ES2569075T3 - Sistema de expresión - Google Patents

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ES2569075T3 ES13191424.4T ES13191424T ES2569075T3 ES 2569075 T3 ES2569075 T3 ES 2569075T3 ES 13191424 T ES13191424 T ES 13191424T ES 2569075 T3 ES2569075 T3 ES 2569075T3
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Christopher Lennon
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Abstract

Un sistema de expresión de proteínas que comprende: a) un promotor λpL; y b) una secuencia de operador palindrómica perfecta.

Description

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DESCRIPCION
Sistema de expresion
La presente invencion se refiere a un sistema de expresion adecuado para la expresion microbiana de polipeptidos recombinantes.
Se conocen sistemas de expresion de protemas basados en secuencias de operador palindromicas perfectas basadas en T7 a partir de la patente US 6.537.779. Los sistemas basados en T7 presentan inconvenientes porque el funcionamiento del sistema de T7 requiere polimerasa de fago que se proporciona comunmente insertando un profago ADE3 que expresa la polimerasa de fago requerida en la cepa huesped de Escherichia coli para crear cepas huesped lisogenicas. La polimerasa de fago tambien puede suministrarse a la celula mediante infeccion con un fago de transduccion A especializado que porta el gen para la polimerasa de fago (por ejemplo ARN polimerasa de T7). El profago ADE3 carece de los elementos geneticos requeridos para la escision del profago para formar partmulas de fago lfticas. Sin embargo, se ha mostrado que cepas huesped lisogenicas de ADE3 liberan partmulas de fago y por tanto provocan infecciones no deseadas en plantas de fermentacion. De hecho, no se permite el uso de cepas de ADE3 a determinados operadores de plantas de fermentacion.
La expresion de la protema heterologa antes de la induccion no es deseable porque algunas protemas heterologas tienen efectos perjudiciales sobre el crecimiento de la celula huesped y la estabilidad del plasmido lo que reduce la productividad global. Para evitar esto, los sistemas de expresion basados en T7 controlan generalmente la expresion de protemas heterologas en dos niveles. En primer lugar, se requiere la induccion de la expresion del gen de ARN polimerasa de T7 para producir ARN polimerasa de T7 para impulsar la expresion a partir del promotor de T7. En segundo lugar, tambien se necesita inducir el propio promotor de T7. Esto aumenta la complejidad del funcionamiento de los sistemas de expresion basados en T7.
Lanzer et al., Proc. Nat. Acad. Sci. vol 85, pags. 8973-7 (1988) dan a conocer la influencia de la ubicacion del operador lac en la represion de varios promotores. Becker et al., J. Molecular Biology, vol 349, n.° 4, pags. 716-30 (2005) dan a conocer que la naturaleza y ubicacion de los operadores desempenan una funcion en la formacion de bucles de represion. Edamatsu et al., Gene, vol 187, n.° 2, pags. 289-94 (1997) dan a conocer una expresion en mairnferos que comprende tres operadores lac en direccion 3' respecto al promotor EF-1x humano. Brosius et al., Proc. Nat. Acad. Sci. vol 81, vol 81, pags. 6929-22 (1984) dan a conocer la regulacion de promotores de ARN ribosomico con un operador lac sintetico.
Existe un gran numero de sistemas de expresion de protemas heterologas con diferentes modos de control e induccion, haciendo que la seleccion y optimizacion del sistema de expresion/procedimiento de fermentacion para protemas de interes sea un procedimiento ampliamente empmco. Esto requiere mucho tiempo y no se desea. Por tanto, hay una necesidad de sistemas que puedan proporcionar un control mejorado de la expresion y niveles mejorados de expresion de protemas sin el uso de polimerasa de fago ni cepas huesped lisogenicas. Tambien hay una necesidad de sistemas que puedan proporcionar una expresion heterologa inducible en celulas procariotas, asf como en celulas eucariotas tales como celulas de marnfferos y levaduras.
Segun la presente invencion, se proporciona un sistema de expresion de protemas que comprende:
a) un promotor Apl; y
b) una secuencia de operador palindromica perfecta.
Las secuencias de operador que pueden emplearse en el sistema de expresion segun la presente invencion incluyen lac, gal, deo y gln. Se pueden emplear una o mas secuencias de operador palmdromo perfectas. En muchas realizaciones preferidas, se emplean dos secuencias de operador palindromicas perfectas donde mas convenientemente una secuencia de operador esta ubicada en direccion 3' respecto al promotor y una secuencia operador esta ubicada en direccion 5' respecto al promotor. Cuando se emplean dos sistemas de operador, las secuencias de operador estan preferiblemente separadas para maximizar el control del promotor. En muchas realizaciones, la separacion es de desde 85 hasta 150 pares de bases, preferiblemente desde 90 hasta 126 pares de bases y lo mas preferiblemente de 91 o 92 pares de bases. En determinadas realizaciones, una secuencia de operador se solapa con el punto de inicio transcripcional.
Se reconocera que el sistema de operador se emplea comunmente con una secuencia represora apropiada. Las secuencias represoras producen protema represora, por ejemplo la secuencia genica de lacl cuando se usan operadores de lac. Tambien pueden usarse otras secuencias represoras de lac, por ejemplo puede usarse la secuencia laclQ para aumentar el nivel de la protema represora de lac. La secuencia represora tambien puede proporcionarse mediante el genoma de celula huesped o mediante el uso de un plasmido compatible adicional.
El sistema de expresion puede estar integrado en el genoma de celula huesped, pero esta comprendido preferiblemente dentro de un elemento extracromosomico tal como un plasmido. Alternativamente, el sistema de expresion puede estar incorporado en vectores de fago o virales y estos usarse para suministrar el sistema de expresion en el sistema de celula huesped. Pueden ensamblarse plasmidos o vectores de expresion mediante
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metodos conocidos en la tecnica. El plasmido tambien comprende normalmente uno o mas de los siguientes: un marcador seleccionable, por ejemplo una secuencia que confiere resistencia a antibioticos, una secuencia de estabilidad cer y un casete de expresion. El sistema de expresion tambien incorpora una secuencia senal si se requiere secrecion de la protema deseada.
La expresion puede inducirse mediante la adicion de un inductor tal como isopropil-p-D-1-tiogalactopiranosido (IPTG), analogos de IPTG tal como isobutil-C-galactosido (IBCG), lactosa o melibiosa. Pueden usarse otros inductores y se describen mas completamente en otra parte (por ejemplo vease The Operon, eds Miller and Renznikoff (1978)). Pueden usarse inductores individualmente o en combinacion. La construccion de plasmidos o vectores de expresion apropiados resultara evidente para el cientifico habitual en la tecnica.
El sistema de expresion de la presente invencion se puede emplear para expresar protemas en celulas huesped, y especialmente en microorganismos. Tal como se usa en el presente documento, “protemas” se refiere generalmente a peptidos y protemas que tienen mas de aproximadamente 10 aminoacidos. La celula huesped puede ser procariota o eucariota. Los ejemplos de celulas procariotas incluyen celulas bacterianas, por ejemplo celulas bacterianas gram-negativas, incluyendo E. coli, Salmonella typhimurium, Serratia marsescens y Pseudomonas aeruginosa, y celulas bacterianas gram-positivas incluyendo Bacillus subtilis. Los ejemplos de celulas eucariotas incluyen levaduras, tales como Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe. Las celulas huesped de mairnferos que se pueden emplear incluyen lmeas celulares humanas, tales como las celulas renales embrionarias humanas y PERC.6; lmeas celulares murinas, tales como celulas NS0; y particularmente lmeas celulares de hamster tales como las celulas renales de cnas de hamster y especialmente las celulas de ovario de hamster chino. Tambien se pueden emplear otras celulas huesped eucariotas tales como las celulas de hongos filamentosos, plantas, insectos, anfibios o de especies de ovario. Celulas huesped preferidas son bacterias, particularmente enterobacteriaceas, preferiblemente E. coli, y especialmente cepas B o K12 de la misma.
El sistema de expresion de la presente invencion se emplea comunmente en forma de un plasmido, y plasmidos que comprenden un promotor Apl y una secuencia de operador palindromica perfecta forman otro aspecto de la presente invencion. Los plasmidos pueden ser plasmidos de replicacion autonoma o plasmidos de integracion.
El sistema de expresion de la presente invencion se emplea convenientemente para la fabricacion de protemas, especialmente protemas recombinantes, mediante el cultivo de celulas recombinantes. Para la expresion de protemas, se reconocera que el promotor y la secuencia de operador estan operativamente unidos a ADN que codifica para una protema que va a expresarse.
Por consiguiente, la presente invencion tambien proporciona un metodo para la produccion de una protema que comprende expresar un sistema de expresion que comprende
a) un promotor Apl;
b) una secuencia de operador palindromica perfecta; y
c) un casete de expresion para una protema.
Si se desea, pueden estar presentes uno o mas promotores, secuencias de operador y casetes de expresion, que pueden ser los mismos o diferentes.
El sistema de expresion se expresa mediante metodos bien conocidos en la tecnica para las celulas empleadas. Los metodos de expresion preferidos incluyen cultivar las celulas recombinantes en medio de crecimiento, especialmente mediante fermentacion, y luego recuperar la protema expresada. El termino “medio de crecimiento” se refiere a un medio de nutrientes usado para hacer crecer las celulas recombinantes. En muchas realizaciones, se emplea una disolucion de nutrientes. En la tecnica se conocen bien medios de crecimiento adecuados para celulas recombinantes dadas.
La presente invencion se ilustra sin limitacion mediante los siguientes ejemplos.
1. Generacion de series de vectores pAVE Vector, pAVE012
El vector de partida para la generacion de pAVE012 fue pZT7#2.0, preparado tal como se describe en el documento US 6.537.779. pZT7#2.0 tiene una estructura principal de vector pAT153, secuencia de estabilidad cer, tet A/R, una secuencia de operador lac nativa individual en el sentido de 5' del gen de interes y un terminador de la transcripcion de T4 en el sentido de 5'. Se clonaron un promotor T7A3 y operadores lac palindromicos perfectos dobles en este plasmido usando ligadores oligonucleotfdicos sinteticos por medio de los sitios de enzimas de restriccion Nco I, EcoR I yXba I.
Se preparo el ligador 12.1 hibridando los oligonucleotidos 1 y 2.1:
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Oligonucleotido 1 (SEQ ID NO 1)
5’CATGTGGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCAAGAACAATCCTGCACG Oligonucleotido 2.1 (SEQ ID NO 2)
5’AATTCGTGCAGGATTGTTCTTGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCA
Entonces se ligo el ligador al plasmido pZT7#2.0 y se transformo en la cepa huesped de donation XL-1 Blue MR (Stratagene) como fragmento de Nco I/EcoR I. Se realizo un examen inicial de transformantes mediante digestion de restriction usando Nco I. Se confirmo la secuencia mediante secuenciacion. El plasmido resultante se denomino pAVE012.
Vectores pAVE029 y pAVE027
El vector de partida para la generation de pAVE029 fue pZT7#2.0, preparado tal como se describe en detalle en el documento US 6.537.779. Se clonaron un promotor Apl y un operador lac palindromico perfecto individual en este plasmido usando un ligador oligonucleotidico sintetico por medio de los sitios de enzimas de restriccion EcoR I y Xba I.
Se preparo ligador 78 hibridando los oligonucleotidos 7 y 8 Oligonucleotido 7 (SEQ ID NO 11)
5’AATT AT CT CT GGCGGT GTTG ACAT AAATACCACT GG CGGT GAT ACT GAGCG G AATT GT G AGCGCT CACAATT CCCCA
Oligonucleotido 8 (SEQ ID NO 12)
5'CTAGTGGG G AATT GTGAGCGCT CACAATT CCGCTCAGTAT C ACCG CC A GT G GT ATTT AT GT CAACACCG CCAG AG AT
Entonces se ligo el ligador al plasmido pZT7#2.0 y se transformo en la cepa huesped de clonacion XL-1 Blue MR (Stratagene) como fragmento de Xba I/EcoR I. Se realizo un examen inicial de transformantes mediante digestion de restriccion usando Nco I. Se confirmo la secuencia mediante secuenciacion. El plasmido resultante se denomino pAVE029.
Se clono un gen de TNFa humano en este plasmido como fragmento de Nde I/Xho I para generar pAVE027.
Vectores pAVE034 y pAVE035
El vector de partida para la generacion de pAVE034 fue pAVE012. Se clono un casete de promotor ApL en pAVE012 hibridando los oligonucleotidos 9 y 10:
Oligonucleotido 9 (SEQ ID NO 39)
5’AATT CAT CT CTGGCGGT GTT GACAT AAATACCACTGGCGGT G ATACT GAGCGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA
Oligonucleotido 10 (SEQ ID NO 40)
5'CTAGTGGGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCGCTCAGTATCACCGCCAGTGGTATT TAT GT CAACACCGCCAGAGAT G
Se ligaron los oligonucleotidos hibridados al plasmido pAVE012 y se transformaron en la cepa huesped de clonacion XL-1 Blue MR (Stratagene) como fragmento de Xba I/EcoR I. Se realizo un examen inicial mediante digestion de restriccion de ADN de plasmido. Entonces se confirmo la secuencia mediante secuenciacion. El plasmido resultante se denomino pAVE034.
Se clono un gen de TNFa humano en este plasmido como fragmento de Nde I/Xho I para generar pAVE035.
Vector pAVE020 y pAVE021
El vector de partida para la generacion de pAVE020 fue pAVE012. Se clono un casete de promotor ApL en pAVE012 hibridando los oligonucleotidos 7 y 8.
Oligonucleotido 7 (SEQ ID NO 11)
5'AATT AT CT CT GGCGGT GTT GACAT AMT ACCACT GGCGGT GAT ACT GAGCGGAATT GTGAGCGCTCACAATTCCCCA
Oligonucleotido 8 (SEQ ID NO 12)
5'CTAGT GGGGAATT GT G AGCGCT CACAATT CCGCT CAGTAT CACCGCCA GT GGT ATTT AT GT CAACACCGCCAGAG AT
5 Se ligaron los oligonucleotidos hibridados al plasmido pAVE012 y se transformaron en la cepa huesped de donation XL-1 Blue MR (Stratagene) como fragmento de Xba I/EcoR I. Se realizo un examen inicial mediante digestion de restriction de ADN de plasmido. Entonces se confirmo la secuencia mediante secuenciacion. El plasmido resultante se denomino pAVE020.
Se clono un gen de TNFa humano en este plasmido como fragmento de Nde I/Xho I para generar pAVE021.
10 Vector pAVE046
El vector de partida para la generation del vector de secretion pAVE046 fue pAVE027. Se clono un casete de expresion de D1.3 Fab (Figura 1, SEQ ID NO 17) como un fragmento de Nde I-Ban HI. Se realizo un examen inicial mediante digestion de restriccion de ADN de plasmido. Entonces se confirmo la secuencia mediante secuenciacion. El plasmido resultante se denomino pAVE046.
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Tabla 1: Resumen de vectores pAVE
Plasmido
Promotor Sistema de operador Comentarios
pAVE041
tac Secuencia lac nativa individual
pAVE021
ApL Secuencias palindromicas perfectas dobles Separation de operador de 91 pares de bases (DPPS91)
pAVE035
ApL Secuencias palindromicas perfectas dobles Separacion de operador de 92 pares de bases (DPPS92)
pAVE027
ApL Secuencia palindromica perfecta individual
pAVE046
ApL Secuencia palindromica perfecta individual Vector de secrecion
2. Generacion de cepas recombinantes
Se transformaron cepas de E. coli W3110 (disponible de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo como cepa 20 ATCC27325) y BL21 (disponible de EMD Biosciences Inc, San Diego, EE.UU.) mediante electroporation con los
plasmidos tal como se describen en la tabla 2 a continuation. Se purificaron las cepas recombinantes resultantes y se mantuvieron en disoluciones madre en glicerol a -80°C.
Tabla 2: Cepas recombinantes construidas
Huesped
Plasmido Description (protema:promotor:sistema de operador) N.° de designation recombinante
ATCC27325
pAVE041 TNFa:tac:IacO nativo individual CLD043
ATCC27325
pAVE021 TNFa:ApL:DPPS91 CLD021
ATCC27325
pAVE035 TNFa:ApL:DPPS92 CLD038
ATCC27325
pAVE027 TNFa:ApL:SPPS CLD030
ATCC27325
pAVE046 D1.3 Fab:ApL:SPPS CLD048
Ejemplo 1
Se extrajo un vial de CLD030 del congelador a -80°C y se dejo que se descongelara. Se inocularon 10 |jl de la disolucion madre en glicerol descongelada en 5 ml de caldo de Luria (LB, extracto de levadura 5 g/l (Oxoid), triptona 10 g/l (Oxoid) y cloruro de sodio 5 g/l) complementado con tetraciclina (10 jg/ml) y glucosa (1 g/l). Esto se incubo a
5 37°C en un agitador orbital durante 16 h. Entonces se usaron 500 Al de este cultivo para inocular matraces
Erlenmeyer de 250 ml que conteman 50 ml de caldo de Luria (composicion tal como se describio anteriormente). Se incubaron los matraces a 37°C, a 200 rpm en un agitador orbital. Se monitorizo el crecimiento hasta DO600=0,5-0,7. En este punto se indujo un matraz con IPTG (isopropil-p-D-1-tiogalactopiranosido) hasta una concentracion final de 0,05 mM mientras el otro matraz se dejo sin inducir y se continuo la incubacion, en las condiciones descritas
10 anteriormente, durante la cual se tomaron muestras para la medicion del crecimiento, y acumulacion de hTNFa
dentro de las celulas bacterianas. Se determino el nivel de acumulacion de hTNFa usando exploracion de densitometna de geles SDS-PAGE tenidos con Colloidal Blue de lisados de celulas completas de las bacterias tomadas como muestra. Se resumen los resultados a continuacion en la Tabla 3.
Tabla 3
Tiempo (horas)
Nivel de acumulacion de hTNFa (% de TCP)
4
2
6
5
8
9
24
12
24 (basal, sin IPTG)
No detectado
15
Los datos presentados en la Tabla 3 muestran claramente que, sorprendentemente, el control del promotor ApL sumamente potente se puede lograr utilizando una secuencia de operador palindromica perfecta individual. Los niveles elevados de acumulacion del producto se pueden lograr utilizando el sistema de control palindromico perfecto individual.
20 Ejemplo 2
Se extrajeron viales de CLD021 y CLD038 del congelador a -80°C y se dejo que se descongelaran. Se inocularon por separado 10 jl de cada disolucion madre en glicerol descongelada en 5 ml de caldo de Luria (LB, extracto de levadura 5 g/l (Oxoid), triptona 10 g/l (Oxoid) y cloruro de sodio 5 g/l) complementado con tetraciclina (10 jg/ml) y glucosa (1 g/l). Estos se incubaron a 37°C en un agitador orbital durante 16 h. Entonces se usaron 500 jl de este 25 cultivo para inocular matraces Erlenmeyer de 250 ml que conteman 50 ml de caldo de Luria (composicion tal como se describio anteriormente). Se incubaron los matraces a 37°C, a 200 rpm en un agitador orbital. Se monitorizo el crecimiento hasta DO600=0,5-0,7. En este punto se indujo un matraz con IPTG (isopropil-p-D-1-tiogalactopiranosido) hasta una concentracion final de 1 mM mientras que se dejo sin inducir un segundo matraz y se continuo la incubacion, en las condiciones descritas anteriormente, durante la cual se tomaron muestras para la medicion del 30 crecimiento, acumulacion de hTNFa dentro de las celulas bacterianas. Se determino la acumulacion de hTNFa usando geles SDS-PAGE tenidos con Colloidal Blue y analisis de inmunotransferencia de tipo Western (usando anticuerpo anti-hTNFa) siguiendo SDS-PAGE de lisados de celulas completas de las bacterias tomadas como muestra. Se resumen los datos en la tabla 4. El analisis de inmunotransferencia de tipo Western para la cepa CLD038 se presenta en la figura 3.
35 Tabla 4
Analisis
Acumulacion de hTNFa - CLD021 (ApL:DPPS91) Acumulacion de hTNFa -CLD038 (ApL:DPPS92)
SDS-PAGE con Colloidal Blue (tras la induccion con IPTG )
No detectado No detectado
Transferencia de tipo Western (tras la induccion con IPTG )
Positivo Positivo (vease la figura 2)
SDS-PAGE con Colloidal Blue (Basal sin induccion con IPTG, 24 h)
No detectado No detectado
5
10
15
20
25
30
Transferencia de tipo Western (Basal
No detectado No detectado
sin induccion con IPTG, 24 h)
Estos resultados demuestran que la combinacion de secuencias de operador palindromicas perfectas dobles con el promotor ApL con la separacion de o bien 91 pb o bien 92 pb dio como resultado una represion muy ajustada. Las transferencias de tipo Western indican que no se detecto ninguna expresion basal de la protema diana. Con la induccion se logro un nivel de expresion de bajo nivel. Estos resultados fueron totalmente inesperados dado que el promotor ApL es un promotor extremadamente potente. Un sistema de este tipo puede usarse, por ejemplo, para dirigir la expresion de protemas de alta toxicidad a la celula huesped. Puede usarse cuando es ventajosa una expresion controlada, por ejemplo, para la expresion e insercion de protemas de membrana.
Ejemplo 3
Se prepararon los inoculos de fermentacion anadiendo 200 pl de disolucion madre en glicerol de cada una de las cepas descritas a continuacion a un matraz de agitacion con deflectores de 2,0 l que contema 200 ml de caldo de Luria (LB, extracto de levadura 5 g/l (Oxoid), triptona 10 g/l (Oxoid) y cloruro de sodio 5 g/l) complementado con 15 pg/ml de tetraciclina. Se hicieron crecer los inoculos durante 12 h a 37°C en un agitador-incubador con una agitacion de 250 rpm. Se uso un inoculo de matraz de agitacion de 200 ml para inocular un fermentador de 15 l de volumen de trabajo que contema 10 l de medio de crecimiento discontinuo. Se llevaron a cabo fermentaciones en las condiciones de funcionamiento descritas a continuacion. Se controlo la temperatura a 37°C y el pH a 6,8, controlado mediante adicion automatica de hidroxido de amonio al 35% (p/v). El punto de referencia de tension de oxfgeno disuelto (dOT) fue del 30% de saturacion de aire y se controlo mediante ajuste automatico de la velocidad del agitador del fermentador, desde un mmimo de 250 rpm hasta un maximo de 1500 rpm, y complementacion automatica de oxfgeno a la corriente de gas de entrada. El flujo de aire hacia el recipiente de fermentador fue de 10 l/min. en todo momento. Se mantuvo la presion en el fermentador entre 50 y 200 mbar.
Se realizaron fermentaciones en modo discontinuo hasta agotamiento de la fuente de carbono (es decir glicerol) lo que se produjo aproximadamente 10 h tras la inoculacion y se caracterizo por un aumento repentino de la dOT. Se inicio la fermentacion con alimentacion discontinua en el punto de agotamiento de la fuente de carbono mediante la adicion de una alimentacion de glicerol/cloruro de magnesio a una velocidad de alimentacion de 11 g de glicerol por l de medio por h. Se llevo a cabo la induccion mediante la adicion de IPTG hasta una concentracion final de 0,5 mM una vez que el nivel de biomasa en la fermentacion alcanzo DO600 = 50-60. Se continuo la fase con alimentacion discontinua durante 12 h tras la induccion. Se tomaron muestras para determinar el nivel de biomasa (DO600) y la acumulacion de hTNFa (% de TCP)/tftulo de hTNFa (g/l) en la recogida (geles SDS-PAGE tenidos con Colloidal Blue).
En la tabla 5 se proporciona la composicion del medio de crecimiento discontinuo.
Tabla 5
Componente
Concentracion final [g/l], [mg/l] y [ml/l] de agua purificada
(NH4)2SO4
14,0
Glicerol
35,0
Extracto de levadura (Becton Dickinson)
20,0
KH2PO4
2,0
K2HPO4
16,5
Acido cftrico
7,5
MgSO4,7H2O
2,47
H3PO4
1,5 ml/l
CaCl2,2H2O
0,294
Antiespumante AF204
0,2 ml/l
Tetraciclina
15 mg/l
FeSO4,7H2O
114 mg/l
5
10
15
20
25
30
ZnSO4,7H2O
29 mg/l
MnSO4.H2O
17 mg/l
Na2MoO4,2H2O
9 mg/l
CuSO4,5H2O
4 mg/l
H3.BO3
12 mg/l
En la tabla 6 se proporciona la composicion de la alimentacion de glicerol / cloruro de magnesio. Tabla 6
Componente de alimentacion
Cantidad requerida [g/l] de agua purificada
Glicerol
714
MgSO4,7H2O
7,4
Se resumen los resultados en la tabla 7. El perfil de productividad de hTNFa para la cepa CLD030 se presenta en la Figura 4.
Tabla 7
Cepa
Descripcion de vector expresion DO600 en la recogida Acumulacion de hTNFa (% de TCP) en la recogida Tftulo de hTNFa (mg/l) en la recogida
CLD018
Promotor ApL con secuencia palindromica perfecta individual 167 7 2600
Los datos demuestran claramente la utilidad de los sistemas para la fabricacion de protemas heterologas. Se lograron altos tttulos de producto usando una fermentacion no optimizada generica sencilla y procedimientos de induccion. Las caractensticas de control del plasmido pAVE027, segun se demuestran mediante el perfil de productividad ejemplificado en la Figura 4, se pueden aprovechar para maximizar la produccion de protemas heterologas, particularmente protemas que requieren un control de la expresion para maximizar la secrecion.
Ejemplo 4
Se extrajo un vial de CLD048 del congelador a -80°C y se dejo que se descongelara. Se inocularon 10 pl de la disolucion madre en glicerol descongelada en 5 ml de caldo de Luria (LB, extracto de levadura 5 g/l (Oxoid), triptona 10 g/l (Oxoid) y cloruro de sodio 5 g/l) complementado con tetraciclina (10 pg/ml) y glucosa (1 g/l). Se incubo el cultivo de siembra a 37°C en un agitador orbital durante 16 h. Entonces se usaron 500 pl de este cultivo para inocular un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contema 50 ml de caldo de Luria (composicion tal como se describio anteriormente). Se incubo el matraz a 37°C, a 200 rpm en un agitador orbital. Se monitorizo el crecimiento hasta DO600=0,5-0,7. En este punto se indujo el matraz con IPTG (isopropil-p-D-1-tiogalactopiranosido) hasta una concentracion final de 0,1 mM y se continuo la incubacion, en las condiciones descritas anteriormente durante 2 horas adicionales. Entonces se recogieron las celulas y el medio de crecimiento libre de celulas residual. Las celulas recogidas se sometieron ademas a fraccionamiento de celulas por choque osmotico para aislar la fraccion celular que contema protemas que se habfan repartido en la fraccion periplasmica de E. coli soluble. Se estimo la acumulacion de D1.3 Fab biologicamente activo en el extracto periplasmico soluble y en el medio de crecimiento residual determinando la union de D1.3 Fab a lisozima (antfgeno) en un ensayo de ELISA por referencia a una curva patron preparada con D1.3 Fab activo purificado. La acumulacion de D1.3 Fab biologicamente activo en el periplasma de E. coli y en el medio de crecimiento residual (debido a la filtracion de material desde el periplasma hasta el medio de cultivo) se presenta en la Tabla 8. La acumulacion de D1.3 Fab en el periplasma y medio de crecimiento residual se normalizo como “pg de material activo por litro de cultivo por unidad de biomasa (DO600)”.
5
10
15
20
25
30
35
40
Tabla 8
Fraccion
D1.3 Fab biologicamente activo (pg/l de cultivo/DO)
Medio de crecimiento residual
460
Periplasma
4020
Total (medio de crecimiento residual + periplasma)
4480
La utilidad del control proporcionado por este sistema para hacer posible un nivel elevado de secrecion de protemas heterologas, particularmente aquellas que requieren la formacion de enlaces disulfuro complejos, esta claramente ejemplificada por la secrecion y acumulacion de niveles elevados de D1.3 Fab biologicamente activo en el periplasma de E. coli. Ademas, sera evidente para los expertos en la tecnica la manera en que puede utilizarse la fermentacion con alimentacion discontinua (por ejemplo, tal como se ha descrito previamente en el Ejemplo 3 o posteriormente en el I inicial Ejemplo 5) para producir tales protemas con un rendimiento elevado.
Ejemplo 5
Se repitio el proceso de fermentacion descrito en el Ejemplo 3 utilizando CDL048. La induccion se llevo a cabo mediante la adicion de IPTG hasta una concentracion final de 0,15 mM una vez que el nivel de biomasa en la fermentacion alcanzo DO600 = aprox 50. La fase de alimentacion discontinua se prolongo durante 35-45 h despues de la induccion. Entonces se recogieron las celulas y el medio de crecimiento libre de celulas residual. Las celulas recogidas se sometieron ademas a fraccionamiento de celulas por choque osmotico para aislar la fraccion celular que contema protemas que se habfan repartido en la fraccion periplasmica de E. coli soluble. Se estimo la acumulacion de D1.3 Fab biologicamente activo en el extracto periplasmico soluble y en el medio de crecimiento residual determinando la union de D1.3 Fab a lisozima (antigeno) en un ensayo de ELISA por referencia a una curva patron preparada con D1.3 Fab activo purificado. La acumulacion de D1.3 Fab en el periplasma de E. coli y en el medio de crecimiento residual se normalizo como “mg de material activo por litro de cultivo”.
La acumulacion de D1.3 Fab biologicamente activo en el periplasma de E. coli y en el medio de crecimiento residual (debido a la filtracion de material desde el periplasma hasta el medio de cultivo) se presenta en la Tabla 9.
Tabla 9
Fraccion
D1.3 Fab biologicamente activo (mg/l de cultivo)
Medio de crecimiento residual
525
Periplasma
57
Total (medio de crecimiento residual + periplasma)
582
Se demuestra un nivel elevado de secrecion de D1.3 Fab biologicamente activo utilizando el sistema de expresion. Ejemplo 6
Se diseno un diacuerpo tetravalente monocatenario biespedfico sintetico (bsctDb), en el que se unieron las regiones ligera variable y pesada variable de D1.3 (anticuerpo anti-lisozima) y A5B7 (anticuerpo anti-CEA (antfgeno carcinoembrionario)) en una unica cadena polipeptfdica. La secuencia de ADN para esta molecula se muestra en la figura 5 (SEQ ID NO 22). Esto se clono como fragmento de Nde I/Not I en pAVE046 que se habfa digerido con Nde I y Not I. Se examinaron plasmidos recombinantes mediante digestion de restriccion y se confirmaron mediante secuenciacion. El plasmido resultante se denomino pAVE078. Se transformo pAVE078 en W3110 de E. coli para preparar CLD073, que se purifico y se mantuvo en disoluciones madre en glicerol a -80°C.
Se extrajo un vial de CLD0073 del congelador a -80°C y se dejo que se descongelara. Se inocularon 10 pl de la disolucion madre en glicerol descongelada en 5 ml de caldo de Luria (LB, extracto de levadura 5 g/l (Oxoid), triptona 10 g/l (Oxoid) y cloruro de sodio 5 g/l) complementado con tetraciclina (10 pg/ml) y glucosa (1 g/l). Esto se incubo a 37°C en un agitador orbital durante 16 h. Entonces se usaron 500 pl de este cultivo para inocular dos matraces Erlenmeyer de 250 ml que conteman 50 ml de caldo de Luria (composicion tal como se describio anteriormente). Se incubaron los matraces a 37°C, a 200 rpm en un agitador orbital. Se monitorizo el crecimiento hasta DO600=0,5-0,7. En este punto se indujeron los matraces con IPTG hasta una concentracion final de o bien 0,5 mM o bien 0,1 mM y se continuo la incubacion, en las condiciones descritas anteriormente durante 20 horas adicionales. Entonces se recogieron las celulas y el medio de crecimiento libre de celulas residual. Se sometieron ademas las celulas

Claims (15)

10
15
20
25
30
35
REIVINDICACIONES
1. Un sistema de expresion de protemas que comprende:
a) un promotor ApL; y
b) una secuencia de operador palindromica perfecta.
2. Un vector que comprende:
a) un promotor ApL; y
b) una secuencia de operador palindromica perfecta.
3. Un vector de acuerdo con la reivindicacion 2, que ademas comprende un casete de expresion para una protema.
4. Un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, donde el vector es un plasmido, preferentemente un plasmido de replicacion autonoma.
5. Una celula huesped transformada por un vector tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.
6. Un metodo para la produccion de una protema recombinante que comprende expresar un sistema de expresion que comprende:
a) un promotor ApL;
b) una secuencia de operador palindromica perfecta; y
c) un casete de expresion para una protema recombinante.
7. Un sistema de expresion, vector, celula huesped o un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el sistema operador es lac, gal, deo o gln.

8. Un sistema de expresion, vector, celula huesped o metodo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, donde se emplea una secuencia de operador palindromica perfecta, que preferentemente esta ubicada en direccion 3' respecto al promotor.

9. Un sistema de expresion, vector, celula huesped o metodo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, donde se emplea un operador palindromico perfecto individual.

10. Un sistema de expresion, vector, celula huesped o metodo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, donde el operador tiene la secuencia GGAATTGTGAGCGCTCACAATTCC (nucleobases 51 a 74 de SEQ ID NO. 3) o AATTGTGAGCGCTCACAATT (nucleobases 53 a 72 de SEQ ID NO. 3).

11. Un sistema de expresion, vector, celula huesped o metodo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, donde un operador se superpone al punto de inicio de la transcripcion.
12. Un metodo para producir una protema, que comprende:
a) cultivar una celula huesped transformada con un vector de acuerdo con la reivindicacion 3; y
b) recuperar la protema.
13. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 12, donde la celula huesped es E. coli.
14. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13, donde el vector es un vector tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11.
15. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, donde un operador se superpone al punto de inicio de la transcripcion.
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