ES2445173T3

ES2445173T3 - Sistema de expresión

Info

Publication number: ES2445173T3
Application number: ES11171994.4T
Authority: ES
Inventors: Ian John Hodgson; Christopher David John Lennon; Bhupendra Vallabh Kara
Original assignee: Fujifilm Diosynth Biotechnologies UK Ltd
Current assignee: Fujifilm Diosynth Biotechnologies UK Ltd
Priority date: 2006-02-03
Filing date: 2007-02-01
Publication date: 2014-02-28
Anticipated expiration: 2027-02-01
Also published as: WO2007088371A3; JP2013078323A; JP2016136959A; EP2386643A2; EP2695943B1; CN108841848B; DK1984506T3; CA2959915A1; EP2390334A3; US9677103B2; CN102690834A; JP5221385B2; EP2386642B1; KR101492844B1; EP2695943A1; JP5713984B2; JP2009525038A; JP6571707B2; JP2015006193A; SG169390A1

Abstract

Un sistema de expresión de proteína, que comprende: a) un promotor T7A3 ligado operablemente a b) una secuencia operadora palindrómica perfecta.

Description

Sistema de expresión

La presente invención se refiere a un sistema de expresión adecuado para la expresión microbiana de polipéptidos recombinantes.

Desde la patente US 6.537.779 se conocen sistemas de expresión de proteínas basados en secuencias operadoras palindrómicas perfectas basadas en T7. Los sistemas basados en T7 presentan inconvenientes porque el funcionamiento del sistema de T7 requiere polimerasa de fago que se proporciona comúnmente insertando un profago !DE3 que expresa la polimerasa de fago requerida en la cepa huésped de Escherichia coli para crear cepas huésped lisogénicas. La polimerasa de fago también puede suministrarse a la célula mediante infección con un fago de transducción ! especializado que porta el gen para la polimerasa de fago (por ejemplo ARN polimerasa de T7). El profago !DE3 carece de los elementos genéticos requeridos para el corte del profago para formar partículas de fago líticas. Sin embargo, se ha mostrado que cepas huésped lisogénicas de !DE3 liberan partículas de fago y por tanto provocan infecciones no deseadas en plantas de fermentación. De hecho, no se permite el uso de cepas de !DE3 a determinados operadores de plantas de fermentación.

La expresión de la proteína heteróloga antes de la inducción no es deseable porque algunas proteínas heterólogas tienen efectos perjudiciales sobre el crecimiento de la célula huésped y la estabilidad del plásmido, lo que reduce la productividad global. Para evitar esto, los sistemas de expresión basados en T7 controlan generalmente la expresión de proteínas heterólogas en dos niveles. En primer lugar, se requiere la inducción de la expresión del gen de ARN polimerasa de T7 para producir ARN polimerasa de T7 para conducir la expresión a partir del promotor de T7. En segundo lugar, también se necesita inducir el propio promotor de T7. Esto aumenta la complejidad del funcionamiento de los sistemas de expresión basados en T7.

Lanzer et al, Proc. Nat. Acad. Sci. Vol. 85, p. 8973-7 (1988) describe la influencia de la localización del operador lac sobre la represión de diversos promotores. Becker et al, J. Molecular Biology, Vol. 349, nº 4, p. 716-30 (2005) describe que la naturaleza, localización y de operadores desempeñan un papel en la formación de bucles de represión. Edamatsu et al, Gene, Vol. 187, nº 2, p. 289-94 (1997) describe una expresión de mamífero que comprende tres operadores lac en dirección 3’ del promotor EF-1x humano. Brosius et al, Proc. Nat. Acad. Sci. vol. 81, Vol. 81, p. 6929-33 (1984) describe la regulación de promotores de ARN ribosómico con un operador lac sintético. Savochina et al, Molecular & General Genetics, Vol. 189, nº 1 p. 142-7 (1983) describe aspectos de estabilidad plasmídica de la clonación de los promotores del fago T7 T7A1, T7A2 y T7A3 en tándem en plásmidos. Chidgeavadze et al, Nucleic Acids Research, Vol. 12, nº 3, p. 1671-86 (1984) describe que 2,3’-didesoxi-3’aminonucleósido-5’-trifosfatos son terminadores de la síntesis de ADN catalizada por ADN polimerasas.

Existe un gran número de sistemas de expresión de proteínas heterólogos con diferentes modos de control e inducción, haciendo que la selección y optimización del sistema de expresión/procedimiento de fermentación para proteínas de interés sea un procedimiento enormemente empírico. Esto requiere mucho tiempo y no es deseable. Por tanto, hay una necesidad de sistemas que puedan proporcionar un control mejorado de la expresión y niveles mejorados de expresión de proteínas sin el uso de polimerasa de fago ni cepas huésped lisogénicas. También hay una necesidad de sistemas que puedan proporcionar una expresión heteróloga inducible en células procariotas, así como en células eucariotas tales como células de mamíferos y levaduras.

Según la presente invención, se proporciona un sistema de expresión de proteínas que comprende:

a) un promotor T7A3; y

b) una secuencia operadora palindrómica perfecta.

Las secuencias operadoras que pueden emplearse en el sistema de expresión según la presente invención incluyen lac, gal, deo y gln. Se pueden emplear una o más secuencias operadoras palindrómicas perfectas. En muchas realizaciones preferidas, se emplean dos secuencias operadoras palindrómicas perfectas, más ventajosamente una secuencia operadora que está situada en dirección 3’ del promotor, y estando situada una secuencia operadora en dirección 5’ del promotor. Cuando se emplean dos sistemas de operador, las secuencias operadoras están preferiblemente separadas para maximizar el control del promotor. En muchas realizaciones, la separación es de de 85 a 150 pares de bases, preferiblemente de 90 a 126 pares de bases, y lo más preferiblemente de 91 ó 92 pares de bases. En determinadas realizaciones, una secuencia operadora se solapa con el punto de inicio transcripcional.

Se reconocerá que el sistema operador se emplea comúnmente con una secuencia represora apropiada. Las secuencias represoras producen proteína represora, por ejemplo la secuencia génica lacl cuando se usan operadores lac. También pueden usarse otras secuencias represoras de lac, por ejemplo puede usarse la secuencia laclQ para aumentar el nivel de la proteína represora lac. La secuencia represora también puede proporcionarse mediante el genoma de célula huésped o mediante el uso de un plásmido compatible adicional.

El sistema de expresión puede estar integrado en el genoma de la célula huésped, pero está comprendido preferiblemente dentro de un elemento extracromosómico tal como un plásmido. Alternativamente, el sistema de expresión puede estar incorporado en vectores fágicos o virales, y éstos pueden usarse para suministrar el sistema de expresión en el sistema de célula huésped. Pueden ensamblarse plásmidos o vectores de expresión mediante métodos conocidos en la técnica. El plásmido también comprende normalmente uno o más de los siguientes: un marcador seleccionable, por ejemplo una secuencia que confiere resistencia a antibióticos, una secuencia de estabilidad cer y un casete de expresión. El sistema de expresión también puede incorporar una secuencia señal si se requiere secreción de la proteína deseada.

La expresión puede inducirse mediante la adición de un inductor tal como isopropil-∀-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG), análogos de IPTG tales como isobutil-C-galactósido (IBCG), lactosa o melibiosa. Pueden usarse otros inductores, y se describen más completamente en otra parte (por ejemplo, véase The Operon, eds Miller and Renznikoff (1978)). Pueden usarse inductores individualmente o en combinación. La construcción de plásmidos o vectores de expresión apropiados resultará evidente para el científico de pericia normal.

El sistema de expresión de la presente invención se puede emplear para expresar proteínas en células huésped, y especialmente en microorganismos. Tal como se usa en el presente documento, “proteínas” se refiere generalmente a péptidos y proteínas que tienen más de aproximadamente 10 aminoácidos. La célula huésped puede ser procariota o eucariota. Los ejemplos de células procariotas incluyen células bacterianas, por ejemplo células bacterianas gram-negativas, incluyendo E. coli, Salmonella typhimurium, Serratia marsescens y Pseudomonas aeruginosa, y células bacterianas gram-positivas incluyendo Bacillus subtilis. Los ejemplos de células eucariotas incluyen levaduras, tales como Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe. Las células huésped de mamífero que se pueden emplear incluyen estirpes celulares humanas, tales como células de riñón embriónico humano y PERC.6; estirpes celulares murinas, tales como células NS0; y particularmente estirpes celulares de hámster, tales como células de riñón de hámster neonato y especialmente células de ovario de hámster chino. También se pueden emplear otras células huésped eucariotas, tales como aquellas de hongos filamentosos, células vegetales, de insectos, de anfibios, o especies ovíparas. Las células huésped preferidas son bacterias, particularmente enterobacteriáceas, preferiblemente E. coli, y especialmente sus cepas B o K12.

El sistema de expresión de la presente invención se emplea comúnmente en forma de un plásmido, y los plásmidos que comprenden un promotor T7A3 y una secuencia operadora palindrómica perfecta forman otro aspecto de la presente invención. Los plásmidos pueden ser plásmidos de replicación autónoma o plásmidos de integración.

El sistema de expresión de la presente invención se emplea ventajosamente para la fabricación de proteínas, especialmente proteínas recombinantes, mediante el cultivo de células recombinantes. Para la expresión de proteínas, se reconocerá que el promotor y la secuencia operadora están operativamente unidos a ADN que codifica una proteína que va a expresarse.

Por consiguiente, la presente invención también proporciona un método para la producción de una proteína que comprende expresar un sistema de expresión que comprende

a) un promotor T7A3;

b) una secuencia operadora palindrómica perfecta; y

c) un casete de expresión para una proteína;

Si se desea, pueden estar presentes uno o más promotores, secuencias operadoras y casetes de expresión, que pueden ser los mismos o diferentes.

El sistema de expresión se expresa mediante métodos bien conocidos en la técnica para las células empleadas. Los métodos de expresión preferidos incluyen cultivar las células recombinantes en medio de crecimiento, especialmente mediante fermentación, y luego recuperar la proteína expresada. El término “medio de crecimiento” se refiere a un medio de nutrientes usado para hacer crecer las células recombinantes. En muchas realizaciones, se emplea una disolución de nutrientes. En la técnica, los medios de crecimiento adecuados para células recombinantes dadas son bien conocidos.

La presente invención se ilustra sin limitación mediante los siguientes ejemplos.

1. Generación de series de vectores pAVE

Vectores pAVE011, pAVE012 y pAVE013

El vector de partida para la generación de pAVE011 fue pZT7#2.0, preparado tal como se describe en el documento US 6.537.779. pZT7#2.0 tiene una estructura principal de vector pAT153, secuencia de estabilidad cer, tet A/R, una secuencia operador lac nativa individual en el sentido de 5’ del gen de interés, y un terminador de la transcripción de T4 en el sentido de 5’. Se clonaron un promotor T7A3 y operadores lac palindrómicos perfectos dobles en este plásmido usando ligadores oligonucleotídicos sintéticos por medio de los sitios de enzimas de restricción Nco I, EcoR I y Xba I.

Se preparó el ligador 12.1 hibridando los oligonucleótidos 1 y 2.1: Oligonucleótido 1 (SEQ ID NO 1) 5’CATGTGGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCAAGAACAATCCTGCACG Oligonucleótido 2.1 (SEQ ID NO 2)

5 5’AATTCGTGCAGGATTGTTCTTGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCA El ligador se ligó entonces al plásmido pZT7#2.0, y se transformó en la cepa huésped de clonación XL-1 Blue MR (Stratagene) como un fragmento de Nco I/EcoR I. El cribado inicial de transformantes se realizó mediante digestión de restricción usando Nco I. La secuencia se confirmó mediante secuenciación. El plásmido resultante se denominó pAVE012. 10 Entonces se clonó el casete del promotor T7A3 en pAVE012 hibridando los oligonucleótidos 3 y 4: Oligonucleótido 3 (SEQ ID NO 3)

Oligonucleótido 4 (SEQ ID NO 4)

15 ligándose los oligonucleótidos hibridados al plásmido pAVE012 y transformándose en la cepa huésped de clonación XL-1 Blue MR (Stratagene) como un fragmento de Xba I/EcoR I. El cribado inicial se realizó mediante digestión de restricción de ADN de plásmido. La secuencia se confirmó entonces mediante secuenciación. El plásmido resultante se denominó pAVE011.

Se clonó el gen de TNF# humano en este plásmido como un fragmento de Nde I/Xho I para generar pAVE013. En la

20 figura 7 se presenta un mapa de plásmido para pAVE013. Aquella muestra la disposición de operadores y promotor, y los sitios de enzimas de restricción usados en la construcción. Los operadores son ambos operadores lac palindrómicos perfectos. RBS es el sitio de unión al ribosoma El vector incluye una estructura principal de vector pAT153, una secuencia de estabilidad cer, un gen de resistencia a tetraciclina inducible (tet A/R), y un terminador de la transcripción de T4 en el sentido de 5’.

25 Vectores pAVE038 y pAVE041

El vector de partida para la generación de pAVE038 fue pZT7#2.0, preparado tal como se describe en el documento US 6.537.779. Se clonaron en este plásmido un promotor tac y un operador lac nativo individual usando un ligador oligonucleotídico sintético por medio de los sitios de enzimas de restricción EcoR I y Xba I.

El ligador 1112 se obtuvo hibridando los oligonucleótidos 11 y 12

30 Oligonucleótido 11 (SEQ ID NO 5)

Oligonucleótido 12 (SEQ ID NO 6)

El ligador se ligó entonces al plásmido pZT7#2.0, y se transformó en la cepa huésped de clonación XL-1 Blue MR

35 (Stratagene) como un fragmento de Xba I/EcoR I. El cribado inicial de transformantes se realizó mediante digestión de restricción usando Nco I. La secuencia se confirmó mediante secuenciación. El plásmido resultante se denominó pAVE038.

Se clonó un gen de TNF# humano en este plásmido como un fragmento de Nde I/Xho I para generar plásmido pAVE041.

Vector pAVE028 y pAVE030 El vector de partida para la generación de pAVE028 fue pAVE012. Se clonó un casete de promotor T7A3 en pAVE012 hibridando los oligonucleótidos 5 y 6.

Oligonucleótido 5 (SEQ ID NO 9)

Oligonucleótido 6 (SEQ ID NO 10)

10 ligándose los oligonucleótidos hibridados al plásmido pAVE012 y transformándose en la cepa huésped de clonación XL-1 Blue MR (Stratagene) como un fragmento de Xba I/EcoR I. El cribado inicial se realizó mediante digestión de restricción de ADN de plásmido. La secuencia se confirmó entonces mediante secuenciación. El plásmido resultante se denominó pAVE028.

Se clonó un gen de TNF# humano en este plásmido como un fragmento de Nde I/Xho I para generar pAVE030.

15 Vectores pAVE007 y pAVE031

El vector de partida para la generación de pAVE007 fue pZT7#2.0, preparado tal como se describe en el documento US 6.537.779. Se clonaron en este plásmido un promotor T7A3 y un operador lac palindrómico perfecto individual usando un ligador oligonucleotídico sintético por medio de los sitios de enzimas de restricción EcoR I y Xba I.

El ligador que contiene el promotor T7A3 se obtuvo hibridando los oligonucleótidos 3 y 4.

20 Oligonucleótido 3 (SEQ ID NO 3)

Oligonucleótido 4 (SEQ ID NO 4)

Los oligonucleótidos 3 y 4 se hibridaron, el ligador formado se ligó entonces al plásmido pZT7#2.0 y se transformó

25 en la cepa huésped de clonación XL-1 Blue MR (Stratagene) como un fragmento de Xba I/EcoR I. El cribado inicial se realizó mediante digestión de restricción de ADN de plásmido. La secuencia se confirmó mediante secuenciación. El plásmido resultante se denominó pAVE007.

Se clonó un gen de TNF# humano en este plásmido como un fragmento de Nde I/Xho I para generar pAVE031.

Tabla 1: Resumen de vectores pAVE 2. Generación de cepas recombinantes

Plásmido: Promotor Sistema de operador Comentarios

pAVE041: tac Secuencia lac nativa individual

pAVE013: T7A3 Secuencias palindrómicas perfectas dobles Separación de operador de 91 pares de bases (DPPS91)

pAVE030: T7A3 Secuencias palindrómicas perfectas dobles Separación de operador 92 pares de bases (DPPS92)

pAVE031: T7A3 Secuencias palindrómicas perfectas individuales

Se transformaron cepas de E. coli W3110 (disponible de la Colección Americana de Cultivos Tipo como cepa ATCC27325) y BL21 (disponible de EMD Biosciences Inc, San Diego, USA) mediante electroporación con los plásmidos tal como se describen en la Tabla 2 a continuación. Las cepas recombinantes resultantes se purificaron y se mantuvieron en disoluciones madre en glicerol a -80ºC.

Tabla 2: Cepas recombinantes construidas

Huésped: Plásmido Descripción (proteína:promotor:sistema de operador) Nº de designación recombinante

ATCC27325: pAVE013 TNF#:T7A3:DPPS91 CLD018

ATCC27325: pAVE030 TNF#:T7A3:DPPS92 CLD026

ATCC27325: pAVE031 TNF#:T7A3:SPPS CLD032

ATCC27325: pAVE041 TNF#:tac:lacO nativo individual CLD043

BL21: pAVE013 TNF#:T7A3:DPPS91 CLD035

BL21: pAVE030 TNF#:T7A3:DPPS92 CLD028

Comparación 1 10 El vector de partida para la generación de un plásmido con el promotor T7A3 sin ningún operador fue pZT7#2.0. Se

clonó un promotor T7A3 en este plásmido usando ligador oligonucleotídico sintético por medio de los sitios de enzimas de restricción EcoR I y Xba I. El ligador 2122 se preparó hibridando los oligonucleótidos 21 y 22 Oligonucleótido 21 (SEQ ID NO 18)

Oligonucleótido 22 (SEQ ID NO 19)

El ligador se ligó entonces al plásmido pZT7#2.0, y se transformó en la cepa huésped de clonación XL-1 Blue MR (Stratagene) como ujn fragmento de Xba I/EcoR I. El cribado inicial se realizó mediante digestión de restricción de

20 ADN de plásmido. La secuencia se confirmó entonces mediante secuenciación. Se cribaron ochenta y dos clones mediante digestión de restricción y secuenciación.

No se identificó ningún clon con la secuencia de promotor T7A3 correcta (todos contenían mutaciones en la secuencia). Esto sugiere que la construcción de plásmidos que contienen este promotor constitutivo potente es problemática.

25 Comparación 2

El vector de partida para la generación de un plásmido con el promotor T7A3 bajo el control de una secuencia operadora Lac nativa individual fue pZT7#2.0. Se clonó un promotor T7A3 y secuencia operadora Lac (LacO) nativa en este plásmido usando ligador oligonucleotídico sintético por medio de los sitios de enzimas de restricción EcoR I y Xba I.

30 El ligador 2324 se obtuvo hibridando los oligonucleótidos 23 y 24

Oligonucleótido 23 (SEQ ID NO 20)

El ligador se ligó entonces al plásmido pZT7#2.0, y se transformó en la cepa huésped de clonación XL-1 Blue MR (Stratagene) como un fragmento de Xba I/EcoR I. El cribado inicial se realizó mediante digestión de restricción de 5 ADN de plásmido. La secuencia se confirmó entonces mediante secuenciación. Se examinaron noventa y cuatro clones mediante digestión de restricción y secuenciación. De nuevo, no se identificó ningún clon con la secuencia correcta. Sin embargo, se encontró que un clon tenía una secuencia casi intacta. Este clon contenía una ‘G’ adicional en la secuencia, aproximadamente en la posición -37. Es difícil asignar la posición exacta de la mutación puesto que la secuencia esperada contiene -GG-en esta región. Se clonó el gen de TNF# humano en el plásmido

10 con la secuencia casi intacta como un fragmento de Nde I/Xho I. Se cribaron veinte colonias de la cepa huésped de clonación XL-Blue MR (Stratagene). Una fue el clon positivo sin mutaciones (aparte de la ‘G’ adicional descrita anteriormente). Este plásmido se transformó en un huésped de producción (ATCC27325) y se volvió a secuenciar el plásmido.

Esto indicó que el plásmido contenía mutaciones visibles en las secuencias tanto del promotor T7A3 como de TNF#

15 humano, lo que indica que el uso del promotor T7A3, incluso bajo el control de la secuencia operadora lac nativa, da como resultado inestabilidad del plásmido.

Ejemplo 3

Se retiró un vial de CLD032 del congelador a -80ºC y se dejó que se descongelara. Se inocularon 10 ∃l de la disolución madre en glicerol descongelada en 5 ml de caldo de Luria (LB, extracto de levadura 5 g/l (Oxoid), triptona 20 10 g/l (Oxoid) y cloruro de sodio 5 g/l) suplementado con tetraciclina (10 ∃g/ml) y glucosa (1 g/l). Se incubó a 37ºC en un agitador orbital durante 16 h. Entonces se usaron 500 ∃l de este cultivo para inocular dos matraces Erlenmeyer de 250 ml que contenían 50 ml de caldo de Luria (composición tal como se describió anteriormente). Los matraces se incubaron a 37ºC, a 200 rpm en un agitador orbital. El crecimiento se monitorizó hasta DO600=0,5-0,7. En este punto, un matraz se indujo con IPTG (isopropil-∀-D-1-tiogalactopiranósido) hasta una concentración final de

25 0,05 mM, mientras que el segundo matraz se dejó sin inducir para monitorizara la expresión basal. Se continuó la incubación, en las condiciones descritas anteriormente, durante la cual se tomaron muestras para la medición del crecimiento, acumulación de hTNF# en las células bacterianas. El nivel de acumulación de hTNF# se determinó usando barrido de densitometría de geles SDS-PAGE teñidos con Colloidal Blue de lisados de células completas de las bacterias tomadas como muestra. A continuación se resumen los resultados en la Tabla 3.

30 Tabla 3

Tiempo (horas): Nivel de acumulación de hTNF# (% de TCP*)

3: 2

4: 18

6: 25

8: 33

24: 42

24 (basal, sin IPTG): 13

(*): TCP = Proteína Celular Total

Tomados juntos, los datos presentados en las Comparaciones 1 y 2, y en el Ejemplo 3, muestran que se logró sorprendentemente el control eficaz del promotor T7A3 potente usando una secuencia operadora palindrómica perfecta individual. Esto fue totalmente inesperado dado que el uso del operador nativo individual (Comparación 2)

35 no proporcionó control basal suficiente para permitir que se estableciese una cepa de producción recombinante estable. Se lograron niveles elevados de acumulación de producto con el sistema de control palindrómico perfecto individual usando concentración relativamente baja de inductor para la inducción. Aunque se observó expresión basal (en ausencia de inductor), fue evidente sólo tras incubación significativamente prolongada (24 h).

Ejemplo 4

Se retiraron viales de CLD018 del congelador a -80ºC y se dejaron descongelar. Se inocularon 10 ∃l de la disolución madre en glicerol descongelada en 5 ml de caldo de Luria (LB, extracto de levadura 5 g/l (Oxoid), triptona 10 g/l (Oxoid) y cloruro de sodio 5 g/l) suplementado con tetraciclina (10 ∃g/ml) y glucosa (1 g/l). El cultivo de siembra se incubó a 37ºC en un agitador orbital durante 16 h. Entonces se usaron 500 ∃l del cultivo de siembra para inocular matraces Erlenmeyer de 250 ml que contenían 50 ml de caldo de Luria (composición tal como se describió anteriormente). Los matraces se incubaron a 37ºC, a 200 rpm en un agitador orbital. El crecimiento se monitorizó hasta DO600=0,5-0,7. En este punto, los matraces se indujeron con IPTG (isopropil-∀-D-1-tiogalactopiranósido) hasta una concentración final de 0,05 mM y 1 mM. También se dejó un matraz sin inducir, y se continuó la incubación, en las condiciones descritas anteriormente, durante la cual se tomaron muestras para la medición del crecimiento, acumulación de hTNF# en las células bacterianas. Se determinó el nivel de acumulación de hTNF# usando barrido de densitometría de geles de SDS-PAGE teñidos con Colloidal Blue de lisados de células completas de las bacterias tomadas como muestra. A continuación se resumen los resultados en la Tabla 4.

Tabla 4

Tiempo con IPTG 0,05 mM (horas): Nivel de acumulación de hTNF# (% de TCP)

3: 2

4: 5

6: 8

8: 13

24: 19

24 (basal, sin IPTG): No detectado

Tiempo con IPTG 1 mM (horas): Nivel de acumulación de hTNF# (% de TCP)

5: 7

6: 12

8: 19

24: 26

Estos datos demostraron que puede realizarse un control adicional del promotor T7A3 potente usando dos secuencias operadoras palindrómicas perfectas separadas por 91 pb. Se ha reducido significativamente la expresión basal (en ausencia de inductor) con respecto a la lograda usando un operador palindrómico perfecto individual para controlar la represión. El control de la expresión basal logrado usando las secuencias palindrómicas perfectas dobles fue inesperado en comparación con el sistema de T7 del documento US 6.537.779, en el que el control de la expresión basal requiere dos elementos de control diferentes. En este ejemplo, el control de la expresión basal se logró en un fondo elevado de ARN polimerasa de E. coli.

Ejemplo 5

Se retiró un vial de CLD026 del congelador a -80ºC y se dejó que se descongelara. Se inocularon 10 ∃l de la disolución madre en glicerol descongelada en 5 ml de caldo de Luria (LB, extracto de levadura 5 g/l (Oxoid), triptona 10 g/l (Oxoid) y cloruro de sodio 5 g/l) suplementado con tetraciclina (10 ∃g/ml) y glucosa (1 g/l). Se incubó a 37ºC en un agitador orbital durante 16 h. Entonces se usaron 500 ∃l de este cultivo para inocular matraces Erlenmeyer de 250 ml que contenían 50 ml de caldo de Luria (composición tal como se describió anteriormente). Los matraces se incubaron a 37ºC, a 200 rpm en un agitador orbital. El crecimiento se monitorizó hasta DO600=0,5-0,7. En este punto, los matraces se indujeron con IPTG (isopropil-∀-D-1-tiogalactopiranósido) hasta una concentración final de 0,05 mM y 0,005 mM. También se dejó un matraz sin inducir, y se continuó la incubación, en las condiciones descritas anteriormente, durante la cual se tomaron muestras para la medición del crecimiento, y acumulación de hTNF# en las células bacterianas. El nivel de acumulación de hTNF# se determinó usando barrido de densitometría de geles de SDS-PAGE teñidos con Colloidal Blue de lisados de células completas de las bacterias tomadas como muestra. Los resultados se presentan en la Tabla 5.

Tabla 5

Tiempo de inducción con IPTG 0,005 mM (horas): Nivel de acumulación de hTNF# (% de TCP)

8: 15

24 (basal, sin IPTG): No detectado

Tiempo de inducción con IPTG 0,05 mM (horas): Nivel de acumulación de hTNF# (% de TCP)

8: 17

Los resultados demostraron que el cambio de la separación entre las dos secuencias operadoras palindrómicas perfectas en 1 pb (desde 91 hasta 92 pb) no influyó de manera adversa en el comportamiento tanto en términos de la expresión basal como en el nivel de acumulación final logrado. Inesperadamente, la reducción de la concentración de IPTG 10 veces (de 0,05 mM a 0,005 mM) no redujo significativamente la productividad inducida.

Ejemplo 6

Se retiraron viales de CLD028 y CLD035 del congelador a -80ºC y se dejaron descongelar. Se inocularon por separado 10 ∃l de cada disolución madre en glicerol descongelada en cada uno de 2x5 ml de caldo de Luria (LB, extracto de levadura 5 g/l (Oxoid), triptona 10 g/l (Oxoid) y cloruro de sodio 5 g/l) suplementado con tetraciclina (10 ∃g/ml) y glucosa (1 g/l). Se incubaron a 37ºC en un agitador orbital durante 16 h. Entonces se usaron 500 ∃l de estos cultivos para inocular por separado matraces Erlenmeyer de 250 ml que contenían 50 ml de caldo de Luria (composición tal como se describió anteriormente). Los matraces se incubaron a 37ºC, a 200 rpm en un agitador orbital. El crecimiento se monitorizó hasta DO600=0,5-0,7. En este punto, los matraces se indujeron con IPTG (isopropil-∀-D-1-tiogalactopiranósido) hasta una concentración final de 1 mM, y se continuó la incubación, en las condiciones descritas anteriormente, durante la cual se tomaron muestras para la medición del crecimiento, acumulación de hTNF# en las células bacterianas. La acumulación de hTNF# se determinó usando barrido de densitometría de geles de SDS-PAGE teñidos con Colloidal Blue de lisados de células completas de las bacterias tomadas como muestra. Los datos se resumen en la Tabla 6.

Tabla 6

CLD035: Promotor T7A3, operadores palindrómicos perfectos dobles con separación de 91 pb

Tiempo (horas) tras la inducción con IPTG: Nivel de acumulación de hTNF# (% de TCP)

2: 7

4: 14

20: 27

CLD028: Promotor T7A3, operadores palindrómicos perfectos dobles con separación de 92 pb

Tiempo (horas) tras la inducción con IPTG: Nivel de acumulación de hTNFa (% de TCP)

2: 10

4: 15

20: 23

Estos datos, tomados junto con los datos presentados en los Ejemplos 4 y 5 anteriormente, indicaron que pueden usarse las cepas tanto K-12 como B de E. coli.

Ejemplo 7

Se prepararon inóculos de fermentación añadiendo 200 ∃l de disolución madre en glicerol de cada una de las cepas descritas a continuación a un matraz de agitación con deflectores de 2,0 l que contenía 200 ml de caldo de Luria (LB, extracto de levadura 5 g/l (Oxoid), triptona 10 g/l (Oxoid) y cloruro de sodio 5 g/l) suplementado con 15 ∃g/ml de tetraciclina. Los inóculos se hicieron crecer durante 12 h a 37ºC en un agitador-incubador con una agitación de 250 rpm. Se usó inóculo del matraz de agitación de 200 ml para inocular un fermentador de 15 l de volumen de trabajo que contenía 10 l de medio de crecimiento discontinuo. Las fermentaciones se llevaron a cabo en las condiciones de funcionamiento descritas a continuación. Se controló la temperatura a 37ºC y pH a 6,8, controlado mediante adición automática de hidróxido de amonio al 35% (p/v). El punto de referencia de tensión de oxígeno disuelto (dOT) fue 30% de saturación de aire, y se controló mediante ajuste automático de la velocidad del agitador del fermentador, desde un mínimo de 250 rpm hasta un máximo de 1500 rpm, y suplementación automática de oxígeno a la corriente de gas de entrada. El flujo de aire hacia la vasija de fermentador fue de 10 l/min. en todo momento. La presión se mantuvo en el fermentador entre 50 y 200 mbares.

Se realizaron fermentaciones en modo discontinuo hasta agotamiento de la fuente de carbono (es decir, glicerol), lo que se produjo aproximadamente 10 h tras la inoculación y se caracterizó por un aumento repentino de la dOT. La fermentación con alimentación discontinua se inició en el punto de agotamiento de la fuente de carbono mediante la adición de una alimentación de glicerol/cloruro de magnesio a una velocidad de alimentación de 11 g de glicerol por l de medio por h. La inducción se llevó a cabo mediante la adición de IPTG hasta una concentración final de 0,5 mM una vez que el nivel de la biomasa en la fermentación alcanzó DO600 = 50-60. La fase con alimentación discontinua se continuó durante 12 h tras la inducción. Se tomaron muestras para determinar el nivel de biomasa (DO600) y la acumulación de hTNF# (% de TCP)/título de hTNF# (g/l) en la cosecha (geles de SDS-PAGE teñidos con Colloidal Blue).

En la Tabla 7 se proporciona la composición del medio de crecimiento discontinuo.

Tabla 7

Componente: Concentración final [g/l], [mg/l] y [ml/l] de agua purificada

(NH4)2SO4: 14,0

Glicerol: 35,0

Extracto de levadura (Becton Dickinson): 20,0

KH2PO4: 2,0

K2HPO4: 16,5

Acido cítrico: 7,5

MgSO4.7H2O: 2,47

H3PO4: 1,5 ml/l

CaCl2.2H2O: 0,294

Antiespumante AF204: 0,2 ml/l

Tetraciclina: 15 mg/l

FeSO4.7H2O: 114 mg/l

ZnSO4.7H2O: 29 mg/l

MnSO4.H2O: 17 mg/l

Na2MoO4.2H2O: 9 mg/l

CuSO4.5H2O: 4 mg/l

H3.BO3: 12 mg/l

En la Tabla 8 se proporciona la composición de la alimentación de glicerol / cloruro de magnesio. Tabla 8

Componente de alimentación: Cantidad requerida [g/l] de agua purificada

Glicerol: 714

MgSO4.7H2O: 7,4

Los resultados se resumen en la tabla 9. Tabla 9

Cepa: Descripción del vector de expresión DO600 en la cosecha Acumulación de hTNF# (% de TCP) en la cosecha Título de hTNF# (mg/l) en la cosecha

CLD018: Promotor T7A3, palíndromo perfecto doble con 91 pb de separación 147 29 8400

CLD026: Promotor T7A3, palíndromo perfecto doble con 92 pb de separación 204 34 11400

CLD032: Promotor T7A3, secuencia palindrómica perfecta individual 194 41 12500

Los datos demuestran claramente la utilidad de los sistemas para la fabricación de proteínas heterólogas. Se lograron títulos elevados de producto usando una fermentación no optimizada genérica y procedimientos de inducción sencillos.

Ejemplo 8

Se clonó el gen de fusión glutatión-S-transferasa-3C proteinasa (GST-3C) como un fragmento de Nde I/Xho I en pAVE011 digerido con Nde I y Xho I. La secuencia del inserto se muestra en la Figura 1 (SEQ ID NO 23). Los plásmidos recombinantes se cribaron mediante digestión de restricción, y se confirmaron mediante secuenciación. El plásmido resultante se denominó pAVE052. Se transformó pAVE052 en BL21 de E. coli para obtrener CLD054, que se purificó y se mantuvo en disoluciones madre en glicerol a -80ºC.

Se clonó el gen de interferón #2 (IFN#2) humano como un fragmento de Nde I/Xho I en pAVE011 digerido con Nde I y Xho I. La secuencia de ADN del inserto se muestra en la Figura 2 (SEQ ID NO 24). Los plásmidos recombinantes se cribaron mediante digestión de restricción, y se confirmaron mediante secuenciación. El plásmido resultante se denominó pAVE058. Se transformó pAVE058 en W3110 de E. coli para obtener CLD059, que se purificó y se mantuvo en disoluciones madre en glicerol a -80ºC.

Se clonó el gen de eritropoyetina (EPO) humana, que se había sometido a optimización de codones para su expresión en E coli, como un fragmento de Nde I/Xho I en pAVE011 digerido con Nde I y Xho I. La secuencia de ADN del inserto se muestra en la Figura 3 (SEQ ID NO 25). Los plásmidos recombinantes se cribaron mediante digestión de restricción, y se confirmaron mediante secuenciación. El plásmido resultante se denominó pAVE061. Se transformó pAVE061 en W3110 de E. coli para obtener CLD060, que se purificó y se mantuvo en disoluciones madre en glicerol a -80ºC.

Se llevaron a cabo fermentaciones con alimentación discontinua usando CLD054, CLD059 y CLD060 usando los medios y las condiciones de procedimiento descritos en el Ejemplo 7. Las fermentaciones se mantuvieron a 30ºC o 37ºC, tal como se describe en la Tabla 19. Se realizaron fermentaciones en modo discontinuo hasta agotamiento de la fuente de carbono (es decir, glicerol). La fermentación con alimentación discontinua se inició en este punto mediante la adición de una alimentación que contenía glicerol (714 g/l) y sulfato de magnesio (30 g/l). Se llevó a cabo la inducción mediante adición de IPTG una vez que el nivel de biomasa en la fermentación alcanzó DO600 = 50

60. Las concentraciones de IPTG usadas se describen en la Tabla 10. La fase con alimentación discontinua se continuó durante 12-15 h tras la inducción. Se tomaron muestras a lo largo de la totalidad de las fermentaciones para determinar el nivel de biomasa (DO600) y producto de proteína (título de (GST-3C, IFN#2 y EPO) (g/l), usando geles de SDS-PAGE teñidos con Colloidal Blue de lisados de células completas de las bacterias tomadas como muestra).

Tabla 10

Cepa: Huésped E. coli Descripción de proteína y vector expresión Temp. de ferm. ºC Conc. de IPTG de inducción (mM) DO600 Título de producto (g/l)

CLD 054: BL21 GST-3C T7A3:DPPS91 37 0,50 100 8

CLD 059: W3110 IFN#2 T7A3:DPPS91 37 0,10 120 9

37: 0,25 150 14

37: 0,50 160 14

CLD 060: W3110 EPO T7A3:DPPS91 37 0,10 100 >13

30: 0,50 90 >13

Los datos presentados en la Tabla 10 demuestran adicionalmente la utilidad de los sistemas para la fabricación de una amplia gama de proteínas heterólogas. Se logran títulos elevados de producto usando un procedimiento de fermentación genérico sencillo acoplado con manipulación de sólo la concentración de IPTG usada para la inducción. Esto es particularmente beneficioso para reducir los plazos de desarrollo del procedimiento para proteínas heterólogas terapéuticamente útiles.

Ejemplo 9

Se clonó el gen de L-2-haloalcanoato deshalogenasa (hadL) de Pseudomonas putida usando sitios Nde I y Spe I que se habían modificado por ingeniería usando PCR. La secuencia génica se muestra en la Figura 4 (SEQ ID NO 26). El plásmido pAVE011 se digirió con Nde I y Spe I, y la banda se extrajo con gel. El gen hadL se digirió con Nde I y Spe I, y el gen hadL se extrajo con gel y se ligó a pAVE011 para producir pAVE075. El origen de replicación de Pseudomonas savastanoi se copió usando la PCR a partir de plásmido pCN60 (ATCC 77101; Nieto C, et al. (1990) Gene 87: 145-149).

Los cebadores usados fueron:

F37A: Secuencia: 5’ AGATCTACGCTTATGGGTGCCTTTCC (SEQ ID NO 27), y

B29a: Secuencia: 5’ AGATCTAATACGCAAACCGCCTCTCC (SEQ ID NO 28).

El producto de PCR se clonó inicialmente en TOPO TA pCR2.1 (Invitrogen) y luego en pAVE075 mediante digestión con Bgl II. El plásmido resultante, pAVE086, se transformó en Pseudomonas putida NCIMB 12018, mediante electroporación, para preparar CLD075, que se purificó y se mantuvo en disoluciones madre en glicerol a -80ºC. Se retiró un vial de CLD075 de un congelador a -80ºC y se dejó descongelar. Se inocularon 10 ∃l de la disolución madre en glicerol descongelada en 5 ml de caldo de Luria (LB, extracto de levadura 5 g/l (Oxoid), triptona 10 g/l (Oxoid) y cloruro de sodio 5 g/l) suplementado con tetraciclina (10 ∃g/ml). Se incubó a 30ºC en un agitador orbital durante 16

h. Entonces se usaron 500 ∃l de este cultivo para inocular por separado dos matraces Erlenmeyer de 250 ml que contenían 50 ml de caldo de Luria (composición tal como se describió anteriormente). Los matraces se incubaron a 30ºC, a 200 rpm en un agitador orbital. El crecimiento se monitorizó hasta DO600=0,5-0,7. En este punto, un matraz se indujo con IPTG hasta una concentración final de 0,5 mM mientras que se dejó sin inducir el segundo matraz para monitorizar la expresión basal. Se continuó la incubación, en las condiciones descritas anteriormente, durante la cual se tomaron muestras para la medición del crecimiento y acumulación de proteína HadL en las células bacterianas. El nivel de acumulación de HadL se determinó usando barrido de densitometría de geles de SDS-PAGE teñidos con Colloidal Blue de lisados de células completas de las bacterias tomadas como muestra.

La expresión y acumulación de la proteína HadL se presentan en la Figura 5. Los datos indican que el sistema de expresión de T7A3:DPPS91 funcionó en otro sistema de huésped procariota. Sorprendentemente, el sistema de expresión funcionó con la misma eficacia en Pseudomonas putida que la observada cuando se usó E. coli como sistema huésped. No se detectó expresión basal incluso tras 23 h de incubación en ausencia de inductor. Se logró un nivel elevado de expresión y acumulación de proteína en Pseudomonas putida tras la inducción usando IPTG.

Ejemplo 10

Se llevó a cabo una fermentación con alimentación discontinua usando CLD075 de Pseudomonas putida usando los medios de E. coli genéricos y las condiciones de procedimiento descritas en el Ejemplo 11. Las fermentaciones se mantuvieron a 30ºC y pH 7,0 (controlado con hidróxido de amonio al 25% y ácido fosfórico al 10%). Se realizaron fermentaciones en modo discontinuo hasta agotamiento de la fuente de carbono (es decir, glicerol). La fermentación con alimentación discontinua se inició en este punto mediante adición de una alimentación que contenía glicerol (714 g/l) y sulfato de magnesio (30 g/l). Se llevó a cabo la inducción mediante adición de IPTG 1 mM (concentración final) una vez que el nivel de biomasa en la fermentación alcanzó DO600 = 50. La fase con alimentación discontinua se continuó durante 12-15 h tras la inducción. Se tomaron muestras a lo largo de la totalidad de la fermentación para determinar el nivel de biomasa (DO600) y la acumulación de proteína HadL ((% de TCP) geles de SDS-PAGE teñidos con Colloidal Blue de lisados de células completas de las bacterias tomadas como muestra). El crecimiento de CLD075 y la expresión/acumulación de proteína HadL tras la inducción se presentan en la Figura 6.

Se lograron niveles elevados de expresión y acumulación de proteína (>40% TCP) usando el sistema de expresión en Pseudomonas putida incluso usando únicamente un medio de crecimiento genérico diseñado para su uso con E. coli.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> FUJIFILM Diosynth Biotechnologies UK Limited

<120> Sistema de expresión

<130> SMC 60733/EPT/D1

<141> 2007-02-01

<150> GB 0602173.7

<151> 2006-02-03

<160> 40

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 47

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleótido 1 usado en la preparación del Ligador 12.1

<400> 1 catgtgggaa ttgtgagcgc tcacaattcc aagaacaatc ctgcacg 47

<210> 2

<211> 47

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleótido 2.1 usado en la preparación del Ligador 12.1

<400> 2 aattcgtgca ggattgttct tggaattgtg agcgctcaca attccca 47

<210> 3

<211> 77

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleótido 3 usado en la clonación del promotor T7A3

<400> 3

<210> 4

<211> 77

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleótido 4 usado en la clonación del promotor T7A3

<400> 4

<210> 5

<211> 79

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleótido 11 usado en la preparación del Ligador 1112

<400> 5

<210> 6

<211> 79

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleótido 12 usado en la preparación del Ligador 1112

<400> 6

<210> 7

<211> 78

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleótido 13 usado en la preparación del Ligador 1314

<400> 7

<210> 8

<211> 78

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido 14 usado en la preparación del Ligador 1314

<400> 8 <210> 9

<211> 78

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleótido 5 usado en la clonación del promotor T7A3

<400> 9

<210> 10

<211> 78

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleótido 6 usado en la clonación del promotor T7A3

<400> 10

<210> 11

<211> 77

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleótido 7 usado en la preparación del Ligador 78

<400> 11

<210> 12

<211> 77

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleótido 8 usado en la preparación del Ligador 78

<400> 12 <210> 13

<211> 77

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleótido 15 usado en la clonación del promotor tac

<400> 13

<210> 14

<211> 77

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido 16 usado en la clonación del promotor tac

<400> 14

<210> 15

<211> 33

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido 19 usado en la preparación del Ligador EcoR I

<400> 15 aattcaccgg tgtacagtca tgtacaaccg gtg 33

<210> 16

<211> 33

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido 20 usado en la preparación del Ligador EcoR I <210> 17

<211> 1550

<212> ADN

<213> Murinae gen. sp.

<400> 17

<210> 18

<211> 72

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleótido 21 usado en la preparación del Ligador 2122

<400> 18

<210> 19

<211> 72 10 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleótido 22 usado en la preparación del Ligador 2122

<400> 19

<210> 20

<211> 79

<212> ADN

<213> Artificial 20 <220>

<223> oligonucleótido 23 usado en la preparación del Ligador 2324

<400> 20

<210>21 25 <211> 79

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleótido 24 usado en la preparación del Ligador 2324 30 <400> 21

<210> 22

<211> 1592

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia que codifica dianticuerpo tetravalente individual biespecífico producido en el Ejemplo 15

<400> 22 <210> 23

<211> 1237

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia que codifica proteíkna de fusión GST producida en el Ejemplo 16

<400> 23

<210> 24

<211> 513

<212> ADN

<213> Homosapiens

<400> 24

<210> 25

<211> 517

<212> ADN

<213> Homosapiens

<400> 25

<210> 26

<211> 713 10 <212> ADN

<213> Pseudomonas putida

<400> 26

<210> 27

<211> 26

<212> ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> Cebador F37A usado en el Ejemplo 17

<400> 27

agatctacgc ttatgggtgc ctttcc 26 10 <210> 28

<211> 26

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 15 <223> Cebador B29a usado en el Ejemplo 17

<400> 28 agatctaata cgcaaaccgc ctctcc 26

<210> 29

<211> 69 20 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleótido GalB1 usado en la preparación del Ligador GalB

<400> 29 <210> 30

<211> 69

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleótido GalB2 usado en la preparación del Ligador GalB

<400> 30

<210> 31

<211> 68

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido GalA1 usado en la preparación del Ligador GalA

<400> 31

<210> 32

<211> 72

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido GalA2 usado en la preparación del Ligador GalA

<400> 32

<210> 33

<211> 438

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia que codifica el promotor hCMV y los operadores Lac usados en el Ejemplo 21

<400> 33

<210> 34 5 <211> 813

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia que codifica proteína IgG Fc usada en el Ejemplo 21 10 <400> 34

<210> 35

<211> 1104

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia clónica 1 usada en el Ejemplo 20

<400> 35

<210> 36

<211> 1026

<212> ADN

<213>: Artificial 10 <220>

<223> secuencia clónica 2 usada en el Ejemplo 20

<400> 36

<210> 37

<211> 78

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleótido 17 usado en la clonación del promotor tac

<400> 37

<210> 38

<211> 78

<212> ADN

<213>: Artificial 15 <220>

<223> Oligonucleótido 18 usado en la clonación del promotor tac

<400> 38

<210> 39

<211> 78

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido 9 usado en la clonación del promotor pL lambda

<400> 39

<210> 40

<211> 78

<212> ADN

<213>: Artificial 15 <220>

10 10

<223> oligonucleótido 10 usado en la clonación del promotor pL lambda

<400> 40

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un sistema de expresión de proteína, que comprende: a) un promotor T7A3 ligado operablemente a b) una secuencia operadora palindrómica perfecta.
2.

Un vector que comprende: a) un promotor T7A3 ligado operablemente a b) una secuencia operadora palindrómica perfecta.
3.

Un vector según la reivindicación 2, que comprende además un casete de expresión para una proteína.
4.

Un vector según las reivindicaciones 2 ó 3, en el que el vector es un plásmido, preferiblemente un plásmido que se replica de forma autónoma.
5.

Una célula huésped transformada mediante un vector como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.
6.

Un método para la producción de una proteína recombinante, que comprende expresar un sistema de expresión que comprende: a) un promotor T7A3; operablemente ligado a

b) una secuencia operadora palindrómica perfecta; y operablemente enlazada a c) un casete de expresión para una proteína recombinante.
7.

Un sistema de expresión, vector, célula huésped o método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el sistema operador es lac, gal, deo o gln.
8.

Un sistema de expresión, vector, célula huésped o método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que se emplea una secuencia operadora palindrómica perfecta individual, que está situada preferiblemente en dirección 3’ del promotor.
9.

Un sistema de expresión, vector, célula huésped o método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el operador tiene la secuencia GGAATTGTGAGCGCTCACAATTCC (nucleobases 51 a 74 de SEC ID No. 3).
10.

Un sistema de expresión, vector, células huésped o método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que un operador solapa el punto de partida transcripcional.
11.

Un método para producir una proteína, que comprende: a) cultivar una célula huésped transformada con un vector según la reivindicación 3; y b) recuperar la proteína.
12.

Un método según la reivindicación 11, en el que la célula huésped es E. coli.
13.

Un método según las reivindicaciones 11 ó 12, en el que el vector es un vector como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10.
14.

Un método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que un operador solapa el punto de partida transcripcional.

Figura 1 Secuencia de la fusión GST-3C (SEC ID nº 23)

Figure 2 Secuencia de interferón #2 (SEC ID nº 24)

Figura 3 Secuencia de eritropoyetina (EPO) (SEC ID nº 25)

Figura 4 Secuencia de L-2-haloalcanoato deshalogenasa (hadL) (SEC ID nº 26)

Figura 5

La flecha indica la posición para la proteína HadL Línea 1: Marcadores de peso molecular Línea 2: Matraz 1 – pre-inducción de CLD075 Línea 3: Matraz 2 -pre-inducción de CLD075 Línea 4: Matraz 1 - CLD075, 6 h de cultivo, 3 h tras inducción con 0,5 mM IPTG Línea 5: Matraz 2 - CLD075, 6 h de cultivo, sin inducción Línea 6: Matraz 1 - CLD075, 23 h de cultivo, 20 h tras inducción con 0,5 mM IPTG Línea 7: Matraz 2 - CLD075, 23 h de cultivo, sin inducción Línea 8: Marcadores de peso molecular