ES2447843T3 - Polip�ptidos de Lutzomyia longipalpis y m�todos de uso - Google Patents

Abstract

Un polipéptido salival de Lu. longipalpis sustancialmente purificado, donde el polipéptido comprende a) una secuencia de aminoácido al menos un 80% idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidopresentada como SEC. ID. Nº: 15; b) un fragmento inmunogénico, que comprende al menos ocho aminoácidos consecutivos de la secuencia deaminoácido presentada como SEC. ID. Nº: 15, específicamente reconocido por un anticuerpo que se une deforma específica con la secuencia de aminoácido que se presenta como SEC. ID. Nº: 15; o c) la secuencia de aminoácido que se presenta como SEC. ID. Nº: 15; y donde la administración del polipéptidoa un sujeto provoca una respuesta inmune a Lu. longipalpis.

Description

Polip�ptidos de Lutzomyia longipalpis y m�todos de uso

Campo de la invenci�n

La divulgaci�n se refiere a prote�nas sustancialmente purificadas de las gl�ndulas salivales del fleb�tomo Lutzomyia longipalpis (Lu. longipalpis), o vectores recombinantes que expresan estas prote�nas, as� como a una respuesta inmune que producen estas prote�nas. Esta divulgaci�n se refiere tambi�n a la producci�n de una respuesta inmune que afecta a la supervivencia de la Leishmania.

Antecedentes

La leishmaniasis es un conjunto de enfermedades causadas por protozoos del g�nero Leishmania y que afecta a muchos millones de personas en todo el mundo. En el ser humano, la infecci�n por el par�sito se manifiesta en forma de una enfermedad cut�nea, causada principalmente por L. major, L. tropica, y L. mexicana; de una enfermedad mucocut�nea causada principalmente por L. brasiliensis; o de una enfermedad visceral causada principalmente por L. donovani y L. chagasi. En c�nidos, las infecciones por Leishmania se manifiestan como una enfermedad visceral que puede provocar unos elevados �ndices de mortalidad.

Todas las enfermedades por Leishmania se transmiten a sus hu�spedes vertebrados a trav�s de fleb�tomos, que adquieren el pat�geno al alimentarse de hu�spedes infectados y lo transmiten regurgitando el par�sito en el lugar en el que se alimentan de sangre posteriormente (Killick-Kendrick, Biology of Leishmania in phlebotomine sand flies. En Biology of the Kinetoplastida. W. Lumsden y D. Evans, compiladores. Academic Press, New York. 395, 1979).

Mientras se alimenta de sangre, el fleb�tomo saliva en la piel del hu�sped. La saliva contiene compuestos anticoagulantes, antiplaquetarios y vasodilatadores que incrementan el foco hemorr�gico en el que se alimentan los fleb�tomos (Ribeiro et al., Comp. Biochem. Physiol 4:683, 1986; Charlab et al., Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU. 26:15155, 1999). Algunos de estos componentes son tambi�n inmunomoduladores. Por ejemplo, el fleb�tomo del Nuevo Mundo Lutzomyia longipalpis contiene el p�ptido 6.5kDa, maxadilano, que es el vasodilatador m�s potente conocido (Lerner et al., J. Biol. Chem. 17:11234, 1991). Por otra parte, el propio maxadilano tiene actividades inmunosupresoras (Qureshi et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 6:665, 1996), al igual que muchos vasodilatadores persistentes, tales como la prostaglandina E2 (Makoul et al., J. Immunol. 134:2645, 1985; Santoli y Zurier, J. Immunol 143:1303, 1989; Stockman y Mumford, Exp. Hematol 2:65, 1974) y el p�ptido relacionado con el gen de la calcitonina (Nong et al., J. Immunol. 1 :45, 1989). Los fleb�tomos del Viejo Mundo no tienen maxadilano, pero en su lugar utilizan AMP y adenosina como vasodilatadores (Ribeiro et al., J. Exp. Biol 11:1551, 1999). La adenosina es tambi�n un componente inmunomodulador que promueve la producci�n de IL-10 y suprime el TNF-α. y la IL-12 en ratones (Hasko et al., J. Immunol. 10:4634, 1996; Webster, Asian Pac. J. Allergy Immunol. 2:311, 1984; Hasko et al., FASEB J. 14:2065, 2000). A pesar de lo que se sabe acerca del papel de la saliva del fleb�tomo y la transmisi�n de la enfermedad, queda mucho por saber y no existe una vacuna efectiva. Por tanto, existe una necesidad de agentes que se puedan utilizar para inducir una respuesta inmune a los organismos que causan la leishmaniasis.

Resumen

La presente divulgaci�n se refiere a prote�nas salivales de vectores fleb�tomos Lutzomyia longipalpis (Lu. longipalpis) y a los �cidos nucleicos que codifican estas prote�nas. Se divulgan, asimismo, m�todos para producir una respuesta inmune en un sujeto.

El presente proporciona polip�ptidos salivales de Lu. longipalpis sustancialmente purificados. Tambi�n se divulgan polinucle�tidos que codifican los polip�ptidos de Lu. longipalpis.

Se proporcionan m�todos para inducir una respuesta inmune utilizando una cantidad terap�uticamente efectiva de un polip�ptido salival de Lu. longipalpis sustancialmente purificado divulgado en el presente, o bien el polinucle�tido que codifica los polip�ptidos de Lu. longipalpis divulgados en el presente. En otra realizaci�n del presente, se divulgan m�todos para inhibir los s�ntomas de una infecci�n por Leishmania o para prevenir la infecci�n por Leishmania en un sujeto. Los m�todos incluyen la administraci�n al sujeto de una cantidad terap�uticamente efectiva de un polip�ptido de Lu. longipalpis, o bien de un polinucle�tido que codifica un polip�ptido de Lu. longipalpis. En dos ejemplos, sin car�cter limitador, se puede administrar m�s de un polip�ptido de Lu. longipalpis, o al menos un polip�ptido de Lu. longipalpis conjuntamente con un polip�ptido de P. ariasi o P. perniciosus.

En el presente se divulgan asimismo m�todos para diagnosticar la infecci�n por Leishmania en un sujeto. Los m�todos incluyen poner en contacto un sustrato s�lido que contiene al menos tres, seis o diez polip�ptidos de Lu. longipalpis, o bien un fragmento inmunog�nico de los mismos, con una muestra obtenida del sujeto y detectar la uni�n de un componente de la muestra con al menos un polip�ptido del sustrato s�lido. La detecci�n de la uni�n del componente con el sustrato indica que el sujeto est� infectado por Leishmania.

Se divulgan composiciones farmac�uticas que incluyen un veh�culo farmac�uticamente aceptable y un polip�ptido de Lu. longipalpis.

Lo anterior y otras caracter�sticas y ventajas se pondr�n de manifiesto m�s claramente en la siguiente descripci�n 5 detallada de diversas realizaciones, que se ofrecen con referencia a las figuras adjuntas.

Breve descripci�n de las figuras

FIG. 1 es un conjunto de gr�ficos de barras que muestran los niveles de anticuerpos contra la saliva de Lutzomyia longipalpis (Lu. longipalpis) en el suero de los individuos. Los sueros humanos se obtuvieron en el momento 0 (serolog�a anti-Leishmania negativa (S-) o DTH negativa (DTH-)) y 6 meses m�s tarde (serolog�a anti-Leishmania positiva (S+) o DTH anti-Leishmania positiva (DTH+)). Se realiz� un ensayo de inmunosorci�n enzim�tica (ELISA) con estos sueros utilizando la sonicaci�n de las gl�ndulas salivales del fleb�tomo Lu. longipalpis. La FIG. 1A es un gr�fico de barras de los niveles de IgG anti-saliva en individuos que pasaron de S-→ S+ y los que pasaron de DTH

15 a DTH+. La FIG. 1B es un gr�fico de barras de los niveles de IgE anti-saliva en los individuos descritos en la FIG. 1A. La FIG. 1C es un gr�fico de barras de los niveles de IgGI anti-saliva en los individuos descritos en la FIG. 1A. La FIG. 1D es un gr�fico de barras de los niveles de IgG4 anti-saliva en los individuos descritos en la FIG. 1A. Se emple� la prueba comparativa de Wilcoxon no param�trica para comparar los niveles de anticuerpos contra saliva de Lu. longipalpis en el momento 0 y despu�s de 6 meses. El valor P < 0,05 se estableci� como nivel de significaci�n.

La FIG. 2 es un conjunto de dos im�genes digitales y un gr�fico de barras que muestra prote�nas salivales reconocidas mediante an�lisis Western blot. Las FIG. 2A y 2B son im�genes digitales de un Western blot de prote�nas salivales de Lu. longipalpis que reaccionan con sueros humanos de los individuos que pasaron de S-→

25 S+ en Leishmania (bandas 1-6) o de DTH-→DTH+ en Leishmania (bandas 7—14). S�mbolos:— , momento 0; +, 6 meses. La FIG. 2C es un gr�fico de barras de la frecuencia de prote�nas salivales reconocidas por sueros de 13 individuos que pasaron de DTB-→ DTH+ en Leishmania. El eje X muestra las diferentes prote�nas salivales de Lu. longipapis (etiquetadas por el peso molecular aproximado) reconocido por an�lisis Western blot, mientras que el eje Y indica el n�mero de sueros humanos que reconocen una prote�na salival concreta.

Listado de secuencias

Las secuencias de amino�cidos y �cidos nucleicos que se recogen en el siguiente listado de secuencias se muestran utilizando las abreviaturas de letras est�ndar para las bases de nucle�tidos y un c�digo de tres letras para

35 los amino�cidos, tal como se define en 37 C.F.R. 1.822. Solamente se muestra una cadena de cada secuencia de �cidos nucleicos, pero se entiende que la cadena complementaria est� incluida por referencia a la cadena mostrada. En el listado de secuencias adjunto:

SEC. ID. N�: 1 es la secuencia de amino�cidos de LJL34. SEC. ID. N�: 2 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJL34. SEC. ID. N�: 3 es la secuencia de amino�cidos de LJL18. SEC. ID. N�: 4 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJL18. SEC. ID. N�: 5 es la secuencia de amino�cidos de LJS193. SEC. ID. N�: 6 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJS193.

45 SEC. ID. N�: 7 es la secuencia de amino�cidos de LJS201. SEC. ID. N�: 8 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJS201. SEC. ID. N�: 9 es la secuencia de amino�cidos de LJL13. SEC. ID. N�: 10 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJL13. SEC. ID. N�: 11 es la secuencia de amino�cidos de LJL23. SEC. ID. N�: 12 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJL23. SEC. ID. N�: 13 es la secuencia de amino�cidos de LJM10. SEC. ID. N�: 14 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJM10. SEC. ID. N�: 15 es la secuencia de amino�cidos de LJL143. SEC. ID. N�: 16 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJL143.

55 SEC. ID. N�: 17 es la secuencia de amino�cidos de LJS142. SEC. ID. N�: 18 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJS142. SEC. ID. N�: 19 es la secuencia de amino�cidos de LJL17. SEC. ID. N�: 20 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJL17. SEC. ID. N�: 21 es la secuencia de amino�cidos de LJM06. SEC. ID. N�: 22 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJM06. SEC. ID. N�: 23 es la secuencia de amino�cidos de LJM17. SEC. ID. N�: 24 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJM17. SEC. ID. N�: 25 es la secuencia de amino�cidos de LJL04. SEC. ID. N�: 26 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJL04.

65 SEC. ID. N�: 27 es la secuencia de amino�cidos de LJMl 14. SEC. ID. N�: 28 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJMl 14.

SEC. ID. N�: 29 es la secuencia de amino�cidos de LJMl 11. SEC. ID. N�: 30 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJMl 11. SEC. ID. N�: 31 es la secuencia de amino�cidos de LJM78. SEC. ID. N�: 32 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJM78.

5 SEC. ID. N�: 33 es la secuencia de amino�cidos de LJS238. SEC. ID. N�: 34 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJS238. SEC. ID. N�: 35 es la secuencia de amino�cidos de LJS169. SEC. ID. N�: 36 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJS169. SEC. ID. N�: 37 es la secuencia de amino�cidos de LJL11. SEC. ID. N�: 38 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJL11. SEC. ID. N�: 39 es la secuencia de amino�cidos de LJL08. SEC. ID. N�: 40 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJL08. SEC. ID. N�: 41 es la secuencia de amino�cidos de LJS105. SEC. ID. N�: 42 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJS105.

15 SEC. ID. N�: 43 es la secuencia de amino�cidos de LJL09. SEC. ID. N�: 44 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJL09. SEC. ID. N�: 45 es la secuencia de amino�cidos de LJL38. SEC. ID. N�: 46 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJL38. SEC. ID. N�: 47 es la secuencia de amino�cidos de LJM04. SEC. ID. N�: 48 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJM04. SEC. ID. N�: 49 es la secuencia de amino�cidos de LJM26. SEC. ID. N�: 50 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJM26. SEC. ID. N�: 51 es la secuencia de amino�cidos de LJS03. SEC. ID. N�: 52 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJS03.

25 SEC. ID. N�: 53 es la secuencia de amino�cidos de LJS192. SEC. ID. N�: 54 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJS192. SEC. ID. N�: 55 es la secuencia de amino�cidos de LJM19. SEC. ID. N�: 56 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJM19. SEC. ID. N�: 57 es la secuencia de amino�cidos de LJL138. SEC. ID. N�: 58 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJL138. SEC. ID. N�: 59 es la secuencia de amino�cidos de LJL15. SEC. ID. N�: 60 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJL15. SEC. ID. N�: 61 es la secuencia de amino�cidos de LJL91. SEC. ID. N�: 62 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJL91.

35 SEC. ID. N�: 63 es la secuencia de amino�cidos de LJM11. SEC. ID. N�: 64 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJM11. SEC. ID. N�: 65 es la secuencia de amino�cidos de LJS138. SEC. ID. N�: 66 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJS138. SEC. ID. N�: 67 es la secuencia de amino�cidos de LJL124. SEC. ID. N�: 68 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJL124. SEC. ID. N�: 69 es la secuencia de amino�cidos de LJL35. SEC. ID. N�: 70 es la secuencia de �cidos nucleicos de LJL35. SEC. ID. N�: 71 es un oligonucle�tido cebador. SEC. ID. N�: 72 es un oligonucle�tido cebador.

45 SEC. ID. N�: 73 es un oligonucle�tido cebador.

Descripci�n detallada

I. Abreviaturas

AAV virus adenoasociados AcNPV Virus de la polihedrosis nuclear Autographa California alum fosfato de aluminio o hidr�xido de aluminio BCG Bacilo de Calmette-Gu�rin BLAST Herramienta de b�squeda de alineamientos locales b�sicos

55 BSA alb�mina de suero bovino CAV adenovirus canino CDR regi�n determinante de la complementariedad CHV herpesvirus canino CMV citomegalovirus CTL linfocitos T citot�xicos DMRIE N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)-l-propanamonio DOPE dioleoil-fosfatidil-etanolamina DTH hipersensibilidad tard�a fMLP N-formil-metionil-leucil-fenilalanina

65 GM-CSF factor estimulante de colonias de granulocitos y macr�fagos H cadenas pesadas

HLB balance hidrof�lico-lipof�lico ID intrad�rmico IM intramuscular ISS secuencia inmunoestimulante

5 KLH hemocianina de lapa californiana L cadenas ligeras LB caldo Luria

Lu. longipalpis Lutzomyia logipalpis

MVA Virus Vaccinia modificado de Ankara OFR marco abierto de lectura

P. ariasi Phlebotomus ariasi PCR reacci�n en cadena de la polimerasa polyA se�al de poliadenilaci�n

P. papatasi Phlebotomus papatasi

15 PVDF fluoruro de polivinilideno SC subcut�neo SCA anticuerpo de cadena sencilla sFv prote�nas de uni�n a ant�geno de cadena sencilla SGH homogeneizado de las gl�ndulas salivales SPGA (sacarosa, fosfato, glutamato y alb�mina) tPA activador tisular del plasmin�geno VH regi�n variable de la cadena pesada VL regi�n variable de la cadena ligera VL leishmaniasis visceral

II. T�rminos

A menos que se indique lo contrario, los t�rminos t�cnicos se usan con arreglo al uso convencional. Las definiciones de t�rminos comunes en biolog�a molecular se pueden encontrar en Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 87-9); Kendrew et al. (comp.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (comp.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081569-8).

35 A fin de facilitar la revisi�n de las diversas realizaciones de la divulgaci�n, se facilitan las siguientes explicaciones de t�rminos concretos:

Amplificaci�n de una mol�cula de �cido nucleico (por ejemplo, una mol�cula de ADN o ARN): Una t�cnica que incrementa el n�mero de copias de una mol�cula de �cido nucleico en una muestra. Un ejemplo de amplificaci�n es la reacci�n en cadena de la polimerasa, en la que la muestra biol�gica recogida de un sujeto se pone en contacto con un par de cebadores oligonucle�tidos en unas condiciones que permiten la hibridaci�n de los cebadores con un �cido nucleico molde en la muestra. Los cebadores se elongan en condiciones adecuadas, se disocian del molde y se renaturalizan, se elongan y disocian para amplificar el n�mero de copias de �cido nucleico. El producto de la amplificaci�n se puede caracterizar mediante electroforesis, patrones de clivaje de endonucleasas de restricci�n,

45 uni�n o hibridaci�n de oligonucle�tidos y/o secuenciaci�n de �cido nucleico utilizando t�cnicas est�ndar. Otros ejemplos de amplificaci�n incluyen la amplificaci�n por desplazamiento de la cadena, tal como se divulga en la Patente estadounidense n� 5.744.311; la amplificaci�n isot�rmica sin transcripci�n, tal como se divulga en la Patente estadounidense n� 6.033.881; amplificaci�n por reacci�n en cadena de amplificaci�n, tal como se divulga en WO 90/01069; amplificaci�n por reacci�n en cadena de ligasa, tal como se divulga en EP 0320308; amplificaci�n por reacci�n en cadena de ligasa con relleno de huecos, tal como se divulga en la Patente estadounidense n� 5.427.930; y amplificaci�n sin transcripci�n de ARN NASBA™, tal como se divulga en la Patente estadounidense n� 6.025.134.

Anticuerpo: Mol�culas de inmunoglobulina y porciones inmunol�gicamente activas de mol�culas de inmunoglobulina, es decir, mol�culas que contienen un sitio de uni�n a ant�geno que se une espec�ficamente a

55 (inmunorreacciona con) un ant�geno.

Un anticuerpo naturalmente presente (por ejemplo, IgG, IgM, IgD) incluye cuatro cadenas de polip�ptidos, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro. Sin embargo, se ha demostrado que la funci�n de uni�n a ant�geno de un anticuerpo se puede realizar con fragmentos de un anticuerpo naturalmente presente. De este modo, estos fragmentos de uni�n a ant�geno tambi�n se designar�n por el t�rmino "anticuerpo". Algunos ejemplos concretos, a t�tulo meramente enunciativo, de fragmentos de uni�n incluidos en el t�rmino anticuerpo son (i) un fragmento Fab que se compone de los dominios VL, VH; CL, y CH1; (ii) un fragmento Fd que se compone de los dominios VH y CH1; (iii) un fragmento Fv que se compone de los dominios VL y VH de un anticuerpo, (iv) un fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989) que se compone de un dominio VH ; (v)

65 una regi�n determinante de la complementariedad (CDR) aislada; y (vi) un fragmento F(ab')2 , un fragmento bivalente que se compone de dos fragmentos Fab unidos por un puente de disulfuro en la regi�n bisagra.

Las inmunoglobulinas y ciertas variantes de las mismas son conocidas; muchas han sido preparadas en cultivo de c�lulas recombinantes (v�ase, por ejemplo, la Patente estadounidense n� 4.745.055; la Patente estadounidense n� 4.444.487; WO 88/03565; EP 0256654; EP 0120694; EP 0125023; Faoulkner et al., Nature 298:286, 1982; Morrison,

5 J. Immunol. 123:793, 1979; Morrison et al., Ann Rev. Immunol 2:239, 1984).

Animal: Organismos vertebrados multicelulares vivos. Una categor�a que incluye, por ejemplo, mam�feros y aves. El t�rmino mam�fero incluye tanto humanos como mam�feros no humanos. De forma similar, el t�rmino "sujeto" incluye tanto humanos como sujetos veterinarios, tales como perros.

10 Variantes conservadoras: Las sustituciones conservadoras de amino�cidos son aquellas que no afectan sustancialmente ni disminuyen la actividad o antigenicidad del polip�ptido de Lu. longipalpis. Algunos ejemplos concretos, sin car�cter limitador, de una sustituci�n conservadora incluyen los siguientes:

Residuo original Sustituciones conservadoras

Ala Ser Arg Lys Asn Gln, His Asp Glu Lys Ser Gln Asn Glu Asp His Asn; Gln Ile Leu, Val Leu Ile; Val Lys Arg; Gln; Glu Met Leu; Ile Phe Met; Leu; Tyr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp; Phe Val Ile ; Leu

15 El t�rmino variaci�n conservadora incluye tambi�n el uso de un amino�cido sustituido en lugar de un amino�cido matriz no sustituido, siempre que los anticuerpos obtenidos para el polip�ptido no sustituido tambi�n inmunorreaccionen esencialmente con el polip�ptido sustituido, o que se pueda generar una respuesta inmune contra el polip�ptido sustituido que sea similar a la respuesta inmune contra el polip�ptido no sustituido. Por tanto,

20 en una realizaci�n, las sustituciones no conservadoras son aquellas que reducen una actividad o antigenicidad.

ADNc (ADN complementario): Un fragmento de ADN que carece de segmentos internos no codificantes (intrones) y secuencias de control de la expresi�n. El ADNc se sintetiza en el laboratorio mediante transcripci�n inversa a partir de ARN mensajero extra�do de c�lulas.

25 Variante degenerada: Un polinucle�tido que codifica un polip�ptido de Lu. longipalpis que incluye una secuencia que est� degenerada como resultado del c�digo gen�tico Existen 20 amino�cidos naturales, la mayor�a de los cuales est�n especificados por m�s de un cod�n. Por lo tanto, todas las secuencias de nucle�tidos degeneradas est�n incluidas en la divulgaci�n siempre que la secuencia de amino�cidos del polip�ptido de Lu. longipalpis

30 codificado por la secuencia de nucle�tidos se mantenga sin cambios.

Hipersensibilidad tard�a (DTH): Una reacci�n inmune en la que la activaci�n de macr�fagos dependiente de linfocitos T y la inflamaci�n causan da�os en los tejidos. A menudo se utiliza una reacci�n por DTH a la inyecci�n subcut�nea de ant�geno como un ensayo de la inmunidad mediada por c�lulas.

35 Ep�topo: Un determinante antig�nico. Se trata de grupos qu�micos o secuencias pept�dicas concretas de una mol�cula que son antig�nicos, es decir, que producen una respuesta inmune espec�fica. Un anticuerpo se une espec�ficamente a un ep�topo antig�nico concreto de un polip�ptido. Algunos ejemplos concretos, a t�tulo meramente enunciativo, de un ep�topo incluyen una secuencia de tetra a pentap�ptidos de un polip�ptido, una secuencia de tri

40 a-pentagluc�sidos de un polisac�rido. En el animal, la mayor�a de los ant�genos presentar�n varios o incluso

numerosos determinantes antig�nicos simult�neamente. Este polip�ptido tambi�n puede ser cualificado como un polip�ptido inmunog�nico y el ep�topo puede ser identificado como se define en el presente.

Secuencias de control de la expresi�n: Secuencias de �cido nucleico que controlan y regulan la expresi�n de una secuencia de �cido nucleico, como una secuencia de �cido nucleico heter�loga, a la que est�n operativamente unidas. Las secuencias de control de la expresi�n est�n operativamente unidas a una secuencia de �cido nucleico cuando las secuencias de control de la expresi�n controlan y regulan la transcripci�n y, cuando corresponde, la traducci�n de la secuencia de �cido nucleico. Por tanto, las secuencias de control de la expresi�n pueden incluir promotores, potenciadores, terminadores de la transcripci�n, se�ales de polyA, un cod�n de inicio (por ejemplo, ATG) delante de una secuencia de polinucle�tidos que codifica prote�na, la se�al de uni�n para los intrones, el mantenimiento del marco de lectura correcto de ese gen que permita la correcta traducci�n de ARNm y codones de parada apropiados.

Para los fines del presente, el t�rmino "secuencias de control" incluye, como m�nimo, componentes cuya presencia puede influir en la expresi�n y tambi�n puede incluir componentes adicionales cuya presencia es beneficiosa, por ejemplo, secuencias l�der y secuencias del componente de fusi�n. Las secuencias de control de la expresi�n pueden incluir un promotor.

Un promotor es una secuencia m�nima suficiente para dirigir la transcripci�n de un �cido nucleico. Los promotores pueden ser espec�ficos de un tipo de c�lula o espec�ficos de un tejido. Un promotor incluye secuencias de �cido nucleico necesarias cerca del sitio de inicio de la transcripci�n, como, en el caso de un promotor de la polimerasa tipo II, un elemento TATA. Un promotor tambi�n incluye opcionalmente un potenciador distal o elementos represores que pueden estar ubicados a varios miles de pares de bases del sitio de inicio de la transcripci�n. Se incluyen tanto promotores constitutivos como inducibles (v�ase, por ejemplo, Bitter et al., Methods in Enzymology 153:516-544, 1987).

Por ejemplo, cuando se clonan sistemas bacterianos, pueden usarse promotores inducibles tales como pL del bacteri�fago lambda, plac, ptrp, ptac (promotor h�brido ptrp-lac) y similares. En una realizaci�n, cuando se clonan sistemas celulares de mam�fero, pueden usarse promotores obtenidos del genoma de c�lulas de mam�fero (tales como el promotor de la metalotione�na) o de virus de mam�fero (tales como la repetici�n terminal larga de retrovirus; el promotor tard�o de adenovirus; el promotor 7.5K del virus vaccinia). Tambi�n pueden usarse promotores producidos por ADN recombinante o t�cnicas sint�ticas para proporcionar la transcripci�n de las secuencias de �cido nucleico. Se puede insertar un polinucle�tido en un vector de expresi�n que contiene una secuencia promotora que facilita la transcripci�n eficiente de la secuencia gen�tica insertada del hu�sped. T�picamente el vector de expresi�n contiene un origen de la replicaci�n, un promotor, as� como secuencias de �cido nucleico espec�ficas que permiten la selecci�n fenot�pica de las c�lulas transformadas. En una realizaci�n, el promotor es un promotor de citomegalovirus.

C�lulas hu�sped: C�lulas en las que puede propagarse un vector y expresarse su ADN. La c�lula puede ser procariota o eucariota. El t�rmino tambi�n incluye cualquier descendencia de la c�lula hu�sped del sujeto. Se entiende que toda la descendencia puede no ser id�ntica a la c�lula precursora ya que puede haber mutaciones que suceden durante la replicaci�n. Sin embargo, dicha descendencia se incluye cuando se usa la expresi�n "c�lula hu�sped". Tambi�n se incluyen las c�lulas del sujeto.

Respuesta inmune: Una respuesta de una c�lula del sistema inmunitario, como un linfocito B, linfocito T o monocito, a un est�mulo. En una realizaci�n, la respuesta es espec�fica para un ant�geno concreto (una "respuesta espec�fica de ant�geno"). La respuesta tambi�n puede ser no espec�fica (no dirigida espec�ficamente a los polip�ptidos salivales), como la producci�n de linfocinas. En una realizaci�n, una respuesta inmune es una respuesta de linfocitos T, como una respuesta de CD4+ o una respuesta de CD8+. En otra realizaci�n, la respuesta es una respuesta de Th1 (un subconjunto de linfocitos T colaboradores). En otra respuesta m�s, la respuesta es una respuesta de linfocitos B y provoca la producci�n de anticuerpos espec�ficos.

Polip�ptido inmunog�nico: Un polip�ptido que comprende un motivo espec�fico de alelo, un ep�topo u otra secuencia de modo que el polip�ptido se una a una mol�cula MHC e induzca una respuesta de linfocitos T citot�xicos ("CTL"), y/o una respuesta de linfocitos B (por ejemplo, producci�n de anticuerpos), y/o una respuesta de linfocitos T coadyuvantes, y/o una respuesta de hipersensibilidad tard�a (DTH) contra el ant�geno del que se obtiene el polip�ptido inmunog�nico.

En una realizaci�n, los polip�ptidos inmunog�nicos se identifican utilizando motivos de secuencias u otros m�todos conocidos en el campo. T�picamente se utilizan algoritmos para determinar el "umbral de uni�n" de los polip�ptidos, a fin de seleccionar aquellos con las puntuaciones que hacen que tengan una mayor probabilidad de unirse a una determinada afinidad y que ser�n inmunog�nicos. Los algoritmos se basan en los efectos sobre la uni�n a MHC de un amino�cido concreto en una posici�n concreta, los efectos sobre la uni�n al anticuerpo de un amino�cido concreto en una posici�n concreta, o los efectos sobre la uni�n de una sustituci�n concreta en un polip�ptido que contiene un motivo En el contexto de un polip�ptido inmunog�nico, un "residuo conservado" es aquel que aparece con una frecuencia notablemente superior a la que cabr�a esperar de una distribuci�n aleatoria en una posici�n

concreta de un polip�ptido. En una realizaci�n, un residuo conservado es aquel en el que la estructura del MHC puede proporcionar un punto de contacto con el polip�ptido inmunog�nico.

Composici�n inmunog�nica: Una composici�n que, cuando se administra a un sujeto, induce una respuesta inmune a un polip�ptido salival de Lu. longipalpis. En una realizaci�n, en particular una respuesta DTH positiva.

Aislado: Un componente biol�gico "aislado" (como un �cido nucleico o prote�na u org�nulo) ha sido sustancialmente separado o purificado de otros componentes biol�gicos de la c�lula del organismo en la que el componente est� naturalmente presente, como, por ejemplo, otro ADN o ARN cromos�mico y extracromos�mico, prote�nas y org�nulos. Los �cidos nucleicos y prote�nas que han sido "aislados" incluyen �cidos nucleicos y prote�nas purificados mediante m�todos de purificaci�n est�ndar. El t�rmino tambi�n comprende los �cidos nucleicos y prote�nas preparados mediante tecnolog�a recombinante y s�ntesis qu�mica. Etiqueta: Un compuesto o composici�n detectable que se conjuga directa o indirectamente con otra mol�cula para facilitar la detecci�n de dicha mol�cula. Algunos ejemplos de etiquetas, a t�tulo meramente enunciativo, incluyen etiquetas fluorescentes, enlaces enzim�ticos e is�topos radiactivos.

Leishmaniasis: Una enfermedad parasitaria que se propaga por la picadura de fleb�tomos infectados. El par�sito tripanosoma del g�nero Leishmania es el agente etiol�gico de diversas manifestaciones patol�gicas, conocidas colectivamente como leishmaniasis. La leishmaniasis es prevalente en todas las regiones tropicales y subtropicales de �frica, Asia, el Mediterr�neo, el sur de Europa (Viejo Mundo), y el sur y el centro de Am�rica (Nuevo Mundo). Las especies del viejo Mundo se transmiten a trav�s del vector fleb�tomo Phlebotomus sp. Los seres humanos, animales salvajes y animales dom�sticos (como los perros) son objetivos conocidos de estos fleb�tomos, que act�an como hu�spedes de dep�sito o desarrollan la leishmaniasis.

La leishmaniasis cut�nea comienza con la aparici�n de un �nico o m�ltiples n�dulos, que se convierten en �lceras en la piel en el lugar de la picadura. La �lcera de los chicleros t�picamente se presenta como una p�rdida de tejido similar a un corte en el l�bulo de la oreja. El periodo de incubaci�n se prolonga entre unos d�as y varios meses, o incluso a�os en algunos casos. Por lo general, las heridas persisten durante varios meses o algunos a�os y en la mayor�a de los casos cicatrizan por s� solas. El tipo mucocut�neo puede provocar lesiones erosivas en nariz, boca o garganta, pudiendo provocar graves desfiguraciones. La leishmaniasis visceral normalmente provoca la aparici�n de fiebre en un patr�n diario t�pico, aumento de tama�o del abdomen acompa�ado de dolor, debilidad, hinchaz�n generalizada de los n�dulos linf�ticos y p�rdidas de peso, adem�s de infecciones sobreimpuestas como consecuencia de la debilitaci�n del sistema inmunitario. La leishmaniasis visceral (VL) puede provocar tasas de mortalidad elevadas. La aparici�n de los s�ntomas puede ser repentina, aunque por lo general tiende a ser insidiosa.

Lutzomyia longipalpis (Lu. longipalpis): Una especie de fleb�tomo end�gena del Nuevo Mundo (Am�rica del Sur y Centroam�rica). Este fleb�tomo es el principal vector de la leishmaniasis visceral americana, una enfermedad potencialmente mortal que afecta principalmente a los ni�os en varios pa�ses de Sudam�rica y Am�rica Central. Linfocitos: Un tipo de leucocito que participa en la defensa inmunitaria del organismo. Existen dos tipos de linfocitos: los linfocitos B y T.

Mam�fero: Este t�rmino incluye tanto a los seres humanos como a los mam�feros no humanos. De forma similar, el t�rmino "sujeto" incluye tanto a seres humanos como a sujetos veterinarios.

Oligonucle�tido: Una secuencia lineal de polinucle�tidos de hasta unas 100 bases de nucle�tidos de longitud.

Marco abierto de lectura (ORF): Una secuencia de �cido nucleico que cuenta con una serie de tripletes de nucle�tidos (codones), que comienza por un cod�n de inicio y termina por un cod�n de parada, que codifica amino�cidos sin ning�n cod�n de terminaci�n interno. Habitualmente estas secuencias se pueden convertir en un polip�ptido.

Operativamente unido: Una primera secuencia de �cido nucleico est� operativamente unida con una segunda secuencia de �cido nucleico cuando la primera secuencia de �cido nucleico est� dispuesta en una relaci�n funcional con la segunda secuencia de �cido nucleico. Por ejemplo, un promotor est� operativamente unido con una secuencia de codificaci�n si el promotor influye en la transcripci�n o expresi�n de la secuencia de codificaci�n. Por lo general, las secuencias de ADN operativamente unidas son contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones de codificaci�n de prote�nas, en el mismo marco de lectura.

Modificaciones de polip�ptidos: Los polip�ptidos de Lu. longipalpis incluyen realizaciones sint�ticas de los polip�ptidos descritos en el presente. Por otra parte, se pueden utilizar an�logos (mol�culas org�nicas no pept�dicas), derivados (mol�culas pept�dicas qu�micamente funcionalizadas obtenidas a partir de las secuencias de polip�ptidos divulgadas) y variantes (hom�logos) de estas prote�nas en los m�todos descritos en el presente. Cada polip�ptido de la divulgaci�n se compone de una secuencia de amino�cidos, que pueden ser L-amino�cidos y/o Damino�cidos, naturalmente presentes y de otro modo.

Los polip�ptidos se pueden modificar mediante diversas t�cnicas qu�micas para producir derivados que tienen b�sicamente la misma actividad que los polip�ptidos sin modificar y, opcionalmente, otras propiedades deseables. Por ejemplo, los grupos de �cido carbox�lico de la prote�na, sean de cadena carboxi-terminal o lateral, se pueden proporcionar en forma de una sal de un cati�n farmac�uticamente aceptable o esterificarse para formar un �ster C1-C16 , o convertirse en una amida de f�rmula NR1R2 en la que R1 y R2 cada una independientemente H o alquilo C1-C16 , o combinarse para formar un anillo heteroc�clico, tal como un anillo de 5 � 6 elementos. Los grupos amino del p�ptido, ya sean de cadena amino-terminal o lateral, pueden ser en forma de una sal de adici�n de �cido farmac�uticamente aceptable, como HC1, HBr, ac�tico, benzoico, toluensulf�nico, maleico, tart�tico y otras sales org�nicas, o pueden modificarse a alquilo C1-C16 o dialquilamino o transformarse m�s hasta una amida.

Los grupos hidroxilo de las cadenas pept�dicas laterales pueden convertirse en alcohoxi C1-C16 o en �ster C1-C16 utilizando t�cnicas bien reconocidas. Los anillos fenilos y fen�licos de las cadenas laterales del p�ptido pueden estar sustituidas con uno o m�s �tomos de hal�geno, tales como fl�or, cloro, bromo o iodo, o con alquilo C1-C16 , alcoxi C1-C16 , �cidos carbox�licos y �steres de los mismos o amidas de dichos �cidos carbox�licos. Los grupos metileno de las cadenas laterales del p�ptido pueden prolongarse a alquilenos C2-C4 hom�logos. Los tioles pueden protegerse con uno cualquiera de varios grupos de protecci�n bien reconocidos, tales como grupos acetamida. Los expertos en el campo tambi�n reconocer�n m�todos para introducir estructuras c�clicas en los p�ptidos de esta divulgaci�n para seleccionar y proporcionar restricciones conformacionales a la estructura que produzcan una estabilidad potenciada.

Se prev�n realizaciones peptidomim�ticas y organomim�ticas, por las cuales la disposici�n tridimensional de los constituyentes qu�micos de dichos peptidomim�ticos y organomim�ticos imitan la disposici�n tridimensional de la estructura pept�dica y las cadenas laterales de los amino�cidos componentes, produciendo dichos peptidomim�ticos y organomim�ticos de un polip�ptido de L. longipalpis que tienen capacidad medible o potenciada de generar una respuesta inmune. Para aplicaciones de modelizaci�n por ordenador, un farmac�foro es una definici�n tridimensional idealizada de los requisitos estructurales para la actividad biol�gica. Los peptidomim�ticos y organomim�ticos pueden dise�arse de forma que se adapten a cada farmac�foro con el software de modelizaci�n por ordenador actual (usando dise�o de f�rmacos asistido por ordenador o CADD). V�ase Walters, "Computer-Assisted Modeling of Drugs," Klegerman & Groves (comp.), 1993, Pharmaceutical Biotechnology, Interpharm Press: Buffalo Grove, IL, pp. 165-174 y Principles of Pharmacology Munson (comp.) 1995, Ch. 102, para consultar una descripci�n de las t�cnicas utilizadas en el CADD. Tambi�n se incluyen mim�ticos preparados usando dichas t�cnicas.

Veh�culos o excipientes farmac�uticamente aceptables: Los veh�culos o excipientes farmac�uticamente aceptables utilizado son los convencionales. Remington's Pharmaceutical Sciences, de E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15� edici�n (1975), describe composiciones y formulaciones adecuadas para la administraci�n farmac�utica de los polip�ptidos, pl�smidos y vectores virales divulgados en el presente.

En general, la naturaleza del veh�culo o excipiente depender� del modo de administraci�n concreto que se vaya a emplear. Por ejemplo, las formulaciones parenterales habitualmente comprenden fluidos inyectables que incluyen como veh�culo fluidos farmac�utica y fisiol�gicamente aceptables, tales como agua, suero fisiol�gico, soluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares. Para composiciones s�lidas (por ejemplo, comprimidos secados por congelaci�n, polvos, p�ldoras, tabletas o c�psulas), los veh�culos o excipientes s�lidos no t�xicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, manitol, lactosa, almid�n o estearato de magnesio de grado farmac�utico. Adem�s de veh�culos o excipientes biol�gicamente neutros, las composiciones farmac�uticas a administrar pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no t�xicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes y agentes tamp�n del pH y similares, por ejemplo, acetato s�dico o monolaurato de sorbit�n.

Phlebotomus ariasi (P. ariasi): Una especie del g�nero fleb�tomo (mosca de la arena) end�gena del Viejo Mundo, en particular del sur de Europa y los pa�ses del Mediterr�neo, m�s concretamente de Espa�a y Francia. Este fleb�tomo es un vector de la leishmaniasis visceral demostrado. P. ariasi es un miembro del subg�nero Phlebotomus Larroussius.

Phlebotomus perniciosus (P. perniciosus): Una especie de fleb�tomo (mosca de la arena) end�gena del Viejo Mundo, en particular del sur de Europa y los pa�ses del Mediterr�neo, m�s concretamente de Francia, Italia, Grecia, Marruecos y Espa�a. Este fleb�tomo es un vector de la leishmaniasis visceral demostrado. P. perniciosus es un miembro del subg�nero Phlebotomus Larroussius.

Polinucle�tido: El t�rmino polinucle�tido o secuencia de �cido nucleico se refiere a una forma polim�rica de nucle�tido de al menos 10 bases de longitud, que incluye, por tanto, oligonucle�tidos y genes. Un polinucle�tido recombinante incluye un polinucle�tido que no se encuentra inmediatamente contiguo a las dos secuencias codificantes inmediatamente contiguas (una en el extremo 5' y una en el extremo 3') en el genoma de origen natural del organismo del que se obtiene. Por tanto, el t�rmino incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que est� incorporado en un vector; en un virus o un pl�smido de replicaci�n aut�noma; o en el ADN gen�mico de una c�lula procariota o eucariota, o que existe en forma de una mol�cula separada (por ejemplo, un ADNc) independiente de otras secuencias. Los polinucle�tidos pueden ser ribonucle�tidos, desoxirribonucle�tidos, o formas modificadas de cualquier nucle�tido. El t�rmino incluye formas monocatenarias y bicatenarias de ADN.

Polip�ptido: Cualquier cadena de amino�cidos, independientemente de la longitud (incluyendo, por tanto, 5 oligop�ptidos, p�ptidos y prote�nas) o modificaci�n posterior a la traducci�n (por ejemplo, glucosilaci�n, fosforilaci�n

o acilaci�n). Un polip�ptido incluye tambi�n el precursor, as� como la prote�na madura. En una realizaci�n, el polip�ptido es un polip�ptido aislado de Lu. longipalpis o codificado por un �cido nucleico aislado de Lu. longipalpis, como los polip�ptidos de Lu. longipalpis divulgados en el presente.

Sondas y cebadores: Una sonda comprende un polinucle�tido aislado unido a una etiqueta detectable o mol�cula informadora. Los cebadores son polinucle�tidos cortos. En una realizaci�n, los polinucle�tidos tienen 15 nucle�tidos

o m�s de longitud. Los cebadores pueden hibridarse con una cadena de ADN diana complementaria por hibridaci�n de �cido nucleico para formar un h�brido entre el cebador y la cadena de ADN diana, y despu�s extenderse a lo largo de la cadena de ADN diana por una enzima ADN polimerasa. Pueden usarse pares de cebadores para la

15 amplificaci�n de una secuencia de �cido nucleico, por ejemplo, por reacci�n en cadena de la polimerasa (PCR) u otros m�todos de amplificaci�n de �cidos nucleicos conocidos en el campo. Un experto en el campo apreciar� que la especificidad de una sonda o cebador concreto aumenta con su longitud As�, por ejemplo, un cebador que comprende 20 nucle�tidos consecutivos se hibridar� con una diana con una especificidad mayor que un cebador correspondiente de solamente 15 nucle�tidos. Por tanto, para obtener mayor especificidad, pueden seleccionarse sondas y cebadores que comprenden al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 o m�s nucle�tidos consecutivos.

Purificaci�n de prote�nas: Los polip�ptidos de Lu. longipalpis divulgados en el presente se pueden purificar por cualquiera de los medios conocidos en el campo. V�ase, por ejemplo, Guide to Protein Purification, Deutscher (comp.), Meth. Enzymol 185, Academic Press, San Diego, 1990; y Scopes, Protein Purification: Principles and

25 Practice, Springer Verlag, New York, 1982. Purificaci�n sustancial se refiere a la purificaci�n a partir de otras prote�nas o componentes celulares. Una prote�na sustancialmente purificada tiene una pureza m�nima del 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98%. As�, en un ejemplo concreto, a t�tulo meramente enunciativo, una prote�na sustancialmente purificada est� un 90% libre de otras prote�nas o componentes celulares.

Purificado: El t�rmino purificado no requiere pureza absoluta, sino que se entiende como un t�rmino relativo. As�, por ejemplo, una preparaci�n de polip�ptido purificada es una en la que el polip�ptido est� m�s enriquecido que el polip�ptido en su entorno natural. Por ejemplo, una preparaci�n de polip�ptido se encuentra sustancialmente purificada cuando el polip�ptido representa al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, o al menos el 98% del contenido total de polip�ptido de la preparaci�n Lo mismo se aplica a los

35 polinucle�tidos. Los polip�ptidos divulgados en el presente se pueden purificar por cualquiera de los medios conocidos en el campo (v�ase, por ejemplo, Guide to Protein Purification, Deutscher (comp.), Meth. Enzymol. 185, Academic Press, San Diego, 1990; and Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer Verlag, New York, 1982).

Recombinante: Un polinucle�tido recombinante es aquel que tiene una secuencia que no se encuentra naturalmente presente o tiene una secuencia que se compone de una combinaci�n artificial de dos segmentos de secuencia que de otro modo estar�an separados. Por lo general, esta combinaci�n artificial se realiza mediante s�ntesis qu�mica o, m�s frecuentemente, mediante la manipulaci�n artificial de segmentos aislados de �cidos nucleicos, por ejemplo mediante t�cnicas de ingenier�a gen�tica. En una realizaci�n, un polinucle�tido recombinante

45 codifica una prote�na de fusi�n.

Hibridaci�n selectiva: Hibridaci�n en condiciones de rigurosidad moderada o elevada que excluye secuencias de nucle�tidos no relacionadas.

En reacciones de hibridaci�n de �cidos nucleicos, las condiciones usadas para conseguir un nivel concreto de rigurosidad variar�n dependiendo de la naturaleza de los �cidos nucleicos que se est�n hibridando. Por ejemplo, la longitud, el grado de complementariedad, la composici�n de la secuencia de nucle�tidos (por ejemplo, contenido de GC frente a AT), y el tipo de �cido nucleico (por ejemplo, ARN frente a ADN) de las regiones de hibridaci�n de los �cidos nucleicos pueden considerarse a la hora de seleccionar las condiciones de hibridaci�n. Una consideraci�n

55 adicional es si uno de los �cidos nucleicos est� inmovilizado, por ejemplo, en un filtro.

Un ejemplo espec�fico, a t�tulo meramente enunciativo, de condiciones de rigurosidad progresivamente m�s elevadas es el siguiente: 2 x SSC/SDS al 0,1% aproximadamente a temperatura ambiente (condiciones de hibridaci�n); 0,2 x SSC/SDS al 0,1% aproximadamente a temperatura ambiente (condiciones de baja rigurosidad); 0,2 x SSC/SDS al 0,1% aproximadamente a 42�C (condiciones de rigurosidad moderada); y 0,1 x SSC aproximadamente a 68�C (condiciones de elevada rigurosidad). Un experto en el campo puede determinar f�cilmente variaciones de estas condiciones (por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2� ed., vol. 1-3, comp. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Las condiciones de hibridaci�n se pueden mantener durante 2 a 16 horas. El lavado puede realizarse usando solamente una de estas 65 condiciones, por ejemplo, condiciones de elevada rigurosidad, o puede usarse cada una de las condiciones, por ejemplo, durante 10-15 minutos cada una, en el orden enumerado anteriormente, repitiendo todos y cada uno de los

pasos indicados. Sin embargo, como se ha mencionado anteriormente, las condiciones �ptimas variar�n, dependiendo de la reacci�n de hibridaci�n particular implicada, y pueden determinarse emp�ricamente.

Identidad de secuencia: La similitud entre secuencias de amino�cidos se expresa en t�rminos del porcentaje de identidad entre las mismas. Cuanto mayor es el porcentaje, m�s similares son las dos secuencias. Los hom�logos o variantes de un polip�ptido de Lu. longipalpis tendr�n un grado relativamente elevado de identidad de secuencia cuando se alinean usando m�todos convencionales.

Los m�todos de alineaci�n de secuencias para la comparaci�n son bien conocidos en el campo. Se describen diversos programas y algoritmos de alineaci�n en: Smith y Waterman, Adv. Appl Math. 2:482, 1981; Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48:443, 1970; Pearson y Lipman, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins y Sharp, Gene 73:237, 1988; Higgins y Sharp, CABIOS 5:151, 1989; Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881, 1988; y Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. , 85:2444, 1988. Altschul et al., Nature Genet. 6:119, 1994 presenta un an�lisis detallado de los m�todos de alineaci�n de secuencias y los c�lculos de identidad.

La herramienta de b�squeda de alineamientos locales b�sicos (BLAST) del NCBI (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990) est� disponible de varias fuentes, incluyendo el Centro Nacional de Informaci�n Biotecnol�gica (NCBI, Bethesda, MD) y en Internet, para su uso en relaci�n con los programas de an�lisis de secuencias blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. En el sitio web del NCBI se encuentra disponible una descripci�n de c�mo determinar la identidad de secuencia usando este programa.

Los hom�logos y variantes de un polip�ptido de Lu. longipalpis t�picamente se caracterizan por tener al menos un 75%, por ejemplo al menos un 80%, de identidad de secuencia contada sobre la alineaci�n de longitud completa con la secuencia del polip�ptido de Lu. longipalpis usando NCBI Blast 2.0, blastp de huecos ajustado a los par�metros por defecto. La comparaci�n entre las secuencias se realiza sobre la alineaci�n de longitud completa con la secuencia de amino�cidos proporcionada en la presente divulgaci�n, empleando la funci�n de secuencias Blast 2 con la matriz BLOSUM62 por defecto ajustada a los 10 par�metros por defecto, (la existencia de un hueco tiene un valor de 11, y un hueco por residuo tiene un valor de 1).

Cuando se alinean p�ptidos cortos (menos de aproximadamente 30 amino�cidos), la alineaci�n debe realizarse usando la funci�n de secuencias Blast 2, con la matriz PAM30 ajustada a los par�metros por defecto (penalizaciones de abertura de hueco 9, extensi�n de hueco 1). Las prote�nas con una similitud incluso mayor a las secuencias de referencia mostrar�n porcentajes de identidad crecientes cuando se eval�an por este m�todo, tales como al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98%, o al menos el 99% de identidad de secuencia Cuando se est� comparando menos de la secuencia completa para la identidad de secuencia, los hom�logos y variantes t�picamente tendr�n al menos un 80% de identidad de secuencia sobre ventanas cortas de 10-20 amino�cidos, y pueden tener identidades de secuencia de al menos el 85% o al menos el 90% o el 95% dependiendo de su similitud con la secuencia de referencia. Los m�todos para determinar la identidad de secuencia sobre estas ventanas cortas est�n disponibles en el sitio web del NCBI en Internet. Un experto en el campo apreciar� que estos intervalos de identidad de secuencia se proporcionan solamente como a t�tulo orientativo; es completamente posible que se puedan obtener hom�logos muy significativos fuera de los intervalos proporcionados.

Agente de uni�n espec�fica: Un agente que se une sustancialmente s�lo a una diana definida. Por tanto, un agente de uni�n espec�fica a Lu. longipalpis es un agente que se une sustancialmente a un polip�ptido de Lu. longipalpis.

En una realizaci�n, el agente de uni�n espec�fica es un anticuerpo monoclonal o policlonal que se une espec�ficamente a al polip�ptido de Lu. longipalpis.

Sujeto: Organismos vertebrados multicelulares vivos, una categor�a que incluye tanto sujetos humanos como veterinarios, incluyendo mam�feros humanos y no humanos. En una realizaci�n, el sujeto es un miembro de la familia de los c�nidos, como un perro. En otra realizaci�n, el sujeto es un ser humano.

Linfocito T: Una c�lula sangu�nea de color blanco cr�tica para la respuesta inmune. Los linfocitos T incluyen, a t�tulo meramente enunciativo, linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+. Un linfocito T CD4+ es una c�lula inmune que lleva un marcador sobre su superficie conocido como "grupo de diferenciaci�n 4" (CD4). Estas c�lulas, tambi�n conocidas como linfocitos T coadyuvantes, ayudan a organizar la respuesta inmune, incluyendo respuestas de anticuerpos as� como respuestas de linfocitos T citot�xicos. Los linfocitos T CD8+ llevan el marcador del "grupo de diferenciaci�n 8" (CD8). En una realizaci�n, un linfocito T CD8 es un linfocito T citot�xico En otra realizaci�n, un linfocito T CD8 es un linfocito T supresor.

Polip�ptido terap�uticamente activo: Un agente, como un polip�ptido de Lu. longipalpis, que induce una respuesta inmune, medida por la respuesta cl�nica (por ejemplo, el aumento en una poblaci�n de c�lulas inmunes, producci�n de anticuerpo que se une espec�ficamente al polip�ptido de Lu. longipalpis, una reducci�n mensurable de los s�ntomas resultantes de la exposici�n a Leishmania o protecci�n frente a la infecci�n por Leishmania). Las mol�culas terap�uticamente activas tambi�n pueden prepararse a partir de �cidos nucleicos. Ejemplos de una mol�cula terap�uticamente activada basada en �cido nucleico es una secuencia de �cido nucleico que codifica un

polip�ptido de Lu. longipalpis, donde la secuencia de �cido nucleico est� operativamente unida a un elemento de control como un promotor Los agentes terap�uticamente activos tambi�n pueden incluir compuestos org�nicos u otros compuestos qu�micos que imitan los efectos del polip�ptido de Lu. longipalpis.

El t�rmino "fragmento terap�uticamente efectivo de un polip�ptido de Lu. longipalpis" incluye cualquier fragmento del polip�ptido de Lu. longipalpis, o variante del polip�ptido de Lu. longipalpis, o prote�na de fusi�n de un polip�ptido de Lu. longipalpis, que conserva una funci�n del polip�ptido de Lu. longipalpis (como la inmunogenicidad) o conserva la capacidad para reducir los s�ntomas de la exposici�n a la Leishmania y para proteger frente a la infecci�n por Leishmania.

As�, en una realizaci�n, una cantidad terap�uticamente efectiva de un fragmento de polip�ptido de Lu. longipalpis es una cantidad utilizada para generar una respuesta inmune al polip�ptido. En otra realizaci�n, una cantidad terap�uticamente efectiva de un fragmento de un polip�ptido de Lu. longipalpis es una cantidad de uso para prevenir

o tratar una infecci�n por Leishmania en un sujeto. Tratamiento se refiere a una intervenci�n terap�utica que confiere resistencia a la infecci�n por Leishmania o una reducci�n de los s�ntomas asociados con la exposici�n a la Leishmania. Algunos ejemplos concretos, de car�cter no limitador, de un fragmento de polip�ptido son la mitad Nterminal o la mitad C-terminal de un polip�ptido de Lu. longipalpis divulgado en el presente. Cabe se�alar que se incluyen las prote�nas de fusi�n, como una fusi�n con seis residuos de histidina, una etiqueta c-myc o cualquier otra etiqueta del polip�ptido. Estas fusiones son conocidas para un experto en el campo y se utilizan a menudo en la purificaci�n de prote�nas.

Transducida: Una c�lula transducida es una c�lula en la que se ha introducido una mol�cula de �cido nucleico por t�cnicas de biolog�a molecular. Para los fines del presente, el t�rmino transducci�n abarca todas las t�cnicas por las cuales puede introducirse una mol�cula de �cido nucleico en dicha c�lula, incluyendo transfecci�n con vectores virales, transformaci�n con vectores plasm�dicos, e introducci�n de ADN desnudo por electroporaci�n, lipofecci�n, y aceleraci�n por pistola de part�culas.

Vector: Una mol�cula de �cido nucleico que introducida en una c�lula hu�sped produce una c�lula hu�sped transducida. Un vector puede incluir secuencias de �cido nucleico que le permiten replicarse en una c�lula hu�sped, como un origen de replicaci�n. Un vector tambi�n puede incluir uno o m�s genes marcadores seleccionables y otros elementos gen�ticos conocidos en el campo.

Vacuna: Una composici�n que, cuando se administra a un sujeto, induce una reducci�n de la gravedad de los s�ntomas de un trastorno o una enfermedad. En una realizaci�n, una vacuna reduce la gravedad de los s�ntomas de la leishmaniasis y/o reduce la carga parasitaria.

A menos que se explique lo contrario, todos los t�rminos t�cnicos y cient�ficos empleados en el presente tienen los mismos significados que normalmente entiende un experto en el campo al que corresponde la divulgaci�n. Los t�rminos singulares "un", "una" y "el", "la" incluyen los plurales, salvo que el contexto indique claramente lo contrario. Asimismo, se entiende que la palabra "o" incluye "y", salvo que el contexto indique claramente lo contrario El t�rmino "comprende" significa "incluye" y una composici�n que comprende un polip�ptido incluye ese polip�ptido. Debe entenderse tambi�n que todos los tama�os de bases o tama�os de amino�cidos y todos los valores de peso molecular o masa molecular dados para los polinucle�tidos o polip�ptidos son aproximados y se proporcionan con fines descriptivos. Aunque en la pr�ctica o el ensayo de la presente divulgaci�n pueden usarse m�todos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente, a continuaci�n se describen m�todos y materiales adecuados Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en el presente se incorporan como referencia en su totalidad. En caso de conflicto, predominar� la presente especificaci�n, incluyendo las explicaciones de t�rminos. Por otra parte, los materiales, m�todos y ejemplos se ofrecen �nicamente a t�tulo ilustrativo y no tienen un car�cter limitador.

Polinucle�tidos y polip�ptidos de Lu. Longipalpis

En el presente se divulgan los polip�ptidos salivales del fleb�tomo Lu. longipalpis.

LJL34 (SEC. ID. N�: 1)

LJS201 (SEC ID N�: 7)

LHL13 (SEC ID N�: 9)

15 LJL23 (SEC ID N�: 11

LJM10 (SEC ID N�: 13) LJL143 (SEC ID N� 15)

LJS142 (SEC ID N�: 17)

LJL17 (SEC ID N�: 19)

10 LJM06 (SEC ID N�: 21)

LJM17 (SEC ID N�: 23)

LJM114 (SEC ID N�. 27) LJM111 (SEC ID N�: 29)

LJM78 (SEC ID N�. 31)

LJL238 (SEC ID N�: 33)

LJL11 (SEC ID N�: 37)

LJL105 (SEC ID N�:41) LJL 09 (SEC ID N�: 43)

LJL38 (SEC ID N�: 45)

LJS192 (SEC ID N�: 53)

LJM19 (SEC ID N�: 55)

LJL138 (SEC ID N�: 57)

LJL15 (SEC ID N�: 59)

LJL91 (SEC ID N�: 61)

10 LJM11 (SEC ID N�: 63)

LJL124 (SEC ID N�: 67)

20 LJL35 (SEC ID N� 69)

De acuerdo con la invenci�n, se proporciona un polip�ptido que incluye la SEC. ID. N�: 15, y polip�ptidos hom�logos que tienen una secuencia de amino�cidos al menos un 80% id�ntica a la secuencia de amino�cidos presentada 25 como SEC. ID. N�: 15. En el presente se divulgan asimismo prote�nas de fusi�n, que incluyen la SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�:

41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N� 67.

Los fragmentos y variantes de los polip�ptidos de Lu. longipalpis anteriormente identificados se divulgan en el

5 presente y un experto en el campo podr� prepararlos f�cilmente empleando t�cnicas de biolog�a molecular. En una realizaci�n, un fragmento de un polip�ptido de Lu. longipalpis incluye al menos 8, 10, 15 o 20 amino�cidos consecutivos de un polip�ptido de Lu. longipalpis. En otra realizaci�n, un fragmento de un polip�ptido de Lu. longipalpis incluye un ep�topo antig�nico espec�fico que se encuentra en un polip�ptido de Lu. longipalpis de longitud completa.

10 En una realizaci�n, un fragmento tiene al menos 19 amino�cidos, al menos 23 amino�cidos, al menos 25 amino�cidos o al menos 30 amino�cidos de longitud de cualquier polip�ptido (incluyendo los polip�ptidos presentados en la SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�:

15 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N� 67, variantes conservadoras u hom�logos de los mismos) o cualquier fragmento que conserva al menos un ep�topo.

20 Tambi�n se pueden producir prote�nas de fusi�n que incluyen un polip�ptido de Lu. longipalpis, utilizando m�todos conocidos por un experto en el campo. En una realizaci�n, una prote�na de fusi�n incluye una secuencia de amino�cidos presentada como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 1, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�:

25 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N� 67, o variantes conservadoras de la misma y un polip�ptido marcador. Los polip�ptidos marcadores incluyen, a t�tulo meramente enunciativo, etiquetas polipept�dicas, tales como un polip�ptido que colabora en la purificaci�n de prote�na (por ejemplo, seis residuos de histidina o polip�ptido c-myc) o un marcador enzim�tico (por ejemplo, fosfatasa alcalina) o un marcador fluorescente (por ejemplo, prote�na fluorescente verde).

30 Dada la presente divulgaci�n, un experto en el campo podr� purificar un polip�ptido de Lu. longipalpis empleando t�cnicas est�ndar para la purificaci�n de prote�nas. El polip�ptido sustancialmente puro producir� una �nica banda principal en un gel de poliacrilamida no reductor. La pureza del polip�ptido de Lu. longipalpis tambi�n se puede determinar mediante el an�lisis de la secuencia de amino�cidos amino-terminal.

35 Las modificaciones menores de las secuencias de amino�cidos primarias del polip�ptido de Lu. longipalpis pueden producir p�ptidos con una actividad sustancialmente equivalente en comparaci�n con la contraparte del p�ptido sin modificar descrito en el presente. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como por mutag�nesis de sitio dirigido, o pueden ser espont�neas. Todos los polip�ptidos producidos mediante estas modificaciones se incluyen en

40 el presente.

En el presente se divulgan los polinucle�tidos que codifican polip�ptidos salivales del fleb�tomo Lu. longipalpis , tales como los polinucle�tidos que codifican la SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29,

45 SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N� 67.

Algunos ejemplos concretos, de car�cter no limitador, de secuencias de �cido nucleico de Lu. longipalpis incluyen la

50 SEC. ID N�: 4, SEC. ID N�: 6, SEC. ID N�: 8, SEC. ID N�: 10, SEC. ID N�: 16, SEC. ID N�: 18, SEC. ID N�: 20, SEC. ID N�: 22, SEC. ID N�: 26, SEC. ID N�: 28, SEC. ID N�: 30, SEC. ID N�: 32, SEC. ID N�: 34, SEC. ID N�: 36, SEC. ID N�: 42, SEC. ID N�: 44, SEC. ID N�: 46, o SEC. ID N�: 48, SEC. ID N�: 50, SEC. ID N�: 52, SEC. ID N�: 54, SEC. ID N�: 56, SEC. ID N�: 58, SEC. ID N�: 60, SEC. ID N�: 62, SEC. ID N�: 64, SEC. ID N�: 66, SEC. ID N�: 68, y variantes degeneradas de las mismas. Estos polinucle�tidos incluyen secuencias de ADN, ADNc y ARN que codifican un

55 polip�ptido de Lu. longipalpis. Se entiende que todos los polinucle�tidos que codifican un polip�ptido de Lu. longipalpis est�n tambi�n incluidos en el presente, siempre que codifiquen un polip�ptido con la actividad reconocida, como la uni�n a un anticuerpo que reconoce el polip�ptido, la inducci�n de una respuesta inmune al polip�ptido, o un efecto sobre la supervivencia de la Leishmania cuando se administra a un sujeto que padece leishmaniasis o que experimenta una reducci�n de un signo o un s�ntoma de la infecci�n por Leishmania.

60 Los polinucle�tidos de la divulgaci�n incluyen secuencias que est�n degeneradas como consecuencia del c�digo gen�tico. Hay 20 amino�cidos naturales, la mayor�a de ellos especificados por m�s de un cod�n. Por tanto, todas las secuencias de nucle�tidos degeneradas se incluyen en la divulgaci�n en la medida en que la secuencia de amino�cidos del polip�ptido de Lu. longipalpis codificado por la secuencia de nucle�tidos se mantenga

65 funcionalmente sin cambios.

A continuaci�n se presentan ejemplos concretos, de car�cter no limitador, de un polinucle�tido que codifica un polip�ptido de P. ariasi:

LJL18 (SEC ID N�: 4)

10 LJS193(SEC ID N�: 6) LJS201 (SEC ID N�: 8)

LJL13(SEC ID N�: 10)

LJL23 (SEC ID N�: 12)

LJM10 (SEC ID N�: 14) LJL143(SEC ID N�: 16)

LJS142 (SEC ID N�: 18)

LJL17 (SEC ID N�: 20)

LJM17 (SEC ID N�: 24) LJL04 (SEC ID N�: 26) LJM114 (SEC ID N�: 28) LJM78 (SEC ID N�: 32)

LJ238 (SEC ID N�: 34)

LJS169 (SEC ID N�: 36)

LJL11 (SEC ID N�: 38)

LJL08 (SEC ID N�: 40)

LJS105 (SEC ID N�: 42)

LJL09(SEC ID N�: 44)

LJL38 (SEC ID N�:46)

LJM04 (SEC ID N�:48)

LJM26 (SEC ID N�: 50)

LJS03(SEC ID N�: 52)

LJS192(SEC ID N�: 54)

LJM19 (SEC ID N�: 56)

LJL138 (SEC ID N�: 58)

LJL15 (SEC ID N�: 60)

LJL91 (SEC ID N�: 62)

LJM11 (SEC ID N�: 64)

LJS138 (SEC ID N�: 66)

LJL124 (SEC ID N�: 68)

LJL35 (SEC ID N�: 70)

Tambi�n se incluyen fragmentos de las secuencias de �cido nucleico anteriormente descritas que tienen al menos

10 33 bases, al menos 36 bases, al menos 42 bases o al menos 48 bases de longitud, lo que es suficiente para permitir que el fragmento se hibride selectivamente con un polinucle�tido que codifica un polip�ptido de Lu. longipalpis divulgado en condiciones especificadas. El t�rmino "hibridaci�n selectiva" se refiere a la hibridaci�n en condiciones de una rigurosidad moderada a elevada, lo que excluye las secuencias de nucle�tidos no relacionadas.

15 En el presente tambi�n se divulgan marcos abiertos de lectura (ORF) que codifican un polip�ptido de Lu. longipalpis. Estos ORF est�n delimitados por un cod�n de inicio y un cod�n de parada. Esto tambi�n incluye las variantes degeneradas de secuencias de nucle�tidos que codifican hom�logos y variantes conservadoras.

Algunos ejemplos concretos, sin car�cter limitador, de marcos abiertos de lectura son los siguientes:

20 La prote�na sin procesar LJL34 est� codificada por los �cidos nucleicos 30-842 de la SEC. ID. N�: 2; y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 87-842 de la SEC. ID. N�: 2. La prote�na sin procesar LJL18 est� codificada por los �cidos nucleicos 56-532 de la SEC. ID. N�: 4 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 113-532 de la SEC. ID. N�: 4.

La prote�na sin procesar LJS193 est� codificada por los �cidos nucleicos 216-502 de la SEC. ID. N�: 6 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 276-502 de la SEC. ID. N�: 6. La prote�na sin procesar LJS201 est� codificada por los �cidos nucleicos 48-353 de la SEC. ID. N�: 8 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 117-352 de la SEC. ID. N�: 8. 5 La prote�na sin procesar LJL13 est� codificada por los �cidos nucleicos 26-766 de la SEC. ID. N�: 10 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 83-766 de la SEC. ID. N�: 10. La prote�na sin procesar LJL23 est� codificada por los �cidos nucleicos 18-992 de la SEC. ID. N�: 12 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 81-992 de la SEC. ID. N�: 12. La prote�na sin procesar LJM10 est� codificada por los �cidos nucleicos 92-571 de la SEC. ID. N�: 14 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 149-571 de la SEC. ID. N�: 14. La prote�na sin procesar LJL143 est� codificada por los �cidos nucleicos 46-948 de la SEC. ID. N�: 16 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 115-948 de la SEC. ID. N�: 16. La prote�na sin procesar LJS142 est� codificada por los �cidos nucleicos 25-507 de la SEC. ID. N�: 18 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 85-507 de la SEC. ID. N�: 18. 15 La prote�na sin procesar LJL17 est� codificada por los �cidos nucleicos 28-342 de la SEC. ID. N�: 20 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 88-342 de la SEC. ID. N�: 20. La prote�na sin procesar LJM06 est� codificada por los �cidos nucleicos 50-523 de la SEC. ID. N�: 22 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 107-523 de la SEC. ID. N�: 22. La prote�na sin procesar LJM17 est� codificada por los �cidos nucleicos 24-1264 de la SEC. ID. N�: 24 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 83-1264 de la SEC. ID. N�: 24. La prote�na sin procesar LJL04 est� codificada por los �cidos nucleicos 30-914 de la SEC. ID. N�: 26 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 81-914 de la SEC. ID. N�: 26. La prote�na sin procesar LJMI 14 est� codificada por los �cidos nucleicos 29-475 de la SEC. ID. N�: 28 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 101-475 de la SEC. ID. N�: 28. 25 La prote�na sin procesar LJMI 11 est� codificada por los �cidos nucleicos 24-1214 de la SEC. ID. N�: 30 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 78-1214 de la SEC. ID. N�: 30. La prote�na sin procesar LJM78 est� codificada por los �cidos nucleicos 42-1091 de la SEC. ID. N�: 32 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 102-11091 de la SEC. ID. N�: 32. La prote�na sin procesar LJS238 est� codificada por los �cidos nucleicos 27-206 de la SEC. ID. N�: 34 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 87-206 de la SEC. ID. N�: 34. La prote�na sin procesar LJS169 est� codificada por los �cidos nucleicos 11-370 de la SEC. ID. N�: 36 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 77-370 de la SEC. ID. N�: 36. La prote�na sin procesar LJL11 est� codificada por los �cidos nucleicos 30-1745 de la SEC. ID. N�: 38 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 105-1745 de la SEC. ID. N�: 38. 35 La prote�na sin procesar LJL08 est� codificada por los �cidos nucleicos 26-238 de la SEC. ID. N�: 40 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 95-238 de la SEC. ID. N�: 40. La prote�na sin procesar LJS105 est� codificada por los �cidos nucleicos 24-275 de la SEC. ID. N�: 42 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 81-275 de la SEC. ID. N�: 42. La prote�na sin procesar LJL09 est� codificada por los �cidos nucleicos 74-1954 de la SEC. ID. N�: 44 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 128-1954 de la SEC. ID. N�: 44. La prote�na sin procesar LJL38 est� codificada por los �cidos nucleicos 40-165 de la SEC. ID. N�: 46 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 100-165 de la SEC. ID. N�: 46. La prote�na sin procesar LJM04 est� codificada por los �cidos nucleicos 40-456 de la SEC. ID. N�: 48 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 100-456 de la SEC. ID. N�: 48. 45 La prote�na sin procesar LJM26 est� codificada por los �cidos nucleicos 96-1616 de la SEC. ID. N�: 50 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 147-1616 de la SEC. ID. N�: 50. La prote�na sin procesar LJS03 est� codificada por los �cidos nucleicos 41-553 de la SEC. ID. N�: 52 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 98-553 de la SEC. ID. N�: 52. La prote�na sin procesar LJS192 est� codificada por los �cidos nucleicos 18-344 de la SEC. ID. N�: 54 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 87-344 de la SEC. ID. N�: 54. La prote�na sin procesar LJM19 est� codificada por los �cidos nucleicos 16-360 de la SEC. ID. N�: 56 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 82-360 de la SEC. ID. N�: 56. La prote�na sin procesar LJL138 est� codificada por los �cidos nucleicos 12-1238 de la SEC. ID. N�: 58 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 72-1238 de la SEC. ID. N�: 58. 55 La prote�na sin procesar LJL15 est� codificada por los �cidos nucleicos 63-542 de la SEC. ID. N�: 60 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 120-542 de la SEC. ID. N�: 60. La prote�na sin procesar LJL91 est� codificada por los �cidos nucleicos 63-542 de la SEC. ID. N�: 62 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 120-542 de la SEC. ID. N�: 62. La prote�na sin procesar LJMI est� codificada por los �cidos nucleicos 20-1216 de la SEC. ID. N�: 64 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 74-1216 de la SEC. ID. N�: 64. La prote�na sin procesar LJS138 est� codificada por los �cidos nucleicos 12-1238 de la SEC. ID. N�: 66 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 72-138 de la SEC. ID. N�: 66. La prote�na sin procesar LJL124 est� codificada por los �cidos nucleicos 23-241 de la SEC. ID. N�: 68 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 83-241 de la SEC. ID. N�: 68. 65 La prote�na sin procesar LJL35 est� codificada por los �cidos nucleicos 12-1238 de la SEC. ID. N�: 70 y la prote�na madura est� codificada por la secuencia de �cido nucleico 72-1238 de la SEC. ID. N�: 70.

Otro ejemplo concreto, de car�cter no limitador, de un polinucle�tido que codifica un polip�ptido de Lu. longipalpis es un polinucle�tido que tiene una homolog�a de al menos el 75%, 85%, 90%, 95% o 99% con una de las secuencias anteriormente presentadas que codifica un polip�ptido que tiene una funci�n o ep�topo antig�nico de un polip�ptido de Lu. longipalpis. Otro ejemplo concreto m�s, de car�cter no limitador, de un polinucle�tido que codifica un polip�ptido de Lu. longipalpis es un polinucle�tido que codifica un polip�ptido al que se ha unido de forma espec�fica un anticuerpo que se une espec�ficamente al polip�ptido de Lu. longipalpis.

Los polinucle�tidos de Lu. longipalpis incluyen un ADN recombinante que se incorpora a un vector, a un virus o pl�smido que se replica de forma aut�noma, al ADN gen�mico de una c�lula procariota o eucariota, o que existe como una mol�cula separada (por ejemplo, un ADNc) independiente de otras secuencias. Los nucle�tidos pueden ser ribonucle�tidos, desoxinucle�tidos o formas modificadas de alguno de estos nucle�tidos. El t�rmino incluye formas individuales o dobles de cada nucle�tido. El t�rmino incluye formas individuales o dobles de ADN.

En el presente se divulgan tambi�n vectores recombinantes que incluyen un polinucle�tido que codifica un polip�ptido o un fragmento del mismo de acuerdo con la divulgaci�n. Los vectores recombinantes incluyen pl�smidos y vectores virales y se pueden utilizar para la expresi�n in vitro o in vivo.

Un pl�smido puede incluir una unidad de transcripci�n de ADN, por ejemplo una secuencia de �cido nucleico que le permite replicarse en una c�lula hu�sped, como un origen de replicaci�n (procariota o eucariota). Un pl�smido puede incluir tambi�n uno o m�s genes marcadores seleccionables y otros elementos gen�ticos conocidos en el campo. En la presente divulgaci�n se incluyen formas circulares y lineales de pl�smidos.

Para la expresi�n in vivo, por lo general el promotor es de origen celular o viral. En una realizaci�n, se puede utilizar el promotor temprano del citomegalovirus (promotor de CMV-IE), incluyendo el promotor y potenciador. El promotor de CMV-IE puede ser de origen humano o murino, o proceder de otra fuente, como la rata o la cobaya (v�ase EP 0260148; EP 0323597; WO 89/01036; Pasleau et al., Gene 38:227-232, 1985; Boshart M. et al., Cell 41:521-530, 1985). Tambi�n se pueden emplear fragmentos funcionales del promotor de CMV-IE (WO 98/00166). Asimismo, se puede utilizar el promotor temprano o tard�o del virus SV40 y el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous. Otros promotores incluyen, a t�tulo meramente enunciativo, un promotor de un gen citoesquel�tico, como por ejemplo (a t�tulo meramente enunciativo), el promotor de la desmina (Kwissa M. et al., Vaccine 18(22):2337-2344, 2000), o el promotor de la actina (Miyazaki J. et al., Gene 79(2):269-277, 1989). Cuando hay varios genes presentes en el mismo pl�smido, se pueden proporcionar en la misma unidad de transcripci�n o en unidades diferentes.

Los pl�smidos tambi�n pueden comprender otros elementos reguladores de la transcripci�n, como, por ejemplo, secuencias estabilizadoras de tipo intr�n. En diversas realizaciones, los pl�smidos incluyen el primer intr�n de CMV-IE (Solicitud de PCT publicada n� WO 89/01036), el intr�n II del gen de la beta-globina de conejo (van Ooyen et al., Science 206:337-344, 1979), la secuencia de se�al de la prote�na codificada por el activador del plasmin�geno tisular (tPA; Montgomery et al., Cell. Mol Biol. 43:285-292, 1997), y/o una se�al de poliadenilaci�n (polyA), en concreto la polyA del gen de la hormona de crecimiento bovino (bGH) (Patente estadounidense n� 5.122.458) o la polyA del gen de beta-globina de conejo o del virus SV40.

En un ejemplo concreto, de car�cter no limitador, se puede utilizar el pl�smido pVR1020 (VICAL Inc.; Luke C. et al., Journal of Infectious Diseases 175:91-97, 1997; Hartikka J. et al., Human Gene Therapy 7:1205-1217, 1996)) como vector para la inserci�n de esta secuencia de polinucle�tidos, generando pl�smidos recombinantes.

Los pl�smidos son evaluados en perros para determinar su eficacia contra la infecci�n por Leishmania (Vidor E. et al., P3.14, XXIV Congreso Internacional de Veterinaria, R�o de Janeiro, Brasil, 18-23 de agosto de 1991).

Tambi�n se pueden utilizar diversos vectores virales con un polinucle�tido que codifica un polip�ptido de Lu. longipalpis. Un ejemplo concreto, de car�cter no limitador, incluye poxvirus recombinantes, incluyendo virus avipox, como el virus de la viruela del canario. Otro ejemplo concreto, de car�cter no limitador, incluye poxvirus recombinantes, incluyendo virus vaccinia (Patente estadounidense n� 4.603.112), como el virus vaccinia atenuado, como, por ejemplo el NYVAC (v�ase la Patente estadounidense n� 5.494.807) o el virus vaccinia modificado de Ankara (MVA, Stickl H. y Hochstein-Mintzel V., Munch. Med. Wschr. 113:1149-1153, 1971; Sutler G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10847-10851, 1992; Carroll M. W. et al., Vaccine 15(4):387-394, 1997; Stittelaar K. J. et al.,

J. Virol. 74(9) :4236-4243, 2000; Sutler G. et al., Vaccine 12(11): 1032-1040, 1994). Cuando se emplean virus avipox, resultan �tiles los virus de la viruela del canario (Patente estadounidense n� 5.756.103.) y los virus de la viruela aviar (Patente estadounidense n� 5.766.599), tal como virus atenuados. Para los vectores de virus de la viruela del canario recombinantes, los sitios de inserci�n pueden estar en particular en las ORF C3, C5 o C6. Cuando el vector de expresi�n es un poxvirus, el polinucle�tido heter�logo se puede insertar bajo el control de un promotor espec�fico de poxvirus, como el promotor 7.5kDa del virus vaccinia (Cochran et al., J. Virology 54:30-35, 1985), el promotor I3L del virus vaccinia (Riviere et al., J. Virology 66:3424-3434, 1992), el promotor HA del virus vaccinia (Shida, Virology 150:451-457, 1986), el promotor ATI del virus de la viruela bovina (Funahashi et al., J. Gen. Virol. 69:35-47, 1988), otro promotor H6 del virus vaccinia (Taylor et al., Vaccine 6:504-508, 1988; Guo et al., J. Virol. 63:4189-4198, 1989; Perkus et al., J. Virol. 63:3829-3836, 1989).

Otros vectores virales �tiles son los vectores del herpesvirus o adenovirus. Algunos ejemplos concretos, de car�cter no limitador, incluyen un vector de herpesvirus canino (CHV) o de adenovirus canino (CAV) (v�ase, por ejemplo, la Patente estadounidense n� 5.529.780; la Patente estadounidense n� 5.688.920; la solicitud de PCT publicada n� WO 95/14102). Para el CHV, los sitios de inserci�n pueden estar en particular en el gen de la timidina quinasa, en la ORF3, o en la ORF de UL43 (v�ase la Patente estadounidense n� 6.159.477). Para el CAV, los sitios de inserci�n pueden estar en particular en la regi�n E3 o en la regi�n que se encuentra entre la regi�n E4 y la regi�n ITR izquierda (v�ase la Patente estadounidense n� 6.090.393; Patente estadounidense n� 6.156.567). En una realizaci�n en vectores de CHV o CAV, la inserci�n se produce en general bajo el control de un promotor (tal y como se ha descrito anteriormente para los pl�smidos), como el promotor de CMV-IE.

Se pueden realizar m�ltiples inserciones en el mismo vector utilizando sitios de inserci�n diferentes o utilizando el mismo sitio de inserci�n. Cuando se utiliza el mismo sitio de inserci�n, cada elemento insertado del polinucle�tido se inserta bajo el control de diferentes promotores. La inserci�n se puede realizar de cola a cola, de cabeza a cabeza, de cola a cabeza o de cabeza a cola. Tambi�n se pueden utilizar los elementos del IRES (sitio de entrada del ribosoma interno, v�ase la Patente europea EP 0803573) para separar y expresar m�ltiples elementos insertados operativamente unidos al mismo promotor. Tambi�n se pueden emplear vectores bacterianos para la expresi�n in vivo.

Cualquier polinucle�tido de conformidad con la divulgaci�n se puede expresar in vitro mediante transferencia de ADN o vectores de expresi�n en una c�lula hu�sped adecuada. La c�lula hu�sped puede ser procariota o eucariota. El t�rmino "c�lula hu�sped" incluye tambi�n cualquier descendencia de la c�lula hu�sped del sujeto. Los m�todos de transferencia estable, lo que significa que el polinucle�tido extra�o se mantiene continuamente en la c�lula hu�sped, son conocidos en el campo. Las c�lulas hu�sped pueden incluir bacterias (por ejemplo, Escherichia coli), levaduras, c�lulas de insectos y c�lulas de vertebrados. Los m�todos para expresar secuencias de ADN en c�lulas eucariotas son bien conocidos en el campo.

Como m�todo para la expresi�n in vitro, los vectores de baculovirus recombinantes (por ejemplo, el virus de la polihidrosis nuclear de la Autographa californica (AcNPV)) se pueden utilizar con los �cidos nucleicos divulgados en el presente. Por ejemplo, los promotores de polihedrina se pueden utilizar con c�lulas de insectos (por ejemplo, c�lulas de Spodopterafrugiperda, como c�lulas Sf9 disponibles en la ATCC bajo el n�mero de acceso CRL-1711, o c�lulas Sf21) (v�ase, por ejemplo, Smith et al., Mol. Cell Biol. 3:2156-2165, 1983; Pennock et al., Mol. Cell Biol. 4: 399-406, 1994; Vialard et al., J. Virol. 64:37-50, 1990; Verne A., Virology 167:56-71, 1988; O'Reilly et al., "Baculovirus expression vectors, A laboratory manual," New York Oxford, Oxford University Press, 1994; Kidd I. M. & Emery V.C., "The use of baculoviruses as expression vectors," Applied Biochemistry and Biotechnology 42:37-159, 1993; Patente europea n�. EP 0370573; Patente europea n�. EP 0265785; Patente estadounidense n�. 4.745.051). Para la expresi�n se puede utilizar el BaculoGold™ Starter Package (Cat # 21001K) de Pharmingen (Becton Dickinson).

Como m�todo para la expresi�n in vitro, se puede utilizar E. coli recombinante con un vector. Por ejemplo, cuando se clonan sistemas bacterianos, se pueden utilizar promotores inducibles como el promotor de arabinosa, pL de bacteri�fago lambda, plac, ptrp, ptac (promotor h�brido ptrp-lac) y similares.

La transformaci�n de una c�lula hu�sped con ADN recombinante se puede realizar mediante t�cnicas convencionales bien conocidas por los expertos en el campo. Cuando la c�lula hu�sped es procariota, como E. coli, se pueden preparar c�lulas competentes que son capaces de absorber ADN a partir de c�lulas cosechadas tras una fase de crecimiento exponencial para tratarlas despu�s mediante el m�todo de CaCl2 utilizando procedimientos bien conocidos en el campo. Alternativamente, se puede utilizar MgCl2 o RbCl. Tambi�n se puede realizar la transformaci�n tras formar un protoplasto de la c�lula hu�sped, si se desea, o mediante electroporaci�n.

Cuando la c�lula hu�sped es eucariota, se pueden utilizar m�todos de transducci�n del ADN como los coprecipitados de fosfato c�lcico, procedimientos mec�nicos convencionales como microinyecci�n, electroporaci�n, inserci�n de un pl�smido encapsulado en liposomas o vectores virales. Las c�lulas eucariotas tambi�n se pueden transformar conjuntamente con secuencias de polinucle�tidos de Lu. longipalpis y una segunda mol�cula de ADN extra�a que codifica un fenotipo seleccionable, como el gen timidina quinasa del herpes simple. Otro m�todo consiste en utilizar un vector viral eucariota (v�ase arriba), como un herpesvirus o adenovirus (por ejemplo, adenovirus canino 2), para transducir de forma transitoria c�lulas eucariotas y expresar la prote�na (v�ase, por ejemplo, Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982). Por otra parte, se puede utilizar un agente de transfecci�n, como dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE).

El aislamiento y la purificaci�n del polip�ptido expresado recombinantemente se pueden realizar por medios convencionales incluyendo cromatograf�a preparativa (por ejemplo, exclusi�n por tama�o, intercambio de iones, afinidad), precipitaci�n selectiva y ultrafiltraci�n. Este polip�ptido expresado recombinantemente forma parte de la presente divulgaci�n. Tambi�n se incluyen m�todos para la producci�n de este polip�ptido, en particular el uso de un vector de expresi�n recombinante que comprende un polinucle�tido de conformidad con la divulgaci�n y de una c�lula hu�sped.

Anticuerpos

Se puede utilizar un polip�ptido de Lu. longipalpis de la divulgaci�n o un fragmento del mismo de conformidad con la divulgaci�n para producir anticuerpos. Se incluyen anticuerpos policlonales, anticuerpos que se componen b�sicamente de anticuerpos monoclonales agrupados con diferentes especificidades epit�picas, as� como anticuerpos monoclonales distintos. Estos anticuerpos son �tiles como marcadores para la exposici�n y como herramientas de inmunodiagn�stico para seguir la evoluci�n de la respuesta inmune a las prote�nas salivales de Lu. longipalpis.

La preparaci�n de anticuerpos policlonales es bien conocida por los expertos en el campo. V�ase, por ejemplo, Green et al., "Production of Polyclonal Antisera," Immunochemical Protocols, pp. 1-5, Manson, comp., Humana Press, 1992; Coligan et al., "Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters," Current Protocols in Immunology, section 2.4.1, 1992.

Del mismo modo, la preparaci�n de anticuerpos monoclonales es convencional. V�ase, por ejemplo, Kohler & Milstein, Nature 256:495, 1975; Coligan et al., secciones 2.5.1-2.6.7; y Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual., p. 726, Cold Spring Harbor Pub., 1988. En resumen, los anticuerpos monoclonales se pueden obtener inyectando a ratones una composici�n que comprende un ant�geno, verificando la presencia de producci�n de anticuerpos mediante la extracci�n de una muestra de suero, extirpando el bazo para obtener linfocitos B, fusionando los linfocitos B con c�lulas de mieloma para producir hibridomas, clonando los hibridomas, seleccionando clones positivos que producen anticuerpos para el ant�geno y aislando los anticuerpos de los cultivos de hibridoma. Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar y purificar a partir de cultivos de hibridoma mediante diversas t�cnicas bien establecidas. Estas t�cnicas de aislamiento incluyen la cromatograf�a de afinidad con Prote�na A-Sefarosa, cromatograf�a de exclusi�n por tama�os y cromatograf�a de intercambio de iones. V�ase, por ejemplo, Coligan et al., secciones 2.7.1-2.7.12 y secciones 2.9.1-2.9.3; Barnes et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," Methods in Molecular Biology, Vol. 10, pp. 79-104, Humana Press, 1992.

Los m�todos de multiplicaci�n in vitro e in vivo de anticuerpos monoclonales son bien conocidos por los expertos en el campo. La multiplicaci�n in vitro se puede realizar en medios de cultivo adecuados, tales como el Modified Eagle Medium de Dulbecco o medio RPMI 1640, opcionalmente suplementados con un suero de mam�fero, como suero fetal bovino u oligoelementos y suplementos potenciadores del crecimiento, como c�lulas de exudado peritoneal, c�lulas de bazo, timocitos o macr�fagos de m�dula espinal de ratones normales. La producci�n in vitro proporciona preparaciones de anticuerpos relativamente puros y permite ampliar para producir grandes cantidades de los anticuerpos deseados. El cultivo de hibridomas a gran escala se puede realizar mediante cultivo de suspensi�n homog�nea en un reactor por bucle de aire, un reactor de agitaci�n continua o en cultivo de c�lulas atrapadas o inmovilizadas. La multiplicaci�n in vivo se puede realizar inyectando clones de c�lulas a mam�feros histocompatibles con las c�lulas madre, por ejemplo, ratones sing�nicos, para provocar el crecimiento de tumores que producen anticuerpos. Opcionalmente, a los animales se les aplica un hidrocarburo, especialmente aceites como pristano (tetrametilpentadecano), antes de la inyecci�n. Despu�s de una a tres semanas, el anticuerpo monoclonal deseado se recupera del fluido corporal del animal.

Los anticuerpos tambi�n se pueden obtener de anticuerpos de primates no humanos. Las t�cnicas generales para obtener anticuerpos terap�uticamente �tiles en babuinos se pueden encontrar, por ejemplo, en WO 91/11465, 1991, y Losman et al., Int. J. Cancer 46:310, 1990.

Alternativamente, un anticuerpo que se une espec�ficamente a un polip�ptido se puede obtener de un anticuerpo monoclonal humanizado. Los anticuerpos monoclonales humanizados se producen transfiriendo regiones determinantes de complementariedad murinas de cadenas variables pesadas y ligeras de la inmunoglobulina murina a un dominio variable humano y, a continuaci�n, sustituyendo los residuos humanos de las regiones marco de las contrapartes murinas. El uso de componentes de anticuerpos obtenidos de anticuerpos monoclonales humanizados evita posibles problemas asociados con la inmunogenicidad de las regiones constantes murinas. Las t�cnicas generales para clonar dominios variables de inmunoglobulina murina se describen, por ejemplo, en Orlandi et al., Proc. Nat'lAcad. Sci. EE.UU. , 86:3833, 1989. Las t�cnicas para producir anticuerpos monoclonales humanizados se describen, por ejemplo, en Jones et al., Nature 321:522, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534, 1988; Carter et al., Proc. Nat'lAcad. Sci. USA 89:4285, 1992; Sandhu, Crit. Rev. BiotechA2:437, 1992; y Singer et al., J. Immunol. 150:2844, 1993.

Se pueden obtener anticuerpos obtenidos de fragmentos de anticuerpos humanos aislados de una biblioteca de inmunoglobulina combinatoria. V�ase, por ejemplo, Barbas et al., Methods: a Companion to Methods in Enzymology, Vol. 2, p. 119, 1991; Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12:433, 1994. Los vectores de clonaci�n y de expresi�n que son �tiles para producir una biblioteca de fagos de inmunoglobulina humana se pueden obtener, por ejemplo, de STRATAGENE Cloning Systemas (La Jolla, CA).

Por otra parte, se pueden obtener anticuerpos de un anticuerpo monoclonal humano. Estos anticuerpos se obtienen de ratones transg�nicos que han sido "modificados gen�ticamente" para producir anticuerpos humanos espec�ficos en respuesta a un desaf�o antig�nico. En esta t�cnica, se introducen elementos de los lugares de la cadena pesada y la cadena ligera humanas en cadenas murinas obtenidas de l�neas de c�lulas madre embri�nicas que contienen alteraciones seleccionadas de los lugares de la cadena pesada y la cadena ligera end�genas. Los ratones transg�nicos pueden sintetizar anticuerpos humanos espec�ficos para ant�genos humanos y los ratones se pueden utilizar para producir hibridomas que secretan anticuerpos humanos. Los m�todos para obtener anticuerpos

5 humanos de ratones transg�nicos se describen en Green et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg et al., Nature 368:856, 1994; y Taylor et al., Int. Immunol. 6:579, 1994.

Los anticuerpos incluyen mol�culas intactas, as� como fragmentos de las mismas, tales como Fab, F(ab')2, y Fv, que son capaces de unirse al determinante epit�pico. Estos fragmentos de anticuerpo conservan cierta capacidad para

10 unirse selectivamente con su ant�geno o receptor y se definen como sigue:

(1) Fab, el fragmento que contiene un fragmento monovalente de uni�n a ant�geno de una mol�cula de anticuerpo se produce por digesti�n del anticuerpo entero con la enzima papa�na para obtener una cadena ligera (L) intacta y una porci�n de una cadena pesada (H).

15 (2) Fab’, el fragmento de una mol�cula de anticuerpo se puede obtener tratando el anticuerpo entero con pepsina, seguido por reducci�n, para producir una cadena ligera intacta y una porci�n de la cadena pesada; se obtienen dos fragmentos Fab’ por mol�cula de anticuerpo;

(3) (Fab')2, el fragmento del anticuerpo se puede obtener tratando todo el anticuerpo con la enzima pepsina que

puede obtenerse sin reducci�n subsiguiente; F(ab')2 es un d�mero de dos fragmentos de Fab mantenidos juntos 20 por dos enlaces de disulfuro;

(4)

Fv, definido como un fragmento modificado gen�ticamente que contiene la regi�n variable de la cadena ligera (VL) y la regi�n variable de la cadena pesada (VH) expresadas como dos cadenas; y

(5)

Anticuerpo de una sola cadena (“SCA”), definido como una mol�cula modificada gen�ticamente que

contiene la regi�n variable de la cadena ligera, la regi�n variable de la cadena pesada, ligadas por un conector 25 polipept�dico adecuado como una mol�cula de una sola cadena gen�ticamente fusionada.

Los m�todos de preparaci�n de estos fragmentos son conocidos en el campo. (V�ase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988).

30 Por ejemplo, se pueden preparar fragmentos de anticuerpos mediante hidr�lisis proteol�tica del anticuerpo o mediante expresi�n en E. coli del ADN que codifica el fragmento. Se pueden obtener fragmentos de anticuerpos mediante digesti�n con pepsina o papa�na de anticuerpos enteros por m�todos convencionales Por ejemplo, se pueden producir fragmentos de anticuerpos mediante clivaje enzim�tico de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento de 5S denominado F(ab')2. Este fragmento se puede clivar adicionalmente usando un

35 agente reductor de tiol, y opcionalmente un grupo bloqueante para los grupos sulfhidrilo resultantes del clivaje de los enlaces disulfuro, para producir fragmentos monovalentes Fab' de 3,5S. De forma alternativa, un clivaje enzim�tico usando pepsina produce dos fragmentos monovalentes Fab' y un fragmento Fc directamente (v�ase la Patente estadounidense n� 4.036.945 y la Patente estadounidense n� 4.331.647, y referencias contenidas en las mismas; Isonhoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J 73:119, 1959; Edelman et al., Methods in

40 Enzymology, Vol. 1, p�gina 422, Academic Press, 1967; y Coligan et al. en las secciones 2.8.1-2.8.10 y 2.10.12.10.4).

Tambi�n se pueden usar otros m�todos de clivaje de anticuerpos, tales como separaci�n de cadenas pesadas para formar fragmentos monovalentes de cadena ligera-pesada, clivaje adicional de fragmentos, u otras t�cnicas

45 enzim�ticas, qu�micas o gen�ticas, siempre que los fragmentos se unan al ant�geno que reconoce el anticuerpo intacto.

Por ejemplo, los fragmentos Fv comprenden una asociaci�n de cadenas VH y VL . Esta asociaci�n puede ser no covalente (Inbar et al., Proc. Nat'lAcad. Sci. USA 69:2659, 1972). De forma alternativa, las cadenas variables se 50 pueden unir por un enlace disulfuro intermolecular o entrecruzar mediante agentes qu�micos como glutaraldeh�do V�ase, por ejemplo, Sandhu, supra. En una realizaci�n, los fragmentos Fv comprenden cadenas VH y VL conectadas por un conector pept�dico. Estas prote�nas de uni�n al ant�geno de cadena �nica (sFv) se preparan construyendo un gen estructural que comprende secuencias de ADN que codifican los dominios de VH y VL unidos por un oligonucle�tido. El gen estructural se inserta en un vector de expresi�n, que se introduce posteriormente en una

55 c�lula hu�sped como E. coli. Las c�lulas hu�sped recombinantes sintetizan una �nica cadena polipept�dica con un conector pept�dico que une los dos dominios V. Los m�todos para producir sFv son conocidos en el campo (v�ase Whitlow et al., Methods: a Companion to Methods in Enzymology, Vol. 2, p�gina 97, 1991; Bird et al., Science 242:423, 1988; Patente estadounidense n� 4.946.778; Pack et al., Bio/Technology 11:1271, 1993; y Sandhu, supra).

60 Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un p�ptido que codifica una �nica regi�n determinante de la complementariedad (CDR). Se pueden obtener p�ptidos CDR (unidades m�nimas de reconocimiento) construyendo genes que codifican la CDR de un anticuerpo de inter�s. Estos genes se preparan, por ejemplo, mediante el uso de la reacci�n en cadena de la polimerasa para sintetizar la regi�n variable a partir del ARN de c�lulas productoras de anticuerpos (Larrick et al., Methods: a Companion to Methods in Enzymology, Vol. 2, p�gina 106, 1991).

65 Los anticuerpos se pueden preparar usando como ant�geno de inmunizaci�n un polip�ptido intacto o fragmentos que contienen peque�os p�ptidos de inter�s. El polip�ptido o el p�ptido usado para inmunizar a un animal se puede obtener de un polip�ptido sustancialmente purificado producido en c�lulas hu�sped, ADNc transducido in vitro o mediante s�ntesis qu�mica, que se puede conjugar con una prote�na portadora si se desea. Estos portadores

5 com�nmente utilizados y que son acoplados qu�micamente al p�ptido incluyen hemocianina de lapa (KLH), tiroglobulina, alb�mina de suero bovino (BSA) y toxoide de t�tano. El p�ptido acoplado se emplea entonces para inmunizar el animal (por ejemplo, un rat�n, una rata o un conejo).

Los anticuerpos policlonales o monoclonales pueden ser purificados adicionalmente, por ejemplo, por uni�n y

10 eluci�n a partir de una matriz a la que se une el polip�ptido o p�ptido para el cual se promovieron los anticuerpos. Los expertos en el campo conocer�n diversas t�cnicas comunes en materia de inmunolog�a para la purificaci�n y/o concentraci�n de anticuerpos policlonales, as� como anticuerpos monoclonales (v�ase, por ejemplo, Coligan et al., Unidad 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991).

15 Tambi�n es posible utilizar la tecnolog�a del anti-idiotipo para producir anticuerpos monoclonales que imitan a un ep�topo. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-idiot�pico preparado conforme a un primer anticuerpo monoclonal tendr� un dominio de uni�n en la regi�n hipervariable que es la “imagen” del ep�topo al que se une el primer anticuerpo monoclonal.

20 En vista del gran n�mero de m�todos que se ha documentado para unir diversos compuestos de radiodiagn�stico, compuestos radioterap�uticos, f�rmacos marcadores (como enzimas o mol�culas fluorescentes), toxinas y otros agentes a los anticuerpos, un experto en el campo ser� capaz de determinar un m�todo apropiado para unir un determinado agente a un anticuerpo u otro polip�ptido.

25 En una realizaci�n, se puede utilizar un anticuerpo que se une a un polip�ptido de Lu. longipalpis para valorar si un sujeto ha sido picado por un fleb�tomo. En un ejemplo concreto, de car�cter no limitador, se obtiene una muestra de un sujeto de inter�s, como un ser humano o un perro. La muestra puede ser un fluido corporal (como sangre, suero, orina, saliva, etc.) o una biopsia de tejido. La muestra o una fracci�n de ella se pone en contacto con el anticuerpo y se valora la capacidad del anticuerpo para formar un complejo de ant�geno-anticuerpo. Un experto en el campo

30 podr� detectar f�cilmente la formaci�n de un complejo de ant�geno-anticuerpo. Por ejemplo se puede utilizar un ensayo ELISA, Western blot o radioinmunol�gico.

Composiciones inmunog�nicas, vacunas y m�todos de uso

35 En el presente se divulgan composiciones inmunog�nicas y vacunas. En una realizaci�n, las composiciones inmunog�nicas y vacunas incluyen un polip�ptido. En una realizaci�n, las composiciones inmunog�nicas y vacunas incluyen un vector recombinante, como un vector viral o un pl�smido. Cuando se administra a un sujeto, esta composici�n inmunog�nica o vacuna genera una respuesta inmune a la prote�na o prote�nas salivales del fleb�tomo y, sorprendentemente, se produce una reducci�n de los s�ntomas de la leishmaniasis y una reducci�n de la carga

40 parasitaria de Leishmania. De este modo, sin pretender vincularse a una teor�a, una respuesta celular, como una respuesta de Th1, producida en contra de la prote�na salival puede matar indirectamente a un par�sito Leishmania. Por ejemplo, la respuesta de tipo Th1 puede permitir que los macr�fagos absorban ant�genos de Leishmania y los presenten a los linfocitos T en un contexto de Th1. La inducci�n de la respuesta de Th1 puede producir una respuesta inmune contra la Leishmania, o puede preparar el sistema inmunitario del hu�sped mam�fero para la

45 inmunidad frente a la Leishmania en respuesta a una infecci�n posterior.

En una realizaci�n, la composici�n inmunog�nica o la vacuna incluye una cantidad efectiva de al menos un polip�ptido de Lu. longipalpis divulgado en el presente. La composici�n inmunog�nica y la vacuna pueden incluir un excipiente y/o un adyuvante farmac�uticamente aceptables. En una realizaci�n, la composici�n inmunog�nica o 50 vacuna incluye un polip�ptido que tiene una secuencia de amino�cido como la que se presenta como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 13, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N� 67, un 55 polip�ptido al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 99% hom�logo a uno de estos polip�ptidos, una variante conservadora, un hom�logo o un fragmento inmunog�nico que comprende al menos ocho

o al menos diez amino�cidos consecutivos de uno de estos polip�ptidos, o una combinaci�n de estos polip�ptidos. En un ejemplo concreto, de car�cter no limitador, la composici�n inmunog�nica o vacuna incluye un polip�ptido que tiene una secuencia de amino�cido como la que se presenta como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, 60 SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 13, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N� 67. En ejemplos concretos, de car�cter no limitador, la composici�n inmunog�nica incluye un polip�ptido que tiene una secuencia que se presenta como una

65 de las SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 11, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 55 o SEC. ID. N� 59.

En una realizaci�n, la composici�n inmunog�nica incluye m�s de un polip�ptido de Lu. longipalpis, como dos, tres, cuatro, cinco, seis, diez o m�s de los polip�ptidos divulgados en el presente. De este modo, la composici�n inmunog�nica incluye al menos un polip�ptido que tiene una secuencia de amino�cido como la que se presenta como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 13, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N� 67, un polip�ptido al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 99% hom�logo a uno de estos polip�ptidos, una variante conservadora, un hom�logo o un fragmento inmunog�nico que comprende al menos ocho o al menos diez amino�cidos consecutivos de uno de estos polip�ptidos y, opcionalmente, otro polip�ptido que tiene una secuencia de amino�cido como la que se presenta como SEC. ID. N�: 1, SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 11, SEC. ID. N�: 13, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 37, SEC. ID. N�: 39, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N� 67 o SEC. ID. N� 69, un polip�ptido al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 99% hom�logo a uno de estos polip�ptidos, una variante conservadora de uno de estos polip�ptidos, o un hom�logo o un fragmento inmunog�nico que comprende al menos ocho o al menos diez amino�cidos consecutivos de uno de estos polip�ptidos.

En ejemplos concretos, de car�cter no limitador, la composici�n inmunog�nica incluye un amino�cido que tiene una secuencia como la que se presenta como SEC. ID. N�: 1, SEC. ID. N�: 23, SEC. ID. N�: 39, un polip�ptido al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 99% hom�logo a uno de estos polip�ptidos, una variante conservadora de uno de estos polip�ptidos, o un hom�logo o un fragmento inmunog�nico que comprende al menos ocho o al menos diez amino�cidos consecutivos de uno de estos polip�ptidos, o una combinaci�n de estos polip�ptidos. De este modo, la composici�n inmunog�nica puede incluir un polip�ptido que tiene una secuencia como la que se presenta como SEC. ID. N�: 1, SEC. ID. N�: 23 o SEC. ID. N� 39. Estas composiciones incluyen, a t�tulo meramente enunciativo, una composici�n inmunog�nica que incluye un polip�ptido que tiene una secuencia como la que se presenta como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 11, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 55 o SEC. ID. N� 59, y un polip�ptido que tiene una secuencia como la que se presenta como SEC. ID. N�: 1, SEC. ID. N�: 23 o SEC. ID. N� 39.

La composici�n inmunog�nica o la vacuna puede incluir un excipiente y/o un adyuvante farmac�uticamente aceptables.

En otra realizaci�n, la composici�n inmunog�nica o la vacuna incluye una cantidad efectiva de al menos un polip�ptido de Lu. longipalpis conjuntamente con uno o m�s polip�ptidos de P. perniciosus y/o uno o m�s polip�ptidos de P. ariasi. Estas secuencias de polip�ptidos se divulgan en la Solicitud de patente estadounidense n� 60/412,327, presentada el 19 de septiembre de 2002, la Solicitud de patente estadounidense n� 60/425,852, presentada el 12 de noviembre de 2002, y la Solicitud de PCTn� PCT/US03/29833, presentada el 18 de septiembre de 2003, que se incorporan al presente como referencia.

En una realizaci�n, la composici�n inmunog�nica o vacuna comprende una cantidad efectiva de un vector recombinante que expresa al menos un polip�ptido de Lu. longipalpis divulgado en el presente y un veh�culo o excipiente farmac�uticamente aceptable. En un ejemplo concreto, de car�cter no limitador, el vector recombinante codifica al menos un polip�ptido que tiene la secuencia de amino�cido como la que se presenta como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 13, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N� 67, una variante conservadora, un hom�logo, un fragmento inmunog�nico o una prote�na de fusi�n de la misma. En ejemplos concretos, de car�cter no limitador, el vector codifica un polip�ptido que tiene una secuencia como la que se presenta como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 11, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 55 o SEC. ID. N� 59, un polip�ptido al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 99% hom�logo a uno de estos polip�ptidos, una variante conservadora, un hom�logo, un fragmento inmunog�nico o una prote�na de fusi�n de los mismos. En varios ejemplos, el vector codifica uno o m�s polip�ptidos que tienen una secuencia como la que se presenta como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 11, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 55 o SEC. ID. N�

59. El vector tambi�n puede codificar opcionalmente un polip�ptido que tiene una secuencia como la que se presenta como SEC. ID. N�: 1, SEC. ID. N�: 23 o SEC. ID. N� 39.

El compuesto inmunog�nico puede incluir una secuencia de �cido nucleico que codifica un polip�ptido o polip�ptidos de P. ariasi y/o un polip�ptido o polip�ptidos de P. perniciosus (v�ase la Solicitud provisional estadounidense n� 60/412.327, que se incorpora por referencia al presente en su totalidad). En una realizaci�n, el polip�ptido o polip�ptidos de Lu. longipalpis que tienen una secuencia de amino�cido como la presentada como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 13, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�:

35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N�: 67, una variante conservadora, un hom�logo, un fragmento inmunog�nico o una prote�na de fusi�n de la misma, son codificados por el mismo vector recombinante, como un polip�ptido o polip�ptidos de P. ariasi y/o un polip�ptido o polip�ptidos de P. perniciosus. En otra realizaci�n, el polip�ptido o los polip�ptidos de Lu. longipalpis, un polip�ptido

o polip�ptidos de P. ariasi y/o un polip�ptido o polip�ptidos de P. perniciosus son codificados por vectores recombinantes diferentes.

El polip�ptido de Lu. longipalpis se puede administrar por cualquier medio conocido para un experto en el campo (v�ase Banga, A., "Parenteral Controlled Delivery of Therapeutic Peptides and Proteins," Therapeutic Peptides and Proteins, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA, 1995), como, por ejemplo, mediante inyecci�n intramuscular (IM), intrad�rmica (ID), subcut�nea (SC) o intravenosa, aunque tambi�n se puede contemplar la administraci�n oral, nasal o incluso anal. En una realizaci�n, la administraci�n se realiza por inyecci�n subcut�nea, intrad�rmica o intramuscular utilizando un inyector sin aguja (Biojector™, Bioject, Oregon, EE. UU.).

Para ampliar el tiempo durante el que el p�ptido o la prote�na est� disponible para estimular una respuesta, el p�ptido o la prote�na se puede proporcionar como un implante, una inyecci�n de aceite o un sistema de part�culas. El sistema de part�culas puede ser una micropart�cula, una microc�psula, una microesfera, una nanoc�psula o una part�cula similar (v�ase, por ejemplo, Banja, supra). Se ha demostrado que un veh�culo de part�culas basado en un pol�mero sint�tico act�a como un adyuvante para potenciar la respuesta inmune, adem�s de proporcionar una liberaci�n controlada. Se pueden utilizar sales de aluminio como adyuvantes para producir una respuesta inmune humoral. De este modo, en una realizaci�n, se administra un polip�ptido de Lu. longipalpis de manera que se induce una respuesta humoral.

En otra realizaci�n, un polip�ptido de Lu. longipalpis se administra de manera que se dirige la respuesta inmune a una respuesta celular (es decir, una respuesta de CTL), en lugar de una respuesta humoral (anticuerpo). Se conocen diversos medios para inducir respuestas celulares, tanto in vitro como in vivo. Los l�pidos han sido identificados como agentes capaces de ayudar a aplicar CTL in vivo contra diversos ant�genos. Por ejemplo, tal como se describe en la Patente estadounidense 5.662.907, los residuos de �cido palm�tico se pueden unir a los grupos amino alfa y �psilon de un residuo de lisina y, a continuaci�n, enlazarse (por ejemplo, a trav�s de uno o m�s residuos de uni�n, tales como glicina, glicina-glicina, serina, serina-serina o similares) a un p�ptido inmunog�nico. El p�ptido lipidado se puede inyectar despu�s directamente en una forma micelar, incorporar en un liposoma o emulsionar en un adyuvante. Como otro ejemplo, se pueden emplear lipoprote�nas de E. coli, como tripalmitoil-Sglicerilcisteinilseril-serina, para aplicar CTL espec�ficos tumorales cuando se unen covalentemente a un p�ptido apropiado (v�ase Deres et al., Nature 342:561, 1989). Por otra parte, dado que la inducci�n de anticuerpos neutralizantes tambi�n se puede aplicar con la misma mol�cula conjugada con un p�ptido que presenta un ep�topo apropiado, las dos composiciones se pueden combinar para provocar tanto respuestas humorales como mediadas por c�lulas cuando se considere recomendable.

En otra realizaci�n m�s, se a�ade un ep�topo T adyuvante restringido a MHC de clase II al polip�ptido de la divulgaci�n para inducir que las c�lulas T adyuvantes secreten citoquinas en el microentorno para activar c�lulas precursoras de CTL. La t�cnica implica adicionalmente a�adir mol�culas lip�dicas cortas para retener la construcci�n en el sitio de la inyecci�n durante varios d�as para localizar el ant�geno en el sitio de la inyecci�n y potenciar su proximidad a las c�lulas dendr�ticas u otras c�lulas presentadoras de ant�geno "profesionales" durante un periodo de tiempo (v�ase Chesnut et al., "Design and Testing of Peptide-Based Cytotoxic T-Cell-Mediated Immunotherapeutics to Treat Infectious Diseases and Cancer", Powell et al., comp., Vaccine Design, the Subunit and Adjuvant Approach, Plenum Press, Nueva York, 1995).

Se puede preparar una composici�n inmunog�nica o una vacuna de acuerdo con la divulgaci�n, utilizando t�cnicas est�ndar bien conocidas por los expertos en el campo farmac�utico o veterinario. Estas composiciones se pueden administrar en dosis y mediante t�cnicas bien conocidas por los expertos en el campo m�dico o veterinario, teniendo en cuenta factores como la edad, el sexo, el peso, la especie y la condici�n del sujeto en particular, as� como la v�a de administraci�n. La composici�n inmunog�nica o la vacuna se puede administrar sola o conjuntamente con adyuvante(s) y/u otro(s) ant�geno(s). El otro ant�geno o ant�genos puede ser un ant�geno de la Leishmania. En una realizaci�n, el ant�geno de la Leishmania es el ant�geno A2, como el ant�geno A2 de L. infantum (v�ase la Solicitud de Patente PCT publicada n� WO 95/06729 y, en particular, la secuencia proporcionada en SEC. ID. N�: 2). El otro ant�geno o ant�genos pueden estar presentes en la composici�n como una prote�na, o como un fragmento inmunol�gico de la misma (por ejemplo, un ep�topo), o como un elemento insertado en un vector de expresi�n (por ejemplo, un vector viral recombinante, un pl�smido recombinante, en particular el pVR1012 (Vical Inc.; Hartikka J. et al., Human Gene Therapy 7:1205-1217, 1996)).

Cualquier composici�n inmunog�nica, vacuna o composici�n terap�utica de acuerdo con la divulgaci�n se puede mezclar con un adyuvante.

Composiciones basadas en polip�ptidos:

En varias realizaciones, las vacunas y composiciones inmunog�nicas basadas en polip�ptidos de conformidad con la divulgaci�n est�n formuladas (1) con vitamina E, saponina (por ejemplo, Quil A™, QS21™), hidr�xido de aluminio, fosfato de aluminio, �xido de aluminio ("Vaccine Design, The subunit and adjuvant approach," Pharmaceutical Biotechnology, vol. 6, Compilado por Micheal F. Powell y Mark J. Newman, 1995, Plenum Press New York), (2) con 5 un pol�mero de �cido acr�lico o �cido metacr�lico, un pol�mero de anh�drido maleico y de derivado alquinilo, (3) con una secuencia inmunoestimuladora (ISS), en particular una secuencia oligodesoxirribonucleot�dica que contiene uno

o m�s grupos CpG no metilados (Klinman D. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:2879-2883, 1996; Solicitud de PCT publicada n� WO 98/16247), (4) para formular la composici�n inmunog�nica o vacuna en forma de una emulsi�n de aceite en agua, en particular la emulsi�n de SPT que se describe en la p�gina 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" , compilado por M. Powell y M. Newman, Plenum Press, 1995, y la emulsi�n MF59 descrita en la p�gina 183 del mismo libro, (5) con citoquinas, o (6) combinaciones o mezclas de los anteriores elementos.

Las citoquinas (5) que se pueden a�adir a la composici�n incluyen, a t�tulo meramente enunciativo, GM-CSF (factor

15 estimulante de colonias de granulocitos y macr�fagos) o citoquinas que inducen Th1 (por ejemplo, IL-12). Todas estas citoquinas se pueden a�adir a la composici�n como una prote�na o como un vector que codifica esta prote�na de citoquina. En una realizaci�n, las citoquinas son de origen canino, por ejemplo GM-CSF canino para el que se ha depositado una secuencia gen�tica en la base de datos de GenBank (n�mero de acceso S49738). Esta secuencia se puede utilizar para crear el vector de una manera similar a la recogida en la Solicitud de patente PCT publicada n� WO 00/77210.

En un ejemplo concreto, de car�cter no limitador, el adyuvante contiene dos o m�s emulsionantes, agentes de formaci�n de micela y aceites. Algunos emulsionantes, agentes de formaci�n de micela y aceites apropiados se detallan en las Patentes estadounidenses n� 5. 585.103; 5.709.860; 5.270.202; y 5.695.770, todas ellas incorporadas

25 al presente como referencia. Un emulsionante es cualquier mol�cula que permite que los componentes de la emulsi�n permanezcan en forma de una emulsi�n estable. Estos emulsionantes incluyen polisorbato 80 (Sorbitanmono-9-octadecenoato-poli(oxi-1,2-etanediil); fabricado por ICI Americas, Wilmington, Del), polisorbato 20, polisorbato 21, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 61, polisorbato 85, dodecil-N,N-dimetil-3-ammonio-1propanosulfonato, TEEPOL HB7™, y SPAN 80™ SPAN 85™, alcoholes grasos etoxilados, �cidos grasos etoxilados, aceite de ricino etoxilado (hidrogenado o no). En una realizaci�n, estos emulsionantes se proporcionan en una cantidad de entre 0,05 y 0,5% aproximadamente. En otra realizaci�n, estos emulsionantes se proporcionan en una cantidad aproximada del 0,2%. Un agente de formaci�n de micela es un agente capaz de estabilizar la emulsi�n formada con los dem�s componentes, de forma que se genere una estructura similar a una micela.

35 Algunos ejemplos de estos agentes incluyen tensioactivos polim�ricos descritos por las publicaciones de BASF Wyandotteof. por ejemplo, Schmolka, J. Am. Oil. Chem. Soc. 54:110, 1977, y Hunter et al., J. Immunol. 129:1244, 1981, PLURONIC™ L62LF, L101, L121, and L64, PEG1000, y TETRONIC™ 1501, 150R1, 701, 901, 1301, y 130R1. Las estructuras qu�micas de estos agentes son bien conocidas en el campo. En una realizaci�n, se selecciona el agente para que presente un balance hidr�filo-lip�filo de entre 0 y 2 aproximadamente, conforme a la definici�n de Hunter y Bennett, J. Immun. 133:3167, 1984. En una realizaci�n, el agente se puede proporcionar en una cantidad efectiva, por ejemplo entre 0,5 y 10% aproximadamente. En otra realizaci�n, el agente se puede proporcionar en una cantidad efectiva, por ejemplo entre un 1,25 y un 5% aproximadamente.

En una realizaci�n, el aceite incluido en la composici�n se selecciona para que promueva la retenci�n del ant�geno

45 en la emulsi�n de aceite en agua, por ejemplo, para proporcionar un veh�culo para el ant�geno deseado. En otra realizaci�n, el aceite tiene una temperatura de fusi�n inferior a unos 65�C, de forma que la emulsi�n se forma a temperatura ambiente (entre 20 y 25�C aproximadamente) o una vez que la temperatura de la emulsi�n se ha reducido hasta la temperatura ambiente.

La emulsi�n de aceite en agua (4) se puede basar, en particular, en aceite de parafina l�quida ligera (tipo Farmacopea Europea) ; aceite de isoprenoides como escualano, escualeno, EICOSANE™ o tetratetracontano; aceite resultante de la oligomerizaci�n de alquenos, en particular, de isobuteno o deceno; �steres de �cidos o de alcoholes que contienen un grupo alquilo lineal, tales como aceites vegetales, oleato de etilo, di (caprilato/caprato) de propilenglicol, tri (caprilato/caprato) de glicerilo o dioleato de propilenglicol; �steres de �cidos grasos o alcoholes

55 ramificados, por ejemplo, �steres de �cido isoste�rico. El aceite se utiliza ventajosamente en combinaci�n con emulsionantes para formar la emulsi�n. En varias realizaciones, los emulsionantes son tensioactivos no i�nicos, en particular �steres de sorbit�n, manida (por ejemplo, oleato de anhidromanitol) , glicerol, poliglicerol, propilenglicol y �cido oleico, isoste�rico, ricinoleico o hydroxieste�rico, opcionalmente etoxilados, y copol�meros de bloque de polioxipropileno-polioxietileno, en particular los productos Pluronic�, especialmente, L121. En un ejemplo concreto, de car�cter no limitador, el aceite se proporciona en una cantidad de entre 1 y 60% aproximadamente. En otro ejemplo concreto, de car�cter no limitador, el aceite se proporciona en una cantidad de entre 5 y 30% aproximadamente. En una realizaci�n el adyuvante es una mezcla de emulsionantes, agente de formaci�n de micela y aceite disponible bajo el nombre de Provax � (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA).

65 Los pol�meros de �cido acr�lico o �cido metacr�lico (2) se pueden entrelazar en particular con �teres de polialquenil de az�cares o de polialcoholes. Estos compuestos se conocen bajo el t�rmino "carbomer" (Pharmeuropa, Vol. 8, N�

2, junio de 1996). Un experto en el campo podr� consultar tambi�n la Patente estadounidense n� 2.909.462 (incorporada al presente como referencia), en la que se describen estos pol�meros acr�licos entrelazados con un compuesto polihidroxilado que contiene al menos tres grupos hidroxilo. En una realizaci�n, un compuesto polihidroxilado contiene no m�s de 8 grupos hidroxilo. En otra realizaci�n, los �tomos de hidr�geno de al menos 3 5 hidroxilos son sustituidos por radicales alif�ticos insaturados que contienen al menos 2 �tomos de carbono. En otras realizaciones, los radicales contienen entre 2 y 4 �tomos de carbono aproximadamente, como, por ejemplo, vinilos, alilos y otros grupos etil�nicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden contener por s� mismos otros sustituyentes, como metilo. Los productos comercializados bajo el nombre Carbopol� (Noveon Inc., Ohio, USA) resultan particularmente adecuados. �stos se entrelazan con un alilo de sacarosa o con alilpentaeritritol. Entre ellos,

10 cabe se�alar los productos Carbopol� 474P, 934P, y 971P.

Los copol�meros de anh�drido maleico y de un derivado alquenilo, como los productos EMA� (Monsanto) que son copol�meros de anh�drido maleico y de etileno, pueden ser lineales o entrelazados, por ejemplo entrelazados con �ter de divinilo. Se puede hacer referencia a J. Fields et al., Nature 186:778-780, 1960 (incorporado al presente

15 como referencia). En una realizaci�n, los pol�meros de �cido acr�lico o �cido metacr�lico y los productos EMA� se forman a partir de unidades basadas en la f�rmula siguiente:

20 en la que:

-R1 y R2, que pueden ser id�nticos o diferentes, representan H o CH3 -x = 0 o 1, en una realizaci�n, x = 1 -y = 1 o 2, con x + y = 2.

25 Para los productos EMA�, x = 0 e y = 2. Para los carb�meros, x = y = 1.

En una realizaci�n, la disoluci�n de estos pol�meros en agua conduce a una soluci�n �cida que se neutralizar� a pH fisiol�gico, para proporcionar al sujeto la soluci�n de adyuvante en la cual se incorporar� la composici�n

30 inmunog�nica o la vacuna. Los grupos carboxilo del pol�mero se hallan parcialmente en la forma COO−.

En una realizaci�n, una soluci�n de adyuvante, especialmente de carb�mero, se prepara en agua destilada. En otra realizaci�n, una soluci�n de adyuvante, especialmente de carb�mero, se prepara en presencia de cloruro s�dico, teniendo la soluci�n obtenida un pH �cido. En otra realizaci�n, esta soluci�n madre se diluye mediante la adici�n de

35 la cantidad adecuada (con el fin de obtener la concentraci�n final deseada), o una parte sustancial de la misma, de agua cargada con NaCl. En otra realizaci�n m�s, la soluci�n madre se diluye mediante la adici�n de la cantidad deseada de soluci�n salina fisiol�gica (NaCl 9 g/l), en una o m�s partes con una neutralizaci�n concomitante o posterior (pH 7.3 a 7.4). En una realizaci�n, la soluci�n madre se neutraliza con NaOH. Esta soluci�n a pH fisiol�gico se utilizar� para mezclarla con la composici�n inmunog�nica o con la vacuna, que puede ser especialmente

40 almacenada en forma secada por congelaci�n, l�quida o congelada.

En una realizaci�n, la concentraci�n de pol�mero en la composici�n de la vacuna final es de aproximadamente 0,01 a 1,5% p/v. En otra realizaci�n, la composici�n de la vacuna final es de aproximadamente 0,05 a 1% p/v. En otra realizaci�n m�s, la composici�n de la vacuna final es de aproximadamente 0,1 a 0,4% p/v.

45 Los l�pidos han sido identificados como agentes capaces de estimular la respuesta inmune para diversos ant�genos. Por ejemplo, tal como se describe en la Patente estadounidense 5.662.907, los residuos de �cido palm�tico se pueden unir a los grupos amino alfa y �psilon de un residuo de lisina y, a continuaci�n, enlazarse (por ejemplo, a trav�s de uno o m�s residuos de uni�n, tales como glicina, glicina-glicina, serina, serina-serina o similares) a un

50 p�ptido inmunog�nico. El p�ptido lipidado se puede inyectar despu�s directamente en una forma micelar, incorporar en un liposoma o emulsionar en un adyuvante. En otro ejemplo, se pueden utilizar las proprote�nas de E. coli, como tripalmitoil-S-glicerilcisteinilseril-serina.

Para ampliar el tiempo durante el que el p�ptido o la prote�na est� disponible para estimular una respuesta, el

55 p�ptido o la prote�na se puede proporcionar como un implante, una inyecci�n de aceite o un sistema de part�culas. El sistema de part�culas puede ser una micropart�cula, una microc�psula, una microesfera, una nanoc�psula o una part�cula similar (v�ase, por ejemplo, Banja, supra). Se ha demostrado que un excipiente particulado basado en un

pol�mero sint�tico act�a como adyuvante para potencial la respuesta inmune, adem�s de proporcionar una liberaci�n controlada.

Composiciones basadas en pl�smidos: En una realizaci�n, las composiciones basadas en pl�smidos se formulan con l�pidos cati�nicos, en particular con l�pidos cati�nicos que contienen una sal de amonio cuaternario con la f�rmula siguiente:

10 donde R1 es un radical alif�tico lineal saturado o insaturado de 12 a 18 �tomos de carbono; R2 es otro radical alif�tico que comprende de 2 a 3 �tomos de carbono, y X es un grupo hidroxilo o amino.

En una realizaci�n, DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(terradeciloxi)-1-propanamonio; Solicitud de PCT publicada n� WO 96/34109) es el l�pido cati�nico. En otra realizaci�n, el l�pido cati�nico se encuentra en

15 asociaci�n con un l�pido neutro, por ejemplo DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanolamina; Behr J. P., Bioconjugate Chemistry 5:382-389, 1994), con el objeto de formar el DMRIE-DOPE. En otra realizaci�n m�s, la mezcla se realiza de forma extempor�nea, aproximadamente entre 10 y 60 minutos antes de la administraci�n. En otra realizaci�n, la mezcla se realiza de forma extempor�nea, aproximadamente 30 minutos antes de la administraci�n. En una realizaci�n, el ratio molar DMRIE/DOPE es aproximadamente de 95/5 a 5/95. En otra realizaci�n, el ratio molar

20 DMRIE/DOPE es aproximadamente de 1/1. En una realizaci�n, el ratio en peso de pl�smido/DMRIE o DMRIE-DOPE adyuvante es aproximadamente de 50/1 a 1/10. En otra realizaci�n, el ratio en peso de pl�smido/DMRIE o DMRIE-DOPE adyuvante es aproximadamente de 10/1 a 1/5. En otra realizaci�n m�s, el ratio en peso de pl�smido/DMRIE o DMRIE-DOPE adyuvante es aproximadamente de 1/1 a 1/2.

25 En una realizaci�n, se a�ade una citoquina o grupos CpG no metilados a la composici�n, tal y como se ha descrito anteriormente para las composiciones basadas en polip�ptidos. La adici�n se puede hacer ventajosa mediante un pl�smido que codifica la citoquina.

Composici�n basada en el vector viral:

30 La composici�n basada en el vector viral recombinante se puede suplementar con fMLP (N-formil-metionil-leucilfenilalanina; Patente estadounidense n� 6.017.537) y/o pol�mero de �cido acr�lico o �cido metacr�lico adyuvante, tal y como se ha descrito anteriormente para las composiciones basadas en polip�ptidos. Tambi�n se pueden formular con emulsiones como se ha descrito anteriormente.

35 En una realizaci�n, se a�aden citoquinas, grupos CpG no metilados o emulsiones a la composici�n, tal y como se ha descrito anteriormente para las composiciones basadas en polip�ptidos. La adici�n se puede hacer ventajosa mediante un vector viral que codifica dicha citoquina.

40 Las composiciones inmunog�nicas y vacunas de conformidad con la divulgaci�n se conservan y almacenan en forma formulada a 5�C o en forma liofilizada. En una realizaci�n, las composiciones inmunog�nicas y vacunas de conformidad con la divulgaci�n se conservan y almacenan en forma formulada a 5�C o en forma liofilizada con un estabilizador. El secado por congelaci�n se puede realizar conforme a procedimientos est�ndar bien conocidos. Los estabilizantes farmac�uticamente aceptables pueden ser SPGA (sacarosa, fosfato, glutamato y alb�mina) (Bovarnik

45 et al., J. Bacteriology, 1950, 59: 509), carbohidratos (por ejemplo sorbitol, manitol, lactosa, sacarosa, glucosa, dextrano, trehalosa), glutamato s�dico (Tsvetkov T et al., Cryobiology 20(3): 318-23, 1983; Israeli E et al., Cryobiology 30(5): 519-23, 1993), prote�nas como peptona, alb�mina o case�na, agentes que contienen prote�nas tales como leche desnatada (Mills CK et al., Cryobiology 25(2): 148-52, 1988 ; Wolff E et al., Cryobiology 27(5): 56975, 1990), y tampones (por ejemplo, tamp�n fosfato, tamp�n fosfato de un metal alcalino). Para hacer solubles las

50 preparaciones desecadas por congelaci�n se puede usar un adyuvante.

M�todos de inmunizaci�n

La presente divulgaci�n proporciona m�todos para inducir una respuesta inmune a un polip�ptido de fleb�tomo

55 Lutzomyia en un sujeto. La presente divulgaci�n proporciona asimismo m�todos para inhibir o prevenir la leishmaniasis en un sujeto.

Estos m�todos incluyen la administraci�n de al menos una composici�n inmunog�nica o vacuna, de conformidad con la divulgaci�n.

Seg�n la divulgaci�n, una composici�n inmunol�gica o una vacuna se puede preparar mediante t�cnicas est�ndar bien conocidas por los expertos en el campo farmac�utico o veterinario. Estas composiciones se pueden administrar en dosis y mediante t�cnicas bien conocidas por los expertos en el campo m�dico o veterinario, teniendo en cuenta factores como la edad, el sexo, el peso, la especie y la condici�n del sujeto en particular, as� como la v�a de

5 administraci�n.

Si se precisa m�s de una administraci�n, se pueden administrar concurrentemente (por ejemplo, diferentes composiciones administradas durante el mismo periodo de tiempo a trav�s de la misma o de diferentes v�as, o una misma composici�n administrada en el mismo periodo de tiempo a trav�s de diferentes v�as) o secuencialmente (por ejemplo, la misma o diferentes composiciones administradas al menos dos veces a trav�s de la misma o de diferentes v�as). En una realizaci�n, el intervalo entre dos administraciones secuenciales es de aproximadamente 1 semana a 6 meses. En otra realizaci�n, el intervalo es de aproximadamente 3 semanas a 6 semanas. En otra realizaci�n m�s, el intervalo es a partir de unas 4 semanas. Tras la vacunaci�n, se puede administrar una dosis de refuerzo anual. Preferiblemente, en un programa de vacunaci�n de sensibilizaci�n y refuerzo, se puede realizar al

15 menos una administraci�n de sensibilizaci�n con una composici�n que contiene un pl�smido de conformidad con la divulgaci�n, seguida de al menos la administraci�n de un refuerzo con una composici�n que contiene un vector recombinante de conformidad con la divulgaci�n, con la condici�n de que un mismo polip�ptido salival de Lu. longipalpis est� presente dos veces, codificado por el pl�smido y por el vector viral. Alternativamente, la administraci�n de refuerzo se puede realizar con una composici�n que contiene un polip�ptido de conformidad con la divulgaci�n, con la condici�n de que un mismo polip�ptido salival de Lu. longipalpis est� presente dos veces, codificado por el pl�smido de la administraci�n de sensibilizaci�n y en la composici�n del refuerzo basado en el polip�ptido.

En estas composiciones, el ant�geno o ant�genos pueden encontrarse combinados con un veh�culo o excipiente

25 adecuado, como agua est�ril, soluci�n salina fisiol�gica, glucosa o similares. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes del pH, aditivos gelificantes o que potencian la viscosidad, conservantes, agentes aromatizantes, colorantes, y similares, dependiendo de la v�a de administraci�n y de la preparaci�n deseada. Para preparar las preparaciones adecuadas, sin experimentaci�n excesiva, se pueden consultar textos est�ndares tales como “Remington's Pharmaceutical Science, 17� edici�n, 1985. Las composiciones tambi�n pueden estar liofilizadas.

Las dosis apropiadas tambi�n se pueden basar en los ejemplos siguientes. Para las composiciones basadas en polip�ptidos, la v�a de administraci�n puede ser ID, IM, SC, intravenosa, oral, nasal o anal. Esta administraci�n se puede realizar con una jeringuilla y una aguja o con un aparato sin aguja, como, por ejemplo Biojector™ (Bioject,

35 Oregon, USA). En diversas realizaciones, las dosis de polip�ptidos puede ser de entre 1 y 250 μg/ml, de entre 15 y 150 μg/dosis, de entre 20 y 100 μg/dosis, aproximadamente. En otra realizaci�n, utilizando un aparato sin aguja el volumen de una dosis puede ser de entre 0,1 ml y 0,5 ml, aproximadamente. En otra realizaci�n m�s, utilizando un aparato sin aguja el volumen de una dosis puede ser de 0,25 ml aproximadamente. Es preferible la administraci�n con m�ltiples puntos de inyecci�n. En una realizaci�n, para la inyecci�n convencional con una jeringuilla y una aguja, los vol�menes son de entre 0,1 y 2 ml, aproximadamente. En otra realizaci�n, para la inyecci�n convencional con una jeringuilla y una aguja, los vol�menes son de entre 0,5 y 1 ml, aproximadamente.

Para las composiciones basadas en pl�smidos, la v�a de administraci�n puede ser ID, IM, SC, intravenosa, oral, nasal o anal. Esta administraci�n se puede hacer con una jeringuilla y una aguja o con un aparato sin aguja, como,

45 por ejemplo, Biojector™. La dosis es de unos 50 μg a 500 μg por pl�smido. Cuando se a�ade DMRIE-DOPE, es preferible unos 100 μg por pl�smido. En una realizaci�n, cuando se utiliza GM-CSF canino u otra citoquina, el pl�smido que codifica esta prote�na se encuentra presente a una dosis de entre 200 μg y 500 μg aproximadamente. En otra realizaci�n, el pl�smido que codifica esta prote�na se encuentra presente a una dosis de 200 μg aproximadamente. En una realizaci�n, utilizando un aparato sin aguja, el volumen de una dosis puede estar entre 0,1 ml y 0,5 ml aproximadamente. En otra realizaci�n, el volumen de una dosis puede ser de 0,25 ml aproximadamente. En otra realizaci�n m�s, la administraci�n se realiza utilizando m�ltiples puntos de inyecci�n. En una realizaci�n, para la inyecci�n convencional con una jeringuilla y una aguja, los vol�menes son de entre 0,1 y 2 ml, aproximadamente. En otra realizaci�n, los vol�menes son de entre 0,5 ml y 1 ml aproximadamente. Las dosis son las mismas que las mencionadas anteriormente.

55 Para las composiciones basadas en un vector viral recombinante, la v�a de administraci�n puede ser ID, EM, SC, intravenosa, oral, nasal o anal. Esta administraci�n se puede hacer con una jeringuilla y una aguja o con un aparato sin aguja, como, por ejemplo, Biojector™. La dosis es de unos 103 pfu a unos 109 pfu por vector de poxvirus recombinante. En una realizaci�n, cuando el vector es un virus de la viruela del canario, la dosis es de entre 108 pfu y 109 pfu aproximadamente. En otra realizaci�n, la dosis es de entre 106 pfu y 108 pfu aproximadamente. En una realizaci�n, el volumen de las dosis administradas con aparato sin aguja podr�an ser de entre 0,1 ml y 0,5 ml aproximadamente. En otra realizaci�n, el volumen de la dosis administrada con aparato sin aguja es de 0,25 ml. En otra realizaci�n m�s, la administraci�n se realiza utilizando m�ltiples puntos de inyecci�n. En una realizaci�n, para la inyecci�n convencional con una jeringuilla y una aguja, los vol�menes son de entre 0,1 y 2 ml, aproximadamente. En

65 otra realizaci�n, los vol�menes son de entre 0,5 ml y 1 ml aproximadamente. Las dosis son las mismas que las mencionadas anteriormente. En una realizaci�n, cuando se utiliza una jeringuilla y una aguja, la inyecci�n es IM.

Preferiblemente, en un programa de vacunaci�n de sensibilizaci�n y refuerzo, la administraci�n de sensibilizaci�n se realiza con una composici�n que contiene un pl�smido y la administraci�n de refuerzo con una composici�n que contiene un vector recombinante. En una realizaci�n, la administraci�n de refuerzo se realiza con un vector del virus de la viruela del canario. Tanto la administraci�n de sensibilizaci�n como la de refuerzo incluye vectores que

5 codifican al menos un ant�geno salival de Lu. longipalpis id�ntico, y opcionalmente ant�genos A2 de Leishmania. La dosis de pl�smidos y vectores virales recombinantes son las mismas que se han indicado anteriormente. Opcionalmente, la administraci�n de refuerzo se puede realizar con una composici�n basada en un polip�ptido. En este caso, la dosis del polip�ptido es de 1 a 250 μg/ml, de 15 a 150 μg/dosis, o de 20 a 100 μg/dosis, aproximadamente.

La inmunizaci�n por construcciones de �cido nucleico es bien conocida en el campo y se muestra, por ejemplo, en la Patente estadounidense n� 5.643.578 (que describe m�todos para inmunizar vertebrados introduciendo ADN que codifica un ant�geno deseado para provocar una respuesta mediada por c�lulas o humoral), y la Patente estadounidense n� 5.593.972 y la Patente estadounidense n� 5.817.637 (que describe la uni�n funcional de una

15 secuencia de �cido nucleico que codifica un ant�geno a secuencias reguladoras que posibilitan la expresi�n). La Patente estadounidense n� 5.880.103 describe varios m�todos de suministro de �cidos nucleicos que codifican p�ptidos inmunog�nicos u otros ant�genos a un organismo. Los m�todos incluyen suministro por liposomas de los �cidos nucleicos (o de los propios p�ptidos sint�ticos), y construcciones inmunoestimuladoras, o ISCOMS™, estructuras tipo jaula cargadas negativamente de 30-40 nm de tama�o formadas espont�neamente al mezclar colesterol y Quil A™ (saponina). Se ha generado inmunidad protectora en una diversidad de modelos experimentales de infecci�n, incluyendo tumores inducidos por toxoplasmosis y virus de Epstein-Barr, usando ISCOMS™ como veh�culo de suministro para ant�genos (Mowat y Donachie, Immunol Today 12:383,1991). Se ha descubierto que dosis de ant�geno tan bajas como 1 g encapsulado en ISCOMS™ producen respuestas de CTL mediadas por clase I (Takahashi et al., Nature 344:873, 1990).

25 En otro enfoque para usar �cidos nucleicos para inmunizaci�n, tambi�n puede expresarse un polip�ptido de Lu.longipalpis o un fragmento inmunog�nico del mismo por hu�spedes o vectores virales atenuados o vectores bacterianos. Pueden usarse vectores de virus vaccinia recombinante, virus adenoasociados (AAV), herpesvirus, retrovirus, u otros vectores virales para expresar el p�ptido o prote�na, provocando de este modo una respuesta de CTL. Por ejemplo, se describen vectores de vaccinia y m�todos �tiles en protocolos de inmunizaci�n en la Patente estadounidense n� 4.722.848. El BCG (bacilo de Calmette Gu�rin) proporciona otro vector para la expresi�n de p�ptidos (v�ase Stover, Nature 351:456-460, 1991).

En una realizaci�n, un �cido nucleico que codifica un polip�ptido de Lu. longipalpis, o un fragmento inmunog�nico

35 del mismo, se introduce directamente en las c�lulas. Por ejemplo, el �cido nucleico puede cargarse en microesferas de oro por m�todos est�ndar e introducirse en la piel por un dispositivo como Bio-Rad's Helios™ Gene Gun. Tambi�n se puede utilizar un inyector sin aguja, como Bioinjector2000™. Los �cidos nucleicos pueden estar "desnudos", compuestos por pl�smidos bajo el control de un promotor fuerte. T�picamente, el ADN se inyecta en m�sculo, aunque tambi�n puede inyectarse directamente en otros sitios. Los modelos de dosis para la inyecci�n se encuentran en torno a 0.5 μg/kg a50 mg/kg, y t�picamente son de 0,005 mg/kg a 5 mg/kg aproximadamente (v�ase, por ejemplo, la Patente estadounidense n� 5.589.466). En una realizaci�n, se utiliz� una estrategia de sensibilizaci�n y refuerzo para la inmunizaci�n. De este modo, en una realizaci�n, se administra un �cido nucleico que codifica un polip�ptido de Lu. longipalpis al sujeto, seguido de la inmunizaci�n con la forma atenuada o inactivada de la Leishmania.

45 Las composiciones inmunog�nicas y las vacunas divulgadas en el presente pueden ser administradas para tratamientos preventivos y terap�uticos. En aplicaciones terap�uticas, las composiciones se administran a un sujeto que sufre una enfermedad, como la Leishmaniasis, en una cantidad terap�uticamente efectiva, que es una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad o un signo o s�ntoma de la enfermedad. Las cantidades efectivas para este uso depender�n de la gravedad de la enfermedad y del estado general de salud del sujeto. Una cantidad efectiva del compuesto es la que proporciona un alivio subjetivo de los s�ntomas o una mejora objetivamente identificable observada por el m�dico u otro observador cualificado.

Las dosis �nicas o m�ltiples del compuesto se administran dependiendo de la dosis y la frecuencia necesaria y

55 tolerada por el sujeto. En una realizaci�n, la dosis se administra una �nica vez en forma de bolo, pero en otra realizaci�n se puede aplicar peri�dicamente hasta conseguir un resultado terap�utico. Por lo general, la dosis es suficiente para tratar o mejorar los s�ntomas o signos de la enfermedad sin producir una toxicidad inaceptable en el sujeto.

Como se ha se�alado, la dosis de la composici�n variar� en funci�n del peso, la edad, el sexo y el m�todo de administraci�n. La dosis tambi�n podr� ser ajustada por el m�dico individual en funci�n de las circunstancias particulares. Las composiciones se pueden administrar convencionalmente como vacunas que contienen el compuesto activo como una cantidad predeterminada de material activo calculado para producir una efecto terap�utico o inmunol�gico deseado conjuntamente con el diluyente o veh�culo necesario y farmac�uticamente

65 aceptable (por ejemplo, veh�culo o portador). Por ejemplo, una vacuna con una construcci�n de ADN de unos 50 μg de la presente divulgaci�n se puede inyectar por v�a intrad�rmica tres veces a intervalos de dos semanas para producir el efecto terap�utico o inmunol�gico deseado. En otra realizaci�n, una dosis aproximada de 1 mg/kg de una vacuna de prote�na de la presente divulgaci�n se puede inyectar por v�a intrad�rmica tres veces a intervalos de dos semanas para producir el efecto terap�utico o inmunol�gico deseado.

5 En el presente se proporciona una vacuna que incluye un polip�ptido o polinucle�tido de Lu. longipalpis. La administraci�n de la vacuna a un sujeto, como un sujeto humano o veterinario, produce una resistencia a la infecci�n por Leishmania. En una realizaci�n, el sujeto es un sujeto humano. En otra realizaci�n, el sujeto es un c�nido, como un perro.

M�todos y kits para el diagn�stico de la infecci�n por Leishmania

En el presente se divulga que los individuos que presentan una conversi�n de la respuesta de DTH anti-Leishmania tambi�n experimentan un aumento de los anticuerpos contra las prote�nas salivales del polip�ptido de Lu. longipalpis. Por tanto, la presencia o ausencia de anticuerpos contra las prote�nas salivales del polip�ptido de Lu.

15 longipalpis se puede utilizar para determinar si un sujeto presenta una infecci�n por Leishmania.

En el presente se divulga un m�todo para diagnosticar la infecci�n por Leishmania, detectando la presencia de anticuerpos que se unen espec�ficamente a uno o m�s polip�ptidos que tienen una secuencia de amino�cidos como la presentada como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 13, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N� 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N�: 67, o un polip�ptido al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 99% hom�logo a uno de estos polip�ptidos, una variante conservadora, un hom�logo o un fragmento inmunog�nico de

25 uno de estos polip�ptidos. El m�todo puede emplear un �nico polip�ptido de Lu. longipalpis o una combinaci�n de estos polip�ptidos. En determinados ejemplos, el m�todo de diagn�stico detecta anticuerpos que se unen espec�ficamente al menos a 3, 6 o 10 de estos polip�ptidos, o fragmentos inmunog�nicos de los mismos.

En una realizaci�n, se pueden unir uno o m�s polip�ptidos de Lu. longipalpis a un sustrato s�lido. Por ejemplo, el polip�ptido de Lu. longipalpis que tiene una secuencia de amino�cidos como la que se presenta como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 13, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N�: 67 se 35 puede unir al sustrato. Uno o m�s de estos polip�ptidos se pueden unir al sustrato, por ejemplo al menos 3, 6 o 10 de estos polip�ptidos, o un fragmento inmunog�nico de los mismos. En un ejemplo, uno o m�s polip�ptidos que tienen una secuencia presentada como una de las SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 11, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 55 o SEC. ID. N�: 59 se pueden unir al sustrato. En otro ejemplo, uno o m�s polip�ptidos de Lu. longipalpis que tienen una secuencia presentada como una de las SEC. ID. N�: 1, SEC. ID. N�: 23 o SEC. ID. N�: 39 se pueden unir al sustrato. En un ejemplo concreto, de car�cter no limitador, al menos seis polip�ptidos de Lu. longipalpis se unen a un sustrato s�lido, donde cada uno de los polip�ptidos comprende una secuencia de amino�cidos como la presentada como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 11, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 55 o SEC. ID. N�: 59, o un fragmento inmunog�nico de la misma. En otro ejemplo concreto, de car�cter no limitador, al menos tres polip�ptidos de Lu. longipalpis se unen a un sustrato s�lido, donde cada uno de los

45 polip�ptidos comprende una secuencia de amino�cidos como la presentada como SEC. ID. N�: 1, SEC. ID. N�: 23 o SEC. ID. N�: 39, o un fragmento inmunog�nico de la misma.

En una realizaci�n, dos o m�s polip�ptidos (por ejemplo, al menos 3, 6 o 10) de Lu. longipalpis (o fragmentos inmunog�nicos de los mismos) se aplican a un sustrato s�lido, por ejemplo como una serie de "puntos", como en un ensayo 'dot blot'. En otra realizaci�n, se aplican dos o m�s polip�ptidos de Lu. longipalpis a un sustrato como en una disposici�n lineal.

En otra realizaci�n, se aplican polip�ptidos de Lu. longipalpis a una membrana en una disposici�n bidimensional. De esta manera, se valora la presencia de anticuerpos para m�s de un polip�ptido de Lu. longipalpis. Cada polip�ptido

55 de Lu. longipalpis se puede aplicar directamente a la superficie de una membrana en un �nico lugar o en una combinaci�n de lugares.

El sustrato s�lido puede ser una perla de poliestireno, una membrana, una part�cula o una placa. Se puede utilizar un sustrato de pl�stico o de vidrio. En otras realizaciones, se utiliza una membrana que se compone de materiales porosos, tales como nylon, nitrocelulosa, acetato de celulosa, fibras de vidrio y otros pol�meros porosos. La superficie de un portador s�lido se puede activar mediante procesos qu�micos que causan un enlace covalente del polip�ptido al portador. Sin embargo, se puede utilizar otro m�todo adecuado para inmovilizar un polip�ptido en un portador s�lido, incluyendo, a t�tulo meramente enunciativo, interacciones i�nicas, interacciones hidr�fobas, interacciones covalentes y similares. Una vez que se ha aplicado el polip�ptido al sustrato, el sustrato se puede 65 poner en contacto con una sustancia, como una soluci�n que contiene prote�na, que satura de forma no espec�fica

los sitios de uni�n de la misma. Algunos ejemplos concretos, de car�cter no limitador, de una soluci�n que contiene prote�na incluyen una soluci�n fabricada con leche en polvo o alb�mina de suero, como alb�mina de suero bovino.

A continuaci�n se a�ade una muestra (por ejemplo, suero, sangre, plasma, orina, semen, saliva, esputo, fluido lacrimal, fluido linf�tico) al sustrato, y la muestra combinada y el sustrato se incuban durante un tiempo suficiente como para permitir la uni�n espec�fica. La uni�n espec�fica de anticuerpos a los polip�ptidos de Lu. longipalpis se divulga en el presente y, a continuaci�n, se detecta utilizando cualquier medio conocido para un experto en el campo. En una realizaci�n, se utiliza un anticuerpo secundario etiquetado para detectar los anticuerpos que se unen espec�ficamente a los polip�ptidos de Lu. longipalpis. La etiqueta puede ser un radiomarcador (por ejemplo, I25I), una etiqueta enzim�tica (por ejemplo, fosfatasa alcalina o peroxidasa de r�bano), o una etiqueta fluorescente (por ejemplo, isotiocianato de fluorosce�na). Los sistemas de detecci�n de estas etiquetas son conocidos por los expertos en el campo. La uni�n de la muestra o de un componente de la muestra al polip�ptido de Lu. longipalpis, se�alada por la presencia del marcador, indica una infecci�n por Leishmania.

En otra realizaci�n, la muestra se absorbe en un sustrato s�lido que contiene sitios de uni�n para polip�ptidos, como mol�culas de anticuerpo. En una realizaci�n, el sustrato s�lido es una perla, una part�cula, una membrana o una placa de poliestireno. A continuaci�n, se pone en contacto el sustrato con la sustancia, como una soluci�n que contiene prote�na que satura de forma no espec�fica sus sitios de uni�n. Despu�s se lava el sustrato con una soluci�n tamp�n. A continuaci�n, se a�ade una soluci�n de uno o m�s polip�ptidos de Lu. longipalpis a las muestras unidas. En una realizaci�n, el polip�ptido de Lu. longipalpis es directamente etiquetado. El etiquetado del polip�ptido de Lu. longipalpis se puede activar mediante el uso de cualquier marcador, como mediante la incorporaci�n de un grupo o is�topo radiactivo, o uniendo este componente con una enzima o un tinte, por ejemplo una fracci�n cromof�rica o un grupo fluorescente. Las enzimas que se pueden utilizar son aquellas que se pueden detectar colorim�tricamente, espectrofotom�tricamente o fluorim�tricamente. Algunos ejemplos, a t�tulo meramente enunciativo, de enzimas que se pueden utilizar en la presente invenci�n son las enzimas del grupo de las oxidoreductasas, como catalasa, peroxidasa, glucosa oxidasa, beta-glucuronidasa, beta-D-glucosidasa, beta-Dgalactosidasa, ureasa y galactosa oxidasa. Una vez que el polip�ptido de Lu. longipalpis etiquetado ha sido incubado con el sustrato s�lido, se retiran todos los polip�ptidos de Lu. longipalpis etiquetados no unidos mediante lavado. A continuaci�n, se detecta el polip�ptido de Lu. longipalpis etiquetado unido a trav�s de un ensayo apropiado. La uni�n del polip�ptido de Lu. longipalpis etiquetado a la muestra, o a un componente de la muestra, es indicativo de una infecci�n por Leishmania.

Por lo general, los pasos de incubaci�n utilizados en la realizaci�n de los procedimientos se pueden llevar a cabo de una manera conocida, como la incubaci�n a temperaturas de entre unos 4�C y 25�C, durante unos 30 minutos a 48 horas aproximadamente. Los lavados se pueden incluir con una soluci�n acuosa como una soluci�n tamp�n, en la que la soluci�n tamp�n tiene un pH de entre 6 y 8 aproximadamente, por ejemplo utilizando una soluci�n salina isot�nica con un pH 7 aproximadamente.

Los ensayos de uni�n competitiva tambi�n resultan �tiles para detectar la infecci�n por Leishmania. Un experto en el campo al que se le proporcionen los polip�ptidos de Lu. longipalpis divulgados en el presente ser� capaz r�pidamente de dise�ar ensayos adicionales, tales como ensayos de uni�n competitiva, que resulten �tiles para detectar la infecci�n por Leishmania.

En otra realizaci�n, los polip�ptidos de Lu. longipalpis divulgados en el presente se pueden incluir en un kit de ensayo de diagn�stico. Por ejemplo, un kit de ensayo de diagn�stico para detectar una infecci�n por Leishmania incluye un sustrato s�lido sobre el que se ha aplicado uno o m�s polip�ptidos de Lu. longipalpis divulgados en el presente. En otras realizaciones, el kit incluye instrucciones escritas y/o un recipiente que contiene una cantidad especificada de anticuerpos etiquetados contra las inmunoglobulinas, tales como IgG o IgM, o anticuerpos secundarios etiquetados que se unen a anticuerpos de una especie de inter�s. Por ejemplo, se pueden proporcionar anticuerpos etiquetados que detectan espec�ficamente las inmunoglobulinas caninas o humanas. Los anticuerpos etiquetados se pueden etiquetar por fluorescencia, enzim�ticamente o con radiomarcadores. Los anticuerpos etiquetados utilizados en los kits de ensayo anteriormente descritos pueden estar envasados en forma de soluci�n o en formas liofilizadas apropiadas para la reconstituci�n.

En otra realizaci�n, el kit de ensayo incluye una cantidad especificada de uno o m�s polip�ptidos de Lu. longipalpis descritos en el presente introducidos en un recipiente e instrucciones por escrito. En un ejemplo, el polip�ptido de Lu. longipalpis es directamente etiquetado. En otro ejemplo, el polip�ptido o los polip�ptidos de Lu. longipalpis no est�n etiquetados. Si el polip�ptido de Lu. longipalpis no est� etiquetado, tambi�n puede incluir un recipiente con un reactivo de detecci�n que se une espec�ficamente al polip�ptido de Lu. longipalpis, como un anticuerpo monoclonal etiquetado. El kit tambi�n puede incluir opcionalmente un sustrato s�lido para la uni�n de la muestra.

El proceso anteriormente descrito y el kit de ensayo para la detecci�n de anticuerpos contra polip�ptidos de Lu. longipalpis divulgados en el presente se pueden utilizar en m�ltiples aplicaciones, incluyendo, a t�tulo meramente enunciativo, la detecci�n de la infecci�n por Leishmania en un sujeto, utilizando los m�todos divulgados en el presente. Los ensayos y kits divulgados en el presente se pueden utilizar para detectar la eficacia de un tratamiento terap�utico en un sujeto. En otra realizaci�n m�s, los ensayos y kits divulgados en el presente se pueden utilizar

tambi�n para valorar una infecci�n primaria por Leishmania o para predecir la recuperaci�n de la infecci�n por Leishmania tomando una muestra de fluido corporal de un sujeto infectado, por ejemplo, en distintos momentos tras la infecci�n, y aplicando los procedimientos de detecci�n anteriormente descritos.

La divulgaci�n se ilustra a trav�s de los siguientes Ejemplos, que no tendr�n un car�cter limitador.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Construcci�n de la librer�a

La mosca de la arena y la preparaci�n del homogenato de gl�ndulas salivales (SGH). Las gl�ndulas salivales del fleb�tomo Lutzomyia longipalpis se obtuvieron de moscas de la arena colonizadas en Walter Reed Army Institute y en los Institutos Nacionales de Salud estadounidenses.

Las gl�ndulas salivales diseccionadas bajo un microscopio de disecci�n y recogidas en tubos micr�fugos en soluci�n tamp�n de fosfato (PBS) est�ril, pH 7.0, son almacenadas en hielo seco y transferidas a -70�C hasta su uso.

La gl�ndula salival de Lu. longipalpis es una estructura como una bolsa que se compone de una capa de epitelio unicelular que rodea un gran lumen (Adler y Theodor, Ann. Trop. Med. Parasitol 20: 109, 1926). Tras haberse alimentado de sangre, el contenido de prote�na total de la gl�ndula se reduce a la mitad o menos con respecto a su valor de ~1μg (Ribeiro et al., Insect Biochem. 19:409-412, 1989). Por consiguiente, la mayor parte de la prote�na del SGH del fleb�tomo se debe destinar a la secreci�n. De hecho, la SDS-PAGE del SGH revela una composici�n de baja complejidad consistente en ~12 bandas principales que var�an de 10-100 kD (Valenzuela et al., J. Exp. Med. 194:331-42, 2001). Para la SDS-PAGE, se utilizaron geles de Tris-glicina (16%), 1 mm de grosor, y geles BIS-tris NUPAGE (12%) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los geles se migraron a una soluci�n tamp�n de migraci�n de Trisglicina o MPS Nupage, conforme a las instrucciones del fabricante. Para calcular el peso molecular de las muestras, se utilizaron marcadores See BlueJ de Invitrogen (miosina, BSA, deshidrogenasa glut�mica, alcohol deshidrogenasa, anhidrasa carb�nica, mioglobina, lisozima, aprotinina e insulina, cadena beta).

Los SGH fueron tratados con partes iguales de 2X tamp�n de SDS (8% SDS en tamp�n de Tris-HCl, 0.5M, pH 6.8, 10% glicerol y 1% azul de bromofenol (tinte). Se aplicaron treinta pares de gl�ndulas salivales homogeneizadas por l�nea (aproximadamente 30μg de prote�na) para visualizar las bandas de prote�na te�idas con azul de Coomassie. Para la secuenciaci�n amino-terminal de las prote�nas salivales, 40 pares homogeneizados de gl�ndulas se sometieron a electroforesis y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinildeno (PVDF) utilizando 10 mM CAPS, pH 11, 10% metanol como tamp�n de transferencia en un Blot-Module para XCell II Mini-Cell (Invitrogen, Carlsbad, CA). La membrana se ti�� con azul de Coomassie en ausencia de �cido ac�tico. Las bandas te�idas se cortaron de la membrana de PVDF y se sometieron a degradaci�n de Edman utilizando una secuenciador Procise (Perkin-Elmer Corp., Foster City, CA).

Construcci�n de la biblioteca de ADNc de gl�ndulas salivales Se aisl� el ARNm de 80 pares de gl�ndulas salivales de hembras adultas de Lu. longipalpis. Se utiliz� el kit de aislamiento de ARNm Micro-FastTrack (Invitrogen, Carlsbad, CA), que produjo aproximadamente 100 ng de poly (A)+ ARNm. La librer�a de ADNc basada en PCR se realiz� siguiendo las instrucciones del kit de construcci�n de una biblioteca de ADNc SMART (Clontech, Palo Alto, CA). Se sometieron 100 nanogramas de ARNm de gl�ndula salival de Lu. longipalpis a transcripci�n inversa para obtener ADNc utilizando Superscript II RNase H-reverse transcriptase (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) y el cebador CDS/3 ' (Clontech, Palo Alto, CA) durante 1 hora a 42� C. La s�ntesis de la segunda cadena se realiz� utilizando un protocolo basado en la PCR, utilizando el cebador SMART III (Clontech, Palo Alto, CA) como cebador de sentido y el cebador CDS/3' como cebador antisentido; estos dos cebadores adicionalmente se crean en los extremos de los sitios Sfil A y B del ADNc naciente. La s�ntesis de ADN de doble cadena se realiz� en un ciclador Perkin Elmer 9700 Thermal (Perkin Elmer Corp., Foster City, CA) y utilizando ADN polimerasa Advantage Klen-Taq (Clontech, Palo Alto, CA). Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: 94� C durante 2 minutos; 19 ciclos de 94�C durante 10 segundos y 68� C durante 6 minutos. El ADNc de doble cadena fue tratado inmediatamente con proteinasa K (0,8 μg/μl) durante 20 minutos a 45� C y se lav� tres veces con agua utilizado filtros Amicon con un corte de 100 kDa (Millipore Corp., Bedford MA). El ADNc de doble cadena se someti� a digesti�n con Sfi l durante 2 horas a 50� C (Los sitios Sfi I se insertaron en el ADNc durante la s�ntesis de la segunda cadena, utilizando el cebador SMART III y CDS/3'). A continuaci�n, el ADNc fue fraccionado utilizando columnas proporcionadas por el fabricante (Clontech, Palo Alto, CA). Las fracciones que conten�an ADNc de m�s de 400 pares de bases (bp) fueron agrupadas, concentradas y lavadas en tres ocasiones con agua, utilizando un filtro Amicon con un corte de 100 kDa. El ADNc se concentr� hasta un volumen de 7 μl. A continuaci�n, el ADNc concentrado se lig� a un vector Lambda Triplex2 (Clontech, Palo Alto, CA), y la reacci�n de la uni�n resultante se envas� utilizando el Gigapack gold III de Stratagene/Biocrest (Cedar Creek, TE) conforme a las especificaciones del fabricante. La librer�a obtenida se pas� a una placa infectando las c�lulas XLI-blue (Clontech, Palo Alto, CA) en fase de registro y la cantidad de recombinantes se determin� mediante PCR utilizando cebadores del vector que flanqueaban el ADNc insertado y se visualiz� en un gel de agarosa al 1,1% con bromuro de etidio (1,5 μg/ml).

Secuenciaci�n masiva de la librer�a de ADNc de gl�ndulas salivales de Lu. longipalpis La librer�a de ADNc de gl�ndulas salivales de Lu. longipalpis se coloc� en placas a aproximadamente 200 pocillos por placa (placa Petri de 150 mm). Los pocillos se recogieron aleatoriamente y se transfirieron a una placa de polipropileno de 96 pocillos que conten�a 100 μl de agua por pocillo. La placa se cubri� y se coloc� en un agitador giratorio durante una hora a temperatura ambiente. Se utilizaron cuatro microlitros de una muestra de fago como plantilla para una reacci�n PCR para la amplificaci�n aleatoria de los ADNc. Los cebadores utilizados para esta reacci�n fueron secuencias del vector Triplex2; los cebadores se denominaron PT2F1 (5'-AAGTACTCT AGCAAT TGTGAGC-3') (SEC ID N�: 71) que est� posicionado antes del ADNc de inter�s (extremo 5'), y PT2R1 (5'-CTCTTCGCTATTACGCCAGCT G-3') (SEC. ID. N�: 72) que est� posicionado despu�s del ADNc de inter�s (extremo 3'). Se utiliz� polimerasa Taq Platinum (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) para estas reacciones. Las condiciones de amplificaci�n fueron las siguientes: 1 fase de 75� C durante 3 minutos, 1 fase de 94� C durante 3 minutos y 34 ciclos de 94� C durante 30 segundos, 49� C durante 30 segundos y 72� C durante 1 minuto y 20 segundos. Los productos amplificados se visualizaron en gel de agarosa al 1,1% con bromuro de etidio. La PCR limpia se utiliz� como plantilla para una reacci�n de secuenciaci�n c�clica utilizando el kit marcador DTCS de Beckman Coulter Inc. (Fullerton, CA). El cebador utilizado para la secuenciaci�n (PT2F3) (5'-TCTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTT -3') (SEC. ID N�:73) se encuentra antes del ADNc insertado y despu�s del cebador PT2F1. La reacci�n de secuenciaci�n se realiz� en un termociclador Perkin Elmer 9700. Las condiciones fueron 75� C durante 2 minutos, 94� C durante 4 minutos, y 30 ciclos de 96� C durante 20 segundos, 50� C durante 20 segundos y 60� C durante 4 minutos.

Tras la secuenciaci�n c�clica de las muestras, se realiz� un paso de limpieza utilizando el sistema de limpieza para placas multi-screen de 96 pocillos de Millipore (Bedford, MA). La placa multi-screen de 96 pocillos se prepar� a�adiendo una cantidad fija (conforme a las especificaciones del fabricante) de Sephadex-50 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) y 300 μl de agua desionizada. Tras una hora de incubaci�n a temperatura ambiente, se retir� el agua de la placa multi-screen mediante centrifugaci�n a 750 g durante 5 minutos. Una vez que el Sephadex de la placa multi-screen se hubo secado parcialmente, se a�adi� la secuenciaci�n c�clica completa al centro de cada pocillo, se centrifug� a 750 g durante 5 minutos y la muestra limpia se recogi� en una placa de microtitulaci�n por secuenciaci�n (Beckman Coulter, Fullerton, CA). La placa se sec� a continuaci�n en el modelo Speed-Vac SC 110 con un soporte para placas de microtitulaci�n (Savant Instruments Inc, Holbrook, NY). Las muestras secas se resuspendieron de inmediato con 25 μl de formamida ultrapura desionizada (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ), y se a�adi� una gota de aceite mineral encima de cada muestra. Las muestras se secuenciaron de inmediato en un instrumento de secuenciaci�n de ADN CEQ 2000 (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA) o se almacenaron a -30� C. El ADNc completo de genes seleccionados fue plenamente secuenciado utilizando los cebadores habituales en un instrumento de secuenciaci�n de ADN CEQ 2000 (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA) como se ha descrito anteriormente.

Construcci�n de la vacuna de ADN y descripci�n del vector VRI 020. Los genes que codifican las prote�nas secretadas previstas se amplificaron a partir de ADNc espec�fico de Lu. longipalpis mediante PCR utilizando polimerasa Taq Platinum (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) y cebadores espec�ficos que portan el extremo N-terminal previsto (cebador directo); y el cod�n de parada (cebador inverso) del ADNc seleccionado.

El producto de la PCR se clon� de inmediato en el vector de clonaci�n VR-2001 -TOPO habitual (obtenido del vector VR1020) siguiendo las especificaciones de los fabricantes (Invitrogen, Carlsbad, CA). La mezcla de uni�n se utiliz� para transformar c�lulas TOP 10 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y las c�lulas se incubaron durante una noche a 37� C. Se recogieron ocho colonias y se mezclaron con 10 μl de agua est�ril. Se transfirieron cinco microlitros de cada muestra a caldo Luria (LB) con ampicilina (100 μg/ml) y se cultivaron a 37� C. Los otros 5 μl se utilizaron como plantilla para una reacci�n PCR utilizando dos cebadores de vector espec�fico para el vector PCRII, al objeto de confirmar la presencia del elemento insertado y el an�lisis de la secuenciaci�n. Tras la visualizaci�n del producto de la PCR en gel de agarosa al 1.1 %, los productos de la PCR se secuenciaron por completo, tal como se ha descrito anteriormente, utilizando un instrumento de secuenciaci�n de ADN CEQ2000 (Beckman Coulter). Las c�lulas que conten�an el pl�smido portador del gen de Lu. longipalpis seleccionado se cultivaron durante una noche a 37�C en caldo Luria con ampicilina (100 μg/ml), y se realiz� el aislamiento del pl�smido utilizando el kit Wizard Miniprep (Promega, Madison, Wl). El pl�smido VR-2001-TOPO (una variante del pl�smido VRl 020 de Vical) contiene un gen resistente a la kanamicina, el promotor del citomegalovirus humano, el promotor del citomegalovirus humano y el p�ptido se�al del activador plasmin�geno tisular, antes del sitio de clonaci�n TOPO TA. Se seleccion� la muestra que conten�a la secuencia del cod�n de inicio al cod�n de parada en la orientaci�n correcta y en el marco abierto de lectura correcto despu�s de que la secuencia del nucle�tido codificase el activador plasmin�geno titular.

Los pl�smidos se transformaron en la cadena de E. coli de TOP-10 (Invitrogen, Carlsbad, CA) conforme a las instrucciones del fabricante. Las bacterias transformadas se cultivaron en medio LB y el pl�smido fue posteriormente purificado utilizando el kit de purificaci�n de pl�smidos comercializado por Megaprep (Qiagen, Valencia, CA). Cada pl�smido se denomin� en funci�n del nombre del polip�ptido. De este modo, pLJL34 es un pl�smido que codifica LJL34, y pLJMl 1 es un pl�smido que codifica el polip�ptido LJMl 1, etc.

Poblaci�n del estudio.

Los sueros utilizados en el estudio realizado con seres humanos se obtuvieron de un ensayo epidemiol�gico de la leishmaniasis visceral (VL) en ni�os menores de 7 a�os en una regi�n end�mica de Sao Luiz,, Estado de Maranhao, al noreste de Brasil. Durante este estudio prospectivo, se analizaron la serolog�a y DTH anti-Leishmania dos veces al a�o durante 1997 y 1998. Solamente los ni�os que no padec�an VL, ni una serolog�a o DTH positiva en el primer

5 estudio fueron incluidos en el ensayo. Ninguno de los individuos del conjunto de datos padec�a la enfermedad y todos ten�an respuestas negativas al ant�geno de la Leishmania durante el semestre precedente. La positividad en los ensayos anti-Leishmania documentados aqu� demuestra una reciente conversi�n determinada por un ELISA sensible y espec�fico (Barral et al., Am J Trop MedHyg 62:740-5, 200) y/o DTH (Barral et al., ibid). Para determinar el valor de corte para la IgG anti-Lu. longipalpis en los ensayos ELISA, se obtuvieron sueros de ni�os del mismo rango de edades procedentes de una regi�n no end�mica. Considerando que la reciente seroconversi�n representa infecci�n y que una respuesta DTH positiva es un marcador de protecci�n frente a la leishmaniasis en los casos subcl�nicos, clasificados a los ni�os en dos grupos en funci�n de sus respuestas anti-Leishmania: Grupo I, serolog�a positiva (S-→ S+) (n =15) y Grupo II, DTH positiva (DTET→ DTH+) (n = 15).

15 Serolog�a contra saliva de mosca de la arena

Se realiz� un ELISA para determinar la serolog�a contra saliva de la mosca de la arena como se ha descrito anteriormente (Barral et al., ibid). Las subclases de IgG s�rica se determinaron utilizando conjugados de alcalinafosfatasa contra IgGl, IgG3, o IgG4 humana (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Para determinar los niveles de IgE, los sueros se absorbieron previamente utilizando el Factor Reumatoide. En el ELISA se emple� anti-IgE humana (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

Western blots

25 Se realizaron ensayos Western blot de los ant�genos de las gl�ndulas salivales como se ha descrito anteriormente (Barral et al., ibid).

An�lisis estad�stico. Estudios con seres humanos

Se utiliz� el test no param�trico de Wilcoxon para comparar los niveles de anticuerpos contra saliva de Lu. longipalpis en los mismos ni�os en el momento 0 (al comienzo del estudio) y despu�s de 6 meses. El valor P < 0,05 se estableci� como nivel de significaci�n. Se utiliz� el software Graph Pad Prism (San Diego, CA) para realizar an�lisis estad�sticos.

35 Ejemplo 2

An�lisis de la secuencia de prote�nas previstas y ADN

Los datos del ADN obtenidos del proyecto de secuenciaci�n masiva fueron analizados con un programa interno escrito en VisualBASIC (Microsoft). Este programa retir� las secuencias del vector y el cebador de la secuencia original. Las secuencias retiradas fueron comparadas con la base de datos de prote�nas no redundantes NCBI utilizando el programa BlastX con la matriz BLOSUM-62 (Altschul et al., Nucleic Acids Research 25:3389, 1997). Las secuencias de ADN se agruparon realizando comparaciones dentro de la misma base de datos con un umbral preseleccionado, normalmente1e-10 (programa BlasfN) (Altschul et al., Nucleic Acids Research 25:3389, 1997). Las 45 secuencias del mismo grupo se alinearon utilizando ClustalX (Jeanmougin et al., Trends Biochem. Sci. 23:403, 1998). Para encontrar las secuencias de ADN correspondientes a la secuencia de amino�cidos obtenida mediante degradaci�n Edman de las prote�nas transferidas a membranas de PVDF desde los geles de SDS-PAGE, se escribi� un programa de b�squeda que comprobase esas secuencias de amino�cidos frente a las tres posibles transducciones de cada secuencia de ADNc obtenida en el proyecto de secuenciaci�n masiva. El programa se escribi� utilizando el mismo planteamiento que el empleado en los programas BLOCKS (Henikoff et al., Bioinformatics 15:471, 1999) o Prosite (Bairoch, Nucleic Acids Res. 19 (Suppl):2241,1991). Las transducciones de prote�nas de los clones de longitud completa fueron procesadas adicionalmente para identificar los p�ptidos se�al previstos, utilizando el programa Signal P (Nielsen et al., Protein Eng. 10:1, 1997), disponible online. Los sitios clivados con el p�ptido se�al previsto se compararon con la secuencia N-terminal obtenida de la degradaci�n Edman

55 de las prote�nas salivales del fleb�tomo. La estimaci�n del punto isoel�ctrico y del peso molecular de la prote�na transducida se realiz� utilizando el programa DNA STAR (DNASTAR). La informaci�n de la secuencia de prote�na transducida de longitud completa se compar� con la base de datos de prote�nas no redundantes de NCBI utilizando el programa BLAST-P (Altschul et al., Nucleic Acids Research 25:3389, 1997) y se buscaron los motivos enviando cada secuencia a la base de datos electr�nica.

Para caracterizar la estructura primaria de las principales prote�nas de SGH de Lu. longipalpis, se transfirieron geles de SDS-PAGE a membranas de PVDF y se calcul� la secuencia amino-terminal de cada banda de corte mediante degradaci�n de Edman.

65 Adem�s, se calcularon los valores siguientes:

Tabla 1

Caracter�sticas de las prote�nas

Nombre del polip�ptido

Posici�n o sitio de clivaje Peso molecular (MW) de la prote�na sin procesar pI de la prote�na sin procesar Peso molecular de la prote�na procesada pI de la prote�na procesada

LJL34

19 31 9,14 28,9 9,1

LJL18

19 18,7 6,42 16,4 6,1

LJS193

20 34,5 6,59 32,2 63

LJS201

23 11,2 4,89 8,7 4,8

LJL13

19 28,7 5 26,6 4,9

LJL23

21 37,4 9,15 35,1 9,1

L3M10

19 18,8 8,73 16,7 8,6

LJL143

23 35 8,4 32,5 8,3

LJS142

20 18,9 6,43 16,7 6,5

LJL17

20 123 4,36 102 4,4

LJM06

19 18,6 8,79 16,5 8,7

LJM17

18 47,3 5,92 45,2 5,7

LJL04

17 31,1 10,1 29,3 10

LJM114

24 17 7,58 14,3 5,6

LJM111

18 45,2 4,9 43 4,9

LJM78

20 39,4 7,54 373 7,7

LJS238

20 6,9 7,92 4,8 6,7

US169

22 14,1 4,64 11,6 4,5

LJL11

24 63,4 6,49 60,8 6,7

UL08

23 9,5 8,76 7 8,8

US 105

19 9,5 4,85 7,4 4,7

LJL09

18 73 5,65 71,1 5,6

OL3S

20 4,8 3,66 2,5 33

LJM04

20 162 8,91 13,9 9

LJM26

i7 50,7 5,77 48,8 5,8

LJS03

19 17,3 4,27 15,2 4,2

LJS192

23 12,1 4,29 9,7 42

LJM19

22 13,4 426 10,8 4,2

LJL138

19 45,9 9,42 43,8 9,5

LJL15

19 18,7 6,2 16,5 6,1

LJL91

19 18,5 5,82 16,4 5,8

LJM11

24 45,3 9,35 42,7 9,4

LJS138

20 18,5 5,88 16,2 5,5

Ejemplo 3

5 Anticuerpos contra saliva de Lu. Longipalpis

Ya se ha demostrado anteriormente que los sueros de ni�os que viven en una regi�n end�mica para VL tienen anticuerpos contra IgG de SGS que reconocen de forma diferenciada los ant�genos de las gl�ndulas salivales. Los individuos con una respuesta positiva en DTH anti-Leishmania presentaban anticuerpos contra saliva de Lu.

10 longipalpis. Se observ� una correlaci�n positiva entre los anticuerpos contra saliva de Lu. longipalpis y DTH anti-Leishmania, aunque no se observ� ninguna correlaci�n entre los anticuerpos contra saliva y la serolog�a anti-Leishmania (Barral et al., ibid).

Se estudi� la variaci�n en las respuestas anti-Leishmania mediadas por c�lulas y humorales en un seguimiento de

15 seis meses de individuos en una regi�n end�mica para VL, as� como la variaci�n en las respuestas de anticuerpos contra saliva de Lu. longipalpis en los mismos individuos. Los individuos (n = 15) que pasaron a una DTH anti-Leishmania positiva incrementaron notablemente su IgG contra Lu. longipalpis (FIG. 1A; P = 0,02) y niveles de anticuerpo IgE (FIG. 1B, P = 0,002). IgG1 fue la principal subclase de anticuerpos implicada en el aumento de anticuerpos anti-saliva en el grupo que pas� a una DTH positiva anti-Leishmania (n = 15) (FIG. 1C); no se

20 observaron cambios significativos en otras subclases de IgG. El valor de corte de IgG contra Lu. longipalpis en los ensayos ELISA fue de 0,045. Se observ� una importante reducci�n de los niveles de anticuerpos IgG contra saliva (P = 0,035) en los sueros de los ni�os que experimentaron un cambio en su serolog�a anti-Leishmania (Grupo I) (FIG. 1,4). No se observaron cambios significativos en la IgE anti-saliva del Grupo I (FIG. 15). A pesar de que los niveles de IgG anti-saliva de los ni�os del Grupo II se redujeron en el periodo de seis meses, se observ� un

25 importante aumento de la IgG4 anti-saliva en este grupo (P = 0,0245; FIG. 1D).

El n�mero y el patr�n de las prote�nas salivales de Lu. longipalpis reconocidos por los sueros de individuos que pasaron de S-→ S+ o de DTH-→ DTH + se evalu� mediante ensayo Western blot. De siete sueros seleccionados al azar pertenecientes a individuos que modificaron su serolog�a anti-Leishmania, dos reconoc�an escasamente dos prote�nas salivales diferentes de 33 kDa y 200 kDa, respectivamente (FIG. 2A, banda 4); los restantes sueros no

5 reconocieron ninguna prote�na salival en ning�n punto temporal. Por lo contrario, de 13 sueros seleccionados al azar de individuos que pasaron de DTH-→ DTH + , 12 reconocieron una variedad de prote�nas salivales con diversas intensidades. Las FIG. 2A y 2B muestran la diversidad de ant�genos salivales reconocidos por estos sueros (bandas 7-14). Por otra parte, los sueros de seis individuos que pasaron de DTH-→ DTH+ demostraron un incremento del n�mero y/o la intensidad en el reconocimiento de prote�nas salivales al comparar los puntos temporales del momento 0 (-) y a los seis meses (+) (FIG. 2A, bandas 7(-) y 8(+), 11(-) y 12(+), 13(-) y 14(+); FIG. 2B, bandas 11(-) y 12(+), 13(-) y 14(+), y datos no mostrados). Algunos individuos del grupo que pas� de DTH-→ DTH+ no mostr� ninguna variaci�n entre los puntos temporales del momento 0 y a los 6 meses (FIG. 2A, bandas 9(-) y 10(+); FIG. 2B, bandas 7(-) y 8(+)) o no reconocieron ninguna prote�na salival (FIG. 2B, bandas 9(-) y 10(+)).

15 Los sueros de los individuos que pasaron de DTH-→ DTH+ reconocieron un total de 16 prote�nas salivales diferentes; sin embargo, la frecuencia del reconocimiento var�a entre estos individuos (FIG. 2C). Una prote�na salival de 45 kDa fue reconocida por 12 sueros, seguida de prote�nas de 44 y 43 y 35 kDa reconocidas por 8 sueros (cada una), un prote�na de 17 kDa por 6 sueros, y una prote�na de 16 kDa por 5 sueros. Otras prote�nas salivales fueron reconocidas tambi�n, aunque con menor frecuencia (3 sueros o menos, FIG. 2C).

De este modo, los ni�os del Grupo II, que convirtieron su DTH anti-Leishmania, tambi�n presentaron un aumento de los anticuerpos anti-saliva del fleb�tomo, tal y como ponen de manifiesto los ensayos ELISA y Western blot. Se ha demostrado una correlaci�n entre los t�tulos de anticuerpos anti-saliva y la DTH anti-Leishmania (Barral et al., ibid); los resultados aqu� presentados muestran que la evoluci�n de la DTH contra el par�sito coincide temporalmente con

25 la evoluci�n de los anticuerpos contra saliva de Lu. longipalpis. Sin pretender vincularse a una teor�a, la neutralizaci�n de los componentes salivales de la mosca de la arena mediante anticuerpos o respuesta celular a las prote�nas salivales permite generar una respuesta inmune m�s eficiente mediada por c�lulas contra la Leishmania, probablemente desarrollando una respuesta de Th1 contra el par�sito. Los componentes de la saliva de este fleb�tomo, como el maxadilano, son capaces de obstaculizar la funci�n de los macr�fagos (Charlab et al., Proc Natl Acad Sci USA 96:15155-60, 1999), que interfiere en la supervivencia de la Leishmania y en la presentaci�n de ant�geno (Soares et al., J. Immunol. 160: 1811-6, 1998). El aumento de los niveles de anticuerpos observado en los individuos que han pasado de DTH-→ DTH + sugiere que el hecho de generar una respuesta inmune contra los componentes anti-saliva est� vinculado a la evoluci�n de la inmunidad mediada por c�lulas contra la Leishmania.

35 Los resultados revelados por el an�lisis Western blot demostraron que los individuos que modificaron su serolog�a anti-Leishmania pr�cticamente no reconocieron ninguna prote�na salival, mientras que los individuos que modificaron su DTH anti-Leishmania reconocieron varias prote�nas salivales diferentes. La frecuencia de los ant�genos salivales reconocidos por estos sueros revela un grupo de tan solo unas cuantas prote�nas, incluyendo ant�genos con una masa molecular aproximada de 45, 44, 43, 35, 27 y 16 kDa (FIG. 2C).

Entre estos ant�genos, el reconocimiento de al menos dos prote�nas salivales (45 kDa y 35 kDa) representa dos de las m�ximas frecuencias de reconocimiento por parte de los sueros humanos. Sorprendentemente, solamente dos sueros reconocieron una prote�na en el rango de 6 kDa, el peso molecular del maxadilano (Titus y Ribeiro, Parasitol Today 6; 157-159, 1990), lo que sugiere que, en los seres humanos, el maxadilano puede no inducir una respuesta

45 de anticuerpos s�lida, aunque podr�a ser un fuerte inductor de la inmunidad celular.

Los individuos que convirtieron su inmunidad mediada por c�lulas anti-Leishmania demostraron un incremento de los niveles de IgG1 e IgE. La IgG1 ha sido relacionada con una respuesta humana de Th1. El aumento de los anticuerpos IgE sugiere el desarrollo de una hipersensibilidad inmediata, dado que la IgE se considera un marcador de las respuestas de tipo Th2. Sin pretender vincularse a una teor�a, es probable que una respuesta combinada de tipo Th2 (relacionada con la hipersensibilidad inmediata) y de tipo Th1 (relacionada con la DTH) contra los componentes de la saliva coexista en los individuos que han convertido recientemente su DTH anti-Leishmania. De hecho, este tipo de respuesta mixta fue documentada en individuos expuestos a las picaduras del insecto, donde la respuesta inmune del hu�sped contra la saliva del insecto comienza por la respuesta de DTH y evoluciona hacia una

55 hipersensibilidad de tipo inmediato predominante y finalmente hacia la desensibilizaci�n (Melanby, Nature. 158, 554555.13, 1946).

Como se ha divulgado en el presente, en los ratones, la inmunizaci�n utilizando genes de la saliva de Lu. longipalpis se tradujo en una respuesta t�pica de anticuerpos y/o DTH a las prote�nas salivales de Lu. longipalpis (v�ase m�s abajo), lo que sugiere que las picaduras de Lu. longipalpis podr�an inducir respuestas de tipo Th1 y Th2 en los seres humanos. Cabe se�alar que la prote�na salival de P. papatasti (SP15) responsable de la respuesta de DTH en ratones es altamente hom�loga a la prote�na SL1 presente en la saliva de Lu. longipalpis (Charlab et al., Proc Natl Acad Sci USA 96:15155— 60, 1999). Sin pretender vincularse a una teor�a, los resultados presentados en el presente sugieren que una respuesta combinada anti-saliva tanto con componentes Th1 como Th2 puede ayudar a

65 establecer una respuesta inmune anti-Leishmania.

Ejemplo 4

Vacunaci�n de ADN en ratones

5 Para la inmunizaci�n gen�tica, se compraron ratones Swiss Webster a Taconi Farms. Los ratones se mantuvieron en el centro de cuidado de animales NIAED en condiciones libres de pat�genos. Se inocularon en la oreja derecha de los ratones 30 μg del pl�smido que codifica el ADNc seleccionado de Lu. longipalpis suspendidos en 5 μl de PBS. Cada grupo recibe una dosis de refuerzo dos semanas m�s tarde utilizando el mismo r�gimen. A los ratones se les inyect� en la oreja izquierda un homogenato de gl�ndulas salivares de Lu. longipalpis para medir la respuesta de

10 hipersensibilidad tard�a (DTH) 24 horas despu�s de la inyecci�n, valorando el grosor y el enrojecimiento de la oreja (++: al menos 2 ratones con una buena respuesta de DTH, +++ : al menos tres ratones con una buena respuesta de DTH).

Tabla 2

Respuesta de DTH en ratones

ADNc de gl�ndula salival de Lutzomyia longipalpis

Respuesta de DTH (grosor y enrojecimiento)

PLJS201

-

pLJM19

++

pLJL91

-

pLJM06

-

PLJL15

+++

pLJMll

-

PLJM17

4-H

pLJLll

-

PL3L08

++

pLJL18

++

PUS142

-

PLJL13

-

PLJL34

++

pLJMlll

+++

pLJL17

+++

pLJM04

-

pLJL23

++

* Respuesta de hipersensibilidad tard�a (DTH) inducida mediante inyecci�n de un homogenato de gl�ndulas salivales en la oreja de los ratones (grupo de tres) previamente inmunizados con la vacuna de ADN salival. Los ratones fueron previamente sensibilizados con pl�smidos de ADN espec�ficos en dos ocasiones a intervalos de dos semanas y posteriormente se les inyect� el homogenato de gl�ndulas salivales del fleb�tomo Lutzomyia longipalpis. La respuesta de DTH se midi� (grosor y enrojecimiento de la oreja) 24 horas despu�s de la inyecci�n del homogenato de gl�ndulas salivales. (++= al menos dos ratones tuvieron una buena respuesta de DTH, +++ al menos tres ratones tuvieron una buena respuesta de DTH).

Ejemplo 5

Producci�n de una respuesta inmune en perros

20 En un primer experimento, la reacci�n de DTH (hipersensibilidad tard�a) se realiza en perros con una inmunidad natural frente a la leishmaniasis, con el fin de determinar qu� prote�nas salivales de Lu. longipalpis son reconocidas por una respuesta inmune de protecci�n. Estos perros con inmunidad natural sobrevivieron sin s�ntomas despu�s de dos a�os de exposici�n en una regi�n end�mica. En un segundo experimento, se inmuniza a perros que no hab�an

25 recibido tratamiento previo con la prote�na de las gl�ndulas salivales de Lu. longipalpis expresada por un pl�smido, con el fin de evaluar la capacidad de inducir una respuesta inmune celular medida por la DTH.

Doce perros de aproximadamente tres a�os de edad con inmunidad natural contra la Leishmaniasis reciben una inyecci�n por v�a intrad�rmica (ID) en el lomo, despu�s de afeitar la zona, con 100 μg de cada pl�smido individual

30 suspendido en 100 μg de PBS. Cada pl�smido se inyecta en un punto diferente. Estos puntos est�n separados por al menos 3 cm, con el fin de evitar interferencias entre las respuestas de DTH. El control negativo (100 μg de soluci�n tamp�n) se inocula tambi�n por v�a ID.

La respuesta de DTH se valora 72 horas despu�s de la inyecci�n, midiendo el aumento de di�metro de la zona de

35 tumefacci�n de la piel. Los resultados se expresan como el valor medio de la zona de tumefacci�n para todos los perros y en forma de un porcentaje de los perros que presentan una respuesta de DTH positiva. Una DTH positiva es un di�metro de la zona de tumefacci�n mayor o igual a 4 mm a las 72 horas de la inyecci�n.

En un segundo estudio, 10 perros sin tratamiento previo, de entre 4 y 6 meses de edad, son inmunizados mediante una inyecci�n ID en 10 puntos (100 μl por punto) en la oreja derecha con un conjunto de los pl�smidos que codifican un polip�ptido de Lu. longipalpis, 100 μl para cada uno suspendidos en 100 μl de PBS. El d�a 21 los perros reciben una inyecci�n en 10 puntos (100 μl por punto) de la oreja izquierda y en 10 puntos (100 μl por punto) del abdomen, 5 con un conjunto de pl�smidos, 100 μl para cada uno suspendidos en 2000 μl de PBS. Todos los perros son expuestos el d�a 35 a una inoculaci�n por v�a ID en el lomo (tras afeitar la zona) a 100 μl de cada pl�smido individual suspendido en 100 μl de PBS. Cada pl�smido se inyecta en un punto diferente. Los puntos est�n separados al menos por 3 cm para evitar interferencias. Como control negativo, se inoculan 100 μl de soluci�n tamp�n por v�a intrad�rmica. La respuesta a la DTH se valora 72 horas despu�s de esta exposici�n, midiendo el aumento de

10 di�metro de la zona de tumefacci�n de la piel. Los resultados se expresan como el valor medio de la zona de tumefacci�n para todos los perros y en forma de un porcentaje de los perros que presentan una respuesta de DTH positiva. Una DTH positiva es un di�metro de la zona de tumefacci�n mayor o igual a 4 mm a las 72 horas de la inyecci�n.

15 Los resultados de este estudio demuestran que los pl�smidos pueden inducir una inmunidad celular en los perros despu�s de la inyecci�n, una inmunidad celular puesta de manifiesto por una respuesta de DTH. La variaci�n del nivel de respuesta de DTH puede darse por la variaci�n de la expresi�n del elemento insertado.

Resultar� evidente que los m�todos y datos concretos descritos se pueden variar o modificar sin desviarse del

20 contenido de la divulgaci�n descrita. Reivindicamos todas las modificaciones y variaciones que se enmarcan en el �mbito de aplicaci�n y el contenido de las reivindicaciones siguientes.

La invenci�n incluye asimismo el asunto objeto de las reivindicaciones del documento WO2004/039958, del que se deriva la presente solicitud, y cuyo contenido se reproduce m�s adelante en forma de p�rrafos numerados.

25 P�rrafo 1 Un polip�ptido salival sustancialmente purificado de Lu. longipalpis .

P�rrafo 2 El polip�ptido del P�rrafo 1, donde el polip�ptido comprende

30 a) una secuencia de amino�cidos al menos un 80% id�ntica a una secuencia de amino�cidos presentada como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 13, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID.

35 N�: 65 o SEC. ID. N�: 67 b) una variante conservadora de la secuencia de amino�cido presentada como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 13, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID.

40 N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N�: 67; c) Aun fragmento inmunog�nico que comprende al menos ocho amino�cidos consecutivos de la secuencia de amino�cido presentada como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 13, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N� 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45,

45 SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N�: 67, que se une espec�ficamente a un anticuerpo que se une espec�ficamente a la secuencia de amino�cido presentada como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 13, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 41,

50 SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N�: 67, respectivamente; o d) la secuencia de amino�cido presentada como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 13, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID.

55 N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N�: 67, y donde la administraci�n del polip�ptido a un sujeto produce una respuesta inmunol�gica a Lu. longipalpis.

60 P�rrafo 3. El polip�ptido de Lu. longipalpis del P�rrafo 2, donde el polip�ptido comprende una secuencia de amino�cido como la presentada como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 13, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61,

65 SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N�: 67, o una variante conservadora del mismo.

P�rrafo 4. El polip�ptido de Lu. longipalpis del P�rrafo 3, donde el polip�ptido comprende una secuencia de amino�cido presentada como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 13, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N�: 67.

P�rrafo 5. Un fragmento antig�nico del polip�ptido del P�rrafo 4.

P�rrafo 6. El polip�ptido del P�rrafo 1, donde el polip�ptido comprende una secuencia de amino�cido al menos un 80% id�ntico a la secuencia de amino�cido presentada como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 13, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N� 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N�: 67.

P�rrafo 7. Un �cido nucleico aislado que codifica el polip�ptido del P�rrafo 1.

P�rrafo 8. El �cido nucleico del P�rrafo 7, donde el �cido nucleico comprende una secuencia como la presentada como SEC. ID. N�: 4, SEC. ID. N�: 6, SEC. ID. N�: 8, SEC. ID. N�: 10, SEC. ID. N�: 14, SEC. ID. N�: 16, SEC. ID. N�: 18, SEC. ID. N�: 20, SEC. ID. N�: 22, SEC. ID. N�: 26, SEC. ID. N�: 28, SEC. ID. N�: 30, SEC. ID. N�: 32, SEC. ID. N�: 34, SEC. ID. N�: 36, SEC. ID. N�: 42, SEC. ID. N�: 44, SEC. ID. N�: 46, SEC. ID. N�: 48, SEC. ID. N�: 50, SEC. ID. N�: 52, SEC. ID. N�: 54, SEC. ID. N�: 56, SEC. ID. N�: 58, SEC. ID. N�: 62, SEC. ID. N�: 64, SEC. ID. N�: 66 o SEC. ID. N�: 68, o una variante degenerada de la misma.

P�rrafo 9. El �cido nucleico del P�rrafo 7, donde el �cido nucleico comprende una secuencia como la presentada como SEC. ID. N�: 4, SEC. ID. N�: 6, SEC. ID. N�: 8, SEC. ID. N�: 10, SEC. ID. N�: 14, SEC. ID. N�: 16, SEC. ID. N�: 18, SEC. ID. N�: 20, SEC. ID. N�: 22, SEC. ID. N�: 26, SEC. ID. N�: 28, SEC. ID. N�: 30, SEC. ID. N�: 32, SEC. ID. N�: 34, SEC. ID. N�: 36, SEC. ID. N�: 42, SEC. ID. N�: 44, SEC. ID. N� 46, SEC. ID. N� 48, SEC. ID. N�: 50, SEC. ID. N�: 52, SEC. ID. N�: 54, SEC. ID. N�: 56, SEC. ID. N�: 58, SEC. ID. N�: 62, SEC. ID. N�: 64, SEC. ID. N�: 66 o SEC. ID. N�: 68.

P�rrafo 10. El �cido nucleico del P�rrafo 7, donde el �cido nucleico codifica una secuencia de amino�cido al menos un 80% id�ntica a la secuencia de amino�cido presentada como SEC. ID. N�: 4, SEC. ID. N�: 6, SEC. ID. N�: 8, SEC. ID. N� 10, SEC. ID. N�: 14, SEC. ID. N�: 16, SEC. ID. N�: 18, SEC. ID. N�: 20, SEC. ID. N�: 22, SEC. ID. N�: 26, SEC. ID. N�: 28, SEC. ID. N�: 30, SEC. ID. N�: 32, SEC. ID. N� 34, SEC. ID. N�: 36, SEC. ID. N�: 42, SEC. ID. N�: 44, SEC. ID. N�: 46, SEC. ID. N�: 48, SEC. ID. N� 50, SEC. ID. N�: 52, SEC. ID. N�: 54, SEC. ID. N�: 56, SEC. ID. N�: 58, SEC. ID. N� 62, SEC. ID. N�: 64, SEC. ID. N�: 66 o SEC. ID. N�: 68.

P�rrafo 11. El �cido nucleico del P�rrafo 7, operativamente unido a una secuencia de control de la expresi�n.

P�rrafo 12. El �cido nucleico del P�rrafo 11, donde la secuencia de control de la expresi�n es un promotor.

P�rrafo 13. El �cido nucleico del P�rrafo 12, donde el promotor es un promotor inducible o constitutivo.

P�rrafo 14. El �cido nucleico del P�rrafo 13, donde el promotor es un promotor de citomegalovirus.

P�rrafo 15. Un vector que comprende el �cido nucleico del P�rrafo 7.

P�rrafo 16. El vector del P�rrafo 15, donde el vector es un pl�smido.

P�rrafo 17. El vector del P�rrafo 15, donde el vector es un vector viral.

P�rrafo 18. Una c�lula hu�sped transformada con el vector del P�rrafo 15.

P�rrafo 19. Un anticuerpo que se une espec�ficamente al polip�ptido del P�rrafo 1.

P�rrafo 20. El anticuerpo del P�rrafo 19, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

P�rrafo 21. El anticuerpo del P�rrafo 20, que comprende una etiqueta detectable.

P�rrafo 22. El anticuerpo del P�rrafo 21, donde la etiqueta es una etiqueta fluorescente, enzim�tica o radiactiva.

P�rrafo 23. Una composici�n farmac�utica que comprende el polip�ptido del P�rrafo 1 y un veh�culo farmac�uticamente aceptable.

P�rrafo 24. Una composici�n farmac�utica que comprende el �cido nucleico del P�rrafo 7 y un veh�culo farmac�uticamente aceptable.

P�rrafo 25. Un m�todo para inducir una respuesta inmune a un polip�ptido de Ln. longipalpis en un sujeto, que consiste en:

administrar al sujeto una cantidad terap�uticamente efectiva de:

a) una secuencia de amino�cido al menos un 80% id�ntica a una secuencia de amino�cido presentada como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 13, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N�: 67; b) una variante conservadora de la secuencia de amino�cido presentada como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 13, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N�: 67; c) un fragmento inmunog�nico que comprende al menos ocho amino�cidos consecutivos de la secuencia de amino�cido presentada como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 13, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65, o SEC. ID. N�: 67, que se une espec�ficamente a un anticuerpo que se une espec�ficamente a la secuencia de amino�cido presentada como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 13, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N� 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N�: 67, respectivamente; o d) la secuencia de amino�cido presentada como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 13, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N�: 67; o

(e) un polinucle�tido que codifica el polip�ptido presentado en las letras a), b), c) o d), induciendo as� la respuesta inmune al polip�ptido de Lu. longipalpis en un sujeto.

P�rrafo 26. El m�todo del P�rrafo 25, donde la respuesta inmune es una respuesta de linfocitos T.

P�rrafo 27. El m�todo del P�rrafo 25, donde la respuesta inmune es una respuesta de linfocitos B.

P�rrafo 28. El m�todo del P�rrafo 25, donde el sujeto es un sujeto veterinario no humano.

P�rrafo 29. El m�todo del P�rrafo 25, donde el sujeto es un perro.

P�rrafo 30. El m�todo del P�rrafo 25, donde el sujeto es un ser humano.

P�rrafo 31. Un m�todo para inhibir un s�ntoma de una infecci�n por Leishmania o para prevenir una infecci�n por Leishmania en un sujeto, que comprende la administraci�n al sujeto de una cantidad terap�uticamente efectiva de:

a) una secuencia de amino�cido al menos un 80% id�ntica a la secuencia de amino�cido presentada como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 13, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N�: 67; b) una variante conservadora de la secuencia de amino�cido presentada como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 13, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N�: 67; c) un fragmento inmunog�nico que comprende al menos ocho amino�cidos consecutivos de la secuencia de amino�cido presentada como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 13,

SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N�: 67, que se une espec�ficamente a un anticuerpo que se 5 une espec�ficamente a la secuencia de amino�cido presentada como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 13, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N� 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N� 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N�: 67, respectivamente; o

10 d) la secuencia de amino�cido presentada como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 13, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N�: 25, SEC. ID. N� 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID. N�: 35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N� 45, SEC. ID. N� 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N�: 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N� 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N�: 65 o SEC. ID. N�: 67; o

15 (e) un polinucle�tido que codifica el polip�ptido presentado en las letras a), b), c) o d), inhibiendo as� el s�ntoma de la infecci�n por Leishmania o previniendo la infecci�n por Leishmania .

P�rrafo 32. Uso de una composici�n que comprende el polip�ptido del P�rrafo 1 o un �cido nucleico que codifica el polip�ptido del P�rrafo 1 para la fabricaci�n de un medicamento.

20 P�rrafo 33. Uso de la composici�n del P�rrafo 32, conjuntamente con una composici�n que comprende un polip�ptido de P. ariasi o P. perniciosus para la fabricaci�n de un medicamento.

P�rrafo 34. Un m�todo para diagnosticar la infecci�n por Leishmania en un sujeto, que consiste en:

25 poner en contacto un sustrato s�lido que comprende al menos tres, seis o diez polip�ptidos, donde cada uno de los polip�ptidos comprende una secuencia de amino�cido como la presentada como SEC. ID. N�: 3, SEC. ID. N�: 5, SEC. ID. N�: 7, SEC. ID. N�: 9, SEC. ID. N�: 13, SEC. ID. N�: 15, SEC. ID. N�: 17, SEC. ID. N�: 19, SEC. ID. N�: 21, SEC. ID. N� 25, SEC. ID. N�: 27, SEC. ID. N�: 29, SEC. ID. N�: 31, SEC. ID. N�: 33, SEC. ID.

30 N�: 35, SEC. ID. N�: 41, SEC. ID. N�: 43, SEC. ID. N�: 45, SEC. ID. N�: 47, SEC. ID. N�: 49, SEC. ID. N� 51, SEC. ID. N�: 53, SEC. ID. N�: 55, SEC. ID. N�: 59, SEC. ID. N�: 61, SEC. ID. N�: 63, SEC. ID. N� 65 o SEC. ID. N�: 67, o un fragmento inmunog�nico de la misma;

poner en contacto el sustrato s�lido con una muestra obtenida del sujeto, y detectar la uni�n de un componente de la 35 muestra al menos a un polip�ptido en el sustrato s�lido, donde la detecci�n de la uni�n del componente al sustrato indica que el sujeto est� infectado por Leishmania,

diagnosticando as� la infecci�n por Leishmania en el sujeto.

40 P�rrafo 35. El m�todo del p�rrafo 34, donde uno de los al menos tres polip�ptidos comprende una secuencia de amino�cido como la presentada como SEC. ID. N�: 1, donde otro de los al menos tres polip�ptidos comprende una secuencia de amino�cido como la presentada como SEC. ID. N�: 23, y donde otro m�s de los al menos tres polip�ptidos comprende una secuencia de amino�cido como la presentada como SEC. ID. N�: 39.

45 P�rrafo 36. El m�todo del P�rrafo 34, donde el sustrato s�lido comprende al menos seis polip�ptidos, donde un primer polip�ptido comprende una secuencia de amino�cido como la presentada como SEC. ID. N�: 3, donde un segundo polip�ptido comprende una secuencia de amino�cido como la presentada como SEC. ID. N�: 11, donde un tercer polip�ptido comprende una secuencia de amino�cido como la presentada como SEC. ID. N�: 19, donde un cuarto polip�ptido comprende una secuencia de amino�cido como la presentada como SEC. ID. N�: 29, donde un

50 quinto polip�ptido comprende una secuencia de amino�cido como la presentada como SEC. ID. N�: 55, y donde un sexto polip�ptido comprende una secuencia de amino�cido como la presentada como SEC. ID. N�: 59.

P�rrafo 37. El m�todo del P�rrafo 34, donde el sustrato s�lido comprende una perla, una part�cula, una membrana o una placa de poliestireno.

55 P�rrafo 38. El m�todo del P�rrafo 34, donde la detecci�n consiste en poner en contacto el componente unido al sustrato s�lido con un anticuerpo secundario etiquetado.

LISTADO DE SECUENCIAS 60

<110> EL GOBIERNO DE LOS ESTADOS UNIDOS DE AM�RICA REPRESENTADO POR EL SECRETARIO DEL DEPARTAMENTO DE SALUD Y SERVICIOS HUMANOS Valenzuela, Jesus G. Ribeiro, Jose M. c . Barral, Aldina, Netto, Manoel Brodskyn, Claudia Gomes, Regis

65 <120> POLIP�PTIDOS DE LUTZOMYIA LONGIPALPIS Y M�TODOS DE USO <130> 4239-67028

<150> US 60/422,303

<151> 5

<160> 73

<170> Versi�n de la patente 3 . 2 10 <210> 1

<211> 271

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis 15 <400> 1

<210> 2

<211> 905

<212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 2

<210> 3 10 <211> 159

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<210> 4

<211> 617

<212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 4

<210> 5

<211> 304

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 5

<210>6

<211> 1273

<212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 6

<210> 7

<211> 102

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 7

<210> 8

<211> 466

<212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 8

10 <210> 9

<211> 247

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

15 <400> 9 <210> 10

<211> 955

<212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 10

5 <210> 11

<211> 325

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

10 <400> 11

<210> 12

<211> 1071

<212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 12

<210> 13

<211> 160

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 13

<210> 14

<211> 648

<212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 14

<210> 15

<211> 301

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis 15

<400> 15

<210> 16

<211> 1021

<212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 16

<210> 17

<211> 161

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 17

<210> 18

<211> 586

<212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 18

<210> 19

<211> 105

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 19

<210> 20 10 <211> 457

<212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 20

<210> 21

<211> 157

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 21

<210> 22

<211> 596

<212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis 15

<400> 22

5 <210> 23

<211> 412

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

10 <400> 23

<210> 24

<211> 1409

<212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 24

<210> 25

<211> 295

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 25

<210> 26

<211> 989

<212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 26

<210> 27

<211> 148

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis 15

<400> 27

<210> 28

<211> 826

<212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 28

<210> 29

<211> 397

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 29

<210> 30

<211> 1325

<212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 30

<210> 31

<211> 350

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 31

<210> 32

<211> 1275 5 <212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 32

<210> 33

<211> 60

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 33

<210> 34

<211> 413

<212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 34

<210> 35 10 <211> 120

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 35

<210> 36

<211> 428

<212> ADN 20 <213> Lutzomyia longipalpis

<400> 36

<210> 37

<211> 572

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 37

<210> 38

<211> 1839

<212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 38

<210> 39

<211> 86

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 39

<210> 40

<211> 419

<212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis

<210> 41 15 <211> 84

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 41

<210> 42

<211> 429

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 42

<210> 43

<211> 626

<212> PRT

<213>

Lutzomyia longipalpis 15

<400> 43

<210> 44

<211> 2121

<212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis

<210> 47

<211> 139

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 47

<210> 48

<211> 579

<212> ADN

<213>

Lutzomyia longipalpis 15

<210> 45

<211> 42

5

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 45

10

<210> 46

<211> 463

<212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis

15

<400> 46

<400> 48

<210> 49

<211> 446

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 49

<210> 50

<211> 1651

<212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis

<220>

<221> misc_feature

<222> (1636)..(1636)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 50

<210> 51 10 <211> 166

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 51

<210> 52

<211> 739

<212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis

<210> 53

<211> 109

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 53

<210> 54

<211> 447

<212> ADN

<213>

Lutzomyia longipalpis 15

<400> 54

<210> 55

<211> 115

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 55

<210> 56

<211> 496

<212> ADN

<213>

Lutzomyia longipalpis 15

<400> 56

<211> 409 20 <212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 57

<210> 58

<211> 1281

<212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 58

<210> 59

<211> 160

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 59

<210> 60

<211> 671

<212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 60

10 <210> 61

<211> 160

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

15 <400> 61

<210> 62

<211> 672

<212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 62

<210> 63

<211> 399

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 63

<210> 64

<211> 1429

<212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 64

<210> 65

<211> 170

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 65

<210> 66

<211> 712

<212> ADN 15 <213> Lutzomyia longipalpis

<400> 66

<210> 67

<211> 73

<212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 67

<210> 68

<211> 379

<212> ADN

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 68

<210> 69

<211> 76 20 <212> PRT

<213> Lutzomyia longipalpis

<400> 69

<210> 70

<211> 526

<212>

ADN 10 <213> Lutzomyia longipalpis

<400> 70

<210> 72

<211> 22

<212>

ADN 30 <213> Secuencia artificial

15

<210> 71

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20

<220>

<223> cebador del oligonucle�tido

<220>

<223> cebador del oligonucle�tido

<210> 73

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador del oligonucle�tido

<400> 73

Claims (27)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un polip�ptido salival de Lu. longipalpis sustancialmente purificado, donde el polip�ptido comprende

   a) una secuencia de amino�cido al menos un 80% id�ntica a la longitud total de la secuencia de amino�cido presentada como SEC. ID. N�: 15; b) un fragmento inmunog�nico, que comprende al menos ocho amino�cidos consecutivos de la secuencia de amino�cido presentada como SEC. ID. N�: 15, espec�ficamente reconocido por un anticuerpo que se une de forma espec�fica con la secuencia de amino�cido que se presenta como SEC. ID. N�: 15; o c) la secuencia de amino�cido que se presenta como SEC. ID. N�: 15; y donde la administraci�n del polip�ptido a un sujeto provoca una respuesta inmune a Lu. longipalpis.

2. 2.

   El polip�ptido de Lu. longipalpis de la reivindicaci�n 1, donde el polip�ptido comprende la secuencia de amino�cido que se presenta como SEC. ID. N�: 15.

3. 3.

   El polip�ptido de Lu. longipalpis de las reivindicaciones 1 o 2, donde el polip�ptido se compone de una secuencia de amino�cido como la que se presenta en la SEC. ID. N�: 15.

4. 4.

   Un fragmento antig�nico del polip�ptido de la reivindicaci�n 3.

5. 5.

   El polip�ptido de la reivindicaci�n 1, donde el polip�ptido comprende una secuencia de amino�cido al menos un 80% id�ntica a la longitud total de la secuencia de amino�cido presentada como SEC. ID. N�: 15.

6. 6.

   Un �cido nucleico aislado que codifica el polip�ptido de la reivindicaci�n 1.

7. 7.

   El �cido nucleico de la reivindicaci�n 6, donde el �cido nucleico comprende una secuencia como la presentada como SEC. ID. N�: 16 o donde el �cido nucleico codifica una secuencia de amino�cido al menos un 80% id�ntica a la secuencia de amino�cido presentada como SEC. ID. N�: 16.

8. 8.

   El �cido nucleico de la reivindicaci�n 6, operativamente unido a una secuencia de control de la expresi�n, donde la secuencia de control de la expresi�n es preferiblemente un promotor, donde preferiblemente el promotor es un promotor inducible o constitutivo, donde preferiblemente el promotor es un promotor de citomegalovirus.

9. 9.

   Un vector que comprende el �cido nucleico de la reivindicaci�n 6.

10. 10.

    El vector de la reivindicaci�n 9, donde el vector es un pl�smido, o donde el vector es un vector viral.

11. 11.

    Una c�lula hu�sped transformada con el vector de la reivindicaci�n 9.

12. 12.

    Un anticuerpo que se une espec�ficamente al polip�ptido de la reivindicaci�n 3 o al fragmento antig�nico de la reivindicaci�n 4.

13. 13.

    El anticuerpo de la reivindicaci�n 12, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

14. 14.

    El anticuerpo de la reivindicaci�n 13, que comprende una etiqueta detectable, donde preferiblemente la etiqueta es una etiqueta fluorescente, enzim�tica o radiactiva.

15. 15.

    Una composici�n farmac�utica que comprende el polip�ptido de la reivindicaci�n 1 y un veh�culo farmac�uticamente aceptable; o una composici�n farmac�utica que comprende el �cido nucleico de la reivindicaci�n 6 y un veh�culo farmac�uticamente aceptable.

16. 16.

    Un polip�ptido salival de Lu. longipalpis sustancialmente purificado seleccionado del grupo compuesto por:

    a) una secuencia de amino�cido al menos un 80% id�ntica a la longitud total de la secuencia de amino�cido presentada como SEC. ID. N�: 15. b) un fragmento inmunog�nico, que comprende al menos ocho amino�cidos consecutivos de la secuencia de amino�cido presentada como SEC. ID. N�: 15, espec�ficamente reconocido por un anticuerpo que se une de forma espec�fica con la secuencia de amino�cido que se presenta como SEC. ID. N�: 15; o c) la secuencia de amino�cido presentada como SEC. ID. N�: 15; para su uso en la inducci�n de una respuesta inmune a un polip�ptido de Lu. longipalpis en un sujeto.

17. 17.

    Un polinucle�tido que codifica el polip�ptido que se presenta en las letras a), b) o c) de la reivindicaci�n 16, para su uso en la inducci�n de una respuesta inmune a un polip�ptido de Lu. longipalpis en un sujeto.

18. 18.

    El polip�ptido de la reivindicaci�n 16 o el polinucle�tido de la reivindicaci�n 17, donde la respuesta inmune es una respuesta de linfocitos T o donde la respuesta inmune es una respuesta de linfocitos B.

19. 19.

    El polip�ptido de la reivindicaci�n 16 o el polinucle�tido de la reivindicaci�n 17, donde el sujeto es un sujeto veterinario no humano o donde el sujeto veterinario no humano es un perro.

20. 20.

    El polip�ptido de la reivindicaci�n 16 o el polinucle�tido de la reivindicaci�n 17, donde el sujeto es un ser humano.

21. 21.

    Un polip�ptido salival de Lu. longipalpis sustancialmente purificado seleccionado del grupo compuesto por:

    a) una secuencia de amino�cido al menos un 80% id�ntica a la longitud total de la secuencia de amino�cido presentada como SEC. ID. N�: 15; b) un fragmento inmunog�nico que comprende al menos ocho amino�cidos consecutivos de la secuencia de amino�cido que se presenta como SEC. ID. N�: 15, espec�ficamente reconocido por un anticuerpo que se une de forma espec�fica con la secuencia de amino�cido que se presenta como SEC. ID. N�: 15; o c) la secuencia de amino�cido presentada como SEC. ID. N�: 15; para su uso en la inhibici�n de un s�ntoma de una infecci�n por Leishmania o en la prevenci�n de una infecci�n por Leishmania en un sujeto.

22. 22.

    Un polinucle�tido que codifica el polip�ptido que se presenta en las letras a), b) o c) de la reivindicaci�n 21, para su uso en la inhibici�n de un s�ntoma de una infecci�n por Leishmania o en la prevenci�n de una infecci�n por Leishmania en un sujeto.

23. 23.

    Uso de una composici�n que comprende el polip�ptido de la reivindicaci�n 1 o un �cido nucleico que codifica el polip�ptido de la reivindicaci�n 1 para la fabricaci�n de un medicamento.

24. 24.

    Uso de una composici�n que comprende el polip�ptido de la reivindicaci�n 1 o un �cido nucleico que codifica el polip�ptido de la reivindicaci�n 1 conjuntamente con una composici�n que comprende un polip�ptido de P. ariasi o

    P. perniciosus para la fabricaci�n de un medicamento.

25. 25.

    Un m�todo para diagnosticar la infecci�n por Leishmania en un sujeto, que consiste en:

    poner en contacto un sustrato s�lido con una muestra obtenida del sujeto, donde el sustrato s�lido contiene un polip�ptido que comprende una secuencia de amino�cido presentada como SEC. ID. N�: 15 o un fragmento inmunog�nico del mismo; detectar la uni�n de un componente de la muestra a dicha secuencia del polip�ptido en el sustrato s�lido, donde la detecci�n de la uni�n del componente al sustrato indica que el sujeto est� infectado por Leishmania, diagnosticando as� la infecci�n por Leishmania en el sujeto.

26. 26.

    El m�todo de la reivindicaci�n 25, donde el sustrato s�lido comprende una perla, una part�cula, una membrana o una placa de poliestireno; o donde la detecci�n consiste poner en contacto el componente unido al sustrato s�lido con un anticuerpo secundario etiquetado.

27. 27.

    El polip�ptido de la reivindicaci�n 1, donde el polip�ptido est� codificado por los residuos de �cido nucleico 115948 de la SEC. ID. N�: 16 o los residuos de �cido nucleico 46-948 de la SEC. ID. N�: 16.

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