 %) en forma de sólido blanco. Conforme al espectro de 1H RMN.

3, 4, 5, 6 –4 – O – bencil – 1, 2, -O – (L – 1, 7, 7 – trimetilbiciclo [2, 2, 1] hept – 6 – ilideno– D – mioinositol (compuesto 4, Figura 2a)

SFPIM – 72

Se añadió el hidruro de sodio (NaH) (1,16 g, 0,048 mol, 12 eq, 60 % en dispersión en aceite mineral) en atmósfera de argón a una solución previamente enfriada a 0 ºC del compuesto 3 (1,266 g, 4,02 mmol) en DFM anhidro (30 ml). Tras 15 min de agitación a 0 ºC, el bromuro de bencilo (2,9 ml, 0,024 mmol, 6 eq) se añadió gota a gota, luego, la mezcla de reacción se agitó 24 h a temperatura ambiente (aproximadamente a 20 ºC). A continuación se enfrió a 0 ºC, luego, el exceso de NaH se destruyó por adición de MeOH (3 ml) y el medio se diluyó con tolueno (250 ml). La fase orgánica se lavó con agua (100 ml), después con una solución de NaCL saturada (3 x 100 ml), más tarde se secó en MgSO4. Se evaporaron los disolventes y una purificación por cromatografía en columna en gel de sílice (hexano / éter dietílico 8 / 1) dando lugar al compuesto 4 (2,15 g, 80 %) en forma de jarabe incoloro. C44H50O6 (M = 674,89 g / mol). RMN1H (400 Mhz, CDL3) δ 0,86 (s, 3H, CH3), 0,87 (s, 3H, CH3), 1,09 (s, 3H, CH3), 1,22 – 1,33 (m, 3H), 1,34 – 1,45 (b, 1H), 1,47 (s, 0,5H), 1,50 (s, 0,5H), 1,68 – 1,76 (m, 2H), 1,9 – 2,02 (m, 2H), 3,44 (dd, 1H, H5, J5-6 = 8,2 Hz, J4 – 5 = 9,6 Hz), 3,74 (dd, 1H, H4, J4 – 3 = 7,2 Hz), 3,77 (t, 1H, H1, J1 – 2 = 4,2 Hz), 3,84 (dd, 1H, H6, J1-6 = 8,4 Hz), 3,96 (dd, 1H, H3, J2-3 = 6,2 Hz), 3,44 (dd, 1H, H5, J5-6 = 8,2 Hz, J4 – 5 = 9,6 Hz), 4,30 (dd, 1H, H2), 7,20 – 7,45 (m, 20H, 4Ph). RMN13C (100 MHz, CDL3) δ 10,27 (CH3), 20,52 (CH3), 20,75 (CH3), 27,76 (CH2), 29,89 (CH2), 45,08 (CH2), 45,31 (CH), 48,08 (Cq), 51,67 (Cq), 72,55 (CH2, CH2Ph), 73,19 (CH, C2), 74,00 (CH2, CH2Ph), 75,08 (CH2, CH2Ph), 75,25 (CH2, CH2Ph), 76,32 (CH, C3), 77,50 (CH, C1), 80,86 (CH, C6), 82,22 (CH, C5), 83,31 (CH, C4), 117,77 (Cq), 127,55

– 128,44 (CH, Ph), 138,55 – 138, 89 (Cq, Ph, 4 líneas). SM – IS: M calculada 674,36; encontrada: 675,5 [M + H]+, 692,5 [M + NH4]+, 697,5 [M + Na]+, 713,5 [M + K]+.

3,4,5,6 – 4 – O – bencil– D – mioinositol (compuesto 5, Figura 2a)

SFPIM – 17

El compuesto 4 (1,53 g, 2,26 mmol) se suspendió en una solución acuosa de ácido acético al 80 % (75 ml) y el medio se agitó a 100 ºC durante 4 h. Se evaporaron los diisolventes al vacío para luego coevaporarlos con tolueno. Se purificó el residuo por cromatografía en columna en gel de sílice (tolueno / acetona 35 / 1 con un gradiente hasta 10 / 1) para dar lugar al compuesto 5 (1,029 g, 84 %) en forma de sólido blanco. C34H36O6 (M = 540,66 g / mol). RMN1H (400 MHz, CDL3) δ 2,53 (d, 1H, OH – 1, J1-OH = 4,8 Hz), 2,64 (s, 1H, OH – 2), 3,42 – 3,51 (m, 3H, H3, H1, H5), 3,83 (dd, 1H, H6, J6-5 = 9,6 Hz, J1-6 = 9,6 Hz), 3,97 (dd, 1H, H4, J3-4 = 9,6 Hz, J4-5 = 9,6 Hz), 4,17 (dd, 1H, H2, J2-3 = 2,8 Hz, J2-1 = 2,8 Hz), 4,65 – 4,96 (m, 8H, 4 CH2Ph), 7,25 – 7,4 (m, 20 H, 4 x 5 CHAr). RMN13C (100 MHz, CDL3) δ 69,33 (CH, C2), 71,87 (CH, C1), 72,84 (CH2, CH2Ph), 75,71 (CH2, CH2Ph), 75,82 (CH2, CH2Ph), 76,07 (CH2, CH2Ph), 80,11 (CH, C3), 81,45 (CH, C6), 81,74 (CH, C4), 83,33 (CH, C5), 127,73 – 128,67 (CH, Ph, 9 líneas), 137,89 (Cq, Ph), 138,62 (2Cq, Ph), 138,73 (Cq, Ph). MS – IS: M calculada 540,25; encontrada: 541,5 [M + H]+, 558,5 [M + NH4]+, 563,5 [M + Na]+, 579,5 [M + K]+.

3, 4, 5, 6 – 4 – O – bencil – 1 – O – metoxibencil – D – mioinositol (compuesto 6, Figura 2a)

SFPIM104

Se calentó una suspensión del compuesto 5 (301 mg, 0,557 mmol) y de óxido de dibutilestaño (193 mg, 0,557 mmol, 1eq.) en tolueno (5 ml) durante 18 h a 140 ºC en atmósfera de argón utilizando una trampa de Dean Stark para recuperar el agua formada. El medio se concentró al vacío y el residuo se disolvió en DMF anhidro con fluoruro de cesio (CsF) (172 mg, 1,11 mmol) y cloruro de 4 – metoxibencilo (76 μl, 0,557 mmol, 1 eq). La reacción se agitó durante 7 h y media y, a continuación, se evaporaron los disolventes a sequedad para dejar un residuo sólido blanco que se disolvió parcialmente en acetato de etilo (20 ml). El sólido residual se retiró a través de filtros de vidrio sinterizado y el filtrado se evaporó a sequedad. El residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (éter de petróleo / acetato de etilo 7 / 3) para dar lugar al compuesto 6 (262 mg, 71 %) en forma de sólido blanco. C42H44O7 (M = 660,81 g / mol). RMN 1H (499 MHz, CDCL3) δ 2,43 (s, 1H, OH), 3,27 y 3,28 (2 dd, 2H, H1 y H3, J1-6 = J 3-4 = 9,6 Hz, J1-2 = J2-3 = 2,8 Hz), 3,69 (s, 3H, CH3), 3,89 y 3,91 (2 dd, 2H, H4 y H6), 4,09 (dd, 1H, H2, J2-3 = J2-1 = 2,8 Hz), 4,53 (s, 2H, CH2Ph), 4,61 (s, 2H, CH2Ph), 4,72 – 4,83 (m, 63 H, 3 x CH2Ph), 6,74 y 6,76 (2s, 2H, CHAr PMB), 7,17 – 7,3 (m, 23H, CHAr). RMN 13C (100 MHz, CDCL3) δ 55,3 (CH3), 67,59 (CH, C2), 72,44 (CH2), 72,76 (CH2), 75,95 (CH2), 75,98 (2 x CH2), 79,55 y 79,86 (2 CH, C1 y C3), 81,27 y 81,29 (2 CH, C4 y C6), 83,26 (CH, C5), 127,61 – 129,59 (CHAr, 8 líneas), 130,10 (Cq), 138,05 (Cq), 138,77 (Cq), 138,83 (Cq), 138,88 (Cq), 159,42 (Cq).

3, 4, 5, 6 – 4 –O – bencil – 1 – O – (2, 3, 4, 6 –4 –acetil –α – D –manopiranosil) –D –mioinositol (compuesto 7, Figura 2a)

SFPIM63

Se canuló una solución del compuesto 6 (457 mg, 0,69 mmol, 1 eq) en CH2Cl2 (10 ml) en atmósfera de argón en una solución del compuesto 1 (845 mg, 2,08 mmol, 3 eq) en CH2CL2 (10 ml). La mezcla reactiva se agitó enpresencia de tamices moleculares 4Å durante 20 min y, a continuación, se enfrió a -20 ºC. Se añadió triflato de plata (1,066 g, 4,15 mmol, 6 eq) y se agitó el medio reactivo durante 1 h hasta que la temperatura aumentó a 20 ºC. La reacción se neutralizó añadiendo trietilamina (1 ml), y, a continuación, se diluyó con CH2Cl2. La fase orgánica se lavó con una solución saturada de NaHCO3 (30 ml), seguida de NaCl (30 ml) y se secó en MgSO4. El disolvente se evaporó al vacío y el residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (éter de petróleo / acetato de etilo 3 / 1) para dar lugar al compuesto 7 (309 mg, 21 %). C48H54O15 (M = 870,96 g / mol). RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,38 – 7,20 (m, 20H, CHAr), 5,43 (dd, 1H, H3', J3'-2' = 2,6 Hz, J3'-4' = 10 Hz), 5,34 (dd, 1H, H2', J2'-1' = 1Hz), 5,27 (dd, 1H, H4', J4'-5' = 10 Hz), 5,07 (d, 1H, H1', J1-2' = 1 Hz), 4,86 (s, 4H, 2 CHB2Ph), 4,85, (d, 1H, CH2Ph, J = 10,8 Hz), 4,80 (d, 1H, CH2Ph, J = 10,8 Hz), 4,75 (d, 1H, CH2Ph, J = 11,2 Hz), 4,68 (d, 1H, CH2Ph, J = 11,2 Hz), 4,29 (m, 3H, H2, H5', H6A'), 4,03 (m, 2H, H6B', H4 o H6), 3,95 (dd, 1H, J5-4 = J5-6 = 9,6 Hz), 3,54 (dd, 1H, H1 o H3, J = 2,8 y 10 Hz), 3,45 (dd, 1H, H4 o H6), 3,43 (dd, 1H, H3 o H1), 2,08 (s, 3H, CH3Ac), 2,06 (s, 3H, CH3Ac), 2,03 (s, 3H, CH3Ac), 2,00 (s, 3H, CH3Ac). RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ 170,74, 169,94, 169,91, 169,72, 138,68, 138,64, 138,33, 137,87, 128,65 – 127,75, 99,85 (C1'), 83,12, 81,27, 81,07, 80,42, 80,13, 76,28, 76,07, 76,01, 73,15, 69,64 (C2'), 69,54 (C5'), 69,20 (C3'), 68,92 (C2), 66,65 (C4'), 63,16 (c6'), 20,86, 20,78. MS – IS: M calculada 870,65; encontrada 888,5 [M + NH4]+, 893,5 [M + Na]+, 909,0 [M + K]+.

1, 2 – dipalmitoil – 3 – O – bencil – sn – glicerol (compuesto 8, Figura 2a)

SFPIM77

Se añadieron el clorhidrato de carbodiimida (EDC) (dimetilamino – propil) (847 mg, 4,42 mmol, 3 eq) y la DMAP (54 mg, 0,44 mmol, 0,3 eq) a una solución de 3 – O – bencil – sn – glicerol (268 mg, 1,47 mmol, 1 eq) y de ácido palmítico (943 mg, 3,68 mmol, 2,5 eq) en atmósfera de argón en CH2Cl2 anhidro (20 ml). La mezcla reactiva se agitó durante 18 h a temperatura ambiente (aproximadamente 20 ºC) y, a continuación, se diluyó con CH2Cl2 (100 ml). La fase orgánica se lavó con una solución de HCl 1N (50 ml), agua (50 ml) y, a continuación, con una solución de NaCl saturada (50 ml) y se secó en MgSO4. El disolvente se evaporó al vacío y el residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (éter de petróleo / acetato de etilo 6 / 1) para dar lugar al compuesto 8 (909 mg, 93 %) en forma de sólido blanco. C42H74O5 (M = 659,06 g / mol). RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 0,88 (t, 3H, CH3), 1,25 (b, 48H, 24 CH2), 1,59 (b, 4H, 2 x 2H3''), 2,28 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 2,32 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 3,59 (d, 2H, 2H3a), 4,19 (dd, 1H, H1aA, J1aA-1aB = 12 Hz, J1A-2a = 6,4 Hz), 4,35 (dd, 1H, H1aB, J1aB-2a = 3,6 H), 4,53 (AB, 2H, CH2Ph, J = 12,2 Hz), 5,24 (m, 1H, H2a), 7,32 (m, 5H, CHAr). MS – IS: M calculada 658,55; encontrada: 660,0 [M + H] +, 677,0 [M + NH4]+, 682,0 [M + Na]+.

1, 2 – O – Dipalmitoil – sn – glicerol (compuesto 9, Figura 2a)

SFPIM82

El compuesto 8 (890 mg, 1,35 mmol) se disolvió en una mezcla de CH2Cl2 / EtOH (1 / 1,5, 25 ml). Se añadió un exceso de paladio en carbono (Pd / C 10 %) y la reacción se agitó durante 4 h a temperatura ambiente (aproximadamente 20 ºC) en atmósfera de hidrógeno (balón). La mezcla reactiva se calentó a 40 ºC para conseguir una mejor disolución del producto esperado y, a continuación, se retiró el catalizador mediante la filtración con una membrana millipore. El sólido se aclaró 3 veces con 20 ml de mezcla de CH2Cl2 / EtOH (1 / 1) previamente calentada a 4 ºC. Los disolventes residuales se evaporaron al vacío para dar lugar al compuesto esperado 9 (757 mg, 99 %) en forma de sólido blanco. C35H68O5 (M = 568,93 g / mol). RMN 1H (250 MHz, CDCl3) δ 0,88 (t, 6H, 2 CH3, J = 6,8 Hz), 1,26 (m, 48H, 24 CH2), 1,62 (m, 4H, 2H3''), 1,99 (t, 1H, OH, J= 6,5 Hz), 2,32 (t, 2H, J = 7,7 Hz), 2,35 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 3,73 (dd, 2H, 2H3a, J = 5 y 6,2 Hz), 4,23 (dd, 1H, H1aA, J1aA-1aB = 12 Hz, J1A-2a = 5,5 Hz), 4,35 (dd, 1H, H1aB, J1aB-2a = 4,5 Hz), 5,08 (m, 1H, H2a). MS – IS: M calculada 568,51; encontrada: 570,0 [M + H]+, 587,0 [M + NH4]+, 592,0 [M + Na]+.

(S) – 2, 3 – Dipalmitoiloxipropilbencil (N, N – diisopropilamino) fosforamidita (compuesto 11, Figura 2a)

SFPIM83

El compuesto 9 (200 mg, 0,352 mmol), previamente secado durante 18 h al vacío en P2O5, se disolvió en CH2Cl2 anhidro (15ml) y se le añadió una solución de bis(N, N – diisopropilamino) bencilfosfina (0,84 M, 938 μl,

0,788 mmol, 2,24 eq) (compuesto 10). La mezcla reactiva se enfrió a 0 ºC y se le añadió 1H – tetrazol sólido (32 mg, 0,458 mmol, 1,3 eq). Tras 1 h y media de agitación, el disolvente se evaporó al vacío y el residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (éter de petróleo / acetato de etileno 9 / 1 con 3 % de Et3N) para dar lugar al compuesto 11 (259mg, 92 %) en forma de jarabe incoloro. C48H88NO6P (M = 806,21 g / mol). RMN 1H (250 Mhz, CDCl3) δ 0,88 (app t, 6 H, 2CH3), 1,16 – 1,30 (m, 60H, 24 CH2, 4 x CH3 isopropil), 1,60 (m, 4H, 2CH2),, 2,29 (t, 4H, 2CH2, J = 7,5 Hz), 3,55 – 3,85 (m, 4H, 2CH isopropil, 2H3a), 4,17 (ddd, 1H, H1aB, J1aB-1aA = 12 Hz, J1aB-2a = 6,3 Hz, J1aB-P = 3 Hz), 4,34 (ddd, 1H, H1aA, J1aA-2a = J1aA-P = 4,5 Hz), 4,71 (m, 2H, C2Ph), 5,19 (m, 1H, H2a), 7,2 – 7,4 (m, 5H, 5CHAr).

3, 4,5, 6 –4 –O –bencil –1 –O –(2, 3, 4, 6 –4–O–acetil –α –D –manopiranosil) –2 –O –[((S) –2,3 – dipalmitoiloxipropil) (bencil) fosforil] – D – mioinositol (compuesto 12, Figura 2a)

SFPIM87

El compuesto 11 (259 mg, 0,321 mmol, 2,8 eq) y el compuesto 7 (100 mg, 0,115 mmol) se coevaporaron juntos con tolueno anhidro (2 x 10 ml) y, a continuación, se secaron durante 30 min al vacío de alto grado antes de ser disueltos, en atmósfera de argón, en CH2Cl2 anhidro (12 ml). Se añadió 1H – tetrazol sólido (26 mg, 0,386 mmol, 3,2 eq) a 0 ºC y, tras 1 h y media de agitación a temperatura ambiente, la mezcla reactiva se enfrió a -40 ºC. Se añadió gota a gota una solución de ácido metacloroperbenzóico (m – CPBA) (50 %, 79 mg, 0,230 mmol, 2 eq) en CH2Cl2 anhidro. Tras las 2 horas de agitación que permitieron al medio reactivo alcanzar la temperatura ambiente (aproximadamente 20 ºC), la reacción se detuvo añadiendo una solución acuosa al 10 % de Na2S2O3 (65 ml) y la mezcla se extrajo con dietil éter (Et2O) (130 ml). La fase orgánica se lavó con una solución acuosa al 5 % de NAHCO3 (3 x 65 ml) y, a continuación, se secó en MgSO4. El disolvente se evaporó al vacío y el residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (éter de petróleo / acetato de etilo 4 / 1) para dar una parte del primer p – estereoisómero del compuesto 12 (42 mg), una parte de la mezcla de isómeros (23 mg) y una parte del segundo isómero del compuesto 12 (38 mg) (rendimiento global 56 %). C90H127O22P (M = 1591,88 g / mol). RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ 173, 36, 172,97, 170,72, 170,15, 169,89, 169,53, 138,36, 138,33, 137,90, 137,30, 136,00 (d), 135,67 (d), 128,82 – 172,08, 83,22, 81,12, 80,89, 78,75 (d), 76,11, 76,07, 76,01, 75,91, 72,99, 69,90, 69,82, 69,39, 69,33, 69,16, 67,45, 67,39, 65,91, 65,43, 62,89, 62,28, 34,33, 34,16, 32,06, 29,84, 29,79, 29,65, 29,50, 29,46, 29,28, 29,27, 24,98, 22,82, 20,96, 20,83, 20,74, 14,25.

3, 4, 5, 6 – 4 – O – bencil – 1 – O – α – D – manopiranosil – 2 – O – [((S) – 2, 3 – dipalmotoiloxipropil) (bencil) fosforil] – D – mioinositol (compuesto 13, Figura 2a)

SFPIM90

Se añadió una solución de hidróxido de sodio 0,1 M preparada recientemente (1 ml, 0,1 mmol, 4eq) a una solución del compuesto 12 (40 mg, 0,025 mmol) en tetrahidrofurano (THF) (3 ml). La mezcla reactiva se agitó durante 4 h a temperatura ambiente y, a continuación, se diluyó con CH2Cl2 (10 ml). La fase orgánica se lavó con H2O y, a continuación, se secó en MgSO4. El disolvente se evaporó para dar lugar al compuesto esperado 13 (36 mg, 100 %). Los espectros RMN del producto bruto indican la presencia de aproximadamente un 30 % de producto aun acetilado.

1 – O – α – D – manopiranosil – 2 – O – [((S) – 2, 3 – dipalmitoiloxipropil) fosforil] – D – mioinositol (compuesto 14, Figura 2a)

SFPIM91

El compuesto 13 (36 mg, 0,025 mmol) obtenido anteriormente se disolvió en una mezcla de CH2Cl2 / EtOH / ácido acétido (4 / 5 / 0,5 ml). Se añadió un exceso de paladio en carbono (Pd / C 10 %) y la reacción se agitó durante 6 h a temperatura ambiente (aproximadamente 20 ºC) en atmósfera de hidrógeno (balón). El catalizador se retiró por filtración mediante una membrana millipore y se aclaró 3 veces con 20 ml de mezcla de CH2Cl2 / EtOH (1 / 1). Los disolventes residuales se evaporaron al vacío y se coevaporaron con tolueno para dar lugar al compuesto 14 (25 mg, 100 %) en forma de sólido blanco.

2) Preparación de cultivos primarios de macrófagos:

Se obtuvieron células múridas de médula ósea del fémur de ratones salvajes. Las células obtenidas se cultivaron (106 / ml) durante 7 días en un medio DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco) complementado con 20 % de suero equino y 30 % de medio celular condicionado L929 [22]. Transcurridos tres días de la renovación del medio, la preparación celular comprendía una población homogénea de macrófagos.

3) Estimulación de los macrófagos de ratones salvajes mediante LPS en presencia y en ausencia de isómero de PIM isoPIM1 –2C16 (SFPIM91)

Se cultivaron los macrófagos derivados de la médula ósea de ratones salvajes en placas de cultivo de 96 pocillos de 105 células por pocillo y, a continuación, se estimularon con LPS (100 ng / ml, Escherichia. Coli, serotipo O111 : B4, SIGMA) con o sin PIM análogo (1 – 10 μg / ml). Todas las preparaciones de PIM análogo liofilizadas empleadas son solubilizadas en DMSO y adicionadas a los cultivos a una concentración final máxima no citotóxica de 1 %.

Tras una estimulación de 24 horas, los sobrenadantes de cultivo fueron colectados y analizados en cuanto a su contenido en citoquina TFN – α, IL – 6, IL – 12p40 y KC mediante ELISA (DUOSET R&D) y en cuanto a su contenido en nitrito mediante la prueba de Griess.

Los resultados mostraron que la forma “isomérica” de PIM1 isoPIM1 –2C16 (SFPIM91) inhibió fuertemente la síntesis de TFN – α inducidos en los macrófagos estimulados con LPS, en comparación con los PIM naturales Ac2PIM6 y Ac2PIM6, y el PIM1 sintético (SFPIM135) (Figura 3). Se obtuvieron resultados similares para el NO. Un test de citotoxicidad MTT en los mismos macrófagos en presencia de diferentes partes de PIM permitió demostrar la ausencia de citotoxicidad de las diferentes preparaciones para las células (Figura 4). La expresión de IL – 6 mediante macrófagos estimulados con LPS en presencia o ausencia de interferón – у también se inhibió (Figura 5). La secreción de IL – 12p40 en respuesta a LPS ya se había inhibido fuertemente en concentraciones de 1 ug / ml de PIM o de IsoPIM (Figura 6). Del mismo modo, la producción de quimioquina KC, implicada en el reclutamiento de células inflamatorias como los neutrófilos, también se redujo fuertemente en presencia de PIM1 (SFPIM135) o más fuertemente de isoPIM1 –2C16 (SFPIM91) (Figura 7).

En la medida en la que las preparaciones de PIM2 y de PIM6 fueron identificadas inicialmente como estimulantes de la secreción de TFN y de IL – 12p40 por cultivos primarios de macrófagos, las preparaciones de isoméro de PIM se probaron por su capacidad para inducir una respuesta pro-inflamatoria a concentraciones de hasta 20 μg / ml. Los resultados obtenidos por las preparaciones de isómero de PIM no mostraron estimulación alguna de la respuesta inflamatoria (TNF – α e IL – 12p40) de los cultivos primarios de macrófagos.

4) Actividad antiinflamatoria in vivo de los derivados sintéticos de PIM

Modelo in vivo de dificultad respiratoria

Los ratones C57BL / 6 recibieron el vehículo solo (solución salina con 1,25 % DMSO) o LPS (1 μg por ratón) de Escherichia coli (serotipo O111 : B4; Sigma, St Louis, MO, USA) en ausencia o en presencia de PIM1 (SFPIM135) o de isoPIM1 –2C16 (SFPIM91) (50 μg / ratón), aplicados por instilación nasal en un volumen de 40 μl con anestesia ligera de ketamina y xilacina.

La resistencia de las vías respiratorias se evaluó por pletismografía no invasiva en un período de 3 horas tras la aplicación de LPS. Se dispusieron ratones en vigilia en cámaras de pletismografía (EMKA Technologies, París, Francia). Se registró el aumento de la pausa respiratoria (Penh) como medida de las molestias respiratorias y se analizó utilizando el programa “Datanalyst Software” (EMKA Technologies, París, Francia) y se expresó en media aproximada de SEM de Penh de n = 2 – 3 ratones individuales por grupo [23].

Lavado bronco alveolar (BAL)

El fluido BAL se recolectó canulando la tráquea y lavando los pulmones cuatro veces con 0,5 ml de PBS frío. Tras la centrifugación a 400 xg durante 10 min a 4 ºC, el sobrenadante del primer lavado se conservó a -70 ºC para el posterior análisis de las citoquinas. Se contaron los pools de pellet celulares con azul de Tripano (Sigma) en una célula hematocitométrica. Para el conteo diferencial, las células se marcaron con Diff – Quik Staining (Merz & Dade AG., Dudingen, Switzerland). Se contaron 200 células.

Determinación de las citoquinas

Las concentraciones de TFN y de KC se evaluaron mediante ensayos por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) según las directrices del fabricante (R&D Duoset, Minneapolis, MO).

Resultados

El TNF es esencial para la disfunción respiratoria aguda inducida por el LPS como se mostró en los ratones con deficiencias de TFN [23]. Para determinar su actividad potencial in vivo, el PIM1 (SFPIM135) y el isoPIM1-2C16 (SFPIM91) se probaron por su actividad inhibidora en un modelo múrido de inflamación pulmonar aguda y deficiencia respiratoria inducidas mediante la aplicación intranasal de LPS (1 μg / ratón).

A los ratones C57BL / 6 se les administró por vía intranasal 1 μg de LPS y se registró Penh durante 200 min utilizando la pletismografía no invasiva. El gráfico de la Figura 11 representa el área bajo la curva (de 70 a 175 min). Los valores que representan la media aproximada de SEM de n = 2 – 3 ratones por grupo.

Típicamente, los ratones que recibieron una aplicación intranasal de LPS desarrollaron un aumento agudo de Penh (crecimiento de la pausa respiratoria o enhanced respiratory pause), medida de la disfunción respiratoria, que comenzó 90 min después de la aplicación de LPS (Figura 8).

La adición de PIM1 (SFPIM135) causa la reducción parcial del crecimiento de Penh inducido por el LPS. Esta inhibición resulta más pronunciada tras la adición de isoPIM1-2C16 (SFPIM91) (Figura 8).

El LPS provoca el reclutamiento de las células inflamatorias en las vías respiratorias, medida en número total de células en el fluido bronco alveolar (BAL) de los ratones tratados con LPS. En este caso, el número de células inflamatorias detectado en BAL tras 18 min de la aplicación de LPS, se redujo parcialmente en presencia de isoPIM12C16 (SFPIM91), y menos en presencia de PIM1 (SFPIM135) (Figura 9). Los neutrófilos constituyen la mayor parte de las células inflamatorias reclutadas tras la exposición a LPS. Los macrófagos son esencialmente invariables. En esta primera experiencia, se observó una reducción del número de neutrófilos de hasta el 50 % o el 70 % en 2 de cada 3 ratones que habían recibido el PIM1 (SFPIM135) o el isoPIM1-2C16 (SFPIM91), respectivamente.

El reclutamiento de los neutrófilos depende de diferentes factores, entre ellos la quimioquina KC, incluso si no depende de manera crítica del TNF [23]. En la Figura 10, los ratones tratados se sacrificaron 24 horas después de la aplicación intranasal de 1 μg de LPS y el fluido bronco alveolar se analizó para determinar el contenido de quimioquina KC. La secreción de KC en el espacio bronco alveolar disminuyó fuertemente debido a la administración de PIM1 (SFPIM135) o de isoPIM1-2C16 (SFPIM91) (Figura 10). Igualmente, la liberación de TNF en el espacio bronco alveolar disminuyó debido a la coadministración de PIM1 (SFPIM135) o más fuertemente de isoPIM1-2C16 (SFPIM91) (Figura 11). Los valores representan la media aproximada de SEM de n = 3 ratones por grupo, de un experimento representativo de 3 experimentos independientes.

Otros experimentos complementarios indican que isoPIM1-2C16 (SFPIM91) causa la disminución de la expresión de numerosas citoquinas y quimioquinas inflamatorias en los pulmones expuestos a las endotoxinas.

En estas experiencias, isoPIM1-2C16 (SFPIM91) causa la inhibición marcada de la inflamación pulmonar y la resistencia de las vías respiratorias en respuesta a las endotoxinas locales.

EJEMPLO 2:

1) Síntesis del compuesto 25 (IsoPIM1 – C16 – C18) (Figura 2b)

Per – O – metoxiacetil – D – manopiranosa (compuesto 15, Figura 2b)

SFPIM – 93

Se añadió cloruro de metoxiacetilo (660 μl, 7,22 mmol, 6,5 eq) gota a gota a una solución de D – manosa (200 mg, 1,11 mmol) en piridina (6 ml) a temperatura ambiente (aproximadamente 20 ºC) y la mezcla se agitó durante 18

h. Los disolventes se evaporaron y el residuo se diluyó en acetato de etilo (30 ml). A continuación, la solución se lavó con una solución acuosa de HCl 1 N (10 ml) y, después, con una solución de NaCl saturada (10 ml) y se secó en sulfato de magnesio (MgSO4). Los disolventes se evaporaron y la purificación por cromatografía en columna en gel de sílice (éter de petróleo / acetato de etilo 2 / 1 y 1 / 1) dio lugar al compuesto 15 puro (518 mg, 86 %) en forma de jarabe amarillo. C21H32O16 (M = 540,47 g / mol). RMN 1H (250 MHz, CDCl3) δ 3,41 (s, 6H), 3,45 (s, 3H), 3,49 (s, 6H), 3,85 – 4,26 (m, 14H), 5,25 – 5,53 (m, 3H), 6,21 (s, 1H); RMN 13C (62,9 MHz, CDCl3) δ 59,34, 59,42, 59,50, 61,83, 65,50, 68,35, 68,82, 69,14, 69,26, 69,37, 70,44, 90,49, 167,61, 169,08, 169,22, 169,33, 169,90. MS IS: M calculada 540,17; encontrada: 558,5 [M + NH4]+, 563,5 [M + Na]+, 579,5 [M + K]+.

2, 3, 4, 6 – 4 – O – metoxiacetil – D – manopiranosa (compuesto 16, Figura 2b)

SFPIM – 114

Se añadió acetato de hidracina (500 mg, 5,48 mml, 1,6 eq) a una solución del compuesto 15 (1,850 g, 3,4 mmol) en dimetil formamida (DMF) (15 ml) enfriada con anterioridad a -20 ºC. Tras una hora de agitación a 20 ºC, la mezcla se diluyó con acetato de etilo (150 ml) y, a continuación, se lavó con una solución de NaCl saturada (5 x 50 ml), se secó en MgSO4 y se concentró al vacío para dar lugar al compuesto 16 (1,331 g, 83 %) en forma de jarabe amarillo. C18H28O14 (M = 468,42 g / mol). RMN 1H ( 400 MHz, CDCl3) δ 3,34 (s, 3H,), 3,35 (s, 3H), 3,39 (s, 3H), 3,41 (s, 3H) (4 Ome), 3,87 (AB, 2H, CH2OMe), 3,95 (s, 2H, CH2OMe), 4,02 (s, 2H, CH2OMe), 4,08 (AB, 2H, CH2OMe), 4,2 – 4,35 (m, 3H, H5', H6'A, H6'B), 5,19 (d, 1H, H1', J1-2 = 1,8 Hz), 5,27 (t, 1H, H4', J4-3 = 10 Hz), 5,3 (dd, 1H, H2', J2-3 = 3,2 Hz), 5,49 (dd, 1H, H3').

RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ 59,45 (CH3), 59,50 (CH3), 62,62 (C6'), 66,53 (CH2, C4'), 68,00 (CH, C5'), 69,29 (CH, C3'), 69,34 (CH2), 69,41 (CH2), 69,52 (CH2), 70,50 (CH, C2'), 91,98 (CH, C1').

2, 3, 4, 6 – 4 – O – metoxiacetil – 1 – O – tricloroacetimidoil – α – D – manopiranose (compuesto 17, Figura 2b)

SFPIM – 125

Se añadió tricloroacetonitrilo (1,28 ml, 12,80 mmol, 12 eq) a una mezcla del compuesto 16 (500 mg, 1,067 mmol) y de 1, 8 – diazabiclo [5,4,0] undec – 7 – eno (DBU) (45 μl, 0,299 mmol, 0,28 eq) en diclorometano (CH2Cl2) anhidro (10 ml) a temperatura ambiente (20 ºC) en atmósfera de argón. Tras 10 min de agitación, la mezcla reactiva se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (éter de petróleo / acetato de etilo 1 / 2 con 0,2 % de trielamina (Et3N)) y dio lugar así al compuesto 17 (479 mg, 73 %) en forma de jarabe amarillo. C20H28O14NCl3 (M = 614,81 g / mol). RMN 1H (250 MHz, CDCl3) δ 3,41 (s, 3H, CH3), 3,42 (s, 3H, CH3), 3,45 (s, 3H, CH3), 3,50 (s, 3H, CH3), 3,95 (dd, 2H, CH2OMe), 4,03 (s, 2H, CH2OMe), 4,08 (s, 2H, CH2OMe), 4,19 (dd, 2H, CH2OMe), 4,22 – 4,33 (m, 2H, H5', H6'A), 4,40 (dd, 1H, J = 5,3 y 13,3 Hz, H6'B), 5,45 (t, 1H, J = 9,8 Hz, H4'), 5,55 (dd, 1H, J = 5,2 y 10,0 Hz, H3'), 5,59 (dd, 1H, H2'), 6,32 (d, 1H, J= 1,5 Hz, H1'), 8,84 (s, 1H, NH).

3, 4, 5, 6 –4–O –bencil –1O –(2, 3, 4, 5, 6 –4 –metoxiacetil – α – D –manopiranosil) – D –mioinositol (compuesto 18, Figura 2b)

SFPIM – 207

Se unieron el compuesto aceptador 6 (940 mg), 1,42 mmol, 1 eq) y el compuesto donador 17 (1,16 g, 1,89 mmol, 1,3 eq) en un mismo balón y se sometieron al vacío en P2O5 durante 18 h. La mezcla se colocó a continuación en atmósfera de argón y se le añadió un tamiz 4Å. El balón se dejó en flujo de argón durante 10 minutos y, a continuación, se le añadió CH2Cl2 anhidro (7 ml). Transcurridos otros 30 min de agitación en argón, el medio reactivo se enfrió a 0 ºC y se añadió TMSOTf (68 μl, 0,38 mmol) gota a gota. Tras 5 minutos de agitación a 0 ºC y 1 hora a temperatura ambiente (20 ºC) en atmósfera de argón, la mezcla reactiva se enfrió a 0 ºC y la reacción se detuvo al añadir Et3N (1 ml). El tamiz se filtró a través de vidrio sinterizado, los disolventes se evaporaron al vacío y el residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (éter de petróleo / acetato de etilo 1 / 1) para dar lugar al compuesto 18 (296 mg, 21 %). (Se aisló igualmente una fracción de 350 mg del compuesto 18 en mezcla con el isómero inicialmente esperado, que había perdido el PMB pero estaba glicosilado en la posición 2 del inositol). C52H62O19 (M = 991,06 g / mol). RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 2,89 (m, 1H, OH), 3,34 (s, 3H, CH3), 3,41 (s, 3H, CH3), 3,42 (s, 3H, CH3), 3,44 (s, 3H, CH3), 3,41 – 3,48 (m, 2H, 2CHins), 3,45 (dd, 1H, Chins, J = 2,4, 6,0 Hz), 3,86 – 4,16 (m, 8H, 4CH2OMe), 4,15 (dd, 1H, H6'A, J6'A-5' = 2,4 J6'A-6'B = 12 Hz), 4,29 (br s, 1H, H2), 4,34 (dd, 1H, H6'B, J6'B-5' = 4,8 Hz), 4,43 (ddd, 1H, H5'), 4,65 – 4,91 (m, 8H, 4CH2Ph), 5,07 (d, 1H, H1', J1'-2' = 2 Hz), 5,31 (t, 1H, H4', J4'-3' = J4'-5' = 10,0 Hz), 5,41 (dd, 1H, H2', J2'-3' = 3,2 Hz), 5,56 (dd, 1H, H3'), 7,15 – 7,4 (m, 20H, 4 x 5CHAr). RMN 13C (69,9 MHz, CDCl3) δ 59,42, 59,48, 59,52, 63,12 (C6'), 66,65 (4'), 68,83 (C5'), 69,26 (C2), 69,38 (C3'), 69,46 (2CH2OMe), 69,49 (CH2OMe), 69,74 (CH2OMe), 69,87 (C2'), 73,17 (CH2Ph), 76,0 (CH2Ph), 76,03 (CH2Ph), 76,28 (CH2Ph), 80,27, 80,31, 31,15, 81,53 y 83,12 (Chins), 99,47 (C1'), 127,69 – 128,62 (11 picos, CHAr), 137,88, 138,26, 138,57, 138,63, 169,25 (CO), 169,31 (CO), 169,49 (CO), 169,86 (CO).

3 – O – bencil – 1 – O – octadecanoil – sn – glicerol (compuesto 19, Figura 2b)

SFPIM1

Se añadieron (dimetilamino)piridina (DMAP) (5,6 mg, 0,05 mmol, 1 eq) y diclohexilcarbidiimida (DCC) (190 mg, 0,92 mmol, 2 eq) a una solución, enfriada a 0 ºC anteriormente, de ácido esteárico (130 mg, 0,46 mmol) y de 3 – O – bencil – sn – glicerol (100 mg, 0,55 mmol, 1,2 eq) en diclorometano anhidro (CH2Cl2) (5 ml). La mezcla reactiva se agitó 1 h a 0 ºC y después 18 h a temperatura ambiente (aproximadamente 20 ºC) para, a continuación, filtrarla en algodón para retirar una parte de la diciclohexilurea formada. El disolvente se evaporó al vacío y el residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (éter de petróleo / acetato de etilo 6 / 1) para dar lugar al compuesto 19 (129 mg, 63 %) en forma de sólido blanco. C28H48O4 (M = 448,69 g / mol). RMN 1H (250 MHz, CDCl3) δ 0,88 (t, 3H, CH3, J = 6,5 Hz), 1, 25 (b, 28H, 14CH2), 1,60 (m, 2H, 2h3''), 2,31 (t, 2H, 2H2'', J = 7,5 Hz), 2,64 (d, 1H, OH, J = 3,5 Hz), 3, 48 (dd, 1H, H3aA, J3aA-3aB = 9,75 Hz, J3aA-2a = 6 Hz), 3,55 (dd, 1H, H3aB, J3aB-2a = 4,5 Hz), 4,02 (m, 1H, H2a), 4,12 (dd, 1H, H1aA, J1aA-2a ~ 4,8 Hz), 4,19 (dd, 1H, H1aB, J1aB-1aA = 11,5 Hz, J1aB-2a 5 Hz), 4,55 (s, 2H, CH2Ph), 7,33 (m, 5H, CHAr). RMN 13C (62,9 MHz, CDCl3) δ 14,22 (CH3), 22,19 (CH2), 25,00 (CH2, C300), 29,23, 29,36, 29,46, 29,66, 29,71, 29,76, 29,80 (7 CH2), 32,02 (CH2), 34,24 (CH2, C2''), 65,43 (CH2, C1a), 68,80 (CH, C2a), 71,00 (CH2 C3a), 73,58 (CH2Ph), 127,82 (CHAr), 127,94 (CHAr), 128,54 (CHAr), 137,77 (CqAr), 174,01 (Cq, C1''). MS – IS: calculada 448,36; encontrada: 449,5 [M + H]+, 466,5 [M + NH4]+, 471,5 [M + Na]+.

3 – O – bencil – 2 – O – hexadecanoil – 1 – O – octadecanoil – sn – glicerol (compuesto 20, Figura 2b)

SFPIM34

Se añadieron clorhidrato de 1 – etil – 3 – [3 – (dimetilamino) propilcarbodiimida (EDCI) (662 mg, 3,45 mmol, 2,5 eq) y DAMP (34 mg, 0,28 mmol, 0,2 eq) a una solución del compuesto 19 (620 mg, 1,38 mmol) y de ácido palmítico (708 mg, 2,76 mmol, 2 eq) en CH2Cl2 anhidro (25 ml). La mezcla reactiva se agitó 18 h a temperatura ambiente (aproximadamente 20 ºC) y, después, se diluyó con CH2Cl2 (100 ml). La fase orgánica se lavó con una solución de HCl 1 N (40 ml), agua (40 ml) y, después, una solución de NaCl saturada (40 ml) y se secó en MgSO4. El disolvente se evaporó al vacío y el residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (éter de petróleo / acetato etílico 25 / 1 y 20 / 1) para dar lugar al compuesto 20 (899 mg, 95 %) en forma de sólido blanco. C44H78O5 (M = 687,11 g / mol). RMN 1H (250 MHz, CDCl3) δ 0,88 (t, 3H, CH3, J = 6,5 Hz), 1,26 (m, 52H, 26CH2), 1,60 (m, 4H, 2H3', 2H3''), 2,27 (t, 2H, J = 7,5 Hz) y 2,31 (t, 2H, J = 7,5 Hz) (2H2' y 2H2''), 3,59 (d, 2H, 2H3a, J = 5 Hz), 4,19 (dd, 1H, H1aA, J1aA-1aB = 11,75 Hz, J1A-2a = 6,3 Hz), 4,35 (dd, 1H, H1aB, J1aB-2a = 3,8 Hz), 4,53 (AB, 2H, CH2Ph, J = 12,2 Hz), 5,24 (quint., 1H, H2a), 7,32 (m, 5H, CHAr). RMN (100 MHz, CDCl3) δ 14,23 (CH3), 22,82 (CH2), 25,01 y 25,08 (2CH2, C3', C3''), 29,22 – 29,83 (CH2, 8 líneas), 32,06 (CH2), 34,23 y 34,44 (2CH2), 62,16 (CH2, C1a), 68,38 (CH2, C3a), 70,12 (CH, C2a), 73, 42 (CH2Ph), 127,72 (CHAr), 127,87 (CHAr), 128,51 (CHAr), 137,83 (CqAr), 173,16 (Cq, CO), 173,45 (Cq, CO). SM – IS: M calculada: 686,58; encontrada: 687,5 [M + H]+, 704,5 [M + NH4]+, 709,5 [M + Na]+.

2 – O – hexadecanoil – 1 – O – octadecanoil – sn – glicerol (compuesto 21, Figura 2b)

SFPIM29

Se disolvió el compuesto 20 (250 mg, 0,36 mmol) en una mezcla de CH2Cl2 / EtOH (1 / 2,5, 14 ml). Se añadió un exceso de paladio en carbono (PD / C 10 %) y la reacción se agitó 4 h a temperatura ambiente (aproximadamente 20 ºC) en atmósfera de hidrógeno (balón). La mezcla reactiva se calentó a 30 ºC para la mejor disolución del producto esperado y el catalizador se retiró por filtración mediante una membrana millipore. Se aclaró 3 veces con 20 ml de mezcla CH2Cl2 / EtOH (1 / 1) calentada con anterioridad a 30 ºC. Los disolventes residuales se evaporaron al vacío para dar lugar al compuesto 31 (215 mg, 99 %) esperado en forma de sólido blanco. C37H72O5 (M = 596,98 g / mol). RMN 1H (250 MHz, CDCl3) δ 0,88 (t, 6H, 2CH3), 1,26 (m, 52H, 26CH2), 1,62 (m, 4H), 1,99 (s muy grande, 1H, OH), 2,32 (t, 2H, J = 7,7 Hz), 2,34 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 3,73 (d, 2H, 2H3a, J = 5 Hz), 4,23 (dd, 1H, H1aA, JaA-1aB = 11,75 Hz, J1A-2a = 5,75 HZ), 4,35 (dd, 1H, H1aB, J 1aB-2a = 4,5 Hz), 5,08 (quint, 1H, H2a, J = 4,5 Hz). RMN 13C (62,9 MHz, CDCl3) δ 14,27 (CH3), 22,84 (CH2), 25,04 y 25,09 (2CH2), 29,25 – 29,85 (CH2, 8 líneas), 32,08 (CH2), 34,26 y 34,44 (2CH2), 61,68, 62,16, 72,25, 173,57 (Cq, CO), 173,93 (Cq, CO).

(S) – 2 – O – hexadecanoiloxi – 1 – O – octadecanoiloxipropil bencil (N, N – diisopropilamino) fosforamidita (compuesto 22, Figura 2b)

SFPIM47

Se secaron por separado 1H – tetrazol sólido (11 mg, 0,151 mmol, 06 eq) y el compuesto 21 (150 mg, 0,251 mmol) al vacío en P2O5 durante 1 h antes de ser unidas y disueltas en CH2Cl2 anhidro (2 ml). Se añadió la solución stock del compuesto 10 (0,84 M, 358 μl, 0,301 mmol, 1,2 eq) y, tras 30 minutos de agitación a temperatura ambiente (aproximadamente 20 ºC), la mezcla reactiva se diluyó con CH2Cl2 (50 ml), se enfrió a 0 ºC y la fase orgánica se lavó con una solución saturada de NaHCO3 a 0 ºC (10 ml) y, a continuación, se secó en MgSO4. El disolvente se evaporó y una purificación rápida por cromatografía en columna en gel de sílice (éter de petróleo / acetato de etilo 6 / 1 con 1 % de Et3N) permitió obtener el compuesto esperado 22 (100 mg, 48 %) en forma de aceite incoloro. C50H92NO6P (M = 834,27 g / mol). RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 0,88 (t, 6H, 2CH3), 1,18 (d, 6H, CH3 isopropil), 1,19 (d, 6H, CH3 isopropil), 1,25 (m, 52H, 26 CH2), 1,60 (m, 4H, 2CH2), 2,29 (2t, 4H, 2CH2), 3,56 – 3,9 (2m, 4H, 2CHMe2, 2H3a), 4,17 (ddd, 1H, H1aB, J = 4,8, 6,4 y 12 Hz), 4,34 (ddd, 1H, H1aA, J = 4, 8 y 12 Hz), 4,65 y 4,66 (2dd, 1H, POCHAPh, JA,B = 12,4 Hz, JA,P = 8,4 Hz), 4,732 y 4,735 (2dd, 1H, POCHBPh, JA,B = 12,4 Hz, JA,P = 8,4 Hz), 5,19 (m, 1H, H2a), 7,3 – 7,4 (m, 5H, 5CHAr).31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 148,70, 148,80.

3, 4,5, 6 –4 –O –bencil –1 –O –(2, 3, 4, 6 –O –metoxiacetil –α –D –manopuranosil) –2 –O – hexadecanoil – 3 – O – octadecanoil – propil) (bencil) fosforil) – D – mioinositol (compuesto 23, Figura 2b)

SFPIM214

Se coevaporaron el compuesto 22 (290 mg, 0,348 mmol, 3 eq) y el compuesto 18 (115 mg, 0,116 mmol) con tolueno anhidro (2 x 10 ml) y, a continuación, se secaron 30 min al vacío de alto grado antes de ser disueltos, en atmósfera de argón, en CH2Cl2 anhidro (8 ml). Se añadió 1H – tetrazol sólido (41 mg, 0,58 mmol, 5 eq) a 0 ºC y, tras

1 h y media de agitación a temperatura ambiente, la mezcla reactiva se enfrió a -40 ºC. Se añadió una solución de ácido m-cloroperbenzoico (m-CPBA) (50 %, 120 mg, 0,348 mmol, 3 eq) en el CH2Cl2 (8 ml) gota a gota. Tras 2 horas de agitación en las que se permitió al medio reactivo volver a temperatura ambiente (aproximadamente 20 ºC), la reacción se detuvo con la adición de una solución acuosa con 10 % de Na2S2O3 (50 ml) y la mezcla se extrajo con dietil éter (Et2O) (100 ml). La fase orgánica se lavó con una solución acuosa con 5 % de NaHCO3 ( 3 x 50 ml) y, a continuación, se secó en MgSO4. El disolvente se evaporó al vacío y el residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (éter de petróleo / acetato etílico 2 / 1 con un gradiente de hasta 1 / 1) para dar una parte de un primer P-estereoisómero del compuesto 23 (55 mg) y una parte de mezcla de isómeros (76 mg con aproximadamente un 30 % del primer isómero) (rendimiento total 65 %). C96H139O26P (M = 1740,14 g / mol). SM – IS m / z M calculada: 1738,92; encontrada: 140,5 [M + H]+, 1763,5 [M + Na]+. HRMS calculada para [M + H]+: C96H140O26P: 1739,9370; encontrada: 1739,9386.

3, 4, 5, 6 – 4 –O – bencil – 1– O – α – D –manopiranosil – 2 –O –[((S) –2 –O – hexadecanoil – 3 –O – octadecanoil – propil) (bencil) fosforil] – D – mioinositol (compuesto 24, Figura 2b)

SFPIM218

El compuesto 23 (129 mg, 0,074 mmol) se disolvió en una mezcla de CHCl3 / MeOH (4 / 1, 1 ml). La mezcla reactiva se enfrió a 0 ºC y se añadió t – butilamina (160 μl). Tras 10 min de agitación a 0 ºC y 1 h en la que el medio reactivo alcanzó la temperatura ambiente, los disolventes se evaporaron al vacío de alto grado a temperatura ambiente (aproximadamente 20 ºC) y el residuo se purificó por dos cromatografías en columna en gel de sílice sucesivas (CH2Cl2 / MeOH 20 / 1) con una cantidad de sílice para dar lugar al compuesto esperado 24 (67 mg, 63 %) en forma de sólido blanco homogéneo (RMN: presencia de los dos P* -estereoisómeros). C84H123O18P (M = 1415,85 g / mol). HRMS calculada para [M + H]+: C84H124O18P: 1451,8525; encontrada: 1451,8521.

1 – O – α – D – manopiranosil – 2 – O – [((S) – 2 – O – hexadecanoil – 3 – O – octadecanoilpropil) fosforil] – D

– mioinositol (compuesto 25, Figura 2b)

SFPIM219

El compuesto 24 (63 mg, 0,043 mmol) se disolvió en una mezcla de CH2Cl2 / EtOH (0,6 / 1, 16 ml). Se añadió un exceso de paladio en carbono ( Pd / C 10 %) y la reacción se agitó 18 h a temperatura ambiente (aproximadamente 20 ºC) en atmósfera de hidrógeno (balón). El catalizador se retiró por filtración mediante una membrana millipore y se aclaró 3 veces con una mezcla CH2Cl2 / EtOH (1 / 1) (20 ml). Los disolventes residuales se evaporaron al vacío para dar lugar al compuesto 25 (43 mg, 100 %) en forma de sólido blanco muy homogéneo (RMN). C49H93O18P (M = 1001,25 g / mol). RMN 1H (400 MHz, CD3OD / CDCl3 0,7 / 0,3 ml) δ 0,88 (t, 6H, 2CH3), 1,26 (m, 52H, 26CH2), 1,60 (m, 4H), 2,32 (t, 2H, J = 7,6 Hz), 2,37 (t, 2H, J = 7,6 Hz), 3,22 (t, 1H, H5, J4-5 = J5-6 = 8,8 Hz), 3,52 (br d, 1H, H3), 3,55 (t, 1H, H4', J4'-5' = 10,0 Hz), 3,56 (t, 1H, H4, J4-3 = 8,8 Hz), 3,66 (m, 1H, H1), 3,67 – 3,72 (m, 2H, H6, H6'A), 3,81 (dd, 1H, H3', J3'-4' = 9,4, J3'-2' = 3,2 Hz), 3,83 (m, 1H, H5'), 3,89 (dd, 1H, H6'B, J6'B-5' = 2, J6'B-6'A = 11,6 Hz), 3,97 (dd, 1H, H2', J2'-1' = 1,6 Hz), 4,16 – 4,23 (m, 3H, H3aA y 2H1a), 4,42 (dd, 1H, H3aB, J3aB-2a = 3,2, J3aB-3aA = 12 Hz), 4,75 (ddd, 1H, H2, J2-3 ~ 10, J2-1 = 2,2 Hz), 5,16 (d, 1H, H1', J = 1,2 Hz), 5,26 (m, 1H, H2a). RMN 13C (100 MHz, CD3OD / CDCl3 0,7 / 0,3 ml) δ 14,40 (CH3) 23,43, 25,67, 25,70, 29,90, 30,15, 30,16, 30,33, 30,36, 30,44, 30,46, 30,48, 32,74, 34,75, 34,88, 62,83 (C6'), 63,23 (C3a), 65,87 (d, C1a), 68,77 (C4'), 70,89 (d, C2a), 71,48 (C3 y C2'), 73,58 (C4), 73,96 (C6), 74,70 (C5'), 75,79 (C5), 76,37 (d, C1), 81,37 (d, C1), 102,95 (C1'), 174,43 (CO), 174,81 (CO).31P NMR (162 MHz, CD3OD / CDCl3 0,7 / 0,3 ml) δ -1,71 ppm. HRMS calculada para [M + H]+: C49H94O18P: 1001,6178; encontrada: 1001,6172.

2) Estimulación de los macrófagos de ratones salvajes por LPS en presencia de isómero PIM1 isoPIM1-C16C18 (SFPIM219)

Se probó un nuevo isómero de PIM, el isoPIM1C16C18 (SFPIM219) por su actividad inhibidora en los macrófagos estimulados por LPS (Figura 12).

Los macrófagos derivados de la médula espinal de ratones salvajes se cultivaron en placas de cultivo de 96 pocillos con 105 células por pocillo que, a continuación, se estimularon con LPS (100 ng / ml, Escherichia. Coli, serotipo O111: B4, SIGMA), con isoPIM1C16C18 (SFPIM219) (1 – 10 μg / ml) o un control DMSO. La preparación de SFPIM219 liofilizada utilizada se solubilizó en DMSO y se adicionó a los cultivos a una concentración final máxima no citotóxica de 1 %.

Tras una estimulación de 24 horas, los sobrenadantes de cultivo fueron colectados y analizados en cuanto a su

contenido en citoquinas TNF – α o IL – 12p40 mediante ELISA (R & D Douset, Minneapolis, MO). Los resultados corresponden a la media aproximada de SD de n = 2 ratones por genotipo.

El isoPIM1C16C18 (SFPIM219) inhibe fuertemente la secreción de TNF (Figura 12). El test de citotoxicidad MTT llevado a cabo en los mismos macrófagos incubados en presencia de isoPIM1C16C18 (SFPIM219) permitió demostrar la ausencia de citotoxicidad en los macrófagos (Figura 13).

La secreción de IL – 12p40 en respuesta al LPS ya se había inhibido fuertemente a concentraciones de 1 ug / ml de isoPIM1C16C18 (SFPIM219) (Figura 14).

EJEMPLOS 3 y 4:

1) Ejemplo 3: Síntesis del compuesto 36 de la Figura 2c o PIM – 2 – mimNCOCF3

SFPIM342 – t2

Ejemplo 4: Síntesis del compuesto 37 de la Figura 2c o PIM – 2mimNH

SFPIM324 – t8

3 – O – bencil – 1, 2 : 5, 6 – di – O – isopropilidena – α – D – glucofuranosa (compuesto 26, Figura 2c)

SFPIM311

A una solución de 1, 2 : 5, 6 – di – O – isopropilidena – α – D – glucofuranosa comercial (13,5 g; 52 mmol) en THF anhidro (100 ml) se le añadió, a 0 ºC y en atmósfera de azote, hidruro de sodio (en forma de una dispersión al 60 % en aceite mineral) (2,5 g; 62 mmol; 1,2 eq). La mezcla se agitó durante 20 min a 0 ºC. Tras la adición, a temperatura ambiente (aproximadamente 20 ºC), de yoduro de tetrabutilamonio (149 mg; 0,4 mmol; 0,008 eq), el bromuro de bencilo (9 ml; 76 mmol; 1,3 eq) se añadió gota a gota. El medio se calentó por reflujo durante 2 horas y, a continuación, se añadió metanol (10 ml) lentamente. La mezcla se diluyó con diclorometano (100 ml) y agua (40 ml). La fase acuosa se extrajo 3 veces en diclorometano (50 ml). Las fases orgánicas se unieron, secaron y concentraron al vacío. El producto bruto se purificó por cromatografía en gel de sílice (ciclohexano / Et2O 4 / 1 + 0,4 % de Et3N) para dar lugar al compuesto 26 en forma de aceite amarillo. C19H26O6 (M = 350,42 g / mol). RMN 1H (400 MHz, CDCl3): δ 1,31 (s, 3H, CH3), 1,37 (s, 3H, CH3), 1,43 (s, 3H, CH3), 1,49 (S, 3H, CH3), 4,00 (d, 1J, H6A, J6A-5 = 5,6, J6A-6B = 8,4 Hz), 4,02 (d, 1H, H3, J4-3 = 3,0 Hz), 4,11 (d, 1H, H6B, J6B-5 = 6,0 Hz), 4,15 (d, 1H, H4, J45 = 7,6 Hz), 4,37 (m, 1H, H5), 4,58 (d, 1H, H2, J2-1 = 3,6 Hz), 4,66 (AB, 2H, CH2Ph), 5,90 (d, 1H, H1), 7,27,25 (m, 5H, CHar). RMN 13C (101 MHz, CDCl3): δ 25,57 (CH3), 26,37 (CH3), 26,92 (CH3), 26,97 (CH3), 67,53 (C6'), 72,50 (CH2Ph), 72,65 (C5'), 81,45 (C4'), 81,83 (C3'), 82,79 (C2'), 105,42 (C1'), 109,10 (Cq), 111,90 (Cq), 127,77, 127,96, 128,52, 137,77. SM –IS m / z M calculada: 350,17; encontrada: 351,0 [M + H]+, 373,0 [M + Na]+.

3 – O – bencil – 1, 2 – O – isopropilideno – α – D – xilo – pentodialdo – 1, 4 – furanosa (compuesto 27, Figura 2c)

SFPIM268A

El compuesto 27 se sintetizó según [25]. Se agitó una solución del compuesto 26 (1,03 g; 2,9 mmol) en una mezcla de ácido acético y agua (21 / 9) a 45 ºC durante 2 horas. La mezcla reactiva se enfrió a continuación a 0 ºC y se añadió una solución de periodato de sodio (692 mg; 3,23 mmol; 1,1 eq) en agua (7 ml). El medio se agitó a temperatura ambiente (aproximadamente 20 ºC) durante 18 horas. Se añadió diclorometano (15 ml) y la fase acuosa se extrajo 3 veces en el diclorometano (15 ml). Las fases orgánicas se unieron y se lavaron 2 veces con agua (20 ml), se secaron en MgSO4 y se concentraron al vacío. El residuo se coevaporó 2 veces con tolueno. El aldehído 27 se utilizó sin purificar en la etapa siguiente. RMN 1H (250 MHz, CDCl3): δ 1,33 (s, 3H, CH3), 1,47 (s, 3H, CH3), 4,33 (d, 1H, H3, J3-1 = 3,7 z), 4,54 (AB, 2H, CH2Ph), 4,61 (dd, 1H, H4, J4-5 = 1,5, J4-3 = 3,7 Hz), 4,64 (d, 1H, H2, J2-1 = 3,7 Hz), 6,12 (d, 1H, H1), 7,1 – 7,4 (m, 5H, CHar), 9,67 (d, 1H, H5, J5-4 = 1,8 Hz).

3 – O – bencil – xilo – pentodialdo – 1, 4 – furanosa (compuesto 28, Figura 2c)

SFPIM268

Se añadió resina Dowex 50WX8 a una solución del compuesto 27 (2,9 mmol) en una mezcla de dioxano / agua (10 / 4 ml). El medio se agitó ligeramente 18 h a 75 ºC. La resina se filtró en vidrio sinterizado y se aclaró con una mezcla de dioxano / agua. Los disolventes se evaporaron a presión reducida. El residuo se coevaporó varias veces

con tolueno hasta que se obtuvo el producto 28 con forma de espuma naranja – roja. El compuesto se utilizó sin purificar en la etapa siguiente.

N – bencil – 3 – O – bencil – 1, 5 – dideoxi – 1, 5 – imino – xilitol (compuesto 29, Figura 2c)

SFPIM272

A una solución del compuesto 28 (700 mg, 2,9 mmol) secada con anterioridad en P2O5 durante una noche en metanol anhidro (50 ml), se añadió, en atmósfera de azote, el cianoborohidruro de sodio (554 mg, 2,67 mmol, 3 eq). La mezcla se agitó en presencia de tamices moleculares 3Å durante 10 minutos. El medio se enfrió a -78 ºC y, a continuación, se añadieron ácido acético glacial (332 μl, 5,8 mmol, 2 eq) y bencilamina (292 μL, 2,67 mmol, 0,9 eq). Tras volver a la temperatura ambiente (aproximadamente 20 ºC), el medio se agitó 18 h y se filtró sobre Célite. El Célite se aclaró con acetato de etilo ( 3 x 10 ml). Los disolventes se evaporaron a presión reducida. El residuo se recogió en el acetato de etilo (60 ml) y se lavó con una solución saturada de NaHCO3 (20 ml) y 2 veces con agua (20 ml). La fase orgánica se secó y se concentró al vacío para dar lugar al compuesto 29 en forma de sólido blanco homogéneo. El compuesto puede eventualmente volverse a cristalizarse en acetato de etilo. C19H23O3N (M = 313,40 g / mol). RMN 1H (250 MHz, CDCl3): δ 2,24 (dd, 2H, H1aA, H5a'A, J1aA-2a = J5aA-4a = 8, J1aA-1aB = J5aA-5aB = 11 H), 2,45 (m, 2H, OH), 2,85 (dd, 2H, H1aB, H5aB, J1aB-2a = J5aB-4a = 3,5 Hz), 2,25 (app t, 1H, H3a, J2a-3a = J3a-4a = 7 Hz), 3,55 (s, 2H, CH2Ph), 3,77 (ddd, 2H, H4a, H2a), 4,76 (s, 2H, CH2Ph), 7,20 – 7,40 (m, 10H, 2 x 5 Char). RMN 13C (101 MHz, CDCl3): δ 57,12 (C1a, C5a), 62,20 (CH2Ph Nbn), 69,91 (C2a, C4a), 73,98 (Ch2Ph Obn), 84,30 (C3a, señal de intensidad débil), 127,39 – 129,14 (9 picos, Char), 137,86 (Cqar), 138,68 (Cqar). SM –IS m / z M calculada: 313,17; encontrada 314,0 [M + H]+, 336,0 [M + Na]+.

3 – O – bencil – 1, 5 – dideoxi – 1, 5 – imino – xilitol (compuesto 30, Figura 2c)

SFPIM314

El compuesto 29 (300 mg; 0,957 mmol) se disolvió en EtOH (10 ml). Se añadió un exceso de hidróxido de paladio en carbono 20 % y el medio reactivo se agitó a temperatura ambiente (aproximadamente 20 ºC) en atmósfera de hidrógeno durante 20 horas. Se volvió a añadir hidróxido de paladio en carbono 20 % y la reacción continuó 18 h suplementarias. El medio reactivo se filtró en membranas millipore y el catalizador se aclaró con EtOH (2 x 10 ml). El filtrado se evaporó a presión reducida para dar lugar al compuesto 30 (172 mg, se observa aproximadamente un 35 % de producto O – debencilado). C12H17NO3 (M = 223,27 g / mol). RNM 1H (400 MHz, CD3OD): (contiene un 35 % de compuesto O – debencilado referencia*) δ *2,38 (dd, ~ 0,4H, *H1aA, *H5aA, J1aA-2a = J5aA-4a = 10,1, J1aA-1aB = J5aA-5aB = 12,6 Hz), 2,45 (dd, ~1,7H, H1aA, H5aA, J1aA-2a = J5aA-4a = 9,7, J1aA-1aB = J5aA-5aB = 12,8 Hz), 2,85 (dd, 2H, H1aB, H5aB, J1aB-2a = J5aB-4a = 4,3 Hz, + compuesto *), 3,21 (app t, 1H, *H3a, H3a, J2a-3a = J4a-3a = 8,3 Hz), *3,39 – 3,41 (2dd, ~ 0,4H, *H4a, *H2a), 3,55 – 3,57 (2dd, ~1,7H4a, H2a), 4,85 (s, CH2Ph), 7,20 – 7,40 (M, 5H, CHar). RMN 13C (101 MHz, CD3OD): δ *51,39 (*C1a, *C5a), 51,47 (C1a, C5a), 71,92 (C2a, C4a), *72,45 (*C2a, *C4a), 75,55 (CH2Ph OBn), *79,94 (*C3a), 87,12 (C3a), 127,93 – 128,98, 129,17 (CHar), 140,36 (Cqar). SM –IS m / z M calculada: 223,12; encontrada 224,5 [M + H]+, 246,5 [M + Na]+.

N – trifluoroacetamido – 3 – O – bencil – 1, 5 – dideoxi – 1, 5 – imino – xilitol (compuesto 31, Figura 2c)

SFPIM315

A una solución del compuesto 30 (172 mg; 0,77 mmol) en diclorometano anhidro (5 ml) se añadieron piridina (100 μl; 1,31 mmol; 1,7 eq) y anhídrido trifluoroacético (160 μl, 1,16 mmol; 1,5 eq). El medio reactivo se agitó durante 18 h a temperatura ambiente (aproximadamente 20 ºC) y, a continuación, se diluyó en diclorometano. La fase orgánica se lavó dos veces con una solución de HCl 1 N, una vez con H2O, se secó en MgSO4 y se concentró al vacío. El producto bruto se purificó por cromatografía en gel de sílice (éter de petróleo / acetato de etilo 3 / 1,5) para dar el producto 31 (110 mg; 45 %). C14H15NO4F3 (M = 318,28 g / mol). RMN 1H (400 MHz, CDCl3): δ 3,50 (d, 1H, H1A o H5A, J = 13,4Hz), 3,61 (m, 1H, H3), 3,66 -3,78 (m, 3H, H1 o H5, OH), 3,82 (m, 2H, H2 o H4, OH), 3,96 (m, 1 H, H4 o H2), 4,10 (dd, H1B o H5B, J = 4,0, J = 13,6Hz), 4,66 (s, 2H, CH2Ph), 7,25 -7,38 (m, 5H, Char). RMN 13C (101 MHz, CDCl3): δ 45,77 (C5 o C1), 48,25 y 48,28 (C1 o C5 rotámeros), 67,80, (C2 o C4), 67,97 (C4 o C2), 73,04 (CH2Ph), 76,52 (C3), 116,51 (q, CF3, JC-F = 289 Hz), 127,78, 128,23, 128,72 (3 picos CHar), 137,71 (Car), 157,72 (q, COCF3, J C-F = 36Hz). RMN 19F (376 MHz, CDCl3): δ – 67,72.

N –trifluoroacetamido –3 –O –bencil – 2,4 –bis –O – (2, 3, 4, 5 –4–O –metoxiacetil –α –D – manopiranosil) – 1, 5 – dideoxi – 1, 5 – imino – xilitol (compuesto 32, Figura 2c)

SFPIM318

Una solución del compuesto 17 (500 mg; 0,813 mmol; 2,5 eq) en diclorometano (2 ml) se canuló en atmósfera de argón en una solución del compuesto 31 (105 mg; 0,33 mmol) en diclorometano (5 ml) con tamices moleculares 4Å. La mezcla reactiva se agitó durante 30 min a temperatura ambiente (aproximadamente 20 ºC) y se añadió trimetilsilil trifluorometanosulfonato (30 μl, 0,163 mmol; 20 % respecto al imidato). El medio reactivo se agitó durante 2 h a temperatura ambiente (aproximadamente 20 ºC) y, a continuación, se detuvo la reacción por la adición de trietilamina (0,8 ml) y se filtró sobre Célite. Se aclaró el Célite con diclorometano, se evaporó el disolvente en seco y el producto bruto se purificó por cromatografía en gel de sílice (diclorometano / acetona 6 / 1) para dar lugar al producto 32 (188 mg; 47 %) en forma de jarabe incoloro. C50H68NO30F3 (M = 1220,08 g / mol). Nota: en RMN se observan rotámeros debidos a la presencia de NCOCF3. RMN 1H (400 MHz, CDCl3): δ 2,92 (dd, 0,5H, H1aA o H5aA, J = 9,9, 12,9Hz), 3,06 (dd, 0,5H, H1aA o H5aA, J= 10,1, 12,9Hz), 3,18 (dd, 0,5H, H1aA o H5aA, J = 9,8, 13,9Hz), 3,26 (dd, 0,5H, H1aA o H5aA, J = 10,3, 13,9Hz), 3,36, 3,38, 3,38, 3,40 3,41, 3,44, 3,45, 3,48 (8 CH3), 3,64 – 4,22 (m, 25H, 8CH2 MAc, 2H5, 1H1aB o 1H5aB, 3H6, H3a, H2a, H1a), 4,40 (m, 1H, H6B), 4,53 (m, 1H, H1aB o H5aB), 4,80 – 4,90 (m, 2H, CH2Ph), 4,94 (s, 0,5H, H1), 5,05 (s, 0,5H, H1), 5,14 (s, 0,5H, H1), 5,17 (s, 0,5H, H1), 5,24 – 5,45 (m, 6H, 2H2, 2H3, 2H4), 7,15 – 7,40 (m, 5H, CHar). RMN 13C (101 MHz, CDCl3): δ 43,44, 45,52, 45,56, 45,85, 47,89, 47,92 (6 picos para C1a y C5a), 59,32, 59,37, 59,39, 59,41, 59,44, 59,45, 59,53 (7 CH3), 61,75, 62,23, 62,58 (3 picos para los H6), 65,43, 65,56, 65,97, 66,07, 68,49, 68,62, 68,68, 68,94, 69,26, 69,49 (10 picos para C2, C3, C4, C5), 69,14, 69,22, 69,26, 69,29, 69,39, 69,43, 69,46 (7 picos para los CH2 MAc), 71,17, 72,20, 76,56, 77,08, 81,88, 82,00 (6 picos para C1a, C2a, C3a), 75,48, 75,57 (2 picos para CH2Ph), 94,41, 94,75 (2 picos para C1), 98,82, 99,07 (2 picos para C1), 116,14. (q, CF3, JC-F = 289Hz), 116,21 (q, CF3, JC-F = 289Hz), 125,32 – 129,06 (9 picos para CHar), 137,09, 169,12 – 170,18 (14 picos para COMAc). RMN 19F (376 MHz, CDCl3): δ -68,79, -68,55.

N – trifluoroacetamido – 2, 4 – bis – O – (2, 3, 4, 5, -4 – O – metoxiacetil – α – D – manopiranosil) – 1, 5 – dideoxi – 1, 5 – imino – xilitol (compuesto 33, Figura 2c)

SFPIM319

El compuesto 32 (188 mg; 0,154 mmol) se disolvió en una mezcla de EtOH / CH2Cl2 ( 6 / 6 ml). Se añadió un exceso de paladio en carbono 10 % y el medio reactivo se agitó a temperatura ambiente (aproximadamente 20 ºC) en atmósfera de hidrógeno durante 3 horas. El medio reactivo se filtró mediante una membrana millipore y el catalizador se aclaró con una mezcla de EtOH / CH2Cl2 (1 / 1). El filtrado se evaporó a presión reducida para dar lugar al compuesto 33 (168 mg; 97 %). C43H62NO30F3 (M = 1129,96 g / mol). Nota: en RMN se observaron rotámeros debidos a la presencia de NCOCF3. RMN 1H (400 MHz, CDCl3): δ 2,74 (app t, 0,5H, H1aA o H5aA, J = 12,1Hz), 2,84 (app t, 0,5 H, H1aA o H5aA, J = 11,6Hz), 3,12 (m, 1H, H1aA o H5aA), 3,41, 3,42, 3,44, 3,45, 3,46, 3,47, 3,48, 3,49 (8 CH3), 3,59 (m, 3H, H4a, H2a, OH), 3,74 (m, 1 H, H3a), 3,88 – 4,49 (m, 23H, 8CH2 MAc, 2H5, 1H1aB o 1H5aB, 4H6), 4,64 (m, 1H, H1aB o H5aB), 4,94 (s, 0,5H, H1), 5,01 (s, 0,5H, H1), 5,21 (s, 0,5H, H1), 5,25 (s, 0,5H, H1), 5,26 – 5,48 (m, 6H, 2H2, 2H3, 2H4). RMN 13C (101 MHz, CDCl3): δ 44,26, 45,61, 46,01, 47,69 (4 picos para C1a y C5a), 59,22 – 59,43 (7 CH3), 62,21, 62,24, 62,58 (3 picos para los H6), 65,85, 65,90, 65,98, 66,04, 68,57, 68,62, 69,07, 69,13, 69,53 (9 picos para C2, C3, C4, C5), 69,19, 69,22, 69,33, 69,42, 69,46 (4 CH2 MAc), 74,05, 74,78, 75,64, 75,84, 76,54, 77,25 (6 picos para C1a, C2a, C3a), 95,75, 98,99 (2 C), 116,10 (q, CF3, JC-F = 289Hz), 116,18 (q, CF3, JC-F = 289Hz), 155,58 (q, COCF3, JC-F = 36Hz), 155,62 (q, COCF3, JC-F = 36Hz), 169,16 – 170,18 (13 picos COMAc). RMN 19F (376 MHz, CDCl3): δ – 68,91, -68,72.

N – trifluoroacetamido – 2, 4 – bis – O – (2, 3, 4, 5 – 4 – O – metoxiacetil – α – D – manopiranosil) – (3 – O – (((S) – 2 – O – hexadecanoiloxi – 3 – O – octadecanoiloxi – propil) (bencil) fosforil) – 1, 5 – dideoxi – 1, 5 – imino – D – xilitol (compuesto 34, Figura 2c)

SFPIM322

Se añadió una solución 0,26 M en el CH2Cl2 anhidro del compuesto 22 (861 μl; 0,223 mmol; 1,5 eq) a una solución del compuesto 33 (168 mg; 0,149 mmol) en el CH2Cl2 anhidro (8 ml). Se añadió un tamiz 3Å y el medio reactivo se agitó durante 30 min a temperatura ambiente en atmósfera de argón. Se añadió una solución comercial de tetrazol (~ 0,45 M en acetonitrilo), secada con anterioridad y a 0 ºC (1,65 ml, 0,743 mmol, 5 eq) y la reacción continuó agitándose a temperatura ambiente durante 2 h. La mezcla reactiva se enfrió a – 40 ºC y se añadió una solución de ácido m – cloro – perbenzoica (m – CPBA) (50 %, 154 mg, 0,447 mmol, 3 eq) gota a gota en el CH2Cl2 (2 ml). Tras 2 h de agitación en la que el medio reactivo alcanzó la temperatura ambiente (aproximadamente 20 ºC), la reacción se detuvo por la adición de una solución acuosa al 50 % de Na2S2O3 (20 ml) y la mezcla se extrajo con dietil éter (Et2O) (80 ml). La fase orgánica se lavó 4 veces con una solución acuosa al 50 % de Na2S2O3 (3 x 20 ml), 1 vez con una solución saturada de NaHCO3, 1 vez con H2O y, posteriormente, se secó en MgSO4. El disolvente se

evaporó al vacío y el residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (Tolueno / acetona 4 / 1) para dar lugar al compuesto 34 (104 mg; 37 %) en forma de jarabe incoloro. C87H139NO37F3 (M = 1879,03 g / mol). Nota: los espectros son difícilmente interpretables. De hecho, se observan numerosos picos debido a los rotámeros relacionados con la presencia de NCOCF3, los diastereoisómeros relacionados con la presencia de fosfato bencilado y de la no equivalencia de los azúcares. También se pueden observar 4 picos para un único carbono anomérico. Cabe destacar igualmente que hay 4 picos en RMN del Flúor.

RMN 13C (101 MHz, CDCl3) : δ 94,47, 94,50, 94,91, 95,00 (1C1), 98,69, 98,76, 99,18 (2C) (1C1). RMN 31P (162 MHz, CDCl3) : δ – 0,92 RMN 19F (376 MHz, CDCl3): δ – 68,68, -68,67, -68,47, -68,44. SM –IS m / z M calculada: 1877,87; encontrada 1901,0 [M + Na]+.

N – trifluoroacetamido – 2, 4 – bis – O – (2, 3, 4, 5 – 4 – O – metoxiacetil – α – D – manopiranosil) – (3 – O – (((S) – 2 – O – hexadecanoiloxi – 3 – O – octadecanoiloxi – propil) fosforil) – 1, 5 – dideoxi – 1, 5 – imino – D – xilitol (compuesto 35, Figura 2c)

SFPIM323

El compuesto 34 (90 mg, 0,048 mmol) se disolvió en una mezcla de EtOH / CH2Cl2 (6 / 4 ml). Se añadió un exceso de paladio en carbono 10 % y el medio reactivo se agitó a temperatura ambiente (aproximadamente 20 ºC) en atmósfera de hidrógeno durante 3 h. El medio reactivo se filtró mediante una membrana millipore y el catalizador se aclaró con una mezcla de EtOH / CH2Cl2 (1 / 1). El filtrado se evaporó a presión reducida para dar lugar al compuesto 35 (82 mg, 95 %). C80H133NO37F3P (M = 1788,91 g / mol).

Nota: Los espectros son difícilmente interpretables. De hecho, se observan numerosos picos debido a los rotámeros relacionados con la presencia de NCOCF3 de la no equivalencia de los azúcares. Así pues, los diaesteroisómeros han desaparecido, el fosfato ha quedado desprotegido. Cabe destacar que hay 2 picos para un único carbono anomérico. Se observan igualmente 2 picos en RMN del Flúor.

RMN 13C (101 MHz, CDCl3) : δ 94,54, 94,98 (1C1), 98,65, 99,17 (1C1). RMN 31P (162 MHz, CDCl3) : δ – 1,36, -1,30. RMN 19F (376 MHz, CDCl3): δ – 68,66, -68,45.

Ejemplo 3: N – trifluoroacetamido – 2, 4 – bis – O – (α – D – manopiranosil) – (3 – O – (((S) – 2 – O – hexadecanoiloxi – 3 – O – octadecanoiloxi – propil) fosforil) – 1, 5 – dideoxi – 1, 5 – imino – D – xilitol (compuesto 36, Figura 2c)

SFPIM324 – t2

y

Ejemplo 4: 2,4 – bis – O –(α – D –manopiranosil) –(3 –O – (((S) – 2 –O – hexadecanoiloxi – 3 –O – octadecanoiloxi – propil) fosforil) – 1, 5 – dideoxi – 1, 5 – imino – D – xilitol (compuesto 37, Figura 2c)

SFPIM327 – t8

El compuesto 35 (80 mg, 0,045 mmol) se disolvió en una mezcla de CHCl3 / MeOH (0,2 / 0,8 ml). La mezcla reactiva se enfrió a 0 ºC y se añadió butilamina (164 μl). Tras 10 minutos de agitación a 0 ºC y 1 h y media suplementaria en la que el medio reactivo recuperó la temperatura ambiente (aproximadamente 20 ºC), los disolventes se evaporaron al vacío de alto grado a temperatura ambiente y el residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (CHCl3 / MeOH / H2O 70 / 40 / 1) para dar lugar en los primeros tubos al compuesto 36 (16 mg, 32 %) y en los tubos siguientes al compuesto 37 (21 mg, 48 %) en forma de sólidos blancos. Compuesto 36 C56H101NO21PF3 (M = 1212,39 g / mol).

Nota: se siguen observando rotámeros debidos a la presencia de NCOCF3, sobre todo a nivel de los H anoméricos.

RMN 1H (400 MHz, CDCl3 / CD3OD 0,4 / 0,2 mL): δ 0,89 (t, 6H, 2CH3, J = 6,7Hz), 1,27 (m, 52H), 1,61 (m, 4H), 2,32 (t, 2H, J = 7,6Hz), 2,34 (t, 2H, J = 7,6Hz), 3,20 – 4,22 (numerosos macizos), 4,91 (s, 0,5H, H1), 5,03 (s, 0,5H, H1); 5,12 (s, 0,5H, H1), 5,17 (s, 0,5H, H1), 5,25 (m; 1H, H2a'). RMN 31P (162 MHz, CDCl3 / CD3OD 0,4 / 0,2 mL) : δ 0,161. RMN 19F (376 MHz, CDCl3 / CD3OD 0,4 / 0,2 mL): δ – 68,34, -67,83. SM -IS (-) m / z M calculada : 1211,66; encontrada 1210,5 [M – H]-. Compuesto 37 C54H102NO20P (M = 1116,38 g / mol). Nota: ya no se observan los rotámeros a nivel de los H anoméricos. RMN 1H (250 MHz, CDCl3 / CD3OD / D2O difícilmente soluble): δ 0,89 (t, 6H, 2CH3, J = 6,8Hz), 1,27 (m, 52H), 1,60 (m, 4H), 2,31 (t, 2H, J = 7,3Hz), 2,34 (t, 2H, J = 7,3Hz), 3,00 – 4,5 (numerosos macizos), 4,93 (s, 1H, H1), 5,08 (s, 1H, H1), 5,23 (m, 1H, H2a'). RMN 31P (162 MHz, CDO3 / CD3OD / D2O difícilmente soluble) : δ 0,670

5 10 15 20 25: SM – IS (-) m / z M calculada : 1115,67; encontrada 1116,0 [M + Na]+ . 2) Estimulación de los macrófagos de ratones salvajes por LPS en presencia de los compuestos 36 y 37 Los compuestos 36 de la Figura 2c o PIM – 2 – mimNCOCF3 (SFPIM324 – t2) y 37 de la Figura 2c o PIM – 2 – mimNH (SFPIM324 – t8) han sido probados por su actividad inhibidora en los macrófagos estimulados por LPS (figuras 15 a 17). Los macrófagos derivados de la médula ósea de ratones salvajes se cultivaron en placas de cultivo de 96 pocillos con 105 células por pocillo y, a continuación, fueron estimulados con LPS (100 ng / ml, Escherichia. Coli, serotipo O111: B4, SIGMA) con el PIM1 (SFPIM145), el isoPIM1C16C18 (SFPIM219) o los compuestos PIM – 2 – mimNCOCF3 (SFPIM324 – t2) o PIM – 2 – mimNH (SFPIM324 – t8) (valorados en 1, 3, 10, 30 μg / ml) o de controles DMSO. Las preparaciones de SFPIM145, SFPIM219, SFPIM324 – t2 y SFPIM324 – t8 liofilizadas empleadas son solubilizadas en DMSO y adicionadas a los cultivos a una concentración final máxima no citotóxica del 1 %. Tras 24 horas de estimulación, los sobrenadantes de cultivo fueron colectados y analizados por su contenido en citoquinas TNF – α o IL – 12p40 mediante ELISA (R & D Duoset, Minneapolis, MO). Los resultados corresponden a la media aproximada de SD de n = 2 ratones por genotipo. Los compuestos PIM – 2 – mimNCOCF3 (SFPIM324 – t2) e isoPIM1C16C18 (SFPIM219) inhiben fuertemente la secreción de TNF, mientras que el PIM1 (SFPIM145) y PIM – 2 – mimNH (SFPIM324 – t8) la inhiben menos (Figura 15). El test de viabilidad de células en MTT realizado en los mismos macrófagos indica cierta toxicidad con la concentración más alta, sobre todo en presencia de PIM – 2 – mimNH (SFPIM324 – t8) (Figura 16). La secreción de IL – 12p40 en respuesta al LPS queda prácticamente eliminada en concentraciones de 10 ug / ml de PIM – 2 – mimNCOCF3 (SFPIM324 – t2) y de isoPIM1C16C18 (SFPIM219), mientras que PIM1 (SFPIM145) y PIM – 2 – mimNH (SFPIM324 – t8) inhiben parcialmente a esta concentración (Figura 17).

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Compuesto de la fórmula general (I): 5

en la que:

C20, un radical acilo C1 –C20, siendo entendido siempre y cuando uno de los sustituyentes R1 o R2 sea 25 un átomo de hidrógeno, el otro sustituyente sea diferente al de hidrógeno;

•

Z1 y Z2 representan, independientemente el uno del otro, un átomo de hidrógeno, al menos un azúcar seleccionado del grupo formado por manosa, glucosa, galactosa siendo entendido siempre y cuando uno de los sustituyentes Z1 o Z2 sea un átomo de hidrógeno, el otro sustituyente sea diferente al de hidrógeno;

•

Q representa a – OP (O)2O -, -OCO2 -, NHCO2 -, NHCONH -;

•

Y representa un átomo de hidrógeno, un radical hidroxilo, un radical alcoxi en C1 –C6 – (CH2)n –OH donde n es un número entero igual a 1, 2 o 3, siendo entendido siempre y cuando Y sea un radical hidroxilo; y Z1 y Z2 no representen a los dos grupos de un átomo de hidrógeno;

• A representa –-CH2 -; 35 • X representa un átomo de hidrógeno;

• o A y X forman un enlace para conducir a un ciclo de 6 eslabones en el que

! A representa un – CH-,

! X representa un -CH2 -, -CH (OH) -, un átomo de oxígeno, un –NR3 – en el que R3 es un

átomo de hidrógeno, un radical alquilo en C1 –C6 o un radical acilo en C1 –C20,

siendo entendido siempre y cuando

! A y X formen un enlace para conducir a un ciclo de 6 eslabones,

! X =-CH (OH) -,

! Y = -OH, y

! Z1 y Z2 representen, independientemente el uno del otro, al menos un azúcar seleccionado del

45 grupo formado por manosa, glucosa y galactosa el ciclo de 6 miembros tenga una configuración mioinositol con Z1 o Z2 en posición 1 y representen, al menos un azúcar, sabiendo que “alquilo” se refiere a un radical carbonado lineal, ramificado o cíclico, saturado o insaturado, eventualmente sustituido, que comprende 1 a 20 átomos de carbono, sabiendo que “acilo” se refiere a un radical – COR´ en el que R´ es un radical alquilo tal y como se ha definido anteriormente, sabiendo que “alcoxi” se refiere a un radical – OR´ en el que R´ es un radical alquilo tal y como se ha definido anteriormente;

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables;

55 sabiendo que “sales farmacéuticamente aceptables” se refiere a las sales preparadas con ácidos o bases no tóxicas.
2. Compuesto según la reivindicación 1 en el que A y X forman un enlace para conducir un ciclo de 6 eslabones, fórmula (Ia)

en la que:

• A representa –-CH -;

20 • X representa un -CH2 -, -CH (OH) -, un átomo de oxígeno, un –NR3 – en el que R3 es un átomo de hidrógeno, un radical alquilo en C1 –C6 o un radical acilo en C1 –C20,

siendo entendido siempre y cuando

25 • X =-CH (OH) -,

•

Y = -OH, y

•

Z1 y Z2 representen, independientemente el uno del otro, al menos un azúcar seleccionado del grupo formado por manosa, glucosa y galactosa el ciclo de 6 miembros tenga una configuración mioinositol con Z1 o Z2 en posición 1 y representen, al

30 menos un azúcar o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
3. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que A y X forman un enlace para conducir un ciclo de 6 eslabones en el que

35 • R1 y R2 son aquellos definidos de la reivindicación 1;

•

Q representa a – OP (O)2O -;

•

A representa –-CH -;

•

X representa un -CH (OH) -,

•

Y representa un radical hidroxilo;

40 • Z1 y Z2 representan, independientemente el uno del otro, al menos un azúcar seleccionado del grupo formado por manosa, glucosa y galactosa el ciclo de 6 miembros tiene una configuración mioinositol con Z1 o Z2 en posición 1 y representan, al menos un azúcar o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

45 4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 en el que A y X forman un enlace para conducir un ciclo de 6 eslabones en el que

• R1 y R2, Z1 y Z2 Q e Y son aquellos definidos de la reivindicación 1;

• Q representa a – OP (O)2O -; 50 • A representa –-CH -;

• X representa un –NR3 – en el que R3 es un átomo de hidrógeno, un radical alquilo en C1 –C6 o un radical acilo en C1 –C20, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
5. Compuesto según la reivindicación 1 de la fórmula (Ib) 55

•

•

A representa –-CH2-;

•

X representa un átomo de hidrógeno o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 en el que A y X forman un enlace para conducir un ciclo de 6 eslabones en el que

• R1 y R2 representan, independientemente el uno del otro, un radical acilo en C1 –C20 25 • Z1 representa la manosa;

•

Z2 representa el átomo de hidrógeno;

•

Q representa a – OP (O)2O -;

•

A representa –-CH -;

•

X representa un -CH (OH) -,

•

Y representa un radical hidroxilo;

•

El ciclo de 6 eslabones tiene una configuración mioinositol con Z1 en posición 1

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

35 7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que las sales farmacéuticamente aceptable son las sales de sodio, potasio, calcio, amonio, magnesio, las sales derivadas de ácido clorhídrico, bromhídrico, nítrico, carbónico, monohidrógeno carbónico, fosfórico, monohidrógeno fosfórico, dihidrógeno fosfórico, sulfúrico, monohidrógeno sulfúrico e iodhídrico, las sales derivadas de ácido acético, propiónico, isobutírico, maléico, malónico, benzóico, succínico, subérico, fumárico, láctico, mandélico, ftálico, bencensulfónico, p – tolilsulfónico, cítrico, tartárico, metansulfónico.
8. Procedimiento de preparación de los compuestos definidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que:

55 en la que

• G = OH o NH2

10 en la que

• J = OH o NH,

• K = P –Obn, P(O)n o C = O, 15 • L = grupo saliente

b) el intermediario (IV) se condensa con un derivado de poliol o un aminopoliol de la fórmula general (V)

35 en la que

• G = OH o NH2,

•

Z3 y Z4, representan independientemente el uno del otro, un hexopiranosa con configuración mano,

gluco o galacto y llevando a los grupos protectores de acetilo o metoxiacetilo o un grupo bencilo, siendo 40 entendido siempre que al menos uno de los grupos Z3 y Z4 represente un azúcar protegido.

• R4 representa un grupo protector seleccionado del grupo que contiene un grupo bencilo o un radical alcoxiacetilo en C1 –C6,

o se condensa el intermediario (IV) con un compuesto cíclico de la fórmula general (VI)

60 en la que

•

G = OH o NH2,

•

Z3 y Z4, tienen las mismas definiciones que anteriormente

• Y2 = H o un grupo – OR4 o un grupo – (CH2)n OR4 en el que R4 tiene la misma definición que 65 anteriormente

• X2 = -CH2 , -CHOR 4, –NR3, u O en el que R3 es un átomo de hidrógeno, un radical alquilo en C1 –C6

o un radical acilo en C1 –C20 y R4 representa un grupo protector, como un grupo bencilo o un radical alcoxiacetilo en C1 –C6

eventualmente en presencia de un agente de acoplamiento;

c) eventualmente, se somete el compuesto obtenido de la etapa b) a una reacción de oxidación para dar un compuesto de la fórmula general (VII)

25 en la que

•

J y J´ = OH o NH

•

M = P (O) OBn o C = O

o un compuesto de la fórmula general (VIII)

en la que

•

J y J´ = OH o NH

•

M = P (O) OBn o C = O

•

X2 Y2, Z3, R1, R2 R4 tienen las mismas definiciones que anteriormente,

d) se somete el producto de la fórmula general (VII) o de la fórmula general (VIII) a una desprotección en dos etapas que consiste primero en el tratamiento con una alquilamina seleccionada del grupo formado por t – butilamina para luego someter los productos desacilados a una hidrogenación catalítica.
9.

Compuesto definido como medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
10.

Composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y en cualquier excipiente farmacéuticamente aceptable.
11.

Utilización de un compuesto tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la fabricación de un medicamento destinado a la prevención o al tratamiento de una enfermedad asociada a la

sobreexpresión de citoquinas o de quimioquinas, particularmente de TNF y / o de la IL – 12, dicha enfermedad

comprende:

A) Las enfermedades inmunes o autoinmunes seleccionadas del grupo formado por la artritis reumatoide,

5

la diabetes mellitas, el lupus eritematoso sistémico o la enfermedad de Basedow.

B) El rechazo del injerto.

C) Las infecciones virales y / o parasitarias.

D) Los choques resultantes de una infección crónica o aguda de origen bacteriano, viral y / o parasitario.

E) Las enfermedades inflamatorias seleccionadas del grupo formado por las enfermedades crónicas y las

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enfermedades inflamatorias vasculares.

F) Enfermedades neurodegenerativas seleccionadas del grupo formado por las enfermedades

desmielinizantes, las enfermedades extrapiramidales y las cerebelosas.

G) Las patologías malignas que implican tumores secretores de TNF o que implican al TNF, seleccionadas

del grupo formado por leucemia y linfoma.

15

H) Hepatitis inducida por alcohol.
12.

Utilización según la reivindicación 11, según la cual el medicamento se destina a la prevención o al tratamiento

de una enfermedad inflamatoria.

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