ES2441182T3 - Producción fermentativa de alcoholes de cuatro carbonos - Google Patents

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ES2441182T3 ES07776684.8T ES07776684T ES2441182T3 ES 2441182 T3 ES2441182 T3 ES 2441182T3 ES 07776684 T ES07776684 T ES 07776684T ES 2441182 T3 ES2441182 T3 ES 2441182T3
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Andrew C. Eliot
Vasantha Nagarajan
Charles E. Nakamura
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Abstract

Célula hospedadora microbiana recombinante que comprende moléculas de ADN heterólogo que codificanpolipéptidos que catalizan las conversiones de sustrato en producto: i) piruvato en α-acetolactato; ii) α-acetolactato en acetoína; iii) acetoína en 2,3-butanodiol; iv) 2,3-butanodiol en 2-butanona; y v) 2-butanona en 2-butanol; en donde dicha célula hospedadora microbiana produce 2-butanol.

Description

Producción fermentativa de alcoholes de cuatro carbonos
Esta solicitud reclama la prioridad sobre 35 U.S.C. § 119 de la solicitud provisional de los EE.UU. de n.º de serie 60/796816, registrada el 2 de mayo de 2006, y la solicitud provisional de los EE.UU. de n.º de serie 60/871156, registrada el 21 de diciembre de 2006.
Campo de la invención
La invención se refiere al ámbito de la microbiología industrial y de la producción de los alcoholes. Más específicamente, el 2-butanol se produce mediante la fermentación industrial de un microorganismo recombinante. Los microorganismos recombinantes y los procedimientos de la invención también pueden adaptarse para producir 2-butanona, un producto intermedio de las vías biosintéticas del 2-butanol descritas en la presente memoria.
Antecedentes de la invención
El butanol es un compuesto químico industrial importante, útil como aditivo de combustibles, como compuesto químico que sirve de materia prima en la industria del plástico, y como disolvente de extracción con calidad alimentaria en la industria alimentaria y de los aromas. Cada año se producen de 10.000 a 12.000 millones de libras de butanol por medios petroquímicos y con toda probabilidad aumentará la necesidad el comercio de este compuesto químico. La 2-butanona, también denominada metiletilcetona (MEK), es un disolvente ampliamente utilizado y es la cetona de producción comercial más importante, tras la acetona. Se utiliza como un disolvente para pinturas, resinas y adhesivos, y también como disolvente de extracción selectivo y activador de reacciones oxidativas.
Se conocen los procedimientos para la síntesis química de la 2-butanona, tales como la deshidrogenación del 2butanol, o en un procedimiento en el cual el butano líquido se oxida catalíticamente para dar 2-butanona y ácido acético («Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry», 6.ª edición, 2003, Wiley-VCHVerlag GmbH y Co., Weinheim, Alemania, vol. 5, págs. 727-732). La 2-butanona también se puede convertir químicamente en 2-butanol mediante hidrogenación (Breen et al., J of Catalysts 236: 270-281 (2005)). Se conocen los procedimientos para la síntesis química del 2-butanol, tal como la hidratación del n-buteno («Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry», 6.ª edición, 2003, Wiley-VCHVerlag GmbH y Co., Weinheim, Alemania, vol. 5, págs. 716-719). Estos procedimientos parten de materiales procedentes de sustancias petroquímicas y por lo general son caros, y no respetan el medio ambiente. La producción de 2-butanona y 2-butanol a partir de materiales brutos de origen vegetal disminuiría al mínimo las emisiones de efecto invernadero y representaría un avance en la técnica.
También se conocen procedimientos para producir 2-butanol mediante la biotransformación de otras sustancias orgánicas. Por ejemplo, Stampfer et al., (patente internacional WO 03/078615) describe la producción de alcoholes secundarios, tales como el 2-butanol, por la reducción de cetonas, lo que está catalizado por una enzima, la alcohol deshidrogenasa, obtenida de Rhodococcus ruber. De igual forma, Kojima et al. (patente europea EP 0645453) describen un procedimiento para preparar alcoholes secundarios, tales como el 2-butanol, mediante la reducción de cetonas catalizada por una enzima, la alcohol deshidrogenasa secundaria, obtenida de Candida parapsilosis. Adicionalmente, Kuehnle et al. (patente europea EP 1149918) describe un procedimiento que produce tanto 1butanol como 2-butanol mediante la oxidación de hidrocarburos con distintas cepas de Rhodococcus ruber. El procedimiento favoreció la producción de 1-butanol con una selectividad del 93,8%.
También se conoce la producción de 2-butanol desde determinadas cepas de Lactobacillus (Speranza et al. J. Agric. Food Chem. (1997) 45: 3476-3480). El 2-butanol se produce mediante la transformación del meso-2,3-butanodiol. También se demostró que estas cepas de Lactobacillus producían el 2-butanol a partir de acetolactato y de acetoína. Sin embargo, no se ha descrito el diseño de un microorganismo recombinante que produzca el 2-butanol.
Por lo tanto, existe la necesidad de procedimientos rentables para la producción de 2-butanol y 2-butanona, y que sean responsables con el medio ambiente. La presente invención trata esta necesidad a través del descubrimiento de hospedadores recombinantes de origen microbiano que expresan las vías biosintéticas del 2-butanol y de la 2butanona.
Compendio de la invención
La invención da a conocer un microorganismo recombinante que tiene una vía biosintética genomanipulada del 2butanol. También se da a conocer un microorganismo recombinante que tiene una vía biosintética de la 2-butanona genomanipulada, que es la misma que la vía biosintética del 2-butanol con omisión de la última etapa. Los microorganismos genomanipulados se pueden utilizar para la producción comercial del 2-butanol o de la 2-butanona.
De acuerdo con esto, la presente invención da a conocer una célula hospedadora microbiana recombinante que comprende moléculas de ADN heterólogo que codifican polipéptidos que catalizan las conversiones de sustrato en producto:
i) piruvato en a-acetolactato; ii) a-acetolactato en acetoína; iii) acetoína en 2,3-butanodiol; iv) 2,3-butanodiol en 2-butanona; y v) 2-butanona en 2-butanol;
en dónde dicha célula hospedadora microbiana produce 2-butanol. También se describe en la presente memoria una célula hospedadora microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica un polipéptido que cataliza la conversión de sustrato en producto
seleccionada del grupo que consiste en: i) piruvato en a-acetolactato; ii) a-acetolactato en acetoína; iii) acetoína en 2,3-butanodiol; iv) 2,3-butanodiol en 2-butanona; y v) 2-butanona en 2-butanol;
en donde al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula hospedadora microbiana y en donde dicha
célula hospedadora microbiana produce 2-butanol. En otra realización, la invención da a conocer una célula hospedadora microbiana recombinante que comprende moléculas de ADN heterólogo que codifican polipéptidos que catalizan las conversiones de sustrato en producto;
i) piruvato en a-acetolactato; ii) a-acetolactato en acetoína; iii) acetoína en 2,3-butanodiol; y iv) 2,3-butanodiol en 2-butanona;
en donde dicha célula hospedadora microbiana produce 2-butanona. También se describe en la presente memoria una célula hospedadora microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica un polipéptido que cataliza la conversión de un sustrato en producto
seleccionada del grupo que consiste en: i) piruvato en a-acetolactato; ii) a-acetolactato en acetoína; iii) acetoína en 2,3-butanodiol; y iv) 2,3-butanodiol en 2-butanona;
en donde al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula hospedadora microbiana y en donde dicha célula hospedadora microbiana produce 2-butanona.
En otra realización, la invención da a conocer un procedimiento para la producción de 2-butanol que comprende: 1) proporcionar una célula hospedadora microbiana recombinante que comprende moléculas de ADN heterólogo que codifican polipéptidos que catalizan las conversiones de sustrato en producto:
i) piruvato en a-acetolactato; ii) a-acetolactato en acetoína; iii) acetoína en 2,3-butanodiol; iv) 2,3-butanodiol en 2-butanona; y v) 2-butanona en 2-butanol;
en donde dicha célula hospedadora microbiana produce 2-butanol; y
2) poner en contacto la célula hospedadora de 1) con un sustrato de carbono fermentable en un medio de fermentación en las condiciones en las que se produce 2-butanol. También se describe en la presente memoria un procedimiento para la producción de 2-butanol que comprende: 1) proporcionar una célula hospedadora microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de
ADN que codifica un polipéptido que cataliza la conversión de un sustrato a un producto seleccionada del grupo que consiste en: i) piruvato en a-acetolactato; ii) a-acetolactato en acetoína; iii) acetoína en 2,3-butanodiol; iv) 2,3-butanodiol en 2-butanona; y v) 2-butanona en 2-butanol;
en donde al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula hospedadora microbiana; y 2) poner en contacto la célula hospedadora de (1) con un sustrato de carbono fermentable en un medio de fermentación en las condiciones en las que se produce 2-butanol.
En otra realización, la invención da a conocer un procedimiento para la producción de 2-butanona que comprende: 1) proporcionar una célula hospedadora microbiana recombinante que comprende moléculas de ADN
heterólogo que codifican polipéptidos que catalizan las conversiones de sustrato en producto: i) piruvato en a-acetolactato; ii) a-acetolactato en acetoína; iii) acetoína en 2,3-butanodiol; y iv) 2,3-butanodiol en 2-butanona;
en donde dicha célula hospedadora microbiana produce 2-butanona; y
2) poner en contacto la célula hospedadora de 1) con un sustrato de carbono fermentable en un medio de fermentación en las condiciones en las que se produce la 2-butanona. También se describe un procedimiento para la producción de 2-butanona que comprende: 1) proporcionar una célula hospedadora microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de
ADN que codifica un polipéptido que cataliza la conversión de un sustrato en un producto seleccionada del grupo que consiste en: i) piruvato en a-acetolactato; ii) a-acetolactato en acetoína; iii) acetoína en 2,3-butanodiol; y iv) 2,3-butanodiol en 2-butanona;
en donde al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula hospedadora microbiana; y 2) poner en contacto la célula hospedadora de (1) con un sustrato de carbono fermentable en un medio de fermentación en las condiciones en las que se produce la 2-butanona.
En otra realización, la invención da a conocer un medio de fermentación que comprende: a) 2-butanol; y b) la célula hospedadora microbiana recombinante de la invención. En otra realización, la invención da a conocer un medio de fermentación que comprende: a) 2-butanona; y
b) la célula hospedadora microbiana recombinante de la invención.
También se describe en la presente memoria el medio que contiene el producto de fermentación 2-butanol o 2butanona producido por el procedimiento de la invención.
Breve descripción de las figuras, tablas y descripciones de las secuencias
5 La invención se puede conocer con más profundidad a partir de las siguientes descripción detallada, figuras y descripciones de las secuencias acompañantes, que forman parte de esta solicitud.
La figura 1 muestra las cuatro diferentes vías de la biosíntesis de 2-butanona y de 2-butanol.
La figura 2 muestra un árbol filogenético de las subunidades mayores completas de las diol/glicerol deshidratasas, en donde se han retirado las secuencias con una identidad >95% (salvo las secuencias cuya función ha sido
10 verificada experimentalmente, que se conservaron) y una clave que recoge la identidad de cada secuencia del árbol. Las secuencias cuya función se ha determinado experimentalmente que es diol o glicerol deshidratasa están resaltadas en gris oscuro o gris claro, respectivamente.
La figura 3 muestra un árbol filogenético de las subunidades medianas completas de las diol/glicerol deshidratasas, en donde se han retirado las secuencias con una identidad >95%, y una clave que recoge la identidad de cada
15 secuencia del árbol. Las secuencias cuya función se ha determinado experimentalmente que es diol o glicerol deshidratasa están resaltadas en gris oscuro o gris claro, respectivamente.
La figura 4 muestra un árbol filogenético de las subunidades menores completas de las diol/glicerol deshidratasas, en donde se han retirado las secuencias con una identidad >95%, y una clave que recoge la identidad de cada secuencia del árbol. Las secuencias cuya función se ha determinado experimentalmente que es diol o glicerol
20 deshidratasa están resaltadas en gris oscuro o gris claro, respectivamente.
La tabla 12 es una tabla del perfil de HMM de la subunidad mayor a para la enzima diol/glicerol deshidratasa. La tabla 12 se ha enviado aquí por vía electrónica.
La tabla 13 es una tabla del perfil de HMM de la subunidad mediana � para la enzima diol/glicerol deshidratasa. La tabla 13 se ha enviado aquí por vía electrónica .
25 La tabla14 es una tabla del perfil de HMM de la subunidad menor y para la enzima diol/glicerol deshidratasa. La tabla 14 se ha enviado aquí por vía electrónica .
Las siguientes secuencias se atienen a la 37 C.F.R. 1.821-1.825 («Requisitos para las solicitudes de patentes que contienen descripciones de secuencias nucleotídicas y/o secuencias aminoacídicas: las Normas de las Secuencias» y son acordes con el estándar ST.25 (1998) de la Organización Mundial de la Propiedad Intelectual (OMPI) y los
30 requisitos de listas de secuencias de la EPO y de la PCT (Normas 5.2 y 49.5 (a-bis) y apartado 208 y anexo C de las Instrucciones administrativas). Los símbolos y el formato utilizados para los datos de secuencias nucleotídicas y aminoacídicas cumplen con las normas presentadas en 37 C.F.R. § 1.822.
Tabla 1
Resumen de los números de SEQ ID de las proteínas y de los ácidos nucleicos
Descripción
SEQ ID del ácido nucleico SEQ ID de la proteína
BudA, acetolactato descarboxilasa de Klebsiella pneumoniae ATCC 25955
1 2
alsD, acetolactato descarboxilasa de Bacillus subtilis
80 81
budA, acetolactato descarboxilasa de Klebsiella terrigena
82 83
budB, acetolactato sintasa de Klebsiella pneumoniae ATCC 25955
3 4
alsS, acetolactato sintasa de Bacillus subtilis
76 77
budB, acetolactato sintasa de Klebsiella terrigena
78 79
budC, butanodiol deshidrogenasa de Klebsiella pneumoniae IAM1063
5 6
butanodiol deshidrogenasa de Bacillus cereus
84 85
Resumen de los números de SEQ ID de las proteínas y de los ácidos nucleicos
Descripción
SEQ ID del ácido nucleico SEQ ID de la proteína
butanodiol deshidrogenasa de Bacillus cereus
86 87
butB, butanodiol deshidrogenasa de Lactococcus lactis
88 89
pddA, subunidad a de la butanodiol deshidratasa de Klebsiella oxytoca ATCC 8724
7 8
pddB, subunidad �de la butanodiol deshidratasa de Klebsiella oxytoca ATCC 8724
9 10
pddC, subunidad y de la butanodiol deshidratasa de Klebsiella oxytoca ATCC 8724
11 12
pduC, subunidad mayor de la diol deshidratasa dependiente de B12 de Salmonella typhimurium
92 93
pduD, subunidad mediana de la diol deshidratasa dependiente de B12 de Salmonella typhimurium
94 95
pduE, subunidad menor de la diol deshidratasa dependiente de B12 de Salmonella typhimurium
96 97
pduC, subunidad grande de la diol deshidratasa dependiente de B12 de Lactobacillus collinoides
98 99
pduD, subunidad mediana de la diol deshidratasa dependiente de B12 de Lactobacillus collinoides
100 101
pduE, subunidad menor de la diol deshidratasa dependiente de B12 de Lactobacillus collinoides
102 103
pddC, subunidad a de la diol deshidratasa dependiente de adenosilcobalamina de Klebsiella pneumoniae
104 105
pddD, subunidad � de la diol deshidratasa dependiente de adenosilcobalamina de Klebsiella pneumoniae
106 107
pddD, subunidad y de la diol deshidratasa dependiente de la adenosilcobalamina de Klebsiella pneumoniae
108 109
ddrA, subunidad mayor del factor reactivador de la diol deshidratasa de Klebsiella oxytoca
110 111
ddrB, subunidad menor del factor reactivador de la diol deshidratasa de Klebsiella oxytoca
112 113
pduG, subunidad mayor del factor reactivador de la diol deshidratasa de Salmonella typhimurium
114 115
pduH, subunidad menor del factor reactivador de la diol deshidratasa de Salmonella typhimurium
116 117
pduG, subunidad mayor del factor reactivador de la diol deshidratasa de Lactobacillus collinoides
118 119
pduH, subunidad menor del factor reactivador de la diol deshidratasa de Lactobacillus collinoides
120 121
sadH, butanol deshidrogenasa de Rhodococcus ruber 219
13 14
Resumen de los números de SEQ ID de las proteínas y de los ácidos nucleicos
Descripción
SEQ ID del ácido nucleico SEQ ID de la proteína
adhA, butanol deshidrogenasa de Pyrococcus furiosus
90 91
chnA, ciclohexanol deshidrogenasa de Acinteobacter sp.
71 72
yqhD, butanol deshidrogenasa de Escherichia coli
74 75
amina:piruvato transminasa de Vibrio fluvialis (una acetoína aminasa)
144 codones opc. 122
amino alcohol cinasa de Erwinia carotovora subsp. atroseptica
123 124
amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia carotovora subsp. atroseptica
125 126
budC, acetoína reductasa (butanodiol deshidrogenasa) de Klebsiella terrigena (ahora Raoultella terrigena)
133 134
Subunidad a de la glicerol deshidratasa de Klebsiella pneumoniae
145 146
Subunidad �de la glicerol deshidratasa de Klebsiella pneumoniae
147 148
Subunidad y de la glicerol deshidratasa de Klebsiella pneumoniae
149 150
subunidad mayor de la reactivasa de la glicerol deshidratasa de Klebsiella pneumoniae
151 152
subunidad menor de la reactivasa de la glicerol deshidratasa de Klebsiella pneumoniae
153 154
Las SEQ ID n.º 15 a 65 son las secuencias nucleotídicas de los oligonucleótidos para PCR, clonación, escrutinio y
cebadores de secuenciación utilizados en los ejemplos. La SEQ ID n.º 66 es la secuencia nucleotídica de la región eliminada del gen yqhD en la cepa de E. coli MG1655 LyqhCD, descrita en el ejemplo 11.
5 La SEQ ID n.º 67 es la secuencia nucleotídica de una variante del promotor de la glucosa isomerasa 1.6GI.
La SEQ ID n.º 68 es la secuencia nucleotídica del promotor 1.5GI.
La SEQ ID n.º 69 es la secuencia nucleotídica del operón de la diol deshidratasa de Klebsiella oxytoca.
La SEQ ID n.º 70 es la secuencia nucleotídica del operón del factor reactivador de la diol deshidratasa de Klebsiella
oxytoca.
10 La SEQ ID n.º 73 es la secuencia nucleotídica de pDCQ2, que se describe en el ejemplo 9.
Las SEQ ID n.º 127 a 132 son las secuencias nucleotídicas de otros oligonucleótidos para PCR y cebadores para clonación utilizados en los ejemplos. La SEQ ID n.º 155 es una región codificante con optimización de codones para la amino alcohol cinasa de Erwinia
carotovora subsp. atroseptica.
15 La SEQ ID n.º 156 es una región codificante con optimización de codones para la amino alcohol O-fosfato liasa de
Erwinia carotovora subsp. atroseptica.
Las SEQ ID n.º 157 a 163 son las secuencias nucleotídicas de otros oligonucleótidos para PCR y cebadores de
clonación utilizados en los ejemplos.
La SEQ ID n.º 275 es la secuencia nucleotídica de un operón de Erwinia carotovora subsp. atropseptica. 20
Tabla 2
Otras subunidades grandes, medianas y pequeñas de las glicerol y diol deshidratasas
aDescripción
bSubunidad SEQ ID de la proteína
Subunidades correspondientes del mismo organismoc
Subunidad a de la glicerol deshidratasa de Clostridium pasteurianum
L 135
Subunidad �de la glicerol deshidratasa de Clostridium pasteurianum
M 136
Subunidad y de la glicerol deshidratasa de Clostridium pasteurianum
S 137
Subunidad a de la glicerol deshidratasa de Escherichia blattae
L 138
Subunidad �de la glicerol deshidratasa de Escherichia blattae
M 139
Subunidad y de la glicerol deshidratasa de Escherichia blattae
S 140
Subunidad a de la glicerol deshidratasa de Citrobacter freundii
L 141
Subunidad �de la glicerol deshidratasa de Citrobacter freundii
M 142
Subunidad y de la glicerol deshidratasa de Citrobacter freundii
S 143
Subunidad a de la diol deshidratasa de Lactobacillus brevis
L 164
Subunidad �de la diol deshidratasa de Lactobacillus brevis
M 165
Subunidad y de la diol deshidratasa de Lactobacillus brevis
S 166
Subunidad a de la diol deshidratasa de Salmonella enterica subsp. enterica serovar Coleraesuis str. SC-B67
L 167
Subunidad �de la diol deshidratasa de Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis str. SC-B67
M 168
Subunidad y de la diol deshidratasa de Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis str. SC-B67
S 169
Subunidad mayor de la propanodiol deshidratasa de Escherichia coli E24377A
L 170
Subunidad mediana de la diol/glicerol deshidratasa de Escherichia coli E24377A
M 171
Subunidad menor de la propanodiol deshidratasa de Escherichia coli E24377A
S 172
Subunidad mayor de la diol deshidratasa de Shigella sonnei Ss046
L 173
Subunidad mediana de la diol deshidratasa de Shigella sonnei Ss046
M 174
Subunidad menor de la diol deshidratasa de Shigella sonnei Ss046
S 175
Subunidad mayor de la propanodiol deshidratasa de Yersinia bercovieri ATCC 43970
L 176
Otras subunidades grandes, medianas y pequeñas de las glicerol y diol deshidratasas
aDescripción
bSubunidad SEQ ID de la proteína
Proteína hipotética YberA_01000484 de Yersinia bercovieri ATCC 43970
M 177
Subunidad menor de la propanodiol deshidratasa de Yersinia bercovieri ATCC 43970
S 178
Subunidad mayor de la propanodiol deshidratasa de Yersinia mollaretii ATCC 43969
L 179
Proteína hipotética YmolA_010001292 de Yersinia mollaretii ATCC 43969
M 180
Subunidad menor de la propanodiol deshidratasa de Yersinia mollaretii ATCC 43969
S 181
Subunidad mayor de la diol deshidratasa de Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica 8081
L 182
Subunidad mediana de la diol deshidratasa de Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica 8081
M 183
Subunidad menor de la diol deshidratasa de Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica 8081
S 184
Subunidad mayor de la propanodiol deshidratasa de Yersinia intermedia ATCC 29909
L 185
Subunidad mediana de la diol/glicerol deshidratasa de Yersinia intermedia ATCC 29909
M 186
Subunidad menor de la propanodiol deshidratasa de Yersinia intermedia ATCC 29909
S 187
Subunidad mayor de la glicerol deshidratasa de Listeria welshimeri serovar 6b str. SLCC5334
L 188
Subunidad mediana de la deshidratasa de utilización de propanodiol de Listeria welshimeri serovar 6b str. SLCC5334
M 189
Subunidad menor de la deshidratasa de utilización de propanodiol de Listeria welshimeri serovar 6b str. SLCC5334
S 190
Proteína hipotética lin1117 de Listeria innocua Clip11262
L 191
Proteína hipotética lin1118 de Listeria innocua Clip11262
M 192
Proteína hipotética lin1119 de Listeria innocua Clip11262
S 193
Proteína hipotética Imo1153 de Listeria monocytogenes EGD-e
L 194
Proteína hipotética Imo1154 de Listeria monocytogenes EGD-e
M 195
Proteína hipotética lmo1155 de Listeria monocytogenes EGD-e
S 196
Subunidad mayor de la glicerol deshidratasa de Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str. CT18
L 197
Subunidad mediana de la diol deshidratasa de Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str. CT18
M 198
Otras subunidades grandes, medianas y pequeñas de las glicerol y diol deshidratasas
aDescripción
bSubunidad SEQ ID de la proteína
Subunidad menor de la diol deshidratasa de Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str. CT18
S 199
Subunidad mayor de la posible glicerol deshidratasa de Escherichia coli
L 200
Subunidad mediana de la posible diol deshidratasa de Escherichia coli
M 201
Subunidad menor de la posible diol deshidratasa de Escherichia coli
S 202
Subunidad mayor de la glicerol deshidratasa de Listeria monocytogenes str. 4b F2365
L 203
Utilización de propanodiol: deshidratasa, subunidad mediana de Listeria monocytogenes str. 4b F2365
M 204
Utilización de propanodiol: deshidratasa, subunidad menor de Listeria monocytogenes str. 4b F2365
S 205
Subunidad mayor pduC de la posible glicerol deshidratasa de Streptococcus sanguinis SK36
L 206
Utilización de propanodiol: subunidad mediana de la posible deshidratasa de Streptococcus sanguinis SK36
M 207
Subunidad menor de la posible diol deshidratasa dependiente de B12 de Streptococcus sanguinis SK36
S 208
DhaB de Escherichia blattae
L 209
DhaC de Escherichia blattae
M 210
DhaE de Escherichia blattae
S 211
Subunidad mayor de la glicerol deshidrogenasa dependiente de la coenzima B12 de Clostridium perfringens str. 13
L 212
Subunidad mediana de la glicerol deshidrogenasa dependiente de la coenzima B12 de Clostridium perfringens str. 13
M 213
Subunidad menor de la glicerol deshidrogenasa dependiente de la coenzima B12 de Clostridium perfringens str. 13
S 214
Subunidad mayor de la propanodiol deshidratasa de Yersinia frederiksenii ATCC 33641
L 215
Proteína hipotética Yfre_01000478 de Yersinia frederiksenii ATCC 33641
M 216
Subunidad menor de la propanodiol deshidratasa de Yersinia frederiksenii ATC 33641
S 217
Glicerol deshidratasa de Thermoanaerobacter ethanolicus X514
L 218
Subunidad mediana de la deshidratasa de Thermoanaerobacter ethanolicus X514
M 219
Subunidad menor de la deshidratasa de Thermoanaerobacter ethanolicus X514
S 220
Otras subunidades grandes, medianas y pequeñas de las glicerol y diol deshidratasas
aDescripción
bSubunidad SEQ ID de la proteína
Subunidad mayor GldC de la glicerol deshidratasa de Lactobacillus hilgardii
L 221
Subunidad mediana GldD de la glicerol deshidratasa de Lactobacillus hilgardii
M 222
Subunidad menor GldE de la glicerol deshidratasa de Lactobacillus hilgardii
S 223
Glicerol deshidratasa de Lactobacillus reuteri JCM 1112
L 224
Similar a la subunidad y de la diol deshidratasa de Lactobacillus reuteri JCM 1112
M 225
Utilización de propanodiol: subunidad menor de la dehidratasa de Lactobacillus reuteri JCM 1112
S 226
Subunidad mayor GldC de la glicerol deshidratasa de Lactobacillus diolivorans
L 227
Subunidad mediana GldD de la glicerol deshidratasa de Lactobacillus diolivorans
M 228
Subunidad menor GldE de la glicerol deshidratasa de Lactobacillus diolivorans
S 229
Subunidad mayor de la propanodiol deshidratasa de Lactobacillus reuteri
L 230
Subunidad mediana de la propanodiol deshidratasa de Lactobacillus reuteri
M 231
Subunidad menor de la propanodiol deshidratasa de Lactobacillus reuteri
S 232
Subunidad mayor de la glicerol deshidratasa de Mesorhizobium loti MAFF303099
L+M 233
Subunidad menor de la glicerol deshidratasa de Mesorhizobium loti MAFF303099
S 234
Glicerol deshidratasa de Mycobacterium vanbaalenii PYR-1
L+M 235
Utilización de propanodiol: subunidad menor de la deshidratasa de Mycobacterium vanbaalenii PYR-1
S 236
Glicerol deshidratasa de Mycobacterium sp. MCS
L+M 237
Subunidad menor de la deshidratasa de Mycobacterium sp. MCS
S 238
Subunidad mayor de la deshidratasa:subunidad mediana de la deshidratasa de Mycobacterium flavescens PYR-GCK
L+M 239
Utilización de propanodiol: subunidad menor de la deshidratasa de Mycobacterium flavescens PYR-GCK
S 240
Glicerol deshidratasa de Mycobacterium sp. JLS
L+M 241
Subunidad menor de la deshidratasa de Mycobacterium sp. JLS
S 242
Subunidad mayor de la glicerol deshidratasa de Mycobacterium smegmatis str. MC2 155
L 243
Otras subunidades grandes, medianas y pequeñas de las glicerol y diol deshidratasas
aDescripción
bSubunidad SEQ ID de la proteína
Subunidad mediana de la deshidratasa de Mycobacterium smegmatis str. MC2 155
M 244
Subunidad y de la diol deshidratasa de Mycobacterium smegmatis str. MC 155
S 245
Otras subunidades
Subunidad mayor de la glicerol deshidratasa de Mycobacterium smegmatis str. MC2 155
L+M 246
Subunidad mayor de la glicerol deshidratasa de Mycobacterium smegmatis str. MC2 155
L+M 247
Subunidad menor de la glicerol deshidrogenasa dependiente de la coenzima B12 de Mycobacterium smegmatis str. MC2 155
S 248
Subunidad menor de la glicerol deshidrogenasa dependiente de la coenzima B12 de Mycobacterium smegmatis str. MC2 155
S 249
Subunidad mediana de la diol deshidratasa de Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A str. ATCC 9150
M 250
Subunidad menor de la diol deshidratasa de Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A str. ATCC 9150
S 251
Glicerol deshidratasa, subunidad � de Clostridium perfringens SM101
M 252
Glicerol deshidratasa, subunidad y de Clostridium perfringens SM101
S 253
PduC de Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium
L 254
Subunidad mayor de la glicerol deshidratasa de Listeria monocytogenes str. 4b H7858
L 255
DhaB de Escherichia blattae
L 256
DhaB de bacteria sin cultivar
L 257
DhaB de bacteria sin cultivar
L 258
Subunidad mayor GldC de la glicerol deshidratasa de Lactobacillus collinoides
L 259
PduD de bacteria sin cultivar
M 260
PduD de bacteria sin cultivar
M 261
DhaC de bacteria sin cultivar
M 262
DhaC de bacteria sin cultivar
M 263
DhaC de bacteria sin cultivar
M 264
Otras subunidades grandes, medianas y pequeñas de las glicerol y diol deshidratasas
aDescripción
bSubunidad SEQ ID de la proteína
Otras subunidades
Subunidad mediana de la glicerol deshidratasa dependiente de la coenzima B12 de Clostridium perfringens ATCC 13124
M 265
Desconocida
M 266
Subunidad �de la glicerol deshidratasa de Escherichia blattae
M 267
PduE de bacteria sin cultivar
S 268
PduE de bacteria sin cultivar
S 269
Subunidad menor de la deshidratasa de Listeria monocytogenes str. 1/2a F6854
S 270
DhaE de bacteria sin cultivar
S 271
DhaE de bacteria sin cultivar
S 272
DhaE de bacteria sin cultivar
S 273
Subunidad menor de la deshidratasa de Listeria monocytogenes FSL N1-017
S 274
a Descripción: de la anotación de GenBank para la secuencia y puede que no sea correcta, incluida la designación de glicerol o de diol, o puede no incluir información de la subunidad. b Subunidad: identificada por la homología de secuencia con la subunidad mayor, mediana o pequeña de la enzima de Klebsiella oxytoca. c Las subunidades que aparecen juntas son del mismo organismo y tienen anotaciones como si fueran la misma enzima, o tienen números de GenBank próximos que indican proximidad en el genoma.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a los procedimientos para la producción de 2-butanol con microorganismos recombinantes. La presente invención cumple una serie de necesidades comerciales e industriales. El butanol es un compuesto químico comercial industrial importante con una amplia gama de aplicaciones, en donde su potencial
5 como combustible o como aditivo de combustibles es particularmente significativo. Aunque sólo es un alcohol de cuatro carbonos, el butanol tiene un contenido de energía similar al de la gasolina y puede mezclarse con cualquier combustible fósil. Se promueve el uso del butanol como combustible o como aditivo de combustibles porque produce sólo CO2 y poco o nada de SOx ni NOx cuando se quema en el motor de combustión interna estándar. Adicionalmente, el butanol es menos corrosivo que el etanol, el aditivo de combustible más preferido hasta la fecha.
10 Además de su utilidad como biocombustible o como aditivo de combustibles, el butanol tiene la capacidad de repercutir sobre los problemas de distribución del hidrógeno en la emergente industria de pilas de combustible. Las pilas de combustible están plagadas hoy en día de problemas de seguridad asociados al transporte y distribución del hidrógeno. El butanol se puede regenerar con facilidad por su contenido en hidrógeno y se puede distribuir a través de las gasolineras existentes con la pureza requerida tanto para las pilas de combustible como para los motores de
15 combustión en los vehículos.
Finalmente, la presente invención produce el 2-butanol a partir de fuentes de carbono de origen vegetal, lo que evita el impacto medioambiental negativo que está asociado a los procedimientos petroquímicos estándares para la producción del butanol.
La presente invención también da a conocer microorganismos recombinantes y procedimientos para producir 220 butanona, un producto intermedio en las vías biosintéticas del 2-butanol descritas en la presente memoria. La 2
butanona, también conocida como metiletilcetona (MEK), es útil como un solvente en las pinturas y en otros revestimientos. También se utiliza en la industria de gomas sintéticas y para la producción de la cera de parafina.
Las siguientes definiciones y abreviaturas se utilizan para interpretar las reivindicaciones y la especificación.
La terminología «invención» o «presente invención» tal y como se utiliza en la presente memoria es una terminología no limitante y que no pretende referirse a ninguna realización concreta de esta invención concreta, sino que abarca todas las posibles realizaciones tal y como se describe en la especificación y en las reivindicaciones.
La terminología «vía biosintética del 2-butanol» se refiere a las vías enzimáticas que producen el 2-butanol a partir del piruvato.
La terminología «vía biosintética de la 2-butanona» se refiere a las vías enzimáticas que producen la 2-butanona a partir del piruvato.
La terminología «acetolactato sintasa», también conocida como «acetohidroxiácido sintasa», se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de dos moléculas de ácido pirúvico en una molécula de a-acetolactato. La acetolactato sintasa, conocida como EC 2.2.1.6. [antiguamente 4.1.3.18] (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego) puede depender del cofactor pirofosfato de tiamina para su actividad. Las enzimas de acetolactato sintasa adecuadas están disponibles de distintas fuentes, por ejemplo, Bacillus subtilis [n.º de GenBank AAA22222 del NCBI (National Center for Biotechnology Information) para la secuencia aminoacídica (SEQ ID n.º 77), L04470 del NCBI para la secuencia nucleotídica (SEQ ID n.º 76)], Klebsiella terrigena [n.º de GenBank AAA25055 (SEQ ID n.º 79), L04507 (SEQ ID n.º 78)], y Klebsiella pneumoniae [n.º de GenBank AAA25079 (SEQ ID n.º 4), M73842 (SEQ ID n.º 3)].
La terminología «acetolactato descarboxilasa» se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión del a-acetolactato en acetoína. Las acetolactato descarboxilasas se conocen como EC 4.1.1.5 y están disponibles, por ejemplo, de Bacillus subtilis [n.º de GenBank AAA22223 (SEQ ID n.º 81), L04470 (SEQ ID n.º 80)], Klebsiella terrigena [n.º de GenBank AAA25054 (SEQ ID n.º 83), L04507 (SEQ ID n.º 82)] y Klebsiella pneumoniae [n.º de GenBank AAU43774 (SEQ ID n.º 2), AY722056 (SEQ ID n.º 1)].
La terminología «acetoína aminasa» se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de la acetoína en 3-amino-2-butanol. La acetoína aminasa puede utilizar el cofactor 5'fosfato de piridoxal o el NADH (dinucleótido de nicotinamida y adenina reducido) o el NADPH (dinucleótido fosfato de nicotinamida y adenina reducido). El producto resultante puede tener una estereoquímica (R) o (S) en la posición
3. La enzima dependiente del fosfato de piridoxal puede utilizar un aminoácido. tal como alanina o glutamato, como donante del amino. Las enzimas dependientes de NADH o NADPH pueden utilizar amonio como un segundo sustrato. Un ejemplo adecuado de una acetoína aminasa dependiente de NADH, también conocida como amino alcohol deshidrogenasa, la describen Ito et al. (patente de los EE.UU. n.º 6.432.688). Un ejemplo de una acetoína aminasa dependiente de piridoxal es la amina:piruvato aminotransferasa (también denominada amina:piruvato transaminasa) descrita por Shin y Kim (J. Org. Chem. 67: 2848-2853 (2002)).
La terminología «butanol deshidrogenasa» se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la interconversión entre la 2-butanona y el 2-butanol. Las butanol deshidrogenasas son un subconjunto de una amplia familia de alcohol deshidrogenasas. La butanol deshidrogenasa puede ser dependiente de NAD o de NADP. Las enzimas dependientes de NAD se conocen como EC 1.1.1.1. y están disponibles, por ejemplo, de Rhodococcus ruber [n.º de GenBank CAD36475 (SEQ ID n.º 14), AJ491307 (SEQ ID n.º 13)]. Las enzimas dependientes de NADP se conocen como EC 1.1.1.2 y están disponibles, por ejemplo, de Pyrococcus furiosus [n.º de GenBank AAC25556 (SEQ ID n.º 91), AF013169 (SEQ ID n.º 90)]. Adicionalmente, una butanol deshidrogenasa está disponible de Escherichia coli [n.º de GenBank NP_417484 (SEQ ID n.º 75), N_000913 (SEQ ID n.º 74)] y una ciclohexanol deshidrogenasa está disponible de Acinetobacter sp. [n.º de GenBank AAG10026 (SEQ ID n.º 72), AF282240 (SEQ ID n.º 71)].
La terminología «acetoína cinasa» se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de acetoína en fosfoacetoína. La acetoína cinasa puede utilizar ATP (trifosfato de adenosina)
o fosfoenolpiruvato como donante de fosfato en la reacción. Aunque no hay informes de enzimas que catalizan esta reacción en acetoína, hay enzimas que catalizan la reacción análoga sobre la dihidroxiacetona, un sustrato similar, por ejemplo, las enzimas conocidas como EC 2.7.1.29 (Garcia-Alles et al. (2004) Biochemistry 43: 130037-13046).
La terminología «fosfoacetoína aminasa» se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tienen una actividad enzimática que cataliza la conversión de la fosfoacetoína en 3-amino-2-butanol O-fosfato. La fosfoacetoína aminasa puede utilizar el cofactor 5'-fosfato de piridoxal, el NADH o el NADPH. El producto resultante puede tener una estereoquímica (R) o (S) en la posición 3. La enzima dependiente de fosfato de piridoxal puede utilizar un aminoácido tal como alanina o glutamato. Las enzimas dependientes de NADH y NADPH pueden utilizar amonio de segundo sustrato. Aunque no hay informes de enzimas que catalizan esta reacción sobre la fosfoacetoína, hay una enzima dependiente del fosfato de piridoxal que se propone que lleva a cabo la reacción análoga sobre el fosfato de serinol, un sustrato similar (Yasuta et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67: 4999-5009).
La terminología «fosfoaminobutanol fosfoliasa», también denominada «aminoalcohol O-fosfato liasa», se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión del O-fosfato de 3-amino-2butanol en 2-butanona. La fosfoaminobutanol fosfoliasa puede utilizar el cofactor 5'-fosfato de piridoxal. No hay resultados previos de enzimas que catalizan esta reacción sobre el fosfato de aminobutanol, aunque hay informes de enzimas que catalizan la reacción análoga sobre el fosfato de 1-amino-2-propanol, un sustrato similar (Jones et al. (1973) Biochem J. 134: 167-182). La presente invención describe una fosfoaminobutanol fosfoliasa recién identificada (SEQ ID n.º 126) del organismo Erwinia carotovora, cuya actividad se demuestra en el ejemplo 15 de la presente memoria.
La terminología «aminobutanol cinasa» se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión del 3-amino-2-butanol en O-fosfato de 3-amino-2-butanol. La aminobutanol cinasa puede utilizar ATP como donante del fosfato. Aunque no hay datos de enzimas que catalicen esta reacción sobre el 3-amino-2-butanol, hay resultados de enzimas que catalizan la reacción análoga con etanolamina y 1amino-2-propanol, unos sustratos similares (Jones et al., véase más arriba). La presente invención describe, en el ejemplo 14, una aminoalcohol cinasa de Erwinia carotovora subsp. atroseptica (SEQ ID n.º 124). La terminología «butanodiol deshidrogenasa» también se conoce como «acetoína reductasa», y se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de la acetoína en 2,3-butanodiol. Las butanodiol deshidrogenasas son un subconjunto de la amplia familia de las alcohol deshidrogenasas. Las enzimas butanodiol deshidrogenasa puede tener especificidad para producir la estereoquímica (R) o (S) en el producto alcohólico. Las butanodiol deshidrogenasas específicas de (S) se conocen como EC 1.1.1.76 y están disponibles, por ejemplo, de Klebsiella pneumoniae [n.º de GenBank BBA13085 (SEQ ID n.º 6), D86412 (SEQ ID n.º 5)]. Las butanodiol deshidrogenasas específicas de (R) se conocen como EC 1.1.1.4 y están disponibles, por ejemplo, de Bacillus cereus [n.º de GenBank NP_830481 (SEQ ID n.º 85), NC_004722 (SEQ ID n.º 84); AAP07682 (SEQ ID n.º 87), AE017000 (SEQ ID n.º 86)] y Lactococcus lactis [n.º de GenBank AAK04995 (SEQ ID n.º 89), AE006323 (SEQ ID n.º 88)].
La terminología «butanodiol deshidratasa», también conocida como «diol deshidratasa» o «propanodiol deshidratasa», se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión del 2,3-butanodiol en 2-butanona. La butanodiol deshidratasa puede utilizar el cofactor adenosilcobalamina (vitamina B12). Las enzimas dependientes de la adenosilcobalamina se conocen como EC
4.2.1.28 y están disponibles, por ejemplo, de Klebsiella oxytoca [n.º de GenBank BAA08099 (subunidad a) (SEQ ID n.º 8), D45071 (SEQ ID n.º 7), BAA08100 (subunidad �) (SEQ ID n.º 10), D45071 (SEQ ID n.º 9) y BBA08101 (subunidad y) (SEQ ID n.º 12), D45071 (SEQ ID n.º 11) (obsérvese que se necesitan las tres subunidades para la actividad] y Klebsiella pneumoniae [n.º de GenBank AAC98384 (subunidad a) (SEQ ID n.º 105), AF102064 (SEQ ID n.º 104); n.º de GenBank AAC98385 (subunidad �) (SEQ ID n.º 107), AF102064 (SEQ ID n.º 106), n.º de GenBank AAC98386 (subunidad y) (SEQ ID n.º 109), AF102064 (SEQ ID n.º 108)]. Otras diol deshidratasas adecuadas incluyen, pero sin limitarse a ellas, las diol deshidratasas dependientes de B12 disponibles de Salmonella typhimurium [n.º de GenBank AAB84102 (subunidad mayor) (SEQ ID n.º 93), AF026270 (SEQ ID n.º 92); n.º de GenBank AAB84103 (subunidad mediana) (SEQ ID n.º 95), AF026270 (SEQ ID n.º 94); n.º de GenBank AAB84104 (subunidad menor) (SEQ ID n.º 97), AF026270 (SEQ ID n.º 96)]; y Lactobacillus collinoides [n.º de GenBank CAC82541 (subunidad mayor) (SEQ ID n.º 99), AJ297723 (SEQ ID n.º 98); n.º de GenBank CAC82542 (subunidad mediana) (SEQ ID n.º 101); AJ297723 (SEQ ID n.º 100); n.º de GenBank CAD01091 (subunidad menor) (SEQ ID n.º 103), AJ297723 (SEQ ID n.º 102)]; y enzimas de Lactobacillus brevis (en particular de las cepas CNRZ734 y CNRZ735, Speranza et al., véase más arriba) y las secuencias nucleotídicas que codifican las correspondientes enzimas. Los procedimientos de aislamiento del gen de la diol deshidratasa se conocen bien en la técnica (p. ej., patente de los EE.UU. n.º 5.686.276). Otras diol deshidratasas se recogen en la tabla 2.
La terminología «glicerol deshidratasa» se refiere a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión del glicerol en 3-hidroxipropionaldehído. Las glicerol deshidratasas dependientes de adenosilcobalamina se conocen como EC 4.2.1.30. Las glicerol deshidratasas de EC 4.2.1.30 se parecen a las diol deshidratasas en la secuencia y en que tienen tres subunidades. Las glicerol deshidratasas también pueden utilizarse para convertir el 2,3-butanodiol en 2-butanona. Algunos ejemplos de glicerol deshidratasas de EC 4.2.1.30 incluyen las de Klebsiella pneumoniae (subunidad a, SEQ ID n.º 145 para la región codificante y SEQ ID n.º 146 para la proteína; subunidad , SEQ ID n.º 147 para la región codificante y SEQ ID n.º 148 para la proteína; y subunidad y, SEQ ID n.º 149 para la región codificante y SEQ ID n.º 150 para la proteína); de Clostridium pasteurianum [n.º de GenBank 3360389 (subunidad a, SEQ ID n.º 135), 3360390 (subunidad �, SEQ ID n.º 136) y 3360391 (subunidad y, SEQ ID n.º 137)]; de Escherichia blattae [n.º de GenBank 60099613 (subunidad a, SEQ ID n.º138), 57340191 (subunidad �, SEQ ID n.º 139) y 57340192 (subunidad y, SEQ ID n.º 140)]; y de Citrobacter freundii [n.º de GenBank 1169287 (subunidad a, SEQ ID n.º 141), 1229154 (subunidad �, SEQ ID n.º 142) y 1229155 (subunidad y, SEQ ID n.º 143)]. Obsérvese que para la actividad se necesitan las tres subunidades. En la tabla 2 se recogen otras glicerol deshidratasas.
Las diol y glicerol deshidratasas pueden sufrir una inactivación suicida durante la catálisis. Una proteína que es factor reactivador, también denominada en la presente memoria «reactivasa», se puede utilizar para reactivar las enzimas inactivas [Mori et al., J. Biol. Chem. 272: 32034 (1997)]. Preferiblemente, el factor reactivador debe proceder del mismo organismo que la diol o glicerol deshidratasa utilizada. Por ejemplo, los factores reactivadores adecuados de las diol deshidratasas están disponibles de Klebsiella oxytoca [n.º de GenBank AAC15871 (subunidad
mayor) (SEQ ID n.º 111), AF017781 (SEQ ID n.º 110); n.º de GenBank AAC15872 (subunidad menor) (SEQ ID n.º 113), A017781 (SEQ ID n.º 112)]; Salmonella typhimurium [n.º de GenBank AAB84105 (subunidad mayor) (SEQ ID n.º 115), AF026270 (SEQ ID n.º 114), n.º de GenBank AAD39008 (subunidad menor) (SEQ ID n.º 117), AF026270 (SEQ ID n.º 116)]; y Lactobacillus collinoides [n.º de GenBank CAD01092 (subunidad mayor) (SEQ ID n.º 119), AJ297723 (SEQ ID n.º 118); n.º de GenBank CAD01093 (subunidad menor) (SEQ ID n.º 121), AJ297723 (SEQ ID n.º 120)]. Para la actividad se necesitan ambas subunidades grande y pequeña. Por ejemplo, los factores reactivadores adecuados de las glicerol deshidratasas están disponibles de Klebsiella pneumoniae (subunidad mayor, SEQ ID n.º 151 para la región codificante y SEQ ID n.º 152 para la proteína; y subunidad menor, SEQ ID n.º 153 para la región codificante y SEQ ID n.º 154 para la proteína).
La terminología «un anaerobio facultativo» se refiere a un microorganismo que puede crecer tanto en medio aerobio como en medio anaerobio.
La terminología «sustrato carbonado» o «sustrato carbonado fermentable» se refiere a una fuente de carbono capaz de ser metabolizada por los microorganismos hospedadores de la presente invención y en particular las fuentes de carbono seleccionadas del grupo que consiste en monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos y sustratos de un carbono, o mezclas de los mismos.
La terminología «gen» se refiere a un fragmento de ácido nucleico que es capaz de expresarse como una proteína específica, que incluye opcionalmente secuencias reguladoras por delante (secuencias no codificantes en 5') y por detrás (secuencias no codificantes en 3') de la secuencia codificante. «Gen nativo» se refiere a un gen que se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. «Gen quimérico» se refiere a todo gen que no es un gen nativo, y que comprende secuencias reguladoras y secuencias codificantes que no se encuentran juntas en la naturaleza. En consonancia, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que tiene diferentes orígenes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes que tienen el mismo origen, pero dispuestas de una manera diferente a la encontrada en la naturaleza. «Gen endógeno» se refiere a un gen nativo en su localización natural en el genoma de un organismo. Un gen «foráneo» o «heterólogo» se refiere a un gen que no se encuentra normalmente en el organismo hospedador, pero que se introduce en el organismo hospedador mediante transferencia génica. Los genes foráneos pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo o genes quiméricos. Un «transgén» es un gen que se ha introducido en el genoma mediante un procedimiento de transformación.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, un «fragmento de ácido nucleico aislado» o «molécula de ácido nucleico aislado» o «construcción genética» se utilizarán indistintamente y significarán un polímero de ARN o ADN que es monocatenario o bicatenario, que contiene opcionalmente bases nucleotídicas sintéticas, no naturales o alteradas. Un fragmento de ácido nucleico aislado en forma de un polímero de ADN puede comprender uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético.
Un fragmento de ácido nucleico se puede «hibridar» a otro fragmento de ácido nucleico, tal como ADNc, ADN genómico o molécula de ARN, cuando una forma monocatenaria del fragmento de ácido nucleico puede aparearse al otro fragmento de ácido nucleico en una solución con las condiciones adecuadas de temperatura y fuerza iónica. Las condiciones de hibridación y lavado se conocen bien y se ejemplifican en Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis,
T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989), en particular en el capítulo 11 y en la tabla 11.1 que hay en éste. Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan el «rigor» de la hibridación. Las condiciones rigurosas se pueden ajustar para escrutar fragmentos moderadamente similares (tales como secuencias homólogas de organismos poco relacionados), a fragmentos muy similares (tales como genes que duplican las enzimas funcionales de organismos muy relacionados). Los lavados posteriores a la hibridación determinan las condiciones del rigor. Un conjunto de condiciones preferidas utiliza una serie de lavados que comienza con SSC a 6X, SDS al 0,5% a temperatura ambiente durante 15 min, luego se repite con SSC a 2X, SDS al 0,5% a 45 °C durante 30 min, y luego se repite dos veces con SSC a 0,2 X, SDS al 0,5% a 50 °C durante 30 min. Un conjunto más preferido de condiciones rigurosas utiliza temperaturas más altas en las cuales los lavados son idénticos a los anteriores, salvo que la temperatura de los dos lavados finales de 30 min en SSC a 0,2X, SDS al 0,5% se incrementó a 60 °C. Otro conjunto preferido de condiciones muy rigurosas utiliza dos lavados finales en SSC a 0,1 X, SDS al 0,1% a 65 °C. Un conjunto adicional de condiciones rigurosas incluye la hibridación en SSC a 0,1X , SDS al 0,1%, 65 °C y lavados con SSC a 2X, SDS al 0,1% seguido de SSC a 0,1 X, SDS al 0,1%, por ejemplo.
La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque en función del rigor de la hibridación, se permiten que haya discordancias entre las bases. El rigor apropiado para hibridar los ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables bien conocidas en la técnica. Cuanto mayor es la similitud o la homología entre dos secuencias nucleotídicas, mayor es el valor de la Tm para los híbridos de los ácidos nucleicos que tienen esas secuencias. La estabilidad relativa (que corresponde a la mayor Tm) de las hibridaciones de los ácidos nucleicos disminuye en el orden siguiente: ARN:ARN, ADN:ARN, ADN:ADN. Se han deducido ecuaciones para calcular la Tm de los híbridos de más de 100 nucleótidos de longitud (véase Sambrook et al., como más arriba, 9.50-9.51). Para las hibridaciones con ácidos nucleicos más pequeños, a saber, oligonucleótidos, la posición de las discordancias se vuelve más importante, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook et al., como más arriba, 11.7-11.8). En una realización,
la longitud para el ácido nucleico que se puede hibridar es de al menos de 10 nucleótidos. Preferiblemente, una longitud mínima para un ácido nucleico que se puede hibridar es de al menos 15 nucleótidos; más preferiblemente al menos de aproximadamente 20 nucleótidos; y lo más preferiblemente, la longitud es al menos de aproximadamente 30 nucleótidos. Además, el experto en la técnica reconocerá que la temperatura y la concentración de sales en la solución de lavado se puede ajustar según se necesite de acuerdo con factores tales como la longitud de la sonda.
Una «porción sustancial» de una secuencia aminoacídica o nucleotídica es la porción que comprende suficiente secuencia aminoacídica de un polipéptido o suficiente secuencia nucleotídica de un gen para identificar posiblemente este polipéptido o gen, bien mediante evaluación manual de la secuencia por un experto en la técnica,
o bien mediante comparación e identificación de secuencias de forma automática por ordenador utilizando algoritmos tales como BLAST (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1993)). En general, se necesita una secuencia de diez aminoácidos, o más, o treinta nucleótidos, o más, contiguos para identificar que un polipéptido o secuencia de ácido nucleico sea posiblemente homóloga a una proteína o gen conocido. Además, respecto a las secuencias nucleotídicas, en los procedimientos dependientes de secuencia para la identificación génica (p. ej., hibridación Southern) y el aislamiento (p. ej., hibridación in situ de colonias bacterianas o de calvas de bacteriófagos) se pueden utilizar sondas oligonucleotídicas específicas de genes que comprenden de 20 a 30 nucleótidos contiguos. Además, los oligonucleótidos pequeños de 12 a 15 bases se pueden utilizar como cebadores de amplificación por PCR para obtener un fragmento de ácido nucleico concreto que comprende los cebadores. En consecuencia, una «porción sustancial» de una secuencia nucleotídica comprende suficiente secuencia para identificar y/o aislar específicamente un fragmento de ácido nucleico que comprende la secuencia. La especificación presente da a conocer la secuencia nucleotídica y aminoacídica completa que codifica proteínas fúngicas concretas. El experto en la técnica, que puede sacar provecho de las secuencias que se describen en la presente memoria, puede utilizar ahora toda o una parte sustancial de las secuencias descritas para los propósitos conocidos por los expertos en la técnica. Por consiguiente, la presente invención comprende las secuencias completas tal y como se describen en la Lista de secuencias acompañantes, así como porciones sustanciales de las secuencias tal y como se define más arriba.
La terminología «complementario» se utiliza para describir la relación entre las bases nucleotídicas que son capaces de hibridarse entre sí. Por ejemplo, respecto al ADN, la adenosina es complementaria a la timina y la citosina es complementaria a la guanina.
Las terminologías «homología» y «homólogo» se utilizan indistintamente en la presente memoria. Se refieren a fragmentos de ácido nucleico en los que los cambios de una o más bases nucleotídicas no afectan a la capacidad de que el fragmento de ácido nucleico intervenga en la expresión génica o produzca un determinado fenotipo. Esta terminología también se refiere a las modificaciones de los fragmentos de ácido nucleico tales como la deleción o inserción de uno o más nucleótidos que no alteran sustancialmente las propiedades funcionales del fragmento de ácido nucleico resultante con respecto al fragmento inicial sin modificar. Por lo tanto, se entiende, como apreciarán los expertos en la técnica, que quedan englobadas otras secuencias además de las especificadas a modo de ejemplo.
Además, el experto en la técnica reconoce que las secuencias de ácidos nucleicos homólogos abarcadas por esta invención también están definidas por su capacidad para hibridarse, en las condiciones moderadamente rigurosas
(p. ej., SSC a 0,5 X, SDS al 0.1%, 60 °C) con las secuencias de ejemplo de la presente memoria, o a cualquier porción de las secuencias nucleotídicas descritas en la presente memoria y que son funcionalmente equivalentes a cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente memoria.
La «degeneración de los codones» se refiere a la naturaleza del código genético que permite la variación de la secuencia nucleotídica sin afectar a la secuencia aminoacídica de un polipéptido codificado. El experto en la técnica es bien consciente del «sesgo de codones» que presenta una célula hospedadora específica en el uso de los codones nucleotídicos para especificar un aminoácido determinado. Por lo tanto, cuando se sintetiza un gen para que su expresión en una célula hospedadora sea mejor, es deseable diseñar el gen tal que su frecuencia de uso de codones se acerque a la frecuencia del uso de los codones preferidos de la célula hospedadora.
La terminología «porcentaje de identidad», tal y como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas, o dos o más secuencias polinucleotídicas, según se determina al comparar las secuencias. En la técnica, «identidad» también significa el grado de relación de secuencia entre las secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas, como puede ser el caso, según se determina mediante la concordancia entre los cadenas de tales secuencias. «Identidad» y «similitud» se pueden calcular fácilmente mediante los procedimientos conocidos, entre ellos, pero sin limitarse a ellos, los descritos en: 1) Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., Ed.) Oxford Universiity: NY (1988); 2) Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., Ed.) Academic: NY (1993); 3) Computer Analysis of Sequence Data, Parte I (Griffin A. M., y Griffin, H. G., Eds) Humania: NJ (1994); 4) Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Ed.) Academic (1987) y 5) Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. y Devereux, J., Eds.) Stockton: NY (1991).
Los procedimientos preferidos para determinar la identidad se diseñan para dar la mejor concordancia entre las secuencias analizadas. Los procedimientos para determinar la identidad y la similitud están codificados en programas informáticos de acceso libre. Los alineamientos de secuencias y los cálculos del porcentaje de identidad
se pueden realizar con el programa MegAlignTM de la suite de programas para bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). El alineamiento múltiple de las secuencias se realiza con el «procedimiento de alineamiento Clustal» que abarca varias versiones del algoritmo, entre ellas el «procedimiento de alineamiento Clustal V» que corresponde al procedimiento de alineamiento denominado Clustal V (descrito por Higgins y Sharp, CABIOS. 5: 151-153 (1989); Higgins, D. G. et al., Comput. Appl. Biosci., 8: 189-191 (1992)) y encontrado en el programa MegAlignTM de la suite de programas para bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc.). Para los alineamientos múltiples, los valores por defecto corresponden a PENALIZACIÓN POR HUECO = 10 yPENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 10. Los parámetros por defecto para los alineamientos por pares y el cálculo del porcentaje de identidad de las secuencias de las proteínas mediante el procedimiento Clustal son KTUPLA = 1, PENALIZACIÓN POR HUECO = 3, VENTANA = 5 y DIAGONALES GUARDADAS = 5. Para los ácidosnucleicos, estos parámetros son KTUPLA = 2, PENALIZACIÓN POR HUECO = 5, VENTANA = 4 y DIAGONALES GUARDADAS = 4. Tras el alineamiento de las secuencias mediante el programa Clustal V, es posible obtener un «porcentaje de identidad» viendo la tabla de «distancias entre las secuencias» en el mismo programa. Adicionalmente, está disponible el «procedimiento de alineamiento Clustal W» y corresponde al procedimiento de alineamiento denominado Clustal W (descrito por Higgins y Sharp., CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D. G. et al., Comput. Appl. Biosci. 8: 189-191 (1992)) y encontrado en el programa MegAlignTM v. 6.1 de la suite de programas para bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc.). Los parámetros por defecto para el alineamiento múltiple (PENALIZACIÓN POR HUECOS = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0,2, Desfase en la divergencia de secuencia (%) = 30, ponderación de transición en el ADN = 0,5, Matriz de ponderación para proteínas = serie Gonnet, Matriz de ponderación para ADN = IUB). Después de alinear las secuencias con el programa Clustal W, se puede obtener un «porcentaje de identidad» viendo la tabla de «distancias entre las secuencias» en el propio programa.
El experto en la técnica sabe bien que para identificar los polipéptidos, de otras especies, resultan útiles muchos niveles de identidad de secuencia, en donde tales polipéptidos tienen la misma o parecida a función o actividad. Ejemplos útiles de porcentajes de identidad incluyen, pero sin limitarse a ellos, 4%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95%, o cualquier porcentaje entero del 24% al 100% puede ser útil para describir la presente invención, tal como 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. Los fragmentos adecuados de ácido nucleico no sólo tienen las homologías anteriores sino que típicamente codifican un polipéptido que tiene al menos 50 aminoácidos, preferiblemente al menos 100 aminoácidos, más preferiblemente al menos 150 aminoácidos, aún más preferiblemente al menos 200 aminoácidos, y lo más preferiblemente al menos 250 aminoácidos.
La terminología «programa informático de análisis de secuencias» se refiere a cualquier algoritmo o programa informático que es útil para el análisis de secuencias nucleotídicas o aminoacídicas. El «programa informático para análisis de secuencias» puede estar disponible en el mercado o haber sido desarrollado independientemente. Los programas informáticos para análisis de secuencias típicos incluirán, pero sin limitarse a ellos, 1) la suite GCG de programas informáticos (versión 9.0 del paquete de Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI; 2) BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990)); 3) DNASTAR (DNASTAR, Inc., Madison, WI; 4) Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI) y 5) el programa FASTA que incorpora el algoritmo de Smith-Waterman (W. R. Pearson, Comput. Methods. Genome Res., [Proc. Int. Symp] (1994), fecha del congreso 1992, 111-20. Editor(es): Suhai, Sandor. Plenum: Nueva York, NY). Dentro del contexto de esta solicitud, se ha de saber que cuando se utiliza para el análisis el programa informático para análisis de secuencias, los resultados del análisis se basarán en los «valores por defecto» del programa informático citado, a menos que se especifique de otra manera. Tal y como se utiliza en la presente memoria, los «valores por defecto» harán referencia a todo conjunto de valores o parámetros que se cargan originalmente con el programa cuando se inicia por primera vez.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «secuencia codificante» o «CDS» se refiere a una secuencia de ADN que codifica una secuencia aminoacídica específica. Las «secuencias reguladoras adecuadas» se refieren a secuencias nucleotídicas que se localizan secuencia arriba (secuencias no codificantes en 5'), dentro, o secuencia abajo (secuencias no codificantes en 3') de una secuencia codificante, y que influye en la transcripción, procesamiento o estabilidad del ARN, o traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias líder de traducción, intrones, secuencias de reconocimiento para la poliadenilación, sitio de procesamiento del ARN, sitio de unión de efector y estructura de horquilla.
La terminología «promotor» se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia codificante o ARN funcional. En general, una secuencia codificante está localizada en 3' respecto a una secuencia promotora. Los promotores pueden proceder en su totalidad de un gen nativo, o estar compuestos de diferentes elementos procedentes de los diferentes promotores que se hallan en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de ADN sintético. Los expertos en la técnica han de saber que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos celulares, o en diferentes etapas del desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones medioambientales o fisiológicas. Los promotores que hacen que un gen se exprese en la mayoría de los tipos celulares la mayor parte del tiempo se denominan habitualmente «promotores constitutivos».
Además se reconoce que ya que en la mayoría de los casos no están completamente definidos los límites exactos de las secuencias reguladoras, fragmentos de ADN de diferente longitud pueden tener la misma actividad promotora.
La terminología «unido operativamente» se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un único fragmento de ácido nucleico de tal modo que la función de uno está afectada por el otro. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una secuencia codificante cuando es capaz de afectar a la expresión de la secuencia codificante (a saber, que el promotor controla a la secuencia codificante desde el punto de vista transcripcional). Las secuencias codificantes pueden estar unidas operativamente a las secuencias reguladoras en una orientación sentido o antisentido.
La terminología «expresión», tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la transcripción y a la acumulación estable de ARN sentido (ARNm) o antisentido procedente del fragmento de ácido nucleico de la invención. La expresión puede también referirse a la traducción del ARNm en un polipéptido.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «transformación» se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico al interior de un organismo hospedador, lo que da lugar a una herencia estable desde el punto de vista genético. Los organismos hospedadores que contienen los fragmentos de ácido nucleico con los que se han transformado se denominan organismos «transgénicos», «recombinantes» o «transformados».
Las terminologías «plásmido» y «vector» se refieren a un elemento cromosómico extra que a menudo lleva genes que no son parte del metabolismo central de la célula, y que suelen estar en forma de fragmentos de ADN bicatenarios circulares. Tales elementos pueden ser secuencias de replicación autónoma, secuencias que se integran en el genoma, secuencias de fagos o nucleotídicas, lineales o circulares, de un ADN o ARN monocatenario
o bicatenario, procedentes de cualquier fuente, en los cuales una serie de secuencias nucleotídicas se han juntado o recombinado en una construcción única que es capaz de introducir en una célula un fragmento del promotor y la secuencia del ADN que codifica un producto génico de selección junto con la secuencia en 3' apropiada sin traducir. El «vector de transformación» se refiere a un vector específico, que contiene un gen foráneo y que tiene otros elementos además del gen foráneo, que facilita la transformación de una célula hospedadora particular.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «degeneración de codones» se refiere a la naturaleza del código genético que permite la variación de la secuencia nucleotídica sin afectar a la secuencia aminoacídica de un polipéptido codificado. El experto en la técnica es bien consciente del «sesgo de codones» mostrado por una célula hospedadora específica en el uso de los codones nucleotídicos para especificar un aminoácido determinado. Por lo tanto, al sintetizar un gen para mejorar su expresión en una célula hospedadora, es deseable diseñar el gen de tal manera que su frecuencia de uso de codones se acerque a la frecuencia del uso de codones preferido de la célula hospedadora.
La terminología «codones optimizados», al referirse a los genes o regiones codificantes de moléculas de ácido nucleico para la transformación de diferentes huéspedes, se refiere a la alteración de los codones en el gen o regiones codificantes de las moléculas de ácido nucleico para reflejar el uso de codones típico del organismo hospedador sin alterar el polipéptido codificado por el ADN.
La terminología «medio del producto de fermentación» se refiere a un medio en el que se ha producido la fermentación de tal manera que el producto está presente en el medio.
Las técnicas estándares de ADN recombinante y de clonación molecular utilizadas aquí se conocen bien en la técnica y se describen en Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989) (de aquí en adelante «Maniatis»); y por Silhavy, T. J., Bennan, M. L y Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984); y por Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc. y Wiley-Interscience (1987).
Las vías biosintéticas del 2-butanol y de la 2-butanona
Los microorganismos que utilizan los glúcidos emplean la vía de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP), la vía de Entner-Doudoroff y el ciclo de las pentosas fosfato a modo de vías metabólicas centrales para proporcionar energía y precursores celulares para crecer y mantenerse. Estas vías tienen en común el producto intermedio gliceraldehído3-fosfato y, finalmente, se forma el piruvato directamente o en combinación con la vía de EMP. Las reacciones combinadas de la conversión de azúcares en piruvato producen energía (p. ej., adenosina-5'-trifosfato, ATP) y equivalentes reductores (p. ej., dinucleótido reducido de nicotinamida y adenina, NADH, y dinucleótido fosfato reducido de nicotinamida y adenina, NADPH). El NADH y el NADPH se tienen que reciclar a sus formas oxidadas
–
(NAD+ y NADP+, respectivamente). En presencia de aceptores inorgánicos de electrones (p. ej., O2, NO3 y SO42–), los equivalentes de reducción se pueden utilizar para aumentar las reservas energéticas; alternativamente, se puede formar un subproducto de carbono reducido.
La invención permite producir 2-butanona o 2-butanol, a partir de fuentes glucídicas, con microorganismos recombinantes a los que se les ha proporcionado una vía biosintética completa desde el piruvato a la 2-butanona o
al 2-butanol. Se describen tres vías más. Aunque se sabe que el 2-butanol no es el producto principal de ninguna fermentación bacteriana, hay una serie de vías posibles para producir el 2-butanol a través de tipos conocidos de reacciones bioquímicas. Estas vías se muestran en la figura 1. Las letras y los números romanos citados a continuación corresponden a las letras y los números romanos de la figura 1, que se utilizan para describir las etapas de la conversión y los productos, respectivamente. Tal y como se describe más adelante, la 2-butanona es un producto intermedio en todas estas vías biosintéticas del 2-butanol.
Todas las vías comienzan con la reacción inicial de dos moléculas de piruvato para producir a-acetolactato (I), que se muestra como el sustrato a convertir en el producto (a) en la figura 1. A partir del a-acetolactato, hay 4 posibles vías para dar 2-butanona (V), denominadas en la presente memoria vías biosintéticas de 2-butanona:
Vía
1)
I - II -III-IV-V (conversiones de sustrato en producto b, c, d, e);
2)
I -II-VII-IV-V (conversiones de sustrato en producto b, g, h, e);
3)
I-II-VIII-V (conversiones de sustrato en producto b, i, j): esta es la vía de la presente invención.
4)
I-IX-X-V (conversiones de sustrato en producto k, l, m)
Las vías biosintéticas del 2-butanol concluyen con la conversión de la 2-butanona (V) en el 2-butanol (VI). A continuación se ofrece una explicación detallada de las conversiones de sustrato en producto en cada vía.
Vía 1:
(a) de piruvato a a-acetolactato:
La etapa inicial de la vía 1 es la conversión de dos moléculas de piruvato a una molécula de a-acetolactato (compuesto I en la figura 1) y una molécula de dióxido de carbono, catalizada por una enzima dependiente del pirofosfato de tiamina. Se conocen bien las enzimas que catalizan esta conversión de sustrato en producto (por lo general se denominan o bien acetolactato sintasas o bien acetohidroxiácido sintasas, EC 2.2.1.6 [cambiado de
4.1.3.18 en 2002], y participan en la vía biosintética de los aminoácidos proteinógenos leucina y valina, así como en la vía para la producción fermentativa del 2,3-butanodiol y acetoína de una serie de organismos.
El experto en la técnica apreciará que los polipéptidos que tienen actividad acetolactato sintasa que se han aislado de distintos microorganismos serán útiles en la presente invención, independientemente de la homología entre las secuencias. Algún ejemplo de enzimas acetolactato sintásicas adecuadas están disponibles de distintos orígenes, por ejemplo, Bacillus subtilis [n.º de GenBank AAA22222 del NCBI (National Center for Biotechnology Information) para la secuencia de aminoácidos (SEQ ID n.º 77), L04470 del NCBI para la secuencia nucleotídica (SEQ ID n.º 76)], Klebsiella terrigena [n.º de GenBank AAA25055 (SEQ ID n.º 79), L04507 (SEQ ID n.º 78)] y Klebsiella pneumoniae [n.º de GenBank AAA25079 (SEQ ID n.º 4), M73842 (SEQ ID n.º 3)]. Las enzimas acetolactato sintásicas preferidas son las que tienen una identidad de al menos el 80%-85% con las SEQ ID n.º 4, 77 y 79, en donde se prefiere más una identidad de al menos el 85%-90% y en donde lo más preferido es una identidad de al menos el 95% que se basa en el procedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetros por defecto dePENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0,1 y una serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.
(b) de a-acetolactato a acetoína:
El a-acetolactato (I) se convierte en acetoína (II) mediante la acción de una enzima tal como la acetolactato descarboxilasa (EC 4.1.1.5). Al igual que la acetolactato sintasa, esta enzima depende del pirofosfato de tiamina y también interviene en la producción de 2,3-butanodiol y acetoína en muchos microorganismos. Las enzimas de diferentes orígenes varían realmente mucho en tamaño (25 a 50 kDa), oligomerización (dímero a hexámero), localización (intracelular o extracelular) y regulación alostérica (por ejemplo, activación mediante aminoácidos de cadena ramificada). Para el propósito de la presente invención, se prefiere una localización intracelular a la extracelular, pero por lo general resultan aceptables otras variaciones.
El experto en la técnica apreciará que los polipéptidos que tienen actividad acetolactato descarboxilasa que se han aislado de distintos microorganismos serán útiles en la presente invención independientemente de la homología entre las secuencias. Algunos ejemplos de enzimas acetolactato descarboxilásicas adecuadas están disponibles de muchas fuentes, por ejemplo, Bacillus subtilis [n.º de GenBank AAA22223 (SEQ ID n.º 81), L04470 (SEQ ID n.º 80)], Klebsiella terrigena [n.º de GenBank AAA25054 (SEQ ID n.º 83), L04507 (SEQ ID n.º 82)] y Klebsiella pneumoniae [n.º de GenBank AAU43774 (SEQ ID n.º 2), AY722056 (SEQ ID n.º 1)].
Las enzimas acetolactato descarboxilásicas preferidas son las que tienen una identidad de al menos el 80% al 85% con las SEQ ID n.º 2, 81 y 83, en donde se prefiere más una identidad de al menos el 85% al 90% y en donde lo más preferido es una identidad de al menos el 95% basada en el procedimiento de alineamiento Clustal W queutiliza los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL
HUECO = 0,1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.
(c) de acetoína a 3-amino-2-butanol:
Hay dos tipos conocidos de reacciones bioquímicas que podrían afectar a la conversión de sustrato en producto de la acetoína (II) en el 3-amino-2-butanol (III), específicamente, la transaminación dependiente del fosfato de piridoxal que utiliza un donante de amino accesorio y la aminación reductora directa con amonio. En el último caso, los equivalentes de reducción se suministran en forma de cofactor reducido de nicotinamida (bien NADH o NADPH). En Ito et al. (patente de los EE.UU. n.º 6.432.688) se describe un ejemplo de una enzima dependiente de NADH que cataliza esta reacción con acetoína de sustrato. No se ha valorado la estereoespecificidad de esta enzima. Shin y Kim (véase más arriba) han descrito un ejemplo de una transaminasa dependiente del fosfato de piridoxal que cataliza la conversión de la acetoína en el 3-amino-2-butanol. Esta enzima se demuestra en el ejemplo 13 de la presente memoria que convierte tanto el isómero (R) de la acetoína en el isómero (2R, 3S) del 3-amino-2-butanol y el isómero (S) de la acetoína en el isómero (2S, 3S) del 3-amino-2-butanol. Cualquiera de los dos tipos de enzima (a saber, transaminasa o aminasa reductora) se considera que es una acetoína aminasa y se puede utilizar en la producción de 2-butanol. Otras enzimas de este grupo pueden tener diferente estereoespecificidad.
El experto en la técnica apreciará que los polipéptidos que tienen actividad acetoína aminasa que se han aislado de distintos microorganismos serán útiles independientemente de la homología entre las secuencias. Un ejemplo de esta actividad se describe en la presente memoria y se identifica como SEQ ID n.º 122. Por consiguiente, las enzimas acetoína aminásicas preferidas son las que tienen una identidad de al menos el 80% al 85% con la SEQ ID n.º 122, en donde se prefiere más una identidad de al menos el 85% al 90% y en donde lo más preferido es una identidad de al menos el 95% basada en el procedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetros pordefecto de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0,1, y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.
(d) de 3-amino-2-butanol a O-fosfato de 3-amino-2-butanol:
No se conocen enzimas en la técnica que catalicen la conversión de sustrato en producto del 3-amino-2-butanol (III) en el fosfato de 3-amino-2-butanol (IV). Sin embargo, se ha demostrado que unas pocas especies de Pseudomonas y Erwinia expresan una etanolamina cinasa dependiente de ATP (EC 2.7.1.82) que les permite utilizar etanolamina o 1-amino-2-propanol como fuente de nitrógeno (Jones et al., (1973) Biochem. J. 134: 167-182). Es probable que esta enzima también tenga actividad sobre el 3-amino-2-butanol o que pueda manipularse genéticamente para que lo haga, lo que proporcionaría una aminobutanol cinasa. La presente invención describe en el ejemplo 14 un gen de Erwinia carotovora subsp. atroseptica (SEQ ID n.º 123) que codifica una proteína (SEQ ID n.º 24) que está identificada como una aminoalcohol cinasa. Esta enzima se puede utilizar para convertir el 3-amino-2-butanol en Ofosfato de 3-amino-2-butanol.
El experto en la técnica apreciará que los polipéptidos que tienen actividad aminobutanol cinasa que se han aislado de distintos microorganismos serán útiles independientemente de la homología entre las secuencias. Un ejemplo de esta actividad se describe en la presente memoria y se identifica como SEQ ID n.º 124. Por consiguiente, las enzimas aminobutanol cinásicas preferidas son las que tienen una identidad de al menos el 80% al 85% con la SEQ ID n.º 124, en donde se prefiere más una identidad de al menos el 85% al 90% y en donde lo más preferido es una identidad de al menos el 95% basada en el procedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetros pordefecto de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0,1, y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.
(e) de fosfato de 3-amino-2-butanol a 2-butanona:
Aunque no se han descrito enzimas que catalicen la conversión de sustrato en producto del fosfato de 3-amino-2butanol (IV) en la 2-butanona (V), el sustrato es muy parecido a los utilizados por la enzima fosfoetanolamina fosfoliasa dependiente de fosfato de piridoxal, que se ha encontrado en un pequeño número de especies de Pseudomonas y de Erwinia. Estas enzimas tienen actividad sobre la fosfoetanolamina y los dos enantiómeros de 2fosfo-1-amino-propano (Jones et al. (1973) Biochem. J. 134: 167-182) y también puede tener actividad sobre el Ofosfato de 3-amino-2-butanol. Se describe en la presente memoria un gen de Erwinia carotovora subsp. atroseptica (SEQ ID n.º 125) que codifica una proteína (SEQ ID n. 126) que tiene homología con las aminotransferasas de clase
III. El ejemplo 15 demuestra que esta enzima es activa con sustratos de fosfato de aminopropanol y fosfato de aminobutanol. La enzima recién identificada y caracterizada fue capaz de catalizar la conversión de una mezcla de (R)-3-amino-(S)-2-butanol y O-fosfato de (S)-3-amino-(R)-2-butanol, y una mezcla de (R)-3-amino-(R)-2-butanol y Ofosfato de (S)-3-amino-(S)-2-butanol, en 2-butanona. La enzima recién identificada y caracterizada también fue capaz de catalizar la conversión del fosfato de ambos fosfatos de (R)- y (S)-2-amino-1-propanol en propanona, con preferencia por el fosfato de (S)-2-amino-1-propanol. Se observó que la actividad más elevada aparecía con el sustrato natural propuesto, el fosfato de DL-1-amino-2-propanol, que era convertido en propionaldehído.
El experto en la técnica apreciará que los polipéptidos que tienen actividad aminobutanol-fosfato fosfoliasa que se han aislado de distintos microorganismos serán útiles independientemente de la homología entre las secuencias. Un ejemplo de enzima aminobutanol-fosfato fosfoliásica se describe en la presente memoria como SEQ ID n.º 126. Por
consiguiente, las enzimas aminobutanol-fosfato fosfoliásicas preferidas son las que tienen una identidad de al menos el 80% al 85% con la SEQ ID n.º 126, en donde se prefiere más una identidad de al menos el 85% al 90% y en donde lo más preferido es una identidad de al menos el 95% basada en el procedimiento de alineamiento Clustal Wque utiliza los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0,1, y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.
(f)
de 2-butanona a 2-butanol:
La etapa final en todas las vías para producir el 2-butanol a partir del ácido pirúvico es la reducción de la 2-butanona
(V)
en el 2-butanol (VI). Esta conversión de sustrato en producto está catalizada por algunos miembros de la amplia clase de alcohol deshidrogenasas (tipos que utilizan bien NADH o NADPH como fuente de hidruro, según la enzima) que se pueden llamar butanol deshidrogenasas. Se conocen bien las enzimas de cada tipo que catalizan la reducción de la 2-butanona, tal y como se describe más arriba en la definición de butanol deshidrogenasa.
El experto en la técnica apreciará que los polipéptidos que tienen actividad butanol deshidrogenasa que se han aislado de distintos microorganismos serán útiles en la presente invención independientemente de la homología de secuencia. Algunos ejemplos de enzimas butanol deshidrogenásicas adecuadas están disponibles de una serie de fuentes, por ejemplo, Rhodococcus ruber [n.º de GenBank CAD36475 (SEQ ID n.º 14), AJ491307 (SEQ ID n.º 13)]. Las enzimas dependientes de NADP se conocen como EC 1.1.1.2 y están disponibles, por ejemplo, de Pyrococcus furiosus [n.º de GenBank AAC25556 (SEQ ID n.º 91), AF013169 (SEQ ID n.º 90)]. Adicionalmente, una butanol deshidrogenasa está disponible de Escherichia coli [n.º de GenBank NP_417484 (SEQ ID n.º 75), NC_000913 (SEQ ID n.º 74)] y una ciclohexanol deshidrogenasa está disponible de Acinetobacter sp. [n.º de GenBank AAG10026 (SEQ ID n.º 72), AF282240 (SEQ ID n.º 71)]. Las enzimas butanol deshidrogenásicas preferidas son las que tienen una identidad de al menos el 80% al 85% con las SEQ ID n.º 14, 91, 75 y 72, en donde se prefiere más una identidad de al menos el 85% al 90% y en donde lo más preferido es una identidad de al menos el 95% basada en elprocedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0,1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.
Vía 2:
(a)
de piruvato a a-acetolactato:
Esta conversión de sustrato en producto es la misma que se describe más arriba para la vía 1.
(b)
de a-acetolactato a acetoína:
Esta conversión de sustrato en producto es la misma que se describe más arriba para la vía 1.
(g)
de acetoína a fosfoacetoína:
Aunque no se han descrito las enzimas que catalizan la conversión de sustrato en producto de la acetoína (II) en la fosfoacetoína (VII), la estructura del sustrato acetoína es muy parecida a la de la dihidroxiacetona y, por lo tanto, la acetoína puede ser un sustrato aceptable para la dihidroxiacetona cinasa (EC 2.7.1.29), una enzima que cataliza la fosforilación de la dihidroxiacetona. Se conocen bien las técnicas de ingeniería de proteínas para la alteración de la especificidad de sustrato de las enzimas (Antikainen y Martin, (2005) Bioorg. Med. Chem. 13: 2701-2716) y se pueden utilizar para generar una enzima con la especificidad necesaria. En esta conversión, el resto de fosfato puede ser suministrado por un donante biológico de fosfatos de alta energía, en donde los sustratos habituales son fosfoenolpiruvato (como en la dihidroxiacetona cinasa de E. coli) y ATP (como en la dihidroxiacetona cinasa de Citrobacter freundii) (Garcia-Alles et al. (2004) Biochemistry 43: 13037-13045).
(h)
de fosfoacetoína a O-fosfato de 3-amino-2-butanol:
Aunque no se han descrito las enzimas que catalicen la conversión de sustrato en producto de la fosfoacetoína (VII) en el O-fosfato de 3-amino-2-butanol (IV), la estructura del sustrato es muy parecida a la del fosfato de dihidroxiacetona, un sustrato para la propuesta serinolfosfato aminotransferasa que está codificada por la porción en 5' del gen rtxA en algunas especies de Bradyrhizobium (Yasuta et al., véase más arriba). Así pues, una serinolfosfato aminotransferasa puede ser funcional en esta etapa.
(e)
de O-fosfato de 3-amino-2-butanol a 2-butanona:
Esta conversión de sustrato en producto es la misma que se describe más arriba para la vía 1.
(f)
de 2-butanona a 2-butanol:
Esta conversión de sustrato en producto es la misma que se describe más arriba para la vía 1.
Vía 3:
(a)
de piruvato a a-acetolactato:
Esta conversión de sustrato en producto es la misma que se describe más arriba para la vía 1.
(b)
de a-acetolactato a acetoína:
Esta conversión de sustrato en producto es la misma que se describe más arriba para la vía 1.
(i)
de acetoína a 2,3-butanodiol:
La conversión de sustrato en producto de la acetoína (II) en el 2,3-butanodiol (VIII) puede estar catalizada por una butanodiol deshidrogenasa que puede utilizar bien NADH o bien NADPH como fuente de equivalentes de reducción cuando se llevan a cabo las reducciones. Las enzimas con actividad sobre la acetoína participan en la vía para la producción del 2,3-butanodiol en los microorganismos, lo que produce dicho compuesto. Las enzimas descritas (p. ej., BudC de Klebsiella pneumoniae [Ui et al., (2004) Letters in Applied Microbiology 39: 533-537]) utilizan generalmente NADH. En esta vía se puede utilizar cualquiera de los cofactores para la producción del 2-butanol.
El experto en la técnica apreciará que los polipéptidos que tienen actividad butanodiol deshidrogenasa que se han aislado de distintos microorganismos serán útiles en la presente invención independientemente de la homología entre las secuencias. Algunos ejemplos de enzimas butanodiol deshidrogenásicas adecuadas están disponibles de una serie de microorganismos, por ejemplo, Klebsiella pneumoniae (n.º de GenBank BBA13085 (SEQ ID n.º 6), D86412 (SEQ ID n.º 5)). Las butanodiol deshidrogenasas específicas de (R) se conocen como EC 1.1.1.4 y están disponibles, por ejemplo, de Bacillus cereus [n.º de GenBank NP_830481 (SEQ ID n.º 85), NC_004722 (SEQ ID n.º 84); AAP07682 (SEQ ID n.º 87), AE017000 (SEQ ID n.º 86)] y Lactococcus lactis [n.º de GenBank AAK04995 (SEQ ID n.º 89), AE006323 (SEQ ID n.º 88)]. Las butanodiol deshidrogenasas preferidas son las que tienen una identidad de al menos el 80% al 85% con las SEQ ID n.º 6, 85, 87 y 89, donde se prefiere más una identidad de al menos el 85% al 90% y en donde lo más preferido es una identidad de al menos el 95% basada en el procedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10,PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0,1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.
(j) de 2,3-butanodiol a 2-butanona:
La conversión de sustrato en producto del 2,3-butanodiol (VIII) en la 2-butanona (V) puede ser catalizada por las enzimas diol deshidratásicas (EC 4.2.1.28) y las enzimas glicerol deshidratásicas (EC 4.2.1.30). La diol deshidratasa mejor caracterizada es la enzima de Klebsiella oxytoca dependiente de la coenzima B12, pero se encuentran enzimas similares en otras muchas bacterias entéricas. Se ha demostrado que la enzima de K. oxytoca acepta el meso-2,3-butanodiol como sustrato (Bachovchin et al. (1977) Biochemistry 16: 1082-1092), lo que produce la 2butanona, el producto deseado. El ejemplo 17 demuestra que la glicerol deshidratasa de Klebsiella pneumoniae fue capaz de convertir el meso-2,3-butanodiol en la 2-butanona. Las tres subunidades de la glicerol deshidratasa de Klebsiella pneumoniae (a: SEQ ID n.º 145 (región codificante) y 146 (proteína); �: SEQ ID n.º 147 (región codificante) y 148 (proteína); y y: SEQ ID n.º 149 (región codificante) y 150 (proteína)) se expresaron junto con las dos subunidades de la reactivasa de la glicerol deshidratasa de Klebsiella pneumoniae [subunidad mayor, SEQ ID n.º 151 (región codificante) y 152 (proteína); y subunidad menor, SEQ ID n.º 153 (región codificante) y 154 (proteína)] para proporcionar la actividad.
También se encuentran resultados en la bibliografía de una diol deshidratasa independiente de B12 de Clostridium glycolicum (Hartmanis et al. (1986) Arch. Biochem. Biophys. 245: 144-152). Esta enzima tiene actividad sobre el 2,3butanodiol, aunque esta actividad es de menos del 1% de la actividad sobre el etanodiol, pero la enzima se puede modificar genéticamente para mejorar esa actividad. Una deshidratasa independiente de B12 mejor caracterizada es la glicerol deshidratasa de Clostridium butyricum (O'Brien et al. (2004) Biochemistry 43: 4635-4645), que es muy activa sobre el 1,2-propanodiol así como sobre el glicerol. Esta enzima utiliza S-adenosilmetionina como fuente de radicales adenosílicos. No hay datos de que actúe sobre el 2,3-butanodiol, pero tal actividad, en caso de no estar presente, posiblemente se pueda incluir por manipulación genética.
El experto en la técnica apreciará que los polipéptidos que tienen actividad butanodiol deshidrogenasa que se han aislado de distintos microorganismos serán útiles en la presente invención independientemente de la homología entre las secuencias. Tal y como se indica más arriba, se ha descrito en la bibliografía una gran cantidad de diol y glicerol deshidratasas y serán adecuadas para el uso en la presente invención. Por consiguiente, en un aspecto de la invención, las enzimas diol y glicerol deshidratásicas son las que tienen una identidad de al menos el 80% al 85% con las enzimas que tienen las subunidades mayor, mediana y menor, respectivamente, de las secuencias enumeradas a continuación:
a) SEQ ID n.º 8, SEQ ID n.º 10 y SEQ ID n.º 12;
b) SEQ ID n.º 93, SEQ ID n.º 95 y SEQ ID n.º 97;
c) SEQ ID n.º 99, SEQ ID n.º 101 y SEQ ID n.º 103;
d) SEQ ID n.º 105, SEQ ID n.º 107 y SEQ ID n.º 109;
e) SEQ ID n.º 135, SEQ ID n.º 136 y SEQ ID n.º 137;
f) SEQ ID n.º 138, SEQ ID n.º 139 y SEQ ID n.º 140;
g) SEQ ID n.º 146, SEQ ID n.º 148 y SEQ ID n.º 150;
h) SEQ ID n.º 141, SEQ ID n.º 142 y SEQ ID n.º 143; y
i) SEQ ID n.º 164, SEQ ID n.º 165 y SEQ ID n.º 166.
en donde se prefiere más una identidad de al menos el 85% al 90%, y en donde lo más preferido es una identidad de al menos el 95% basada en el procedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetros por defecto dePENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0,1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.
Las enzimas diol y glicerol deshidratásicas preferidas de igual forma son las que tienen una identidad de al menos el 80% al 85% con las enzimas que tienen las subunidades mayor, mediana y menor, respectivamente, de las secuencias recogidas a continuación: subunidad mayor: SEQ ID n.º 8, 99, 105, 135, 138, 141, 146 y 164; subunidad mediana: SEQ ID n.º 10, 101, 107, 136, 139, 142, 148, y 165; subunidad menor: SEQ ID n.º 12, 103, 109, 137, 140, 143, 150 y 166; en donde se prefiere más una identidad de al menos el 85% al 90% y en donde lo más preferido es una identidad de al menos el 95% basada en el procedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetrospor defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0,1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.
Otras enzimas diol y glicerol deshidratásicas que se pueden utilizar en la vía biosintética 3 de la presente invención se identificaron a través de un análisis bioinformático de la relación entre función y estructura que se describe a continuación y en el ejemplo 18.
(f) de 2-butanona a 2-butanol:
Esta conversión de sustrato en producto es la misma que se describe más arriba para la vía 1.
Diol y glicerol deshidratasas para la vía biosintética 3
Cualquier enzima que sea una diol o glicerol deshidratasa se puede utilizar en la presente invención para convertir el 2,3-butanodiol en 2-butanona. En el ejemplo 18 de la presente memoria se establece una relación entre la estructura y la función para las diol y glicerol deshidratasas en las clases de enzimas EC 4.2.1.28 y EC 4.2.1.30, respectivamente. La función se da a conocer mediante datos experimentales y la estructura se da a conocer mediante el análisis bioinformático. Se analizaron las ocho enzimas diol y glicerol deshidratásicas cuya actividad estaba demostrada experimentalmente. En este grupo (recogido en la tabla 10) se demostró que las enzimas diol deshidratasa de Klebsiella oxytoca y glicerol deshidratasa de Klebsiella pneumoniae convertían el 2,3-butanodiol en 2-butanona (Bachovchin et al., (1977) Biochemistry 16: 1082-1092 y ejemplo 17 de la presente memoria, respectivamente), mientras que se demostró la actividad de las otras seis enzimas con el uso de sus sustratos naturales (en la tabla 10 se dan las referencias). Este conjunto de ocho diol y glicerol deshidratasas se analizó con el algoritmo hhmsearch del paquete informático HMMER (Janelia Farm Research Campus, Ashburn, VA). El parámetro Z del algoritmo hmmsearch se fijó en 1.000 millones. La salida del análisis de HMMER con un conjunto de secuencias de proteínas es un perfil de modelo oculto de Markov (HMM, por su nombre en inglés). La teoría que subyace a los perfiles de HMM se describe en Durbin et al., Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids, Cambridge University Press, 1998; Krogh et al., J. Mol. Biol. 235: 1501-1531, que caracteriza el conjunto de proteínas basado en la probabilidad de que cada aminoácido aparezca cada posición en el alineamiento de las proteínas del conjunto.
Ya que las ocho diol y glicerol deshidratasas (diol/glicerol deshidratasas) que se utilizaron para el análisis, cuya función se había verificado experimentalmente, tienen cada una tres subunidades (mayor o a, mediana o � y menor
o y), se preparó un perfil de HMM distinto para cada subunidad. El perfil de HMM para la subunidad mayor (tabla 12) se construyó con las proteínas de SEQ ID n.º 8, 99, 105, 135, 138, 141, 146 y 164 que se describen en las tablas 1 y
2. El perfil de HMM para la subunidad mediana (tabla 13) se construyó con las proteínas de SEQ ID n.º 10, 101, 136, 139, 142, 148 y 165 que se describen en las tablas 1 y 2. El perfil de HMM para la subunidad menor (Tabla 14) se construyó con las proteínas de SEQ ID n.º 12, 103, 109, 137, 140, 143, 150 y 166 que se describen en las tablas 1 y
2. Las referencias que proporcionan los datos del ensayo funcional se ofrecen en la tabla 10. El perfil de HMM preparado para una subunidad mayor da una caracterización estructural para la subunidad mayor funcional de las diol/glicerol deshidratasas. De igual forma, los perfiles de HMM para las subunidades mediana y menor dan caracterizaciones estructurales para las subunidades funcionales medianas y menores, respectivamente, de las diol/glicerol deshidratasas. Por lo tanto, cualquier proteína que tenga una concordancia significativa con el perfil de HMM para la subunidad mayor, o bien para la mediana, o bien para la menor, está directamente relacionada con la función de la subunidad para la cual se preparó el perfil. Para ser significativa, la concordancia tiene un valor de E de
0,01 o menor, y además el uso de la «concordancia» se entiende que está con este criterio de valor de E. Así pues, las subunidades de las diol/glicerol deshidratasas que se pueden utilizar en la presente invención son proteínas que concuerdan con los perfiles de HMM que se prepararon con las proteínas cuyo SEQ ID n.º se la enumerado más arriba, con un valor de E de 0,01 o inferior.
5 Las proteínas que están completas y que tienen una relación funcional con la subunidad mayor de las diol/glicerol deshidratasas, a través de la concordancia con el perfil de HMM para la subunidad mayor, incluyen, pero sin limitarse a ellas, las proteínas de SEQ ID n.º 93, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 130, 243, 254, 255, 256, 257, 258 y 259. Las proteínas completas y que tienen una relación funcional con la subunidad mediana de las diol/glicerol deshidratasas, a través del la concordancia con el perfil de HMM para la subunidad mediana, incluyen, pero sin limitarse a ellas, las proteínas de SEQ ID n.º 95, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 244, 250, 252, 260, 261, 262, 263, 364, 265, 266 y 167. Las proteínas completas y que tienen una relación funcional con la subunidad menor de las diol/glicerol deshidratasas, a través del la concordancia con el perfil de HMM para la subunidad menor, incluyen, pero sin limitarse a ellas, las proteínas de SEQ ID n.º 97, 169, 172, 175,
15 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 245, 248, 249, 251, 253, 268, 270, 271, 272, 273 y 274. Además, las proteínas que son una fusión de longitud completa de las subunidades mayor y mediana que tienen una relación funcional con las subunidades mayor y mediana de las diol/glicerol deshidratasas, a través de la concordancia con los perfiles de HMM para las subunidades mayor y mediana, incluyen, pero sin limitarse a ellas, las proteínas de SEQ ID n.º 233, 235, 237, 239, 241, 246 y 247.
Ya que los perfiles de HMM descritos más arriba proporcionan una relación entre la estructura y la función para las diol/glicerol deshidratasas, las proteínas nuevas que se identifiquen y que concuerden con estos perfiles también pueden utilizarse en la presente invención. Además, la secuencia de las proteínas de las subunidades de las diol/glicerol deshidratasas que se pueden utilizar en la presente invención incluye toda proteína con cambios de
25 aminoácidos que tienen efectos mínimos sobre el funcionamiento de la subunidad, que son sustancialmente similares a los de las secuencias cuyas SEQ ID n.º se han enumerado anteriormente. Se sabe bien en la técnica que es muy frecuente que se sustituya un aminoácido químicamente equivalente en un sitio determinado que no afecta a las propiedades funcionales de la proteína codificada. Para los propósitos de la presente invención, las sustituciones que proporcionan proteínas sustancialmente similares se definen por intercambios dentro de uno de los siguientes cinco grupos:
1.
Restos alifáticos pequeños y apolares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly);
2.
Restos polares cargados negativamente y sus amidas: Asp, Asn, Glu, Gln;
3.
Restos polares cargados positivamente: His, Arg, Lys;
4.
Restos alifáticos grandes y apolares: Met, Leu, Ile, Val (Cys); y
35 5. Restos aromáticos grandes: Phe, Tyr, Trp.
Así pues, las sustituciones de un aminoácido por otro en estos grupos se espera que produzcan una proteína funcionalmente equivalente. En muchos casos, los cambios que dan lugar a la alteración de las porciones del extremo amino y del extremo carboxilo de la proteína no se esperaría que alterasen la actividad de la proteína.
Proteínas sustancialmente similares a las de las SEQ ID que concuerdan con los perfiles de HMM pueden tener la secuencia aminoacídica idéntica al 90% o 95% a una de las proteínas concordantes, y estas se pueden utilizar en la presente invención.
El experto en la técnica puede identificar fácilmente un conjunto de tres subunidades que se pueden utilizar juntas para proporcionar una diol/glicerol deshidratasa funcional. Particularmente adecuada es una combinación de una subunidad mayor, mediana y menor de la misma cepa de microorganismo, cuyas regiones codificantes están
45 localizadas cercanas entre sí en el genoma. Estas subunidades lo más probable es que formen una diol o glicerol deshidratasa natural. Muchas subunidades mayores, medianas y menores se agrupan de este modo en la tabla 2. Una combinación de subunidades de especies o cepas muy relacionadas es adecuada para componer una diol deshidratasa o una glicerol deshidratasa. Se puede utilizar cualquier combinación de subunidades que catalice la conversión del 2,3-butanodiol en la 2-butanona. Las combinaciones de subunidades eficaces las puede determinar con facilidad un experto en la técnica mediante la comparación de la secuencia de aminoácidos y/o con ensayos funcionales.
En consonancia, la invención da a conocer enzimas diol y glicerol deshidratásicas que tienen secuencias aminoacídicas que comprenden subunidades mayores, medianas y menores de longitud completa, cada una de las cuales da un parámetro del valor de E de 0,01 o inferior cuando se interroga con un perfil de modelo oculto de 55 Markov preparado con las subunidades mayores de SEQ ID n.º 8, 99, 105, 135, 138, 141, 146, y 164; las subunidades medianas de SEQ ID n.º 10, 101, 107, 136, 139, 142, 148 y 165; y las subunidades menores de SEQ ID n.º 12, 103, 109, 137, 140, 143, 150 y 166; cada interrogación se lleva a cabo con el algoritmo hmmsearch, en
donde el parámetro Z se fija a 1.000 millones. Alternativamente, la invención da a conocer enzimas diol y glicerol deshidratásicas que tienen secuencias aminoacídicas identificadas por un procedimiento que comprende:
a) generar un perfil de modelo oculto de Markov a partir del alineamiento de las secuencias aminoacídicas que corresponden a las subunidades mayor, mediana y menor de las enzimas diol y glicerol deshidratásicas, en donde:
i) la subunidad mayor comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 8, 99, 105, 135, 138, 141, 146 y 164;
ii) la subunidad mediana comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 10, 101, 107, 136, 139, 142, 148 y 165; y
iii) la subunidad menor comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 12, 103, 109, 137, 140, 143, 150 y 166;
b) interrogar al menos una base de datos pública de secuencias de proteínas que contiene secuencias de diol y glicerol deshidratasas con el perfil de modelo oculto de Markov de (a) mediante el algoritmo hmmsearch, en donde el parámetro Z se fija a 1.000 millones y el parámetro del valor de E se fija a 0,01, para identificar un primer conjunto de datos de las secuencias aminoacídicas de diol y glicerol deshidratasas; y
c) retirar cualquier secuencia parcial del primer conjunto de datos de (b) para generar un segundo conjunto de datos de las secuencias aminoacídicas de diol y glicerol deshidratasas, en donde se identifican las enzimas diol deshidratasa y glicerol deshidratasa.
Con respecto a las subunidades mayores de las diol y glicerol deshidratasas de la invención, las enzimas pueden comprender una subunidad mayor que comprende una secuencia aminoacídica que tiene una identidad de al menos el 95% con una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 8, 93, 99, 105, 135, 138, 141, 146, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 130, 243, 254, 255, 256, 257, 258 y 259, basándose en el procedimiento de alineamiento Clustal W que utilizalos parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0,1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.
Con respecto a las subunidades medianas de las diol y glicerol deshidratasas de la invención, las enzimas pueden comprender una subunidad mediana que comprende una secuencia aminoacídica que tiene una identidad de al menos el 95% con una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 10, 95, 101, 107, 136, 139, 142, 148, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 244, 250, 252, 260, 261, 262, 263, 364, 265, 266 y 167 basándose en el procedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10,PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0,1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.
Con respecto a las subunidades menores de las diol y glicerol deshidratasas de la invención, las enzimas pueden comprender una subunidad mediana que comprende una subunidad menor que comprende una secuencia aminoacídica que tiene una identidad de al menos el 95% con una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 12, 97, 103, 109, 137, 140, 143, 150, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 245, 248, 249, 251, 253, 268, 270, 271, 272, 273 y 274, basándose en el procedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetrospor defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0,1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.
Alternativamente, la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa pueden comprender subunidades mayores, medianas y menores fusionadas que comprenden una secuencia aminoacídica que tiene una identidad de al menos el 95% con una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 233, 235, 237, 239, 241, 246 y 247, basándose en el procedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetros por defecto dePENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0,1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.
Alternativamente, las enzimas diol deshidratasa o glicerol deshidratasa pueden comprender subunidades mayores, medianas y menores fusionadas y tener una identidad de al menos el 95% con una secuencia aminoacídica que comprende las tres secuencias aminoacídicas que codifican las subunidades mayores, medianas y menores seleccionadas del grupo que consiste en:
a) SEQ ID n.º 8, SEQ ID n.º 10 y SEQ ID n.º 12;
b) SEQ ID n.º 93, SEQ ID n.º 95 y SEQ ID n.º 97;
c) SEQ ID n.º 99, SEQ ID n.º 101 y SEQ ID n.º 103;
d) SEQ ID n.º 105, SEQ ID n.º 107 y SEQ ID n.º 109;
e) SEQ ID n.º 135, SEQ ID n.º 136 y SEQ ID n.º 137;
f) SEQ ID n.º 138, SEQ ID n.º 139 y SEQ ID n.º 140;
g) SEQ ID n.º 146, SEQ ID n.º 148 y SEQ ID n.º 150;
h) SEQ ID n.º 141, SEQ ID n.º 142 y SEQ ID n.º 143; y
i) SEQ ID n.º 164, SEQ ID n.º 165 y SEQ ID n.º 166;
basándose en el procedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetros por defecto de PENALIZACIÓNPOR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0,1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.
Vía 4:
(a)
de piruvato a a-acetolactato:
Esta conversión de sustrato a producto es la misma que se describe más arriba para la vía 1.
(k)
de a-acetolactato a ácido 2,3-dihidroxi-2-metilbutanoico:
La conversión de sustrato en producto del acetolactato (I) en el ácido 2,3-dihidroxi-2-metilbutanoico (IX) no se conoce en la técnica. Sin embargo, el producto de esta conversión se ha descrito que es un componente de los caldos de fermentación (Ziadi et al. (1973) Comptes Rendus des Seances de l'Academie des Sciences, Serie D: Sciences Naturelles 276: 965-8), pero se desconoce el mecanismo de formación. El probable mecanismo de la formación es la reducción del acetolactato en la que el NADH o el NADPH es el donante de electrones. Para utilizar esta vía para la producción del 2-butanol, hay que identificar o manipular genéticamente una enzima que catalice esta reacción. Sin embargo, se ha establecido bien el precedente para la reducción enzimática de las cetonas en alcoholes.
(l)
de ácido 2,3-dihidroxi-2-metilbutanoico a ácido 2-hidroxi-2-metil-3-fosfobutanoico:
No se conocen enzimas que catalicen la conversión de sustrato en producto del ácido 2,3-dihidroxi-2-metilbutanoico
(IX)
en el ácido 2-hidroxi-2-metil-3-fosfobutanoico (X). Sin embargo, hay un gran número de cinasas en la naturaleza que poseen una especificidad variante. Así pues, es probable que se pueda aislar o manipular genéticamente una enzima con esta actividad.
(m)
de ácido 2-hidroxi-2-metil-3-fosfobutanoico a 2-butanona:
No se conocen enzimas que catalicen la conversión de sustrato en producto del ácido 2-hidroxi-2-metil-3fosfobutanoico (X) en la 2-butanona (V). La combinación de esta reacción con la anterior es muy similar a la reacción en varias etapas catalizada por la mevalonato-5-pirofosfato (M5PP) descarboxilasa, que consiste en la fosforilación inicial del M5PP en el 3-fosfomevalonato-5-PP, seguida de la eliminación, dependiente de descarboxilación, del fosfato (Alvear et al., (1982) Biochemistry 21: 4646-4650).
(f)
de 2-butanona a 2-butanol:
Esta conversión de sustrato en producto es la misma que se describe más arriba para la vía 1.
Así pues, al proporcionar varias vías recombinantes desde el piruvato al 2-butanol, las etapas de conversión individuales se pueden realizar de muchas maneras, y la persona experta en la técnica podrá utilizar las secuencias públicas disponibles y las secuencias descritas en la presente memoria para construir las vías relevantes. En las tablas 1 y 2 presentadas anteriormente se ofrece una lista con un número representativo de genes conocidos en la técnica y útiles para la construcción de las vías biosintéticas del 2-butanol.
Hospedadores microbianos para la producción del 2-butanol y de la 2-butanona:
Los hospedadores microbianos para la producción del 2-butanol o de la 2-butanona se pueden seleccionar entre bacterias, cianobacterias, hongos filamentosos y levaduras. El hospedador microbiano utilizado para la producción del 2-butanol o de la 2-butanona debe ser tolerante al producto producido, para que el rendimiento no se vea limitado por la toxicidad del producto en el hospedador. La selección de un hospedador microbiano para la producción del 2-butanol se describe en detalle a continuación. Los mismos criterios se aplican a la selección de un hospedador para la producción de 2-butanona.
No se conocen bien en la técnica los microorganismos que son metabólicamente activos a títulos elevados de 2butanol. Aunque se han aislado mutantes tolerantes al butanol de clostridios solventógenos, se dispone de poca información referente a la tolerancia al butanol en otras cepas bacterianas potencialmente útiles. La mayoría de los estudios sobre la comparación de la tolerancia al alcohol en las bacterias sugieren que el butanol es más tóxico que el etanol (de Cavalho et al., Microsc. Res. Tech. 64: 215-22 (2004) y Kabelitz et al., FEMS Microbiol. Lett. 220: 223
227 (2003)). Tomas et al. (J. Bacteriol. 186: 2006-2018 (2004)) describen que la producción de 1-butanol durante la fermentación en Clostridium acetobutylicum puede estar limitada por la toxicidad del butanol. El efecto primario del 1-butanol sobre Clostridium acetobutylicum es la interrupción del funcionamiento de la membrana (Hermann et al., Appl. Environ. Microbiol. 50: 1238-1243 (1985)).
Los hospedadores microbianos seleccionados para la producción de 2-butanol deben tolerar el 2-butanol y deben ser capaces de convertir los glúcidos en 2-butanol mediante la vía biosintética que se les ha introducido. Los criterios para la selección de hospedadores microbianos adecuados incluyen lo siguiente: tolerancia intrínseca al 2-butanol, alta tasa de utilización de los glúcidos, disponibilidad de las herramientas genéticas para la manipulación génica y la capacidad para generar alteraciones cromosómicas estables.
Las cepas hospedadoras adecuadas tolerantes al 2-butanol se pueden identificar por detección selectiva basándose en la tolerancia intrínseca de la cepa. La tolerancia intrínseca de los microorganismos al 2-butanol se puede medir determinando la concentración de 2-butanol que es responsable de la inhibición del 50% de la tasa de crecimiento (CI50) cuando crece en medio mínimo. Los valores de CI50 se pueden determinar con los procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los microorganismos de interés pueden crecer en presencia de diferentes cantidades de 2-butanol y la tasa de crecimiento puede seguirse midiendo la densidad óptica a 600 nm. El tiempo de generación se puede calcular en la parte logarítmica de la curva de crecimiento y se puede utilizar como medida de la tasa de crecimiento. La concentración de 2-butanol que produce una inhibición del 50% de crecimiento puede determinarse a partir de un gráfico del porcentaje de inhibición del crecimiento frente a la concentración de 2-butanol. Preferiblemente, la cepa hospedadora debe tener una CI50 para el 2-butanol de más de aproximadamente el 0,5%. Es más adecuada una cepa hospedadora con una CI50 para el 2-butanol que está por encima de aproximadamente el 1,5%. Es particularmente adecuada una cepa hospedadora con una CI50 para el 2-butanol que está por encima de aproximadamente el 2,5%.
El hospedador microbiano para la producción del 2-butanol también debe utilizar glucosa y/o otros glúcidos a gran velocidad. La mayoría de los microorganismos son capaces de utilizar los glúcidos. Sin embargo, determinados microorganismos medioambientales no pueden utilizar los glúcidos con eficacia y, así pues, no serían hospedadores adecuados.
La capacidad de modificar genéticamente el hospedador es esencial que cualquier microorganismo recombinante pueda entrar en producción. Los modos de la tecnología de transferencia génica que se pueden utilizar incluyen electroporación, conjugación, transducción o transformación natural. Se dispone de un amplio abanico de plásmidos conjugativos del hospedador y marcadores de resistencia a los fármacos. Los vectores de clonación utilizados con un organismo están adaptados al organismo hospedador sobre la base de la naturaleza de los marcadores de resistencia a antibióticos que pueden funcionar en dicho hospedador.
El hospedador microbiano también puede estar manipulado para que tenga inactivadas las vías que compiten por el flujo de carbono, mediante la inactivación de una serie de genes. Esto requiere que la inactivación directa se pueda realizar o bien con transposones o bien con vectores de integración cromosómica. Adicionalmente, los hospedadores para producción en los que se pueden realizar mutagénesis químicas se puede hacer que mejoren su tolerancia intrínseca al 2-butanol a través de la mutagénesis química y el escrutinio de los mutantes.
Según los criterios descritos más arriba, los microorganismos hospedadores adecuados para producir 2-butanol y 2butanona incluyen, pero sin limitarse a ellos, miembros del género Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Pichia, Candida, Hansenula y Saccharomyces. Los hospedadores preferidos incluyen Escherichia coli, Alcaligenes eutrophus, Bacillus licheniformis, Paenibacillus macerans, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas putida, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum, Enterococcus faecalis, Pediococcus pantosaceus, Pediococcus acidilactici, Bacillus subtilis y Saccharomyces cerevisiae.
Construcción del hospedador para la producción
Con la tecnología bien conocida en la técnica se pueden construir los microorganismos recombinantes que contienen los genes necesarios que codifican la vía enzimática para la conversión de un sustrato de carbono fermentable en 2-butanol o 2-butanona. En la presente invención se pueden aislar de distintas fuentes los genes que codifican las enzimas de la vía biosintética 3 del 2-butanol: acetolactato sintasa, acetolactato descarboxilasa, butanodiol deshidrogenasa, butanodiol deshidratasa y butanol deshidrogenasa; o de la vía biosintética 3 de la 2butanona que omite la butanol deshidrogenasa, como se describió anteriormente.
Los procedimientos para obtener los genes deseados de un genoma bacteriano son los habituales y se conocen bien en la técnica de la biología molecular. Por ejemplo, si se conoce la secuencia del gen, se pueden diseñar los cebadores y se puede amplificar la secuencia deseada con los procedimientos estándares de amplificación dirigida por cebadores, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (patente de los EE.UU. n.º 4.683.202) para obtener cantidades de ADN adecuadas para clonar en los vectores de expresión. Si se tiene que aislar un gen que es heterólogo a una secuencia conocida, se pueden crear genotecas genómicas adecuadas mediante digestión con
endonucleasas de restricción y se pueden escrutar con sondas que tienen una secuencia complementaria a la secuencia génica deseada. Una vez que se ha aislado la secuencia, se puede amplificar el ADN con los procedimientos estándares de amplificación dirigida por cebadores, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (patente de los EE.UU n.º 4.683.202) para obtener cantidades de ADN adecuadas para clonar en los vectores de
5 expresión, que a continuación se introducen por transformación en las células hospedadoras adecuadas.
Además, dada la secuencia aminoacídica de una proteína con la actividad enzimática deseada, se puede averiguar la secuencia codificante mediante traducción inversa de la secuencia de la proteína. Se puede preparar sintéticamente un fragmento de ADN que contiene dicha secuencia codificante y se puede clonar en un vector de expresión, y luego se puede introducir por transformación en la célula hospedadora deseada.
10 Al preparar un fragmento de ADN sintético que contiene una secuencia codificante, se puede optimizar la expresión de esta secuencia en la célula hospedadora deseada. Las herramientas para la optimización de los codones para la expresión en un hospedador heterólogo son fáciles de acceder. Algunas herramientas disponibles para la optimización de codones se basan en el contenido de GC del organismo hospedador. El contenido de GC de algunos hospedadores microbianos de ejemplo se ofrece en la tabla 3.
15 Tabla 3
Contenido de GC de hospedadores microbianos
Cepa
% GC
B. licheniformis
46
B. subtilis
42
C. acetobutylicum
37
E. coli
50
P. putida
61
A. eutrophus
61
Paenibacillus macerans
51
Rhodococcus erythropolis
62
Brevibacillus
50
Paenibacillus polymyxa
50
Una vez que se identifican y aíslan los genes de las vías relevantes, se pueden introducir por transformación en los hospedadores de expresión adecuados mediante los medios conocidos en la técnica. Los vectores útiles para la transformación de una gama de células hospedadoras son los habituales y los venden en el mercado compañías tales como EPICENTRE® (Madison, WI), Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA), Stratagene (La Jolla, CA) y New England 20 Biolabs, Inc. (Beverly, MA). Típicamente, el vector contiene un marcador de selección y secuencias que permiten la replicación autónoma o la integración cromosómica en el hospedador deseado. Además, los vectores adecuados comprenden una región promotora que alberga los controles de la iniciación de la transcripción y una región de control de la terminación de la transcripción, entre los cuales se puede insertar un fragmento de ADN de la región codificante, con lo que se expresa la región codificante insertada. Ambas regiones de control pueden proceder de
25 genes homólogos a la célula hospedadora transformada, aunque hay que saber que tales regiones de control también pueden proceder de genes que no son nativos para la especie específica que se ha elegido como hospedador de producción.
Son numerosas las regiones de control de la iniciación o promotores, que son útiles para impulsar la expresión de las regiones codificantes de las vías relevantes en la célula hospedadora deseada, y les resultan familiares a los 30 expertos en la técnica. Virtualmente, cualquier promotor capaz de impulsar estos elementos genéticos es adecuado para la presente invención, que incluye, pero sin limitarse a ellos, los promotores procedentes de los genes siguientes: CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI, CUP1, FBA, GPD y GPM (útiles para la expresión en Saccharomyces); AOX1 (útil para la expresión en Pichia); así como los promotores de lac, ara, tet, trp, IPL, IPR, T7, tac y trc (útiles para la expresión en Escherichia coli, Alcaligenes y 35 Pseudomonas); los promotores de amy, apr y npr, y distintos promotores de fagos útiles para la expresión en Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis y Paenibacillus macerans; nisA (útil para la expresión en las bacterias
grampositivas, Eichenbaum et al., Appl. Environ. Microbiol. 64 (8): 2763-2769 (1988)); y el promotor sintético P11 (útil para la expresión en Lactobacillus plantarum, Rud et al., Microbiology 152: 1011-1019 (2006)).
Las regiones de control de la terminación también pueden proceder de distintos genes nativos para los hospedadores preferidos. Opcionalmente, se puede prescindir del sitio de terminación, pero se prefiere su inclusión.
Algunos vectores son capaces de replicarse en un amplio abanico de bacterias hospedadoras y se puede transferir por conjugación. Está disponible la secuencia completa y anotada de pRK404 y tres vectores relacionados: pRK437, pRK442 y pRK442 (H). Estos derivados han resultado ser herramientas valiosas para la manipulación genética de las bacterias gramnegativas (Scott et al., Plasmid 50 (1): 74-79 (2003)). Varios derivados plasmídicos de RSF1010, el plásmido derivado de P4 de amplio espectro de hospedadores, están disponibles con promotores que pueden funcionar en un abanico de bacterias gramnegativas. Los plásmidos pAYC36 y pAYC37 tienen promotores activos junto a sitios de clonación múltiple para permitir la expresión génica heteróloga en las bacterias gramnegativas.
Las herramientas de reemplazo cromosómico de genes también son fácilmente accesibles. Por ejemplo, se ha modificado una variante termosensible del replicón de amplio espectro de hospedadores pWV101 para construir un plásmido, el pVE6002, que se puede utilizar para efectuar el reemplazo génico en un abanico de bacterias grampositivas (Maguin et al., J. Bacteriol. 174 (17): 5633-5638 (1992)). Adicionalmente, los trasposomas in vitro están disponibles de fuentes comerciales tales como EPICENTRE® para crear mutaciones aleatorias en muy distintos genomas.
Más adelante se describe en detalle la expresión de una vía biosintética del 2-butanol en distintos hospedadores microbianos preferidos. Para la expresión de una vía biosintética de la 2-butanona, se aplica la misma descripción, pero se omite la conversión final de sustrato en producto de la 2-butanona en el 2-butanol.
Expresión de una vía biosintética de la 2-butanona o del 2-butanol en E. coli
Se conocen bien los vectores útiles para la transformación de E. coli y están disponibles comercialmente de las compañías enumeradas anteriormente. Por ejemplo, los genes de una vía biosintética del 2-butanol se pueden aislar de distintas fuentes, tal y como se describe más arriba, se pueden clonar en un vector pUC19 modificado, y se pueden transformar en E. coli NM522, tal y como se describe en los ejemplos 6 y 7. Alternativamente, los genes que codifican una vía biosintética del 2-butanol se pueden dividir en varios operones, se pueden clonar en vectores de expresión y se pueden introducir por transformación en distintas cepas de E. coli, tal y como se describe en los ejemplos 9, 10 y 11. La vía de biosíntesis de la 2-butanona puede expresarse de igual forma, omitiendo la butanol deshidrogenasa.
Expresión de una vía biosintética del 2-butanol o de la 2-butanona en Rhodococcus erythropolis
Para la expresión en R. erythropolis están disponibles una serie de vectores lanzadera de E. coli a Rhodococcus, entre ellos, pero sin limitarse a ellos, pRhBR17 y pDA71 (Kostichka et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 62: 61-68 (2003)). Adicionalmente, están disponibles una serie de promotores para la expresión génica heteróloga en R. erythropolis (véase, por ejemplo, Nakashima et al., Appl. Environ. Microbiol. 70: 5557-5568 (2004) y Tao et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, DOI 10.1007/s00253-005-0064). Se pueden crear disrupciones génicas selectivas en genes cromosómicos de R. erythropolis con los procedimientos descritos por Tao et al., véase más arriba, y Brans et al. (Appl. Environ. Microbiol. 66: 2029-2036 (2000)).
Los genes heterólogos que se necesitan para producir el 2-butanol, tal y como se describe más arriba, se pueden clonar inicialmente en el pDA71 o en el pRhBR71, e introducirse por transformación en E. coli. A continuación, los vectores se pueden introducir por transformación en R. erythropolis mediante electroporación, tal y como describieron Kostichka et al., véase más arriba. Los recombinantes se pueden hacer crecer en medio sintético que contiene glucosa y la producción del 2-butanol se sigue con los procedimientos de fermentación conocidos en la técnica. La vía de la biosíntesis de la 2-butanona se puede expresar de igual forma, omitiendo la butanol deshidrogenasa.
Expresión de una vía biosintética del 2-butanol o de la 2-butanona en B. Subtilis
Se conocen bien en la técnica los procedimientos para la expresión génica y la creación de mutaciones en B. subtilis. Por ejemplo, los genes de la vía biosintética del 2-butanol se pueden aislar de distintas fuentes, como se describió anteriormente, se pueden clonar en un vector lanzadera de E. coli a Bacillus modificado y se pueden introducir por transformación en Bacillus subtilis BE1010, como se describe en el ejemplo 8. Los genes deseados pueden clonarse en un vector de expresión de Bacillus y se pueden introducir por transformación en una cepa para convertirla en un hospedador productor. Alternativamente, los genes se pueden integrar en el cromosoma de Bacillus con los replicones condicionales o los vectores suicidas que le son conocidos al experto en la técnica. Por ejemplo, el Bacillus Genetic Stock Center contiene muchos vectores de integración. La vía de biosíntesis de la 2butanona se puede expresar de igual forma, omitiendo la butanol deshidrogenasa.
Expresión de una vía biosintética del 2-butanol o de la 2-butanona en B. licheniformis
La mayoría de los plásmidos y vectores lanzadera que se replican en B. subtilis pueden utilizarse para transformar
B. licheniformis por transformación de protoplastos o electroporación. Los genes necesarios para la producción de 2butanol se pueden clonar en derivados de los plásmidos pBE20 o pBE60 (Nagarajan et al., Gene 114. 121-126 (1992)). Los procedimientos para transformar B. licheniformis se conocen en la técnica (por ejemplo, véase Fleming et al., Appl. Environ. Microbiol., 61 (11): 3775-3780 (1995)). Los plásmidos construidos para la expresión en B. subtilis se pueden transformar en B. licheniformis para producir un hospedador microbiano recombinante que produce 2-butanol. La vía de biosíntesis de la 2-butanona se puede expresar de igual forma, omitiendo la butanol deshidrogenasa.
Expresión de una vía biosintética del 2-butanol o de la 2-butanona en Paenibacillus macerans
Se pueden construir plásmidos como se describe más arriba para la expresión en B. subtilis y utilizarse para transformar Paenibacillus macerans mediante transformación de protoplastos para generar un hospedador microbiano recombinante que produce 2-butanol. La vía de biosíntesis de la 2-butanona puede expresarse de igual forma, omitiendo la butanol deshidrogenasa.
Expresión de una vía biosintética del 2-butanol o de la 2-butanona en Alcaligenes (Ralstonia) eutrophus
Se conocen bien en la técnica los procedimientos para la expresión génica y la creación de mutaciones en Alcaligenes eutrophus (véase, por ejemplo, Taghavi et al., Appl. Environ. Microbiol. 60 (10): 3585-3591 (1994)). Los genes para la vía biosintética del 2-butanol se pueden clonar en cualquiera de los vectores de amplio espectro de hospedadores descritos más arriba, y electroporarse en Alcaligenes eutrophus para generar recombinantes que producen 2-butanol. Se ha descrito en detalle la vía del poli(hidroxibutirato) en Alcaligenes, se conocen una serie de técnicas genéticas para modificar el genoma de Alcaligenes eutrophus, y esas herramientas se pueden aplicar para manipular genéticamente una vía biosintética del 2-butanol. La vía de biosíntesis de la 2-butanona se puede expresar de igual forma, omitiendo la butanol deshidrogenasa.
Expresión de una vía biosintética del 2-butanol o de la 2-butanona en Pseudomonas putida
Se conocen en la técnica los procedimientos para la expresión génica en Pseudomonas putida (véase, por ejemplo, Ben-Bassat et al., patente de los EE.UU. n.º 6.586.229). Los genes de una vía biosintética del 2-butanol se pueden insertar en el pPCU18, y este ADN ligado se puede electroporar en las células electrocompetentes DOT-T1 C5aAR1 de Pseudomonas putida para generar recombinantes que producen 2-butanol. La vía de la biosíntesis de la 2butanona se puede expresar de igual forma, omitiendo la butanol deshidrogenasa.
Expresión de una vía biosintética del 2-butanol o de la 2-butanona en Lactobacillus plantarum
El género Lactobacillus pertenece a la familia Lactobacillales y muchos plásmidos y vectores utilizados para la transformación de Bacillus subtilis y Streptococcus se pueden utilizar en Lactobacillus. Ejemplos no limitantes de vectores adecuados incluyen pAM �1 y derivados del mismo (Renault et al., Gene 183: 175-182 (1996); y O'Sullivan et al., Gene 137: 227-231(1993)); pMBB1 y pHW800, un derivado de pMBB1 (Wyckoff et al. Appl. Environ. Microbiol.
62: 1481-1486 (1996)); pMG1, un plásmido conjugativo (Tanimoto et al., J. Bacteriol. 184: 5800-5804 (2002)), pNZ9520 (Kleerebezem et al., Appl. Environ. Microbiol. 63: 4581-4584 (1997)); pAM401 (Fujimoto et al., Appl. Environ. Microbiol. 67: 1262-1267 (2001)); y pAT392 (Arthur et al., Antimicrob. Agents Chemother. 38: 1899-1903 (1994)). También se han descrito varios plásmidos de Lactobacillus plantarum (van Kranenburg et al., Appl. Environ. Microbiol. 71 (3): 1223-1230 (2005)).
Los diferentes genes para una vía biosintética del 2-butanol se pueden ensamblar en cualquier vector adecuado, tales como los descritos anteriormente. Los codones se pueden optimizar para la expresión basándose en el índice de codones deducido de las secuencias genómicas de Lactobacillus plantarum o Lactobacillus arizonensis. Los plásmidos se pueden introducir en la célula hospedadora con los procedimientos conocidos en la técnica, tales como la electroporación (Cruz-Rodz et al. Molecular Genetics and Genomics 224: 1252-154 (1990), Bringel et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 33: 664-670 (1990), Alegre et al., FEMS Microbiology Letters 241: 73-77 (2004)), y conjugación (Shrago et al., Appl. Environ. Microbiol. 52: 574-576 (1986)). Los genes de la vía biosintética del 2butanol se pueden también integrar en el cromosoma de Lactobacillus con los vectores de integración (Hols et al., Appl. Environ. Microbiol. 60: 1401-1403 (1990), Jang et al., Micro. Lett. 24: 191-195 (2003)). La vía de biosíntesis de la 2-butanona se puede expresar de igual forma, omitiendo la butanol deshidrogenasa.
Expresión de una vía biosintética del 2-butanol o de la 2-butanona en Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarium y Enterococcus faecalis
El género Enterococcus pertenece a la familia Lactobacillales y se pueden utilizar para Enterococcus muchos plásmidos y vectores utilizados para la transformación de Lactobacillus, Bacillus subtilis y Streptococcus que se describen más arriba. También se pueden utilizar los vectores de expresión para E. faecalis que utilizan el gen nisA de Lactococcus (Eichenbaum et al., Appl. Environ. Microbiol. 64: 2763-2769 (1998). Adicionalmente, se pueden utilizar vectores para el reemplazo génico en el cromosoma de E. faecium (Nallaapareddy et al., Appl. Environ. Microbiol. 72:334-345 (2006)).
Los diferentes genes para una vía biosintética del 2-butanol se pueden agrupar en cualquier vector adecuado, tal como los descritos anteriormente. Los codones se pueden optimizar para la expresión basándose en el índice de codones deducido de las secuencias genómicas de Enterococcus faecalis o Enterococcus faecium. Los plásmidos se pueden introducir en la célula hospedadora con los procedimientos conocidos en la técnica, tales como electroporación, como describen Cruz-Rodz et al. (Molecular Genetics and Genomics 224: 1252-154 (1990)) o conjugación, como describen Tanimoto et al. (J. Bacteriol. 184: 5800-5804 (2002) y Grohamann et al. (Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67: 277-301 (2003)). La vía de la biosíntesis de la 2-butanona puede expresarse de igual forma, omitiendo la butanol deshidrogenasa.
Expresión de una vía biosintética del 2-butanol o de la 2-butanona en Pediococcus pentosaceus y Pediococcus acidilactici
El género Pediococcus pertenece a la familia Lactobacillales y se pueden utilizar en Pediococcus muchos plásmidos y vectores utilizados para la transformación de Bacillus subtilis y Streptococcus que se describen más arriba. Un ejemplo no limitante de un vector adecuado es pHPS9 (Bukhtiyarova et al. Appl. Environ. Microbiol. 60: 3405-3408 (1994). Se han descrito también varios plásmidos de Pediococcus (Alegre et al., FEMS Microbiol. Lett. 250: 151-156 (2005); Shareck et al., Crit. Rev. Biotechnol. 24: 155-208 (2004)).
Los genes para una vía biosintética del 2-butanol se pueden ensamblar en cualquier vector adecuado, tal como los descritos anteriormente. Los codones se pueden optimizar para la expresión basándose en el índice de codones deducido de las secuencias genómicas de Pediococcus pentosaceus. Los plásmidos se pueden introducir en la célula hospedadora con los procedimientos conocidos en la técnica, tales como electroporación (véase, por ejemplo, Osmanagaoglu et al., J. Basic Microbiol. 40: 233-241 (2000); Alegre et al., FEMS Microbiol. Lett. 250: 151-156 (2005)) y conjugación (Gonzalez y Kunka, Appl. Environ. Microbiol. 46: 81-89 (1983)). Los genes de la vía biosintética del 2-butanol también se pueden integrar en el cromosoma de Pediococcus mediante los vectores de integración (Davidson et al. Antonie van Leeuwenhoek 70: 161-183 (1996)). La vía de biosíntesis de la 2-butanona se puede expresar de igual forma, omitiendo la butanol deshidrogenasa.
Medios de fermentación
Los medios de fermentación de la presente invención deben contener sustratos de carbono adecuados. Los sustratos adecuados pueden incluir, pero sin limitarse a ellos, monosacáridos tales como la glucosa y la fructosa, oligosacáridos tales como la lactosa o la sacarosa, polisacáridos tales como el almidón o la celulosa, o mezclas de los mismos, y mezclas sin purificar de materias primas renovables tales como exudado del suero de queso, licor de maíz fermentado, melaza de remolacha de azúcar y malta de cebada. Adicionalmente, el sustrato carbonado puede ser también sustrato de un carbono, tales como dióxido de carbono, o metanol, el cual se ha demostrado que se convierte metabólicamente en moléculas bioquímicas intermedias clave. Además de los sustratos de uno y dos carbonos, también se sabe que los organismos metilótrofos utilizan una serie de compuestos diferentes que contienen carbono, tales como metilamina, glucosamina y una gama de aminoácidos para la actividad metabólica. Por ejemplo, se sabe que las levaduras metilótrofas utilizan el carbono de la metilamina para formar trehalosa o glicerol (Bellion et al., Microb. Growth C1 Compd., [Int. Symp], 7.ª (1993), 415-32, Editor(es): Murrell, J. Collin; Kelly, Don P. Publisher: Intercept, Andover, GB). De igual forma, distintas especies de Candida metabolizarán la alanina o el ácido oleico (Sulter et al., Arch. Microbiol. 153: 485-489 (1990)). Por lo tanto, se contempla que la fuente de carbono utilizada en la presente invención pueda abarcar una amplia gama de sustratos que contienen carbono y sólo estará limitada por la elección del organismo.
Aunque se contempla que todos los sustratos de carbono mencionados anteriormente y las mezclas de los mismos son adecuados en la presente invención, los sustratos de carbono preferidos son glucosa, fructosa y sacarosa, así como las mezclas de alguno de estos azúcares. La sacarosa se puede obtener de materias primas tales como la caña de azúcar, remolachas azucareras, yuca y sorgo dulce. La glucosa y la dextrosa se pueden obtener a través de la sacarificación de materias primas que contienen almidón, entre ellas cereales tales como maíz, trigo, centeno, cebada y avena.
Además, los azúcares fermentables se pueden obtener de biomasa celulósica y lignocelulósica a través de procedimientos de pretratamiento y sacarificación, como se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente de los EE.UU. en tramitación con la presente y en cotitularidad US20070031918A1. Biomasa se refiere a cualquier material celulósico y lignocelulósico e incluye materiales que comprenden celulosa, y opcionalmente comprende además hemicelulosa, lignina, almidón, oligosacáridos y/o monosacáridos. La biomasa también puede comprender otros componentes, tales como proteínas y/o lípidos. La biomasa puede proceder de una única fuente, o la biomasa puede comprender una mezcla procedente de más de una fuente; por ejemplo, la biomasa podría comprender una mezcla de mazorcas de maíz y sobrantes del maíz, o una mezcla de pasto y hojas. La biomasa incluye, pero no se limita a ellos, cultivos para bioenergía, residuos agrícolas, residuos sólidos municipales, residuos sólidos industriales, lodos de la fabricación del papel, residuo de corrales, residuo de madera y de bosques. Ejemplos de biomasa incluyen, pero sin limitarse a ellos, grano de maíz, mazorcas de maíz, residuos de cultivos tales como cáscara del maíz, sobrantes del maíz, pasto, trigo, paja de trigo, cebada, paja de cebada, heno, paja de arroz, mijo perenne, papel usado, bagazo de caña de azúcar, sorgo, soja, componentes obtenidos de la molienda de cereales, árboles, ramas, raíces, hojas, virutas, serrín, arbustos y matas, hortalizas, frutos, flores y abono animal.
Además de una fuente de carbono adecuada, los medios de fermentación deben contener los adecuados minerales, sales, cofactores, tamponantes y otros componentes, conocidos por los expertos en la técnica, adecuados para el crecimiento de los cultivos y la promoción de una vía enzimática necesaria para la producción de 2-butanol y de 2butanona.
Condiciones del cultivo
Típicamente, las células se hacen crecer a una temperatura en el margen de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 40 °C en un medio adecuado. Los medios de crecimiento idóneos en la presente invención son los medios habituales preparados de forma comercial, tales como medio de Luria Bertani (LB), medio con dextrosa de Sabouraud (SD, por su nombre en inglés) o medio de cultivo de levadura (YM, por su nombre en inglés). También se pueden utilizar otros medios de crecimiento sintéticos o definidos, y el medio adecuado para el crecimiento del microorganismo concreto lo conocerá el experto en la técnica de microbiología o de la ciencia de la fermentación. El uso de agentes que se sabe que modulan directa o indirectamente la represión catabólica, p. ej., 2':3'-monosfosfato cíclico de adenosina, también se puede incorporar en el medio de fermentación.
Los márgenes de pH idóneos para la fermentación están entre pH 5,0 y pH 9,0, en donde se prefiere que la condición inicial sea de pH 6,0 a pH 8,0.
Las fermentaciones se pueden realizar en condiciones aerobias o anaerobias, en donde se prefieren las condiciones anaerobias o microaerobias.
Fermentaciones industriales continua y discontinua
El procedimiento presente emplea un procedimiento de fermentación discontinua. Una fermentación discontinua clásica es un sistema cerrado en donde se pone la composición del medio al comienzo de la fermentación y no está sujeta a las alteraciones artificiales durante la fermentación. Así pues, al comienzo de la fermentación, se inocula el medio con el organismo u organismos deseados, y se permite que se produzca la fermentación sin añadir nada al sistema. Típicamente, sin embargo, una fermentación «discontinua» es discontinua respecto a la adición de la fuente de carbono y a menudo se intentan controlar factores tales como el pH y la concentración de oxígeno. En los sistemas discontinuos, el metabolito y las composiciones de la biomasa del sistema cambian constantemente hasta el momento en que se detiene la fermentación. Dentro de los cultivos por lotes, las células se atemperan desde una fase latente estática a una fase de crecimiento logarítmico rápido y finalmente a una fase estacionaria en donde se disminuye o se detiene la velocidad de crecimiento. Si no se tratan, las células en la fase estacionaria morirán finalmente. Las células en la fase logarítmica son generalmente responsables del volumen de producción del producto final o intermedio.
Una variación de sistema discontinuo estándar es el sistema discontinuo alimentado. Los procedimientos de fermentación discontinua alimentada también son adecuados en la presente invención y comprenden un sistema discontinuo típico con la excepción de que el sustrato se añade en incrementos a medida que avanza la fermentación. Los sistemas discontinuos alimentados son útiles cuando la represión catabólica es apta para inhibir el metabolismo de las células y cuando es deseable tener cantidades limitadas del sustrato en los medios. La medición de la concentración del sustrato real en los sistemas discontinuos alimentados es difícil y, por supuesto, se estima sobre la base de los cambios de factores medibles, tales como el pH, el oxígeno disuelto y la presión parcial de gases de desecho, tales como el CO2. Las fermentaciones discontinuas y discontinuas alimentadas son habituales y se conocen bien en la técnica, y se pueden encontrar ejemplos en Thomas D. Brock en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, segunda edición (1989), Sinauer Associates, Inc, Sunderland, MA., o Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36: 227, (1992).
Aunque la presente invención se realiza en modo discontinuo, se contempla que el procedimiento sería adaptable a los procedimientos de fermentación continua. La fermentación continua es un sistema abierto en donde a un biorreactor se le añade continuamente un medio de fermentación definido y una cantidad igual del medio acondicionado se retira simultáneamente para el procedimiento. La fermentación continua generalmente mantiene los cultivos a una densidad elevada y constante.
La fermentación continua permite la modulación de un factor o una serie de factores que afectan al crecimiento celular o a la concentración del producto final. Por ejemplo, un procedimiento mantendrá un nutriente limitante, tal como la fuente de carbono o la cantidad de nitrógeno, a una velocidad fija y permitirá moderar todos los otros parámetros. En otros sistemas, se pueden alterar continuamente una serie de factores que afectan al crecimiento, mientras que se mantiene constante la concentración celular, medida mediante la turbidez del medio de cultivo. Los sistemas continuos se esfuerzan por mantener las condiciones de crecimiento en estado de equilibrio y así la pérdida celular debida al medio que se extrae debe equilibrarse gracias a la velocidad de crecimiento celular en la fermentación. Los procedimientos para modular los nutrientes y los factores de crecimiento para los procedimientos de fermentación continua, así como las técnicas que aumentan al máximo la velocidad de la formación del producto, se conocen bien en la técnica de la microbiología industrial y se detallan una gran cantidad de procedimientos en Brock, véase más arriba.
Se contempla que la presente invención se puede poner en práctica con cualquier procedimiento discontinuo,
discontinuo alimentado o continuo, y que sería adecuado cualquier modo de fermentación conocido. Adicionalmente se contempla que las células se pueden inmovilizar en un sustrato como catalizadores de células enteras y que se pueden someter a las condiciones de fermentación para la producción de 2-butanol o de 2-butanona.
Procedimientos para el aislamiento del 2-butanol y de la 2-butanona desde el medio de fermentación
5 El 2-butanol bioproducido se puede aislar del medio de fermentación mediante los procedimientos conocidos en la técnica para las fermentaciones ABE (véase, por ejemplo, Durre, Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 639-648 (1998), Groot et al., Process Biochem. 27: 61-75 (1992) y las referencias en ellas). Por ejemplo, los sólidos se pueden eliminar del medio de fermentación mediante centrifugación, filtración, decantación o similares. A continuación, se puede aislar el 2-butanol del medio de fermentación mediante procedimientos tales como la destilación, destilación
10 azeotrópica, extracción de líquido-líquido, absorción, extracción de gas, evaporación a través de membrana o pervaporación. Estos mismos procedimientos se pueden adaptar para aislar la 2-butanona bioproducida del medio de fermentación.
Ejemplos
La presente invención se define adicionalmente en los siguientes ejemplos. Se debe entender que estos ejemplos,
15 aunque indiquen una realización preferida de la invención, sólo se ofrecen a modo de ilustración. A partir de la explicación anterior y de estos ejemplos, el experto en la técnica puede averiguar las características esenciales de esta invención y, sin alejarse del espíritu y alcance de la misma, puede realizar distintos cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a diferentes usos y condiciones.
Procedimientos generales
20 Las técnicas estándares de ADN recombinante y de clonación molecular descritas en los ejemplos se conocen bien en la técnica y están descritas en Sambrook J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY, (1989) (Maniatis) y por T. J. Silhavy, M. L. Bennah y
L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
(1984) y por Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc. y 25 Wiley-Interscience (1987).
Los materiales y procedimientos adecuados para el mantenimiento y crecimiento de los cultivos bacterianos se conocen bien en la técnica. Las técnicas adecuadas para el uso en los siguientes ejemplos se pueden encontrar tal se expone en Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg y G. Briggs Phillips, eds.), American Society for Microbiology, 30 Washington, DC (1994)) o por Thomas D. Brock en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, segunda edición, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989). Todos los reactivos, enzimas de restricción y materiales descritos para el crecimiento y mantenimiento de las células bacterianas se adquirieron a Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI), BD Diagnostic Systems (Sparks, MD), Life Technologies (Rockville, MD) o Sigma Chemical Company (St Louis, MO), a menos que se especifique de otra manera. Las cepas bacterianas se obtuvieron de la
35 American Type Culture Collection (ATCC, por su nombre en inglés, Manassas, VA), a menos que se especifique de otra manera. Los cebadores oligonucleotídicos descritos en los siguientes ejemplos se ofrecen en la tabla 4. Todos los cebadores oligonucleotídicos fueron sintetizados por Sigma-Genosys (Woodlands, TX).
Tabla 4
Cebadores de clonación y escrutinio
Gene
Nombre del cebador Secuencia SEQ ID n.º Descripción
budB
B1 15 budB directo
budB
B2 16 budB inverso
budA
B3 17 budA directo
budA
B4 18 budA inverso
Cebadores de clonación y escrutinio
Gene
Nombre del cebador Secuencia SEQ ID n.º Descripción
budC
B5 19 budC directo
budC
B6 20 budC inverso
pddA
B7 21 pddABC directo
pddC
B8 22 pddABC inverso
sadh
B9 23 sadh directo
sadh
B10 24 sadh inverso
budA
B11 25 budABC directo
budC
B12 26 budABC inverso
pddA
B13 27 pddABC directo
pddC
B14 28 pddABC inverso
sadh
B15 29 sadh directo
sadh
B16 30 sadh inverso
–
BenF 31
–
BenBPR 32 –
budAB
BABC F 33 budAB directo
budAB
BAB R 34 budAB inverso
Cebadores de clonación y escrutinio
Gene
Nombre del cebador Secuencia SEQ ID n.º Descripción
budC
BC Spe F 40 budC directo
budC
BC Xba R 41 budC inverso
pddABCddrAB
DDo For 44 pddABC-ddrAB directo
pddABCddrAB
DDo Rev 45 pddABC-ddrAB inverso
chnA
ChnA F 54 chnA directo
chnA
ChnA R 55 chnA inverso
–
Top ter F1 58 Directo
–
Top ter F2 59 Directo
–
Bot ter R1 60 inverso
–
Bot ter R2 61 inverso
KA-AT
OT872 127 Operón de amino alcohol cinasa/liasa directo
KA-AT
OT873 128 Operón de amino alcohol cinasa/liasa inverso
KA
OT879 129 Aminoalcohol cinasa inverso
AT
OT880 130 Aminoalcohol liasa directo
Cebadores de clonación y escrutinio
Gene
Nombre del cebador Secuencia SEQ ID n.º Descripción
pBAD.HisB
OT909 131 Añade el sitio EcoRI para reemplazar el sitio Ncol
pBAD.HisB
OT910 132 Añade el sitio EcoRI para reemplazar el sitio Ncol
BudAB
N84seqR3 159 inverso
APT
APTfor 162 APT directo
APT
APTrev 163 APT inverso
Tabla 5
Cebadores para secuenciación
Nombre
Secuencia Específico del gen SEQ ID n.º
M13 directo
– 35
M13 inverso
– 36
N83 SeqF2
– 37
N83 SeqF3
-- 38
N84 Seq R2
– 65
N84 SeqR4
– 39
Trc F
Todos 42
Trc R
Todos 43
DDko seq F2
pddABC-ddrAB 46
DDko seq F5
pddABC-ddrAB 47
DDko seq F7
pddABC-ddrAB 48
DDko seq F9
pddABC-ddrAB 49
DDko seq R1
pddABC-ddrAB 50
DDko seq R3
pddABC-ddrAB 51
DDko seq R7
pddABC-ddrAB 52
DDko seq R10
pddABC-ddrAB 53
Cebadores para secuenciación
Nombre
Secuencia Específico del gen SEQ ID n.º
chnSeq F1
chnA 56
chnSeq R1
chnA 57
pCL 1925 vec F
Todos 62
pCL 1925 vec R1
Todos 63
pCL 1925 vec R2
Todos 64
APTseqRev
APT 160
APTseqFor
APT 161
Procedimientos para determinar la concentración de 2-butanol y 2-butanona en los medios de cultivo
La concentración de 2-butanol y 2-butanona en los medios de cultivo se puede determinar mediante una serie de procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en un procedimiento de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) específica se utilizó una columna Shodex SH-1011 con una columna de guarda Shodex SH-G, 5 ambas compradas a Waters Corporation (Milford, MA), con detección del índice de refracción (IR). La separación cromatográfica se consiguió con una fase móvil de H2SO4 a 0,01 M a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min y una temperatura de columna de 50 °C. En las condiciones utilizadas, la 2-butanona y el 2-butanol tienen un tiempo de retención de 39,5 y 44,3 min, respectivamente. Alternativamente, se dispone de procedimientos de cromatografía de gases (CG). Por ejemplo, un procedimiento de CG específico utilizó una columna HP-INNOWax (30 m x 0,53 mm 10 [diámetro interno], grosor de la película de 1 μm, Agilent Technologies, Wilmington, DE) con un detector de ionización de llama (DIL). El gas portador era helio a una velocidad de flujo de 4,5 ml/min, medido a 150 °C con una presión de cabeza constante; la división de flujo del inyector era 1:25 a 200 °C; la temperatura del horno era de 45 °C durante 1 min, de 45 a 220 °C a 10 °C/min, y de 220 °C durante 5 min; y se empleó la detección con DIL a 240 °C con un gas de reposición de helio a 26 ml/min. El tiempo de retención de la 2-butanona y del 2-butanol fue de 3,61 y
15 5,03 min, respectivamente.
La 2-butanona también puede detectarse mediante modificación con hidrazona de 3-metil-2-benzotiazolinona (MBTH, por su nombre en inglés). Una solución acuosa que contiene 2-butanona se mezcla con un volumen igual de una solución acuosa de MBTH a 6 mg/ml en glicina-HCl a 375 mM (pH 2,7) y se incubó a 100 °C durante 3 min. Las muestras resultantes modificadas con la MBTH se analizaron en una columna de 5 μm Supelosil LC-18-D5 de 25 cm
20 x 4,6 mm (diámetro interno) con una fase móvil de acetonitrilo al 55% en agua a una velocidad de flujo de 1 ml/min. El derivado de la 2-butanona aparece en dos picos (isómeros cis y trans) con un tiempo de retención de aproximadamente 12,3 y 13,3 min, y un máximo de absorbancia de 230 y 307 nm.
El significado de las abreviaturas es el siguiente: «s» significa segundo(s), «min» significa minuto(s), «h» significa hora(s), «psi» significa libras por pulgada cuadrada, «nm» significa nanómetros, «d» significa día(s), «μl» significa 25 microlitro(s), «ml» significa mililitro(s), «l» significa litro(s), «mm» significa milímetro(s), «nm» significa nanómetros, «mM» significa milimolar, «M» significa molar, «mmol» significa milimol(es), «μmol» significa micromol(es), «g» significa gramo(s), «μg» significa microgramo(s) y «ng» significa nanogramo(s), «PCR» significa reacción en cadena de la polimerasa, «DO» significa densidad óptica, «DO600» significa la densidad óptica medida a una longitud de onda de 600 nm, «kDa» significa kilodalton, «g» significa la constante de gravitación, «pb» significa par(es) de
30 bases, «kpb» significa kilopar(es) de bases, «% p/v» significa porcentaje en peso/volumen, «% v/v» significa porcentaje en volumen/volumen, «%p» significa porcentaje en peso, «HPLC» significa cromatografía líquida de alta resolución y «CG» significa cromatografía de gases. La terminología «selectividad molar» es el número de moles del producto producido por mol de sustrato glucídico consumido y se describe en forma de porcentaje.
Ejemplo 1
35 Clonación y expresión de la acetolactato sintasa
El propósito de este ejemplo fue clonar y expresar en E. coli el gen budB que codifica la enzima acetolactato sintasa. El gen budB se amplificó por PCR a partir del ADN genómico de la cepa ATCC 25955 de Klebsiella pneumoniae.
La secuencia de budB que codifica la acetolactato sintasa se amplificó por PCR a partir del ADN genómico de Klebsiella pneumoniae (ATCC 25955) con la pareja de cebadores B1 (SEQ ID n.º 15) y B2 (SEQ ID n.º 16). Otros 40 reactivos para amplificación por PCR [p. ej., ADN polimerasa Kod de alta fidelidad (Novagen Inc., Madison, WI; n.º
catálogo 71805-3)] se suministró en kits del fabricante y se utilizó de acuerdo con el protocolo de fabricante. El ADN genómico de Klebsiella pneumoniae se preparó con el kit Gentra Puregene Puregene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN; número de catálogo D-5000A). Se llevó a cabo la amplificación en un termociclador de ADN GeneAmp 9700 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). La secuencia nucleotídica del marco abierto de lectura (ORF) y la secuencia aminoacídica predicha de la enzima se ofrecen como SEQ ID n.º 3 y SEQ ID n.º 4, respectivamente.
Para los estudios de expresión se utilizó la tecnología de clonación Gateway (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). El vector de entrada pENTR/SD/D-TOPO permite la clonación direccional y proporcionó una secuencia de Shine-Dalgamo para el gen de interés. El vector de destinación pDEST14 utiliza un promotor de T7 para la expresión del gen sin ninguna etiqueta. El cebador directo incorporó cuatro bases (CACC) inmediatamente adyacentes al codón de inicio de la traducción para permitir la clonación direccional del producto de PCR de la región codificante de la acetolactato sintasa budB en el pENTR/SD/D-TOPO (Invitrogen), lo que generó el plásmido pENTRSDD-TOPObudB. La construcción pENTR se introdujo por transformación en las células de E. coli Top10 (Invitrogen) y se sembraron en placas de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los transformantes se hicieron crecer durante una noche y el ADN plasmídico se preparó con el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, Valencia, CA; número de catálogo 27106) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Para crear un clon de expresión, la región codificante de budB de pENTRSDD-TOPObudB se transfirió al vector pDEST14 mediante recombinación in vitro con la mezcla LR Clonase (Invitrogen, Corp., Carlsbad, CA). El vector resultante, pDEST14budB, se introdujo por transformación en las células BL-21-AI (Invitrogen Corp.). Las células BL-21-AI llevan una copia cromosómica de la ARN polimerasa de T7 controlada por el promotor araBAD inducible por arabinosa.
Los transformantes se inocularon en medio LB complementado con 50 μg/ml de ampicilina y se hicieron crecer durante una noche. Se utilizó una alícuota del cultivo de una noche para inocular 50 ml del medio LB complementado con 50 μg/ml de ampicilina. El cultivo se incuba a 37 °C con agitación hasta que la DO600 alcanza 0,6-0,8. El cultivo se divide en dos porciones de 25 ml y se añade arabinosa a uno de los matraces a una concentración final del 0,2% p/v. El matraz de control negativo no se induce con arabinosa. Los matraces se incuban durante 4 h a 37 °C con agitación. Las células se recogen por centrifugación y los sedimentos celulares se resuspenden en el tampón MOPS a 50 mM, pH 7,0. Las células se rompen por sonicación o bien haciéndolas pasar por una celda de prensa French. Cada lisado celular se centrifuga para producir el sobrenadante y el sedimento, o la fracción insoluble. Una alícuota de cada fracción (el lisado completo de las células, de células inducidas y de control, se resuspende en tampón de carga con SDS (MES) (Invitrogen), se calienta a 85 °C durante 10 min y se somete a análisis de SDS-PAGE (NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel, número de catálogo NP0322Box, Invitrogen). En el cultivo inducido está presente una proteína con la masa molecular esperada, tal y como se deduce de la secuencia del ácido nucleico, pero no en el control sin inducir.
La actividad de la acetolactato sintasa en los extractos sin células se mide con el procedimiento descrito por Bauerle et al. (Bauerle et al. (1964) Biochim. Biophys. Acta. 92: 142-149). La concentración de proteínas se mide bien mediante el procedimiento de Bradford o bien mediante el kit Bicinchoninic (Sigma, n.º de catálogo BCA-1, St. Louis, MO) en el que se utiliza la seroalbúmina bovina (SAB) (BioRad, Hercules, CA) como estándar.
Ejemplo 2
Clonación y expresión de la acetolactato descarboxilasa
El propósito de este ejemplo fue clonar y expresar en E. coli el gen budA que codifica la enzima acetolactato descarboxilasa. El gen budA se amplificó por PCR del ADN genómico de la cepa ATCC 25955 de Klebsiella pneumoniae.
La secuencia de budA que codifica la acetolactato descarboxilasa se clonó del mismo modo que se describe para budB en el ejemplo 1, salvo que los cebadores utilizados para la amplificación por PCR fueron B3 (SEQ ID n.º 17) y B4 (SEQ ID n.º 18). La secuencia nucleotídica del marco abierto de lectura (ORF) y la secuencia aminoacídica predicha para la enzima se presentan como SEQ ID n.º 1 y SEQ ID n.º 2, respectivamente. El plásmido resultante se denominó pENTRSDD-TOPObudA.
La actividad de la acetolactato descarboxilasa en los extractos sin células se mide con el procedimiento descrito por Bauerle et al., véase más arriba.
Ejemplo 3 (predictivo)
Clonación y expresión de la butanodiol deshidrogenasa
El propósito del ejemplo predictivo es describir cómo se clona y se expresa en E. coli el gen budC que codifica la enzima butanodiol deshidrogenasa. El gen budC se amplifica por PCR a partir del ADN genómico de la cepa IAM 1063 de Klebsiella pneumoniae.
La secuencia de budC que codifica la butanodiol deshidrogenasa se clona y se expresa de la misma manera que se describe para budA en el ejemplo 1, salvo que los cebadores utilizados para la amplificación por PCR son B5 (SEQ
ID n.º 19) y B6 (SEQ ID n.º 20), y el ADN genómico de molde es de Klebsiella pneumoniae IAM1063 (que se obtuvo del Institute of Applied Microbiology Culture Collection, Tokio, Japón). El ADN genómico de Klebsiella pneumoniae IAM1063 se prepara con el kit Gentra Puregene Puregene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN; número de catálogo D-5000A). La secuencia nucleotídica del marco abierto de lectura (ORF) y la secuencia aminoacídica predicha de la enzima se ofrecen como SEQ ID n.º 5 y SEQ ID n.º 6, respectivamente.
La actividad de la butanodiol deshidrogenasa en los extractos sin células se mide espectrofotométricamente mediante el consumo de NADH a una absorbancia de 340 nm.
Ejemplo 4 (predictivo)
Clonación y expresión de la butanodiol deshidratasa
El propósito de este ejemplo predictivo es describir cómo se clonan y se expresan en E. coli los genes pddA, ppdB y pddC que codifican la butanodiol deshidratasa. Los genes pddA, pddB y pddC se amplifican por PCR a partir del ADN genómico de Klebsiella oxytoca ATCC 8724.
Las secuencias de pddA, pddB y pddC que codifican la butanodiol deshidratasa se clonan y se expresan de la misma manera que se describió para budA en el ejemplo 1, salvo que el ADN genómico de molde es de Klebsiella oxytoca ATCC 8724, y que los cebadores son B7 (SEQ ID n.º 21) y B8 (SEQ ID n.º 22). El ADN genómico de Klebsiella oxytoca se prepara con el kit Gentra Puregene Puregene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis; número de catálogo D-5000A). Se clona un único producto de PCR que incluye los tres marcos abiertos de lectura (ORF), por lo que las tres regiones codificantes se expresan como un operón desde un único promotor en el plásmido de expresión. Las secuencias nucleotídicas de los marcos abiertos de lectura de las tres subunidades se ofrecen como SEQ ID n.º 7, 9 y 11, respectivamente, y las secuencias aminoacídicas predichas de las tres subunidades de la enzima se ofrecen como SEQ ID n.º 8, 10 y 12, respectivamente.
La actividad de la butanodiol deshidratasa en los extractos sin células se mide por la modificación del producto cetónico con la 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH). Brevemente, se pararon 100 μl de la mezcla de reacción, extracto celular que contiene aproximadamente 0,0005 unidades de enzima, 40 mM de tampón de fosfato de potasio (pH 8,0), 2 μg de adenosilcolabalamina, 5 μg de 2,3-butanodiol y 1 μg de seroalbúmina bovina, mediante la adición de un volumen igual de DNPH al 0,05 % en peso en HCl a 1,0 N. Tras 15 min a temperatura ambiente, se revela el color con la adición de 100 μl de NaOH a 4 N. La cantidad del producto se determina a partir de la absorbancia de la solución final a 550 nm en comparación con una curva estándar preparada con 2-butanona. Todas las reacciones se llevan a cabo a 37 °C con luz roja tenue.
Ejemplo 5 (predictivo)
Clonación y expresión de la butanol deshidrogenasa
El propósito de este ejemplo predictivo es describir cómo se clona y se expresa en E. coli el gen sadh que codifica la butanol deshidrogenasa. El gen sadh se amplifica por PCR a partir del ADN genómico de la cepa 219 de Rhodococcus ruber.
La secuencia de sadh que codifica la butanol deshidrogenasa se clona y expresa de la misma manera que se describe para budA en el ejemplo 1, salvo que el ADN genómico de molde es de la cepa 219 de Rhodococcus ruber (Meens, Institut fuer Mikrobiologie, Universidad de Hannover, Hannover, Alemania) y los cebadores son B9 (SEQ ID n.º 23) y B10 (SEQ ID n.º 24). El ADN genómico de Rhodococcus ruber se prepara con el kit de aislamiento de ADN microbiano Ultra CleanTM (MO BIO Laboratories Inc., Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La secuencia nucleotídica del marco abierto de lectura (ORF) y la secuencia aminoacídica predicha de la enzima se ofrecen como SEQ ID n.º 13 y SEQ ID n.º 14, respectivamente.
La actividad de la butanol deshidrogenasa en los extractos sin células se mide siguiendo el incremento de la absorbancia a 340 nm que se produce por la conversión del NAD en NADH cuando la enzima se incuba con NAD y 2-butanol.
Ejemplo 6 (predictivo)
Construcción de un vector de transformación para los genes de una vía biosintética de 2-butanol
El propósito de este ejemplo predictivo es describir la preparación de un vector de transformación para los genes de una vía biosintética de 2-butanol (a saber, la vía 3 que se describe más arriba). Al igual que la mayoría de organismos, E. coli convierte inicialmente la glucosa en ácido pirúvico. Las enzimas necesarias para convertir el ácido pirúvico en 2-butanol siguiendo la vía 3, a saber, acetolactato sintasa, acetolactato descarboxilasa, butanodiol deshidrogenasa, butanodiol deshidratasa y butanodiol deshidrogenasa, están codificadas por los genes budA, budB, budC, pddA, pddB, pddC y sadh. Para simplificar la construcción de la vía biosintética del 2-butanol en un organismo recombinante, los genes que codifican las 5 etapas en la vía se dividen en dos operones. La vía superior comprende las primeras tres etapas catalizadas por la acetolactato sintasa, la acetolactato descarboxilasa y la butanodiol
deshidrogenasa. La vía inferior comprende las últimas dos etapas catalizadas por la butanodiol deshidratasa y la butanol deshidrogenasa.
Las secuencias codificantes se amplifican por PCR con cebadores que incorporan los sitios de restricción para la clonación posterior, y los cebadores directos contienen un sitio de fijación del ribosoma de E. coli optimizado (AAAGGAGG). Los productos de la PCR se clonan con TOPO en el vector pCR4Blunt-TOPO y se introducen por transformación en las células Top10 (Invitrogen). El ADN plasmídico se prepara de los clones TOPO, y se verifica la secuencia del fragmento de PCR clonado. Las enzimas de restricción y la ADN ligasa de T4 (New England Biolabs, Beverly, MA) se utilizan de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Para los experimentos de clonación, los fragmentos de restricción se purifican en gel con el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen).
Tras la confirmación de la secuencia, las regiones codificantes se subclonan en un vector pUC19 modificado como plataforma de clonación. El vector pUC19 se modifica mediante una digestión con HindIII y SapI, y luego se trata con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa para llenar los extremos. El fragmento de vector de 2,4 kb se purifica en gel y se religa para crear el pUC19dHS. Alternativamente, el vector pUC19 se modifica mediante una digestión con Sphl y SapI, y luego se trata con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa para hacer romos los extremos. El fragmento de vector de 2,4 kb se purifica en gel y se religa para crear el pUC19dSS. Las digestiones retiran el promotor lac adyacente al MCS (sitio de clonación múltiple), lo que evita que se transcriban los operones desde el vector.
Vía superior:
Las regiones codificantes de budABC se amplifican por PCR del ADN genómico de Klebsiella pneumoniae con la pareja de cebadores B11 y B12 (tabla 4), presentadas como SEQ ID n.º 25 y 26, respectivamente. El cebador directo incorpora un sitio de restricción EcoRI y un sitio de fijación del ribosoma (RBS, por su nombre en inglés). El cebador inverso incorpora un sitio de restricción Sphl. El producto de PCR se clona en el pCR4 Blunt-TOPO, lo que crea el pCR4 Blunt-TOPO-budABC.
Para construir el operón de la vía superior, el pCR4 Blunt-TOPO-budABC se digiere con EcoRI y SphI para liberar un fragmento de budABC de 3,2 kpb. El vector pUC19dSS también se digiere con EcoRI y SphI, lo que libera un fragmento de vector de 2,0 kbp. El fragmento de bucMBC y el fragmento del vector se ligan juntos con la ADN ligasa de T4 (New England Biolabs) para formar el pUC19dSS-budABC.
Vía inferior:
Las regiones codificantes de pddABC se amplifican por PCR a partir del ADN genómico de Klebsiella oxytoca ATCC 8724 con los cebadores B13 y B14 (tabla 4), presentados como SEQ ID n.º 27 y 28, respectivamente, lo que crea un producto de 2,9 kpb. El cebador directo incorpora los sitios de restricción de EcoRI y PmeI y un RBS. El cebador inverso incorpora el sitio de restricción de BamHI. El producto de PCR se clona en el pCRBlunt II-TOPO para crear el pCRBluntII-pdd.
El gen sadh se amplifica por PCR del ADN genómico de la cepa 219 de Rhodococcus ruber con los cebadores B15 y B16 (tabla 4), presentados como SEQ ID n.º 29 y 30, respectivamente, con lo que se crea un producto de 1,0 kpb. El cebador directo incorpora un sitio de restricción de BamHI y un RBS. El cebador inverso incorpora un sitio de restricción de XbaI. El producto de la PCR se clona en el pCRBlunt II-TOPO para crear el pCRBluntII-sadh.
Para construir el operón de la vía inferior, se ponen a ligar juntos un fragmento de EcoRI y BamHI de 2,9 kpb de pCRBluntII-pdd, un fragmento de BamHI y XbaI de 1,0 kpb de pCRBluntII-sadh, y el fragmento grande de una digestión de EcoRI y XbaI de pUC19dHS. La ligación tripartita crea el pUC19dHS-pdd-sadh.
El vector pUC19dSS-budABC se digiere con PmeI y HindIII, lo que libera un fragmento de 3,2 kpb que se clona en pBenBP, un vector lanzadera de E.coli-B. subtilis. El plásmido pBenBP se crea por la modificación del vector pBE93, que describe Nagarajan (patente internacional WO 93/2463, ejemplo 4). Para generar el pBenBP, la secuencia señal del promotor de la proteasa neutra (NPR) de Bacillus amyloliquefaciens y el gen phoA se retiran de pBE93 con una digestión con NcoI y HindIII. El promotor de NPR se amplifica por PCR a partir de pBE93 mediante los cebadores BenF y BenBPR, presentados en las SEQ ID n.º 31 y 32, respectivamente. El cebador BenBPR incorpora los sitios de BstEII, PmeI y HindIII detrás del promotor. El producto de la PCR se digiere con NcoI y HindIII, y el fragmento se clona en los sitios correspondientes en el vector pBE93 para crear pBenBP. El fragmento superior del operón se subclona en los sitios de PmeI y HindIII de pBenBP para crear el pBen-budABC.
El vector pUC19dHS-pdd-sadh se digiere con PmeI y HindIII para liberar un fragmento de 3,9 kpb que se clona entre los sitios PmeI y HindIII de pBenBP, para crear el pBen-pdd-sadh.
Ejemplo 7 (predictivo)
Expresión en E. coli de una vía biosintética del 2-butanol
El propósito de este ejemplo predictivo es describir cómo expresar en E. coli una vía biosintética del 2-butanol.
Los plásmidos pBen-budABC y pBen-pdd-sadh, preparados como se describe en el ejemplo 6, se transforman por separado en E. coli NM522 (ATCC n.º 47000), y la expresión de los genes de cada operón se supervisa mediante análisis por SDS-PAGE y ensayo enzimático. Tras confirmar la expresión de todos los genes, pBen-budABC se digiere con EcoRI y HindIII para liberar el fragmento del promotor de NPR-budABC. Se hacen romos los extremos del fragmento con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa (New England Biolabs, número de catálogo M0210S). El plásmido pBen-pdd-sadh se digiere con EcoRI y se le hacen romos los extremos de igual forma para crear un fragmento linealizado de vector con los extremos romos. Los fragmentos de vector y de NPR-budABC se ligan para crear el p2BOH. Este plásmido se introduce por transformación en E. coli NM522 para dar E. coli NM522/p2BOH, y la expresión de los genes se supervisa como se describe más arriba.
E. coli NM522/p2BOH se inocula en un matraz para agitación de 250 ml que contiene 50 ml de medio y se agita a 250 rpm y 35 °C. El medio se compone de: dextrosa, 5 g/l; MOPS, 0,05 M; sulfato de amonio, 0,01 M; fosfato de potasio, monobásico, 0,005 M; mezcla de metales S10, 1% (v/v); extracto de levadura, 0,1% (p/v); casaminoácidos, 0,1% (p/v); tiamina, 0,1 mg/l; prolina, 0,05 mg/l; y biotina, 0,002 mg/l, y se titula a pH 7,0 con KOH. La mezcla de metales S10 contiene: MgCl2, 200 mM; CaCl2, 70 mM; MnCl2, 5 mM; FeCl3, 0,1 mM; ZnCl2, 0,1 mM; hidrocloruro de tiamina, 0,2 mM; CuSO4, 172 μM; CoCl2, 253 μM; y Na2MoO4, 242 μM. Después de 18 h, se detecta el 2-butanol mediante HPLC o análisis de CG con los procedimientos que se conocen bien en la técnica, por ejemplo, como los descritos en el apartado Procedimientos generales más arriba.
Ejemplo 8 (predictivo)
Expresión de una vía biosintética del 2-butanol en Bacillus subtilis
El propósito de este ejemplo predictivo es describir cómo se expresa una vía biosintética del 2-butanol en Bacillus subtilis.
Los plásmidos pBen-budABC y pBen-pdd-sadh, preparados como se describe en el ejemplo 6, se transforman por separado en Bacillus subtilis BE1010 (J. Bacteriol. 173: 2278-2282 (1991)) y se supervisa la expresión de los genes en cada operón como se describe en el ejemplo 7. El plásmido pBen-budABC se digiere con EcoRI y HindIII para liberar el fragmento promotor de NPR-budABC. Los extremos del fragmento se hacen romos con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa (New England Biolabs, n.º de catálogo M0210S). El plásmido pBen-pdd-sadh se digiere con EcoRI y de igual forma se le hacen romos los extremos para crear un fragmento de vector linealizado con los extremos romos. Se ligan el vector y los fragmentos NPR-budABC para crear el p2BOH. Este plásmido se introduce por transformación en Bacillus subtilis BE1010 para dar Bacillus subtilis BE1010/p2BOH, y la expresión de los genes se supervisa como se describe más arriba.
Bacillus subtilis BE1010/p2BOH se inocula en un matraz para agitación de 250 ml que contiene 50 ml del medio y se agita a 250 rpm y 35 °C durante 18 h. El medio se compone de: dextrosa, 5 g/l; MOPS, 0,05 M; ácido glutámico, 0,02 M; sulfato de amonio, 0,01 M; fosfato de potasio, tampón monobásico, 0,005 M; mezcla de metales S10 (como se describe en el ejemplo 7), 1% (v/v); extracto de levadura, 0,1% (v/v); casaminoácidos, 0,1% (p/v); triptófano, 50 mg/l; metionina, 50 mg/l; y lisina, 50 mg/l, y se titula a pH 7,0 con KOH. Después de 18 h, se detecta el 2-butanol mediante HPLC o análisis de CG con los procedimientos que se conocen bien en la técnica, por ejemplo, como se describe en el apartado Procedimientos generales más arriba.
Ejemplo 9
Construcción de un vector de transformación para los genes de una vía biosintética del 2-butanol
El propósito de este ejemplo fue preparar un hospedador recombinante de E. coli que lleva los genes de una vía biosintética del 2-butanol (a saber, la vía 3 como se describe anteriormente). Al igual que la mayoría de organismos,
E. coli convierte inicialmente la glucosa en ácido pirúvico. Las enzimas que se necesitan para convertir el ácido pirúvico en 2-butanona en la vía 3, a saber, acetolactato sintasa, acetolactato descarboxilasa, butanodiol deshidrogenasa y butanodiol deshidratasa, están codificadas por los genes budA, budB, budC, pddA, pddB y pddC. En la última etapa de la vía, una butanol deshidrogenasa convierte la 2-butanona en 2-butanol. Las deshidrogenasas que llevan a cabo esta última etapa son promiscuas y se pueden encontrar en muchos organismos. Para simplificar la construcción de la vía biosintética del 2-butanol en un organismo recombinante, los genes que codifican las 5 etapas de la vía se dividieron en varios operones. El operón de la vía superior comprendía las primeras tres etapas catalizadas por la acetolactato sintasa, la acetolactato descarboxilasa y la butanodiol deshidrogenasa, y se clonaron en un vector de expresión. La vía inferior comprendía las últimas dos etapas catalizadas por la butanodiol deshidratasa, e incluye el factor reactivador (Mori et al., J. Biol. Chem. 272: 32034 (1997)) y una butanol deshidrogenasa. La diol deshidratasa se puede someter a la inactivación suicida durante la catálisis. La proteína del factor reactivador codificada por ddrA y ddrB (GenBank AF017781, SEQ ID n.º 70) reactiva la enzima inactiva. Los genes ddrA y ddrB flanquean el operón de la diol deshidratasa. Los operones para el factor reactivador/deshidratasa y la butanol deshidrogenasa se clonaron en otro vector de expresión o bien el operón del factor reactivador/deshidratasa se clonó él solo en otro vector de expresión y la última etapa fue proporcionada por una actividad endógena del hospedador de la demostración.
Construcción del vector pTrc99a-budABC:
Las regiones codificantes de budAB se amplificaron por PCR a partir del ADN genómico de K. Pneumoniae ATCC 25955 con la pareja de cebadores BABC F y BAB R, presentados como SEQ ID n.º 33 y 34, respectivamente (véase la tabla 4), con lo que se crea un producto de 2,5 kpb. El cebador directo incorporó los sitios de restricción de Sacl y EcoRI y un sitio de unión al ribosoma (RBS). El cebador inverso incorporó un sitio de restricción de SpeI. El producto
5 de la PCR se clonó en pCR4 Blunt-TOPO para crear el pCR4 Blunt-TOPO-budAB. Se preparó el ADN plasmídico de los clones TOPO y la secuencia de los genes se verificó con los cebadores M13 directo (SEQ ID n.º 35), M13 inverso (SEQ ID n.º 36), N83 SeqF2 (SEQ ID n.º 37), N83 SeqF3 (SEQ ID n.º 38) y N84 SeqR4 (SEQ ID n.º 39) (véase la tabla 5).
La región codificante de budC se amplificó por PCR a partir del ADN genómico de K. pneumoniae ATCC 25955 con
10 la pareja de cebadores BC Spe F y BC Xba R dados como SEQ ID n.º 40 y 41, respectivamente, para crear un producto de 0,8 kpb. El cebador directo incorporó un sitio de restricción de SpeI, un RBS y modificó los CDS cambiando el segundo y tercer codones de AAA a AAG. El cebador inverso incorporó un sitio de restricción de XbaI. El producto de la PCR se clonó en pCR4 Blunt-TOPO para crear el pCR4 Blunt-TOPO-budC. El ADN plasmídico se preparó de los clones TOPO y la secuencia de los genes se verificó con los cebadores M13 directo (SEQ ID n.º 35) y
15 M13 inverso (SEQ ID n.º 36).
Para construir el operón budABC, se digirió el pCR4 Blunt-TOPO-budC con SnaBI y XbaI para liberar un fragmento budC de 1,0 kpb. El vector pTrc99a (Amann et al., Gene 69 (2): 301-315 (1988)) se digirió con SmaI y XbaI para crear un fragmento de vector linealizado de 4,2 kpb. El vector y el fragmento de budC se ligaron para crear el pTrc99a-budC y se introdujo por transformación en las células Top 10 de E. coli (Invitrogen). Los transformantes se 20 analizaron mediante amplificación por PCR con los cebadores Trc F (SEQ ID n.º 42) y Trc R (SEQ ID n.º 43) para encontrar un producto de 1,2 kpb que confirme la presencia del inserto de budC. Los genes budAB se subclonaron del pCR4 Blunt-TOPO-budAB como un fragmento EcoRI/SpeI de 2,5 kpb. El vector pTrc99a-budC se digirió con EcoRI y SpeI, y el fragmento de vector resultante de 5,0 kpb se purificó en gel. El vector purificado y el inserto budAB se ligaron y se introdujeron por trasformación en las células Top 10 de E. coli. Los transformantes se
25 detectaron selectivamente por amplificación por PCR con los cebadores Trc F (SEQ ID n.º 42) y N84 Seq R2 (SEQ ID n.º 65) para confirmar la creación del pTrc99a-budABC. En este plásmido, las regiones codificantes de budA, B, y C son adyacentes las unas a las otras, en este orden, y entre el promotor de Trc y la secuencia de terminación de rrnB.
Resultados:
30 La producción de butanodiol se examinó en tres aislados independientes de E. coli Top 10/pTrc99a-budABC utilizando E. coli Top 10/pCL1925-Kodd-ddr (se describe a continuación) como control negativo. Las cepas se hicieron crecer en medio LB con 100 μg/ml de carbenicilina. Las células resultantes se utilizaron para inocular matraces para agitación (aproximadamente un volumen total de 175 ml) con 125 ml del medio TM3a/glucosa con 100 μg/ml de carbenicilina. Además, los matraces inoculados con cepas que llevaban pTrc99a-budABC contenían
35 0,4 mM de isopropil �-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). El medio TM3a/glucosa contiene (por litro): 10 g de glucosa, 13,6 g de KH2PO4, 2,0 g de ácido cítrico monohidratado, 3,0 g de (NH4)2SO4, 2,0 g de MgSO4·7H2O, 0,2 g de CaCl2·2H2O, 0,33 g de citrato de amonio férrico, 1,0 mg de hidrocloruro de tiamina, 0,50 g de extracto de levadura y 10 ml de una solución de elementos traza, ajustada a pH 6,8 con NH4OH. La solución de elementos traza contenía: ácido cítrico·H2O (4,0 g/l), MnSO4·H2O (3,0 g/l), NaCl (1,0 g/l), FeSO4·7H2O (0,10 g/l), CoCl2·6H2O (0,10 g/l),
40 ZnSO4·7H2O (0,10 g/l), CuSO4·5H2O (0,010 g/l), H3BO3 (0,010 g/l) y Na2MoO4·2H2O (0,010 g/l). Los matraces, cerrados con tapones con ventilación, se inocularon a una DO600 inicial de aproximadamente 0,03 unidades y se incubaron a 34 °C con agitación a 300 rpm.
Unas 23 horas después de la inducción, se analizó una alícuota del caldo por HPLC (columna de Shodex Sugar SH1011) y CG (HP-INNOWax), con los mismos procedimientos descritos en el apartado Procedimientos generales
45 para el 2-butanol y la 2-butanona. Los resultados del análisis se dan en la tabla 6. Los tres clones de E. coli convirtieron la glucosa en acetoína, y meso-2,3-butanodiol, los productos intermedios deseados de la vía, con una selectividad molar del 14%. Esta selectividad era aproximadamente 35 veces mayor que la observada con la cepa de control de E. coli que carece de budABC.
Tabla 6
Producción de acetoína y meso-2,3-butanodiol en E. coli Top 10/pTrc99a-budABC
Cepa
DO600 Acetoína, mM Meso-2,3-butanodiol, mM Selectividad molara, %
Control negativo
1,4 0,07 0,03 0,4
Producción de acetoína y meso-2,3-butanodiol en E. coli Top 10/pTrc99a-budABC
Cepa
DO600 Acetoína, mM Meso-2,3-butanodiol, mM Selectividad molara, %
Aislado n.º 1
1,5 0,64 1,3 14
Aislado n.º 2
1,4 0,70 1,2 14
Aislado n.º 3
1,4 0,74 1,3 15
a La selectividad molar es (acetoína + meso-2,3-butanodiol)/(glucosa consumida).
Construcción del vector pCL1925-KoDD-ddr:
Los operones de la diol deshidratasa (GenBank D45071, SEQ ID n,º 69) y el factor reactivador (GenBank AF017781, SEQ ID n.º 70) se amplificaron por PCR a partir de Klebsiella oxytoca ATCC 8724 como una unidad simple con los cebadores DDo For (SEQ ID n.º 44) y DDo Rev (SEQ ID n.º 45). El cebador directo incorporó un RBS de E. coli 5 optimizado y un sitio de restricción de HindIII. El cebador inverso incluía un sitio de restricción de XbaI. El producto de PCR de 5318 pb se clonó en el pCR4Blunt-TOPO y los clones del pCR4Blunt-TOPO-Kodd-ddr resultante se secuenciaron con los cebadores M13 directo (SEQ ID n.º 35), M13 inverso (SEQ ID n.º 36), DDko seq F2 (SEQ ID n.º 46), DDko seq F5 (SEQ ID n.º 47), DDko seq F7 (SEQ ID n.º 48), DDko seq F9 (SEQ ID n.º 49), DDko seq R1 (SEQ ID n.º 50), DDko seq R3 (SEQ ID n.º 51), DDko seq R7 (SEQ ID n.º 52) y DDko seq R10 (SEQ ID n.º 53). Se
10 identificó un clon que tenía el inserto con la secuencia esperada.
Para poderlos expresar, los genes de la diol deshidratasa/factor reactivador se subclonaron en el pCL1925 (patente de los EE.UU. n.º 7.074.608), un plásmido de bajo número de copias que lleva el promotor de la glucosa isomerasa de Streptomyces. El pCR4Blunt-TOPO-Kodd-ddr se digirió con HindIII y XbaI, y se purificó en gel el fragmento resultante Kodd-ddr de 5,3 kpb. El vector pCL1925 se digirió con HindIII y XbaI, y se purificó en gel el vector
15 resultante de 4539 pb. El vector y el fragmento Kodd-ddr se ligaron y se transformaron en E. coli Top 10. Los transformantes se escrutaron por PCR con los cebadores DDko Seq F7 (SEQ ID n.º 48) y DDko Seq R7 (SEQ ID n.º 52). La amplificación del plásmido (pCL1925-Kodd-ddr) que llevaba el inserto dio lugar a un producto de aproximadamente 797 pb.
La actividad de la diol deshidratasa con el meso-2,3-butanodiol se midió incubando el extracto celular (proteínas
20 totales aproximadamente a 0,8 mg/ml) con butanodiol a 10 mM y coenzima B12 a 12 mM en HEPES a 80 mM (pH 8,2) durante 17 h a temperatura ambiente. La formación del producto esperado, la 2-butanona, se determinó por HPLC como se describe en los Procedimientos generales.
Construcción del vector pCL1925-KoDD-ddr::T5 chnA ter:
Para proporcionar una actividad alcohol deshidrogenasa heteróloga, el gen chnA que codifica la ciclohexanol
25 deshidrogenasa de Acinetobacter sp. (Cheng et al., J. Bacteriol. 182: 4744-4751 (2000)) se clonó en el vector pCL1925 con el operón de la diol deshidratasa, pCL1925-Kodd-ddr. El gen chnA, dado como SEQ ID n.º 71 (GenBank n.º AF282240, SEQ ID n.º 73) se amplificó de pDCQ2, un cósmido que lleva el agrupamiento génico del ciclohexanol de Acinetobacter, con los cebadores ChnA F (SEQ ID n.º 54) y ChnA R (SEQ ID n.º 55). El producto de PCR resultante de 828 pb se clonó en el pCR4Blunt-TOPO para crear el pCR4Blunt-TOPO-chnA y los
30 transformantes se escrutaron mediante PCR sobre colonias con los cebadores M13 directo (SEQ ID n.º 35) y M13 inverso (SEQ ID n.º 36). Los clones correctos produjeron un producto de PCR de aproximadamente 1 kpb y se secuenciaron con los cebadores M13 directo (SEQ ID n.º 35) y M13 inverso (SEQ ID n.º 36).
Tras secuenciar el pCR4Blunt-TOPO-chnA para confirmar que la secuencia es correcta, el gen chnA se subclonó del plásmido como un fragmento Mfel/SmaI de 813 pb. El vector de expresión pQE30 (Qiagen) se digirió con MfeI y
35 SmaI, y se purificó en gel el fragmento de vector resultante de 3350 pb. El fragmento de chnA y el vector purificado se ligaron y se introdujeron por transformación en las células Top 10 de E. coli. Los transformantes se escrutaron por PCR sobre colonias con los cebadores chnSeq F1 (SEQ ID n.º 56) y chnseq R1 (SEQ ID n.º 57) para detectar un producto de PCR de 494 pb. Esta clonación colocó el gen chnA en el plásmido pQE30-chnA bajo el control del promotor de T5.
40 Para preparar el vector pCL1925 para que lleve dos operones, se añadieron terminadores al vector. Se preparó un fragmento de terminador tonB-mcs-terminador trpA mediante hibridación de oligonucleótidos con los cebadores Top ter F1 (SEQ ID n.º 58), Top ter F2 (SEQ ID n.º 59), Bot ter R1 (SEQ ID n.º 60) y Bot ter R2 (SEQ ID n.º 61). El ADN hibirdado se purificó de un gel PAGE al 6% (Embi-tec, San Diego, CA). El vector pCL1925 se digirió con Sacl y XbaI y se purificó en gel. El ADN hibridado y el fragmento del vector se ligaron para crear el pCL1925-ter. Los
45 transformantes se escrutaron por amplificación de las colonias con PCR con los cebadores pCL1925 vec F (SEQ ID n.º 62) y pCL1925 vec R1 (SEQ ID n.º 63) en busca de la presencia de un producto de PCR de aproximadamente 400 pb. Los clones positivos del escrutinio por PCR se secuenciaron con los mismos cebadores.
El vector pCL1925-ter se digirió con XhoI y PmeI y el fragmento de 4622 pb resultante se purificó en gel. El pQE30chnA se digirió con NcoI y el ADN se trató con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa para hacer romos los extremos. A continuación, el pQE30-chnA se digirió con XhoI y se purificó en gel el fragmento resultante promotor T5-chnA de 1,2 kpb. El vector pCL1925-ter y el fragmento del operón de chnA se ligaron juntos para dar el pCL1925
5 ter-T5-chnA y se introdujeron por transformación en la cepa Top 10 de E. coli. Los transformantes se escrutaron por amplificación por PCR sobre colonias con los cebadores pCL1925 vec F (SEQ ID n.º 64) y chnseq R1 (SEQ ID n.º 59) en busca de un producto de aproximadamente 1 kpb.
Para acabar de construir el vector con la vía, el plásmido pCL1925-KoDD-ddr se digirió con XbaI y SacI, y se purificó en gel el fragmento de vector resultante de 9504 pb. Se purificó en gel como un fragmento XbaI/SacI de 1271 pb el 10 operón de chnA flanqueado por terminadores, con el terminador trpA (Koichi et al., (1997) Volumen 272, número 51, págs. 32034-32041) del lado 3' en la secuencia codificante de chnA, obtenido de pCL1925-ter-TschnA. Tras la ligación de los fragmentos y la introducción por transformación en la cepa Top 10 de E. coli, los transformantes se escrutaron por PCR sobre colonias. Los cebadores chnSeq F1 (SEQ ID n.º 58) y pCL1925 vec R2 (SEQ ID n.º 64) amplificaron el producto de PCR esperado de 1107 pb en el plásmido resultante, el pCL1925-KoDD-ddr::ter-T5chnA.
15 Ejemplo 10
Expresión de una vía biosintética del 2-butanol en E. coli con sobreexpresión de la alcohol deshidrogenasa endógena
El propósito de este ejemplo fue expresar una vía biosintética del 2-butanol en varias cepas de E. coli
Construcción de cepas de E. coli que expresan constitutivamente yqhD:
20 E. coli contiene un gen nativo (yqhD) que se identificó que era una 1,3-propanodiol deshidrogenasa (patente de los EE.UU. n.º 6.514.733). El gen yqhD, dado a conocer como SEQ ID n.º 74, tiene una identidad del 40% con el gen adhB de Clostridium, una probable butanol deshidrogenasa dependiente de NADH. El gen yqhD se colocó bajo la expresión constitutiva de una variante del promotor de la glucosa isomerasa 1.6GI (SEQ ID n.º 67) en la cepa de E. coli MG1655 1.6yqhD::Cm (patente internacional WO 2004/033646) mediante la tecnología A Red (Datsenko y
25 Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97: 6640 (2000)). De igual forma, el promotor nativo fue reemplazado por el promotor 1.5GI (patente internacional WO 2003/089621) (SEQ ID n.º 68), con lo que se creó la cepa MG1655 1.5yqhD::Cm, con lo que se reemplazó el promotor 1.6GI de MG1655 1.6yqhD::Cm con el promotor 1.5GI. Los promotores 1.5GI y 1.6GI difieren en 1 pb en la región –35, lo que altera la fuerza de los promotores (patente internacional WO 2004/033646). A la vez que se reemplazó el promotor nativo de yqhD bien con el promotor 1.5GI o
30 bien con el 1.6GI, se eliminó el gen yqhC que codifica el posible regulador transcripcional del operón de yqh. Se confirmó la actividad butanol deshidrogenasa mediante un ensayo enzimático con los procedimientos que se conocen bien en la técnica.
Transformación de las cepas de E. coli:
Los plásmidos de la vía, pCL1925-Kodd-ddr y pTrc99q-budABC, descritos en el ejemplo 9, se cotransformaron en
35 las cepas de E. coli MG1655, MG1655 1.6yqhD y MG1655 1.5yqhD. Las últimas dos cepas sobreexpresan la 1,3propanodiol deshidrogenasa, YqhD, que también tiene actividad butanol deshidrogenásica. Se examinaron las cepas para detectar la producción de 2-butanona y de 2-butanol esencialmente como se describe más arriba. Se inocularon las células en matraces para agitación (de aproximadamente 175 ml de volumen total) que contenían bien 50 o bien 150 ml del medio TM3a/glucosa (con 0,1 mg/l de vitamina B12, los antibióticos adecuados e IPTG) para
40 representar el medio y las condiciones con escaso oxígeno, respectivamente. Se utilizaron la espectinomicina (50 !g/ml) y la carbenicilina (100 !g/ml) para los plásmidos pCL1925-Kodd-ddr y pTrc99a-budABC, respectivamente. Los matraces se inocularon a una DO600 inicial : 0,04 unidades y se incubaron a 34 °C con agitación a 300 rpm. Los matraces con 50 ml de medio se cerraron con tapones con ventilación; los matraces con 150 ml se cerraron con tapones sin ventilación para disminuir al mínimo el intercambio de aire. Había IPTG en el momento 0 a una
45 concentración de 0 mM o de 0,04 mM. Los resultados analíticos para la producción de 2-butanona y 2-butanol se presentan en la tabla 7. Todas las cepas de E. coli que comprenden una vía biosintética del 2-butanol produjeron 2butanona en condiciones de oxígeno bajo y medio, y produjeron 2-butanol en las condiciones con poco oxígeno.
Tabla 7
Producción de 2-butanona y 2-butanol en las cepas MG1655 de E.coli que albergan los plásmidos de la vía pCL1925-Kodd-ddr y pTrc99a-budABC
Cepaa,b
IPTG, mM Volumen de medio, ml 2-butanona, mM 2-butanol, mM
MG1655 n.º 1
0 50 0,08 No detectado
Producción de 2-butanona y 2-butanol en las cepas MG1655 de E.coli que albergan los plásmidos de la vía pCL1925-Kodd-ddr y pTrc99a-budABC
Cepaa,b
IPTG, mM Volumen de medio, ml 2-butanona, mM 2-butanol, mM
MG1655 n.º 2
0 50 0,11 No detectado
MG1655 n.º 1
0,04 50 0,12 No detectado
MG1655 n.º 2
0,04 50 0,11 No detectado
MG1655 n.º 1
0 150 0,15 0,047
MG1655 n.º 2
0 150 0,19 0,041
MG1655 n.º 1
0,04 150 0,10 0,015
MG1655 n.º 2
0,04 150 0,11 0,015
MG1655 1.5yqhD n.º 1
0 50 0,10 No detectado
MG1655 1.5yqhD n.º 2
0 50 0,07 No detectado
MG1655 1.5yqhD n.º 1
0,04 50 0,12 No detectado
MG 1655 1.5yqhD n.º 2
0,04 50 0,18 No detectado
MG1655 1.5yqhD n.º 1
0 150 0,16 0,030
MG1655 1.5yqhD n.º 2
0 150 0,18 0,038
MG1655 1.5yqhD n.º 1
0,04 150 0,10 0,021
MG1655 1.5yqhD n.º 2
0,04 150 0,09 0,017
MG1655 1.6yqhD n.º 1
0 50 0,08 No detectado
MG1655 1.6yqhD n.º 2
0 50 0,07 No detectado
MG 1655 1.6yqhD n.º 1
0,04 50 0,12 No detectado
MG1655 1.6yqhD n.º 2
0,04 50 0,15 No detectado
MG1655 1.6yqhD n.º 1
0 150 0,17 0,019
MG1655 1.6yqhD N.º 2
0 150 0,18 0,041
MG1655 1.6yqhD n.º 1
0,04 150 0,11 0,026
MG1655 1.6yqhD n.º 2
0,04 150 0,11 0,038
Control (medio sin inocular)
No detectada No detectado
Producción de 2-butanona y 2-butanol en las cepas MG1655 de E.coli que albergan los plásmidos de la vía pCL1925-Kodd-ddr y pTrc99a-budABC
Cepaa,b
IPTG, mM Volumen de medio, ml 2-butanona, mM 2-butanol, mM
a n.º 1 y n.º 2 representan aislados independientes. b MG1655 es MG1655/pCL1925-Kodd-ddr/pTrc99a-budABC. MG1655 1.6yqhD es MG1655 1.6yqhD/pCL1925Kodd-ddr/pTrc99a-budABC. MG1655 1.5yqhD es MG1655 1.5yqhD/pCL1925-Kodd-ddr/pTrc99a-budABC.
Ejemplo 11
Expresión de una vía biosintética del 2-butanol en E. coli con la alcohol deshidrogenasa heteróloga
Los plásmidos pCL1925-KoDD-ddr::ter-T5chnA y pTrc99-budABC, descritos en el ejemplo 9, se transformaron en las cepas de E. coli MG1655 y MG1655 fyqhCD para demostrar que se produce el 2-butanol.
5 La MG1655 fyqhCD lleva una inactivación de yqhCD que se realizó con el procedimiento de Datsenko y Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (12): 6640-6645 (2000)). Tras el reemplazo de la región con el casete de pKD3, FRT-CmR-FRT, se eliminó el marcador de resistencia del cloranfenicol con la recombinasa FLP. La secuencia de la región eliminada se da a conocer como SEQ ID n.º 66.
Las cepas MG1655/pTrc99a-budABC/pCL1925KoDD-ddr::ter-T5 chnA y MG1655 f yqhCD/pTrc99a
10 budABC/pCL1925KoDD-ddr::ter-T5 chnA se examinaron en busca de la producción de 2-butanona y 2-butanol esencialmente como se describe más arriba. La cepa MG1655 fyqhCD/pCL1925 se utilizó como control negativo. Las células se inocularon en matraces para agitación (aproximadamente 175 ml de volumen total) que contenían 50
o 150 ml del medio TM3a/glucosa (con 0,1 mg/l de vitamina B12 y los antibióticos adecuados) para representar las condiciones con oxígeno medio y con poco oxígeno, respectivamente. Se utilizaron espectinomicina (50 μg/ml) y 15 ampicilina (100 μg/ml) para la selección de los plásmidos basados en pCL1925 y pTrc99a-budABC, respectivamente. La actividad enzimática procedente de pTrc99a-budABC se detectó mediante el ensayo enzimático en ausencia del inductor IPTG, por lo que no se añadió el IPTG al medio. Se inocularon los matraces a una DO600 inicial : 0,01 unidades y se incubaron a 34 °C con agitación a 300 rpm durante 24 h. Los matraces que contenían 50 ml de medio se taparon con tapones con ventilación; los matraces que contienen 150 ml se taparon con tapones sin
20 ventilación para disminuir al mínimo el intercambio de aire. Los resultados analíticos para la producción de 2butanona y 2-butanol se presentan en la tabla 8. Ambas cepas de E.coli que comprenden una vía biosintética de 2butanol produjeron la 2-butanona en las condiciones con poco oxígeno y con oxígeno medio, y produjeron el 2butanol en las condiciones con poco oxígeno, mientras que la cepa de control negativo no produjo ninguna cantidad detectable de 2-butanona ni de 2-butanol.
25 Tabla 8
Producción de 2-butanona y 2-butanol desde las cepas de E. coli
Cepaa
Volumen, ml 2-Butanona, mM 2-Butanol, mM
Control negativo, MG1655 fyqhCD/pCL1925
50 No detectada No detectado
MG1655/pTrc99a-budABC/pCL1925KoDD-ddr::T5 chnA ter
50 0,33 No detectado
MG1655 fyqhCD/pTrc99a-budABC/pCL1925KoDD-ddr::T5 chnA ter n.º 1
50 0,23 No detectado
MG1655 fyqhCD/pTrc99a-budABC/pCL1925KoDD-ddr::T5 chnA n.º 2
50 0,19 No detectado
Control negativo, MG1655 fyqhCD/pCL1925
150 No detectada No detectado
MG1655/pTrc99a-budABC/pCL1925KoDD-ddr::T5 chA ter
150 0,41 0,12
Producción de 2-butanona y 2-butanol desde las cepas de E. coli
Cepaa
Volumen, ml 2-Butanona, mM 2-Butanol, mM
MG 1655 fyqhCD/pTrc99a-budABC/pCL1925KoDD-ddr::T5 chnA n.º 1
150 0,15 0,46
MG1655 fyqhCD/pTrc99a-budABC/pCL1925KoDD-ddr::T5 chnA n.º 2
150 0,44 0,14
Medio
No detectada No detectado
a n.º 1 y n.º 2 representan aislados independientes.
Ejemplo 12
Clonación de la amino:piruvato transaminasa (APT)
Shin et al., (Appl. Microbiol. Biotechnol. (2003) 61: 463-471) identificaron una amino:piruvato transaminasa (APT) de Vibrio fluvialis JS17. Se encontró que la secuencia aminoacídica (SEQ ID n.º 122) tenía una homología significativa 5 con las w-aminoácido:piruvato transaminasas (Shin y Kim (J. Org. Chem. 67: 2848-2853 (2002)). Se demostró que la APT de Vibrio fluvialis tiene actividad transaminásica con la acetoína.
Para la expresión de la enzima APT en E. coli, se diseñó una región codificante de APT con los codones optimizados (SEQ ID n.º 144) utilizando los codones preferidos de E. coli además de otras consideraciones tales como el equilibrio de codones y la estabilidad del ARNm, y luego se hizo sintetizar (por DNA 2.0; Redwood City, CA).
10 El fragmento de ADN de la región codificante se subclonó en el vector pBAD.HisB (Invitrogen) entre los sitios NcoI y HindIII, y el plásmido resultante, de ahora en adelante denominado pBAD.APT1, se introdujo por transformación en las células TOP10.
Ejemplo 13
Caracterización de la actividad alanina:acetoína aminotransferasa, APT, de Vibrio fluvialis
15 Un volumen de 5 ml de medio LB + ampicilina a 100 !g/ml se inoculó con una colonia reciente de células TOP10/pBAD:APT1. El cultivo se incubó a 37 °C durante aproximadamente 16 h con agitación (225 rpm). Se utilizó una alícuota de 300 !l de este cultivo para inocular 300 ml del mismo medio, que se incubó a 37 °C con agitación (225 rpm). Cuando el cultivo alcanzó una DO600 de 0,8, se añadió L-arabinosa a una concentración final del 0,2% (p/v). El cultivo se incubó durante 16 h más, y luego se recogió. Las células se lavaron una vez con tampón de
20 fosfato de potasio a 100 mM (pH 7,8) y, a continuación, se congelaron y conservaron a –80 °C.
Para aislar la enzima, el sedimento celular se descongeló y se resuspendió en 8 ml de tampón de fosfato de potasio a 100 mM (pH 7) con 0,2 mM de etilendiaminotetraacetato, 1 mM de ditiotreitol y 1 comprimido del cóctel de inhibidores de proteasas (Roche; Indianapolis, IN). Las células se lisaron con dos pases por una celda de prensa French a 900 psi, y el lisado resultante se hizo transparente por centrifugación durante 30 min a 17.000 x g. Se 25 añadió sulfato de amonio a una saturación del 35%, y la solución se agitó durante 30 min a temperatura ambiente, en cuyo momento se retiraron los sólidos precipitados por centrifugación (30 min, 17.000 x g). Se añadió más sulfato de amonio al sobrenadante para dar una saturación del 55%, y la solución se agitó de nuevo durante 30 min a temperatura ambiente. Los sólidos precipitados se retiraron por centrifugación (30 min, 17.000 x g) y, a continuación, se resuspendieron en 5 ml de tampón de fosfato de potasio a 100 mM (pH 7) con 10 !M de 5'-fosfato de pirodoxal y 30 1 mM de ditiotreitol. Esta solución se desaló al pasarla por una columna PD10 equilibrada con el tampón A (50 mM del tampón de bis-tris propano (pH 6) que contiene 10 !M de 5'-fosfato de piridoxal y 1 mM de ditiotreitol). A continuación, el extracto desalado se cargó en una columna Q-Fast Flow de 20 ml equilibrada previamente con el tampón A. La APT se eluyó con un gradiente lineal de NaCI de 0 a 0,1 M en el tampón A. La enzima se detectó en las fracciones eluidas por la presencia de una banda de proteína de un tamaño de aproximadamente 50 kDa cuando
35 se analizó por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y por la absorbancia característica a 418 nm. Las fracciones que contenían la enzima se eluyeron a aproximadamente 0,3 M de NaCl. Estas fracciones se agruparon para producir un total de 6 ml de una solución de enzima a 5,45 mg/ml, que era pura a > 90%, a juzgar por la electroforesis con SDS en gel de poliacrilamida.
La actividad alanina:acetoína aminotransferasa de la APT se analizó con un ensayo acoplado a la lactato
40 deshidrogenasa. Las mezclas de reacción contenían 100 mM de bis-tris propano (pH 9,0), 10 !M de 5'-fosfato de piridoxal, 0-50 mM de acetoína, 0-5 mM de L-alanina, 0,14 o 0,28 mg/ml de enzima purificada, 200 !M de NADH y 20 U/ml de lactato deshidrogenasa (Sigma; St. Louis, MO). Tras la reacción, se midió el cambio de la absorbancia a
340 nm, indicativa de la oxidación del NADH. En estas condiciones, la kcat/Km para la acetoína fue de 10 M-1 s-1 y para la L-alanina fue de 400 M-1 s-1.
La identidad del producto esperado, el 3-amino-2-butanol, se confirmó mediante la comparación a un estándar sintético. Se sintetizó una mezcla de (R, R)- y(S, S)-3-amino-2-butanol mediante el procedimiento de Dickey et al.
[J. Amer Chem Soc 74: 944 (1952)]: 5 g de trans-2,3-epoxibutano se agitaron lentamente en 150 ml de NH4OH frío (4 °C). La reacción se calentó lentamente a temperatura ambiente, se selló y se agitó a temperatura ambiente otros 10 días más. En este momento se retiraron el exceso de amonio, de agua, y el epoxibutano residual, mediante evaporación al vacío con rotación a 40 °C. El aceite transparente resultante (2,9 g) se resuspendió en agua a una concentración del 10% (p/v). La producción del producto deseado se confirmó mediante análisis de RMN y la comparación del espectro con el descrito por Levy et al. [Org. Magnetic Resonance 14: 214 (1980)]. Se produjo una mezcla de los correspondientes isómeros de (2R, 3S)- y(2S, 3R)- utilizando el mismo procedimiento, con la excepción de que el material de partida era el isómero cis del 2,3-epoxibutano.
Se desarrolló un procedimiento analítico para la detección del 3-amino-2-butanol sobre la base del procedimiento de modificación del o-ftaldialdehído para la determinación de aminoácidos descrita por Roth [Anal. Chem. 43: 880 (1971)]. Una alícuota de 200 !l del 3-amino-2-butanol a 1 mM (mezcla de isómeros) se mezcló con 200 !l de una solución de borato a 50 mM (pH 9,5) a la cual se le añadieron 10 !l de 2-mercaptoetanol a 5 !l/ml en etanol y 10 !l de o-ftaldialdehído a 10 mg/ml en etanol. La solución se incubó a temperatura ambiente durante 10 min, momento en el cual se extrajo el derivado en 200 !l de hexano. El hexano se separó de la solución acuosa por decantación, y se inyectaron 10 !l en una columna de HPLC Chiracel OD (Daicel Chemical Industries; Fort Lee, NJ). La columna se hizo funcionar isocráticamente con una fase móvil de hexano:isopropanol a 90:10 a una velocidad de 1 ml/min. Los isómeros derivados del 3-amino-2-butanol se detectaron por absorbancia a 340 nm con tiempos de retención de aproximadamente 15,7 y 16,8 min [(2S, 3S) y(2R, 3R)], y de 18,4 y 21,9 min [(2R, 3S) y (2S, 3R)]. Para diferenciar los enantiómeros en la primera mezcla, el isómero puro (2R, 3R) (Bridge Organics; Vicksburg, MI) también se cromatografió en las mismas condiciones y se halló que estaba en el pico de 16,8 min. Para diferenciar los enantiómeros en la segunda mezcla, primero se resolvió cinéticamente la mezcla con la alanina:acetoína aminotransferasa: 0,28 mg de la enzima purificada se incubaron con 10 mM de piruvato y 10 mM de 3-amino-2butanol [mezcla de 1:1 de los isómeros (2R, 3S) y(2S, 3R)] en 1 ml de 100 mM de bis-tris propano (pH 9,0). Después de 24 h a temperatura ambiente, se retiró una alícuota y se analizó como se describe más arriba. El análisis reveló que el 95% del pico de 18,4 min había desaparecido, mientras que el pico de 21,9 min se retenía a > 90%. Una alícuota de 100 !l de la mezcla de reacción restante se mezcló con 50 !l de NADH a 20 mM y 10 !l del extracto de la cepa TOP 10/pTrc99a-budC descrita en el ejemplo 9. La enzima BudC se sabe que reduce la (R)acetoína en meso-2,3-butanodiol, y la (S)-acetoína en (S, S)-2,3-butanodiol [Ui et al. (2004) Letters in Applied Microbiology 39: 533-537]. Después de 3 h se tomaron muestras de la reacción y se analizaron como se describe más arriba para la acetoína y el butanodiol. El análisis indicó que el producto primario de la reacción era el meso2,3-butanodiol, lo que indica que el producto de la reacción de la aminotransferasa era la (R)-acetoína y, por lo tanto, el isómero consumido del 3-amino-2-butanol era el isómero (2R, 3S). Así pues, el tiempo de retención de 18,4 min se puede asignar a este isómero y el de 21,9 al isómero (2S, 3R).
Para confirmar que el producto de la reacción catalizada por la alanina:acetoína aminotransferasa, APT, era el 3amino-2-butanol, se incubaron 0,28 mg de enzima purificada con 10 mM de acetoína, 10 mM de L-alanina, 50 U de lactato deshidrogenasa y 200 !M de NADH en 1 ml de bis-tris propano a 100 mM (pH 9,0). La mezcla de reacción se incubó a la temperatura ambiente durante 20 h, tras las cuales se retiró una alícuota de 200 !l y se modificó como se describe más arriba. El tiempo de retención de los productos derivados era de 15,8 min (producto principal) y 18,5 min (producto menor), concordando con los estándares de (2S, 3S)- y(2R,3S)-3-amino-2-butanol.
Ejemplo 14
Identificación y clonación de la amino alcohol cinasa y de la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia carotovora subsp. atroseptica
El propósito de este ejemplo es el de describir la identificación y clonación de las secuencias que codifican una amino alcohol cinasa y una amino alcohol O-fosfato liasa de la bacteria Erwinia carotovora. Estas dos enzimas son parte de la vía 1 para la conversión del 3-amino-2-butanol en 2-butanona mediante el producto intermedio fosfato de 3-amino-2-butanol, como se muestra en la figura 1.
Predicción de la amino alcohol cinasa y de la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia
Se ha detectado la actividad de la amino alcohol cinasa dependiente de ATP y de la amino alcohol O-fosfato liasa en varias especies de Pseudomonas y Erwinia, entre ellas Pseudomonas sp. P6 (NCIB 10431), Pseudomonas putida NCIB 10558 (Jones et al., (1973) Biochem. J. 134: 167-182), Erwinia carotovora, Erwinia amanas, Erwinia milletiae y Erwinia atroseptica (Jones et al., (1973) Biochem. J.134: 959-968). En estos estudios, los extractos de las especies anteriores se demuestra que tienen actividad para la conversión enzimática del aminopropanol, pasando por el Ofosfato de aminopropanol, en propionaldehído, y la conversión de la etanolamina, pasando por el O-fosfato de etanolamina, en acetaldehído.
Sn el Instituto Sanger se ha determinado la secuencia genómica( Bell et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (30): 11105-11110) de la cepa de Erwinia atroseptica en la cual se describió que existían estas actividades (ahora denominada Erwinia carotovora subsp. atroseptica cepa SCRI1043 (ATCC BAA-672)). El análisis de las posibles cinasas del genoma de Erwinia carotovora subsp. atroseptica reveló una secuencia del operón (SEQ ID n.º 275) que codifica una posible proteína (ECA2059; SEQ ID n.º 124) que tiene una identidad del 39% con una homoserina cinasa de Rhizobium loti y con una posible aminotransferasa de clase III dependiente de fosfato de piridoxal (PLP) (ECA2060; SEQ ID n.º 126) que tiene una identidad del 58% con una posible aminotransferasa de Rhizobium meliloti. Se esperaba que la ECA2059 fuera una amino alcohol cinasa y que la ECA2060 fuera una amino alcohol Ofosfato liasa que utiliza el PLP como cofactor.
Clonación de la posible amino alcohol cinasa y de la posible amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia carotovora subsp. atroseptica
El ADN genómico de Erwinia carotovora subsp. atroseptica (ATCC n.º BAA-672D) se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC). El operón que codifica la posible amino alcohol cinasa (KA) y la posible amino alcohol Ofosfato liasa (AT) se denominó KA-AT (SEQ ID n.º 275). Este operón se amplificó del ADN genómico de Erwinia mediante la ADN polimerasa Phusion (Finnzymes; vía New England Biolabs; Ipswich, MA) con los cebadores OT872 (SEQ ID n.º 127) y OT873 (SEQ ID n.º 128). Por PCR se obtuvo un fragmento de ADN de 2,4 kb, que corresponde al tamaño del operón KA-AT. El producto de la PCR se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y PstI, y se clonó en el vector pKK223-3 (Amersham Biosciences; Piscataway, NJ) que se digirió con las mismas enzimas de restricción. Esto produjo el plásmido pKK223.KA-AT, que contenía el posible operón de la amino alcohol cinasa-liasa de Erwinia bajo el control del promotor de tac. De igual forma se construyeron los plásmidos pKK223.KA y pKK223.AT que colocaron las regiones codificantes de la posible cinasa de Erwinia y de la posible liasa de Erwinia en vectores independientes, cada una bajo el control del promotor tac. Para la clonación por PCR de la región codificante de KA (SEQ ID n.º 123) se utilizaron los cebadores OT872 (SEQ ID n.º 127) y OT879 (SEQ ID n.º 129); y para la clonación por PCR de la región codificante de AT (SEQ ID n.º 125) se utilizaron los cebadores OT873 (SEQ ID n.º 128) y OT880 (SEQ ID n.º 130) en las amplificaciones por PCR, que generaron los productos de PCR de 1,1 kb y de 1,3 kb, respectivamente. Los productos de PCR se digirieron cada uno con EcoRI y PstI, y se ligaron al vector pKK223-3 para generar pKK223.KA y pKK223.AT.
Actividad in vivo de la posible amino alcohol cinasa y de la posible amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia carotovora subsp. atroseptica
Los plásmidos pKK223.KA-AT, pKK223.KA, pKK223.AT y pKK223-3 se introdujeron por transformación en la cepa MG1655 de E. coli. Los transformantes se volvieron a sembrar en estrías en una placa del medio mínimo MOPS con glucosa al 1%, aminopropanol al 0,5% como única fuente de nitrógeno, IPTG a 1 mM y 100 μg/ml de ampicilina. La expresión de los genes de KA-AT, KA y AT se indujo con el IPTG. Una placa de control no llevaba el IPTG. Las placas se incubaron a 37 °C durante 7 días. En la placa con IPTG sólo creció la cepa MG1655/pKK223.KA-AT, mientras que no crecieron las otras tres cepas. En la placa que no lleva IPTG, la cepa MG1655/pKK223.KA-AT sí creció, pero las colonias eran significativamente más pequeñas que las de la placa que contenía IPTG, que corresponde a los niveles de expresión más bajos de KA y AT en las células sin inducir. Ninguna de las otras tres cepas creció en esta placa. Esto indica que la coexpresión de los genes de las posibles KA y AT de Erwinia proporcionó una actividad enzimática suficiente para permitir que la cepa MG1655/pKK223.KA-AT de E. coli utilizara el aminopropanol como única fuente de nitrógeno. La expresión de cada enzima KA o AT por separado no bastó para proporcionar tal actividad enzimática in vivo.
Ejemplo 15
Actividad in vitro de la posible amino alcohol cinasa y de la posible amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia
Subclonación del operón KA-AT de Erwinia en el vector pBAD.HisB e inducción de la expresión de las proteínas
Los niveles de expresión de las proteínas de las posibles enzimas KA y AT de Erwinia expresados en las células MG1655 desde el vector pKK223.KA-AT se analizaron mediante análisis de SDS-PAGE. El nivel de expresión de la enzima AT de Erwinia era relativamente bajo, y se detectó una nueva banda de proteína a la masa molecular correcta de 46 kDa en la fracción soluble de un extracto celular, mientras que no se detectaba ninguna nueva banda de proteína al tamaño predicho para la enzima KA.
En un intento de mejorar la expresión de los genes de las posibles KA y AT de Erwinia, se subclonó el operón KA-AT entre los sitios EcoRI y HindIII del vector pBAD.HisB-EcoRI. pBAD.HisB-EoRI procedía del vector pBAD.HisB (Invitrogen) por reemplazo del sitio de NcoI en pBAD.Hisb por un sitio de EcoRI mediante mutagénesis dirigida con QuickChange (Stratagene, La Jolla, CA) y los cebadores OT909 (SEQ ID n.º 131) y OT910 (SEQ ID n.º 132). En el plásmido construido pBAD.KA-AT, el operón KA-AT se colocó directamente bajo el control del promotor de araB (sin la etiqueta de His).
El plásmido pBAD.KA-AT se introdujo por transformación en la cepa TOP10 de E. coli. Un cultivo de 50 ml de la cepa TOP10/pBAD.KA-AT se hizo crecer hasta la mitad de la fase logarítmica (DO600 = 0,6) en el medio LB con 100 μg/ml de ampicilina a 37 °C con agitación a 250 rpm. El cultivo se indujo mediante la adición de L-arabinosa a una
concentración final del 0,1% (p/v) y se incubó adicionalmente a 37 °C durante 5 h antes de recogerlas por centrifugación. El sedimento celular se resuspendió en Tris-HCl a 50 mM enfriado en hielo, pH 8,0, y se rompieron por sonicación en hielo con un Fischer Sonic Model 300 Dismembrator (Fischer, Pittsburg, PA) a una potencia del 50%, con repetición de cuatro ciclos de sonicación de 30 s con 60 s de reposo entre cada ciclo. Se centrifugó cada
5 muestra sonicada (15.000 x g, 4 min, 4 °C). A los extractos transparentes y sin células se les analizó el nivel de expresión de la proteína y la actividad amino alcohol O-fosfato liásica.
Síntesis química del O-fosfato de aminobutanol y del O-fosfato de aminopropanol
El sustrato O-fosfato de (R, R)-3-amino-2-butanol se sintetizó mediante un procedimiento basado en el descrito por Ferrari y Ferrari (patente de los EE.UU. 2730542 [1956]) para la fosfoetanolamina. 10 mmol de H3PO4 en una 10 solución acuosa al 50% (p/v) se mezclaron con una solución al 50% (p/v) de (R, R)-3-amino-2-butanol (Bridge Organics; Vicksburg, MI) mientras se agitaba en hielo. Tras la mezcla, se calentó lentamente la solución a temperatura ambiente y, a continuación, se agitó al vacío y se calentó a 70 °C. Después de 1 h a 70 °C, se incrementó lentamente la temperatura hasta 185 °C y se mantuvo ahí durante 2 h más. En ese momento se enfrió la reacción a temperatura ambiente y se liberó el vacío. El material restante se disolvió en agua, y el análisis mediante
15 RMN indicó que el 80% del material inicial se había convertido en producto y que el 20% no reaccionó. No se observaron otros productos.
Los sustratos adicionales O-fosfato de (2R, 3S)-3-amino-2-butanol y O-fosfato de (2S, 3R)-3-amino-2-butanol se sintetizaron por el mismo procedimiento con una mezcla 1:1 de (2R, 3S)-3-amino-2-butanol y (2S, 3R)-3-amino-2butanol (sintetizados como se describe en el ejemplo 13) como material de partida. El O-fosfato de DL-1-amino-2
20 propanol, el O-fosfato de (S)-2-amino-1-propanol y el O-fosfato de (R)-2-amino-1-propanol se sintetizaron con el mismo procedimiento utilizando como el material de partida DL-1-amino-2-propanol, (R)-2-amino-1-propanol o (S)-2amino-1-propanol.
Análisis de la actividad aminopropanol O-fosfato liasa codificada por el posible operón KA-AT de Erwinia
El ensayo de la aminopropanol O-fosfato liasa se realizó como describen Jones et al. (1973, Biochem. J. 134: 167
25 182) y G. Gori et al. (1995, Chromatographia 40: 336). La formación del propionaldehído a partir del O-fosfato de aminopropanol se analizó colorimétricamente con MBTH, que permite detectar la formación del aldehído. La reacción se realizó como sigue. En una reacción de 1 ml, 100 μg del extracto libre de células de E. coli TOP10/pBAD.KA-AT se añadieron a O-fosfato de DL-1-amino-2-propanol a 10 mM en Tris-HCl a 100 mM, pH 7,8, con PLP a 0,1 mM. La reacción se incubó a 37 °C durante 10 min y 30 min, y se retiró una alícuota de 100 μl de la
30 mezcla de reacción en cada punto temporal y se mezcló con 100 μl de MBTH a 6 mg/ml en 375 mM de glicina-HCl, pH 2,7. Esta mezcla se incubó a 100 °C durante 3 min, se enfrió en hielo durante 15-30 s, y se le añadió 1 ml de FeCl3·6H2O a 3,3 mg/ml (en 10 mM de HCl), y luego se incubó durante 30 min a temperatura ambiente. Se midió a 670 nm la absorbancia de la mezcla de reacción con el aducto aldehído-MBTH. Los resultados del ensayo se recogen en la tabla 9. En presencia del sustrato fosfato de aminopropanol, PLP y extracto sin células, se detectó la
35 formación de aldehído, tal como se indica que la Ab670 sea más grande que el ruido de fondo del control en 0,3 unidades. En ausencia de o bien el sustrato o bien el extracto sin células, no se detectó la formación del aldehído. En ausencia del PLP añadido, se detectó una cantidad algo menor de aldehído, supuestamente debido a la presencia de PLP en el extracto sin células. El extracto sin células del cultivo sin inducir de TOP10/pBAD.KA-AT no produjo ningún aldehído detectable en la reacción. Estos resultados indicaron que la posible amino alcohol O-fosfato
40 liasa de Erwinia no cataliza la conversión del O-fosfato de aminopropanol en el propionaldehído.
Tabla 9
Ensayo de la aminopropanol O-fosfato liasa. La muestra 1 era el extracto sin células del un control sin inducir de E. coli TOP10/pBAD.KA-AT. Las muestras 2 a 5 contenían el extracto sin células del cultivo inducido de E. coli TOP10/pBAD.KA-AT.
Número de muestra
Inducción con arabinosa al 0,1% O-Fosfato de aminopropanol PLP Extracto enzimático (100 μg/ml) DO670, 10 min DO670, 30 min
1
Sin inducir (+) (+) (+) 0,262 0,255
2
Inducido (+) (+) (+) 1,229 2,264
3
Inducido (-) (+) (+) 0,303 0,223
4
Inducido (+) (-) (+) 0,855 1,454
5
Inducido (+) (+) (-) 0,156 0,065
Análisis de la actividad de la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia con el sustrato O-fosfato de aminobutanol
La actividad de la amino alcohol O-fosfato liasa sobre el sustrato O-fosfato de aminobutanol se estudió en las mismas condiciones que se describen más arriba. La reacción se llevó a cabo a 37 °C durante una noche en una reacción de 1 ml que contenía 100 μg del extracto sin células de E. coli TOP10/pBAD.KA-AT, 10 mM de O-fosfato de aminobutanol (bien la mezcla de isómeros (R, R) + (S, S) o la (R, S) + (S, R) descritas en el ejemplo 15) en 100 mM de Tris-HCl, pH 7,8, con 0,1 mM de PLP. Se retiró una alícuota de 100 μl de la mezcla de reacción y se le detectó el producto 2-butanona con el procedimiento de modificación con MBTH descrito en los Procedimientos generales. Se observaron los dos picos que representan los isómeros procedentes de la 2-butanona. Por consiguiente, la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia es una aminobutanol fosfato fosfoliasa, además de una aminopropanol fosfato fosfoliasa.
Análisis de la actividad de la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia con los estereoisómeros del O-fosfato de aminopropanol y del O-fosfato de aminobutanol
La actividad de la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia con distintos estereoisómeros del O-fosfato de aminopropanol y de O-fosfato de aminobutanol se estudió en las mismas condiciones que se describen más arriba. En presencia de la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia, tanto el O-fosfato de (R)-2-amino-1-propanol como del (S)-2-amino-1-propanol se convirtieron en propanona gracias a la enzima, pero el rendimiento del producto era mucho más alto con el isómero (S). La enzima también produjo butanona a partir de ambas mezclas de los isómeros del O-fosfato de 3-amino-2-butanol con un rendimiento de producto más alto en la reacción que contiene los isómeros del sustrato (R, S) y(S, R). Ambos productos de propanona y butanona se modificaron con MBTH y se detectaron por HPLC como se describe en los Procedimientos generales.
Optimización del nivel de expresión génica para la amino alcohol cinasa y la amino alcohol O-fosfato liasa de Erwinia
Para mejorar el nivel de expresión para la amino alcohol cinasa y de la amino alcohol O-fostato liasa de Erwinia en
E. coli, se sintetizaron en DNA2.0 (Redwood City, CA) las regiones codificantes de ambas enzimas con los codones optimizados (denominadas EKA: SEQ ID n.º 155 y EAT: SEQ ID n.º 156, respectivamente). Cada región codificante se sintetizó con colas en 5' y 3' que incluyen los sitios de restricción para la clonación: EKA tiene los sitios Bbsl en 5', y EcoRI y HindIII en 3'; EAT tiene los sitios EcoRI en 5' y HindIII en 3'. Las regiones codificantes de EKA y EAT las proporcionó DNA2.0 como los plásmidos pEKA y pEAT, que estaban en el vector pJ51 de DNA2.0. La región codificante optimizada de EKA se subclonó por ligación de un fragmento de pEKA digerido con BbsI y HindIII en el vector pBAD.HisB entre los sitios NcoII y HindIII, para generar el plásmido pBAD.EKA. En el plásmido resultante, la región codificante está en 5' respecto a la etiqueta de His, por lo que, para generar el vector pBAD.His-EKA, se construyó una región codificante para la fusión a una etiqueta de His6 en el extremo amino de la amino alcohol cinasa de Erwinia mediante una reacción de mutagénesis dirigida con QuickChange y con los cebadores SEQ ID n.º 157 y SEQ ID n.º 158.
El pBAD.His-EKA se introdujo por transformación en la cepa de E. coli BL21AI (F ompT hsdSB (rB– mB–) gal dcm araB::T7RNAP-tetA; Invitrogen) para producir la cepa BL2AI/pBAD.HisA-EKA. Se hizo crecer un cultivo de 50 ml de BL21AI/pBAD.HisA-EKA hasta la mitad de la fase logarítmica (DO600 = 0,6), se indujo con 0,1% de arabinosa y se incubó de nuevo a 30 °C durante una noche. Los extractos sin células se prepararon mediante sonicación. La proteína de fusión de la amino alcohol cinasa de Erwinia etiquetada con His6 se purificó con el sistema de purificación ProBondTM (Invitrogen) en las condiciones de purificación no desnaturalizantes siguiendo las instrucciones del fabricante.
Resultado predictivo
La actividad cinásica de la amino alcohol cinasa de Erwinia etiquetada con His6 se analiza mediante el ensayo ADP Quest (DiscoveRx, Fremont, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se trata de un ensayo bioquímico que mide la acumulación de ADP, un producto de la reacción de la amino alcohol cinasa bien con el aminopropanol o bien con el aminobutanol como sustrato. El sustrato a 10 mM se mezcla con la amino alcohol cinasa de Erwinia etiquetada con His6, en 100 mM de Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM de MgCl2, 2 mM de KCl, 0,1 mM de ATP, y se incubó a 37 °C durante 1 h en una reacción de 0,2 ml. Se añadieron el reactivo A de ADP (100 μL) y el reactivo B de ADP (200 μl) y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 min. La señal de fluorescencia que indica actividad se mide a una longitud de onda de excitación de 530 nm y a una longitud de onda de emisión de 590 nm.
Ejemplo 16
Expresión de la vía 3 completa
Construcción del vector pCLBudAB-ter-T5chnA
El vector pTrc99a::BudABC (descrito en el ejemplo 9) se digiere con EcoRI, y el ADN se trata con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa para hacer romos los extremos. El vector romo se digiere posteriormente con SpeI para producir un fragmento de 2,5 kb que contiene los genes budA y budB. El vector pCL1925-ter-T5hnA (descrito en el ejemplo 9) se digiere con HindIII, y el ADN se trata con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa para hacer
romos los extremos. El vector romo se digiere posteriormente con XbaI para producir un fragmento de 4,6 kb que luego se liga al fragmento de budAB obtenido de pTrc99a::BudABC. El plásmido resultante, denominado pCLBudAB-ter-T5chnA, se usa para transformar las células Top10 de E. coli, y las colonias aisladas se escrutan en busca de la estructura apropiada del plásmido por PCR con los cebadores pCL1925vecF (SEQ ID n.º 62) y N84seqR3 (SEQ ID n.º 159). El plásmido se prepara de una colonia única que produce un producto de PCR del tamaño esperado de 1,4 kb.
Construcción del vector pKK223.KA-AT-APT
El gen de APT se amplifica del vector pBAD.APT (descrito en el ejemplo 12) por PCR con los cebadores APTfor (SEQ ID n.º 162; el 5' incluye la RBS y el sitio de SmaI) y APTrev (SEQ ID n.º 163; el 3' añade el sitio de SmaI). El producto del tamaño esperado de 1,7 kpb se purifica en gel y se digiere con SmaI para producir extremos romos. El vector pKK223.KA-AT (descrito en el ejemplo 14) se digiere con PstI, y el ADN se trata con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa para hacer romos los extremos. El fragmento de ADN resultante se liga con el producto de PCR digerido con SmaI, y el producto de la ligación se utiliza para transformar las células Top10 de E. coli. Cada colonia resistente a la ampicilina se escruta por PCR con los cebadores OT872 (SEQ ID n.º 127) y APTrev (SEQ ID n.º 163). La presencia de un producto de PCR del tamaño esperado de 4,1 kpb indica que el gen que codifica la APT está presente y orientado en la misma dirección que los genes que codifican KA y AT. La secuencia del inserto se verifica con los cebadores APTseqRev (SEQ ID n.º 160) y APTseqFor (SEQ ID n.º 161). Este plásmido se denomina pKK223.KA-AT-APT. La expresión adecuada de los tres genes se verifica haciendo crecer un cultivo de 5 ml de Top10/pKK223.KA-AT-APT en LB + 100 μg/ml de ampicilina a 37 °C con agitación. Cuando la DO600 alcanza aproximadamente 0,8, la expresión de los genes que hay en el plásmido se induce por la adición de IPTG a 0,4 mM. La expresión se evalúa mediante SDS PAGE y los ensayos de la actividad que se han descrito más arriba.
Construcción de la cepa de producción de 2-butanol y producción de la 2-butanona y del 2-butanol
La cepa MG1655 de E. coli se transforma con pKK223.KA-AT-APT y con pCLBudAB-ter-T5chnA, y se seleccionan los transformantes por la resistencia a la ampicilina y a la espectinomicina, indicativas de la presencia de los plásmidos. Las células se inoculan en matraces para agitación (el volumen total es de aproximadamente 175 ml) que contienen 50 o 150 ml del medio TM3a/glucosa (con antibióticos adecuados) para representar las condiciones de oxígeno medio y bajo, respectivamente. Se añade el IPTG a 0,4 mM para inducir la expresión de los genes de pKK223.KA-AT-APT. Como control negativo, las células MG1655 se hacen crecer en el mismo medio sin antibióticos. Los matraces se inoculan a una DO600 inicial : 0,01 y se incuban a 34 °C con agitación a 300 rpm durante 24 h. Los matraces que contienen 50 ml de medio se cierran con tapones con ventilación; los matraces que contienen 150 ml están cerrados con tapones sin ventilación para disminuir al mínimo el intercambio de aire. La cepa MG1655/ pKK223.KA-AT-APT/ pCLBudAB-ter-T5chnA que comprende una vía biosintética del 2-butanol produce tanto 2-butanona como 2-butanol en las condiciones de oxígeno bajo y medio, mientras que la cepa de control negativo no produce un nivel detectable de 2-butanona ni de 2-butanol.
Ejemplo 17
Caracterización de la actividad glicerol deshidratasa y butanodiol deshidratasa.
La glicerol deshidratasa (E. C. 4.2.1.30) y la diol deshidratasa (E.C. 4.2.1.28), aunque relacionadas desde el punto de vista estructural, a menudo se diferencian en la técnica basándose en una serie de diferencias que incluyen la especificidad de sustrato. Este ejemplo demuestra que la glicerol deshidratasa convierte el meso-2,3-butanodiol en 2-butanona. La cepa de E. coli recombinante KLP23/pSYCO12, que comprende los genes de Klebsiella pneumoniae que codifican las distintas subunidades de la glicerol deshidratasa [a: SEQ ID n.º 145 (región codificante) y 146 (proteína); �: SEQ ID n.º 147 (región codificante) y 148 (proteína); y y: SEQ ID n.º 149 (región codificante) y 150 (proteína)]; y los genes de Klebsiella pneumoniae que codifican las distintas subunidades de la reactivasa de la glicerol deshidratasa [subunidad mayor, SEQ ID n.º 151 (región codificante) y 152 (proteína); y subunidad menor, SEQ ID n.º 153 (región codificante) y 154 (proteína)], se describen en Emptage et al., patente de los EE.UU. n.º
6.514.733 y en la patente internacional WO 2003089621. Se preparó un extracto bruto sin células de KLP23/pSYCO12 mediante los procedimientos conocidos por el experto en la técnica. Se realizó el ensayo enzimático en ausencia de luz en el tampón HEPES a 80 mM, pH 8,2, a 37 °C con 12 !M de la coenzima B12 y 10 mM del meso-2,3-butanodiol. La formación de 2-butanona se supervisó por HPLC (columna Shodex SH-1011 y columna de guarda SH-G con detección del índice de refracción; H2SO4 a 0,01 M como la fase móvil a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min y una temperatura de la columna de 50 °C; el tiempo de retención de la 2-butanona = 40,2 min). La velocidad de formación de la 2-butanona mediante la preparación de la glicerol deshidratasa se determinó que era de 0,4 nmol/min y mg de proteína bruta.
Ejemplo 18
Análisis estructural de las diol/glicerol deshidratasas mediante la generación y validación de un perfil de HMM para las diol/glicerol deshidratasas cuya actividad se ha demostrado experimentalmente
Las enzimas diol deshidratasa y glicerol deshidratasa pertenecen a las clases de enzimas 4.2.1.28 y 4.2.1.30, respectivamente. Las enzimas que hay en ambas clases son cada una un complejo de tres subunidades: mayor
(también llamada a), mediana (también llamada �) y menor (también llamada y). En algunas glicerol deshidratasas, las subunidades mayor y mediana se halló que estaban fusionadas.
Identificación de miembros de familia por la secuencia
La enzima butanodiol deshidratasa de Klebsiella oxytoca se utilizó como enzima prototípica para identificar una familia de enzimas diol y glicerol deshidratasas. La secuencia aminoacídica de las subunidades a (GenBank n.º BAA08099, SEQ ID n.º 8), � (GenBank n.º BAA08100; SEQ ID n.º 10) y y (GenBank n.º BAA08101; SEQ ID n.º 12) se utilizaron como secuencias de consulta en una búsqueda BLASTp contra la base de datos de proteínas no redundante de GenBank con los parámetros por defecto. Se extrajeron las secuencias con concordancias relevantes. La relevancia se juzgó mediante la puntuación del valor de E, definición de la proteína, detalles incluidos en el informe de GenBank para las proteínas coincidentes, y la revisión de la bibliografía del tema. Para la subunidad mayor, la salida de BLAST mostró una disminución abrupta del valor de E desde 10–20 a un valor de E de 1,5. Todas las secuencias coincidentes con un valor de E de 1,5 o mayor tenían definiciones incoherentes con las que eran deshidratasas. Muchas de estas secuencias estaban rotuladas como subunidades � de la ARN polimerasa dirigida por ADN. Había coincidencias con valores de E alrededor de 10–20 que no eran más que secuencias parciales. Las secuencias sin ninguna anotación se incluían si el valor de E era menor de 1,5.
Utilizando la subunidad a de la butanodiol deshidratasa de Klebsiella oxytoca como secuencia de consulta, se identificaron 50 homólogos que podrían ser miembros de esta familia de proteínas. Este grupo incluía algunas secuencias que no eran proteínas completas. Las secuencias completas identificadas para la familia de la subunidad a de las diol/glicerol deshidratasas son el prototipo SEQ ID n.º 8 y las SEQ ID n.º 3, 99, 105, 135, 138, 141, 146, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 130, 243, 254, 255, 256, 257, 258 y 259. Las SEQ ID n.º 233, 235, 237, 239, 241, 246, 247 incluyen las subunidades a y
�, que están fusionadas en estos casos.
Utilizando la subunidad � de la butanodiol deshidratasa de Klebsiella oxytoca como secuencia de consulta, se identificaron 51 homólogos que podrían ser miembros de esta familia de proteínas. Este grupo incluía algunas secuencias que no eran proteínas completas. Las secuencias completas identificadas para la familia de la subunidad
� de las diol/glicerol deshidratasas son el prototipo SEQ ID n.º 10 y las SEQ ID n.º 95, 101, 107, 136, 139, 142, 148, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 244, 250, 252, 260, 261, 262, 263, 364, 265, 266 y 167.
Utilizando la subunidad y de la butanodiol deshidratasa de Klebsiella oxytoca como secuencia de consulta, se identificaron 48 homólogos que podrían ser miembros de esta familia de proteínas. Este grupo incluía algunas secuencias que no eran proteínas completas. Las secuencias completas identificadas para la familia de la subunidad y de las diol/glicerol deshidratasas son el prototipo SEQ ID n.º 12 y las SEQ ID n.º 97, 103, 109, 137, 140, 143, 150, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 245, 248, 249, 251, 253, 268, 270, 271, 272, 273 y 274.
Identificación de miembros de familia cuya función se ha valorado experimentalmente
Para cada secuencia identificada por el análisis descrito anteriormente, en las bases de datos BRENDA, UniProt y Entrez del NCBI se llevó a cabo una búsqueda para encontrar pruebas experimentales de su función bioquímica. BRENDA es una base de datos revisada a mano por un humano que contiene información detallada sobre las propiedades cinéticas, físicas y bioquímicas de la enzima extraídas de la bibliografía experimental y con enlaces a las bases de datos oportunas (Cologne University BioInformatics Center). La UniProt Knowledgebase se compone de una parte revisada a mano por un humano, la base de datos Swiss-Prot, y un complemento anotado a máquina, la base de datos TrEMBL. La base de datos Swiss-Prot revisada a mano (Swiss Institute of Bionformatics) proporciona una anotación de las proteínas de alto nivel que incluye la arquitectura de dominios, las modificaciones postraduccionales y variantes de secuencia. Entrez del NCBI es el sistema integrado de búsqueda basado en texto y de recuperación utilizado en el NCBI (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD) para las bases de datos importantes, entre ellas PubMed, secuencias de nuceótidos y proteínas, estructuras proteicas, genomas completos y taxonomía.
Mediante el análisis de la información y de las referencias identificadas de estas bases de datos, se identificaron ocho diol/glicerol deshidratasas cuya función se ha verificado experimentalmente que es una diol o glicerol deshidratasa. Se ofrecen en la tabla 10.
Tabla 10
Diol/glicerol deshidratasas cuya función se ha verificado experimentalmente
Organismo
Subunidad GenBank n.º SEQ ID n.º Tipo Referencia
Klebsiella oxytoca
Mayor gi|6980836 8 diol Shibata et al., Structure 1999; 7:
Diol/glicerol deshidratasas cuya función se ha verificado experimentalmente
Organismo
Subunidad GenBank n.º SEQ ID n.º Tipo Referencia
K. oxytoca
Mediana gi|6980837 10 diol 997-1008
K. oxytoca
Menor gi|6980838 12 diol
Klebsiella pneumoniae
Mayor gi|4063702 105 diol Tobimatsu et al., 1998; Biosci. Biotechnol. Biochem. 62: 1774-1777
K. pneumoniae
Mediana gi|94470233 107 diol
K. pneumoniae
Meno gi|4063704 109 diol
Clostridium pasteurianum
Mayor gi|3360389 135 glicerol Macis et al., FEMS Microbiol. Lett. 1998; 164 (1): 21-8
C. pasteurianum
Mediana gi|3360390 136 glicerol
C. pasteurianum
Menor gi|3360391 137 glicerol
Escherichia blattae
Mayor gi|60099613 138 glicerol Sönke et al., J. of Mol. Micro. and Biotech. 2004; 8: 150-168
E. blattae
Mediana gi|57340191 139 glicerol
E. blattae
Menor gi|57340192 140 glicerol
Klebsiella pneumoniae
Mayor gi|24158719 146 glicerol Williard, Thesis (1994), U of Wisconsin-Madison
K. pneumoniae
Mediana gi|24158720 148 glicerol
K. pneumoniae
Menor gi|24158721 150 glicerol
Citrobacter freundii
Mayor gi|1169287 141 glicerol Seyfried, Gottsschalk; J. Bacteriol. 178: 5793-5796 (1996)
C. freundii
Mediana gi|1229154 142 glicerol
C. freundii
Menor gi|1229155 143 glicerol
Lactobacillus brevis
Mayor gi|116334196 164 diol Schuetz y Radler, 1984; Arch. Microbiol. 139, 366-370
L. brevis
Mediana gi|116334195 165 diol
L. brevis
Menor gi|116334194 166 diol
Lactobacillus collinoides
Mayor gi|18857678 99 diol Sauvageot et al., 2002; Eur. J. Biochem. 269 (22): 5731-7.
L. collinoides
Mediana gi|18857679 101 diol
L. collinoides
Menor gi|18857680 103 diol
El conjunto de 8 secuencias aminoacídicas de cada subunidad de las diol/glicerol deshidratasas con una función determinada experimentalmente, recogidas en la tabla 10, se compararon haciendo un alineamiento múltiple de secuencias con ClustalW con los parámetros por defecto. El % de identidad para las secuencias de las subunidades mayores oscilaba del 97,6% al 58,4%. El % de identidad para las secuencias de las subunidades medianas oscilaba
5 del 89,5% al 41,7%. El % de identidad para las secuencias de las subunidades menores oscilaba del 88,3% al 36,4%. Así pues, la cantidad de identidad de secuencia entre algunas secuencias de subunidades fue muy baja (tal como 36,4%, 41,7%), incluso aunque se supiera que estas subunidades eran componentes de enzimas conocidas porque los datos experimentales indicaban que realizan la misma función. El bajo valor de % de identidad de secuencia hizo que el uso de este criterio para las correlaciones de estructura/función fuera impracticable.
10 Relación entre las secuencias de las diol/glicerol deshidratasas con verificación experimental y otras diol/glicerol deshidratasas
Para realizar este análisis, las secuencias muy redundantes que tienen una identidad de > 95% se retiraron del conjunto de secuencias para las subunidades mayores, medianas o menores, a excepción de todas las secuencias cuya función estuviera verificada experimentalmente, que se conservaron. También se retiraron las secuencias de proteínas truncadas o parciales. Se realizó usando ClustalW con los parámetros por defecto un alineamiento múltiple de secuencias con las secuencias que quedaban. El % de identidad para las subunidades mayores oscilaba del 97,6% (el % más alto es de secuencias que se verificaron experimentalmente varias veces) al 42,8%. El % de identidad para las subunidades medianas oscilaba del 91,9% al 26,4%. El % de identidad para las subunidades menores oscilaba del 85,2% al 20,5%. Estos % de identidad son intervalos similares a los % de identidad para las secuencias con verificación experimental.
Basándose en los alineamientos múltiples de secuencias, se construyeron árboles filogenéticos con el algoritmo Neighbor Joining (que viene implementado en el paquete informático MEGA, versión 3.1; Kumar et al., 2004, Briefings in Bioinformatics 5: 150-163). Los árboles filogenéticos se muestran en las figuras 2 (subunidad mayor), 3 (subunidad mediana) y 4 (subunidad menor), en donde cada identidad de secuencia mapeada se recoge en una clave para cada figura. Tal y como se observa de las posiciones marcadas para las secuencias cuya función se ha verificado experimentalmente (en círculos grises oscuro y claro para la diol deshidratasa y para la glicerol deshidratasa, respectivamente), estas secuencias se extienden por la mayor parte del árbol. Sin embargo, cada árbol incluye una rama con miembros sin verificación experimental, pero que parecen pertenecer a la familia de las diol/glicerol deshidratasas.
Construcción de un perfil de modelo oculto de Markov (HMM) de la familia de las diol/glicerol deshidratasas basado en los conjuntos de ocho secuencias de subunidades
Una caracterización alternativa de la estructura/función de los conjuntos de subunidades de la familia de enzimas de las diol/glicerol deshidratasas se realizó utilizando el paquete informático HMMER (la teoría en la que se fundamenta el perfil de HMM es describe en R. Durbin, S. Eddy, A. Krogh y G. Mitchison, Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids, Cambridge University Press, 1998; Krogh et al., 1994, J. Mol. Biol.
235: 1501-1531), siguiendo la guía del usuario de HMMER que está disponible (Janelia Farm Research Campus, Ashburn, VA).
Cada conjunto de 8 secuencias aminoacídicas para las subunidades mayores, medianas y menores de las diol/glicerol deshidratasas caracterizadas funcionalmente (en la tabla 10) se analizó por separado con el programa informático HMMER. La salida del programa informático HMMER es un perfil de modelo oculto de Markov (HMM) que caracteriza las secuencias de entrada. Tal y como se menciona en la guía del usuario, los perfiles de HMM son modelos estadísticos de alineamientos múltiples de secuencias. Capturan información específica en cada posición en relación con lo conservada que está cada columna del alineamiento, y qué restos aminoacídicos es más probable que aparezcan en cada posición. Así pues, los HMM tienen una base probabilística formal. Los perfiles de HMM para un gran número de familias de proteínas están disponibles públicamente en la base de datos PFAM (Janelia Farm Research Campus, Ashburn, VA).
Cada perfil de HMM se construyó del siguiente modo:
Etapa 1. Construcción de un alineamiento de secuencias
Las ocho secuencias para la subunidad mayor de las diol/glicerol deshidratasas verificadas funcionalmente (SEQ ID n.º 8, 99, 105, 135, 138, 141, 146 y 164) se alinearon con Clustal W con los parámetros por defecto. Se hizo lo mismo para el conjunto de secuencias de las subunidades medianas (SEQ ID n.º 10, 101, 107, 136, 139, 142, 148 y 165) y el conjunto de secuencias de las subunidades menores (SEQ ID n.º 12, 103, 109, 137, 140, 143, 150 y 166).
Etapa 2. Construcción de un perfil de HMM
El programa hmmbuild se ejecutó con cada conjunto de las secuencias alineadas utilizando los parámetros por defecto. hmmbuild lee el archivo del alineamiento múltiple de secuencias, construye un nuevo perfil de HMM, y guarda el perfil de HMM en el archivo. Con este programa se generó un perfil sin calibrar a partir de los alineamientos múltiples para cada conjunto de secuencias de subunidades descritas anteriormente.
La siguiente información basada en la guía del usuario del programa informático HMMER ofrece cierta descripción del modo en el que el programa hmmbuild prepara un perfil de HMM. Un perfil de HMM es capaz de modelar alineamiento con huecos, p. ej., que incluyan inserciones y deleciones, lo que permite que el programa informático describa un dominio conservado completo (en vez de un motivo pequeño sin huecos). Las inserciones y deleciones se modelan utilizando estados de inserción (I) y estados de deleción (D). Todas las columnas que contienen más de una determinada fracción x de caracteres de hueco se asignarán como una columna insertada. Por defecto, x está puesto a 0,5. Cada estado de concordancia tiene un estado I y D asociado a él. En HMMER, un grupo de tres estados (M/D/I) en la misma posición de consenso en el alineamiento se denomina «nodo». Estos estados están interconectados con flechas denominadas probabilidades de transición de estado. Los estados M y I son emisores, mientras que los estados D son silenciosos. Las transiciones están dispuestas de tal manera que en cada nodo, o bien se usa el estado M (y se alinea y puntúa un resto) o bien se usa el estado D (y no se alinea ningún resto, lo que da lugar a un carácter de hueco-deleción, «-»). Las inserciones se producen entre nodos, y los estados I tienen una
autotransición, lo que permite que aparezcan uno o más restos insertados entre columnas de consenso.
Las puntuaciones de los restos en un estado de concordancia (a saber, puntuaciones de emisión del estado de concordancia) o un estado de inserción (a saber, puntuaciones de emisión del estado de inserción) son proporcionales al log2(p_x)/(null_x). Donde p_x es la probabilidad de que un resto aminoacídico esté en una posición
5 concreta del alineamiento, de acuerdo con el perfil de HMM, y null_x es la probabilidad de acuerdo con el modelo nulo. El modelo nulo es un modelo probabilístico de un estado sencillo con un conjunto calculado previamente de probabilidades de emisión para cada uno de los 20 aminoácidos procedentes de la distribución de aminoácidos en la versión 24 de SWISSPROT.
Las puntuaciones de transición de estado también se calculan como parámetros de probabilidad logarítmica y son 10 proporcionales al log2 (t_x). En donde t_x es la probabilidad de transitar a un estado emisor o no emisor.
Etapa 3. Calibración del perfil de HMM
Cada perfil de HMM se leyó con hmmcalibrate, que puntúa un gran número de secuencias aleatorias sintéticas con el perfil (el número por defecto de secuencias sintéticas utilizado es 5000), ajusta una distribución de valores extremos (EVD, por su nombre en inglés) al histograma de estas puntuaciones y vuelve a guardar el archivo HMM 15 que ahora incluye los parámetros de la EVD. Estos parámetros de la DVE (μ y A) se utilizan para calcular los valores de E de las puntuaciones de bits cuando el perfil se usa para buscar en una base de datos de secuencias de proteínas. hmmcalibrate escribe dos parámetros en el archivo HMM en una línea etiquetada como «EVD»: estos parámetros son los parámetros μ (localización) y A (escala) de una distribución de valores extremos (EVD) que ajusta mejor un histograma de puntuaciones calculadas sobre secuencias generadas aleatoriamente de
20 aproximadamente la misma longitud y composición de restos que SWISSPROT. Esta calibración se hizo una vez para cada perfil de HMM.
Los perfiles de HMM calibrados para los conjuntos de subunidades mayores, medianas y pequeñas de secuencias se ofrecen en el apéndice como matrices Excel del perfil de HMM de a, perfil de HMM de � y perfil de HMM de y. Cada perfil de HMM es ofrece en una matriz que presenta la probabilidad de que cada aminoácido aparezca en cada
25 posición en la secuencia aminoacídica. Se resalta la probabilidad más alta para cada posición. La tabla 11 muestra unas pocas líneas del perfil de HMM preparado para las subunidades mayores de las diol/glicerol deshidratasas cuya función se ha verificado experimentalmente.
Tabla 11
Una porción del perfil de HMM de la subunidad mayor
Los aminoácidos se representan mediante el código de una letra.
La primera línea para cada posición describe las puntuaciones de emisión de la concordancia: la probabilidad de que cada aminoácido esté en ese estado (se resalta la puntuación más alta). La segunda línea describe las puntuaciones de emisión de las inserciones, y la tercera línea describe las puntuaciones de transición de estado: M-M, M-I,
35 M-D; I-M, I-I; D-M, D-D; B-M; M-E.
La tabla 11 muestra que para las subunidades mayores, la metionina tiene una probabilidad 4141 de estar en la primera posición, y es la probabilidad más alta y por eso se resalta. En la segunda posición, la lisina tiene la probabilidad más alta, que es 1954. En la tercera posición, la arginina tiene la probabilidad más alta, que es 3077.
Etapa 4. Prueba de la especificidad y de la sensibilidad de perfiles de HMM construidos
40 Cada perfil de HMM se evaluó con hmmsearch, que lee un perfil de HMM desde el archivo del HMM (hmmfile) y busca en un archivo de secuencia las concordancias de secuencia significativamente similares. El archivo de secuencia para la búsqueda fue la base de datos de proteínas no redundante GenBank. El tamaño de la base de datos (parámetro Z) se fijó a 1.000 millones. Este ajuste del tamaño asegura que los valores de E significativos contra la base de datos actual permanecerán significativos en el futuro inmediato. El valor de corte del valor de E se
fijó a 10.
Los perfiles de HMM para las subunidades mayores, medianas y pequeñas de las diol/glicerol deshidratasas cuya función se ha verificado experimentalmente eran específicos porque sólo se recuperaron subunidades de las diol/glicerol deshidratasas, según indicaba la anotación de las secuencias concordantes, y eran sensibles porque se recuperaron incluso las secuencias parciales de subunidades de las diol/glicerol deshidratasas. Cada una de las secuencias recuperadas tenía un valor de E de 0,01 o menos.
Todas las secuencias de los árboles filogenéticos de las figuras 2, 3 y 4 se recuperaron por concordar con el perfil de HMM. Concordaban todas las secuencias de las ramas de los árboles que contenían secuencias cuya función no estaba verificada experimentalmente. Así pues, todas las diol y glicerol deshidratasas quedaban conectadas con las 8 diol y glicerol deshidratasas cuya función se había verificado experimentalmente a través de la concordancia con los perfiles de HMM para las subunidades mayores, medianas y menores de las enzimas. Las subunidades completas de las diol y glicerol deshidratasas que concuerdan con los perfiles de HMM tienen las siguientes SEQ ID n.º:
Subunidades mayores (a); 8, 93, 99, 105, 135, 138, 141, 146, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 130, 243, 254, 255, 256, 257, 258 y 259. Las subunidades medianas + mayores fusionadas (la porción de la subunidad mayor y de la subunidad mediana concuerdan con el perfil para la mayor y el perfil para la mediana, respectivamente): 233, 235, 237, 239, 241, 246 y 247.
Subunidades medianas (�), 10, 95, 101, 107, 136, 139, 142, 148, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 244, 250, 252, 260, 261, 262, 263, 364, 265, 266 y
167.
Subunidades pequeñas (y): 12, 97, 103, 109, 137, 140, 143, 150, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 245, 248, 249, 251, 253, 268, 270, 271, 272, 273 y 274.
Este análisis muestra que el perfil de HMM para cada subunidad, que se preparó con las secuencias cuya función estaba verificada experimentalmente, proporciona una estructura que está relacionada con la función de las enzimas diol/glicerol deshidratasas. La concordancia de todas las secuencias anteriores con los perfiles de HMM a su vez proporciona una conexión entre la estructura y la función para esas secuencias.
Tabla 12
HMMER 2.0 [2.3.2] Nombre y versión del programa NAME alpha_exp_seqs Nombre del archivo de entrada con el alineamiento de las secuencias LENG 557 Longitud del alineamiento: incluye indelsALPH Amino Tipo d
e restos
MAP yes Mapa de los estados de la concordancia con las columnas del alineamiento
COM hmmbuild apha.hmm Comandos utilizados para generar el archivo: este significa que se aplicó hmmbuild (con los parámetros por defecto) al
alpha_exp_seqs.aln archivo de alineamiento. COM hmmcalibrate alpha.htm Comandos utilizados para generar el archivo: este significa que se aplicó hmmcalibrate (con los parámetros por defecto)
al perfil de HMM.
NSEQ 8 Número de secuencias en el archivo de alineamiento.
DATE Fri Mar 30 19:02:15 2007 Cuando se generó el archivo.
XT -8455 -4 -1000 -1000 -8455 -4 -8455 -4
NULT -4 -8455 La distribución de probabilidad de transición para el modelo nulo (estado G único)
NULE 595 -1558 85 338 -294 453 -1158 197 249 902 -1085 -142 -21 -313 45 531 201 384 -1998 -644La distribución de la probabilidad de emisión del símbolo para el modelo nulo (estado G); (p. ej., 4 o 20) enteros. Laprobabilidad de nulo que se utiliza para convertirlos en las probabilidades del modelo es 1/K.
EVD-264.989197 0.112643 Los parámetros de distribución de valores extremos ! y A, respectivamente; ambos valores son de punto flotante. A espositivo y diferente de cero. Estos valores se fijan cuando el modelo se calibra con hmmcalibrate.
TABLA 13
HMMER 2.0 [2.3.2]NAME beta_exp_seqsLENG 238ALPH AminoRF noCS noMAP yesCOM hmmbuild beta_hmm2 beta_exp_seqs.a COM hmmcalibrate beta_hmm2 NSEQ 8DATE Fri Mar 30 18:30:25 2007 CKSUM 9853
XT -8455 -4 -1000 -1000 -8455 -4 -8455 -4 NULT -4 -8455 NULE 595 -1558 85 338 -294 453 -1158 197 902 -1085 -142 -21 -313 45 531 201 384 -1998 -644
Evd-152.743744 0.132052
TABLA 14
HMMER 2.0 [2.3.2]NAME gamma_exp_seqsLENG 175ALPH AminoRF noCS noMAP yesCOM hmmbuild gamma_hmm3 gamma_exp_seqs.a COM hmmcalibrate gamma_hmm3 NSEQ 8DATE Fri Mar 30 18:50:16 2007 CKSUM 2849
XT -8455 -4 -1000 -1000 -8455 -4 -8455 -4 NULT -4 -8455 NULE 595 -1558 85 338 -294 453 -1158 197 902 -1085 -142 -21 -313 45 531 201 384 -1998 -644
EVD—145.815587 0.162883
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> E.I. du Pont de Nemours and Co.
<120> Producción fermentativa de alcoholes de cuatro carbonos
<130> CL3893 PCT 5 <160> 275
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 780
<212> ADN 10 <213> Klebsiella pneumoniae
<400> 1
<210> 2
<211>
259 15 <212> PRT
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 2
<210> 3
<211> 1680
<212> ADN
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 3
<210> 4
<211> 559
<212> PRT
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 4
<210> 5
<211> 771
<212> ADN
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 5
<210> 6
<211> 256
<212> PRT
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 6
<210> 7
<211> 1665
<212> ADN
<213> Klebsiella oxytoca
<400> 7
<210> 8
<211> 554
<212> PRT
<213> Klebsiella oxytoca
<400> 8
<210> 9
<211> 675
<212> ADN
<213> Klebsiella oxytoca
<400> 9
<210> 10
<211> 224
<212> PRT
<213> Klebsiella oxytoca
<400> 10
<210> 11
<211>
522 10 <212> ADN
<213> Klebsiella oxytoca
<400> 11
<210> 12
<211> 173
<212> PRT
<213> Klebsiella oxytoca
<400> 12
<210> 13 10 <211> 1041
<212> ADN
<213> Rhodococcus ruber
<400> 13
<210> 14
<211> 346
<212> PRT
<213> Klebsiella oxytoca
<400> 14
<210> 15
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 15 caccatggac aaacagtatc cggtacgcc
<210> 16
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 16 cgaagggcga tagctttacc aatcc
<210> 17
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 17 caccatgaat cattctgctg aatgcacctg cg
<210> 18
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 18 gatactgttt gtccatgtga cc
<210> 19
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 19 caccatgaaa aaagtcgcac ttgttacc
<210> 20
<211> 15
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 20 ttagttaaat accat
<210> 21
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 21 caccatgaga tcgaaaagat ttg
<210> 22
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 22 cttagagaag ttaatcgtcg cc
<210> 23
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 23 caccatgaaa gccctccagt acacc
<210> 24
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 24 cgtcgtgtca tgcccggg
<210> 25
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 25 gatcgaattc gtttaaactt agttttctac cgcacg
<210> 26 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador
<400> 26 gatcgcatgc aagctttcat atagtcggaa ttcc
34
<210> 27 <211> 43 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador
<400> 27 gatcgaattc gtttaaacaa aggaggtctg attcatgaga tcg
43
<210> 28 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador
<400> 28 gatcggattc ttaatcgtcg cc
22
<210> 29 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador
<400> 29 gatcggatcc aaaggaggtc gggcgcatga aagccc
36
<210> 30 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador
<400> 30 gatctctaga aagctttcag cccgggacga cc
32
<210> 31 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador
<400> 31 actttctttc gcctgtttca c
21
<210> 32 <211> 79 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador
<400> 32 catgaagctt gtttaaactc ggtgaccttg aaaataatga aaacttatat tgttttgaaa
60
ataatgaaaa cttatattg
79
<210> 33 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador BABC F
<400> 33 gagctcgaat tcaaaggagg aagtgtatat gaatcattc
39
<210> 34 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador BAB R
<400> 34 ggatcctcta gaattagtta aataccatcc cgccg
35
<210> 35 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador M13 Directo
<400> 35 gtaaaacgac ggccagt
17
<210> 36 <211> 16 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador M13 Inverso
<400> 36 aacagctatg accatg
16
<210> 37 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador N83 seqF2
<400> 37 gctggattac cagctcgacc
20
<210> 38 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador N83seqF3
<400> 38 cggacgcatt accggcaaag
20
<210> 39 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador N84 seqR4
<400> 39 cgaagcgaga gaagttatcc
20
<210> 40 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador BC Spe F
<400> 40 actagtaaag gaggaaagag tatgaagaag gtcgcact
38
<210> 41 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador BC xba R
<400> 41 tctagaaagc aggggcaagc catgtc
26
<210> 42 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador Trc F
<400> 42 ttgacaatta atcatccggc
20
<210> 43 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador Trc R
<400> 43 cttctctcat ccgccaaaac
20
<210> 44 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador DDO For
<400> 44 aagcttaaag gaggctgatt catgagatcg aaaagatt
<210> 45
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador DDO Rev
<400> 45 tctagattat tcatcctgct gttctcc
<210> 46
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador DDko seq F2
<400> 46 gcatggcgcg gatttgacga ac
<210> 47
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador DDko seq F5
<400> 47 cattaaagag accaagtacg tg
<210> 48
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador DDko seq F7
<400> 48 atatcctggt ggtgtcgtcg gcgt
<210> 49
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador DDko seq F9
<400> 49 tctttgtcac caacgccctg cg
<210> 50
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador DDko seq R1
<400> 50 gcccaccgcg ctcgccgccg cg
<210> 51 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador DDko seq R3
<400> 51 cccccaggat ggcggcttcg gc
22
<210> 52 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador DDko seq R7
<400> 52 gggccgacgg cgataatcac tt
22
<210> 53 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador DDko seq R10
<400> 53 ttcttcgatc cactccttaa cg
22
<210> 54 <211> 56 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador ChnA F
<400> 54 catcaattga ctacgtagtc gtacgtgtaa ggaggtttga aatggaaaaa attatg
56
<210> 55 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador ChnA R
<400> 55 catgctagcc ccgggtatct tctactcatt ttttatttcg
40
<210> 56 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Cebador chnseq F1
<400> 56 ctcaacaggg tgtaagtgta gt
22
<210> 57 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador chnseq R1
<400> 57 cgttttgata tagccaggat gt
22
<210> 58 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador Top ter F1
<400> 58 ctagaagtca aaagcctccg accggaggct tttga
35
<210> 59 <211> 60 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador Top ter F2
<400> 59 ctgctcgagt tgctagcaag tttaaacaaa aaaaagcccg ctcattaggc gggctgagct
60
<210> 60 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador Bot ter R1
<400> 60 cagcccgcct aatgagcggg cttttttttg tttaaac
37
<210> 61 <211> 50 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador Bot ter R2
<400> 61 ttgctagcaa ctcgagcagt caaaagcctc cggtcggagg cttttgactt
50
<210> 62 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador pCL1925 vec F
<400> 62 cggtatcatc aacaggctta cc
22
<210> 63 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador pCL1925 vec R1
<400> 63 agggttttcc cagtcacgac gt
22
5
<210> 64 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador pCL1925 vec R2
10
<400> 64 cgcaatagtt ggcgaagtaa tc 22
15
<210> 65 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador N84 Seq R2
<400> 65 gcatcgagat tatcgggatg
20
20
<210> 66 <211> 208 <212> ADN <213> Escherichia coli
<400> 66
<210> 67 <211> 42 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
30
<220> <223> variante del promotor 1.6GI
<400> 67 gcccttgaca atgccacatc ctgagcaaat aattcaacca ct
42
35
<210> 68 <211> 42 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> promotor 1.5 GI
40
<400> 68 gcccttgact atgccacatc ctgagcaaat aattcaacca ct 42
45
<210> 69 <211> 3240 <212> ADN <213> Klebsiella oxytoca
<400> 69
<210> 70
<211> 2640
<212> ADN
<213> Klebsiella oxytoca
<400> 70
<210> 71
<211> 756
<212> ADN
<213> Acinetobacter sp.
<400> 71
<210> 72
<211> 251
<212> PRT 10 <213> acinetobacter sp.
<400> 72
<210> 73
<211> 17417
<212> ADN
<213> Acinetobacter sp.
<400> 73
<210> 74
<211> 1164
<212> ADN
<213> Escherichia coli
<400> 74
<210> 75
<211> 387
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 75
<210> 76
<211> 1623
<212> ADN
<213> Bacillus subtilis
<400> 76
<210> 77
<211> 540
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 77
<210> 78
<211> 1680
<212> ADN
<213> Klebsiella terrigena
<400> 78
<210> 79
<211> 559
<212> PRT
<213> Klebsiella terrigena
<400> 79
<210> 80
<211> 768
<212> ADN
<213> Bacillus subtilis
<400> 80
<210> 81
<211> 255
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 81
<210> 82
<211> 780
<212> ADN
<213> Klebsiella terrigena
<400> 82
<210> 83 10 <211> 259
<212> PRT
<213> Klebsiella terrigena
<400> 83
<210> 84
<211> 1053
<212> ADN
<213> Bacillus cereus
<400> 84
<210> 85
<211> 350
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 85
<210> 86
<211> 1053
<212> ADN
<213> Bacillus cereus
<400> 86
<210> 87
<211>
350 10 <212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 87
<210> 88
<211> 1113
<212> ADN
<213> Lactococcus lactis
<400> 88
<210> 89
<211>
370 10 <212> PRT
<213> Lactococcus lactis
<400> 89
<210> 90
<211> 705
<212> ADN
<213> Pyrococcus furiosus
<400> 90
<210> 91
<211>
234 10 <212> PRT
<213> Pyrococcus furiosus
<400> 91
<210> 92
<211> 1665
<212> ADN
<213> salmonella typhimurium
<400> 92
<210> 93
<211> 554
<212> PRT
<213> Salmonella typhimurium
<400> 93
<210> 94
<211> 675
<212> ADN
<213> Salmonella typhimurium
<400> 94
<210> 95
<211> 224
<212> PRT
<213> Salmonella typhimurium
<400> 95
<210> 96
<211> 522
<212> ADN
<213> salmonella typhimurium
<400> 96
<210> 97
<211>
173 10 <212> PRT
<213> salmonella typhimurium
<400> 97
<210> 98
<211> 1677
<212> ADN
<213> Lactobacillus collinoides
<400> 98
<210> 99
<211> 558
<212> PRT
<213> Lactobacillus collinoides
<400> 99
<210> 100
<211> 693
<212> ADN
<213> Lactobacillus collinoides
<400> 100
<210> 101
<211> 230
<212> PRT
<213> Lactobacillus collinoides
<400> 101
<210> 102
<211> 522
<212> ADN
<213> Lactobacillus collinoides
<400> 102
<210> 103
<211>
173 10 <212> PRT
<213> Lactobacillus collinoides
<400> 103
<210> 104
<211> 1665
<212> ADN
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 104
<210> 105
<211> 554
<212> PRT
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 105
<210> 106
<211> 687
<212> ADN
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 106
<210> 107
<211>
228 10 <212> PRT
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 107
<210> 108
<211> 525
<212> ADN
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 108
<210> 109
<211> 174
<212> PRT
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 109
<210> 110 10 <211> 1833
<212> ADN
<213> Klebsiella oxytoca
<400> 110
<210> 111
<211> 610
<212> PRT
<213> Klebsiella oxytoca
<400> 111
<210> 112
<211> 378
<212> ADN
<213> Klebsiella oxytoca
<400> 112
<210> 113
<211>
125 10 <212> PRT
<213> Klebsiella oxytoca
<400> 113
<210> 114
<211> 1833
<212> ADN
<213> salmonella typhimurium
<400> 114
<210> 115
<211> 610
<212> PRT
<213> Salmonella typhimurium
<400> 115
<210> 116
<211> 372
<212> ADN
<213> Salmonella typhimurium
<400> 116
<210> 117
<211> 123
<212> PRT
<213> salmonella typhimurium
<400> 117
<210> 118
<211>
1833 10 <212> ADN
<213> Lactobacillus collinoides
<400> 118
<210> 119
<211> 610
<212> PRT
<213> Lactobacillus collinoides
<400> 119
<210> 120
<211> 351
<212> ADN
<213> Lactobacillus collinoides
<400> 120
<210> 121
<211>
116 10 <212> PRT
<213> Lactobacillus collinoides
<400> 121
<210> 122
<211> 453
<212> PRT
<213> vibrio fluvialis
<400> 122
<210> 123
<211> 1122
<212> ADN
<213> Erwinia caratovora subsp. atroseptica
<400> 123
<210> 124
<211> 374
<212> PRT
<213> Erwinia caratovora subsp. atroseptica
<400> 124
<210> 125
<211> 1272
<212> ADN
<213> Erwinia caratovora subsp. atroseptica
<400> 125
<210> 126
<211>
424 10 <212> PRT
<213> Erwinia caratovora subsp. atroseptica
<400> 126
5
<210> 127 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Cebador
<400> 127 ctccggaatt catgtctgac ggacgactca ccgca
35
10
<210> 128 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
15
<220> <223> Cebador
<400> 128 ttccaatgca ttggctgcag ttatctctgt gcacgagtgc cgatga
46
20
<210> 129 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Cebador
<400> 129 aacagccaag cttggctgca gtcatcgcgc attctccggg
40
5
<210> 130 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Cebador
10
<400> 130 tctccggaat tcatgacgtc tgaaatgaca gcgacagaag 40
<210> 131 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial
15
<220> <223> Cebador
<400> 131 gctaacagga ggaagaattc atggggggtt ctc
33
20
<210> 132 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador
25
<400> 132 gagaaccccc catgaattct tcctcctgtt agc 33
30
<210> 133 <211> 723 <212> ADN <213> Klebsiella terrigena
<400> 133
<210> 134 35 <211> 241
<212> PRT
<213> Klebsiella terrigena
<400> 134
<210> 135
<211> 554
<212> PRT
<213> Clostridium pasteurianum
10 <400> 135
<210> 136
<211> 179
<212> PRT
<213> Clostridium pasteurianum
<400> 136
<210> 137
<211> 146
<212> PRT
<213> Clostridium pasteurianum
<400> 137
<210> 138
<211> 555 10 <212> PRT
<213> Escherichia blattae
<400> 138
<210> 139
<211> 196
<212> PRT
<213> Escherichia blattae
<400> 139
<210> 140 10 <211> 141
<212> PRT
<213> Escherichia blattae
<400> 140
<210> 141
<211> 555
<212> PRT
<213> Citrobacter freundii
<400> 141
<210> 142
<211> 194
<212> PRT
<213> Citrobacter freundii
<400> 142
<210> 143
<211> 142
<212> PRT
<213> Citrobacter freundii
<400> 143
<210> 144
<211> 1359
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Condón optimizado para la amina:piruvato transminasa de vibrio fluvialis
<400> 144
<210> 145
<211> 1668
<212> ADN
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 145
<210> 146
<211> 555
<212> PRT
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 146
<210> 147
<211> 585
<212> ADN
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 147
<210> 148
<211> 194 10 <212> PRT
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 148
<210> 149
<211> 426
<212> ADN
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 149
<210>
150 10 <211> 141
<212> PRT
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 150
<210> 151
<211> 1824
<212> ADN
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 151
<210> 152
<211> 607
<212> PRT
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 152
<210> 153
<211> 354
<212> ADN
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 153
<210> 154
<211> 117
<212> PRT
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 154
<210>
155 10 <211> 1125
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Codón optimizado para la amino alcohol cinasa de Erwinia caratovora subsp. atroseptica
15 <400> 155
<210> 156
<211> 1275
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Codón optimizado para la alcohol O-fosfato liasa de Erwinia caratovora subsp. Atroseptica
<400> 156
<210> 157
<211> 77
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 157
10 <210> 158
<211> 77
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Cebador
<400> 158
20
<210> 159 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador
25
<400> 159 ggacctgctt cgctttatcg 20
<210> 160
<211> 15 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador
<400> 160 gctagagatg atagc
15
<210> 161 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador
<400> 161 ggaagagact atccagcg
18
<210> 162 <211> 50 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador
<400> 162 gcgcgcccgg gaagaaggag ctcttcacca tgaacaaacc acagtcttgg
50
<210> 163 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador
<400> 163 gcgcgcccgg gttcatgcca cctctgcg
28
<210> 164 <211> 558 <212> PRT <213> Lactobacillus brevis
<400> 164
<210> 165
<211> 239
<212> PRT
<213> Lactobacillus brevis
<400> 165
<210> 166
<211> 175
<212> PRT
<213> Lactobacillus brevis
<400> 166
<210> 167
<211> 554
<212> PRT
<213> Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis
<400> 167
<210> 168
<211> 224
<212> PRT
<213> salmonella enterica subsp. enterica serovar choleraesuis str. SC-B67
<400> 168
<210> 169
<211> 173
<212> PRT
<213> salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis str. SC-B67
<400> 169
<210> 170
<211> 554
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 170
<210> 171
<211> 222
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 171
<210> 172
<211> 172
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 172
<210> 173
<211> 554
<212> PRT
<213> shigella sonnei
<400> 173
<210> 174
<211> 222
<212> PRT
<213> shigella sonnei
<400> 174
<210> 175
<211> 172
<212> PRT
<213> Shigella sonnei
<400> 175
<210> 176
<211> 554
<212> PRT
<213> Yersinia bercovieri
<400> 176
<210> 177
<211> 221
<212> PRT
<213> Yersinia bercovieri
<400> 177
<210> 178
<211> 174
<212> PRT
<213> Yersinia bercovieri
<400> 178
<210> 179
<211> 551
<212> PRT
<213> Yersinia mollaretii
<400> 179
<210> 180
<211> 224
<212> PRT
<213> Yersinia mollaretii
<400> 180
<210> 181
<211> 175
<212> PRT
<213> Yersinia mollaretii
<400> 181
<210> 182
<211> 554
<212> PRT
<213> Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica
<400> 182
<210> 183
<211> 223
<212> PRT
<213> Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica
<400> 183
<210> 184
<211> 174
<212> PRT
<213> Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica
<400> 184
<210> 185
<211> 554
<212> PRT
<213> Yersinia intermedia
<400> 185
<210> 186
<211> 224
<212> PRT
<213> Yersinia intermedia
<400> 186
<210> 187
<211> 175
<212> PRT
<213> Yersinia intermedia
<400> 187
<210> 188 10 <211> 554
<212> PRT
<213> Listeria welshimeri
<400> 188
<210> 189
<211> 219
<212> PRT
<213> Listeria welshimeri
<400> 189
<210> 190
<211> 170
<212> PRT
<213> Listeria welshimeri
<400> 190
<210> 191
<211> 554 10 <212> PRT
<213> Listeria innocua
<400> 191
<210> 192
<211> 219
<212> PRT
<213> Listeria innocua
<400> 192
<210> 193
<211> 170
<212> PRT 10 <213> Listeria innocua
<400> 193
<210> 194
<211> 554
<212> PRT
<213> Listeria monocytogenes
<400> 194
<210> 195
<211> 219
<212> PRT
<213> Listeria monocytogenes
<400> 195
<210> 196
<211> 170
<212> PRT
<213> Listeria monocytogenes
<400> 196
<210> 197
<211> 554
<212> PRT
<213> Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi
<400> 197
<210> 198
<211> 224
<212> PRT
<213> salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi
<400> 198
<210> 199
<211> 173
<212> PRT
<213> Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi
<400> 199
<210> 200
<211> 554
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 200
<210> 201
<211> 222
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 201
<210> 202
<211> 172
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 202
<210> 203
<211> 554
<212> PRT
<213> Listeria monocytogenes
<400> 203
<210> 204
<211> 219
<212> PRT
<213> Listeria monocytogenes
<400> 204
<210> 205
<211> 170
<212> PRT
<213> Listeria monocytogenes
<400> 205
<210> 206
<211> 553
<212> PRT
<213> Streptococcus sanguinis
<400> 206
<210> 207
<211> 222
<212> PRT
<213> streptococcus sanguinis
<400> 207
<210> 208
<211> 171
<212> PRT
<213> Streptococcus sanguinis
<400> 208
<210> 209
<211> 555
<212> PRT
<213> Escherichia blattae
<400> 209
<210> 210
<211> 196
<212> PRT
<213> Escherichia blattae
<400> 210
<210> 211
<211> 140
<212> PRT
<213> Escherichia blattae
<400> 211
<210> 212
<211> 554 10 <212> PRT
<213> Clostridium perfringens
<400> 212
<210> 213
<211> 190
<212> PRT
<213> Clostridium perfringens
<400> 213
<210>
214 10 <211> 141
<212> PRT
<213> Clostridium perfringens
<400> 214
<210> 215
<211> 408
<212> PRT
<213> Yersinia frederiksenii
<400> 215
<210> 216
<211> 224
<212> PRT
<213> Yersinia frederiksenii
<400> 216
<210> 217
<211> 175
<212> PRT
<213> Yersinia frederiksenii
<400> 217
<210>
218 10 <211> 554
<212> PRT
<213> Thermoanaerobacter ethanolicus
<400> 218
<210> 219
<211> 229
<212> PRT
<213> Thermoanaerobacter ethanolicus
<400> 219
<210> 220
<211> 182
<212> PRT
<213> Thermoanaerobacter ethanolicus
<400> 220
<210>
221 10 <211> 558
<212> PRT
<213> Lactobacillus hilgardii
<400> 221
<210> 222
<211> 217
<212> PRT
<213> Lactobacillus hilgardii
<400> 222
<210> 223
<211> 176
<212> PRT
<213> Lactobacillus hilgardii
<400> 223
<210> 224
<211>
558 10 <212> PRT
<213> Lactobacillus reuteri
<400> 224
<210> 225
<211> 236
<212> PRT
<213> Lactobacillus reuteri
<400> 225
<210> 226
<211>
172 10 <212> PRT
<213> Lactobacillus reuteri
<400> 226
<210> 227
<211> 558
<212> PRT
<213> Lactobacillus diolivorans
<400> 227
<210> 228
<211> 245
<212> PRT
<213> Lactobacillus diolivorans
<400> 228
<210> 229
<211> 180
<212> PRT 10 <213> Lactobacillus diolivorans
<400> 229
<210> 230
<211> 558
<212> PRT
<213> Lactobacillus reuteri
<400> 230
<210> 231
<211> 236
<212> PRT
<213> Lactobacillus reuteri
<400> 231
<210> 232
<211> 171
<212> PRT
<213> Lactobacillus reuteri
<400> 232
<210> 233
<211> 756 10 <212> PRT
<213> Mesorhizobium loti
<400> 233
<210> 234
<211> 139
<212> PRT
<213> Mesorhizobium loti
<400> 234
<210> 235
<211> 746
<212> PRT
<213> Mycobacterium vanbaalenii
<400> 235
<210> 236
<211> 119
<212> PRT
<213> Mycobacterium vanbaalenii
<400> 236
<210> 237 10 <211> 739
<212> PRT
<213> Mycobacterium sp.
<400> 237
<210> 238
<211> 110
<212> PRT
<213> Mycobacterium sp.
<400> 238
<210> 239
<211> 746
<212> PRT
<213> Mycobacterium flavescens
<400> 239
<210> 240
<211> 109
<212> PRT
<213> Mycobacterium flavescens
<400> 240
<210> 241
<211> 739 10 <212> PRT
<213> Mycobacterium sp.
<400> 241
<210> 242
<211> 110
<212> PRT
<213> Mycobacterium sp.
<400> 242
<210> 243
<211> 570
<212> PRT
<213> Mycobacterium smegmatis
<400> 243
<210> 244
<211> 200
<212> PRT
<213> Mycobacterium smegmatis
<400> 244
<210> 245
<211> 114
<212> PRT
<213> Mycobacterium smegmatis
<400> 245
<210> 246 10 <211> 754
<212> PRT
<213> Mycobacterium smegmatis
<400> 246
<210> 247
<211> 757
<212> PRT
<213> Mycobacterium smegmatis
<400> 247
<210> 248
<211> 142
<212> PRT
<213> Mycobacterium smegmatis
<400> 248
<210> 249
<211> 119
<212> PRT
<213> Mycobacterium smegmatis
<400> 249
<210> 250
<211> 224
<212> PRT
<213> salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi
<400> 250
<210> 251
<211>
173 10 <212> PRT
<213> salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi
<400> 251
<210> 252
<211> 188
<212> PRT
<213> Clostridium perfringens
<400> 252
<210> 253
<211> 141
<212> PRT
<213> Clostridium perfringens
<400> 253
<210> 254
<211> 554
<212> PRT
<213> salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium
<400> 254
<210> 255
<211> 524
<212> PRT
<213> Listeria monocytogenes
<400> 255
<210> 256
<211> 555
<212> PRT
<213> Escherichia blattae
<400> 256
<210> 257
<211> 555
<212> PRT
<213> no identificado
<400> 257
<210> 258
<211> 555
<212> PRT
<213> no identificado
<400> 258
<210> 259
<211> 556
<212> PRT
<213> Lactobacillus collinoides
<400> 259
<210> 260
<211> 224
<212> PRT
<213> no identificado
<400> 260
<210> 261
<211> 224
<212> PRT
<213> no identificado
<400> 261
<210> 262
<211> 194
<212> PRT
<213> no identificado
<400> 262
<210> 263
<211> 194
<212> PRT
<213> no identificado
<400> 263
<210> 264
<211>
194 10 <212> PRT
<213> no identificado
<400> 264
<210> 265
<211> 188
<212> PRT
<213> Clostridium perfringens
<400> 265
<210> 266
<211> 146
<212> PRT
<213> no identificado
<400> 266
<210> 267
<211> 148
<212> PRT
<213> Escherichia blattae
<400> 267
<210> 268
<211> 172
<212> PRT
<213> no identificado
<400> 268
<210> 269
<211>
121 10 <212> PRT
<213> no identificado
<400> 269
<210> 270
<211> 170
<212> PRT
<213> Listeria monocytogenes
<400> 270
<210> 271
<211> 142
<212> PRT
<213> no identificado
<400> 271
<210> 272
<211>
142 10 <212> PRT
<213> no identificado
<400> 272
<210> 273
<211> 142
<212> PRT
<213> no identificado
<400> 273
<210> 274
<211> 170
<212> PRT
<213> Listeria monocytogenes
<400> 274
<210> 275
<211>
2432 10 <212> ADN
<213> Erwinia caratovora subsp. atroseptica
<400> 275

Claims (20)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Célula hospedadora microbiana recombinante que comprende moléculas de ADN heterólogo que codifican polipéptidos que catalizan las conversiones de sustrato en producto: i) piruvato en a-acetolactato; ii) a-acetolactato en acetoína; iii) acetoína en 2,3-butanodiol; iv) 2,3-butanodiol en 2-butanona; y
    v) 2-butanona en 2-butanol; en donde dicha célula hospedadora microbiana produce 2-butanol.
  2. 2.
    Célula hospedadora microbiana recombinante que comprende moléculas de ADN heterólogo que codifican polipéptidos que catalizan las conversiones de sustrato en producto: i) piruvato en a-acetolactato; ii) a-acetolactato en acetoína; iii) acetoína en 2,3,butanodiol; y
    iv) 2,3-butanodiol en 2-butanona; en donde dicha célula hospedadora microbiana produce 2-butanona.
  3. 3.
    Célula hospedadora de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el polipéptido que cataliza una conversión de sustrato en producto de: a) piruvato en a-acetolactato es la acetolactato sintasa; b) a-acetolactato en acetoína es la acetolactato descarboxilasa; c) acetoína en 2,3-butanodiol es la butanodiol deshidrogenasa;
    d) 2,3-butanodiol en 2-butanona es la diol deshidratasa o glicerol deshidratasa; o e) 2-butanona en 2-butanol es la butanol deshidrogenasa.
  4. 4.
    Célula hospedadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la célula se selecciona del grupo que consiste en: una bacteria, una cianobacteria, un hongo filamentoso y una levadura.
  5. 5.
    Célula hospedadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la célula es un miembro del género seleccionado del grupo que consiste en Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Pichia, Candida, Hansenula y Saccharomyces.
  6. 6.
    Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 3, en donde:
    a) la acetolactato sintasa tiene una secuencia aminoacídica que tiene una identidad de al menos el 95% con una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 4, SEQ ID n.º 77 y SEQ ID n.º 79 basándose en el procedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0,1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas;
    b) la acetolactato descarboxilasa tiene una secuencia aminoacídica que tiene una identidad de al menos el 95% con una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 2, SEQ ID n.º 81 y SEQ ID n.º 83 basándose en el procedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetros pordefecto de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0,1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas; o
    c) la butanodiol deshidrogenasa tiene una secuencia aminoacídica que tiene una identidad de al menos el 95% con una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 6, SEQ ID n.º 85, SEQ ID n.º 87 y SEQ ID n.º 89 basándose en el procedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0,1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.
  7. 7. Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa comprende subunidades mayores, medianas y menores de longitud completa que dan cada una un parámetro de valor de E de 0,01 o menos cuando se consulta con un perfil de modelo oculto de Markov preparado con las subunidades mayores seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID n.º 8, 99, 105, 135, 138, 141, 146 y 164; las subunidades medianas seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID n.º 10, 101, 107, 136, 139, 142, 148 y 165; y las subunidades menores seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID n.º 12, 103, 109, 137, 140, 143, 150 y 166; cada consulta se lleva a cabo con el algoritmo hmmsearch, en donde el parámetro Z está fijado a
    1.000 millones.
  8. 8. Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa se identifica mediante un procedimiento que comprende las etapas de:
    a) a) generación de un perfil de modelo oculto de Markov a partir del alineamiento de las secuencias aminoacídicas que corresponden a las subunidades mayores, medianas y menores de las enzimas diol y glicerol deshidratasas, en donde:
    i) la subunidad mayor comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 8, 99, 105, 135, 138, 141, 146 y 164;
    ii) la subunidad mediana comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 10, 101, 107, 136, 139, 142, 148 y 165; y
    iii) la subunidad menor comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 12, 103, 109, 137, 140, 143, 150 y 166;
    b) con el perfil de modelo oculto de Markov de (a) se consulta al menos una base de datos pública de secuencias de proteínas que contiene secuencias de las diol y glicerol deshidratasas mediante el algoritmo hmmsearch, en donde el parámetro Z está fijado a 1.000 millones y el parámetro del valor de E está fijado a 0,01, para identificar un primer conjunto de datos de secuencias aminoacídicas de diol y glicerol deshidratasas; y
    c) eliminación de todas las secuencias parciales del primer conjunto de datos de (b) para generar un segundo conjunto de datos de secuencias aminoacídicas de diol y glicerol deshidratasas, en donde están identificadas las enzimas diol deshidratasa y glicerol deshidratasa.
  9. 9. Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa comprende una subunidad mayor que comprende una secuencia aminoacídica que tiene una identidad de al menos el 95% con una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 8, 93, 99, 105, 135, 138, 141, 146, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 130, 243, 254, 255, 256, 257, 258 y 259, basándose en el procedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0,1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.
    10 Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa comprende una subunidad mediana que comprende una secuencia aminoacídica que tiene una identidad de al menos el 95% con una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 10, 95, 101, 107, 136, 139, 142, 148, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 244, 250, 252, 260, 261, 262, 263, 364, 265, 266 y 167 basándose en el procedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0,1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.
  10. 11.
    Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa comprende una subunidad menor que comprende una secuencia aminoacídica que tiene una identidad de al menos el 95% con una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 12, 97, 103, 109, 137, 140, 143, 150, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 245, 248, 249, 251, 253, 268, 270, 271, 272, 273 y 274, basándose en el procedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetros por defecto de PENALIZACIÓNPOR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0,1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.
  11. 12.
    Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa comprende la fusión de subunidades mayores, medianas y menores que comprenden una secuencia aminoacídica que tiene una identidad de al menos el 95% con una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 233, 235, 237, 239, 241, 246 y 247, basándose en el procedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0,1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.
  12. 13.
    Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa comprende la fusión de subunidades mayores, medianas y menores y tiene una identidad de al menos el 95% con una secuencia aminoacídica que comprende las tres secuencias aminoacídicas que codifican las subunidades mayores, medianas y menores, seleccionadas del grupo que consiste en:
    a) SEQ ID n.º 8, SEQ ID n.º 10 y SEQ ID n.º 12; b) SEQ ID n.º 93, SEQ ID n.º 95 y SEQ ID n.º 97; c) SEQ ID n.º 99, SEQ ID n.º 101 y SEQ ID n.º 103; d) SEQ ID n.º 105, SEQ ID n.º 107 y SEQ ID n.º 109; e) SEQ ID n.º 135, SEQ ID n.º 136 y SEQ ID n.º 137; f) SEQ ID n.º 138, SEQ ID n.º 139 y SEQ ID n.º 140; g) SEQ ID n.º 146, SEQ ID n.º 148 y SEQ ID n.º 150; h) SEQ ID n.º 141, SEQ ID n.º 142 y SEQ ID n.º 143; y i) SEQ ID n.º 164, SEQ ID n.º 165 y SEQ ID n.º 166;
    basándose en el procedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetros por defecto de PENALIZACIÓNPOR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0,1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.
  13. 14.
    Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la butanol deshidrogenasa tiene una secuencia aminoacídica que tiene una identidad de al menos el 95% con una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 14, SEQ ID n.º 72, SEQ ID n.º 75 y SEQ ID n.º 91 basándose en elprocedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO = 0,1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.
  14. 15.
    Procedimiento para la producción de 2-butanol, que comprende:
    1) proporcionar una célula hospedadora microbiana recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 o 6 a 14; y
    2) poner en contacto la célula hospedadora de 1) con un sustrato de carbono fermentable en un medio de fermentación en las condiciones en las que se produce el 2-butanol.
  15. 16. Procedimiento para la producción de 2-butanona, que comprende:
    1) proporcionar una célula hospedadora microbiana recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 o 6 a 13; y
    2) poner en contacto la célula hospedadora de 1) con un sustrato de carbono fermentable en un medio de fermentación en las condiciones en las que se produce la 2-butanona.
  16. 17.
    Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 15 o 16, en donde la célula se selecciona del grupo que consiste en: una bacteria, una cianobacteria, un hongo filamentoso y una levadura.
  17. 18.
    Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en donde la célula es un miembro de un género seleccionado del grupo que consiste en Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Pichia, Candida, Hansenula y Saccharomyces.
  18. 19.
    Medio de fermentación, que comprende: a) 2-butanol; y b) la célula hospedadora microbiana recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a
  19. 14.
  20. 20.
    Medio de fermentación que comprende: a) 2-butanona; y b) la célula hospedadora microbiana recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13.
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