ES2442248T3 - Procedimiento para la preparación de L-aminoácidos con de cepas mejoradas de la familia Enterobacteriaceae - Google Patents

Abstract

Microorganismos de la especie Escherichia coli recombinantes, productores de L-treonina o L-triptófano, en losque se potencia o sobre-expresa un polinucleótido, cuya secuencia de aminoácidos tiene una identidad de almenos 5 95% con la secuencia de aminoácidos conforme a SEQ ID No. 16, presentando el polipéptido la actividadde glicerol quinasa GlpK (dependiente de ATP), en donde a) en los microorganismos productores de L-treonina se potencia o sobre-expresa al menos un gendel operón thrABC, que codifica la aspartato quinasa, la homoserina-deshidrogenasa, lahomoserina quinasa y la treonina sintasa, y b) en los microorganismos productores de L-triptófano se potencia o sobre-expresa al menos ungen del operón triptófano que codifica la antranilato-sintasa, la antranilatofosforribosiltransferasa,la fosforribosilantranilato-isomerasa, la indol-3-glicerolfosfato-sintasa y latriptófano-sintasa.

Description

Procedimiento para la preparación de L-aminoácidos con de cepas mejoradas de la familia Enterobacteriaceae

Esta invención se refiere a un procedimiento para la preparación de L-treonina y L-triptófano utilizando microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriaceae, en los que el gen glpK está potenciado, en particular sobre-expresado, y que muestran una capacidad mejorada para el aprovechamiento de glicerol y, con ello, para la formación y acumulación de los L-aminoácidos, así como a estos microorganismos.

Estado conocido de la técnica

L-aminoácidos, en particular L-treonina y L-triptófano, encuentran aplicación en la medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria alimentaria y, de manera muy particular, en la alimentación de animales.

Es conocido que L-aminoácidos se preparan mediante fermentación de cepas de Enterobacteriaceae, en particular Escherichia coli (E. coli) y Serratia marcescens. Debido a la gran importancia, se trabaja constantemente en la mejora de los procedimientos de preparación. Mejoras en el procedimiento pueden afectar a medidas técnicas de la fermentación tales como, p. ej., agitación y abastecimiento de oxígeno, o a la composición de los medios nutricios tales como, p. ej., la concentración de azúcares durante la fermentación, o el tratamiento para dar la forma de producto, p. ej. mediante cromatografía de intercambio de iones, o las propiedades de rendimiento intrínsecas del propio microorganismo.

Para mejorar las propiedades de rendimiento de estos microorganismos se emplean métodos de la mutagénesis, selección y elección de mutantes. De esta manera se obtienen cepas que son resistentes frente a anti-metabolitos tales como, p. ej., el análogo de treonina ácido α-amino-β-hidroxivalérico (AHV) o son auxótrofos para metabolitos de importancia reguladora y producen L-aminoácidos tales como, p. ej., L-treonina. La resistencia frente al análogo de triptófano 5-metil-DL-triptófano (5-MT) distingue, p. ej., por una cepa que produce L-triptófano.

Desde hace algunos años se emplean asimismo métodos de la técnica de ADN recombinante para la mejora de las cepas productoras de L-aminoácidos de la familia Enterobacteriaceae, amplificando genes de la biosíntesis de aminoácidos individuales y examinando el efecto sobre la producción. Informaciones recopilatorias para la biología celular y molecular de Escherichia coli y Salmonella se pueden encontrar en Neidhardt (comp.): Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology, 2ª edición, ASM Press, Washington, D. C., EE.UU., (1996).

Toda la industria de fermentación para la preparación de L-aminoácidos discurre hoy en día la mayoría de las veces en base a glucosa o sacarosa como fuente de carbono que se obtienen en el tratamiento de productos agrarios. Sin embargo, dado que aumenta el precio de estas fuentes de carbono, es deseable una alternativa tecnológicamente factible para la producción de los L-aminoácidos, preferiblemente L-treonina y L-triptófano, un aprovechamiento mejorado de un material más económico como materia prima alternativa para la fermentación.

Es conocido que microorganismos productores de L-aminoácidos se desarrollan sobre glicerol como única fuente de carbono (documento US-A-5.175.107). Glicerol (propanotriol) es un componente natural de aceites y grasas y une en forma de “puente” las moléculas de ácidos grasos en los triglicéridos. La molécula de glicerol es fuertemente polar y, por lo tanto, bien soluble en agua. Como producto de acoplamiento, esta materia prima valiosa se forma en la preparación de biodiesel (éster metílico de colza) y se emplea en productos cosméticos, productos farmacéuticos, alimentos y para aplicaciones técnicas. Decisivo para el empleo de glicerol como materia prima para la preparación de componentes de alimentos para animales es su buen precio. Se ha de partir del hecho de que con la producción creciente de biodiesel, el glicerol se vuelve más interesante para el sector de los alimentos para animales.

Misión de la invención

Los autores de la invención se han propuesto proporcionar nuevas medidas para la preparación fermentativa mejorada de L-treonina y L-triptófano.

Descripción de la invención

Objeto de la invención son microorganismos de la especie Escherichia coli recombinantes, productores de Ltreonina o L-triptófano, en los que se potencia o sobre-expresa un polinucleótido, cuya secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos 95%, preferiblemente de al menos 98%, de manera particularmente preferida de al menos 99%, y de manera muy particularmente preferida de 100%, con la secuencia de aminoácidos conforme a

2 SEQ ID No. 16, presentando el polipéptido la actividad de glicerol quinasa GlpK (dependiente de ATP), en donde

a) en los microorganismos productores de L-treonina se potencia o sobre-expresa al menos un gen del operón thrABC, que codifica la aspartato quinasa, la homoserina-deshidrogenasa, la homoserina quinasa y la treonina sintasa, y

5 b) en los microorganismos productores de L-triptófano se potencia o sobre-expresa al menos un gen del operón triptófano que codifica la antranilato-sintasa, la antranilatofosforribosiltransferasa, la fosforribosilantranilato-isomerasa, la indol-3-glicerolfosfato-sintasa y la triptófano-sintasa.

10 Como punto de partida para la comparación sirven en cada caso los microorganismos no recombinantes para el gen a potenciar que contienen al gen respectivo no en forma potenciada y en los que se pueden llevar a cabo las medidas de la invención.

A estos microorganismos pertenecen, en particular, microorganismos de la especie Escherichia coli, en los que

15 adicionalmente se sobre-expresa al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 95%, preferiblemente de al menos el 98%, de manera particularmente preferida de al menos el 99% y de manera muy particularmente preferida del 100%, con una secuencia de aminoácidos elegida del grupo SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID

20 No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 36 y SEQ ID No. 38.

Los microorganismos de acuerdo con la invención contienen preferiblemente al menos un polinucleótido sobreexpresado que codifica un polipéptido con la actividad de la glicerol quinasa GlpK dependiente de ATP, seleccionado del grupo

25 a) polinucleótido con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 15, b) polinucleótido con la secuencia de nucleótidos que corresponde a la SEQ ID NO: 15 en el marco de la degeneración del código genético,

c) secuencia de polinucleótidos con una secuencia que se hibrida bajo condiciones rigurosas con la secuencia complementaria a la SEQ ID NO: 15, alcanzándose las condiciones rigurosas mediante una 30 etapa de lavado en la que la temperatura se extiende a lo largo de un intervalo de 64ºC a 68ºC y la

concentración de sales del tampón se extiende a lo largo de un intervalo de 2xSSC a 0,1 SSC.

Los microorganismos mencionados contienen, además, preferiblemente al menos un polinucleótido potenciado o sobre-expresado, elegido del grupo:

35 a) polinucleótido con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 35 o SEQ ID No. 37;

40 b) polinucleótido con una secuencia de nucleótidos que corresponde a SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 35 o SEQ ID No. 37 en el marco de la degeneración del código genético;

45 c) secuencia de polinucleótidos con una secuencia que se hibrida bajo condiciones rigurosas con la secuencia complementaria a la secuencia SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 35 o

50 SEQ ID No. 37, alcanzándose las condiciones rigurosas preferiblemente mediante una etapa de lavado en la que la temperatura se extiende a lo largo de un intervalo de 64ºC a 68ºC y la concentración de sales del tampón se extiende a lo largo de un intervalo de 2xSSC a 0,1xSSC;

en donde los polinucleótidos codifican enzimas del metabolismo del glicerol.

55 Objeto de la invención es asimismo un procedimiento para la preparación fermentativa de L-treonina o L-triptófano, conteniendo el medio glicerol como fuente de carbono, utilizando microorganismos recombinantes de la especie Escherichia coli que, en particular, ya producen L-aminoácidos y en los que el gen glpK o secuencias de nucleótidos que codifican su producto génico ya es o son potenciados, en particular sobre-expresados.

60 Preferiblemente, se emplean los microorganismos de acuerdo con la invención. 3

Si en lo que sigue se hace mención a L-aminoácidos o aminoácidos, con ello se quiere dar a entender L-treonina y/o L-triptófano.

5 El término “potenciación” describe a este respecto el aumento de la actividad intracelular o de la concentración de una o varias enzimas o proteínas en un microorganismo que son codificadas por el ADN correspondiente, aumentando, por ejemplo, el número de copias del gen o de los genes, del ORF o bien de los ORFs en al menos una (1) copia, enlazando funcionalmente con el gen un promotor fuerte o utilizando un gen o alelo u ORF que codifica una enzima o bien proteína correspondiente con una elevada actividad y, eventualmente, combinando

10 estas medidas.

Como marco de lectura abierta (ORF, siglas en ingles), se designa un segmento de una secuencia de nucleótidos que codifica o puede codificar una proteína o bien polipéptido o ácido ribonucleico a la que (al que) no se puede asociar función alguna según el estado conocido de la técnica. Después de la asociación de una función al

15 segmento correspondiente de la secuencia de nucleótidos se habla, en general, de un gen. Por alelos se entienden, en general, formas alternativas de un gen dado. Las formas se distinguen por diferencias en la secuencia de nucleótidos.

Como producto génico se designa, en general, la proteína codificada por una secuencia de nucleótidos, es decir, 20 un ORF, un gen o un alelo, o el ácido ribonucleico codificado.

Mediante las medidas de la potenciación, en particular la sobre-expresión, se aumenta la actividad o concentración de la proteína correspondiente, por lo general, en al menos un 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% o 500%, como máximo a 1000% o 2000%, referido a la proteína de tipo salvaje o bien a la actividad o

25 concentración de la proteína en el microorganismo o cepa parental no recombinante para la correspondiente enzima o bien proteína. Por microorganismo o cepa parental no recombinante se entiende el microorganismo en el que se llevan a cabo las medidas de acuerdo con la invención.

Objeto de la invención es un procedimiento para la preparación de L-treonina o L-triptófano mediante fermentación 30 de microorganismos recombinantes de la especie Escherichia coli, caracterizado por que

a) los microorganismos productores del L-aminoácido deseado, en los que se potencia o sobreexpresa un polinucleótido que codifica un polipéptido, cuya secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 95% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, presentando

35 el polipéptido la actividad de la glicerol quinasa GlpK (dependiente de ATP) se cultiva en un medio con contenido en una o varias fuentes de C bajo condiciones en las que el L-aminoácido deseado se acumula en el medio o en las células, y

b) se aísla el L-aminoácido deseado, en donde eventualmente componentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su conjunto o porciones (≥ 0 a 100%) permanecen en el producto 40 aislado o se separan por completo.

Microorganismos recombinantes se generan, por lo general, mediante transformación, transducción o conjugación,

o mediante una combinación de estos métodos, con un vector que contiene al gen deseado, al ORF deseado, a un alelo de este gen u ORF o a partes del mismo y/o un promotor que potencia la expresión del gen u ORF. En el

45 caso de este promotor se puede tratar del promotor que procede mediante mutación potenciadora de la propia secuencia reguladora que se encuentra aguas arriba del gen u ORF, o un promotor eficaz se fusionó con el gen u ORF.

Por ejemplo, como cepas de la especie Escherichia coli productoras de L-treonina, adecuadas como cepa parental,

50 se pueden mencionar:

-

Escherichia coli H4581

-

Escherichia coli KY10935

55 - Escherichia coli VNIIgenetika MG442 -Escherichia coli VNIIgenetika M1

-

Escherichia coli VNIIgenetika 472T23

-

Escherichia coli BKIIM B-3996

-

Escherichia coli kat 13 60 - Escherichia coli KCCM-10132

(documento EP 0 301 572) (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61 (11): 18771882 (1997)) (documento US-A-4.278.765) (documento US-A-4.321.325) (documento US-A-5.631.157) (documento US-A-5.175.107) (documento WO 98/04715) (documento WO 00/09660)

Cepas productoras de L-treonina de la familia de las Enterobacteriaceae poseen preferiblemente, entre otras, una o varias de las características genéticas o bien fenotípicas elegidas del grupo: resistencia frente al ácido α-amino-βhidroxivalérico, resistencia frente a tialisina, resistencia frente etionina, resistencia frente a α-metilserina, resistencia frente a ácido diaminosuccínico, resistencia frente a ácido α-aminobutírico, resistencia frente a 5 borrelidina, resistencia frente a ácido ciclopentan-carboxílico, resistencia frente a rifampicina, resistencia frente análogos de valina, tales como, por ejemplo, hidroxamato de valina, resistencia frente a análogos de purina tales como, por ejemplo, 6-dimetilaminopurina, necesidad por L-metionina, eventualmente necesidad parcial y compensable de L-isoleucina, necesidad de ácido meso-diamonopimélico, auxotrofia en relación con dipéptidos con contenido en treonina, resistencia frente a L-treonina, resistencia frente a refinado de treonina, resistencia 10 frente a L-homoserina, resistencia frente a L-lisina, resistencia frente a L-metionina, resistencia frente al ácido Lglutámico, resistencia frente a L-aspartato, resistencia frente a L-leucina, resistencia frente a L-fenilalanina, resistencia frente a L-serina, resistencia frente L-cisteína, resistencia frente a L-valina, sensibilidad frente a fluoropiruvato, treonina-deshidrogenada defectuosa, eventualmente capacidad para el aprovechamiento de sacarosa, potenciación del operón treonina, potenciación de la homoserina-deshidrogenasa I-aspartato quinasa I, 15 preferiblemente de la forma resistente a la retroalimentación, potenciación de la homoserina quinasa, potenciación de la treonina sintasa, potenciación de la aspartato quinasa, eventualmente de la forma resistente a la retroalimentación, potenciación de la aspartato semialdehído deshidrogenasa, potenciación de la fosfoenolpiruvato carboxilasa, eventualmente de la forma resistente a la retroalimentación, potenciación de la fosfoenolpiruvatosintasa, potenciación de la transhidrogenasa, potenciación del producto génico RhtB, potenciación del producto

20 génico RhtC, potenciación del producto génico YfiK, potenciación de una piruvato-carboxilasa y debilitamiento de la formación de ácido acético.

Como cepas de la especie Escherichia coli productoras de L-triptófano y adecuadas como cepa parental se pueden mencionar, por ejemplo:

25 -Escherichia coli JP4735/pMU3028 (documento US 5.756.345) -Escherichia coli JP6015/pMU91 (documento US 5.756.345) -Escherichia coli SV164 (pGH5) (documento WO94/08031) -E. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) (documento US 4.371.614)

30 -E. coli AGX6 (pGX50) aroP (NRRL B-12264) (documento US 4.371.614) -Escherichia coli AGX17/pGX50, pACKG4-pps (documento WO97/08333) -Escherichia coli ATCC 31743 (documento CA 1182409) -E. coli C534/pD2310,pDM136 (ATCC 39795) (documento WO87/01130) -Escherichia coli JB102/p5LRPS2 (documento 5.939.295)

35 Cepas productoras de L-triptófano de la familia de las Enterobacteriaceae poseen, entre otras, preferiblemente, una

o varias de las características genéticas o bien fenotípicas elegidas del grupo: resistencia frente a 5-metil-DLtriptófano, resistencia frente a 5-fluoro-triptófano, resistencia frente a 4-metil-DL-triptófano, resistencia frente a 6metil-DL-triptófano, resistencia frente a 4-fluoro-triptófano, resistencia frente a 6-fluoro-triptófano, resistencia frente 40 a antranilato, resistencia frente a triptazano, resistencia frente a indol, resistencia frente a ácido indol-acrílico, necesidad de fenilalanina, necesidad de tirosina, eventualmente capacidad para el aprovechamiento de sacarosa, potenciación del operón triptófano, preferiblemente de la antranilato-sintasa, preferiblemente de la forma resistente a la retroalimentación, una triptofanil-ARNt-sintasa parcialmente defectuosa, una absorción debilitada de triptófano, una triptofanasa defectuosa, proteínas represoras inactivadas, potenciación de la biosíntesis de serina,

45 potenciación de la síntesis de fosfoenolpiruvalo, potenciación de la síntesis de D-eritrosa-4-fosfato, potenciación de la síntesis de 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato (DHAP), potenciación de la biosíntesis de corismato.

Se encontró que microorganismos de la especie Escherichia coli, después de la sobre-expresión del gen glpK o de sus alelos, producen de manera mejorada L-treonina y L-triptófano.

50 Las secuencias de nucleótidos de los genes o marcos de lectura abiertos (ORF) de Escherichia coli pertenecen al estado conocido de la técnica y pueden tomarse de la secuencia del genoma de e Escherichia coli publicada por Blattner et al. (Science 277: 1453-1462 (1997)).

55 A partir de Salmonella typhimurium (Nº de acceso: NC 003197 (secuencia de todos los genomas) y Shigella flexneri (Nº de acceso; NC 004337 (secuencia de todo el genoma)), pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, se conoce asimismo la secuencia de nucleótidos para los genes glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX y tpiA. Además de ello, a partir de Salmonella typhimurium (Nº de acceso; NC 003197 (secuencia de todo el genoma)) es conocida la secuencia de nucleótidos para los genes gldA y talC, y a partir de Shigella

60 flexneri (Nº de acceso; NC 004337 (secuencia de todo el genoma)) es conocida la secuencia de nucleótidos para los genes dhaK, dhaL, dhaM, dhaR y fsa. 5

Es conocido que mediante enzimas propias del hospedador (metionina-aminipeptidasa) se puede disociar el aminoácido N-terminal metionina.

5 Los genes y actividades del metabolismo del glicerol se describen de manera recopilatoria también por Lin (en: Neidhardt (comp.), Escherichai coli und Salmonella, American Society for Microbiology, Washington, D. C., EE.UU.: 307-342 (1996)).

El regulón glicerofosfato (glp), que contiene el transporte y metabolismo de glicerol, se compone de cinco operones 10 que se encuentran en tres lugares diferentes del gen en el cromosoma de E. coli (Cozzarelli et al., Journal of Molecular Biology 31: 371-387 (1968)).

Un regulón es una unidad de genes que ciertamente están localizados en diferentes lugares de un genoma, pero cuya expresión es controlada por las mismas proteínas reguladoras. Un operón es una unidad de genes regulados 15 conjuntamente en un lugar del gen.

A los 88 min se encuentra el operón glpFKX (Cozzarelli y Lin, Journal of Bacteriology 91: 1763-1766 (1966); Weissenborn et al., Journal of Biological Chemistry 267: 6122-6131 (1992)), que codifica el facilitador de glicerol GlpF y la glicerol quinasa GlpK y una fructose-1,6-biofosfatasa II GlpX (Donahue et al., Journal of Bacteriology 182 20 (19): 5624-5627 (2000)). En el caso del operón representado en mapa a los 49 min, están recopilados los genes glpT (glicerol-3-fosfato-permeasa) y glpQ (glicerolfosfodiesterasa periplasmática), que son transcritos en el sentido contrario a las agujas del reloj. En sentido opuesto a ello está dispuesto el operón glpABC, cuyos genes codifican las tres sub-unidades de sn-glicerol-3-fosfato-deshidrogenasa heterotrímera eficazmente bajo la exclusión de oxígeno del aire (anaerobio) (Cole et al., Journal of Bacteriology 170: 2448-2456 (1988); Ehrmann et al., Journal of 25 Bacteriology 169: 526-532 (1987)). A los 75 min, en el cromosoma se encuentra el operón glpDEG, que codifica la glicerol-3-fosfato-deshidrogenasa GlpD eficazmente en presencia del oxígeno del aire (aerobio) (Cozzarelli et al., Journal of Molecular Biology 31: 371-387 (1968)), la azufre transferasa GlpE (Cozzarelli et al., Journal of Molecular Biology 31: 371-387 (1968)) y el gen glpG con una función desconocida (Zeng et al., Journal of Bacteriology 178:

7080-7089 (1996)).

30 gen glpA: Denominación: Función:

Nº EC:

50 Referencia: SEQ ID No.: Nº de acceso: Nombre alternativo del gen:

55 gen glpB: Denominación:

Función: Nº EC: 60 Referencia: SEQ ID No.:

sub-unidad grande la sn-glicerol-3-fosfato-deshidrogenasa (anaerobio) en medio anaerobio, glicerol-3-fosfato es oxidado, para la obtención de energía de una glicerol-3-fosfato-deshidrogenasa (GlpABC) dependiente de FAD, en dihidroxiacetona-fosfato que puede pasar a formar parte de la glicolisis como producto intermedio. Los equivalentes de reducción que se liberan durante esta reacción de oxidación son transferidos de la flavoenzima a un complejo de citocromo asociado a la membrana, en cuyo extremo se asienta un aceptor de electrones terminal, fumarato o nitrato (Lin, en: Neidhardt (comp.), Escherichia coli and Salmonella, American Society for Microbiology, Washington, D. C., EE.UU: 307-342 (1996)). Mientras que los electrones son conducidos a través del complejo del citocromo, la energía que se libera se aprovecha para bombear protones a través de la membrana del lado citoplasmático al lado periplasmático. Con los gradientes de protones creados en la membrana se modifica tanto el potencial eléctrico como también el potencial químico, con lo que se activa la ATPasa unida a la membrana y, con ello, se puede generar ATP.

1.1.99.5 Blattner et al.; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997) 1 U00096 (región: 2350669-2352297) b2241

subunidad para el anclaje a la membrana de la sn-glicerol-3-fosfatodeshidrogenasa (anaerobia) véase glpA

1.1.99.5 Blattner et al.; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997) 3

Nº de acceso:

U00096 (región: 2352287-2353546)

Nombre alternativo del gen:

b2242

gen glpC:

5

Denominación: subunidad pequeña de la sn-glicerol-3-fosfato-deshidrogenasa

(anaerobia)

Función:

véase glpA

Nº EC:

1.1.99.5

Referencia:

Blattner et al.; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997)

10

SEQ ID No.: 5

Nº de acceso:

U00096 (región: 2353543-2354733)

Nombre alternativo del gen:

b2243

gen glpD:

´

15

Denominación: glicerol-3-fosfato-dehidrogenasa (aerobia)

Función:

GlpD fue identificado como glicerol-3-fosfato-dehidrogenasa aerobia

(Cozzarelli et al., Journal of Molecular Biology 31: 371-387 (1968)). En medio

aerobio, glicerol-3-fosfato es oxidado, para la obtención de energía de esta

glicerol-3-fosfato-deshidrogenasa (GlpD) dependiente de FAD, en

20

dihidroxiacetona-fosfato que puede pasar a formar parte de la glicolisis como

producto intermedio. Los equivalentes de reducción que se liberan durante esta

reacción de oxidación son transferidos por la flavoenzima a un complejo del

citocromo asociado a la membrana, en cuyo extremo se asienta un aceptor de

electrones terminal. En el caso de la oxidación aerobia, éste es oxígeno

25

molecular o bien nitrato (Lin, en: Neidhardt (comp.), Escherichia coli and

Salmonella, American Society for Microbiology, Washington, D. C., EE.UU.:

307-342 (1996). Mientras que los electrones son conducidos a través del

complejo del citocromo, la energía que se libera se aprovecha para bombear

protones a través de la membrana desde el lado citoplasmático al lado

30

periplasmático. Con los gradientes de protones generados en la membrana se

modifica tanto el potencial eléctrico como también el potencial químico, con lo

que se activa la ATPasa ligada a la membrana y, con ello, se puede generar

ATP.

El marco de lectura abierto del gen glpD se compone de 501 codones y la

35

secuencia traducida codifica una proteína con un peso molecular de 57 kDa

(Austin y Larson, Journal of Bacteriology 173: 101-107 (1991)).

Nº EC:

1.1.99.5

Referencia:

Blattner et al.; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997)

SEQ ID No.:

7

40

Nº de acceso: U00096 (región: 3560036-3561541)

Nombre alternativo del gen:

b3426, glyD

gen glpE:

Denominación:

azufre transferasa; rodanasa citoplasmática ácida

45

Función: GlpE fue identificada como azufre transferasa (Cozzarelli et al.,

Journal of Bacteriology 31: 371-387 (1968)). La rodanasa citoplasmática ácida,

codificada por el gen glpE, con un peso molecular de 12 kDa, cataliza como

dímero la transferencia de azufre al aceptor de azufre tiorredoxina 1 (Ray et al.,

Journal of Bacteriology 182: 2277-2284 (2000)).

50

Nº EC: 2.8.1.1

Referencia:

Blattner et al.; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997)

SEQ ID No.:

9

Nº de acceso:

U00096 (región: 3559520-3559846)

Nombre alternativo del gen:

b3425

55

gen glpF:

Denominación:

facilitador de glicerol GlpF

Función:

la difusión facilitada de glicerol a partir del medio nutricio es

catalizada por el facilitador de glicerol GlpF (Borgnia y Agre, Proc. Natl. Acad.

60

Sci. U.S.A. 98: 2888-2893 (2001)), que forma un canal específico para el

sustrato con un tamaño de poros de 0,4 nm (Heller et al., Journal of

7

Bacteriology 144: 274-278 (1980)).

Nº EC:

-

Referencia:

Blattner et al.; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997)

SEQ ID No.:

11

5

Nº de acceso: U00096 (región: 4115268-4116113)

Nombre alternativo del gen:

b3927

gen glpG:

Denominación:

gen del regulón glp

10

Función: la función fisiológica de glpG es todavía desconocida. El producto

génico glpG es una proteína de carácter básico, citoplasmática o asociada a la

membrana, con un peso molecular de 28 kDa (Zeng et al., Journal of

Bacteriology 178: 7080-7089 (1996)).

Nº EC:

-

15

Referencia: Blattner et al.; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997)

SEQ ID No.:

13

Nº de acceso:

U00096 (región: 3558645-3559475)

Nombre alternativo del gen:

b3424

20

gen glpK:

Denominación:

glicerol quinasa GlpK (dependiente de ATP)

Función:

glicerol citoplasmático es fosforilado inmediatamente por la glicerol quinasa K

dependiente de ATP, que en su forma enzimáticamente activa se presenta

asociada con el facilitador de glicerol GlpF (Voegele et al., Journal of

25

Bacteriology 175: 1087-1094 (1993)).

Nº EC:

2.7.1.30

Referencia:

Blattner et al.; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997)

SEQ ID No.:

15

Nº de acceso:

U00096 (región: 4113737-4115245)

30

Nombre alternativo del gen: b3926

gen glpQ:

Denominación:

glicerol fosfodiesterasa periplasmática

Función:

diésteres de glicerofosfato, los productos de degradación desacetilados de los

35

fosfolípidos (Lin, en: Neidhardt (comp.), Escherichia coli and Salmonella,

American Society for Microbiology, Washington, D. C., EE.UU.: 307-342

(1996)), son hidrolizados en el periplasma por la fosfodiesterasa GlpQ allí

localizada para formar alcohol y glicerol-3-fosfato (Larson et al., Journal of

Biological Chemistry 258: 5428-5432 (1983)).

40

Nº EC: 3.1.4.46

Referencia:

Blattner et al.; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997)

SEQ ID No.:

17

Nº de acceso:

U00096 (región: 2347957-2349033)

Nombre alternativo del gen:

b2239

45

gen glpT:

Denominación:

glicerol-3-fosfato-permeasa

Función:

glicerol-3-fosfato es transportado al interior de la célula mediante la permeasa

GlpT (Eiglmeier et al., Molecular Microbiology 1: 251-258 (1987); Larson et al.,

50

Journal of Bacteriology 152: 1008-1021 (1982)) en intercambio por fosfato

inorgánico (Auer et al., Biochemistry 40: 6628-6635 (2001)). La energía

necesaria para el transporte es habilitada por este anti-portador y, al mismo

tiempo, se evita una acumulación del fosfato de acción tóxica (Xavier et al.,

Journal of Bacteriology 177: 699-704 (1995)).

55

Nº EC: -

Referencia:

Blattner et al.; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997)

SEQ ID No.:

19

Nº de acceso:

U00096 (región: 2349038-2350396)

Nombre alternativo del gen:

b2240

60

gen glpX:

8

Denominación:

fructosa -1,6-bisfosfatasa II

Función:

hasta ahora no se pudo encontrar papel fisiológico alguno de la enzima GlpX.

Una mutación en fbp, el gen para la fructosa-1,6-bisfosfatasa I, no pudo

complementarse mediante GlpX. No obstante, a pesar de ello parece segura

5

una importancia funcional, dado que los mutantes que, en virtud de una

mutación de pfkA (fosfofructoquinasa A) están perturbados en la glicolisis,

crecen mucho más lentamente sin GlpX (Donahue et al.; Journal of Bacteriology

182 (19): 5624-5627 (2000)).

Nº EC:

3.1.3.11

10

Referencia: Blattner et al.; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997)

SEQ ID No.:

21

Nº de acceso:

U00096 (región: 4112592-4113602)

Nombre alternativo del gen:

b3925

15 Junto a los genes del transporte y metabolismo del glicerol se pueden potenciar, en particular sobre-expresar, los siguientes genes de la degradación de diferentes productos intermedios y finales de dicho metabolismo:

gen tpiA:

Denominación: triosafosfato-isomerasa

20 Función: dihidroxiacetona-fosfato es transformado por la triosafosfato-isomerasa en gliceraldehído-3-fosfato, un proceso reversible. (Pichersky et al., Molecular and General Genetics 195 (1-2): 314-20 (1984); Fraenkel, en: Neidhardt (comp.), Escherichia coli and Salmonella, American Society for Microbiology, Washington, D. C., EE.UU.: 142-150 (1987)). La potenciación de este gen

25 también es de importancia debido a que, alternativamente a la vía de EmbdenMeyerhof-Parnas se puede aprovechar la vía secundaria del metilglioxal con el fin de formar piruvato a partir de dihidroxiacetona-fosfato. Mediante la eliminación del fosfato por parte de la metilglioxal-sintasa (gen mgsA), se forma metilglioxal que luego se oxida a través de lactato en piruvato. El metilglioxal

30 formado actúa ya a partir de una concentración relativamente baja como veneno para la célula que inhibe el desarrollo mediante inhibición de la iniciación del ADN y mediante inhibición de la biosíntesis de proteínas (Freedberg et al., Journal of Bacteriology 108(1): 137-144 (1971); Inoue y Kimura, Advances in Microbial Physiology 37: 177-227 (1995)).

35 Nº EC: 5.3.1.1 Referencia: Blattner et al.; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997) SEQ ID No.: 23 Nº de acceso: U00096 (región: 4108763-4109530) Nombre alternativo del gen: b3919, tpi

40 gen gldA: Denominación: glicerol-deshidrogenasa (NAD) Función: la glicerol-deshidrogenasa cataliza la reacción reversible dependiente de NAD

de glicerol para formar dihidroxiacetona (Truniger y Boos, Journal of

45 Bacteriology 176 (6): 1796-1800 (1994)) Nº EC: 1.1.1.6 Referencia: Blattner et al.; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997) SEQ ID No.: 25 Nº de acceso: U00096 (región: 4135955-4137097)

50 Nombre alternativo del gen: b3945

gen dhaK:

Denominación: subunidad de la dihidroxiacetona-quinasa, dominio N-terminal

Función: la dihidroxiacetona-quinasa cataliza en su función como dihidroxiacetona

55 fosfotransferasa dependiente de fosfoenolpiruvato (PEP) la reacción de dihidroxiacetona para formar dihidroxiacetona-fosfato (Gutknecht et al., The EMBO Journal 20(10): 2480-2486 (2001)). DhaK porta el sitio de unión a dihidroxiacetona.

Nº EC: 2.7.1.29 60 Referencia: Blattner et al.; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997) SEQ ID No.: 27 9

Nº de acceso:

U00096 (región: 1248991-1250091)

Nombre alternativo del gen:

dhaK1, ycgT, b1200

gen dhaL:

5

Denominación: subunidad de la dihidroxiacetona-quinasa, dominio C-terminal

Función:

la dihidroxiacetona-quinasa cataliza en su función como dihidroxiacetona

fosfotransferasa dependiente de PEP la reacción de dihidroxiacetona para

formar dihidroxiacetona-fosfato (Gutknecht et al., The EMBO Journal 20(10):

2480-2486 (2001)). DhaL porta ADP como cofactor para la transferencia de

10

fosfato de DhaM a dihidroxiacetona.

Nº EC:

2.7.1.29

Referencia:

Blattner et al.; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997)

SEQ ID No.:

29

Nº de acceso:

U00096 (región: 1248348-1248980)

15

Nombre alternativo del gen: dhaK2, ycgS, b1199

gen dhaM:

Denominación:

subunidad de la proteína PTS de la dihidroxiacetona-quinasa, proteína de multi

transferencia de fosforilo

20

Función: la dihidroxiacetona-quinasa cataliza en su función como dihidroxiacetona

fosfotransferasa dependiente de PEP la reacción de dihidroxiacetona para

formar dihidroxiacetona-fosfato (Gutknecht et al., The EMBO Journal 20(10):

2480-2486 (2001)). DhaM se compone de tres dominios con similitud a los tres

dominios del sistema de fosfotransferasa dependiente de fosfoenolpiruvato.

25

DhaM fosforilado transfiere el fosfato al ADP ligado a DhaL.

Nº EC:

2.7.1.29

Referencia:

Blattner et al.; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997)

SEQ ID No.:

31

Nº de acceso:

U00096 (región: 1246919-1248340)

30

Nombre alternativo del gen: dhaH, ycgC, b1198

gen dhaR:

Denominación:

activador del operón dha (dhaKLM)

Función:

activador transcripcional, estimula la transcripción del operón dha de un

35

promotor sigma70 (Bachler et al., The EMBO Journal 24(2): 283-293 (2005))

Nº EC:

-

Referencia:

Blattner et al.; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997)

SEQ ID No.:

33

Nº de acceso:

U00096 (región: 1250280-1252208)

40

Nombre alternativo del gen: ycgU, b1201

gen fsa:

Denominación:

fructosa-6-fosfato-aldolasa I

Función:

la fructosa-6-fosfato-aldolasa I cataliza una disociación del aldol del fructosa-6

45

fosfato, sustratos de la enzima son dihidroxiacetona, así como fructosa-6

fosfato y gliceraldehído-3-fosfato, no se utilizan fructosa, fructosa-1-fosfato,

fructosa-1,6-bisfosfato o dihidroxiacetona-fosfato (Schurmann y Sprenger,

Journal of Biological Chemistry 276 (14): 11055-11061 (2001))

Nº EC:

4.1.2.

50

Referencia: Blattner et al.; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997)

SEQ ID No.:

35

Nº de acceso:

U00096 (región: 862793-863527)

Nombre alternativo del gen:

mipB, ybiZ, B0825

55

gen talC:

Denominación:

fructosa-6-fosfato-aldolasa II

Función:

la fructosa-6-fosfato-aldolasa II cataliza una disociación de fructosa-6-fosfato

(Schurmann y Sprenger, Journal of Biological Chemistry 276 (14): 11055-11061

(2001)). El gen talC se encuentra directamente junto al gen gldA.

60

Nº EC: 4.1.2.-

Referencia:

Blattner et al.; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997)

10

SEQ ID No.: 37 Nº de acceso: U00096 (región: 4137069-4137731) Nombre alternativo del gen: fsaB, yijG, b3946

Las secuencias de ácidos nucleicos pueden tomarse de los bancos de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) de la National Library of Medicine (Bethesda, MD, EE.UU.), del banco de datos de secuencias de nucleótidos de European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidlberg, Alemania o bien Cambridge, Reino Unido) o del banco de datos de ADN de Japón (DDBJ, Mishima, Japón).

En aras a una mejor claridad, la secuencias conocidas para los genes tratados de Escherichia coli están representados bajo la SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 35 y SEQ ID No. 37.

Los marcos de lectura abiertos descritos en los lugares del texto indicados pueden utilizarse de acuerdo con la invención. Además, pueden utilizarse alelos de los genes o marcos de lectura abiertos que resultan de la degeneración del código genético o mediante mutaciones sentido (“sense mutations”) de función neutra. Se prefiere el uso de genes endógenos o bien de marcos de lectura abiertos endógenos.

Por “genes endógenos” o “secuencias de nucleótidos endógenas” se entienden los genes o marcos de lectura abiertos o alelos o bien secuencias de nucleótidos presentes en la población de una especie.

A los alelos de los genes u ORFs tratados, que contienen mutaciones sentido de función neutra, pertenecen, entre otros, aquellos que conducen a lo sumo a 13 o a lo sumo a 10, preferiblemente a lo sumo a 7 o a lo sumo a 5, de manera muy particularmente preferida, a lo sumo a 3 o a lo sumo a 2, o al menos a un intercambio conservativo de aminoácidos en la proteína codificada por ellos.

En el caso de los aminoácidos aromáticos se habla de intercambios conservativos cuando fenilalanina, triptófano y tirosina son intercambiados entre sí. En el caso de los aminoácidos hidrófobos se habla de intercambios conservativos cuando leucina, isoleucina y valina son intercambiados entre sí. En el caso de los aminoácidos polares se habla de intercambios conservativos cuando glutamina y asparagina son intercambiadas entre sí. En el caso de los aminoácidos de carácter básico se habla de intercambios conservativos cuando arginina, lisina e histidina son intercambiadas entre sí. En el caso de los aminoácidos de carácter ácido se habla de intercambios conservativos cuando ácido aspártico y ácido glutámico son intercambiados entre sí. En el caso de los aminoácidos con contenido en grupos hidroxilo se habla de intercambios conservativos cuando serina y treonina son intercambiados entre sí.

De igual manera, también pueden utilizarse aquellas secuencias de nucleótidos que codifican variantes de las proteínas mencionadas, las cuales, adicionalmente al extremo N o C, contienen una prolongación o un acortamiento de al menos un (1) aminoácido. Esta prolongación o acortamiento no supone más de 13, 10, 7, 5, 3 ó 2 aminoácidos o restos aminoácidos.

A los alelos adecuados pertenecen también aquellos que codifican proteínas en las que al menos se ha añadido (inserción) o separado (deleción) un (1) aminoácido. El número máximo de este tipo de prolongaciones designadas como indelos puede afectar a 2, 3, 4, 5, pero en ningún caso a más de 6 aminoácidos.

A los alelos adecuados pertenecen, además, aquellos que se pueden obtener mediante hibridación, en particular bajo condiciones rigurosas, utilizando SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 35 o SEQ ID No. 37,

o partes de las mismas, en particular de las regiones codificadoras o bien de las secuencias complementarias a las mismas.

Indicaciones para la identificación de secuencias de ADN por medio de hibridación las encuentra el experto en la materia, entre otros, en el manual “The DIG System User’s Guide for Filter Hybridization” de la razón social Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993) y en Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)). La hibridación tiene lugar bajo condiciones rigurosas, es decir, sólo se forman híbridos en los que la sonda y la secuencia diana, es decir, los polinucleótidos tratados con la sonda, tengan una identidad de al menos el 70%. Es conocido que la rigurosidad de la hibridación, incluidas las etapas de lavado, se ve afectada o bien es determinada por la variación de la composición tampón, la temperatura y la concentración salina. La reacción de hibridación se lleva a cabo, por lo general, bajo una rigurosidad relativamente baja en

11 5

comparación con las etapas de lavado (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, Reino Unido, 1996).

Para la reacción de hibridación puede emplearse, por ejemplo, un tampón correspondiente al tampón 5x SSC, a una temperatura de aprox. 50ºC -68ºC. En este caso, las sondas también pueden hibridar con polinucleótidos que presenten una identidad menor que el 70% con respecto a la secuencia de la sonda. Híbridos de este tipo son menos estables y se separan mediante lavado bajo condiciones rigurosas. Esto puede alcanzarse, por ejemplo, reduciendo la concentración salina a 2x SSC y, eventualmente, subsiguientemente a 0,5x SSC (The DIG System User’s Guide for Filter Hybridization”, Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania, 1995), ajustándose una temperatura de aprox. 50ºC -68ºC, aprox. 52ºC -68ºC, aprox. 54ºC -68ºC, aprox. 56ºC -68ºC, aprox. 58ºC 68ºC, aprox. 60ºC -68ºC, aprox. 62ºC -68ºC, aprox. 64ºC -68ºC, aprox. 66ºC -68ºC. Se prefieren intervalos de temperaturas de aprox. 64ºC -68ºC o de aprox. 66ºC -68ºC. Eventualmente, es posible reducir la concentración salina hasta una concentración correspondiente a 0,2x SSC o 0,1x SSC. Mediante el aumento escalonado de la temperatura de hibridación en pasos de aprox. 1 -2ºC de 50ºC hasta 68ºC pueden aislarse fragmentos de polinucleótidos que, por ejemplo, presentan una identidad de al menos el 70% o de al menos el 80% o de al menos el 90%, de al menos el 91%, de al menos el 92%, de al menos el 93%, de al menos el 94%, de al menos el 95%, de al menos el 96%, de al menos el 97%, de al menos el 98% o de al menos el 99% con respecto a la secuencia de la sonda empleada o bien con respecto a las secuencias de nucleótidos representadas en SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 35 o SEQ ID No. 37. Otras indicaciones para la hibridación se pueden adquirir en el comercio en forma de los denominados kits (p. ej. DIG Easy Hyb de la razón social Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Nº de catálogo 1603558).

Para conseguir una potenciación, pueden aumentarse, por ejemplo, la expresión de los genes o marcos de lectura abiertos o alelos, o las propiedades catalíticas de la proteína. Eventualmente, se pueden combinar ambas medidas.

Para conseguir una sobre-expresión, se puede aumentar, por ejemplo, el número de copias de los genes correspondientes o marcos de lectura abiertos, o se puede mutar la región del promotor y de regulación o el punto de unión a ribosomas que se encuentra aguas arriba del gen estructural. De la misma manera actúan las casetes de expresión que se incorporan aguas arriba del gen estructural. Mediante promotores inducibles es adicionalmente posible aumentar la expresión en el transcurso de la producción fermentativa de L-treonina y Ltriptófano, además de ello puede ser ventajoso también el uso de promotores para la expresión génica que posibilita otra expresión del gen en el tiempo. En el plano de la regulación de la traducción de la expresión génica es posible aumentar la frecuencia de la iniciación (adición del ribosoma al ARNm) o la velocidad del alargamiento (fase de prolongación). Mediante medidas para la prolongación de la vida útil del ARNm se mejora asimismo la expresión. Además, impidiendo la degradación de la proteína enzimática se potencia asimismo la actividad enzimática. Los ORFs, genes o construcciones de genes pueden presentarse en plásmidos con un número de copias diferente o pueden estar integrados y amplificados en el cromosoma. Alternativamente, también se puede alcanzar una sobre-expresión de los genes correspondientes variando la composición de los medios y la realización del cultivo.

Métodos de la sobre-expresión se describen suficientemente en el estado conocido de la técnica – por ejemplo en Makrides et al. (Microbiological Reviews 60 (3), 512-538 (1996)) - . Mediante el uso de vectores se aumenta el número de copias en al menos una (1) copia. En calidad de vectores pueden utilizarse plásmidos tal como se describen, por ejemplo, en el documento US 5.538.873. En calidad de vectores pueden utilizarse asimismo fagos, por ejemplo el fago Mu, tal como se describe en el documento EP 0332448, o el fago lambda (λ). Un aumento del número de copias también se puede conseguir incorporando otra copia en otro lugar del cromosoma – por ejemplo en el sitio att del fago λ (Yu y Court, Gene 223, 77-81 (1998)) -. En el documento US 5.939.307 se describe que mediante la incorporación de casetes de expresión o promotores tales como, por ejemplo, el promotor tac, el promotor trp, el promotor lpp o el promotor PL y el promotor PR del fago λ, por ejemplo aguas arriba del operón treonina cromosómico, se pudo alcanzar un aumento de la expresión. De igual manera, pueden utilizarse los promotores del fago T7, los promotores gear-box o el promotor nar. Casetes de expresión o promotores de este tipo también pueden utilizarse con el fin de sobre-expresar genes ligados a plásmidos tal como se describe en el documento EP 0 593 792. Mediante el uso del alelo lacIQ se puede de nuevo controlar la expresión de genes ligados a plásmidos (Glascock y Weickert, Gene 223, 221-231 (1998)). Además, es posible que la actividad de los promotores esté incrementada mediante la modificación de su secuencia por medio de uno o varios intercambios de nucleótidos mediante inserción o inserciones y/o deleción o deleciones. Puede alcanzarse otra expresión génica en el tiempo, por ejemplo tal como se describe en Walker et al. (Journal of Bacteriolgy 181: 1269-80 (1999)) mediante el uso del promotor fis dependiente de fases de crecimiento. La velocidad de la elongación se ve afectada

mediante el uso de codones, mediante el uso de codones para ARNts, que se presentan a menudo en la cepa parental, se puede potenciar la expresión génica. Indicaciones generales para ello las encuentra el experto en la materia, entre otros, en Chang y Cohen (Journal of Bacyerilogy 134: 1141-1156 (1978)), en Hartley y Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)), en Amann y Brosius (Gene

5 40: 183-190 (1985)), en de Broer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of teh United States of America 80: 21-25 (1983)), en LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11: 187.193 (1993)), en el document PCT/US97/13359, en Llosa et al. (Plasmid 26: 222-224 (1991)), en Quandt y Klipp (Gene 80: 161-169 (1989)), en Hamilton et al. (Journal of Bacterilogy 171: 4617-4622 (1989)), en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)) y en libros de texto de Genética y Biología Molecular conocidos.

10 Pueden utilizarse vectores de plásmidos replicables en Enterobacteriaceae tales como, p. ej., vectores de clonación derivados de pACYC184 (Bartolomé et al.; Gene 102: 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene 69: 301-315 (1988)) o derivados de pSC101 (Vocke y Bastia; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80(21): 6557-6561 (1983)). En un procedimiento de acuerdo con la invención se puede emplear una cepa transformada

15 con un vector de plásmido, en donde el vector de plásmido porta al menos una secuencia de nucleótidos o alelos que codifica uno o varios de los genes del metabolismo del glicerol elegidos del grupo glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, tpiA, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa y talC, o sus productos génicos.

Por el término transformación se entiende la captación de un ácido nucleico aislado por parte de un hospedador 20 (microorganismo).

Asimismo, es posible transformar mutaciones que afectan a los respectivos genes o marcos de lectura abiertos, mediante el intercambio de la secuencia (Hamilton et al.; Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), conjugación o transducción en diferentes cepas.

25 Explicaciones más detalladas con respecto a los términos y expresiones de Genética y Biología Molecular se encuentran en libros de texto de Genética y Biología Molecular conocidos tal como, por ejemplo, el libro de texto de Birge (Bacterial and Bacteriophage Genetics, 4ª Ed. editorial Springer, Nueva Yokr (EE.UU.), 2000) o el libro de texto de Berg, Tymoczko y Stryer (Biochemistry, 5ª ed., Freeman and Company, Nueva York (EE.UU.), 2002) o el

30 libro de texto de Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (conjunto de 3 volúmenes), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (EE.UU.), 2001).

Además, para la producción de L-aminoácidos, en particular L-treonina, con cepas de la familia Enterobacteriaceae puede ser ventajoso potenciar, adicionalmente a la potenciación del gen glpK, uno o varios de los genes del

35 metabolismo del glicerol elegidos del grupo glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpQ, glpT, glpX, tpiA, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa y talC, y/o potenciar una o varias enzimas de la vía de la biosíntesis de treonina conocida o enzimas del metabolismo anaplerótico o enzimas para la producción de nicotinamida-adeninadinucleótido-fosfato reducido o enzimas de la glicolisis o enzimas PTS o enzimas del metabolismo del azufre. En general, se prefiere el uso de genes endógenos.

40 Así, por ejemplo, pueden potenciarse, en particular sobre-expresarse al mismo tiempo, uno o varios de los genes elegidos del grupo

● al menos un gen del operón thrABC que codifica la aspartato quinasa, la homoserina-deshidrogenasa, la 45 homoserina quinasa y la treonina sintasa (documento US-A-4.278.765),

● el gen pyc que codifica la piruvato-carboxilasa de Corynebacterium glutamicum (documento WO 99/18228),

50 ● el gen pps que codifica la fosfoenolpiruvato-sintasa (Molecular and General Genetics 231 (2): 332-336 (1992)),

● el gen ppc que codifica la fosfoenolpiruvato-carboxilasa (documento WO 02/064808),

55 ● los genes pntA y pntB que codifican las subunidades de la transhidrogenasa (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986)),

● el gen rhtC que codifica la proteína inductora de resistencia a treonina (documento EP-A 1 013 765),

60 ● el gen thrE de Corynebacterium glutamicum que codifica la proteína de exportación-soporte de treonina (documento WO 01/92545), 13

● el gen gdhA que codifica la glutamato-deshidrogenasa (Nucleic Acids Research 11: 5257-5266 (1983); Gene 23: 199-209 (1983)),

5 ● el gen ptsH del operón ptsHIcrr que codifica la fosfohistidina-proteína-hexosa-fosfotransferasa del sistema de fosfotransferasa PTS (documento WO 03/004674),

● el gen ptsI del operón ptsHIcrr que codifica la enzima I del sistema de fosfotransferasa PTS (documento

WO 03/004674), 10

● el gen crr del operón ptsHIcrr que codifica el componente IIA específico para glucosa del sistema de fosfotransferasa PTS (documento WO 03/004674),

● el gen ptsG que codifica el componente IIBC específico para glucosa (documento WO 03/004670), 15

●

el gen cysK que codifica la cisteína-sintasa A (documento WO 03/006666),

●

el gen cysB que codifica el regulador del regulón cys (documento WO 03/006666),

20 ● el gen cysJ del operón cysJIH que codifica la flavoproteína de la NADPH-sulfito-reductasa (documento WO 03/006666),

● el cen cysI del operón cysJIH que codifica la hemoproteína de la NADPH-sulfito-reductasa (documento

WO 03/006666), 25

●

el gen cysH del operón cysJIH que codifica la adenililsulfato-reductasa (documento WO 03/006666),

●

el gen sucA del operón sucABCD que codifica la subunidad descarboxilasa de la 2-cetoglutarato

deshidrogenasa (documento WO 03/008614), 30

● el gen sucB del operón sucABCD que codifica la subunidad E2 de dihidrolipoiltranssuccinasa de la 2cetoglutarato deshidrogenasa (documento WO 03/008614),

● el gen sucC del operón sucABCD que codifica la subunidad β de la succinil-CoA-sintetasa (documento 35 WO 03/008615),

● el gen sucD del operón sucABCD que codifica la subunidad α de la succinil-CoA-sintetasa (documento WO 03/008615),

40 ● el producto génico en el marco de lectura abierto (ORF) yibD de Escherichia coli (Número de Acceso AE000439 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.), documento DE102004005836.9).

Además, para la producción de L-aminoácidos, en particular L-triptófano, con cepas de la familia

45 Enterobacteriaceae puede ser ventajoso potenciar, adicionalmente a la potenciación del gen glpK, uno o varios de los genes del metabolismo del glicerol elegidos del grupo glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpQ, glpT, glpX, tpiA, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa y talC y/o una o varias enzimas de la vía de la biosíntesis del triptófano conocida o enzimas de la biosíntesis de serina o enzimas para la producción de 3-desoxi-D-arabinoheptulosonato-7-fosfato (DHAP) y corismato. En general, se prefiere el uso de genes endógenos.

50 Así, por ejemplo se pueden potenciar, en particular sobre-expresar al mismo tiempo uno o varios de los genes elegidos del grupo

● al menos un gen del operón triptófano que codifica la antranilato-sintasa, la antranilato

55 fosforribosiltransferasa, la fosforribosilantranilato-isomerasa, la indol-3-glicerolfosfato-sintasa y la triptófano-sintasa (Applied and Environmental Microbiology 38(2): 181-190 (1979)),

●

el gen serA que codifica la 3-fosfoglicerato-deshidrogenasa (documento WO 87/01130)

●

el gen serC que codifica la fosfoserina-aminotransferasa (documento WO 87/01130)

●

el gen aroF que codifica la DHAP-sintasa sensible a L-tirosina (documentos WO 87/01130; EP1270721)

60 ● el gen serB que codifica la fosfoserinafosfatasa (documento WO 87/01130)

5 ● el gen aroG que codifica la DHAP-sintasa sensible a L-fenilalanina (documentos WO 87/01130; EP1270721)

●

el gen aroH que codifica la DHAP-sintasa sensible a L-triptófano (documentos WO 87/01130; EP1270721) 10 ● el gen pps que codifica la fosfoenolpiruvato-sintasa (documento WO 96/08567)

● el gen pckA que codifica la fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa (documento WO 2004/090125)

●

el gen tktA que codifica la transcetolasa A (documento US 5.168.056) 15

●

el gen tktB que codifica la transcetolasa B (documento US 5.168.056)

●

el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yddG de Escherichia coli (Número de acceso

NC000913 (Región 1544312-1545193) del National Center for Biotechnology Information (NCBI, 20 Bethesda, MD, EE.UU.), documento EP1449918).

Además, para la producción de L-aminoácidos, en particular L-treonina, puede ser ventajoso, adicionalmente a la potenciación del gen glpK, debilitar, en particular eliminar o reducir la expresión de uno o varios de los genes elegidos del grupo

●

el gen tdh que codifica la treonina-deshidrogenasa (Journal of Bacteriology 169: 4716-4721 (1987)),

●

el gen mdh que codifica la malato-deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.37) (Archives in Microbiology 149: 36-42

(1987)), 30

● el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yjfA de Escherichia coli (Número de acceso AAC77180 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.), documento WO 02/29080),

35 ● el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) ytfP de Escherichia coli (Número de acceso AAC77179 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.), documento WO 02/29080),

● el gen pckA que codifica la enzima fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa (documento WO 02/29080), 40

●

el gen poxB que codifica la piruvato-oxidasa (documento WO 02/36797),

●

el gen dgsA que codifica el regulador de DgsA del sistema de fosfotransferasa (documento WO

02/081721), que también es conocido bajo la denominación gen mlc, 45

● el gen fruR que codifica el represor de fructosa (documento WO 02/081698) que también es conocido bajo la denominación gen cra,

● el gen rpoS que codifica al factor Sigma38 (documento WO 01/05939) que también es conocido bajo la 50 denominación gen katF,

●

el gen aspA que codifica la aspartato amonio-liasa (documento WO 03/008603) y

●

el gen glpR que codifica el represor del regulón de glp (Nucleic Acids Research 16(15): 7732 (1988)).

55 Además, para la producción de L-aminoácidos, en particular L-triptófano, puede ser ventajoso, adicionalmente a la potenciación del gen glpK, debilitar, en particular eliminar o reducir la expresión de uno o varios de los genes elegidos del grupo

60 ● el gen tnaA que codifica la triptofanasa (documento US 4.371.614),

●

el gen trpR que codifica el represor del operón trp (documento US 4.371.614),

●

el gen tyrA que codifica la corismato-mutasa T y prefenato-deshidrogenasa (documento US 4.371.614),

5 ● el gen pheA que codifica la corismato-mutasa P y prefenato-deshidrogenasa (documento US 4.371.614),

● el gen mtr que codifica la proteína de transporte específica para triptófano (documento US 5.756.345),

● el gen tnaB que codifica la triptófano-permeasa (documento US 5.756.345), 10

●

el gen aroP que codifica el transportador para aminoácidos aromáticos (documento US 5.756.345),

●

el gen sdaA que codifica la L-serina desaminasa (documento EP 0149539),

15 ● el gen pgi que codifica la glucosa-6-fosfato-isomerasa (documento WO 87/01130),

●

el gen tyrB que codifica la tirosina-aminotransferasa (documento WO 87/01130) y

●

el gen glpR que codifica el represor del regulón glp (Nucleic Acids Research 16(15): 7732 (1988)).

20 El término “debilitamiento” describe a este respecto la reducción o eliminación de la actividad intracelular o concentración de una o varias enzimas o bien proteínas en un microorganismo que son codificadas por el ADN correspondiente, utilizando, por ejemplo, un promotor más débil que en el microorganismo o cepa parental no recombinante para la correspondiente enzima o bien proteína, o un gen o bien alelo que codifica una enzima o bien

25 proteína correspondiente con una actividad baja o bien inactiva a la correspondiente enzima o bien proteína o al marco de lectura abierto o al gen y, eventualmente, combinando estas medidas.

Mediante las medidas del debilitamiento se reduce la actividad o la concentración de la proteína correspondiente, por lo general, hasta 0 a 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% o 0 a 5% la actividad o concentración de la proteína de

30 tipo salvaje, o bien la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo o cepa parental no recombinante para la correspondiente enzima o bien proteína. Por microorganismo o cepa parental no recombinante se entiende el microorganismo en el que se llevan a cabo las medidas de acuerdo con la invención.

Para conseguir un debilitamiento pueden reducirse o eliminarse, por ejemplo, la expresión de los genes o marcos 35 de lectura abiertos o las propiedades catalíticas de las proteínas enzimáticas. Eventualmente, pueden combinarse ambas medidas.

La reducción de la expresión génica puede tener lugar mediante una realización adecuada del cultivo, mediante modificación genética (mutación) de las estructuras de señal de la expresión génica o también mediante técnica de 40 ARN antisentido. Estructuras de señal de la expresión génica son, por ejemplo, genes represores, genes activadores, operadores, promotores, atenuadores, sitios de unión a ribosomas, el codón de iniciación y terminadores. Datos para ello los encuentra el experto en la materia, entre otros, por ejemplo, en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)), en Carrier y Kessling (Biotechnology Progress

15: 58-64 (1999)), Franch y Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3: 159-164 (2000)) y en libros de texto de

45 Genética Biología Molecular conocidos tal como, por ejemplo, el libro de texto de Knippers (“Molekulare Genetik”, 6ª edición, editorial Georg Thieme, Stuttgart, Alemania, 1995) o del de Winnacker (“Gene und Klone”, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990).

Mutaciones que conducen a una variación o bien reducción de las propiedades catalíticas de proteínas enzimáticas

50 son conocidas del estado general de la técnica. Como ejemplos se pueden mencionar los trabajos de Qiu y Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95: 5511-5515 (1998)), Wente y Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266: 20833-20839 (1991)). Descripciones recopilativas pueden tomarse, por ejemplo, de libros de texto de Genética y Biología Molecular

55 conocidos tal como, p. ej., de von Hagemann (“Allgemeine Genetik”, editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1986).

Como mutaciones entran en consideración transiciones, transversiones, inserciones y deleciones de al menos un

(1) par de bases o bien nucleótido. En función del efecto del intercambio de aminoácidos provocado por la mutación sobre la actividad enzimática se habla de mutaciones con cambio de sentido (“missense mutations”) o

60 mutaciones sin sentido (“nonsense mutations”). La mutación con cambio de sentido conduce a un intercambio de un aminoácido dado en una proteína por otro aminoácido, tratándose en particular de un intercambio de

aminoácidos no conservativo. Con ello, se merma la capacidad funcional o bien actividad de la proteína y se reduce a un valor de 0 a 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% o 0 a 5%. La mutación sin sentido conduce a un codón de terminación en la zona de codificación del gen y, con ello, a una interrupción prematura de la traducción. Inserciones o deleciones de al menos un par de bases en un gen conducen a mutaciones de desplazamiento de 5 marco (“frame shift mutations”), las cuales conducen a que se incorporen aminoácidos falsos o se interrumpa prematuramente la traducción. Si como consecuencia de la mutación se forma un codón de terminación en la zona codificadora, entonces esto conduce asimismo a una interrupción prematura de la traducción. Deleciones de al menos un (1) o varios codones conducen típicamente asimismo a una pérdida completa de la actividad enzimática.

10 Indicaciones para crear mutaciones de este tipo pertenecen al estado conocido de la técnica y pueden tomarse de libros de texto de Genética y Biología Molecular conocidos, tales como, p. ej., el libro de texto de Knippers (“Molekulare Genetik”, 6ª edición, editorial Georg Thieme, Stuttgart, Alemania, 1995), el de von Winnacker (“Gene und Klone”, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) o el de von Hagemann (“Allgemeine Genetik”, editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1986).

15 Mutaciones adecuadas en los genes se pueden incorporar mediante intercambio de genes o bien alelos en cepas adecuadas.

Un método habitual es el método descrito por Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)) del

20 intercambio de genes con ayuda de un derivado de pSC101, pMAK705, que replica de forma condicionada. Asimismo, pueden utilizarse otros métodos descritos en el estado conocido de la técnica tales como, por ejemplo, el de Martínez-Morales et al. (Journal of Bacteriology 181: 7143-7148) (1999)) o el de Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182: 842-847 (2000)).

25 Asimismo, es posible introducir mutaciones en los respectivos genes o mutaciones que afecten a la expresión de los respectivos genes o marcos de lectura abiertos, mediante conjugación o transducción en diferentes cepas.

Además, para la producción de L-aminoácidos, en particular L-treonina y L-triptófano, puede ser ventajoso, adicionalmente a la potenciación de uno o varios de los genes del metabolismo del glicerol, elegidos del grupo

30 glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, tpiA, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa y talC, eliminar reacciones secundarias indeseadas (Nakayama: “Breeding of Amino Acid Producing Microrganisms”, en: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (comps.), Academic Press, Londres, Reino Unido, 1982).

35 El rendimiento de las bacterias aisladas o bien del proceso de fermentación utilizando las mismas, en relación con uno o varios de los parámetros elegidos del grupo de la concentración del producto (producto por volumen), del rendimiento del producto (producto formado por fuente de carbono consumida) y de la formación de producto (producto formado por volumen y tiempo) o también otros parámetros del proceso y combinaciones de los mismos, se mejora en al menos 0,5%, al menos 1%, al menos 1,5% o al menos 2%, referido al microorganismo o

40 cepa parental no recombinante o bien al proceso de fermentación utilizando los mismos.

Los microorganismos producidos de acuerdo con la invención pueden cultivarse en un proceso en lotes, en un proceso de lote alimentado, en un proceso de lote alimentado repetitivo o en un proceso continuo (documentos DE102004028859.3 o US 5.763.230). Una recopilación sobre métodos de cultivo conocidos está disponible en el

45 libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (editorial Vieweg, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

El medio de cultivo a utilizar debe satisfacer de manera adecuada los requisitos de las cepas respectivas.

50 Descripciones de medios de cultivo de diferentes microorganismos están contenidos en el manual “Manual of Methods for General Bacterilogy” de la American Society for Bacterilogy (Washington, D.C., EE.UU., 1981).

En calidad de fuente de carbono se emplea glicerol. Éste puede utilizarse por sí solo o en forma de mezcla. Pueden añadirse azúcares e hidratos de carbono tales como, p. ej., glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, 55 almidón y, eventualmente, celulosa, aceites y grasas tales como, p. ej., aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y grasa de coco, ácidos grasos tales como, p. ej., ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linólico, alcoholes tales como, p. ej., etanol y metanol, y ácidos orgánicos tales como, p. ej., ácido acético, debiendo ascender la proporción del glicerol al menos a mayor o igual (≥) 50% o al menos ≥ 75% o al menos ≥ 90%, al menos ≥ 95%, preferiblemente 100%. Además de ello, los microorganismos recombinantes de acuerdo con la 60 invención de la familia Enterobacteriaceae, en los que está o están potenciados, en particular sobre-expresados, al menos uno o varios de los genes elegidos del grupo tpiA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa y talC o sus alelos, pueden

17 5

emplearse también en fermentaciones en las que las fuentes de carbono mencionadas se utilizan individualmente

o como mezcla en ausencia de glicerol.

Como fuente de nitrógeno pueden utilizarse compuestos nitrogenados orgánicos tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, líquido de maceración de maíz, harina de soja y urea, o compuestos inorgánicos tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno pueden utilizarse individualmente o en forma de mezcla.

Como fuente de fósforo pueden utilizarse ácido fosfórico, dihidrógeno-fosfato potásico o hidrógeno-fosfato dipotásico o las correspondientes sales con contenido en sodio. El medio de cultivo debe contener, además, sales de metales tales como, p. ej., sulfato de magnesio o sulfato de hierro que son necesarias para el crecimiento. Finalmente, adicionalmente a las sustancias arriba mencionadas pueden emplearse sustancias de crecimiento esenciales tales como aminoácidos y vitaminas. Al medio de cultivo pueden añadirse, además de ello, precursores adecuados. Las sustancias de partida mencionadas pueden añadirse al cultivo en forma de una tanda única o alimentarse durante el cultivo de manera adecuada.

La fermentación se lleva a cabo, por lo general, a un valor del pH de 5,5 a 9,0, en particular de 6,0 a 8,0. Para el control del pH del cultivo se emplean de manera adecuada compuestos de carácter básico tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o bien agua amoniacal, o compuestos de carácter ácido tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Para el control del desarrollo de espuma pueden emplearse agentes antiespumantes tales como, p. ej., ésteres poliglicólicos de ácidos grasos. Para el mantenimiento de la estabilidad de plásmidos pueden agregarse al medio sustancias de acción selectiva adecuadas, p. ej. antibióticos. Con el fin de conservar las condiciones aerobias se incorporan en el cultivo oxígeno o mezclas gaseosas con contenido en oxígeno tales como, p. ej., aire. La temperatura del cultivo se encuentra normalmente en 25ºC a 45ºC y, preferiblemente, en 30ºC a 40ºC. Mediante la actividad de los microorganismos se produce en el caldo de cultivo una acumulación del L-aminoácido. El cultivo se prolonga hasta que se haya formado un máximo de L-aminoácidos o bien de L-treonina

o L-triptófano. Este objetivo se alcanza normalmente en el espacio de 10 horas hasta 160 horas.

A partir del caldo de cultivo retirado pueden obtenerse, recogerse o concentrarse y eventualmente purificarse la Ltreonina o el L-triptófano. Métodos típicos para la purificación de los L-aminoácidos son la cromatografía de intercambio de iones y la cristalización. Con ello se obtienen L-aminoácidos ampliamente puros.

Asimismo, es posible preparar un producto a partir del caldo de cultivo retirado (= caldo de fermentación) separando la biomasa de la bacteria contenida en el caldo de cultivo por completo (100%) o casi por completo, es decir en más de o mayor que (>) 90%, > 95%, > 97%, > 99%, y dejando ampliamente en el producto a los restantes componentes del caldo de fermentación, es decir, en un 30% -100%, 40% -100%, 50% -100%, 60% 100%, 70% -100%, 80% -100% o 90% -100%, preferiblemente en una cantidad mayor o igual (≥) 50%, ≥ 60%, ≥ 70%, ≥ 80%, ≥ 90% o ≥ 95%, o también por completo (100%).

Para la eliminación o separación de la biomasa se emplean métodos de separación tales como, por ejemplo, centrifugación, filtración, decantación, floculación o una combinación de los mismos.

El caldo obtenido se espesa o se concentra a continuación con métodos conocidos tal como, por ejemplo, con ayuda de un evaporador de rotación, evaporador de capa fina, evaporador de película descendente, mediante ósmosis inversa, mediante nanofiltración o mediante una combinación de los mismos.

Este caldo concentrado se elabora a continuación por métodos de liofilización, de secado por pulverización, de granulación por pulverización o mediante otros procedimientos para formar un polvo finamente dividido, preferiblemente capaz de fluir. Este polvo finamente dividido capaz de fluir puede transformarse de nuevo, mediante procedimientos de compactación o granulación adecuados, en un producto de grano grueso, bien fluyente, almacenable y ampliamente exento de polvo. El agua se elimina en este caso en conjunto en más de un 90%, de modo que el contenido en agua en el producto es menor que 10%, menor que 5% o menor que 3%.

El análisis de L-aminoácidos puede tener lugar mediante cromatografía de intercambio de aniones con subsiguiente derivatización de ninhidrina tal como se describe en Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 11901206 (1958)), o puede tener lugar mediante HPLC de fase inversa, tal como se describe en Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979)).

18 PROTOCOLO DE SECUENCIAS

<110>

Degussa AG

<120>

Procedimiento para la preparación de L-aminoácidos con empleo de cepas mejoradas de la familia

Enterobateriaceae

<130>

050065 BT

<160>

38

<170>

PatentIn version 3.3

<210>

1

<211>

1629

<212>

ADN

<213>

Escherichia coli

<220>

<221>

CDS

<222>

(1) .... (1629)

<223>

región codificadora de glpA

<400>

1

5

<211> <212> <213> 542 PRT Escherichia coli

<400>

2

5

<211> <212> <213> 1260 ADN Escherichia coli

10

<220> <221> <222> <223> CDS (1) .... (1260) región codificadora de glpB

<400>

3

5

<210> <211> <212> <213> 4 419 PRT Escherichia coli

<400>

4

5

<211> <212> <213> 1191 ADN Escherichia coli

10

<220> <221> <222> <223> CDS (1) .... (1191) región codificadora de glpC

<400>

5

5

<210> <211> <212> <213> 6 396 PRT Escherichia coli

<400>

6

5

<210> <211> <212> <213> 7 1506 ADN Escherichia coli

10

<220> <221> <222> <223> CDS (1) .... (1506) región codificadora de glpD

<400>

7

5

<210> <211> <212> <213> 8 501 PRT Escherichia coli

<400>

8

5

<210> <211> <212> <213> 9 327 ADN Escherichia coli

10

<220> <221> <222> <223> CDS (1) .... (327) región codificadora de glpE

15

<400> 9

5

<210> <211> <212> <213> 10 108 PRT Escherichia coli

<400>

10

<210> 11

<211> 846

<212> ADN

<213> Escherichia coli 15

<220>

<221> CDS

<222> (1) .... (846)

<223> región codificadora de glpF

<400> 11

5

<211> <212> <213> 281 PRT Escherichia coli

10

<400> 12

5

<212> <213> ADN Escherichia coli

10

<220> <221> <222> <223> CDS (1) .... (831) región codificadora de glpG

<400>

13

<210> 14

<211> 276

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 14

5

<211> <212> <213> 1509 ADN Escherichia coli

10

<220> <221> <222> <223> CDS (1) .... (1509) región codificadora de glpK

<400>

15

<400>

17

<212> <213>

PRT Escherichia coli

5

<400> 16

5

<212> <213> ADN Escherichia coli

10

<220> <221> <222> <223> CDS (1) .... (1077) región codificadora de glpQ 44

5

<210> <211> <212> <213> 18 358 PRT Escherichia coli

<400>

18

<210> 19

<211> 1359 5 <212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS 10 <222> (1) .... (1359)

<223> región codificadora de glpT

<400> 19

5

10

<210> <211> <212> <213> 20 452 PRT Escherichia coli

49

<400> 20

5

<211> <212> <213> 1011 ADN Escherichia coli

10

<220> <221> <222> <223> CDS (1) .... (1011) región codificadora de glpX

<400>

21

5

<212> PRT

<213>

Escherichia coli

<400>

22

5

<212> <213> ADN Escherichia coli

10

<220> <221> <222> <223> CDS (1) .... (768) región codificadora de tpiA

<400>

23

15

5

<210> <211> <212> <213> 24 255 PRT Escherichia coli

<400>

24

5 <210>

<211>

<212>

<213>

10 <220>

<221>

<222>

<223>

25 1143 ADN Escherichia coli

CDS

(1) .... (1143) región codificadora de gldA

<400> 25

5

<211> <212> <213> 380 PRT Escherichia coli

<400>

26

5

<211> <212> <213> 1101 ADN Escherichia coli

10

<220> <221> <222> <223> CDS (1) .... (1101) región codificadora de dhaK

<400>

27

5

<210> <211> <212> <213> 28 366 PRT Escherichia coli

<400>

28

10

5

<211> <212> <213> 633 ADN Escherichia coli

10

<220> <221> <222> <223> CDS (1) .... (633) región codificadora de dhaL

<400>

29

5

<210> <211> <212> <213> 30 210 PRT Escherichia coli

<400>

30

5

<210> <211> <212> <213> 31 1422 ADN Escherichia coli

10

<220> <221> <222> <223> CDS (1) .... (1422) región codificadora de dhaM

<400>

31

5

<210> <211> <212> <213> 32 473 PRT Escherichia coli

<400>

32

<210> 33

<211> 1929 5 <212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS 10 <222> (1) .... (1929)

<223> región codificadora de dhaR

<400> 33

5

<210> <211> <212> <213> 34 642 PRT Escherichia coli

<400>

34

5

<210> <211> <212> <213> 35 735 ADN Escherichia coli

10

<220> <221> <222> <223> CDS (1) .... (735) región codificadora de fsa

<400>

35

5

<210> <211> <212> <213> 36 244 PRT Escherichia coli

<400>

36

5

<211> <212> <213> 663 ADN Escherichia coli

10

<220> <221> <222> <223> CDS (1) .... (663) región codificadora de talC

<400>

37

5

<210> <211> <212> <213> 38 220 PRT Escherichia coli

<400>

38

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1.-Microorganismos de la especie Escherichia coli recombinantes, productores de L-treonina o L-triptófano, en los que se potencia o sobre-expresa un polinucleótido, cuya secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos 95% con la secuencia de aminoácidos conforme a SEQ ID No. 16, presentando el polipéptido la actividad de glicerol quinasa GlpK (dependiente de ATP), en donde

   a) en los microorganismos productores de L-treonina se potencia o sobre-expresa al menos un gen del operón thrABC, que codifica la aspartato quinasa, la homoserina-deshidrogenasa, la homoserina quinasa y la treonina sintasa, y

   b) en los microorganismos productores de L-triptófano se potencia o sobre-expresa al menos un gen del operón triptófano que codifica la antranilato-sintasa, la antranilatofosforribosiltransferasa, la fosforribosilantranilato-isomerasa, la indol-3-glicerolfosfato-sintasa y la triptófano-sintasa.
2. 2.-Microorganismos recombinantes según la reivindicación 1, en los que adicionalmente se sobre-expresa al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos 95% con una secuencia de aminoácidos, seleccionada del grupo:

   a) SEQ ID NO: 2, en donde el polipéptido cumple la función de la sub-unidad grande de la sn-glicerol-3fosfato-deshidrogenasa (anaerobia), b) SEQ ID NO: 4, en donde el polipéptido cumple la función de la subunidad para el anclaje a la membrana de la sn-glicerol-3-fosfato-deshidrogenasa (anaerobia), c) SEQ ID NO: 6, en donde el polipéptido cumple la función de la subunidad pequeña de la sn-glicerol-3fosfato-deshidrogenasa (anaerobia), d) SEQ ID NO: 8, en donde el polipéptido presenta la actividad de la glicerol-3-fosfato-dehidrogenasa

   (aerobia), e) SEQ ID NO: 10, en donde el polipéptido presenta la actividad de la azufre transferasa, f) SEQ ID NO: 12, en donde el polipéptido presenta la actividad del facilitador de glicerol GlpF, g) SEQ ID NO: 14, h) SEQ ID NO: 18, en donde el polipéptido presenta la actividad de la glicerol fosfodiesterasa periplasmática, i) SEQ ID NO: 20, en donde el polipéptido presenta la actividad de la glicerol-3-fosfato-permeasa, j) SEQ ID NO: 22, en donde el polipéptido presenta la actividad de la fructosa -1,6-bisfosfatasa II, k) SEQ ID NO: 24, en donde el polipéptido presenta la actividad de la triosafosfato-isomerasa, l) SEQ ID NO: 26, en donde el polipéptido presenta la actividad de la glicerol-deshidrogenasa (dependiente

   de NAD), m) SEQ ID NO: 28, en donde el polipéptido cumple la función del dominio N-terminal de la dihidroxiacetonaquinasa, n) SEQ ID NO: 30, en donde el polipéptido cumple la función del dominio C-terminal de la dihidroxiacetonaquinasa, o) SEQ ID NO: 32, en donde el polipéptido cumple la función de la subunidad de la proteína PTS de la

   dihidroxiacetona-quinasa, p) SEQ ID NO: 34, en donde el polipéptido cumple la función del activador del operón dha, q) SEQ ID NO: 36, en donde el polipéptido cumple la función de la fructosa-6-fosfato-aldolasa I, y r) SEQ ID NO: 38, en donde el polipéptido cumple la función de la fructosa-6-fosfato-aldolasa II.
3. 3.- Microorganismos según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizados por que los polipéptidos presentan

   secuencias de aminoácidos que tienen una identidad del 100% con una de las secuencias elegidas del grupo: SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 36 y SEQ ID No. 38.
4. 4.- Microorganismos según la reivindicación 1, caracterizados por que contienen al menos un polinucleótido sobreexpresado que codifica un polipéptido con la actividad de la glicerol quinasa GlpK dependiente de ATP, seleccionado del grupo: a) polinucleótido con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 15, b) polinucleótido con la secuencia de nucleótidos que corresponde a la SEQ ID NO: 15 en el marco de la

   degeneración del código genético,

   c) secuencia de polinucleótidos con una secuencia que se hibrida bajo condiciones rigurosas con la secuencia complementaria a la SEQ ID NO: 15, alcanzándose las condiciones rigurosas mediante una etapa de lavado en la que la temperatura se extiende a lo largo de un intervalo de 64ºC a 68ºC y la concentración de sales del tampón se extiende a lo largo de un intervalo de 2xSSC a 0,1 SSC.
5. 5.- Microorganismos según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizados por que contienen al menos un

   polinucleótido potenciado o sobre-expresado, elegido del grupo:

   a) polinucleótido con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 35 o SEQ ID No. 37;

   b) polinucleótido con una secuencia de nucleótidos que corresponde a SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 35 o SEQ ID No. 37 en el marco de la degeneración del código genético;

   c) secuencia de polinucleótidos con una secuencia que se hibrida bajo condiciones rigurosas con la secuencia complementaria a la secuencia SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 35 o SEQ ID No. 37, alcanzándose las condiciones rigurosas preferiblemente mediante una etapa de lavado en la que la temperatura se extiende a lo largo de un intervalo de 64ºC a 68ºC y la concentración de sales del tampón se extiende a lo largo de un intervalo de 2xSSC a 0,1xSSC.
6. 6.- Microorganismos según las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que se preparan mediante transformación, transducción, conjugación o mediante una combinación de estos métodos, con un vector que contiene al menos uno o varios de los polinucleótidos mencionados, o sus alelos y/o un promotor.
7. 7.- Microorganismos según las reivindicaciones 1 a 6, en los que el número de copias de al menos uno de los polinucleótidos o de los alelos de los mismos se presenta incrementado en al menos 1, comparado con el microorganismo o cepa parental no recombinante.
8. 8.- Microorganismos según la reivindicación 7, en los que el número de copias incrementado en al menos 1 se consigue mediante integración del gen o de los alelos en el cromosoma de los microorganismos.
9. 9.- Microorganismos según la reivindicación 7, caracterizados por que el aumento del número de copias 1 se alcanza mediante un vector que se replica de forma extracromosómica.
10. 10.-Microorganismos según las reivindicaciones 1 a 9, caracterizados por que para alcanzar

    la potenciación a) se incorporan casetes de expresión o promotores aguas arriba de al menos uno de los polinucleótidos mencionados.
11. 11.- Microorganismos según las reivindicaciones 1 a 9, caracterizados por que la expresión de al menos uno de los polinucleótidos mencionados se encuentra bajo el control de un promotor que potencia la expresión del gen.
12. 12.- Microorganismos según las reivindicaciones 1 a 11, caracterizados por que mediante la potenciación de al menos uno de los polinucleótidos mencionados se aumenta en al menos un 10% la concentración o actividad del respectivo producto GlpK (proteína) codificado, referido a la actividad o concentración del producto génico en el microorganismo o cepa parental no recombinante referido al polinucleótido.
13. 13.- Procedimiento para la preparación de L-treonina o L-triptófano mediante fermentación de microorganismos recombinantes de la especie Escherichia coli, caracterizado por que

    a) los mencionados microorganismos productores del L-aminoácido, en los que se potencia o sobre-expresa un polinucleótido que codifica un polipéptido, cuya secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 95% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, presentando el polipéptido la actividad de la glicerol quinasa GlpK (dependiente de ATP) se cultiva en un medio que contiene una o varias fuentes de C bajo condiciones en las que el Laminoácido mencionado se acumula en el medio o en las células, y

    b) se aísla el L-aminoácido mencionado, en donde la biomasa en su conjunto o porciones permanecen en el producto aislado o se separan por completo. 14.-Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado por que a) los microorganismos productores del L-aminoácido mencionado según las reivindicaciones 1 a 12 se cultivan en un medio que contiene una o varias fuentes de C bajo condiciones en las que el

    L-aminoácido mencionado se acumula en el medio o en las células, y b) se aísla el L-aminoácido mencionado, en donde la biomasa en su conjunto o porciones permanecen en el producto aislado o se separan por completo.
14. 15.- Procedimiento según las reivindicaciones 13 ó 14, caracterizado por que como fuente de C se emplea ≥ 50 a 100% de glicerol.
15. 16.- Procedimiento según las reivindicaciones 13 ó 14, caracterizado por que microorganismos según la reivindicación 2.k), 2.m) a 2.r) se cultivan en un medio de fermentación exento de glicerol.
16. 17.-Procedimiento según las reivindicaciones 13 a 16, caracterizado por que para la preparación de L-treonina se fermentan microorganismos de la especie Escherichia coli, en los que adicionalmente al mismo tiempo se potencia, en particular se sobre-expresa uno o varios de los genes seleccionados del grupo:

    a)

    el gen pyc que codifica la piruvato-carboxilasa de Corynebacterium glutamicum,

    b)

    el gen pps que codifica la fosfoenolpiruvato-sintasa,

    c)

    el gen ppc que codifica la fosfoenolpiruvato-carboxilasa,

    d)

    los genes pntA y pntB que codifican las subunidades de la piridina-transhidrogenasa,

    e)

    el gen rhtC que codifica la proteína inductora de resistencia a treonina,

    f)

    el gen thrE de Corynebacterium glutamicum que codifica la proteína de exportación-soporte de treonina,

    g)

    el gen gdhA que codifica la glutamato-deshidrogenasa,

    h)

    el gen ptsH que codifica la fosfohistidina-proteína-hexosa-fosfotransferasa,

    i)

    el gen ptsI que codifica la enzima I del sistema de fosfotransferasa,

    j)

    el gen crr que codifica el componente IIA específico para glucosa,

    k)

    el gen ptsG que codifica el componente IIBC específico para glucosa,

    l)

    el gen cysK que codifica la cisteína-sintasa A,

    m)

    el gen cysB que codifica el regulador del regulón cys,

    n)

    el gen cysJ que codifica la flavoproteína de la NADPH-sulfito-reductasa,

    o)

    el cen cysI que codifica la hemoproteína de la NADPH-sulfito-reductasa,

    p)

    el gen cysH que codifica la adenililsulfato-reductasa,

    q)

    el gen sucA que codifica la subunidad descarboxilasa de la 2-cetoglutarato deshidrogenasa,

    r)

    el gen sucB que codifica la subunidad E2 de dihidrolipoiltranssuccinasa de la 2-cetoglutarato

    deshidrogenasa,

    s)

    el gen sucC que codifica la subunidad β de la succinil-CoA-sintetasa,

    t)

    el gen sucD que codifica la subunidad α de la succinil-CoA-sintetasa, y

    u)

    el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yibD de Escherichia coli.

17. 18.-Procedimiento según las reivindicaciones 13 a 16, caracterizado por que para la preparación de L-triptófano se fermentan microorganismos de la especie Escherichia coli, en los que adicionalmente al mismo tiempo se potencia, en particular se sobre-expresa uno o varios de los genes seleccionados del grupo:

    a) el gen serA que codifica la 3-fosfoglicerato-deshidrogenasa, b) el gen serB que codifica la fosfoserinafosfatasa, c) el gen serC que codifica la fosfoserina-aminotransferasa, d) el gen aroF que codifica la DHAP-sintasa sensible a L-tirosina, e) el gen aroG que codifica la DHAP-sintasa sensible a L-fenilalanina, f) el gen aroH que codifica la DHAP-sintasa sensible a L-triptófano, g) el gen pps que codifica la fosfoenolpiruvato-sintasa, h) el gen pckA que codifica la fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa, i) el gen tktA que codifica la transcetolasa A, j) el gen tktB que codifica la transcetolasa B, y k) el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yddG de Escherichia coli. 19.-Procedimiento según las reivindicaciones 13 a 17, caracterizado por que para la

    preparación de L-treonina se fermentan microorganismos de la especie Escherichia coli, en los que adicionalmente al mismo tiempo se potencia, en particular se elimina o se reduce la expresión de uno o varios de los genes seleccionados del grupo:

    a) el gen tdh que codifica la treonina-deshidrogenasa, b) el gen mdh que codifica la malato-deshidrogenasa, c) el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yjfA de Escherichia coli, d) el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) ytfP de Escherichia coli, e) el gen pckA que codifica la enzima fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa, f) el gen poxB que codifica la piruvato-oxidasa, g) el gen dgsA que codifica el regulador de DgsA del sistema de fosfotransferasa, h) el gen fruR que codifica el represor de fructosa, i) el gen rpoS que codifica al factor Sigma38, j) el gen aspA que codifica la aspartato amonio-liasa, y k) el gen glpR que codifica el represor del regulón de glp. 20.-Procedimiento según las reivindicaciones 13 a 16 y 18, caracterizado por que para la

    preparación de L-triptófano se fermentan microorganismos de la especie Escherichia coli, en los que adicionalmente al mismo tiempo se potencia, en particular se elimina o se reduce la expresión de uno o varios de los genes seleccionados del grupo:

    a) el gen tnaA que codifica la triptofanasa, b) el gen trpR que codifica el represor del operón trp, c) el gen tyrA que codifica la corismato-mutasa T y prefenato-deshidrogenasa, d) el gen pheA que codifica la corismato-mutasa P y prefenato-deshidrogenasa,

    e)

    el gen mtr que codifica la proteína de transporte específica para triptófano,

    f)

    el gen tnaB que codifica la triptófano-permeasa,

    5

    g)

    el gen aroP que codifica el transportador para aminoácidos aromáticos,

    h)

    el gen sdaA que codifica la L-serina desaminasa,

    10

    i) el gen pgi que codifica la glucosa-6-fosfato-isomerasa,

    j)

    el gen tyrB que codifica la tirosina-aminotransferasa, y

    k)

    el gen glpR que codifica el represor del regulón glp.

    15