ES2445624T3 - Oligonucleótidos - Google Patents

Abstract

Un oligonucleótido monocatenario, que no tiene una secuencia que contiene partes hechas de cuatro o más restos nucleotídicos consecutivos que son el complemento inverso de cada uno de los otros que permite el apareamiento intramolecular de bases, y que está formado de restos nucleotídicos donde las bases de dos o más restos nucleotídicos internos están marcadas con un fluoróforo sin un inactivador asociado, donde al menos dos de los restos nucleotídicos marcados con un fluoróforo están separados por al menos dos restos nucleotídicos no marcados, donde el resto nucleotídico 3' no contiene un hidroxilo 3' y donde cada fluoróforo es el mismo fluoróforo.

Description

Oligonucleótidos

La presente invención se refiere a oligonucleótidos, en particular a oligonucleótidos marcados de forma fluorescente para su uso como sondas de hibridación.

Se conoce una multitud de tecnologías para detectar secuencias específicas de ADN y valorar los polimorfismos conocidos de un único nucleótido. Varios de estos métodos de detección utilizan hibridación de sondas fluorescentes y dependen de la transferencia de energía entre los restos donante y aceptor.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) homogénea es un método que acopla los procesos de amplificación y detección. Los beneficios de la PCR homogénea sobre los métodos tradicionales, tales como amplificación de diana seguido por electroforesis en gel, son una reducción en la duración del ensayo, las manipulaciones y el potencial de contaminación cruzada. Se emplean sondas fluorescentes con instrumentos de PCR en tiempo real, tales como el LightCycler (Roche), ABI PRISM 7700 y 7900 (Applied Biosystems), Smartcycler (Cepheid), Rotogene (Corbett Research), MX4000 (Stratagene), SynChron (Biogene) e iCycler (BioRad), para detectar e identificar productos amplificados durante (a tiempo real) o después (punto final) de la amplificación. Ejemplos de tecnologías basadas en sondas incluyen, balizas moleculares (Tyagi et al, 1996), el ensayo de 5'-exonucleasa (documento US 5.691.146), sondas de hibridación (documento US 6.174.670), cebadores Scorpion (Whitcombe et al, 1999), y ResonSense (Lee et al, 2002). Las sondas fluorescentes normalmente están en un estado inactivado o no excitado hasta que su hibridación con una secuencias diana provoca la desactivación, tal como por cambios conformacionales o degradación de la sonda, o excitación como resultado de interacciones de la sonda. Estos sistemas de sonda dependen de la transferencia de energía entre los restos donante (por ejemplo fluoróforo) y aceptor (por ejemplo, inactivador o fluoróforo secundario). La energía absorbida por un fluoróforo puede transferirse a un inactivador o un fluoróforo aceptor y liberarse como calor o emitirse como luz de una diferente longitud de onda. La inactivación de la señal fluorescente puede suceder por mecanismos de Transferencia de Energía por Resonancia de Fluorescencia (FRET) o no FRET. La inactivación FRET requiere un solapamiento espectral entre el donante y el aceptor, donde la eficacia de la inactivación está relacionada con la distancia entre los dos restos. La inactivación no FRET sucede a través de "contactos" de corto intervalo entre el fluoróforo y el inactivador, lo que no requiere solapamiento espectral entre los restos.

El ensayo de 5'-exonucleasa (TaqManT) usa inactivación FRET para detectar el ADN diana amplificado por PCR. Las sondas TaqMan son oligonucleótidos que contienen restos de fluoróforo e inactivador preferiblemente localizados en los extremos 5' y 3'. Se emite muy poca fluorescencia desde la sonda intacta debido a la inactivación intramolecular eficaz. Sin embargo, durante la amplificación por PCR, la sonda hibrida específicamente con su secuencia diana y la actividad 5'-3'-exonucleasa de la Taq polimerasa escinde la sonda entre los restos de fluoróforo e inactivador. La escisión enzimática de las sondas TaqMan separa espacialmente los componentes de fluoróforo e inactivador, causando aumentos significativos en la emisión de fluorescencia correlacionados con la amplificación de la diana. Un diseño cuidadoso de las sondas TaqMan permite la discriminación de dianas polimórficas, donde solamente se degradan las sondas perfectamente apareadas para generar aumentos en la señal de fluorescencia. Como las sondas TaqMan se digieren durante la amplificación por PCR en tiempo real, las sondas no están disponibles para análisis de secuencias post-amplificación.

Las sondas Eclipse son oligonucleótidos lineales cortos que tienen un agente de unión al surco menor (MGB) y un resto inactivador en el extremo 5' y un fluoróforo unido al extremo 3'. Se cree que el MGB evita la actividad exonucleasa de Taq que escinde la sonda. El enrollamiento aleatorio de la sonda sitúa a los componentes de fluoróforo e inactivador en cercana proximidad causando inactivación de fluorescencia. La hibridación con las secuencias diana causa que la sonda se enderece de modo que los restos de fluoróforo e inactivador queden separados espacialmente.

Las Balizas Moleculares son sondas oligonucleotídicas monocatenarias que son no fluorescentes en aislamiento, pero que llegan a ser fluorescentes tras la hibridación con las secuencias diana. Las Balizas Moleculares no hibridadas forman estructuras de tallo-bucle, que tienen un fluoróforo unido covalentemente a un extremo de la molécula y un inactivador unido al otro, de modo que la horquilla de la baliza sitúa al resto de fluoróforo en cercana proximidad del inactivador. Cuando las Balizas Moleculares hibridan con las secuencias diana, los restos de fluoróforo e inactivador quedan espacialmente separados, de modo que el fluoróforo ya no está inactivado y la Baliza Molecular emite fluorescencia. Pueden usarse Balizas Moleculares en ensayos en tiempo real y de punto final para la detección de secuencia y discriminación de SNP. La estructura secundaria de la Baliza Molecular transmite alta especificidad a la sonda, permitiendo la identificación de dianas que difieren en un único nucleótido. Sin embargo, la interacción intramolecular de la Baliza Molecular produce potencialmente una fuente de competición para la hibridación de la diana intermolecular y, como la Baliza Molecular es una sonda interna, debe competir con la hebra opuesta del amplicón por la unión con la secuencia diana. La combinación de ambas formas de competición puede reducir la eficacia de hibridación de la Baliza Molecular con algunas moléculas diana.

Los Scorpion son cebadores de PCR con una cola de tallo-bucle que contiene un fluoróforo y un inactivador (Whitcombe et al, 1999). La estructura de tallo-bucle sitúa los componentes de fluoróforo e inactivador en cercana proximidad. El componente de bucle del Scorpion contiene la secuencia de sonda y la detección de la diana sucede por un mecanismo intramolecular altamente eficaz. Durante la PCR, los Scorpion se extienden para formar productos que incluyen la secuencia diana sonda. La cola del Scorpion se pliega sobre y posibilita la hibridación de la sonda y las secuencias diana. La hibridación de la secuencia de sonda con la diana amplificada está termodinámicamente favorecida sobre la estructura de tallo-bucle y un diseño cuidadoso de la sonda posibilita la discriminación de dianas que difieren en tan solo un único nucleótido. La hibridación de la sonda causa que la estructura de tallo-bucle se disocie de modo que los componentes de fluoróforo e inactivador queden espacialmente separados y se generan grandes aumentos en la emisión de fluorescencia. La cola de tallo-bucle se separa de la secuencia cebadora de PCR por un tapón de PCR (por ejemplo, HEG) que evita que la ADN polimerasa copie la secuencia de tallo-bucle del Scorpion. El Scorpion dúplex (Solinas et al, 2001) utiliza dos oligonucleótidos marcados, uno que comprende el cebador, el fluoróforo y la secuencia de sonda, y el otro que contiene el resto inactivador. De nuevo, la extensión del Scorpion dúplex posibilita que la secuencia de sonda se pliegue sobre e hibride la diana amplificada, disociando de este modo los oligonucleótidos fluoróforo e inactivador y aumentando la cantidad de señal fluorescente emitida.

Las sondas de hibridación son oligonucleótidos que están marcadas individualmente con restos de fluoróforo. Se requieren dos de dichos oligonucleótidos para cada ensayo de sonda de hibridación, uno marcado con un fluoróforo donante y el otro con un fluoróforo aceptor. La fluoresceína se emplea habitualmente como el donante y Cy5, LC-RED 640 y LC-RED 705 se usan habitualmente como aceptores. La excitación del fluoróforo donante produce un espectro de emisión que solapa con el espectro de absorción del fluoróforo aceptor. Se diseñan pares de sondas de hibridación para reconocer secuencias de nucleótidos adyacentes dentro de moléculas diana. En aislamiento, el oligonucleótido aceptor no se excita y no genera una señal fluorescente. Sin embargo, durante la hibridación con las secuencias diana polinucleotídicas, las sondas donante y aceptora se sitúan en cercana proximidad, permitiendo la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia desde el donante hasta el aceptor. La señal fluorescente desde el fluoróforo aceptor se emite solamente cuando ambas sondas se hibridan con la molécula diana. Cuando se incorporan en reacciones de PCR, la fluorescencia desde la sonda aceptora se controla una vez por ciclo de amplificación, para facilitar la medición en tiempo real de la acumulación de producto, donde la cantidad de fluorescencia emitida por el aceptor es proporcional a la cantidad de diana sintetizada. Un diseño cuidadoso de las sondas y las condiciones de ensayo permite la discriminación de dianas muy relacionadas por PCR en tiempo real. Además, pueden emplearse pares de sonda de hibridación para discriminar alelos por análisis de picos de fusión y determinación de Tm. Pueden identificarse muestras homocigóticas mediante la generación de picos específicos durante el análisis de la curva de fusión y pueden identificarse muestras heterocigóticas mediante la presencia de dos picos dentro de una única huella de fusión.

Las sondas ResonSense son oligonucleótidos individualmente marcados que se unen a secuencias diana entre las posiciones de pares de cebadores. Las sondas ResonSense no producen señal detectable en aislamiento o ausencia de secuencia diana. En su lugar, se incluyen intercalantes de ADN, tales como SYBR Gold, para excitar la sonda ResonSense. El intercalante de ADN se une a ADN dúplex y, cuando se excita por el instrumento en tiempo real, transfiere la energía hasta el fluoróforo de la sonda ResonSense (Lee et al, 2002).

Las anteriores tecnologías de sonda utilizan FRET y marcadores inactivadores para detectar y discriminar secuencias polinucleotídicas. Sin embargo, el sistema alternativo de sonda Light-up (Svanvik et al, 2000) no requiere marcadores inactivadores o transferencia FRET entre los restos donante y aceptor para detectar y discriminar secuencias de ADN. Estas sondas Light-up comprenden una secuencia que reconoce oligonucleótidos, compuesta por ácido péptido-nucleico (PNA), y un único grupo indicador fluorescente, donde el indicador normalmente es un derivado del colorante de cianuro asimétrico naranja de tiazol y porta una carga positiva. El componente de colorante fluorescente de las sondas Light-up está unido al extremo de la molécula oligonucleotídica. Cuando son monocatenarias, las sondas emiten niveles significativamente inferiores de fluorescencia que cuando hibridan con secuencias de ácido nucleico complementarias. En sondas monocatenarias, los fluoróforos están libres y puede liberarse la energía excitada en forma de movimiento o calor, de modo que las sondas no emiten fluorescencia significativamente. Tras la hibridación, el fluoróforo cargado positivamente se inserta entre las bases de ADN y llega a "bloquearse" en esa posición como resultado de la interacción de cargas, de modo que la energía excitada solamente puede liberarse como luz. Midiendo la cantidad de emisión de fluorescencia, pueden emplearse sondas Light-up para detectar secuencias de ácido nucleico y diferenciar entre dianas que difieren en una única posición.

También se han descrito otras varias tecnologías de sonda que no requieren la unión de restos inactivadores para posibilitar la detección e identificación de dianas. Se ha informado de que la emisión de muchos fluoróforos cambia a través de su interacción con nucleobases (Siedel et al, 1996, Knemeyer et al, 2000, Lee et al, 1994, Crockett y Wittwer 2001, Nazerenko et al, 2002). También se ha informado de que la interacción de fluoróforos con ADN afecta a la longitud de onda de la emisión de fluorescencia. El mayor efecto sobre la fluorescencia se ha atribuido a la guanina, que es un donante eficaz de electrones. Se cree que la inactivación surge de la transferencia de electrones de la nucleobase guanina al colorante fluorescente. Se ha informado de que el grado de inactivación depende de la proximidad de los fluoróforos a las guaninas en la sonda y las hebras diana (Xu et al, 1994, Hawkins et al, 1997, Norlund et al, 1989). Se ha informado de que la magnitud y la dirección del cambio de emisión en sondas marcadas fluorescentes dependen de la localización de los restos de guanina en la sonda y las secuencias diana. Los cebadores LUX (Invitrogen) emplean estructuras de horquilla para inactivar fluoróforos unidos cerca del extremo 3' de la horquilla (Nazerenko et al, 2002). La estructura de horquilla de los cebadores LUX frecuentemente sitúa a los restos de fluoróforo en cercana proximidad a la región de G, inactivando de este modo la fluorescencia. Cuando el cebador llega a incorporarse en un producto bicatenario de PCR, la estructura de horquilla se disocia causando que el fluoróforo llegue a reactivarse. Se ha informado de que la presencia de restos de guanina en proximidad al marcador afecta a la funcionalidad de los cebadores LUX. Los cebadores LUX producen una señal fluorescente cuando se incorporan en cualquier molécula bicatenaria y detectarán, por lo tanto, productos de amplificación no específicos y dímeros de cebador.

Las sondas GenePin (Atto-tec GmbH) o las sondas Smart (Knemeyer et al, 2000, Heinlein et al, 2003) son estructuras de tallo-bucle similares a las Balizas Moleculares. El bucle es el componente de sonda y el tallo se emplea para inactivar la fluorescencia en el estado monocatenario (documento WO 01/36668). El fluoróforo en las sondas GenePin está unido al componente poli(C) del tallo y la fluorescencia se inactiva de forma eficaz mediante el componente de tallo poli(G) complementario. Tras la hibridación con la diana, los componentes poli(C) y poli(G) quedan separados, se retira el efecto de la inactivación por guanina y aumenta el nivel de emisión de fluorescencia.

Las sondas Simple son oligonucleótidos individualmente marcados que muestran cambios en la emisión de fluorescencia tras la hibridación con la diana (documento US 6.635.427). Los fluoróforos normalmente están unidos en el extremo, donde la sondas marcadas en 5' también incluyen preferiblemente un fosfato 3'. La magnitud y dirección del cambio de fluorescencia en la sondas Simple depende de la secuencia de ADN sonda que flanquea la posición de la unión del fluoróforo y la secuencia de ADN diana con que el fluoróforo interacciona tras la hibridación. Se ha informado de la inactivación de la fluorescencia de las sondas Simple tras la hibridación cuando los fluoróforos se ponen en proximidad a nucleótidos de desoxiguanosina en la hebra diana (Crockett y Wittwer 2001). En contraste, se ha informado de potenciación de la fluorescencia cuando los fluoróforos terminales, unidos a o cerca de restos G, se hibridan con secuencias diana complementarias (documento US 6.635.427). En un ejemplo específico, cuando fluoróforo remplaza una base interna ("nucleótido virtual"), se ha demostrado que la fluorescencia de una sonda Simple se potencia y también se inactiva tras la hibridación con la diana, cuando el fluoróforo se sitúa en oposición a nucleótidos A y G respectivamente en alelos diana polimórficos. Las muestras heterocigóticas no mostraron un aumento o disminución significativa en la fluorescencia tras la hibridación de la sonda/diana.

Las balizas de hibridación (también llamadas HyBeacons®) son oligonucleótidos marcados de forma interna que emiten mayores cantidades de fluorescencia cuando hibridan con secuencias diana que cuando están en estado monocatenario (documento WO 01/73118). Los HyBeacons no requieren un resto inactivador para la generación de señal fluorescente, y no dependen de estructuras secundarias de la sonda, escisión enzimática o FRET con otro fluoróforo. En ausencia de un marcador inactivador, las propiedades inactivadoras presentadas del ADN son responsables de la alteración en la emisión de fluorescencia tras la hibridación. A diferencia de las otras tecnologías de sonda marcadas individualmente descritas anteriormente, la dirección del cambio de fluorescencia no se ve afectada por la secuencia de nucleótidos de la sonda o las hebras diana.

Dobson et al (2003) Chem: Comm. 11, 1234-1235 describe la síntesis de sondas TaqMan marcadas de forma doble. El documento WO 94/02640 describe sondas de ácido nucleico con colorantes fluorescentes unidos covalentemente a átomos fosfato en la estructura.

La enumeración o el análisis de un documento publicado previamente en esta memoria descriptiva no debe tomarse necesariamente como un reconocimiento de que el documento es parte del estado de la técnica o es conocimiento general común.

Los inventores han descubierto que, sorprendentemente, oligonucleótidos con múltiples fluoróforos internos, preferiblemente especiados de forma definida entre sí, dan señales fluorescentes inesperadamente grandes sobre la unión de una secuencia polinucleotídica diana cuando se comparan con versiones marcadas individualmente equivalentes de otro modo.

Un primer aspecto de la invención proporciona un oligonucleótido monocatenario que no tiene una secuencia que contenga partes hechas de cuatro o más restos nucleotídicos consecutivos que son el complemento inverso de cada uno de los otros que permite un apareamiento de bases intramolecular, y que está formado de restos nucleotídicos donde las bases de dos o más restos nucleotídicos internos están marcados con un fluoróforo sin un inactivador asociado, donde al menos dos de los restos nucleotídicos marcados con un fluoróforo están separados por al menos dos restos nucleotídicos no marcados, donde el resto nucleotídico 3' no contiene un hidroxilo 3' y donde cada fluoróforo es el mismo fluoróforo.

Como se analiza en detalle a continuación, los oligonucleótidos de la invención son particularmente útiles como sondas de hibridación.

Los oligonucleótidos de la invención, como los HyBeacons® descritos en el documento WO 01/73118, no dependen de estructuras secundarias oligonucleotídicas, acción enzimática o restos inactivadores unidos al oligonucleótido para que sean eficaces como sondas de hibridación fácilmente detectables. La interacción entre estos oligonucleótidos y sus secuencias diana (como se analiza a continuación) genera alteraciones significativas en la emisión de fluorescencia que posibilitan una detección fiable de la diana. Variaciones en la estabilidad de la sonda posibilitan la discriminación de dianas que difieren en tan solo un único nucleótido a través de la medición de la temperatura de fusión del dúplex como se analiza en más detalle a continuación.

En contra de los datos dependientes de secuencia presentados en el documento US 6.635.427, que sugiere que se esperaría que fluoróforos unidos a oligonucleótidos estuvieran inactivados tras la hibridación de la sonda/diana debido a que los fluoróforos están flanqueados por restos C y las hebras de la diana tienen una abundancia de restos G en la región del fluoróforo, los oligonucleótidos de la invención muestran niveles potenciados de fluorescencia cuando hibridan con secuencias diana completamente complementarias y (parcialmente) desapareadas (es decir, parcialmente complementarias), independientemente de las secuencias de la sonda y la diana.

Los datos demuestran que los fluoróforos de los oligonucleótidos de la invención interaccionan con el propio oligonucleótido monocatenario, pero no con ADN dúplex en el hibrido formado tras la hibridación. Por lo tanto, aunque la secuencia de la sonda puede afectar a la magnitud del cambio de fluorescencia, las sondas no llegan a inactivarse tras la hibridación. Incluso cuando las bases marcadas con fluoróforo de los oligonucleótidos de la invención se sitúan en proximidad a una región diana rica en G tras la hibridación, se observa reactivación y picos de fusión positivos (-dF/dT produce un valor positivo) como se demuestra en este documento, particularmente con sondas oligonucleotídicas donde los restos nucleotídicos marcados directamente con fluoróforo están separados por dos o más restos nucleotídicos no marcados. La independencia de secuencia de los oligonucleótidos de la invención contrasta con lo presentado por Nazerenko et al, (2002b), donde la emisión dT de fluoresceína interna se potenciaba

o inactivaba tras la hibridación dependiente de la localización del fluoróforo dentro de la sonda y la proximidad de guaninas al fluoróforo. Se informó de que al menos una base de guanina era necesaria en cuatro nucleótidos del marcador para posibilitar la potenciación de fluorescencia tras la hibridación.

Como con los HyBeacons® del documento WO 01/73118, los oligonucleótidos con marcaje múltiple de la invención descritos en este documento producen niveles aumentados de potenciación de fluorescencia independientemente de las secuencias de la sonda y la diana y no requieren guaninas en localizaciones definidas para facilitar la potenciación de la fluorescencia tras la hibridación con la diana. Aunque sin limitarse por la teoría, se cree que los fluoróforos unidos a los oligonucleótidos de la invención interaccionan con ADN sonda (oligonucleótido) cunado es monocatenario (por ejemplo, estando enterrado en un bolsillo hidrófobo monocatenario) causando de este modo inactivación de la fluorescencia (por ejemplo, mediante un apilamiento de bases que causa inactivación por colisión). Sin embargo, se cree que los fluoróforos no interaccionan con ADN dúplex cuando las sondas hibridan con una diana, de modo que los fluoróforos unidos a los oligonucleótidos de la invención se proyectan en solución y muestran niveles elevados de emisión, donde dichos aumentos son independientes de la secuencia de la diana. El modelado molecular e informático descrito en Marks et al (2005), es relevante para este punto.

Mediante "oligonucleótido monocatenario que no tiene sustancialmente estructura secundaria" incluimos el significado de que el oligonucleótido no tiene una secuencia mediante la cual halla parte sustanciales que son el complemento inverso de cada una de las otras que permita apareamiento de bases intramolecular. Por "partes sustanciales" se entienden cuatro o más restos nucleotídicos consecutivos. En particular, a diferencia de las sondas oligonucleotídicas de la técnica previa tales como Balizas Moleculares, Scorpions, sondas LUX y Smart que están diseñadas para contener regiones sustanciales de complementariedad inversa, las sondas de la invención normalmente se diseñan para evitar dicha complementariedad inversa. Las sondas oligonucleotídicas de la invención solamente emplean el complemento inverso de la diana y no incluyen secuencias adicionales para generar estructura secundaria.

La estructura secundaria potencial de un oligonucleótido puede predecirse usando software de plegamiento de ácidos nucleicos tal como Mfold (Zucker (2003)). La estabilidad de la estructura secundaria frecuentemente se representa por su energía libre (iG), es decir, la energía necesaria para romper la estructura secundaria, donde grandes valores iG negativos indican estructuras estables. Las sondas de la invención normalmente poseen valores iG positivos o negativos pequeños, preferiblemente menos negativos que -2 kcal/mol y más preferiblemente menos negativos que -1 kcal/mol. Las tecnologías de sonda que dependen de la estructura secundaria, tales como Scorpions, normalmente muestran valores iG negativos mucho mayores. Las sondas Scorpion descritas por Thelwell et al (2000) poseen valores iG que varían de -7,7 kcal/mol a -12,2 kcal/mol.

La estructura secundaria surge cuando una región de un oligonucleótido hibrida con otra, por ejemplo, formando un bucle (como en Balizas Moleculares convencionales) que disminuye la eficacia de la hibridación del oligonucleótido con su diana. En los oligonucleótidos de la invención no existe tendencia sustancial de que una región del oligonucleótido hibride con otra, y esto puede evaluarse, por ejemplo, usando el software Mfold mencionado anteriormente.

Se unen grupos fluorescentes (fluoróforos) a beses internas en el oligonucleótido de la invención, en oposición a los extremos 5' ó 3', y se cree que se inactivan a un grado mayor cuando son monocatenarios que cuando están en forma de dúplex (es decir, tras la hibridación con la diana), ya que se propone que las bases de ADN son capaces de apilarse sobre el fluoróforo cuando no están formando pares de bases. En el estado monocatenario, el fluoróforo puede emparedarse entre dos bases de ADN formando una estructura hidrófoba estable. Esta estructura se abrirá tras la formación de dúplex ya que los nucleótidos participan en el apareamiento de bases.

Con marcadores terminales, el apilamiento de bases aún sucederá solamente en un lado del fluoróforo en hibridación. Cuando los oligonucleótidos de la invención hibridan, el fluoróforo no se posicionará entre bases de ADN, pero es capaz de extenderse sin impedimentos desde la base. Sondas marcadas de forma terminal tales como las sondas Simple llegarán a inactivarse tras la formación de dúplex si el fluoróforo está en proximidad más cercana a más guaninas en el dúplex que en el estado monocatenario. Sin embargo, si los marcadores terminales están unidos a la sonda en una región de alta abundancia en guanina, la fluorescencia se potenciará tras la formación del dúplex (documento US 6.635.427). Esta dependencia de la secuencia de la inactivación y potenciación de la fluorescencia, de acuerdo con la localización y abundancia de guaninas en la sonda y la hebra diana, no se observa en los oligonucleótidos de la invención.

Todas las bases de ADN son capaces de inactivar la fluorescencia en algún grado, donde la G es la que tiene mayor capacidad de hacerlo. Para evitar dudas, la expresión "inactivador asociado" no incluye bases de ADN que forman parte del oligonucleótido. Los fluoróforos en los oligonucleótidos de la invención interaccionarán con las bases de sondas monocatenarias de modo que se inactive la fluorescencia. Como se espera que los fluoróforos se proyecten en solución tras la hibridación con la diana y no interaccionen con ADN dúplex, la secuencia de la diana puede no afectar a la dirección del cambio de la fluorescencia, es decir, las guaninas en la diana pueden no inactivar la fluorescencia tras la hibridación. Por lo tanto, los oligonucleótidos de la invención muestran niveles aumentados de fluorescencia cuando hibridan con secuencias diana. Las G pueden modular la potencia de la fluorescencia pero todas se reactivan significativamente en hibridación. La fluorescencia procedente de fluoróforos unidos de forma interna de los oligonucleótidos de la invención siempre se potencia tras la formación de dúplex independientemente de la localización y abundancia de guaninas en la sonda y hebra diana.

Los oligonucleótidos con marcaje doble y múltiple de la invención emiten cantidades significativamente mayores de fluorescencia cuando hibridan con secuencias de ácido nucleico complementarias en comparación con la conformación monocatenaria (no hibridada) a pesar de la ausencia de un componente inactivador aunque normalmente se siguen las restricciones de espaciado desveladas en este documento para evitar interacciones adversas que conduzcan a alturas de picos reducidas o picos negativos como se muestra en la Figura 11.

La proporción de señal-a-ruido es la proporción de la intensidad de señal de un híbrido bicatenario que comprende un oligonucleótido de la invención a la intensidad de señal de la sonda monocatenaria y es preferiblemente lo más grande posible, por ejemplo, 2 o más. Las proporciones de señal-a-ruido en los oligonucleótidos de la invención son significativas y útilmente mayores de 1 a pesar de la ausencia de restos inactivadores asociados. Se cree que los restos de fluoróforo emiten significativamente más señal fluorescente cuando las sondas hibridan con moléculas diana que cuando están en estado monocatenario debido a alguna forma de interacción con las secuencias de ADN. Las sondas oligonucleotídicas con marcaje doble o múltiple de la invención poseen proporciones que son mayores de las esperadas a partir de oligonucleótidos marcados individualmente de secuencia idéntica.

La potenciación de la fluorescencia sucede tras la hibridación con la diana cuando los restos marcados con fluoróforo se sitúan en todos los entornos de secuencia. La colocación de restos marcados con fluoróforo adyacentes a G puede producir los mayores niveles de potenciación de fluorescencia en el estado dúplex. Sin embargo, la potenciación de la fluorescencia tras la hibridación con la diana también sucederá cuando los restos marcados con fluoróforo se localizan dentro de regiones de alta abundancia en C. En una realización de esta invención, los restos en la hebra diana no son responsables de la inactivación o potenciación de la fluorescencia de la sonda tras la hibridación. La naturaleza de la interacción del fluoróforo con el oligonucleótido difiere entre el oligonucleótido libre e hibridado de modo que los oligonucleótidos de la invención muestran niveles mayores de emisión de fluorescencia cuando en forma de dúplex que cuando son monocatenarios lo que demuestra que no hay restricciones aparentes de secuencia en la funcionalidad, aunque la secuencia puede afectar a la magnitud de la potenciación de la fluorescencia.

Normalmente, el oligonucleótido tiene 2 ó 3 ó 4 ó 5 ó 6 ó 7 u 8 ó 9 ó 10 restos internos marcados con un fluoróforo. La cantidad puede depender de la longitud del oligonucleótido. Normalmente, se marcan hasta aproximadamente un tercio de los restos internos con un fluoróforo, pero puede haber menos.

La longitud del oligonucleótido de la invención es preferiblemente una que sea adecuada para hibridar con una diana polinucleotídica complementaria, para proporcionar un híbrido estable cuya temperatura de fusión dependa de la secuencia exacta de la diana. Los oligonucleótidos que contienen menos de 15 restos nucleotídicos en muchos casos no forman híbridos suficientemente estables, particularmente cuando las dos secuencias de hibridación no son completamente complementarias, aunque pueden usarse en algunas circunstancias. Los oligonucleótidos, que son más largos de aproximadamente 30 restos nucleotídicos pueden formar híbridos cuya temperatura de fusión es relativamente insensible a la posible presencia de un desapareamiento de un único nucleótido, aunque pueden usarse en algunas circunstancias.

Normalmente, el oligonucleótido es de 10 a 50 restos nucleotídicos de longitud, preferiblemente de 15 a 30 restos nucleotídicos de longitud. Por tanto, normalmente, el oligonucleótido es de 10 u 11 ó 12 ó 13 ó 14 ó 15 restos nucleotídicos de longitud hasta (e incluyendo) 25 ó 26 ó 27 ó 28 ó 29 ó 30. Por lo tanto, la invención incluye oligonucleótidos dentro de cualquiera de los intervalos de tamaño mencionados.

Un oligonucleótido dentro del intervalo de tamaño de 15 a 30 nucleótidos puede tener hasta aproximadamente 10 de sus restos nucleotídicos internos marcados con un fluoróforo, pero convenientemente un oligonucleótido en este intervalo de tamaño tiene 2 ó 3 ó 4 ó 5 de sus restos internos marcados con un fluoróforo.

Se prefiere que al menos dos (o los dos según pueda ser el caso) de los restos nucleotídicos marcados con un fluoróforo estén separados por al menos dos restos nucleotídicos no marcados. Normalmente, hay 2 ó 3 ó 4 ó 5 ó 6 restos nucleotídicos no marcados que separan los restos nucleotídicos marcados. Se prefiere particularmente que dos restos no marcados separen los restos marcados. También se prefiere particularmente que todos los restos nucleotídicos marcados estén separados por al menos dos restos nucleotídicos no marcados. Preferiblemente, los fluoróforos están separados de tal modo que se evite la inactivación 'por contacto' directo entre los fluoróforos. La inactivación por contacto surge del contacto físico de los fluoróforos y normalmente se evita por separación física (es decir, al menos dos restos nucleotídicos entre las bases marcadas con fluoróforo).

Los restos nucleotídicos habitualmente derivan de los nucleósidos de origen natural A, C, G, T y U. Sin embargo, pueden usarse análogos de nucleótidos en una o más localizaciones del oligonucleótido de la invención, estando modificados dichos análogos de nucleótidos, por ejemplo, en la parte de la base y/o la parte del azúcar y/o el enlace fosfato. Las modificaciones de bases, tales como propinil dU (análogo de dT) y 2-amino dA (análogo de dA), generalmente alteran las propiedades de hibridación y pueden hacer atractivo el uso de oligonucleótidos que tengan menos de 15 restos nucleotídicos. En el caso de oligonucleótidos que contengan propinil dU, puede haber aproximadamente 10 restos de longitud dependiendo de la temperatura de fusión con la secuencia diana requerida.

Como alternativa, los oligonucleótidos compuestos de o que comprenden ácido péptido-nucleico (PNA), ácido nucleico bloqueado (LNA), 2'-O-metil ARN, ADN fosforamidita, ADN fosforotioato, ADN metil fosfonato o ADN fosfotriéster pueden emplearse para formar interacciones química o enzimáticamente más estables con las secuencias diana.

Puede usarse cualquier fluoróforo que pueda unirse a un resto nucleotídico, con la condición de que no evite la hibridación del oligonucleótido con su secuencia diana.

Los fluoróforos adecuados incluyen fluoróforos basados en fluoresceína tales como FAM (6-carboxifluoresceína), TET (tetraclorofluoresceína), HEX (hexaclorofluoresceína); fluoróforos basados en rodamina tales como ROX (6carboxi-X-rodamina) y TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina); la familia Cy de colorantes, especialmente Cy3 y Cy5, todos disponibles en Glen Research, 22825 Davis Drive, Sterling, VA 20164, Estados Unidos.

Pueden usarse otros colorantes de fluoresceína, por ejemplo aquellos con diferentes espectros de emisión, tales como NED y JOE. También pueden usarse otros fluoróforos, tales como aquellos de las familias de colorantes Alexa, Atto, Dyomics Megastokes y Thilyte como se detalla en las siguientes Tablas 9 a 15.

En una realización preferida de la invención, los oligonucleótidos se marcan en la posición 5 de bases internas de uracilo/timina usando C6 FAM dU (disponible en la University of Southampton, R.U.) o fluoresceína dT (disponible en Glen Research, Sterling, VA) respectivamente (en este contexto, la estructura de dT y dU son idénticas y los términos por lo tanto son intercambiables). Pueden incorporarse fosforamiditas protegidas con FMOC en posiciones internas dT dentro de los oligonucleótidos y pueden usarse como punto de unión para una diversidad de colorantes fluorescentes, incluyendo, aunque sin limitación, FAM, TET, HEX, ROX, TAMRA, Cy3 y Cy5, todos disponibles en Glen Research. Tras la síntesis del oligonucleótido, el grupo FMOC puede retirarse de la uridina protegida en 2' y puede acoplarse un fluoróforo fosforamidita, tal como una 6-carboxifluoresceína fosforamidita protegida, al grupo 2'hidroxi libre. En otra realización más, los oligonucleótidos pueden marcarse en posiciones internas de A, C o G, donde los nucleótidos marcados se incorporan como fosforamiditas durante la síntesis en fase sólida del oligonucleótido o como fluoróforos unidos tras la síntesis del oligonucleótido usando fosforamiditas protegidas (por ejemplo, 8-aminoalquil-dA, 7-aminoalquil 7-desaza-dA, N(4)-aminoalquil dC y 5-aminoalquil-dC).

Se prefiere que el fluoróforo no se intercale en ADN bicatenario. Se prefiere que el fluoróforo no sea naranja de tiazol (TO).

Puede esperarse que los oligonucleótidos con marcaje doble de la invención muestren señales fluorescentes y ruido de fondo que sean el doble de los observados con sondas marcadas individualmente, de modo que la proporción de señal-a-ruido se mantenga (es decir, se esperaría un efecto aditivo). Sin embargo, sorprendentemente, las proporciones de señal-a-ruido de sondas con marcaje doble son mayores que las observadas con sondas marcadas individualmente de secuencia idéntica. Un aumento inesperado similar en la proporción de señal-a-ruido también se observa con otros oligonucleótidos con marcaje múltiple de la invención.

Además, como se describe en más detalle en los Ejemplos, se ha demostrado que sondas con marcaje doble, triple, cuádruple, y múltiple adicional generan picos de fusión considerablemente más grandes que los esperados del efecto cumulativo de las sondas individuales marcadas individualmente de secuencia nucleotídica idéntica si el efecto fuera simplemente aditivo.

Normalmente, el oligonucleótido de la invención tiene una complementariedad de secuencia con la secuencia polinucleotídica de la diana. Por tanto, el oligonucleótido es capaz de hibridar con la secuencia polinucleotídica de la diana en condiciones apropiadas. Por lo tanto, salvo que el contexto indique otra cosa, por "complementario" incluimos el significado de que el oligonucleótido es capaz de hibridar con una secuencia polinucleotídica diana. El oligonucleótido puede ser completamente complementario a la secuencia polinucleotídica diana (es decir, hay un apareamiento perfecto en términos de apareamiento de bases entre los oligonucleótidos), o el oligonucleótido puede ser parcialmente complementario a la secuencia polinucleotídica diana (es decir, hay uno o más desapareamientos entre el oligonucleótido y la secuencia polinucleotídica diana, pero el oligonucleótido aún es capaz de hibridar). Normalmente, cuando el oligonucleótido es parcialmente complementario al polinucleótido diana, hay menos de 5 desapareamientos, preferiblemente 1 ó 2 ó 3 ó 4 desapareamientos, más preferiblemente un desapareamiento. Convenientemente, el oligonucleótido tiene una identidad de secuencia de al menos el 70 % con el complemento de su diana, más preferiblemente de al menos el 80 % o al menos el 85 % o al menos el 90 % o al menos el 95 %. Por ejemplo, para un oligonucleótido de 20 restos, puede haber 6 ó 4 ó 3 ó 2 ó 1 desapareamiento con la diana.

Normalmente, la secuencia polinucleotídica diana se selecciona entre el grupo compuesto por el genoma humano incluyendo cualquier gen en el mismo o alelo del mismo, el genoma del ratón incluyendo cualquier gen en el mismo

o alelo del mismo, y el genoma de cualquier agente infeccioso incluyendo cualquier gen en el mismo o alelo del mismo. Preferiblemente, el oligonucleótido es uno que tiene una secuencia complementaria a uno cualquiera de los

siguientes genes humanos o un alelo de los mismos:

N-acetiltransferasa 2

X14672

Factor V Leiden

AY364535

Factor II

AF493953

MTHFR

NM_005957

Anemia falciforme

AY356351

El gen PrP de oveja (NM_001009481) también es un gen preferido para el análisis.

Preferiblemente también el oligonucleótido es uno que tiene una secuencia complementaria al genoma o cualquier gen en el mismo o alelo del mismo de los siguientes agentes infecciosos:

Chlamydia trachomatis X07547 Adenovirus AJ293905 Influenza A AY130766 Streptococcus pneumoniae X52474 MRSA AJ810121

Como se describe adicionalmente en los Ejemplos, el oligonucleótido puede ser uno que tiene una secuencia complementaria a un alelo de un gen. Por ejemplo, puede ser complementario a un alelo mutante de un gen que, en seres humanos, puede estar asociado a una enfermedad genética particular (por ejemplo, fibrosis quística), o puede ser complementario al alelo de tipo silvestre. Es preferible que la secuencia complementaria a la diferencia de la secuencia nucleotídica del alelo dado en comparación con otro alelo del gen esté localizada hacia el centro del oligonucleótido (por ejemplo, dentro de la mitad central a un tercio de los restos nucleotídicos). Esto permite una buena discriminación en las temperaturas de fusión para uno de estos oligonucleótidos dado (que puede hibridar con ambos alelos pero con diferentes Tm).

En una realización preferida, el oligonucleótido de acuerdo con la invención preferiblemente tiene una secuencia completamente complementaria a un alelo de una diana polinucleotídica conocida que tiene un polimorfismo conocido, por ejemplo, una mutación puntual o una inserción o deleción de una única base (SNP). El sitio de polimorfismo está preferiblemente, aunque no esencialmente, localizado de forma central dentro de la sonda oligonucleotídica. Como alternativa, el oligonucleótido puede ser complementario a una secuencia polinucleotídica no polimórfica conocida y puede simplemente usarse para detectar esa diana, por ejemplo, para una rápida detección de patógenos. Además, el polinucleótido puede usarse para estudiar dianas potencialmente polimórficas con polimorfismos desconocidos o no caracterizados. La posibilidad se concibe mapeando la posición y/o naturaleza de polimorfismos desconocidos por hibridación diferencial de oligonucleótidos y diferencias en la Tm del pico de fusión. Cuando se provoca que el oligonucleótido de la invención hibride con una diana polinucleotídica, todas las anteriores características contribuyen a la formación de un híbrido estable con una temperatura de fusión óptima y una diferencia sustancial en las temperaturas de fusión (iTm) entre hebras que aparean perfectamente y hebras que tienen una única posición o múltiples posiciones de desapareamiento.

Como se analiza en más detalle a continuación, particularmente cuando el oligonucleótido de la invención se usa como sonda de la producción de una secuencia polinucleotídica diana en una reacción de amplificación de ácido nucleico, el oligonucleótido es uno en que el resto nucleotídico 3' no contiene un grupo hidroxilo 3'. El oligonucleótido no es capaz de actuar como cebador para una ADN polimerasa y no es capaz de ligar mediante una ADN ligasa. Convenientemente, el resto nucleotídico 3' es un resto 3' desoxi. También convenientemente, el resto nucleotídico 3' puede tener un fosfato 3', u otros grupos 3' que evitarían la extensión de cadena.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un oligonucleótido de la invención inmovilizado en un soporte sólido. El soporte sólido puede ser cualquier soporte sólido adecuado. Las técnicas y enlazadores para inmovilizar oligonucleótidos usando soportes en formatos que los dejan libres de hibridar con dianas complementarias en solución están bien descritos en la bibliografía.

Un aspecto adicional más de la invención proporciona una serie de oligonucleótidos de la invención. La serie puede comprender dos o más sitios individualmente abordables de oligonucleótido inmovilizado en un soporte sólido. Normalmente, la serie contendrá al menos 10, o al menos 100, o al menos 1000 de estos sitios. Normalmente, la serie comprende oligonucleótidos con diferentes secuencias, normalmente cada sitio diferente está asociado con un oligonucleótido con una secuencia de diferencia. En una realización preferida, la serie es una serie de las sondas oligonucleotídicas inmovilizadas en localizaciones especiadas usando un soporte, donde las diferentes sondas oligonucleotídicas son diferentes oligonucleótidos de acuerdo con esta invención. Además, los oligonucleótidos de la invención pueden emplearse para analizar dianas de ADN inmovilizadas sobre o dentro de un soporte, donde las distintas dianas pueden posicionarse en localizaciones espaciadas en formatos de tipo serie.

Los métodos para inmovilizar oligonucleótidos y preparar series de oligonucleótidos son bien conocidos en la técnica.

En un aspecto adicional más de la invención, se proporciona un método para investigar una secuencia polinucleotídica diana en una muestra que contiene secuencias polinucleotídicas, comprendiendo el método poner en contacto la muestra con un oligonucleótido de la invención que es capaz de hibridar con la secuencia polinucleotídica diana, y determinar si sucede hibridación.

La muestra puede ser cualquier muestra adecuada, y puede ser una que se sabe que contiene la secuencia polinucleotídica diana, o puede ser una donde no se sabe que contiene la secuencia polinucleotídica diana, y el propósito de la investigación es determinar si lo hace o no.

Como el oligonucleótido está marcado de forma fluorescente, y como hay un aumento en la fluorescencia tras la unión del oligonucleótido con la diana, se usa convenientemente un aumento en la fluorescencia para determinar si ha sucedido hibridación entre el oligonucleótido y la secuencia polinucleotídica diana.

Se apreciará que, en condiciones dadas, el oligonucleótido es capaz de hibridar con su diana a ciertas temperaturas. Como se analiza en más detalle a continuación, puede ser deseable variar la temperatura de la hibridación y detectar fluorescencia a diferentes temperaturas para investigar la secuencia polinucleotídica diana. Por tanto, en una realización preferida de la invención, el método se realiza a una temperatura predeterminada, o sobre un intervalo de temperaturas, cerca del punto de fusión (Tm) del híbrido formado entre la secuencia polinucleotídica diana y dicho oligonucleótido. Las Tm se determinan normalmente mediante análisis de la curva de fusión donde el 50 % de la sonda hibrida con la secuencia diana y el 50 % está disociada y libre en solución.

El oligonucleótido puede ser completamente complementario a la secuencia polinucleotídica diana, y ese oligonucleótido tendrá una Tm característica en condiciones de hibridación dadas. Como alternativa, el oligonucleótido puede no ser completamente complementario a la secuencia polinucleotídica diana, pero no obstante es capaz de hibridar con ella (es parcialmente complementario), y ese oligonucleótido tendrá una Tm característica (pero casi seguramente distinta).

El método de la invención es particularmente adecuado para el análisis de polimorfismos de un gen y similares. En una realización, la secuencia polinucleotídica diana investigada son uno o más alelos de un gen. Uno (o el) oligonucleótido usado en el método es convenientemente uno que es capaz de hibridar con más de un alelo del gen, y normalmente tiene diferentes Tm en condiciones de hibridación dadas con respecto a los diferentes alelos.

El método puede usarse para detectar la presencia de la secuencia diana, por ejemplo en una muestra en que se desconoce si está presente. El método también puede usarse para identificar la secuencia diana o puede usarse para cuantificar la cantidad de la secuencia polinucleotídica diana en la muestra. Normalmente, el aumento en la fluorescencia tras la unión del oligonucleótido al polinucleótido diana se usa para esto.

Es particularmente conveniente que la muestra contenga secuencias polinucleotídicas producidas por amplificación ya que a menudo una fuente inicial de material biológico (tal como saliva, un raspado bucal, cantidades pequeñas de sangre seca, etc.) contienen solamente una pequeña cantidad de ácido nucleico que puede contener el polinucleótido diana.

Adecuadamente, las secuencias polinucleotídicas se producen mediante una cualquiera o más de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, incluyendo amplificación por PCR asimétrica), PCR de transcripción inversa (RT-PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), amplificación mediada por transcripción (TMA), amplificación por círculo rodante (RCA) o amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA).

En una realización preferida, la amplificación de las secuencias polinucleotídicas en la muestra se realiza en presencia del oligonucleótido que es capaz de hibridar con la secuencia polinucleotídica diana. El resto nucleotídico 3' del oligonucleótido no contiene un hidroxilo 3'. El oligonucleótido de la invención presente en la reacción no tiene capacidad de extensión de cadena mediante una ADN polimerasa y no tiene capacidad de ligamiento por ADN ligasa. En esta realización, se prefiere que la observación de la fluorescencia se haga durante la amplificación de las secuencias polinucleotídicas en la muestra.

Puede no haber necesidad de extraer el ácido nucleico de la fuente biológica antes de la amplificación, ya que el proceso de amplificación puede tener capacidad de dicha extracción. Por tanto, por ejemplo, las secuencias polinucleotídicas en la muestra pueden producirse por amplificación de una fuente biológica tal como saliva sin extracción previa del ácido nucleico.

La invención proporciona un método para investigar una diana polinucleotídica que tiene un polimorfismo conocido, comprendiendo dicho método proporcionar una sonda oligonucleotídica que comprenda restos nucleotídicos marcados con fluoróforo. La diana polinucleotídica se incuba con la sonda oligonucleotídica para formar un híbrido, mostrando la sonda oligonucleotídica un nivel mayor de fluorescencia cuando está en forma de híbrido que cuando está en forma monocatenaria. El nivel de fluorescencia emitida por la sonda oligonucleotídica se observa a una temperatura predeterminada o se controla sobre un intervalo de temperaturas.

Convenientemente, si se usa una única sonda oligonucleotídica en una investigación en que el oligonucleótido puede hibridar con dos alelos diferentes con diferentes Tm, puede usarse una temperatura intermedia a las dos Tm,

o el ensayo puede realizarse sobre un intervalo de temperaturas (es decir, por análisis de fusión).

Se apreciará que el método puede incluir dos o más sondas oligonucleotídicas de la invención que hibridan con diferentes secuencias diana (por ejemplo, diferentes alelos del mismo gen). Convenientemente, estas pueden distinguirse mediante el uso de fluoróforos con diferentes propiedades fluorescentes, o los dos o más oligonucleótidos tienen diferentes características de fusión (por ejemplo, Tm) cuando hibridan con (o que hibridan con) sus respectivas secuencias polinucleotídicas diana.

Normalmente, cuando se usa un intervalo de temperaturas, el intervalo abarca la Tm del híbrido formado entre el oligonucleótido y su diana polinucleotídica. Convenientemente, el intervalo de temperatura es ±10 ºC, normalmente ±5 ºC en comparación con la Tm.

Convenientemente, si se incluyen dos sondas oligonucleotídicas diferentes en una investigación, el ensayo se realiza sobre un intervalo de temperaturas (es decir, por análisis de fusión).

Es particularmente útil realizar el método de la invención de modo que se haga una observación de la tasa de cambio de la señal fluorescente con la temperatura.

Normalmente, los oligonucleótidos de la invención son unos que forman un híbrido con su secuencia polinucleotídica diana donde el híbrido tiene una Tm de 20 ºC a 90 ºC, preferiblemente de 40 ºC a 70 ºC.

En una situación en que se usa una sonda oligonucleotídica de la invención para detectar una secuencia diana completamente complementaria y una secuencia diana parcialmente complementaria, puede suceder hibridación preferencial con la secuencia completamente complementaria si la concentración de diana excede a la concentración de sonda ya que las secuencias desapareadas son menos estables. En casos extremos, la hibridación preferencial puede detectar solamente la forma completamente complementaria de la diana. El aumento en la concentración de la sonda puede, por lo tanto, emplearse para promover la hibridación con dianas desapareadas y mejorar el equilibrio de las alturas de pico.

En una realización de este aspecto de la invención, se incluyen uno o más oligonucleótidos de la invención en ensayos de PCR y emiten cantidades mayores de fluorescencia cuando hibridan con secuencias dianas complementarias que cuando están en estado monocatenario. Tras la amplificación, se determina la presencia e identidad de secuencias diana por análisis de curva de fusión (French et al, 2001, French et al, 2002). La estabilidad y temperatura de fusión de las sondas hibridadas depende del grado de homología entre la sonda y la secuencia diana. El aumento de la temperatura de reacción por encima de la Tm del oligonucleótido de la invención causa que se disocien dúplex sonda/diana y disminuya la cantidad de emisión de fluorescencia. Pueden detectarse secuencias que difieren en tan sólo un único nucleótido y diferenciarse basándose en la Tm del pico de fusión. Pueden completarse cincuenta ciclos de amplificación y análisis de fusión en tan sólo 16 minutos. Una ventaja de usar los oligonucleótidos de la invención para análisis de secuencia homogénea deriva de su capacidad de identificar de forma fiable muestras homocigóticas y heterocigóticas usando una única sonda oligonucleotídica.

La diana polinucleotídica puede ser ADN, ARN o ADNc, y se usa en forma monocatenaria, o puede sondearse un dúplex de ADN para formar una triple hélice. En una realización, la diana polinucleotídica tiene un polimorfismo conocido, preferiblemente un polimorfismo de un único nucleótido (SNP). La diana se incuba en condiciones de hibridación con una sonda oligonucleotídica de la invención. Es necesario que el híbrido genere una señal de fluorescencia más fuerte que la sonda oligonucleotídica monocatenaria. La temperatura de fusión del híbrido dependerá, entre otras cosas, de si la diana polinucleotídica y la sonda oligonucleotídica son completamente complementarias o si existe un apareamiento único o incluso doble que surge en o cerca de la localización del SNP. El método implica observar el nivel de señal de fluorescencia, emitida por la sonda oligonucleotídica, a una temperatura predeterminada cerca de la temperatura de fusión del híbrido, o sobre un intervalo de temperaturas. Se describen dos alternativas, aunque son posibles otras:

a) La temperatura de una solución que contiene el híbrido se eleva lentamente, observando continuamente una señal de fluorescencia, para construir un gráfico de la derivada negativa de la intensidad de la señal de fluorescencia con respecto a la temperatura (-dF/dT) frente a la temperatura. La temperatura de fusión (Tm) del híbrido aparece como un pico, y proporciona información acerca de la secuencia de la diana polinucleotídica. Las Tm generadas a través de análisis de fusión del oligonucleótido de la invención pueden usarse para distinguir dianas polimórficas. Así mismo, el análisis puede realizarse enfriando la solución lentamente desde una elevada temperatura y determinando la temperatura de hibridación. b) Una solución del híbrido se mantiene a una temperatura predeterminada y se observa el nivel de fluorescencia. Generalmente, la temperatura predeterminada se elige para que sea intermedia entre la temperatura de fusión de un híbrido perfectamente apareado y la temperatura de fusión de un híbrido con uno

o dos desapareamientos. El nivel se señal de fluorescencia observado proporciona una indicación de si se ha disociado el híbrido o no, y así proporciona información acerca de la secuencia de la diana polinucleotídica. Pueden distinguirse dianas polimórficas en formatos de punto final y tiempo real.

Convenientemente, la diana polinucleotídica puede ser un amplímero de PCR, formado mediante el uso de cebadores adecuados para amplificar una parte deseada de ADN genómico. Puede ser conveniente realizar la amplificación y la investigación de la diana en un modo homogéneo, por ejemplo, en un único recipiente de reacción añadiendo la sonda oligonucleotídica antes, durante o después del procedimiento del ciclo de amplificación. También puede ser conveniente realizar la amplificación de la diana y la investigación de la secuencia directamente a partir de las muestras, tales como saliva, sin extracción previa de ADN, ARN o ADNc. La sonda oligonucleotídica se modifica en su extremo 3' para evitar la extensión de cadena durante la amplificación por PCR. En otro aspecto, la amplificación de la diana puede realizarse usando PCR asimétrica para generar una abundancia de la diana monocatenaria. La hibridación de la sonda preferencial con secuencias diana completamente complementarias sobre dianas desapareadas puede evitarse aumentando la concentración de la sonda. La amplificación de la diana para ensayos usando el oligonucleótido de la invención también puede realizarse usando técnicas alternativas tales como reacción en cadena de ligamiento (LCR), amplificación por círculo rodante (RCA), amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), amplificación mediada por transcripción (TMA) y amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA). Normalmente, se usan concentraciones de sonda mayores de 150 nM en ensayos asimétricos.

Puede ser conveniente proporcionar dos o más de los oligonucleótidos de la invención, uno completamente complementario a cada alelo del SNP en investigación. Cuando cada oligonucleótido de la invención porta un diferente fluoróforo, puede ser conveniente mezclar las sondas en solución para el análisis de dianas homocigóticas y heterocigóticas. Del mismo modo, puede usarse una mezcla de oligonucleótidos de la invención complementarios a los diversos alelos de varios SNP diferentes juntos en solución para análisis múltiple, con la condición de que cada uno está marcado con un fluoróforo espectralmente distinto. Dicho análisis múltiple también puede realizarse usando un único tipo de colorante indicador (fluoróforo), empleando dos o más oligonucleótidos de la invención que muestren diferentes Tm apareadas y desapareadas, de modo que las múltiples dianas y alelos puedan detectarse e identificarse simultáneamente basándose en la temperatura de fusión.

El método de la invención puede realizarse donde el oligonucleótido que es capaz de hibridar con la secuencia polinucleotídica diana, la muestra que puede contener la secuencia diana polinucleotídica o ambos están inmovilizados sobre o dentro de un soporte.

La secuencia polinucleotídica diana se selecciona preferiblemente entre el grupo que consiste en el genoma humano incluyendo cualquier gen en el mismo o alelo del mismo, el genoma de ratón o cualquier gen en el mismo o alelo del mismo, y el genoma de cualquier agente infeccioso incluyendo cualquier gen en el mismo o alelo del mismo. Las secuencias diana preferidas son las descritas anteriormente.

También se desvela un proceso para preparar un oligonucleótido de la invención, comprendiendo el proceso seleccionar una secuencia polinucleotídica diana y sintetizar un oligonucleótido que tiene una complementariedad de secuencia con el polinucleótido diana y que tiene las propiedades expuestas en el primer aspecto de la invención. Normalmente, el oligonucleótido es uno que es capaz de hibridar con la secuencia diana. El oligonucleótido puede ser uno que es completamente complementario a la secuencia diana o puede ser uno que esté desapareado como se ha descrito anteriormente.

Preferiblemente, la secuencia polinucleotídica diana se selecciona entre el grupo que consiste en el genoma humano incluyendo cualquier gen en el mismo o alelo del mismo, el genoma de ratón incluyendo cualquier gen en el mismo o alelo del mismo, y el genoma de cualquier agente infeccioso incluyendo cualquier gen en el mismo o alelo del mismo como se ha descrito en más detalle anteriormente.

Los oligonucleótidos de la invención producidos por este método pueden situarse en una serie, por tanto también se desvela un proceso para producir una serie de oligonucleótidos colocando dos o más oligonucleótidos de la invención en un soporte sólido. Normalmente, los sitios donde se han colocado (unido) los oligonucleótidos están uniformemente distribuidos sobre el soporte.

La invención se describirá ahora en más detalle por referencia a los siguientes Ejemplos no limitantes y Figuras.

La Figura 1 muestra las estructuras químicas de los marcadores C6 FAM dU y Fluoresceína dT Glen empleados en los oligonucleótidos de la invención.

La Figura 2 muestra que se empleó un oligonucleótido marcado individualmente (HYBA1928C) para analizar directamente muestras de saliva con respecto al polimorfismo A1928C de la 5, 10-metilenotetrafolato reductasa (MTHFR). La derivada negativa de la fluorescencia con respecto a la temperatura (-dF/dT sobre el eje y) se representó frente a la temperatura de la muestra (eje x) para generar picos de fusión. El oligonucleótido produce picos de fusión con Tm de aproximadamente 51,5 ºC y 61 ºC en presencia de los alelos A y C respectivamente. Las muestras heterocigóticas generan ambos picos de fusión de 51,5 ºC y 61 ºC.

La Figura 3 muestra los picos de fusión derivados de los oligonucleótidos marcados individualmente (FVG1) y con marcaje doble (FVG11) del factor V. El fluoróforo adicional causa que la altura del pico de fusión aumente en 4-5 veces y reduce la Tm de la sonda en aproximadamente 5 ºC.

Figura 4. A) Picos de fusión de la sonda HYBCH2 obtenidos con ADN purificado de Chlamydia trachomatis (LGV-II, cepa 434, ATCC VR-920B, Advanced Biotechnologies, Maryland, EE.UU.) y muestras de hisopo clínico procesadas. Se genera un único pico de fusión, con una Tm de aproximadamente 60 ºC, en presencia de ADN diana de Chlamydia. B) PCR en tiempo real y datos de los picos de fusión obtenidos con la sonda HYBCH6 de Chlamydia. La sonda con marcaje triple de Chlamydia produce picos de fusión que son aproximadamente 6 veces la magnitud del oligonucleótido HYBCH2 marcado individualmente.

La Figura 5 muestra los picos de fusión de HYBNG (un oligonucleótido con marcaje doble de la invención) obtenidos con ADN purificado de Neisseria gonorrhoeae. Se genera un único pico de fusión con una Tm de aproximadamente 59 ºC.

Figura 6. A) Picos de fusión obtenidos de una serie de ADN genómicos humanos purificados, usando la sonda FVG11 con marcaje doble para tipar muestras con respecto al polimorfismo del factor V Leiden. Las muestras de tipo silvestre homocigóticas generan un único pico de fusión con una Tm de aproximadamente 55 ºC. Las muestras heterocigóticas producen simultáneamente picos de fusión apareados y desapareados que poseen Tm de aproximadamente 55 ºC y 45 ºC respectivamente. Las muestras 'mutantes' homocigóticas producirían solamente los picos de fusión de 45 ºC. Las reacciones de control negativo no generan ningún pico de fusión. B) El software LightCycler puede emplearse para tipar muestras con respecto al polimorfismo del Factor V basándose en la cantidad y Tm de los picos de fusión.

La Figura 7 muestra un método para calcular la proporción de señal-a-ruido de la sonda. Las lecturas de fluorescencia se miden a Tm más y menos 10 ºC para estados de sonda disociada e hibridada respectivamente. La proporción de señal-a-ruido puede calcularse como la señal hibridada dividida por la señal disociada.

Figura 8. A) La sonda FVG11 con marcaje doble muestra aproximadamente dos veces la cantidad de fluorescencia de fondo (por encima de 70 ºC) en comparación con la sonda FVG1 marcada individualmente. Sin embargo, B) la sonda con marcaje doble del factor V produce picos de fusión que son aproximadamente 56 veces el tamaño de los picos generados con la sonda marcada individualmente. Esto demuestra que la proporción de señal-a-ruido es �3 veces mejor con FVG11 en comparación con FVG1 en comparación con el resultado esperado que es dos veces el que produciría el fluoróforo dos veces el de fondo y dos veces la señal, por lo tanto una proporción señal-a-ruido sin cambios. Las sondas FVG1 y FVA11 muestran aumentos del 33 % y el 82 % en la fluorescencia tras la hibridación, respectivamente.

La Figura 9 muestra una comparación de las sondas con marcaje individual (FVG1) y doble (FVG11) del factor V usando muestras genómicas purificadas. Los picos de fusión se analizaron usando 10 ºC para suavizar el promedio de los datos y el polinómico con la función LightCycler de corrección del fondo. Las reacciones de control negativo (NC) no producen picos de fusión con las sondas FVG1 o FVG11. 1 ng/!l de ADN 'de tipo silvestre' homocigótico produce picos de fusión individuales con Tm de aproximadamente 59 ºC y 54,6 ºC para las sondas con marcaje individual y doble respectivamente. Las muestras genómicas heterocigóticas (HET) producen picos de fusión tanto apareados como desapareados. Las alturas de los picos de fusión con marcaje son aproximadamente 3-4 veces mayores que los generados con la sonda marcada individualmente.

La Figura 10 muestra una comparación de sondas con marcaje 3', 5' e interno de secuencia idéntica. La sonda con marcaje 5' mostró inactivación de la fluorescencia tras la hibridación con la diana y generó picos invertidos en las huellas -dF/dT. La sonda con marcaje 3' no presentó ni potenciación de fluorescencia ni inactivación tras la hibridación. El oligonucleótido con marcaje interno presentó potenciación de la fluorescencia tras la hibridación con la diana y picos de fusión positivos en huellas -dF/dT. Tanto la sonda con marcaje individual como la sonda con marcaje doble son independientes de la secuencia diana y siempre muestran niveles potenciados de fluorescencia cuando hibridan.

Figura 11. A) Comparación de las sondas HYBCH (1), HYBCH2 (2), HYBCH3 (3) y HYBCH4 (4) de Chlamydia. Las sondas marcadas con 3 y 4 colorantes FAM emiten niveles considerablemente inferiores de fluorescencia en comparación con las sondas con marcaje individual y doble debido a la cercana proximidad de los marcadores. La sonda con marcaje triple (3) muestra niveles aumentados de emisión tras la disociación del dúplex. B) Picos de fusión derivados de las cuatro sondas de Chlamydia. La sonda con marcaje triple produce pequeños picos de fusión invertidos a una Tm superior que la variante con marcaje doble. La sonda marcada con 4 colorantes FAM produce un pequeño pico de fusión positivo con una Tm aproximadamente igual a la generada con la sonda con marcaje doble. C) Comparación de los oligonucleótidos con marcaje doble HYBCH (1), con marcaje individual HYBCH2 (2), y con marcaje triple HYBCH5 (5) y HYBCH6 (6).

La Figura 12 muestra los picos de fusión derivados de las sondas oligonucleotídicas marcada individualmente (1), con marcaje doble (2) y con marcaje triple (3) del factor V.

La Figura 13 muestra los oligonucleótidos marcado individualmente (1) y con marcaje doble (2) de la invención que contienen A) FAM dA y B) FAM dC.

Figura 14. A) Comparación de protocolos de PCR simétrica y asimétrica para la detección de Chlamydia trachomatis usando la sonda HYBCH2. B) Comparación de PCR simétrica y sonda marcada individualmente

(1) con amplificación asimétrica y sonda marcada individualmente (2) y PCR asimétrica con la variante de sonda con marcaje doble (3). La altura de los picos de fusión de Chlamydia se potencia en más de 7 veces usando PCR asimétrica y la sonda con marcaje doble HYBCH.

Figura 15. Se hibridaron 150 nM de FVG11 con 75 nM de FVG y 75 nM de dianas oligonucleotídicas FVA (1). Se hibridaron 300 nM de la sonda con 150 nM de FVG y 150 nM de FVA (2). También se hibridaron 150 nM de sonda con 500 nM de FVG y 500 nM de FVA. A elevada concentración de la diana, la hibridación preferencial de la sonda con la secuencia diana completamente complementaria evita la detección de la variante de diana desapareada (3).

Figura 16. A) Después de 60 ciclos de amplificación asimétrica de la diana, las alturas de los picos de fusión apareado y desapareado del factor V están desequilibrados cuando se emplea 150 nM de sonda FVG11. El aumento de la concentración de la sonda hasta 500 nM mejora el equilibrio de las alturas de los picos de fusión. B) Las alturas de los picos de fusión de FVG11 se midieron tras 50, 60 y 70 ciclos de amplificación simétrica y asimétrica de la diana usando 150 nM, 300 nM y 500 nM de la sonda FVG11.

La Figura 17 muestra detección múltiple de secuencias diana usando las sondas oligonucleotídicas poliT (1), HYBINF (2), HYBCH2 (3) y HyBAdC (4). La detección múltiple fue basándose en la Tm del pico de fusión y empleó FAM en todas las sondas.

La Figura 18 muestra los picos de fusión obtenidos con la sonda con marcaje triple HYBCH6 que detecta secuencias diana apareadas y desapareadas amplificadas a partir de ADN purificado de Chlamydia y plásmido mímico respectivamente. La sonda presenta Tm de aproximadamente 60,3 ºC y 51,8 ºC con dianas de ADN de Chlamydia y mímicas respectivamente. No se generaron picos en ausencia de diana.

La Figura 19 muestra la sonda FVG11 con marcaje doble que se empleó para generar una curva patrón en tiempo real usando diluciones de ADN genómico humano. La serie de dilución comprendió 100 ng/!l, 10 ng/!l, 1 ng/!l, 0,1 ng/!l y 0,01 ng/!l de ADN genómico.

La Figura 20 muestra las curvas de fusión para sondas derivadas FVG11 con marcaje doble marcadas con A.

TAMRA, B. ROX, C. Cy5, D. ROX y FAM y las inflexiones en las mismas que indican cambios en la fluorescencia como resultado del estado de hibridación.

Materiales y métodos referentes a los Ejemplos

Diseño y síntesis de la sonda oligonucleotídica

Las sondas oligonucleotídicas de la invención se diseñan normalmente para que sean de aproximadamente 18-25 nucleótidos de longitud y posean Tm de aproximadamente 55-60 ºC cuando hibridan con secuencias diana completamente complementarias. Los fluoróforos se unen a restos internos en la secuencia de la sonda usando C6 FAM dU (University of Southampton, R.U.) o Fluoresceína dT (Glen Research, Sterling, VA). En el caso de C6 FAM dU (Figura 1), se une 6-carboxifluoresceína (FAM) a la posición 5 de bases de uracilo a través de métodos de síntesis de ADN que son bien conocidos para los especialistas en la técnica. Los fluoróforos pueden incorporarse en sondas en forma de fosforamiditas durante la síntesis en fase sólida de los oligonucleótidos (Brown et al, 2001, Brown et al, 2003). También pueden hacerse otras modificaciones fluorescentes tras la síntesis usando monómeros tales como 8-aminoalquil-dA y 5-aminoalquil-dC de Glen Research. Los oligonucleótidos de la invención pueden poseer un componente fosfato 3' u otro agente de bloqueo para evitar la extensión mediada por Taq cuando las sondas se incorporan en ensayos de PCR en tiempo real. La cantidad de sonda obtenida de la síntesis se determina disolviendo una alícuota de la sonda oligonucleotídica en un volumen específico de agua y midiendo la absorbancia UV a 260 nm. La concentración de la sonda se calcula a partir de la absorbancia UV del oligonucleótido y su coeficiente de extinción a 260 nm. El coeficiente de extinción del oligonucleótido se calcula a partir de la suma de los coeficientes individuales de extinción de los nucleósidos no modificados y marcados con fluorescencia de los cuales está compuesto.

Los sitios polimórficos se posicionan convenientemente hacia el centro de los oligonucleótidos para maximizar la iTm. El nucleótido en el sitio del polimorfismo se selecciona normalmente de modo que sucedan interacciones altamente desestabilizantes cuando las sondas hibriden con dianas desapareadas. Las sondas que muestran desapareamientos C/A, C/T y C/C se emplean de forma preferencial mientras que se evitan los desapareamientos G/T, G/A y G/G. Como se ha analizado anteriormente, la sonda oligonucleotídica puede tener una identidad de secuencia del 70 % u 80 % u 85 % ó 90 % ó 95 % con el complemento de su diana.

Reacción en cadena de la polimerasa

Los volúmenes de PCR son normalmente de 20 !l, que comprenden 2 !l de muestra, tampón de PCR 1x, cebadores 0,5 !M, 1 unidad de Taq polimerasa (Amersham Pharmacia Biotech), MgCl2 total 3 mM, 5 ng/!l de BSA (Roche Diagnostics), dNTP 1 nM (Amersham Pharmacia Biotech) y 150 nM de sonda. Los tampones empleados en los ensayos usando los oligonucleótidos son tampón de PCR 10x (TaKaRa, contiene MgCl2 1,5 nM), HEPES Nº7 10x (HEPES 100 mM pH 8,3, KCl 250 mM) para análisis directo de orina y HEPES Nº8 10x (HEPES 100 nM pH 8,3, KCl 500 mM) para análisis directo de saliva y muestras purificadas/procesadas. La amplificación homogénea y detección de las dianas puede realizarse usando un instrumento LightCycler (Roche Diagnostics). La detección por PCR a tiempo real y la cuantificación de la diana pueden conseguirse con un protocolo térmico de 3 fases donde, tras una etapa de reacción de desnaturalización inicial (95 ºC 1 min.), las dianas se amplifican usando 50 ciclos que comprenden desnaturalización (95 ºC 5 s), hibridación de cebador (55 ºC 10 s) y extensión de productos (72 ºC 10 s). La adquisición de la fluorescencia se realiza una vez por ciclo, en ensayos de 3 fases, al final de cada etapa de hibridación del cebador. Como alternativa, las dianas pueden amplificarse rápidamente usando un protocolo térmico de 2 fases donde, tras una etapa de desnaturalización inicial (95 ºC 1 min.), las dianas se amplifican usando 50 ciclos que comprenden desnaturalización (95 ºC 5 s) y una fase combinada de hibridación/extensión (65 ºC 10 s). La fluorescencia no se adquiere durante la amplificación de 2 fases.

Detección e identificación de la diana

Tras amplificación de 3 fases y 2 fases, las reacciones se desnaturalizan inmediatamente (95°C 0 s) y se enfrían (35°C 30 s) antes del análisis de la curva de fusión (35-95°C con una velocidad de transición de 0,2°C/s) donde la fluorescencia se adquiere de forma continua. Los picos de fusión se construyen usando el software LightCycler (versión 3.5) representando la derivada negativa de la fluorescencia con respecto a la temperatura (-dF/dT en el eje y) frente a la temperatura (eje x). Las dianas pueden detectarse de forma fiable e identificarse usando las temperaturas de fusión (Tm) de los picos de las sondas oligonucleotídicas.

Ejemplo 1: Sondas oligonucleotídicas marcadas individualmente a modo de ejemplo

Lo siguiente son ejemplos de sondas que se han usado para la detección de secuencias diana y la identificación de dianas polimórficas. Se proporcionan las secuencias cebadoras usadas para amplificar las dianas correspondientes. Este ejemplo contiene sondas oligonucleotídicas marcadas individualmente para su comparación con las sondas con marcaje doble y múltiple de la invención.

El análisis del polimorfismo NAT2*5A (C481T) puede realizarse por análisis de fusión usando sondas oligonucleotídicas tales como 2303002 (5'GAGAGGAATCFGGTACCTGGACC (SEC ID Nº 1)), donde F es un nucleótido marcado fluorescente y las bases subrayadas representan la posición del polimorfismo. La extensión por PCR a partir de la sonda está bloqueada con un fosfato 3'. La secuencia diana que contiene el SNP NAT2*5A puede amplificarse usando cebadores tales como 195993 (5'CCTCTAGAATTAATTTCTGGG (SEC ID Nº 2)) y 195991 (5'CTGCTCTCTCCTGATTTGGTCC (SEC ID Nº 3)). Los alelos *4 completamente complementario y *5A desapareado (C:A) pueden detectarse de forma fiable e identificarse basándose en la Tm de la sonda (tabla 1). La sonda 2303002 está diseñada para hibridar con una sección del gen NAT2 (acceso a Genbank X14672) que tiene una secuencia de:

NAT2*4 5'GGTCCAGGTACCAGATTCCTCTC (SEC ID Nº 4) NAT2*5ª 5'GGTCCAAGTACCAGATTCCTCTC (SEC ID Nº 5)

El análisis del polimorfismo NAT2*5C (A803G) puede realizarse por análisis de fusión usando una sonda oligonucleotídica tal como DdeFL1*4 (5'GAAGTGCFGAAAAATATATTTAAG (SEC ID Nº 6)), donde F es un nucleótido marcado fluorescente y las bases subrayadas representan la posición del polimorfismo. La extensión por PCR a partir de la sonda está bloqueada con un fosfato 3'. La secuencia diana que contiene el SNP NAT2*5C puede ampliarse usando cebadores tales como DdeF2 (5'CCTATAGAAAATTCAATTATAAAG (SEC ID Nº 7)) y DdeR (5'CACGAGATTTCTCCCCAAGG (SEC ID Nº 8)). Los alelos *4 completamente complementario y *5C desapareado

(A:C) pueden detectarse de forma fiable e identificarse basándose en la Tm de la sonda (tabla 1). La sonda DdeFL1*4 está diseñada para hibridar con una sección del gen NAT2 (acceso a Genbank X14672) que tiene una secuencia de:

NAT2*4 5'CTTAAATATATTTTTCAGCACTTC (SEC ID Nº 9) NAT2*5C 5'CTTAAATATATTTCTCAGCACTTC (SEC ID Nº 10)

El análisis del polimorfismo NAT2*7 (G857A) puede realizarse por análisis de fusión usando una sonda oligonucleotídica tal como BamFL1*7 (5'CCTGGTGAFGAATCCCTTAC (SEC ID Nº 11)), donde F es un nucleótido marcado fluorescente y las bases subrayadas representan la posición del polimorfismo. La extensión por PCR a partir de la sonda está bloqueada con un fosfato 3'. La secuencia diana que contiene el SNP NAT2*7 puede amplificarse usando cebadores tales como BamF2 (5'CCTATAGAAAATTCAATTATAAAG (SEC ID Nº 12)) y BamR (5'CACGAGATTTCTCCCCAAGG (SEC ID Nº 13)). Los alelos *7 completamente complementario y *4 desapareado

(A:C) pueden detectarse de forma fiable e identificarse basándose en la Tm de la sonda (véase la tabla 1). La sonda DdeFL1*7 está diseñada para hibridar con una sección del gen NAT2 (acceso a Genbank X14672) que tiene una secuencia de:

NAT2*4 5'GTAAGGGATTCATCACCAGG (SEC ID Nº 14) NAT2*7 5'GTAAGGGATCCATCACCAGG (SEC ID Nº 15)

El análisis de dos SNP NAT1*10 puede realizarse por análisis de fusión usando una sonda oligonucleotídica tal como HYBNAT3S (5 'CTTTAAAATACAFTTTTTATTATTA (SEC ID Nº 16)), donde F es un nucleótido marcado fluorescente y los nucleótidos subrayados representan las posiciones del polimorfismo. La extensión por PCR a partir de la sonda está bloqueada con un fosfato 3'. Los alelos completamente complementario, desapareado y doblemente desapareado pueden detectarse de forma fiable e identificarse basándose en la Tm de la sonda (véase la tabla 1). La funcionalidad de esta sonda se ha demostrado usando oligonucleótidos complementarios que poseen todas las combinaciones posibles de bases en las posiciones del polimorfismo. La sonda HYBNAT3S está diseñada para hibridar con una sección del gen NAT1 (acceso a Genbank AY3 76850) que tiene una secuencia de:

NATRAA TAATAATAAAAAATGTATTTTAAAGATGGC (SEC ID Nº 17) NATRTA TAATAATAATAAATGTATTTTAAAGATGGC (SEC ID Nº 18) NATRTC TAATAATAATAAATGTCTTTTAAAGATGGC (SEC ID Nº 19) NATRAC TAATAATAAAAAATGTCTTTTAAAGATGGC (SEC ID Nº 20)

El análisis del polimorfismo del Factor V Leiden (G1691A) puede realizarse por análisis de fusión usando una sonda oligonucleotídica tal como FVG1, (5'CTGTAFTCCTCGCCTGTCC (SEC ID Nº 21)), donde F es un nucleótido marcado fluorescente y el nucleótido subrayado es la posición del polimorfismo. La extensión por PCR a partir de la sonda está bloqueada con un fosfato 3'. La secuencia diana que contiene el SNP del factor V puede amplificarse usando cebadores tales como FVF1.3 (5'GGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATC (SEC ID Nº 22)) y FVR3.5 (5'GCCCCATTATTTAGCCAGGAGACCTAACATG (SEC ID Nº 23)). Los alelos completamente complementario 'de tipo silvestre' y desapareado (C:A) 'mutante' pueden detectarse de forma fiable e identificarse basándose en la Tm de la sonda (véase la tabla 1). La sonda FVG1 está diseñada para hibridar con una sección del gen del Factor V (acceso a Genbank AY364535) que tiene una secuencia de:

FVG 5'GGACAGGCGAGGAATACAG (SEC ID Nº 24) FVA 5'GGACAGGCAAGGAATACAG (SEC ID Nº 25)

El análisis simultáneo de los polimorfismos HbS y HbC de anemia falciforme puede realizarse por análisis de fusión usando una sonda oligonucleotídica marcada individualmente tal como SCT1 (5'GTGCACCTGACFCCTGTGG (SEC ID Nº 26)), donde F es un nucleótido marcado fluorescente y los nucleótidos subrayados son las posiciones del polimorfismo. La extensión por PCR a partir de la sonda está bloqueada con un fosfato 3'. La secuencia diana que contiene los polimorfismos de células falciformes puede amplificarse usando cebadores tales como SCF1

5 (5'AGGGCAGAGCCATCTATTGCT (SEC ID Nº 27)) y SCR2 (5'CATCCACGTTCACCTTGCC (SEC ID Nº 28)). Los alelos HbS completamente complementario (GT:CA), desapareado (GT:CT) de tipo silvestre y HbC doblemente desapareado (GT:TT) pueden detectarse de forma fiable e identificarse basándose en la Tm de la sonda (tabla 1). La sonda SCT1 está diseñada para hibridar con una sección del gen de la 1-globina (acceso a Genbank AY356351) que tiene una secuencia de:

10 HbS 5'CCACAGGAGTCAGGTGCAC (SEC ID Nº 29) HbWT 5'CCTCAGGAGTCAGGTGCAC (SEC ID Nº 30) HbC 5'CCTTAGGAGTCAGGTGCAC (SEC ID Nº 31)

15 La detección del plásmido críptico de Chlamydia trachomatis puede realizarse por análisis de fusión usando una sonda oligonucleotídica tal como HYBCH2 (5'CAAGCCTGCAAAFGTATACCAAG (SEC ID Nº 32)), donde F es un nucleótido marcado fluorescente. La extensión por PCR a partir de la sonda está bloqueada con un fosfato 3'. La secuencia diana del plásmido críptico puede amplificarse usando cebadores tales como CHF3-1 (5'GGGTTCGTTGTAGAGCCATGTCCTATCTTG (SEC ID Nº 33)) y CHR4-1 (5'CGCAGCTGCTGTAATCACCCAGT

20 CGATAAA (SEC ID Nº 34)). El plásmido críptico de Chlamydia y un control de amplificación positiva desapareado

(C:A) (véase a continuación) pueden detectarse de forma fiable e identificarse basándose en la Tm de la sonda (véase la tabla 1). La sonda HYBCH2 está diseñada para hibridar con una sección del plásmido críptico (acceso a Genbank X07547) que tiene una secuencia de:

25 HYBCHRC 5'CTTGGTATACATTTGCAGGCTTG (SEC ID Nº 35) Mímico 5'CTTGGTATACATTTACAGGCTTG (SEC ID Nº 36)

Se describen ensayos adicionales empleando sondas oligonucleotídicas marcadas individualmente para analizar dianas tales como SNP CYP2D6*3, CYP2D6*4, CYP2C19m1, CYP2C19m2, CYP2C9*2 y CYP2C9*3 en el

30 documento WO 01/73118 A2.

TABLA 1 - Tm de las sondas oligonucleotídicas, en MgCl2 3 mM, con dianas completamente complementarias y desapareadas. Los picos de fusión y las Tm se obtuvieron de oligonucleótidos complementarios y secuencias diana amplificadas por PCR. Se incluyen los números de identificación de secuencia para las sondas y las dianas.

Sonda SEC ID Secuencia Tm apareada Tm desapareada

PoliT 37, 38 TTTTTTTTTTTFTTTTTTTTTTT 49,6 -C19m1A 39-41 GATTATTFCCCAGGAACCC 56,6 51,5 HYBNAT3S 16-19 CTTTAAAATACAFTTTTTATTATTA 49,7 42,8 C19m2G 42-44 TACCFGGATCCAGGGGGTG 57,5 47 FVG1 21,24-25 CTGTAFTCCTCGCCTGTCC 59,0 49,5 HEPB 45-46 AAGAACTCCCFCGCCTCGCA 62,3 -PJ18S 47-48 GAGACGAACAACFGCGAAAGC 58,6 -HYBCH2 32, 35 CAAGCCTGCAAAFGTATACCAAG 60,6 -NAT2*5 124, 4-5 GAGAGGAATCFGGTACTTGGACC 61,3 57,1 2303002 1,4-5 GAGAGGAATCFGGTACCTGGACC 52,4 42,3 BamFL1*7 11, 14-15 CCTGGTGAFGAATCCCTTAC 56,7 48,9 HSV1 49-50 GGACACCGGCGCFACTTCACCT 66,0 -DdeFL1*4 6,9-10 GAAGTGCFGAAAAATATATTTAAG 53,5 45,5 2D64C* 51-53 GGGCGFCCTGGGGGTG 60,4 49,3 C9*2T 54-56 CATTGAGGACTGFGTTCAAG 54,8 52,1 C9*2C 55-57 CATTGAGGACCGFGTTCAAG 57,8 48,2 SCT1 26, 29-31 GTGCACCTGACFCCTGTGG 57,9 52,2, 47,6 HYBNG 58-59 TCTGCFTCCGCFACGGCTTC 59,0 -FVG11 60, 24-25 CTGTAFTCCTCGCCFGTCC 55,0 45,0 FVG111 127, 24 CTGTAFTCCFCGCCFGTCC 55,0 -HYBCH 61, 35 CAAGCCFGCAAAFGTATACCAAG 56,0 -G08377 62-63 ATGGGAAFGGGGAFCCAAATAA 50,8 -SP1 64-65 GGGGTCTFCCACTFGGAGAAAGCTATC 56,8 -HYBINF 66-67 GGGAFCCAAAFAACATGGACAGAGCT 52,3 -HYBAdC 68-70 GACGTGGFCCGTGFGCACCAGCCT 65,5 52,5 HYBAdD 69-71 GACGTGGFCAGAGFGCACCAGCCT 62,3 55,4 FVG1ALT 101,24 CTGTATTCCTCGCCFGTCC 61,1 -HYBCH5 102-103 CAAGCCFGCAAAFGTAFACCAAG 55,2 -HYBCH6 104, 103 GTAAFCAAGCCFGCAAAFGTATACCAAG 60,6 -HYBCH7 105, 103 CAAGCCFGCAAATGTATACCAAG 61,7 -

HYBCH8 106, 103 CAAGCCTGCAAATGTAFACCAAG 60,3 - HYBCH9 107, 103 C AAGCCTGCAAAFGTAFACCAAG 57,8 -

HYBCH10 108, 103 CAAGCCFGCAAATGTAFACCAAG 58,3 -HYBCH11 126, 103 GTAAFCAAGCCFGCAAAFGTAFACCAAG 57,9 -HYBMTH 109-111 GTCFGCGGGAGCCGAFTTCATC 63,0 54,5 HYBA1928C 112-114 GACCAGFGAAGCAAGFGTCTTTG 61,0 51,5 HYBFII 115-117 GCATFGAGGCTCGCFGAGAGTC 63,5 54,5

Ejemplo 2: Sondas oligonucleotídicas con marcaje doble a modo de ejemplo de la invención

El análisis del polimorfismo del Factor V Leiden (G1691A) puede realizarse por análisis de fusión usando una sonda

5 oligonucleotídica tal como FVG11 (5'CTGTAFTCCTCGCCFGTCC (SEC ID Nº 60)), donde F son nucleótidos marcados fluorescentes y el nucleótido subrayado es la posición del polimorfismo. La extensión por PCR a partir de la sonda está bloqueada con un fosfato 3'. La secuencia diana que contiene el SNP del factor V puede amplificarse usando cebadores tales como FVF1.3 (5'GGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATC (SEC ID Nº 22)) y FVR3.5 (5'GCCCCATTATTTAGCCAGGAGACCTAACATG (SEC ID Nº 23)). Los alelos completamente complementario 'de

10 tipo silvestre' y desapareado (C:A) 'mutante' pueden detectarse de forma fiable e identificarse basándose en la Tm de la sonda (véase la tabla 1). La sonda FVG1 está diseñada para hibridar con una sección del gen del factor V (acceso a Genbank AY364535) que tiene una secuencia de:

FVG 5'GGACAGGCGAGGAATACAG (SEC ID Nº 24) 15 FVA 5'GGACAGGCAAGGAATACAG (SEC ID Nº 25)

La detección del plásmido críptico de Chlamydia trachomatis puede realizarse por análisis de fusión usando una sonda oligonucleotídica tal como HYBCH (5'CAAGCCFGCAAAFGTATACCAAG (SEC ID Nº 61)), donde F son nucleótidos marcados fluorescentes. La extensión por PCR a partir de la sonda está bloqueada con un fosfato 3'. La 20 secuencia diana del plásmido críptico puede amplificarse usando cebadores tales como CHF3-1 (5'GGGTTCGTTGTAGAGCCATGTCCTATCTTG (SEC ID Nº 33)) y CHR4-1 (5'CGCAGCTGCTGTAATCACCCAGT CGATAAA (SEC ID Nº 34)). El plásmido críptico de Chlamydia y un control de amplificación positiva desapareado

(C:A) pueden detectarse de forma fiable e identificarse basándose en la Tm de la sonda (véase la tabla 1). La sonda

HYBCH2 está diseñada para hibridar con una sección del plásmido críptico (acceso a Genbank X07547) que tiene 25 una secuencia de:

HYBCHRC 5'CTTGGTATACATTTGCAGGCTTG (SEC ID Nº 35) Mímico 5'CTTGGTATACATTTACAGGCTTG (SEC ID Nº 36)

30 La detección del plásmido críptico de Neisseria gonorrhoeae puede realizarse por análisis de fusión usando una sonda oligonucleotídica tal como HYBNG (5'TCTGCFTCCGCFACGGCTTC (SEC ID Nº 58)), donde F son nucleótidos marcados fluorescentes. La extensión por PCR a partir de la sonda está bloqueada con un fosfato 3'. La secuencia diana del plásmido críptico puede amplificarse usando cebadores tales como NGF1 (5'ACTTTGGCGATATTGCTCGG (SEC ID Nº 74)) y NGR1 (5'TACCGAGAACGAACGCGACA (SEC ID Nº 75)). El

35 plásmido críptico gonorrhoeae puede detectarse de forma fiable e identificarse basándose en la Tm de la sonda (tabla 1). La sonda HYBNG está diseñada para hibridar con una sección del plásmido críptico (acceso a Genbank M10316) que tiene una secuencia de:

HYBNGRC 5'GAAGCCGTAGCGGAAGCAGA (SEC ID Nº 59)

40 La detección del gen del hexón en cepas de Adenovirus C y Adenovirus D puede realizarse por análisis de fusión usando los oligonucleótidos de la invención tales como HyBAdC (5'GACGTGGFCCGTGFGCACCAGCCT (SEC ID Nº 68)) y HyBAdD (5'GACGTGGFCAGAGFGCACCAGCCT (SEC ID Nº 71)), donde F son nucleótidos marcados fluorescentes. La extensión por PCR a partir de estas sondas está bloqueada con fosfatos 3'. La secuencia diana del

45 hexón puede amplificarse usando cebadores tales como ADRJC1 (5'GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA (SEC ID Nº 76)) (Elnifro et al., 2000) y PB00432 (5'GCCGAGAAGGGCGTGCGCAGGTA (SEC ID Nº 77)) obtenidas de la base de datos VirOligo. Las cepas de Adenovirus pueden detectarse de forma fiable e identificarse basándose en la Tm de la sonda (véase la tabla 1). La sonda HyBAdC es completamente complementaria a la secuencia de Adenovirus C y muestra desapareamientos tanto C:T como T:T cuando hibrida con la secuencia de Adenovirus D.

50 La sonda HyBAdD es completamente complementario a la secuencia de Adenovirus D y muestra desapareamientos tanto A:G como A:A cuando hibrida con la secuencia de Adenovirus C. Se obtienen variaciones mayores en la temperatura de fusión de la sonda con la sonda HyBAdC (tabla 1). Las sondas de Adenovirus están diseñadas para hibridar con una sección del gen del hexón (acceso a Genbank AJ293905) que tiene una secuencia de:

55 HyBAdCRC 5'AGGCTGCTGCACACGGACCACGTC (SEC ID Nº 69) HyBAdDRC 5'AGGCTGGTGCACTCTGACCACGTC (SEC ID Nº 70)

La detección del gen de la matriz de Influenza A puede realizarse por análisis de fusión usando una sonda oligonucleotídica tal como HYBINF (5'GGGAFCCAAAFAACATGGACAGAGCT (SEC ID Nº 66)), donde F son nucleótidos marcados fluorescentes. La extensión por PCR a partir de la sonda está bloqueada con un fosfato 3'. La secuencia diana de la matriz puede amplificarse usando cebadores tales como INFA-1 (5'GGACTGCAGCGTAGACGCTT (SEC ID Nº 78)) y FLU-4 (5'ATTTCTTTGGCCCCATGGAATGT (SEC ID Nº 79)). Como la Influenza es un virus ARN, se necesita una etapa de transcripción inversa (RT) para la amplificación de la diana. La producción de ADNc, la amplificación por PCR y la detección de la diana pueden realizarse todas en un único recipiente de reacción usando un kit de RT-PCR LightCycler de una etapa de Roche. La Influenza A puede detectarse de forma fiable e identificarse basándose en la Tm de la sonda (tabla 1). La sonda HYBINF está diseñada para hibridar con una sección del gen de la matriz (acceso a Genbank AY130766) que tiene una secuencia de:

INFRC 5'AGCTCTGTCCATGTTATTTGGATCCC (SEC ID Nº 67)

La detección del gen de la neumolisina de Streptococcus pneumoniae puede realizarse por análisis de fusión usando una sonda oligonucleotídica tal como SP1 (5'GGGGTCTFCCACTFGGAGAAAGCTATC (SEC ID Nº 64)), donde F son nucleótidos marcados fluorescentes. También se investigó una versión marcada individualmente de la sonda de Streptococcus (5'GGGGTCTFCCACTTGGAGAAAGCTATC (SEC ID Nº 80)). La extensión por PCR a partir de la sonda está bloqueada con un fosfato 3'. La secuencia diana de la neumolisina puede amplificarse usando cebadores tales como SPF2 (5'CTTGCGGTTGATCGTGCTCCGATGAC (SEC ID Nº 81)) y SPR2 (5'CATTATTGACCTGACCATAATCTTGATGCC (SEC ID Nº 82)). El Streptococcus pneumoniae puede detectarse de forma fiable e identificarse basándose en la Tm de la sonda (tabla 1). La sonda SP1 está diseñada para hibridar con una sección del gen de la neumolisina (acceso a Genbank X52474) que tiene una secuencia de:

SP1RC 5'GATAGCTTTCTCCAAGTGGAAGACCCC (SEC ID Nº 65)

La detección del SNP del Factor II (G20210A) puede realizarse por análisis de fusión usando una sonda oligonucleotídica tal como HYBFII (5'GCATFGAGGCTCGCFGAGAGTC (SEC ID Nº 115)), donde F son nucleótidos marcados fluorescentes y el nucleótido subrayado es la posición del polimorfismo. La extensión por PCR a partir de la sonda está bloqueada con un fosfato 3'. La secuencia diana del Factor II puede amplificarse usando cebadores tales como FIIF2 (5'CTGGGCTCCTGGAACCAATC (SEC ID Nº 118)) y FIIR1 (5'GCTGCCCATGAATAGCACTGG (SEC ID Nº 119)). Los alelos completamente complementario y desapareado (C:A) pueden detectarse de forma fiable e identificarse basándose en la Tm de la sonda (véase la tabla 1). La sonda HYBFII está diseñada para hibridar con una sección del gen del factor II (acceso a Genbank AF493953) que tiene una secuencia de:

FIIRC 5'GACTCTCAGCGAGCCTCAATGC (SEC ID Nº 116) FIIMM 5'GACTCTCAGCAAGCCTCAATGC (SEC ID Nº 117)

La detección del SNP MTHFR (A1928C) puede realizarse por análisis de fusión usando una sonda oligonucleotídica tal como HYBA1928C (5'GACCAGFGAAGCAAGFGTCTTTG (SEC ID Nº 112)), donde F son nucleótidos marcados fluorescentes y el nucleótido subrayado es la posición del polimorfismo. La extensión por PCR a partir de la sonda está bloqueada con un fosfato 3'. La secuencia diana de A1928C puede amplificarse usando cebadores tales como 1928F (5'CCCAAGGAGGAGCTGCTGAA (SEC ID Nº 120)) y 1928R (5' CCATTCCGGTTTGGTTCTCC (SEC ID Nº 121)). Los alelos completamente complementario y desapareado (C:T) pueden detectarse de forma fiable e identificarse basándose en la Tm de la sonda (véase la tabla 1). La sonda HYBA1928C está diseñada para hibridar con una sección del gen de la 5,10-metilenotetrahidrofolato reductasa (acceso a Genbank NM_005957) que tiene una secuencia de:

FIIRC 5'CAAAGACACTTGCTTCACTGGTC (SEC ID Nº 113) FIIMM 5'CAAAGACACTTTCTTCACTGGTC (SEC ID Nº 114)

La detección del SNP MTHFR (C677T) puede realizarse por análisis de fusión usando una sonda oligonucleotídica tal como HYBMTH (5'GTCFGCGGGAGCCGAFTTCATC (SEC ID Nº 112)), donde F son nucleótidos marcados fluorescentes y el nucleótido subrayado es la posición del polimorfismo. La extensión por PCR a partir de la sonda está bloqueada con un fosfato 3'. La secuencia diana de C677T puede amplificarse usando cebadores tales como MTHF2 (5'CTGACCTGAAGCACTTGAAGGAG (SEC ID Nº 122)) y MTHR2 (5'GCGGAAGAATGTGTCAGCCTC AAAG (SEC ID Nº 123)). Los alelos completamente complementario y desapareado (C:A) pueden detectarse de forma fiable e identificarse basándose en la Tm de la sonda (véase la tabla 1). La sonda HYBMTH está diseñada para hibridar con una sección del gen de la 5,10-metilenotetrahidrofolato reductasa (acceso a Genbank NM_005957) que tiene una secuencia de:

FIIRC 5'CAAAGACACTTGCTTCACTGGTC (SEC ID Nº 110) FIIMM 5'CAAAGACACTTTCTTCACTGGTC (SEC ID Nº 129)

Ejemplo 3: Análisis directo de muestras de saliva

Se analizó una serie de muestras de saliva con los cebadores de MTHFR (A1928C) y la sonda, como se ha descrito anteriormente, sin purificación de ADN. Se incluyeron enjuagados bucales, que comprenden aproximadamente el 50 % de saliva en agua, directamente en los ensayos. También pueden analizarse directamente hisopos bucales expresados en agua. La sonda HYBA1928C genera picos individuales de fusión con Tm de aproximadamente 51,5 ºC y 61 ºC con muestras homocigóticas para los alelos A y C respectivamente (Figura 2). Las muestras de saliva que son heterocigóticas para los alelos A y C se identifican claramente mediante la generación de picos tanto de 51,5 ºC como de 61 ºC. La detección e identificación de las dianas polinucleotídicas también se ha conseguido directamente a partir de sangre sin la necesidad de purificación de ADN.

Ejemplo 4: Detección rápida de la diana usando sondas con marcaje doble y triple

Las dianas del plásmido críptico de Chlamydia pueden amplificarse usando los cebadores CHF3-1 (SEC ID Nº 33) y CHR4-1 (SEC ID Nº 34). Los ensayos emplean protocolos LightCycler de 3 fases que consisten en una desnaturalización inicial (95 ºC 1 min.) seguida de 50 ciclos de PCR que comprenden desnaturalización (95 ºC 5 s), hibridación de cebador (55 ºC 10 s) y extensión de productos (72 ºC 10 s). La diana amplificada se detecta y caracteriza a través de la inclusión de las sondas HYBCH (SEC ID Nº 61) o HYBCH6 (SEC ID Nº 104) y del análisis de la curva de fusión que comprende desnaturalización (95 ºC 0 s), enfriamiento (35 ºC 30 s) y un lento calentamiento hacia 95 ºC usando una velocidad de transición de 0,2 ºC/s. En presencia de ADN de Chlamydia, las sondas HYBCH y HYBCH6 generar claros picos de fusión con Tm de aproximadamente 56 ºC y 60,5 ºC respectivamente. Los ensayos usando los oligonucléotidos de la invención han detectado la presencia de Chlamydia en ADN purificados, orinas netas, orinas procesadas (Becton Dickinson, Oxford, R.U.) e hisopos y muestras líquidas pipeteadas directamente de los frotis (Figura 4).

Las dianas del plásmido gonorrhoeae se amplifican usando los cebadores NGF1 (SEC ID Nº 74) y NGR1 (SEC ID Nº 75). Los ensayos emplean protocolos LightCycler de 3 fases que consisten en una desnaturalización inicial (95 ºC 1 min.) seguida de 50 ciclos de PCR que comprenden desnaturalización (95 ºC 5 s), hibridación de cebador (55 ºC 10 s) y extensión de productos (72 ºC 10 s). La diana amplificada se detecta y caracteriza a través de la inclusión de la sonda HYBNG (SEC ID Nº 58) y el análisis de la curva de fusión que comprende desnaturalización (95 ºC 0 s), enfriamiento (35 ºC 30 s) y un lento calentamiento hacia 95 ºC usando una velocidad de transición de 0,2 ºC/s. En presencia de ADN de gonorrhoeae, la sonda HYBNG genera claros picos de fusión con Tm de aproximadamente 59 ºC (Figura 5).

Ejemplo 5: Comparación de sondas marcadas individualmente y con marcaje doble

Las dianas del Factor V se amplifican directamente de muestras de saliva, sin purificación de ADN, usando los cebadores FVF1.3 (SEC ID Nº 22) y FVR3.5 (SEC ID Nº 23)). Los ensayos emplean protocolos LightCycler de 2 fases que consisten en una desnaturalización inicial (95 ºC 1 min.) seguida de 50 ciclos de PCR que comprenden desnaturalización (95 ºC 1 s) y fases combinadas de hibridación/extensión (65 ºC 5 s). La diana amplificada se detecta y caracteriza a través de la inclusión de las sondas oligonucleotídicas FVG1 (SEC ID Nº 21) o FVG11 (SEC ID Nº 60) y el análisis de la curva de fusión que comprende desnaturalización (95 ºC 0 s), enfriamiento (35 ºC 30 s) y un lento calentamiento hacia 95 ºC usando una velocidad de transición de 0,2 ºC/s. Los ensayos del Factor V pueden completarse en tan solo 16 minutos. Las muestras de tipo silvestre homocigóticas producen picos de fusión individuales que poseen Tm de aproximadamente 59 ºC y 55 ºC cuando se emplean las sondas FVG1 y FVG11 respectivamente. Las muestras mutantes homocigóticas generan picos de fusión individuales que poseen Tm de aproximadamente 49,5 ºC y 45 ºC cuando se emplean las sondas FVG1 y FVG11 respectivamente. Las muestras heterocigóticas de Factor V producen picos de fusión tanto de 59 ºC como de 49,5 ºC cuando se usa la sonda FVG1 marcada individualmente y generan picos tanto de 55 ºC como de 45 ºC cuando se emplea la sonda FVG11 con marcaje doble (Figura 6). Los ensayos funcionan de forma eficaz con ADN purificados, muestras de frotis y lavados bucales. Se ha tipado de forma fiable más de 450 muestras genómicas, con respecto al polimorfismo del Factor V, usando las sondas FVG1 y FVG11.

La sonda con marcaje doble no muestra niveles mayores de señales de fondo, en comparación con la sonda marcada individualmente, en estado monocatenario. Sin embargo, la sonda FVG11 con marcaje doble produce picos de fusión que son aproximadamente cuatro veces el tamaño de los generados con la sonda FVG1 marcada individualmente, lo que es significativamente mayor que lo que se esperaría si el efecto del fluoróforo adicional fuera simplemente aditivo. El fluoróforo adicional en FVG11 reduce la Tm de la sonda en aproximadamente 4,5 ºC en comparación con la sonda FVG1 marcada individualmente (Figura 3). Se observa una reducción similar en la Tm con las sondas HYBCH2 marcada individualmente (SEC ID Nº 32) y HYBCH con marcaje doble (SEC ID Nº 61) de Chlamydia (Figura 11).

Ejemplo 6: Señal de la sonda-a-ruido

La cantidad de emisión de fluorescencia desde los oligonucléotidos de la invención se midió en estado monocatenario y bicatenario para investigar el efecto de la secuencia de la sonda, la colocación del fluoróforo y el marcaje doble/triple. Normalmente se hibridaron 150 nM de la sonda con 150 nM del oligonucleótido completamente complementario, en tampón TaKaRa, para determinar la proporción de señal-a-ruido de los oligonucléotidos de la invención. Las mediciones de la fluorescencia se hicieron usando un protocolo de curva de fusión LightCycler que comprende desnaturalización (95 ºC 0 s), enfriamiento (35 ºC 30 s) y un lento calentamiento hasta 95 ºC usando una velocidad de transición de 0,2 ºC/s. Los valores de fluorescencia se obtuvieron de las curvas de fusión a temperaturas de Tm de sonda más y menos 10 ºC para los estados disociado e hibridado respectivamente (Figura 7). Las mediciones de fluorescencia se hicieron sobre este intervalo de temperatura definido en un intento de eliminar algunos de los efectos que la temperatura tiene sobre la cantidad de emisión. Los valores de fluorescencia hibridada y disociada proporcionan una medida de la proporción de señal-a-ruido y una indicación del efecto de la hibridación de la sonda sobre la emisión (tabla 2), donde la proporción de señal-a-ruido se calcula como la señal hibridada dividida por la señal disociada. Se ha descubierto que las proporciones de señal-a-ruido son muy reproducibles y muestran baja variación entre ejecuciones y entre instrumentos.

La sonda FVG1 marcada individualmente (SEC ID Nº 21) posee una Tm de aproximadamente 59 ºC cuando hibrida con la secuencia diana completamente complementaria (SEC ID Nº 24) y muestra niveles de fluorescencia de 8 y 6 (unidades arbitrarias de fluorescencia LightCycler) a 49 ºC y 69 ºC respectivamente. La sonda FVG11 con marcaje doble (SEC ID Nº 60)) posee una Tm de aproximadamente 55 ºC cuando hibrida con la secuencia diana completamente complementaria y muestra niveles de fluorescencia de 21,8 y 12 a 45 ºC y 65 ºC respectivamente. Las proporciones de señal-a-ruido de las sondas con marcaje individual y doble del factor V se calculan como 1,33 y 1,82 respectivamente.

Las sondas con marcaje doble pueden mostrar niveles mayores de ruido de fluorescencia de fondo en comparación con las sondas marcada individualmente equivalentes. Sin embargo, a pesar del elevado ruido de fondo, las sondas con marcaje doble producen coherentemente proporciones de señal-a-ruido y alturas de pico de fusión considerablemente mayores. Con dianas oligonucleotídicas, las sondas marcadas individualmente han producido aumentos de emisión entre el 20 % y el 92 %. Mientras que las sondas con marcaje doble han demostrado aumentos de fluorescencia entre el 71 % y 199 %. La hibridación de sonda FVG11 150 nM con el oligonucleótido complementario FVG (SEC ID Nº 24) produce una fluorescencia de fondo aproximadamente dos veces mayor (a 90 ºC) que la hibridación de sonda FVG1 150 nM (Figura 8). Sin embargo, la función de corrección del fondo del software LightCycler demuestra que el pico de marcaje doble es aproximadamente cinco veces mayor en altura que el pico de la sonda marcada individualmente equivalente con dianas oligonucleotídicas (Figuras 3 y 8). Los datos corregidos del fondo derivados de muestras de ADN portadoras de Factor V heterocigótico demuestran que la sonda con marcaje doble produce dos picos de fusión que son cada uno aproximadamente tres veces la altura de los picos generados con la sonda marcada individualmente en ensayos de amplificación de diana (Figura 9).

Fluoróforos flanqueados por nucleótidos de guanina

Dado que las bases de guanina son inactivadores eficaces de la fluorescencia, puede esperarse que fluoróforos flanqueados por G estén inactivados de forma eficaz cuando las sondas estén en estado disociado y puede esperarse que la emisión de fluorescencia se aumente considerablemente tras la hibridación de la sonda. Todas las sondas que contienen fluoróforos internos adyacentes a G (5', 3' o ambas posiciones) han mostrado potenciación de la señal tras hibridación con la diana (tabla 2). Las sondas oligonucleotídicas C9*2C (SEC ID Nº 55), 136A (SEC ID Nº 83) y HYBA1928C (SEC ID Nº 112) son buenos ejemplos de sondas con marcadores fluorescentes posicionados entre dos nucleótidos G. La proporción de señal-a-ruido de C9*2C es comparable a la sonda 2D64C* (SEC ID Nº 51), cuyo fluoróforo está adyacente a una única G pero es muy rica en G en general. La sonda DdeFL1*4 rica en A/T (SEC ID Nº 6) también muestra una proporción similar de señal-a-ruido y posee un único nucleótido G adyacente al fluoróforo. La colocación de fluoróforos adyacentes a restos G es muy probable, aunque no es necesario, que genere grandes alturas de pico y proporciones de señal-a-ruido. La ausencia de restos G en localizaciones adecuadas dentro de la sonda no es problemática ya que las sondas producen señales de hibridación eficaces cuando los fluoróforos se colocan en todos los entornos de secuencia. Aunque este ejemplo muestra oligonucléotidos marcados individualmente, así como oligonucléotidos de la invención, no obstante demuestra que es la independencia de la secuencia diana, y no una interacción entre fluoróforos, lo que causa la potenciación independiente de secuencia de la fluorescencia tras la hibridación con la diana.

Fluoróforos flanqueados por nucleótidos de citosina

Si los restos de guanina en secuencias diana tienen la capacidad de causar inactivación de la fluorescencia, puede esperarse que la emisión desde fluoróforos flanqueados por restos C disminuya tras la hibridación con la diana. Sin embargo, todas las sondas oligonucleotídicas con fluoróforos adyacentes a restos C, tales como HYBNG (SEC ID Nº 58), 171R (SEC ID Nº 85), C19m1A (SEC ID Nº 39), SCT1 (SEC ID Nº 26) y SP2 (SEC ID Nº 80), han mostrado potenciación de la fluorescencia tras la hibridación con la sonda. Incluso sondas oligonucleotídicas altamente ricas en C, tales como HEPB (SEC ID Nº 45) y FVG2 (5'GTATFCCTCGCCTGTCCAG (SEC ID Nº 87)), emiten niveles mayores de fluorescencia cuando hibridan con las dianas que cuando son monocatenarias. La potenciación de la fluorescencia tras la hibridación de la sonda parece ser independiente de la presencia de nucleótidos de guanina en la secuencia diana, como se había predicho por modelado molecular, lo que indica que los fluoróforos no interaccionan con ADN dúplex.

Fluoróforos flanqueados por nucleótidos de adenina y timina

Las sondas oligonucleotídicas con fluoróforos situados entre restos A y T también muestran potenciación de la emisión de fluorescencia tras la hibridación con la diana. Las sondas NAT2*6 (SEC ID Nº 88), HYBNAT3S (SEC ID Nº 16) y FVG1 (SEC ID Nº 21) son buenos ejemplos de sondas cuyas bases marcadas con fluoróforo están rodeadas por nucleótidos de A y T. Una sonda PoliT construida artificialmente (5'TTTTTTTTTTTFTTTTTTTTTTT (SEC ID Nº 37)) presenta niveles aumentados de emisión de fluorescencia cuando hibridan con secuencias diana, en comparación con el estado monocatenario, a pesar de la ausencia completa de nucleótidos de G tanto en la

5 sonda como en la hebra diana. Estos oligonucléotidos contienen un único fluoróforo y por esto no son oligonucléotidos de la invención. No obstante, demuestra la independencia de secuencia de la naturaleza fluorescente de las sondas.

Potencia de la señal y contexto de secuencia de la unión del fluoróforo

10 Los datos de la tabla 2 demuestran que la funcionalidad de la sonda no es dependiente de la presencia de restos de guanina en la sonda o las secuencias diana. Hay, sin embargo, una posible asociación entre las mayores proporciones de señal-a-ruido y la presencia de G en posiciones de la sonda inmediatamente adyacentes al fluoróforo. Para sondas marcadas individualmente, muchas de las grandes proporciones de señal-a-ruido derivan de

15 sondas con fluoróforos flanqueados por bases de guanina. Sin embargo, la mayor proporción de señal-a-ruido con marcaje individual se obtuvo de un oligonucleótido que poseía un fluoróforo flanqueado por nucleótidos de A y C (SEC ID Nº 85).

Las sondas con fluoróforos flanqueados por bases A, C y T han producido mayores señales que varias sondas con

20 nucleótidos G directamente adyacentes a la base marcada con fluoróforo. Además, todas las sondas oligonucleotídicas con marcaje individual, doble, y múltiple han mostrado niveles potenciados de emisión de fluorescencia tras la hibridación con la diana independientemente de la secuencia flanqueante de los fluoróforos internos. Por lo tanto, aunque pueden obtenerse picos de fusión más grandes situando nucleótidos marcados con fluoróforo adyacentes a restos de guanina, pueden obtenerse picos de fusión de alta calidad sin la necesidad de

25 restos G en sitios específicos en la secuencia de la sonda. Aunque estos oligonucléotidos contienen un único fluoróforo, demuestran la independencia de secuencia y también ayudarán al espaciado óptimo en ciertos contextos de secuencia.

Independencia de secuencia diana

30 El análisis de la curva de fusión LightCycler sugiere firmemente que la secuencia de la diana tiene poco o ningún efecto sobre la funcionalidad de las sondas oligonucleotídicas. Si los fluoróforos de las sondas oligonucleotídicas se proyectan en solución tras la hibridación, de modo que no interaccionen con ADN dúplex, los fluoróforos pueden posicionarse en regiones altamente ricas en C de la sonda sin inactivarse por los nucleótidos G de la diana. Todas

35 las sondas oligonucleotídicas con marcaje individual y doble diseñadas hasta la fecha muestran niveles potenciados de fluorescencia tras la hibridación relativos al estado monocatenario independientemente de la secuencia de la sonda y los nucleótidos que flanquean las bases marcadas con fluoróforo.

TABLA 2 - Proporciones de señal-a-ruido obtenidas de la hibridación de sondas oligonucleotídicas 150 nM con

40 oligonucléotidos completamente complementarios. Se proporcionan los números de identificación de secuencia para las sondas y las dianas. Las proporciones de señal-a-ruido se clasifican desde la más baja hasta la más alta. Las curvas de fusión se generaron todas usando un único instrumento LightCycler (LC2).

Sonda SEC ID Secuencia Proporción de señal-a-ruido

NAT2*6 88, 89 CTTCAAFTGTTTGAGGTTCAAG 1,26 poliT 37-38 TTTTTTTTTTTFTTTTTTTTTTT 1,27 C19m1A 39-40 GATTATTFCCCAGGAACCC 1,29 HYBNAT3S 16-17 CTTTAAAATACAFTTTTTATTATTA 1,28 C19m2G 42-43 TACCFGGATCCAGGGGGTG 1,33 FVG1 21, 24 CTGTAFTCCTCGCCTGTCC 1,33 HYBCH8 106, 103 CAAGCCTGCAAATGTAPACCAAG 1,33 HEPB 45-46 AAGAACTCCCFCGCCTCGCA 1,36 SP2 80, 65 GGGGTCTFCCACTTGGAGAAAG 1,36 PJ18S 47-48 GAGACGAACAACFGCGAAAGC 1,42 HYBCH2 32, 35 CAAGCCTGCAAAFGTATACCAAG 1,44 FVG1ALT 101,24 CTGTATTCCTCGCCFGTCC 1,48 FVG1ALT2 128, 24 CTGTATTCCFCGCCTGTCC 1,50 NAT2*5 124, 4 GAGAGGAATCFGGTACTTGGACC 1,52 BamFL1*7 11, 14 CCTGGTGAFGAATCCCTTAC 1,53 HYBCH7 105, 103 CAAGCCFGCAAATGTATACCAAG 1,54 HSV1 49-50 GGACACCGGCGCFACTTCACCT 1,56 DdeFL1*4 6, 9 GAAGTGCFGAAAAATATATTTAAG 1,56 2D64C* 51-52 GGGCGFCCTGGGGGTG 1,63 C9*2T 54-55 CATTGAGGACTGFGTTCAAG 1,63 C9*2C 56-57 CATTGAGGACCGFGTTCAAG 1,67 HYBSTR 91, 86 GGTGGATAGAFAGATAGAFAG 1,71 ATAGATAGATAGATAGATAGA TAGATAGATAGATAGATA

HYBCH10 108, 103 CAAGCCFGCAAATGTAFACCAAG 1,74 HYBNG 58-59 TCTGCFTCCGCFACGGCTTC 1,78 FVG11 60, 24 CTGTAFTCCTCGCCFGTCC 1,82 136A 83-84 GGGAAGFGCCATGAGCAG 1,83 HYBMTH 109-110 GTCFGCGGGAGCCGAFTTCATC 1,84 HYBCH 61, 35 CAAGCCFGCAAAFGTATACCAAG 1,91 HYBCH9 107, 103 CAAGCCTGCAAAFGTAFACCAAG 1,92 171R 85-86 CAGTGGAFCGGTATAGTAAC 1,92 G08377 62, 63 ATGGGAAFGGGGAFCCAAATAA 1,93 SP1 64-65 GGGGTCTFCCACTFGGAGAAAGCTATC 1,94 HYBINF 66-67 GGGAFCCAAAFAACATGGACAGAGCT 1,95 HYBMRSA 99-100 CGTAGFTACTGCGTFGTAAGACGTC 2,07 HYBA1928C 112-113 GACCAGFGAAGCAAGFGTCTTTG 2,14 HYBFII 115-116 GCATFGAGGCTCGCFGAGAGTC 2,36 HYBCH5 102-103 CAAGCCFGCAAAFGTAFACCAAG 2,38 HYBCH6 103-104 GTAAFCAAGCCFGCAAAFGTATACCAAG 2,38 HYBAdC 68-69 GACGTGGFCCGTGFGCACCAGCCT 2,88 HYBCH11 126, 103 GTAAFCAAGCCFGCAAAFGTAFACCAAG 2,90 HYBAdD 70-71 GACGTGGFCAGAGFGCACCAGCCT 2,99 FVG111 127, 24 CTGTAFTCCFCGCCFGTCC 3,14

La medición de la absorción de UV-visible y los espectros de fluorescencia (Marks et al. (2005)) demuestra que hay una desplazamiento al azul de aproximadamente 4 nm y un aumento en la intensidad en la hibridación de las sondas oligonucleotídicas con secuencias diana complementarias. Las propiedades de fluorescencia del colorante FAMCAP 5 libres son más parecidas a las del dúplex sonda/diana. La incorporación de FAMCAP en construcciones sonda de ADN causa un desplazamiento al rojo en la Xmáx de excitación y emisión. El desplazamiento al rojo sugiere una posible interacción del fluoróforo con ADNmc, que puede incluir interacciones de apilamiento 1-1 entre el colorante y las bases de ADN. Los resultados de Marks et al. también sugieren que los fluoróforos no interaccionan con el ADN bicatenario por intercalación o unión en el surco ya que estas interacciones causarían un fuerte desplazamiento al 10 rojo tras la hibridación. Por lo tanto, puede haber una interacción entre el fluoróforo y las bases de la sonda de ADN monocatenario que causa inactivación de la fluorescencia. Esta interacción entre el fluoróforo y el ADN sonda se elimina tras la hibridación con la diana de modo que el colorante se proyecta en solución y se potencia la fluorescencia. No se espera que este mecanismo de potenciación de la fluorescencia funcione con sondas marcadas de forma terminal ya que el apilamiento de bases puede suceder sobre solamente un lado del fluoróforo. Los datos

15 indican que los aumentos de fluorescencia de la sonda oligonucleotídica están causados por la eliminación de la inactivación en lugar de por la potenciación de la fluorescencia. Este modelo de la funcionalidad de la sonda también apoya nuestra proposición de que las señales de la sonda son independientes de la secuencia de la diana, de modo que los fluoróforos pueden posicionarse incluso en regiones ricas en C y aún mostrar niveles potenciados de fluorescencia tras la hibridación con la diana.

Ejemplo 7: Alturas de pico

También se midieron las alturas de pico de sondas con marcaje individual, doble y triple para investigar el efecto de la secuencia de la sonda, la colocación del fluoróforo y múltiples fluoróforos. Las mediciones de las alturas de pico 25 son ligeramente menos fiables que las proporciones de señal-a-ruido para comparaciones de sondas debido a las variaciones entre ejecuciones y entre instrumentos. Sin embargo, los picos de fusión generados en un único experimento LightCycler pueden emplearse para comparar de forma fiable secuencias de sonda. Normalmente se hibridaron 150 nM de sonda con 150 nM de oligonucleótido completamente complementario en tampón TaKaRa. Las mediciones de fluorescencia se hicieron usando un protocolo de curva de fusión LightCycler que comprendía 30 desnaturalización (95 ºC 0 s), enfriamiento (35 ºC 30 s) y un lento calentamiento hasta 95 ºC usando una velocidad de transición de 0,2 ºC/s. Los datos de los picos de fusión obtenidos solamente con el software LightCycler versión

3.5 se han incluido en la tabla 3. La versión 3.01 del software LightCycler requirió que el usuario estableciera la ganancia de fluorescencia manualmente. Mientras que la versión 3,5 del el software determina automáticamente los niveles de fluorescencia relativos a la muestra que presenta el mayor nivel de emisión.

35 Todos los oligonucléotidos de la invención muestras picos de fusión positivos cuando se representa -dF/dT sobre el eje y frente a la temperatura en el eje x, independientemente de las secuencias de la sonda y la diana y la posición de las G en las mismas. La colocación de fluoróforos individuales, en la secuencia de sonda del Factor V, entre bases A y T (FVG1) y entre bases C y G (FVG1ALT) produce picos de fusión de aproximadamente la misma altura.

40 La sonda del Factor V con marcaje doble (FVG11) produce picos de fusión que son aproximadamente cuatro veces la altura de los generados con las dos sondas marcadas individualmente FVG1 y FVG1ALT (tabla 3). La suma de las alturas de pico con marcaje individual es menor que la mostrada por la sonda con marcaje doble. Además, el empleo de 75 nM o 150 nM de ambas sondas marcadas individualmente en un único recipiente de reacción también produce picos de fusión que son más pequeños que los generados por las sondas oligonucleotídicas con marcaje doble. Una

interacción entre las bases marcadas con fluoróforo puede ser responsable de la proporción de señal-a-ruido potenciada y las alturas de los picos de fusión, haciendo que la sonda con marcaje doble sea mayor que la suma de las dos sondas marcadas individualmente. Se obtiene potenciación adicional de la señal de sondas con marcaje triple (véase a continuación). La localización y grado de separación de los fluoróforos en las sondas puede afectar a 5 la magnitud del cambio de fluorescencia tras la hibridación y disociación de la diana. Las sondas marcadas individualmente poseen Tm reducidas en comparación con oligonucléotidos no marcados y sondas con marcaje doble muestran coherentemente Tm reducidas en comparación con sondas marcadas individualmente equivalentes (tabla 1). Como se cree que los fluoróforos se proyectan en solución tras la hibridación con la diana, no interaccionando de este modo con el ADN dúplex, se cree que los fluoróforos estabilizan las especies de sonda 10 monocatenaria en lugar de desestabilizar el dúplex. Se cree que las sondas con marcaje múltiple estabilizan las estructuras de sonda monocatenaria más que las sondas oligonucleotídicas marcadas individualmente equivalentes. Las sondas con marcaje doble y múltiple frecuentemente muestran niveles inferiores de ruido de fluorescencia que lo esperado (tabla 5) debido a las estructuras monocatenarias estabilizadas e inactivadas de forma eficaz. Los fondos reducidos y las señales aumentadas de las sondas con marcaje doble y múltiple dan logar a mayores alturas

15 de pico y proporciones de señal-a-ruido en comparación con oligonucléotidos marcados individualmente equivalentes.

Ejemplo 8: Comparación de sondas marcadas de forma interna y terminal

20 Las secuencias diana del Factor V se amplificaron usando los cebadores FVF1 (5'GACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAG (SEC ID Nº 92)) y FVR3 (5'CCATTATTTAGCCAGGAGAC (SEC ID Nº 93)). Los ensayos emplearon protocolos LightCycler de 3 fases que consisten en una desnaturalización inicial (95 ºC 1 min.) seguida de 50 ciclos de PCR que comprenden desnaturalización (95 ºC 0 s), hibridación de cebador (55 ºC 10 s) y extensión de productos (72 ºC 10 s). La diana amplificada se detectó y caracterizó a través de la inclusión de las

25 sondas marcadas de forma terminal FV3 (5'CTGTATTCCTCGCCTGTCCF (SEC ID Nº 94)) o FV5 (5'FCTGTATTCCTCGCCTGTCC (SEC ID Nº 95)) y el análisis de la curva de fusión que comprende desnaturalización (95 ºC 0 s), enfriamiento (35 ºC 30 s) y un lento calentamiento hacia 95 ºC usando una velocidad de transición de 0,1 ºC/s. La sonda FV3 marcada en 3' fue completamente no funcional, no produciendo ningún pico en los análisis de curva de fusión. La medición de los espectros de emisión de la sonda verificó una eficaz síntesis

30 del oligonucleótido y unión del fluoróforo. La sonda FV5, que posee una unión 5'-FAM, mostró una reducción en la emisión de fluorescencia tras la hibridación con la diana. La sonda FV5 generó picos de fusión invertidos en los diagramas de -dF/dT (Figura 10) que permitieron la identificación de muestras homocigóticas y heterocigóticas. Los picos de fusión invertidos obtenidos de la sonda marcada en 5' fueron de magnitud similar a las alturas de los picos obtenidos de la sonda FVG1 marcada individualmente del Factor V (Figura 10).

35 5'CTGTATTCCTCGCCTGTCC3' (secuencia de la sonda del Factor V; SEC ID Nº 140) 3'ATGGACATAAGGAGCGGACAGGTCC5' (Secuencia diana; SEC ID Nº 141)

La sonda marcada en 5' sitúa el fluoróforo en cercana proximidad a restos G, en las posiciones 0 y +1, tras la

40 hibridación con la secuencia diana, lo que explica la reducción observada en la emisión de fluorescencia. La sonda marcada en 3' también sitúa el fluoróforo en proximidad a restos G, en las posiciones 0 y -1, pero la fluorescencia ni se potenció ni se inactivó tras la hibridación.

TABLA 3 - Alturas de los picos de fusión obtenidas de la hibridación de sondas oligonucleotídicas 150 nM con

45 oligonucléotidos completamente complementarios. Se proporcionan los números de identificación de secuencia para las sondas y las dianas. Las alturas de pico se clasifican desde la más baja hasta la más alta. Todos los picos fueron positivos cuando se representaba la derivada negativa de la fluorescencia con respecto a la temperatura (-dF/dT) frente a la temperatura en el eje y y x respectivamente. Todos los picos de fusión se obtuvieron usando un único LightCycler (LC2) para evitar la variabilidad entre instrumentos.

Sonda SEC ID Secuencia Altura de pico (Versión 3.5)

HSV1 49-50 GGACACCGGCGCFACTTCACCT 0,16 poliT 37-38 TTTTTTTTTTTFTTTTTTTTTTT 0,18 C19m2G 42-43 TACCFGGATCCAGGGGGTG 0,22 FVG1ALT 101, 24 CTGTATTCCTCGCCFGTCC 0,25 FVG1 21-24 CTGTAFTCCTCGCCTGTCC 0,28 NAT2*6 88-89 CTTCAAFTGTTTGAGGTTCAAG 0,3 2D64C* 51-52 GGGCGFCCTGGGGGTG 0,3 FVG1ALT2 128, 24 CTGTATTCCFCGCCTGTCC 0,31 HYBCH8 105, 103 CAAGCCTGCAAATGTAFACCAAG 0,33 DdeFL1*4 6, 9 GAAGTGCFGAAAAATATATTTAAG 0,34 HYBNAT3S 16-17 CTTTAAAATACAFTTTTTATTATTA 0,34 PJ18S 47-48 GAGACGAACAACFGCGAAAGC 0,36 HEPB 45-46 AAGAACTCCCFCGCCTCGCA 0,38 C19m1A 39-40 GATTATTFCCCAGGAACCC 0,43 136A 83-84 GGGAAGFGCCATGAGCAG 0,45

G08377 62-63 ATGGGAAFGGGGAFCCAAATAA 0,5 HYBCH7 105, 103 GAAGCCFGCAAATGTATACCAAG 0,52

HYBINF 66-67 GGGAFCCAAAFAACATGGACAGAGCT 0,53 C9*2T 54-55 CATTGAGGACTGFGTTCAAG 0,59 NAT2*5 124,4 GAGAGGAATCFGGTACTTGGACC 0,64 C9*2C 56-57 CATTGAGGACCGFGTTCAAG 0,65 BamFL1*7 11, 14 CCTGGTGAFGAATCCCTTAC 0,67 171R 85-86 CAGTGGAFCGGTATAGTAAC 0,75 HYBCH2 32, 35 CAAGCCTGCAAAFGTATACCAAG 0,8 HYBNG 58-59 TCTGCFTCCGCFACGGCTTC 0,8 HYBSTR 91, 86 GGTGGATAGAFAGATAGAFAG 0,9

ATAGATAGATAGATAGATAGA

TAGATAGATAGATAGATA HYBMTH 109-110 GTCFGCGGGAGCCGAFTTCATC 1,18 FVG11 60, 24 CTGTAFTCCTCGCCFGTCC 1,2 HYBCH10 108, 103 CAAGCCFGCAAATGTAFACCAAG 1,24 HYBCH 61, 35 CAAGCCFGCAAAFGTATACCAAG 1,50 HYBCH9 107, 103 CAAGCCTGCAAAFGTAFACCAAG 1,59 HYBFII 115-116 GCATFGAGGCTCGCFGAGAGTC 1,59 HYBA1928C 112-113 GACCAGFGAAGCAAGFGTCTTTG 1,62 HYBMRSA 99-100 CGTAGFTACTGCGTFGTAAGACGTC 2,0 FVG111 127, 24 CTGTAFTCCFCGCCFGTCC 2,2 HYBAdD 68-69 GACGTGGFCAGAGFGCACCAGCCT 2,4 HYBCH5 102-103 CAAGCCFGCAAAFGTAFACCAAG 2,6 HYBCH6 103-104 GTAAFCAAGCCFGCAAAFGTATACCAAG 2,6 HYBAdC 70-71 GACGTGGFCCGTGFGCACCAGCCT 3,4 HYBCH11 126, 103 GTAAFCAAGCCFGCAAAFGTAFACCAAG 3,5

Los fluoróforos unidos a restos internos de los oligonucléotidos de la invención se inactivan en estado monocatenario y la hibridación libera una proporción de esta inactivación. La inactivación en la sonda monocatenaria puede surgir porque las bases del ADN pueden apilarse sobre el grupo fluorescente cuando no están formando

5 pares de bases. En la forma monocatenaria el fluoróforo se emparedará entre dos bases de ADN que forman una estructura hidrófoba bastante estable. Ésta se descompondrá con la formación del dúplex ya que las bases tienen que participar en el apareamiento de base. El fenómeno no puede ser simplemente "inactivación por guanina", aunque las guanines posiblemente tendrían una influencia mayor que otras bases.

10 La situación con los marcadores terminales es diferente, ya que el apilamiento de bases puede suceder solamente en un lado del fluoróforo. En la hebra sencilla (y en el dúplex) el fluoróforo no se emparedará entre bases de ADN, sino que se apilará solamente en una base. La inactivación tras la hibridación puede suceder si el fluoróforo se sitúa en cercana proximidad a bases de guanina en la hebra diana. A la inversa, la potenciación de la fluorescencia puede suceder en la hibridación si los fluoróforos están unidos a restos G terminales de la sonda. Los marcadores internos

15 de las sondas oligonucleotídicas se ven afectados considerablemente menos por las secuencias de la sonda y la diana y siempre muestran aumentos de fluorescencia tras la hibridación independientemente de la posición de las guanines en el dúplex. Las sondas con marcaje terminal están influidas por los oligonucléotidos en la secuencia diana y pueden mostrar niveles aumentados o disminuidos de fluorescencia tras la hibridación con la diana. Los oligonucléotidos con marcaje doble de la invención muestran niveles aumentados de fluorescencia en hibridación

20 debido a la independencia de secuencia diana y no a una interacción entre fluoróforos.

Ejemplo 9: Potencia de la señal y espaciado de fluoróforos en sondas con marcaje múltiple

Puede esperarse que la incorporación de fluoróforos adicionales en secuencias de sondas oligonucleotídicas

25 aumente la emisión de la sonda tanto en estado hibridado (señal) como monocatenario (ruido), manteniendo de este modo la proporción de señal-a-ruido. Como alternativa, como los colorantes FAM pueden realmente inactivarse entre sí cuando están en proximidad, el marcaje de sondas con múltiples fluoróforos puede causar el deterioro de la proporción de señal-a-ruido. Sin embargo, las proporciones de señal-a-ruido y las alturas de los picos de fusión de la sonda se han mejorado considerablemente a través de la inclusión de dos o más colorantes FAM en las secuencias

30 de las sondas oligonucleotídicas. Todas las sondas descritas anteriormente utilizan C6 FAM dU o fluoresceína dT Glen para remplazar nucleótidos de timina y los fluoróforos en estas sondas se separan por al menos tres nucleótidos. La inclusión de fluoróforos adicionales en los oligonucléotidos de la invención (por ejemplo, 3 ó 4 marcadores FAM) puede potenciar adicionalmente las proporciones de señal-a-ruido y las alturas de los picos de fusión. Sin embargo, las bases marcadas con fluoróforo deben separarse por una cantidad mínima de nucleótidos

35 para evitar la inactivación directa entre fluoróforos por transferencia de energía no radiante. Esta inactivación no FRET puede suceder a través de 'contactos' de corto intervalo entre los colorantes y no requiere el solapamiento de los espectros de excitación y emisión. La inactivación FRET también puede suceder entre marcadores FAM debido al solapamiento entre los espectros de excitación y emisión. El espaciado preferido cuando se diseñan las sondas oligonucleotídicas de la invención es 3-6. Sin embargo, todas las sondas con fluoróforos separados por al menos 2 nucleótidos no marcados muestran aumentos considerables en la fluorescencia en hibridación con la diana. No se han ensayado espaciados mayores de 11 nucleótidos pero pueden producir señales eficaces dependiendo de su disposición angular relativa en el dúplex (véase la tabla 7).

Se hibridaron 150 nM del oligonucleótido homólogo inverso HYBCHRC (SEC ID Nº 35) con 150 nM de las sondas marcada individualmente (HYBCH2), con marcaje doble (HYBCH), con marcaje triple (HYBCH3) y cuádruple (HYBCH4) de Chlamydia en tampón de PCR TaKaRa y un total de 3 mM de MgCl2.

HYBCH2 5'CAAGCCTGCAAAFGTATACCAAG (SEC ID Nº 32) HYBCH 5'CAAGCCFGCAAAFGTATACCAAG (SEC ID Nº 61) HYBCH3 5'CAAGCCFGCAAAFGFATACCAAG (SEC ID Nº 96) HYBCH4 5'CAAGCCFGCAAAFGFAFACCAAG (SEC ID Nº 97)

Los picos de fusión se generaron usando un protocolo LightCycler que comprendía desnaturalización (95 ºC 5 s), enfriamiento (35 ºC 30 s) y un lento calentamiento hasta 95 ºC a 0,2 ºC/s. En comparación con la sonda marcada individualmente, la sonda oligonucleotídica HYBCH con marcaje doble presentó una elevada proporción de señal-aruido y altura de pico de fusión junto con una Tm reducida como se ha descrito anteriormente. Las bases marcadas con fluoróforo de HYBCH están separadas por 5 nucleótidos. La sonda HYBCH3 con marcaje triple se inactiva ligeramente tras la hibridación con la diana y muestra un pequeño pico negativo/invertido en huellas -dF/dT (Figura 11). La Tm de HYBCH3 está reducida en comparación con la sonda marcada individualmente, pero es mayor que la de la sonda oligonucleotídica con marcaje doble. La sonda HYBCH4 con marcaje cuádruple muestra un pequeño pico positivo en huellas -dF/dT y una Tm similar a la de HYBCH. Tanto la sonda HYBCH3 como la HYBCH4 contienen bases marcadas con fluoróforo que están separadas solamente por un único nucleótido y presentan niveles reducidos de fluorescencia tanto en estado hibridado como disociado (Figura 11). Los datos de fluorescencia indican que los colorantes FAM proximales se están inactivando entre sí en el estado monocatenario. La sonda HYBCH3 se inactiva a un grado mayor tras la hibridación con las secuencias diana complementarias, lo que sugiere que cuando los fluoróforos se proyectan en solución pueden situarse en contacto incluso más próximo que cuando están en conformación monocatenaria.

Se diseñaron sondas adicionales con marcaje triple de Chlamydia con un mayor nivel de separación entre las bases marcadas con fluoróforo. Se hibridaron 150 nM del oligonucleótido homólogo inverso HYBCH6RC (SEC ID Nº 103) con 150 nM de las sondas marcada individualmente (HYBCH2), con marcaje doble (HYBCH) y con marcaje triple (HYBCH5 y HYBCH6) en tampón de PCR TaKaRa y un total de 3 mM MgCl2. Los picos de fusión se generaron usando un protocolo LightCycler que comprendía desnaturalización (95 ºC 5 s), enfriamiento (35 ºC 30 s) y un lento calentamiento hasta 95 ºC a 0,2 ºC/s.

HYBCH2 5'CAAGCCTGCAAAFGTATACCAAG (SEC ID Nº 32) HYBCH 5'CAAGCCFGCAAAFGTATACCAAG (SEC ID Nº 61) HYBCH5 5'CAAGCCFGCAAAFGTAFACCAAG (SEC ID Nº 102) HYBCH6 5'GTAAFCAAGCCFGCAAAFGTATACCAAG (SEC ID Nº 104)

La sonda HYBCH5 con marcaje triple muestra una Tm muy similar a la de la sonda con marcaje doble HYBCH (tabla 1). Añadir más de dos colorantes fluorescentes puede no proporcionar estabilización adicional de la estructura monocatenaria. La sonda HYBCH6 con marcaje triple es 5 nucleótidos más larga que las sondas de Chlamydia mencionadas previamente y presenta una Tm similar a la sonda HYCH2 marcada individualmente. Las sondas con marcaje triple producen picos de fusión que son 6,5 y 3,25 veces la altura de las sondas HYBCH2 marcada individualmente y HYBCH con marcaje doble respectivamente (Figuras 4 y 11C).

Para investigar las contribuciones que cada fluoróforo tiene sobre la potencia de la señal total, se comparó la sonda HYBCH5 con marcaje triple con las tres sondas posibles de Chlamydia marcadas individualmente y tres sondas oligonucleotídicas con marcaje doble. Cada posición modificada dentro de las sondas oligonucleotídicas con marcaje triple se representó en las sondas con marcaje individual y doble. Estas sondas también se compararon con una sonda oligonucleotídica con marcaje cuádruple (SEC ID Nº 126). Como se ha descrito previamente, se hibridaron 150 nM del oligonucleótido homólogo inverso HYBCH6RC (SEC ID Nº 103) con 150 nM de la sonda en tampón de PCR TaKaRa y un total de 3 mM de MgCl2.

HYBCH2 5'CAAGCCTGCAAAFGTATACCAAG (SEC ID Nº 32) HYBCH7 5'CAAGCCFGCAAATGTATACCAAG (SEC ID Nº 105) HYBCH8 5'CAAGCCTGCAAATGTAFACCAAG (SEC ID Nº 106) HYBCH 5'CAAGCCFGCAAAFGTATACCAAG (SEC ID Nº 61) HYBCH9 5'CAAGCCTGCAAAFGTAFACCAAG (SEC ID Nº 107) HYBCH10 5'CAAGCCFGCAAATGTAFACCAAG (SEC ID Nº 108) HYBCH5 5'CAAGCCFGCAAAFGTAFACCAAG (SEC ID Nº 102) HYBCH11 5'GTAAFCAAGCCFGCAAAFGTAFACCAAG (SEC ID Nº 126)

Las alturas de picos de fusión generados en dos instrumentos LightCycler (LC1 y LC2) mostraron niveles mayores de variación que las proporciones de señal-a-ruido calculadas (tabla 4). Sin embargo, con ambos instrumentos LightCycler, las alturas de pico de la sonda con marcaje triple fueron aproximadamente dos veces la altura de la sonda con marcaje doble más eficaz y más de cuatro veces mayor que la sonda oligonucleotídica marcada individualmente más eficaz (tabla 4). La altura de los picos de fusión con marcaje triple es mayor que la suma de las

5 tres sondas oligonucleotídicas marcadas individualmente y también es mayor que la suma de cualquier sonda con marcaje doble más cualquier sonda oligonucleotídica marcada individualmente equivalente. La sonda oligonucleotídica con marcaje cuádruple también produjo datos de fusión de alta calidad, mostrando alturas de pico que fueron aproximadamente un 25 % más grandes que las sondas con marcaje triple (tabla 4).

10 TABLA 4: Alturas de pico y proporciones de señal-a-ruido generadas con sondas con marcaje individual, doble y triple de Chlamydia usando dos instrumentos LightCycler (LC1 y LC2). Cada pico y curva de fusión se analizó por duplicado y se presenta el valor medio. Sonda Fluoróforos Altura de pico Altura de pico Señal-a-ruido Señal-a-ruido (LC1) (LC2) (LC1) (LC2)

HYBCH2 1 0,71 0,43 1,43 1,47 HYBCH7 1 0,97 0,52 1,42 1,54 HYBCH8 1 0,62 0,33 1,36 1,33 HYBCH 2 1,41 0,74 1,87 1,87 HYBCH9 2 2,1 1,59 1,58 1,92 HYBCH10 2 2,23 1,24 1,60 1,74 HYBCH5 3 4,28 2,80 2,33 2,42 HYBCH11 4 -3,50 -2,90

Las sondas con marcaje individual, doble y triple de Chlamydia también se investigaron a 35 ºC en presencia y

15 ausencia de diana para comparar los niveles de emisión de fluorescencia en estado hibridado y monocatenario. Se hibridaron 150 nM de oligonucleótido homólogo inverso HYBCH6RC (SEC ID Nº 103) con 150 nM de sonda en tampón de PCR TaKaRa y un total de 3 mM de MgCl2. Las muestras se desnaturalizaron en capilares LightCycler (95 ºC 5 s) antes del enfriamiento hasta 35 ºC con adquisición continua de fluorescencia. Las sondas se analizaron por duplicado en presencia y ausencia de diana y se detallan los valores medios de emisión para los estados

20 hibridado y monocatenario en la tabla 5. En ausencia de diana, la sonda oligonucleotídica con marcaje triple emite menos fluorescencia que cualquiera de las sondas con marcaje individual y doble. Mientras que, en presencia de diana, el nivel de fluorescencia a partir de la sonda con marcaje triple fue muy similar al emitido a partir de la sonda HYBCH10 con marcaje doble. La sonda con marcaje triple muestra la mayor diferencia entre los estados dúplex y monocatenario y por tanto produce los mayores picos de fusión. Una interacción entre fluoróforos, tal como la

25 inactivación en la estructura de sonda monocatenaria, puede ser responsable de las elevadas alturas de pico y proporciones de señal-a-ruido mostradas por las sondas oligonucleotídicas con marcaje doble y triple. En estado monocatenario (enrollamiento aleatorio) los fluoróforos pueden contactar entre sí y apilarse dando lugar a inactivación por colisión mientras que esto no es posible en el dúplex ya que los fluoróforos se mantienen apartados por la estructura rígida de ADN-B cuando están separados por al menos dos nucleótidos. Si están aún más juntos, el

30 enlazador flexible en la posición 5 de la base de timina puede permitir que los fluoróforos se acerquen entre sí.

TABLA 5: Niveles de emisión (unidades arbitrarias de fluorescencia LightCycler) a 35 ºC en presencia y ausencia de un oligonucleótido complementario. También se incluye la diferencia entre los estados hibridado y monocatenario. Sonda Fluoróforos Más diana Menos diana Diferencia

HYBCH2 1 9,0 7,2 1,8 HYBCH7 1 8,4 7,0 1,4 HYBCH8 1 9,8 7,8 2,0 HYBCH 2 10,2 5,1 5,1 HYBCH9 2 14,3 7,4 6,9 HYBCH10 2 16,5 11,6 4,9 HYBCH5 3 16,2 5,0 11,2

35 Ejemplo 10: Comparación adicional de oligonucléotidos con marcaje individual, doble y triple

Se compararon tres sondas oligonucleotídicas marcadas individualmente del Factor V con sondas con marcaje doble y triple de secuencia idéntica. Todos los fluoróforos presentes en las sondas oligonucleotídicas con marcaje doble y triple se representaron en las sondas marcadas individualmente. Se hibridaron 150 nM del oligonucleótido homólogo

40 inverso FVG (SEC ID Nº 24) con 150 nM de sonda oligonucleotídica en tampón de PCR TaKaRa y un total de 3 mM de MgCl2. Los picos de fusión se generaron usando un protocolo LightCycler que comprendía desnaturalización (95 ºC 5 s), enfriamiento (35 ºC 30 s) y un lento calentamiento hasta 95 ºC a 0,2 ºC/s. Las alturas de pico y las proporciones de señal-a-ruido de las sondas con marcaje individual, doble y triple se presentan en la tabla 6.

45

FVG1 5'CTGTAFTCCTCGCCTGTCC (SEC ID Nº 21)

FVG1ALT

5'CTGTATTCCTCGCCFGTCC (SEC ID Nº 101)

FVG1ALT2

5'CTGTATTCCFCGCCTGTCC (SEC ID Nº 128)

FVG11 5'CTGTAFTCCTCGCCFGTCC (SEC ID Nº 60)

FVG111 5'CTGTAFTCCFCGCCFGTCC (SEC ID Nº 127) La sonda FVG11 con marcaje doble produce picos de fusión que son aproximadamente 3-4 veces mayores que las sondas oligonucleotídicas marcadas individualmente que poseen fluoróforos en posiciones idénticas dentro de la

5 secuencia. Por tanto, los picos de fusión con marcaje doble son mayores que la suma de los picos marcados individualmente. Además, la sonda oligonucleotídica con marcaje triple genera picos de fusión que son al menos 7 veces mayores que las sondas oligonucleotídicas marcadas individualmente y 2,6 veces mayores que la sonda con marcaje doble (Figura 12). Los picos de fusión de las sondas con marcaje triple son considerablemente más grandes que la suma de los picos derivados de oligonucléotidos marcados individualmente. Como con los oligonucléotidos de

10 Chlamydia, la adición de múltiples fluoróforos a las sondas causa la generación de picos de fusión cuyas alturas son mayores que las que se esperarían de las sondas oligonucleotídicas marcadas individualmente. Los datos derivados de las sondas de Chlamydia y el Factor V demuestran que la incorporación de dos o tres bases marcadas con fluoróforo no duplica o triplica necesariamente la altura de los picos de fusión de las sondas oligonucleotídicas.

15 TABLA 6: Alturas de pico y proporciones de señal-a-ruido generadas con sondas con marcaje individual, doble y triple del Factor V en un único experimento LightCycler (LC2). Se analizó cada pico y curva de fusión por duplicado y se presenta el valor medio. Sonda Fluoróforos Tm Altura de pico Señal-a-ruido

FVG 1 60,0 0,21 1,33 FVG1ALT 1 61,2 0,28 1,46 FVG1ALT2 1 61,2 0,30 1,47 FVG11 2 56,1 0,84 1,79 FVG111 3 55,9 2,2 3,14

Ejemplo 11: Espaciado mínimo entre fluoróforos

20 Se sintetizó una serie de sondas oligonucleotídicas para determinar el espaciado mínimo requerido entre las bases marcadas con fluoróforo en sondas oligonucleotídicas con marcaje doble. Las sondas poseían entre 0 y 9 nucleótidos entre las bases marcadas con fluoróforo. Se hibridaron 150 nM del oligonucleótido homólogo inverso MODRC (5'CCCCCCTTTTTTTTTTTTTCCCCCC (SEC ID Nº 139)) con 150 nM de la sonda oligonucleotídica en

25 tampón de PCR TaKaRa y un total de 3 mM de MgCl2. Los picos de fusión se generaron usando un protocolo LightCycler que comprendía desnaturalización (95 ºC 5 s), enfriamiento (35 ºC 30 s) y un lento calentamiento hasta 95 ºC a 0,2 ºC/s. Las proporciones de señal-a-ruido y las alturas de los picos de fusión se presentan en la tabla 7. Las sondas que poseían 0 y 1 nucleótidos entre las bases marcadas mostraron niveles considerablemente reducidos de fluorescencia debido a la inactivación por contacto causada por la cercana proximidad de los fluoróforos. Estas

30 dos sondas mostraron picos de fusión negativos (invertidos), donde el nivel de fluorescencia disminuyó cuando hibridaban con las secuencias diana en relación al estado monocatenario. Todas las sondas que poseían entre 2 y 9 nucleótidos separando las bases marcadas con fluoróforo mostraron picos de fusión positivos y potenciación de la fluorescencia tras la hibridación con la diana. Las sondas que poseían fluoróforos separados por 7 y 8 nucleótidos mostraron niveles ligeramente reducidos de fluorescencia y picos de fusión más pequeños en comparación con las

35 sondas con espaciados de 2-6 y 9. Las sondas que poseen múltiples fluoróforos en la misma superficie del ADN dúplex pueden encontrarse con un grado de inactivación por contacto, presentando de este modo reducidas alturas de pico y proporciones de señal-a-ruido. Estos efectos de la disposición angular pueden ser específicos de secuencia ya que se han empleado espaciados de 8 nucleótidos en las sondas FVG11 (SEC ID Nº 60), HYBMRSA (SEC ID Nº 99) y HYBA1928C (SEC ID Nº 112), generando grandes picos de fusión y proporciones de señal-a-ruido.

40 Se requieren al menos dos nucleótidos separando las bases marcadas con fluoróforo para que las sondas oligonucleotídicas produzcan niveles mayores de emisión de fluorescencia tras la hibridación con la diana en relación a la sonda libre.

TABLA 7: Picos de fusión generados en un único experimento LightCycler (LC2) para determinar el espaciado 45 mínimo requerido entre bases marcadas con fluoróforo. Cada pico de fusión se analizó por duplicado y se presenta el valor medio.

Sonda Espacio Secuencia SEC ID Altura de puco Señal-a-ruido

MOD0 0 GGGGGGTTTTTFFTTTTTTGGGGGG 129 -0,06 0,71 MOD1 1 GGGGGGTTTTTFTFTTTTTGGGGGG 130 -0,07 0,84 MOD2 2 GGGGGGTTTTFTTFTTTTTGGGGGG 131 0,26 1,29 MOD3 3 GGGGGGTTTTFTTTFTTTTGGGGGG 132 0,24 1,30 MOD4 4 GGGGGGTTTFTTTTFTTTTGGGGGG 133 0,24 1,30 MOD5 5 GGGGGGTTTFTTTTTFTTTGGGGGG 134 0,17 1,25 MOD6 6 GGGGGGTTFTTTTTTFTTTGGGGGG 135 0,20 1,23 MOD7 7 GGGGGGTTFTTTTTTTFTTGGGGGG 136 0,09 1,15 MOD8 8 GGGGGGTFTTTTTTTTFTTGGGGGG 137 0,06 1,11 MOD9 9 GGGGGGTFTTTTTTTTTFTGGGGGG 138 0,15 1,31

Todas las sondas oligonucleotídicas con marcaje doble, triple y cuádruple diseñadas hasta la fecha, que poseen

entre dos y once nucleótidos separando las bases marcadas con fluoróforo, muestran una considerable potenciación de la fluorescencia tras la hibridación con secuencias diana complementarias. Se ha descubierto que solamente aquellas sondas con ningún nucleótido o uno separando las bases marcadas con fluoróforo muestran pequeños niveles de inactivación de la fluorescencia tras la hibridación con la diana. Aún no se ha identificado una separación

5 máxima de nucleótidos marcados con fluoróforo.

Ejemplo 12: Unión de fluoróforos a dA y dC

Se sintetizaron sondas oligonucleotídicas FAM dA y FAM dC usando monómeros amino-dA y amino-dC (Glen

10 Research, Sterling, VA) y marcaje post-sintético con FAM. Se sintetizaron sondas con marcaje individual y doble que contenían FAM dC y FAM dA y se compararon con sondas oligonucleotídicas con marcaje individual y doble C6 FAM dU (tabla 8). Se hibridaron 150 nM del oligonucleótido homólogo inverso apropiado (FVG o GLENARC) con 150 nM de la sonda oligonucleotídica en tampón de PCR TaKaRa y un total de 3 mM de MgCl2. Los picos de fusión se generaron usando un protocolo LightCycler que comprendía desnaturalización (95 ºC 5 s), enfriamiento (35 ºC 30

15 s) y un lento calentamiento hasta 95 ºC a 0,2 ºC/s.

FVG 5'GGACAGGCGAGGAATACAG (SEC ID Nº 24) GLENARC 5'CTGTATACCTTGCCTGTCC (SEC ID Nº 91)

20 Las sondas FAM dC y FAM dA mostraron todas niveles potenciados de fluorescencia tras la hibridación con la diana en relación al estado monocatenario (Figura 13). La potenciación de la emisión de fluorescencia tras la hibridación de FAM dC apoya el modelo de que los fluoróforos de la sonda oligonucleotídica no interaccionan con el ADN de la hebra diana ya que se esperaría que la interacción con G en la diana causara inactivación de la fluorescencia. Como con C6 FAM dU y fluoresceína dT, las sondas con marcaje doble FAM dC y FAM dA producen ambas picos de

25 fusión que son mayores que dos veces la altura de la sonda oligonucleotídica marcada individualmente equivalente.

Las sondas con marcaje doble de C6 FAM dU y fluoresceína dT muestran Tm que son aproximadamente 4-5 ºC inferiores que las sondas marcadas individualmente de secuencia idéntica. Las sondas marcadas con FAM dC y FAM dA mostraron diferentes de Tm de 1 ºC y 8,3 ºC respectivamente (tabla 8).

30 TABLA 8: Alturas de pico y proporciones de señal-a-ruido derivadas de sondas oligonucleotídicas que contienen marcadores C6 FAM dU, FAM dC y FAM dA. Sonda SEC ID Nº Secuencia Base marcada Tm Altura de pico Señal-a-ruido

FVG1 21 CTGTAFTCCTCGCCTGTCC FAM dU 59,9 0,22 1,35 FVG11 60 CTGTAFTCCTCGCCFGTCC FAM dU 56,0 0,81 1,81 GLENC 1 125 CTGTATTFCTCGCCTGTCC FAM dC 60,9 0,28 1,37 GLENC 2 72 CTGTATTFCTCGCFTGTCC FAM dC 59,9 1,03 1,81 GLENA 1 73 GGACAGGCAAGGFATACAG FAM dA 49,8 0,59 2,4 GLENA 2 90 GGACFGGCAAGGFATACAG FAM dA 41,5 1,52 4,1 ATD063 8 142 GGACAFGCAAGGTATACAG FAM dG 53,0 0,63 2,0 ATD063 9 143 GGACAFGCAAGFTATACAG FAM dG 53,0 0,15 1,5

Para A, T, C y U, no importa si los fluoróforos se unen a los nucleótidos antes, durante o después de la síntesis. La

35 unión a estos nucleótidos es posible mientras se mantenga la base 'natural'. La unión del fluoróforo directamente a G produce un análogo de base.

Ejemplo 13: PCR asimétrica para potenciar la altura del pico de fusión

40 Después de la fase de PCR de los ensayos usando los oligonucléotidos de la invención, las sondas compiten con los productos amplificados por hibridar con la secuencia diana. Esta competición reduce el potencial de las interacciones sonda/diana y limita la altura de los picos de fusión. Si la diana hibridación se desplaza a favor de la sonda, puede aumentarse la altura de los picos de fusión. Esto puede conseguirse aumentando la concentración de la sonda o disminuyendo la abundancia de la hebra competidora de PCR.

45 Se ha descubierto que la concentración óptima de las sondas oligonucleotídicas es 150 nM. Se ha descubierto que el aumento de la concentración de la sonda por encima de 200 nM no mejora las proporciones de señal-a-ruido. De hecho, una concentración aumentada de la sonda tiene un efecto adverso sobre las huellas de fusión de Chlamydia, generando un segundo pico a aproximadamente 80 ºC que aumenta en altura junto con la concentración de la

50 sonda. También se ha descubierto que las calidades de los picos se reducen a elevadas concentraciones de sonda debido a la fluorescencia adicional del fondo que surge de las sondas monocatenarias que son incapaces de hibridar con las secuencias diana.

Puede reducirse la abundancia de la hebra de ADN competidora, con relación a la secuencia diana, usando un

55 método de amplificación asimétrica. Se optimizó la concentración de los cebadores directo e inverso de Chlamydia para maximizar la altura de los picos de fusión. Se amplificaron las dianas de plásmido críptico de Chlamydia usando los cebadores CHF3-1 (SEC ID Nº 33) y CHR4-1 (SEC ID Nº 34). Los ensayos emplearon protocolos LightCycler de 3 fases que consistían en una desnaturalización inicial (95 ºC 1 min.) seguida de 50 ciclos de PCR que comprendían desnaturalización (95 ºC 5 s), hibridación de cebador (55 ºC 10 s) y extensión de productos (72 ºC 10 s). La diana amplificada se detectó y caracterizó a través de la inclusión de la sonda HYBCH (SEC ID Nº 61) y el análisis de la curva de fusión que comprendía desnaturalización (95 ºC 0 s), enfriamiento (35 ºC 30 s) y un lento calentamiento hacia 95 ºC usando una velocidad de transición de 0,2 ºC/s. En presencia de ADN de Chlamydia, la sonda HYBCH genera claros picos de fusión con Tm de aproximadamente 56 ºC (Figura 14). Se descubrió que una dilución de factor diez del cebador directo (0,05 !M) relativa al cebador inverso (0,5 !M) aumentaba la altura de los picos de Chlamydia en tres a cinco veces en comparación con ensayos equimolares convencionales (Figura 14). Esta altura de pico aumentada se observó con ADN genómico purificado y muestras clínicas procesadas. La combinación de PCR asimétrica con una sonda con marcaje triple (HYBCH6) generó picos de fusión que fueron aproximadamente 20 veces el tamaño de aquellos generados en ensayos simétricos que emplean la sonda oligonucleotídica marcada individualmente.

Ejemplo 14: PCR asimétrica, concentración de la sonda y alturas de pico

La PCR asimétrica ha producido alturas de pico aumentadas, relativas a la amplificación simétrica, con ensayos de Chlamydia, gonorrhoeae, Factor ll, A1928C, y C677T. Sin embargo, la amplificación asimétrica no logró potenciar las alturas de pico en el ensayo de NAT2*5C. Como la PCR asimétrica genera dianas monocatenarias, las sondas no tienen que competir por la hibridación con las hebras complementarias de PCR y los picos de fusión tienen el potencial de ser de similar magnitud a los obtenidos con oligonucléotidos. Si la amplificación simétrica produce picos de fusión que ya son de similar magnitud a los picos de oligonucleótido (por ejemplo, ensayo de NAT2*5C), no puede obtenerse beneficio de la amplificación asimétrica. Parece que solamente aquellas sondas que presentan alturas de pico reducidas, en comparación con los oligonucléotidos, muestran alturas de pico potenciadas cuando los ensayos se convierten en ensayos asimétricos. La PCR asimétrica puede ser beneficiosa si los ensayos utilizan largos amplicones diana o si se generan dímeros de cebador.

Las sondas de Factor V (FVG1 y FVG11) son una situación más complicada. Los picos de fusión generados en ensayos simétricos son de altura razonable, permitiendo una identificación fiable de las muestras, pero son reducidos en comparación con picos derivados de dianas oligonucleotídicas. Se ha descubierto que cincuenta ciclos de amplificación asimétrica, realizados con una muestra heterocigótica, no afectan a la altura de los picos apareados

o desapareados con relación a ensayos simétricos. Sin embargo, se descubrió que 60 y 70 ciclos de amplificación asimétrica aumentan la altura del pico de fusión apareado reduciendo/no afectando al mismo tiempo la altura del pico desapareado (Figura 14). Después de 70 ciclos, la sonda llega a saturarse con diana de modo que la hibridación preferencial con el alelo completamente complementario provoca un desequilibrio de las alturas de pico. La estabilidad aumentada de los dúplex sonda/diana completamente complementarios es responsable de esta hibridación preferencial y altura de pico aumentada relativas al dúplex desapareado.

La sonda FVG11 (SEC ID Nº 60) se hibridó con los oligonucléotidos completamente complementario (FVG (SEC ID Nº 24)) y desapareado (FVA (SEC ID Nº 25)) para investigar el efecto de la concentración de diana sobre las alturas de los picos de fusión. El análisis de fusión se realizó en un instrumento LightCycler empleando un protocolo térmico que comprendía desnaturalización (95 ºC 0 s), enfriamiento (35 ºC 30 s) y un lento calentamiento hasta 95 ºC usando una velocidad de transición de 0,2 ºC/s. Se emplearon las dianas apareada y desapareada a concentraciones equimolares. La sonda 150 nM hibridada con 150 nM de diana produjo picos de fusión apareados y desapareados de altura idéntica (Figura 15). Sonda 300 nM hibridada con 300 nM de diana también produjo picos apareados y desapareados de altura comparable. Sin embargo, 150 nM de sonda hibridada con 1 !M de la diana produjo solamente el pico de fusión apareado (Figura 15). La diana completamente complementaria secuestra la sonda y la hibridación competitiva evita la hibridación eficaz con la diana desapareada. El SNP del factor V afecta a la estabilidad de los dúplex sonda/diana considerablemente, de modo que a elevadas concentraciones de diana la sonda se une preferentemente a la secuencia completamente complementaria. Esta observación también explica el desequilibrio de las alturas de pico entre dianas completamente complementarias y doblemente desapareadas, tal como en ensayos de células falciformes y NAT1*10.

Para averiguar si mayores concentraciones de sonda podrían re-establecer el equilibrio de las alturas de los picos apareados y desapareados a elevadas concentraciones de diana, se realizaron ensayos simétricos y asimétricos usando 150 nM, 300 nM y 500 nM de la sonda FVG11 y una muestra de ADN genómico heterocigótico del Factor V. Se realizaron cincuenta, sesenta y setenta ciclos de amplificación de 2 fases. Después de 50 ciclos, las alturas de los picos apareado y desapareado se equilibraron y no hubo diferencia considerable entre las reacciones simétrica y asimétrica (Figura 16). Las reacciones de sonda 150 nM produjeron los datos de mayor calidad. Las alturas de los picos de fusión apareado y desapareado generados, con 150 nM de sonda, tras 60 y 70 ciclos asimétricos eran desiguales como se demuestra en la figura 14. La altura del pico de fusión desapareado se mejoró considerablemente a las mayores concentraciones de sonda. Después de 60 ciclos asimétricos, 150 nM de FVG11 produjo picos de fusión apareados y desapareados con alturas de 0,83 y 0,35 respectivamente (diferencia de 2,3 veces). Mientras que 500 nM de sonda produjo picos de fusión apareados y desapareados con alturas de 0,63 y 0,50 respectivamente (diferencia de 1,13 veces). La altura combinada de los picos heterocigóticos en las reacciones de sonda 150 nM y 500 nM fue de 1,19 y 1,13 respectivamente, similar a la observada con diana oligonucleotídica homocigótica (Figura 3). La concentración aumentada de la sonda equilibró la altura de los picos de fusión apareado y desapareado generados con productos amplificados de forma asimétrica. Los datos del oligonucleótido y la PCR no confirman la hibridación competitiva de las sondas con moléculas diana apareadas y desapareadas. A concentraciones mayores de diana, esta hibridación competitiva y la estabilidad reducida de los dúplex desapareados provoca la reducción o pérdida de picos en un perfil de fusión multi-diana. Pueden ser necesarias concentraciones de sonda mayores de 150 nM en ciertos ensayos asimétricos.

Ejemplo 15: Análisis múltiple por temperatura de fusión

Se hibridaron simultáneamente cuatro sondas oligonucleotídicas con sus dianas oligonucleotídicas complementarias en un único capilar LightCycler para demostrar el potencial de combinación del análisis de picos de fusión. Las sondas y las dianas se emplearon a diversas concentraciones para compensar las alturas de los picos derivados de sondas con marcaje individual y doble. Las sondas poliT, HYBINF, HYBCH2 y HYBAdC y las dianas oligonucleotídicas se emplearon a 1,2 !M, 233 nM, 183 nM y 27 nM respectivamente. Los picos de fusión se generaron en tampón de PCR TaKaRa, y un total de 3 mM MgCl2 usando un protocolo LightCycler que comprendía desnaturalización (95 ºC 5 s), enfriamiento (35 ºC 30 s) y un calentamiento hacia 95 ºC a 0,4 ºC/s. Las sondas poliT, HYBINF, HYBCH2 y HYBAdC generaron claros picos de fusión con Tm de aproximadamente 49 ºC, 54 ºC, 62 ºC y 68 ºC respectivamente (Figura 17). Pueden detectarse e identificarse al menos cuatro secuencias diana basándose en la Tm usando las sondas oligonucleotídicas que permiten análisis simultáneo de dos SNP bialéicos. El potencial de combinación puede potenciarse adicionalmente usando colorantes fluorescente espectralmente distintos.

Ejemplo 16: Control positivo de amplificación

Pueden emplearse oligonucleótidos de la invención para determinar la presencia o ausencia de patógenos infecciosos en muestras clínicas. La generación de picos de fusión específicos indica la presencia de agentes infecciosos particulares dentro de la muestra. Sin embargo, la ausencia total de picos de fusión no indica de forma fiable la ausencia de patógeno. Las muestras clínicas, tales como orina, pueden contener elevados niveles de inhibidores de PCR que pueden evitar la detección de patógenos en muestras positivas. Se requiere un control de amplificación para distinguir reacciones que sean negativas debido a la ausencia de patógeno de aquellas que no logren generar picos de fusión debido a la inhibición de la PCR.

El control de amplificación de Chlamydia (mímico) se construyó usando un oligonucleótido de 142 bases (SEC ID Nº 98). El largo oligonucleótido se empleó como molde de PCR con propósitos de clonación y contenía una sustitución de base C a T dentro de la región de sonda para posibilitar la diferenciación entre el mímico de la diana de Chlamydia basándose en la Tm. La amplificación a partir del largo oligonucleótido se realizó usando los cebadores CHF3-1 (SEC ID Nº 33) y CHR4-1 (SEC ID Nº 34). El producto amplificado se ligó en el vector pDrive usando un kit PCR cloningplus (Qiagen Ltd, Crawley, RU) y se transformó en células competentes Qiagen EZ. Se identificaron colonias que contenían la secuencia mímica directamente usando el ensayo de Chlamydia que usa las sondas oligonucleotídicas de la invención. Los plásmidos se purificaron de los cultivos transformantes usando un kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen Ltd, Crawley, RU) usando los procedimientos recomendados por el fabricante. La hibridación de los oligonucléotidos de Chlamydia de la invención con la secuencia diana mímica provoca un desapareamiento

C:A que reduce las Tm de las sondas en aproximadamente 8 ºC (Figura 18).

Ejemplo 17: Cuantificación de ADN usando las sondas oligonucleotídicas de la invención

Se amplificaron las dianas del Factor V a partir de una serie de patrones de ADN usando los cebadores FVF1.3 (SEC ID Nº 22) y FVR3.5 (SEC ID Nº 23). Los patrones de ADN contenían 100 ng/!l, 10 ng/!l, 1 ng/!l, 100 pg/!l y 10 pg/!l de ADN genómico humano. Los ensayos emplearon protocolos LightCycler de 3 fases que consistían en una desnaturalización inicial (95 ºC 1 min.) seguida de 50 ciclos de PCR que comprendían fases de desnaturalización (95 ºC 0 s) e hibridación (50 ºC 10 s) y extensión (72 ºC 10 s). La diana amplificada se detectó y caracterizó a través de la inclusión de FVG 1 (SEC ID Nº 21) o FVG 11 (SEC ID Nº 60) y la adquisición de fluorescencia durante la fase de hibridación de PCR. La medición del número de ciclo al que aumenta la emisión de fluorescencia por encima de un nivel umbral (CT) posibilita la cuantificación de las dianas de ADN (Figura 19). Los valores CT derivados obtenidos durante ensayos de PCR a tiempo real son directamente proporcionales a la cantidad de copias de partida de la secuencia diana y pueden usarse para construir curvas patrón, a partir de las cuales pueden cuantificarse muestras 'desconocidas'. Se ha descubierto que las muestras de saliva normalmente contienen aproximadamente 1 ng/!l de ADN genómico humano.

Ejemplo 18: Análisis usando fluoróforos diferentes a fluoresceína

Se sintetizaron cuatro sondas oligonucleotídicas del Factor V cada una marcada con fluoróforos en dos posiciones internas. Estas sondas fueron:

FVG11TAM 5'CTGTAXTCCTCGCCXGTCC (SEC ID Nº 140) donde X es un resto dT marcado con TAMRA.

FVG11ROX 5'CTGTAXTCCTCGCCXGTCC (SEC ID Nº 141) donde X es un resto dT marcado con ROX.

FVG11Cy5 5'CTGTAXTCCTCGCCXGTCC (SEC ID Nº 142) donde X es un resto dT marcado con Cy5.

FVG11Mix 5'CTGTAFTCCTCGCCXGTCC (SEC ID Nº 143) donde F es un resto dT marcado con FAM y X es un resto dT marcado con ROX.

5 Las sondas se hibridaron con sus dianas oligonucleotídicas complementarias (SEC ID Nº 24) en placas ópticas de 96 pocillos en tampón de PCR TaKaRa y un total de 3 mM de MgCl2 y se generaron curvas de fusión usando un termociclador ABI 7700. El protocolo de fusión comprendía desnaturalización (95 ºC 30 s), enfriamiento (35 ºC 30 s) y un perfil de fusión que comprendía una progresión por etapas desde 35 ºC hasta 95 ºC en incrementos de 1 ºC con

10 un mantenimiento de 15 s a cada temperatura. Las sondas y los complementos se usaron a concentraciones de 150 nM. Los datos sin procesar se exportaron desde el termociclador ABI 7700 y se procesaron usando el programa de hojas de cálculo Excel de Microsoft. Las Figuras 20A, 20B, 20C y 20D muestran las curvas de fusión de estas sondas a partir de sus complementos y en todos los casos se observa una intersección en la curva y demuestra una disminución en la fluorescencia como resultado directo de la disociación de la sonda desde su diana en comparación

15 con la disminución lineal de la fluorescencia como una función de la temperatura a pesar de que el sistema óptico es sub-óptimo para la detección de Cy5. Estos datos confirman los datos y conclusiones previas de que este fenómeno es una característica general de los fluoróforos y no está restringido a la fluoresceína y otros derivados basados en fluoresceína.

20 Conclusión

Las sondas oligonucleotídicas que poseen una única y múltiples bases internas marcadas con fluoróforo muestran todas niveles aumentados de emisión de fluorescencia cuando hibridan en comparación con el estado monocatenario. Como la fluorescencia de la sonda siempre aumenta tras la hibridación independientemente de las

25 secuencias oligonucleotídica y diana, se prevé que los fluoróforos interaccionan con el ADN sonda cuando es monocatenario, provocando inactivación, pero no interaccionan con las secuencias sonda o diana cuando está en estado dúplex, de modo que los fluoróforos se reactivan y aumenta la fluorescencia. Se cree que los niveles aumentados de fluorescencia emitida por las sondas hibridadas surge de los fluoróforos que se proyectan en solución lejos de la influencia inactivadora del ADN.

30 Un hallazgo inesperado resultante de la comparación de sondas oligonucleotídicas marcadas individualmente con sondas con marcaje dual y triple de secuencia idéntica fue que la fluorescencia no se duplicaba o triplicaba simplemente con la inclusión de fluoróforos adicionales. Las sondas con marcaje doble y triple mostraban picos de fusión que eran mayores que los esperados de cada una de las sondas oligonucleotídicas marcadas

35 individualmente, lo que sugiere una interacción entre fluoróforos. Los fluoróforos en las sondas oligonucleotídicas se separan preferiblemente por al menos dos nucleótidos para evitar la inactivación por contacto y asegurar una generación eficaz de la señal sobre la detección de la diana.

TABLA 9: Colorantes fluorescentes generales de marcaje de oligonucleótidos

Colorante

-excitación -emisión color

Fluoresceína

494 nm 525 nm Verde

Tetracloro de Fluoresceína TET

521 nm 536 nm Naranja

JOE

525 nm 555 nm Verde

Amarillo Yakima

530 nm 549 nm Amarillo

Hexacloro de Fluoresceína HEX

535 nm 556 nm Rosado

Cy3 (también Quasar 570)

546 nm 563 nm Rojo

5-TAMRA

541 nm 568 nm Rosa

6-TAMRA

547 nm 573 nm Rosa

Rojo Redmond

579 nm 595 nm Rojo

Cy3.5

588 nm 604 nm Púrpura

ROX

585 nm 610 nm Rojo

Pulsar 650

490 nm 650 nm Púrpura

Cy5 (también Quasar 670)

646 nm 662 nm Violeta

Cy5.5

683 nm 707 nm Azul oscuro

TABLA 10: Colorantes Alexa (Invitrogen)

Colorante Alexa

-excitación -emisión

Alexafluor 350

350 nm 442 nm

Alexafluor 405

405 nm 421 nm

Alexafluor 430

430 nm 540 nm

Alexafluor 488

488 nm 518 nm

Alexafluor 500

502 nm 524 nm

Alexafluor 514

518 nm 542 nm

Alexafluor 532

534 nm 553 nm

Alexafluor 546

546 nm 565 nm

Alexafluor 555

552 nm 567 nm

Alexafluor 568

578 nm 603 nm

Alexafluor 594

591 nm 618 nm

Alexafluor 610

612 nm 628 nm

Alexafluor 633

633 nm 650 nm

Alexafluor 647

647 nm 662 nm

Alexafluor 660

663 nm 690 nm

Alexafluor 680

679 nm 702 nm

Alexafluor 700

696 nm 719 nm

Alexafluor 750

752 nm 779 nm

TABLA 11: Colorantes ATTO (ATTO-TEC GmbH)

Colorante ATTO

-excitación -emisión

ATTO 425

436 nm 484 nm

ATTO 465

453 nm 508 nm

ATTO 488

501 nm 523 nm

ATTO 495

495 nm 527 nm

ATTO 520

525 nm 545 nm

ATTO 532

532 nm 553 nm

ATTO 550

554 nm 576 nm

ATTO 565

563 nm 592 nm

ATTO 590

594 nm 624 nm

ATTO 610

615 nm 634 nm

ATTO 620

619 nm 643 nm

ATTO 635

635 nm 659 nm

ATTO 647

645 nm 669 nm

ATTO 655

633 nm 684 nm

ATTO 680

680 nm 700 nm

ATTO 700

700 nm 719 nm

TABLA 12: Colorantes Dyomics (Dyomics GmbH)

Colorante Dyomics

-excitación -emisión

DY415

418 nm 465 nm

DY495

495 nm 520 nm

DY505

505 nm 530 nm

DY547

557 nm 574 nm

DY548/549

558 nm 572 nm

DY550

553 nm 578 nm

DY555

555 nm 580 nm

DY556

548 nm 573 nm

DY560

559 nm 578 nm

DY590

580 nm 599 nm

DY610

609 nm 629 nm

DY615

621 nm 641 nm

DY630

636 nm 657 nm

DY631

637 nm 658 nm

DY632/633/634

637 nm 657 nm

DY635

647 nm 671 nm

DY636

645 nm 671 nm

DY647

652 nm 673 nm

DY648

653 nm 674 nm

DY650

653 nm 674 nm

DY651

653 nm 678 nm

DY652

654 nm 675 nm

DY675/676

674 nm 699 nm

DY677

673 nm 694 nm

DY680/682

690 nm 709 nm

DY700

702 nm 723 nm

DY701

706 nm 731 nm

DY730

734 nm 750 nm

DY731/734

736 nm 759 nm

DY732

736 nm 759 nm

DY750

747 nm 776 nm

DY751

751 nm 779 nm

DY752

748 nm 772 nm

DY776

771 nm 801 nm

DY781

783 nm 800 nm

DY782

782 nm 800 nm

TABLA 13: Colorantes Dyomics Megastokes (Dyomics GmbH). Todos pueden excitarse a 488 nm

Colorante Dyomics

-excitación -emisión

DY475XL

493 nm 514 nm

DY480XL

500 nm 630 nm

DY485XL

485 nm 560 nm

DY500XL

505 nm 555 nm

DY510XL

509 nm 590 nm

DY600XL

603 nm 634 nm

DY520XL

520 nm 664 nm

TABLA 14: Colorantes Hilyte (Cambridge Bioscience)

Colorante

-excitación -emisión

Hilyte Fluor 488

502 nm 527 nm

Hilyte Fluor 555

552 nm 569 nm

Hilyte Fluor 647

649 nm 674 nm

Hilyte Fluor 680

678 nm 699 nm

TABLA 15: Fluoróforos con baja longitud de onda de excitación (UV)

Derivado

Abs* Em*

Alexa Fluor 350

346 442

Alexa Fluor 405

402 412

Amilinonaftaleno

326 462

Bimane

375 456

Dansilo

328 563

Dapoxilo

374 572

Dibromobimane

394 490

Dietilaminocumarina

384 470

Dimetilaminocumarina

376 465

Dimetilaminonaftaleno

391 500

Monobromobimane

394 490

Monoclorobimane

394 490

Naftaleno

336 490

Pireno

339 384

Estilbeno

329 408

Referencias citadas

Documentos de patente

5 US 5.691.146 11/1997 Mayrand US 6.174.670 B1 1/2001 Rasmussen et al. WO 01/36668 A1 5/2001 Sauer et al. US 6.635.427 B2 10/2003 Wittwer et al.

10 WO 01/73118 A2 10/2001 French et al.

Otras publicaciones

1. Brown et al (2001) Synthesis of a modified thymidine monomer for site-specific incorporation of reporter 15 groups into oligonucleotides. Tetrahedron Lett. 42, 2587-2591.

2.

Brown et al (2003) Synthesis of fluorophore and quencher monomers for use in Scorpion primers and nucleic acid structure probes. Organic and Biomolecular Chem. 1, 2267-2275.

3.

Crockett y Wittwer (2001) Fluorescein-Labeled Oligonucleotides for Real-Time PCR: Using the Inherent Quenching of Deoxyguanosine Nucleotides. Anal. Biochem., 290, 89-97.

20 4. Dobson et al (2003) Synthesis of HyBeacons and dual-labelled probes containing 2'-fluorescent groups for use in genetic analysis. Chem. Comm. 1234-1235.

5. Elnifro et al (2000) PCR and restriction endonuclease analysis for rapid identification of Human Adenovirussubgenera. J. Clin. Microbiol. 38: 2055-2061.

6. French et al (2001) HyBeacon probes: a new tool for DNA sequence detection and allele discrimination. 25 Molecular and Cellular Probes. 15, 363-74.

7.

French et al (2002) Ultra-rapid DNA analysis using HyBeacon probes and direct PCR amplification direct from saliva. Molecular and Cellular Probes. 16, 319-26.

8.

Hawkins et al (1997) Fluorescence properties of pteridine nucleoside analogs as monomers and incorporated into oligonucleotides. Anal. Biochem. 244, 86-95.

30 9. Heinlein et al (2003) Photoinduced electron transfer between fluorescent dyes and guanosine residues DNAhairpins. J. Phys. Chem. 107, 7957-7964.

10. Knemeyer et al (2000). Probes for detection of specific DNA sequences at the single-molecule level. Anal. Chem. 72, 3717-24.

11. Lee et al (1994) A fluorogenic assay for DNA cleavage reactions characterized with BamHI restriction 35 endonucleoase. Anal. Biochem. 220, 377-83.

12.

Lee et al (2002) ResonSense: simple linear fluorescent probes for quantitative homogeneous rapid polymerase chain reaction. Analytica Chimica Acta 457, 61-70.

13.

Marks et al (2005) Molecular basis of action of HyBeacon fluorogenic probes: A spectroscopic and molecular dynamics study. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics 23, 49-62.

40 14. Nazerenko et al (2002) Multiplex quantitative PCR using self-quenched primers labeled with a single fluorophore. Nucleic Acids Res. 30, e37.

15. Nazerenko et al (2002b) Effect of primary and secondary structure of oligodeoxyribonucleotides on the fluorescent properties of conjugated dyes. Nucleic Acids Res. 30, 2089-2195.

16. Norlund et al (1989) Structure and dynamics of a fluorescent DNA oligomer containing the EcoRI recognition 45 sequence: fluorescence, molecular dynamics and NMR studies. Biochemistry 28, 9095-9103.

17.

Seidel et al (1996) Nucleobase-specific quenching of fluorescent dyes. 1.Nucleobase one-electron redox potentials and their correlation with static and dynamic quenching efficiencies. J. Phys. Chem., 100, 5541-5553.

18.

Solinas et al (2001) Duplex Scorpion primers in SNP assays and FRET applications. Nucleic Acids Res. 29, e96.

50 19. Svanvik et al (2000) Detection of PCR products in real time using light-up probes. Analytical Biochemistry 287, 179-182.

20.

Thelwell et al (2000) Mode of action and application of Scorpion Primers to mutation detection. Nucleic Acids Res. 28, 3752-3761.

21.

Tyagi y Kramer (1996) Molecular Beacons: probes that fluoresce upon hybridisation. Nature Biotechnology 14, 303-308.

22.

Whitcombe et al (1999) Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence. Nature Biotechnology 17, 804-807.

23.

Xu et al (1994) Melting and premelting transitions of an oligomer measured by DNA base fluorescence and absorption. Biochemistry 33, 9592-9599.

24.

Zucker (2003) Mfold web server for nucleic acid folding and hybridisation prediction. Nucleic Acids Res. 31, 3406-3415.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> LGC Limited

<120> Oligonucleótidos

<130> LGCBW/P35723PC

<140> Not yet known

<141> Not yet known

<150> GB 0514889.5

<151>

<160> 143

<170> PatentIn versión 3.1

<210> SEC ID Nº 1

<211> LONGITUD: 23

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (11)...(11)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia C6 FAM dU

<400> SECUENCIA: 1 GAGAGGAATC FGGTACCTGG ACC

<210> SEC ID Nº 2

<211> LONGITUD: 21

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 2 CCTCTAGAAT TAATTTCTGG G

<210> SEC ID Nº 3

<211> LONGITUD: 22

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 3 CTGCTCTCTC CTGATTTGGT CC

<210> SEC ID Nº 4

<211> LONGITUD: 23

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 4 GGTCCAGGTA CCAGATTCCT CTC

<210> SEC ID Nº 5

<211> LONGITUD: 24

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 5 GGTCCAAGTA CCAGATTCC TCTC

<210> SEC ID Nº 6

<211> LONGITUD: 24

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (8)...(8)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia C6 FAM dU

<400> SECUENCIA: 6 GAAGTGCFGA AAAATATATT TAAG

<210> SEC ID Nº 7

<211> LONGITUD: 24

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 7 CCTATAGAAA ATTCAATTAT AAAG

<210> SEC ID Nº 8

<211> LONGITUD: 20

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 8 CACGAGATTT CTCCCCAAGG

<210> SEC ID Nº 9

<211> LONGITUD: 24

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 9 CTTAAATATA TTTTTCAGCA CTTC

<210> SEC ID Nº 10

<211> LONGITUD: 24

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 10 CTTAAATATA TTTCTCAGCA CTTC

<210> SEC ID Nº 11

<211> LONGITUD: 20

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified base

<222> LOCALIZACIÓN: (9)...(9)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia C6 FAM dU

<400> SECUENCIA: 11 CCTGGTGAFG AATCCCTTAC

<210> SEC ID Nº 12

<211> LONGITUD: 24

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 12 CCTATAGAAA ATTCAATTAT AAAG

<210> SEC ID Nº 13

<211> LONGITUD: 20

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 13 CACGAGATTT CTCCCCAAGG

<210> SEC ID Nº 14

<211> LONGITUD: 20

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 14 GTAAGGGATT CATCACCAGG

<210> SEC ID Nº 15

<211> LONGITUD: 20

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 15 GTAAGGGATC CATCACCAGG

<210> SEC ID Nº 16

<211> LONGITUD: 25

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (13)...(13)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia Glen Fluoresceína dT

<400> SECUENCIA: 16 CTTTAAAATA CAFTTTTTAT TATTA

<210> SEC ID Nº 17

<211> LONGITUD: 30

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 17 TAATAATAAA AAATGTATTT TAAAGATGGC

<210> SEC ID Nº 18

<211> LONGITUD: 30

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 18 TAATAATAAT AAATGTATTT TAAAGATGGC

<210> SEC ID Nº 19

<211> LONGITUD: 30

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens <400> SECUENCIA: 19 TAATAATAAT AAATGTCTTT TAAAGATGGC

<210> SEC ID Nº 20

<211> LONGITUD: 30

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 20 TAATAATAAA AAATGTCTTT TAAAGATGGC

<210> SEC ID Nº 21

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (6)...(6)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia C6 FAM dU

<400> SECUENCIA: 21 CTGTAFTCCT CGCCTGTCC

<210> SEC ID Nº 22

<211> LONGITUD: 29

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 22 GGACTACTTC TAATCTGTAA GAGCAGATC

<210> SEC ID Nº 23

<211> LONGITUD: 31

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 23 GCCCCATTAT TTAGCCAGGA GACCTAACAT G

<210> SEC ID Nº 24

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 24 GGACAGGCGA GGAATACAG

<210> SEC ID Nº 25

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 25 GGACAGGCAA GGAATACAG

<210> SEC ID Nº 26

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (12)...(12)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia C6 FAM dU <400> SECUENCIA: 26 GTGCACCTGA CFCCTGTGG

<210> SEC ID Nº 27

<211> LONGITUD: 21

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 27 AGGGCAGAGC CATCTATTGC T

<210> SEC ID Nº 28

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 28 CATCCACGTT CACCTTGCC

<210> SEC ID Nº 29

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 29 CCACAGGAGT CAGGTGCAC

<210> SEC ID Nº 30

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 30 CCTCAGGAGT CAGGTGCAC

<210> SEC ID Nº 31

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 31 CCTTAGGAGT CAGGTGCAC

<210> SEC ID Nº 32

<211> LONGITUD: 23

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Chlamydia trachomatis

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (13)...(13)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia C6 FAM dU

<400> SECUENCIA: 32 CAAGCCTGCA AAFGTATACC AAG

<210> SEC ID Nº 33

<211> LONGITUD: 30

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Chlamydia trachomatis

<400> SECUENCIA: 33 GGGTTCGTTG TAGAGCCATG TCCTATCTTG

<210> SEC ID Nº 34

<211> LONGITUD: 30

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Chlamydia trachomatis

<400> SECUENCIA: 34 CGCAGCTGCT GTAATCACCC AGTCGATAAA

<210> SEC ID Nº 35

<211> LONGITUD: 23

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Chlamydia trachomatis

<400> SECUENCIA: 35 CTTGGTATAC ATTTGCAGGC TTG

<210> SEC ID Nº 36

<211> LONGITUD: 23

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Chlamydia trachomatis

<400> SECUENCIA: 36 CTTGGTATAC ATTTACAGGC TTG

<210> SEC ID Nº 37

<211> LONGITUD: 23

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Artificial SECUENCIA

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (12)...(12)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia C6 FAM dU

<400> SECUENCIA: 37 TTTTTTTTTT TFTTTTTTTT TTT

<210> SEC ID Nº 38

<211> LONGITUD: 23

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<400> SECUENCIA: 38 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA

<210> SEC ID Nº 39

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (8)...(8)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia C6 FAM dU

<400> SECUENCIA: 39 GATTATTFCC CAGGAACCC

<210> SEC ID Nº 40

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 40 GGGTTCCTGG GAAATAATC

<210> SEC ID Nº 41

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 41 GGGTTCCCGG GAAATAATC

<210> SEC ID Nº 42

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (5)...(5)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia C6 FAM dU

<400> SECUENCIA: 42 TACCFGGATC CAGGGGGTG

<210> SEC ID Nº 43

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 43 CACCCCCTGG ATCCAGGTA

<210> SEC ID Nº 44

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 44 CACCCCCTGA ATCCAGGTA

<210> SEC ID Nº 45

<211> LONGITUD: 20

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Hepatitis B virus

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (11)...(11)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia C6 FAM dU

<400> SECUENCIA: 45 AAGAACTCCC FCGCCTCGCA

<210> SEC ID Nº 46

<211> LONGITUD: 20

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Hepatitis B virus

<400> SECUENCIA: 46 TGCGAGGCGA GGGAGTTCTT

<210> SEC ID Nº 47

<211> LONGITUD: 21

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Plasmodium junxanuclease

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (13)...(13)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia C6 FAM dU <400> SECUENCIA: 47 GAGACGAACA ACFGCGAAAG C

<210> SEC ID Nº 48

<211> LONGITUD: 21

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Plasmodium junxanuclease

<400> SECUENCIA: 48 GCTTTCGCAG TTGTTCGTCT C

<210> SEC ID Nº 49

<211> LONGITUD: 22

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Herpes simplex virus TIPO 1 (HSV-1)

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (13)...(13)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia C6 FAM dU

<400> SECUENCIA: 49 GGACACCGGC GCFACTTCAC CT

<210> SEC ID Nº 50

<211> LONGITUD: 22

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Herpes simplex virus TIPO 1 (HSV-1)

<400> SECUENCIA: 50 AGGTGAAGTA GCGCCGGTGT CC

<210> SEC ID Nº 51

<211> LONGITUD: 16

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (6)...(6)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia C6 FAM dU

<400> SECUENCIA: 51 GGGCGFCCTG GGGGAG

<210> SEC ID Nº 52

<211> LONGITUD: 16

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 52 CTCCCCCAGG ACGCCC

<210> SEC ID Nº 53

<211> LONGITUD: 16

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 53 CTCCCCCAAG ACGCCC

<210> SEC ID Nº 54

<211> LONGITUD: 20

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (13)...(13)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia C6 FAM dU

<400> SECUENCIA: 54 CATTGAGGAC TGFGTTCAAG

<210> SEC ID Nº 55

<211> LONGITUD: 20

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 55 CTTGAACACA GTCCTCAATG

<210> SEC ID Nº 56

<211> LONGITUD: 20

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 56 CTTGAACACG GTCCTCAATG

<210> SEC ID Nº 57

<211> LONGITUD: 20

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (13)...(13)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia C6 FAM dU

<400> SECUENCIA: 57 CATTGAGGAC CGFGTTCAAG

<210> SEC ID Nº 58

<211> LONGITUD: 20

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Neisseria gonorrhoeae

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (6)...(6), (12)...(12)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia C6 FAM dU

<400> SECUENCIA: 58 TCTGCFTCCG CFACGGCTTC

<210> SEC ID Nº 59

<211> LONGITUD: 20

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Neisseria gonorrhoeae

<400> SECUENCIA: 59 GAAGCCGTAG CGGAAGCAGA

<210> SEC ID Nº 60

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (6)...(6), (15)...(15)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia C6 FAM dU

<400> SECUENCIA: 60 CTGTAFTCCT CGCCFGTCC

<210> SEC ID Nº 61

<211> LONGITUD: 23

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Chlamydia trachomatis

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (7)...(7), (13)...(13)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia C6 FAM dU

<400> SECUENCIA: 61 CAAGCCFGCA AAFGTATACC AAG

<210> SEC ID Nº 62

<211> LONGITUD: 22

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Influenza

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (8)...(8), (14)...(14)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia C6 FAM dU

<400> SECUENCIA: 62 ATGGGAAFGG GGAFCCAAAT AA

<210> SEC ID Nº 63

<211> LONGITUD: 22

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Influenza

<400> SECUENCIA: 63 TTATTTGGAT CCCCATTCCC AT

<210> SEC ID Nº 64

<211> LONGITUD: 27

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (8)...(8), (14)...(14)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia C6 FAM dU

<400> SECUENCIA: 64 GGGGTCTFCC ACTFGGAGAA AGCTATC

<210> SEC ID Nº 65

<211> LONGITUD: 27

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

<400> SECUENCIA: 65 GATAGCTTTC TCCAAGTGGA AGACCCC

<210> SEC ID Nº 66

<211> LONGITUD: 26

<212> TIPO: AND

<213> ORGANISMO: Influenza

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (5)...(5), (11)...(11)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia C6 FAM dU

<400> SECUENCIA: 66 GGGAFCCAAA FAACATGGAC AGAGCT

<210> SEC ID Nº 67

<211> LONGITUD: 26

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Influenza

<400> SECUENCIA: 67 AGCTCTGTCC ATGTTATTTG GATCCC

<210> SEC ID Nº 68

<211> LONGITUD: 24

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Adenovirus C

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (8)...(8), (14)...(14)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia C6 FAM dU

<400> SECUENCIA: 68 GACGTGGFCC GTGFGCACCA GCCT

<210> SEC ID Nº 69

<211> LONGITUD: 24

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Adenovirus C

<400> SECUENCIA: 69 AGGCTGGTGC ACACGGACCA CGTC

<210> SEC ID Nº 70

<211> LONGITUD: 24

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Adenovirus D

<400> SECUENCIA: 70 AGGCTGGTGC ACTCTGACCA CGTC

<210> SEC ID Nº 71

<211> LONGITUD: 24

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Adenovirus D

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (8)...(8), (14)...(14)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia C6 FAM dU

<400> SECUENCIA: 71 GACGTGGFCA GAGFGCACCA GCCT

<210> SEC ID Nº 72

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (8)...(8), (14)...(14)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Glen amino-dC marcado con FAM post-síntesis

<400> SECUENCIA: 72 CTGTATTFCT CGCFTGTCC

<210> SEC ID Nº 73

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (13)...(13)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Glen amino-dA marcado con FAM post-síntesis

<400> SECUENCIA: 73 GGACAGGCAA GGFATACAG

<210> SEC ID Nº 74

<211> LONGITUD: 20

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Neisseria gonorrhoeae

<400> SECUENCIA: 74 ACTTTGGCGA TATTGCTCGG

<210> SEC ID Nº 75

<211> LONGITUD: 20

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Neisseria gonorrhoeae

<400> SECUENCIA: 75 TACCGAGAAC GAACGCGACA

<210> SEC ID Nº 76

<211> LONGITUD: 29

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Adenovirus

<400> SECUENCIA: 76 GACATGACTT TCGAGGTCGA TCCCATGGA

<210> SEC ID Nº 77

<211> LONGITUD: 23

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Adenovirus

<400> SECUENCIA: 77 GCCGAGAAGG GCGTGCGCAG GTA

<210> SEC ID Nº 78

<211> LONGITUD: 20

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Influenza

<400> SECUENCIA: 78 GGACTGCAGC GTAGACGCTT

<210> SEC ID Nº 79

<211> LONGITUD: 23

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Influenza

<400> SECUENCIA: 79 ATTTCTTTGG CCCCATGGAA TGT

<210> SEC ID Nº 80

<211> LONGITUD: 22

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (8)...(8)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia C6 FAM dU

<400> SECUENCIA: 80 GGGGTCTFCC ACTTGGAGAA AG

<210> SEC ID Nº 81

<211> LONGITUD: 26

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

<400> SECUENCIA: 81 CTTGCGGTTG ATCGTGCTCC GATGAC

<210> SEC ID Nº 82

<211> LONGITUD: 30

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

<400> SECUENCIA: 82 CATTATTGAC CTGACCATAA TCTTGATGCC

<210> SEC ID Nº 83

<211> LONGITUD: 18

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Ovis aries

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (7)...(7)

<223> OTRA INFORMACIÓN: C6 FAM dU

<400> SECUENCIA: 83 GGGAAGFGCC ATGAGCAG

<210> SEC ID Nº 84

<211> LONGITUD: 18

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Ovis aries

<400> SECUENCIA: 84 CTGCTCATGG CACTTCCC

<210> SEC ID Nº 85

<211> LONGITUD: 20

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Ovis aries

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (8)...(8)

<223> OTRA INFORMACIÓN: C6 FAM dU

<400> SECUENCIA: 85 CAGTGGAFCG GTATAGTAAC

<210> SEC ID Nº 86

<211> LONGITUD: 20

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Ovis aries <400> SECUENCIA: 86 GTTACTATAC CGATCCACTG

<210> SEC ID Nº 87

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (5)...(5)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia C6 FAM dU

<400> SECUENCIA: 87 GTATFCCTCG CCTGTCCAG

<210> SEC ID Nº 88

<211> LONGITUD: 22

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (7)...(7)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia C6 FAM dU

<400> SECUENCIA: 88 CTTCAAFTGT TTGAGGTTCA AG

<210> SEC ID Nº 89

<211> LONGITUD: 22

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 89 CTTGAACCTC AAACAATTGA AG

<210> SEC ID Nº 90

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (5)...(5), (13)...(13)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Glen amino-dA marcado con FAM post-síntesis

<400> SECUENCIA: 90 GGACFGGCAA GGFATACAG

<210> SEC ID Nº 91

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 91 CTGTATACCT TGCCTGTCC

<210> SEC ID Nº 92

<211> LONGITUD: 25

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 92 GACTACTTCT AATCTGTAAG AGCAG

<210> SEC ID Nº 93

<211> LONGITUD: 20

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 93 CCATTATTTA GCCAGGAGAC

<210> SEC ID Nº 94

<211> LONGITUD: 20

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: misc_CARACTERÍSTICA

<222> LOCALIZACIÓN: (20)...(20)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Colorante 5’ de FAM

<400> SECUENCIA: 94 CTGTATTCCT CGCCTGTCCF

<210> SEC ID Nº 95

<211> LONGITUD: 20

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: misc_CARACTERÍSTICA

<222> LOCALIZACIÓN: (1)...(1)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Colorante 3’ de FAM

<400> SECUENCIA: 95 FCTGTATTCC TCGCCTGTCC

<210> SEC ID Nº 96

<211> LONGITUD: 23

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Chlamydia trachomatis

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (7)...(7), (13)...(13), (15)...(15)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia Glen Fluoresceína dT

<400> SECUENCIA: 96 CAAGCCFGCA AAFGFATACC AAG

<210> SEC ID Nº 97

<211> LONGITUD: 23

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (7)...(7), (13)...(13), (15)...(15), (17)...(17)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia Glen Fluoresceína dT

<400> SECUENCIA: 97 CAAGCCFGCA AAFGFAFACC AAG

<210> SEC ID Nº 98

<211> LONGITUD: 142

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<400> SECUENCIA: 98

<210> SEC ID Nº 99

<211> LONGITUD: 25

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Staphylococcus aureus (MRSA)

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (6)...(6), (15)...(15)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia Glen Fluoresceína dT

<400> SECUENCIA: 99 CGTAGFTACT GCGTFGTAAG ACGTC

<210> SEC ID Nº 100

<211> LONGITUD: 25

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Staphylococcus aureus (MRSA)

<400> SECUENCIA: 100 GACGTCTTAC AACGCAGTAA CTACG

<210> SEC ID Nº 101

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (15)...(15)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia Glen Fluoresceína dT

<400> SECUENCIA: 101 CTGTATTCCT CGCCFGTCC

<210> SEC ID Nº 102

<211> LONGITUD: 23

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Chlamydia trachomatis

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (7)...(7), (13)...(13), (17)...(17)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia Glen Fluoresceína dT

<400> SECUENCIA: 102 CAAGCCFGCA AAFGTAFACC AAG

<210> SEC ID Nº 103

<211> LONGITUD: 28

<212> TIPO: ADN.

<213> ORGANISMO: Chlamydia trachomatis

<400> SECUENCIA: 103 CTTGGTATAC ATTTGCAGGC TTGATTAC

<210> SEC ID Nº 104

<211> LONGITUD: 28

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Chlamydia trachomatis

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (5)...(5), (12)...(12), (18)...(18)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia Glen Fluoresceína dT

<400> SECUENCIA: 104 GTAAFCAAGC CFGCAAAFGT ATACCAAG

<210> SEC ID Nº 105

<211> LONGITUD: 23

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Chlamydia trachomatis

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (7)...(7)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia Glen Fluoresceína dT

<400> SECUENCIA: 105 CAAGCCFGCA AATGTATACC AAG

<210> SEC ID Nº 106

<211> LONGITUD: 23

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Chlamydia trachomatis

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (17)...(17)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia Glen Fluoresceína dT

<400> SECUENCIA: 106 CAAGCCTGCA AATGTAFACC AAG

<210> SEC ID Nº 107

<211> LONGITUD: 23

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Chlamydia trachomatis

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (13)...(13), (17)...(17)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia Glen Fluoresceína dT

<400> SECUENCIA: 107 CAAGCCTGCA AAFGTAFACC AAG

<210> SEC ID Nº 108

<211> LONGITUD: 23

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Chlamydia trachomatis

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (7)...(7), (17)...(17)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia Glen Fluoresceína dT

<400> SECUENCIA: 108 CAAGCCFGCA AATGTAFACC AAG

<210> SEC ID Nº 109

<211> LONGITUD: 22

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (4)...(4), (16)...(16)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia Glen Fluoresceína dT

<400> SECUENCIA: 109 GTCFGCGGGA GCCGAFTTCA TC

<210> SEC ID Nº 110

<211> LONGITUD: 22

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 110 GATGAAATCG GCTCCCGCAG AC

<210> SEC ID Nº 111

<211> LONGITUD: 22

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 111 GATGAAATCG ACTCCCGCAG AC

<210> SEC ID Nº 112

<211> LONGITUD: 23

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (7)...(7), (16)...(16)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia Glen Fluoresceína dT

<400> SECUENCIA: 112 GACCAGFGAA GCAAGFGTCT TTG

<210> SEC ID Nº 113

<211> LONGITUD: 23

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 113 CAAAGACACT TGCTTCACTG GTC

<210> SEC ID Nº 114

<211> LONGITUD: 23

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 114 CAAAGACACT TTCTTCACTG GTC

<210> SEC ID Nº 115

<211> LONGITUD: 22

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (5)...(5), (15)...(15)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia Glen Fluoresceína dT

<400> SECUENCIA: 115 GCATFGAGGC TCGCFGAGAG TC

<210> SEC ID Nº 116

<211> LONGITUD: 22

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 116 GACTCTCAGC GAGCCTCAAT GC

<210> SEC ID Nº 117

<211> LONGITUD: 22

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 117 GACTCTCAGC AAGCCTCAAT GC

<210> SEC ID Nº 118

<211> LONGITUD: 22

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 118 CTGGGCTC CTGGAACCAA TC

<210> SEC ID Nº 119

<211> LONGITUD: 21

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 119 GCTGCCCATG AATAGCACTG G

<210> SEC ID Nº 120

<211> LONGITUD: 20

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 120 CCCAAGGAGG AGCTGCTGAA

<210> SEC ID Nº 121

<211> LONGITUD: 20

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 121 CCATTCCGGT TTGGTTCTCC

<210> SEC ID Nº 122

<211> LONGITUD: 23

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 122 CTGACCTGAA GCACTTGAAG GAG

<210> SEC ID Nº 123

<211> LONGITUD: 25

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<400> SECUENCIA: 123 GCGGAAGAAT GTGTCAGCCT CAAAG

<210> SEC ID Nº 124

<211> LONGITUD: 23

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (11)...(11)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia C6 FAM dU

<400> SECUENCIA: 124 GAGAGGAATC FGGTACTTGG ACC

<210> SEC ID Nº 125

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (8)...(8)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Glen amino-dC marcado con FAM post-síntesis

<400> SECUENCIA: 125 CTGTATTFCT CGCCTGTCC

<210> SEC ID Nº 126

<211> LONGITUD: 28

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Chlamydia trachomatis

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (5)...(5), (12)...(12), (18)...(18), (22)...(22)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia Glen Fluoresceína dT

<400> SECUENCIA: 126 GTAAFCAAGC CFGCAAAFGT AFACCAAG

<210> SEC ID Nº 127

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (6)...(6), (10)...(10), (15)...(15)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia Glen Fluoresceína dT

<400> SECUENCIA: 127 CTGTAFTCCF CGCCFGTCC

<210> SEC ID Nº 128

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (10)...(10)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia Glen Fluoresceína dT

<400> SECUENCIA: 128 CTGTATTCCF CGCCTGTCC

<210> SEC ID Nº 129

<211> LONGITUD: 25

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (12)...(12), (13)...(13)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia Glen Fluoresceína dT

<400> SECUENCIA: 129 GGGGGGTTTT TFFTTTTTTG GGGGG

<210> SEC ID Nº 130

<211> LONGITUD: 25

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (12)...(12), (14)...(14)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia Glen Fluoresceína dT

<400> SECUENCIA: 130 GGGGGGTTTT TFTFTTTTTG GGGGG

<210> SEC ID Nº 131

<211> LONGITUD: 25

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (11)...(11), (14)...(14)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia Glen Fluoresceína dT

<400> SECUENCIA: 131 GGGGGGTTTT FTTFTTTTTG GGGGG

<210> SEC ID Nº 132

<211> LONGITUD: 25

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA: <221>.NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (11)...(11), (15)...(15)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia Glen Fluoresceína dT

<400> SECUENCIA: 132 GGGGGGTTTT. FTTTFTTTTG GGGGG

<210> SEC ID Nº 133

<211> LONGITUD: 25

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (10)...(10), (15)...(15)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia Glen Fluoresceína dT

<400> SECUENCIA: 133 GGGGGGTTTF TTTTFTTTTG GGGGG

<210> SEC ID Nº 134

<211> LONGITUD: 25

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (10)...(10), (16)...(16)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia Glen Fluoresceína dT

<400> SECUENCIA: 134 GGGGGGTTTF TTTTTFTTTG GGGGG

<210> SEC ID Nº 135

<211> LONGITUD: 25

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (9)...(9), (16)...(16)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia Glen Fluoresceína dT

<400> SECUENCIA: 135 GGGGGGTTFT TTTTTFTTTG GGGGG

<210> SEC ID Nº 136

<211> LONGITUD: 25

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (9)...(9), (17)...(17)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia Glen Fluoresceína dT

<400> SECUENCIA: 136 GGGGGGTTFT TTTTTTFTTG GGGGG

<210> SEC ID Nº 137

<211> LONGITUD: 25

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (8)...(8), (17)...(17)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia Glen Fluoresceína dT

<400> SECUENCIA: 137 GGGGGGTFTT TTTTTTFTTG GGGGG

<210> SEC ID Nº 138

<211> LONGITUD: 25

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (8)...(8), (18)...(18)

<223> OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluorescencia Glen Fluoresceína dT

<400> SECUENCIA: 138 GGGGGGTFTT TTTTTTTFTG GGGGG

<210> SEC ID Nº 139

<211> LONGITUD: 25

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<400> SECUENCIA: 139 CCCCCCTTTT TTTTTTTTTC CCCCC

<210> SEC ID Nº 140

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<400> SECUENCIA: 140 CTGTATTCCT CGCCTGTCC

<210> SEC ID Nº 141

<211> LONGITUD: 25

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<400> SECUENCIA: 141 CCTGGACAGG CGAGGAATAC AGGTA

<210> SEC ID Nº 142

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<400> SECUENCIA: 142 GGACAFGCAA GGTATACAG

<210> SEC ID Nº 143

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Secuencia artificial

<400> SECUENCIA: 143 GGACAFGCAA GFTATACAG

<210> SEC ID Nº 140

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (6) (6), (15) (15) <223 OTRA INFORMACIÓN:Nucleótido marcado con fluoróforo MeNPOCOH dT + TAMRA

<400> SECUENCIA 140 CTGTAXTCCTCGCCXGTCC

<210> SEC ID Nº 141

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (6) (6), (15) (15) <223 OTRA INFORMACIÓN:Nucleótido marcado con fluoróforo MeNPOCOH dT + ROX

<400> SECUENCIA 141 CTGTAXTCCT CGCCXGTCC

<210> SEC ID Nº 142

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN

<213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (6) (6), (15) (15) <223 OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido marcado con fluoróforo MeNPOCOH dT + Cy5

<400> SECUENCIA 142 5 CTGTAXTCCT CGCCXGTCC

<210> SEC ID Nº 143

<211> LONGITUD: 19

<212> TIPO: ADN 10 <213> ORGANISMO: Homo sapiens

<220> CARACTERÍSTICA:

<221> NOMBRE/CLAVE: modified_base

<222> LOCALIZACIÓN: (6) (6), (15) (15) 15 <223 OTRA INFORMACIÓN: Fluoresceína dT (F) , MeNPOCOHdT + Cy5 (X)

<400> SECUENCIA 143 CTGTAFTCCT CGCCXGTCC

Claims (43)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un oligonucleótido monocatenario, que no tiene una secuencia que contiene partes hechas de cuatro o más restos nucleotídicos consecutivos que son el complemento inverso de cada uno de los otros que permite el apareamiento intramolecular de bases, y que está formado de restos nucleotídicos donde las bases de dos o más restos nucleotídicos internos están marcadas con un fluoróforo sin un inactivador asociado, donde al menos dos de los restos nucleotídicos marcados con un fluoróforo están separados por al menos dos restos nucleotídicos no marcados, donde el resto nucleotídico 3' no contiene un hidroxilo 3' y donde cada fluoróforo es el mismo fluoróforo.

2. 2.

   Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, donde hasta aproximadamente un tercio de los restos internos están marcados con un fluoróforo.

3. 3.

   Un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde todos los restos nucleotídicos marcados con un fluoróforo están separados por al menos dos restos nucleotídicos no marcados.

4. 4.

   Un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y que contiene al menos un resto G, donde al menos uno de los restos nucleotídicos marcados con fluoróforo está posicionado adyacente a al menos uno de los restos G.

5. 5.

   Un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el resto nucleotídico 3' contiene un fosfato 3' o es un resto 3' desoxi.

6. 6.

   Un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que contiene de 10 a 50 restos nucleotídicos.

7. 7.

   Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 6 que contiene de 15 a 30 restos nucleotídicos.

8. 8.

   Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 7 que contiene de 2 a 10 restos nucleotídicos internos marcados con fluoróforo.

9. 9.

   Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 8 que contiene de 2 a 5 restos internos marcados con fluoróforo.

10. 10.

    Un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el fluoróforo se selecciona entre el grupo que consiste en colorantes basados en fluoresceína tales como 6-carboxifluoresceína (FAM), tetraclorofluoresceína (TET), hexaclorofluoresceína (HEX), colorantes basados en rodamina tales como 6carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxitetrametilrodamina (TAMRA); un colorante de la familia Cy tal como Cy3 o Cy5; otros fluoróforos tales como NED o JOE, y colorantes Alexa, colorantes Atto, colorantes Dyomic, colorantes Dyomic megastoke y colorantes Thilyte.

11. 11.

    Un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el fluoróforo no se intercala en ADN estándar bicatenario.

12. 12.

    Un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que tiene una secuencia complementaria a una secuencia polinucleotídica diana.

13. 13.

    Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 12, donde la secuencia polinucleotídica diana se selecciona entre el grupo que consiste en el genoma humano incluyendo cualquier gen en el mismo o alelo del mismo, el genoma de ratón incluyendo cualquier gen en el mismo o alelo del mismo, y el genoma de cualquier agente infeccioso incluyendo cualquier gen en el mismo o alelo del mismo; o donde el oligonucleótido tiene una secuencia complementaria al gen PrP de oveja.

14. 14.

    Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 13 que tiene una secuencia complementaria a uno cualquiera de los siguientes genes humanos o un alelo de los mismos:

    N-acetiltransferasa 2 Factor V Leiden Factor II MTHFR Anemia falciforme

15. 15.

    Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 13 que tiene una secuencia complementaria al genoma o a cualquier gen en el mismo o alelo del mismo de los siguientes agentes infecciosos:

    Chlamydia trachomatis

    Adenovirus Influenza A

    Streptococcus pneumoniae

    16 Un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 que tiene una secuencia completamente complementaria a un alelo de un gen.

16. 17.

    Un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70 % con el complemento de la secuencia polinucleotídica diana.

17. 18.

    Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 17 que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80 % con el complemento de la secuencia polinucleotídica diana.

18. 19.

    Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 16, donde la secuencia complementaria a la diferencia de la secuencia nucleotídica del alelo dado en comparación con otro alelo del gen está localizada hacia el centro del oligonucleótido.

19. 20.

    Un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, inmovilizado sobre o dentro de un soporte.

20. 21.

    Una serie de oligonucléotidos inmovilizados en localizaciones espaciadas sobre o dentro de un soporte, donde al menos uno de los oligonucléotidos es un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a

21. 19.

22. 22.

    Una serie de oligonucléotidos de acuerdo con la reivindicación 21, donde cada oligonucleótido es un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.

23. 23.

    Un método para investigar una secuencia polinucleotídica diana en una muestra que contiene secuencias polinucleotídicas, comprendiendo el método poner en contacto la muestra con un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, que es capaz de hibridar con la secuencia polinucleotídica diana, y determinar si sucede hibridación.

24. 24.

    Un método de acuerdo con la reivindicación 23, donde la detección de un aumento de la fluorescencia se usa para determinar si ha sucedido hibridación entre el oligonucleótido y la secuencia polinucleotídica diana.

25. 25.

    Un método de acuerdo con la reivindicación 23 o la reivindicación 24, donde el método se realiza a una temperatura predeterminada próxima al, o en un intervalo de temperaturas que abarca el punto de fusión del híbrido

    o de los híbridos formados entre la secuencia polinucleotídica diana y dicho oligonucleótido.

26. 26.

    Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, donde el oligonucleótido es completamente complementario a la secuencia polinucleotídica diana.

27. 27.

    Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, donde el oligonucleótido no es completamente complementario a la secuencia polinucleotídica diana.

28. 28.

    Un método de acuerdo con la reivindicación 27, donde el oligonucleótido tiene una identidad de secuencia de al menos el 70 % con el complemento de la secuencia polinucleotídica diana.

29. 29.

    Un método de acuerdo con la reivindicación 28, donde el oligonucleótido tiene una identidad de secuencia de al menos el 80 % con el complemento de la secuencia polinucleotídica diana.

30. 30.

    Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 28, donde la secuencia polinucleotídica diana investigada son uno o más alelos de un gen.

31. 31.

    Un método de acuerdo con la reivindicación 30, donde el oligonucleótido es capaz de hibridar con más de un alelo del gen.

32. 32.

    Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29, donde el método se usa para detectar, identificar o cuantificar la presencia o la cantidad de la secuencia polinucleotídica diana en la muestra.

33. 33.

    Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 30, donde la muestra contiene secuencias polinucleotídicas producidas por amplificación.

34. 34.

    Un método de acuerdo con la reivindicación 33, donde las secuencias polinucleotídicas se producen mediante una cualquiera o más de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR de transcripción inversa (RT-PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), amplificación mediada por transcripción (TMA), amplificación por círculo rodante (RCA) o amplificación basada en secuencias de ácido nucleico

    (NASBA).

35. 35.

    Un método de acuerdo con la reivindicación 33 ó 34, donde la amplificación de las secuencias polinucleotídicas en la muestra se realiza en presencia del oligonucleótido que es capaz de hibridar con la secuencia polinucleotídica diana.

36. 36.

    Un método de acuerdo con la reivindicación 35, donde la observación de la fluorescencia se hace durante la amplificación de las secuencias polinucleotídicas en la muestra.

37. 37.

    Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 33 a 36, donde las secuencias polinucleotídicas de la muestra se producen por amplificación de una fuente biológica sin extracción previa del ácido nucleico.

38. 38.

    Un método de acuerdo con la reivindicación 34, donde la PCR es una amplificación asimétrica.

39. 39.

    Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 38, donde el oligonucleótido que es capaz de hibridar con la secuencia polinucleotídica diana, la muestra que puede contener la secuencia polinucleotídica diana o ambos están inmovilizados sobre o dentro de un soporte.

40. 40.

    Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 39, donde la secuencia polinucleotídica diana se selecciona entre el grupo que consiste en el genoma humano incluyendo cualquier gen en el mismo o alelo del mismo, el genoma de ratón o cualquier gen en el mismo o alelo del mismo, y el genoma de cualquier agente infeccioso incluyendo cualquier gen en el mismo o alelo del mismo.

41. 41.

    Un proceso para preparar un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 19, comprendiendo el proceso seleccionar una secuencia polinucleotídica diana y sintetizar un oligonucleótido que tiene una secuencia complementaria al polinucleótido diana y que tiene las propiedades expuestas en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.

42. 42.

    Un proceso de acuerdo con la reivindicación 41, donde la secuencia polinucleotídica diana se selecciona entre el grupo que consiste en el genoma humano incluyendo cualquier gen en el mismo o alelo del mismo, el genoma de ratón incluyendo cualquier gen en el mismo o alelo del mismo, y el genoma de cualquier agente infeccioso incluyendo cualquier gen en el mismo o alelo del mismo.

43. 43.

    Un método para investigar una secuencia polinucleotídica diana en una muestra que contiene secuencias polinucleotídicas producidas por amplificación, comprendiendo el método poner en contacto la muestra con un oligonucleótido que es capaz de hibridar con la secuencia polinucleotídica diana y determinar si sucede hibridación, donde el oligonucleótido es un oligonucleótido monocatenario que no tiene una secuencia que contiene partes hechas de cuatro o más restos nucleotídicos consecutivos que son el complemento inverso de cada uno de los otros que permiten el apareamiento intramolecular de bases y que está formado de restos nucleotídicos, donde las bases de dos o más restos nucleotídicos internos están marcadas con un fluoróforo sin un inactivador asociado, donde al menos dos de los restos nucleotídicos marcados con un fluoróforo están separados por al menos dos restos nucleotídicos no marcados, y donde cada fluoróforo es el mismo fluoróforo.

    Fluorescencia-d(F1)/dT