ES2443996T3 - Anticuerpos y moléculas derivadas de los mismos que se unen a proteínas STEAP-1 - Google Patents

Anticuerpos y moléculas derivadas de los mismos que se unen a proteínas STEAP-1 Download PDF

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Abstract

El anticuerpo monoclonal designado X120.545.1.1 y nº de acceso de ATCC asignado: PTA-5803 o una forma humanizada de dicho anticuerpo; o un fragmento de dicho anticuerpo o forma humanizada que contiene el dominio de unión a antígeno de dicho anticuerpo o forma humanizada; en el que la forma humanizada y el fragmento se unen específicamente a STEAP-1.

Description

Anticuerpos y moléculas derivadas de los mismos que se unen a proteínas STEAP-1
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La invención descrita en el presente documento se refiere a anticuerpos, además de a fragmentos de unión de los mismos y a moléculas manipuladas de los mismos, que se unen a proteínas, llamadas STEAP-1. La invención se refiere además a procedimientos de diagnóstico, pronóstico, profilácticos y terapéuticos y a composiciones útiles en el tratamiento de cánceres que expresan STEAP-1.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0002] El cáncer es la segunda causa frecuente de muerte humana junto a la enfermedad coronaria. En el mundo, millones de personas mueren de cáncer cada año. En Estados Unidos solo, como se informa por la Sociedad americana del cáncer, el cáncer produce la muerte de más de medio millón de personas anualmente, con más de 1,2 millones de casos nuevos diagnosticados por año. Aunque las muertes de enfermedad cardíaca han ido disminuyendo significativamente, aquellas resultantes de cáncer generalmente están en aumento. Se predice que a principios del próximo siglo el cáncer sea la causa principal de muerte.
[0003] En el mundo, varios cánceres destacan como las causas principales de mortalidad. En particular, los carcinomas de pulmón, próstata, mama, colon, páncreas, ovario y vejiga representan la causa primaria de muerte por cáncer. Estos y prácticamente todos los otros carcinomas comparten una característica mortal común. Con muy pocas excepciones, la enfermedad metastásica de un carcinoma es mortal. Además, incluso para aquellos pacientes con cáncer que inicialmente sobreviven a sus cánceres primarios, la experiencia común ha mostrado que sus vidas están espectacularmente alteradas. Muchos pacientes con cáncer experimentan fuertes ansiedades accionadas por la conciencia de las posibilidades de reaparición o fracaso del tratamiento. Muchos pacientes con cáncer experimentan debilitaciones físicas tras el tratamiento. Además, muchos pacientes con cáncer experimentan una reaparición.
[0004] En el mundo, el cáncer de próstata es el cuarto cáncer más prevalente en el hombre. En América del norte y Europa del norte, es con mucho el cáncer más común en hombres y es la segunda causa principal de muerte por cáncer en el hombre. En Estados Unidos solo, más de 30.000 hombres mueren anualmente de esta enfermedad
-
segunda sólo al cáncer de pulmón. A pesar de la magnitud de estas cifras, todavía no hay tratamiento eficaz para el cáncer de próstata metastásico. La prostatectomía quirúrgica, radioterapia, terapia de ablación de hormonas, castración quirúrgica y quimioterapia continúan siendo las principales modalidades de tratamiento. Desafortunadamente, estos tratamientos son ineficaces para muchos y frecuentemente están asociados a consecuencias no deseables.
[0005] En el frente del diagnóstico, la falta de un marcador de tumor de próstata que pueda detectar con exactitud tumores localizados en el estado temprano sigue siendo una limitación significativa en el diagnóstico y la atención de esta enfermedad. Aunque el ensayo de antígeno prostático específico (PSA) en suero ha sido una herramienta muy útil, sin embargo se considera ampliamente que su especificidad y utilidad general carecen de varios aspectos importantes.
[0006] El progreso en identificar marcadores específicos adicionales para cáncer de próstata ha mejorado por la generación de xenoinjertos de cáncer de próstata que pueden recapitular diferentes estados de la enfermedad enratones. Los xenoinjertos de LAPC (cáncer de próstata de Los Ángeles) son xenoinjertos de cáncer de próstata que han sobrevivido a pase por ratones inmunodeficientes combinados graves (SCID) y han presentado la capacidad de imitar la transición de dependencia de andrógenos a independencia de andrógenos (Klein y col., 1997, Nat. Med. 3:402). Marcadores de cáncer de próstata más recientemente identificados incluyen PCTA-1 (Su y col., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7252), antígeno prostático específico de membrana (PSM) (Pinto y col., Clin Cancer Res 1996 Sep 2 (9): 1445-51), STEAP (Hubert y col., Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Dec 7; 96(25): 14523-8) y antígeno de citoblasto de próstata (PSCA) (Reiter y col., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1735).
[0007] Aunque los marcadores previamente identificados tales como PSA, PSM, PCTA y PSCA han facilitado esfuerzos para diagnosticar y tratar cáncer de próstata, existe la necesidad de la identificación de marcadores y dianas terapéuticas adicionales para cánceres de próstata y relacionados con el fin de mejorar adicionalmente el diagnóstico y la terapia.
El carcinoma de células renales (CCR) representa aproximadamente el 3 por ciento de los tumores malignos en adultos. Una vez los adenomas alcanzan un diámetro de 2 a 3 cm, existe potencial maligno. En el adulto, los dos tumores renales malignos principales son adenocarcinoma de células renales y carcinoma de células transicionales de la pelvis renal o uréter. La incidencia de adenocarcinoma de células renales se estima en más de 29.000 casos en Estados Unidos, y más de 11.600 pacientes murieron de esta enfermedad en 1998. El carcinoma de células transicionales es menos frecuente, con una incidencia de aproximadamente 500 casos por año en Estados Unidos.
[0008] La cirugía ha sido la terapia primaria para adenocarcinoma de células renales durante muchas décadas. Hasta recientemente, la enfermedad metastásica ha sido resistente a cualquier terapia sistémica. Con los recientes desarrollos en terapias sistémicas, particularmente inmunoterapias, el carcinoma de células renales metastásico puede abordarse agresivamente en pacientes apropiados con una posibilidad de respuestas duraderas. Sin embargo, hay una necesidad continua de terapias eficaces para estos pacientes.
[0009] De todos los nuevos casos de cáncer en Estados Unidos, el cáncer de vejiga representa aproximadamente el 5 por ciento en hombres (quinta neoplasia más común) y el 3 por ciento en mujeres (octava neoplasia más común). La incidencia está aumentando lentamente, simultáneamente a una población cada vez mayor. En 1998 hubo un cálculo aproximado de 54.500 casos, que incluyeron 39.500 en hombres y 15.000 en mujeres. La incidencia ajustada a la edad en Estados Unidos es 32 por cada 100.000 para hombres y ocho por cada
100.000 en mujeres. La relación histórica hombre/mujer de 3:1 puede estar disminuyendo relacionado con los patrones de tabaquismo en las mujeres. Hay un cálculo aproximado de 11.000 muertes de cáncer de vejiga en 1998
(7.800 en hombres y 3.900 en mujeres). La incidencia y mortalidad del cáncer de vejiga aumentan considerablemente con la edad y serán un problema cada vez mayor a medida que la población se vuelve cada vez mayor.
[0010] La mayoría de los cánceres de vejiga se producen en la vejiga. El cáncer de vejiga se trata con una combinación de resección transuretral (RTU) de la vejiga y quimioterapia intravesical o inmunoterapia. La naturaleza multifocal y recurrente del cáncer de vejiga señala las limitaciones de la RTU. La mayoría de los cánceres invasivos de músculo no son curados por RTU sola. La cistectomía radical y la diversión urinaria son el medio más eficaz para eliminar el cáncer, pero lleva un impacto innegable sobre la función urinaria y sexual. Continúa habiendo una necesidad significativa para las modalidades de tratamiento que son beneficiosas para pacientes con cáncer de vejiga.
[0011] Un cálculo estimado de 130.200 casos de cáncer colorrectal se produjeron en 2000 en Estados Unidos, que incluyeron 93.800 casos de cáncer de colon y 36.400 de cáncer rectal. Los cánceres colorrectales son el tercer cáncer más común en hombres y mujeres. Las tasas de incidencia disminuyeron significativamente durante 1992-1996 (-2,1 % por año). La investigación sugiere que estas diminuciones han sido debidas a un aumento del cribado y extirpación de pólipos, prevención de la progresión de pólipos a cánceres invasivos. Hubo un cálculo estimado de 56.300 muertes (47.700 de cáncer de colon, 8.600 de cáncer rectal) en 2000, representando aproximadamente el 11 % de todas las muertes por cáncer en EE.UU.
[0012] Actualmente, la cirugía es la forma más común de terapia para el cáncer colorrectal, y para cánceres que no se han diseminado es frecuentemente curativa. La quimioterapia, o quimioterapia más radiación, se da antes
o después de la cirugía a la mayoría de los pacientes cuyo cáncer ha perforado profundamente la pared del intestino
o se ha diseminado a los ganglios linfáticos. Ocasionalmente se necesita una colostomía permanente (creación de una abertura abdominal para la eliminación de desechos del cuerpo) para cáncer de colon y frecuentemente es poco requerida para cáncer rectal. Continúa habiendo una necesidad de modalidades de diagnóstico y tratamiento eficaces para cáncer colorrectal.
[0013] Hubo un cálculo estimado de 164.100 nuevos casos de cáncer de pulmón y bronquial en 2000, representando el 14 % de todos los diagnósticos de cáncer en EE.UU. La tasa de incidencia de cáncer de pulmón y bronquial está disminuyendo significativamente en hombres, desde un máximo de 86,5 por cada 100.000 en 1984 a 70,0 en 1996. En los 90, la tasa de aumento entre mujeres empezó a disminuir. En 1996, la tasa de incidencia en mujeres era de 42,3 por cada 100.000.
[0014] El cáncer de pulmón y bronquial produjo un cálculo estimado de 156.900 muertes en 2000, representando el 28 % de todas las muertes por cáncer. Durante 1992-1996, la mortalidad de cáncer de pulmón disminuyó significativamente entre hombres (-1,7 % por año), mientras que las tasas para mujeres todavía fueron aumentando significativamente (0,9 % por año). Desde 1987, más mujeres han muerto cada año de cáncer de pulmón que de cáncer de mama que, durante más de 40 años, fue la principal causa de muerte por cáncer en las mujeres. La disminución de las tasas de incidencia y mortalidad por cáncer de pulmón se produjo lo más probablemente por la disminución de las tasas de tabaquismo durante los 30 años previos; sin embargo, la disminución en los patrones de tabaquismo entre mujeres se quedó atrás de los de hombres. Es de interés que, aunque han disminuido los descensos en el uso de tabaco en adultos, el uso del tabaco en la juventud está aumentado de nuevo.
[0015] Las opciones de tratamiento para cáncer de pulmón y bronquial se determinan por el tipo y el estado del cáncer e incluyen cirugía, radioterapia y quimioterapia. Para muchos cánceres localizados, la cirugía es normalmente el tratamiento de elección. Debido a que la enfermedad normalmente se ha diseminado para el momento en el que se descubre, la radioterapia y quimioterapia son frecuentemente necesarias en combinación con cirugía. La quimioterapia sola o combinada con radiación es el tratamiento de elección para cáncer de pulmón de células pequeñas; con esta pauta, un gran porcentaje de pacientes experimentan remisión, que en algunos casos es de larga duración. Sin embargo, hay una necesidad continua de estrategias de tratamiento y diagnóstico eficaces para cánceres de pulmón y bronquiales.
[0016] Se esperó que se produjera un cálculo estimado de 182.800 nuevos casos invasivos de cáncer de mama entre mujeres en Estados Unidos durante 2000. Adicionalmente, se esperó que se diagnosticaran aproximadamente 1.400 nuevos casos de cáncer de mama en hombres en 2000. Después de aumentar aproximadamente el 4 % por año en los 80, las tasas de incidencia de cáncer de mama en mujeres se han estabilizado en los 90 a aproximadamente 110,6 casos por 100.000.
[0017] En EE.UU. solo hubo un cálculo estimado de 41.200 muertes (40.800 mujeres, 400 hombres) en 2000 debido a cáncer de mama. El cáncer de mama está clasificado como el segundo entre las muertes por cáncer en mujeres. Según los datos más recientes, las tasas de mortalidad disminuyeron significativamente durante 1992-1996 con la mayor disminución en mujeres jóvenes, tanto blancas como negras. Estas disminuciones fueron probablemente el resultado de detección temprana y tratamiento mejorado.
[0018] Teniendo en cuenta las circunstancias médicas y las preferencias del paciente, el tratamiento de cáncer de mama puede implicar lumpectomía (extirpación local del tumor) y eliminación de los ganglios linfáticos debajo del brazo; mastectomía (extirpación quirúrgica de la mama) y extirpación de los ganglios linfáticos debajo del brazo; radioterapia; quimioterapia; o terapia con hormonas. Frecuentemente se usan dos o más procedimientos en combinación. Numerosos estudios han mostrado que, para enfermedad en estado temprano, las tasas de supervivencia a largo plazo después de lumpectomía más radioterapia son similares a las tasas de supervivencia después de mastectomía radical modificada. Avances significativos en las técnicas de reconstrucción proporcionan varias opciones para la reconstrucción de la mama después de la mastectomía. Recientemente, tal reconstrucción se ha hecho al mismo tiempo que la mastectomía.
[0019] La extirpación local de carcinoma ductal in situ (CDIS) con cantidades adecuadas de tejido de mama normal de alrededor puede prevenir la reaparición local de CDIS. La radiación a la mama y/o tamoxifeno pueden reducir la probabilidad de que el CDIS se produzca en el tejido de mama restante. Esto es importante debido a que el CDIS, si se deja sin tratar, puede desarrollarse en cáncer de mama invasivo. Sin embargo, hay graves efectos secundarios o secuelas a estos tratamientos. Por tanto, hay una necesidad de tratamientos eficaces para el cáncer de mama.
[0020] Hubo un cálculo estimado de 23.100 nuevos casos de cáncer de ovario en Estados Unidos en 2000. Representa el 4 % de todos los cánceres entre mujeres y se clasifica como el segundo entre cánceres ginecológicos. Durante 1992-1996, las tasas de incidencia de cáncer de ovario fueron disminuyendo significativamente. Como consecuencia del cáncer de ovario hubo un cálculo estimado de 14.000 muertes en 2000. El cáncer de ovario produce más muertes que ningún otro cáncer del aparato reproductor femenino.
[0021] La cirugía, radioterapia y quimioterapia son opciones de tratamiento para cáncer de ovario. La cirugía normalmente incluye la extirpación de uno o ambos ovarios, las trompas de Falopio (salpingo-ooforectomía) y el útero (histerectomía). En algunos tumores muy tempranos sólo se extirpará el ovario implicado, especialmente en mujeres jóvenes que desean tener niños. En enfermedad avanzada se hace un intento por extirpar toda la enfermedad intra-abdominal para potenciar el efecto de la quimioterapia. Continúa habiendo una necesidad importante de opciones de tratamiento eficaces para cáncer de ovario.
[0022] Hubo un cálculo estimado de 28.300 nuevos casos de cáncer pancreático en Estados Unidos en 2000. Durante los últimos 20 años, las tasas de cáncer pancreático han disminuido en hombres. Las tasas entre mujeres han permanecido aproximadamente constantes, pero pueden estar empezando a disminuir. El cáncer pancreático produjo un cálculo estimado de 28.200 muertes en 2000 en Estados Unidos. Durante los últimos 20 años ha habido una disminución ligera, pero significativa, en las tasas de mortalidad entre hombres (aproximadamente -0,9 % por año), mientras que las tasas han aumentado ligeramente entre mujeres.
[0023] La cirugía, radioterapia y quimioterapia son opciones de tratamiento para cáncer pancreático. Estas opciones de tratamiento pueden prolongar la supervivencia y/o aliviar síntomas en muchos pacientes, pero no es probable que produzcan una cura para la mayoría. Hay una necesidad significativa de opciones terapéuticas y dediagnóstico adicionales para cánceres. Éstas incluyen el uso de anticuerpos, vacunas y moléculas pequeñas como modalidades de tratamiento. Adicionalmente, también existe una necesidad de usar estas modalidades como herramientas de investigación para diagnosticar, detectar, monitorizar y adicionalmente el estado de la materia en todas las áreas de tratamiento del cáncer y estudios.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0024] La invención proporciona anticuerpos designados X120.545.1.1 y nº de acceso de ATCC asignado PTA-5803, además de fragmentos de unión de los mismos y moléculas manipuladas de los mismos, como se define en la reivindicación 1, que se unen a proteínas STEAP-1 y fragmentos de polipéptidos de proteínas STEAP-1. Como se usa en el presente documento, el término STEAP-1 es sinónimo de 8P1D4. La invención comprende anticuerpos monoclonales, anticuerpos murinos y de otros mamíferos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y completamente humanos, y anticuerpos marcados con un marcador detectable o agente terapéutico. En ciertas realizaciones existe la condición de que la secuencia de ácidos nucleicos entera de la Figura 2 no esté codificada y/o la secuencia de aminoácidos entera de la Figura 2 no se prepare. La secuencia de ácidos nucleicos entera de la Figura 2 puede codificarse y/o la secuencia de aminoácidos entera de la Figura 2 puede prepararse, cualquiera de las cuales están en formas de dosis unitaria humana respectiva.
[0025] La divulgación proporciona además procedimientos para detectar la presencia y estado de polinucleótidos y proteínas STEAP-1 en diversas muestras biológicas, además de procedimientos para identificar células que expresan STEAP-1. La divulgación proporciona procedimientos para monitorizar productos del gen STEAP-1 en un tejido o muestra de hematología que tiene o que se sospecha que tiene alguna forma de desregulación del crecimiento tal como cáncer.
[0026] La divulgación proporciona además diversas composiciones inmunogénicas o terapéuticas y estrategias para tratar cánceres que expresan STEAP-1, tales como los cánceres de tejidos enumerados en la Tabla I, que incluyen terapias que tienen como objetivo inhibir la transcripción, traducción, procesamiento o función de STEAP-1, además de vacunas para el cáncer. La divulgación proporciona composiciones y procedimientos que las comprenden, para tratar un cáncer que expresa STEAP-1 en un sujeto humano en el que la composición comprende un vehículo adecuado para uso humano y una dosis unitaria humana de uno o más de un agente que inhibe la producción o función de STEAP-1. Preferentemente, el vehículo es un vehículo exclusivamente humano. El agente puede ser un resto que es inmunorreactivo con la proteína STEAP-1. Ejemplos no limitantes de tales restos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos (tales como anticuerpos monocatenarios, monoclonales, policlonales, humanizados, quiméricos o humanos), equivalentes funcionales de los mismos (tanto si se producen naturalmente como son sintéticos), y combinaciones de los mismos. Los anticuerpos pueden conjugarse con un resto de diagnóstico o terapéutico. El agente puede ser una molécula pequeña como se define en el presente documento.
[0027] El agente puede comprender uno o más de un péptido que comprende un epítope de linfocitos T citotóxico (CTL) que se une a molécula HLA de clase I en un ser humano para provocar una respuesta de CTL a STEAP-1 y/o uno o más de un péptido que comprende un epítope de linfocitos T colaboradores (HTL) que se une a molécula HLA de clase II en un ser humano para provocar una respuesta de HTL. Los péptidos pueden estar sobre las mismas moléculas de polipéptido o sobre una o más separadas. El agente puede comprender una o más de una molécula de ácido nucleico que expresa uno o más de uno de los péptidos estimulantes de la respuesta de CTL o HTL como se ha descrito anteriormente. Una o más de una molécula de ácido nucleico puede expresar un resto que es inmunológicamente reactivo con STEAP-1 como se ha descrito anteriormente. La una o más de una molécula de ácido nucleico también puede ser, o codificar, una molécula que inhibe la producción de STEAP-1. Ejemplos no limitantes de tales moléculas incluyen, pero no se limitan a, aquellos complementarios a una secuencia de nucleótidos esencial para la producción de STEAP-1 (por ejemplo, secuencias o moléculas antisentido que forman una hélice triple con una hélice doble de nucleótidos esencial para la producción de STEAP-1) o una ribozima eficaz para lisar ARNm de STEAP-1.
[0028] También se proporcionan epítopes de anticuerpo que comprenden una región de péptido, o un oligonucleótido que codifica la región de péptido, que tienen una, dos, tres, cuatro o cinco de las siguientes características:
i) una región de péptido de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de número entero hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual a o superior a 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o que tiene un valor igual a 1,0, en el perfil de hidrofilia de la Figura 5;
ii) una región de péptido de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de número entero hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual a o inferior a 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, o que tiene un valor igual a 0,0, en el perfil de hidropaticidad de la Figura 6;
iii) una región de péptido de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de número entero hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual a o superior a 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o que tiene un valor igual a 1,0, en el perfil de porcentaje de residuos accesibles de la Figura 7;
iv) una región de péptido de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de número entero hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual a o superior a 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o que tiene un valor igual a 1,0, en el perfil de flexibilidad promedio de la Figura 8; o v) una región de péptido de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de número entero hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual a o superior a 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o que tiene un valor igual a 1,0, en el perfil de giro beta de la Figura 9.
[0029] La presente divulgación también se refiere a un gen, designado STEAP-1, que se ha encontrado que se expresa en exceso en el (los) cáncer(es) enumerado(s) en la Tabla I. El análisis de expresión por transferencia Northern de la expresión génica de STEAP-1 en tejidos normales muestra un patrón de expresión limitado en tejidos adultos. Se proporcionan secuencias de nucleótidos (Figura 2) y aminoácidos (Figura 2 y Figura 3) de STEAP-1: El perfil relacionado con tejido de STEAP-1 en tejidos adultos normales, combinado con la expresión en exceso observada en los tejidos enumerados en la Tabla I, muestra que STEAP-1 se expresa anómalamente en exceso en al menos algunos cánceres, y así sirve de diana de diagnóstico, profiláctica, de pronóstico y/o terapéutica útil para cánceres del (de los) tejido(s) tal(es) como aquellos enumerados en la Tabla I.
[0030] La divulgación proporciona polinucleótidos correspondientes o complementarios a todos o parte de los genes STEAP-1, ARNm y/o secuencias codificantes, preferentemente en forma aislada, que incluye polinucleótidos que codifican proteínas relacionadas con STEAP-1 y fragmentos de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, o más de 25 aminoácidos contiguos; al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100 o más de 100 aminoácidos contiguos de una proteína relacionada con STEAP-1, además de los propios péptidos/proteínas; ADN, ARN, híbridos de ADN/ARN, y moléculas, polinucleótidos u oligonucleótidos relacionados complementarios o que tienen al menos una homología del 90 % con los genes STEAP-1 o secuencias de ARNm o partes de los mismos, y polinucleótidos u oligonucleótidos que se hibridan con los genes STEAP-1, ARNm, o con polinucleótidos que codifican STEAP-1. También se proporcionan medios para aislar ADNc y los genes que codifican STEAP-1. También se proporcionan moléculas de ADN recombinantes que contienen polinucleótidos de STEAP-1, células transformadas o transducidas con tales moléculas, y sistemas de huésped-vector para la expresión de productos del gen STEAP-1.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
[0031]
Figura 1. La secuencia de SSH de STEAP-1 de 436 nucleótidos.
Figura 2. La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 1 de STEAP-1 (también llamada “STEAP-1 v.1” o “variante 1 de STEAP-1”) se muestra en la Figura 2A. La metionina de inicio está subrayada. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 66-1085, incluyendo el codón de parada.
La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 2 de STEAP-1 (también llamada “STEAP-1 v.2”) se muestra en la Figura 2B. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 96-872, incluyendo el codón de parada.
La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 3 de STEAP-1 (también llamada “STEAP-1 v.3”) se muestra en la Figura 2C. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 96-944, incluyendo el codón de parada.
La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 4 de STEAP-1 (también llamada “STEAP-1 v.4”) se muestra en la Figura 2D. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 96-872, incluyendo el codón de parada.
La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 5 de STEAP-1 (también llamada “STEAP-1 v.5”) se muestra en la Figura 2E. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 96-872, incluyendo el codón de parada.
La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 6 de STEAP-1 (también llamada “STEAP-1 v.6”) se muestra en la Figura 2F. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 96-872, incluyendo el codón de parada.
La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 7 de STEAP-1 (también llamada “STEAP-1 v.7”) se muestra en la Figura 2G. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 96-872, incluyendo el codón de parada.
La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 8 de STEAP-1 (también llamada “STEAP-1 v.8”) se muestra en la Figura 2H. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 96-872, incluyendo el codón de parada.
La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 9 de STEAP-1 (también llamada “STEAP-1 v.9”) se muestra en la Figura 2I. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 96-872, incluyendo el codón de parada.
La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 10 de STEAP-1 (también llamada “STEAP-1 v.10”) se muestra en la Figura 2J. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 96-872, incluyendo el codón de parada.
La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 11 de STEAP-1 (también llamada “STEAP-1 v.11”) se muestra en la Figura 2K. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 96-872, incluyendo el codón de parada.
La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 12 de STEAP-1 (también llamada “STEAP-1 v.12”) se muestra en la Figura 2L. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 96-872, incluyendo el codón de parada.
La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 13 de STEAP-1 (también llamada “STEAP-1 v.13”) se muestra en la Figura 2M. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 96-872, incluyendo el codón de parada.
La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 14 de STEAP-1 (también llamada “STEAP-1 v.14”) se muestra en la Figura 2N. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 96-872, incluyendo el codón de parada.
La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 15 de STEAP-1 (también llamada “STEAP-1 v.15”) se muestra en la Figura 2O. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 96-872, incluyendo el codón de parada.
La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 16 de STEAP-1 (también llamada “STEAP-1 v.16”) se muestra en la Figura 2P. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 96-872, incluyendo el codón de parada.
La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 17 de STEAP-1 (también llamada “STEAP-1 v.17”) se muestra en la Figura 2Q. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 96-872, incluyendo el codón de parada. Como se usa en el presente documento, una referencia a STEAP-1 incluye todas las variantes de la misma, que incluyen aquellas mostradas en las Figuras 10, 11 y/o 12, a menos que el contexto indique claramente de otro modo.
Figura 3. La secuencia de aminoácidos de STEAP-1 v.1 se muestra en la Figura 3A; tiene 339 aminoácidos.
La secuencia de aminoácidos de STEAP-1 v.2 se muestra en la Figura 3B; tiene 258 aminoácidos.
La secuencia de aminoácidos de STEAP-1 v.3 se muestra en la Figura 3C; tiene 282 aminoácidos.
La secuencia de aminoácidos de STEAP-1 v.4 se muestra en la Figura 3D; tiene 258 aminoácidos. Como se usa en el presente documento, una referencia a STEAP-1 incluye todas las variantes de la misma, que incluye aquellas mostradas en las Figuras 10, 11 y/o 12, a menos que el contexto indique claramente de otro modo.
Figura 4. Figura 4A. El alineamiento de secuencias de aminoácidos de STEAP-1 v.1 con proteína relacionada con adiposo inducida por TNFa de ratón (gi/16905133). Figura 4B. El alineamiento de secuencias de aminoácidos de STEAP-1 v.1 con proteína pHyde de rata (gi/21717655/). Figura 4C. Muestra homología de STEAP-1 con antígeno epitelial de seis transmembrana de ratón de la próstata (gi|20820492|).
Figura 5. Perfil de aminoácidos de hidrofilia de la variante 1 de STEAP-1 (Figura 5(a)). Perfil de aminoácidos de hidrofilia de la variante 3 de STEAP-1 (Figura 5(b)), determinados por análisis de secuencias por algoritmo informático usando el procedimiento de Hopp y Woods (Hopp T.P., Woods K.R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828) al que se accede por el sitio web de ProtScale localizado en la malla mundial URL ch/cgibin/protscale.pl) por el servidor de biología molecular ExPasy.
Figura 6. (Figura 6(a)). Perfil de aminoácidos de hidropaticidad de la variante 1 de STEAP-1. Perfil de aminoácidos de hidropaticidad de la variante 3 de STEAP-1, determinados por análisis de secuencias por algoritmo informático usando el procedimiento de Kyte y Doolittle (Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132) al que se accede por el sitio web de ProtScale localizado en la malla mundial URL expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) por el servidor de biología molecular ExPasy.
Figura 7. (Figura 7(a)). Perfil de aminoácidos de porcentaje de residuos accesibles de la variante 1 de STEAP-1. (Figura 7(b)). Perfil de aminoácidos de porcentaje de residuos accesibles de la variante 3 de STEAP-1, determinados por análisis de secuencias por algoritmo informático usando el procedimiento de Janin (Janin J., 1979 Nature 277:491-492) al que se accede por el sitio web de ProtScale localizado en la malla mundial URL expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) por el servidor de biología molecular ExPasy.
Figura 8. (Figura 8(a)). Perfil de aminoácidos de flexibilidad promedio de la variante 1 de STEAP-1. (Figura 8(b)). Perfil de aminoácidos de flexibilidad promedio de la variante 3 de STEAP-1, determinados por análisis de secuencias por algoritmo informático usando el procedimiento de Bhaskaran y Ponnuswamy (Bhaskaran R., y Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255) al que se accede por el sitio web de ProtScale localizado en la malla mundial en URL expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) por el servidor de biología molecular ExPasy.
Figura 9. Figura 9(a)). Perfil de aminoácidos del giro beta de la variante 1 de STEAP-1. (Figura 9(b)). Perfil de aminoácidos de flexibilidad promedio de la variante 3 de STEAP-1, determinados por análisis de secuencias por algoritmo informático usando el procedimiento de Deleage y Roux (Deleage, G., Roux B, 1987 Protein Engineering 1:289-294) al que se accede por el sitio web de ProtScale localizado en la malla mundial en URL expasy.ch/cgibin/protscale.pl) por el servidor de biología molecular ExPasy.
Figura 10. Alineamiento esquemático de variantes de SNP de STEAP-1. Las variantes STEAP-1 v.4 a v.17 son variantes con diferencias en un único nucleótido con respecto a STEAP-1 v.2. Aunque estas variantes de SNP se muestran por separado, también podrían producirse en cualquier combinación y en cualquier variante de transcrito que contuviera los pares de bases, por ejemplo, STEAP-1 v.1 y v.3. El recuadro negro muestra la misma secuencia que STEAP-1 v.2. Los SNP se indican encima del recuadro.
Figura 11. Composiciones de exones de variantes de transcritos de STEAP-1. Esta figura muestra la estructura de las variantes de transcritos sin cola de poli A. Las variantes STEAP-1 v.1, v.2 y v.3 son variantes de transcritos que comparten los mismos exones 2 y 3. El primer exón de STEAP-1 v.1 es 30 bases más corto en el extremo 5' que los primeros exones de las dos otras variantes de transcritos. El cuarto exón de STEAP-1 v.2 es el mismo que el exón 4, intrón 4 y exón 5 combinados de STEAP-1 v.1. En comparación con STEAP-1 v.1, la variante STEAP-1 v.3 tiene un exón adicional cortado y empalmado fuera del intrón 4 de STEAP-1 v.1. Las longitudes de intrones y exones no son proporcionales.
Figura 12. Alineamiento esquemático de variantes de proteína de STEAP-1. Las variantes de proteína se corresponden con variantes de nucleótidos. Las variantes de nucleótidos STEAP-1 v.5 a v.17 en la Figura 10 codifican la misma proteína que STEAP-1 v.2. Las proteínas traducidas de variantes de transcritos STEAP-1 v.1 y
v.3 como se muestra en la Figura 11 pueden contener el aminoácido F (Phe) o L (Leu) en la posición 169. Diferencias individuales de aminoácidos se indicaron encima de los recuadros. Los recuadros negros representan la misma secuencia que STEAP-1 v.1. Los recuadros con diferentes patrones de relleno muestran diferentes secuencias. Números debajo del recuadro se corresponden con STEAP-1 v.1.
Figura 13. Figuras 13(a) - (c). Estructura secundaria y predicción de dominios transmembrana para variantes de la proteína STEAP-1. La estructura secundaria de variantes de la proteína STEAP-1 1 (SEQ ID NO: 46), 2 (SEQ ID NO: 47) y 3 (SEQ ID NO: 48); (Figuras 13a-13c, respectivamente) se predijo usando HNN - Procedimiento de redes neurales jerárquicas (Guermeur, 1997, http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.p)?page=npsa_nn.html), al que se accede desde el servidor de biología molecular ExPasy localizado en la malla mundial en (.expasy.ch/tools/). Este procedimiento predice la presencia y localización de hélices alfa, cadenas extendidas y bobinas al azar de la secuencia de proteínas primaria. También se enumera el porcentaje de la proteína en una estructura secundaria dada. Figuras 13(d), 13(f) y 13(h): Representaciones esquemáticas de la probabilidad de existencia de regiones transmembrana y orientación de la variante 1-3 de STEAP-1, Figuras 13(d), 13(f) y 13(h), respectivamente, basadas en el algoritmo TMpred de Hofmann y Stoffel que utiliza TMBASE (K. Hofmann, W. Stoffel. TMBASE – A database of membrane spanning protein segments. Biol. Chem. Hoppe-Seyer 374:166,1993). Figuras 13(e), 13(g) y 13(i): Representaciones esquemáticas de la probabilidad de la existencia de regiones transmembrana y la orientación extracelular e intracelular de variantes 1-3 de STEAP-1, Figuras 13(e), 13(g) y 13(i), respectivamente, basadas en el algoritmo de TMHMM de Sonnhammer, von Heijne y Krogh (Erik L.L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne y Anders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. En Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, pág. 175-182 Ed J. Glasgow, T. Litflejohn, F. Major,
R. Lathrop, D. Sankoff y C. Sensen Menlo Park, CA: AAAI Press, 1998). A los algoritmos TMpred y TMHMM se accede desde el servidor de biología molecular ExPasy localizado en la malla mundial en (.expasy.ch/tools/).
Figura 14. Figura 14a. Expresión de STEAP-1 en espécimen de paciente con cáncer de estómago. Se extrajo ARN de estómago normal (N) y de 10 especímenes de paciente con cáncer de estómago diferentes (T). Se sondó transferencia Northern con 10 µg de ARN total/carril con secuencia de STEAP-1. Los resultados muestran una fuerte expresión de STEAP-1 de aproximadamente 1,6 kD en los tejidos tumorales de estómago. El panel inferior representa tinción con bromuro de etidio de la transferencia que muestra la calidad de las muestras de ARN. Figura 14b. Expresión de STEAP-1 en tejidos de paciente con cáncer de recto. Se extrajo ARN de recto normal (N), tumores de pacientes con cáncer de recto (T) y metástasis de cáncer de recto (M). Se sondaron transferencias Northern con 10 µg de ARN total con la secuencia de STEAP-1. Los resultados muestran una fuerte expresión de STEAP-1 en los tejidos de paciente con cáncer de recto. El panel inferior representa tinción con bromuro de etidio de la transferencia que muestra la calidad de las muestras de ARN. Figura 14c. Expresión de STEAP-1 en células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC). Se preparó ADNc de la primera cadena a partir de células HUVEC, xenoinjertos de cáncer de próstata LAPC-4AD y LAPC-9AD, además de tejidos de cerebro humano. La normalización se realizó por PCR usando cebadores para actina y GAPDH. Se realizó PCR semi-cuantitativa, usando cebadores para STEAP-1, a 27 y 30 ciclos de amplificación (A). Como control, PCR usando cebadores para actina se muestra en (B). Los resultados muestran una fuerte expresión de STEAP-1 en células HUVEC similar a la expresión detectada en tejidos de xenoinjerto de cáncer de próstata. La expresión de STEAP-1 en células HUVEC indica que la elección como diana de STEAP-1 puede también elegir como diana células endoteliales de la neovasculatura de los tumores. Figura 14(d) y Figura 14(e). Expresión de STEAP-1 en tejidos normales y con cáncer. Se preparó ADNc de la primera cadena a partir de tejidos normales (vejiga, cerebro, corazón, riñón, hígado, pulmón, próstata, bazo, músculo esquelético, testículos, páncreas, colon y estómago), y de conjuntos de especímenes de cáncer de paciente (conjunto de cáncer de próstata, conjunto de cáncer de vejiga, conjunto de cáncer de riñón, conjunto de cáncer de colon, conjunto de cáncer de pulmón, conjunto de cáncer de ovario, conjunto de cáncer de mama, conjunto de metástasis de cáncer, conjunto de cáncer de páncreas, conjunto de xenoinjertos de cáncer de próstata y conjunto de metástasis de próstata al ganglio linfático). La normalización se realizó por PCR usando cebadores para actina. Se realizó PCR semi-cuantitativa, usando cebadores para STEAP-1, a 26 y 30 ciclos de amplificación. En la (Figura 14d) se muestra la imagen de la RT-PCR en gel de agarosa. En la (Figura 14e) se cuantificaron productos de PCR usando el software AlphaImager. Los resultados muestran una fuerte de expresión de STEAP-1 en próstata normal entre todos los tejidos normales probados. La regulación por incremento de la expresión de STEAP-1 se detectó en conjunto de cáncer de próstata, conjunto de cáncer de vejiga, conjunto de cáncer de riñón, conjunto de cáncer de colon, conjunto de cáncer de pulmón, conjunto de cáncer de ovario, conjunto de cáncer de mama y conjunto de cáncer pancreático. La fuerte expresión de STEAP-1 se detectó en conjunto de metástasis de cáncer, conjunto de xenoinjerto de cáncer de próstata y metástasis de próstata al ganglio linfático. Figura 14(f): Expresión de STEAP-1 en especímenes de paciente con linfoma. Se preparó ADNc de la primera cadena a partir de un panel de especímenes de pacientes con linfoma. La normalización se realizó por PCR usando cebadores para actina. Se realizó PCR semi-cuantitativa, usando cebadores para STEAP-1, a 26 y 30 ciclos de amplificación. Las muestras se ejecutaron en un gel de agarosa, y los productos de PCR se cuantificaron usando el software AlphaImager. La expresión se registró como fuerte o media, si la señal se detecta como 26 ó 30 ciclos de amplificación respectivamente, y ausente si no se detecta señal incluso a 30 ciclos de amplificación. Los resultados muestran expresión de STEAP-1 en 8 de los 11 (72,7 %) especímenes de tumor probados.
Figura 15. Tinción de la superficie celular específica de STEAP-1 por mAb M2/92.30. Paneles izquierdos: Análisis de FACS de células 3T3 y Rat1 recombinantes que expresan establemente tanto STEAP-1 (líneas oscuras) como un gen de resistencia a neomicina de control (líneas claras) teñidas con mAb anti-STEAP M2/92.30 (10 µg/ml) y se detectó mAb unido a la superficie celular unido con un reactivo secundario de conjugado de anticuerpo de cabra dirigido contra IgG de ratón-PE. Entonces, las células teñidas se sometieron a análisis de FACS. Como se indica por el desplazamiento fluorescente de las células Rat1-STEAP1 y 3T3-STEAP1 en comparación con las células de control respectivas, el mAb M2/92.30 se une específicamente a STEAP-1 de la superficie celular. Panel derecho: Microscopía fluorescente de células 3T3-STEAP1 teñidas con el mAb M2/92.30 que muestran fluorescencia de la superficie celular brillante.
Figura 16. El mAb para STEAP-1 M2/92.30 reconoce STEAP-1 de la superficie celular sobre xenoinjertos de cáncer de próstata humano. Se tiñeron células de cáncer de próstata LAPC9 con 10 ug/ml de tanto mAb M2/92.30 como con un mAb anti-KLH de control. El mAb unido a superficie se detectó con Ab secundario de cabra conjugado con anti-IgG de ratón-PE. Entonces, las células teñidas se sometieron a análisis de FACS. Estos resultados demuestran que el mAb anti-STEAP-1 M2/120.545 se une específicamente a STEAP-1 endógena de la superficie celular expresada en células de xenoinjerto de cáncer de próstata.
Figura 17. El mAb para STEAP-1 M2/92.30 reconoce STEAP-1 de ratón. Se transfectaron transitoriamente células 293T con tanto pcDNA3.1 que codifica el ADNc de STEAP-1 murina como con un vector vacío. 2 días después las células se recogieron y se tiñeron con mAb anti-STEAP-1 M2/92.30 (10 ug/ml) y se detectó mAb unido a la superficie celular con un reactivo secundario de conjugado de anticuerpo de cabra dirigido contra IgG de ratón-PE. Entonces, las células se sometieron a análisis de FACS. Como se indica por el desplazamiento fluorescente de las células 293T transfectadas con STEAP-1 murina en comparación con las células transfectadas con el vector vacío, el mAb M2/92.30 se une específicamente a proteína STEAP-1 murina.
Figura 18. El mAb para STEAP-1/120.545 reconoce STEAP-1 de la superficie celular. Panel A y Panel B. Células 3T3-neo (A, histogramas rellenos) y 3T3-STEAP1 (A, histogramas sin rellenar) y células Rat1-neo (B, histogramas rellenos) y Rat1-STEAP (B, histogramas sin rellenar) se tiñeron con mAb M2/120.545 (10 ug/ml) y el mAb unido a la superficie se detectó con Ab secundario de cabra conjugado con anti-IgG de ratón-PE. Entonces, las células se sometieron a análisis de FACS. Como se indica por el desplazamiento de fluorescencia de las células 3T3-STEAP1 y Rat1-STEAP1 en comparación con sus controles de neo respectivos, el mAb M2/120.545 se une específicamente a STEAP-1 de la superficie celular. Panel C. Células LNCaP se tiñeron con tanto mAb M2/120.545 como con un mAb anti-KLH de control y se sometieron a análisis de FACS como antes. Panel D. Microscopía de fluorescencia de las células LNCaP teñidas con M2/120.545 que muestran fluorescencia de la superficie celular brillante. Estos resultados demuestran que el mAb M2/120.545 se une específicamente a STEAP-1 de la superficie celular endógena en células LNCaP.
Figura 19. Figura 19(a) Secuencia de ADNc (SEQ ID NO: 49) y de aminoácidos (SEQ ID NO: 50) del clon nº 2 de VH de M2/X92.30. Figura 19(b) Secuencia de ADNc (SEQ ID NO: 51) y de aminoácidos (SEQ ID NO: 52) del clon nº 2 de VL de M2/X92.30. Figura 19(c) Secuencia de ADNc (SEQ ID NO: 53) y de aminoácidos (SEQ ID NO: 54) del clon nº 6 de VL de M2/X92.30. Figura 19(d) Secuencia de ADNc (SEQ ID NO: 55) y de aminoácidos (SEQ ID NO: 56) del clon nº 8 de VL de M2/X120.545.
Figura 20. Figura 20a. Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 57) del clon nº 2 de VH de M2/X92.30.
Figura 20b. Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 58) del clon nº 2 de VL de M2/X92.30.
Figura 20c. Secuencia de ADNc (SEQ ID NO: 59) y de aminoácidos (SEQ ID NO: 60) del clon nº 6 de VL de M2/X92.30.
Figura 20d. Alineamiento de aminoácidos del clon nº 2 de VL de M2/X92.30 (SEQ ID NO: 61) y el clon nº 6 de VL de M2/M92.30 (SEQ ID NO: 62). Figura 20e. Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 63) del clon nº 8 de VL de M2/X120.545.
La secuencia del péptido señal está subrayada.
Figura 21. El mAb para STEAP-1 M2/92.30 reconoce STEAP-1 de la superficie celular en xenoinjertos de cáncer de próstata y de vejiga humano. Se tiñeron células de cáncer de vejiga UGB1 (panel izquierdo) y células de cáncer de próstata LAPC9 (panel derecho) con 10 ug/ml de tanto mAb M2/92.30 como con un mAb anti-KLH de control. El mAb unido a la superficie se detectó con Ab secundario de cabra conjugado con anti-IgG de ratón-PE. Entonces, las células teñidas se sometieron a análisis de FACS. Estos resultados demuestran que el mAb anti-STEAP-1 M2/92.30 se une específicamente a STEAP-1 de la superficie celular endógena expresada en células de xenoinjerto de cáncer de vejiga y de próstata.
Figura 22. Internalización de STEAP-1 por el mAb para STEAP-1/92.30. Se tiñeron células 3T3-STEAP1 a 4 ºC con mAb M2/92.30 (10 ug/ml), se lavaron, luego se incubaron con Ab secundario de cabra conjugado con anti-IgG de ratón-PE a 4 ºC. La mitad de las células se movieron a 37 ºC durante 30 minutos y la otra mitad permaneció a 4 ºC. Entonces, células de cada tratamiento se sometieron a microscopía fluorescente. Las células que quedaron en 4
ºC mostraron fluorescencia de la superficie celular “similar a anillo” brillante. Las células que se movieron a 37 ºC mostraron pérdida de la fluorescencia de la superficie celular “similar a anillo” y aparición de fluorescencia punteada y agregada indicativa de encapuchado e internalización.
Figura 23. Internalización de STEAP-1 por el mAb para STEAP-1 M2/120.545. Se tiñeron células PC3-STEAP1 a 4 ºC con mAb M2/120.545 (10 ug/ml), se lavaron, luego se incubaron con Ab secundario de cabra conjugado con anti-IgG de ratón-PE. La mitad de las células se movieron a 37 ºC durante 30 minutos y la otra mitad permaneció a 4 ºC. Entonces, las células de cada tratamiento se sometieron a microscopía fluorescente. Las células que
permanecieron a 4 ºC mostraron fluorescencia de la superficie celular “similar a anillo” brillante. Las células que se movieron a 37 ºC mostraron pérdida de la fluorescencia de la superficie celular “similar a anillo” y aparición de fluorescencia punteada y agregada indicativa de encapuchado e internalización.
Figura 24. Internalización de STEAP-1. Se usaron conjugados de anti-IgG de ratón-saporina (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA) para demostrar que STEAP-1 murina M2/120.545 entra en células diana mediante la expresión de STEAP-1 sobre la superficie de células LNCaP. Se usaron los siguientes protocolos. Se sembraron células LNCaP a 5000 células/90 µl/pocillo en placa de 96 pocillos y se incubaron durante la noche. Se prepararon conjugados de inmunotoxina secundarios (anti-IgG de ratón-saporina y anti-IgG de cabra-saporina) o anti-IgG de ratón en medio de cultivo celular dando una concentración final de 100 ng/ml. El anticuerpo primario se añadió a concentraciones que oscilan de 1-1000 ng/ml. Las placas se incubaron durante 72 horas y la viabilidad se determinó por ensayo de MTT. Los resultados muestran que las células LNCaP se destruyeron en presencia de M2/120.545 y anti-IgG de ratón-saporina. No se detectaron efectos con tanto el anticuerpo secundario solo (anti-IgG de ratón) como conjugados de anticuerpo secundario no específicos (anti-IgG de cabra-saporina). No se observó toxicidad con el anticuerpo primario (M2/120.545) solo probado hasta 1 µg/ml.
Figura 25. Inmunoprecipitación de STEAP-1 por mAb anti-STEAP-1 M2/92.30 y M2/120.545. Se lisaron células 3T3-STEAP1 y 3T3-neo en tampón RIPA (Tris-Cl 25 mM a pH7,4; NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, 1 % de Triton X100, 0,5 % de ácido desoxicólico, 0,1 % de SDS y mezcla de inhibidores de proteasas). Los lisados celulares se aclararon previamente con perlas de proteína G-Sepharose y luego se incubaron con 5 ug de tanto mAb M2/92.30 como M2/120.545 durante 2 horas a temperatura ambiente. Las perlas de proteína G se añadieron y la mezcla se incubó adicionalmente durante 1 hora. Los inmunocomplejos se lavaron y se solubilizaron en tampón de muestra de SDS-PAGE. Entonces, las muestras solubilizadas se sometieron a SDS-PAGE y análisis de transferencia Western usando un mAb de conejo anti-STEAP. También se ejecutaron lisados de células completas de células 293T transfectadas con STEAP-1 como control positivo. Solo se observó una banda inmunorreactiva de ~37 kD en muestras derivadas de células 3T3-STEAP1 indicativa de inmunoprecipitación específica de STEAP-1 por mAb tanto M2/92.30 como M2/120.545.
Figura 26. Efecto de mAb para STEAP-1 sobre el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de próstata humano
LAPC9 en ratones. Se probaron STEAP-1 M2/92.30 y M2/120.545 a dos dosis diferentes de 100 µg y 500 µg. Se usaron PBS y mAb anti-KLH como controles. La cohorte del estudio consistió en 6 grupos con 10 ratones en cada grupo. Los mAb se dosificaron IP dos veces a la semana durante un total de 12 dosis, a partir del mismo día que la inyección de células tumorales. El tamaño del tumor se monitorizó mediante mediciones con compás calibrador dos veces a la semana. Se tomaron la dimensión más larga (L) y la dimensión perpendicular a la misma (W) para calcular el volumen tumoral usando la fórmula: W2xL/2. La concentración de PSA en suero en el día de tratamiento 40 para cada animal se midió usando kit de ELISA comercial. Se usaron la prueba de Kruskal-Wallis y la prueba de la U de Mann-Whitney para evaluar diferencias de crecimiento tumoral y nivel de PSA entre grupos. Todas las pruebas fueron bilaterales con ά=0,05. Los datos muestran que STEAP-1 M2/92.30 y M2/120.545 retardan significativamente el crecimiento de xenoinjerto de próstata humana en un tumor dependiente de la dosis.
Figura 27. Efecto de mAb para STEAP-1 sobre el crecimiento de xenoinjerto de cáncer de próstata humano LAPC9 en ratones. Se probaron STEAP-1 M2/92.30 y M2/120.545 a dos dosis diferentes de 100 µg y 500 µg. Se usaron PBS y mAb anti-KLH como controles. La cohorte del estudio consistió en 6 grupos con 10 ratones en cada grupo. Los mAb se dosificaron IP dos veces a la semana durante un total 12 dosis, a partir del mismo día que la inyección de células tumorales. El tamaño del tumor se monitorizó mediante mediciones con compás calibrador dos veces a la semana. Se tomaron la dimensión más larga (L) y la dimensión perpendicular a ella (W) para calcular el volumen tumoral usando la fórmula: W2 x L/2. La concentración de PSA en suero en el día de tratamiento 40 para cada animal se midió usando kit de ELISA comercial. Se usaron la prueba de Kruskal-Wallis y la prueba de la U de Mann-Whitney para evaluar diferencias de crecimiento tumoral y nivel de PSA entre grupos. Todas las pruebas fueron bilaterales con ά=0,05. Los resultados muestran que STEAP-1 M2/92.30 y M2/120.545 retardan significativamente el crecimiento de xenoinjerto de próstata humana en un tumor dependiente de la dosis.
Figura 28. STEAP-1 indujo fosforilación de ERK-1 y ERK-2. Paneles izquierdos: Se transfectaron células PC3 con gen de resistencia a neomicina solo o con STEAP-1 en el vector pSRa. Las células se cultivaron durante la noche en 0,5 % de SBF, luego se estimularon con 10 % de SBF durante 5 minutos con o sin 10 µg/ml del inhibidor de MEK PD98058. Los lisados celulares se resolvieron por 12,5 % de SDS-PAGE y transferencia Western con antifosfo-ERK (Cell Signaling) y anti-ERK (Zymed). Paneles derechos: Se transfectaron células NIH-3T3 con gen de resistencia a neomicina solo o con STEAP-1 en el vector pSRa. Las células se trataron como antes pero sin el inhibidor de MEK. Además, células NIH-3T3-Neo se trataron con 10 mg/ml de salicilato de Na. La expresión de STEAP-1 induce la fosforilación de ERK-1 y ERK-2 en suero y se inhibió por el inhibidor de MEK cinasas aguas arriba PD98058.
Figura 29. STEAP-1 media en la comunicación célula-célula. Se transfectaron células PC3 con gen de resistencia a neomicina solo o con STEAP-1 o un gen de control en el vector pSRa. Las células receptoras se marcaron con 1 mg/ml de dextrano-rojo Texas y las células donantes se marcaron con 2,5 µg/ml de calceína AM. Las células donantes (verdes) y receptoras (rojas) se co-cultivaron a 37 ºC durante 18-24 horas y se analizaron por microscopía para la co-localización de colorantes fluorescentes. Panel izquierdo: Se usaron células PC3-Neo como tanto donante como receptor. Panel central: Se usaron células PC3-STEAP-1 como tanto donante como receptor. Panel derecho: Se usaron células de control de PC3 como tanto donante como receptor. STEAP-1 indujo la transferencia de calceína a células que contienen dextrano-rojo Texas, que indica que STEAP-1 facilita la comunicación célula-célula.
Figura 30. La comunicación de células requiere expresión de STEAP-1 en células donantes y receptoras. Se transfectaron células PC3 con gen de resistencia a neomicina solo o con STEAP-1 en el vector pSRa. Las células receptoras se marcaron con 1 mg/ml de dextrano-rojo Texas y las células donantes se marcaron con 2,5 µg/ml de calceína AM. Las células donantes (verdes) y receptoras (rojas) se co-cultivaron a 37 ºC durante 18-24 horas y se analizaron por microscopía para la co-localización de colorantes fluorescentes. Paneles superiores: Microscopía óptica; paneles inferiores: Fluorescencia UV. Paneles izquierdos: Células PC3-Neo fueron tanto donantes como receptoras. Paneles centrales: PC3-Neo fueron las células donantes y PC3-STEAP-1 fueron las receptoras. Paneles derechos: Células PC3-STEAP-1 fueron tanto donantes como receptoras. Solo cuando STEAP-1 se expresó en tanto donantes como receptores se detectó la comunicación célula-célula.
Figura 31. Efecto del mAb para STEAP-1/120.545 sobre la unión comunicante. Se transfectaron células PC3 con gen de resistencia a neomicina solo o con STEAP-1 en el vector pSRa. Las células receptoras se marcaron con 1 mg/ml de dextrano-rojo Texas y las células donantes se marcaron con 2,5 µg/ml de calceína AM. Las células donantes (verdes) y receptoras (rojas) se co-cultivaron a 37 ºC durante 18-24 horas y se analizaron por microscopía para la co-localización de colorantes fluorescentes. En todos los experimentos, las mismas células se usaron como donante y aceptor. Las células se incubaron con las cantidades indicadas del mAb para STEAP-1/120.545 durante 10 minutos antes de sembrarlas y el mAb se mantuvo en el cultivo durante 24 horas antes del análisis. STEAP1/120.545 reduce la unión comunicante mediada por STEAP-1 de un modo dependiente de la dosis.
Figura 32. Inhibición de la fosforilación de ERK-1 y ERK-2 por mAb para STEAP-1 e iARN. Se transfectaron células PC3 con gen de resistencia a neomicina solo o con STEAP-1 y mAb en el vector pSRa. Para el silenciamiento por iARN, células PC3-STEAP-1 se transfectaron establemente con un vector pPUR-U6-27-STEAP-1 que contenía ARNip para STEAP-1. Las células se dejaron morir en 0,1 % de SBF durante 18 horas a 37 ºC, se colocaron sobre hielo durante 10 minutos sin o con 10 µg/ml de mAb M2/92.30, se llevaron a ta durante 3 minutos, luego se estimularon con 10 % de SBF durante 5 minutos. Las células se lisaron en tampón RIPA, los lisados de células completas se resolvieron por 12,5 % de SDS-PAGE y las proteínas se detectaron por transferencia Western. Se detectó fosfo-ERK con antisuero de conejo (Cell Signaling) y ERK se detectó con anti-ERK de conejo (Zymed). STEAP-1 se detectó con anti-STEAP-1 de oveja y la actina se detectó con mAb anti-actina (Santa Cruz). La fosforilación de ERK-1 y ERK-2 fueron ambas inducidas por 10 % de suero, y se inhibieron por mAb M2/92.30 y ARNip para STEAP-1.
Figura 33. Efecto de iARN de STEAP-1 en la comunicación célula-célula. Se transfectaron células PC3 con gen de resistencia a neomicina solo o con STEAP-1 en vector pSRa. Para el silenciamiento por iARN, células PC3-STEAP-1 se transfectaron establemente con un vector pPUR-U6-27-STEAP-1 que contenía ARNip para STEAP-1 o un vector vacío. Las células receptoras se marcaron con 1 mg/ml de dextrano-rojo Texas y las células donantes se marcaron con 2,5 µg/ml de calceína AM. Las células donantes (verdes) y receptoras (rojas) se co-cultivaron a 37 ºC durante 18-24 horas y se analizaron por microscopía para la co-localización de colorantes fluorescentes. En todos los experimentos, las mismas células se usaron como donante y aceptor. La iARN de STEAP-1 específico establemente expresado en células PC3-STEAP-1 reduce la comunicación célula-célula inducida por STEAP-1.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Resumen de secciones
[0032]
I.) Definiciones II.) Polinucleótidos STEAP-1 II.A.) Usos de polinucleótidos STEAP-1 II.A.1.) Monitorización de anomalías genéticas II.A.2.) Antisentido II.A.3.) Cebadores y pares de cebadores II.A.4.) Aislamiento de moléculas de ácidos nucleicos que codifican STEAP-1 II.A.5.) Moléculas de ácido nucleico recombinantes y sistemas de huésped-vector III.) Proteínas relacionadas con STEAP-1 III.A.) Proteína que lleva motivos III.B.) Expresión de proteínas relacionadas con STEAP-1 III.C.) Modificaciones de proteínas relacionadas con STEAP-1 III.D.) Usos de proteínas relacionadas con STEAP-1 IV.) Anticuerpos para STEAP-1 V.) Respuestas inmunitarias celulares a STEAP-1 VI.) Animales transgénicos para STEAP-1 VII.) Procedimientos para la detección de STEAP-1 VIII.) Procedimientos para monitorizar el estado de genes relacionados con STEAP-1 y sus productos IX.) Identificación de moléculas que interaccionan con STEAP-1 X.) Procedimientos y composiciones terapéuticos X.A.) Vacunas contra el cáncer X.B.) STEAP-1 como diana para terapia basada en anticuerpos
X.C.) STEAP-1 como diana para respuestas inmunitarias celulares
X.C.1. Vacunas de minigen
X.C.2. Combinaciones de péptidos CTL con péptidos colaboradores
X.C.3. Combinaciones de péptidos CTL con agentes sensibilizantes de linfocitos T
X.C.4. Composiciones de vacuna que comprenden CD pulsadas con péptidos de CTL y/o de HTL
X.D.) Inmunoterapia adoptiva
X.E.) Administración de vacunas para fines terapéuticos o profilácticos
XI.) Realizaciones de diagnóstico y pronóstico de STEAP-1.
XII.) Inhibición de la función de proteínas STEAP-1
XII.A.) Inhibición de STEAP-1 con anticuerpos intracelulares
XII.B.) Inhibición de STEAP-1 con proteínas recombinantes
XII.C.) Inhibición de la transcripción o traducción de STEAP-1
XII.D.) Consideraciones generales para las estrategias terapéuticas
XIII.) Identificación, caracterización y uso de moduladores de STEAP-1
XIV.) iARN y uso terapéutico de ARN interferente pequeño (ARNip)
XV.) KITS/Artículos de fabricación
I.) Definiciones:
[0033] A menos que se defina de otro modo, todos los términos de la materia, notaciones y otros términos científicos o terminología usada en el presente documento pretenden tener los significados comúnmente entendidos por aquellos expertos en la materia a la que se refiere la presente invención. En algunos casos, los términos con significados comúnmente entendidos se definen en el presente documento para claridad y/o para fácil referencia, y la inclusión de tales definiciones en el presente documento no debe interpretarse necesariamente que represente una diferencia sustancial con respecto a lo que generalmente se entiende en la materia. Muchas de las técnicas y procedimientos descritos o citados en el presente documento son muy entendidos y comúnmente empleados usando metodología convencional por aquellos expertos en la materia tal como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular ampliamente utilizadas descritas en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ª edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Según sea apropiado, los procedimientos que implican el uso de kits y reactivos comercialmente disponibles se llevan a cabo generalmente según protocolos y/o parámetros definidos por el fabricante, a menos que se indique lo contrario.
[0034] Los términos “cáncer de próstata avanzado”, “cáncer de próstata localmente avanzado”, “enfermedad avanzada” y “enfermedad localmente avanzada” significa cánceres de próstata que se han extendido por la cápsula
de la próstata y pretenden incluir enfermedad en estado C bajo el sistema de la Asociación urológica americana (AUA), enfermedad de estado C1 - C2 bajo el sistema de Whitmore-Jewett y enfermedad de estado T3 - T4 y N+ bajo el sistema de TNM (tumor, nodo, metástasis). En general, la cirugía no se recomienda para pacientes con enfermedad localmente avanzada, y estos pacientes tienen desenlaces sustancialmente menos favorables en comparación con pacientes que tienen cáncer de próstata clínicamente localizado (confinado al órgano). La enfermedad localmente avanzada se identifica clínicamente por pruebas palpables de induración más allá del límite lateral de la próstata, o asimetría o induración por encima de la base de la próstata. El cáncer de próstata localmente avanzado se diagnostica presentemente patológicamente tras prostatectomía radical si el tumor invade o penetra en la cápsula prostática, se extiende en el margen quirúrgico o invade las vesículas seminales.
[0035] “Alterar el patrón de glucosilación nativo” está previsto para los fines en el presente documento que signifique delecionar uno o más restos de hidrato de carbono encontrados en la secuencia nativa de STEAP-1 (tanto eliminando el sitio de glucosilación subyacente como delecionando la glucosilación por medios químicos y/o enzimáticos), y/o añadiendo uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en la secuencia nativa de STEAP-1. Además, el término incluye cambios cualitativos en la glucosilación de las proteínas nativas, que implican un cambio en la naturaleza y proporciones de los diversos restos de hidrato de carbono presentes.
[0036] El término “análogo” se refiere a una molécula que es estructuralmente similar o comparte atributos
similares o correspondientes con otra molécula (por ejemplo, una proteína relacionada con STEAP-1). Por ejemplo, un análogo de una proteína STEAP-1 puede unirse específicamente por un anticuerpo o linfocito T que se une específicamente a STEAP-1.
[0037] El término “anticuerpo” se usa en el sentido más amplio, a menos que se indique claramente de otro modo. Por tanto, un “anticuerpo” puede producirse naturalmente o producirse por el hombre tal como anticuerpos
monoclonales producidos por tecnología de hibridomas convencional. Los anticuerpos anti-STEAP-1 comprenden anticuerpos monoclonales y policlonales, además de fragmentos que contienen el dominio de unión a antígeno y/o una o más regiones determinantes de la complementariedad de estos anticuerpos. Como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a cualquier forma de anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a STEAP-1 y/o presenta la actividad biológica deseada, y específicamente cubre anticuerpos monoclonales (que incluyen anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos, mientras que se unan específicamente a STEAP-1 y/o presenten la actividad biológica deseada. Cualquier anticuerpo específico como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2 puede usarse en los procedimientos y composiciones
proporcionados en el presente documento. El término “anticuerpo” engloba una molécula que comprende al menos
una región variable de una molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera y al menos una región variable de una molécula de la cadena pesada que en combinación forman un sitio de unión específica para el antígeno diana. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG, por ejemplo, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Anticuerpos útiles en los presentes procedimientos y composiciones pueden generarse en cultivo celular, en fago o en diversos animales, que incluyen, pero no se limitan a, vacas, conejos, cabras, ratones, ratas, hámsteres, cobayas, ovejas, perros, gatos, monos, chimpancés, simios superiores. Por tanto, en una realización, un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo de mamífero. Las técnicas de fago pueden usarse para aislar un anticuerpo inicial o para generar variantes con especificidad alterada o características de avidez. Tales técnicas son rutinarias y muy conocidas en la técnica. En una realización, el anticuerpo se produce por medios recombinantes conocidos en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo recombinante puede producirse transfectando una célula huésped con un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica el anticuerpo. Pueden usarse uno o más vectores para transfectar la secuencia de ADN que expresa al menos una región VL y VH en la célula huésped. Descripciones a modo de ejemplo de medios recombinantes de generación y producción de anticuerpos incluyen Delves, ANTIBODY PRODUCTION: ESSENTIAL TECHNIQUES (Wiley, 1997); Shephard y col., MONOCLONAL ANTIBODIES (Oxford University Press, 2000); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (Academic Press, 1993); CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons, edición más reciente). Un anticuerpo de la presente invención puede modificarse por medios recombinantes para aumentar la eficacia del anticuerpo en mediar en la función deseada. Así, está dentro del alcance de la invención que los anticuerpos puedan modificarse por sustituciones usando medios recombinantes. Normalmente, las sustituciones serán sustituciones conservativas. Por ejemplo, al menos un aminoácido en la región constante del anticuerpo puede sustituirse con un residuo diferente. Véanse, por ejemplo, patente de EE.UU. nº 5.624.821, patente de EE.UU. nº 6.194.551, solicitud nº WO 9958572; y Angal y col., Mol. Immunol. 30 :105-08 (1993). La modificación en los aminoácidos incluye deleciones, adiciones, sustituciones de aminoácidos. En algunos casos, tales cambios se hacen para reducir actividades no deseadas, por ejemplo, citotoxicidad dependiente del complemento. Frecuentemente, los anticuerpos se marcan uniendo, tanto covalentemente como no covalentemente, una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conoce una amplia variedad de marcas y técnicas de conjugación y se informan ampliamente en tanto la bibliografía científica como de patentes. Estos anticuerpos pueden cribarse para unirse a STEAP-1 normal o defectuosa. Véase, por ejemplo, ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH (Oxford University Press, 1996). Anticuerpos adecuados con las actividades biológicas deseadas pueden identificarse en los siguientes ensayos in vitro que incluyen, pero no se limitan a: proliferación, migración, adhesión, crecimiento en agar blando, angiogénesis, comunicación célula-célula, apoptosis, transporte, transducción de señales, y los siguientes ensayos in vivo tales como la inhibición del crecimiento tumoral. Los anticuerpos proporcionados en el presente documento también pueden ser útiles en aplicaciones de diagnóstico. Como anticuerpos de captura o no neutralizantes, pueden cribarse para la capacidad para unirse al antígeno específico sin inhibir la actividad de unión a receptor o biológica del antígeno. Como anticuerpos neutralizantes, los anticuerpos pueden ser útiles en ensayos de unión competitiva. También pueden usarse para cuantificar STEAP-1 o su receptor.
[0038] Un “fragmento de anticuerpo” se define como al menos una parte de la región variable de la molécula
de inmunoglobulina que se une a su diana, es decir, la región de unión a antígeno. En una realización cubre específicamente anticuerpos anti-STEAP-1 individuales y clones de los mismos (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizantes) y composiciones de anticuerpo anti-STEAP-1 con especificidad poliepitópica. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. Un anticuerpo puede estar en forma de un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno que incluye un fragmento Fab, fragmento F(ab')2 , una región variable monocatenaria, y similares. Pueden generarse fragmentos de moléculas intactas usando procedimientos muy conocidos en la técnica e incluyen digestión enzimática y medios recombinantes.
[0039] Como se usa en el presente documento, cualquier forma del “antígeno” puede usarse para generar un
anticuerpo que sea específico para STEAP-1. Así, el antígeno provocador puede ser un único epítope, múltiples epítopes, o la proteína entera sola o en combinación con uno o más agentes potenciadores de la inmunogenicidad conocidos en la técnica. El antígeno provocador puede ser una proteína de longitud completa aislada, una proteína de la superficie celular (por ejemplo, inmunizando con células transfectadas con al menos una porción del antígeno),
o una proteína soluble (por ejemplo, inmunizando con solo la porción del dominio extracelular de la proteína). El antígeno puede producirse en una célula genéticamente modificada. El ADN que codifica el antígeno puede ser genómico o no genómico (por ejemplo, ADNc) y codificar al menos una porción del dominio extracelular. Como se
usa en el presente documento, el término “porción” se refiere al número mínimo de aminoácidos o ácidos nucleicos,
según sea convenga, para constituir un epítope inmunogénico del antígeno de interés. Puede emplearse cualquier vector genético adecuado para la transformación de las células de interés, que incluyen, pero no se limitan a, vectores adenovirales, plásmidos y vectores no virales, tales como lípidos catiónicos. En una realización, el anticuerpo de los procedimientos y composiciones en el presente documento se une específicamente a al menos una porción del dominio extracelular de la STEAP-1 de interés.
[0040] Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en el presente
documento pueden conjugarse con un “agente bioactivo”. Como se usa en el presente documento, el término “agente bioactivo” se refiere a cualquier compuesto sintético o que se produce naturalmente que se une al antígeno y/o potencia o media en un efecto biológico deseado para potenciar toxinas destructoras de células.
[0041] Los fragmentos de unión útiles en la presente invención puede ser fragmentos biológicamente activos. Como se usa en el presente documento, el término “biológicamente activo” se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que puede unirse al epítope antigénico deseado y ejercer directamente o indirectamente un efecto biológico. Efectos directos incluyen, pero no se limitan a, la modulación, estimulación y/o inhibición de una señal de crecimiento, la modulación, estimulación y/o inhibición de una señal antiapoptósica, la modulación, estimulación y/o inhibición de una señal apoptósica o necrótica, modulación, estimulación y/o inhibición de la cascada de ADCC, y modulación, estimulación y/o inhibición de la cascada de CDC.
[0042] Los anticuerpos “biespecíficos” también son útiles en los presentes procedimientos y composiciones. Como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo biespecífico” se refiere a un anticuerpo, normalmente un anticuerpo monoclonal, que tiene especificidades de unión por al menos dos epítopes antigénicos diferentes. Los epítopes pueden ser del mismo antígeno o de dos antígenos diferentes. Procedimientos para preparar anticuerpos biespecíficos se conocen en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden producirse recombinantemente usando la co-expresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de la inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, Milstein y col., Nature 305:537-39 (1983). Alternativamente, los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse usando enlace químico. Véase, por ejemplo, Brennan y col., Science 229:81 (1985). Los anticuerpos biespecíficos incluyen fragmentos de anticuerpo biespecíficos. Véase, por ejemplo, Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-48 (1993), Gruber y col., J. Immunol. 152:5368 (1994).
[0043] Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen específicamente anticuerpos
“quiméricos” en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a u homóloga a secuencias
correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) sea idéntico a u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, además de fragmentos de tales anticuerpos, mientras que se unan específicamente al antígeno diana y/o presenten la actividad biológica deseada (patente de EE.UU. nº 4.816.567; y Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).
[0044] El término “secuencias de codón optimizado” se refiere a secuencias de nucleótidos que han sido optimizadas para una especie de huésped particular reemplazando cualquier codón que tenga una frecuencia de uso inferior a aproximadamente el 20 %. Las secuencias de nucleótidos que han sido optimizadas para la expresión en una especie de huésped dada por eliminación de secuencias de poliadenilación falsas, eliminación de señales de corte y empalme de exones/intrones, eliminación de repeticiones similares a transposón y/u optimización del contenido de GC, además de optimización de codones, se denominan en el presente documento “secuencias de expresión potenciada”.
[0045] Una “biblioteca combinatoria” es una colección de diversos compuestos químicos generada por tanto síntesis química como síntesis biológica combinando varios “bloques de unión” químicos tal como reactivos. Por ejemplo, una biblioteca química combinatoria lineal, tal como una biblioteca de polipéptidos (por ejemplo, muteína), se forma combinando un conjunto de bloques de construcción químicos llamados aminoácidos de cualquier forma posible para una longitud de compuesto dada (es decir, el número de aminoácidos en un compuesto de polipéptido). Numerosos compuestos químicos se sintetizan por tal mezcla combinatoria de bloques de construcción químicos (Gallop y col., J. Med. Chem. 37(9):1233-1251 (1994)).
[0046] La preparación y cribado de bibliotecas combinatorias es muy conocido para aquellos expertos en la materia. Tales bibliotecas químicas combinatorias incluyen, pero no se limitan a, bibliotecas de péptidos (véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.010.175, Furka, Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991), Houghton y col., Nature, 354:84-88 (1991)), peptoides (publicación PCT nº WO 91/19735), péptidos codificados (publicación PCT WO 93/20242), bio-oligómeros al azar (publicación PCT WO 92/00091), benzodiazepinas (patente de EE.UU. nº 5.288.514), diversómeros tales como hidantoínas, benzodiazepinas y dipéptidos (Hobbs y col., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993)), polipéptidos vinílogos (Hagihara y col., J. Amer. Chem. Soc,114:6568 (1992)), peptidomiméticos no peptídicos con un andamiaje de beta-D-glucosa (Hirschmann y col., J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992)), síntesis orgánicas análogas de bibliotecas de compuestos pequeños (Chen y col., J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994)), oligocarbamatos (Cho y col., Science 261:1303 (1993)) y/o fosfonatos de peptidilo (Campbell y col., J. Org. Chem. 59:658 (1994)). Véanse, generalmente, Gordon y col., J. Med. Chem. 37:1385 (1994), bibliotecas de ácidos nucleicos (véase, por ejemplo, Stratagene, Corp.), bibliotecas de ácidos nucleicos peptídicos (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.539.083), bibliotecas de anticuerpos (véanse, por ejemplo, Vaughn y col., Nature Biotechnology 14(3): 309-314 (1996) y el documento PCT/US96/10287), bibliotecas de hidratos de carbono (véanse, por ejemplo, Liang y col., Science 274:1520-1522 (1996) y la patente de EE.UU. nº 5.593.853) y bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas (véanse, por ejemplo, benzodiazepinas, Baum, C&EN, Jan 18, página 33 (1993); isoprenoides, patente de EE.UU. nº 5.569.588; tiazolidinonas y metatiazanonas, patente de EE.UU. nº 5.549.974; pirrolidinas, patentes de EE.UU. nº 5.525.735 y 5.519.134; compuestos de morfolino, patente de EE.UU. nº 5.506.337; benzodiazepinas, patente de EE.UU. nº 5.288.514; y similares).
[0047] Los dispositivos para la preparación de bibliotecas combinatorias están comercialmente disponibles (véanse, por ejemplo, 357 NIPS, 390 NIPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY; Symphony, Rainin, Woburn, MA; 433A, Applied Biosystems, Foster City, CA; 9050, Plus, Millipore, Bedford, NIA). También se han desarrollado varios sistemas robóticos muy conocidos para químicas en fase de disolución. Estos sistemas incluyen estaciones de trabajo automatizadas tales como el aparato de síntesis automatizado desarrollado por Takeda Chemical Industries, LTD. (Osaka, Japón) y muchos sistemas robóticos que utilizan brazos robóticos (Zymate H, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass; Orca, Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif.), que imitan las operaciones sintéticas manuales realizadas por un químico. Cualquiera de los dispositivos anteriores es adecuado para su uso con la presente invención. La naturaleza e implementación de las modificaciones a estos dispositivos (si las hay) de manera que puedan operar como se ha tratado en el presente documento serán evidentes para expertos en la materia relevante. Además, numerosas bibliotecas combinatorias están comercialmente disponibles por sí mismas (véanse, por ejemplo, ComGenex, Princeton, NJ; Asinex, Moscow, RU; Tripos, Inc., St. Louis, MO; ChemStar, Ltd, Moscú, RU; 3D Pharmaceuticals, Exton, PA; Martek Biosciences, Columbia, MD; etc.).
[0048] Como se usa en el presente documento, el término “sustitución conservativa” se refiere a sustituciones
de aminoácidos que son conocidas para aquellos expertos en esta materia y pueden hacerse generalmente sin alterar la actividad biológica de la molécula resultante. Aquellos expertos en esta materia reconocen que, en general, las sustituciones de un único aminoácido en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, por ejemplo, Watson y col., MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, The Benjamin/Cummings Pub. Co., pág. 224 (4ª edición 1987)). Tales sustituciones a modo de ejemplo se hacen preferentemente según aquellas expuestas en la(s) Tabla(s) III(a-b). Por ejemplo, tales cambios incluyen sustituir cualquiera de isoleucina (I), valina (V) y leucina (L) por cualquier otro de estos aminoácidos hidrófobos; ácido aspártico (D) por ácido glutámico (E) y viceversa; glutamina (Q) por asparagina (N) y viceversa; y serina (S) por treonina (T) y viceversa. Otras sustituciones también pueden considerarse conservativas dependiendo del entorno del aminoácido particular y su función en la estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, glicina (G) y alanina (A) pueden ser frecuentemente intercambiables, como puede ser alanina (A) y valina (V). La metionina (M), que es relativamente hidrófoba, puede intercambiarse frecuentemente con leucina e isoleucina, y algunas veces con valina. La lisina (K) y la arginina (R) son frecuentemente intercambiables en localizaciones en las que la característica significativa del residuo de aminoácido es su carga y los pK diferentes de estos dos residuos de aminoácidos no son significativos. Otros cambios más pueden considerarse “conservativos” en entornos particulares (véanse, por ejemplo, la Tabla III(a) en el presente documento; páginas 13-15 “Biochemistry” 2ª ED. Lubert Stryer ed (Stanford University); Henikoff y col., PNAS 1992 Vol 89 10915-10919; Lei y col., J Biol Chem 1995 May 19; 270(20):11882-6). Otras sustituciones también son permisibles y pueden determinarse empíricamente o según sustituciones conservativas conocidas.
[0049] El término “agente citotóxico” se refiere a una sustancia que inhibe o previene la actividad de expresión de células, función de células y/o produce la destrucción de células. El término está previsto que incluya isótopos radiactivos, agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, que incluyen fragmentos y/o variantes de las mismas. Ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, auristatinas, auristatina E, auromicinas, maitansinoides, itrio, bismuto, ricina, cadena de ricina A, combrestatina, duocarmicinas, dolostatinas, doxorubicina, daunorubicina, taxol, cisplatino, cc1065, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxiantracenodiona, actinomicina, toxina diftérica, exotoxina A de Pseudomonas (PE), PE40, abrina, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina, retstrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, caliqueamicina, inhibidor de Saponaria officinalis y glucocorticoide, y otros agentes quimioterapéuticos, además de radioisótopos tales como At211, I131, I125, Y80, Re186, Re188, Sm153, Bi212 o 213 , P32 e isótopos radiactivos de Lu que incluyen Lu177. Los anticuerpos también pueden conjugarse con una enzima activante de pro-fármaco anticancerígeno que puede convertir el pro-fármaco en su forma activa.
[0050] Como se usa en el presente documento, el término “diacuerpos” se refiere a pequeños fragmentos de
anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable (VH) de la cadena pesada conectado a un dominio variable (VL) de la cadena ligera en la misma cadena de polipéptidos (VH-VL). Usando un ligador que sea demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son obligados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, los documentos EP 404.097; documento WO 93/11161; y Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48 (1993).
[0051] El “producto génico” se usa en el presente documento para indicar un péptido/proteína o ARNm. Por ejemplo, un “producto génico de la divulgación” se refiere algunas veces en el presente documento a una “secuencia de aminoácidos de cáncer”, “proteína de cáncer”, “proteína de un cáncer enumerado en la Tabla I”, un “ARNm de cáncer”, “ARNm de un cáncer enumerado en la Tabla I”, etc. La proteína de cáncer puede codificarse por un ácido nucleico de la Figura 2. La proteína de cáncer puede ser un fragmento, o alternativamente, ser la proteína de longitud completa codificada por ácidos nucleicos de la Figura 2. Una secuencia de aminoácidos de cáncer puede usarse para determinar identidad o similitud de secuencias. Las secuencias pueden ser variantes alélicas que se producen naturalmente de una proteína codificada por un ácido nucleico de la Figura 2. Las secuencias pueden ser variantes de secuencia como se ha descrito adicionalmente en el presente documento.
[0052] Anticuerpos “heteroconjugados” son útiles en los presentes procedimientos y composiciones. Como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo heteroconjugado” se refiere a dos anticuerpos covalentemente
unidos. Tales anticuerpos pueden prepararse usando procedimientos conocidos en la química de proteínas sintéticas, que incluyen usar agentes de reticulación. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.676.980.
[0053] Los ensayos de “cribado de alto rendimiento” para la presencia, ausencia, cuantificación u otras propiedades de ácidos nucleicos particulares o productos de proteína son muy conocidos para aquellos expertos en la materia. Similarmente, los ensayos de unión y los ensayos de genes indicadores son similarmente muy conocidos. Por tanto, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.559.410 desvela procedimientos de cribado de alto rendimiento para proteínas; la patente de EE.UU. nº 5.585.639 desvela procedimientos de cribado de alto rendimiento para la unión a ácido nucleico (es decir, en matrices); mientras que las patentes de EE.UU. nº 5.576.220 y 5.541.061 desvelan procedimientos de alto rendimiento de cribado para la unión de ligando/anticuerpo.
[0054] Además, los sistemas de cribado de alto rendimiento están comercialmente disponibles (véanse, por ejemplo, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ; Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA; Precision Systems, Inc., Natick, MA; etc.). Estos sistemas normalmente automatizan procedimientos enteros, que incluyen todo el pipeteado de muestras y reactivos, dispensación de líquidos, incubaciones controladas y lecturas finales de la microplaca en detector(es) apropiado(s) para el ensayo. Estos sistemas configurables proporcionan alto rendimiento y rápido arranque, además de un alto grado de flexibilidad y personalización. Los fabricantes de tales sistemas proporcionan protocolos detallados para diversos sistemas de alto rendimiento. Por tanto, por ejemplo, Zymark Corp. proporciona boletines técnicos que describen sistemas de cribado para detectar la modulación de la transcripción de genes, unión a ligando y similares.
[0055] El término “homólogo” se refiere a una molécula que presenta homología con otra molécula, por
ejemplo, teniendo secuencias de residuos químicos que son iguales o similares en las posiciones correspondientes.
[0056] En una realización, el anticuerpo en el presente documento proporciona un “anticuerpo humano”. Como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo humano” se refiere a un anticuerpo en el que
esencialmente las secuencias enteras de las secuencias de la cadena ligera y cadena pesada, que incluyen las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), son de genes humanos. En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos se preparan por la técnica del trioma, la técnica de linfocitos B humanos (véase, por ejemplo, Kozbor y col., lmmunol. Today 4: 72 (1983)), técnica de transformación en EBV (véase, por ejemplo, Cole y col., MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY 77-96 (1985)), o usando expresión en fago (véase, por ejemplo, Marks y col., J. Mol. Biol. 222:581 (1991)). En una realización específica, el anticuerpo humano se genera en un ratón transgénico. Las técnicas para preparar tales anticuerpos de parcialmente a completamente humanos se conocen en la técnica y puede usarse cualquiera de tales técnicas. Según una realización particularmente preferida, secuencias de anticuerpos completamente humanos se preparan en un ratón transgénico manipulado para expresar genes de anticuerpos de la cadena pesada y ligera humana. Una descripción a modo de ejemplo de preparación de ratones transgénicos que producen anticuerpos humanos se encuentra en la solicitud nº WO 02/43478 y la patente de Estados Unidos 6.657.103 (Abgenix) y su progenie. Los linfocitos B de ratones transgénicos que producen el anticuerpo deseado pueden entonces fusionarse para hacer líneas celulares de hibridoma para la producción continua del anticuerpo. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 6.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; y 5.545.806; y Jakobovits, Adv. Drug Del. Rev. 31:33-42 (1998); Green y col., J. Exp. Med,188:483-95 (1998).
[0057] El “antígeno leucocitario humano” o “HLA” es una proteína del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) humano de clase I o clase II (véase, por ejemplo, Stites y col., IMMUNOLOGY, 8ª ED., Lange Publishing, Los Altos, CA (1994)).
[0058] Como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo humanizado” se refiere a formas de
anticuerpos que contienen secuencias de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos), además de anticuerpos humanos. Tales anticuerpos son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, correspondiéndose todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables con aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Véanse, por ejemplo, Cabilly, patente de EE.UU. nº 4.816.567; Queen y col., (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033; y ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPPROACH (Oxford University Press 1996).
[0059] Los términos “hibridar”, “hibridando”, “se hibrida” y similares, usados en el contexto de polinucleótidos, pretenden referirse a condiciones de hibridación convencionales, preferentemente tales como hibridación en 50 % de formamida/6X SSC/0,1 % de SDS/100 µg/ml de ADNmc, en las que las temperaturas para la hibridación están por encima de 37 ºC y las temperaturas para lavar en 0,1X SSC/0,1 % de SDS están por encima de 55 ºC.
[0060] Los términos “aislado” o “biológicamente puro” se refieren a material que está sustancialmente o
esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan al material como se encuentra en su estado nativo. Por tanto, los péptidos aislados no contienen preferentemente materiales normalmente asociados a los péptidos en su entorno in situ. Por ejemplo, un polinucleótido se dice que está “aislado” cuando está sustancialmente separado de polinucleótidos contaminantes que se corresponden o son complementarios a genes distintos de los genes STEAP-1 o que codifican polipéptidos distintos del producto del gen STEAP-1 o fragmentos del mismo. Un experto puede emplear fácilmente procedimientos de aislamiento de ácidos nucleicos para obtener un polinucleótido STEAP-1 aislado. Una proteína se dice que está “aislada”, por ejemplo, cuando se emplean procedimientos físicos, mecánicos o químicos para eliminar las proteínas STEAP-1 de constituyentes celulares que normalmente están asociados a la proteína. Un experto puede emplear fácilmente procedimientos de purificación convencionales para obtener una proteína STEAP-1 aislada. Alternativamente, una proteína aislada puede prepararse por medios químicos.
[0061] “Marcas” adecuadas incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, restos
fluorescentes, restos quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Patentes que enseñan el uso de tales marcas incluyen las patentes de EE.UU. nº 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.998.345; 4.277.437; 4.276.149; y
4.366.241. Además, los anticuerpos proporcionados en el presente documento pueden ser útiles como componente de unión a antígeno de fluorocuerpos. Véase, por ejemplo, Zeytun y col., Nat. Biotechnol. 21:1473-79 (2003).
[0062] El término “mamífero” se refiere a cualquier organismo clasificado como mamífero, que incluye
ratones, ratas, conejos, perros, gatos, vacas, caballos y seres humanos. En una realización de la invención, el mamífero es un ratón. En otra realización de la invención, el mamífero es un ser humano.
[0063] Los términos “cáncer de próstata metastásico” y “enfermedad metastásica” significan cánceres de
próstata que se han diseminado a ganglios linfáticos regionales o a sitios distantes y pretenden incluir enfermedad en estado D bajo el sistema AUA y estado TxNxM+ bajo el sistema TNM. Como es el caso con cáncer de próstata localmente avanzado, la cirugía no es generalmente indicada para pacientes con enfermedad metastásica, y la terapia hormonal (ablación de andrógenos) es una modalidad de tratamiento preferida. Los pacientes con cáncer de próstata metastásico eventualmente desarrollan un estado resistente a andrógenos en el plazo de 12 a 18 meses desde el inicio del tratamiento. Aproximadamente la mitad de estos pacientes resistentes a andrógenos mueren en el plazo de 6 meses después de desarrollar ese estado. El sitio más común para la metástasis de cáncer de próstata es el hueso. Las metástasis de hueso por cáncer de próstata son frecuentemente osteoblásticas en vez de osteolíticas (es decir, que producen la formación de hueso neta). Las metástasis ósea se encuentran lo más frecuentemente en la espina dorsal, seguido del fémur, pelvis, caja torácica, cráneo y húmero. Otros sitios comunes para metástasis incluyen ganglios linfáticos, pulmón, hígado y cerebro. El cáncer de próstata metastásico se diagnostica normalmente por linfadenectomía pélvica abierta o laparoscópica, barridos con radionúclidos del cuerpo entero, radiografía esquelética y/o biopsia de lesión ósea.
[0064] El término “modulador” o “compuesto de prueba” o “candidato a fármaco” o equivalentes gramaticales
como se usan en el presente documento describen cualquier molécula, por ejemplo, proteína, oligopéptido, molécula orgánica pequeña, polisacárido, polinucleótido, etc., que vaya a probarse para la capacidad para alterar directamente o indirectamente el fenotipo del cáncer o la expresión de una secuencia de cáncer, por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos o de proteínas, o efectos de secuencias de cáncer (por ejemplo, señalización, expresión génica, interacción de proteínas, etc.). Un modulador puede neutralizar el efecto de una proteína de cáncer de la divulgación. Por “neutralizar” se indica que una actividad de una proteína se inhibe o bloquea, junto con el efecto consecuente sobre la célula. Un modulador puede neutralizar el efecto de un gen, y su proteína correspondiente, de la divulgación normalizando niveles de dicha proteína. Los moduladores pueden alterar los perfiles de expresión, o perfiles de expresión de ácidos nucleicos o proteínas proporcionados en el presente documento, o vías efectoras en la dirección 3'. El modulador puede suprimir un fenotipo de cáncer, por ejemplo, para una huella de tejido normal. En otra realización, un modulador indujo un fenotipo de cáncer. Generalmente, una pluralidad de mezclas de ensayo se ejecuta en paralelo con diferentes concentraciones de agente para obtener una respuesta diferencial a las diversas concentraciones. Normalmente, una de estas concentraciones sirve de control negativo, es decir, a concentración cero o por debajo del nivel de detección.
[0065] Moduladores, candidatos a fármaco o compuestos de prueba engloban numerosas clases químicas, aunque normalmente son moléculas orgánicas, preferentemente compuestos orgánicos pequeños, que tienen un peso molecular superior a 100 e inferior a aproximadamente 2.500 Dalton. Moléculas pequeñas preferidas son inferiores a 2000, o inferiores a 1500 o inferiores a 1000 o inferiores a 500 D. Agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, particularmente unión a hidrógeno, y normalmente incluyen al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferentemente al menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos frecuentemente comprenden estructuras de carbono cíclicas o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los moduladores también comprenden biomoléculas tales como péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. Particularmente se prefieren péptidos. Una clase de moduladores son péptidos, por ejemplo, de aproximadamente cinco a aproximadamente 35 aminoácidos, prefiriéndose de aproximadamente cinco a aproximadamente 20 aminoácidos, y prefiriéndose particularmente de aproximadamente 7 a aproximadamente 15. Preferentemente, la proteína moduladora del cáncer es soluble, incluye una región no transmembrana y/o tiene una Cys del extremo N para ayudar en la solubilidad. El extremo C del fragmento puede mantenerse como un ácido libre y el extremo N puede ser una amina libre para ayudar en el acoplamiento, es decir, a cisteína. Una proteína de cáncer de la divulgación puede conjugarse con un agente inmunogénico como se trata en el presente documento. La proteína de cáncer puede conjugarse con BSA. Los péptidos, por ejemplo, de longitudes preferidas, pueden ligarse entre sí o a otros aminoácidos para crear un péptido/proteína más largo. Los péptidos moduladores pueden ser digestos de proteínas que se producen naturalmente como se ha explicado brevemente anteriormente, péptidos al azar o
péptidos al azar “sesgados”. Moduladores basados en péptidos/proteínas pueden ser anticuerpos, y fragmentos de
los mismos, como se define en el presente documento.
[0066] Los moduladores de cáncer también pueden ser ácidos nucleicos. Los agentes moduladores de ácidos nucleicos pueden ser ácidos nucleicos que se producen naturalmente, ácidos nucleicos al azar o ácidos
nucleicos al azar “sesgados”. Por ejemplo, pueden usarse digestos de genomas procariotas o eucariotas en una
estrategia análoga a la explicada brevemente anteriormente para proteínas.
[0067] El término “anticuerpo monoclonal”, como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo
obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se producen naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos estando dirigidos contra un único sitio antigénico. A diferencia, preparaciones de anticuerpos (policlonales) convencionales normalmente incluyen una multitud de anticuerpos dirigidos contra (o específicos para) diferentes epítopes. El anticuerpo policlonal puede contener una pluralidad de anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades, afinidades o avideces de epítopes dentro de un único antígeno que contiene múltiples
epítopes antigénicos. El modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido de una
población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse como que requiera la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que van a usarse según la presente invención pueden prepararse mediante el procedimiento de hibridomas descrito por primera vez por Kohler y col., Nature 256:495 (1975), o pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.816.567). Los “anticuerpos monoclonales” también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fago usando las técnicas descritas, por ejemplo, en Clackson y col., Nature 352; 624-628 (1991) y Marks y col., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991). Estos anticuerpos monoclonales se unirán normalmente con al menos una Kd de aproximadamente 1 □M, más normalmente al menos aproximadamente 300 nM, normalmente al menos aproximadamente 30 nM, preferentemente al menos aproximadamente 10 nM, más preferentemente al menos aproximadamente 3 nM o mejor, normalmente determinada por ELISA.
[0068] Un “motivo”, como en motivo biológico de una proteína relacionada con STEAP-1, se refiere a cualquier patrón de aminoácidos que forma parte de la secuencia primaria de una proteína, que está asociada a una función particular (por ejemplo, interacción proteína-proteína, interacción proteína-ADN, etc.) o modificación (por ejemplo, que está fosforilada, glucosilada o amidada), o localización (por ejemplo, secuencia secretora, secuencia de localización nuclear, etc.) o una secuencia que guarda relación con ser inmunogénica, tanto humoralmente como celularmente. Un motivo puede ser tanto contiguo como puede estar alineado con ciertas posiciones que
generalmente guardan relación con una cierta función o propiedad. En el contexto de motivos de HLA, “motivo” se
refiere al patrón de residuos en un péptido de longitud definida, normalmente un péptido de aproximadamente 8 a aproximadamente 13 aminoácidos para un motivo de HLA de clase I y de aproximadamente 6 a aproximadamente 25 aminoácidos para un motivo de HLA de clase II, que es reconocido por una molécula HLA particular. Los motivos de péptido para unión a HLA son normalmente diferentes para cada proteína codificada por cada alelo de HLA humano y se diferencian en el patrón de los residuos de anclaje primarios y secundarios.
[0069] Un “excipiente farmacéutico” comprende un material tal como un adyuvante, un vehículo, agentes de
ajuste del pH y de tamponamiento, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes, conservantes y similares.
[0070] “Farmacéuticamente aceptable” se refiere a una composición no tóxica, inerte y/o que es fisiológicamente compatible con seres humanos u otros mamíferos.
[0071] El término “polinucleótido” significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases o pares
de bases de longitud, tanto ribonucleótidos como desoxinucleótidos, o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido, y pretende incluir formas mono y bicatenarias de ADN y/o ARN. En la materia, este término se usa frecuentemente indistintamente con “oligonucleótido”. Un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos desvelada en el presente documento en la que la timidina (T), como se muestra, por ejemplo, en la Figura 2, también puede ser uracilo (U); esta definición se refiere a las diferencias entre las estructuras químicas de ADN y ARN, en particular la observación de que una de las cuatro bases principales en el ARN es uracilo (U) en lugar de timidina (T).
[0072] El término “polipéptido” significa un polímero de al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7 u 8
aminoácidos. En toda la memoria descriptiva se usan las designaciones de tres letras o de una letra convencionales
para aminoácidos. En la materia, este término se usa frecuentemente indistintamente con “péptido” o “proteína”.
[0073] Un “residuo de anclaje primario” de HLA es un aminoácido en una posición específica a lo largo de una secuencia de péptidos que se entiende que proporciona un punto de contacto entre el péptido inmunogénico y la molécula HLA. Uno a tres, normalmente dos, residuos de anclaje primarios dentro de un péptido de longitud definida
definen generalmente un “motivo” para un péptido inmunogénico. Se entiende que estos residuos se ajustan en
estrecho contacto con el surco de unión a péptido de una molécula HLA, con sus cadenas laterales enterradas en bolsillos específicos del surco de unión. En un caso, por ejemplo, los residuos de anclaje primarios para una molécula HLA de clase I están localizados en la posición 2 (desde la posición del extremo amino) y en la posición del extremo carboxilo de un epítope de péptido de 8, 9, 10, 11 ó 12 residuos según la invención. Alternativamente, los residuos de anclaje primarios de un péptido que se unen a una molécula HLA de clase II están separados los unos con respecto a los otros en vez de con respecto a los extremos de un péptido, en los que el péptido tiene generalmente al menos 9 aminoácidos de longitud. Las posiciones de anclaje primarias para cada motivo y supermotivo se exponen en la Tabla IV (a). Por ejemplo, puede crearse péptido análogo alterando la presencia o ausencia de residuos particulares en las posiciones de anclaje primarias y/o secundarias mostradas en la Tabla IV. Tales análogos se usan para modular la afinidad de unión y/o cobertura de la población de un péptido que comprende un motivo o supermotivo de HLA particular.
[0074] “Radioisótopos” incluyen, pero no se limitan a, los siguientes (también se exponen usos a modo de
ejemplo no limitantes en la Tabla IV(i))
[0075] Por “aleatorizado” o equivalentes gramáticas como se aplican en el presente documento a ácidos
nucleicos y proteínas se indica que cada ácido nucleico y péptido consiste en nucleótidos y aminoácidos esencialmente al azar, respectivamente. Estos péptidos al azar (o ácidos nucleicos, tratados en el presente documento) pueden incorporar cualquier nucleótido o aminoácido en cualquier posición. El procedimiento sintético puede diseñarse para generar proteínas o ácidos nucleicos aleatorizados, para permitir la formación de todas o casi todas las posibles combinaciones sobre la longitud de la secuencia, formándose así una biblioteca de agentes proteináceos bioactivos candidatos aleatorizados.
[0076] Una biblioteca puede ser “completamente aleatorizada”, sin ninguna preferencia o constante de secuencia en cualquier posición, o puede ser una biblioteca “al azar sesgada”. Es decir, algunas posiciones dentro de la secuencia tanto se mantienen constantes como están seleccionadas de un número limitado de posibilidades. Por ejemplo, los nucleótidos o residuos de aminoácidos se aleatorizan dentro de una clase definida, por ejemplo, de aminoácidos hidrófobos, residuos hidrófilos, residuos estéricamente sesgados (tanto pequeños como grandes), hacia la creación de dominios de unión a ácido nucleico, la creación de cisteínas, para reticulación, prolinas para dominios SH-3, serinas, treoninas, tirosinas o histidinas para sitios de fosforilación, etc., o para purinas, etc.
[0077] Una molécula de ADN o ARN “recombinante” es una molécula de ADN o ARN que se ha sometido a
manipulación molecular in vitro.
[0078] Como se usa en el presente documento, el término “Fv monocatenario” o “scFv” o anticuerpo “monocatenario” se refiere a fragmentos de anticuerpos que comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, en el que estos dominios están presentes en una cadena individual de los polipéptidos. Generalmente, el polipéptido de Fv comprende además un polipéptido ligador entre los dominios VH y VL que permite que sFv formen la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de sFv véase Pluckthun, THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, pág. 289-315 (1994).
[0079] Ejemplos no limitantes de “moléculas pequeñas” incluyen compuestos que se unen o interaccionan
con STEAP-1, ligandos que incluyen hormonas, neuropéptidos, quimiocinas, fragancias, fosfolípidos y equivalentes funcionales de los mismos que se unen y preferentemente inhiben la función de proteínas STEAP-1. Tales moléculas pequeñas no limitantes tienen preferentemente un peso molecular inferior a aproximadamente 10 kDa, más preferentemente inferior a aproximadamente 9, aproximadamente 8, aproximadamente 7, aproximadamente 6, aproximadamente 5 o aproximadamente 4 kDa. Moléculas pequeñas pueden asociarse físicamente con, o unirse a, proteína STEAP-1; pueden no encontrarse en rutas metabólicas que se producen naturalmente; y/o pueden ser más solubles en disoluciones acuosas que en no acuosas.
[0080] Como se usa en el presente documento, el término “específico” se refiere a la unión selectiva del
anticuerpo al epítope del antígeno diana. Los anticuerpos pueden probarse para especificidad de unión comparando la unión a antígeno apropiado con la unión a antígeno o mezcla de antígenos irrelevante bajo un conjunto dado de condiciones. Si el anticuerpo se une al antígeno apropiado al menos 2, 5, 7, y preferentemente 10 veces más que a un antígeno o mezcla de antígenos irrelevante, entonces se considera que es específico. En una realización, un anticuerpo específico es uno que solo se une al antígeno de STEAP-1, pero que no se une a antígeno irrelevante. En otra realización, un anticuerpo específico es uno que se une a antígeno de STEAP-1 humana, pero que no se une a antígeno de STEAP-1 no humana con el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor homología de aminoácidos con el antígeno de STEAP-1, en otra realización, un anticuerpo específico es uno que se une a antígeno de STEAP-1 humana y se une a antígeno de STEAP-1 murina, pero con un mayor grado de unión al antígeno humano. En otra realización, un anticuerpo específico es uno que se une a antígeno de STEAP-1 humana y se une a antígeno de STEAP-1 de primate, pero con un mayor grado de unión al antígeno humano. En otra realización, el anticuerpo específico se une a antígeno de STEAP-1 humana y cualquier antígeno de STEAP-1 no humana, pero con un mayor grado de unión al antígeno humano o cualquier combinación de los mismos.
[0081] La “rigurosidad” de reacciones de hibridación puede determinarse fácilmente por un experto en la
materia, y generalmente es un cálculo empírico dependiente de la longitud de sonda, temperatura de lavado y concentración de sales. En general, sondas más largas requieren mayores temperaturas para la apropiada hibridación, mientras que sondas más cortas necesitan menores temperaturas. La hibridación depende generalmente de la capacidad de las secuencias de ácidos nucleicos desnaturalizadas para rehibridarse cuando están presentes las cadenas complementarias en un entorno por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor sea el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor será la temperatura relativa que pueda usarse. Como resultado, de esto resulta que las mayores temperaturas relativas tenderían a hacer las condiciones de reacción más rigurosas, mientras que temperaturas menores a menos rigurosas. Para detalles adicionales y explicación de la rigurosidad de reacciones de hibridación véase Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
[0082] “Condiciones rigurosas” o “condiciones de alta rigurosidad”, como se define en el presente documento,
se identifican por, pero no se limitan a, aquellas que (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo, cloruro sódico 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/0,1 % de dodecilsulfato de sodio a 50 ºC; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante tal como formamida, por ejemplo, 50 % (v/v) de formamida con 0,1 % de albúmina de suero bovino/0,1 % de Ficoll/0,1 % de polivinilpirrolidona/tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 ºC; o (3) emplean 50 % de formamida, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), 0,1 % de pirofosfato de sodio, 5 x disolución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 µg/ml), 0,1 % de SDS y 10 % de sulfato de dextrano a 42 ºC, con lavados a 42 ºC en 0,2 x SSC (cloruro sódico/citrato de sodio) y 50 % de formamida a 55 ºC, seguido de un lavado a alta rigurosidad que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55 ºC.
“Condiciones moderadamente rigurosas” se describen por, pero no se limitan a, aquellas en Sambrook y col.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de disolución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos rigurosas que aquellas descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es incubación durante la noche a 65 ºC en una disolución que comprende: 1 % de albúmina de suero bovino, fosfato de sodio 0,5 M a pH 7,5, EDTA 1,25 mM, y 7 % de SDS 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), seguido de lavado de los filtros en 2 x SSC/1 % de SDS a 50 ºC y 0,2 X SSC/0,1 % de SDS a 50 ºC. El experto reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc., según sea necesario para acomodar factores tales como longitud de sonda y similares.
[0083] Un “supermotivo” de HLA es una especificidad de unión a péptido compartida por moléculas HLA
codificadas por dos o más alelos de HLA. Las frecuencias fenotípicas globales de supertipos de HLA en diferentes poblaciones étnicas se exponen en la Tabla IV(f). Los constituyentes no limitantes de diversos supertipos son del siguiente modo:
A2: A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A*0205, A*0206, A*6602, A*6901, A*0207
A3: A3, A11, A31, A*3301, A*6801, A*0301, A*1101, A*3101 B7: B7, B*3501-03, B*51, B*5301, B*5401, B*5501, B*5502, B*5601, B*6701, B*7801, B*0702, B*5101, B*5602
B44: B*3701, B*4402, B*4403, B*60 (B*4001), B61 (B*4006)
A1: A*0102, A*2604, A*3601, A*4301, A*8001
A24: A*24, A*30, A*2403, A*2404, A*3002, A*3003
B27: B*1401-02, B*1503, B*1509, B*1510, B*1518, B*3801-02, B*3901, B*3902, B*3903-04, B*4801-02, B*7301, B*2701-08
B58: B*1516, B*1517, B*5701, B*5702, B58
B62: B*4601, B52, B*1501 (B62). B*1502 (B75), B*1513 (B77)
La cobertura de la población calculada proporcionada por diferentes combinaciones de supertipos de HLA se expone en la Tabla IV(g).
[0084] Como se usa en el presente documento, “para tratar” o “terapéutico” y términos gramaticalmente
relacionados se refieren a cualquier mejora de cualquier consecuencia de enfermedad, tal como supervivencia prolongada, menos morbilidad y/o una reducción de efectos secundarios que son los subproductos de una modalidad terapéutica alternativa; como es fácilmente apreciado en la materia, se prefiere la erradicación completa de la enfermedad, pero sin embargo no es un requisito para un acto de tratamiento.
[0085] Un “animal transgénico” (por ejemplo, un ratón o rata) es un animal que tiene células que contienen un transgén, transgén que se introdujo en el animal o un antepasado del animal en un estado prenatal, por ejemplo, embrionario. Un “transgén” es un ADN que está integrado en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico.
[0086] Como se usa en el presente documento, una “vacuna” de respuesta inmunitaria a HLA o celular es
una composición que contiene o codifica uno o más péptidos de la divulgación. Hay numerosas realizaciones de tales vacunas, tales como una mezcla de uno o más péptidos individuales; comprendiendo uno o más péptidos de la divulgación un péptido poliepitópico; o ácidos nucleicos que codifican tales péptidos o polipéptidos individuales, por ejemplo, un minigen que codifica un péptido poliepitópico. El “uno o más péptidos” puede incluir cualquier número entero unitario de 1-150 o más, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 ó 150 o más péptidos. Los péptidos o polipéptidos pueden modificarse opcionalmente tal como por lipidación, adición de secuencias que eligen diana u otras secuencias. Los péptidos de clase I de HLA pueden mezclarse con, o ligarse a, péptidos de clase II de HLA para facilitar la activación de tanto linfocitos T citotóxicos como linfocitos T colaboradores. Las vacunas de HLA también pueden comprender células presentadoras de antígeno pulsadas por péptido, por ejemplo, células dendríticas.
[0087] El término “variante” se refiere a una molécula que presenta una variación de un tipo o norma descrita,
tal como una proteína que tiene uno o más residuos de aminoácidos diferentes en la(s) posición (posiciones) correspondiente(s) de una proteína específicamente descrita, por ejemplo, la proteína STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3. Un análogo es un ejemplo de una proteína variante. Las isoformas de corte y empalme y polimorfismos de un único nucleótido (SNP) son otros ejemplos de variantes.
[0088] Las “proteínas relacionadas con STEAP-1” de la divulgación incluyen aquellas específicamente identificadas en el presente documento, además de variantes alélicas, variantes de sustitución conservativa, análogos y homólogos que pueden aislarse/generarse y caracterizarse sin experimentación adicional siguiendo los procedimientos explicados brevemente en el presente documento o fácilmente disponibles en la materia. También están incluidas las proteínas de fusión que combinan partes de diferentes proteínas STEAP-1 o fragmentos de las mismas, además de proteínas de fusión de una proteína STEAP-1 y un polipéptido heterólogo. Tales proteínas STEAP-1 se denominan en conjunto las proteínas relacionadas con STEAP-1, las proteínas de la divulgación, o STEAP-1. El término “proteína relacionada con STEAP-1” se refiere a un fragmento de polipéptido o una secuencia de proteínas STEAP-1 de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más de 25 aminoácidos; o, al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 330, 335, 339 o más aminoácidos.
II.) Polinucleótidos STEAP-1
[0089] La divulgación proporciona polinucleótidos correspondientes o complementarios a todo o parte de un gen STEAP-1, ARNm y/o secuencia codificante, preferentemente en forma aislada, que incluyen polinucleótidos que codifican una proteína relacionada con STEAP-1 y fragmentos de la misma, ADN, ARN, híbrido de ADN/ARN y moléculas relacionadas, polinucleótidos o oligonucleótidos complementarios a un gen STEAP-1 o secuencia de ARNm o una parte de la misma, y polinucleótidos o oligonucleótidos que se hibridan con un gen STEAP-1, ARNm o con un polinucleótido que codifica STEAP-1 (en conjunto “polinucleótidos STEAP-1”). En todos los casos en los que se refiere a esta sección, T también puede ser U en la Figura 2.
[0090] Realizaciones de un polinucleótido STEAP-1 incluyen: un polinucleótido STEAP-1 que tiene la secuencia mostrada en la Figura 2, la secuencia de nucleótidos de STEAP-1 como se muestra en la Figura 2 en la que T es U; al menos 10 nucleótidos contiguos de un polinucleótido que tiene la secuencia como se muestra en la Figura 2; o al menos 10 nucleótidos contiguos de un polinucleótido que tiene la secuencia como se muestra en la Figura 2 en la que T es U. Por ejemplo, realizaciones de nucleótidos de STEAP-1 comprenden, sin limitación:
(I)
un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en una secuencia como se muestra en la Figura 2, en el que T también puede ser U;
(II)
un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2A, desde el residuo de nucleótido número 66 hasta el residuo de nucleótido número 1085, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(III) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2B, desde el residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(IV)
un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2C, desde el residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 944, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(V)
un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2D, desde el residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(VI)
un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2E, desde el residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(VII) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2F, desde el residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(VIII) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2G, desde el residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(IX)
un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2H, desde el residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(X)
un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2I, desde el residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(XI)
un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2J, desde el residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(XII) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2K, desde el residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(XIII) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2L, desde el residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(XIV) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2M, desde el residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(XV) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2N, desde el residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(XVI) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2O, desde el residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(XVII) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2P, desde el residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(XVIII) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2Q, desde el residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(XIX) un polinucleótido que codifica una proteína relacionada con STEAP-1 que es al menos el 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o el 100 % homóloga a una secuencia de aminoácidos entera mostrada en la Figura 2A-Q;
(XX) un polinucleótido que codifica una proteína relacionada con STEAP-1 que es al menos el 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o el 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos entera mostrada en la Figura 2A-Q;
(XXI) un polinucleótido que codifica al menos un péptido expuesto en las Tablas V-XVIII y XXII-LI como se expone en la solicitud de patente de Estados Unidos 10/236.878 presentada el 6 de septiembre de 2002, cuyos contenidos específicos están completamente incorporados por referencia en el presente documento;
(XXII) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3A en cualquier incremento de número entero hasta 339 que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de hidrofilia de la Figura 5;
(XXIII) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3A en cualquier incremento de número entero hasta 339 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor inferior a 0,5 en el perfil de hidropaticidad de la Figura 6;
(XXIV) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3A en cualquier incremento de número entero hasta 339 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de porcentaje de residuos accesibles de la Figura 7;
(XXV) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3A en cualquier incremento de número entero hasta 399 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de flexibilidad promedio de la Figura 8;
(XXVI) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3A en cualquier incremento de número entero hasta 339 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de giro beta de la Figura 9;
(XXVII) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3B y 3D en cualquier incremento de número entero hasta 258 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de hidrofilia de la Figura 5;
(XXVIII) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3B y 3D en cualquier incremento de número entero hasta 258 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor inferior a 0,5 en el perfil de hidropaticidad de la Figura 6;
(XXIX) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3B y 3D en cualquier incremento de número entero hasta 258 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de porcentaje de residuos accesibles de la Figura 7;
(XXX) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3B y 3D en cualquier incremento de número entero hasta 258 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de flexibilidad promedio de la Figura 8;
(XXXI) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3B y 3D en cualquier incremento de número entero hasta 258 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de giro beta de la Figura 9;
(XXXII) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3C en cualquier incremento de número entero hasta 282 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de hidrofilia de la Figura 5;
(XXXIII) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3C en cualquier incremento de número entero hasta 282 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor inferior a 0,5 en el perfil de hidropaticidad de la Figura 6;
(XXXIV) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9,10,11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3C en cualquier incremento de número entero hasta 282 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de porcentaje de residuos accesibles de la Figura 7;
(XXXV) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3C en cualquier incremento de número entero hasta 282 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de flexibilidad promedio de la Figura 8;
(XXXVI) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3C en cualquier incremento de número entero hasta 282 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 8, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de giro beta de la Figura 9;
(XXXVII) un polinucleótido que es completamente complementario a un polinucleótido de una cualquiera de (I)(XXXVI);
(XXXVIII) un polinucleótido que es completamente complementario a un polinucleótido de una cualquiera de (I)(XXXVII);
(XXXIX) un péptido que está codificada por cualquiera de (I) a (XXXVIII); y;
(XL) una composición que comprende un polinucleótido de cualquiera de (I)-(XXXVIII) o péptido de (XXXIX) junto con un excipiente farmacéutico y/o en una forma de dosis unitaria humana;
(XLI) un procedimiento de uso de un polinucleótido de cualquiera de (I)-(XXXVIII) o péptido de (XXXIX) o una composición de (XL) en un procedimiento para modular una célula que expresa STEAP-1;
(XLII) un procedimiento de uso de un polinucleótido de cualquiera de (I)-(XXXVIII) o péptido de (XXXIX) o una composición de (XL) en un procedimiento para el diagnóstico, profilaxis, pronóstico o tratamiento de un individuo que lleva una célula que expresa STEAP-1;
(XLIII) un procedimiento de uso de un polinucleótido de cualquiera de (I)-(XXXVIII) o péptido de (XXXIX) o una composición de (XL) en un procedimiento para el diagnóstico, profilaxis, pronóstico o tratamiento de un individuo que lleva una célula que expresa STEAP-1, dicha célula de un cáncer de un tejido enumerado en la Tabla I;
(XLIV) un procedimiento de uso de un polinucleótido de cualquiera de (I)-(XXXVIII) o péptido de (XXXIX) o una composición de (XL) en un procedimiento para el diagnóstico, profilaxis, pronóstico o tratamiento de un cáncer;
(XLV) un procedimiento de uso de un polinucleótido de cualquiera de (I)-(XXXVIII) o péptido de (XXXIX) o una composición de (XL) en un procedimiento para el diagnóstico, profilaxis, pronóstico o tratamiento de un cáncer de un tejido enumerado en la Tabla I; y;
(XLVI) un procedimiento de uso de un polinucleótido de cualquiera de (I)-(XXXVIII) o péptido de (XXXIX) o una composición de (XL) en un procedimiento para identificar o caracterizar un modulador de una célula que expresa STEAP-1.
[0091] Como se usa en el presente documento, se entiende que un intervalo desvela específicamente todas las posiciones unitarias completas del mismo.
[0092] Polinucleótidos STEAP-1 típicos pueden codificar porciones específicas de secuencias de ARNm de STEAP-1 (y aquellas que son complementarias a tales secuencias) tales como aquellas que codifican las proteínas y/o fragmentos de las mismas, por ejemplo:
(a) 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 330, 335, 339 o más aminoácidos contiguos de la variante 1 de STEAP-1; las longitudes máximas relevantes para otras variantes son: variante 2, 258 aminoácidos; variante 3, 282 aminoácidos, y variante 4, 258 aminoácidos.
[0093] Por ejemplo, representantes desvelados en el presente documento incluyen: polinucleótidos y sus péptidos codificados por sí mismos que codifican de aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 10 de la proteína STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 10 a aproximadamente el aminoácido 20 de la proteína STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 20 a aproximadamente el aminoácido 30 de la proteína STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 30 a aproximadamente el aminoácido 40 de la proteína STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 40 a aproximadamente el aminoácido 50 de la proteína STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 50 a aproximadamente el aminoácido 60 de la proteína STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 60 a aproximadamente el aminoácido 70 de la proteína STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 70 a aproximadamente el aminoácido 80 de la proteína STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 80 a aproximadamente el aminoácido 90 de la proteína STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 90 a aproximadamente el aminoácido 100 de la proteína STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, en incrementos de aproximadamente 10 aminoácidos, terminando en el aminoácido del extremo carboxilo expuesto en la Figura 2 o la Figura 3. Por consiguiente, se desvelan polinucleótidos que codifican porciones de la secuencia de aminoácidos (de aproximadamente 10 aminoácidos) de los aminoácidos 100 al aminoácido del extremo carboxilo de la proteína STEAP-1. Entendiéndose que cada posición de aminoácido particular desvela esa la posición más o menos cinco residuos de aminoácido.
[0094] Los polinucleótidos que codifican porciones relativamente largas de una proteína STEAP-1 también están dentro del alcance de la divulgación. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 1 (o 20 ó 30 ó 40 etc.) a aproximadamente el aminoácido 20 (o 30 ó 40 ó 50 etc.) de la proteína STEAP
1 “o variante” mostrada en la Figura 2 o la Figura 3 pueden generarse mediante una variedad de técnicas muy
conocidas en la técnica. Estos fragmentos de polinucleótidos pueden incluir cualquier porción de la secuencia de STEAP-1 como se muestra en la Figura 2.
[0095] En el presente documento también se desvelan fragmentos de polinucleótidos STEAP-1 que codifican uno o más de los motivos biológicos contenidos dentro de una secuencia de proteína “o variante” de STEAP-1” que incluye una o más de las subsecuencias que llevan motivos de una proteína STEAP-1 “o variante” expuesta en las Tablas V-XVIII y XXIL-LI. Fragmentos de polinucleótidos típicos codifican una o más de las regiones de la proteína STEAP-1 o variante que presentan homología con una molécula conocida. Fragmentos de polinucleótidos típicos pueden codificar uno o más de los sitios de N-glucosilación de la proteína STEAP-1 o variante, sitios de fosforilación de proteínas cinasas dependientes de AMPc y GMPc, sitios de fosforilación de caseínas cinasas II o sitio de Nmiristoilación y sitios de amidación.
[0096] Obsérvese que para determinar la posición de inicio de cualquier péptido expuesto en las Tablas V-XVIII y Tablas XXII a LI (en conjunto tablas de péptidos de HLA) con respecto a su proteína parental, por ejemplo, variante 1, variante 2, etc., se hace referencia a tres factores: la variante particular, la longitud del péptido en una tabla de péptidos de HLA y los péptidos de búsqueda enumerados en la Tabla LII. Generalmente se usa un único péptido de búsqueda para obtener péptidos de HLA para una variante particular. La posición de cada péptido de búsqueda con respecto a su molécula parental respectiva está enumerada en la Tabla LII. Por consiguiente, si un
péptido de búsqueda empieza en la posición “X”, debe añadírsele el valor “X menos 1” a cada posición en las Tablas
V-XVIII y las Tablas XXII-LI para obtener la posición real de los péptidos de HLA en su molécula parental. Por ejemplo si un péptido particular de búsqueda empieza en la posición 150 de su molécula parental, debe añadírsele 150 - 1, es decir, 149, a cada posición de aminoácido del péptido de HLA para calcular la posición de ese aminoácido en la molécula parental.
II.A.) Usos de polinucleótidos STEAP-1
II.A.1.) Monitorización de anomalías genéticas
[0097] Los polinucleótidos de los párrafos precedentes tienen varios usos específicos diferentes. El gen STEAP-1 humano se mapea para la localización cromosómica expuesta en el ejemplo titulado “Mapeo cromosómico de STEAP-1”. Por ejemplo, debido a que el gen STEAP-1 se mapea para este cromosoma, los polinucleótidos que codifican diferentes regiones de las proteínas STEAP-1 se usan para caracterizar anomalías citogenéticas de este escenario cromosómico, tal como anomalías que se identifican como que están asociadas a diversos cánceres. En ciertos genes, una variedad de anomalías cromosómicas que incluyen transposiciones se han identificado como anomalías citogenéticas frecuentes en varios cánceres diferentes (véanse, por ejemplo, Krajinovic y col., Mutat. Res. 382(3-4): 81-83 (1998); Johansson y col., Blood 86(10): 3905-3914 (1995) y Finger y col., P.N.A.S. 85(23): 91589162 (1988)). Por tanto, los polinucleótidos que codifican regiones específicas de las proteínas STEAP-1 proporcionan nuevas herramientas que pueden usarse para delinear, con mayor precisión que la previamente posible, anomalías citogenéticas en la región cromosómica que codifica STEAP-1 que pueden contribuir al fenotipo maligno. En este contexto, estos polinucleótidos satisfacen una necesidad en la materia para ampliar la sensibilidad del cribado cromosómico con el fin de identificar anomalías cromosómicas más leves y menos comunes (véase, por ejemplo, Evans y col., Am. J. Obstet. Gynecol 171(4):1055-1057 (1994)).
[0098] Además, como se mostró que STEAP-1 se expresaba altamente en cánceres de próstata y otros cánceres, los polinucleótidos STEAP-1 se usan en procedimientos que evalúan el estado de productos del gen STEAP-1 en tejidos normales frente a cancerosos. Normalmente, los polinucleótidos que codifican regiones específicas de las proteínas STEAP-1 se usan para evaluar la presencia de perturbaciones (tales como deleciones, inserciones, mutaciones puntuales o alteraciones que producen una pérdida de un antígeno, etc.) en regiones específicas del gen STEAP-1, tal como regiones que contienen uno o más motivos. Ensayos a modo de ejemplo incluyen tanto ensayos de RT-PCR, además de análisis de polimorfismos de conformación monocatenaria (SSCP) (véase, por ejemplo, Marrogi y col., J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378 (1999), ambos de los cuales utilizan polinucleótidos que codifican regiones específicas de una proteína para examinar estas regiones dentro de la proteína.
ILA.2.) Antisentido
[0099] Otros ácidos nucleicos específicamente contemplados desvelados en el presente documento son ADN genómico, ADNc, ribozimas y moléculas antisentido, además de moléculas de ácidos nucleicos basadas en un esqueleto alternativo, o que incluyen bases alternativas, tanto derivadas de fuentes naturales como sintetizadas, e incluyen moléculas que pueden inhibir el ARN o expresión de proteínas de STEAP-1. Por ejemplo, moléculas antisentido pueden ser ARN u otras moléculas, que incluyen ácidos nucleicos peptídicos (PNA) o moléculas de no ácido nucleico tales como derivados de fosforotioato que se unen específicamente a ADN o ARN en un modo dependiente del par de bases. Un experto puede obtener fácilmente estas clases de moléculas de ácidos nucleicos usando los polinucleótidos STEAP-1 y secuencias de polinucleótidos desveladas en el presente documento.
[0100] La tecnología antisentido implica la administración de oligonucleótidos exógenos que se unen a un polinucleótido diana localizado dentro de las células. El término “antisentido” se refiere al hecho de que tales oligonucleótidos son complementarios a sus dianas intracelulares, por ejemplo, STEAP-1. Véanse, por ejemplo, Jack Cohen, Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, 1989; y Synthesis 1:1-5 (1988). Los oligonucleótidos antisentido STEAP-1 incluyen derivados tales como S-oligonucleótidos (derivados de fosforotioato o S-oligos, véase, Jack Cohen, arriba), que presentan acción inhibidora del crecimiento de células cancerosas potenciado. Los S-oligos (fosforotioatos de nucleósido) son análogos isoelectrónicos de un oligonucleótido (O-oligo) en los que un átomo de oxígeno de no puente del grupo fosfato está sustituido con un átomo de azufre. Los S-oligos pueden prepararse por tratamiento de los O-oligos correspondientes con 1,1-dióxido de 3H-1,2-benzoditiol-3-ona, que es un reactivo de transferencia de azufre. Véase, por ejemplo, lyer, R. P. y col., J. Org. Chem. 55:4693-4698 (1990); y lyer, R. P. y col., J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254 (1990). Oligonucleótidos antisentido de STEAP-1 adicionales incluyen oligonucleótidos antisentido de morfolino conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Partridge y col., 1996, Antisense & Nucleic Acid Drug Development 6: 169-175).
[0101] Los oligonucleótidos antisentido STEAP-1 normalmente pueden ser ARN o ADN que es complementario a y se hibrida establemente con los 100 primeros codones de 5' o los 100 últimos codones de 3' de una secuencia genómica de STEAP-1 o el ARNm correspondiente. No se requiere complementariedad absoluta, aunque se prefieren altos grados de complementariedad. El uso de un oligonucleótido complementario a esta región permite la hibridación selectiva con ARNm de STEAP-1 y no con ARNm que especifique otras subunidades reguladoras de proteína cinasa. Oligonucleótidos antisentido STEAP-1 pueden ser fragmentos 15 a 30-meros de la molécula de ADN antisentido que tiene una secuencia que se hibrida con ARNm de STEAP-1 Opcionalmente, el oligonucleótido antisentido STEAP-1 es un oligonucleótido 30-mero que es complementario a una región en los 10 primeros codones de 5' o los 10 últimos codones de 3' de STEAP-1. Alternativamente, las moléculas antisentido se modifican para emplear ribozimas en la inhibición de la expresión de STEAP-1, véase, por ejemplo, L. A. Couture &
D. T. Stinchcomb; Trends Genet 12: 510-515 (1996).
II.A.3.) Cebadores y pares de cebadores
[0102] Otros ejemplos específicos de estos nucleótidos incluyen cebadores y pares de cebadores que permiten la amplificación específica de polinucleótidos de la divulgación o de cualquier parte específica de los mismos, y sondas que se hibridan selectivamente o específicamente con moléculas de ácidos nucleicos de la divulgación o con cualquier parte de los mismos. Las sondas pueden marcarse con un marcador detectable tal como, por ejemplo, un radioisótopo, compuesto fluorescente, compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, quelante metálico o enzima. Tales sondas y cebadores se usan para detectar la presencia de un polinucleótido STEAP en una muestra y como medio para detectar una célula que expresa una proteína STEAP-1.
[0103] Ejemplos de tales sondas incluyen polipéptidos que comprenden toda o parte de la secuencia de ADNc de STEAP-1 humana mostrada en la Figura 2. En los ejemplos también se describen ejemplos de pares de cebadores que pueden amplificar específicamente ARNm de STEAP-1. Como entenderá el experto, pueden prepararse muchísimos cebadores y sondas diferentes basándose en las secuencias proporcionadas en el presente documento y usarse eficazmente para amplificar y/o detectar un ARNm de STEAP-1.
[0104] Los polinucleótidos STEAP-1 son útiles para una variedad de fines que incluyen, pero no se limitan a, su uso como sondas y cebadores para la amplificación y/o detección del (de los) gen(es) STEAP-1, ARNm o fragmentos de los mismos; como reactivos para el diagnóstico y/o pronóstico de cáncer de próstata y otros cánceres; como secuencias codificantes que pueden dirigir la expresión de polipéptidos STEAP-1; como herramientas para modular o inhibir la expresión del (de los) gen(es) STEAP-1 y/o la traducción del (de los) transcrito(s) de STEAP-1; y como agentes terapéuticos.
[0105] La presente divulgación incluye el uso de cualquier sonda como se describe en el presente documento para identificar y aislar una secuencia de ácidos nucleicos de STEAP-1 o relacionada con STEAP-1 a partir de una fuente que se produce naturalmente, tal como seres humanos u otros mamíferos, además de la secuencia de ácidos nucleicos aislada por sí misma, que comprendería todas o parte de las secuencias encontradas en la sonda usada.
II.A.4.) Aislamiento de moléculas de ácidos nucleicos que codifican STEAP-1
[0106] Las secuencias de ADNc de STEAP-1 descritas en el presente documento permiten el aislamiento de otros polinucleótidos que codifican el (los) producto(s) génico(s) de STEAP-1, además del aislamiento de polinucleótidos que codifican homólogos del producto del gen STEAP-1, alternativamente isoformas cortadas y empalmadas, variantes alélicas y formas mutantes de un producto del gen STEAP-1, además de polinucleótidos que codifican análogos de proteínas relacionadas con STEAP-1. Diversos procedimientos de clonación molecular que pueden emplearse para aislar ADNc de longitud completa que codifican un gen STEAP-1 son muy conocidos (véanse, por ejemplo, Sambrook, J. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel y col., Eds., Wiley y Sons, 1995). Por ejemplo, pueden emplearse convenientemente metodologías de clonación de fago lambda usando sistemas de clonación comercialmente disponibles (por ejemplo, Lambda ZAP Express, Stratagene). Los clones de fago que contienen ADNc del gen STEAP-1 pueden identificarse sondando con un ADNc de STEAP-1 marcado o un fragmento del mismo. Por ejemplo, en una realización, un ADNc de STEAP-1 (por ejemplo, Figura 2) o una parte del mismo puede sintetizarse y usarse como una sonda para recuperar ADNc superpuestos y de longitud completa correspondientes a un gen STEAP-1. Un propio gen STEAP-1 puede aislarse cribando bibliotecas de ADN genómico, bibliotecas de cromosomas artificiales bacterianos (BAC), bibliotecas de cromosomas artificiales de levadura (YAC) y similares, con sondas o cebadores de ADN de STEAP-1.
II.A.5.) Moléculas de ácido nucleico recombinantes y sistemas huésped-vector
[0107] La divulgación también proporciona ADN recombinante o moléculas de ARN que contienen un polinucleótido STEAP-1, un fragmento, análogo u homólogo del mismo que incluyen, pero no se limitan a, fagos, plásmidos, fagémidos, cósmidos, YAC, BAC, además de diversos vectores virales y no virales muy conocidos en la técnica, y células transformadas o transfectadas con tal ADN recombinante o moléculas de ARN. Los procedimientos para generar tales moléculas son muy conocidos (véase, por ejemplo, Sambrook y col., 1989, arriba).
[0108] La divulgación proporciona además un sistema huésped-vector que comprende una molécula de ADN recombinante que contiene un polinucleótido STEAP-1, fragmento, análogo u homólogo del mismo dentro de una célula huésped procariota o eucariota adecuada. Ejemplos de células huésped eucariotas adecuadas incluyen una célula de levadura, una célula de planta o una célula de animal, tal como una célula de mamífero o una célula de insecto (por ejemplo, una célula infectable por baculovirus tal como una célula Sf9 o HighFive). Ejemplos de células de mamífero adecuadas incluyen diversas líneas de células de cáncer de próstata tales como DU145 y TsuPr1, otras líneas de células de cáncer de próstata transfectables o transducibles, células primarias (PrEC), además de varias células de mamífero rutinariamente usadas para la expresión de proteínas recombinantes (por ejemplo, células COS, CHO, 293, 293T). Más particularmente, un polinucleótido que comprende la secuencia codificante de STEAP-1
o un fragmento, análogo u homólogo de la misma, puede usarse para generar proteínas STEAP-1 o fragmentos de las mismas usando cualquier número de sistemas huésped-vector rutinariamente usados y ampliamente conocidos en la técnica.
[0109] Está disponible una amplia gama de sistemas huésped-vector adecuados para la expresión de proteínas STEAP-1 o fragmentos de las mismas, véase, por ejemplo, Sambrook y col., 1989, arriba; Current Protocols in Molecular Biology, 1995, arriba. Vectores preferidos para la expresión de mamífero incluyen, pero no se limitan a, pcDNA3.1/marca de myc-His (Invitrogen) y el vector retroviral pSRatkneo (Muller y col., 1991, MCB 11:1785). Usando estos vectores de expresión, STEAP-1 puede expresarse en varias líneas celulares de cáncer de próstata y no próstata que incluyen, por ejemplo, 293, 293T, rat-1, NIH 3T3 y TsuPr1. Los sistemas huésped-vector son útiles para la producción de una proteína STEAP-1 o fragmento de la misma. Tales sistemas huésped-vector pueden emplearse para estudiar las propiedades funcionales de STEAP-1 y mutaciones o análogos de STEAP-1.
[0110] La proteína STEAP-1 humana recombinante o un análogo u homólogo o fragmento de la misma puede producirse por células de mamífero transfectadas con una construcción que codifica un nucleótido relacionado con STEAP-1. Por ejemplo, células 293T pueden transfectarse con un plásmido de expresión que codifica STEAP-1 o fragmento, análogo u homólogo de la misma, una proteína relacionada con STEAP-1 se expresa en las células 293T, y la proteína STEAP-1 recombinante se aísla usando procedimientos de purificación convencionales (por ejemplo, purificación por afinidad usando anticuerpos anti-STEAP-1). Una secuencia codificante de STEAP-1 puede subclonarse en el vector retroviral pSRaMSVtkneo y usarse para infectar diversas líneas celulares de mamífero, tales como NIH-3T3, TsuPr1, 293 y rat-1 con el fin de establecer líneas celulares que expresan STEAP-1. También pueden emplearse diversos otros sistemas de expresión muy conocidos en la técnica. Las construcciones de expresión que codifican un péptido líder unido en marco con una secuencia codificante de STEAP-1 pueden usarse para la generación de una forma secretada de proteína STEAP-1 recombinante.
[0111] Como se trata en el presente documento, la redundancia en el código genético permite la variación en secuencias de genes STEAP-1. En particular, se sabe en la técnica que las especies huésped específicas frecuentemente tienen preferencias de codón específicas y, por tanto, la secuencia desvelada puede adaptarse según se prefiera para un huésped deseado. Por ejemplo, secuencias de codones análogos preferidas normalmente tienen codones raros (es decir, codones que tienen una frecuencia de uso inferior a aproximadamente el 20 % en secuencias conocidas del huésped deseado) sustituidos por codones de mayor frecuencia. Las preferencias de codones para una especie específica se calculan, por ejemplo, utilizando las tablas de uso de codones disponibles en INTERNET tales como en URL dna.affrc.go.jp/~nakamura/codon.html.
[0112] Se conocen modificaciones de secuencias adicionales para potenciar la expresión de proteínas en unhuésped celular. Éstas incluyen eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación falsas, señales de sitios de corte y empalme de exones/intrones, repeticiones similares a transposones y/u otras secuencias tales bien caracterizadas que son perjudiciales para la expresión génica. El contenido de GC de la secuencia se ajusta a niveles promedio para un huésped celular dado, como se calcula por referencia a genes conocidos expresados en la célula huésped. Cuando sea posible, la secuencia se modifica para evitar estructuras de ARNm secundarias de horquilla predichas. Otras modificaciones útiles incluyen la adición de una secuencia consenso de iniciación de la traducción en el inicio del marco de lectura abierto, como se describe en Kozak, Mol. Cell Biol., 9:5073-5080 (1989). Los expertos habituales entienden que la regla general de que los ribosomas eucariotas inician la traducción exclusivamente en el codón AUG próximo a 5' sólo se deroga bajo condiciones raras (véanse, por ejemplo, Kozak PNAS 92(7): 2662-2666, (1995) y Kozak NAR 15(20): 8125-8148 (1987)).
III.) Proteínas relacionadas con STEAP-1
[0113] También se proporcionan proteínas relacionadas con STEAP-1. Las proteínas STEAP-1 pueden comprender un polipéptido que tiene toda o parte de la secuencia de aminoácidos de STEAP-1 humana como se muestra en la Figura 2 o la Figura 3, preferentemente la Figura 2A. Alternativamente, las proteínas STEAP-1 pueden comprender polipéptidos de variante, homólogos o análogos que tienen alteraciones en la secuencia de aminoácidos de STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3.
[0114] Realizaciones de un polipéptido STEAP-1 incluyen: un polipéptido STEAP-1 que tiene una secuencia mostrada en la Figura 2, una secuencia de péptidos de una STEAP-1 como se muestra en la Figura 2 en la que T es U; al menos 10 nucleótidos contiguos de un polipéptido que tiene la secuencia como se muestra en la Figura 2; o al menos 10 péptidos contiguos de un polipéptido que tiene la secuencia como se muestra en la Figura 2 en la que T es U. Por ejemplo, ejemplos de péptidos STEAP-1 comprenden, sin limitación:
(I)
una proteína que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en una secuencia de aminoácidos como se muestra en la Figura 2A-Q o la Figura 3A-D;
(II)
una proteína relacionada con STEAP-1 que es al menos el 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o el 100 % homóloga a una secuencia de aminoácidos entera mostrada en la Figura 2A-Q o 3A-D;
(III) una proteína relacionada con STEAP-1 que es al menos el 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o el 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos entera mostrada en la Figura 2A-Q o 3A-D;
(IV)
una proteína que comprende al menos un péptido expuesto en las Tablas V a LI como se expone en la solicitud de patente de Estados Unidos 10/236.878 presentada el 6 de septiembre de 2002 cuyos contenidos específicos se incorporan completamente por referencia en el presente documento, opcionalmente con la condición de que no sea una proteína entera de la Figura 2;
(V)
una proteína que comprende al menos un péptido expuesto en las Tablas V-XVIII, conjuntamente, péptido que también se expone en Tablas XXII a LI, conjuntamente, opcionalmente con la condición de que no sea una proteína entera de la Figura 2;
(VI)
una proteína que comprende al menos dos péptidos seleccionados de los péptidos expuestos en las Tablas V-LI, opcionalmente con la condición de que no sea una proteína entera de la Figura 2;
(VII) una proteína que comprende al menos dos péptidos seleccionados de los péptidos expuestos en las Tablas V a LI, conjuntamente, con la condición de que la proteína no sea una secuencia contigua de una secuencia de aminoácidos de la Figura 2;
(VIII) una proteína que comprende al menos un péptido seleccionado de los péptidos expuestos en las Tablas V-XVIII; y al menos un péptido seleccionado de los péptidos expuestos en las Tablas XXII a LI, con la condición de que la proteína no sea una secuencia contigua de una secuencia de aminoácidos de la Figura 2;
(IX)
un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3A en cualquier incremento de número entero hasta 339, respectivamente, que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de hidrofilia de la Figura 5;
(X)
un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3A en cualquier incremento de número entero hasta 339 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor inferior a 0,5 en el perfil de hidropaticidad de la Figura 6;
(XI)
un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3A en cualquier incremento de número entero hasta 339 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de porcentaje de residuos accesibles de la Figura 7;
(XII) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3A en cualquier incremento de número entero hasta 339 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de flexibilidad promedio de la Figura 8;
(XIII) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, aminoácidos de una proteína de la Figura 3A en cualquier incremento de número entero hasta 339 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de giro beta de la Figura 9;
(XIV) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3B o 3D, en cualquier incremento de número entero hasta 258 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de hidrofilia de la Figura 5;
(XV) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3B o 3D, en cualquier incremento de número entero hasta 258 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor inferior a 0,5 en el perfil de hidropaticidad de la Figura 6;
(XVI) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3B o 3D, en cualquier incremento de número entero hasta 258 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de porcentaje de residuos accesibles de la Figura 7;
(XVII) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3B o 3D, en cualquier incremento de número entero hasta 258 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de flexibilidad promedio de la Figura 8;
(XVIII) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, aminoácidos de una proteína de la Figura 3B o 3D en cualquier incremento de número entero hasta 258 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de giro beta de la Figura 9;
(XIX) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3C, en cualquier incremento de número entero hasta 282 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de hidrofilia de la Figura 5;
(XX) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3C, en cualquier incremento de número entero hasta 282 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor inferior a 0,5 en el perfil de hidropaticidad de la Figura 6;
(XXI) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3C, en cualquier incremento de número entero hasta 282 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de porcentaje de residuos accesibles de la Figura 7;
(XXII) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3C, en cualquier incremento de número entero hasta 282 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de flexibilidad promedio de la Figura 8;
(XXIII) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, aminoácidos de una proteína de la Figura 3C en cualquier incremento de número entero hasta 282 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de giro beta de la Figura 9;
(XXIV) un péptido que se produce al menos dos veces en las Tablas V-XVIII y XXII a LI, conjuntamente;
(XXV) un péptido que se produce al menos tres veces en las Tablas VI-XVIII y XXII a LI, conjuntamente;
(XXVI) un péptido que se produce al menos cuatro veces en las Tablas V-XXVIII y XXII a LI, conjuntamente; (XXVII) un péptido que se produce al menos cinco veces en las Tablas V-XVIII y XXII a LI, conjuntamente;
(XXVIII) un péptido que se produce al menos una vez en las Tablas V-XVIII, y al menos una vez en las Tablas XXII a LI;
(XXIX) un péptido que se produce al menos una vez en las Tablas V-XVIII, y al menos dos veces en las Tablas XXII a LI;
(XXX) un péptido que se produce al menos dos veces en las Tablas V-XVIII, y al menos una vez en las Tablas XXII a LI;
(XXXI) un péptido que se produce al menos dos veces en las Tablas V-XVIII, y al menos dos veces en las Tablas XXII a LI;
(XXXII) un péptido que comprende una, dos, tres, cuatro o cinco de las siguientes características, o un oligonucleótido que codifica tal péptido:
i) una región de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de número entero hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual a o superior a 0,5, 0,8, 0,7, 0,8, 0,9, o que tiene un valor igual a 1,0 en el perfil de hidrofilia de la Figura
6:
ii) una región de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de número entero hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual a o inferior a 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, o que tiene un valor igual a 0,0 en el perfil de hidropaticidad de la Figura 6;
iii) una región de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de número entero hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual a o superior a 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o que tiene un valor igual a 1,0 en el perfil de porcentaje de residuos accesibles de la Figura 7;
iv) una región de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de número entero hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual a o superior a 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o que tiene un valor igual a 1,0 en el perfil de flexibilidad promedio de la Figura 8; o
v) una región de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de número entero hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual a o superior a 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o que tiene un valor igual a 1,0 en el perfil de giro beta de la Figura 9;
(XXXIII) una composición que comprende un péptido de (I)-(XXXII) o un anticuerpo o región de unión del mismo junto con un excipiente farmacéutico y/o en una forma de dosis unitaria humana.
(XXXIV) un procedimiento de uso de un péptido de (I)-(XXXII) o un anticuerpo o región de unión del mismo o una composición de (XXXIII) en un procedimiento para modular una célula que expresa STEAP-1;
(XXXV) un procedimiento de uso de un péptido de (I)-(XXXII) o un anticuerpo o región de unión del mismo o una composición de (XXXIII) en un procedimiento para el diagnóstico, profilaxis, pronóstico o tratamiento de un individuo que lleva una célula que expresa STEAP-1;
(XXXVI) un procedimiento de uso de un péptido de (I)-(XXXII) o un anticuerpo o región de unión del mismo o una composición (XXXIII) en un procedimiento para el diagnóstico, profilaxis, pronóstico o tratamiento de un individuo que lleva una célula que expresa STEAP-1, dicha célula de un cáncer de un tejido enumerado en la Tabla I;
(XXXVII) un procedimiento de uso de un péptido de (I)-(XXXII) o un anticuerpo o región de unión del mismo o una composición de (XXXIII) en un procedimiento para el diagnóstico, profilaxis, pronóstico o tratamiento de un cáncer,
(XXXVIII) un procedimiento de uso de un péptido de (I)-(XXXII) o un anticuerpo o región de unión del mismo o una composición de (XXXIII) en un procedimiento para el diagnóstico, profilaxis, pronóstico o tratamiento de un cáncer de un tejido enumerado en la Tabla I; y;
(XXXIX) un procedimiento de uso de un péptido de (I)-(XXXII) o un anticuerpo o región de unión del mismo o una composición (XXXIII) en un procedimiento para identificar o caracterizar un modulador de una célula que expresa STEAP-1;
[0115] Como se usa en el presente documento, se entiende que un intervalo desvela específicamente todas las posiciones unitarias completas del mismo.
[0116] Los polinucleótidos STEAP-1 típicos pueden codificar porciones específicas de secuencias de ARNm de STEAP-1 (y aquellas que son complementarias a tales secuencias) tales como aquellas que codifican las proteínas y/o fragmentos de las mismas, por ejemplo:
(a) 4, 5, 6 8, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 80, 85, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 185, 170, 176, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 330, 335, 339 o más aminoácidos contiguos de la variante 1 de STEAP-1; las longitudes máximas relevantes para otras variantes son: variante 2, 258 aminoácidos; variante 3, 282 aminoácidos, variante 4, 258 aminoácidos.
[0117] En general, las variantes alélicas que se producen naturalmente de STEAP-1 humana comparten un alto grado de identidad y homología estructural (por ejemplo, el 90 % o más de homología). Normalmente, las variantes alélicas de una proteína STEAP-1 contienen sustituciones de aminoácidos conservativas dentro de las secuencias de STEAP-1 descritas en el presente documento o contienen una sustitución de un aminoácido de una posición correspondiente en un homólogo de STEAP-1. Una clase de variantes alélicas de STEAP-1 son proteínas que comparten un alto grado de homología con al menos una región pequeña de una secuencia de aminoácidos de STEAP-1 particular, peo adicionalmente contienen una salida de radical de la secuencia, tal como una sustitución no conservativa, truncación, inserción o desplazamiento del marco. En comparaciones de secuencias de proteínas, los términos, similitud, identidad y homología tienen cada uno un significado distinto como se aprecia en el campo de la genética. Además, la ortología y paralogía pueden ser conceptos importantes que describen la relación de miembros de una familia de proteínas dada en un organismo con los miembros de la misma familia en otros organismos.
[0118] Las abreviaturas de aminoácidos se proporcionan en la Tabla II. Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden hacerse frecuentemente en una proteína sin alterar tanto la conformación como la función de la proteína. Las proteínas de la invención pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 sustituciones conservativas.
[0119] En el presente documento también se desvela una amplia variedad de variantes o análogos aceptados en la materia de proteínas STEAP-1 tales como polipéptidos que tienen inserciones, deleciones y sustituciones de aminoácidos. Las variantes de STEAP-1 pueden prepararse usando procedimientos conocidos en la técnica tales como mutagénesis dirigida a sitio, barrido con alanina y mutagénesis por PCR. La mutagénesis dirigida a sitio (Carter y col., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller y col., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)), mutagénesis en casete (Wells y col., Gene, 34:315 (1985)), mutagénesis de selección por restricción (Wells y col., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)) u otras técnicas conocidas pueden realizarse en el ADN clonado para producir el ADN de la variante de STEAP-1.
[0120] El análisis de aminoácidos por barrido también puede emplearse para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua que participa en una actividad biológica específica tal como una interacción proteína-proteína. Entre los aminoácidos de barrido preferidos están aminoácidos neutros relativamente pequeños. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es normalmente un aminoácido de barrido preferido entre este grupo debido a que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de cadena principal de la variante. La alanina también se prefiere normalmente debido a que es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente en tanto posiciones enterradas como expuestas (Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)). Si la sustitución de alanina no da cantidades adecuadas de variantes, puede usarse un aminoácido isostérico.
[0121] Como se define en el presente documento, las variantes, análogos u homólogos de STEAP-1 tienen el atributo diferenciador de tener al menos un epítope que es “reactivo de forma cruzada” con una proteína STEAP-1 que tiene una secuencia de aminoácidos de la Figura 3. Como se usa en esta frase, “reactivo de forma cruzada” significa que un anticuerpo o linfocito T que se une específicamente a una variante de STEAP-1 también se une específicamente a una proteína STEAP-1 que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 3. Un polipéptido deja de ser una variante de una proteína mostrada en la Figura 3 cuando ya no contiene ningún epítope que pueda ser reconocido por un anticuerpo o linfocito T que se une específicamente a la proteína STEAP-1 de partida. Aquellos expertos en la materia entienden que los anticuerpos que reconocen proteínas se unen a epítopes de tamaño variable, y una agrupación del orden de aproximadamente cuatro o cinco aminoácidos, contiguos o no, se considera un número típico de aminoácidos en un epítope mínimo. Véanse, por ejemplo, Nair y col., J. Immunol 2000 165(12): 6949-6955; Hebbes y col., Mol Immunol (1989) 26(9):865-73; Schwartz y col., J Immunol (1985) 135(4):2598-608.
[0122] Otras clases de variantes de proteína relacionadas con STEAP-1 comparten el 70 %, 75 %, 80 %, 86º % o el 90 % o más similitud con una secuencia de aminoácidos de la Figura 3, o un fragmento de la misma. Otra clase específica de variantes o análogos de proteínas STEAP-1 comprende uno o más de los motivos biológicos de STEAP-1 descritos en el presente documento o presentemente conocidos en la técnica. Por tanto, englobado por la presente divulgación están análogos de fragmentos de STEAP-1 (nucleico o aminoácido) que tienen propiedades funcionales alteradas (por ejemplo, inmunogénicas) con respecto al fragmento de partida. Deberá apreciarse que los motivos de ahora o que se vuelven parte de la materia van a aplicarse a las secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos de la Figura 2 o la Figura 3.
[0123] Como se trata en el presente documento, los polipéptidos pueden contener menos de la secuencia de aminoácidos entera de una proteína STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3. Por ejemplo, péptidos/proteínas pueden tener cualquiera de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más aminoácidos contiguos de una proteína STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3.
[0124] También se incluyen polipéptidos que consisten en de aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 10 de una proteína STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polipéptidos que consisten en de aproximadamente el aminoácido 10 a aproximadamente el aminoácido 20 de una proteína STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polipéptidos que consisten en de aproximadamente el aminoácido 20 a aproximadamente el aminoácido 30 de una proteína STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polipéptidos que consisten en de aproximadamente el aminoácido 30 a aproximadamente el aminoácido 40 de una proteína STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polipéptidos que consisten en de aproximadamente el aminoácido 40 a aproximadamente el aminoácido 50 de una proteína STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polipéptidos que consisten en de aproximadamente el aminoácido 50 a aproximadamente el aminoácido 60 de una proteína STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polipéptidos que consisten en de aproximadamente el aminoácido 60 a aproximadamente el aminoácido 70 de una proteína STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polipéptidos que consisten en de aproximadamente el aminoácido 70 a aproximadamente el aminoácido 80 de una proteína STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polipéptidos que consisten en de aproximadamente el aminoácido 80 a aproximadamente el aminoácido 90 de una proteína STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polipéptidos que consisten en de aproximadamente el aminoácido 90 a aproximadamente el aminoácido 100 de una proteína STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, etc., a lo largo de toda la totalidad de una secuencia de aminoácidos de STEAP-1. Además, se desvelan polipéptidos que consisten en de aproximadamente el aminoácido 1 (o 20 ó 30 ó 40 etc.) a aproximadamente el aminoácido 20 (o 130 ó 140 ó 150 etc.) de una proteína STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3. Deberá apreciarse que las posiciones de inicio y parada en este párrafo se refieren a la posición especificada, además de esa posición más o menos 5 residuos.
[0125] Las proteínas relacionadas con STEAP-1 se generan usando tecnología de síntesis de péptidos convencional o usando procedimientos de escisión química muy conocidos en la técnica. Alternativamente, los procedimientos recombinantes pueden usarse para generar moléculas de ácidos nucleicos que codifican una proteína relacionada con STEAP-1. Las moléculas de ácidos nucleicos pueden proporcionar un medio para generar fragmentos definidos de una proteína STEAP-1 (o variantes, homólogos o análogos de la misma).
III.A.) Proteína que lleva motivos
[0126] En el presente documento también se desvelan polipéptidos STEAP-1 que comprenden los residuos de aminoácidos de uno o más de los motivos biológicos contenidos dentro de una secuencia de polipéptidos STEAP-1 expuesta en la Figura 2 o la Figura 3. Diversos motivos se conocen en la técnica, y una proteína puede evaluarse para la presencia de tales motivos por varios sitios de internet públicamente disponibles (véanse, por ejemplo, las direcciones URL: pfam.wustl.edu/; searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/struc-predict.html; psort.ims.u-tokyo.ac.jp/; cbs.dtu.dk/; ebi.ac.uk/interpro/scan.html; expasy.ch/tools/scnpsit1.html; Epimatrix™ y Epimer™, Brown University, brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html; y BIMAS, bimas.dcrt.nih.gov/.).
[0127] Las subsecuencias que llevan motivos de todas las proteínas variantes STEAP-1 se exponen e identifican en las Tablas V-XVIII y XXII-LI.
[0128] La Tabla IV(h) expone varios motivos que se producen frecuentemente basándose en búsquedas de pfam (véase la dirección URL pfam.wustl.edu/). Las columnas de la Tabla IV(h) enumeran (1) abreviatura del nombre del motivo, (2) identidad en porcentaje encontrada entre los diferentes miembros de la familia de motivos, (3) nombre del motivo o descripción y (4) función más común; se incluye información de localización si el motivo es relevante para la localización.
[0129] Los polipéptidos que comprenden uno o más de los motivos de STEAP-1 tratados anteriormente son útiles en elucidar las características específicas de un fenotipo maligno en vista de la observación de que los motivos de STEAP-1 tratados anteriormente están asociados a desregulación del crecimiento y debido a que STEAP-1 se expresa en exceso en ciertos cánceres (véase, por ejemplo, la Tabla I). La caseína cinasa II, AMPc y la proteína cinasa dependiente de camp, y la proteína cinasa C, por ejemplo, son enzimas conocidas por asociarse al desarrollo de fenotipo maligno (véanse, por ejemplo, Chen y col., Lab Invest, 78(2): 165-174 (1998); Gaiddon y col., Endocrinology 136(10): 4331-4338 (1995); Hall y col., Nucleic Acids Research 24(6):1119-1126 (1998); Peterziel y col., Oncogene 18(46): 6322-6329 (1999) y O'Brian, Oncol. Rep. 5(2): 305-309 (1998)). Además, tanto la glucosilación como la miristoilación también son modificaciones de proteínas asociadas a cáncer y progresión de cáncer (véanse, por ejemplo, Dennis y col., Biochem. Biophys. Acta 1473(1):21-34 (1999); Raju y col., Exp. Cell Res. 235(1):145-154 (1997)). La amidación también es otra modificación de proteínas asociadas a cáncer y progresión de cáncer (véase, por ejemplo, Treston y col., J. Natl. Cancer Inst. Monogr. (13):169-175 (1992)).
[0130] Las proteínas de la divulgación comprenden uno o más de los epítopes inmunorreactivos identificados según procedimientos aceptados en la materia, tales como los péptidos expuestos en las Tablas V-XVIII y XXII-LI. Los epítopes de CTL pueden determinarse usando algoritmos específicos para identificar péptidos dentro de una proteína STEAP-1 que pueden unirse óptimamente a alelos de HLA especificados (por ejemplo, Tabla IV; Epimatrix™ y Epimer™, Brown University, URL brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/Epimatrix/Epimatrix.html; y BIMAS, URL bimas.dcrt.nih.gov/.) Además, los procedimientos para identificar péptidos que tienen suficiente afinidad de unión para moléculas HLA y que guardan relación con epítopes que son inmunogénicos son muy conocidos en la técnica y se llevan a cabo sin experimentación adicional. Además, los procedimientos para identificar péptidos que son epítopes inmunogénicos son muy conocidos en la técnica, y se llevan a cabo sin experimentación adicional tanto in vitro como in vivo.
[0131] En la técnica también se conocen principios para crear análogos de tales epítopes con el fin de modular la inmunogenicidad. Por ejemplo, se empieza con un epítope que lleva un motivo de CTL o HTL (véanse, por ejemplo, motivos/supermotivos de clase I de HLA y clase II de HLA de la Tabla IV). El epítope se analogiza sustituyendo un aminoácido en una de las posiciones especificadas y sustituyéndolo con otro aminoácido especificado para esa posición. Por ejemplo, basándose en residuos definidos en la Tabla IV, un residuo perjudicial puede sustituirse en favor de cualquier otro residuo, tal como un residuo preferido; sustituir un residuo menos preferido con un residuo preferido; o sustituir un residuo preferido que se produce originalmente con otro residuo preferido. Las sustituciones pueden producirse en posiciones de anclaje primarias o en otras posiciones en un péptido; véase, por ejemplo, la Tabla IV.
[0132] Una variedad de preferencias reflejan la materia referente a la identificación y generación de epítopes en una proteína de interés, además de análogos de la misma. Véanse, por ejemplo, el documento WO 97/33602 a Chesnut y col.; Sette, Immunogenetics 1999 50(3-4): 201-212; Sette y col., J. Immunol. 2001 166(2):1389-1397; Sidney y col., Hum. Immunol. 1997 58(1):12-20; Kondo y col., Immunogenetics 1997 45(4): 249-258; Sidney y col., J. Immunol, 1996 157(8): 3480-90; y Falk y col., Nature 351: 290-6 (1991); Hunt y col., Science 255:1261-3 (1992); Parker y col., J. Immunol. 149:3580-7 (1992); Parker y col., J. Immunol. 152:163-75 (1994)); Kast y col., 1994 152(8); 3904-12; Borras-Cuesta y col., Hum. Immunol. 2000 61(3): 266-278; Alexander y col., J. Immunol. 2000 164(3); 164(3):1625-1833; Alexander y col., PMID: 7895164, UI: 95202582; O'Sullivan y col., J. Immunol. 1991 147(8): 26632669; Alexander y col., Immunity 1994 1(9): 751-761 y Alexander y col., Immunol. Res. 1998 18(2): 79-92.
[0133] La divulgación también incluye polipéptidos que comprenden combinaciones de los diferentes motivos expuestos en la(s) Tabla(s) IV(a), IV(b), IV(c), IV(d) y IV(h), y/o uno o más de los epítopes de CTL predichos de las Tablas V-XVIII y XXII-LI y/o uno o más de los epítopes de HTL predichos de las Tablas XLVIII-LI y/o uno o más de los motivos de unión a linfocitos T conocidos en la técnica. Pueden no contener inserciones, deleciones o sustituciones tanto dentro de los motivos como dentro de las secuencias intervinientes de los polipéptidos. Además, pueden incluir varios residuos de aminoácidos tanto del extremo N como del extremo C en cualquier lado de estos motivos pueden ser deseables (para, por ejemplo, incluir una mayor porción de arquitectura de polipéptidos en la que el motivo está localizado). Normalmente, el número de residuos de aminoácidos del extremo N y/o extremo C en cualquier lado de un motivo es entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 residuos de aminoácidos, preferentemente 5 y aproximadamente 50 residuos de aminoácidos.
[0134] Las proteínas relacionadas con STEAP-1 se expresan de muchas formas, preferentemente en forma aislada. Una molécula de proteína STEAP-1 purificada estará sustancialmente libre de otras proteínas o moléculas que alteran la unión de STEAP-1 a anticuerpo, linfocito T u otro ligando. La naturaleza y el grado de aislamiento y purificación dependerán del uso previsto. Las proteínas relacionadas con STEAP-1 pueden incluir proteínas relacionadas con STEAP-1 purificadas y proteínas relacionadas con STEAP-1 solubles funcionales. Una proteína STEAP-1 soluble funcional o fragmento de la misma puede retener la capacidad para ser unida por anticuerpo, linfocito T u otro ligando.
[0135] La divulgación también proporcionar proteínas STEAP-1 que comprenden fragmentos biológicamente activos de una secuencia de aminoácidos de STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3. Tales proteínas presentan propiedades de la proteína STEAP-1 de partida, tales como la capacidad para provocar la generación de anticuerpos que se unen específicamente a epítope asociados a la proteína STEAP-1 de partida; para unirse por tales anticuerpos; para provocar la activación de HTL o CTL; y/o para ser reconocidas por HTL o CTL que también se unen específicamente a la proteína de partida.
[0136] Los polipéptidos relacionados con STEAP-1 que contienen estructuras particularmente interesantes pueden predecirse y/o identificarse usando diversas técnicas analíticas muy conocidas en la técnica que incluyen, por ejemplo, los procedimientos de análisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schulz o Jameson-Wolf, o basándose en inmunogenicidad. Los fragmentos que contienen tales estructuras son particularmente útiles en generar anticuerpos anti-STEAP-1 específicos para subunidad o linfocitos T o en identificar factores celulares que se unen a STEAP-1. Por ejemplo, pueden generarse perfiles de hidrofilia e identificarse fragmentos de péptidos inmunogénicos usando el procedimiento de Hopp, T.P. y Woods, KR., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.SA 78:3824-3828. Pueden generarse perfiles de hidropaticidad e identificarse fragmentos de péptidos inmunogénicos usando el procedimiento de Kyte, J. y Doolittle, R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-132. Puede generarse el perfil de porcentaje (%) de residuos accesibles e identificarse fragmentos de péptidos inmunogénicos usando el procedimiento de Janin J., 1979, Nature 277:491-492. Pueden generarse los perfiles de flexibilidad promedio e identificarse fragmentos de péptidos inmunogénicos usando el procedimiento de Bhaskaran R., Ponnuswamy P.K, 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255. Pueden generarse perfiles de giro beta e identificarse fragmentos de péptidos inmunogénicos usando el procedimiento de Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294.
[0137] Los epítopes de CTL pueden determinarse usando algoritmos específicos para identificar péptidos dentro de una proteína STEAP-1 que pueden unirse óptimamente a alelos de HLA especificados (por ejemplo, usando el sitio de SYFPEITHI en la URL de la malla mundial syfpeithi.bmi-heidelberg.com/; las enumeraciones en la Tabla IV(A)-(E); Epimatrix™ y Epimer™, Brown University, URL (brown.edu/Research/TBHIV_Lab/Epimatrix/Epimatrix.html); y BIMAS, URL bimas.dcrt.nih.gov/). Ilustrando esto, se predijeron epítopes de péptidos STEAP-1 que se presentan en el contexto de moléculas de clase I del MHC humano, por ejemplo, HLA-A1, A2, A3, A11, A24, B7 y B35 (véanse, por ejemplo, las Tablas V-XVIII, XXII-LI). Específicamente, la secuencia de aminoácidos completa de la proteína STEAP-1 y porciones relevantes de otras variantes, es decir, para predicciones de la clase I de HLA 9 residuos flanqueantes en cualquier lado de una mutación puntual o unión de exones, y para las predicciones de la clase II de HLA 14 residuos flanqueantes en cualquier lado de una mutación puntual o unión de exones correspondientes a esa variante, se entraron en el algoritmo de búsqueda de motivos de péptidos de HLA encontrado la malla mundial de Bioinformatics and Molecular Analysis Section (BIMAS) enumerado anteriormente; además del sitio de SYFPEITHI, en URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/.
[0138] El algoritmo de búsqueda de motivos de péptidos de HLA se desarrolló por Dr. Ken Parker basándose en la unión de secuencias de péptidos específicas en el surco de las moléculas HLA de clase I, en particular HLA-A2 (véanse, por ejemplo, Falk y col., Nature 351: 290-8 (1991); Hunt y col., Science 255:1261-3 (1992); Parker y col., J. Immunol. 149:3580-7 (1992); Parker y col., J. Immunol. 152:163-75 (1994)). Este algoritmo permite la localización y clasificación de péptidos 8-meros, 9-meros y 10-meros de una secuencia de proteínas completa para la unión predicha a HLA-A2, además de numerosas otras moléculas HLA de clase I. Muchos péptidos de unión a la clase I de HLA son 8-, 9-,10- ó 11-meros. Por ejemplo, para HLA-A2 de la clase I, los epítopes contienen preferentemente una leucina (L) o metionina (M) en la posición 2 y una valina (V) o leucina (L) en el extremo C (véase, por ejemplo, Parker y col., J. Immunol. 149:3580-7 (1992)). Los resultados seleccionados de los péptidos de unión predichos de STEAP-1 se muestran en las Tablas V-XVIII y XXII-LI en el presente documento. En las Tablas V-XVIII y XXII-XLVIII, los candidatos seleccionados, 9-meros y 10-meros, para cada miembro de familia se muestran junto con su localización, la secuencia de aminoácidos de cada péptido específico y una puntuación de unión estimada. En las Tablas XLVIII-LI, los candidatos seleccionados, 15-meros, para cada miembro de familia se muestran junto con su localización, la secuencia de aminoácidos de cada péptido específico y una puntuación de unión estimada. La puntuación de unión se corresponde con la semivida estimada de la disociación de complejos que contienen el péptido a 37 ºC a pH 8,5. Se predice que los péptidos con la mayor puntuación de unión son los más estrechamente unidos a la clase I de HLA sobre la superficie celular durante el mayor periodo de tiempo y, por tanto, representan las mejores dianas inmunogénicas para el reconocimiento de linfocitos T.
[0139] La unión real de péptidos a un alelo de HLA puede evaluarse por estabilización de la expresión de HLA sobre la línea celular T2 defectuosa en el procesamiento de antígeno (véanse, por ejemplo, Xue y col., Prostate 30:73-8 (1997) y Peshwa y col., Prostate 36:129-38 (1998)). La inmunogenicidad de péptidos específicos puede evaluarse in vitro por estimulación de linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+ en presencia de células presentadoras de antígeno tal como células dendríticas.
[0140] Deberá apreciarse que cada epítope predicho por el sitio BIMAS, los sitios Epimer™ y Epimatrix™, o
especificados por los motivos de clase I o clase II de HLA disponibles en la materia o que se convertirán en parte de la materia tal como se expone en la Tabla IV (o se determinan usando el sitio de la malla mundial URL syfpeithi.bmiheidelberg.com/, o BIMAS, bimas.dcrt.nih.gov/), van a “aplicarse” a una proteína STEAP-1. Como se usa en este contexto, “aplicarse” significa que una proteína STEAP-1 se evalúa, por ejemplo, visualmente o por procedimientos de búsqueda de patrones basados en ordenador, como se aprecia por aquellos expertos en la materia relevante. Cada subsecuencia de una proteína STEAP-1 de 8, 9, 10 u 11 residuos de aminoácidos que lleva un motivo de clase I de HLA, o una subsecuencia de 9 o más residuos de aminoácidos que lleva un motivo de clase II de HLA, están dentro del alcance de la divulgación.
III.B.) Expresión de proteínas relacionadas con STEAP-1
[0141] STEAP-1 puede expresarse convenientemente en células (tal como células 293T) transfectadas con un vector de expresión comercialmente disponible tal como un vector de expresión accionado por el CMV que codifica STEAP-1 con una marca 6XHis y MYC del extremo C (pcDNA3.1/myc-HIS, Invitrogen, o Tag5, GenHunter Corporation, Nashville TN). El vector Tag5 proporciona un señal de secreción de IgGK que puede usarse para facilitar la producción de una proteína STEAP-1 secretada en células transfectadas. La STEAP-1 marcada con His secretada en los medios de cultivo puede purificarse, por ejemplo, usando una columna de níquel usando técnicas convencionales.
III.C.) Modificaciones de proteínas relacionadas con STEAP-1
[0142] Modificaciones de proteínas relacionadas con STEAP-1 tales como modificaciones covalentes están incluidas dentro del alcance de la presente divulgación. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar residuos de aminoácidos elegidos como diana de un polipéptido STEAP-1 con un agente derivatizante orgánico que puede reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos del extremo N o C de una proteína STEAP-1. Otro tipo de modificación covalente de un polipéptido STEAP-1 incluida dentro del alcance de la presente divulgación comprende alterar el patrón de glucosilación nativo de una proteína de la divulgación. Otro tipo de modificación covalente de STEAP-1 comprende enlazar un polipéptido STEAP-1 con uno de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquilenos, en el modo expuesto en las patentes de EE.UU. nº 4.640.835; 4.488.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ó 4.179.337.
[0143] Las proteínas relacionadas con STEAP-1 también pueden modificarse para formar una molécula quimérica que comprende STEAP-1 fusionada con otra secuencia de polipéptidos o aminoácidos heteróloga. Una molécula quimérica tal puede sintetizarse químicamente o recombinantemente. Una molécula quimérica puede tener una proteína de la divulgación fusionada con otro antígeno asociado a tumor o fragmento del mismo. Alternativamente, una proteína puede comprender una fusión de fragmentos de una secuencia de STEAP-1 (aminoácido o ácido nucleico) de forma que se cree una molécula que no es, a lo largo de su longitud, directamente homóloga a las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos mostradas en la Figura 2 o la Figura 3. Una molécula quimérica tal puede comprender múltiples de la misma subsecuencia de STEAP-1. Una molécula quimérica puede comprender una fusión de una proteína relacionada con STEAP-1 con una marca de epítope de polihistidina, que proporciona un epítope con el que puede unirse selectivamente níquel inmovilizado, con citocinas o con factores de crecimiento. La marca de epítope se sitúa generalmente en el extremo amino o carboxilo de una proteína STEAP-1. La molécula quimérica puede comprender una fusión de una proteína relacionada con STEAP-1 con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica
(también denominada una “inmunoadhesina”), una fusión tal podría ser con la región Fc de una molécula de IgG.
Las fusiones de Ig incluyen preferentemente la sustitución de una forma soluble (dominio transmembrana delecionado o inactivado) de un polipéptido STEAP-1 en lugar de al menos una región variable dentro de una molécula de Ig. La fusión de inmunoglobulina preferentemente incluye la bisagra, CH2 y CH3, o la bisagra, regiones CH1, CH2 y CH3 de una molécula de IgG1. Para la producción de fusiones de inmunoglobulina véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.428.130 concedida el 27 de junio de 1995.
III.D.) Usos de proteínas relacionadas con STEAP-1
[0144] Las proteínas de la divulgación tienen varios usos específicos diferentes. Como STEAP-1 se expresa altamente en próstata y otros cánceres, proteínas relacionadas con STEAP-1 se usan en procedimientos que evalúan el estado de productos del gen STEAP-1 en tejidos normales frente a cancerosos, esclareciendo así el fenotipo maligno. Normalmente, los polipéptidos de regiones específicas de una proteína STEAP-1 se usan para evaluar la presencia de perturbaciones (tales como deleciones, inserciones, mutaciones puntuales, etc.) en aquellas regiones (tales como regiones que contienen uno o más motivos). Ensayos a modo de ejemplo utilizan anticuerpos o proteínas relacionadas con STEAP-1 que eligen como diana linfocitos T que comprenden los residuos de aminoácidos de uno o más de los motivos biológicos contenidos dentro de una secuencia de polipéptidos de STEAP-1 con el fin de evaluar las características de esta región en tejidos normales frente a cancerosos o para provocar una respuesta inmunitaria al epítope. Alternativamente, proteínas relacionadas con STEAP-1 que contienen los residuos de aminoácidos de uno o más de los motivos biológicos en una proteína STEAP-1 se usan para cribar factores que interaccionan con esa región de STEAP-1.
[0145] Los fragmentos/subsecuencias de proteínas STEAP-1 son particularmente útiles en generar y caracterizar anticuerpos específicos de dominio (por ejemplo, anticuerpos que reconocen un epítope extracelular o intracelular de una proteína STEAP-1), para identificar agentes o factores celulares que se unen a STEAP-1 o un dominio estructural particular de la misma, y en diversos contextos terapéuticos y de diagnóstico, que incluyen, pero no se limitan a, ensayos de diagnóstico, vacunas para el cáncer y procedimientos de preparación de tales vacunas.
[0146] Proteínas codificadas por los genes STEAP-1, o por análogos, homólogos o fragmentos de los mismos, tienen una variedad de usos, que incluyen, pero no se limitan a, generar anticuerpos y en procedimientos para identificar ligandos y otros agentes y constituyentes celulares que se unen a un producto del gen STEAP-1. Anticuerpos producidos contra una proteína STEAP-1 o fragmento de la misma son útiles en ensayos de diagnóstico y pronóstico, y metodologías de obtención de imágenes en la gestión de cánceres humanos caracterizados por expresión de la proteína STEAP-1, tales como aquellos enumerados en la Tabla I. Tales anticuerpos pueden expresarse intracelularmente y usarse en procedimientos para tratar pacientes con tales cánceres. También se usan ácidos nucleicos o proteínas relacionadas con STEAP-1 en la generación de respuestas de HTL o CTL.
[0147] Se usan diversos ensayos inmunológicos útiles para la detección de proteínas STEAP-1, que incluyen, pero no se limitan a, diversos tipos de radioinmunoensayos, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), enzimoinmunoanálisis de fluorescencia (ELIFA), procedimientos inmunocitoquímicos, y similares. Pueden marcarse anticuerpos y usarse como reactivos de obtención de imágenes inmunológicos que pueden detectar células que expresan STEAP-1 (por ejemplo, en procedimientos de obtención de imágenes radioescintigráficos). Las proteínas STEAP-1 también son particularmente útiles en generar vacunas para el cáncer, como se describe adicionalmente en el presente documento.
IV.) Anticuerpos para STEAP-1
[0148] La invención proporciona anticuerpos como se define en la reivindicación 1 y la reivindicación 2 que se unen específicamente a STEAP-1 y no se unen (o se unen débilmente) a péptidos o proteínas que no son proteínas relacionadas con STEAP-1 bajo condiciones fisiológicas. En este contexto, ejemplos de condiciones fisiológicas incluyen: 1) solución salina tamponada con fosfato; 2) solución salina tamponada con Tris que contiene Tris 25 mM y NaCl 150 mM; o solución salina normal (0,9 % de NaCl); 4) suero animal tal como suero humano; o, 5) una combinación de cualquiera de 1) a 4); estas reacciones tienen lugar preferentemente a pH 7,6, alternativamente en un intervalo de pH 7,0 a 8,0, o alternativamente en el intervalo de pH 6,5 a 8,5; por tanto, estas reacciones tienen lugar a una temperatura entre 4 ºC y 37 ºC. Por ejemplo, anticuerpos que se unen a STEAP-1 pueden unirse a proteínas relacionadas con STEAP-1 tales como los homólogos o análogos de las mismas.
[0149] Los anticuerpos para STEAP-1 de la invención son particularmente útiles en cáncer (véase, por ejemplo, la Tabla I), ensayos de diagnóstico y pronóstico, y metodologías de obtención de imágenes. Similarmente, tales anticuerpos son útiles en el tratamiento, diagnóstico y/o pronóstico de cánceres de próstata y otros cánceres, hasta el punto que STEAP-1 también se exprese o exprese en exceso en estos otros cánceres. Además, anticuerpos intracelularmente expresados (por ejemplo, anticuerpos monocatenarios) son terapéuticamente útiles en el tratamiento de cánceres en los que participa la expresión de STEAP-1, tales como cánceres de próstata avanzados o metastásicos u otros cánceres avanzados o metastásicos.
[0150] La invención también proporciona diversos ensayos inmunológicos útiles para la detección y cuantificación de STEAP-1 y proteínas relacionadas con STEAP-1 mutantes. Tales ensayos comprenden uno o más anticuerpos para STEAP-1 de la invención que pueden reconocer y unirse a una proteína relacionada con STEAP-1, según convenga. Estos ensayos se realizan dentro de diversos formatos de ensayos inmunológicos muy conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, diversos tipos de radioinmunoensayos, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), enzimoinmunoanálisis de fluorescencia (ELIFA), y similares.
[0151] Ensayos de no anticuerpo inmunológicos también comprenden ensayos de inmunogenicidad de linfocitos T (inhibidores o estimulantes), además de ensayos de unión del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC).
[0152] Además, también se proporcionan procedimientos de obtención de imágenes inmunológicos que pueden detectar cáncer de próstata y otros cánceres que expresan STEAP-1, que incluyen, pero no se limitan a, procedimientos de obtención de imágenes radioescintigráficos usando anticuerpos para STEAP-1 marcados. Tales ensayos son clínicamente útiles en la detección, monitorización y pronóstico de STEAP-1 que expresa cánceres tales como cáncer de próstata.
[0153] Los anticuerpos para STEAP-1 también se usan en procedimientos para purificar una proteína relacionada con STEAP-1 y para aislar homólogos de STEAP-1 y moléculas relacionadas. Por ejemplo, un procedimiento de purificación de una proteína relacionada con STEAP-1 comprende incubar un anticuerpo para STEAP-1, que se ha acoplado a una matriz sólida, con un lisado u otra disolución que contiene una proteína relacionada con STEAP-1 en condiciones que permitan que el anticuerpo para STEAP-1 se una a la proteína relacionada con STEAP-1; lavar la matriz sólida para eliminar impurezas; y eluir la proteína relacionada con STEAP1 del anticuerpo acoplado. Otros usos de los anticuerpos para STEAP-1 según la invención incluyen generar anticuerpos antiidiotípicos que imitan a una proteína STEAP-1.
[0154] Diversos procedimientos para la preparación de anticuerpos son muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden prepararse inmunizando un huésped de mamífero adecuado usando una proteína relacionada con STEAP-1, péptido o fragmento, en forma aislada o inmunoconjugada (Anticuerpos: A Laboratory Manual, CSH Press, Eds., Harlow, y Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Además, también pueden usarse proteínas de fusión de STEAP-1, tales como una proteína de fusión de STEAP-1-GST. Puede producirse una proteína de fusión de GST que comprende toda o la mayoría de la secuencia de aminoácidos de la Figura 2 o la Figura 3, luego usarse como inmunógeno para generar anticuerpos apropiados. Una proteína relacionada con STEAP-1 puede sintetizarse y usarse como inmunógeno.
[0155] Además, se usan técnicas de inmunización con ADN desnudo conocidas en la técnica (con o sin proteína relacionada con STEAP-1 purificada o células que expresan STEAP-1) para generar una respuesta inmunitaria al inmunógeno codificado (para una revisión véase Donnetly y col., 1997, Ann. Rev. Immunol. 15:617648).
[0156] La secuencia de aminoácidos de una proteína STEAP-1 como se muestra en la Figura 2 o la Figura 3 puede analizarse para seleccionar regiones específicas de la proteína STEAP-1 para generar anticuerpos. Por ejemplo, se usan análisis de hidrofobia e hidrofilia de una secuencia de aminoácidos de STEAP-1 para identificar regiones hidrófilas en la estructura de STEAP-1. Regiones de una proteína STEAP-1 que muestran estructura inmunogénica, además de otras regiones y dominios, pueden identificarse fácilmente usando diversos otros procedimientos conocidos en la técnica, tales como análisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schulz o Jameson-Wolf. Pueden generarse perfiles de hidrofilia usando el procedimiento de Hopp, T.P. y Woods, K.R, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828. Pueden generarse perfiles de hidropaticidad usando el procedimiento de Kyte, J. y Doolittle, R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-132. Pueden generarse perfiles de porcentaje (%) de residuos accesibles usando el procedimiento de Janin J., 1979, Nature 277:491-492. Pueden generarse perfiles de flexibilidad promedio usando el procedimiento de Bhaskaran R., Ponnuswamy P.K, 1988, Int J. Pept. Protein Res. 32:242-265. Pueden generarse perfiles de giro beta usando el procedimiento de Delesge, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294. Así, cada región identificada por cualquiera de estos programas o procedimientos está dentro del alcance de la presente divulgación. Los procedimientos preferidos para una generación de anticuerpos para STEAP-1 se ilustran adicionalmente a modo de los ejemplos proporcionados en el presente documento. Los procedimientos para preparar una proteína o polipéptido para su uso como un inmunógeno son muy conocidos en la técnica. También son muy conocidos en la técnica los procedimientos para preparar conjugados inmunogénicos de una proteína con un transportador, tal como BSA, KLH u otra proteína transportadora. En algunas circunstancias se usa conjugación directa usando, por ejemplo, reactivos de carbodiimida; en otros casos son eficaces reactivos de enlace tales como aquellos suministrados por Pierce Chemical Co., Rockford, IL. La administración de un inmunógeno de STEAP-1 se realiza frecuentemente mediante inyección durante un periodo de tiempo adecuado y con uso de un adyuvante adecuado, como se entiende en la materia. Durante el programa de inmunización pueden tomarse títulos de anticuerpos para determinar la idoneidad de la formación de anticuerpos.
[0157] Los anticuerpos monoclonales para STEAP-1 pueden producirse por diversos medios muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, líneas celulares inmortalizadas que secretan un anticuerpo monoclonal deseado se preparan usando la tecnología de hibridomas convencional de Kohler y Milstein o modificaciones que inmortalizan linfocitos B productores de anticuerpos, como se conoce generalmente. Líneas celulares inmortalizadas que secretan los anticuerpos deseados se criban por inmunoensayo en las que el antígeno es una proteína relacionada con STEAP-1. Cuando se identifica el cultivo de células inmortalizadas apropiadas, las células pueden expandirse y producirse anticuerpos tanto de cultivos in vitro como de líquido ascítico.
[0158] Los anticuerpos o fragmentos de la invención también pueden producirse por medios recombinantes. Regiones que se unen específicamente a las regiones deseadas de una proteína STEAP-1 también pueden producirse en el contexto de anticuerpos quiméricos o injertados con regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de múltiple origen de especies. También pueden producirse anticuerpos para STEAP-1 humanizados o humanos, y se prefieren para su uso en contextos terapéuticos. Los procedimientos para humanizar anticuerpos murinos y otros anticuerpos no humanos, sustituyendo secuencias de anticuerpo humano correspondientes con una o más de las CDR de anticuerpo no humano, son muy conocidos (véanse, por ejemplo, Jones y col., 1986. Nature 321: 522-525; Riechmann y col., 1988, Nature 332:323-327; Verhoeyen y col., 1988, Science 239:1534-1538). Véanse, por tanto, Carter y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 y Sims y col., 1993, J. Immunol. 151: 2298.
[0159] Los procedimientos para producir anticuerpos monoclonales completamente humanos incluyen procedimientos de expresión en fago y transgénicos (para una revisión véase Vaughan y col., 1998, Nature Biotechnology 16: 535-539). Anticuerpos monoclonales para STEAP-1 completamente humanos pueden generarse usando tecnologías de clonación empleando grandes bibliotecas combinatorias de genes de Ig humana (es decir, expresión en fago) (Griffiths y Hoogenboom, Building an in vitro immune system: human antibodies from phage display libraries. En: Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man, Clark, M. (Ed.), Nottingham Academic, pág. 45-64 (1993); Burton y Barbas, Human Antibodies from combinatorial libraries. ídem, pág 65-82). Los anticuerpos monoclonales para STEAP-1 completamente humanos también pueden producirse usando ratones transgénicos manipulados para contener sitios de genes de inmunoglobulina humana como se describen en la solicitud de patente PCT WO98/24893, Kuchertapati y Jakobovits y col., publicado el 3 de diciembre de 1997 (véase, por tanto, Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4): 607.614; patentes de EE.UU.
6.162.903 concedida el 19 de diciembre de 2000; 6.150.584 concedida el 12 de noviembre de 2000; y 6.114.598 concedida el 5 de septiembre de 2000). Este procedimiento evita la manipulación in vitro requerida con tecnología de expresión en fago y produce eficazmente anticuerpos humanos auténticos de alta afinidad.
[0160] La reactividad de los anticuerpos para STEAP-1 con una proteína relacionada con STEAP-1 puede establecerse por varios medios muy conocidos, que incluyen transferencia Western, inmunoprecipitación, ELISA y análisis de FACS usando, según convenga, proteínas relacionadas con STEAP-1, células que expresan STEAP-1 o extractos de las mismas. Un anticuerpo para STEAP-1 o fragmento del mismo puede marcarse con un marcador
detectable o conjugarse con una segunda molécula. Marcadores detectables adecuados incluyen, pero no se limitan a, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, compuesto quimioluminiscente, un quelante metálico o una enzima. Además, anticuerpos biespecíficos específicos para dos o más epítopes de STEAP-1 se generan usando procedimientos generalmente conocidos en la técnica. También pueden generarse anticuerpos homodiméricos por técnicas de reticulación conocidas en la técnica (por ejemplo, Wolff y col., Cancer Res. 53: 2560-2565).
[0161] La invención proporciona anticuerpos monoclonales identificados como X120.545.1.1 de hibridoma de ratón depositados en la Colección Americana de Cultivos Tipo, ubicada en 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110-2209 en 8 de febrero de 2004 y número de acceso de ATCC asignado PTA-5803.
V.) Respuestas inmunitarias celulares de STEAP-1
[0162] Se ha descrito el mecanismo por el que linfocitos T reconocen antígenos. Composiciones de vacuna de epítopes de péptido eficaces inducen respuestas inmunitarias terapéuticas o profilácticas en segmentos muy amplios de la población mundial. Para un entendimiento del valor y eficacia de las composiciones que inducen respuestas inmunitarias celulares se proporciona una breve revisión de la tecnología relacionada con la inmunología.
[0163] Un complejo de una molécula HLA y un antígeno peptídico actúa de ligando reconocido por linfocitos T limitados a HLA (Buus, S. y col., Cell 47:1071, 1986, Babbitt, B. P. y col., Nature 317:359, 1985; Townsend, A. y Bodmer, H., Annu. Rev. Immunol. 7:601, 1989; Germain, R. N., Annu. Rev. Immunol. 11:403, 1993). A lo largo del estudio de análogos de antígeno sustituidos con un único aminoácido y la secuenciación de péptidos naturalmente procesados endógenamente unidos se han identificado residuos críticos que se corresponden con motivos requeridos para la unión específica de moléculas de antígeno HLA y se exponen en la Tabla IV (véase, por tanto, por ejemplo, Southwood y col., J. Immunol. 160:3383, 1998; Rammensee y col., Immunogenetics 41:178,1995; Rammensee y col., SYFPEITHI, acceso mediante la malla mundial en URL (134.296.221/scripts.hlaserver.dll/home.htm); Sette, A. y Sidney, J. Curr. Opin. Immunol. 10:478, 1998; Engelhard, V. H., Curr. Opin. Immunol. 6:13, 1994; Sette, A. y Grey, H. M., Curr. Opin. Immunol. 4:79, 1992: Sinigaglia, F, y Hammer, J. Curr. Biol. 6:52, 1994; Ruppert y col., Cell 74:929-937, 1993; Kondo y col., J. Immunol. 155:4307-4312, 1995; Sidney y col., J. Immunol, 157:3480-3490, 1996; Sidney y col., Human Immunol. 45:79-93, 1996; Sette, A. y Sidney, J. Immunogenetics 1999 Nov; 50(3-4):201-12, revisión).
[0164] Además, los análisis cristalográficos de rayos X de complejos de HLA-péptido han revelado bolsillos dentro de la hendidura/ranura de unión a péptido de moléculas HLA que acomodan, en un modo específico de alelo, residuos transmitidos por ligandos de péptido; estos residuos determinan a su vez la capacidad de unión a HLA de los péptidos en los que están presentes (véase, por ejemplo, Madden, D.R. Annu. Rev. Immunol, 13:587, 1996; Smith y col., Immunity 4:203, 1996; Fremont y col., Immunity 8:305, 1998; Stem y col., Structure 2:245, 1994; Jones, EY. Curr. Opin. Immunol. 9:75,1997; Brown, J. H. y col., Nature 364:33, 1993; Guo, H. C. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8053, 1993; Guo, H. C. y col., Nature 360:364, 1992; Silver, M. L y col., Nature 360:367, 1992; Matsumura, M. y col., Science 257:927, 1992; Madden y col., Cell 70:1035, 1992; Fremont, D. H. y col., Science 257:919, 1992; Saper, M. A., Bjorkman, P. J. y Wiley, D. C., J. Mol. Biol. 219:277, 1991.)
[0165] Por consiguiente, la definición de motivos de unión a HLA específicos de alelo de clase I y clase II, o supermotivos de clase I y clase II, permite la identificación de regiones dentro de una proteína que están correlacionadas con la unión a antígeno(s) HLA particular(es).
[0166] Así, mediante un procedimiento de identificación de motivos de HLA se han identificado candidatos para vacunas basadas en epítope; tales candidatos pueden evaluarse adicionalmente por ensayos de unión a HLApéptido para determinar la afinidad de unión y/o el periodo de tiempo de asociación del epítope y su molécula HLA correspondiente. Puede realizarse trabajo confirmatorio adicional para seleccionar, entre estos candidatos a vacuna, epítopes con características preferidas en términos de cubrición de la población, y/o inmunogenicidad.
[0167] Pueden utilizarse diversas estrategias para evaluar la inmunogenicidad celular, que incluyen:
1) Evaluación de cultivos de linfocitos T primarios de individuos normales (véase, por ejemplo, Wentworth, P. A y col., Mol. Immunol. 32:603, 1995; Celis, E. y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 91:2105, 1994; Tsai, V. y col., J. Immunol. 158:1798, 1997; Kawashima, I. y col., Human Immunol. 59:1, 1998). Este procedimiento implica la estimulación de linfocitos de sangre periférica (PBL) de sujetos normales con un péptido de prueba en presencia de células presentadoras de antígeno in vitro durante un periodo de varias semanas. Los linfocitos T específicos para los péptidos se activan durante este tiempo y se detectan usando, por ejemplo, una linfocina o ensayo de liberación de 51Cr que implica células diana sensibilizadas a péptidos.
2) Inmunización de ratones transgénicos para HLA (véase, por ejemplo, Wentworth, P. A y col., J. Immunol. 26:97,1996; Wentworth, P. A y col., Int. Immunol. 8:651,1996; Alexander, J. y col., J. Immunol. 159:4753, 1997). Por ejemplo, en tales procedimientos, péptidos en adyuvante incompleto de Freund se administran subcutáneamente a ratones transgénicos para HLA. Varias semanas tras la inmunización, los esplenocitos se extraen y se cultivan in
vitro en presencia de péptido de prueba durante aproximadamente una semana. Los linfocitos T específicos de péptido se detectan usando, por ejemplo, un ensayo de liberación de 51Cr que implica células diana sensibilizadas a péptidos y células diana que expresan antígeno endógenamente generado.
3) Demostración de respuestas de linfocitos T de memoria de individuos inmunes que han sido tanto eficazmente vacunados como de pacientes crónicamente enfermos (véase, por ejemplo, Rehermann, B. y col., J. Exp. Med. 181:1047, 1995; Doolan, D. L y col., Immunity 7:97, 1997; Bertoni, R. y col., J. Clin. Invest. 100:503,1997; Threlkeld,
S. C. y col., J. Immunol. 159; 1648, 1997; Diepolder, H. M. y col., J. Virol. 71:6011,1997). Por consiguiente, las respuestas de memoria se detectan cultivando PBL de sujetos que se han expuesto al antígeno debido a
enfermedad y así han generado una respuesta inmunitaria “naturalmente”, o de pacientes que se vacunaron contra
el antígeno. PBL de sujetos se cultivan in vitro durante 1-2 semanas en presencia de péptido de prueba más células presentadoras de antígeno (APC) para permitir la activación de linfocitos T de “memoria”, con respecto a linfocitos T “sin tratamiento previo”. Al final del periodo de cultivo, la actividad de linfocitos T se detecta usando ensayos que
incluyen liberación de 51Cr que implica dianas sensibilizadas a péptidos, proliferación de linfocitos T o liberación de linfocinas.
VI.) Animales transgénicos para STEAP-1
[0168] Los ácidos nucleicos que codifican una proteína relacionada con STEAP-1 también pueden usarse para generar tanto animales transgénicos como animales “de genes inactivados” que, a su vez, son útiles en el desarrollo y cribado de reactivos terapéuticamente útiles. Según técnicas establecidas, el ADNc que codifica STEAP1 puede usarse para clonar ADN genómico que codifica STEAP-1. Las secuencias genómicas clonadas pueden entonces usarse para generar animales transgénicos que contienen células que expresan ADN que codifican STEAP-1. Procedimientos para generar animales transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas, se han vuelto convencionales en la materia y se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. nº 4.736.866 concedida el 12 de abril de 1988, y 4.870.009 concedida el 26 de septiembre de 1989. Normalmente, células particulares no serían elegidas como diana para la incorporación del transgén de STEAP-1 con potenciadores específicos de tejido. [0169] Animales transgénicos que incluyen una copia de un transgén que codifica STEAP-1 pueden usarse para examinar el efecto de elevada expresión de ADN que codifica STEAP-1. Tales animales pueden usarse como animales de ensayo para reactivos que se cree confieren protección de, por ejemplo, afecciones patológicas asociadas a su expresión en exceso. Un animal puede tratarse con un reactivo y una incidencia reducida de una afección patológica, en comparación con animales sin tratar que llevan el transgén, indicaría una posible intervención terapéutica para la afección patológica.
[0170] Alternativamente, homólogos no humanos de STEAP-1 pueden usarse para construir un animal de gen STEAP-1 “inactivado” que tiene un gen defectuoso o alterado que codifica STEAP-1 como resultado de recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica STEAP-1 y ADN genómico alterado que codifica STEAP-1 introducido en una célula embrionaria del animal. Por ejemplo, el ADNc que codifica STEAP-1 puede usarse para clonar ADN genómico que codifica STEAP-1 según técnicas establecidas. Una porción del ADN genómico que codifica STEAP-1 puede delecionarse o sustituirse con otro gen, tal como un gen que codifica un marcador de selección que puede usarse para monitorizar la integración. Normalmente, varios kilobases de ADN flanqueante sin alterar (tanto en los extremo 5' como 3') están incluidos en el vector (véase, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homólogos). El vector se introduce en una línea de célula madre embrionaria (por ejemplo, por electroporación) y se seleccionan células en las que el ADN introducido se ha recombinado homólogamente con el ADN (véase, por ejemplo, U y col., Cell.
69:915 (1992)). Entonces, las células seleccionadas se inyectan en un blastocisto de un animal (por ejemplo, un ratón o rata) para formar quimeras de agregación (véase, por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford. 1987), pág. 113-152). Un embrión quimérico puede entonces implantarse en un animal de cría hembra pseudopreñado adecuado, y el embrión llevarse a término
para crear un animal “de gen inactivado”. La progenie que aloja el ADN homólogamente recombinado en sus células
germinativas puede identificarse por técnicas convencionales y usarse para criar animales en los que todas las células del animal contienen el ADN homólogamente recombinado. Los animales de genes inactivados pueden caracterizarse, por ejemplo, por su capacidad para defenderse contra ciertas afecciones patológicas o por su desarrollo de afecciones patológicas debido a la ausencia de un polipéptido STEAP-1.
VII.) Procedimientos para la detección de STEAP-1
[0171] La presente divulgación también se refiere a procedimientos para detectar polinucleótidos STEAP-1 y proteínas relacionadas con STEAP-1, además de a procedimientos para identificar una célula que expresa STEAP
1. El perfil de expresión de STEAP-1 hace que sea un marcador de diagnóstico para enfermedad metastatizada. Por consiguiente, el estado de productos del gen STEAP-1 proporciona información útil para predecir una variedad de factores que incluyen la susceptibilidad a enfermedad en estado avanzado, tasa de progresión y/o agresividad del tumor. Como se trata en detalle en el presente documento, el estado de productos del gen STEAP-1 en muestras de paciente puede analizarse por una variedad de protocolos que son muy conocidos en la técnica que incluyen análisis inmunohistoquímicos, la variedad de técnicas de transferencia Northern que incluyen hibridación in situ, análisis por RT-PCR (por ejemplo, en muestras micro-diseccionadas de captura láser), análisis de transferencia Western y análisis de matrices de tejido.
[0172] Más particularmente, la divulgación proporciona ensayos para la detección de polinucleótidos STEAP1 en una muestra biológica, tal como suero, hueso, próstata, y otros tejidos, orina, semen, preparaciones de células, y similares. Polinucleótidos STEAP-1 detectables incluyen, por ejemplo, un gen STEAP-1 o fragmento del mismo, ARNm de STEAP-1, ARNm de STEAP-1 de variantes de corte y empalme alternativas y moléculas de ADN recombinante o ARN que contienen un polinucleótido STEAP-1. Varios procedimientos para amplificar y/o detectar la presencia de polinucleótidos STEAP-1 son muy conocidos en la técnica y pueden emplearse.
[0173] Procedimientos para detectar un ARNm de STEAP-1 en una muestra biológica pueden comprender producir ADNc de la muestra por transcripción inversa usando al menos un cebador, amplificar el ADNc así producido usando un polinucleótido STEAP-1 como cebadores de sentido directo y de sentido contrario para amplificar ADNc de STEAP-1 en su interior; y detectar la presencia del ADNc de STEAP-1 amplificado. Opcionalmente, la secuencia del ADNc de STEAP-1 amplificado puede determinarse.
[0174] Procedimientos de detección de un gen STEAP-1 en una muestra biológica pueden comprender primero aislar ADN genómico de la muestra; amplificar el ADN genómico aislado usando polinucleótidos STEAP-1 como cebadores de sentido directo y de sentido contrario; y detectar la presencia del gen STEAP-1 amplificado. Cualquier número de combinaciones de sonda sentido y antisentido apropiadas puede diseñarse a partir de una secuencia de nucleótidos de STEAP-1 (véase, por ejemplo, la Figura 2) y usarse para este fin.
[0175] La invención proporciona ensayos para detectar la presencia de una proteína STEAP-1 en un tejido u otra muestra biológica tal como suero, semen, hueso, próstata, orina, preparaciones de células y similares. Los procedimientos para detectar una proteína relacionada con STEAP-1 también son muy conocidos e incluyen, por ejemplo, inmunoprecipitación, análisis inmunohistoquímicos, análisis de transferencia Western, ensayos de unión molecular, ELISA, ELIFA y similares. Por ejemplo, un procedimiento de detectar la presencia de una proteína relacionada con STEAP-1 en una muestra biológica comprende primero poner en contacto la muestra con un anticuerpo para STEAP-1, un fragmento reactivo con STEAP-1 del mismo, o una proteína recombinante que contiene una región de unión a antígeno de un anticuerpo para STEAP-1 de la invención; y luego detectar la unión de la proteína relacionada con STEAP-1 en la muestra.
[0176] Los procedimientos para identificar una célula que expresa STEAP-1 también están dentro del alcance de la divulgación. Un ensayo para identificar una célula que expresa un gen STEAP-1 puede comprender detectar la presencia de ARNm de STEAP-1 en la célula. Los procedimientos para la detección de ARNm particulares en células son muy conocidos e incluyen, por ejemplo, ensayos de hibridación usando sondas de ADN complementarias (tal como hibridación in situ usando ribosondas de STEAP-1 marcadas, transferencia Northern y técnicas relacionadas) y diversos ensayos de amplificación de ácidos nucleicos (tales como RT-PCR usando cebadores complementarios específicos para STEAP-1, y otros procedimientos de detección de tipo amplificación tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares). Alternativamente, un ensayo para identificar una célula que expresa un gen STEAP-1 puede comprender detectar la presencia de proteína relacionada con STEAP-1 en la célula o secretada por la célula. Diversos procedimientos para la detección de proteínas son muy conocidos en la técnica y se emplean para la detección de proteínas relacionadas con STEAP-1 y células que expresan proteínas relacionadas con STEAP-1.
[0177] El análisis de expresión de STEAP-1 también es útil como herramienta para identificar y evaluar agentes que modulan la expresión génica de STEAP-1. Por ejemplo, la expresión de STEAP-1 está significativamente regulada por incremento en cáncer de próstata, y se expresa en cánceres de los tejidos enumerados en la Tabla I. La identificación de una molécula o agente biológico que inhibe la expresión o expresión en exceso de STEAP-1 en células cancerosas es de valor terapéutico. Por ejemplo, un agente tal puede identificarse usando un cribado que cuantifica la expresión de STEAP-1 por RT-PCR, hibridación de ácidos nucleicos o unión a anticuerpos.
VIII.) Procedimientos para monitorizar el estado de genes relacionados con STEAP-1 y sus productos
[0178] Se sabe que la oncogénesis es un proceso de múltiples etapas en el que el crecimiento celular se desregula progresivamente y las células progresan de un estado fisiológico normal a precanceroso y luego a estados cancerosos (véanse, por ejemplo, Alers y col., Lab Invest. 77(5): 437-438 (1997) e Isaacs y col., Cancer Surv. 23: 19-32 (1995)). En este contexto, el examen de una muestra biológica para pruebas de crecimiento celular desregulado (tal como la expresión anómala de STEAP-1 en cánceres) permite la detección temprana de tal fisiología anómala antes de que un estado patológico tal como cáncer haya progresado a un estado en el que las opciones terapéuticas están más limitadas y/o el pronóstico es peor. En tales exámenes, el estado de STEAP-1 en una muestra biológica de interés puede compararse, por ejemplo, con el estado de STEAP-1 en una muestra normal correspondiente (por ejemplo, una muestra de ese individuo o alternativamente otro individual que no está afectado por una patología). Una alteración en el estado de STEAP-1 en la muestra biológica (con respecto a la muestra normal) proporciona pruebas de crecimiento celular desregulado. Además de usar una muestra biológica que no está afectada por una patología como muestra normal también puede usarse un valor normativo predeterminado tal como un nivel normal predeterminado de expresión de ARNm (véanse, por ejemplo, Grever y col., J. Comp. Neurol, 1996 Dec 9; 378(2): 306-14 y la patente de EE.UU. nº 5.837.501) para comparar el estado de STEAP-1 en una muestra.
[0179] El término “estado” en este contexto se usa según su significado aceptado en la materia y se refiere a la condición o estado de un gen y sus productos. Normalmente, los expertos habituales usan varios parámetros para evaluar la condición o estado de un gen y sus productos. Estos incluyen, pero no se limitan a, la localización de productos génicos expresados (incluyendo la localización de células que expresan STEAP-1), además del nivel, y actividad biológica de productos génicos expresados (tales como ARNm, polinucleótidos y polipéptidos STEAP-1). Normalmente, una alteración en el estado de STEAP-1 comprende un cambio en la localización de STEAP-1 y/o células que expresan STEAP-1 y/o un aumento en ARNm de STEAP-1 y/o expresión de proteínas.
[0180] El estado de STEAP-1 en una muestra puede analizarse por varios medios muy conocidos en la técnica que incluyen, sin limitación, análisis inmunohistoquímico, hibridación in situ, análisis por RT-PCR en muestras micro-diseccionadas de captura láser, análisis de transferencia Western y análisis de matrices de tejido. Protocolos típicos para evaluar el estado de un gen STEAP-1 y productos génicos se encuentran, por ejemplo en Ausubel y col., eds.,1995, Current Protocols In Molecular Biology, Unidades 2 (transferencia Northern), 4 (transferencia Southern), 15 (inmunotransferencia) y 18 (análisis por PCR). Por tanto, el estado de STEAP-1 en una muestra biológica se evalúa por diversos procedimientos utilizados por expertos en la materia que incluyen, pero no se limitan a, análisis Southern genómico (para examinar, por ejemplo, perturbaciones en un gen STEAP-1), análisis Northern y/o análisis por PCR de ARNm de STEAP-1 (para examinar, por ejemplo, alteraciones en las secuencias de polinucleótidos o niveles de expresión de ARNm de STEAP-1) y análisis Western y/o inmunohistoquímicos (para examinar, por ejemplo, alteraciones en secuencias de polipéptidos, alteraciones en la localización de polipéptidos dentro de una muestra, alteraciones en los niveles de expresión de proteínas STEAP-1 y/o asociaciones de proteínas STEAP-1 con componentes de unión a polipéptido). Polinucleótidos STEAP-1 detectables incluyen, por ejemplo, un gen STEAP-1 o fragmento del mismo, ARNm de STEAP-1, variantes de corte y empalme alternativas, ARNm de STEAP-1 y ADN recombinante o moléculas de ARN que contienen un polinucleótido STEAP-1.
[0181] El perfil de expresión de STEAP-1 hace que sea un marcador de diagnóstico para enfermedad local y/o metastatizada, y proporciona información sobre el crecimiento o potencial oncogénico de una muestra biológica. En particular, el estado de STEAP-1 proporciona información útil para predecir la susceptibilidad a estados de enfermedad particulares, progresión y/o agresividad del tumor. La divulgación proporciona procedimientos y ensayos para determinar el estado de STEAP-1 y diagnosticar cánceres que expresan STEAP-1, tal como cánceres de los tejidos enumerados en la Tabla I. Por ejemplo, debido a que el ARNm de STEAP-1 se expresa tan altamente en cánceres próstata y otros cánceres con respecto a tejido de próstata normal, ensayos que evalúan los niveles de transcritos de ARNm de STEAP-1 o proteínas en una muestra biológica pueden usarse para diagnosticar una enfermedad asociada a desregulación de STEAP-1, y puede proporcionar información de pronóstico útil en definir opciones terapéuticas apropiadas.
[0182] El estado de expresión de STEAP-1 proporciona información que incluye la presencia, estado y localización de células displásicas, precancerosas y cancerosas, prediciendo la susceptibilidad a diversos estados de enfermedad, y/o para calcular la agresividad del tumor. Además, el perfil de expresión hace que sea útil como reactivo de obtención de imágenes para enfermedad metastatizada. Por consiguiente, la divulgación proporciona diversos procedimientos de pronóstico y de diagnóstico molecular para examinar el estado de STEAP-1 en muestras biológicas tales como aquellas de individuos que padecen, o de los que se sospecha que padecen, una patología caracterizada por crecimiento celular desregulado, tal como cáncer.
[0183] Como se ha descrito anteriormente, el estado de STEAP-1 en una muestra biológica puede examinarse por varios procedimientos muy conocidos en la materia. Por ejemplo, el estado de STEAP-1 en una muestra biológica tomada de una localización específica en el cuerpo puede examinarse evaluando la muestra para la presencia o ausencia de células que expresan STEAP-1 (por ejemplo, aquellas que expresan ARNm o proteínas STEAP-1). Este examen puede proporcionar pruebas de crecimiento celular desregulado, por ejemplo, cuando las células que expresan STEAP-1 se encuentran en una muestra biológica que normalmente no contiene tales células (tal como un ganglio linfático), debido a que tales alteraciones en el estado de STEAP-1 en una muestra biológica están frecuentemente asociadas a crecimiento celular desregulado. Específicamente, un indicador de celular desregulado es las metástasis de células cancerosas de un órgano de origen (tal como la próstata) a un área diferente del cuerpo (tal como un ganglio linfático). En este contexto, las pruebas de crecimiento celular desregulado son importantes, por ejemplo, debido a que metástasis de ganglio linfático ocultas pueden detectarse en una proporción sustancial de pacientes con cáncer de próstata, y tales metástasis están asociadas a factores pronósticos conocidos de progresión de enfermedad (véanse, por ejemplo, Murphy y col., Prostate 42(4): 315-317 (2000); Su y col., Semin. Surg. Oncol. 18(1): 17-28 (2000) y Freeman y col., J Urol 1995 Aug 154(2 Pt 1):474-8).
[0184] La invención proporciona procedimientos para monitorizar productos del gen STEAP-1 determinando el estado de productos del gen STEAP-1 expresados por células de un individuo del que se sospecha que tiene una enfermedad asociada a crecimiento celular desregulado (tal como hiperplasia o cáncer) y luego comparando el estado así determinado con el estado de productos del gen STEAP-1 en una muestra normal correspondiente. La presencia de productos del gen STEAP-1 anómalos en la muestra de prueba con respecto a la muestra normal proporciona una indicación de la presencia de crecimiento celular desregulado dentro de las células del individuo.
[0185] También se proporcionan ensayos útiles en determinar la presencia de cáncer en un individuo que comprende detectar un aumento significativo en la expresión de ARNm o de proteínas STEAP-1 en una célula de prueba o muestra de tejido con respecto a los niveles de expresión en la célula o tejido normal correspondiente. La presencia de ARNm de STEAP-1 puede evaluarse, por ejemplo, en tejidos que incluyen, pero no se limitan a, aquellos enumerados en la Tabla I. La presencia de expresión de STEAP-1 significativa en cualquiera de estos tejidos es útil para indicar la aparición, presencia y/o gravedad de un cáncer, ya que los tejidos normales correspondientes no expresan ARNm de STEAP-1 o lo expresan a niveles menores.
[0186] El estado de STEAP-1 puede determinarse al nivel de proteínas en vez de al nivel de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un procedimiento tal comprende determinar el nivel de proteína STEAP-1 expresada por células en una muestra de tejido de prueba y comparar el nivel así determinado con el nivel de STEAP-1 expresado en una muestra normal correspondiente. La presencia de proteína STEAP-1 puede evaluarse, por ejemplo, usando procedimientos inmunohistoquímicos. Los anticuerpos para STEAP-1 o componentes de unión que pueden detectar la expresión de proteínas STEAP-1 se usan en una variedad de formatos de ensayo muy conocidos en la técnica para este fin.
[0187] Puede evaluarse el estado de secuencias de nucleótidos y aminoácidos de STEAP-1 en una muestra biológica con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas. Estas perturbaciones pueden incluir inserciones, deleciones, sustituciones y similares. Tales evaluaciones son útiles debido a que perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos se observan en un gran número de proteínas asociadas a un fenotipo desregulado de crecimiento (véase, por ejemplo, Marrogi y col., 1999, J. Cutan. Pathol. 26(8):369-378). Por ejemplo, una mutación en la secuencia de STEAP-1 puede ser indicativa de la presencia o promoción de un tumor. Por tanto, tales ensayos tienen valor de diagnóstico y predictivo cuando una mutación en STEAP-1 indica una posible pérdida de función o aumento en el crecimiento tumoral.
[0188] Una amplia variedad de ensayos para observar perturbaciones en secuencias de nucleótidos y de aminoácidos son muy conocidos en la técnica Por ejemplo, el tamaño y estructura de secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos de productos del gen STEAP-1 se observan por protocolos de Northern, Southern, Western, PCR y secuenciación de ADN tratados en el presente documento. Además, otros procedimientos para observar perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos tales como análisis de polimorfismos de conformación monocatenaria son muy conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº
5.382.510 concedida el 7 de septiembre de 1999 y 5.952.170 concedida el 17 de enero de 1995).
[0189] Adicionalmente puede examinarse el estado de metilación de un gen STEAP-1 en una muestra biológica. La desmetilación y/o hipermetilación anómala de islotes de CpG en las regiones reguladoras de 5' del gen se produce frecuentemente en células inmortalizadas y transformadas, y puede producir expresión alterada de diversos genes. Por ejemplo, la hipermetilación del promotor de la glutatión S-transferasa de clase pi (una proteína expresada en próstata normal pero no expresada en >90 % de carcinomas de próstata) parece silenciar permanentemente la transcripción de este gen y es la alteración genómica más frecuentemente detectada en carcinoma de próstata (De Marzo y col., Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999)). Además, esta alteración está presente en al menos el 70 % de los casos de neoplasia intraepitelial prostática de alto grado (PIN) (Brooks y col., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7:531-538). En otro ejemplo, la expresión del gen específico para el tumor LAGE-I (que no se expresa en próstata normal pero que se expresa en el 26-50 % de los cánceres de próstata) se induce por desoxi-azacitidina en células linfoblastoides, sugiriendo que la expresión tumoral es debida a desmetilación (Lethe y col., Int. J. Cancer 76(6): 903-908 (1998)). Una variedad de ensayos para examinar el estado de metilación de un gen son muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden utilizarse en estrategias de hibridación Southern, enzimas de restricción sensibles a la metilación que no pueden escindir secuencias que contienen sitios CpG metilados para evaluar el estado de metilación de islotes de CpG. Además, la MSP (PCR específica para metilación) puede perfilar rápidamente el estado de metilación de todos los sitios CpG presentes en un islote de CpG de un gen dado. Este procedimiento implica modificación inicial de ADN por bisulfito de sodio (que convertirá todas las citosinas sin metilar en uracilo), seguido de amplificación usando cebadores específicos para ADN metilado frente a no metilado. Los protocolos que implican interferencia de la metilación también pueden encontrarse, por ejemplo, en Current Protocols In Molecular Biology, Unidad 12, Frederick M. Ausubel y col., eds., 1995.
[0190] La amplificación génica es un procedimiento adicional para evaluar el estado de STEAP-1. La amplificación génica se mide en una muestra directamente, por ejemplo, por transferencia Southern o transferencia Northern convencional para cuantificar la transcripción de ARNm (Thomas, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205), transferencia puntual (análisis de ADN) o hibridación in situ, usando una sonda apropiadamente marcada, basándose en las secuencias proporcionadas en el presente documento. Alternativamente se emplean anticuerpos que reconocen dúplex específicos que incluyen dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína. Los anticuerpos se marcan a su vez y el ensayo se lleva a cabo cuando el dúplex está unido a una superficie, de manera que tras la formación del dúplex sobre la superficie puede detectarse la presencia de anticuerpo unido al dúplex.
[0191] Puede ensayarse convenientemente tejido de biopsia o sangre periférica para la presencia de células cancerosas usando por ejemplo, transferencia Northern, puntual o análisis por RT-PCR para detectar la expresión de STEAP-1. La presencia de ARNm de STEAP-1 amplificable por RT-PCR proporciona una indicación de la presencia de cáncer. Los ensayos de RT-PCR son muy conocidos en la técnica. Los ensayos de detección por RT-PCR para células tumorales en sangre periférica están siendo actualmente evaluados para su uso en el diagnóstico y la atención de varios tumores sólidos humanos. En el campo del cáncer de próstata, éstos incluyen ensayos de RT-PCR para la detección de células que expresan PSA y PSM (Verkaik y col., 1997, Urol. Res. 25:373-384; Ghossein y col., 1995, J. Clin. Oncol. 13:1195-2000; Heston y col., 1995, Clin. Chem. 41:1687-1688).
[0192] También se proporciona una evaluación de la susceptibilidad que tiene un individuo para desarrollar cáncer. Un procedimiento para predecir la susceptibilidad a cáncer puede comprender detectar ARNm de STEAP-1
o proteína STEAP-1 en una muestra de tejido, indicando su presencia la susceptibilidad a cáncer, en el que el grado de expresión de ARNm de STEAP-1 establece una correlación con el grado de susceptibilidad. Puede examinarse la presencia de STEAP-1 en próstata u otro tejido, proporcionando la presencia de STEAP-1 en la muestra una indicación de susceptibilidad a cáncer de próstata (o la aparición o existencia de un tumor de próstata). Similarmente, puede evaluarse la integridad de secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de STEAP-1 en una muestra biológica con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas tales como inserciones, deleciones, sustituciones y similares. La presencia de una o más perturbaciones en productos del gen STEAP-1 en la muestra es una indicación de susceptibilidad a cáncer (o la aparición o existencia de un tumor).
[0193] La divulgación también comprende procedimientos para calcular la agresividad del tumor. Un procedimiento para calcular la agresividad de un tumor puede comprender determinar el nivel de ARNm de STEAP-1
o proteína STEAP-1 expresada por células tumorales, comparando así el nivel determinado con el nivel de ARNm de STEAP-1 o proteína STEAP-1 expresada en un tejido normal correspondiente tomado del mismo individuo o una muestra de referencia de tejido normal, en el que el grado de ARNm de STEAP-1 o expresión de proteínas STEAP-1 en la muestra tumoral con respecto a la muestra normal indica el grado de agresividad. La agresividad de un tumor puede evaluarse determinando el grado al que STEAP-1 se expresa en las células tumorales, indicando mayores niveles de expresión tumores más agresivos. También se proporciona la evaluación de la integridad de secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de STEAP-1 es en una muestra biológica con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas tales como inserciones, deleciones, sustituciones y similares. La presencia de una o más perturbaciones indica tumores más agresivos.
[0194] La divulgación también se refiere a procedimientos para observar la progresión de un tumor maligno en un individuo con el tiempo. Los procedimientos para observar la progresión de un tumor maligno en un individuo con el tiempo pueden comprender determinar el nivel de ARNm de STEAP-1 o proteína STEAP-1 expresada por células en una muestra del tumor, comparar el nivel así determinado con el nivel de ARNm de STEAP-1 o proteína STEAP-1 expresada en un muestra de tejido equivalente tomada del mismo individuo en un momento diferente, en el que el grado de ARNm de STEAP-1 o la expresión de STEAP-1 de proteínas en la muestra tumoral con el tiempo proporciona información sobre la progresión del cáncer. La progresión de un cáncer puede evaluarse determinando la expresión de STEAP-1 en las células tumorales con el tiempo, en la que un aumento de la expresión con el tiempo indica una progresión del cáncer. Por tanto, puede evaluarse la integridad de secuencias de nucleótidos y de aminoácidos STEAP-1 en una muestra biológica con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas tales como inserciones, deleciones, sustituciones y similares, en la que la presencia de una o más perturbaciones indica una progresión del cáncer.
[0195] Las anteriores estrategias de diagnóstico pueden combinarse con una cualquiera de una amplia variedad de protocolos de pronóstico y de diagnóstico conocidos en la técnica. Por ejemplo, la divulgación también se refiere a procedimientos para observar una coincidencia entre la expresión del gen STEAP-1 y productos del gen STEAP-1 (o perturbaciones en el gen STEAP-1 y productos del gen STEAP-1) y un factor que está asociado a tumor maligno, como un medio para diagnosticar y pronosticar el estado de una muestra de tejido. Puede utilizarse una amplia variedad de factores asociados a tumor maligno, tal como la expresión de genes asociados a tumor maligno (por ejemplo, la expresión de PSA, PSCA y PSM para cáncer de próstata, etc.), además de observaciones citológicas macroscópicas (véanse, por ejemplo, Bocking y col., 1984, Anal. Quant. Cytol. 6(2):74-88; Epstein, 1995, Hum. Pathol. 28(2):223-9; Thorson y col., 1998, Mod. Pathol. 11 (6):543-51; Baisden y col., 1999, Am. J. Surg. Pathol. 23(8):918-24). Los procedimientos para observar una coincidencia entre la expresión del gen STEAP-1 y productos del gen STEAP-1 (o perturbaciones en el gen STEAP-1 y productos del gen STEAP-1) y otro factor que está asociado a tumor maligno son útiles, por ejemplo, debido a que la presencia de un conjunto de factores específicos que coinciden con enfermedad proporciona información crucial para diagnosticar y pronosticar el estado de una muestra de tejido.
[0196] Procedimientos para observar una coincidencia entre la expresión del gen STEAP-1 y productos del gen STEAP-1 (o perturbaciones en el gen STEAP-1 y productos del gen STEAP-1) y otro factor asociado a tumor maligno pueden implicar detectar la expresión en exceso de ARNm de STEAP-1 o proteína en una muestra de tejido, detectar la expresión en exceso de ARNm o proteína de PSA en una muestra de tejido (o expresión de PSCA
o PSM), y observar una coincidencia del ARNm de STEAP-1 o proteína y ARNm de PSA o expresión en exceso de proteína (o expresión de PSCA o PSM). Puede examinarse la expresión de STEAP-1 y ARNm de PSA en tejido de próstata, en la que la coincidencia de la expresión en exceso de STEAP-1 y de ARNm de PSA en la muestra indica la existencia de cáncer de próstata, susceptibilidad a cáncer de próstata o la aparición o estado de un tumor de próstata.
[0197] Los procedimientos para detectar y cuantificar la expresión de ARNm de STEAP-1 o proteína se describen en el presente documento, y tecnologías de detección y cuantificación de ácidos nucleicos y proteínas convencionales son muy conocidas en la técnica. Los procedimientos convencionales para la detección y cuantificación de ARNm de STEAP-1 incluyen hibridación in situ usando ribosondas de STEAP-1 marcadas, transferencia Northern y técnicas relacionadas usando sondas de polinucleótidos STEAP-1, análisis por RT-PCR usando cebadores específicos para STEAP-1, y otros procedimientos de detección de tipo amplificación tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares. Puede usarse RT-PCR semi-cuantitativa para detectar y cuantificar la expresión de ARNm de STEAP-1. Para este fin puede usarse cualquier número de cebadores que pueda amplificar STEAP-1, que incluye, pero no se limita a, los diversos conjuntos de cebadores específicamente descritos en el presente documento. Anticuerpos policlonales o monoclonales específicamente reactivos con la proteína STEAP-1 natural pueden usarse en un ensayo inmunohistoquímico de tejido de biopsia.
IX.) Identificación de moléculas que interaccionan con STEAP-1
[0198] Las secuencias de proteínas y ácidos nucleicos de STEAP-1 dispuestas en el presente documento permiten que un experto identifique proteínas, moléculas pequeñas y otros agentes que interaccionan con STEAP-1, además de rutas activadas por STEAP-1, mediante una cualquiera de una variedad de protocolos aceptados en la materia. Por ejemplo, puede utilizarse uno de los llamados sistemas de trampa de interacciones (también
denominado el “ensayo de dos híbridos”). En tales sistemas, las moléculas interaccionan y reconstituyen un factor de
transcripción que dirige la expresión de un gen indicador, tras lo cual se ensaya la expresión del gen indicador. Otros sistemas identifican interacciones proteína-proteína in vivo mediante la reconstitución de un activador transcripcional eucariota, véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 5.955.280 concedida el 21 de septiembre de 1999, 5.925.523 concedida el 20 de julio de 1999, 5.846.722 concedida el 8 de diciembre de 1998 y 6.004.746 concedida 21 de diciembre de 1999. También están disponibles en la materia algoritmos para predicciones basadas en el genoma de la función de proteínas (véase, por ejemplo, Marcotte y col., Nature 402: 4, noviembre de 1999, 8386).
[0199] Alternativamente pueden cribarse bibliotecas de péptidos para identificar moléculas que interaccionan con secuencias de proteínas STEAP-1. En tales procedimientos, péptidos que se unen a STEAP-1 se identifican cribando bibliotecas que codifican una colección al azar o controlada de aminoácidos. Péptidos codificados por las bibliotecas se expresan como proteínas de fusión de proteínas de la envuelta del bacteriófago, luego las partículas del bacteriófago se criban contra la(s) proteína(s) STEAP-1.
[0200] Por consiguiente, péptidos que tienen una amplia variedad de usos, tales como reactivos terapéuticos, de pronóstico o diagnóstico, se identifican así sin ninguna información previa sobre la estructura del ligando esperado o molécula receptora. Bibliotecas de péptidos y procedimientos de cribado típicos que pueden usarse para identificar moléculas que interaccionan con las secuencias de proteínas STEAP-1 se desvelan, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. nº 5.723.286 concedida el 3 de marzo de 1998 y 5.733.731 concedida el 31 de marzo de 1998.
[0201] Alternativamente, líneas celulares que expresan STEAP-1 se usan para identificar interacciones proteína-proteína mediadas por STEAP-1. Tales interacciones pueden examinarse usando técnicas de inmunoprecipitación (véase, por ejemplo, Hamilton B.J. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999, 261:646-51). La proteína STEAP-1 puede inmunoprecipitarse de líneas celulares que expresan STEAP-1 usando anticuerpos anti-STEAP-1. Alternativamente, anticuerpos contra la marca His pueden usarse en una línea celular manipulada para expresar fusiones de STEAP-1 y una marca His (vectores mencionados anteriormente). El complejo inmunoprecipitado puede examinarse para la asociación de proteínas mediante procedimientos tales como transferencia Western, marcado con 35S-metionina de proteínas, microsecuenciación de proteínas, tinción con plata y electroforesis en gel bidimensional.
[0202] Moléculas pequeñas y ligandos que interaccionan con STEAP-1 pueden identificarse mediante realizaciones relacionadas de tales ensayos de cribado. Por ejemplo, pueden identificarse moléculas pequeñas que interfieren con la función de la proteína, que incluyen moléculas que interfieren con la capacidad de STEAP-1 para mediar en la fosforilación y desfosforilación, interacción con moléculas de ADN o ARN como indicación de regulación de ciclos celulares, señalización de segundo mensajero o tumorigénesis. Similarmente se identifican moléculas pequeñas que modulan canal de iones relacionado con STEAP-1, bomba de proteínas, o funciones de comunicación de células y se usan para tratar pacientes que tienen un cáncer que expresa STEAP-1 (véase, por ejemplo, Hille, B., Ionic Channels of Excitable Membranes 2ª ed., Sinauer Assoc., Sunderland, MA, 1992). Además, ligandos que regulan la función de STEAP-1 pueden identificarse basándose en su capacidad para unirse a STEAP-1 y activar una construcción indicadora. Procedimientos típicos se tratan, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.928.868
concedida el 27 de julio de 1999, e incluyen procedimientos para formar ligandos de híbridos en los que al menos un ligando es una molécula pequeña. En una realización ilustrativa, células manipuladas para expresar una proteína de fusión de STEAP-1 y una proteína de unión a ADN se usan para co-expresar una proteína de fusión de un ligando híbrido/molécula pequeña y una proteína activadora de la transcripción de bibliotecas de ADNc. Las células
5 contienen adicionalmente un gen indicador, cuya expresión está condicionada por la proximidad de la primera y segunda proteínas de fusión entre sí, un evento que se produce solo si el ligando híbrido se une a sitios diana en ambas proteínas híbridas. Se seleccionan aquellas células que expresan el gen indicador y se identifica la molécula pequeña desconocida o el ligando desconocido. Este procedimiento proporciona un medio de identificación de moduladores, que activan o inhiben STEAP-1.
10 [0203] La divulgación proporciona un procedimiento de cribado de una molécula que interacciona con una secuencia de aminoácidos de STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, que comprende las etapas de poner en contacto una población de moléculas con una secuencia de aminoácidos de STEAP-1, permitir que la población de moléculas y la secuencia de aminoácidos de STEAP-1 interaccionen en condiciones que faciliten una interacción,
15 determinar la presencia de una molécula que interacciona con la secuencia de aminoácidos de STEAP-1, y luego separar las moléculas que no interaccionan con la secuencia de aminoácidos de STEAP-1 de moléculas que sí lo hacen. El procedimiento puede comprender además purificar, caracterizar e identificar una molécula que interacciona con la secuencia de aminoácidos de STEAP-1. La molécula identificada puede usarse para modular una función realizada por STEAP-1. La secuencia de aminoácidos de STEAP-1 puede ponerse en contacto con una
20 biblioteca de péptidos.
X.) Procedimientos y composiciones terapéuticos
[0204] La identificación de STEAP-1 como una proteína que normalmente se expresa en un conjunto limitado de tejidos, pero que también se expresa en cánceres tales como aquellos enumerados en la Tabla I, abre varias estrategias terapéuticas al tratamiento de tales cánceres.
[0205] De importancia, las terapias antitumorales dirigidas han sido útiles incluso cuando la proteína elegida como diana se exprese en tejidos normales, incluso tejidos de órganos normales vitales. Un órgano vital es uno que es necesario para mantener la vida, tal como el corazón o el colon. Un órgano no vital es uno que puede eliminarse, tras lo cual el individuo todavía puede sobrevivir. Ejemplos de órganos no vitales son ovarios, mama y próstata.
[0206] Por ejemplo, Herceptin® es una composición farmacéutica aprobada por la FDA que consiste en un anticuerpo que es inmunorreactivo con la proteína diversamente conocida como HER2, HER2/neu y erb-b-2. Se comercializa por Genentech y ha sido un agente antitumoral comercialmente satisfactorio. Las sales de Herceptin® alcanzaron casi 400 millones de dólares en 2002. Herceptin® es un tratamiento para cáncer de mama metastásico positivo para HER2. Sin embargo, la expresión de HER2 no se limita a tales tumores. La misma proteína se expresa en varios tejidos normales. En particular, se sabe que HER2/neu está presente en riñón y corazón normales, así estos tejidos están presentes en todos los receptores humanos de Herceptin. La presencia de HER2/neu en riñón normal también se confirma por Latif, Z y col., B.J.U, International (2002) 89:5-9. Como se muestra en este artículo (que evaluó si el carcinoma de células renales debe ser o no una indicación preferida para anticuerpos anti-HER2 tales como Herceptin), tanto la proteína como ARNm se producen en tejidos renales benignos. En particular, la proteína HER2/neu se expresó fuertemente en exceso en tejido renal benigno. A pesar del hecho de que HER2/neu se expresa en tejidos vitales tales como el corazón y riñón, Herceptin es un fármaco muy útil, aprobado por la FDA y
comercialmente satisfactorio. El efecto de Herceptin sobre tejido cardíaco, es decir, “cardiotoxicidad,” ha sido
simplemente un efecto secundario al tratamiento. Cuando se trataron pacientes con Herceptin solo, se produjo cardiotoxicidad significativa en un porcentaje muy bajo de pacientes. Para minimizar la cardiotoxicidad hay un requisito de entrada más riguroso para el tratamiento con HER2/neu. Factores tales como predisposición a afección cardíaca se evalúan antes de que pueda producirse el tratamiento.
[0207] De importancia particular, aunque se indica que el tejido de riñón presenta expresión normal, posiblemente incluso mayor expresión que el tejido cardíaco, el riñón no tiene efecto secundario de Herceptin apreciable cualquiera que fuera. Además, de la diversa matriz de tejidos normales en la que se expresa HER2, hay muy poca manifestación de cualquier efecto secundario. Solo tejido cardíaco ha manifestado algún efecto secundario apreciable. Un tejido tal como riñón, en el que la expresión de HER2/neu es especialmente notable, no ha sido la base de ningún efecto secundario.
[0208] Además, se han encontrado efectos terapéuticos favorables para terapias antitumorales que eligen como diana el receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR); Erbitux (ImClone). EGFR también se expresa en numerosos tejidos normales. Ha habido efectos secundarios muy limitados en tejidos normales tras el uso de terapéuticos anti-EGFR. Un efecto secundario general que se produce con el tratamiento de EGFR es una erupción cutánea grave observada en el 100 % de los pacientes que se someten a tratamiento.
[0209] Así, la expresión de una proteína diana en tejido normal, incluso tejido normal vital, no elimina la utilidad del agente que elige diana para la proteína como terapéutico para ciertos tumores en los que la proteína también se expresa en exceso. Por ejemplo, la expresión en órganos vitales no es por sí misma perjudicial. Además, órganos considerados como dispensables, tales como la próstata y los ovarios, pueden eliminarse sin afectar la mortalidad. Finalmente, algunos órganos vitales no están afectados por la expresión de órganos normales debido a un inmunoprivilegio, órganos inmunoprivilegiados son órganos que están protegidos de la sangre por una barrera sangre-órgano y así no están accesibles a inmunoterapia. Ejemplos de órganos inmunoprivilegiados son el cerebro y los testículos.
[0210] Por consiguiente, estrategias terapéuticas que inhiben la actividad de una proteína STEAP-1 son útiles para pacientes que padecen un cáncer que expresa STEAP-1. Estas estrategias terapéuticas generalmente se clasifican en tres clases. La primera clase modula la función de STEAP-1, ya que se refiere al crecimiento de células tumorales que conducen a inhibición o retardo del crecimiento de células tumorales o inducción de su destrucción. La segunda clase comprende diversos procedimientos para inhibir la unión o asociación de esta proteína STEAP-1 con su componente de unión o con otras proteínas. La tercera clase comprende una variedad de procedimientos para inhibir la transcripción de un gen STEAP-1 o traducción de ARNm de STEAP-1.
X.A.) Vacunas contra el cáncer
[0211] La divulgación proporciona vacunas contra el cáncer que comprenden una proteína relacionada con STEAP-1 o ácido nucleico relacionado con STEAP-1. En vista de la expresión de STEAP-1, vacunas contra el cáncer previenen y/o tratan cánceres que expresan STEAP-1 con efectos mínimos o sin efectos sobre tejidos no diana. El uso de un antígeno de tumor en una vacuna que genera respuestas inmunitarias humorales mediadas por células como terapia contra el cáncer es muy conocido en la técnica y se ha empleado en cáncer de próstata usando inmunógenos de PSMA humano y de PAP de roedor (Hodge y col., 1995, Int. J. Cancer 63:231-237; Fong y col., 1997, J. Immunol. 159:3113-3117).
[0212] Tales procedimientos pueden ponerse fácilmente en práctica empleando una proteína relacionada con STEAP-1, o una molécula de ácido nucleico que codifica STEAP-1 y vectores recombinantes que pueden expresar y presentar el inmunógeno de STEAP-1 (que normalmente comprenden varios epítopes de linfocitos T o anticuerpo). Expertos en la materia entienden que en la técnica se conoce una amplia variedad de sistemas de vacuna para la administración de epítopes inmunorreactivos (véase, por ejemplo, Heryin y col., Ann Med 1999 Feb 31 (1):6678; Maruyama y col., Cancer Immunol Immunother 2000 Jun 49(3):123-32). Brevemente, tales procedimientos de generación de una respuesta inmunitaria (por ejemplo, mediada por células y/o humoral) en un mamífero comprende las etapas de: exponer el sistema inmunitario del mamífero a un epítope inmunorreactivo (por ejemplo, un epítope presente en una proteína STEAP-1 mostrada en la Figura 3 o análogo u homólogo de la misma) de manera que el mamífero genere una respuesta inmunitaria que es específica para ese epítope (por ejemplo, generar anticuerpos que reconocen específicamente ese epítope). En un procedimiento preferido, un inmunógeno de STEAP-1 contiene un motivo biológico, véanse, por ejemplo, las Tablas V-XVIII y XXII-LI, o un péptido de un intervalo de tamaño de STEAP-1 indicado en la Figura 6, Figura 6, Figura 7, Figura 8 y la Figura 9.
[0213] La proteína STEAP-1 entera, regiones inmunogénicas o epítopes de la misma pueden combinarse y administrarse por diversos medios. Tales composiciones de vacuna pueden incluir, por ejemplo, lipopéptidos (por ejemplo, Vitiello, A. y col., J. Clin. Invest. 95:341, 1995), composiciones de péptidos encapsuladas en microesferas de poli(DL-lactida-co-glicolida) (“PLG”) (véase, por ejemplo, Eldridge y col., Molec. Immunol. 28:287-294, 1991; Alonso y col., Vaccine 12:299-308, 1994; Jones y col., Vaccine 13:875-681, 1995), composiciones de péptidos contenidas en complejos inmunoestimulantes (ISCOM) (véase, por ejemplo, Takahashi y col., Nature 344:873-875, 1990; Hu y col., Clin Exp Immunol. 113:235-243, 1998), sistemas de péptidos de múltiples antígenos (MAP) (véanse, por ejemplo, Tam, J. P., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5408-5413, 1988; Tam, J.P., J. Immunol. Methods 196:1732, 1988), péptidos formulados como péptidos multivalentes; péptidos para su uso en sistemas de administración balística, normalmente péptidos cristalizados, vectores de administración viral (Perkus, M. E. y col., en: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E., ed., pág. 379, 1996; Chakrabarti, S. y col., Nature 320:535, 1986; Hu, S.
L. y col., Nature 320:537, 1986; Kleny, M.-P. y col., AIDS Bio/Technology 4:790, 1986; Top, F. H. y col., J. Infect. Dis. 124:148, 1971; Chanda, P. K. y col., Virology 175:535, 1990), partículas de origen viral o sintético (por ejemplo, Kofler, N. y col., J. Immunol. Methods. 192:25, 1998; Eldridge, J. H. y col., Sem. Hematol. 30:16, 1993; Falo, L. D., Jr. y col., Nature Med. 7:649, 1995), adyuvantes (Warren, H. S., Vogel. F. R. y Chedid, L. A. Annu. Rev. Immunol. 4:369, 1988; Gupta, R. K. y col., Vaccine 11:293, 1993), liposomas (Reddy, R. y col., J. Immunol. 148:1585, 1992; Rock, K. L, Immunol. Today 17:131, 1998), o ADNc desnudo o absorbido en partículas (Ulmer, J. B. y col., Science 259:1745, 1993; Robinson, H. L., Hunt, L. A, y Webster, R. G., Vaccine 11:957, 1993, Shiver, J. W. y col., en: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E., ed., pág. 423, 1998; Cease, K. B., y Berzofsky, J. A, Annu. Rev. Immunol. 12:923, 1994 y Eldridge, J. H. y col., Sem. Hematol. 30:16, 1993). También pueden usarse tecnologías de administración que eligen toxinas como diana, también conocidas como elección de diana mediada por receptor, tales como aquellas de Avant Immunotherapeutics, Inc. (Needham, Massachusetts).
[0214] En pacientes con cáncer asociado a STEAP-1, las composiciones de vacuna también pueden usarse conjuntamente con otros tratamientos usados para cáncer, por ejemplo, cirugía, quimioterapia, farmacoterapias, radioterapias, etc., que incluyen uso en combinación con adyuvantes inmunes tales como IL-2, IL-12, GM-CSF y similares.
Vacunas celulares:
[0215] Pueden determinarse epítopes de CTL usando algoritmos específicos para identificar péptidos dentro de la proteína STEAP-1 que se unen a alelos de HLA correspondientes (véase, por ejemplo, la Tabla IV; Epimer™ y Epimatrix™, Brown University (URL brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html); y, BIMAS (URL bimas.dcrt.nih.gov/; SYFPEITHI en URL syfpaithi.bml-heldelberg.com/). Un inmunógeno de STEAP-1 puede contener una o más secuencias de aminoácidos identificadas usando técnicas muy conocidas en la técnica, tales como las secuencias mostradas en las Tablas V-XVIII y XXII-LI o un péptido de 8, 9, 10 ó 11 aminoácidos especificado por un motivo/supermotivo de clase I de HLA (por ejemplo, Tabla IV (A), Tabla IV (D) o Tabla IV (E)) y/o un péptido de al menos 9 aminoácidos que comprende un motivo/supermotivo de clase II de HLA (por ejemplo, Tabla IV (B) o Tabla IV (C)). Como se aprecia en la materia, el surco de unión a clase I de HLA es esencialmente de extremos cerrados, de manera que los péptidos de solo un intervalo de tamaño particular puedan ajustarse en el surco y unirse, generalmente los epítopes de clase I de HLA tienen 8, 9, 10 u 11 aminoácidos de longitud. A diferencia, el surco de unión a clase II de HLA es esencialmente de extremos abiertos; por tanto, un péptido de aproximadamente 9 o más aminoácidos puede unirse por una molécula HLA de clase II. Debido a las diferencias en el surco de unión entre los motivos de clase I y II de HLA, los motivos de clase I de HLA tienen longitud específica, es decir, la posición dos de un motivo de clase I es el segundo aminoácido en una dirección de amino a carboxilo del péptido. Las posiciones de aminoácidos en un motivo de clase II solo son relativas entre sí, no el péptido global, es decir, pueden unirse aminoácidos adicionales a los extremos amino y/o carboxilo de una secuencia que lleva motivo. Los epítopes de clase II de HLA tienen frecuentemente 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 aminoácidos de longitud, o más de 25 aminoácidos.
[0216] En la técnica se conoce una amplia variedad de procedimientos para generar una respuesta inmunitaria en un mamífero (por ejemplo, como primera etapa en la generación de hibridomas). Procedimientos de generación de una respuesta inmunitaria en un mamífero comprenden exponer el sistema inmunitario del mamífero a un epítope inmunogénico sobre una proteína (por ejemplo, una proteína STEAP-1) de manera que se genere una respuesta inmunitaria. Un ejemplo típico consiste en un procedimiento para generar una respuesta inmunitaria a STEAP-1 en un huésped, poniendo en contacto el huésped con una cantidad suficiente de al menos un epítope de linfocitos B o de linfocitos T citotóxicos de STEAP-1 o análogo del mismo; y al menos un intervalo periódico después volver a poner en contacto el huésped con el epítope de linfocitos B o de linfocitos T citotóxicos de STEAP-1 o análogo de los mismos. Un ejemplo específico consiste en un procedimiento de generación de una respuesta inmunitaria contra una proteína relacionada con STEAP-1 o un péptido multiepitópico hecho por el hombre que comprende: administrar inmunógeno de STEAP-1 (por ejemplo, una proteína STEAP-1 o un fragmento de péptido de la misma, una proteína de fusión de STEAP-1 o análogo, etc.) en una preparación de vacuna para un ser humano u otro mamífero. Normalmente, tales preparaciones de vacuna contienen adicionalmente un adyuvante adecuado (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 6.1466635) o un epítope colaborador universal tal como un péptido PADRE™ (Epimmune inc., San Diego, CA; véanse, por ejemplo, Alexander y col., J. Immunol. 2000 164(3); 164(3): 1625-1833; Alexander y col., Immunity 1994 1(9): 751-761 y Alexander y col., Immunol. Res. 1998 18(2): 79-92). Un procedimiento alternativo comprende generar una respuesta inmunitaria en un individuo contra un inmunógeno de STEAP-1: administrando in vivo al músculo o piel del cuerpo del individuo una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un inmunógeno de STEAP-1, la secuencia de ADN operativamente ligada a secuencias reguladoras que controla la expresión de la secuencia de ADN; en el que la molécula de ADN se recoge por células, la secuencia de ADN se expresa en las células y se genera una respuesta inmunitaria contra el inmunógeno (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.962.428). Opcionalmente también se administra un facilitador de vacuna genético tal como lípidos aniónicos; saponinas; lectinas; compuestos estrogénicos; alquilos inferiores hidroxilados; sulfóxido de dimetilo; y urea. Además, puede administrarse un anticuerpo antiidiotípico que imita a STEAP-1, con el fin de generar una respuesta al antígeno diana.
Vacunas de ácido nucleico:
[0217] Las composiciones de vacuna pueden incluir modalidades mediadas por ácido nucleico. Proteína(s) que codifica(n) ADN o ARN de la divulgación puede(n) administrarse a un paciente. Pueden emplearse procedimientos de inmunización genética para generar respuestas inmunitarias humorales y celulares profilácticas o terapéuticas dirigidas contra células cancerosas que expresan STEAP-1. Las construcciones que comprenden ADN que codifica una proteína/inmunógeno relacionado con STEAP-1 y secuencias reguladoras apropiadas pueden inyectarse directamente en el músculo o piel de un individuo, de forma que las células del músculo o piel capten la construcción y expresen la proteína/inmunógeno de STEAP-1 codificada. Alternativamente, una vacuna comprende una proteína relacionada con STEAP-1. La expresión de la proteína relacionada con el inmunógeno de STEAP-1 produce la generación de inmunidad humoral y celular profiláctica o terapéutica contra células que llevan una proteína STEAP-1. Pueden usarse diversas técnicas de inmunización genética profilácticas y terapéuticas conocidas en la técnica (para una revisión véase la información y referencias publicadas en la dirección de internet genweb.com). La administración basada en ácidos nucleicos se describe, por ejemplo, en Wolff y col., Science 247:1465 (1990), además de las patentes de EE.UU. nº 5.580.859; 5.589.466; 5.804.566; 5.739.118; 5.738.524;
5.679.647; documento WO 98/04720. Ejemplos de tecnologías de administración basadas en ADN incluyen “ADN desnudo”, administración facilitada (bupivicaína, polímeros, mediada por péptidos), complejos de lípidos catiónicos y administración mediada por partículas (“pistola de genes”) o mediada por presión (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.922.687).
[0218] Para fines de inmunización terapéutica o profiláctica, las proteínas pueden expresarse mediante vectores virales o bacterianos. Diversos sistemas de administración de genes virales que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, variolovacuna, viruela aviar, viruela del canario, adenovirus, gripe, virus de la poliomielitis, virus adenoasociado, lentivirus y virus de Sindbis (véanse, por ejemplo, Restifo, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8:658663; Tsang y col., J. Natl. Cancer Inst. 87:982-990 (1995)). También pueden emplearse sistemas de administración no viral introduciendo ADN desnudo que codifica una proteína relacionada con STEAP-1 en el paciente (por ejemplo, intramuscularmente o intradérmicamente) para inducir una respuesta antitumoral.
[0219] El virus se usa, por ejemplo, como un vector para expresar secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos de la divulgación. Tras la introducción en un huésped, el virus de la variolovacuna recombinante expresa el péptido inmunogénico de proteína, y así provoca una respuesta inmunitaria del huésped. Vectores de la variolovacuna y procedimientos útiles en protocolos de inmunización se describen en, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.722.848. Otro vector es BCG (bacilo de Calmette Guerin). Los vectores de BCG se describen en Stover y col., Nature 351:456-460 (1991). Una amplia variedad de otros vectores útiles para administración terapéutica o inmunización de los péptidos de la divulgación, por ejemplo, vectores de adenovirus y de virus adenoasociados, vectores retrovirales, vectores de Salmonella typhi, vectores de la toxina del carbunco desintoxicada y similares serán evidentes para aquellos expertos en la materia a partir de la descripción en el presente documento.
[0220] Así, los sistemas de administración de genes se usan para administrar una molécula de ácido nucleico relacionada con STEAP-1. Puede emplearse ADNc de STEAP-1 de longitud completa humana. Pueden emplearse moléculas de ácidos nucleicos de STEAP-1 que codifican epítopes de linfocitos T citotóxicos (CTL) y/o de anticuerpos específicos.
Vacunas ex vivo
[0221] También pueden emplearse diversas estrategias ex vivo para generar una respuesta inmunitaria. Una estrategia implica el uso de células presentadoras de antígeno (APC) tales como células dendríticas (CD) para presentar antígeno de STEAP-1 al sistema inmunitario de un paciente. Las células dendríticas expresan moléculas MHC de clase I y II, B7 co-estimulante e IL-12, y así son células presentadoras de antígeno altamente especializadas. En cáncer de próstata, células dendríticas autólogas pulsadas con péptidos del antígeno prostático específico de membrana (PSMA) están siendo usadas en un ensayo clínico de fase I para estimular sistemas inmunitarios de pacientes con cáncer de próstata (Tjoa y col., 1998, Prostate 28:65-69; Murphy y col., 1998, Prostate 29:371-380). Así, pueden usarse células dendríticas para presentar péptidos STEAP-1 a linfocitos T en el contexto de moléculas MHC de clase I o II. Pueden pulsarse células dendríticas autólogas con péptidos STEAP-1 que pueden unirse a moléculas MHC de clase I y/o II. Las células dendríticas pueden pulsarse con la proteína STEAP-1 completa. Todavía otro ejemplo implica manipular la expresión en exceso de un gen STEAP-1 en células dendríticas usando diversos vectores de implementación conocidos en la técnica, tales como adenovirus (Arthur y col., 1997, Cancer Gene Ther. 4:17-25), retrovirus (Henderson y col., 1996, Cancer Res. 56:3763-3770), lentivirus, virus adenoasociado, transfección de ADN (Ribas y col., 1997, Cancer Res. 57:2865-2869) o transfección de ARN derivado de tumor (Ashley y col., 1997, J. Exp. Med. 186:1177-1182). Las células que expresan STEAP-1 también pueden manipularse para expresar inmunomoduladores, tales como GM-CSF, y usarse como agentes inmunizantes.
X.B.) STEAP-1 como diana para terapia basada en anticuerpos
[0222] STEAP-1 es una diana atractiva para estrategias terapéuticas basadas en anticuerpos. Se conocen varias estrategias de anticuerpos en la técnica para elegir como diana tanto moléculas extracelulares como intracelulares (véase, por ejemplo, destrucción mediada por el complemento y mediada por ADCC, además del uso de intracuerpos). Debido a que STEAP-1 se expresa por células cancerosas de diversos linajes con respecto a células normales correspondientes, la administración sistémica de composiciones inmunorreactivas de STEAP-1 se preparan que presentan excelente sensibilidad sin efectos tóxicos, no específicos y/o no diana producidos por la unión de la composición inmunorreactiva a órganos y tejidos no diana. Anticuerpos específicamente reactivos con dominios de STEAP-1 son útiles para tratar cánceres que expresan STEAP-1 sistémicamente, tanto como conjugados con una toxina o agente terapéutico, como anticuerpos desnudos que pueden inhibir la proliferación o función celular.
[0223] Los anticuerpos para STEAP-1 pueden introducirse en un paciente de forma que el anticuerpo se una a STEAP-1 y module una función, tal como una interacción con un componente de unión, y por consiguiente medie en la destrucción de las células tumorales y/o inhiba el crecimiento de las células tumorales. Mecanismos por los que tales anticuerpos ejercen un efecto terapéutico pueden incluir citólisis mediada por el complemento, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, modulación de la función fisiológica de STEAP-1, inhibición de la unión a ligando
o rutas de transducción de señales, modulación de la diferenciación de células tumorales, alteración de perfiles del factor de angiogénesis tumoral y/o apoptosis. Ejemplos incluyen Rituxan® para linfoma no Hodgkin, Herceptin® para cáncer de mama metastásico y Erbitux® para cáncer colorrectal.
[0224] Aquellos expertos en la materia entienden que los anticuerpos pueden usarse para elegir específicamente como diana y unirse a moléculas inmunogénicas tales como una región inmunogénica de una secuencia de STEAP-1 mostrada en la Figura 2 o la Figura 3. Además, expertos en la materia entienden que es rutinario conjugar anticuerpos con agentes citotóxicos (véase, por ejemplo, Slevers y col., Blood 93:11 3678-3684 (1 de junio de 1999)). Cuando se administran agentes citotóxicos y/o terapéuticos directamente a células, tales como conjugándolos con anticuerpos específicos para una molécula expresada por esa célula (por ejemplo, STEAP-1), el agente citotóxico ejercerá su efecto biológico conocido (es decir, citotoxicidad) sobre aquellas células.
[0225] En la técnica se conoce una amplia variedad de composiciones y procedimientos para usar conjugados de anticuerpo-agente citotóxico para destruir células. En el contexto de cánceres, procedimientos típicos conllevan administrar a un animal que tiene un tumor una cantidad biológicamente eficaz de un conjugado que comprende un agente citotóxico y/o terapéutico seleccionado ligado a un agente que elige diana (por ejemplo, un anticuerpo anti-STEAP-1) que se une a un marcador (por ejemplo, STEAP-1) expresado, accesible para unirse o localizarse sobre las superficies celulares. Una realización típica es un procedimiento de administración de un agente citotóxico y/o terapéutico a una célula que expresa STEAP-1, que comprende conjugar el agente citotóxico con un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un epítope de STEAP-1, y exponer la célula al conjugado de anticuerpo-agente. Otra realización ilustrativa es un procedimiento para tratar un individuo que se sospecha que padece cáncer metastatizado, que comprende una etapa de administrar parenteralmente a dicho individuo una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico y/o terapéutico.
[0226] La inmunoterapia del cáncer usando anticuerpos anti-STEAP-1 puede hacerse según diversas estrategias que han sido satisfactoriamente empleadas en el tratamiento de otros tipos de cáncer, que incluyen, pero no se limitan a, cáncer de colon (Arlen y col., 1998, Crit. Rev. Immunol. 18:133-138), mieloma múltiple (Ozaki y col., 1997, Blood 90:3179-3186, Tsunenari y col., 1997, Blood 90:2437-2444), cáncer gástrico (Kasprzyk y col., 1992, Cancer Res. 52:2771-2776), linfoma de linfocitos B (Funakoshi y col., 1996, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19:93-101), leucemia (Zhong y col., 1996, Leuc. Res. 20:581-589), cáncer colorrectal (Moun y col., 1994, Cancer Res. 54:6160-6166; Velders y col., 1995, Cancer Res. 55:4398-4403) y cáncer de mama (Shepard y col., 1991, J. Clin. Immunol. 11:117-127). Algunas estrategias terapéuticas implican conjugación de anticuerpo desnudo con un toxina o radioisótopo, tal como la conjugación de Y91 o I131 con anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo,
Zevalin™, IDEC Pharmaceuticals Corp. o Bexxar™, Coulter Pharmaceuticals) respectivamente, mientras que otras implican la co-administración de anticuerpos y otros agentes terapéuticos, tales como Herceptin™ (trastuzumab) con paclitaxel (Genentech, Inc.). Los anticuerpos pueden conjugarse con un agente terapéutico para tratar cáncer de próstata, por ejemplo, los anticuerpos para STEAP-1 pueden administrarse conjuntamente con radiación, quimioterapia o ablación hormonal. Por tanto, los anticuerpos pueden conjugarse con una toxina tal como calicheamicina (por ejemplo, Mylotarg™, Wyeth-Ayerst, Madison, NJ, un anticuerpo IgG4 kappa humanizada recombinante conjugado con calicheamicina antibiótica antitumoral) o un maitansinoide (por ejemplo, prófarmaco activado por tumor, TAP, basado en taxano, plataforma, ImmunoGen, Cambridge, MA, véase también, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.416.064) o auristatina E (Seattle Genetics).
[0227] Aunque el anticuerpo para terapia de STEAP-1 es útil para todas las fases del cáncer, la terapia con anticuerpos puede ser particularmente apropiada en cánceres avanzados o metastásicos. El tratamiento con la terapia con anticuerpos de la invención se indica para pacientes que han recibido una o más rondas de quimioterapia. Alternativamente, la terapia con anticuerpos de la invención se combina con una pauta quimioterapéutica o de radiación para pacientes que no han recibido tratamiento quimioterapéutico. Adicionalmente, la terapia con anticuerpos puede permitir el uso de dosificaciones reducidas de quimioterapia concomitante, particularmente para pacientes que no toleran muy bien la toxicidad del agente quimioterapéutico. Fan y col. (Cancer Res. 53:4637-4642, 1993), Prewett y col. (International J. of Onco. 9:217-224, 1996) y Hancock y col. (Cancer Res. 51:4575-4580,1991) describen el uso de diversos anticuerpos junto con agentes quimioterapéuticos.
[0228] Aunque la terapia con anticuerpos para STEAP-1 es útil para todas las fases del cáncer, la terapia con anticuerpos puede ser particularmente apropiada en cánceres avanzados o metastásicos. El tratamiento con la terapia con anticuerpos de la invención se indica para pacientes que han recibido una o más rondas de quimioterapia. Alternativamente, la terapia con anticuerpos de la invención se combina con una pauta quimioterapéutica o de radiación para pacientes que no han recibido tratamiento quimioterapéutico. Adicionalmente, la terapia con anticuerpos puede permitir el uso de dosificaciones reducidas de quimioterapia concomitante, particularmente para pacientes que no toleran muy bien la toxicidad del agente quimioterapéutico.
[0229] Pacientes con cáncer pueden evaluarse para la presencia y nivel de expresión de STEAP-1, preferentemente usando evaluaciones inmunohistoquímicas de tejido tumoral, obtención de imágenes de STEAP-1 cuantitativa, u otras técnicas que indican de forma fidedigna la presencia y grado de expresión de STEAP-1. Se prefiere el análisis inmunohistoquímico de biopsias tumorales o especímenes quirúrgicos para este fin. Procedimientos para análisis inmunohistoquímico de tejidos tumorales son muy conocidos en la técnica.
[0230] Los anticuerpos monoclonales anti-STEAP-1 que tratan cánceres de próstata y otros cánceres incluyen aquellos que inician una potente respuesta inmunitaria contra el tumor o aquellos que son directamente citotóxicos. A este respecto, los anticuerpos monoclonales anti-STEAP-1 (mAb) pueden provocar la lisis de células tumorales por tanto mecanismos de citotoxicidad de células mediadas por el complemento como dependientes de anticuerpo (ADCC), ambos de los cuales requieren una porción Fc intacta de la molécula de inmunoglobulina para la interacción con sitios de receptor de Fc de células efectoras en las proteínas del complemento. Además, los mAb anti-STEAP-1 que ejercen un efecto biológico directo sobre el crecimiento tumoral son útiles para tratar cánceres que expresan STEAP-1. Los mecanismos por los que mAb directamente citotóxicos actúan incluyen: inhibición del crecimiento celular, modulación de la diferenciación celular, modulación de los perfiles de factor de angiogénesis tumoral, y la inducción de apoptosis. El (Los) mecanismo(s) por los que un mAb anti-STEAP-1 particular ejerce un efecto antitumoral se evalúa(n) usando cualquier número de ensayos in vitro que evalúan la muerte celular tales como ADCC, ADMMC, lisis celular mediada por el complemento, etc., como se conocen generalmente en la técnica.
[0231] En algunos pacientes, el uso de anticuerpos monoclonales murinos u otros no humanos, o mAb quiméricos humanos/de ratón, puede inducir respuestas inmunitarias de moderadas a fuertes contra el anticuerpo no humano. Esto puede producir eliminación del anticuerpo de la circulación y eficacia reducida. En los casos más graves, una respuesta inmunitaria tal puede conducir a la amplia formación de complejos inmunes que, posiblemente, pueden producir insuficiencia renal. Por consiguiente, anticuerpos monoclonales preferidos usados en los procedimientos terapéuticos de la invención son aquellos que son tanto completamente humanos como humanizados y que se unen específicamente al antígeno de STEAP-1 diana con alta afinidad, pero presentan baja o ninguna antigenicidad en el paciente.
[0232] Procedimientos terapéuticos de la invención contemplan la administración de mAb anti-STEAP-1
individuales, además de combinaciones, o mezclas, de diferentes mAb. Tales mezclas de mAb pueden tener ciertas ventajas en la medida en que contienen mAb que eligen como diana diferentes epítopes, explotan diferentes mecanismos efectores o combinan directamente mAb citotóxicos con mAb que se basan en la funcionalidad efectora inmune. Tales mAb en combinación pueden presentar efectos terapéuticos sinérgicos. Además, pueden administrarse mAb anti-STEAP-1 concomitantemente con otras modalidades terapéuticas, que incluyen, pero no se limitan a, diversos agentes quimioterapéuticos, bloqueantes de andrógenos, inmunomoduladores (por ejemplo, IL-2, GM-CSF), cirugía o radiación. Los mAb anti-STEAP-1 se administran en su forma “desnuda” o sin conjugar, o pueden tener un agente(s) terapéutico(s) conjugados con ellos.
[0233] Las formulaciones de anticuerpo anti-STEAP-1 se administran mediante cualquier vía que pueda administrar los anticuerpos a una célula tumoral. Vías de administración incluyen, pero no se limitan a, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica, y similares. El tratamiento generalmente implica administración repetida de la preparación de anticuerpo anti-STEAP-1, mediante una vía de administración aceptable tal como inyección intravenosa (IV), normalmente a una dosis en el intervalo de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ó 25 mg/kg de peso corporal. En general, dosis en el intervalo de 10-1000 mg de mAb por semana son eficaces y bien toleradas.
[0234] Basándose en la experiencia clínica con el mAb Herceptin™ en el tratamiento de cáncer de mama metastásico, una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal del paciente IV seguida de dosis semanales de aproximadamente 2 mg/kg IV de la preparación de mAb anti-STEAP-1 representa una pauta de dosificación aceptable. Preferentemente, la dosis de carga inicial se administra como una infusión de 90 minutos o más. La dosis de mantenimiento periódica se administra como una infusión de 30 minutos o más, dado que la dosis inicial fue bien tolerada. Como se aprecia por aquellos expertos en la materia, diversos factores pueden influir en la pauta de dosis ideal en un caso particular. Tales factores incluyen, por ejemplo, la afinidad de unión y semivida del Ab o mAb usados, el grado de expresión de STEAP-1 en el paciente, el grado de antígeno de STEAP-1 liberado circulante, la concentración en estado estacionario deseada del nivel de anticuerpo, frecuencia de tratamiento y la influencia de agentes quimioterapéuticos u otros agentes usados en combinación con el procedimiento de tratamiento de la invención, además del estado de salud de un paciente particular.
[0235] Opcionalmente, los pacientes deben evaluarse para niveles de STEAP-1 en una muestra dada (por ejemplo, los niveles de antígeno de STEAP-1 circulante y/o células que expresan STEAP-1) con el fin de ayudar en la determinación de la pauta de dosificación más eficaz, etc. Tales evaluaciones también se usan para monitorizar fines durante toda la terapia, y son útiles para calibrar el éxito terapéutico en combinación con la evaluación de otros parámetros (por ejemplo, citología de orina y/o niveles de ImmunoCyt en terapia del cáncer de vejiga, o por analogía, niveles de PSA en suero en terapia para cáncer de próstata).
[0236] También pueden usarse anticuerpos anti-STEAP-1 antiidiotípicos en terapia contra el cáncer como una vacuna para inducir una respuesta inmunitaria a células que expresan una proteína relacionada con STEAP-1. En particular, la generación de anticuerpos antiidiotípicos es muy conocida en la técnica, esta metodología puede adaptarse fácilmente para generar anticuerpos anti-STEAP-1 antiidiotípicos que imitan un epítope sobre una proteína relacionada con STEAP-1 (véase, por ejemplo, Wagner y col., 1997, Hybridome 16: 33-40; Foon y col., 1995, J. Clin. Invest. 98:334-342; Hertyn y col., 1998, Cancer Immunol. Immunother. 43:65-76). Un anticuerpo antiidiotípico tal puede usarse en estrategias de vacunas para el cáncer.
X.C.) STEAP-1 como diana para respuestas inmunitarias celulares
[0237] Se proporcionan vacunas y procedimientos de preparación de vacunas que contienen una cantidad inmunogénicamente eficaz de uno o más péptidos de unión a HLA como se describen en el presente documento. Además, las vacunas según la divulgación engloban composiciones de uno o más de los péptidos reivindicados. Un péptido puede estar presente en una vacuna individualmente. Alternativamente, el péptido pueden existir como un homopolímero que comprende múltiples copias del mismo péptido, o como un heteropolímero de diversos péptidos. Los polímeros tienen la ventaja de elevada reacción inmunológica y, si se usan diferentes epítopes de péptido para constituir el polímero, la capacidad adicional de inducir anticuerpos y/o CTL que reaccionan con diferentes determinantes antigénicos del organismo patógeno o péptido relacionado con el tumor elegido como diana por una respuesta inmunitaria. La composición puede ser una región que se produce naturalmente de un antígeno o puede prepararse, por ejemplo, recombinantemente o por síntesis química.
[0238] Vehículos que pueden usarse con vacunas de la divulgación son muy conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, tiroglobulina, albúminas tales como albúmina de suero humano, toxoide tetánico, poliaminoácidos tales como poli-L-lisina, ácido poli-L-glutámico, gripe, proteína de la envuelta del virus de la hepatitis B, y similares. Las vacunas pueden contener un diluyente fisiológicamente tolerable (es decir, aceptable) tal como agua, o solución salina, preferentemente solución salina tamponada con fosfato. Las vacunas también incluyen normalmente un adyuvante. Adyuvantes tales como adyuvante incompleto de Freund, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio o alumbre son ejemplos de materiales muy conocidos en la técnica. Adicionalmente, como se ha desvelado en el presente documento, las respuestas de CTL pueden sensibilizarse conjugando péptidos con lípidos, tales como tripalmitoil-S-glicerilcisteinliseril-serina (PsCSS). Además, se ha encontrado que un adyuvante tal como un oligonucleótido que contiene guanina fosforotiolada con citosina (CpG) sintético aumenta las respuestas de CTL de 10 a 100 veces (véase, por ejemplo Davila y Cells, J. Immunol. 165:539-547 (2000))
[0239] Tras la inmunización con una composición de péptido, mediante inyección, aerosol, vías oral, transdérmica, transmucosa, intrapleural, intratecal u otras vías adecuadas, el sistema inmunitario del huésped responde a la vacuna produciendo grandes cantidades de CTL y/o HTL específicos para el antígeno deseado. Por consiguiente, el huésped se vuelve al menos parcialmente inmune al posterior desarrollo de células que expresan o expresan en exceso antígeno de STEAP-1, o deriva al menos algún beneficio terapéutico cuando el antígeno se asoció al tumor.
[0240] Puede desearse combinar la componentes de péptido de clase I con componentes que inducen o facilitan respuestas de anticuerpos neutralizantes y o linfocitos T colaboradores dirigidas al antígeno diana. Una composición tal puede comprender epítopes de clase I y clase II; o un epítope de clase I y/o clase II junto con un epítope de HTL reactivo de forma cruzada tal como la molécula PADRE™ (Epimmune, San Diego, CA) (descrito, por ejemplo, en la patente de EE.UU. número 5.736.142).
[0241] Una vacuna también puede incluir células presentadoras de antígeno (APC), tales como células dendríticas (CD), como vehículo para presentar péptidos de la divulgación. Las composiciones de vacuna pueden crearse in vitro, siguiendo movilización y recogida de células dendríticas, por lo que la carga de células dendríticas se produce in vitro. Por ejemplo, células dendríticas se transfectan, por ejemplo, con un minigen según la divulgación, o se pulsan con péptidos. La célula dendrítica puede entonces administrarse a un paciente para provocar respuestas inmunitarias in vivo. Las composiciones de vacuna, tanto basadas en ADN como en péptidos, también pueden administrarse in vivo en combinación con movilización de células dendríticas, por lo que la carga de células dendríticas se produce in vivo.
[0242] Preferentemente, los siguientes principios se utilizan cuando se selecciona una matriz de epítopes para inclusión en una composición poliepitópica para su uso en una vacuna, o para seleccionar epítopes discretos que van a incluirse en una vacuna y/o a codificarse por ácidos nucleicos tales como un minigen. Se prefiere que cada uno de los siguientes principios se equilibre con el fin de hacer la selección. Los múltiples epítopes que van a incorporarse en una composición de vacuna dada pueden ser, pero no necesitan ser, contiguos en secuencia en el antígeno nativo del que se derivan los epítopes.
1.) Se seleccionan epítopes que, tras la administración, imitan respuestas inmunitarias que se han observado que se correlacionan con la eliminación de tumor. Para HLA de clase I esto incluye 34 epítopes que proceden de al menos un antígeno asociado a tumor (TAA). Para HLA de clase II se emplea una lógica similar; se seleccionan de nuevo 34 epítopes de al menos un TAA (véase, por ejemplo, Rosenberg y col., Science 278:1447-1450). Los epítopes de un TAA pueden usarse en combinación con epítopes de uno o más TAA adicionales para producir una vacuna que elige como diana tumores con patrones de expresión variables de TAA frecuentemente expresados.
2.) Se seleccionan epítopes que tienen el requisito de afinidad de unión establecida que se correlaciona con inmunogenicidad: para HLA de clase I una CI50 de 500 nM o menos, frecuentemente 200 nM o menos; y para clase II una CI50 de 1000 nM o menos.
3.) Se seleccionan suficientes péptidos que llevan supermotivo, o una matriz suficiente de péptidos que llevan motivos específicos de alelo, para dar amplia cobertura de la población. Por ejemplo, es preferible tener al menos el 80 % de cobertura de la población. Puede emplearse un análisis de Monte Carlo, una evaluación estadística conocida en la técnica, para evaluar la anchura, o redundancia de, cobertura de la población.
4.) Cuando se seleccionan epítopes de antígenos relacionados con el cáncer es frecuentemente útil seleccionar análogos debido a que el paciente puede haber desarrollado tolerancia al epítope nativo.
5.) Son de relevancia particular epítopes denominados “epítopes anidados”. Los epítopes anidados se producen cuando al menos dos epítopes se solapan en una secuencia de péptidos dada. Una secuencia de péptidos anidados puede comprender epítopes de linfocitos B, HLA de clase I y/o HLA de clase II. Cuando se proporcionan epítopes anidados, un objetivo general es proporcionar el mayor número de epítopes por secuencia. Así, un aspecto es evitar el proporcionar un péptido que sea más largo que el extremo amino del epítope del extremo amino y el extremo carboxilo del epítope del extremo carboxilo en el péptido. Cuando se proporciona una secuencia multiepitópica, tal como una secuencia que comprende epítopes anidados, generalmente es importante cribar la secuencia con el fin de asegurar que no tenga propiedades patológicas u otras propiedades biológicas perjudiciales. 6.) Si se crea una proteína poliepitópica, o cuando se crea un minigen, un objetivo es generar el péptido más pequeño que engloba los epítopes de interés. Este principio es similar, si no el mismo, al empleado cuando se selecciona un péptido que comprende epítopes anidados. Sin embargo, con un péptido poliepitópico artificial, el objetivo de minimización del tamaño se equilibra contra la necesidad de integrar cualquier secuencia espaciadora entre epítopes en la proteína poliepitópica. Los residuos de aminoácidos espaciadores pueden, por ejemplo, introducirse para evitar epítopes de unión (un epítope reconocido por el sistema inmunitario, no presente en el antígeno diana, y solo creado por la yuxtaposición hecha por el hombre de epítopes), o para facilitar la escisión entre epítopes y así potenciar la presentación de epítopes. Los epítopes de unión van a evitarse generalmente debido a que el receptor puede generar una respuesta inmunitaria al epítope no nativo. Es de preocupación particular un
epítope de unión que sea un “epítope dominante”. Un epítope dominante puede conducir a una respuesta entusiasta
tal que disminuyan o se supriman las respuestas inmunitarias a otros epítopes.
7.) Cuando las secuencias de múltiples variantes de la misma proteína diana están presentes, también pueden seleccionarse posibles epítopes de péptido basándose en su conservación. Por ejemplo, un criterio para la conservación puede definir que la secuencia entera de un péptido de unión a HLA de clase I o el núcleo 9-mero entero de un péptido de unión a clase II se conserve en un porcentaje designado de las secuencias evaluadas para un antígeno de proteína específico.
X.C.1. Vacunas de minigen
[0243] Están disponibles varias estrategias diferentes que permiten la administración simultánea de múltiplesepítopes. Ácidos nucleicos que codifican los péptidos de la divulgación son particularmente útiles. Los epítopes para inclusión en un minigen se seleccionan preferentemente según las pautas expuestas en la sección previa. Un medio preferido de administrar ácidos nucleicos que codifican los péptidos de la divulgación usa construcciones de minigen que codifican un péptido que comprende uno o múltiples epítopes de la divulgación.
[0244] El uso de minigenes de múltiples epítopes se describe más adelante y en Ishloka y col., J. Immunol. 162:3915-3925, 1999; An, L y Whilton, J. L., J. Virol. 71:2292, 1997; Thomson, S. A. y col., J. Immunol. 157:822, 1998; Whitton, J. L y col., J. Virol. 67:348, 1993; Hanke, R. y col., Vaccine 16:426, 1998. Por ejemplo, puede manipularse un plásmido de ADN de múltiples epítopes que codifica epítopes que llevan supermotivos y/o motivos derivados de STEAP-1, el epítope de linfocitos T colaboradores universal PADRE® o múltiples epítopes de HTL de STEAP-1 (véanse, por ejemplo, las Tablas V-XVIII y XXII a LI), y una secuencia de translocación del retículo endoplásmico. Una vacuna también puede comprender epítopes que se derivan de otros TAA.
[0245] La inmunogenicidad de un minigen multiepitópico puede confirmarse en ratones transgénicos para evaluar la magnitud de respuestas de inducción de CTL contra los epítopes probados. Además, la inmunogenicidad de epítopes codificados por ADN in vivo puede correlacionarse con las respuestas in vitro de líneas de CTL específicas contra células diana transfectadas con el plásmido de ADN. Así, estos experimentos pueden mostrar que el minigen sirve para tanto: 1.) generar una respuesta de CTL como 2.) que los CTL inducidos reconozcan células que expresan los epítopes codificados.
[0246] Por ejemplo, para crear una secuencia de ADN que codifica los epítopes seleccionados (minigen) para la expresión en células humanas, las secuencias de aminoácidos de los epítopes pueden traducirse de forma inversa. Puede usarse una tabla de uso de codones humanos para guiar la elección de codones para cada aminoácido. Estas secuencias de ADN que codifican epítopes pueden colindar directamente, de manera que cuando se traducen, se crea una secuencia de polipéptidos continua. Para optimizar la expresión y/o inmunogenicidad, elementos adicionales pueden incorporarse en el diseño del minigen. Ejemplos de secuencias de aminoácidos que pueden traducirse de forma inversa e incluirse en la secuencia de minigenes incluyen: epítopes de HLA de clase I, epítopes de HLA de clase II, epítopes de anticuerpos, una secuencia señal de ubiquitinación y/o una señal que elige como diana el retículo endoplásmico. Además, la presentación de HLA de epítopes de CTL y HTL puede mejorarse incluyendo secuencias flanqueantes sintéticas (por ejemplo, poli-alanina) o que se producen naturalmente adyacentes a los epítopes de CTL o HTL; estos péptidos más grandes que comprenden el (los) epítope(s) están dentro del alcance de la divulgación.
[0247] La secuencia de minigenes puede convertirse en ADN ensamblando oligonucleótidos que codifican las cadenas más y menos del minigen. Los oligonucleótidos solapantes (30-100 bases de longitud) pueden sintetizarse, fosforilarse, purificarse e hibridarse bajo condiciones apropiadas usando técnicas muy conocidas. Los extremos de los oligonucleótidos pueden unirse, por ejemplo, usando ADN ligasa T4. Este minigen sintético, que codifica el polipéptido del epítope, puede entonces clonarse en un vector de expresión deseado.
[0248] Secuencias reguladoras convencionales muy conocidas para aquellos expertos en la materia se incluyen preferentemente en el vector para garantizar la expresión en las células diana. Varios elementos de vector son deseables: un promotor con un sitio de clonación en la dirección 3' para la inserción del minigen; una señal de poliadenilación para la eficaz terminación de la transcripción; un origen de E. coli de replicación; y un marcador de selección de E. coli (por ejemplo, resistencia a ampicilina o kanamicina). Pueden usarse numerosos promotores para este fin, por ejemplo, el promotor del citomegalovirus humano (CMVh). Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 5.580.859 y 5.589.466 para otras secuencias promotoras adecuadas.
[0249] Pueden desearse modificaciones de vectores adicionales para optimizar la expresión minigénica y la inmunogenicidad. En algunos casos se requieren intrones para la eficaz expresión génica, y uno o más intrones sintéticos o que se producen naturalmente podrían incorporarse en la región transcrita del minigen. También puede considerarse que la inclusión de las secuencias de estabilización de ARNm y secuencias para la replicación en células de mamífero aumentan la expresión minigénica.
[0250] Una vez se ha seleccionado un vector de expresión, el minigen se clona en la región del poliligador en la dirección 3' de un promotor. Este plásmido se transforma en una cepa de E. coli apropiada, y se prepara ADN usando técnicas convencionales. La orientación y secuencia de ADN del minigen, además de todos los otros elementos incluidos en el vector, se confirman usando mapeo de restricción y análisis de secuencias de ADN. Células bacterianas que alojan el plásmido correcto pueden almacenarse como un banco de células maestras y un banco de células de trabajo.
[0251] Además, parece que las secuencias inmunoestimulantes (ISS o CpG) desempeñan una función en la inmunogenicidad de vacunas de ADN. Estas secuencias pueden incluirse en el vector, fuera de la secuencia codificante del minigen, si se desea potenciar la inmunogenicidad.
[0252] Puede usarse un vector de expresión bi-cistrónico que permite la producción de tanto los epítopes codificados por el minigen como una segunda proteína (incluida para potenciar o disminuir la inmunogenicidad). Ejemplos de proteínas o polipéptidos que podrían potenciar beneficiosamente la respuesta inmunitaria si se coexpresaran incluyen citocinas (por ejemplo, IL-2, IL-12, GM-CSF), moléculas inductoras de citocinas (por ejemplo, LeIF), moléculas coestimulantes, o para respuestas de HTL, proteínas de unión a pan-DR (PADRE™, Epimmune, San Diego, CA). Epítopes colaboradores (HTL) pueden unirse a señales de elección de diana intracelular y expresarse por separado de epítopes de CTL expresados; esto permite la dirección de los epítopes de HTL a un compartimento celular diferente del de los epítopes de CTL. Si se requiere, esto podría facilitar la entrada más eficaz de epítopes de HTL en la ruta de HLA de clase II, mejorándose así la inducción de HTL. A diferencia de la inducción de HTL o CTL, el disminuir específicamente la respuesta inmunitaria por co-expresión de moléculas inmunosupresoras (por ejemplo, TGF-β) puede ser beneficioso en ciertas enfermedades.
[0253] Pueden producirse cantidades terapéuticas de ADN de plásmido, por ejemplo, por fermentación en E. coli, seguido de purificación. Se usan alícuotas del banco de células de trabajo para inocular medio de crecimiento, y se cultivan hasta saturación en matraces de agitación o un biorreactor según técnicas muy conocidas. El ADN de plásmido puede purificarse usando tecnologías de bioseparación convencionales tales como resinas de intercambio aniónico en fase sólida suministradas por QIAGEN, Inc. (Valencia, California). Si se requiere, ADN superenrollado puede aislarse de las formas circulares y lineales abiertas usando electroforesis en gel u otros procedimientos.
[0254] El ADN de plásmido purificado puede prepararse para inyección usando una variedad de formulaciones. La más simple de éstas es la reconstitución de ADN liofilizado en solución salina tamponada con
fosfato (PBS) estéril. Esta estrategia, conocidos como “ADN desnudo,” está siendo actualmente usada para
administración intramuscular (IM) en ensayos clínicos. Para maximizar los efectos inmunoterapéuticos de vacunas de ADN de minigen puede ser deseable un procedimiento alternativo para formular ADN de plásmido purificado. Se ha descrito una variedad de procedimientos, y pueden estar disponibles nuevas técnicas. También pueden usarse lípidos catiónicos, glucolípidos y liposomas fusogénicos en la formulación (véanse, por ejemplo, como se describe por el documento WO 93/24640; Mannino & Gould-Fogerite, BioTechniques 6(7): 682 (1988); patente de EE.UU. nº 5.279.833; documento WO 91/08309; y Felgner y col., Proc, Nat'l Acad. Sci. USA 84:7413(1987)). Además, péptidos y compuestos denominados conjuntamente compuestos protectores interactivos de no condensación (PINC) también podrían complejarse con ADN de plásmido purificado para influir en variables tales como estabilidad, dispersión intramuscular o tráfico a órganos específicos o tipos de células.
[0255] Puede usarse la sensibilización de células diana en ensayo funcional para la expresión y presentación de HLA de clase I de epítopes de CTL codificados por minigenes. Por ejemplo, el ADN de plásmido se introduce en una línea celular de mamífero que es adecuada como diana para ensayos de liberación de cromo de CTL convencionales. El procedimiento de transfección usado será dependiente de la formulación final. Puede usarse electroporación para ADN “desnudo”, mientras que los lípidos catiónicos permiten la transfección in vitro directa. Un plásmido que expresa proteína verde fluorescente (GFP) puede co-transfectarse para permitir el enriquecimiento de células transfectadas usando citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS). Entonces, estas células se marcan con cromo-51 (51Cr) y se usan como células diana para líneas de CTL específicas de epítope; la citólisis, detectada por liberación de 51Cr, indica tanto la producción de, como la presentación de HLA de, epítopes de CTL codificados por minigenes. La expresión de epítopes de HTL puede evaluarse de una forma análoga usando ensayos para evaluar actividad de HTL.
[0256] La inmunogenicidad in vivo es una segunda estrategia para la prueba funcional de formulaciones de ADN de minigen. Ratones transgénicos que expresan proteínas de HLA humanas apropiadas se inmunizan con el producto de ADN. La dosis y vía de administración dependen de la formulación (por ejemplo, IM para ADN en PBS, intraperitoneal (i.p.) para ADN complejado con lípido). Veintiún días después de la inmunización, los esplenocitos se recogen y se reestimulan durante una semana en presencia de péptidos que codifican cada epítope que se prueba. Después, para células efectoras de CTL, se realizan ensayos para la citólisis de células diana marcadas con 51Cr cargadas en péptido usando técnicas convencionales. La lisis de células diana que se sensibilizaron por HLA cargado con epítopes de péptido, correspondiente a epítopes codificados por minigen, demuestra función de vacuna de ADN para la inducción in vivo de CTL. La inmunogenicidad de epítopes de HTL se confirma de una forma análoga en ratones transgénicos.
[0257] Alternativamente, los ácidos nucleicos pueden administrarse usando administración balística como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.204.253. Usando esta técnica se administran partículas únicamente comprendidas por ADN. El ADN puede adherirse a partículas, tales como partículas de oro.
[0258] También pueden administrarse minigenes usando otros sistemas de administración bacteriana o viral muy conocidos en la técnica, por ejemplo, una construcción de expresión que codifica epítopes de la divulgación puede incorporarse en un vector viral tal como variolovacuna.
X.C.2. Combinaciones de péptidos de CTL con péptidos colaboradores
[0259] Las composiciones de vacuna que comprenden péptidos de CTL pueden modificarse, por ejemplo, analogizarse, para proporcionar atributos deseados tales como semivida en suero mejorada, cobertura de la población ampliada o inmunogenicidad potenciada.
[0260] Por ejemplo, la capacidad de un péptido para inducir actividad de CTL puede potenciarse ligando el péptido a una secuencia que contiene al menos un epítope que puede inducir una respuesta de linfocitos T colaboradores. Aunque un péptido de CTL puede ligarse directamente a un péptido colaborador T, conjugados de epítope de CTL / epítope de HTL se ligan frecuentemente por una molécula espaciadora. El espaciador comprende normalmente moléculas neutras relativamente pequeñas tales como aminoácidos o miméticos de aminoácidos que están sustancialmente sin cargar bajo condiciones fisiológicas. Los espaciadores se seleccionan normalmente de, por ejemplo, Ala, Gly u otros espaciadores neutros de aminoácidos no polares, o aminoácidos polares neutros. Se entenderá que el espaciador opcionalmente presente no necesita comprender necesariamente los mismos residuos y así puede ser un hetero- u homo-oligómero. Cuando está presente, el espaciador normalmente tendrá al menos uno o dos residuos, más normalmente tres a seis residuos, y algunas veces 10 o más residuos. El epítope del péptido de CTL puede ligarse al epítope del péptido colaborador T tanto directamente como mediante un espaciador tanto en el extremo amino como carboxi del péptido de CTL. El extremo amino de tanto el péptido inmunogénico como el péptido colaborador T puede estar acilado.
[0261] El péptido colaborador T puede ser uno que es reconocido por linfocitos colaboradores T presentes en la mayoría de una población genéticamente diversa. Esto puede llevarse a cabo seleccionando péptidos que se unen a muchas, la mayoría o a todas las moléculas HLA de clase II. Ejemplos de tales aminoácidos que se unen a muchas moléculas HLA de clase II incluyen secuencias de antígenos tales como toxoide tetánico en las posiciones 830-843 QYIKANSKFIGITE; (SEQ ID NO: 84), proteína de circumsporozoíto de Plasmodium falciparum (CS) en las posiciones 378-398 DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS; (SEQ ID NO: 65) y proteína de 18 kD de Streptococcus en las posiciones 116-131 GAVDSILGGVATYGAA; (SEQ ID NO: 66). Otros ejemplos incluyen péptidos que llevan un supermotivo DR 1-4-7, o cualquiera de los motivos DR3.
[0262] Alternativamente es posible preparar péptidos sintéticos que pueden estimular linfocitos colaboradores T, en un modo libremente limitado a HLA, usando secuencias de aminoácidos no encontradas en la naturaleza (véase, por ejemplo, la publicación PCT WO 95/07707). Estos compuestos sintéticos llamados epítopes de unión a Pan-DR (por ejemplo, PADRE™, Epimmune, inc., San Diego, CA) se diseñan, lo más preferentemente, para unirse principalmente a moléculas HLA-DR (HLA de clase II humano). Por ejemplo, se ha encontrado que un péptido de epítope de unión a pan-DR que tiene la fórmula: XKXVAAWTLKAAX (SEQ ID NO: 67) en la que “X” es tanto ciclohexilalanina, fenilalanina o tirosina, como es tanto D-alanina o L-alanina, se une a la mayoría de los alelos de HLA-DR y estimula la respuesta de linfocitos colaboradores T de la mayoría de los individuos, independientemente de su tipo de HLA. Una alternativa de un epítope de unión a pan-DR comprende todos los aminoácidos naturales “L” y puede proporcionarse en forma de ácidos nucleicos que codifican el epítope.
[0263] Los epítopes de péptidos de HTL también pueden modificarse para alterar sus propiedades biológicas. Por ejemplo, pueden modificarse para incluir D-aminoácidos para aumentar su resistencia a proteasas y así prolongar su semivida en suero, o pueden conjugarse con otras moléculas tales como lípidos, proteínas, hidratos de carbono y similares para aumentar su actividad biológica. Por ejemplo, un péptido colaborador T puede conjugarse con una o más cadenas de ácido palmítico en tanto los extremos amino como carboxilo.
X.C.3. Combinaciones de péptidos de CTL con agentes sensibilizantes de linfocitos T
[0264] Puede desearse incluir en las composiciones farmacéuticas de la divulgación al menos un componente que sensibilice linfocitos B o linfocitos T. Se han identificado lípidos como agentes que pueden sensibilizar CTL in vivo. Por ejemplo, residuos de ácido palmítico pueden unirse a los grupos s-y a-amino de un residuo de lisina y luego enlazarse, por ejemplo, mediante uno o más residuos de enlace tales como Gly, Gly-Gly-, Ser, Ser-Ser, o similares, a un péptido inmunogénico. El péptido lipidado puede entonces administrarse tanto directamente en una micela o partícula, incorporarse en un liposoma, como emulsionarse en un adyuvante, por ejemplo, adyuvante incompleto de Freund. Una composición inmunogénica particularmente eficaz puede comprender ácido palmítico unido a grupos s- y a-amino de Lys, que están unidos mediante enlace, por ejemplo, Ser-Ser, al extremo amino del péptido inmunogénico.
[0265] Como otro ejemplo de sensibilización de lípidos de respuestas de CTL, lipoproteínas de E. coli, tales como tripalmitoil-S-glicerilcisteinliseril-serina (P3CSS), pueden usarse para sensibilizar CTL específicos de virus cuando se unen covalentemente a un péptido apropiado (véase, por ejemplo, Deres y col., Nature 342:561, 1989). Los péptidos de la divulgación pueden acoplarse a P3CSS, por ejemplo, y administrarse el lipopéptido a un individuo para sensibilizar específicamente una respuesta inmunitaria al antígeno diana. Además, debido a que la inducción de anticuerpos neutralizantes también puede sensibilizarse con epítopes conjugados con P3CSS, dos de tales composiciones pueden combinarse para provocar más eficazmente tanto respuestas humorales como mediadas por células.
X.C.4. Composiciones de vacuna que comprenden CD pulsadas con péptidos de CTL y/o de HTL
[0266] Una composición de vacuna puede comprender la administración ex vivo de una mezcla de péptidos que llevan epítope para CMSP, o CD aisladas de las mismas, de la sangre del paciente. Puede usarse un producto farmacéutico para facilitar la recolección de CD, tal como Progenipoietin™ (Pharmacia-Monsanto, St Louis, MO) o GM-CSF/IL-4. Después de pulsar las CD con péptidos y antes de la reinfusión en los pacientes, las CD se lavan para eliminar péptidos sin unir. Una vacuna puede comprender CD pulsadas con péptidos que presentan los epítopes de péptidos pulsados complejados con moléculas HLA sobre sus superficies.
[0267] Las CD pueden pulsarse ex vivo con una mezcla de péptidos, algunos de los cuales estimulan respuestas de CTL a STEAP-1. Opcionalmente, un péptido de linfocito T colaborador (HTL), tal como un péptido de HLA de clase II libremente limitado natural o artificial, puede incluirse para facilitar la respuesta de CTL. Así, una vacuna según la divulgación se usa para tratar un cáncer que expresa o expresa en exceso STEAP-1.
X.D. Inmunoterapia adoptiva
[0268] Se usan péptidos relacionados con STEAP-1 antigénicos para también provocar una respuesta de CTL y/o HTL ex vivo. Las células de CTL o HTL resultantes pueden usarse para tratar tumores en pacientes que no responden a otras formas convencionales de terapia, o que no responderán a un péptido de vacuna terapéutica o ácido nucleico según la divulgación. Respuestas de CTL o HTL ex vivo a un antígeno particular se inducen incubando en cultivo de tejido células precursoras de CTL o HTL del paciente, o genéticamente compatibles, junto con una fuente de células presentadoras de antígeno (APC), tal como células dendríticas y el péptido inmunogénico apropiado. Después de un tiempo de incubación apropiado (normalmente aproximadamente 7-28 días) en el que las células precursoras se activan y se expanden en células efectoras, las células se infunden de nuevo al paciente, destruyendo (CTL) o facilitando la destrucción (HTL) de su célula diana específica (por ejemplo, una célula tumoral). También pueden usarse células dendríticas transfectadas como células presentadoras de antígeno.
X.E. Administración de vacunas para fines terapéuticos o profilácticos
[0269] Las composiciones farmacéuticas y de vacuna de la divulgación se usan normalmente para tratar y/o prevenir un cáncer que expresa o expresa en exceso STEAP-1. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones de péptidos y/o ácidos nucleicos se administran a un paciente en una cantidad suficiente para provocar una respuesta de linfocitos B, CTL y/o HTL eficaz al antígeno y para curar o al menos detener parcialmente o ralentizar los síntomas y/o complicaciones. Una cantidad adecuada para realizar esto se define como “dosis terapéuticamente eficaz”. Cantidades eficaces para este uso dependerán, por ejemplo, de la composición particular administrada, el modo de administración, la fase y gravedad de la enfermedad que está tratándose, el peso y estado general de salud del paciente, y el criterio del médico prescriptor.
[0270] Para composiciones farmacéuticas, los péptidos inmunogénicos de la divulgación, o ADN que los codifica, se administran generalmente a un individuo que ya lleva un tumor que expresa STEAP-1. Los péptidos o ADN que los codifica pueden administrarse individualmente o como fusiones de una o más secuencias de péptidos. Los pacientes pueden tratarse con los péptidos inmunogénicos por separado o conjuntamente con otros tratamientos, tales como cirugía, según convenga.
[0271] Para uso terapéutico, la administración debe empezar generalmente en el primer diagnóstico de cáncer asociado a STEAP-1. Esto va seguido de dosis de refuerzo hasta que al menos los síntomas sean sustancialmente abatidos y durante un periodo a partir de ahí. La composición de vacuna (es decir, que incluye, pero no se limita a, ejemplos tales como mezclas de péptidos, polipéptidos poliepitópicos, minigenes o CTL específicos de TAA o células dendríticas pulsadas) administrada al paciente puede variar según la fase de la enfermedad o el estado de salud del paciente. Por ejemplo, en un paciente con un tumor que expresa STEAP-1, una vacuna que comprende CTL específicos de TAA puede ser más eficaz en destruir células tumorales en el paciente con enfermedad avanzada que realizaciones alternativas.
[0272] Es generalmente importante proporcionar una cantidad del epítope de péptido administrado por un modo de administración suficiente para estimular eficazmente una respuesta de linfocitos T citotóxicos; también pueden darse composiciones que estimulan respuestas de linfocitos T colaboradores.
[0273] La dosificación para una inmunización terapéutica inicial generalmente se produce en un intervalo de dosificación unitario en el que el valor inferior es aproximadamente 1, 5, 50, 500 o 1.000 µg y el valor superior es aproximadamente 10.000; 20.000; 30.000; o 60.000 µg. Los valores de dosificación para un ser humano normalmente oscilan de aproximadamente 500 µg a aproximadamente 50.000 µg por paciente de 70 kilogramos. Dosificaciones de refuerzo de entre aproximadamente 1,0 µg a aproximadamente 50.000 µg de péptido conforme a una pauta de refuerzo durante semanas a meses puede administrarse dependiendo de la respuesta del paciente y la afección como se ha determinado midiendo la actividad específica de CTL y HTL obtenida de la sangre del paciente. La administración debe continuar hasta que al menos los síntomas clínicos o las pruebas analíticas indiquen que la neoplasia se ha eliminado o reducido y durante un periodo después a partir de ahí. Las dosificaciones, vías de administración y programas de dosis se ajustan según metodologías conocidas en la técnica.
[0274] Los péptidos y composiciones de la presente divulgación pueden emplearse en estados graves de enfermedad, es decir, situaciones mortales o potencialmente mortales. En tales casos, como resultado de las cantidades mínimas de sustancias extrañas y la naturaleza no tóxica relativa de los péptidos en composiciones preferidas, es posible y puede hacerse sentir deseable por el médico práctico administrar excesos sustanciales de estas composiciones de péptidos con respecto a estas cantidades de dosificación establecidas.
[0275] Las composiciones de vacuna también pueden usarse puramente como agentes profilácticos. Generalmente, la dosificación para una inmunización profiláctica inicial generalmente se produce en un intervalo de dosificación unitario en el que el valor inferior es aproximadamente 1, 5, 50, 500 ó 1000 µg y el valor superior es aproximadamente 10.000; 20.000; 30.000; o 50.000 µg. Los valores de dosificación para un ser humano normalmente oscilan de aproximadamente 500 µg a aproximadamente 50.000 µg por paciente de 70 kilogramos. Esto va seguido de dosificaciones de refuerzo de entre aproximadamente 1,0 µg a aproximadamente 50.000 µg de péptido administrado a intervalos definidos de aproximadamente cuatro semanas a seis meses después de la administración inicial de la vacuna. La inmunogenicidad de la vacuna puede evaluarse midiendo la actividad específica de CTL y HTL obtenida de una muestra de sangre del paciente.
[0276] Las composiciones farmacéuticas para tratamiento terapéutico están previstas para administración parenteral, tópica, oral, nasal, intratecal o local (por ejemplo, como una crema o pomada tópica). Preferentemente, las composiciones farmacéuticas se administran parenteralmente, por ejemplo, intravenosamente, subcutáneamente, intradérmicamente o intramuscularmente. Así, la divulgación proporciona composiciones para administración parenteral que comprenden una disolución de los péptidos inmunogénicos disueltos o suspensos en un vehículo aceptable, preferentemente un vehículo acuoso.
[0277] Puede usarse una variedad de vehículos acuosos, por ejemplo, agua, agua tamponada, 0,8 % de solución salina, 0,3 % de glicina, ácido hialurónico y similares. Estas composiciones pueden esterilizarse por técnicas de esterilización muy conocidas convencionales, o pueden esterilizarse por filtración. Las disoluciones acuosas resultantes pueden envasarse para su uso como tales, o liofilizarse, siendo la preparación liofilizada combinada con una disolución estéril antes de administración.
[0278] Las composiciones pueden contener sustancias colaboradores farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximar las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste del pH y de tamponamiento, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes, conservantes, y similares, por ejemplo, acetato sódico, lactato de sodio, cloruro sódico, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, etc.
[0279] La concentración de péptidos de la invención en las formulaciones farmacéuticas puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente el 0,1 %, normalmente el o al menos aproximadamente el 2 % a nada menos que del 20 % al 50 % o más en peso, y se seleccionará principalmente por volúmenes de fluido, viscosidades, etc., según el modo particular de administración seleccionado.
[0280] Una forma de dosis unitaria humana de una composición se incluye normalmente en una composición farmacéutica que comprende una dosis unitaria humana de un vehículo aceptable, por ejemplo, un vehículo acuoso, y se administra en un volumen/cantidad que es conocido por aquellos expertos en la materia que va a usarse para administración de tales composiciones a seres humanos (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17ª edición, A. Gennaro, Editor, Mack Publishing Co., Easton, Pennsilvania, 1985). Por ejemplo, una dosis de péptido para inmunización inicial puede ser de aproximadamente 1 a aproximadamente 50.000 µg, generalmente 100-5.000 µg, para un paciente de 70 kg. Por ejemplo, para ácidos nucleicos, una inmunización inicial puede realizarse usando un vector de expresión en forma de ácido nucleico desnudo administrado IM (o SC o ID) en las cantidades de 0,5-5 mg en múltiples sitios. El ácido nucleico (0,1 a 1000 µg) también puede administrarse usando una pistola de genes. Tras un período de incubación de 3-4 semanas, entonces se administra una dosis de refuerzo. El refuerzo puede ser virus recombinante de la viruela aviar administrado a una dosis de 5-107 a 5x109 uff.
[0281] Para anticuerpos, un tratamiento generalmente implica administración repetida de la preparación de anticuerpo anti-STEAP-1 mediante una vía de administración aceptable tal como inyección intravenosa (IV), normalmente a una dosis en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. En general, las dosis en el intervalo de 10-500 mg de mAb por semana son eficaces y bien toleradas. Además, una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal del paciente IV, seguida de dosis semanales de aproximadamente 2 mg/kg IV de la preparación de mAb anti-STEAP-1, representa una pauta de dosificación aceptable. Como se ha apreciado por aquellos expertos en la materia, diversos factores pueden influir en la dosis ideal en un caso particular. Tales factores incluyen, por ejemplo, semivida de una composición, la afinidad de unión de un Ab, la inmunogenicidad de una sustancia, el grado de expresión de STEAP-1 en el paciente, el grado de antígeno de STEAP-1 liberado circulante, el nivel de concentración en estado estacionario deseado, frecuencia de tratamiento y la influencia de agentes quimioterapéuticos u otros agentes usados en combinación con el procedimiento de tratamiento de la invención, además del estado de salud de un paciente particular. Dosis unitarias humanas preferidas no limitantes son, por ejemplo, 500 µg - 1 mg, 1 mg - 50 mg, 50 mg -100 mg, 100 mg - 200 mg, 200 mg - 300 mg, 400 mg - 500 mg, 500 mg - 600 mg, 600 mg - 700 mg, 700 mg - 800 mg, 800 mg - 900 mg, 900 mg - 1 g o 1 mg - 700 mg. En ciertas realizaciones, la dosis está en un intervalo de 2-5 mg/kg de peso corporal, por ejemplo, con seguimiento de dosis semanales de 1-3 mg/kg; 0,5 mg, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mg/kg de peso corporal seguido, por ejemplo, en dos, tres o cuatro semanas por dosis semanales; 0,5- -10 mg/kg de peso corporal, por ejemplo, seguido en dos, tres o cuatro semanas por dosis semanales; 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400 mg m2 de área corporal semanalmente: 1-600 mg m2 de área corporal semanalmente; 225-400 mg m2 de área corporal semanalmente; esto puede ir seguido de dosis semanales durante 2, 3, 4, 5, 8, 7, 8, 9, 18, 11, 12 o más semanas.
[0282] En una realización, formas de dosis unitaria humana de los polinucleótidos comprenden un intervalo de dosificación adecuada o cantidad eficaz que proporciona cualquier efecto terapéutico. Como se aprecia por un experto habitual en la materia, un efecto terapéutico depende de varios factores, que incluyen la secuencia del polinucleótido, peso molecular del polinucleótido y vía de administración. Las dosificaciones se seleccionan generalmente por el médico u otro profesional sanitario según una variedad de parámetros conocidos en la técnica, tales como gravedad de los síntomas, historia del paciente y similares. Generalmente, para un polinucleótido de aproximadamente 20 bases, un intervalo de dosificación puede seleccionarse de, por ejemplo, un límite inferior independientemente seleccionado tal como aproximadamente 0,1, 0,25, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 ó 600 mg/kg hasta un límite superior independientemente seleccionado, superior al límite inferior, de aproximadamente 80, 80, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 ó 10.000 mg/kg. Por ejemplo, una dosis puede ser aproximadamente cualquiera de las siguientes: 0,1 a 100 mg/kg, 0,1 a 50 mg/kg, 0,1 a 25 mg/kg, 0,1 a 10 mg/kg, 1 a 500 mg/kg, 100 a 400 mg/kg, 200 a 300 mg/kg, 1 a 100 mg/kg, 100 a 200 mg/kg, 300 a 400 mg/kg, 400 a 500 mg/kg, 500 a 1000 mg/kg, 500 a 5000 mg/kg o 500 a
10.000 mg/kg. Generalmente, vías parenterales de administración puede requerir mayores dosis de polinucleótido en comparación con la aplicación más directa al nucleótido a tejido enfermo, como lo hacen polinucleótidos de longitud creciente.
[0283] En una realización, formas de dosis unitaria humana de linfocitos T comprenden un intervalo de dosificación adecuado o cantidad eficaz que proporciona cualquier efecto terapéutico. Como se ha apreciado por un experto habitual en la materia, un efecto terapéutico depende de varios factores. Las dosificaciones se seleccionan generalmente por el médico u otro profesional sanitario según una variedad de parámetros conocidos en la técnica, tales como gravedad de los síntomas, historia del paciente y similares. Una dosis puede ser aproximadamente 104 células a aproximadamente 108 células, aproximadamente 103 células a aproximadamente 108 células, aproximadamente 109 a aproximadamente 1011 células, o aproximadamente 108 a aproximadamente 5 x 1010 células. Una dosis puede también aproximadamente 108 células/m2 a aproximadamente 1010 células/m2, o aproximadamente 105 células/m2 a aproximadamente 108 células/m2.
[0284] La(s) proteínas(s) de la invención, y/o ácidos nucleicos que codifican la(s) proteína(s), también pueden administrarse mediante liposomas, que pueden también servir para: 1) dirigir las proteínas(s) a un tejido particular, tal como tejido linfoide; 2) dirigir selectivamente a células enfermedades; o, 3) para aumentar la semivida de la composición de péptido. Los liposomas incluyen emulsiones, espumas, micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos, dispersiones de fosfolípidos, capas laminares y similares. En estas preparaciones, el péptido que va a administrarse se incorpora como parte de un liposoma, solo o conjuntamente con una molécula que se une a un receptor predominante entre células linfoides, tales como anticuerpos monoclonales que se unen al antígeno CD45,
o con otras composiciones terapéuticas o inmunogénicas. Así, los liposomas tanto llenos como decorados con un péptido deseado pueden dirigirse al sitio de células linfoides, en las que los liposomas administran entonces las composiciones de péptido. Liposomas para uso según la divulgación se forman a partir de lípidos formadores de vesículas convencionales que generalmente incluyen fosfolípidos neutros y negativamente cargados y un esterol, tal como colesterol. La selección de lípidos está generalmente guiada por consideración de, por ejemplo, tamaño del liposoma, inestabilidad del ácido y estabilidad de los liposomas en la corriente sanguínea. Están disponibles una variedad de procedimientos para preparar liposomas, como se describe en, por ejemplo, Szoka y col., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:487 (1980), y las patentes de EE.UU. nº 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028 y 5.019.369.
[0285] Para elegir como diana células del sistema inmunitario, un ligando que va a incorporarse en el liposoma puede incluir, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos para los determinantes de la superficie celular de las células del sistema inmunitario deseadas. Una suspensión de liposomas que contiene un péptido puede administrarse intravenosamente, localmente, tópicamente, etc., en una dosis que varía según, entre otras cosas, el modo de administración, el péptido que se administra y la fase de la enfermedad que está tratándose.
[0286] Para composiciones sólidas pueden usarse vehículos sólidos no tóxicos convencionales que incluyen, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio, y similares. Para administración por vía oral, una composición no tóxica farmacéuticamente aceptable se forma incorporando cualquiera de los excipientes normalmente empleados, tales como aquellos vehículos previamente enumerados, y generalmente el 10-95 % de principio activo, es decir, uno o más péptidos de la divulgación, y más preferentemente a una concentración del 26 %-75 %.
[0287] Para administración en aerosol, péptidos inmunogénicos se suministran preferentemente en forma finamente dividida junto con un tensioactivo y propulsor. Porcentajes típicos de péptidos son aproximadamente el 0,01 %-20 % en peso, preferentemente aproximadamente el 1 %-10 %. El tensioactivo debe ser, por supuesto, no tóxico, y preferentemente soluble en el propulsor. Representativo de tales agentes son los ésteres o ésteres parciales de ácidos grasos que contienen de aproximadamente 6 a 22 átomos de carbono, tales como ácidos caproico, octanoico, láurico, palmítico, esteárico, linoleico, linolenico, olestérico y oleico con un alcohol polihidroxilado alifático o su anhídrido cíclico. Pueden emplearse ésteres mixtos, tales como glicéridos mixtos o naturales. El tensioactivo puede constituir aproximadamente el 0,1 %-20 % en peso de la composición, preferentemente aproximadamente el 0,25-6 %. El resto de la composición es generalmente propulsor. Un vehículo también puede incluirse, según se desee, como sucede con, por ejemplo, lecitina para administración intranasal.
XI.) Realizaciones de diagnóstico y pronóstico de STEAP-1
[0288] Como se desvela en el presente documento, los polinucleótidos STEAP-1, polipéptidos, linfocitos T citotóxicos reactivos (CTL), linfocitos T colaboradores reactivos (HTL) y anticuerpos anti-polipéptido se usan en ensayos de diagnóstico, pronóstico y terapéuticos muy conocidos que examinan condiciones asociadas a crecimiento celular desregulado tal como cáncer, en particular los cánceres enumerados en la Tabla I (véase, por ejemplo, tanto su patrón específico de expresión de tejido, además de su expresión en exceso en ciertos cánceres, como se describe, por ejemplo, en el ejemplo titulado “Análisis de expresión de STEAP-1 en tejidos normales y especímenes de paciente”).
[0289] STEAP-1 puede analogizarse a un antígeno asociado a la próstata PSA, el marcador arquetípico que ha sido usado por los médicos durante años para identificar y monitorizar la presencia de cáncer de próstata (véanse, por ejemplo, Merrill y col., J. Urol. 163(2): 503-6120 (2000); Polascik y col., J. Urol. Aug; 162(2):293-308 (1999) y Fortier y col., J. Nat. Cancer Inst. 91 (19): 1635-1640(1999)). Una variedad de otros arcadores de diagnóstico también se usan en contextos similares que incluyen p53 y K-ras (véanse, por ejemplo, Tulchinsky y col., Int J Mol Med 1999 Jul 4(1):99-102 y Minimoto y col., Cancer Detect Prev 2000; 24(1):1-12). Por tanto, la presente divulgación de polinucleótidos y polipéptidos STEAP-1 (además de sondas de polinucleótidos STEAP-1 y anticuerpos anti-STEAP-1 usados para identificar la presencia de estas moléculas) y sus propiedades permiten que expertos en la materia utilicen estas moléculas en procedimientos que son análogos a aquellos usados, por ejemplo, en una variedad de ensayos de diagnóstico dirigidos a examinar afecciones asociadas a cáncer.
[0290] Los procedimientos de diagnóstico típicos que utilizan los polinucleótidos STEAP-1, polipéptidos, linfocitos T reactivos y anticuerpos son análogos a aquellos procedimientos de ensayos de diagnóstico bien establecidos que emplean, por ejemplo, polinucleótidos de PSA, polipéptidos, linfocitos T reactivos y anticuerpos. Por ejemplo, precisamente como los polinucleótidos de PSA se usan como sondas (por ejemplo, en análisis de Northern, véase, por ejemplo, Sharief y col., Biochem. Mol. Biol. Int,33(3):567-74(1994)) y cebadores (por ejemplo, en análisis por PCR, véase, por ejemplo, Okegawa y col., J. Urol,163(4): 1189-1190 (2000)) para observar la presencia y/o el nivel de ARNm de PSA en procedimientos de monitorizar la expresión en exceso de PSA o las metástasis de cánceres de próstata, los polinucleótidos STEAP-1 descritos en el presente documento pueden utilizarse de la misma forma para detectar la expresión en exceso de STEAP-1 o la metástasis de próstata y otros cánceres que expresan este gen. Alternativamente, precisamente como los polipéptidos de PSA se usan para generar anticuerpos específicos para PSA que luego pueden usarse para observar la presencia y/o el nivel de proteínas de PSA en procedimientos para monitorizar la expresión en exceso de proteínas de PSA (véase, por ejemplo, Stephan y col., Urology 55(4):560-3 (2000)) o la metástasis de células de próstata (véase, por ejemplo, Alanen y col., Pathol. Res. Pract. 192(3):233-7 (1996)), los polipéptidos STEAP-1 descritos en el presente documento pueden utilizarse para generar anticuerpos para su uso en detectar la expresión en exceso de STEAP-1
o la metástasis de células de próstata y células de otros cánceres que expresan este gen.
[0291] Específicamente, debido a que las metástasis implican el movimiento de células cancerosas de un órgano de origen (tal como el pulmón o próstata, etc.) a un área diferente del cuerpo (tal como un ganglio linfático), los ensayos que examinan una muestra biológica para la presencia de células que expresan polinucleótidos y/o polipéptidos STEAP-1 pueden usarse para proporcionar pruebas de metástasis. Por ejemplo, si se encuentra que una muestra biológica de tejido que normalmente no contiene células que expresan STEAP-1 (ganglio linfático) contiene células que expresan STEAP-1 tales como la expresión de STEAP-1 observada en LAPC4 y LAPC9, xenoinjertos aislados de ganglio linfático y metástasis de hueso, respectivamente, este hallazgo es indicativo de metástasis.
[0292] Alternativamente, los polinucleótidos y/o polipéptidos STEAP-1 pueden usarse para proporcionar pruebas de cáncer, por ejemplo, cuando se encuentra que las células en una muestra biológica que normalmente no expresa STEAP-1 o expresa STEAP-1 a un nivel diferente expresan STEAP-1 o tienen un aumento de expresión de STEAP-1 (véase, por ejemplo, la expresión de STEAP-1 en los cánceres enumerados en la Tabla I y en muestras de paciente, etc., mostradas en las figuras adjuntas). En tales ensayos, los expertos pueden desear adicionalmente generar pruebas complementarias de metástasis para probar la muestra biológica para la presencia de un segundo marcador limitado a tejido (además de STEAP-1) tal como PSA, PSCA, etc. (véase, por ejemplo, Alanen y col., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1996)).
[0293] El uso de inmunohistoquímica para identificar la presencia de un polipéptido STEAP-1 dentro de una sección de tejido puede indicar un estado alterado de ciertas células dentro de ese tejido. Es bien entendido en la materia que la capacidad de un anticuerpo para localizar un polipéptido que se expresa en células cancerosas es una forma de diagnosticar la presencia de enfermedad, estado de enfermedad, progresión y/o agresividad del tumor. Un anticuerpo tal también puede detectar una distribución alterada del polipéptido dentro de las células cancerosas, con respecto a tejido no maligno correspondiente.
[0294] El polipéptido STEAP-1 y composiciones inmunogénicas también son útiles en vista de los fenómenos de localización de proteínas subcelulares alteradas en estados de enfermedad. La alteración de células de estado normal a enfermo produce cambios en la morfología celular y está frecuentemente asociada a cambios en la localización/distribución de proteína subcelular. Por ejemplo, las proteínas de la membrana celular que se expresan de un modo polarizado en células normales pueden alterarse en enfermedad, produciendo distribución de la proteína de un modo no polar sobre toda la superficie celular.
[0295] El fenómeno de localización de proteínas subcelulares alteradas en un estado de enfermedad se ha demostrado con la expresión de proteínas MUC1 y Her2 usando medios inmunohistoquímicos. Las células epiteliales normales tienen una distribución apical típica de MUC1, además de alguna localización supranuclear de la glucoproteína, mientras que las lesiones malignas frecuentemente demuestran un patrón de tinción apolar (Diaz y col., The Breast Journal, 7; 40-45 (2001); Zhang y col., Clinical Cancer Research, 4; 2669-2676 (1998): Cao y col., The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 45:1547-1557 (1997)). Además, el epitelio de mama normal es tanto negativo para proteína Her2 como presenta sólo una distribución basolateral, mientras que células malignas pueden expresar la proteína sobre la superficie celular completa (De Potter y col., International Journal of Cancer, 44; 969-974 (1989): McCormick y col., 117; 935-943 (2002)). Alternativamente, la distribución de la proteína puede alterarse en una única localización de superficie para incluir expresión citoplásmica difusa en el estado de enfermo. Un ejemplo tal puede observarse con MUC1 (Diaz y col., The Breast Journal, 7: 40-45 (2001)).
[0296] La alteración en la localización/distribución de una proteína en la célula, como se detecta por procedimientos inmunohistoquímicos, también puede proporcionar información valiosa referente a la favorabilidad de ciertas modalidades de tratamiento. Este último punto se ilustra por una situación en la que una proteína puede ser intracelular en tejido normal, pero estar en la superficie celular en células malignas; la localización de la superficie celular hace que las células sean favorablemente aceptadas para pautas de diagnóstico y de tratamiento basadas en anticuerpo. Cuando una alteración tal de la localización de proteínas se produce para STEAP-1, la proteína STEAP-1 y las respuestas inmunitarias relacionadas con la misma son muy útiles. Por consiguiente, la capacidad para determinar si la alteración de la localización de proteínas subcelulares se produjo para 24P4C12 o no hace que la proteína STEAP-1 y las respuestas inmunitarias relacionadas con la misma sean muy útiles. El uso de las composiciones de STEAP-1 permite que aquellos expertos en la materia tomen importantes decisiones de diagnóstico y terapéuticas.
Los reactivos inmunohistoquímicos específicos para STEAP-1 también son útiles para detectar metástasis de tumores que expresan STEAP-1 cuando el polipéptido aparece en tejidos en los que normalmente no se produce STEAP-1.
[0297] Por tanto, los polipéptidos STEAP-1 y anticuerpos resultantes de respuestas inmunitarias a los mismos son útiles en una variedad de contextos importantes tales como fines de diagnóstico, pronóstico, preventivos y/o terapéuticos conocidos para aquellos expertos en la materia.
[0298] Precisamente, como los fragmentos de polinucleótidos de PSA y variantes de polinucleótidos son empleados por expertos en la materia para su uso en procedimientos de monitorizar PSA, los fragmentos de polinucleótidos STEAP-1 y variantes de polinucleótidos se usan de un modo análogo. En particular, polinucleótidos de PSA típicos usados en procedimientos de monitorizar PSA son sondas o cebadores que consisten en fragmentos de la secuencia de ADNc de PSA. Ilustrando esto, los cebadores usados para PCR amplifican un polinucleótido de PSA que debe incluir menos de una secuencia de PSA completa para funcionar en la reacción en cadena de la polimerasa. En el contexto de tales reacciones de PCR, los expertos en la materia generalmente crean una variedad de fragmentos de polinucleótidos diferentes que pueden usarse como cebadores con el fin de amplificar diferentes porciones de un polinucleótido de interés, o para optimizar reacciones de amplificación (véanse, por ejemplo, Caetano-Anolles, G. Biotechniques 25(3): 472-476, 478-480 (1998); Robertson y col., Methods Mol. Biol. 98:121-154 (1998)). Una ilustración adicional del uso de tales fragmentos se proporciona en el ejemplo titulado “Análisis de expresión de STEAP-1 en tejidos normales y especímenes de paciente” en el que un fragmento de polinucleótidos STEAP-1 se usa como sonda para mostrar la expresión de ARN de STEAP-1 en células cancerosas. Además, las secuencias de polinucleótidos variantes se usan normalmente como cebadores y sondas para los ARNm correspondientes en análisis de PCR y Northern (véanse, por ejemplo, Sawai y col., Fetal Diagn. Ther. 1996 Nov-Dec 11(6):407-13 y Current Protocols In Molecular Biology, volumen 2, Unidad 2, Frederick M. Ausubel y col., eds., 1995)). Los fragmentos y variantes de polinucleótidos son útiles en este contexto en el que pueden unirse a una secuencia de polinucleótidos diana (por ejemplo, un polinucleótido STEAP-1 mostrado en la Figura 2 o variante del mismo) en condiciones de alta rigurosidad.
[0299] Además, los polipéptidos de PSA que contienen un epítope que puede reconocerse por un anticuerpo
o linfocito T que se une específicamente a ese epítope se usan en procedimientos de monitorizar PSA. Los fragmentos de polipéptidos STEAP-1 y análogos o variantes de polipéptidos también pueden usarse de un modo análogo. Esta práctica de uso de fragmentos de polipéptidos o variantes de polipéptidos para generar anticuerpos (tal como anticuerpos anti-PSA o linfocitos T) es típica en la materia con una amplia variedad de sistemas tales como proteínas de fusión que se usan por médicos (véase, por ejemplo, Current Protocols In Molecular Biology, volumen 2, Unidad 16, Frederick M. Ausubel y col., eds., 1995). En este contexto, cada epítope funciona proporcionando la arquitectura con la que un anticuerpo o linfocito T es reactivo. Normalmente, los expertos en la materia crean una variedad de fragmentos de polipéptidos diferentes que pueden usarse con el fin de generar respuestas inmunitarias específicas para diferentes porciones de un polipéptido de interés (véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº
5.840.501 y la patente de EE.UU. nº 5.939.533). Por ejemplo, puede ser preferible utilizar un polipéptido que comprende uno de los motivos biológicos de STEAP-1 tratados en el presente documento o una subsecuencia que lleva motivos que es fácilmente identificada por un experto en la materia basándose en los motivos disponibles en la materia. Los fragmentos de polipéptidos, variantes o análogos son normalmente útiles en este contexto en tanto que comprendan un epítope que pueda generar un anticuerpo o linfocito T específico para una secuencia de polipéptidos diana (por ejemplo, un polipéptido STEAP-1 mostrado en la Figura 3).
[0300] Como se muestra en el presente documento, los polinucleótidos y polipéptidos STEAP-1 (además de las sondas de polinucleótidos STEAP-1 y anticuerpos anti-STEAP-1 o linfocitos T usados para identificar la presencia de estas moléculas) presentan propiedades específicas que hace que sean útiles en diagnosticar cánceres tales como aquellos enumerados en la Tabla I. Los ensayos de diagnóstico que miden la presencia de productos del gen STEAP-1, con el fin de evaluar la presencia o aparición de una condición de enfermedad descrita en el presente documento, tal como cáncer de próstata, se usan para identificar pacientes para medidas preventivas
o monitorizar adicionalmente, como se ha hecho así satisfactoriamente con PSA. Además, estos materiales satisfacen una necesidad en la materia para moléculas que tienen características similares o complementarias a PSA en situaciones en las que, por ejemplo, no puede hacerse un diagnóstico definitivo de metástasis de origen prostático basándose en una prueba para PSA solo (véase, por ejemplo, Alanen y col., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1996)) y, por consiguiente, necesitan emplearse materiales tales como polinucleótidos y polipéptidos STEAP-1 (además de las sondas de polinucleótidos STEAP-1 y anticuerpos anti-STEAP-1 usados para identificar la presencia de estas moléculas) para confirmar una metástasis de origen prostático.
[0301] Finalmente, además de su uso en ensayos de diagnóstico, los polinucleótidos STEAP-1 desvelados en el presente documento tienen varias otras utilidades tales como su uso en la identificación de anomalías oncogenéticas asociadas a cromosómicas en la región cromosómica con la que el gen STEAP-1 se mapea (véase el ejemplo titulado “Mapeo cromosómico de STEAP-1” más adelante). Además, además de su uso en ensayos de diagnóstico, las proteínas y polinucleótidos relacionados con STEAP-1 desvelados en el presente documento tienen otras utilidades tales como su uso en el análisis forense de tejidos de origen desconocido (véase, por ejemplo, Takahama K Forensic Sci Int 1996 Jun 28;80(1-2): 63-9).
[0302] Adicionalmente, las proteínas o polinucleótidos relacionados con STEAP-1 pueden usarse para tratar una afección patológica caracterizada por la expresión en exceso de STEAP-1. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos de la Figura 2 o la Figura 3, o fragmentos de cualquiera de ellas, puede usarse para generar una respuesta inmunitaria a un antígeno de STEAP-1. Anticuerpos u otras moléculas que reaccionan con STEAP-1 pueden usarse para modular la función de esta molécula, y así proporcionar un beneficio terapéutico.
XII.) Inhibición de la función de proteínas STEAP-1
[0303] La divulgación incluye diversos procedimientos y composiciones para inhibir la unión de STEAP-1 a su componente de unión o su asociación con otra(s) proteína(s), además de procedimientos para inhibir la función de STEAP-1.
XII.A.) Inhibición de STEAP-1 con anticuerpos intracelulares
[0304] En una estrategia, un vector recombinante que codifica anticuerpos monocatenarios que se unen específicamente a STEAP-1 se introducen en células que expresan STEAP-1 mediante tecnologías de transferencia de genes. Por consiguiente, el anticuerpo anti-STEAP-1 monocatenario codificado se expresa intracelularmente, se une a proteína STEAP-1, y así inhibe su función. Procedimientos para manipular tales anticuerpos monocatenarios
intracelulares son muy conocidos. Tales anticuerpos intracelulares, también conocidos como “intracuerpos”, son
elegidos específicamente como diana para un compartimento particular dentro de la célula, proporcionando control sobre donde se centra la actividad inhibidora del tratamiento. Esta tecnología se ha aplicado satisfactoriamente en la materia (para una revisión véase Richardson y Marasco, 1995, TIBTECH vol. 13). Se ha mostrado que los intracuerpos eliminan prácticamente la expresión de receptores de la superficie celular de otro modo abundantes (véase, por ejemplo, Richardson y col., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3137-3141; Beerii y col., 1994, J. Biol. Chem. 289: 23931-23936; Deshane y col., 1994, Gene Ther. 1: 332-337).
[0305] Los anticuerpos monocatenarios comprenden los dominios variables de la cadena pesada y ligera unidos por un polipéptido ligador flexible, y se expresan como un único polipéptido. Opcionalmente, los anticuerpos monocatenarios se expresan como un fragmento de la región variable monocatenario unido a la región constante de la cadena ligera. Señales de tráfico intracelulares bien conocidas se manipulan en vectores de polinucleótido recombinantes que codifican tales anticuerpos monocatenarios con el fin de elegir como diana precisamente el intracuerpo para el compartimento intracelular deseado. Por ejemplo, los intracuerpos elegidos como diana para el retículo endoplásmico (RE) se manipulan para incorporar un péptido líder y, opcionalmente, una señal de retención del RE del extremo C, tal como el motivo de aminoácido KDEL. Los intracuerpos previstos para ejercer actividad en el núcleo se manipulan para incluir una señal de localización nuclear. Restos de lípidos se unen a intracuerpos con el fin de unir el intracuerpo al lado citosólico de la membrana plasmática. Los intracuerpos también pueden ser elegidos como diana para ejercer una función en el citosol. Por ejemplo, se usan intracuerpos citosólicos para secuestrar factores dentro del citosol, previniendo así que sean transportados a su destino celular natural.
[0306] Los intracuerpos pueden usarse para capturar STEAP-1 en el núcleo, previniendo así su actividad dentro del núcleo. Las señales que eligen como diana el núcleo se manipulan en tales intracuerpos de STEAP-1 con el fin de lograr la elección de diana deseada. Tales intracuerpos de STEAP-1 se diseñan para unirse específicamente a un dominio de STEAP-1 particular. Los intracuerpos citosólicos que se unen específicamente a una proteína STEAP-1 pueden usarse para prevenir que STEAP-1 acceda al núcleo, previniendo así que ejerza cualquier actividad biológica dentro del núcleo (por ejemplo, previniendo que STEAP-1 forme complejos de transcripción con otros factores).
[0307] Con el fin de dirigir específicamente la expresión de tales intracuerpos a células particulares, la transcripción del intracuerpo se pone bajo el control regulador de un promotor específico de tumor apropiado y/o potenciador. Con el fin de elegir como diana la expresión del intracuerpo específicamente para próstata puede utilizarse, por ejemplo, el promotor y/o promotor/potenciador de PSA (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº
5.919.652 concedida el 6 de julio de 1999).
XII.B.) Inhibición de STEAP-1 con proteínas recombinantes
[0308] En otra estrategia, moléculas recombinantes se unen a STEAP-1 y así inhiben la función de STEAP-1. Por ejemplo, estas moléculas recombinantes previenen o inhiben que STEAP-1 acceda/se una a su(s) componente(s) de unión o se asocie a otra(s) proteína(s). Tales moléculas recombinantes pueden, por ejemplo, contener la(s) parte(s) reactiva(s) de una molécula específica de anticuerpo para STEAP-1. El dominio de unión de STEAP-1 de un componente de unión de STEAP-1 puede manipularse en una proteína de fusión dimérica, por lo que la proteína de fusión comprende dos dominios de unión a ligando de STEAP-1 ligados a la porción Fc de una IgG humana, tal como IgG1 humana. Tal porción de IgG puede contener, por ejemplo, los dominios CH2 y CH3 y la región bisagra, pero no el dominio CH1. Tales proteínas de fusión diméricas se administran en forma soluble a pacientes que padecen un cáncer asociado a la expresión de STEAP-1, por lo que la proteína de fusión dimérica se une específicamente a STEAP-1 y bloquea la interacción de STEAP-1 con un componente de unión. Tales proteínas de fusión diméricas se combinan adicionalmente en proteínas multiméricas usando tecnologías de enlace de anticuerpos conocidas.
XII.C.) Inhibición de la transcripción o traducción de STEAP-1
[0309] La presente divulgación también comprende diversos procedimientos y composiciones para inhibir la transcripción del gen STEAP-1. Similarmente, la divulgación también proporciona procedimientos y composiciones para inhibir la traducción de ARNm de STEAP-1 en proteína.
[0310] En una estrategia, un procedimiento para inhibir la transcripción del gen STEAP-1 comprende poner en contacto el gen STEAP-1 con un polinucleótido antisentido de STEAP-1. En otra estrategia, un procedimiento para inhibir la traducción de ARNm de STEAP-1 comprende poner en contacto un ARNm de STEAP-1 con un polinucleótido antisentido. En otra estrategia se usa una ribozima específica de STEAP-1 para escindir un mensajero de STEAP-1, inhibiendo así la traducción. Tales procedimientos antisentido y basados en ribozima también pueden dirigirse a las regiones reguladoras del gen STEAP-1, tales como elementos promotores y/o potenciadores de STEAP-1. Similarmente, proteínas que pueden inhibir un factor de transcripción del gen STEAP-1 se usan para inhibir la transcripción de ARNm de STEAP-1. Anteriormente se han descrito diversos polinucleótidos y composiciones útiles en los procedimientos anteriormente mencionados. El uso de moléculas antisentido y de ribozima para inhibir la transcripción y traducción es muy conocido en la técnica.
[0311] Otros factores que inhiben la transcripción de STEAP-1 interfiriendo con la activación transcripcional de STEAP-1 también son útiles para tratar cánceres que expresan STEAP-1. Similarmente, factores que interfieren con el procesamiento de STEAP-1 son útiles para tratar cánceres que expresan STEAP-1. Los procedimientos de tratamiento de cáncer que utilizan tales factores también están dentro del alcance de la divulgación.
XII.D.) Consideraciones generales para estrategias terapéuticas
[0312] Pueden usarse tecnologías de transferencia génica y terapia génica para administrar moléculas de polinucleótido terapéuticas a células tumorales que sintetizan STEAP-1 (es decir, antisentido, ribozima, polinucleótidos que codifican intracuerpos y otras moléculas inhibidoras de STEAP-1). Se conocen varias estrategias de terapia génica en la técnica. Vectores recombinantes que codifican polinucleótidos antisentido de STEAP-1, ribozimas, factores que pueden interferir con la transcripción de STEAP-1, etc., pueden administrarse a células tumorales diana usando tales estrategias de terapia génica.
[0313] Las anteriores estrategias terapéuticas pueden combinarse con una cualquiera de una amplia variedad de pautas quirúrgicas, de quimioterapia o radioterapia. Las estrategias terapéuticas de la divulgación pueden permitir el uso de dosificaciones reducidas de quimioterapia (u otras terapias) y/o administración menos frecuente, una ventaja para todos los pacientes y particularmente para aquellos que no toleran bien la toxicidad del agente quimioterapéutico.
[0314] La actividad antitumoral de una composición particular (por ejemplo, antisentido, ribozima, intracuerpo), o una combinación de tales composiciones, puede evaluarse usando diversos sistemas de ensayo in vitro e in vivo. Los ensayos in vitro que evalúan la actividad terapéutica incluyen ensayos de crecimiento celular, ensayos en agar blando y otros ensayos indicativos de actividad promotora de tumores, ensayos de unión que pueden determinar el grado al que una composición terapéutica inhibirá la unión de STEAP-1 a un componente de unión, etc.
[0315] In vivo, el efecto de una composición terapéutica de STEAP-1 puede evaluarse en un modelo animal adecuado. Por ejemplo, pueden usarse modelos de cáncer de próstata xenogénico, en los que explantes de cáncer de próstata humanos o tejidos de xenoinjerto sometidos a pases se introducen en animales inmunodeprimidos, tales como ratones desnudos o SCID (Klein y col., 1997, Nature Medicine 3:402-408). Por ejemplo, la solicitud de patente PCT WO98/16628 y la patente de EE.UU. 6.107.540 describen diversos modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata humano que pueden recapitular el desarrollo de tumores primarios, micrometástasis y formación de metástasis osteoblásticas características de enfermedad en fase tardía. La eficacia puede predecirse usando ensayos que miden la inhibición de la formación de tumor, regresión o metástasis de tumor, y similares.
[0316] Ensayos in vivo que evalúan la promoción de apoptosis son útiles en evaluar composiciones terapéuticas. En una realización, xenoinjertos de ratones que llevan tumor tratados con la composición terapéutica pueden examinarse para la presencia de focos apoptósicos y compararse con ratones que llevan xenoinjertos de control sin tratar. El grado al que los focos apoptósicos se encuentran en los tumores de los ratones tratados proporciona una indicación de la eficacia terapéutica de la composición.
[0317] Las composiciones terapéuticas usadas en la práctica de los anteriores procedimientos pueden formularse en composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo adecuado para el procedimiento de administración deseado. Vehículos adecuados incluyen cualquier material que, cuando se combine con la composición terapéutica, retenga la función antitumoral de la composición terapéutica y sean generalmente no reactivos con el sistema inmunitario del paciente. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, distintos vehículos farmacéuticos convencionales tales como solución salina tamponada estéril con disoluciones de fosfato, agua bacteriostática y similares (véase, generalmente, Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª edición, A. Osal., Ed., 1980).
[0318] Las formulaciones terapéuticas pueden solubilizarse y administrarse por cualquier vía que pueda administrar la composición terapéutica al sitio del tumor. Vías de administración potencialmente eficaces incluyen, pero no se limitan a, intravenosa, parenteral, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica, intraorgánica, ortotópica y similares. Una formulación para inyección intravenosa comprende la composición terapéutica en una disolución de agua bacteriostática preservada, agua sin preservar estéril y/o diluida en bolsas de poli(cloruro de vinilo) o polietileno que contienen 0,9 % de cloruro sódico estéril para inyección, USP. Las preparaciones de proteína terapéuticas pueden liofilizarse y guardarse como polvos estériles, preferentemente a vacío, y luego reconstituirse en agua bacteriostática (que contiene, por ejemplo, conservante de alcohol bencílico) o en agua estéril antes de la inyección.
[0319] Las dosificaciones y protocolos de administración para el tratamiento de cánceres usando los anteriores procedimientos variarán con el procedimiento y el cáncer diana, y generalmente dependerán de varios otros factores apreciados en la materia.
XIII.) Identificación, caracterización y uso de moduladores de STEAP-1
Procedimientos para identificar y usar moduladores
[0320] Puede realizarse cribado para identificar moduladores que inducen o suprimen un perfil de expresión particular, suprimen o inducen rutas específicas, generando así preferentemente el fenotipo asociado. Habiendo identificado genes diferencialmente expresados importantes en un estado particular, pueden realizarse cribados para identificar moduladores que alteran la expresión de genes individuales, tanto aumentan como disminuyen. El cribado puede realizarse para identificar moduladores que alteran una función biológica del producto de expresión de un gen diferencialmente expresado. De nuevo, habiendo identificado la importancia de un gen en un estado particular, los cribados se realizan para identificar agentes que se unen y/o modulan la actividad biológica del producto génico.
[0321] Además, los cribados se hacen para genes que se inducen en respuesta a un agente candidato después de identificar un modulador (uno que suprime un patrón de expresión de cáncer que conduce a un patrón de expresión normal, o un modulador de un gen de cáncer que conduce a expresión del gen como en tejido normal). Un cribado se realiza para identificar genes que son específicamente modulados en respuesta al agente. El comparar perfiles de expresión entre tejido normal y tejido de cáncer tratado con agente revela genes que no se expresan en tejido normal o tejido de cáncer, pero se expresan en tejido tratado con agente, y viceversa. Estas secuencias específicas de agente se identifican y se usan mediante procedimientos descritos en el presente documento para genes o proteínas de cáncer. En particular, estas secuencias y las proteínas que codifican se usan en marcado e identificación de células tratadas con agente. Además, los anticuerpos se producen contra las proteínas inducidas por agente y se usan para elegir como diana novedosos terapéuticos para la muestra de tejido de cáncer tratada.
Identificación relacionada con modulador y ensayos de cribado:
Ensayos relacionados con la expresión génica
[0322] Proteínas, ácidos nucleicos y anticuerpos de la divulgación se usan en ensayos de cribado. Las proteínas, anticuerpos, ácidos nucleicos, proteínas modificadas y células asociadas al cáncer que contienen estas secuencias se usan en ensayos de cribado, tales como evaluación del efecto de fármacos candidatos basándose en un “perfil de expresión génica, perfil de expresión de polipéptidos o alteración de la función biológica. Los perfiles de expresión pueden usarse, preferentemente conjuntamente con técnicas de cribado de alto rendimiento, para permitir monitorizar genes del perfil de expresión después del tratamiento con un agente candidato (por ejemplo, Davis, GF y col., J Biol Screen 7:69 (2002); Zlokamik y col., Science 279:84-8 (1998); Held, Genome Res 6:986-94,1996).
[0323] Las proteínas, anticuerpos, ácidos nucleicos, proteínas modificadas y células del cáncer que contienen las proteínas o genes del cáncer nativos o modificados se usan en ensayos de cribado. Es decir, la presente divulgación comprende procedimientos para cribar composiciones que modulan el fenotipo del cáncer o una función fisiológica de una proteína del cáncer de la divulgación. Esto se hace en un mismo gen o evaluando el efecto de
fármacos candidatos basándose en un “perfil de expresión génica” o función biológica. Los perfiles de expresión
pueden usarse, preferentemente conjuntamente con técnicas de cribado de alto rendimiento, para permitir monitorizar después del tratamiento con un agente candidato, véase Zlokamik, arriba,
[0324] Se ejecutan una variedad de ensayos dirigidos a los genes y proteínas de la divulgación. Los ensayos se ejecutan en un ácido nucleico individual o nivel de proteínas. Es decir, habiendo identificado un gen particular como regulado por incremento en cáncer, los compuestos de prueba se criban para la capacidad para modular expresión génica o para unirse a la proteína de cáncer de la divulgación “Modulación” en este contexto incluye un aumento o una disminución en la expresión génica. La cantidad preferida de modulación dependerá del cambio original de la expresión génica en tejido normal frente a tejido que sufre cáncer, con cambios de al menos el 10 %, preferentemente del 50 %, más preferentemente del 100-300 %, y en algunas realizaciones del 300-1000 % o mayor. Así, si un gen presenta un aumento de 4 veces en tejido de cáncer en comparación con tejido normal, frecuentemente se desea una disminución de aproximadamente cuatro veces; similarmente, una disminución de 10 veces en tejido de cáncer en comparación con tejido normal. Frecuentemente se desea un valor diana de un aumento de 10 veces en la expresión por el compuesto de prueba. Moduladores que exacerban el tipo de expresión génica observada en cáncer también son útiles, por ejemplo, como una diana regulada por incremento en análisis adicionales.
[0325] La cantidad de expresión génica se monitoriza usando sondas de ácido nucleico y la cuantificación de niveles de expresión génica, o, alternativamente, se monitoriza un propio producto génico, por ejemplo, mediante el uso de anticuerpos para la proteína del cáncer e inmunoensayos convencionales. La proteómica y las técnicas de separación también permiten la cuantificación de la expresión.
Monitorización de la expresión para identificar compuestos que modifican la expresión génica
[0326] La monitorización de la expresión génica, es decir, un perfil de expresión, puede monitorizarse simultáneamente para varias entidades. Tales perfiles normalmente implicarán uno o más de los genes de la Figura
2. Aquí, por ejemplo, sondas de ácido nucleico para cáncer se unen a biochips para detectar y cuantificar secuencias de cáncer en una célula particular. Alternativamente puede usarse PCR. Así, una serie, por ejemplo, pocillos de una placa de microtitulación, puede usarse con cebadores dispensados en los pocillos deseados. Entonces puede realizarse una reacción de PCR y analizarse para cada pocillo.
[0327] La monitorización de la expresión se realiza para identificar compuestos que modifican la expresión de una o más secuencias asociadas al cáncer, por ejemplo, una secuencia de polinucleótidos expuesta en la Figura 2. Generalmente, un modulador de prueba se añade a las células antes del análisis. Además, también se proporcionan cribados para identificar agentes que modulan cáncer, modulan proteínas del cáncer de la divulgación, se unen a una proteína del cáncer de la divulgación, o interfieren con la unión de una proteína del cáncer de la divulgación y un anticuerpo u otro componente de unión.
[0328] Procedimientos de cribado de alto rendimiento pueden implicar proporcionar una biblioteca que contiene un gran número de posibles compuestos terapéuticos (compuestos candidatos). Tales “bibliotecas químicas combinatorias” se criban entonces en uno o más ensayos para identificar aquellos miembros de la biblioteca
(especies químicas particulares o subclases) que muestran una actividad característica deseada. Los compuestos
así identificados puede servir de “compuestos cabeza de serie” convencionales, como compuestos para cribar, o
como terapéuticos.
[0329] Bibliotecas combinatorias de posibles moduladores pueden cribarse para una capacidad para unirse a un polipéptido de cáncer o para modular actividad. Convencionalmente se generan nuevas entidades químicas con
propiedades útiles identificando un compuesto químico (llamado un “compuesto cabeza de serie”) con alguna
propiedad o actividad deseable, por ejemplo, que inhibe la actividad, que crea variantes del compuesto cabeza de serie y que evalúa la propiedad y actividad de aquellos compuestos de variante. Frecuentemente se emplean procedimientos de cribado de alto rendimiento (HTS) para un análisis tal.
[0330] Como se observa anteriormente, la monitorización de la expresión génica se usa convenientemente para probar moduladores candidatos (por ejemplo, proteína, ácido nucleico o molécula pequeña). Después de que el agente candidato se haya añadido y dejado que las células se incuben durante un periodo, la muestra que contiene una secuencia diana que va a analizarse se añade, por ejemplo, a un biochip.
[0331] Si se requiere, la secuencia diana se prepara usando técnicas conocidas. Por ejemplo, una muestra se trata para lisar las células, usando tampones de lisis conocidos, electroporación, etc., con purificación y/o amplificación tal como PCR realizada según convenga. Por ejemplo, se realiza una transcripción in vitro con marcas covalentemente unidas a los nucleótidos. Generalmente, los ácidos nucleicos se marcan con biotina-FITC o PE, o con cy3 o cy5.
[0332] La secuencia diana puede marcarse, por ejemplo, con una señal fluorescente, una quimioluminiscente, una química o una radiactiva para proporcionar un medio de detección de la unión específica de la secuencia diana a una sonda. La marca también puede ser una enzima, tal como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante que, cuando se provee de un sustrato apropiado, produce un producto que se detecta. Alternativamente, la marca es un compuesto marcado o molécula pequeña, tal como un inhibidor de enzima, que se une, pero que no está catalizado o alterado, por la enzima. La marca también puede ser un resto o compuesto, tal como una marca de epítope o biotina que se une específicamente a estreptavidina. Para el ejemplo de biotina, la estreptavidina se marca como se ha descrito anteriormente, proporcionando así una señal detectable para la secuencia diana unida. La estreptavidina marcada sin unir se elimina normalmente antes del análisis.
[0333] Como será apreciado por aquellos expertos en la materia, estos ensayos pueden ser ensayos de
hibridación directos o pueden comprender “ensayos tipo sándwich”, que incluyen el uso de múltiples sondas, como
generalmente se explica resumidamente en las patentes de EE.UU. nº 5.681.702; 5.597.909; 5.545.730; 5.594.117; 5.591.584; 5.571.670; 5.580.731; 5.571.670; 5.591.584; 5.624.802; 5.635.352; 5.594.118; 5.359.100; 5.124.246; y
5.681.697. En general, el ácido nucleico diana se prepara como se explica resumidamente anteriormente, y luego se añade al biochip que comprende una pluralidad de sondas de ácido nucleico, en condiciones que permiten la formación de un complejo de hibridación.
[0334] Se usan una variedad de condiciones de hibridación en la presente divulgación, que incluyen condiciones de alta, moderada y baja rigurosidad, como se explica resumidamente anteriormente. Los ensayos se ejecutan generalmente bajo condiciones de rigurosidad que permiten la formación del complejo de hibridación de la sonda marcada solo en presencia de diana. La rigurosidad puede controlarse alterando un parámetro de etapa que es una variable termodinámica, que incluye, pero no se limita a, temperatura, concentración de formamida, concentración de sales, concentración de sales caotrópicas, pH, concentración de disolvente orgánico, etc. Estos parámetros también pueden usarse para controlar unión no específica, como generalmente se explica resumidamente en la patente de EE.UU. nº 5.681.697. Así, puede desearse realizar ciertas etapas a mayores condiciones de rigurosidad para reducir la unión no específica.
[0335] Las reacciones resumidamente explicadas en el presente documento pueden llevarse a cabo en una variedad de formas. Los componentes de la reacción pueden añadirse simultáneamente, o secuencialmente, en diferentes órdenes, con ejemplos preferidos resumidamente explicados más adelante. Además, la reacción puedeincluir una variedad de otros reactivos. Éstos incluyen sales, tampones, proteínas neutras, por ejemplo, albúmina, detergentes, etc., que pueden usarse para facilitar la hibridación y detección óptima, y/o reducir interacciones no específicas o de referencia. Reactivos que de otro modo mejoran la eficiencia del ensayo, tales como inhibidores de proteasas, inhibidores de nucleasas, agentes antimicrobianos, etc., también pueden usarse según convenga, dependiendo de los procedimientos de preparación de muestras y la pureza de la diana. Los datos del ensayo se analizan para determinar los niveles de expresión de genes individuales, y cambios en los niveles de expresión como entre estados, formando un perfil de expresión génica.
Ensayos relacionados con la actividad biológica
[0336] La divulgación proporciona procedimientos para identificar o cribar un compuesto que modula la actividad de un gen o proteína relacionados con el cáncer de la divulgación. Los procedimientos comprenden añadir un compuesto de prueba, como se ha definido anteriormente, a una célula que comprende una proteína del cáncer de la divulgación. Las células contienen un ácido nucleico recombinante que codifica una proteína del cáncer de la divulgación. Puede probarse una biblioteca de agentes candidatos en una pluralidad de células.
[0337] Los ensayos pueden evaluarse en presencia o ausencia o exposición previa o posterior de señales fisiológicas, por ejemplo, hormonas, anticuerpos, péptidos, antígenos, citocinas, factores de crecimiento, potenciales de acción, agentes farmacológicos como agentes que incluyen quimioterapéuticos, radiación, carcinogénicos u otras células (es decir, contactos célula-célula). En otro ejemplo, las determinaciones se hacen en diferentes fases del procedimiento del ciclo celular. De esta forma se identifican compuestos que modulan genes o proteínas de la divulgación. Los compuestos con actividad farmacológica pueden potenciar o interferir con la actividad de la proteína del cáncer de la divulgación. Una vez identificada, estructuras similares se evalúan para identificar características estructurales críticas del compuesto.
[0338] Se proporciona un procedimiento de modulación (por ejemplo, inhibición) de la división de células cancerosas; el procedimiento comprende administración de un modulador del cáncer. Se proporciona un procedimiento de modulación (por ejemplo, inhibición) del cáncer; el procedimiento comprende administración de un modulador del cáncer. También se proporcionan procedimientos para tratar células o individuos con cáncer; el procedimiento comprende la administración de un modulador del cáncer.
[0339] Se proporciona un procedimiento para modular el estado de una célula que expresa un gen de la divulgación. Como se usa en el presente documento, el estado comprende tales parámetros aceptados en la materia tales como crecimiento, proliferación, supervivencia, función, apoptosis, senescencia, localización, actividad enzimática, transducción de señales, etc. de una célula. Un inhibidor del cáncer puede ser un anticuerpo como se trata anteriormente, o una molécula antisentido. Una variedad de ensayos de crecimiento, proliferación y metástasis celular son conocidos para aquellos expertos en la materia, como se describe en el presente documento.
Cribado de alto rendimiento para identificar moduladores
[0340] Los ensayos para identificar moduladores adecuados son aceptados para cribado de alto rendimiento. Así, ensayos preferidos detectan el potenciamiento o inhibición de la transcripción del gen de cáncer, inhibición o potenciamiento de la expresión de polipéptidos, e inhibición o potenciamiento de la actividad de polipéptidos.
[0341] Los moduladores evaluados en los procedimientos de cribado de alto rendimiento pueden ser proteínas, frecuentemente proteínas que se producen naturalmente o fragmentos de proteínas que se producen naturalmente. Así, se usan, por ejemplo, extractos celulares que contienen proteínas, o digestos al azar o dirigidos de extractos celulares proteináceos. De esta forma se preparan bibliotecas de proteínas para cribar en los procedimientos de la divulgación. Particularmente se prefieren bibliotecas de proteínas bacterianas, fúngicas, virales y de mamífero, siendo preferidas las últimas, y siendo las proteínas humanas especialmente preferidas. El compuesto de prueba particularmente útil se dirigirá a la clase de proteínas a la que pertenece la diana, por ejemplo, sustratos para enzimas, o ligandos y receptores.
Uso de crecimiento en agar blando y formación de colonias para identificar y caracterizar moduladores
[0342] Las células normales requieren un sustrato sólido para unirse y crecer. Cuando las células se transforman, pierden este fenotipo y crecen desprendidas del sustrato. Por ejemplo, células transformadas pueden crecer en cultivo en suspensión con agitación o suspendidas en medios semi-sólidos, tales como agar semi-sólido o blando. Las células transformadas, cuando se transfectan con genes supresores de tumor, pueden regenerar el fenotipo normal y una vez más requieren un sustrato sólido para unirse y crecer. El crecimiento en agar blando o la formación de colonias en ensayos se usan para identificar moduladores de secuencias de cáncer, que cuando se expresan en células huésped, inhiben la proliferación y transformación celular anormal. Un modulador reduce o elimina la capacidad de las células huésped para crecer suspensas en medios sólidos o semisólidos, tales como agar.
[0343] Las técnicas para el crecimiento en agar blando y la formación de colonias en ensayos en suspensión se describen en Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (3ª ed., 1994). Véase, por tanto, la sección de procedimientos de Garkavtsev y col., (1996), arriba.
Evaluación de la inhibición de contactos y limitación de la densidad de crecimiento para identificar y caracterizar moduladores
[0344] Las células normales normalmente crecen en un patrón plano y organizado en cultivo celular hasta que se tocan entre sí. Cuando las células se tocan entre sí, se inhiben por contacto y dejan de crecer. Sin embargo, las células transformadas no se inhiben por contacto y continúan creciendo a altas densidades en focos desorganizados. Así, las células transformadas crecen a una mayor densidad de saturación que las células normales correspondientes. Esto se detecta morfológicamente por la formación de una monocapa desorientada de células o células en focos. Alternativamente, el índice de marcado con (3H)-timidina a la densidad de saturación se usa para medir la limitación de la densidad del crecimiento, similarmente un ensayo de MTT o de azul de Alamar revelará la capacidad de proliferación de células y la capacidad de moduladores para afectar las mismas. Véase Freshney (1994), arriba. Las células transformadas, cuando se transfectan con genes supresores de tumor, pueden regenerar un fenotipo normal e inhibirse por contacto y crecerían a una menor densidad.
[0345] En este ensayo, el índice de marcado con (3H)-timidina a la densidad de saturación es un procedimiento preferido de medición de la limitación de densidad del crecimiento. Células huésped transformadas se transfectan con una secuencia asociada al cáncer y se cultivan durante 24 horas a la densidad de saturación en condiciones de medio no limitante. El porcentaje de células que se marcan con (3H)-timidina se determina por cpm incorporadas.
[0346] Se usa crecimiento independiente del contacto para identificar moduladores de secuencias de cáncer, que habían conducido a proliferación y transformación celular anormal. Un modulador reduce o elimina el crecimiento independiente del contacto y devuelve las células a un fenotipo normal.
Evaluación del factor de crecimiento o dependencia del suero para identificar y caracterizar moduladores
[0347] Las células transformadas tienen menor dependencia del suero que sus homólogos normales (véase, por ejemplo, Temin, J. Natl. Cancer Inst. 37:167-175 (1966); Eagle y col., J. Exp. Med 131:836-879 (1970)); Freshney, arriba. Esto es en parte debido a la liberación de diversos factores de crecimiento por las células transformadas. El grado de dependencia del factor de crecimiento o del suero de células huésped transformadas puede compararse con el de control. Por ejemplo, la dependencia del factor de crecimiento o del suero de una célula se monitoriza en procedimientos para identificar y caracterizar compuestos que modulan secuencias asociadas al cáncer de la divulgación.
Uso de niveles de marcador específico de tumor para identificar y caracterizar moduladores [0348] Las células tumorales liberan una cantidad mayor de ciertos factores (denominados en lo sucesivo
“marcadores específicos de tumor”) que sus homólogos normales. Por ejemplo, el activador del plasminógeno (PA)
es liberado de un glioma humano a un mayor nivel que de las células del cerebro normal (véase, por ejemplo, Gullino, Angiogenesis, Tumor Vascularization, and Potential interference with Tumor Growth, in Biological Responses in Cancer, pág. 178-184 (Mihich (ed.) 1985)). Similarmente, el factor de angiogénesis tumoral (TAF) es liberado a un mayor nivel en células tumorales que sus homólogos normales. Véase, por ejemplo, Folkman, Angiogenesis and Cancer, Sem Cancer Biol. (1992)), mientras que bFGF se libera de tumores endoteliales (Ensoll, B y col.),
[0349] Diversas técnicas que miden la liberación de estos factores se describen en Freshney (1994), arriba. Por tanto, véanse, Unkless y col., J. Biol. Chem. 249:4295-4305 (1974); Strickland & Beers, J. Biol. Chem. 251:56945702 (1976); Whur y col., Br. J. Cancer 42:305 312 (1980); Gullino, Angiogenesis, Tumor Vascularization, and Potential Interference with Tumor Growth, in Biological Responses in Cancer, pág. 178-184 (Mihich (ed.) 1985); Freshney, Anticancer Res. 5:111-130 (1985). Por ejemplo, se monitorizan niveles de marcadores específicos de tumor en procedimientos para identificar y caracterizar compuestos que modulan secuencias asociadas al cáncer de la divulgación.
Invasividad en Matrigel para identificar y caracterizar moduladores
[0350] El grado de invasividad en Matrigel o un constituyente de la matriz extracelular puede usarse como ensayo para identificar y caracterizar compuestos que modulan secuencias asociadas al cáncer. Las células tumorales presentan una correlación positiva entre tumor maligno e invasividad de células en Matrigel o algún otro constituyente de la matriz extracelular. En este ensayo, células tumorigénicas se usan normalmente como células huésped. La expresión de un gen supresor de tumor en estas células huésped disminuiría la invasividad de las células huésped. Pueden usarse técnicas descritas en Cancer Res. 1999; 59:6010; Freshney (1994), arriba. Brevemente, el nivel de invasión de células huésped se mide usando filtros recubiertos con Matrigel o algún otro constituyente de la matriz extracelular. La penetración en el gel, o a través del lado distal del filtro, se evalúa como invasividad, y se evalúa histológicamente por el número de células y distancia movida, o premarcando las células con 125I y contando la radiactividad en el lado distal del filtro o fondo del disco. Véase, por ejemplo, Freshney (1984), arriba.
Evaluación del crecimiento tumoral in vivo para identificar y caracterizar moduladores
[0351] Efectos de secuencias asociadas al cáncer sobre el crecimiento celular se prueban en organismos transgénicos o inmunosuprimidos. Los organismos transgénicos se preparan en una variedad de formas aceptadas en la materia. Por ejemplo, se preparan organismos transgénicos de genes inactivados, por ejemplo, mamíferos tales como ratones en los que un gen de cáncer se altera o en los que se inserta un gen de cáncer. Se preparan ratones transgénicos de genes inactivados por inserción de un gen marcador u otro gen heterólogo en el gen endógeno del sitio de cáncer en el genoma del ratón mediante recombinación homóloga. Tales ratones también pueden prepararse sustituyendo el gen de cáncer endógeno con una versión mutada del gen de cáncer, o mutando el gen de cáncer endógeno, por ejemplo, por exposición a carcinógenos.
[0352] Para preparar animales quiméricos transgénicos, por ejemplo, ratones, una construcción de ADN se introduce en los núcleos de citoblastos embrionarios. Las células que contienen la lesión genética recientemente manipulada se inyectan en un embrión de ratón huésped, que se reimplanta en una hembra receptora. Algunos de estos embriones se desarrollan en ratones quiméricos que poseen células germinativas algunas de las cuales se derivan de la línea celular mutante. Por tanto, criando los ratones quiméricos es posible obtener una nueva línea de ratones que contiene la lesión genética introducida (véase, por ejemplo, Capecchi y col., Science 244:1288 (1989)). Los ratones quiméricos pueden derivarse según la patente de EE.UU. 6.365.797 concedida el 2 de abril de 2002; patente de EE.UU. 6.107.540 concedida el 22 de agosto de 2000; Hogan y col., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) y Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson, ed., IRL Press, Washington, D.C., (1987).
[0353] Alternativamente pueden usarse diversos animales huésped inmunosuprimidos o inmunodeficientes.
Por ejemplo, como huésped pueden usarse un ratón “desnudo” genéticamente atímico (véase, por
ejemplo, Giovanella y col., J. Natl. Cancer Inst. 52:921 (1974)), un ratón SCID, un ratón timectomizado o un ratón irradiado (véase, por ejemplo, Bradley y col., Br. J. Cancer 38:263 (1978); Selby y col., Br. J. Cancer 41:52 (1980)). Células tumorales trasplantables (normalmente aproximadamente 106 células) inyectadas en huéspedes isogénicos producen tumores invasivos en una alta proporción de casos, pero no células normales de origen similar. En huéspedes que desarrollaron tumores invasivos, las células que expresan secuencias asociadas al cáncer se inyectan subcutáneamente u ortotópicamente. Entonces, los ratones se separan en grupos, que incluyen grupos de control y grupos experimentales tratados, por ejemplo, tratados con un modulador. Después de una duración de tiempo adecuada, preferentemente 4-8 semanas, el crecimiento tumoral se mide (por ejemplo, en volumen o por sus dos dimensiones más largas, o peso) y se compara con el control. Se dice que tumores que tienen reducción estadísticamente significativa (usando, por ejemplo, prueba de la t de Student) han inhibido el crecimiento.
Ensayos in vitro para identificar y caracterizar moduladores
[0354] Ensayos para identificar compuestos con actividad moduladora pueden realizarse in vitro. Por ejemplo, un polipéptido de cáncer se pone primero en contacto con un posible modulador y se incuba durante una cantidad adecuada de tiempo, por ejemplo, de 0,5 a 48 horas. Los niveles de polipéptido de cáncer pueden determinarse in vitro midiendo el nivel de proteína o ARNm. El nivel de proteína se mide usando inmunoensayos tales como transferencia Western, ELISA y similares con un anticuerpo que se une selectivamente al polipéptido de cáncer o un fragmento del mismo. Para la medición de ARNm se prefieren amplificación, por ejemplo, usando PCR, LCR o ensayos de hibridación, por ejemplo, hibridación Northern, protección de RNAsa, transferencia puntual. El nivel de proteína o ARNm se detecta usando agentes de detección directamente o indirectamente marcados, por ejemplo, ácidos nucleicos fluorescentemente o radiactivamente marcados, anticuerpos radiactivamente o enzimáticamente marcados, y similares, como se describe en el presente documento.
[0355] Alternativamente, puede idearse un sistema de gen indicador usando un promotor de proteína del cáncer operativamente ligado a un gen indicador tal como luciferasa, proteína verde fluorescente, CAT o P-gal. La construcción indicadora se transfecta normalmente en una célula. Después del tratamiento con un posible modulador, la cantidad de transcripción, traducción o actividad del gen indicador se mide según técnicas convencionales conocidas para aquellos expertos en la materia (Davis GF, arriba; Gonzalez, J. & Negulescu, P. Curr. Opin. Biotechnol. 1998:9:624).
[0356] Como se explica resumidamente anteriormente, se hacen cribados in vitro en genes individuales y productos génicos. Es decir, habiendo identificado un gen particular diferencialmente expresado como importante en un estado particular, se realiza cribado de moduladores de la expresión del gen o el propio producto génico.
[0357] Puede realizarse el cribado de moduladores de la expresión del gen(es) específico(s). Normalmente se evalúa la expresión de solo uno o algunos genes. Pueden diseñarse cribados para primero encontrar compuestos que se unen a proteínas diferencialmente expresadas. Estos compuestos se evalúan entonces para la capacidad para modular la actividad diferencialmente expresada. Además, una vez se identifican compuestos candidatos iniciales, pueden cribarse adicionalmente variantes para evaluar mejor las relaciones de actividad estructural.
Ensayos de unión para identificar y caracterizar moduladores
[0358] En los ensayos de unión generalmente se usa un producto génico purificado o aislado de la divulgación. Por ejemplo, se generan anticuerpos para una proteína de la divulgación y se ejecutan inmunoensayos para determinar la cantidad y/o localización de proteína. Alternativamente, las células que comprenden las proteínas del cáncer se usan en los ensayos.
[0359] Así, los procedimientos comprenden combinar una proteína del cáncer de la divulgación y un compuesto candidato tal como un ligando, y determinar la unión del compuesto a la proteína del cáncer de la divulgación. Ejemplos preferidos utilizan la proteína del cáncer humana; también pueden desarrollarse y usarse modelos animales de enfermedad humana. Por tanto, también pueden usarse otras proteínas de mamífero análogas según se aprecia por aquellos expertos en la materia. Además, pueden usarse proteínas del cáncer de variante o de derivado.
[0360] Generalmente, la proteína del cáncer de la divulgación, o el ligando, no está unido difusiblemente a un soporte insoluble. El soporte puede ser, por ejemplo, uno que tiene áreas que reciben muestra aislada (una placa de microtitulación, una matriz, etc.). Los soportes insolubles pueden prepararse a partir de cualquier composición a la que pueden unirse las composiciones, se separa fácilmente del material soluble y es de otro modo compatible con el procedimiento global de cribado. La superficie de tales soportes puede ser sólida o porosa y de cualquier forma conveniente.
[0361] Ejemplos de soportes insolubles adecuados incluyen placas de microtitulación, matrices, membranas yperlas. Éstos están normalmente hechos de vidrio, plástico (por ejemplo, poliestireno), polisacárido, nailon, nitrocelulosa o Teflon™, etc. Las placas de microtitulación y matrices son especialmente convenientes debido a que puede llevarse a cabo un gran número de ensayos simultáneamente, usando pequeñas cantidades de reactivos y muestras. El modo particular de unión de la composición al soporte no es crucial, mientras que sea compatible con los reactivos y procedimientos globales de la divulgación, mantenga la actividad de la composición y no sea difundible. Procedimientos preferidos de unión incluyen el uso de anticuerpos que no bloquean estéricamente tanto el sitio de unión a ligando como la secuencia de activación cuando se une la proteína al soporte, unión directa a
soportes “pegajosos” o iónicos, reticulación química, síntesis de la proteína o agente sobre la superficie, etc. Tras la
unión de la proteína o ligando/agente de unión al soporte, el exceso de material unido se elimina lavando. Las áreas que reciben la muestra pueden entonces bloquearse mediante incubación con albúmina de suero bovino (BSA), caseína u otra proteína inocua u otro resto.
[0362] Una vez se une una proteína del cáncer de la divulgación al soporte, y un compuesto de prueba se añade al ensayo. Alternativamente, el agente de unión candidato se une al soporte y luego se añade la proteína del cáncer de la divulgación. Agentes de unión incluyen anticuerpos específicos, agentes de unión no naturales identificados en cribados de bibliotecas químicas, análogos de péptidos, etc.
[0363] De particular interés son ensayos para identificar agentes que tienen una baja toxicidad para células humanas. Puede usarse una amplia variedad de ensayos para este fin, que incluyen ensayos de proliferación, ensayos de AMPc, ensayos de unión proteína-proteína in vitro, ensayos de desplazamiento por movilidad electroforética, inmunoensayos para la unión de proteína, ensayos funcionales (ensayos de fosforilación, etc.) y similares.
[0364] Una determinación de la unión del compuesto de prueba (ligando, agente de unión, modulador, etc.) a una proteína del cáncer de la divulgación puede hacerse de varias formas. El compuesto de prueba puede marcarse, y determinarse la unión directamente, por ejemplo, uniendo toda o una porción de la proteína del cáncer de la divulgación a un soporte sólido, añadiendo un compuesto candidato marcado (por ejemplo, una marca fluorescente), lavando el exceso de reactivo y determinando si la marca está presente o no sobre el soporte sólido. Pueden utilizarse diversas etapas de bloqueo y de lavado según convenga.
[0365] Solo uno de los componentes puede marcarse, por ejemplo, una proteína de la divulgación o ligandos marcados. Alternativamente, más de un componente se marca con diferentes marcas, por ejemplo, I125 para las proteínas y un fluoróforo para el compuesto. También son útiles reactivos de proximidad, por ejemplo, reactivos de extinción o de transferencia de energía.
Unión competitiva para identificar y caracterizar moduladores
[0366] La unión del “compuesto de prueba” puede determinarse por ensayo de unión competitiva con un “competidor”. El competidor es un resto de unión que se une a la molécula diana (por ejemplo, una proteína del
cáncer de la divulgación). Los competidores incluyen compuestos tales como anticuerpos, péptidos, componentes de unión, ligandos, etc. En ciertas circunstancias, la unión competitiva entre el compuesto de prueba y el competidor desplaza el compuesto de prueba. El compuesto de prueba puede marcarse. Tanto el compuesto de prueba, el competidor, como ambos, se añaden a la proteína durante un tiempo suficiente para permitir la unión. Las incubaciones se realizan a una temperatura que facilita la actividad óptima, normalmente entre cuatro y 40 ºC. Los periodos de incubación se optimizan normalmente, por ejemplo, para facilitar el rápido cribado de alto rendimiento; normalmente entre cero y una hora será suficiente. El exceso de reactivo se elimina generalmente o se lava. Entonces se añade el segundo componente, y se sigue la presencia o ausencia del componente marcado, para indicar la unión.
[0367] El competidor puede añadirse primero, seguido del compuesto de prueba. El desplazamiento del competidor es una indicación de que el compuesto de prueba está uniéndose a proteína del cáncer y así puede unirse a, y posiblemente modular, la actividad de la proteína del cáncer. Puede marcarse cualquier componente. Así, por ejemplo, si el competidor se marca, la presencia de la marca en la disolución de lavado del compuesto después de la prueba indica desplazamiento por el compuesto de prueba. Alternativamente, si el compuesto de prueba se marca, la presencia de la marca sobre el soporte indica desplazamiento.
[0368] Alternativamente, el compuesto de prueba puede añadirse primero, con incubación y lavado, seguido del competidor. La ausencia de unión por el competidor indica que el compuesto de prueba se une a la proteína del cáncer con mayor afinidad que el competidor. Así, si el compuesto de prueba se marca, la presencia de la marca sobre el soporte, acoplado a una falta de unión a competidor, indica que el compuesto de prueba se une y así modula posiblemente la proteína del cáncer de la divulgación.
[0369] Por consiguiente, los procedimientos de unión competitiva comprenden cribado diferencial para identificar agentes que pueden modular la actividad de las proteínas del cáncer de la divulgación. Los procedimientos pueden comprender combinar una proteína del cáncer y un competidor en una primera muestra. Una segunda muestra comprende un compuesto de prueba, la proteína del cáncer y un competidor. La unión del competidor se determina para ambas muestras, y un cambio, o diferencia en la unión entre las dos muestras, indica la presencia de un agente que puede unirse a la proteína del cáncer y posiblemente modular su actividad. Es decir, si la unión del competidor es diferente en la segunda muestra con respecto a la primera muestra, el agente puede unirse a la proteína del cáncer.
[0370] Alternativamente, se usa cribado diferencial para identificar candidatos a fármaco que se unen a la proteína del cáncer nativa, pero no pueden unirse a proteínas del cáncer modificadas. Por ejemplo, la estructura de la proteína del cáncer se modela y se usa en el diseño racional de fármacos para sintetizar agentes que interaccionan con ese sitio, agentes que generalmente no se unen a proteínas modificadas en el sitio. Además, tales candidatos a fármaco que afectan la actividad de una proteína del cáncer nativa también se identifican cribando fármacos para la capacidad para tanto potenciar como reducir la actividad de tales proteínas.
[0371] Pueden usarse controles positivos y controles negativos en los ensayos. Preferentemente, las muestras de control y de prueba se realizan al menos por triplicado para obtener resultados estadísticamente significativos. La incubación de todas las muestras se produce durante un tiempo suficiente para permitir la unión del agente a la proteína. Tras la incubación, las muestras se lavan libres de material no específicamente unido y se determina la cantidad de agente unido, generalmente agente marcado. Por ejemplo, si se emplea una radiomarca, las muestras pueden contarse en un contador de centelleo para determinar la cantidad de compuesto unido.
[0372] Puede incluirse una variedad de otros reactivos en los ensayos de cribado. Éstos incluyen reactivos como sales, proteínas neutras, por ejemplo, albúmina, detergentes, etc. que se usan para facilitar la óptima unión proteína-proteína y/o reducir interacciones no específicas o de referencia. También pueden usarse reactivos que de otro modo mejoran la eficiencia del ensayo, tales como inhibidores de proteasas, inhibidores de nucleasas, agentes antimicrobianos, etc. La mezcla de componentes se añade en un orden que proporcione la unión requerida.
Uso de polinucleótidos para regular por disminución o inhibir una proteína de la divulgación
[0373] Moduladores de polinucleótido de cáncer pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de nucleótidos diana por formación de un conjugado con un ligando-molécula de unión, como se describe en el documento WO 91/04753. Ligando-moléculas de unión adecuados incluyen, pero no se limitan a, receptores de la superficie celular, factores de crecimiento, otras citocinas u otros ligandos que se unen a receptores de la superficie celular. Preferentemente, la conjugación del ligando-molécula de unión no interfiere sustancialmente con la capacidad del ligando-molécula de unión para unirse a su molécula o receptor correspondiente, o bloquear la entrada del oligonucleótido sentido o antisentido o su versión conjugada en la célula. Alternativamente, un modulador de polinucleótido de cáncer puede introducirse en una célula que contiene la secuencia de ácidos nucleicos diana, por ejemplo, por formación de un complejo de polinucleótido-lípido, como se describe en el documento WO 90/10448. Se entiende que el uso de moléculas antisentido o modelos de inactivación de genes y activación de genes también pueden usarse en ensayos de cribado como se trata anteriormente, además de procedimientos de tratamiento
Nucleótidos inhibidores y antisentido
[0374] La actividad de una proteína asociada al cáncer puede regularse por disminución, o inhibirse completamente, usando polinucleótido antisentido o ARN nuclear pequeño (ARNnp) inhibidor, es decir, un ácido nucleico complementario a, y que puede hibridarse preferentemente específicamente con, una secuencia de ácidos nucleicos de ARNm codificante, por ejemplo, una proteína del cáncer de la divulgación, ARNm o una subsecuencia del mismo. La unión del polinucleótido antisentido al ARNm reduce la traducción y/o estabilidad del ARNm.
[0375] En el contexto de la presente divulgación, los polinucleótidos antisentido pueden comprender nucleótidos que se producen naturalmente, o especias sintéticas formadas a partir de subunidades que se producen naturalmente o sus homólogos próximos. Los polinucleótidos antisentido también pueden tener restos de azúcar alterados o enlaces entre azúcares. A modo de ejemplo entre estos están el fosforotioato y otras especies que contienen azufre que son conocidas para su uso en la materia. Los análogos están comprendidos por la presente divulgación, mientras que sirvan eficazmente para hibridarse con nucleótidos de la divulgación. Véase, por ejemplo, Isis Pharmaceuticals, Carlsbad, CA; Sequitor, Inc., Natick, MA.
[0376] Tales polinucleótidos antisentido pueden sintetizarse fácilmente usando medios recombinantes, o pueden sintetizarse in vitro. Equipo para tales síntesis es comercializado por varios vendedores, que incluyen Applied Biosystems. La preparación de otros oligonucleótidos tales como fosforotioatos y derivados alquilados también es muy conocida para aquellos expertos en la materia.
[0377] Moléculas antisentido como se usa en el presente documento incluyen oligonucleótidos antisentido o sentido. Los oligonucleótidos sentido pueden, por ejemplo, emplearse para bloquear la transcripción uniéndose a la cadena no codificante. El oligonucleótido antisentido y sentido comprenden una secuencia de ácido nucleico monocatenaria (tanto ARN como ADN) que puede unirse a secuencias de ARNm diana (sentido) o ADN (antisentido) para moléculas de cáncer. Los oligonucleótidos antisentido o sentido, según la presente divulgación, comprenden un fragmento de generalmente al menos aproximadamente 12 nucleótidos, preferentemente de aproximadamente 12 a 30 nucleótidos. La capacidad para derivar un oligonucleótido antisentido o sentido, basándose en una secuencia de ADNc que codifica una proteína dada, se describe en, por ejemplo, Steln & Cohen (Cancer Res. 48:2659 (1988 y van der Krol y col., (BioTechniques 6:958 (1988)).
Ribozimas
[0378] Además de los polinucleótidos antisentido pueden usarse ribozimas para elegir como diana e inhibir la transcripción de secuencias de nucleótidos asociadas al cáncer. Una ribozima es una molécula de ARN que escinde catalíticamente otras moléculas de ARN. Se han descrito diferentes tipos de ribozimas, que incluyen ribozimas del grupo I, ribozimas de cabeza de martillo, ribozimas de horquilla, RNasa P y ribozimas de cabeza de hacha (véase, por ejemplo, Castanotto y col., Adv. in Pharmacology 25:289-317 (1994) para una revisión general de las propiedades de diferentes ribozimas).
[0379] Las características generales de las ribozimas de horquilla se describen, por ejemplo, en Hampel y col., Nucl. Acids Res. 18:299-304 (1990); publicación de patente europea nº 0360257; patente de EE.UU. nº
5.254.678. Los procedimientos de preparación son muy conocidos para aquellos expertos en la materia (véanse, por ejemplo, documento WO 94/26877; Ojwang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6340-6344 (1993); Yamada y col., Human Gene Therapy 1:39-45 (1994); Leavitt y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 92:699-703 (1995); Leavitt y col., Human Gene Therapy 5:1151-120 (1994); y Yamada y col., Virology 205:121-126 (1994)).
Uso de moduladores en cribado fenotípico
[0380] Un compuesto de prueba puede administrarse a una población de células cancerosas, que tienen un perfil de expresión de cáncer asociado. Por “administración” o “poner en contacto” en el presente documento se indica que el modulador se añade a las células de un modo tal que se permita que el modular actúe sobre la célula, tanto por captación y acción intracelular como por acción en la superficie celular. Un ácido nucleico que codifica un agente proteináceo (es decir, un péptido) puede ponerse en una construcción viral tal como una construcción adenoviral o retroviral, y añadirse a la célula, de forma que se lleve a cabo la expresión del agente de péptido, por ejemplo, el documento PCT US97/01019. También pueden usarse sistemas de terapia génica regulables. Una vez se ha administrado el modulador a las células, las células se lavan si se desea y se dejan incubar bajo condiciones preferentemente fisiológicas durante algún periodo. Entonces, las células se recogen y se genera un nuevo perfil de expresión génica. Así, por ejemplo, tejido de cáncer se criba para agentes que modulan, por ejemplo, inducen o suprimen, el fenotipo de cáncer. Un cambio en al menos un gen, preferentemente muchos, del perfil de expresión indica que el agente tiene un efecto sobre la actividad del cáncer. Similarmente, alterar una función biológica o una ruta de señalización es indicativo de actividad de modulador. Definiendo un distintivo tal para el fenotipo del cáncer, se idean cribados para nuevos fármacos que alteran el fenotipo. Con esta estrategia, la diana del fármaco no necesita ser conocida y no necesita representarse en la plataforma de cribado de expresión de genes/proteínas original, ni necesita cambiarse el nivel de transcrito para la proteína diana. La función inhibidora del modulador servirá de marcador sustituto.
[0381] Como se explica resumidamente anteriormente, los cribados se hacen para evaluar genes o productos génicos. Es decir, habiendo identificado un gen diferencialmente expresado particular como importante en un estado particular, se realiza el cribado de moduladores de tanto la expresión del gen como el propio producto génico.
Uso de moduladores para afectar los péptidos de la divulgación
[0382] Las mediciones de la actividad de polipéptidos del cáncer, o del fenotipo del cáncer, se realizan usando una variedad de ensayos. Por ejemplo, los efectos de moduladores tras la función de un polipéptido(s) del cáncer se miden examinando los parámetros descritos anteriormente. Se usa un cambio fisiológico que afecta la actividad para evaluar la influencia de un compuesto de prueba sobre los polipéptidos de la presente divulgación. Cuando se determinan resultados funcionales usando células intactas o animales, puede evaluarse una variedad de efectos tales como, en el caso de un cáncer asociado a tumores sólidos, crecimiento tumoral, metástasis tumoral, neovascularización, liberación de hormona, cambios transcripcionales a tanto marcadores genéticos conocidos como sin caracterizar (por ejemplo, por transferencias Northern), cambios en el metabolismo de las células tal como crecimiento celular o cambios de pH, y cambios en segundos mensajeros intracelular tales como cGNIP.
Procedimientos de identificación caracterización de secuencias asociadas al cáncer
[0383] La expresión de diversas secuencias de genes se correlaciona con cáncer. Por consiguiente, se determinan trastornos basados en genes de cáncer mutantes o variantes. La divulgación proporciona procedimientos para identificar células que contienen genes de cáncer variantes, por ejemplo, determinar la presencia de, toda o parte de, la secuencia de al menos un gen de cáncer endógeno en una célula. Esto se lleva a cabo usando cualquier número de técnicas de secuenciación. La divulgación comprende procedimientos de identificación del genotipo del cáncer de un individuo, por ejemplo, determinar toda o parte de la secuencia de al menos un gen de la divulgación en el individuo. Esto se hace generalmente en al menos un tejido del individuo, por ejemplo, un tejido expuesto en la Tabla I, y puede incluir la evaluación de varios tejidos o diferentes muestras del mismo tejido. El procedimiento puede incluir comparar la secuencia del gen secuenciado con un gen de cáncer conocido, es decir, un gen natural para determinar la presencia de miembros de familia, homologías, mutaciones o variantes. La secuencia de todo o parte del gen puede entonces compararse con la secuencia de un gen de cáncer conocido para determinar si existe alguna diferencia. Esto se hace usando cualquier número de programas de homología conocidos, tales como BLAST, Bestfit, etc. La presencia de una diferencia en la secuencia entre el gen de cáncer del paciente y el gen de cáncer conocido se correlaciona con un estado de enfermedad o una propensión a un estado de enfermedad, como se ha explicado resumidamente en el presente documento.
[0384] Los genes de cáncer pueden usarse como sondas para determinar el número de copias del gen de cáncer en el genoma. Los genes de cáncer se usan como sondas para determinar la localización cromosómica de los genes de cáncer. Información tal como localización cromosómica se usa en proporcionar un diagnóstico o pronóstico, en particular cuando anomalías cromosómicas tales como translocalizaciones y similares se identifican en el sitio del gen de cáncer.
XIV.) iARN y uso terapéutico de ARN interferente pequeño (ARNip)
[0385] La presente divulgación también se refiere a oligonucleótidos de ARNip, particularmente ARN de cadenas que engloban al menos un fragmento de la región codificante de STEAP-1 o regiones 5' UTR, o complemento, o cualquier oligonucleótido antisentido específico para la secuencia de STEAP-1. Tales oligonucleótidos pueden usarse para elucidar una función de STEAP-1, o se usan para cribar o evaluar función o expresión de moduladores de STEAP-1. La expresión génica de STEAP-1 puede reducirse usando transfección de ARNip y produce capacidad proliferativa significativamente reducida de células cancerosas transformadas que expresan endógenamente el antígeno; células tratadas con ARNip de STEAP-1 específicos muestran supervivencia reducida como se mide, por ejemplo, por una lectura de la viabilidad celular metabólica, que se correlaciona con capacidad proliferativa reducida. Así, las composiciones de ARNip de STEAP-1 comprenden ARNip (ARN bicatenario) que se corresponde con la secuencia de ORF de ácidos nucleicos de la proteína STEAP-1 o subsecuencias de la misma; estas subsecuencias tienen generalmente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 o más de 35 nucleótidos de ARN contiguos de longitud y contienen secuencias que son complementarias y no complementarias a al menos una porción de la secuencia codificante de ARNm. Las subsecuencias pueden tener 19-25 nucleótidos de longitud, lo más preferentemente 21-23 nucleótidos de longitud.
[0386] La interferencia por ARN es una estrategia novedosa para silenciar genes in vitro e in vivo, así ARN bicatenarios pequeños (ARNip) son agentes terapéuticos valiosos. La potencia de ARNip para silenciar actividades de genes específicas se ha llevado ahora a modelos animales de enfermedad y también se usa en seres humanos. Por ejemplo, se ha mostrado que la infusión hidrodinámica de una disolución de ARNip en un ratón con un ARNip contra una diana particular es terapéuticamente eficaz.
[0387] El trabajo pionero por Song y col. indica que un tipo de ácido nucleico completamente natural, ARN interferentes pequeños (ARNip), sirvió de agentes terapéuticos incluso sin modificación química adicional (Song, E. y col. “RNA Interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis” Nat. Med, 9(3): 347-51(2003)). Este trabajo proporcionó la primera evidencia in vivo de que la infusión de ARNip en un animal podría aliviar la enfermedad. En ese caso, los autores dieron a ratones inyecciones de ARNip diseñado para silenciar la proteína FAS (un receptor de muerte celular que cuando se activa en exceso durante la respuesta inflamatoria induce la muerte de hepatocitos y otras células). Al día siguiente, a los animales se les administró un anticuerpo específico para Fas. Los ratones de control murieron de insuficiencia hepática aguda en el plazo de algunos días, mientras que más del 80 % de los ratones tratados con ARNip permanecieron libres de enfermedad grave y sobrevivieron. Aproximadamente del 80 % al 90 % de sus células hepáticas incorporaron oligonucleótidos de ARNip desnudo. Además, las moléculas de ARN funcionaron durante 10 días antes de perder el efecto después de 3 semanas.
[0388] Para su uso en terapia humana, el ARNip se administra por sistemas eficaces que inducen actividad de iARN de larga duración. Una advertencia importante para uso clínico es la administración de ARNip a las células apropiadas. Parece que los hepatocitos son particularmente receptivos a ARN exógeno. Hoy en día, las dianas localizadas en el hígado son atractivas debido a que el hígado es un órgano que puede ser fácilmente elegido como diana por moléculas de ácidos nucleicos y vectores virales. Sin embargo, también se prefieren otras dianas de tejido y órgano.
[0389] Las formulaciones de ARNip con compuestos que promueven el tránsito a través de membranas celulares se usan para mejorar la administración de ARNip en terapia. También se proporcionan ARNip sintéticos químicamente modificados, que son resistentes a nucleasas y tienen estabilidad en suero, tienen duración potenciada concomitante de efectos de iARN.
[0390] Así, la tecnología de ARNip es un terapéutico para tumor maligno humano por administración de moléculas de ARNip dirigidas a STEAP-1 a individuos con cánceres, tales como aquellos enumerados en la Tabla I. Tal administración de ARNip conduce a crecimiento reducido de células cancerosas que expresan STEAP-1, y proporciona una terapia antitumoral, reduciendo la morbilidad y/o mortalidad asociada al tumor maligno.
[0391] La eficacia de esta modalidad de silenciamiento de productos génicos es significativa cuando se mide in vitro o in vivo. La eficacia in vitro es fácilmente demostrable mediante la aplicación de ARNip a células en cultivo (como se ha descrito anteriormente) o a alícuotas de paciente con biopsias de cáncer cuando se usan procedimientos in vitro para detectar la expresión reducida de proteína STEAP-1.
XV.) Kits/artículos de fabricación
[0392] Kits para su uso en las aplicaciones de laboratorio, pronóstico, profilácticas, de diagnóstico y terapéuticas descritas en el presente documento están dentro del alcance de la divulgación. Tales kits pueden comprender un soporte, envase o recipiente que está compartimentalizado para recibir uno o más recipientes tales como viales, tubos y similares, comprendiendo cada (uno de los) recipiente(s) uno de los elementos separados que van a usarse en el procedimiento, junto con una etiqueta o folleto que comprende instrucciones para su uso, tal como un uso descrito en el presente documento. Por ejemplo, el (los) recipiente(s) puede(n) comprender una sonda que es o puede ser detectablemente marcada. Tal sonda puede ser un anticuerpo o polinucleótido específico para una proteína o un gen o mensajero de la divulgación, respectivamente. Si el procedimiento utiliza hibridación de ácidos nucleicos para detectar el ácido nucleico diana, el kit también puede tener recipientes que contiene(n) nucleótido(s) para la amplificación de la secuencia de ácidos nucleicos diana. Los kits pueden comprender un recipiente que comprende un indicador tal como una proteína de unión a biotina, tal como avidina o estreptavidina, unida a una molécula indicadora, tal como una marca enzimática, fluorescente o de radioisótopo; un indicador tal puede usarse con, por ejemplo, con un ácido nucleico o anticuerpo. El kit puede incluir todas o parte de las secuencias de aminoácidos en la Figura 2 o la Figura 3 o análogos de las mismas, o una molécula de ácido nucleico que codifica tales secuencias de aminoácidos.
[0393] El kit comprenderá normalmente el recipiente descrito anteriormente y uno o varios de otros recipientes asociados con el mismo que comprenden materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas; etiquetas de soportes, envases, recipientes, viales y/o tubos que enumeren contenidos y/o instrucciones para su uso, y prospectos con instrucciones para su uso.
[0394] Una etiqueta puede estar presente sobre o con el recipiente para indicar que la composición se usa para una terapia específica o aplicación no terapéutica, tal como una aplicación de pronóstico, profiláctica, de diagnóstico o de laboratorio, y también puede indicar instrucciones para tanto uso in vivo como in vitro, tal como aquellas descritas en el presente documento. Las instrucciones y/u otra información también puede incluirse en un inserto(s) o etiqueta(s) que se incluyen con o en el kit. La etiqueta puede estar sobre o asociada al recipiente. Una etiqueta puede estar sobre un recipiente cuando letras, números u otros caracteres que forman la etiqueta están moldeados o grabados en el propio recipiente; una etiqueta puede asociarse a un recipiente cuando está presente dentro de un receptáculo o soporte que también contiene el recipiente, por ejemplo, como un prospecto. La etiqueta puede indicar que la composición se usa para el diagnóstico, tratamiento, profilaxis o pronóstico de una afección, tal como una neoplasia de un tejido expuesto en la Tabla I.
[0395] Los términos “kit” y “artículo de fabricación” pueden usarse como sinónimos.
[0396] También se proporciona un artículo(s) de fabricación que contiene(n) composiciones, tales como secuencia(s) de aminoácidos, molécula(s) pequeña(s), secuencia(s) de ácidos nucleicos y/o anticuerpo(s), por ejemplo, materiales útiles para el diagnóstico, pronóstico, profilaxis y/o tratamiento de neoplasias de tejidos tales como aquellos expuestos en la Tabla I. El artículo de fabricación normalmente comprende al menos un recipiente y al menos una etiqueta. Recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringuillas y tubos de ensayo. Los recipientes pueden formarse a partir de una variedad de materiales tales como vidrio, metal o plástico. El recipiente puede contener secuencia(s) de aminoácidos, molécula(s) pequeña(s), secuencia(s) de ácidos nucleicos, población (poblaciones) de células y/o anticuerpo(s). El recipiente puede contener un polinucleótido para su uso en examinar el perfil de expresión de ARNm de una célula, junto con reactivos usados para este fin. Un recipiente puede comprender un anticuerpo, fragmento de unión del mismo o proteína de unión específica para su uso en evaluar la expresión de proteínas de STEAP-1 en células y tejidos, o para fines de laboratorio, pronóstico, diagnóstico, profiláctico y terapéutico relevantes; indicaciones y/o direcciones para tales usos pueden incluirse sobre
o con tal recipiente, ya que reactivos y otras composiciones o herramientas pueden usarse para estos fines. Un recipiente puede comprender materiales para provocar una respuesta inmunitaria celular o humoral, junto con indicaciones y/o direcciones asociadas. Un recipiente puede comprender materiales para inmunoterapia adoptiva, tales como linfocitos T citotóxicos (CTL) o linfocitos T colaboradores (HTL), junto con indicaciones y/o direcciones asociadas; también pueden incluirse reactivos y otras composiciones o herramientas usadas para tal fin.
[0397] El recipiente puede contener alternativamente una composición que es eficaz para el tratamiento, diagnóstico, pronóstico o profilaxis de una afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de disolución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Los agentes activos en la composición pueden ser un anticuerpo que puede unirse específicamente a STEAP-1 y modular la función de STEAP-1.
[0398] El artículo de fabricación puede comprender adicionalmente un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable tal como solución salina tamponada con fosfato, disolución de Ringer y/o disolución de dextrosa. Puede incluir adicionalmente otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, que incluyen otros tampones, diluyentes, filtros, agitadores, agujas, jeringuillas y/o prospectos con indicaciones y/o instrucciones para su uso.
EJEMPLOS:
[0399] Diversos aspectos de la invención se describen adicionalmente y se ilustran a modo de los varios ejemplos que siguen, ninguno de los cuales pretende limitar el alcance de la invención.
Ejemplo 1: Aislamiento generado por SSH de fragmento de ADNc del gen STEAP-1
Materiales y procedimientos
Xenoinjertos de LAPC:
[0400] Se obtuvieron xenoinjertos de LAPC del Dr. Charles Sawyers (UCLA) y se generaron como se ha descrito (Klein y col., 1997. Nature Med. 3:402-408; Craft y col., 1999, Cancer Res. 59:5030-5036). Xenoinjertos de LAPC-4 dependientes e independientes de andrógenos (LAPC-4 AD y AI, respectivamente) y xenoinjertos de LAPC9 (LAPC-9 AD y Al, respectivamente) se cultivaron en ratones SCID macho intactos o en machos castrados, respectivamente, y se sometieron a pases como pequeños trozos de tejido en machos receptores. Los xenoinjertos de LAPC-4 Al se derivaron de tumores de LAPC-4 AD y los xenoinjertos de LAPC-9 Al se derivaron de tumores de LAPC-9 AD. Para generar los xenoinjertos AI, ratones macho que llevaban tumores LAPC AD se castraron y se mantuvieron durante 2-3 meses. Después de volver a crecer los tumores LAPC, los tumores se recogieron y se sometieron a pases en machos castrados o ratones SCID hembra.
[0401] Los xenoinjertos de LAPC-4 AD se cultivaron intratibialmente del siguiente modo. Tejido tumoral de xenoinjerto de LAPC-4 AD cultivado subcutáneamente se troceó en secciones de 1-2 mm3 mientras que el tejido se bañaba en medio Iscove 1X, entonces el tejido troceado se centrifugó a 1,3K rpm durante 4 minutos, el sobrenadante se resuspendió en 10 ml de medio Iscove helado 1X y se centrifugó a 1,3K rpm durante 4 minutos. El sedimento se resuspendió entonces en 1X Iscove con 1 % de pronasa E y se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente con agitación por balanceo suave, seguido de incubación sobre hielo durante 2-4 minutos. El filtrado se centrifugó a 1,3K rpm durante 4 minutos, y la pronasa se eliminó del sedimento aspirado resuspendiendo en 10 ml de Iscove y re-centrifugando. Entonces, los grumos de las células se sembraron en medio PrEGM y se cultivaron durante la noche. Entonces, las células se recogieron, se filtraron, se lavaron 2X RPMI y se contaron. Aproximadamente 50.000 células se mezclaron con y volumen igual de Matrigel frío en hielo sobre hielo, y se inyectaron quirúrgicamente en la metáfisis tibial proximal de ratones SCID mediante una aguja de calibre 27. Después de 10-12 semanas se recuperaron los tumores de LAPC-4 que crecieron en la médula ósea.
Líneas celulares y tejidos:
[0402] Se obtuvieron líneas celulares humanas (por ejemplo, HeLa) de la ATCC y se mantuvieron en DMEM con 5 % de suero bovino fetal. Los tejidos humanos para análisis de ARN y proteína se obtuvieron del Centro deFuentes de Tejido Humano (HTRC) en UCLA (Los Ángeles, CA) y de QualTek, Inc. (Santa Barbara, CA).
Aislamiento de ARN:
[0403] Se homogeneizaron tejido y líneas celulares tumorales en reactivo Trizol (Life Technologies, Gibco BRL) usando 10 ml/g de tejido o 10 ml/108 células para aislar ARN total. Se purificó ARN de poli A de ARN total usando los kits Qiagen's Oligotex mRNA Mini y Midi. Se cuantificaron ARN total y ARNm por análisis espectrofotométrico (D.O. 260/280 nm) y se analizaron por electroforesis en gel.
Oligonucleótidos:
[0404] Se usaron los siguientes oligonucleótidos purificados por HPLC.
DPNCDN (cebador de la síntesis de ADNc):
5'TTTTGATCAAGCTT303' (SEQ ID NO: 68)
Adaptador 1:
5'CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAG3' (SEQ ID NO: 69) 3'GGCCCGTCCTAG5' (SEQ ID NO: 70)
Adaptador 2:
5'GTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAG3' (SEQ ID NO: 71) 3'CGGCTCCTAG5' (SEQ ID NO: 72)
Cebador de PCR 1:
5'CTAATACGACTCACTATAGGGC3' (SEQ ID NO: 73)
Cebador anidado (NP)1:
5'TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGA3' (SEQ ID NO: 74) Cebador anidado (NP)2:
5'AGCGTGGTCGCGGCCGAGGA3' (SEQ ID NO: 75)
Hibridación sustractiva por supresión:
[0405] Se usó hibridación sustractiva por supresión (SSH) para identificar ADNc correspondientes a genes que podían regularse por incremento en cáncer de próstata dependiente de andrógenos en comparación con hiperplasia prostática benigna (BPH).
[0406] Los ADNc bicatenarios correspondientes a xenoinjerto de LAPC-4 AD (probador) y a tejido de BPH (conductor) se sintetizaron a partir de 2 µg de ARN poli(A)+ aislado de tejido de xenoinjerto y de BPH, como se ha descrito anteriormente, usando el kit CLONTECH's PCR-Select cDNA Subtraction y 1 ng de oligonucleótido RSACDN como cebador. La síntesis de la primera y segunda cadena se llevaron a cabo como se describe en el protocolo del manual de usuario del kit (protocolo de CLONTECH nº PT1117-1, nº de catálogo K1804-1). El ADNc resultante se digirió con Rsa I durante 3 h a 37 ºC. El ADNc digerido se extrajo con fenol/cloroformo (1:1) y se precipitó con etanol.
[0407] El ADNc conductor (BPH) se generó combinando en una relación 4 a 1 de ADNc de BPH digerido con Rsa I con ADNc digerido de hígado de ratón, con el fin de garantizar que los genes murinos se eliminaran del ADNc del probador (LAPC-4 AD).
[0408] El ADNc del probador (LAPC-4 AD) se generó diluyendo 1 µl de ADNc de LAPC-4 AD digerido con Rsa I en 5 µl de agua. Entonces, el ADNc diluido (2 µl, 160 ng) se ligó a 2 µl de adaptador 1 y adaptador 2 (10 µM), en reacciones de ligación separadas, en un volumen total de 10 µl a 16 ºC durante la noche, usando 400 u de ADN ligasa T4 (CLONTECH). La ligación se terminó con 1 µl de EDTA 0,2 M y calentando a 72 ºC durante 5 min.
[0409] La primera hibridación se realizó añadiendo 1,5 µl (600 ng) de ADNc conductor a cada uno de dos tubos que contenían 1,5 µl (20 ng) de ADNc probador ligado a adaptador 1 y adaptador 2. En un volumen final de 4 µl, las muestras se recubrieron con aceite mineral, se desnaturalizaron en un ciclador térmico de MJ Research a 98 ºC durante 1,5 minutos, y luego se dejó que se hibridaran durante 8 h a 68 ºC. Entonces, las dos hibridaciones se mezclaron junto con 1 µl adicional de ADNc conductor recientemente desnaturalizado y se dejó que se hibridaran durante la noche a 68 ºC. Entonces, la segunda hibridación se diluyó en 200 µl de HEPES 20 mM, pH 8,3, NaCl 50 mM, EDTA 0,2 mM, se calentó a 70 ºC durante 7 min y se guardó -20 ºC.
Amplificación, clonación y secuenciación por PCR de fragmentos de genes generados a partir de SSH:
[0410] Para amplificar fragmentos de genes resultantes de reacciones de SSH se realizaron dos amplificaciones por PCR. En la reacción de PCR primaria, 1 µl de la mezcla de hibridación final diluida se añadió a 1 µl de cebador de PCR 1 (10 µM), 0,5 µl de mezcla de dNTP (10 µM), 2,5 µl de 10 x tampón de reacción (CLONTECH) y 0,5 µl de 50 x mezcla de polimerasa de ADNc Advantage (CLONTECH) en un volumen final de 25 µl. La PCR 1 se realizó usando las siguientes condiciones: 75 ºC durante 5 min, 94 ºC durante 25 s, luego 27 ciclos de 94 ºC durante 10 s, 66 ºC durante 30 s, 72 ºC durante 1,5 min. Se realizaron cinco reacciones de PCR primarias separadas para cada experimento. Los productos se reunieron y se diluyeron 1:10 con agua. Para la reacción de PCR secundaria, 1 µl de la reacción de PCR primaria reunida y diluida se añadió a la misma mezcla de reacción que se usa para PCR 1, excepto que se usaron los cebadores CA1 y CA2 (10 µM) en lugar del cebador 1 de PCR. La PCR 2 se realizó usando 10-12 ciclos de 94 ºC durante 10 s, 68 ºC durante 30 s, 72 ºC durante 1,5 minutos. Los productos de PCR se analizaron usando electroforesis en 2 % de gel de agarosa.
[0411] Los productos de PCR se insertaron en pCR2.1 usando el kit de clonación de vectores T/A (Invitrogen). Las E. coli transformadas se sometieron a selección azul/blanco y con ampicilina. Las colonias blancas se recogieron y se dispusieron en matrices en placas de 96 pocillos y se cultivaron en cultivo líquido durante la noche. Para identificar insertos se realizó amplificación por PCR en 1 ml de cultivo bacteriano usando las condiciones de PCR1 y CA1 y CA2 como cebadores. Los productos de PCR se analizaron usando electroforesis en 2 % de gel de agarosa. [0412] Los clones bacterianos se almacenaron en 20 % de glicerol en un formato de 96 pocillos. El ADN de plásmido se preparó, se secuenció y se sometió a búsquedas de homología de ácidos nucleicos de las bases de datos GenBank, dbEST y NCI-CGAP.
Análisis de expresión por RT-PCR:
[0413] Los ADNc de la primera cadena se generaron a partir de 1 µg de ARNm con cebado con oligo (dT)1218 usando el sistema de preamplificación Gibco-BRL Superscript. Se usó el protocolo del fabricante e incluyó una incubación durante 50 min a 42 ºC con transcriptasa inversa, seguido de tratamiento con RNAsa H a 37 ºC durante 20 min. Después de completarse la reacción, el volumen se aumentó a 200 µl con agua antes de la normalización.
Se obtuvieron Los ADNc de la primera cadena de 16 tejidos humanos normales diferentes de Clontech.
[0414] La normalización de los ADNc de la primera cadena de múltiples tejidos se realizó usando los cebadores 5'atatcgccgcgctcgtcgtcgacaa3' (SEQ ID NO: 76) y 5'agccacacgcagctcattgtagaagg 3' (SEQ ID NO: 77) para amplificar β-actina. El ADNc de la primera cadena (5 µl) se amplificó en un volumen total de 50 µl que contenía cebadores 0,4 µM, 0,2 µM de cada dNTP, 1X tampón de PCR (Clontech, Tris-HCl 10 mM, MgCl2 1,5 mM, KCl 50 mM, pH 8,3) y 1X ADN polimerasa Klentaq (Clontech). Se extrajeron cinco µl de la reacción de PCR en 18, 20 y 22 ciclos y se usaron para electroforesis en gel de agarosa. La PCR se realizó usando un ciclador térmico MJ Research bajo las siguientes condiciones: la desnaturalización inicial fue a 94 ºC durante 15 s, seguido de 18, 20 y 22 ciclos de 94 ºC durante 15, 65 ºC durante 2 min, 72 ºC durante 5 s. Se llevó a cabo una extensión final a 72 ºC durante 2 min. Después de la electroforesis en gel de agarosa, las intensidades de bandas de las bandas de β-actina de 283 pb de múltiples tejidos se compararon por inspección visual. Los factores de dilución para los ADNc de la primera cadena se calcularon para producir intensidades de bandas de β-actina iguales en todos los tejidos después de 22 ciclos de PCR. Se requirieron tres rondas de normalización para lograr intensidades de bandas iguales en todos los tejidos después de 22 ciclos de PCR.
[0415] Para determinar los niveles de expresión del gen STEAP-1, 5 µl de ADNc de la primera cadena normalizado se analizaron por PCR usando 25, 30 y 35 ciclos de amplificación usando los siguientes pares de cebadores:
5' ACT TTG TTG ATG ACC AGG ATT GGA 3' (SEQ ID NO: 78) 5' CAG AAC TTC AGC ACA CAC AGG AAC 3' (SEQ ID NO: 79)
El análisis de expresión semi-cuantitativa se logró comparando los productos de PCR a números de ciclos que dan intensidades de bandas claras.
Resultados
[0416] Se condujeron varios experimentos de SSH como se ha descrito en Materiales y procedimientos, arriba, y condujeron al aislamiento de numerosos clones de fragmentos de genes candidatos. Todos los clones candidatos se secuenciaron y se sometieron a análisis de homología contra todas las secuencias en las grandes bases de datos de genes y de EST públicas con el fin de proporcionar información sobre la identidad del gen correspondiente y para ayudar a guiar en la decisión de analizar un gen particular para expresión diferencial. En general, fragmentos de genes que no tenían homología con ninguna secuencia conocida en ninguna de las bases de datos investigadas, y así considerados que representaban genes novedosos, además de fragmentos de genes que mostraban homología con marcas de secuencias expresadas (EST) previamente secuenciadas, se sometieron a análisis de expresión diferencial por RT-PCR y/o análisis Northern.
[0417] Uno de los clones de ADNc, designado STEAP-1, tuvo 436 pb de longitud y mostró homología con una secuencia de EST en la base de datos de genes tumorales NCI-CGAP. El ADNc de longitud completa que codifica el gen STEAP-1 se aisló posteriormente usando este ADNc y se renombró STEAP-1. La secuencia de nucleótidos del ADNc de STEAP-1 se corresponde con los residuos de nucleótidos 150 a 585 en la secuencia de ADNc de STEAP-1 como se muestra en la FIG. 1. Otro clon, designado 28P3E1, 561 pb de longitud, mostró homología con varias secuencias de EST en la base de datos de genes tumorales NCI-CGAP o en otras bases de datos. Parte de la secuencia de 28P3E1 (356 pb) es idéntica a una EST derivada de tejido fetal humano. Después de obtener y secuenciar el ADNc de STEAP-1 de longitud completa fue evidente que este clon también se corresponde con STEAP-1 (más específicamente, con los residuos 622 a través del extremo 3' de la secuencia de nucleótidos de STEAP-1 como se muestra en la FIG. 1).
Ejemplo 2: Aislamiento ADNc que codifica STEAP-1 de longitud completa
[0418] Se usó el fragmento del gen de STEAP-1 de 436 pb (véase el ejemplo titulado “Aislamiento generado por SSH de fragmento de ADNc del gen STEAP-1”) para aislar ADNc adicionales que codificaban el gen 8P1D4/STEAP-1. Brevemente, una biblioteca de ADNc de próstata humana normal (Clontech) se cribó con una sonda marcada generada a partir del ADNc de STEAP-1 de 436 pb. Uno de los clones positivos, el clon 10, tiene 1195 pb de longitud y codifica una proteína de 339 aminoácidos que tiene secuencias de nucleótidos y de aminoácidos codificadas que no llevan homología significativa con ningún gen o proteína humanos conocidos (homología con una proteína de lesión de riñón de rata descrita en la solicitud internacional WO98/53071). La proteína codificada contiene al menos 6 motivos transmembrana predichos que implica una orientación de la
superficie celular. Estas características estructurales condujeron a la designación “STEAP”, de “antígeno epitelial de seis transmembrana de la próstata, de Six Transmembrane Epithelial Antigen of the Prostate”.
[0419] La posterior identificación de proteínas “STEAP” adicionales condujeron al rediseño del producto del gen STEAP-1 como “STEAP-1”. El ADNc de STEAP-1 y secuencias de aminoácidos codificados se muestran en la FIG. 2A-Q. El clon 10 del ADNc de STEAP-1 se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipo (“ATCC”) (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, EEU.UU.) como el clon 10.1 de STEAP-1 de plásmido el 26 de agosto de 1998 como el número de acceso de ATCC 98849. El clon de ADNc de STEAP-1 puede escindirse del mismo usando digestión doble con EcoRI/XbaI (EcoRI en el extremo 5', Xbal en el extremo 3').
Ejemplo 3: Mapeo cromosómico de STEAP-1
[0420] La localización cromosómica puede implicar genes en patogénesis de enfermedad. Están disponibles varias estrategias de mapeo de cromosomas que incluyen hibridación fluorescente in situ (FISH), paneles de híbridos de radiación (RH) de ser humano/hámster (Walteran y col., 1994; Nature Genetics 7:22; Research Genetics, Huntsville Al), paneles de híbridos de células somáticas de ser humano-roedor tales como están disponibles de Coriell Institute (Camden, New Jersey) y visualizadores genómicos que utilizan homologías de BLAST para secuenciar y mapear clones genómicos (NCBI, Bethesda, Maryland).
[0421] STEAP-1 está mapeado en el cromosoma 7q21 usando la secuencia de STEAP-1 y la herramienta NCBI BLAST: (localizada en la malla mundial en (.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/page.cgi?F=HsBlast.html&&ORG=Hs)).
Ejemplo 4: Análisis de expresión de STEAP-1
[0422] La expresión de STEAP-1 en especímenes de pacientes con cáncer de estómago se muestra en la Figura 14(a)-(e). Figura 14(a) Se extrajo ARN de estómago normal (N) y de 10 especímenes de pacientes con cáncer de estómago diferentes (T). Se sondó transferencia Northern con 10 µg de ARN total/carril con secuencia de STEAP-1. Los resultados muestran una fuerte expresión de una STEAP-1 de aproximadamente 1,6 kb en los tejidos tumorales de estómago. El panel inferior representa tinción con bromuro de etidio de la transferencia que muestra la calidad de las muestras de ARN.
[0423] La Figura 14(b) muestra que STEAP-1 se expresó en tejidos de paciente con cáncer de recto. Se extrajo ARN de recto normal (N), tumores de pacientes con cáncer de recto (T) y metástasis de cáncer de recto (M). Se sondaron transferencias Northern con 10 µg de ARN total con la secuencia de STEAP-1. Los resultados muestran una fuerte expresión de STEAP-1 en los tejidos de paciente con cáncer de recto. El panel inferior representa tinción con bromuro de etidio de la transferencia que muestra la calidad de las muestras de ARN.
[0424] La expresión de STEAP-1 por RT-PCR demostró que STEAP-1 se expresa fuertemente en células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) (Figura 14(c)). Se preparó ADNc de la primera cadena a partir de células HUVEC, xenoinjertos de cáncer de próstata LAPC-4AD y LAPC-9AD, además de tejidos de cerebro humano. La normalización se realizó por PCR usando cebadores para actina y GAPDH. Se realizó PCR semi-cuantitativa, usando cebadores para STEAP-1, a 27 y 30 ciclos de amplificación. Como control se muestra PCR usando cebadores para actina. Los resultados muestran una fuerte expresión de STEAP-1 en células HUVEC similar a la expresión detectada en tejidos de xenoinjerto de cáncer de próstata. La expresión de STEAP-1 en células HUVEC indica que la elección como diana de STEAP-1 puede también elegir como diana células endoteliales de la neovasculatura de los tumores. En la Figura 14(d) se muestra la imagen de RT-PCR en gel de agarosa. En la Figura 14(e), productos de PCR se cuantificaron usando el software AlphaImager. Los resultados muestran una fuerte expresión de STEAP-1 en próstata normal entre todos los tejidos normales probados. La regulación por incremento de la expresión de STEAP-1 se detectó en conjunto de cáncer de próstata, conjunto de cáncer de vejiga, conjunto de cáncer de riñón, conjunto de cáncer de colon, conjunto de cáncer de pulmón, conjunto de cáncer de ovario y conjunto de cáncer de mama. Se detectó una fuerte expresión de STEAP-1 en conjunto de metástasis de cáncer, conjunto de xenoinjerto de cáncer de próstata y metástasis de próstata al ganglio linfático.
[0425] Expresión de STEAP-1 en especímenes de pacientes con linfoma (Figura 14(f)). Se preparó ADNc de la primera cadena a partir de un panel de especímenes de pacientes con linfoma. La normalización se realizó por PCR usando cebadores para actina. Se realizó PCR semi-cuantitativa, usando cebadores para STEAP-1, a 26 y 30 ciclos de amplificación. Se ejecutaron muestras en un gel de agarosa, y los productos de PCR se cuantificaron usando el software AlphaImager. La expresión se registró como fuerte o media, si la señal se detecta como 26 ó 30 ciclos de amplificación, respectivamente, y ausente si no se detecta señal incluso en 30 ciclos de amplificación. Los resultados muestran expresión de STEAP-1 en 8 de los 11 (72,7 %) especímenes de tumor probados.
Ejemplo 5: Variantes de corte y empalme de STEAP-1
[0426] Las variantes de transcritos son variantes de ARNm maduro del mismo gen que se producen por transcripción alternativa o corte y empalme alternativo. Los transcritos alternativos son transcritos del mismo gen, pero inician la transcripción en diferentes puntos. Las variantes de corte y empalme son variantes de ARNm cortadas y empalmadas de forma diferente del mismo transcrito. En eucariotas, cuando un gen multi-exónico se transcribe a partir de ADN genómico, el ARN inicial se corta y empalma para producir ARNm funcional, que sólo tiene exones y se usa para la traducción en una secuencia de aminoácidos. Por consiguiente, un gen dado puede tener cero a muchos transcritos alternativos y cada transcrito puede tener cero a muchas variantes de corte y empalme. Cada variante de transcrito tiene una única representación de exones y puede tener diferentes porciones codificantes y/o no codificantes (extremo 5' ó 3') del transcrito original. Las variantes de transcritos pueden codificar proteínas similares o diferentes con la misma función o una similar o pueden codificar proteínas con diferentes funciones, y pueden expresarse en el mismo tejido al mismo tiempo, o en diferentes tejidos al mismo tiempo, o en el mismo tejido en momentos diferentes, o en tejidos diferentes en momentos diferentes. Las proteínas codificadas por variantes de transcritos pueden tener localizaciones celulares o extracelulares similares o diferentes, por ejemplo, secretadas frente a intracelulares.
[0427] Las variantes de transcritos se identifican mediante una variedad de procedimientos aceptados en la materia. Por ejemplo, los transcritos y variantes de corte y empalme alternativos se identifican por experimento de clonación de longitud completa, o por uso de transcrito de longitud completa y secuencias EST. Primero, todas las EST humanas se agruparon en agrupaciones que mostraron la identidad directa o indirecta entre sí. Segundo, las EST en la misma agrupación se agruparon adicionalmente en sub-agrupaciones y se ensamblaron en una secuencia consenso. La secuencia del gen original se compara con la(s) secuencia(s) consenso u otras secuencias de longitud completa. Cada secuencia consenso es una posible variante de corte y empalme para ese gen (véase, por ejemplo, Kan, Z y col., Gene structure prediction and alternative splicing analysis using genomically aligned ESTs, Genome Research, mayo de 2001, 11 (5):889-900). Incluso cuando se identifica que una variante no es un clon de longitud completa, esa porción de la variante es muy útil para la generación de antígenos y para clonar adicionalmente la variante de corte y empalme de longitud completa, usando técnicas conocidas en la técnica.
[0428] Además, en la materia están disponibles programas informáticos que identifican variantes de transcritos basadas en secuencias genómicas. Los programas de identificación de variantes de transcritos basadas
en genómica incluyen FgenesH (A. Salamov y V. Solovyev. “Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA”,
Genome Research. Abril de 2000; 10(4):516-22); Grail (URL compbio.ornl.gov/Grail-bin/EmptyGrailForm) y GenScan (URL genes.mit.edu/GENSCAN.html). Para una discusión general de protocolos de identificación de variantes de corte y empalme véanse, por ejemplo, Southan, C., A genomic perspective on human proteases, FEBS Lett. 2001 Jun 8; 498(2-3):214-8; de Souza, S.J. y col., Identification of human chromosome 22 transcribed sequences with ORF expressed sequence tags, Proc. Natl Acad Sci U S A. 2000 Nov 7; 97(23):12690-3.
[0429] Para confirmar adicionalmente los parámetros de una variante de transcrito, en la materia están disponibles una variedad de técnicas, tales como clonación de longitud completa, validación proteómica, validación basada en PCR y validación con 5' RACE, etc. (véanse, por ejemplo, Proteomic Validation: Brennan, S.O. y col., Albumin banks peninsula: a new termination variant characterized by electrospray mass spectrometry, Biochem Biophys Acta. 1999 Aug 17;1433(1-2):321-6; Ferranti P y col., Differential splicing of pre-messenger RNA produces multiple forms of mature caprine alpha(s1)-casein, Eur J Biochem. 1997 Oct 1;249(1):1-7. Para validación basada en PCR: Wellmann S. y col., Specific reverse transcription-PCR quantification of vascular endothelial growth factor (VEGF) splice variants by LightCycler technology, Clin Chem. 2001 Apr;47(4):654-60; Jia, H.P. y col., Discovery of new human beta-defensins using a genomics-based approach, Gene. 2001 Jan 24; 263(1-2):211-8. Para validación basada en PCR y validación con 5' RACE: Brigle, K.E. y col., Organization of the murine reduced folate carrier gene and identification of variant splice forms, Biochem Biophys Acta. 1997 Aug 7; 1353(2): 191-8).
[0430] Se sabe en la técnica que las regiones genómicas se modulan en cánceres. Cuando la región genómica con la que se mapea un gen se modula en un cáncer particular, también se modulan los transcritos o variantes de corte y empalme alternativos del gen. En el presente documento se desvela que STEAP-1 tiene un perfil de expresión particular relacionado con el cáncer. Los transcritos y variantes de corte y empalme alternativos de STEAP-1 también pueden participar en cánceres en los mismos tejidos o tejidos diferentes, sirviendo así de marcadores/antígenos asociados a tumor.
[0431] La composición de exones del transcrito original, designada STEAP-1 v.1, se muestra en la Tabla LlII. Usando las secuencias de genes de longitud completa y de EST se identificaron dos variantes de transcritos, designados STEAP-1 v.2 y v.3. En comparación con STEAP-1 v.1, la variante del transcrito STEAP-1 v.2 no cortó y empalmó un intrón 4 de STEAP-1 v.1 y la variante STEAP-1 v.3 cortó y empalmó un exón adicional del intrón 4 de STEAP-1 v.1, como se muestra en la Figura 11. Teóricamente, cada combinación diferente de exones en orden espacial, por ejemplo, exones 2 y 3, es una posible variante de corte y empalme. La Figura 11 muestra el alineamiento esquemático de exones de las variantes de transcritos.
Ejemplo 6: Polimorfismos de un único nucleótido de STEAP-1
[0432] Un polimorfismo de un único nucleótido (SNP) es una variación en un único par de bases en una secuencia de nucleótidos en una localización específica. En cualquier punto dado del genoma hay cuatro posibles pares de bases de nucleótidos: A/T, C/G, G/C y T/A. El genotipo se refiere a la secuencia de pares de bases específica de una o más localizaciones en el genoma de un individuo. El haplotipo se refiere a la secuencia de pares de bases de más de una localización en la misma molécula de ADN (o el mismo cromosoma en organismos superiores), frecuentemente en el contexto de un gen o en el contexto de varios genes fuertemente ligados. SNP que se producen en un ADNc se llaman cSNP. Estos cSNP pueden cambiar aminoácidos de la proteína codificada por el gen y, por tanto, cambiar las funciones de la proteína. Algunos SNP producen enfermedades heredadas; otros contribuyen a variaciones cuantitativas en el fenotipo y a reacciones a factores medioambientales que incluyen dieta y fármacos entre individuos. Por tanto, los SNP y/o las combinaciones de alelos (llamados haplotipos) tienen muchas aplicaciones, que incluyen diagnóstico de enfermedades heredadas, determinación de reacciones a fármaco y
dosificación, identificación de genes responsables de enfermedades y análisis de la relación genética entre individuos (P. Nowotny, J. M. Kwon y A. M. Goate, “SNP analysis to dissect human traits”, Curr. Opin. Neurobiol. 2001 Oct; 11(5):637-641; M. Pirmohamed y B. K. Park, “Genetic susceptibility to adverse drug reactions”, Trends Pharmacol. Sci. 2001 Jun; 22(6): 298-305; J. H. Riley, C. J. Allan, E. Lai y A. Roses, “The use of single nucleotide polymorphisms in the isolation of common disease genes”, Pharmacogenomics. 2000 Feb; 1(1):39-47; R. Judson, J.
C. Stephens y A. Windemuth, “The predictive power of haplotypes in clinical response”, Pharmacogenomics. 2000 Feb; 1(1):15-26).
[0433] Los SNP se identifican por una variedad de procedimientos aceptados en la materia (P. Bean, “The promising voyage of SNP target discovery”, Am. Clin. Lab. 2001 Oct-Nov; 20(9):18-20; K. M. Weiss, “In search of human variation”, Genome Res. 1998 Jul; 8(7):691-697; M. M. She, “Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies”, Clin. Chem. 2001 Feb; 47(2):164-172). Por ejemplo, los SNP se identifican secuenciando fragmentos de ADN que muestran polimorfismo por procedimientos basados en gel tales como polimorfismo en la longitud del fragmento de restricción (RFLP) y electroforesis en gel en gradiente desnaturalizante (DGGE). También pueden descubrirse por secuenciación directa de muestras de ADN reunidas de diferentes individuos o comparando secuencias de diferentes muestras de ADN. Con la rápida acumulación de datos de secuencias en bases de datos públicas y privadas pueden descubrirse SNP comparando secuencias usando programas informáticos (Z. Gu, L. Hillier y P. Y. Kwok, “Single nucleotide polymorphism hunting in cyberspace”, Hum. Mutat. 1998; 12(4):221-225). Los SNP pueden verificarse y el genotipo o haplotipo de un individuo puede determinarse mediante una variedad de procedimientos que incluyen secuenciación directa y
micromatrices de alto rendimiento (P. Y. Kwok, “Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms”, Annu.
Rev. Genomics Hum. Genet. 2001; 2:235-258; M. Kokoris, K. Dix, K. Moynihan, J. Mathis, B. Erwin, P. Grass, B. Hines y A. Duesterhoeft, “High-throughput SNP genotyping with the Masscode system”, Mol. Diagn. 2000 Dec; 5(4):329-340).
[0434] Usando los procedimientos descritos anteriormente, catorce SNP se identificaron en el transcrito del clon GTH9, designado STEAP-1 v.2, en las posiciones 602 (C/G), 386 (C/T), 1087 (T/G), 1447 (T/C), 1621 (A/T), 1625 (G/T), 1716 (C/A), 2358 (C/T), 2646 (T/G), 2859 (T/G), 2908 (A/T), 3006 (G/C), 3107 (C/T) y 3180 (A/T). Los transcritos o proteínas con alelos alternativos se designaron variantes STEAP-1 v.4, v.5, v.6, v.7, v.8, v.9, v.10, v.11, v.12, v.13, v.14, v.15, v.16 y v.17, respectivamente. La Figura 10 muestra el alineamiento esquemático de las variantes de SNP. La Figura 12 muestra el alineamiento esquemático de las variantes de proteína, correspondientes a variantes de nucleótidos. Estos alelos de SNP, aunque se muestran por separado aquí, pueden producirse en diferentes combinaciones (haplotipos) y en una cualquiera de las variantes de transcritos (tales como STEAP-1 v.1 y v.3) que contienen el contexto de secuencia de los SNP. Por ejemplo, los dos primeros SNP también estuvieron en STEAP-1 v.3 en las mismas posiciones, pero en 572 y 356, respectivamente, en STEAP-1 v.1.
Ejemplo 7: Producción de STEAP-1 recombinante en sistemas procariotas
[0435] Para expresar STEAP-1 recombinante y variantes de STEAP-1 en células procariotas, secuencias de STEAP-1 de longitud completa o parcial y de ADNc de variantes de STEAP-1 se clonan en uno cualquiera de una variedad de vectores de expresión conocidos en la técnica. Se usan el ADNc de longitud completa, o cualquier 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más aminoácidos contiguos de STEAP-1, variantes o análogos de la misma.
A. Construcciones de transcripción y traducción in vitro:
[0436] pCRII: Para generar sondas de ARN sentido y antisentido de STEAP-1 para investigaciones in situ de ARN se generan construcciones de pCRII (Invitrogen, Carlsbad CA) que codifican tanto todo como los fragmentos del ADNc de STEAP-1. El vector pCRII tiene promotores Sp6 y T7 que flanquean el inserto para accionar la transcripción de ARN de STEAP-1 para su uso como sondas en experimentos de hibridación in situ de ARN. Estas sondas se usan para analizar la expresión de células y tejidos de STEAP-1 al nivel de ARN. El ARN de STEAP-1 transcrito que representa la región codificante de aminoácidos de ADNc del gen STEAP-1 se usa en sistemas de traducción in vitro tales como TnT™ Coupled Reticulolysate System (Promega, Corp., Madison, WI) para sintetizar proteína STEAP-1.
B. Construcciones bacterianas:
[0437] Construcciones de pGEX: Para generar proteínas STEAP-1 recombinantes en bacterias que están fusionadas con la proteína glutatión S-transferasa (GST), todo o partes del ADNc de STEAP-1 o variantes se clonan en el vector de fusión de GST (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Estas construcciones permiten la expresión controlada de secuencias de proteínas STEAP-1 recombinantes con GST fusionada en el extremo amino y un epítope de seis histidinas (6X His) en el extremo carboxilo. Las marcas GST y 6X His permiten la purificación de la proteína de fusión recombinante de bacterias inducidas con la matriz de afinidad apropiada y permiten el reconocimiento de la proteína de fusión con anticuerpos anti-GST y anti-His. La marca de 6X His se genera añadiendo 6 codones de histidina al cebador de clonación en el extremo 3', por ejemplo, del marco de lectura abierto (ORF). Un sitio de escisión proteolítica, tal como el sitio de reconocimiento PreScission™ en pGEX-6P-1, puede emplearse de forma que permita la escisión de la marca GST de la proteína relacionada con STEAP-1. El gen de resistencia a ampicilina y el origen pBR322 permiten la selección y el mantenimiento de los plásmidos pGEX en E. coli.
[0438] Construcciones de pMAL: Para generar, en bacterias, proteínas STEAP-1 recombinantes que están fusionadas con proteína de unión a maltosa (MBP), toda o partes de la secuencia codificante de proteínas de ADNc de STEAP-1 se fusionan con el gen MBP clonando en los vectores pMAL-c2X y pMAL-p2X (New England Biolabs, Beverly, MA). Estas construcciones permiten la expresión controlada de secuencias de proteínas STEAP-1 recombinantes con MBP fusionada en el extremo amino y una marca de epítope de 6X His en el extremo carboxilo. Las marcas MBP y 6X His permiten la purificación de la proteína recombinante de bacterias inducidas con la matriz de afinidad apropiada y permiten el reconocimiento de la proteína de fusión con anticuerpos anti-MBP y anti-His. La marca de epítope 6X His se genera añadiendo 6 codones de histidina al cebador de clonación de 3'. Un sitio de reconocimiento de factor Xa permite la escisión de la marca pMAL de STEAP-1. Los vectores pMAL-c2X y pMALp2X se optimizan para expresar la proteína recombinante en el citoplasma o periplasma, respectivamente. La expresión en el periplasma potencia el plegamiento de proteínas con enlaces disulfuro.
[0439] Construcciones de pET: Para expresar STEAP-1 en células bacterianas, toda o partes de la secuencia codificante de proteínas de ADNc de STEAP-1 se clonan en la familia pET de vectores (Novagen, Madison, WI). Estos vectores permiten la expresión fuertemente controlada de la proteína STEAP-1 recombinante en bacterias con y sin fusión con proteínas que potencian la solubilidad, tal como NusA y tiorredoxina (Trx), y marcas de epítopes, tales como 6X His y S-Tag™ que ayudan en la purificación y detección de la proteína recombinante. Por ejemplo, las construcciones se preparan utilizando el sistema de fusión pET NusA 43.1 de forma que las regiones de la proteína STEAP-1 se expresan como fusiones del extremo amino con NusA.
C. Construcciones de levadura:
[0440] Construcciones de pESC: Para expresar STEAP-1 en las especies de levadura Saccharomyces cerevisiae para la generación de proteína recombinante y estudios funcionales, toda o partes de la secuencia codificante de proteínas de ADNc de STEAP-1 se clonan en la familia pESC de vectores, conteniendo cada uno 1 de los 4 marcadores de selección, HIS3, TRP1, LEU2 y URA3 (Stratagene, La Jolla, CA). Estos vectores permiten la expresión controlada del mismo plásmido de hasta 2 genes diferentes o secuencias clonadas que contienen tanto las marcas de epítopes Flag™ como Myc en la misma célula de levadura. Este sistema es útil para confirmar interacciones proteína-proteína de STEAP-1. Además, la expresión en levadura da modificaciones postraduccionales similares tales como glucosilaciones y fosforilaciones, que se encuentran cuando se expresa en células eucariotas.
[0441] Construcciones de pESP: Para expresar STEAP-1 en las especies de levadura Saccharomyces pombe, toda o partes de la secuencia codificante de proteínas de ADNc de STEAP-1 se clonan en la familia pESP de vectores. Estos vectores permiten la expresión controlada de alto nivel de una secuencia de proteínas STEAP-1 que está fusionada en tanto el extremo amino como en el extremo carboxilo con GST que ayuda en la purificación de la proteína recombinante. Una marca de epítope Flag™ permite la detección de la proteína recombinante con anticuerpo anti-Flag™.
Ejemplo 8: Producción de STEAP-1 recombinante en sistemas eucariotas superiores
A. Construcciones de mamífero:
[0442] Para expresar STEAP-1 recombinante en células eucariotas, las secuencias de ADNc de STEAP-1 de longitud completa o parcial pueden clonarse en una cualquiera de una variedad de vectores de expresión conocidos en la técnica. Una o más de las siguientes regiones de STEAP-1 se expresan en estas construcciones, aminoácidos 1 a 339 de STEAP-1 v.1, v.4, aminoácidos 1 a 258 de v.2, aminoácidos 1 a 282 de v.3, o cualquier 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o más aminoácidos contiguos de STEAP-1, variantes o análogos de la misma. Puede expresarse una región de una variante específica de STEAP-1 que codifica un aminoácido en una posición específica que se diferencia del aminoácido de cualquier otra variante encontrada en esa la posición, o puede expresarse una región de una variante de STEAP-1 que se encuentra parcialmente o enteramente dentro de una secuencia que es única para esa variante.
[0443] Las construcciones pueden transfectarse en una cualquiera de una amplia variedad de células de mamífero tal como células 293T. Los lisados de células 293T transformadas pueden sondarse con el suero policlonal anti-STEAP-1, descrito en el presente documento.
[0444] Construcciones de pcDNA4/HisMax: Para expresar STEAP-1 en células de mamífero, un ORF de STEAP-1, o porciones del mismo, de STEAP-1 se clonan en pcDNA4/HisMax versión A (Invitrogen, Carlsbad, CA). La expresión de proteínas es accionada a partir del promotor del citomegalovirus (CMV) y el potenciador de la traducción SP16. La proteína recombinante tiene epítopes de Xpress™ y seis histidinas (6X His) fusionados con el
extremo amino. El vector pcDNA4/HisMax también contiene la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH) y la secuencia de terminación de la transcripción para potenciar la estabilidad de ARNm junto con el origen SV40 para la replicación episómica y el simple rescate de vectores en líneas celulares que expresan el antígeno T grande. El gen de resistencia a zeocina permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína y el gen de resistencia a ampicilina y el origen ColE1 permiten la selección y el mantenimiento del plásmido en E. coli.
[0445] Construcciones de pcDNA3.1/MycHis: Para expresar STEAP-1 en células de mamífero, un ORF de STEAP-1, o porciones del mismo, de STEAP-1 con un sitio de iniciación de la traducción de Kozak consenso se clonó en pcDNA3.1/MycHis versión A (Invitrogen, Carlsbad, CA). La expresión de proteínas es accionada a partir del promotor del citomegalovirus (CMV). Las proteínas recombinantes tienen el epítope de myc y el epítope de 6X His fusionado con el extremo carboxilo. El vector pcDNA3.1/MycHis también contiene la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH) y la secuencia de terminación de la transcripción para potenciar la estabilidad del ARNm, junto con el origen SV40 para la replicación episómica y el simple rescate de vectores en líneas celulares que expresan el antígeno T grande. Se usó el gen de resistencia a neomicina, ya que permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína, y el gen de resistencia a ampicilina y el origen ColE1 permiten la selección y el mantenimiento del plásmido en E. coli.
[0446] Construcción de pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO: Para expresar STEAP-1 en células de mamífero y para permitir la detección de las proteínas recombinantes usando fluorescencia, un ORF de STEAP-1, o porciones del mismo, con un sitio de iniciación de la traducción de Kozak consenso se clonan en pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO (Invitrogen, CA). La expresión de proteínas es accionada a partir del promotor del citomegalovirus (CMV). Las proteínas recombinantes tienen la proteína fluorescente verde (GFP) fusionada con el extremo carboxilo que facilita la detección in vivo no invasiva, y estudios de biología celular. El vector pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO también contiene la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH) y la secuencia de terminación de la transcripción para potenciar la estabilidad del ARNm, junto con el origen SV40 para la replicación episómica y el simple rescate de vectores en líneas celulares que expresan el antígeno T grande. El gen de resistencia a neomicina permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína, y el gen de resistencia a ampicilina y el origen ColE1 permiten la selección y el mantenimiento del plásmido en E. coli. Construcciones adicionales con una fusión de GFP del extremo amino se hacen en pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO que se extiende la longitud entera de una proteína STEAP-1.
[0447] PAPtag: Un ORF de STEAP-1, o porciones del mismo, se clona en pAPtag-5 (GenHunter Corp. Nashville, TN). Esta construcción genera una fusión de fosfatasa alcalina en el extremo carboxilo de una proteína STEAP-1 a la vez que fusiona la secuencia señal IgGκ con el extremo amino. También se generan construcciones en las que la fosfatasa alcalina con una secuencia señal IgGκ del extremo amino está fusionada con el extremo
amino de una proteína STEAP-1. Las proteínas STEAP-1 recombinantes resultantes se optimizan para la secreción en los medios de células de mamífero transfectadas y pueden usarse para identificar proteínas tales como ligandos
o receptores que interaccionan con proteínas STEAP-1. La expresión de proteínas es accionada a partir del promotor del CMV y las proteínas recombinantes también contienen epítopes de myc y 6X His fusionados en el extremo carboxilo que facilitan la detección y purificación. El gen de resistencia a zeocina presente en el vector permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína recombinante y el gen de resistencia a ampicilina permite la selección del plásmido en E. coli.
[0448] pTag5: Un ORF de STEAP-1, o porciones del mismo, se clonó en pTag-5. Este vector es similar a pAPtag, pero sin la fusión de fosfatasa alcalina. Esta construcción generó la proteína STEAP-1 con una secuencia
señal IgGκ del extremo amino y marcas de epítopes de myc y 6X His en el extremo carboxilo que facilitan la
detección y purificación por afinidad. La proteína STEAP-1 recombinante resultante se optimizó para la secreción en los medios de células de mamífero transfectadas, y se usa como inmunógeno o ligando para identificar proteínas tales como ligandos o receptores que interaccionan con las proteínas STEAP-1. La expresión de proteínas se accionó a partir del promotor del CMV. El gen de resistencia a zeocina presente en el vector permitió la selección de células de mamífero que expresan la proteína, y el gen de resistencia a ampicilina permite la selección del plásmido en E. coli.
[0449] PsecFc: Un ORF de STEAP-1, o porciones del mismo, también se clonó en psecFc. El vector psecFc se ensambló clonando la Fc de la inmunoglobulina humana G1 (IgG) (regiones bisagra, CH2, CH3) en pSecTag2 (Invitrogen, California). Esta construcción generó una fusión de Fc de IgG1 en el extremo carboxilo de las proteínas STEAP-1, a la vez que fusiona la secuencia señal IgGK con el extremo N. También se usan las fusiones de STEAP1 que utilizan la región Fc de IgG1 murina. Las proteínas STEAP-1 recombinantes resultantes se optimizaron para secreción en los medios de células de mamífero transfectadas, y se usaron como inmunógenos o para identificar proteínas tales como ligandos o receptores que interaccionan con la proteína STEAP-1. La expresión de proteínas es accionada a partir del promotor del CMV. El gen de resistencia a higromicina presente en el vector permitió la selección de células de mamífero que expresan la proteína recombinante, y el gen de resistencia a ampicilina permite la selección del plásmido en E. coli.
[0450] Construcciones de pSR : Para generar líneas celulares de mamífero que expresan STEAP-1
constitutivamente, ORF de STEAP-1, o porciones del mismo, de STEAP-1 se clonaron en construcciones pSRa. Se generaron retrovirus anfotrópicos y ecotrópicos por transfección de construcciones pSRa en la línea de encapsidación 293T-10A1 o co-transfección de pSRa y un plásmido colaborador (que contenía secuencias de encapsidación delecionadas) en las células 293, respectivamente. El retrovirus se usó para infectar una variedad de líneas celulares de mamífero, produciendo la integración del gen clonado, STEAP-1, en las líneas de células huésped. La expresión de proteínas se accionó a partir de una repetición terminal larga (LTR). El gen de resistencia a neomicina presente en el vector permitió la selección de células de mamífero que expresan la proteína, y el gen de resistencia a ampicilina y el origen ColE1 permiten la selección y el mantenimiento del plásmido en E. coli. Los vectores retrovirales se usaron después para infección y generación de diversas líneas celulares usando, por ejemplo, células PC3, NIH-3T3, TsuPr1, 293 o rat-1.
[0451] Se preparan construcciones pSRa adicionales que fusionan una marca de epítope tal como la marca FLAG™ con el extremo carboxilo de secuencias de STEAP-1 para permitir la detección usando anticuerpos anti-Flag. Por ejemplo, la secuencia de FLAG™ 5' gat tac aag gat gac gac gat aag 3' (SEQ ID NO: 80) se añade al
cebador de clonación en el extremo 3' de ORF. Se prepararon construcciones pSRa adicionales para producir tanto proteínas de fusión de GFP y myc/6X His del extremo amino como del extremo carboxilo de las proteínas STEAP-1 de longitud completa.
[0452] Vectores virales adicionales: Se preparan construcciones adicionales para administración mediada por virus y expresión de STEAP-1. Se logra alto título de virus que conduce a expresión de alto nivel de STEAP-1 en sistemas de administración viral tales como vectores adenovirales y vectores de amplicón de herpes. Secuencias codificantes de STEAP-1 o fragmentos de las mismas se amplifican por PCR y se subclonan en el vector lanzadera AdEasy (Stratagene). La recombinación y la encapsidación de virus se realizan según las instrucciones del fabricante para generar vectores adenovirales. Alternativamente, las secuencias codificantes de STEAP-1 o fragmentos de las mismas se clonan en el vector HSV-1 (Imgenex) para generar vectores virales de herpes. Los vectores virales se usan después para la infección de diversas líneas celulares tales como células PC3, NIH-3T3, 293 o rat-1.
[0453] Sistemas de expresión regulada: Para controlar la expresión de STEAP-1 en células de mamífero, secuencias codificantes de STEAP-1, o porciones de las mismas, se clonan en sistemas de expresión de mamífero regulados tales como el sistema T-Rex (Invitrogen), el sistema GeneSwitch (Invitrogen) y el sistema Ecdysone fuertemente regulado (Stratagene). Estos sistemas permiten el estudio de los efectos temporales y dependientes de la concentración de STEAP-1 recombinante. Estos vectores se usan después para controlar la expresión de STEAP1 en diversas líneas celulares tales como células PC3, NIH-3T3, 293 o rat-1.
B. Sistemas de expresión de baculovirus
[0454] Para generar proteínas STEAP-1 recombinantes en un sistema de expresión de baculovirus, ORF de STEAP-1, o porciones del mismo, se clonan en el vector de transferencia de baculovirus pBlueBac 4.5 (Invitrogen), que proporciona una marca de His en el extremo N. Específicamente, pBlueBac-STEAP-1 se co-transfecta con plásmido colaborador pBac-N-Blue (Invitrogen) en células de insecto SF9 (Spodoptera frugiperda) para generar baculovirus recombinante (véase el manual de instrucciones de Invitrogen para detalles). Entonces se recoge baculovirus del sobrenadante de células y se purifica por ensayo en placa.
Entonces se genera proteína STEAP-1 recombinante por infección de células de insecto HighFive (Invitrogen) con baculovirus purificado. La proteína STEAP-1 recombinante puede detectarse usando anticuerpo anti-STEAP-1 o anti-marca His. La proteína STEAP-1 puede purificarse y usarse en diversos ensayos basados en células o como inmunógeno para generar anticuerpos policlonales y monoclonales específicos para STEAP-1.
Ejemplo 9: Perfiles de antigenicidad y estructura secundaria
[0455] Las Figuras 5(a)-9(a) y 5(b)-9(b) representan gráficamente cinco perfiles de aminoácidos de las variantes 1 y 3 de STEAP-1, respectivamente, cada evaluación disponible accediendo al sitio web ProtScale localizado en la malla mundial en (URL.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) en el servidor de biología molecular ExPasy.
[0456] Estos perfiles: Figura 5(a) y (b), Hidrofilia, (Hopp T.P., Woods K.R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828); Figura 6(a) y (b), Hidropaticidad, (Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132); Figura 7(a) y (b), Porcentaje de residuos accesibles (Janin J., 1979 Nature 277:491-492); Figura 8(a) y (b), Flexibilidad promedio, (Bhaskaran R., y Ponnuswamy P.K,1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255); Figura 9(a) y (b), Giro beta (Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1:289-294); y opcionalmente otros disponibles en la materia, tal como en el sitio web ProtScale, se usaron para identificar regiones antigénicas de la proteína STEAP-1. Cada uno de los perfiles de aminoácidos anteriores de STEAP-1 se generaron usando los siguientes parámetros de ProtScale para análisis: 1) un tamaño de ventana de 9; 2) 100 % en peso de los extremos de ventana en comparación con el centro de la ventana; y, 3) valores del perfil de aminoácidos normalizados para encontrarse entre 0 y 1.
[0457] Los perfiles de hidrofilia (Figura 5(a) y (b)), hidropaticidad (Figura 6(a) y (b)) y porcentaje de residuos accesibles (Figura 7(a) y (b)) se usaron para determinar estiramientos de aminoácidos hidrófilos (es decir, valores superiores a 0,5 en el perfil de hidrofilia y de porcentaje de residuos accesibles, y valores inferiores a 0,5 en el perfil de hidropaticidad). Es probable que tales regiones se expongan al entorno acuoso, estén presentes sobre la superficie de la proteína y, por tanto, disponibles para reconocimiento inmunitario, tal como por anticuerpos.
[0458] Los perfiles de flexibilidad promedio (Figura 8(a) y (b)) y giro beta (Figura 9(a) y (b)) determinan estiramientos de aminoácidos (es decir, valores superiores a 0,5 en el perfil de giro beta y el perfil de flexibilidad promedio) que no están impuestos en estructuras secundarias tales como láminas beta y hélices alfa. También es más probable que tales regiones se expongan sobre la proteína y, por tanto, sean accesibles al reconocimiento inmunitario, tal como por anticuerpos.
[0459] Las secuencias antigénicas de la proteína STEAP-1 y de las proteínas de variante indicadas, por ejemplo, por los perfiles expuestos en la Figura 5(a) y (b), Figura 6(a) y (b), Figura 7(a) y (b), Figura 8(a) y (b) y/o Figura 9(a) y (b) se usan para preparar inmunógenos, tanto péptidos como ácidos nucleicos que los codifican, para generar anticuerpos anti-STEAP-1 terapéuticos y de diagnóstico. El inmunógeno puede ser cualquiera de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más de 50 aminoácidos contiguos, o los ácidos nucleicos correspondientes que los codifican, de las variantes de proteína STEAP-1 enumeradas en las Figuras 2 y 3. En particular, los inmunógenos de péptido pueden comprender una región de péptido de al menos 5 aminoácidos de las Figuras 2 y 3 en cualquier incremento de número entero que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor superior a 0,5 en el perfil de hidrofilia de la Figura 5(a) y (b); una región de péptido de al menos 5 aminoácidos de las Figuras 2 y 3 en cualquier incremento de número entero que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor inferior a 0,5 en el perfil de hidropaticidad de la Figura 6(a) y (b); una región de péptido de al menos 5 aminoácidos de las Figuras 2 y 3 en cualquier incremento de número entero que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor superior a 0,5 en el perfil de porcentaje de residuos accesibles de la Figura 7(a) y (b); una región de péptido de al menos 5 aminoácidos de las Figuras 2 y 3 en cualquier incremento de número entero que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor superior a 0,5 en el perfil de flexibilidad promedio en la Figura 8(a) y (b); y, una región de péptido de al menos 5 aminoácidos de las Figuras 2 y 3 en cualquier incremento de número entero que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor superior a 0,5 en el perfil de giro beta de la Figura 9(a) y (b). Los inmunógenos de péptidos también pueden comprender ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los anteriores.
[0460] Todos los inmunógenos de la divulgación, péptido o ácido nucleico, pueden expresarse en forma de dosis unitaria humana, o estar comprendidos por una composición que incluye un excipiente farmacéutico compatible con la fisiología humana.
[0461] Las estructuras secundarias de la variante 1 y la variante 3 de la proteína STEAP-1, concretamente la presencia y localización predicha de las hélices alfa, cadenas extendidas y bobinas al azar, se predicen a partir de las secuencias de aminoácidos primarias respectivas usando el procedimiento de Red neural jerárquica HNN (Guermeur,1997, http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html), al que se accede por el servidor de biología molecular ExPasy localizado en la malla mundial en (.expasy.ch/tools/). El análisis indica que la variante 1 de STEAP-1 está compuesta por 64,60 % de hélice alfa, 4,72 % de cadena extendida y 30,68 % de bobina al azar (Figura 13a). La variante 2 de STEAP-1 está compuesta por 62,79 % de hélice alfa, 3,10 % de cadena extendida y 34,11 % de bobina al azar (Figura 13b). La variante 3 de STEAP-1 está compuesta por 58,87 % de hélice alfa, 5,32 % de cadena extendida y 35,82 % de bobina al azar (Figura 13c).
[0462] El análisis para la posible presencia de dominios transmembrana en variantes de STEAP-1 se llevó a cabo usando una variedad de algoritmos de predicción transmembrana a los que se accede por el servidor de biología molecular ExPasy localizado en la malla mundial en (.expasy.ch/tools/). Se muestran gráficamente los resultados del análisis de la variante 1 que representan la presencia y localización de 6 dominios transmembrana usando el programa TMpred (Figura 13d) y el programa TMHMM (Figura 13e). También se muestran los resultados del análisis de la variante 2 que representan la presencia y localización de 4 dominios transmembrana usando TMpred (Figura 13f) y 3 dominios transmembrana usando TMHMM (Figura 13g). El análisis de la variante 3 predice la presencia de 4 dominios transmembrana usando TMpred (Figura 13h) y 3 dominios transmembrana con TMHMM (Figura 13i). Los resultados de cada programa, concretamente los aminoácidos que codifican los dominios transmembrana, se resumen en la Tabla XX.
Ejemplo 10: Generación de anticuerpos policlonales para STEAP-1
[0463] Los anticuerpos policlonales pueden producirse en un mamífero, por ejemplo, por una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Normalmente, el agente inmunizante y/o adyuvante se inyectarán en el mamífero por inyecciones subcutáneas o intraperitoneales múltiples. Además de inmunizar con una variante de proteína STEAP-1 de longitud completa, se emplean algoritmos informáticos en el diseño de inmunógenos que, basándose en el análisis de secuencias de aminoácidos, contienen características de ser antigénicas y estar disponibles para el reconocimiento por el sistema inmunitario del huésped inmunizado (véase
el ejemplo titulado “Perfiles de antigenicidad y estructura secundaria”). Se predeciría que tales regiones son
hidrófilas, flexibles, en conformaciones de giro beta y están expuestas sobre la superficie de la proteína (véanse, por ejemplo, la Figura 5(a) y (b), Figura 6(a) y (b), Figura 7(a) y (b), Figura 8(a) y (b) y/o Figura 9(a) y (b) para perfiles de aminoácidos que indican tales regiones de variantes 1 y 3 de la proteína STEAP-1).
[0464] Por ejemplo, las proteínas o péptidos de fusión bacterianos recombinantes que contienen regiones de giro beta flexibles hidrófilas de variantes de la proteína STEAP-1 se usan como antígenos para generar anticuerpos policlonales en conejos blancos de Nueva Zelanda o anticuerpos monoclonales como se describen en el ejemplo titulado (“Generación de anticuerpos monoclonales para STEAP-1 (mAb)). Por ejemplo, tales regiones incluyen, pero no se limitan a, los aminoácidos 1.40, aminoácidos 143-165, aminoácidos 180-220, de las variantes 1, 2 y 3 de STEAP-1, los aminoácidos 312-339 de la variante 1 de STEAP-1 y los aminoácidos 250-282 de la variante 3 de STEAP-1. Es útil conjugar el agente inmunizante con una proteína que se sabe que es inmunogénica en el mamífero que se inmuniza. Ejemplos de tales proteínas inmunogénicas incluyen, pero no se limitan a, hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina de suero, tiroglobulina bovina e inhibidor de tripsina de soja. Un péptido que codifica los aminoácidos 250-282 de la variante 3 de STEAP-1 puede conjugarse con KLH. Este péptido se usa entonces como inmunógeno. Alternativamente, el agente inmunizante puede incluir toda o porciones de las proteínas de variantes de STEAP-1, análogos o proteínas de fusión de las mismas. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la variante 1 de STEAP-1 puede fusionarse usando técnicas de ADN recombinante con una cualquiera de una variedad de componentes de proteínas de fusión que son muy conocidos en la técnica, tal como proteínas de fusión marcadas con glutatión-S-transferasa (GST) y HIS. En otro ejemplo, los aminoácidos 250-282 de la variante 1 de STEAP-1 se fusionan con GST usando técnicas recombinantes y el vector de expresión pGEX se expresó, purificó y usó para inmunizar un conejo. Tales proteínas de fusión se purifican de bacterias inducidas usando la matriz de afinidad apropiada.
[0465] Otras proteínas de fusión bacterianas recombinantes que pueden emplearse incluyen proteína de unión a maltosa, LacZ, tiorredoxina, NusA, o una región constante de inmunoglobulina (véanse la sección titulada “Producción de STEAP-1 en sistemas procariotas” y Current Protocols In Molecular Biology, volumen 2, Unidad 16, Frederick M. Ausubul y col., eds., 1995; Linsley, P.S., Brady, W., Urnes, M., Grosmaire, L., Damle, N. y Ledbetter, L.(1991) J. Exp. Med. 174, 561-566).
[0466] Además de proteínas de fusión derivadas de bacteria también se usan antígenos de proteínas expresadas en mamífero. Estos antígenos se expresan a partir de vectores de expresión de mamífero tales como los vectores de fusión con Tag5 y Fc (véase la sección titulada “Producción de STEAP-1 recombinante en sistemas eucariotas”), y retienen modificaciones postraduccionales tales como glucosilaciones encontradas en la proteína nativa. En un ejemplo, los aminoácidos 185-218 de la variante 1 de STEAP-1 se clonaron en el vector de secreción de mamífero Tag5, y se expresó en células 293T. La proteína recombinante se purificó por cromatografía en quelato metálico a partir de sobrenadantes de cultivo de tejido de células 293T que expresan establemente el vector recombinante. Entonces, la proteína Tag5-variante 1 de STEAP-1 purificada se usa como inmunógeno.
[0467] Durante el protocolo de inmunización es útil mezclar o emulsionar el antígeno en adyuvantes que potencien la respuesta inmunitaria del animal huésped. Ejemplos de adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante MPL-TDM (monofosforil lípido A, trehalosa dicorinomicolato sintético).
[0468] En un protocolo típico, conejos se inmunizan inicialmente subcutáneamente con hasta 200 µg, normalmente 100-200 µg, de proteína de fusión o péptido conjugado con KLH mezclada en adyuvante completo de Freund (CFA). Entonces, los conejos se inyectan subcutáneamente cada dos semanas con hasta 200 µg, normalmente 100-200 µg, del inmunógeno en adyuvante incompleto de Freund (IFA). Los sangrados de prueba se toman aproximadamente 7-10 días tras cada inmunización y se usan para monitorizar el título del antisuero por ELISA.
[0469] Para probar la reactividad y especificidad de suero inmune, tal como el suero de conejo derivado de inmunización con la fusión de GST de la proteína de variante 1 de STEAP-1, el ADNc de la variante 1 de STEAP-1 de longitud completa se clona en el vector de expresión pCDNA3.1/myc-his (Invitrogen, véase el ejemplo titulado “Producción de STEAP-1 recombinante en sistemas eucariotas”). Después de la transfección de las construcciones en células 293T, los lisados celulares se sondan con el suero anti-STEAP-1 y con anticuerpo anti-His (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) para determinar reactividad específica para proteína STEAP-1 desnaturalizada usando la técnica de transferencia Western. Además, el suero inmune se prueba por microscopía de fluorescencia, citometría de flujo e inmunoprecipitación contra 293T y otras células recombinantes que expresan STEAP-1 para determinar el reconocimiento específico de proteína nativa. La transferencia Western, inmunoprecipitación, microscopía fluorescente y técnicas de citometría de flujo usando células que expresan endógenamente STEAP-1 también se llevan a cabo para probar la reactividad y especificidad.
[0470] El antisuero de conejos inmunizados con proteínas de fusión de variantes de STEAP-1, tales como proteínas de fusión GST y MBP, se purifican por agotamiento de anticuerpos reactivos con la secuencia del componente de fusión por pase sobre una columna de afinidad que contiene el componente de fusión tanto solo como en el contexto de una proteína de fusión irrelevante. Por ejemplo, el antisuero derivado de una proteína de fusión de GST-variante 1 de STEAP-1 se purifica primero por pase sobre una columna de proteína GST covalentemente acoplada a la matriz AffiGel (BioRad, Hercules, Calif.). Entonces, el antisuero se purifica por afinidad por pase sobre una columna compuesta de una proteína de fusión MBP-STEAP-1 covalentemente acoplada a matriz de AffiGel. Entonces, el suero se purifica adicionalmente por cromatografía de afinidad por proteína G para aislar la fracción de IgG. Los sueros de otros antígenos marcados con His y conejos inmunizados con péptido, además de sueros agotados en componente de fusión, se purifican por afinidad por pase sobre una matriz de columna compuesta por el inmunógeno de la proteína original o péptido libre.
Ejemplo 11: Generación de anticuerpos monoclonales para STEAP-1 (mAb)
[0471] En un ejemplo, los mAb terapéuticos para variantes de STEAP-1 comprenden aquellos que reaccionan con epítopes específicos para cada proteína de variante o específicos para secuencias en común entre las variantes que se unirían, internalizarían, alterarían o modularían la función biológica de las variantes de STEAP1, por ejemplo, aquellas que alterarían la interacción con ligandos y componentes de unión. Los inmunógenos para la generación de tales mAb incluyen aquellos diseñados para codificar o contener el dominio extracelular o la secuencia de la variante de la proteína STEAP-1 entera, regiones que se predice que contienen motivos funcionales y regiones de las variantes de la proteína STEAP-1 que se predice que son antigénicas del análisis informático de la secuencia de aminoácidos (véanse, por ejemplo, la Figura 5(a)-(b), Figura 6(a)-(b), Figura 7(a)-(b), Figura 8(a)-(b) o la Figura 9(a)-(b), y el ejemplo titulado “Perfiles de antigenicidad y estructura secundaria”). Los inmunógenos incluyen péptidos, proteínas bacterianas recombinantes y proteínas Tag 5 expresadas de mamífero y proteínas de fusión de IgG-Fc humanas y murinas. Además, para inmunizar ratones se usan proteína pTAG5, vectores de ADN que codifican las células pTAG5 manipuladas para expresar altos niveles de una variante de STEAP-1 respectiva, tales como 293T-variante 1 de STEAP-1 o 3T3, RAT, o prelinfocitos B murinos de 300.19-variante 1 de STEAP-1.
[0472] Para generar mAb para variantes de STEAP-1, los ratones se inmunizan primero intraperitonealmente (IP) o en la almohadilla plantar con, normalmente, 10-50 µg de inmunógeno de proteína o 107 células que expresan STEAP-1 mezcladas en adyuvante completo de Freund. Ejemplos de otros adyuvantes usados son Titermax (Sigma) e ImmunEasy (Qlagen). Entonces, los ratones se inmunizan posteriormente IP cada 2-4 semanas con, normalmente, 10-50 µg de inmunógeno de proteína o 107 células mezcladas en adyuvante incompleto de Freund. Alternativamente, en las inmunizaciones se usa adyuvante MPL-TDM. Además de la proteína anterior y las estrategias de inmunización basadas en célula, se emplea un protocolo de inmunización basado en ADN en el que un vector de expresión de mamífero que codifica una secuencia de variante de STEAP-1 se usa para inmunizar ratones por inyección directa del ADN de plásmido. Por ejemplo, los aminoácidos 185-218 de STEAP-1 de la variante 1 se clonaron en el vector de secreción de mamífero Tag5 y el vector recombinante se usó entonces como inmunógeno. En otro ejemplo, los mismos aminoácidos se clonaron en un vector de secreción de fusión de Fc en el que la secuencia de la variante 1 de STEAP-1 está fusionada en el extremo amino con una secuencia conductora IgK y en el extremo carboxilo con la secuencia codificante de la región Fc de IgG humana o murina. Entonces, este vector recombinante se usó como inmunógeno. Los protocolos de inmunización de plásmidos se usaron en combinación con proteínas purificadas expresadas a partir del mismo vector y con células que expresan la variante respectiva de STEAP-1. En otro ejemplo, un anticuerpo monoclonal para la variante 3 de STEAP-1 se genera usando un péptido que codifica los aminoácidos 250-282. El péptido está conjugado con KLH y se usa como inmunógeno. Se usa ELISA en el péptido libre para identificar clones inmunorreactivos. La reactividad y especificidad de los anticuerpos monoclonales para la proteína de la variante 1 de STEAP-1 de longitud completa se monitorizan por transferencia Western, inmunoprecipitación y citometría de flujo usando tanto células de la variante 1 de STEAP-1 recombinantes como que se expresan endógenamente.
[0473] Durante el protocolo de inmunización, sangrados de prueba se toman 7-10 días tras una inyección para monitorizar título y especificidad de la respuesta inmunitaria. Una vez se obtiene la reactividad y especificidad apropiada como se ha determinado por análisis de ELISA, transferencia Western, inmunoprecipitación, microscopía de fluorescencia y de citometría de flujo, entonces se lleva a cabo la fusión y generación de hibridomas con procedimientos establecidos muy conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, 1988).
[0474] La afinidad de unión de anticuerpos monoclonales específicos para la variante 1 de STEAP-1 se determinó usando tecnologías convencionales. Las mediciones de la afinidad cuantifican la fuerza de la unión del anticuerpo al epítope y se usan para ayudar a definir qué anticuerpos monoclonales para variante de STEAP-1 son preferidos para uso de diagnóstico o terapéutico, como se aprecia por un experto en la materia. El sistema BIAcore (Uppsala, Suecia) es un procedimiento preferido para determinar la afinidad de unión. El sistema BIAcore usa resonancia de plasmones superficiales (SPR, Welford K. 1991, Opt. Quant. Elect. 23:1; Morton y Myszka, 1998, Methods in Enzymology 295: 268) para monitorizar interacciones biomoleculares en tiempo real. El análisis BIAcore genera convenientemente constantes de asociación, constantes de disociación, constantes de disociación en equilibrio y constantes de afinidad.
[0475] Para generar anticuerpos monoclonales específicos para otras variantes de STEAP-1 se diseñan inmunógenos que codifican secuencias de aminoácidos únicas para las variantes. Un péptido que codifica aminoácidos únicos para variantes de STEAP-1 puede sintetizarse, acoplarse a KLH y usarse como inmunógeno.
Pueden prepararse péptidos o proteínas de fusión bacterianas que engloban la secuencia única generada por corte y empalme alternativo de variantes. Entonces se seleccionan hibridomas que reconocen el antígeno específico de variante respectivo y también reconocen la proteína de variante de longitud completa expresada en células. Tal selección utiliza inmunoensayos descritos anteriormente tales como transferencia Western, inmunoprecipitación y citometría de flujo.
[0476] La divulgación proporciona anticuerpos monoclonales designados X92.1.30.1.1(1) (a.k.a. M2/92.30) y X120.545.1.1 (a.k.a. M2.120.545). M2/92.30 y M2/120.545 se identificaron y se muestra que reaccionan y se unen a STEAP-1 de la superficie celular (véanse las Figuras 15 y 18). La Figura 16 muestra que el mAb anti-STEAP-1 M2/92.30 se une a STEAP-1 de la superficie celular endógena expresada en células de xenoinjerto de cáncer de vejiga y de próstata. Adicionalmente, M2/92.30 reacciona y se une a STEAP-1 murina como se muestra en la Figura
17.
[0477] Los anticuerpos designados X92.1.30.1.1(1) (a.k.a. M2/92.30) y X120.545.1.1 (a.k.a. M2.120.545) se enviaron (por Federal Express) a la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 el 6 de febrero de 2004 y se les asignaron los números de acceso PTA-5802 y PTA-5803, respectivamente.
[0478] Para clonar los anticuerpos M2/X92.30 y M2/X120.545 se usaron los siguientes protocolos. Células de hibridoma se lisaron con reactivo Trizol (Life Technologies, Gibco BRL). Se purificó ARN total y se cuantificó. Se generaron ADNc de la primera cadena a partir de ARN total cebando oligo (dT)12-18 usando el sistema Gibco-BRL Superscript Preamplification. Los productos de PCR se clonaron en el vector pCRScript (Stratagene, La Jolla). Se
secuenciaron varios clones y se determinaron las regiones de la cadena pesada variable (“VH”) y ligera variable (“VL”). Las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de regiones de la cadena pesada y ligera variables de M2/X92.30 y M2/X120.545 se enumeran en la Figura 19(a)-19(d) y la Figura 20(a)-(e).
Ejemplo 12: Caracterización de anticuerpos para STEAP-1
A. Unión a la superficie celular
[0479] La reactividad de los anticuerpos para STEAP-1 con una proteína relacionada con STEAP-1 puede establecerse por varios medios muy conocidos, que incluyen transferencia Western, inmunoprecipitación, ELISA y análisis de FACS usando, según convenga, proteínas relacionadas con STEAP-1, células que expresan STEAP-1 o extractos de las mismas. Como se muestra en la Figura 15, el análisis de FACS de células 3T3 y Rat-1 recombinantes que expresan establemente tanto STEAP-1 como un control teñido con el mAb anti-STEAP M2/92.30 (10 ug/ml) y mAb unido a la superficie celular se detectó con un reactivo secundario de cabra de conjugado de anti-IgG de ratón-PE. Entonces, las células teñidas se sometieron a análisis de FACS. Como se indica por el desplazamiento fluorescente de las células Rat1-STEAP1 y 3T3-STEAP1 en comparación con las células de control respectivas, M2/92.30 se une específicamente a STEAP-1 de la superficie celular.
[0480] Además, cuando células de cáncer de vejiga UGB1 y células de cáncer de próstata LAPC9 se tiñeron con 10 ug/ml de tanto mAb M2/92.30 como con un mAb anti-KLH de control, el mAb unido a la superficie 92.30 se detectó con Ab secundario de cabra conjugado con anti-IgG de ratón-PE. Entonces, las células teñidas se sometieron a análisis de FACS. Estos resultados demuestran que el mAb anti-STEAP-1 M2/92.30 se une específicamente a STEAP-1 de la superficie celular endógena expresada en células de xenoinjerto de cáncer de vejiga y de próstata (Figura 21).
[0481] También se muestra que STEAP-1 M2/92.30 se une a la proteína STEAP-1 murina (véase la Figura 17). En este experimento, células 293T se transfectaron transitoriamente con tanto pcDNA3.1 que codifica el ADNc de STEAP-1 murina como con un vector vacío. 48 horas después, las células se recogieron y se tiñeron con mAb anti-STEAP-1 M2/92.30 (10 ug/ml) y se detectó el mAb 92.30 unido a la superficie celular con un reactivo secundario de cabra de conjugado anti-IgG de ratón-PE. Entonces, las células se sometieron a análisis de FACS. Se mostró que STEAP-1 M2/92.30 se unía específicamente a células 293T expresadas en STEAP-1.
[0482] También se muestra que STEAP-1 M2/120.545 se une específicamente a STEAP-1 (véase la Figura 18). Células 3T3-neo (Panel A, histogramas rellenos) y 3T3-STEAP1 (Panel A, histogramas sin rellenar) y células Rat1-neo (Panel B, histogramas rellenos) y Rat1-STEAP (Panel B, histogramas sin rellenar) se tiñeron con mAb M2/120.545 (10 ug/ml) y se detectó el mAb unido a la superficie con Ab secundario de cabra conjugado con anti-IgG de ratón-PE. Entonces, las células se sometieron a análisis de FACS. Como se indica por el desplazamiento de fluorescencia de las células 3T3-STEAP1 y Rat1-STEAP1 en comparación con sus controles de neo respectivos, el mAb M2/120.545 se une específicamente a STEAP-1 de la superficie celular. En el panel C, las células LNCaP se tiñeron con tanto mAb M2/120.545 como mAb anti-KLH de control y se sometieron a análisis de FACS como antes. En el panel D, la microscopía de fluorescencia de las células LNCaP teñidas con M2/120.545 muestra fluorescencia de la superficie celular brillante.
[0483] La reactividad y especificidad de M2/92.30 y M2/120.545 también se determinaron por inmunoprecipitación. La Figura 25 muestra células 3T3-STEAP1 y 3T3-neo que se lisaron en tampón RIPA (Tris-Cl 25 mM a pH 7,4; NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, 1 % de Triton X-100, 0,5 % de ácido desoxicólico, 0,1 % de SDS y mezcla de inhibidores de proteasas). Los lisados celulares se aclararon previamente con perlas de proteína G-Sepharose y luego se incubaron con 5 ug de tanto mAb M2/92.30 como M2/120.545 durante 2 horas a temperatura ambiente. Se añadieron perlas de proteína G y la mezcla se incubó adicionalmente durante 1 hora. Los inmunocomplejos se lavaron y se solubilizaron en tampón de muestra de SDS-PAGE. Entonces, las muestras solubilizadas se sometieron a SDS-PAGE y análisis de transferencia Western usando un mAb de conejo anti-STEAP. Los lisados de células completas de células 293T transfectadas con STEAP-1 también se ejecutaron como un control positivo. Se observó una banda inmunorreactiva de -37 kD solo en muestras derivadas de células 3T3-STEAP1 indicativa de inmunoprecipitación específica de STEAP-1 por tanto mAb M2/92.30 como M2/120.545.
B. Internalización de anticuerpos para STEAP-1
[0484] La inmunoterapia basada en la administración de toxinas hacia dianas celulares específicas usando anticuerpos monoclonales se considera una modalidad en la terapia de tumores malignos. El principio general es la administración de toxinas o fármacos antineoplásicos a células cancerosas con moléculas que se unen a antígenos
o receptores que se expresan tanto únicamente como se expresan en exceso sobre las células diana con respecto a tejidos normales.
[0485] Las inmunotoxinas consisten en ligandos selectivos de células (normalmente anticuerpos monoclonales o citocinas) ligados covalentemente a toxinas. La interacción de anticuerpo o ligando con receptores de la superficie celular desencadena la internalización. En compartimentos de vesículas intracelulares definidos, el resto de toxina escapa al citosol, en el que altera catalíticamente funciones celulares que conducen a muerte celular. Véase, Frankel AE., Increased Sophistication of Immunotoxins, Clinical Cancer Research 8: 942-944, (2002) y Allen TM, Ligand-Targeted Therapeutics in Anti-cancer Therapy. Nature Reviews. 2:750-760, (2002).
[0486] La saponina es una proteína inactivante de ribosomas (RIP) que cataliza la despurinación in vitro de un residuo de adenina específico en ARN ribosómicos grandes. Endo Y y col., Mechanism of Action of the Toxin Lectin Ricin on Eukaryotic Cells; The Site and Characteristics of the Modification in 28S RNA Caused by the Toxin, J. Biol. Chem. 262,5908-5912, (1987). Normalmente no pueden entrar células a menos que se complejen con una molécula transportadora apropiada. La conjugación covalente de saporina con anticuerpos monoclonales que reconocen antígenos de tumor produce inmunotoxinas que poseen tanto selectividad por células cancerosas como son internalizadas. Véanse Flavell, DJ, Saponin Immunotoxins, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 234: 51-61, (1998) y Flavell DJ y col., Therapy of Human T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia with a Combination of Anti-CD7 and AntiCD38-Saporin Immunotoxins is Significantly Better than Therapy with Each Individual Immunotoxins. Br. J. Cancer
84: 571-578, (2001). Estas moléculas han entrado recientemente en ensayos clínicos de fase I para leucemia y mieloma múltiple. Foon KA. Monoclonal Antibody Therapies for Lymphomas. Cancer J. 6: 273-278, (2000).
[0487] La internalización de STEAP-1 M2/92.30 se muestra en la Figura 22. En este experimento, células PC3-STEAP1 se tiñeron a 4 ºC con el mAb M2/120.545 (10 ug/ml), se lavaron, luego se incubaron con Ab secundario de cabra conjugado con anti-IgG de ratón-PE. La mitad de las células se movieron a 37 ºC durante 30 minutos y la otra mitad permaneció a 4 ºC. Las células de cada tratamiento se sometieron entonces a microscopía fluorescente. Las células que permanecieron a 4 ºC mostraron tinción brillante sobre la circunferencia de la superficie celular. Las células que se movieron a 37 ºC mostraron pérdida de la tinción sobre la circunferencia celular y la aparición de fluorescencia punteada y agregada indicativa de encapuchado e internalización.
[0488] La internalización de STEAP-1 por el mAb para STEAP-1 M2/120.545 se muestra en la Figura 23. Se tiñeron células PC3-STEAP1 a 4 ºC con el mAb M2/120.545 (10 ug/ml), se lavaron, luego se incubaron con Ab secundario de cabra conjugado con anti-IgG de ratón-PE. La mitad de las células se movieron a 37 ºC durante 30 minutos y la otra mitad permaneció en 4 ºC. Entonces, las células de cada tratamiento se sometieron a microscopía
fluorescente. Las células que permanecieron a 4 ºC mostraron fluorescencia de la superficie celular “similar a anillo” brillante. Las células que se movieron a 37 ºC mostraron pérdida de la fluorescencia de la superficie celular “similar a anillo” y aparición de fluorescencia punteada y agregada indicativa de encapuchado e internalización.
[0489] Una estrategia para seleccionar candidatos a anticuerpos apropiados para la administración de inmunotoxina emplea destrucción con un anticuerpo secundario conjugado con una molécula de fármaco o toxina. El anticuerpo conjugado secundario se monta a caballito sobre el anticuerpo primario permitiendo la evaluación del anticuerpo primario para internalizar y traficar a compartimentos intracelulares apropiados. Una vez se internaliza el conjugado, la saporina se separa del agente que elige diana e inactiva los ribosomas para eliminar células diana. Kohls MD y Lappi DA. MAb-ZAP: A Tool for Evaluating Antibody Efficacy for Use in an Immunotoxin. Bio Techniques. 28(1): 162-165 (2000).
[0490] Para seleccionar el candidato a anticuerpo apropiado usando la estrategia anterior se usó una inmunotoxina secundaria, conjugados de anti-IgG de ratón - saporina (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA) para demostrar que STEAP-1 murina M2/120.545 entra en las células diana mediante la expresión de STEAP-1 sobre la superficie celular de célula LNCaP. Se usaron los siguientes protocolos. Se sembraron células LNCaP a 5000 células/90 µl/pocillo en placa de 96 pocillos y se incubaron durante la noche. Se prepararon los segundos conjugados de inmunotoxina (anti-IgG de ratón-saporina y anti-IgG de cabra-saporina) y anti-IgG de ratón en medio celular que contenía la concentración final a 100 ng/ml. Se añadieron 10 µl a cada pocillo. El anticuerpo primario se añade a la concentración de 1-1000 ng/ml. Las placas se incubaron 72 horas y la viabilidad se determinó por ensayo de MTT. Los resultados en la Figura 24 muestran que células LNCaP se destruyeron en presencia de anti-IgG de ratón-saporina. No se detectaron efectos con tanto el anticuerpo secundario solo (anti-IgG de ratón) como conjugados de anticuerpo secundario no específicos (anti-IgG de cabra - saporina). No se observó toxicidad con el anticuerpo primario (M2/120.545) solo probado hasta 1 µg/ml.
Ejemplo 13: Ensayos de unión de HLA de clase I y de clase II
[0491] Los ensayos de unión de HLA de clase I y de clase II usando moléculas HLA purificadas se realizan según protocolos desvelados (por ejemplo, publicaciones PCT WO 94/20127 y WO 94/03205; Sidney y col., Current Protocols in Immunology 18.3.1 (1998); Sidney y col., J. Immunol. 154:247 (1995); Sette y col., Mol. Immunol. 31:813 (1994)). Brevemente, moléculas de MHC purificadas (5 a 500 nM) se incuban con diversos inhibidores de péptidos sin marcar y péptidos de sonda radiomarcados con 125I 1-10 nM como se ha descrito. Tras la incubación, los complejos MHC-péptido se separan del péptido libre por filtración en gel y la fracción de péptido unida se determina. Normalmente, en experimentos preliminares, cada preparación de MHC se valora en presencia de cantidades fijas de péptidos radiomarcados para determinar la concentración de moléculas HLA necesaria para unirse al 10-20 % de la radiactividad total. Todos los ensayos de inhibición y de unión directa posteriores se realizan usando estas concentraciones de HLA.
[0492] Como bajo estas condiciones [marca]<[HLA] y CI50≥[HLA], los valores de CI50 medidos son aproximaciones razonables de los valores de KD reales. Los inhibidores de péptidos se prueban normalmente a concentraciones que oscilan de 120 µg/ml a 1,2 ng/ml, y se prueban en dos a cuatro experimentos completamente independientes. Para permitir la comparación de los datos obtenidos en experimentos diferentes, para cada péptido se calcula una cifra de unión relativa dividiendo la CI50 de un control positivo para la inhibición entre la CI50 para cada péptido probado (normalmente versiones sin marcar del péptido de sonda radiomarcado). Para fines de bases de datos, y comparaciones entre experimentos, los valores de unión relativa se compilan. Estos valores pueden convertirse de nuevo posteriormente en valores de nM de CI50 dividiendo nM de CI50 de los controles positivos para la inhibición entre la unión relativa del péptido de interés. Este procedimiento de compilación de datos es preciso y coherente para comparar péptidos que han sido probados en diferentes días, o con diferentes lotes de MHC purificado.
[0493] Los ensayos de unión como se explican resumidamente anteriormente pueden usarse para analizar péptidos que llevan supermotivos de HLA y/o motivos de HLA (véase la Tabla IV).
Ejemplo 14: Construcción de plásmidos de ADN de multi-epítopes de “minigen”
[0494] Este ejemplo trata la construcción de un plásmido de expresión de minigen. Los plásmidos de minigen pueden, por supuesto, contener diversas configuraciones de epítopes de linfocitos B, CTL y/o HTL o análogos de epítopes como se describe en el presente documento.
[0495] Un plásmido de expresión de minigen normalmente incluye múltiples epítopes de péptidos de CTL y de HTL. En el presente ejemplo, los epítopes de péptidos que llevan los supermotivos HLA-A2, -A3, -B7 y los epítopes de péptidos que llevan los motivos HLA-A1 y -A24 se usan conjuntamente con epítopes que llevan supermotivos DR y/o epítopes de DR3. Los epítopes de péptidos que llevan supermotivos o motivos de HLA de clase I derivados de STEAP-1 están seleccionados de forma que se representen múltiples supermotivos/motivos para garantizar la amplia cobertura de la población. Similarmente, los epítopes de HLA de clase II están seleccionados de STEAP-1 para proporcionar una amplia cobertura de la población, es decir, tanto los epítopes que llevan supermotivos DR-1-4-7 de HLA como los epítopes que llevan motivos DR-3 de HLA están seleccionados para inclusión en la construcción de minigen. Entonces, los epítopes de CTL y de HTL seleccionados se incorporan en un minigen para la expresión en un vector de expresión.
[0496] Una construcción tal puede incluir adicionalmente secuencias que dirigen los epítopes de HTL al retículo endoplásmico. Por ejemplo, la proteína Ii puede fusionarse con uno o más epítopes de HTL como se describe en la materia, en el que la secuencia CLIP de la proteína li se elimina y se sustituye con una secuencia de epítope de HLA de clase II de manera que el epítope de HLA de clase II se dirige al retículo endoplásmico, en el que el epítope se une a una molécula HLA de clase II.
[0497] Este ejemplo ilustra los procedimientos que van a usarse para construcción de un plásmido de expresión que lleva un minigen. Otros vectores de expresión que pueden usarse para composiciones de minigen están disponibles y son conocidos para aquellos expertos en la materia.
[0498] El plásmido de ADN del minigen de este ejemplo contiene una secuencia consenso de Kozak y una secuencia señal de la cadena ligera de Ig kappa murina consenso seguida de epítopes de CTL y/o de HTL seleccionados según principios desvelados en el presente documento. La secuencia codifica un marco de lectura abierto fusionado con la marca de epítope del anticuerpo Myc y His codificada por el vector de pcDNA3.1/ Myc-His.
[0499] La superposición de oligonucleótidos que pueden, por ejemplo, promediar aproximadamente 70 nucleótidos de longitud con 15 superposiciones de nucleótidos se sintetizan y se purifican por HPLC. Los oligonucleótidos codifican los epítopes de péptidos seleccionados, además de nucleótidos ligadores apropiados, secuencia de Kozak y secuencia señal. El minigen de multiepítopes final se ensambla extendiendo los oligonucleótidos superpuestos en tres conjuntos de reacciones usando PCR. Se usa una máquina de PCR Perkin/Elmer 9600 y se realizan un total de 30 ciclos usando las siguientes condiciones: 95 ºC durante 15 s, temperatura de hibridación (5º por debajo de la menor Tf calculada de cada par de cebadores) durante 30 s, y 72 ºC durante 1 min.
[0500] Por ejemplo, un minigen se prepara del siguiente modo. Para una primera reacción de PCR, 5 µg de cada uno de los dos oligonucleótidos se hibridan y se extienden: en un ejemplo usando ocho oligonucleótidos, es decir, cuatro pares de cebadores, los oligonucleótidos 1+2, 3+4, 5+6 y 7+8 se combinan en 100 µl de reacciones que contienen tampón de Pfu polimerasa (1x= KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, Tris-cloruro 20 mM, pH 8,75, MgSO4 2 mM, 0,1 % de Triton X-100, 100 µg/ml de BSA), 0,25 mM de cada dNTP y 2,5 U de Pfu polimerasa. Los productos dímeros de longitud completa se purifican en gel y dos reacciones que contienen el producto de 1+2 y 3+4, y el producto de 5+6 y 7+8, se mezclan, se hibridan y se extienden durante 10 ciclos. Entonces se mezcla la mitad de las dos reacciones y se llevan a cabo 5 ciclos de hibridación y extensión antes de añadir cebadores flanqueantes para amplificar el producto de longitud completa. El producto de longitud completa se purifica en gel y se clona en pCRblunt (Invitrogen) y los clones individuales se criban por secuenciación.
Ejemplo 15: Construcción de plásmido y el grado al que induce inmunogenicidad
[0501] El grado al que una construcción de plásmido, por ejemplo, un plásmido construido según el ejemplo previo, puede inducir inmunogenicidad se confirma in vitro determinando la presentación de epítope por APC tras la transducción o transfección de APC con una construcción de ácido nucleico que expresa epítope. Un estudio tal
determina “antigenicidad” y permite el uso de APC humana. El ensayo determina la capacidad del epítope para ser
presentado por la APC en un contexto que es reconocido por un linfocito T cuantificando la densidad de complejos de epítope-HLA de clase I sobre la superficie celular. La cuantificación puede realizarse midiendo directamente la cantidad de péptido eluido de la APC (véanse, por ejemplo, Sijts y col., J. Immunol 156:683-692, 1996; Demotz y col., Nature 342:682-684,1989); o el número de complejos de péptido-HLA de clase I puede estimarse midiendo la cantidad de lisis o liberación de linfocinas inducida por células diana enfermas o transfectadas, y luego determinando la concentración de péptido necesaria para obtener niveles equivalentes de lisis o liberación de linfocinas (véase, por ejemplo, Kageyama y col., J. Immunol. 154:567-576, 1995).
[0502] Alternativamente, la inmunogenicidad se confirma por inyecciones in vivo en ratones y posterior evaluación in vitro de la actividad de CTL y HTL, que se analizan usando ensayos de citotoxicidad y de proliferación, respectivamente, como se detalla, por ejemplo, en Alexander y col., Immunity 1:751-761,1994.
[0503] Por ejemplo, para confirmar la capacidad de una construcción de minigen de ADN que contiene al menos un péptido con supermotivo HLA-A2 para inducir CTL in vivo, ratones transgénicos para HLA-A2.1/Kb, por ejemplo, se inmunizan intramuscularmente con 100 µg de ADNc desnudo. Como medio de comparación del nivel de CTL inducidos por la inmunización de ADNc, un grupo de control de animales también se inmuniza con una composición de péptido real que comprende múltiples epítopes sintetizados como un único polipéptido ya que serían codificados por el minigen.
[0504] Esplenocitos de animales inmunizados se estimulan dos veces con cada una de las composiciones respectivas (epítopes de péptidos codificados en el minigen o el péptido poliepitópico), luego se ensayan para actividad citotóxica específica para péptido en un ensayo de liberación de 51Cr. Los resultados indican la magnitud de la respuesta de CTL dirigida contra el epítope limitado a A2, indicando así la inmunogenicidad in vivo de la vacuna del minigen y la vacuna poliepitópica.
[0505] Por tanto, se encuentra que el minigen provoca respuestas inmunitarias dirigidas hacia los epítopes de péptidos con supermotivo HLA-A2 como lo hace la vacuna de péptido poliepitópico. También se realiza un análisis similar usando otros modelos de ratón transgénico HLA-A3 y HLA-B7 para evaluar la inducción de CTL por epítopes con motivo o supermotivo HLA-A3 y HLA-B7, por el cual también se encuentra entonces que el minigen provoca respuestas inmunitarias apropiadas dirigidas hacia los epítopes proporcionados.
[0506] Para confirmar la capacidad de un minigen que codifica el epítope de clase II para inducir HTL in vivo, ratones transgénicos DR, o para aquellos epítopes que reaccionan de forma cruzada con la molécula de MHC de ratón apropiada, ratones limitados a I-Ab, por ejemplo, se inmunizan intramuscularmente con 100 µg de ADN de plásmido. Como medio de comparación del nivel de HTL inducidos por inmunización con ADN, un grupo de animales de control también se inmuniza con una composición de péptido real emulsionada en adyuvante completo de Freund. Los linfocitos T CD4+, es decir, HTL, se purifican a partir de esplenocitos de animales inmunizados y se estimulan con cada una de las composiciones respectivas (péptidos codificados en el minigen). La respuesta de HTL se mide usando un ensayo de proliferación por incorporación de 3H-timidina (véase, por ejemplo, Alexander y col., Immunity 1:751-761,1994). Los resultados indican la magnitud de la respuesta de HTL, demostrándose así la inmunogenicidad in vivo del minigen.
[0507] Los minigenes de ADN, construidos como se describe en el ejemplo previo, también pueden confirmarse como una vacuna en combinación con un agente de refuerzo usando un protocolo de sensibilizaciónrefuerzo. El agente de refuerzo puede consistir en proteína recombinante (por ejemplo, Barnett y col., Aids Res. and Human Retroviruses 14, Suplemento 3:S299-S309, 1998) o variolovacuna recombinante, por ejemplo, que expresa un minigen o ADN que codifica la proteína completa de interés (véanse, por ejemplo, Hanke y col., Vaccine 16:439445,1998; Sedegah y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95:7648-53,1998; Hanke y McMichael, Immunol. Letters 66:177-181,1999; y Robinson y col., Nature Med. 5:526-34,1999).
[0508] Por ejemplo, la eficacia del minigen de ADN usado en un protocolo de sensibilización-refuerzo se evalúa inicialmente en ratones transgénicos. En este ejemplo, ratones transgénicos para A2.1/Kb se inmunizan IM con 100 µg de un minigen de ADN que codifica los péptidos inmunogénicos que incluyen al menos un péptido que lleva supermotivo HLA-A2. Después de un periodo de incubación (que oscila de 3-9 semanas), los ratones se refuerzan IP con 107 ufp/ratón de un virus de la variolovacuna recombinante que expresa la misma secuencia codificada por el minigen de ADN. Los ratones de control se inmunizan con 100 µg de ADN o variolovacuna recombinante sin la secuencia del minigen, o con ADN que codifica el minigen, pero sin el refuerzo de variolovacuna. Después de un periodo de incubación adicional de dos semanas, los esplenocitos de los ratones se ensayan inmediatamente para actividad específica para péptido en un ensayo de ELISPOT. Adicionalmente, los esplenocitos se estimulan in vitro con los epítopes de péptidos limitados a A2 codificados en el minigen y variolovacuna recombinante, luego se ensayan para actividad específica para péptido en un ELISA de IFN alfa, beta y/o gamma.
[0509] Se encuentra entonces que el minigen utilizado en un protocolo de sensibilización-refuerzo provoca mayores respuestas inmunitarias hacia los péptidos con supermotivo HLA-A2 que con ADN solo. También puede realizarse un análisis tal usando modelos de ratón transgénico HLA-A11 o HLA-B7 para evaluar la inducción de CTL por epítopes con motivos o supermotivos HLA-A3 o HLA-B7. El uso de protocolos de sensibilización-refuerzo en
seres humanos se describe más adelante en el ejemplo titulado “Inducción de respuestas de CTL usando un protocolo de sensibilización-refuerzo”.
Ejemplo 16: Composiciones de vacuna poliepitópicas de múltiples antígenos
[0510] Los epítopes de péptidos de STEAP-1 de la presente invención se usan conjuntamente con epítopes de otros antígenos asociados a tumor diana para crear una composición de vacuna que es útil para la prevención o el tratamiento de cáncer que expresa STEAP-1 y tales otros antígenos. Por ejemplo, una composición de vacuna puede proporcionarse como un único polipéptido que incorpora múltiples epítopes de STEAP-1, además de antígenos asociados a tumor que se expresan frecuentemente con un cáncer diana asociado a expresión de STEAP-1, o pueden administrarse como una composición que comprende una mezcla de uno o más epítopes discretos. Alternativamente, la vacuna puede administrarse como una construcción de minigen o como células dendríticas que se han cargado con los epítopes de péptidos in vitro.
Ejemplo 17: Uso de péptidos para evaluar una respuesta inmunitaria
[0511] Los péptidos de la divulgación pueden usarse para analizar una respuesta inmunitaria para la presencia de anticuerpos específicos, CTL o HTL dirigidos a STEAP-1. Un análisis tal puede realizarse de un modo descrito por Ogg y col., Science 279:2103-2106,1998. En este ejemplo, los péptidos se usan como reactivo para fines de diagnóstico o pronóstico, no como un inmunógeno.
[0512] En este ejemplo, complejos tetraméricos (“tetrámeros”) de antígenos leucocitarios humanos altamente
sensibles se usan para un análisis en sección transversal de, por ejemplo, frecuencias de CTL específicas para STEAP-1 HLA-A*0201 de individuos positivos para HLA A*0201 en diferentes estados de enfermedad o tras la inmunización que comprende un péptido de STEAP-1 que contiene un motivo A*0201. Los complejos tetraméricos se sintetizan como se ha descrito (Musey y col., N. Engl. J. Med. 337:1267, 1997). Brevemente, se sintetizan cadena pesada de HLA purificada (A*0201 en este ejemplo) y β2-microglobulina por medio de un sistema de expresión procariota. La cadena pesada se modifica por deleción de la transmembrana-cola citosólica y adición al extremo COOH de una secuencia que contiene un sitio de biotinilación enzimática BirA. La cadena pesada, β2-microglobulina y el péptido se repliegan por dilución. El producto replegado de 45 kD se aísla por cromatografía de líquidos rápida de proteínas y luego se biotinila por BirA en presencia de biotina (Sigma, St. Louis, Missouri), adenosin 5' trifosfato y magnesio. El conjugado de estreptavidina-ficoeritrina se añade en una relación molar 1:4, y el producto se concentra a 1 mg/ml. El producto resultante se denomina tetrámero-ficoeritrina.
[0513] Para el análisis de muestras de sangre de paciente, aproximadamente un millón de CMSP se centrifugan a 300 g durante 5 minutos y se resuspenden en 50 µl de solución salina tamponada con fosfato fría. El análisis Tri-color se realiza con el tetrámero-ficoeritrina, junto con anti-CD8-Tricolor y anti-CD38. Las CMSP se incuban con tetrámero y los anticuerpos sobre hielo durante 30 a 60 min y luego se lavan dos veces antes de la fijación con formaldehído. Se aplican puertas para contener >99,98 % de las muestras de control. Los controles para los tetrámeros incluyen tanto individuos negativos para A*0201 como donantes no enfermos positivos para A*0201. Entonces, el porcentaje de células teñidas con el tetrámero se determina por citometría de flujo. Los resultados indican el número de células en la muestra de CMSP que contiene CTL limitados a epítope, indicando así fácilmente el grado de respuesta inmunitaria al epítope de STEAP-1 y, por tanto, el estado de exposición a STEAP-1, o exposición a una vacuna que provoca una respuesta protectora o terapéutica.
Ejemplo 18: Inducción de respuestas inmunitarias usando un protocolo de sensibilización-refuerzo
[0514] Un protocolo de sensibilización-refuerzo similar en su principio esencial al usado para confirmar la eficacia de una vacuna de ADN en ratones transgénicos, tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo
titulado “Construcción de plásmido y el grado al que induce inmunogenicidad,” también puede usarse para la
administración de la vacuna a seres humanos. Una pauta de vacuna tal puede incluir una administración inicial de, por ejemplo, ADN desnudo seguido de un refuerzo usando virus recombinante que codifica la vacuna, o proteína/polipéptido recombinante o una mezcla de péptidos administrada en un adyuvante.
[0515] Por ejemplo, la inmunización inicial puede realizarse usando un vector de expresión, tal como el construido en el ejemplo titulado “Construcción de plásmidos de ADN de multi-epítopes de “minigen”” en forma de ácido nucleico desnudo administrado IM (o SC o ID) en las cantidades de 0,5-5 mg en múltiples sitios. El ácido nucleico (0,1 a 1000 µg) también puede administrarse usando una pistola de genes. Tras un periodo de incubación de 3-4 semanas, entonces se administra una dosis de refuerzo. El refuerzo puede ser virus recombinante de la viruela aviar administrado a una dosis de 5-107 a 5x109 ufp. Un virus recombinante alternativo, tal como un MVA, virus de la viruela del canario, adenovirus o virus adenoasociado, también puede usarse para el refuerzo, o puede administrarse la proteína poliepitópica o una mezcla de los péptidos. Para la evaluación de la eficacia de la vacuna, muestras de sangre del paciente se obtienen antes de la inmunización, además de a intervalos tras la administración de la vacuna inicial y la dosis de refuerzo de la vacuna. Células mononucleares de sangre periférica se aíslan de sangre recientemente heparinizada por centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque, se separan en alícuotas en medios de congelación y se almacenan congeladas. Las muestras se ensayan para actividad de CTL y de HTL.
[0516] El análisis de los resultados indica que se genera una magnitud de respuesta suficiente para lograr una inmunidad terapéutica o protectora contra STEAP-1.
Ejemplo 19: Polinucleótidos complementarios
[0517] Las secuencias complementarias a las secuencias codificantes de STEAP-1, o cualquier parte de las mismas, se usan para detectar, disminuir o inhibir la expresión de STEAP-1 que se produce naturalmente. Aunque se describe el uso de oligonucleótidos que comprenden de aproximadamente 15 a 30 pares de bases, el mismo procedimiento se usa esencialmente con fragmentos de secuencias más pequeños o más grandes. Se diseñan oligonucleótidos apropiados usando, por ejemplo, el software OLIGO 4.06 (National Biosciences) y la secuencia codificante de STEAP-1. Para inhibir la transcripción se diseña un oligonucleótido complementario a partir de la secuencia de 5' más única y se usa para prevenir la unión del promotor a la secuencia codificante. Para inhibir la traducción se diseña un oligonucleótido complementario para prevenir la unión ribosómica a un transcrito que codifica STEAP-1.
Ejemplo 20: Purificación de STEAP-1 que se produce naturalmente o recombinante usando anticuerpos específicos para STEAP-1
[0518] STEAP-1 que se produce naturalmente o recombinante se purifica sustancialmente por cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos específicos para STEAP-1. Se construye una columna de inmunoafinidad acoplando covalentemente el anticuerpo anti-STEAP-1 a una resina cromatográfica activada tal como SEPHAROSE activada con CNBr (Amersham Pharmacia Biotech). Después del acoplamiento, la resina se bloquea y se lava según las instrucciones del fabricante.
[0519] El medio que contenía STEAP-1 se pasa sobre la columna de inmunoafinidad, y la columna se lava en condiciones que permiten la absorbancia preferencial de STEAP-1 (por ejemplo, tampones de alta fuerza iónica en presencia de detergente). La columna se eluye en condiciones que alteran la unión anticuerpo/STEAP-1 (por ejemplo, un tampón de pH 2 a pH 3, o una alta concentración de un caótropo, tal como urea o ión tiocianato), y se recoge GCR.P.
Ejemplo 21: Identificación de moléculas que interaccionan con STEAP-1
[0520] STEAP-1, o fragmentos biológicamente activos de la misma, se marcan con 121 l de reactivo Bolton-Hunter (véase, por ejemplo, Bolton y col., (1973) Biochem. J. 133:529). Moléculas candidatas previamente matrizadas en los pocillos de una placa de múltiples pocillos se incuban con STEAP-1 marcada, se lavan y se ensaya cualquier pocillo con complejo de STEAP-1 marcado. Los datos obtenidos usando diferentes concentraciones de STEAP-1 se usan para calcular valores para el número, afinidad y asociación de STEAP-1 con las moléculas candidatas.
Ejemplo 22: Ensayo in vivo para la promoción del crecimiento tumoral de STEAP-1
[0521] El efecto de la proteína STEAP-1 sobre el crecimiento de células tumorales se evalúa in vivo evaluando el desarrollo y crecimiento de células tumorales que expresan o que carecen de STEAP-1. Por ejemplo, ratones SCID se inyectan subcutáneamente en cada flanco con 1 x 106 de tanto 3T3 como líneas celulares de cáncer de próstata (por ejemplo, células PC3) que contienen el vector vacío tkNeo o STEAP-1. Pueden usarse al menos dos estrategias: (1) expresión constitutiva de STEAP-1 bajo la regulación de un promotor tal como un promotor constitutivo obtenido de los genomas de virus tales como virus del polioma, virus de la viruela aviar (documento UK 2.211.504 publicado el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como el adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y virus simio 40 (SV40), o de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, siempre que tales promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped, y (2) expresión regulada bajo el control de un sistema de vector inducible tal como ecdisona, tetraciclina, etc., siempre que tales promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped. Entonces, el volumen de tumor se monitoriza por medición con compás calibrador en la aparición de tumores palpables y se sigue con el tiempo para determinar si las células que expresan STEAP-1 crecen a un tasa más rápida y si los tumores producidos por células que expresan STEAP-1 demuestran o no características de agresividad alterada (por ejemplo, metástasis potenciada, vascularización, sensibilidad reducida a fármacos quimioterapéuticos).
[0522] Adicionalmente, los ratones puede implantarse con 1 x 105 de las mismas células ortotópicamente para determinar si STEAP-1 tiene un efecto sobre el crecimiento local en la próstata, y si STEAP-1 afecta o no la capacidad de las células para metastatizar, específicamente a ganglios linfáticos, y hueso (Miki T y col., Oncol Res. 2001; 12:209; Fu X y col., Int J Cancer. 1991, 49:938). El efecto de STEAP-1 sobre la formación y el crecimiento de tumor óseo puede evaluarse inyectando células de tumor de próstata intratibialmente.
[0523] El ensayo también es útil para determinar el efecto inhibidor de STEAP-1 de composiciones terapéuticas candidatas tales como, por ejemplo, intracuerpos de STEAP-1, moléculas antisentido de STEAP-1 y ribozimas.
Ejemplo 23: Inhibición mediada por anticuerpos monoclonales para STEAP-1 de tumores in vivo
[0524] La significativa expresión de STEAP-1 en tejidos de cáncer y la localización superficial, junto con su restrictiva expresión en tejidos normales, hace que STEAP-1 sea una buena diana para terapia con anticuerpos. Similarmente, STEAP-1 es una diana para inmunoterapia basada en linfocitos T. Por tanto, la eficacia terapéutica de mAb anti-STEAP-1 en modelos de ratón de xenoinjerto de cáncer de próstata humano se evalúa usando líneas celulares recombinantes tales como PC3-STEAP-1 y 3T3-STEAP-1 (véase, por ejemplo, Kaighn, M.E. y col., Invest Urol, 1979. 17(1):16-23), además de modelos de xenoinjerto de próstata humana tales como LAPC-9AD (Saffran y col., PNAS 1999,10:1073-1078).
[0525] La eficacia de los anticuerpos sobre el crecimiento tumoral y la formación de metástasis se estudia, por ejemplo, en modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata ortotópicos de ratón. Los anticuerpos pueden estar sin conjugar, como se trata en este ejemplo, o pueden conjugarse con una modalidad terapéutica, como se aprecia en la materia. Los mAb anti-STEAP-1 inhiben la formación de tanto xenoinjertos de pulmón como de próstata. Los mAb anti-STEAP-1 también retardan el crecimiento de tumores ortotópicos establecidos y prolongaron la supervivencia de ratones que tenían tumor. Estos resultados indican la utilidad de mAb anti-STEAP-1 en el tratamiento de fases locales y avanzadas de cáncer de próstata (véanse, por ejemplo, Saffran, D. y col., PNAS 10:1073-1078 o la URL de la malla mundial pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.051624698).
[0526] La administración de los mAb anti-STEAP-1 condujo al retardo del crecimiento tumoral ortotópico establecido y a la inhibición de metástasis a sitios distantes, produciendo una prolongación significativa en la supervivencia de ratones que tenían tumor. Estos estudios indican que STEAP-1 es una diana atractiva para inmunoterapia y demuestran el potencial terapéutico de mAb anti-STEAP-1 para el tratamiento de cáncer de próstata local y metastásico. Este ejemplo demuestra que los anticuerpos monoclonales para STEAP-1 sin conjugar son eficaces para inhibir el crecimiento de xenoinjertos de tumor de próstata humano cultivados en ratones SCID; por consiguiente, también es efectiva una combinación de tales anticuerpos monoclonales eficaces.
Inhibición de tumores usando múltiples mAb STEAP-1 sin conjugar
Materiales y procedimientos
Anticuerpos monoclonales para STEAP-1:
[0527] Se producen anticuerpos monoclonales contra STEAP-1 como se describe en el ejemplo titulado
“Generación de anticuerpos monoclonales para STEAP-1 (mAb)”. Los anticuerpos se caracterizan por ELISA, transferencia Western, FACS e inmunoprecipitación para su capacidad para unirse a STEAP-1. Los datos de mapeo de epítopes para mAb anti-STEAP-1, como se ha determinado por ELISA y análisis Western, reconocen epítopes sobre la proteína STEAP-1. Se realiza el análisis inmunohistoquímico de tejidos y células de cáncer de próstata con estos anticuerpos.
[0528] Los anticuerpos monoclonales se purifican a partir de ascitis o sobrenadantes de cultivo de tejido de hibridoma por cromatografía en proteína G-Sepharose, se dializan contra PBS, se esterilizan por filtración y se guardan a -20 ºC. Las determinaciones de proteína se realizan por un ensayo Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA). Un anticuerpo monoclonal terapéutico o una mezcla que comprende una mezcla de anticuerpos monoclonales individuales se prepara y se usa para el tratamiento de ratones que reciben inyecciones subcutáneas u ortotópicas de xenoinjertos de tumor de UM-UC3 y CaLu1.
Líneas celulares y xenoinjertos
[0529] Las líneas celulares de cáncer de próstata, la línea celular PC3 y LNCaP, además de la línea de fibroblastos NIH-3T3 (Colección Americana de Cultivos Tipo) se mantienen en RPMI y DMEM, respectivamente, complementado con L-glutamina y 10 % de SBF.
[0530] Se generan poblaciones de células PC3-STEAP-1 y 3T3-STEAP-1 por transferencia de genes retrovirales como se describe en Hubert, R.S. y col., Proc Natl Acad Sci USA, 1999. 96(25): 14523.
[0531] El xenoinjerto de LAPC-9, que expresa un receptor de andrógenos natural y produce antígeno prostático específico (PSA), se pasa por ratones ICR-con inmunodeficiencia grave combinada (SCID) macho de 6 a 8 semanas de edad (Taconic Farms) por implante por trocar s.c. (Craft, N. y col., Nat Med. 1999, 5:280). Se preparan suspensiones de una única célula de células tumorales LAPC-9 como se describe en Craft y col.
Modelos de ratón de xenoinjerto.
[0532] Se generan tumores subcutáneos (s.c.) mediante inyección de 1 x 106 células cancerosas mezcladas a una dilución 1:1 con Matrigel (Collaborative Reseach) en el flanco derecho de ratones SCID macho. Para probar la eficacia de los anticuerpos en la formación de tumores, es decir, las inyecciones de anticuerpo se inician en el mismo día que las inyecciones de células de tumor. Como control, los ratones se inyectan tanto con IgG de ratón purificada (ICN) como con PBS; o un anticuerpo monoclonal purificado que reconoce un antígeno irrelevante no expresado en células humanas. En estudios preliminares no se encuentra diferencia entre IgG de ratón o PBS en el crecimiento tumoral. Los tamaños de los tumores se determinan por mediciones de compás calibrador, y el volumen de tumor se calcula como longitud x anchura x altura. Los ratones con tumores subcutáneos superiores a 1,5 cm de diámetro se sacrifican.
[0533] Se realizan inyecciones ortotópicas con anestesia usando ketamina/xilazina. Para estudios ortotópicos de próstata se hace una incisión por el abdomen para exponer la próstata y células tumorales LAPC o PC3 (5 x 105) mezcladas con Matrigel) se inyectan en la cápsula de la próstata en un volumen de 10 µl. Para monitorizar el crecimiento tumoral, los ratones se palpan y se recoge sangre semanalmente para medir niveles de PSA. Los ratones se segregan en grupos para los tratamientos apropiados, inyectándose i.p. mAb anti-STEAP-1 o de control.
Los mAb anti-STEAP-1 inhiben el crecimiento de tumores por cáncer de xenoinjerto que expresan STEAP-1
[0534] El efecto de mAb anti-STEAP-1 sobre la formación de tumores se prueba usando modelos ortotópicos de LNCaP y LAPC9. Como comparación con el modelo de tumor s.c., el modelo ortotópico, que requiere la inyección de células tumorales directamente en la próstata de ratón, produce un crecimiento tumoral local, desarrollo de metástasis en sitios distales, deterioro de la salud del ratón y posterior muerte (Saffran, D. y col., PNA, arriba). Las características hacen que el modelo ortotópico sea más representativo de la progresión de la enfermedad humana y permitió que los inventores siguieran el efecto terapéutico de mAb en criterios de valoración clínicamente relevantes.
[0535] En consecuencia, se inyectan células tumorales en la próstata de ratón y 2 días después los ratones se segregan en dos grupos y se tratan con tanto a) 200-500 µg de Ab anti-STEAP-1 como b) PBS tres veces por semana durante dos a cinco semanas.
[0536] Una ventaja importante de los modelos de cáncer ortotópicos es la capacidad para estudiar el desarrollo de metástasis. La formación de metástasis en ratones que tienen tumores ortotópicos establecidos se estudia por análisis de IHC en secciones de pulmón usando un anticuerpo contra una proteína de la superficie celular específica para tumor tal como anti-CK20 para cáncer de próstata (Lin S y col., Cancer Detect Prev. 2001;25:202).
[0537] Otra ventaja de los modelos de cáncer de xenoinjerto es la capacidad para estudiar la neovascularización y angiogénesis. El crecimiento tumoral es parcialmente dependiente del desarrollo de nuevos vasos sanguíneos. Aunque el sistema capilar y la red sanguínea en desarrollo es de origen huésped, la iniciación y la arquitectura de la neovascularatura está regulada por el tumor de xenoinjerto (Davidoff AM y col., Clin Cancer Res. 2001;7:2870; Solesvik O y col., Eur J Cancer Clin Oncol. 1984, 20:1295). El efecto del anticuerpo y la molécula pequeña sobre la neovascularización se estudia según procedimientos conocidos en la técnica, tales como por análisis de IHC de tejidos tumorales y su microentorno de alrededor.
[0538] Ratones que tienen tumores ortotópicos establecidos se administran con inyecciones de 1000 µg de tanto mAb anti-STEAP-1 como PBS durante un periodo de 4 semanas. Se deja que los ratones en ambos grupos establezcan una alta carga tumoral para garantizar una alta frecuencia de formación de metástasis en pulmones de ratón. Entonces, los ratones se sacrifican y sus vejigas, hígados, hueso y pulmones se analizan para la presencia de células tumorales por análisis de IHC. Estos estudios demuestran una amplia eficacia antitumoral de anticuerpos anti-STEAP-1 en la iniciación y la progresión de cáncer de próstata en modelos de ratón de xenoinjerto. Los anticuerpos anti-STEAP-1 inhiben la formación de tumores de tumores, además de retardar el crecimiento de tumores ya establecidos y prolongar la supervivencia de ratones tratados. Además, los mAb anti-STEAP-1 demuestran un efecto inhibidor espectacular sobre la diseminación de tumor de próstata local a sitios distales, incluso en presencia de una gran carga tumoral. Por tanto, los mAb anti-STEAP-1 son eficaces en importantes criterios de valoración clínicamente relevantes (crecimiento tumoral), prolongación de la supervivencia y salud.
Efecto de mAb para STEAP-1 sobre el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de próstata humano en ratones
[0539] Se usaron ratones ICR-SCID macho, 5-6 semanas de edad (Charles River Laboratory, Wilmington, MA). Los ratones se mantuvieron en un entorno controlado usando los protocolos expuestos en la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de NIH. Se usó un tumor de cáncer de próstata humano dependiente de andrógenos LAPC-9AD para establecer modelos de xenoinjerto. Tumores de partida mantenidos regularmente en ratones SCID se diseccionaron de forma estéril, se trocearon y se digirieron usando pronasa (Calbiochem, San Diego, CA). Las suspensiones de células generadas se incubaron durante la noche a 37 ºC para obtener una suspensión de una única célula homogénea.
[0540] STEAP-1 M2/92-30 y M2/120.545 se probaron a dos dosis diferentes de 100 µg y 500 µg. Se usaron PBS y mAb anti-KLH como controles. La cohorte del estudio consistió en 6 grupos con 10 ratones en cada grupo. Los mAb se dosificaron IP dos veces a la semana durante un total 12 dosis, a partir del mismo día que la inyección de células tumorales.
[0541] El tamaño del tumor se monitorizó mediante mediciones con compás calibrador dos veces a la semana. Se tomaron la dimensión más larga (L) y la dimensión perpendicular a ella (W) para calcular el volumen tumoral usando la fórmula: W2 x L/2. La concentración de PSA en suero en el día de tratamiento 40 para cada animal se midió usando kit de ELISA comercial. La prueba de Kruskal-Wallis y la prueba de la U de Mann-Whitney se usaron para evaluar diferencias de crecimiento tumoral y nivel de PSA entre grupos. Todas las pruebas fueron bilaterales con ά=0,05.
[0542] Los resultados del experimento expuesto en la Figura 26 y Figura 27 muestran que STEAP-1 M2/92.30 y M2/120.545 retardaron significativamente el crecimiento de xenoinjerto de próstata humana de un modo dependiente de la dosis.
Ejemplo 24: Uso terapéutico y de diagnóstico de anticuerpos anti-STEAP-1 en seres humanos
[0543] Anticuerpos monoclonales anti-STEAP-1 se usan con seguridad y eficazmente para fines de diagnóstico, profilácticos, pronósticos y/o terapéuticos en seres humanos. La transferencia Western y el análisis inmunohistoquímico de tejidos de cáncer y xenoinjertos de cáncer con mAb anti-STEAP-1 muestran una fuerte y amplia tinción en carcinoma, pero niveles significativamente menores o indetectables en tejidos normales. La detección de STEAP-1 en carcinoma y en enfermedad metastásica demuestra la utilidad del mAb como indicador de diagnóstico y/o pronóstico. Por tanto, los anticuerpos anti-STEAP-1 se usan en aplicaciones de diagnóstico tales como inmunohistoquímica de especímenes de biopsia de riñón para detectar cáncer de pacientes sospechosos.
[0544] Como se determina por citometría de flujo, el mAb anti-STEAP-1 se une específicamente a células de carcinoma. Por tanto, los anticuerpos anti-STEAP-1 se usan en aplicaciones de obtención de imágenes del cuerpo entero de diagnóstico tales como radioinmunoescintigrafía y radioinmunoterapia (véase, por ejemplo, Potamianos S. y col., Anticancer Res 20(2A):925-948 (2000)) para la detección de cánceres localizados y metastásicos que presentan expresión de STEAP-1. La eliminación o liberación de un dominio extracelular de STEAP-1 en el medio extracelular, tal como el observado para fosfodiesterasa alcalina B10 (Meerson, N. R., Hepatology 27:563-568 (1998)) permite la detección de diagnóstico de STEAP-1 por anticuerpos anti-STEAP-1 en suero y/o muestras de orina de pacientes sospechosos.
[0545] Los anticuerpos anti-STEAP-1 que se unen específicamente a STEAP-1 se usan en aplicaciones terapéuticas para el tratamiento de cánceres que expresan STEAP-1. Los anticuerpos anti-STEAP-1 se usan como modalidad sin conjugar y como forma conjugada en la que los anticuerpos están unidos a una de diversas modalidades terapéuticas o de obtención de imágenes muy conocidas en la técnica, tales como a profármacos, enzimas o radioisótopos. En estudios preclínicos, los anticuerpos anti-STEAP-1 sin conjugar y conjugados se prueban para la eficacia de la prevención de tumor e inhibición del crecimiento en los modelos de xenoinjerto de cáncer de ratón SCID, por ejemplo, modelos de cáncer de riñón AGS-K3 y AGS-K6 (véase, por ejemplo, el ejemplo titulado “Inhibición mediada por anticuerpo monoclonales para STEAP-1 de tumores de vejiga y pulmón in vivo”). Se usan anticuerpos anti-STEAP-1 tanto conjugados como sin conjugar como modalidad terapéutica en ensayos clínicos humanos tanto solos como en combinación con otros tratamientos como se describe en los siguientes ejemplos.
Ejemplo 25: Ensayos clínicos humanos para el tratamiento y el diagnóstico de carcinomas humanos mediante el uso de anticuerpos anti-STEAP-1 humanos in vivo
[0546] Según la presente invención se usan anticuerpos que reconocen un epítope sobre STEAP-1, y se usan en el tratamiento de ciertos tumores tales como aquellos enumerados en la Tabla I. Basándose en varios factores, que incluyen niveles de expresión de STEAP-1, tumores tales como aquellos enumerados en la Tabla I son presentemente indicaciones preferidas. A propósito de cada una de estas indicaciones, se buscan satisfactoriamente tres estrategias clínicas.
I.) Terapia auxiliar: En terapia auxiliar, los pacientes se tratan con anticuerpos anti-STEAP-1 en combinación con un agente quimioterapéutico o antineoplásico y/o radioterapia. Las dianas de cáncer primario tales como aquellas enumeradas en la Tabla I se tratan bajo protocolos convencionales mediante la adición de anticuerpos anti-STEAP-1 a terapia de primera y segunda línea convencional. Los diseños del protocolo tratan la eficacia como se evalúa por reducción en la masa de tumor, además de la capacidad para reducir las dosis usuales de quimioterapia convencional. Estas reducciones de dosificación permiten terapia adicional y/o prolongada reduciendo la toxicidad relacionada con la dosis del agente quimioterapéutico. Los anticuerpos anti-STEAP-1 se utilizan en varios ensayos clínicos auxiliares en combinación con los agentes quimioterapéuticos o antineoplásicos adriamicina (carcinoma de próstata avanzado), cisplatino (carcinomas de cabeza y cuello y de pulmón avanzados), taxol (cáncer de mama) y doxorubicina (preclínico).
II.) Monoterapia: A propósito del uso de los anticuerpos anti-STEAP-1 en monoterapia de tumores, los anticuerpos se administran a pacientes sin un agente quimioterapéutico o antineoplásico. En un ejemplo, la monoterapia se realiza clínicamente en pacientes con cáncer terminal con enfermedad metastásica extensa. Los pacientes muestran alguna estabilización de la enfermedad. Los ensayos demuestran un efecto en pacientes resistentes al tratamiento con tumores cancerosos.
III.) Agente de obtención de imágenes mediante unión de un radionúclido (por ejemplo, yodo o itrio (I131, Y90)) a anticuerpos anti-STEAP-1, los anticuerpos radiomarcados se utilizan como agente de diagnóstico y/o de obtención de imágenes. En una función tal, los anticuerpos marcados se localizan en tanto tumores sólidos, además de lesiones metastásicas de células que expresan STEAP-1. A propósito del uso de los anticuerpos anti-STEAP-1 como agentes de obtención de imágenes, los anticuerpos se usan como auxiliar para el tratamiento quirúrgico de tumores sólidos, como tanto un cribado pre-quirúrgico, además de un seguimiento posoperatorio para determinar qué tumor sigue y/o reaparece. En un ejemplo, un anticuerpo (111In)-STEAP-1 se usa como agente de obtención de imágenes en un ensayo clínico humano de fase I en pacientes que tienen un carcinoma que expresa STEAP-1 (por analogía véase, por ejemplo, Divgi y col., J. Natl. Cancer Inst. 83:97-104 (1991)). Los pacientes son seguidos con gammacámara anterior y posterior convencional. Los resultados indican que se identifican lesiones primarias y lesiones metastásicas.
Dosis y vía de administración
[0547] Como se aprecia para aquellos expertos en la materia, las consideraciones de dosificación pueden determinarse por comparación con los productos análogos que están en la clínica. Por tanto, los anticuerpos anti-STEAP-1 pueden administrarse con dosis en el intervalo de 5 a 400 mg/m2, con la menor dosis usada, por ejemplo, a propósito de estudios de seguridad. La afinidad de anticuerpos anti-STEAP-1 con respecto a la afinidad de un anticuerpo conocido para su diana es un parámetro usado por aquellos expertos en la materia para determinar pautas de dosis análogas. Además, los anticuerpos anti-STEAP-1 que son anticuerpos completamente humanos, con respecto al anticuerpo quimérico, tienen eliminación más lenta; por consiguiente, la dosificación en pacientes con tales anticuerpos anti-STEAP-1 completamente humanos puede ser menor, quizás en el intervalo de 50 a 300 mg/m2, y todavía siguen siendo eficaces. La dosificación en mg/m2, a diferencia de la medición de la dosis convencional en mg/kg, es una medida basada en el área superficial y es una medición de dosificación conveniente que se diseña para incluir pacientes de todos tamaños desde lactantes hasta adultos.
[0548] Tres estrategias de administración distintas son útiles para la administración de anticuerpos anti-STEAP-1. La administración intravenosa convencional es una técnica de administración convencional para muchos tumores. Sin embargo, a propósito de los tumores en la cavidad peritoneal, tales como tumores de los ovarios, vía biliar, otras vías y similares, la administración intraperitoneal puede demostrar ser favorable para obtener alta dosis de anticuerpo en el tumor y también para minimizar la eliminación de anticuerpo. De un modo similar, ciertos
tumores sólidos poseen vasculatura que es apropiada para perfusión regional. La perfusión regional permite una alta dosis de anticuerpo en el sitio de un tumor y minimiza la eliminación a corto plazo del anticuerpo.
Plan de desarrollo clínico (PCD)
[0549] Visión general: El PCD sigue y desarrolla tratamientos de anticuerpos anti-STEAP-1 a propósito de terapia auxiliar, monoterapia y como un agente de obtención de imágenes. Los ensayos demuestran inicialmente la seguridad y después confirman la eficacia en dosis repetidas. Los ensayos son de etiqueta abierta en comparación con la quimioterapia convencional con terapia convencional más anticuerpos anti-STEAP-1. Como se apreciará, un criterio que puede utilizarse a propósito del enrolamiento de pacientes es los niveles de expresión de STEAP-1 en sus tumores como se ha determinado por biopsia.
[0550] Al igual que con cualquier agente terapéutico basado en la infusión de proteínas o anticuerpos, los asuntos de seguridad están relacionados principalmente con (i) síndrome de liberación de citocinas, es decir, hipotensión, fiebre, temblores, escalofríos; (ii) el desarrollo de una respuesta inmunogénica al material (es decir, desarrollo de anticuerpos humanos por el paciente para la respuesta terapéutica del anticuerpo o HAHA); y, (iii) toxicidad para células normales que expresan STEAP-1. Las pruebas convencionales y el seguimiento se utilizan para monitorizar cada uno de estos asuntos de seguridad. Se encuentra que los anticuerpos anti-STEAP-1 son seguros tras la administración humana.
Ejemplo 26: Ensayo clínico humano: Monoterapia con anticuerpo anti-STEAP-1 humano
[0551] Los anticuerpos anti-STEAP-1 son seguros a propósito del ensayo auxiliar anteriormente tratado, un ensayo clínico humano de fase II confirma la eficacia y dosificación óptima para monoterapia. Tal ensayo se lleva a cabo, e implica la misma seguridad y análisis de los resultados, para el ensayo auxiliar anteriormente descrito, siendo la excepción que los pacientes no reciben quimioterapia simultáneamente con la recepción de dosis de anticuerpos anti-STEAP-1.
Ejemplo 27: Ensayo clínico humano: Obtención de imágenes de diagnóstico con anticuerpo anti-STEAP-1
[0552] Una vez más, como la terapia auxiliar tratada anteriormente es segura dentro de los criterios de seguridad tratados anteriormente, se realiza un ensayo clínico humano referente al uso de anticuerpos anti-STEAP-1 como agente de obtención de imágenes de diagnóstico. El protocolo se diseña de una manera sustancialmente similar a aquella descrita en la materia, tal como en Divgi y col., J. Natl. Cancer Inst. 83:97-104 (1991). Se encuentra que los anticuerpos son tanto seguros como eficaces cuando se usan como modalidad de diagnóstico.
Ejemplo 28: Ensayo clínico humano: Terapia auxiliar con anticuerpo anti-STEAP-1 humano y terapia quimioterapéutica, de radiación y/o ablación hormonal.
[0553] Se inicia un ensayo clínico humano de fase I para evaluar la seguridad de seis dosis intravenosas de un anticuerpo anti-STEAP-1 humano a propósito del tratamiento de un tumor sólido, por ejemplo, un cáncer de un tejido enumerado en la Tabla I. En el estudio se evalúa la seguridad de dosis únicas de anticuerpos anti-STEAP-1 cuando se utilizan como terapia auxiliar para un agente antineoplásico o quimioterapéutico o de ablación hormonal como se define en el presente documento tal como, sin limitación: cisplatino, topotecan, doxorubicina, adriamicina, taxol, Lupron, Zoladex, Eulexin, Casodex, Anandron o similares. El diseño del estudio incluye la administración de seis dosis únicas de un anticuerpo anti-STEAP-1 con dosificación de anticuerpo aumentando de aproximadamente 25 mg/m2 a aproximadamente 275 mg/m2 durante el transcurso del tratamiento según el siguiente programa:
Día 0 Día 7 Día 14 Día 21 Día 28 Día 35 Dosis de mAb 25 mg/m2 75 mg/m2 125 mg/m2 175 mg/m2 225 mg/m2 275 mg/m2 Quimioterapia (dosis + + + + + + convencional)
[0554] Los pacientes son estrechamente seguidos durante una semana tras cada administración de anticuerpo y quimioterapia. En particular, los pacientes se evalúan para los asuntos de seguridad mencionados anteriormente: (i) síndrome de liberación de citocinas, es decir, hipotensión, fiebre, temblores, escalofríos; (ii) el desarrollo de una respuesta inmunogénica al material (es decir, desarrollo de anticuerpos humanos por el paciente a la respuesta terapéutica del anticuerpo humano o HAHA); y, (iii) toxicidad para células normales que expresan STEAP-1. Las pruebas convencionales y el seguimiento se utilizan para monitorizar cada uno de estos asuntos de seguridad. También se evalúan pacientes para desenlace clínico, y particularmente la reducción en la masa de tumor como se prueba por RMN u otra obtención de imágenes.
[0555] Se demuestra que los anticuerpos anti-STEAP-1 son seguros y eficaces, los ensayos de fase II confirman la eficacia y refinan la dosificación óptima.
Ejemplo 29: Identificación y confirmación de posibles rutas de transducción de señales
[0556] Se ha informado que muchas proteínas de mamífero interaccionan con moléculas de señalización y participan en la regulación de rutas de señalización (J Neurochem. 2001; 76:217-223). La fibronectina se ha asociado en particular a la cascada de señalización de MAPK que controla la mitogénesis de células (Jiang F, Jia Y, Cohen I. Blood. 2002, 99:3579). Además, la proteína STEAP-1 contiene varios sitios de fosforilación (véase la Tabla XXI) que indican una asociación a cascadas de señalización específicas. Usando técnicas de inmunoprecipitación y transferencia Western se identifican proteínas que se asocian a STEAP-1 y median en los acontecimientos de señalización. Se sabe que varias rutas que desempeñan una función en la biología del cáncer pueden regularse por STEAP-1, que incluyen rutas de fosfolípidos tales como PI3K, AKT, etc., rutas de adhesión y migración, que incluyen FAK, Rho, Rac-1, 1-catenina, etc., además de cascadas mitogénicas/de supervivencia tales como ERK, p38, etc. (Cell Growth Differ. 2000,11:279; J Biol Chem. 1999, 274:801; Oncogene. 2000,19:3003, J. Cell Biol. 1997,138:913.). Con el fin de determinar si la expresión de STEAP-1 es suficiente para regular las rutas de señalización específicas no de otro modo activas en células PC3 en reposo, el efecto de estos genes sobre la activación de la cascada de p38 MAPK se investigó en la línea celular de cáncer de próstata PC3. La activación de la cinasa p38 depende de su fosforilación en residuos de tirosina y serina. p38 fosforilada puede distinguirse del estado no fosforilado por un mAb fosfo-p38. Este Ab específico para fosfo se usó para estudiar el estado de fosforilación de p38 en líneas celulares PC3 manipuladas.
[0557] Células PC3 se transfectaron con gen de resistencia a neomicina solo o con STEAP-1 en el vector pSRa. Las células se cultivaron durante la noche en 0,5 % de SBF, luego se estimularon con 10 % de SBF durante 5 minutos con o sin 10 µg/ml del inhibidor de MEK PD98058. Los lisados celulares se resolvieron por 12,5 % de SDS-PAGE y transferencia Western con anti-fosfo-ERK (Cell Signaling) y anti-ERK (Zymed). Células NIH-3T3 se transfectaron con gen de resistencia a neomicina solo o con STEAP-1 en el vector pSRa. Las células se trataron como antes pero sin el inhibidor de MEK. Además, células NIH-3T3-Neo se trataron con 10 mg/ml de salicilato de Na. La expresión de STEAP-1 induce la fosforilación de ERK-1 y ERK-2 en suero y se inhibió por el inhibidor de MEK cinasas aguas arriba PD98058.
[0558] En otro conjunto de experimentos se examinó la cantidad suficiente de expresión de STEAP-1 en la línea celular de cáncer de próstata PC3 para activar la ruta de MAPK mitogénica, concretamente la cascada de ERK. La activación de ERK depende de su fosforilación sobre residuos de tirosina y serina. ERK fosforilada puede distinguirse del estado no fosforilado por un mAb fosfo-ERK. Este Ab específico para fosfo se usó para estudiar el estado de fosforilación de ERK en líneas celulares PC3 manipuladas. Las células PC3, que expresan una forma activada de Ras, se usaron como control positivo.
[0559] Los resultados muestran que mientras que la expresión del gen neo de control no tiene efecto sobre la fosforilación de ERK, la expresión de STEAP-1 en células PC3 es suficiente para inducir un aumento en la fosforilación de ERK (Figura 28). Estos resultados se verificaron usando transferencia Western anti-ERK y confirman la activación de la ruta de ERK por STEAP-1.
[0560] Como el SBF contiene varios componentes que pueden contribuir a la activación de ERK mediada por receptor, los inventores examinaron el efecto de STEAP-1 en niveles bajos y óptimos de SBF. Las células PC3 que expresan neo o STEAP-1 se cultivaron en tanto 0,1 % como 10 % de SBF durante la noche. Las células se analizaron por transferencia Western anti-fosfo-ERK. Este experimento muestra que STEAP-1 induce la fosforilación de ERK en 0,1 % de SBF, y confirma que la expresión de STEAP-1 es suficiente para inducir la activación de la cascada de señalización de ERK en ausencia de estímulos adicionales.
[0561] Para confirmar que STEAP-1 activa directamente o indirectamente rutas de transducción de señales conocidas en células, ensayos indicadores de la transcripción basados en luciferasa (luc) se llevan a cabo en células que expresan genes individuales. Estos indicadores de la transcripción contienen sitios de unión consenso para factores de transcripción conocidos que se encuentran en la dirección 3' de rutas de transducción de señales bien caracterizadas. Los indicadores y ejemplos de estos factores de transcripción asociados, rutas de transducción de señales y estímulos de activación se enumeran a continuación.
1.
NFkB-luc, NFkB/Rel; Ik-cinasa/SAPK; crecimiento/apoptosis/estrés
2.
SRE-luc, SRF/TCF/ELK1; MAPK/SAPK; crecimiento/diferenciación
3.
AP-1-luc, FOS/JUN; MAPK/SAPK/PKC; crecimiento/apoptosis/estrés
4.
ARE-luc, receptor de andrógenos; esteroides/MAPK; crecimiento/diferenciación/apoptosis
5.
p53-luc, p53; SAPK; crecimiento/diferenciación/apoptosis
6.
CRE-luc, CREB/ATF2; PKA/p38; crecimiento/apoptosis/estrés
7.
TCF-luc, TCF/Lef; 1-catenina, adhesión/invasión
[0562] Los efectos mediados por genes pueden ensayarse en células que muestran expresión de ARNm. Los plásmidos indicadores de luciferasa pueden introducirse por transfección mediada por lípidos (TFX-50, Promega). La actividad de luciferasa, un indicador de actividad de transcripción relativa, se mide por incubación de extractos de células con sustrato de luciferina y la luminiscencia de la reacción se monitoriza en un luminómetro.
[0563] Las rutas de señalización activadas por STEAP-1 se mapean y se usan para la identificación y validación de dianas terapéuticas. Cuando STEAP-1 participa en la señalización de células, se usa como diana para fines de diagnóstico, pronóstico, preventivos y/o terapéuticos.
Ejemplo 30: Participación de STEAP-1 en el transporte de moléculas pequeñas y comunicación célula-célula
[0564] La comunicación célula-célula es esencial en el mantenimiento de la integridad de órganos y homeostasis, ambos de los cuales se desregulan durante la formación y progresión tumoral. Las comunicaciones intercelulares pueden medirse usando dos tipos de ensayos (J. Biol. Chem. 2000, 275:25207). En el primer ensayo, células cargadas con un colorante fluorescente se incuban en presencia de células receptoras sin marcar y las poblaciones de células se examinan bajo microscopía fluorescente. Este ensayo cualitativo mide el intercambio de colorante entre células adyacentes. En el segundo sistema de ensayo, poblaciones de células donantes y receptoras se tratan como antes y las mediciones cuantitativas de la población de células receptoras se realizan por análisis de FACS. Usando estos dos sistemas de ensayo, células que expresan STEAP-1 se comparan con controles que no expresan STEAP-1, y se encuentra que STEAP-1 potencia las comunicaciones de células. La Figura 29 demuestra que STEAP-1 media en la transferencia de la calceína de moléculas pequeñas entre células adyacentes, y así regula la comunicación célula-célula en células de cáncer de próstata. En este experimento, células PC3 receptoras se marcaron con dextrano-Texas Red y células PC3 donantes se marcaron con calceína AM (verde). Las células donantes (verdes) y receptoras (rojas) se co-cultivaron a 37 ºC y se analizaron por microscopía para la colocalización de Texas red y calceína. Los resultados demostraron que mientras que las células de control PC3 (expresión de proteínas STEAP-1 no detectable) presentan poca transferencia de calceína, la expresión de STEAP1 permite la transferencia de moléculas pequeñas entre células, por lo que las células receptoras inicialmente rojas toman un color parduzco, y co-localizan moléculas rojas y verdes. Las moléculas pequeñas y/o anticuerpos que modulan la comunicación célula-célula mediada por STEAP-1 se usan como agentes terapéuticos para cánceres que expresan STEAP-1. La Figura 30 demuestra que la expresión de STEAP-1 es necesaria en tanto poblaciones donantes como receptoras para que tenga lugar la transferencia de moléculas pequeñas. En este experimento, células PC3 se transfectaron con gen de resistencia a neomicina solo o con STEAP-1 en el vector pSRa. Las células receptoras se marcaron con 1 mg/ml de dextrano-rojo Texas y las células donantes se marcaron con 2,5 µg/ml de calceína AM. Las células donantes (verdes) y receptoras (rojas) se co-cultivaron a 37 ºC durante 18-24 horas y se analizaron por microscopía para la co-localización de colorantes fluorescentes. Paneles superiores: Microscopía óptica; paneles inferiores: Fluorescencia UV. Paneles izquierdos: Células PC3-Neo fueron tanto donantes como receptoras. Paneles centrales: PC3-Neo fueron las células donantes y PC3-STEAP-1 fueron las receptoras. Paneles derechos: Células PC3-STEAP-1 fueron tanto donantes como receptoras. Solo cuando STEAP-1 se expresó en tanto donantes como receptores se detectó la comunicación célula-célula.
[0565] Los resultados muestran que co-cultivar células PC3 de control y PC3 deja de mediar en la transferencia de calceína. Similarmente, la co-incubación de PC3 de control y PC3-STEAP-1 no permite la transferencia de calceína. Sin embargo, co-cultivar células donantes de PC3-STEAP-1 y receptoras de PC3-STEAP1 media en la transferencia de moléculas pequeñas como se representa por la co-localización de pigmentos verdes y rojos en las mismas células. Tomados conjuntamente, los datos mostrados en las Figuras 29 y 30 demuestran que STEAP-1 media en la transferencia de moléculas pequeñas y regula la comunicación célula-célula formando canales de comunicación intercelular que son similares en función a uniones comunicantes.
[0566] Adicionalmente se confirmó el efecto de STEAP-1 M2/120.545 sobre la unión comunicante (véase, Figura 31). En este experimento, células PC3 se transfectaron con gen de resistencia a neomicina solo o con STEAP-1 en el vector pSRa. Las células receptoras se marcaron con 1 mg/ml de dextrano-rojo Texas y las células donantes se marcaron con 2,5 µg/ml de calceína AM. Las células donantes (verdes) y receptoras (rojas) se cocultivaron a 37 ºC durante 18-24 horas y se analizaron por microscopía para la co-localización de colorantes fluorescentes. En todos los experimentos, las mismas células se usaron como donante y aceptor. Las células se incubaron con las cantidades indicadas de mAb para STEAP-1/120.545 durante 10 minutos antes de sembrarlas y el mAb se mantuvo en el cultivo durante 24 horas antes del análisis. STEAP-1/120.545 reduce la unión comunicante mediada por STEAP-1 de un modo dependiente de la dosis. Los resultados muestran que STEAP-1/120.545 reduce la unión comunicante mediada por STEAP-1 de un modo dependiente de la dosis.
[0567] Así, debido a que STEAP-1 funciona en la comunicación célula-célula y el transporte de moléculas pequeñas, se usa como diana o marcador para fines de diagnóstico, pronóstico, preventivos y/o terapéuticos.
Ejemplo 31: Interferencia por ARN (iARN)
[0568] La tecnología de interferencia por ARN (iARN) se implementa a una variedad de ensayos celulares relevantes para la oncología. La iARN es un mecanismo de silenciamiento de genes postranscripcional activado por ARN bicatenario (ARNbc). La iARN induce degradación de ARNm específico conduciendo a cambios en la expresión de proteínas y posteriormente en la función del gen. En células de mamífero, estos ARNbc llamados ARN interferente pequeño (ARNip) tienen la composición correcta para activar la ruta de iARN eligiendo como diana la degradación, específicamente algunos ARNm. Véase Elbashir S.M. y col., Duplexes of 21-nucleotide RNAs Mediate RNA interference in Cultured Mammalian Cells, Nature 411(6836):494-8 (2001). Así, la tecnología de iARN se usa satisfactoriamente en células de mamífero para silenciar genes elegidos como diana.
[0569] La pérdida de control de la proliferación celular es un distintivo de células cancerosas; así, evaluar la función de STEAP-1 en ensayos de supervivencia/proliferación celular es relevante Por consiguiente, se usó iARN para investigar la función del antígeno de STEAP-1. Para generar ARNip para STEAP-1 se usaron algoritmos que predicen oligonucleótidos que presentan los parámetros moleculares críticos (contenido de G:C, temperatura de fusión, etc.) y tienen la capacidad para reducir significativamente los niveles de expresión de la proteína STEAP-1 cuando se introduce en células. Por consiguiente, una secuencia elegida como diana para el ARNip de STEAP-1 es: 5' AAGCTCATTCTAGCGGGAAA 3' (SEQ ID NO: 81). Según este ejemplo, se usan composiciones de ARNip de STEAP-1 que comprenden ARNip (ARN interferente corto bicatenario) que se corresponde con la secuencia de ORF de ácidos nucleicos de la proteína STEAP-1 o subsecuencias de la misma. Así, se usan subsecuencias de ARNip, de este modo tienen generalmente 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 28, 27, 28, 29, 30,31, 32, 33, 34, 35 o más de 35 nucleótidos de ARN contiguos de longitud. Estas secuencias de ARNip son complementarias y no complementarias a al menos una porción de la secuencia codificante de ARNm. Preferentemente, las subsecuencias tienen 19-25 nucleótidos de longitud, lo más preferentemente 21-23 nucleótidos de longitud. Preferentemente, estos ARNip consiguen el silenciamiento de antígeno de STEAP-1 en células que expresan la proteína y tienen efectos funcionales como se describe más adelante.
[0570] El ARNip seleccionado (oligo de STEAP-1.b) se probó en numerosas líneas celulares en el ensayo de MTS de supervivencia/proliferación (mide actividad metabólica celular). Ensayos colorimétricos basados en tetrazolio (es decir, MTS) detectan células viables exclusivamente, ya que las células vivas son metabólicamente activas y por tanto pueden reducir las sales de tetrazolio a compuestos de formazano coloreados; sin embargo, las células muertas no. Además, este oligo de STEAP-1.b consiguió el silenciamiento de antígeno de STEAP-1 en células que expresan la proteína y tuvo efectos funcionales como se describe más adelante usando los siguientes protocolos.
[0571] Transfecciones de ARNip de mamífero: El día antes de la transfección del ARNip, las diferentes líneas celulares se sembraron en medios (RPMI 1640 con 10 % de SBF sin antibióticos) a 2x103 células/pocillo en 80 µl (formato de placa de 96 pocillos) para el ensayo de supervivencia/MTS. En paralelo con el oligo de ARNip específico de STEAP-1 se incluyeron las siguientes secuencias en cada experimento como controles: a) células transfectadas con vector vacío con Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y tampón de hibridación (sin ARNip); b) ARNip específico de luciferasa-4 (secuencia elegida como diana: 5'-AAGGGACGAAGACGAACACUUCTT-3') (SEQ ID NO: 82); y, c) ARNip específico de Eg5 (secuencia elegida como diana: 5'-AACTGAAGACCTGAAGACAATAA-3') (SEQ ID NO: 83). Los ARNip se usaron a 10 nM y 1 µg/ml de concentración final de Lipofectamine 2000.
[0572] El procedimiento fue del siguiente modo: los ARNip se diluyeron primero en OPTIMEM (medio de transfección sin suero, Invitrogen) a 0,1 µM (10 veces concentrado) y se incubaron 5-10 min a TA. Se diluyó Lipofectamine 2000 a 10 µg/ml (10 veces concentrado) para el número total de transfecciones y se incubó 5-10 minutos a temperatura ambiente (TA). Las cantidades apropiadas de Lipofectamine 2000 10 veces concentrada diluida se mezclaron 1:1 con ARNip 10 veces concentrado diluido y se incubaron a TA durante 20-30 ºC (disolución de transfección concentrada 5 veces). Se añadieron 20 µl de las disoluciones de transfección concentradas 5 veces a las muestras respectivas y se incubaron a 37 ºC durante 96 horas antes del análisis.
[0573] Ensayo de MTS: El ensayo de MTS es un procedimiento colorimétrico para determinar el número de células viables en ensayos de proliferación, citotoxicidad o quimiosensibilidad basado en un compuesto de tetrazolio [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio, sal interna; MTS(b)] y un reactivo de acoplamiento electrónico (etosulfato de fenazina; PES). Los ensayos se realizaron añadiendo una pequeña cantidad del reactivo en disolución directamente a los pocillos de cultivo, incubando durante 1-4 horas y luego registrando la absorbancia a 490 nm con un lector de placas de 96 pocillos. La cantidad de producto de formazano coloreado como se mide por la cantidad de absorbancia a 490 nm es directamente proporcional a la actividad mitocondrial y/o el número de células vivas en el cultivo.
[0574] Con el fin de tratar la función de STEAP-1 en células, STEAP-1 se silenció transfectando las líneas de células STEAP-1 que se expresan endógenamente. Como se muestra en la Figura 32, se indujeron tanto la fosforilación de ERK-1 como de ERK-2 por 10 % de suero, y se inhibieron por mAb M2/92.30 y ARNip para STEAP
1. En este experimento, células PC3 se transfectaron con gen de resistencia a neomicina solo o con STEAP-1 y mAb en el vector pSRa. Para el silenciamiento por iARN, células PC3-STEAP-1 se transfectaron establemente con un vector pPUR-U6-27-STEAP-1 que contenía ARNip para STEAP-1. Las células se dejaron morir en 0,1 % de SBF durante 18 horas a 37 ºC, se colocaron sobre hielo durante 10 minutos sin o con 10 µg/ml de mAb M2/92.30, se llevaron a ta durante 3 minutos, luego se estimularon con 10 % de SBF durante 5 minutos. Las células se lisaron en tampón RIPA, los lisados de células completas se resolvieron por 12,5 % de SDS-PAGE y las proteínas se detectaron por transferencia Western. Se detectó fosfo-ERK con antisuero de conejo (Cell Signaling) y ERK se detectó con anti-ERK de conejo (Zymed). STEAP-1 se detectó con anti-STEAP-1 de oveja y la actina se detectó con mAb anti-actina (Santa Cruz).
[0575] Adicionalmente, como se muestra en la Figura 33, iARN de STEAP-1 específica expresada establemente en células PC3-STEAP-1 reduce la comunicación célula-célula inducida por STEAP-1. En este experimento, células PC3 se transfectaron con gen de resistencia a neomicina solo o con STEAP-1 en el vector pSRa. Para la inactivación por iARN, células PC3-STEAP-1 se transfectaron establemente con un vector pPUR-U627-STEAP-1 que contenía ARNip para STEAP-1 o un vector vacío. Las células receptoras se marcaron con 1 mg/ml de dextrano-rojo Texas y las células donantes se marcaron con 2,5 µg/ml de calceína AM. Las células donantes (verdes) y receptoras (rojas) se co-cultivaron a 37 ºC durante 18-24 horas y se analizaron por microscopía para la co-localización de colorantes fluorescentes. En todos los experimentos, las mismas células se usaron como donante y aceptor.
[0576] Un procedimiento para analizar la proliferación de células relacionadas con STEAP-1 puede ser la medición de síntesis de ADN como marcador para la proliferación. Se usan precursores de ADN marcados (es decir, 3H-timidina) y se cuantifica su incorporación a ADN. La incorporación del precursor marcado en ADN es directamente proporcional a la cantidad de división celular que se produce en el cultivo. Otro procedimiento usado para medir la proliferación celular es realizar ensayos clonogénicos. En estos ensayos, un número definido de células se siembran sobre la matriz apropiada y se cuenta el número de colonias formadas después de un periodo de crecimiento tras el tratamiento con ARNip.
[0577] En la validación de la diana del cáncer STEAP-1 se considera complementar los análisis de supervivencia/proliferación celular con estudios de perfilado de la apoptosis y ciclo celular. El distintivo bioquímico del proceso apoptósico es la fragmentación del ADN genómico, un evento irreversible que compromete la célula a morir. Un procedimiento para observar ADN fragmentado en células es la detección inmunológica de fragmentos de ADN complejados con histona por un inmunoensayo (es decir, ELISA de detección de muerte celular) que mide el enriquecimiento de fragmentos de ADN complejados con histona (mono- y oligo-nucleosomas) en el citoplasma de células apoptósicas. Este ensayo no requiere el premarcado de las células y puede detectar degradación de ADN en células que no proliferan in vitro (es decir, células tumorales recientemente aisladas),
[0578] Las moléculas efectoras más importantes para desencadenar muerte celular apoptósica son las caspasas. Las caspasas son proteasas que cuando se activan escinden numerosos sustratos en el sitio del extremo carboxi de un residuo de aspartato que media en fases muy tempranas de la apoptosis tras la activación. Todas las caspasas se sintetizan como pro-enzimas y la activación implica escisión en residuos de aspartato. En particular, la caspasa 3 parece desempeñar una función central en la iniciación de eventos celulares de apoptosis. Ensayos para la determinación de la activación de caspasa 3 detectan eventos tempranos de apoptosis. Tras los tratamientos por iARN, la detección por transferencia Western de la presencia de caspasa 3 activa o escisión proteolítica de productos (es decir, PARP) encontrados en células apoptósicas soportan adicionalmente una inducción activa de apoptosis. Debido a que los mecanismos celulares que producen apoptosis son complejos, cada uno tiene sus ventajas y limitaciones. La consideración de otros criterios/puntos finales tales como morfología celular, condensación de cromatina, vesiculación de membranas, cuerpos apoptósicos ayudan a soportar adicionalmente la muerte celular como apoptósica. Como no todas las dianas génicas que regulan el crecimiento celular son antiapoptósicas, el contenido de ADN de células permeabilizadas se mide para obtener el perfil de contenido de ADN o perfil de ciclo celular. Los núcleos de células apoptósicas contienen menos ADN debido a la filtración al citoplasma (población sub-G1). Además, el uso de tintes de ADN (es decir, yoduro de propidio) también diferencia entre las diferentes fases del ciclo celular en la población celular debido a la presencia de diferentes cantidades de ADN en G0/G1, S y G2/M. En estos estudios las subpoblaciones pueden cuantificarse.
[0579] Para el gen STEAP-1, estudios de iARN facilitan el entendimiento de la contribución del producto génico en las rutas de cáncer. Tales moléculas de iARN activas tienen uso en identificar ensayos para cribar mAb que son terapéuticos antitumorales activos. Además, los ARNip se administran como terapéuticos a pacientes con cáncer para reducir el crecimiento maligno de varios tipos de cáncer, que incluyen aquellos enumerados en la Tabla
I. Si STEAP-1 desempeña una función en la supervivencia celular, proliferación celular, tumorigénesis o apoptosis, se usa como diana para fines de diagnóstico, pronóstico, preventivos y/o terapéuticos.
Ejemplos 32: Modulación de la función de STEAP-1
[0580] El transporte de iones desempeña una función importante en la regulación del crecimiento celular, permeabilidad intracelular, tráfico molecular y transducción de señales (Minke B. Cell Mol Neurobiol. 2001, 21:629; Golovina y col., Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2001, 280:H746). Éstas son funciones que son especialmente relevantes para las afecciones neoplásicas. La comunicación célula-célula regula la homeostasis, proliferación celular y muerte celular (Evans WH, Martin PE. Mol Membr Biol. 2002 19:121; Carruba G y col., Ann N
Y Acad Sci. 2002, 963:156). Estas funciones también son especialmente relevantes para la afección neoplásica.
[0581] Usando líneas celulares de control y líneas celulares que expresan STEAP-1 se identifica la función de inhibidores de STEAP-1. Por ejemplo, células PC3 y PC3-STEAP-1 pueden incubarse en presencia y ausencia de 5 mAb o inhibidores de molécula pequeña. El efecto de estos mAb o inhibidores de molécula pequeña se investiga usando ensayos de flujo de iones, comunicación de células, proliferación y señalización descritos anteriormente.
[0582] La transducción de señales y la salida biológica mediada por transportadores puede modularse mediante diversos mecanismos, que incluyen inhibición de la unión de receptor y ligando, antagonistas de iones,
10 interacciones de proteínas, regulación del transporte de iones y de moléculas pequeñas, etc. (Tang W y col., Front Biosci 2002, 7:1583). Usando líneas celulares de control y líneas celulares que expresan STEAP-1 se identifican moduladores (inhibidores o potenciadores) de la función de STEAP-1. Por ejemplo, células PC3 y PC3-STEAP-1 se incuban en presencia y ausencia de mAb o moduladores de molécula pequeña. En vista de las funciones de STEAP1 desveladas en el presente documento, los moduladores que son bloqueantes de los canales de iones usados en el
15 contexto de la presente divulgación incluyen compuestos tales como amlodipina, azuleno, dihidropiridinas, tianinas, nifedina, verapamilo y sus derivados (Tanaka Y, Shigenobu K. Cardiovasc Drug Rev. 2001, 19:297; Djuric D, Mitrovic
V. Jakovljevic V. Arzneimittelforschung. 2002, 52:365; Kourie JI, Wood HB. Prog Biophys Mol Biol. 2000;73:91); y, moduladores que son inhibidores de la comunicación de células usados en el contexto de la presente divulgación incluyen compuestos tales como ácido beta-glicirretínico, retinoides, TPA (Krutovskikh VA y col., Oncogene. 2002,
20 21:1989; Rudkin y col., J Surg Res. 2002,103:183; Ruch J y col., J Cell Blochem. 2001, 83:163). Por consiguiente, el (los) efecto(s) de mAb o inhibidores de molécula pequeña se investigan usando ensayos de flujo de iones, comunicación de células, proliferación y señalización descritos en los ejemplos anteriormente.
[0583] Si se modulan mAb y moléculas pequeñas, por ejemplo, inhiben, el transporte y función tumorigénicos 25 de STEAP-1, se usan para fines preventivos, de pronóstico, diagnósticos y/o terapéuticos.
[0584] En toda la presente solicitud se hace referencia a diversos contenidos de datos de páginas web, publicaciones, solicitudes de patente y patentes (se hace referencia a las páginas web por su localizador uniforme de recursos, o URL, direcciones en la malla mundial)
30 [0585] La presente invención no debe limitarse en alcance por las realizaciones desveladas en el presente documento, que están previstas como ilustraciones individuales de aspectos individuales de la invención, y cualquiera que sea funcionalmente equivalente está dentro del alcance de la invención. Diversas modificaciones a los modelos y procedimientos de la invención, además de aquellos descritos en el presente documento, serán
35 evidentes para aquellos expertos en la materia a partir de la descripción y enseñanzas anteriores, y se prevé similarmente que se encuentren dentro del alcance de la invención.
TABLAS:
40 [0586] TABLA I: Tejidos que expresan STEAP-1 cuando son malignos:
Próstata Vejiga Riñón Colon Pulmón Páncreas Ovario Mama Estómago Recto Linfoma
TABLA II: Abreviaturas de aminoácidos
ÚNICA LETRA
TRES LETRAS NOMBRE COMPLETO
F
Phe fenilalanina
L
Leu leucina
S
Ser serina
Y
Tyr tirosina
C
Cys cisteína
W
Trp triptófano
P
Pro prolina
H
His histidina
Q
Gln glutamina
R
Arg arginina
I
Ile isoleucina
M
Met metionina
T
Thr treonina
N
Asn asparagina
K
Lys lisina
V
Val valina
A
Ala alanina
D
Asp ácido aspártico
E
Glu ácido glutámico
G
Gly glicina
TABLA III(b)
Residuo original
Sustitución conservativa
Ala(A)
Gly; Ser; Val
Arg (R)
Lys
Asn (N)
Gin; His
Asp(D)
Glu
Cys (C)
Ser
Gln (Q)
Asn, His
Glu (E)
Asp
Gly(G)
Ala; Pro
His (H)
Asn; Gln
Ile (I)
Leu; Val
Leu (L)
Ile; Val
Lys (K)
Arg; Gln; Glu
Met (M)
Leu; Tyr; Ile; Val
Phe (F)
Met; Leu; Tyr
Ser (S)
Thr
Thr (T)
Ser
Trp(W)
Tyr
Tyr (Y)
Trp; Phe
Val (V)
Ile; Leu; Ala
TABLA IV: Motivos/Supermotivos de HLA de clase I/II [0587]
TABLA IV (A): Motivos/Supermotivos de HLA de clase I
SUPERMOTIVO
POSICIÓN POSICIÓN POSICIÓN
2 (Anclaje primario)
3 (Anclaje primario) Extremo C (Anclaje primario)
A1
TILVMS FWY
A2
LIVMATQ IVMATL
A3
VSMATLI RK
A24
YFWIVLMT FIYWLM
B7
P VILFMWYA
B27
RHK FILWMIVA
B44
ED FWILIMVA
B58
ATS FWILIVMA
B62
QLIVMP FWYMIVLA
MOTIVOS
A1
TSM Y
A1
DEAS Y
A2,1
LMVQIAT VLIMAT
A3
LMVISATFCGD KYRHFA
A11
VRMLISAGNCDF KRYH
A24
YFWM FLIW
A*3101
MVTALIS RK
A*3301
MVALFIST RK
A*6801
AVTMSLI RK
B*0702
P LMFWYAIV
B*3501
P LMFWYIVA
B51
P LIVFWYAM
B*5301
P IMFWYALV
B*5401
P ATIVLMFWY
Se prefieren los residuos en negrita, los residuos en cursiva son menos preferidos: Un péptido se considera que lleva motivos si tiene anclajes primarios en cada posición de anclaje primario para un motivo o supermotivo como se especifica en la tabla anterior.
TABLA IV (B): Supermotivo de HLA de clase II
1
6 9
W, F, Y, V, I, L
A, V, I, L, P, C, S, T A, V, I, L, C, S, T, M, Y
5
TABLA IV (C): Motivos de HLA de clase II
MOTIVOS
1º anclaje 1 2 3 4 5 1º anclaje 6 7 8 9
DR4
preferida FMILIVW M T I VSTCPALIM MH MH
perjudicial
W R WDE
DR1
preferida MFLIVWY PAMQ VMATSPLIC M AVM
perjudicial
C CH FD CWD GDE D
DR7
preferida MFLIVWY M W A IVMSACTPL M IV
perjudicial
C G GRD N G
DR3
MOTIVOS 1º anclaje 1 2 3 1º anclaje 4 5 1º anclaje 6
Motivo
a LIVMFY D
preferido
Motivo
b LIVMFAY DNQEST KRH
preferido
Supermotivo
MFLIVWY VMSTACPLI
DR
Los residuos en cursiva indican residuos menos preferidos o “tolerados” Los residuos en cursiva indican residuos menos preferidos o “tolerados”
10
TABLA IV (D): Supermotivos de HLA de clase I
POSICIÓN:
1 2 3 4 5 6 7 8 Extremo C
SUPER-
MOTIVOS
A1
1º Anclaje 1º Anclaje
TILVMS
FWY
A2
1º Anclaje 1º Anclaje
LIVMATQ
LIVMAT
A3
preferida 1º Anclaje YFW YFW YFW P 1º Anclaje
VSMATLI
(4/5) (3/5) (4/5) (4/5) RK
perjudicial
DE DE
(3/5);
(4/5)
P (5/5)
A24
1º Anclaje 1º Anclaje
YFWIVLMT
FIYWLM
B7
preferida FWY 1º Anclaje FWY FWY 1ºAnclaje
(5/5)
P (4/5) (3/5) VILFMWYA
LIVM
(3/5)
perjudicial
DE DE G QN DE
(3/5);
(3/5) (4/5) (4/5) (4/5)
P(5/5):
G(4/5);
A(3/5);
QN(3/5)
B27
1º Anclaje 1º Anclaje
RHK
FYLWMIVA
B44
1 º Anclaje 1º Anclaje
ED
FWYLIMVA
B58
1º Anclaje 1 º Anclaje
ATS
FWYLIVMA
B62
1º Anclaje 1º Anclaje
QL/VMP
FWYMIVLA
TABLA IV (E): Motivos de HLA de clase I
POSICIÓN 1 2 3 4 5 67 8 9 Extremo C
o extremo C
A1 preferida GFYW 1º Anclaje DEA YFW P DEQN YFW 1º Anclaje 9-mero STM Y perjudicial DE RHKLIVMP A G A
A1 preferida GRHK ASTCLIVM 1º Anclaje GSTC ASTC LIVM DE 1º Anclaje 9-mero DEAS Y perjudicial A RHKDEPYFW DE PQN RHK PG GP
A1 preferida YFW 1º Anclaje DEAQN A YFWQN PASTC GDE P 1º Anclaje 10-mero STM Y perjudicial GP RHKGLIVM DE RHK QNA RHKYFW RHK A
A1 preferida YFW STCLIVM 1º Anclaje A YFW PG G YFW 1º Anclaje 10-mero DEAS Y perjudicial RHK RHKDEPYFW P G PRHK QN
A2.1 preferida YFW 1º Anclaje YFW STC YFW A P 1º Anclaje 9-mero LMIVQAT VLIMAT perjudicial DEP DERKH RKH DERKH POSICIÓN:1 2 3 4 5 6 7 8 9 Extremo C
A2.1 preferida AYFW 1º Anclaje LVIM G G FYWL1º Anclaje 10-mero LMIVQAT VIM VLIMAT perjudicial DEP DE RKHA P RKH DERK HRKH
A3 preferida RHK 1º Anclaje YFW PRHKYF A YFW P 1º Anclaje perjudicial DEP LMVISATFCGD DE W KYRHFA
A11 preferida A 1º Anclaje YFW YFW A YFW YFW P 1º Anclaje VTLMISAGNCD F KRYH perjudicial DEP A G
A24 preferida YFWRHK 1º Anclaje STC YFW YFW 1º Anclaje 9-mero YFWM FLIW perjudicial DEG DE G QNP DERH KG AQN
A24 Preferida 1º Anclaje P YFWP P 1º Anclaje 10-mero YFWM FLIW Perjudicial GDE QN RHK DE A QN DEA
A3101 Preferida RHK 1º Anclaje YFW P YFW YFW AP 1º Anclaje MVTALIS RK Perjudicial DEP DE ADE DE DE DE
A3301 Preferida 1º Anclaje YFW AYFW 1º Anclaje MVALFIST RK Perjudicial GP DE
Preferida YFWSTC 1º Anclaje YFWLIV YFW P 1º Anclaje AVTMSLI M RK
perjudicial GP DEG RHK A
B0702 Preferida RHKFWY 1º Anclaje RHK RHK RHK RHK PA 1º Anclaje P LMFWYAI V perjudicial DEQNP DEP DE DE GDE QN DE
o extremo C
A1 preferida GFYW 1º Anclaje DEA YFW P DEQN YFW 1º Anclaje 9-mero STM Y perjudicial DE RHKLIVMP A G A
A1 preferida GRHK ASTCLIVM 1º Anclaje GSTC ASTC LIVM DE 1º Anclaje 9-mero DEAS Y perjudicial A RHKDEPYFW DE PQN RHK PG GP
B3501 Preferida FWILIVM 1º FWY FWY 1º Anclaje Anclaje P LMFWYIV A perjudicial AGP G G
B51 Preferida LIVMFWY 1º Anclaje FWY STC FWY G FWY 1º Anclaje P LIVFWYA M perjudicial HKSTC DE G DEQN GDE AGPDER
B5301 preferida LIVMFWY 1º Anclaje FWY STC FWY LIVMFWYFWY 1º Anclaje P IMFWYAL V perjudicial AGPQN G RHKQN DE
B5401 preferida FWY 1º Anclaje FWILIVM LIVM ALIVM FWYA P 1º Anclaje P ATIVLMF WY perjudicial GDESTC RHKDE DE QNDGE DE GPQNDE
TABLA IV (F):
Resumen de supertipos de HLA
Frecuencias fenotípicas globales de supertipos de HLA en diferentes poblaciones étnicas
Especificidad Frecuencia fenotípica
Supertipo
2 Extremo C Caucásico Negro norteamericano Japonés Chino Hispano Promedio
B7
P AILMVFWY 43,2 55,1 57,1 43,0 49,3 49,5
A3
AILMVST RK 37,5 42,1 45,8 52,7 43,1 44,2
A2
AILMVT AILMVT 45,8 39,0 42,4 45,9 43,0 42,2
A24
YF(WIVLMT) (YWLM) 23,9 38,9 58,6 40,1 38,3 40,0
B44
E(D) FWILIMVA 43,0 21,2 42,9 39,1 39,0 37,0
A1
TI (LVMS) FWY 47,1 16,1 21,8 14,7 26,3 25,2
B27
RHK FIL (WMI) 28,4 26,1 13,3 13,9 35,3 23,4
B62
QL (IVMP) FWY (MIV) 12,6 4,8 36,5 25,4 11,1 18,1
B58
ATS FWY (LIV) 10,0 25,1 1,6 9,0 5,9 10,3
TABLA IV(G):
Cobertura de la población calculada proporcionada por diferentes combinaciones de supertipos de HLA
Supertipos de HLA Frecuencia fenotípica
A2, A3 y B7 A2, A3, B7, A24 y A1 A2, A3, B7, A24, B44, A1, B27, B62 y B58
Caucásico Negro norteamericano Japonés Chino Hispano Promedio
83,0
86,1 87,5 88,4 86,3 86,2
99,5
98,1 100,0 99,5 99,4 99,3
99,9
99,6 100,0 99,8 99,9 99,8
Los motivos indican los residuos que definen las especificidades de supertipo. Los motivos incorporan residuos determinados basándose en datos publicados para ser reconocidos por múltiples alelos dentro del supertipo. Los residuos dentro de los paréntesis son residuos adicionales también predichos para ser tolerados por múltiples alelos dentro del supertipo.
Tabla IV(h): Motivos que se producen frecuentemente
Nombre
% de identidad promedio Descripción Posible función
zf-C2H2
34 % Dedo de cinc, tipo C2H2 la proteína de unión a ácido nucleico funciona de factor de transcripción, localización nuclear probable
citocromo_b_ N
68 % Citocromo b (extremo N)/b6/petB oxidasa unida a membrana, generan superóxido
Ig
19 % Dominio de inmunoglobulina los dominios tienen cien aminoácidos de longitud e incluyen un enlace disulfuro intra-dominio conservado
WD40
18 % Dominio WD, repetición de Gbeta repeticiones en tándem de aproximadamente 40 residuos, conteniendo cada una un motivo de Trp-Asp. Función en transducción de señales e interacción de proteínas
Tabla IV(h): Motivos que se producen frecuentemente
Nombre
% de identidad promedio Descripción Posible función
PDZ
23 % Dominio PDZ puede funcionar en la elección como diana de moléculas de señalización para sitios submembranosos
LRR
28 % Repetición rica en leucina motivos de secuencia cortos que participan en las interacciones proteína-proteína
Pcinasa
23 % Dominio de proteína cinasa núcleo catalítico conservado común a tanto serina/treonina como a proteínas tirosinas cinasas que contienen un sitio de unión a ATP y un sitio catalítico
PH
16 % Dominio PH homología a pleckstrina que participa en la señalización intracelular o como constituyentes del citoesqueleto
EGF
34 % Dominio similar a EGF 30-40 aminoácidos de longitud encontrados en el dominio extracelular de proteínas unidas a membrana o en proteínas secretadas
Rvt
49 % Transcriptasa inversa (ADN polimerasa dependiente de ARN)
Ank
25 % Repetición Ank proteína citoplásmica, asocia proteínas de la membrana integral al citoesqueleto
Oxidored_q1
32 % NADH-Ubiquinona/plastoquinona (complejo I), diversas cadenas asociada a membrana. Participa en la translocalización de protones a través de la membrana
Efhand
24 % Mano EF dominio de unión a calcio, consiste en un bucle de 12 residuos flanqueado en ambos lados por un dominio de hélice alfa de 12 residuos
Rvp
79 % Aspartilproteasa retroviral Aspartilproteasas o proteasas ácidas, centradas en un residuo de aspartilo catalítico
Colágeno
42 % Repetición de triple hélice de colágeno (20 copias) proteínas estructurales extracelulares que participan en la formación de tejido conjuntivo. La secuencia consiste en G-X-Y y las cadenas de polipéptidos forman una triple hélice.
Fn3
20 % Dominio de tipo III de fibronectina Localizado en la región de unión a ligando extracelular de receptores y tiene aproximadamente 200 residuos de aminoácidos de longitud con dos pares de cisteínas que participan en enlaces disulfuro
7tm_1
19 % receptor de 7 transmembrana (familia rodopsina) siete regiones transmembrana hidrófobas, con el extremo N localizado extracelularmente mientras que el extremo C es citoplásmico. Señal a través de proteínas G
Isótopo Actinio-225 (Ac-225) Actinio-227 (Ac-227)
Bismuto-212 (Bi-212) Bismuto-213 (Bi-213) Cadmio-109 (Cd-109) Cobalto-60 (Co-60)
Cobre-64 (Cu-64)
Cobre-67 (Cu-67)
Disprosio-166 (Dy-166) Erbio-169 (Er-169)
Europio-152 (Eu-152)
Europio-154 (Eu-154)
Gadolinio-153 (Gd-153) Oro-198 (Au-198) Holmio-166 (Ho-166)
Yodo-125 (I-125)
Yodo-131 (I-131)
Iridio-192 (Ir-192)
Lutecio-177 (Lu-177)
Molibdeno-99 (Mo-99)
Osmio-194 (Os-194) Paladio-103 (Pd-103) Platino-195m (Pt-195m)
Fósforo-32 (P-32)
Fósforo-33 (P-33)
Radio-223 (Ra-223)
Tabla IV(i): Ejemplos de isótopos médicos:
Descripción de uso Véase Torio-229 (Th-229) Padre del Radio-223 (Ra-223) que es un emisor alfa usado para tratar metástasis en el esqueleto resultantes de cáncer (es decir, cánceres de mama y próstata), e radioinmunoterapia para el cáncer Véase Torio-228 (Th-228) Véase Torio-229 (Th-229) Detección de cáncer Fuente de radiación para radioterapia de cáncer, para irradiadores de alimentos y para la esterilización de aparatos médicos Un emisor de positrones usado para terapia contra el cáncer y obtención de imágenes por SPECT Emisor beta/gamma usado en radioinmunoterapia para el cáncer y estudios de diagnóstico (es decir, cánceres de mama y de colon, y linfoma) Radioinmunoterapia para el cáncer Tratamiento de artritis reumatoide, particularmente para las articulaciones pequeñas asociadas a los dedos de las manos y los dedos de los pies Fuente de radiación para irradiación de alimentos y para la esterilización de aparatos médicos Fuente de radiación para irradiación de alimentos y para la esterilización de aparatos médicos Detección de osteoporosis y dispositivos de seguridad de calidad médica nuclear Implante y terapia intracavitaria de cánceres de ovario, próstata y cerebral Tratamiento de múltiples mielomas en terapia esquelética dirigida, inmunoterapia para el cáncer, ablación de médula ósea y tratamiento de artritis reumatoide Detección de osteoporosis, obtención de imágenes de diagnóstico, fármacos trazadores, tratamiento de cáncer cerebral, radiomarcado, obtención de imágenes de tumores, mapeo de receptores en el cerebro, radioterapia intersticial, braquiterapia para tratamiento de cáncer de próstata, determinación de la tasa de filtración glomerular (GFR), determinación del volumen de plasma, detección de trombosis venosa profunda en las piernas Evaluación de la función tiroidea, detección de enfermedad de tiroides, tratamiento de cáncer de tiroides, además de otras enfermedades de tiroides no malignas (es decir, enfermedad de Graves, bocios e hipertiroidismo), tratamiento de leucemia, linfoma y otras formas de cáncer (por ejemplo, cáncer de mama) usando radioinmunoterapia Braquiterapia, tratamiento de tumor cerebral y de médula espinal, tratamiento de arterias bloqueadas (es decir, arteriosclerosis y reestenosis) e implantes para tumores de mama y de próstata Inmunoterapia para el cáncer y tratamiento de arterias bloqueadas (es decir, arteriosclerosis y reestenosis) Padre del Tecnecio-99m (Tc-99m) que se usa para la obtención de imágenes del cerebro, hígado, pulmones, corazón y otros órganos. Actualmente, el Tc-99m es el radioisótopo más ampliamente usado para la obtención de imágenes de diagnóstico de diversos cánceres y enfermedades en las que participa el cerebro, corazón, hígado, pulmones; también se usa en la detección de trombosis venosa profunda en las piernas Inmunoterapia para el cáncer Tratamiento de cáncer de próstata Estudios de biodistribución y metabolismo de cisplatino, un fármaco quimioterapéutico Policitemia roja vera (enfermedad de los glóbulos de la sangre) y tratamiento de leucemia, diagnóstico/tratamiento de cáncer de huesos; tratamiento de cáncer de colon, pancreático y de hígado; radiomarcado de ácidos nucleicos para investigación in vitro, diagnóstico de tumores superficiales, tratamiento de arterias bloqueadas (es decir, arteriosclerosis y reestenosis) y terapia para intracavidad Tratamiento de leucemia, diagnóstico/tratamiento de enfermedad de los huesos, radiomarcado y tratamiento de arterias bloqueadas (es decir, arteriosclerosis y reestenosis) Véase Actinio-227 (Ac-227)
Isótopo Descripción de uso
Renio-186 (Re-186) Alivio de dolor por cáncer de huesos, tratamiento de artritis reumatoide y diagnóstico y tratamiento de linfoma y cánceres de huesos, mama, colon y de hígado usando radioinmunoterapia
Renio-188 (Re-188) Diagnóstico y tratamiento de cáncer usando radioinmunoterapia, alivio de dolor por cáncer de huesos, tratamiento de artritis reumatoide y tratamiento de cáncer de próstata
Rodio-105 (Rh-105) Inmunoterapia para el cáncer Samario-145 (Sm-145) Tratamiento de cáncer ocular Samario-153 (Sm-153) Inmunoterapia para el cáncer y alivio de dolor por cáncer de huesos Escandio-47 (Sc-47) Inmunoterapia para el cáncer y alivio de dolor por cáncer de huesos Selenio-75 (Se-75) Radiotrazador usado en estudios del cerebro, obtención de imágenes de la corteza
suprarrenal por gamma-escintigrafía, localizaciones laterales de tumores secretantes esteroides, barrido pancreático, detección de glándulas paratiroideas hiperactivas, medida de la tasa de pérdida de ácido biliar del conjunto endógeno
Estroncio-85 (Sr-85) Detección de cáncer de huesos y barridos del cerebro Estroncio-89 (Sr-89) Alivio de dolor por cáncer de huesos, tratamiento de mieloma múltiple y terapia
osteoblástica Tecnecio-99m (Tc-99m) Véase Molibdeno-99 (Mo-99) Torio-228 (Th-228) Padre del Bismuto-212 (Bi-212) que es un emisor alfa usado en inmunoterapia para
el cáncer Torio-229 (Th-229) Padre del Actinio-225 (Ac-225) y abuelo del Bismuto-213 (Bi-213) que son emisores alfa usados en inmunoterapia para el cáncer Tulio-170 (Tm-170) Fuente gamma para irradiadores de sangre, fuente de energía para dispositivos
médicos implantados Estaño-117m (Sn-117m) Inmunoterapia para el cáncer y alivio de dolor por cáncer de huesos Tungsteno-188 (W-188) Padre del Renio-188 (Re-188) que se usa para diagnósticos/tratamiento de cáncer,
alivio de dolor por cáncer de huesos, tratamiento de artritis reumatoide y tratamiento de arterias bloqueadas (es decir, arteriosclerosis y reestenosis)
Xenón-127 (Xe-127) Obtención de imágenes neuronales de trastornos del cerebro, estudios de SPECT de alta resolución, pruebas de la función pulmonar y estudios de circulación sanguínea cerebral
Iterbio-175 (Yb-175) Inmunoterapia para el cáncer Itrio-90 (Y-90) Microsemillas obtenidas de irradiar Itrio-89 (Y-89) para el tratamiento de cáncer de hígado
Itrio-91 (Y-91) Una marca gamma-emisora para Itrio-90 (Y-90) que se usa para inmunoterapia para el cáncer (es decir, linfoma, cánceres de mama, colon, riñón, pulmón, ovario, próstata, pancreático y de hígado inoperable)
[0588] Tablas V-XVIII: Expuestas en la solicitud de patente de Estados Unidos número 10/236.878; presentada el 06-September-2002, los contenidos específicos están completamente incorporados por referencia en el presente documento.
Tabla XIX: Motivos que se producen frecuentemente
Nombre
% de identidad promedio Descripción Posible función
zf-C2H2
34 % Dedo de cinc, tipo C2H2 la proteína de unión a ácido nucleico funciona de factor de transcripción, localización nuclear probable
citocromo_b _N
68 % Citocromo b (extremo N)/b6/petB oxidasa unida a membrana, generan superóxido
Ig
19 % Dominio de inmunoglobulina los dominios tienen cien aminoácidos de longitud e incluyen un enlace disulfuro intra-dominio conservado
WD40
18 % Dominio WD, repetición de Gbeta repeticiones en tándem de aproximadamente 40 residuos, conteniendo cada una un motivo de Trp-Asp. Función en transducción de señales e interacción de proteínas
Nombre
% de identidad promedio Descripción Posible función
PDZ
23 % Dominio PDZ puede funcionar en la elección como diana de moléculas de señalización para sitios submembranosos
LRR
28 % Repetición rica en leucina motivos de secuencia cortos que participan en las interacciones proteínaproteína
Pcinasa
23 % Dominio de proteína cinasa núcleo catalítico conservado común a tanto serina/treonina como a proteínas tirosinas cinasas que contienen un sitio de unión a ATP y un sitio catalítico
PH
16 % Dominio PH homología a pleckstrina que participa en la señalización intracelular o como constituyentes del citoesqueleto
EGF
34 % Dominio similar a EGF 30-40 aminoácidos de longitud encontrados en el dominio extracelular de proteínas unidas a membrana o en proteínas secretadas
Rvt
49 % Transcriptasa inversa (ADN polimerasa dependiente de ARN)
Ank
25 % Repetición Ank proteína citoplásmica, asocia proteínas de la membrana integral al citoesqueleto
Oxidored_q1
32 % NADH-Ubiquinona/plastoquinona (complejo I), diversas cadenas asociada a membrana. Participa en la translocalización de protones a través de la membrana
Efhand
24 % Mano EF dominio de unión a calcio, consiste en un bucle de 12 residuos flanqueado en ambos lados por un dominio de hélice alfa de 12 residuos
Rvp
79 % Aspartilproteasa retroviral Aspartilproteasas o proteasas ácidas, centradas en un residuo de aspartilo catalítico
Colágeno
42 % Repetición de triple hélice de colágeno (20 copias) proteínas estructurales extracelulares que participan en la formación de tejido conjuntivo. La secuencia consiste en G-X-Y y las cadenas de polipéptidos forman una triple hélice.
Fn3
20 % Dominio de tipo III de fibronectina Localizado en la región de unión a ligando extracelular de receptores y tiene aproximadamente 200 residuos de aminoácidos de longitud con dos pares de cisteínas que participan en enlaces disulfuro
Nombre
% de identidad promedio Descripción Posible función
7tm_1
19 % receptor de 7 transmembrana (familia rodopsina) siete regiones transmembrana hidrófobas, con el extremo N localizado extracelularmente mientras que el extremo C es citoplásmico. Señal a través de proteínas G
Tabla XX: Motivos y modificaciones postraduccionales de STEAP-1:
Sitio de N-glucosilación 143 -146 NGTK (SEQ ID NO: 84) 331 -334 NKTE (SEQ ID NO: 85)
Sitio de fosforilación de proteína cinasa C
3-5 SrK 160 -162 TrK 187 -189 SyR 246 -248 TwR
Sitio de fosforilación de caseína cinasa II 3 -6 SrkD (SEQ ID NO: 86)
8 -11 TnqE (SEQ ID NO: 87) 240 -243 SvsD (SEQ ID NO: 88) 246 -249 TwrE (SEQ ID NO: 89)
Sitio de fosforilación de tirosina cinasa 19 -27 RRNLEEDDY (SEQ ID NO: 90)
Sitio de N-miristoilación 133 -138 GVIAAI (SEQ ID NO: 91) 265 -270 GTIHAL (SEQ ID NO: 92)
Secuencia que elige como diana nuclear bipartita 4 -20 RKDITNQEELWKMKPRR (SEQ ID NO: 93)
Tabla XXI: Características de proteínas de STEAP-1
Programa URL (localizada en la malla Resultado bioinformático mundial en)
ORF ORF finder 1193 pb
Longitud de 339 aa
proteína
Región TM Pred (.ch.embnet.org/) 6 TM en aa 73-91, 120
transmembrana 141, 163-181, 218-236, 253-274, 286-304
HMMTop (.enzim.hu/hmmtop/) 6 TM en aa 73-90, 117139, 164-182, 220-238, 257-274, 291-309
Sosui (.genome.ad.jp/SOSui/) 6 TM en aa 70-92,114136, 163-184, 219-241, 255-273, 292-313
TMHMM (.cbs.dtu.dk/services/TMHMM) 6 TM en aa 73-95,117139, 164-182, 218-240, 252-274, 289-311
Péptido señal Signal P (.cbs.dtu.dk/services/SeñalP/) posible escisión entre aa 136 y 137
pl
pl/MW tool (.expasy.ch/tools/) 9,2 pl
Peso molecular
pI/MW tool (.expasy.ch/tools/) 39,8 kD
Localización
PSORT http://psort.nibb.ac.jp/ 60 % de membrana
plasmática, 40 % de golgi,
30
% de retículo
endoplásmico
PSORT II
http://psort.nibb.ac.jp/ 66 % de retículo
endoplásmico,
11 % de
mitocondrias,
11 % de
membrana plasmática
Motivos
Pfam (.sanger.ac.uk/Pfam/) ninguno
Prints
(.biochem.ucl.ac.uk/) Distintivo ras de la
proteína
transformante
P21,
distintivo de
repetición de
fibronectina
tipo III
Blocks
(.blocks.fhcrc.org/) Repetición Halt-A-TPR,
distintivo de la proteína de
membrana de la bomba de
arsénico, repetición d la
proteína M
[0589] Tablas XXII - LI: Expuestas en la solicitud de patente de Estados Unidos número 10/236.878; presentada el 06-September-2002, los contenidos específicos están completamente incorporados por referencia en el presente documento.
Tabla LII: Péptidos de búsqueda
Variante 1 de STEAP 1: nonámeros, decámeros y 15-meros: aa 1-339 (SEQ ID NO: 94)
Variante 2: 9-meros aa 247-258 (SEQ ID NO: 95) WREFHYIQVNNI 10-meros aa 246-258 (SEQ ID NO: 96) TWREFHYIQVNNI
15-meros aa 241-258 (SEQ ID NO: 97) VSDSLTWREFHYIQVNNI
Variante 3: 9-meros aa 247-(SEQ ID NO: 98) WREFHYIQIIHKKSDVPESLWDPCLTRFKGLNLIQS 10-meros aa 246-(SEQ ID NO: 99) TWREFHYIQIIHKKSDVPESLWDPCLTRFKGLNLIQS 15-meros aa 241-(SEQ ID NO: 100) VSDSLTWREFHYIQIIHKKSDVPESLWDPCLTRFKGLNLIQS
Variante 4: 9-meros aa 160-176 (SEQ ID NO: 101) RKQFGLLSLFFAVLHAI 10-meros aa 159-177 (SEQ ID NO: 102) TRKQFGLLSLFFAVLHAIY 15-meros aa 154-182 (SEQ ID NO: 103) DKWMLTRKQFGLLSLFFAVLHAIYSLSYP
Tabla LIII: Composición de exones de la variante 1 de STEAP-1 (8P1D4).
Número de exón
Inicio Final
1
1
34
2
35 149
3
150 662
4
663 827
5
828 1176

Claims (36)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    El anticuerpo monoclonal designado X120.545.1.1 y nº de acceso de ATCC asignado: PTA-5803 o una forma humanizada de dicho anticuerpo; o un fragmento de dicho anticuerpo o forma humanizada que contiene el dominio de unión a antígeno de dicho anticuerpo o forma humanizada;
    en el que la forma humanizada y el fragmento se unen específicamente a STEAP-1.
  2. 2.
    Una forma modificada del anticuerpo monoclonal designado X120.545.1.1 y nº de acceso de ATCC asignado: PTA-5803 que se une específicamente a STEAP-1 y presenta la actividad biológica de X120.545.1.1.
  3. 3.
    La forma modificada de la reivindicación 2, en la que la modificación está seleccionada de una deleción, adición y sustitución de aminoácidos.
  4. 4.
    El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 1, en el que el fragmento es un fragmento Fab, F(ab')2, Fv o Sfv.
  5. 5.
    Una proteína recombinante que comprende la región de unión a antígeno del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
  6. 6.
    El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el anticuerpo o fragmento se acopla a un marcador detectable, una toxina o un agente terapéutico.
  7. 7.
    El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 6, en el que el anticuerpo o fragmento se acopla a un marcador detectable, y en el que el marcador detectable es un radioisótopo, un quelante metálico, una enzima, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente o un compuesto quimioluminiscente.
  8. 8.
    El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 7, en el que el radioisótopo está seleccionado de 212Bi, 131I, 111In, 90Y, 186Re, 211At, 125I, 188Re, 153Sm, 213Bi, 32P y 177Lu.
  9. 9.
    El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 6, en el que el anticuerpo o fragmento se acopla a una toxina, y en el que la toxina está seleccionada de ricina, cadena A de ricina, doxorubicina, daunorubicina, un maitansinoide, taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxiantracenodiona, actinomicina, toxina diftérica, exotoxina de Pseudomonas (PE) A, PE40, abrina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina, retstrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, calicheamicina, inhibidor de Saponaria officinalis, glucocorticoide, auristatina, auromicina, itrio, bismuto, combrestatina, duocarmicinas, dolostatina, cc1065 y un cisplatino.
  10. 10.
    El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 9, en el que el anticuerpo o fragmento se acopla a una auristatina.
  11. 11.
    El hibridoma depositado en el nº de acceso de ATCC PTA-5803.
  12. 12.
    Un vector que comprende un polinucleótido que codifica el anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 ó 6-10.
  13. 13.
    El vector de la reivindicación 12 que codifica dicho anticuerpo o fragmento como una cadena única.
  14. 14.
    Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 ó 6-10 en una forma de dosis unitaria humana.
  15. 15.
    Un ensayo para detectar la presencia de una proteína STEAP-1 en una muestra biológica que comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 6-10, y detectar la unión de proteína STEAP-1 en la muestra.
  16. 16.
    El ensayo de la reivindicación 15, en el que la muestra biológica es de un paciente que tiene o se sospecha que tiene un cáncer enumerado en la Tabla I.
  17. 17.
    El ensayo de la reivindicación 15 ó 16, en el que la muestra es suero.
  18. 18.
    El ensayo de la reivindicación 15 ó 16, en el que la muestra es próstata.
  19. 19.
    El vector de la reivindicación 13 para su uso en un procedimiento de tratamiento médico.
  20. 20.
    El vector de la reivindicación 19 para su uso en un procedimiento para inhibir el crecimiento de células cancerosas que expresan STEAP-1 en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:
    administrar el vector a dicho sujeto, de forma que el vector administre la secuencia codificante del anticuerpo o fragmento monocatenario a las células cancerosas y el anticuerpo monocatenario codificado se exprese intracelularmente en su interior.
  21. 21.
    Uso del vector de la reivindicación 13 en la fabricación de un medicamento, en el que el medicamento es para su uso en un procedimiento para inhibir el crecimiento de células cancerosas que expresan STEAP-1 en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:
    administrar el vector a dicho sujeto, de forma que el vector administre la secuencia codificante del anticuerpo o fragmento monocatenario a las células cancerosas y el anticuerpo monocatenario codificado se exprese intracelularmente en su interior.
  22. 22.
    El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 ó 6-10 para su uso en un procedimiento de tratamiento médico.
  23. 23.
    Uso del anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 ó 6-10 en la fabricación de un medicamento, en el que el medicamento es para su uso en un procedimiento para inhibir el crecimiento de células cancerosas que expresan STEAP-1 en un sujeto, comprendiendo el procedimiento administrar el anticuerpo
    o fragmento a dicho sujeto.
  24. 24. El uso de la reivindicación 23, en el que las células cancerosas son de un cáncer expuesto en la Tabla
    I.
  25. 25.
    El uso de la reivindicación 24, en el que las células cancerosas son de próstata maligna.
  26. 26.
    Un procedimiento in vitro de administración de un agente citotóxico o un agente de diagnóstico para una célula que expresa una proteína STEAP-1, que comprende:
    proporcionar un agente citotóxico o un agente de diagnóstico conjugado con el anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 ó 6-10, para formar un conjugado de anticuerpo-agente o fragmento-agente; y,
    exponer la célula al conjugado de anticuerpo-agente o fragmento-agente.
  27. 27.
    Un conjugado de anticuerpo-agente o fragmento-agente formado de un agente citotóxico o un agente de diagnóstico conjugado con el anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 ó 6-10, para su uso in vivo en un procedimiento de tratamiento o diagnóstico.
  28. 28.
    El conjugado de la reivindicación 27 para su uso en un procedimiento de administrar un agente citotóxico o un agente de diagnóstico a una célula que expresa una proteína STEAP-1, comprendiendo el procedimiento:
    proporcionar un agente citotóxico o un agente de diagnóstico conjugado con el anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 ó 6-10, para formar un conjugado de anticuerpo-agente o fragmento-agente; y,
    exponer la célula al conjugado de anticuerpo-agente o fragmento-agente.
  29. 29.
    Uso de un conjugado en la fabricación de un medicamento, en el que el conjugado es un conjugado de anticuerpo-agente o fragmento-agente formado de un agente citotóxico o un agente de diagnóstico conjugado con el anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 ó 6-10, y en el que el medicamento es para administrar el agente citotóxico o agente de diagnóstico a una célula que expresa una proteína STEAP-1.
  30. 30.
    El procedimiento, conjugado o uso de una cualquiera de las reivindicaciones 26-29, en el que el agente citotóxico o el agente de diagnóstico está seleccionado del grupo que consiste en un marcador detectable, una toxina y un agente terapéutico.
  31. 31.
    El procedimiento, conjugado o uso de la reivindicación 30, en el que el anticuerpo o fragmento está conjugado con un marcador detectable, en el que el marcador detectable es un radioisótopo, un quelante metálico, una enzima, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente o un compuesto quimioluminiscente.
  32. 32.
    El procedimiento, conjugado o uso de la reivindicación 31, en el que el radioisótopo está seleccionado de 212Bi,131I, 111In, 90Y, 186Re, 211At, 125I, 188Re, 153Sm, 213Bi, 32P y 177Lu.
  33. 33.
    El procedimiento, conjugado o uso de la reivindicación 30, en el que el anticuerpo o fragmento está conjugado con una toxina, y en el que la toxina está seleccionada de ricina, cadena A de ricina, doxorubicina, daunorubicina, un maitansinoide, taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxiantracenodiona, actinomicina, toxina diftérica, exotoxina de Pseudomonas (PE) A, PE40, abrina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina, retstrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, calicheamicina, inhibidor de Saponaria officinalis, glucocorticoide, auristatina, auromicina, itrio, bismuto, combrestatina, duocarmicinas, dolostatina, cc1065 y un cisplatino.
  34. 34.
    El procedimiento, conjugado o uso de la reivindicación 33, en el que el anticuerpo o fragmento se acopla a una auristatina.
  35. 35.
    Un procedimiento in vitro para detectar una proteína STEAP-1 en una muestra biológica, que comprende etapas de:
    proporcionar la muestra biológica y una muestra de control;
    poner en contacto la muestra biológica y la muestra de control con el anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 ó 6-10 que se une específicamente a la proteína STEAP-1; y determinar una cantidad de un complejo del anticuerpo o fragmento con la proteína STEAP-1 presente en la muestra biológica y la muestra de control.
  36. 36. El procedimiento de la reivindicación 35, en el que la muestra biológica y la muestra de control son de un paciente que tiene o que se sospecha que tiene un cáncer enumerado en la Tabla I.
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