ES2322845T3 - Polipeptido anticomplemento de las glandulas salivales de la garrapata ixodes ricinus. - Google Patents
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Abstract
Polipéptido anticomplemento que presenta más del 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 2.
Description
Polipéptido anticomplemento de las glándulas
salivales de la garrapata Ixodes ricinus.
La presente invención se refiere a un nuevo
polipéptido anticomplemento así como a su utilización y a su
procedimiento de preparación.
En una respuesta inmunitaria, la activación del
complemento conduce a la producción de anafilotoxinas inflamatorias
y a la formación de un complejo de ataque a la membrana que conduce
a la lisis del microorganismo invasor. Existen reguladores
endógenos para prevenir la patología asociada a la activación del
complemento involuntaria y no limitada.
Sin embargo, diversos patógenos han desarrollado
rutas y mecanismos bioquímicos para eludir el sistema de
complemento del huésped.
Las garrapatas son ectoparásitos que infestan a
muchos animales (mamíferos, aves, reptiles y anfibios) y están
presentes en casi todas las regiones del mundo. Además, muchas de
estas garrapatas son vectores de patógenos tales como virus (virus
Toghoto), bacterias (Borrelia burgdorferi, Rickettsia
spp) o protozoos (Trypanosoma sp, Babesia sp,
Theileria sp) que provocan morbilidad del huésped y en
algunos casos mortalidad, en particular en seres humanos y
ganado.
Las glándulas salivales de las garrapatas
desempeñan un papel importante en la consecución de la alimentación
con sangre y la transmisión de dichos patógenos.
La garrapata puede alimentarse repetidamente en
su huésped natural y presenta una actividad anticomplemento salival
que presumiblemente facilita la alimentación.
Valenzuela J. et al. (The Journal of
Biological Chemistry, vol. 275, nº. 25, págs.
18717-18723 (2000)) describe la purificación,
clonación y expresión de una nueva proteína anticomplemento salival
a partir de la garrapata Ixodes scapularis.
Los autores declaran que dicha molécula se
comporta como un regulador de la activación del complemento de una
manera similar al factor acelerador de la degradación y al factor H,
que inhiben la activación del complemento interaccionando con la C3
convertasa de rutas clásicas o alternativas.
Sin embargo, dicha secuencia no presenta ninguna
similitud de secuencia significativa con el factor H ni con
cualquier otra proteína disponible en bases de datos de dominio
público. Por tanto, parecería que dicha molécula pertenece a una
nueva clase de moléculas reguladoras del complemento, que tras su
expresión satisfactoria, constituirían antígenos apropiados para
vacunas anti-garrapatas y/o nuevos agentes
terapéuticos.
Las solicitudes de patente internacionales
WO01/40469, WO2/26247 y Valenzuela et al (J. Biol. CHEM, vol.
275, nº 25 págs. 18717-18723 (2000) describen
moléculas de ADN sintéticas o recombinantes aisladas de garrapatas,
vectores que comprenden dichas moléculas de ADN, células
transformadas mediante dichos vectores y polipéptidos codificados
por dichas moléculas de ADN, así como composiciones farmacéuticas
que los comprenden. Sin embargo, dichas moléculas de ADN se
obtienen a partir de la garrapata Ixodes scapularis.
El objetivo de la presente invención es
proporcionar nuevos polipéptidos anticomplemento y polinucleótidos
que los codifican.
Un objetivo principal de la presente invención
es proporcionar tal(es) péptido(s) y
polinucleótido(s) de la misma clase que inhibe(n) el
complemento a través de rutas clásicas y alternativas y que por
tanto son candidatos antigénicos adecuados para la vacunación
contra garrapatas y para el bloqueo de la transmisión de diversos
microorganismos, especialmente agentes patógenos portados por
garrapatas.
Un objetivo adicional de la presente invención
es proporcionar una composición farmacéutica que puede comprender
dicho(s) polipéptido(s) anticomplemento,
polinucleótido(s) o variante(s) del mismo/de los
mismos para modular (posiblemente mediante una acción sinérgica con
otro(s) polipéptido(s), polinucleótido(s) o
variantes de la misma clase) la respuesta inmunitaria de un
mamífero, en particular, para reducir la activación del complemento
en patologías que implican una activación del complemento no
deseada, tal como, por ejemplo, inflamación y destrucción
miocárdica postisquémica.
La presente invención se refiere a una nueva
clase de moléculas anticomplemento obtenidas de la garrapata
Ixodes resinus. Dichas moléculas anticomplemento presentan
una ruta bioquímica alternativa diferente de otras moléculas
anticomplemento conocidas (especialmente humanas) y se seleccionan
preferentemente del grupo constituido por la secuencia de
aminoácidos del polipéptido SEC ID nº 2 (identificada más adelante
en la presente memoria como molécula IRAC 2) y la secuencia de
aminoácidos del polipéptido SEC ID nº 1 (identificada más adelante
en la presente memoria como molécula IRAC 1).
La presente invención se refiere asimismo a
moléculas que presentan una homología superior al 85%, 90%, 95% ó
98%-99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos
SEC ID nº 2.
La presente invención se refiere también a
polinucleótidos (moléculas de ácido nucleico que codifican para
dichos polipéptidos) y sus variantes, preferentemente un
polinucleótido que presenta más del 80%, 85%, 90%, 95%,
98-99% ó 100% de identidad de secuencia con la
secuencia de nucleótidos SEC ID nº 2 o su hebra complementaria.
Preferentemente, dichos polipéptidos y su
polinucleótido codificante corresponden a la secuencia completa SEC
ID nº 2, sus fragmentos activos o variantes de la misma (moléculas
que presentan la misma actividad anticomplemento o una similar que
la secuencia completa).
Fragmentos o variantes del/de los
polipéptido(s) según la invención son también moléculas que
presentan la misma actividad anticomplemento con una o más
modificaciones genéticas (tales como deleción o adición de uno o
más aminoácidos) en las secuencias completas SEC ID nº 2 o, tales
como variantes alélicas que se producen de manera natural. Tales
modificaciones no modifican el porcentaje de homología o identidad
de secuencia mencionado anteriormente.
Dichas variantes son también moléculas que
presentan una actividad anticomplemento similar a la de los
polipéptidos según la invención a través de la misma ruta
bioquímica y que actúan de manera similar en el mismo sitio
activo.
Los polipéptidos también pueden integrarse como
proteína "nativa" o son parte de una proteína de fusión o
pueden incluir ventajosamente secuencias de aminoácidos adicionales
que contienen secuencias líder o secretoras, prosecuencias,
secuencias que eluyen en purificación tales como múltiples residuos
de histidina o una secuencia adicional para la estabilidad durante
la producción recombinante (cola de His en la secuencia
C-terminal).
Dichos polipéptidos pueden comprender asimismo
secuencias marcadoras que facilitan la purificación del polipéptido
de fusión con una secuencia tal como un péptido de
hexa-histidina tal como se proporciona en el vector
PQE (Invitrogen Inc.) y descrito por Gentz et al.,
Proceeding National Academic of Science of the USA, 1989, vol. 86,
págs. 821-824) o un marcador de HA o
glutatión-S-transferasa. El
polinucleótido correspondiente puede contener también secuencias en
5' y en 3' no codificantes tales como secuencias transcritas no
traducidas, señal de corte y empalme y poliadenilación y sitios de
unión a ribosomas.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un vector que comprende el polinucleótido o polipéptido según la
invención, siendo preferentemente dicho vector un plásmido, un
virus, un liposoma o una vesícula catiónica que puede transfectar
una célula y obtener la expresión de dicho polinucleótido mediante
dicha célula.
Un aspecto adicional de la presente invención se
refiere a la célula (célula procariota o eucariota) transfectada
por lo que comprende dicho vector.
Un aspecto adicional de la presente invención se
refiere a un inhibidor dirigido contra el polipéptido según la
invención, un fragmento (epítopo) del mismo o un polinucleótido que
codifica para dicho polipéptido.
Preferentemente, dicho inhibidor es un
anticuerpo (anticuerpo monoclonal o policlonal) o una parte
hipervariable activa del mismo. El inhibidor podría ser también un
receptor específico de una célula sanguínea que puede interaccionar
específicamente con dicho polipéptido o sus epítopos. El inhibidor
podría ser también un ARN antisentido o una ribozima dirigida
contra el polinucleótido que codifica para dicho polipéptido.
La presente invención se refiere asimismo a las
células (hibridomas) que expresan y producen dicho anticuerpo o una
parte activa del mismo.
Un aspecto adicional de la presente invención se
refiere a una composición farmacéutica (incluyendo una vacuna) que
comprende un vehículo farmacéutico adecuado (o diluyente) y al menos
uno de los diversos elementos según la invención, especialmente el
polipéptido, la(s) variante(s), el polinucleótido
codificante, el vector, la célula transformada mediante dicho
vector o el inhibidor según la invención.
Ventajosamente, dicha composición farmacéutica
comprende los dos polipéptidos según la invención que presentan
inesperadamente un efecto sinérgico cuando se administran.
\newpage
Dicha composición farmacéutica puede comprender
también un adyuvante, tampón antioxidante, agentes bacteriostáticos
y disoluciones adecuados que se convierten en agentes biotónicos con
la sangre del receptor y suspensiones acuosas y no acuosas
estériles (que pueden incluir agentes de suspensión). El adyuvante
utilizado en la composición farmacéutica se utiliza ventajosamente
para modular la respuesta inmunitaria de un mamífero (incluyendo un
ser humano) con el fin de mejorar la característica de la
composición farmacéutica según la invención o de reducir sus
posibles efectos secundarios. El diluyente o vehículo farmacéutico
adecuado lo selecciona el experto en la materia según el tipo de
administración al mamífero (administración oral, administración
intravenosa, administración intradérmica, administración
intramuscular, administración peritoneal, etc.).
La composición farmacéutica puede presentarse en
una formulación en un envase de una única dosis o de múltiples
dosis y puede almacenarse en un estado liofilizado que requiere sólo
la adición de un vehículo líquido estéril.
Dicho vehículo farmacéutico podría estar en
forma sólida, líquida o gaseosa y la dosis de administración
adecuada y la razón entre el vehículo farmacéutico/compuesto activo
varía según el número de dosis de administración, la masa del
mamífero que va a tratarse y los posibles efectos secundarios del
compuesto según la invención en dicho mamífero.
La composición farmacéutica según la invención
podría ser una composición terapéutica o profiláctica tal como una
vacuna.
La composición farmacéutica según la invención
podría ser una composición adecuada para permitir una vacunación
contra la garrapata o diversos microorganismos (virus, bacterias,
protozoos) transmitidos por la garrapata.
La presente invención se refiere asimismo a una
formulación inmunológica/de vacuna que comprende el polinucleótido
según la invención presentado según las técnicas bien conocidas por
el experto en la materia tal como la descrita por Wolff et
al. (Science, vol. 247, págs. 1465-1468
(1999)).
La composición farmacéutica según la invención
podría utilizarse para tratar o prevenir cualquier enfermedad o
patogénesis que implique una activación incontrolada o no deseada
del complemento, tal como enfermedad cardiaca relacionada (en
particular isquemia parcial o total, fenómeno de destrucción de
tejido tras miocarditis postinfarto o la génesis de la destrucción
de tejido renal debido a la presencia de inmunocomplejos
circulantes). Tal composición farmacéutica podría utilizarse
también para desarrollar la inhibición de la activación del
complemento para el tratamiento y/o la prevención de inflamaciones
(crónicas), tales como artritis reumatoide crónica.
La vacunación contra la garrapata podría
obtenerse induciendo un alto rechazo de la garrapata y/o una
neutralización de la protección conferida por la saliva de la
garrapata frente a vectores transmitidos por la garrapata (virus,
bacterias, protozoos).
Un aspecto final de la presente invención se
refiere a la utilización de la composición farmacéutica según la
invención para la preparación de un medicamento en el tratamiento
y/o la prevención de diversas enfermedades, especialmente
enfermedades inducidas por la garrapata o agentes patógenos
transmitidos por la garrapata, especialmente Ixodes ricinus,
así como para el tratamiento o la prevención de inflamaciones o
enfermedades cardiacas relacionadas.
\vskip1.000000\baselineskip
El término "Polipéptido" se refiere a
cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos
unidos entre sí mediante enlaces peptídicos o enlaces peptídicos
modificados, es decir, isoésteres peptídicos. El término
"Polipéptido" se refiere tanto a cadenas cortas, denominadas
comúnmente péptidos, oligopéptidos u oligómeros, como a cadenas más
largas, denominadas generalmente proteínas. Los polipéptidos pueden
contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos codificados
por genes. Los "polipéptidos" incluyen secuencias de
aminoácidos modificadas o bien mediante procesos naturales, tales
como procesamiento tras la traducción, o mediante técnicas de
modificación química que se conocen bien en la técnica. Dichas
modificaciones se describen bien en textos básicos y en monografías
más detalladas, así como en una bibliografía de investigación
voluminosa. Pueden producirse modificaciones en cualquier sitio de
un polipéptido, incluyendo la estructura principal del péptido, las
cadenas laterales de los aminoácidos y los extremos amino o
carboxilo terminales. Se apreciará que puede estar presente el
mismo tipo de modificación en grados variables o iguales en varios
sitios de un polipéptido dado. Además, un polipéptido dado puede
contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden
estar ramificados como resultado de la ubiquitinación, y pueden ser
cíclicos, con o sin ramificaciones. Los polipéptidos cíclicos,
ramificados y ramificados cíclicos pueden resultar de procesos
naturales tras la traducción o pueden prepararse mediante
procedimientos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación,
acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión
covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión
covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente
de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de
fosfatidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlaces
disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes,
formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación,
gamma-carboxilación, glicosilación, formación de
anclaje GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación,
oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación,
racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos a
proteínas mediada por ARN de transferencia tal como arginilación, y
ubiquitinación. Véanse, por ejemplo, PROTEINS - STRUCTURE AND
MOLECULAR PROPERTIES, 2ª Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman y
Comany, Nueva York, 1993 y Wolt, F., Posttranslational Protein
Modifications: Perspectives and Prospects, págs.
1-12 en POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF
PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, 1983;
Seifter et al., "Analysis for protein modifications and
nonprotein cofactors", Meth. Enzymol. (1990) 182:
626-646 y Rattan et al., "Protein
Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging", Ann NY
Acad Sci (1992) 663: 48-62.
El término "Polinucleótido" se refiere
generalmente a cualquier polirribonucleótido o
polidesoxirribonucleótido, que puede ser ADN o ARN no modificado o
ADN o ARN modificado. Los "polinucleótidos" incluyen, sin
limitación, ADN mono y bicatenario, ADN que es una mezcla de
regiones mono y bicatenarias, ARN mono y bicatenario y ARN que es
una mezcla de regiones mono y bicatenarias, moléculas híbridas que
comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarias o, más
normalmente, bicatenarias o una mezcla de regiones mono y
bicatenarias. Asimismo, el término "polinucleótido" se refiere
a regiones tricatenarias que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como
ADN. El término "polinucleótido" incluye también ADN o ARN que
contienen una o más bases modificadas y ADN o ARN con estructuras
principales modificadas por motivos de estabilidad o por otros
motivos. Las bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases
tritiladas y bases inusuales tales como inosina. Se ha realizado una
variedad de modificaciones al ADN y al ARN; por tanto, el término
"polinucleótido" abarca formas modificadas química, enzimática
o metabólicamente de polinucleótidos tal como se encuentran
normalmente en la naturaleza, así como las formas químicas de ADN y
ARN características de virus y células. "Polinucleótido"
también abarca polinucleótidos relativamente cortos, denominados a
menudo oligonucleótidos.
El término "Variante" tal como se utiliza
el término en la presente memoria es un polinucleótido o polipéptido
que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia
respectivamente, pero que conserva propiedades esenciales. Una
variante típica de un polinucleótido difiere en la secuencia de
nucleótidos con respecto a otro polinucleótido de referencia. Los
cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden alterar
o no la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por
el polinucleótido de referencia. Los cambios de nucleótidos pueden
dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y
truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la
secuencia de referencia, tal como se trata más adelante. Una
variante típica de un polipéptido difiere en la secuencia de
aminoácidos con respecto a otro polipéptido de referencia.
Generalmente, las diferencias son limitadas, de modo que las
secuencias del polipéptido de referencia y la variante son
estrechamente similares globalmente y, en muchas regiones,
idénticas. Un polipéptido variante y de referencia pueden diferir
en la secuencia de aminoácidos mediante una o más sustituciones
(preferentemente conservativas), adiciones y deleciones en
cualquier combinación. Un residuo de aminoácido sustituido o
insertado puede ser o no uno codificado por el código genético. Una
variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser una que se
produce de manera natural tal como una variante alélica, o puede ser
una variante que no se sabe que se produzca de manera natural.
Pueden prepararse variantes de polinucleótidos y polipéptidos que
no se producen de manera natural mediante técnicas de mutagénesis o
mediante síntesis directa. Las variantes deben conservar una o más
de las actividades biológicas del polipéptido de referencia. Por
ejemplo, deben presentar actividades antigénicas o inmunogénicas
similares al polipéptido de referencia. Puede someterse a prueba la
antigenicidad utilizando experimentos de inmunotransferencia
convencionales, utilizando preferentemente sueros policlonales
frente al polipéptido de referencia. Puede someterse a prueba la
inmunogenicidad midiendo las respuestas de anticuerpos (utilizando
sueros policlonales generados frente al polipéptido variante) frente
al polipéptido de referencia purificado en una prueba de ELISA
convencional. Preferentemente, una variante conservaría todas las
actividades biológicas anteriores.
El término "Identidad" es una medida de la
identidad de secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos.
En general, las secuencias se alinean de modo que se obtiene el
apareamiento de orden más alto. La "identidad" per se
presenta un significado reconocido en la técnica y puede calcularse
utilizando técnicas publicadas. Véanse, por ejemplo: (COMPUTATIONAL
MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva
York, 1988; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith,
D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF
SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds, Humana
Press, Nueva Jersey, 1994; SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY,
von Heijne, G., Academic Press, 1987; y SEQUENCE ANALYSIS PRIMER,
Gribskov, M. y Devereux, J., eds, M Stockton Press, Nueva York,
1991). Aunque existen varios procedimientos para medir la identidad
entre dos secuencias de polinucleótido o polipéptido, el término
"identidad" lo conocen bien los expertos en la materia
(Carillo, H., y Lipton, D., SIAM J Applied Math (1998) 48: 1073).
Los procedimientos empleados comúnmente para determinar la
identidad o similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se
limitan a los dados a conocer en Guide to Huge Computers, Martin J.
Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, y Carillo, H., y
Lipton, D., SIAM J Applied Math (1988) 48: 1073. Los procedimientos
para determinar la identidad y la similitud están codificados en
programas de ordenador. Los procedimientos de programa de ordenador
preferidos para determinar la identidad y la similitud entre dos
secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas
GCG (Devereux, J., et al., J Molec Biol (1990) 215: 403). Lo
más preferentemente, el programa utilizado para determinar los
niveles de identidad fue el programa GAP, tal como se utilizó en los
ejemplos más adelante en la presente memoria.
A título ilustrativo, mediante un polinucleótido
que presenta una secuencia de nucleótidos que presenta al menos,
por ejemplo, el 95% de "identidad" con respecto a una secuencia
de nucleótidos de referencia se pretende que la secuencia de
nucleótidos del polinucleótido sea idéntica a la secuencia de
referencia excepto porque la secuencia de polinucleótido puede
incluir un promedio de hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100
nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras
palabras, para obtener un polinucleótido que presenta una secuencia
de nucleótidos al menos el 95% idéntica a una secuencia de
nucleótidos de referencia, puede delecionarse o sustituirse por
otro nucleótido hasta el 5% de los nucleótidos en la secuencia de
referencia, o puede insertarse en la secuencia de referencia un
número de nucleótidos de hasta el 5% de los nucleótidos totales en
la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de
referencia pueden producirse en las posiciones terminales en 5' o
en 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier
sitio entre esas posiciones terminales, intercaladas o bien
individualmente entre nucleótidos en la secuencia de referencia o
bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de
referencia.
Asimismo, se incluyen en la presente invención
fragmentos de polipéptidos de glándulas salivales de I.
ricinus. Un fragmento es un polipéptido que presenta una
secuencia de aminoácidos que es igual a una parte, pero no a toda,
de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de glándulas
salivales de I. ricinus mencionados anteriormente. Como con
el polipéptido de glándulas salivales de I. ricinus, el
fragmento puede estar "aislado" o comprendido dentro de un
polipéptido mayor del que forma una parte o región, lo más
preferentemente como una región continua única. Los ejemplos
representativos de fragmentos de polipéptido de la invención
incluyen, por ejemplo, fragmentos desde aproximadamente el
aminoácido número 1-20, 21-40,
41-60, 61-80, 81-100
y 101 hasta el extremo del polipéptido. En este contexto,
"aproximadamente" incluye los intervalos mencionados
particularmente mayores o menores en varios, 5, 4, 3, 2 ó 1
aminoácidos en cualquier extremo o en ambos extremos.
Los fragmentos preferidos incluyen, por ejemplo,
polipéptidos truncados que presentan la secuencia de aminoácidos de
los polipéptidos de glándulas salivales de I. ricinus,
excepto por la deleción de una serie continua de residuos que
incluye el extremo amino terminal, o una serie continua de residuos
que incluye el extremo carboxilo terminal y/o la región
transmembrana o la deleción de dos series continuas de residuos, una
que incluye el extremo amino terminal y una que incluye el extremo
carboxilo terminal. También se prefieren fragmentos caracterizados
por atributos estructurales o funcionales tales como fragmentos que
comprenden alfa-hélice y regiones que forman
alfa-hélice, lámina beta y regiones que forman
lámina beta, giros y regiones que forman giros, espirales y
regiones que forman espirales, regiones hidrófilas, regiones
hidrófobas, regiones anfipáticas alfa, regiones anfipáticas beta,
regiones flexibles, regiones que forman superficies, regiones de
unión a sustrato y regiones de alto índice antigénico. Otros
fragmentos preferidos son fragmentos biológicamente activos.
Fragmentos biológicamente activos son aquéllos que median la
actividad de la proteína de glándulas salivales de I.
ricinus, incluyendo aquéllos con una actividad similar o una
actividad mejorada, o con una disminución de la actividad no
deseable. También se incluyen aquéllos que son antigénicos o
inmunogénicos en un animal o en un ser humano.
Por una molécula anticomplemento se quiere
decir: un compuesto que puede interaccionar con uno de los
componentes del sistema del complemento y bloquear sus propiedades
biológicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las figuras 1 y 2 representan las secuencias de
nucleótidos y aminoácidos de las secuencias de IRAC1 e IRAC2.
La figura 3 representa células
COS-7 transfectadas mediante el vector pcDNA3.1 -
IRAC 2HA (revelado del marcador de HA mediante marcaje
inmunofluorescente indirecto).
Las figuras 4 y 5 representan el perfil de
expresión de los polipéptidos según la invención en las células de
mamífero tras su clonación del ORF.
Las figuras 6 y 7 representan la capacidad
anticomplemento del sobrenadante de células transfectadas mediante
una construcción que expresa los polipéptidos según la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se extrajeron ARNm de las glándulas salivales de
garrapatas hembra. Tras la alimentación con sangre, se purificaron
los ARNm con oligo-dT-celulosa (kit
Fasttrack 2.0 de Invitrogen, Inc.). Se realizó una transcripción
inversa con un cebador de oligodT.
Se realizaron reacciones de PCR con los
siguientes cebadores directos:
5'-acagcactgaggtttcagag-3' y
5'-cagagcaagggtctaccagcc-3' y un
cebador inverso de oligo-dT.
Se clonaron los productos de la PCR en el vector
pGEM-TEasy o pGEM-T (Promega) y se
secuenciaron los insertos. Este enfoque permite la recuperación de
dos secuencias consenso que codifican para proteínas homólogas.
Estas proteínas se identifican más adelante en la presente memoria
como IRAC 1 e IRAC 2 para "proteínas anticomplemento de Ixodes
ricinus" 1 y 2 respectivamente. En la tabla 1 siguiente se
presenta un porcentaje de identidad de dicha secuencia de
nucleótidos y proteína de IRAC 1 e IRAC 2.
Se lograron la clonación y expresión de los ADNc
aislados para IRAC 1 y 2 mediante transfección en células
eucariotas. Se insertaron ADN correspondientes en el vector pcDNA
3.1. Se prepararon tres construcciones (para cada ADNc) con el fin
de obtener una versión no marcada de las proteínas correspondientes,
así como dos versiones marcadas en el extremo
C-terminal adicionales de las proteínas (HA o
6xHis). La transfección de células COS-7 con dichas
construcciones ha permitido una alta expresión de las proteínas
marcadas identificadas mediante inmunomarcaje indirecto (véase al
figura 1, una célula que expresa la proteína IRAC 2 marcada con
HA).
Dado que es posible que la expresión de
proteínas IRAC sea tóxica para las células transfectadas, se propuso
obtener la producción condicional de proteínas IRAC 1 e IRAC 2 en
una línea celular (sistema T-Rex de Invitrogen),
tras inducción mediante la adición de tetraciclina. Se prepararon
cuatro construcciones genéticas utilizando el vector pcDNA4/TO y
pcDNA4/TO/myc-His que permiten la producción de
proteínas nativas y marcadas (6xHis).
Se transfectaron estas construcciones en células
T-Rex-Hela (Invitrogen) y se
seleccionaron líneas celulares estables con zeocina.
A continuación, se purificaron las proteínas
marcadas mediante cromatografía de afinidad sobre columnas de
Ni-quelato. Se utilizaron después dichas proteínas
para la inmunización de animales con el fin de producir anticuerpos
monoclonales y sueros policlonales dirigidos frente a dichas
proteínas IRAC 1 e IRAC 2. Estos anticuerpos permiten la
caracterización bioquímica de dichas proteínas, así como la
identificación de la distribución celular y tisular de dichas
proteínas.
Se utilizaron tales anticuerpos en la
transferencia de inmunidad pasiva experimental y se estudiaron
después para determinar la capacidad de inhibir la alimentación con
sangre de las garrapatas y/o la transmisión de agentes patógenos
(virus, bacterias, protozoos) a un huésped mamífero.
Se sometieron a prueba asimismo las proteínas
según la invención con el fin de comprobar su propiedad de unión a
la superficie de Borrelia burgdorferi y por tanto pueden
conferir la resistencia de dichas bacterias frente a los efectos
perjudiciales del complemento producidos por el huésped.
Este fenómeno se ha observado ya con el factor H
que se une a la proteína de superficie OspE de Borrelia
burgdorferi (Hellwage et al., J. Biol. Chem., vol. 276,
págs. 8427-8435 (2001)).
\vskip1.000000\baselineskip
Se expresaron con éxito los polipéptidos IRAC 1
e IRAC 2 en células de mamífero clonando el marco de lectura
abierto completo (ORF) de dichos polipéptidos (figura 3).
Se purificaron las proteínas de fusión mediante
cromatografía de afinidad y se consistían en el polipéptido de tipo
natural combinado con una cola de His en el extremo
C-terminal.
Se utilizaron dichas proteínas purificadas como
antígenos para una inmunización de ratones.
El análisis de sueros tras dos inmunizaciones
demuestra que dichas proteínas son inmunogénicas. El análisis de
dichos sueros sobre una célula transfectada con construcciones que
codifican para los polipéptidos de tipo natural según la invención
ha demostrado que los anticuerpos producidos reconocen dichos
polipéptidos específicos (proteínas IRAC 1 y/o IRAC 2) (figura
4).
Además, el análisis en microscopía confocal de
células transfectadas que expresan dichos polipéptidos muestra una
alta expresión de dichas proteínas que se presentan en el sistema de
síntesis y excreción de proteínas (figura 5). Este resultado
demuestra que los polipéptidos IRAC 1 e IRAC 2 pueden producirse en
sus formas de tipo natural o marcadas y que son inmunogénicas. Por
tanto, pueden utilizarse para la producción de una vacuna
anti-garrapatas o en una vacuna para inhibir la
transmisión de agentes patógenos por garrapatas.
Se someten a prueba los polipéptidos según la
invención para determinar su actividad anticomplemento. Se sometió
a prueba el sobrenadante de células transfectadas con la
construcción que expresa las proteínas IRAC 1 e IRAC 2 de tipo
natural según el procedimiento AH50 (Current Protocols in Immunology
editado por J.E. Coligan et al., National Institute of
Health (1992)).
Se ha utilizado como control negativo
sobrenadante de células transfectadas con un vector de expresión sin
inserto. Las figuras 6 y 7 muestran que los dos polipéptidos según
la invención pueden inhibir la actividad del complemento. El
polipéptido IRAC 2 parece presentar una capacidad de inhibición
superior que IRAC 1 y la figura 7 muestra que puede obtenerse un
efecto sinérgico de estos dos polipéptidos.
Se seleccionaron garrapatas hembra tras cuatro
días de alimentación con sangre. Se recuperaron las glándulas
salivales de dichas garrapatas hembra y se congelaron después antes
de someterse a una detección inmunofluorescente mediante los sueros
descritos anteriormente. Dicha experiencia demuestra que los
polipéptidos según la invención (IRAC 1 e IRAC 2) se sintetizaron
en elevadas concentraciones en las glándulas salivales de garrapatas
tras la alimentación con sangre.
<110> HENOGEN S.A.
\hskip1cmDaix, Virgine
\hskip1cmGodfroid, Edmond
\hskip1cmPastoret, Paul-Pierre
\hskip1cmBollen, Alex
\hskip1cmVanderplassche, Alain
\vskip0.400000\baselineskip
<120> POLIPÉPTIDOS ANTICOMPLEMENTO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P.HENO.02/WO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/BE02/00108
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 2002606627
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patente en versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 555
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ixodes ricinus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(555)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 184
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ioxides ricinus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip0,5cm3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 537
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ioxides ricinus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(537)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 178
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ixodes ricinus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip0,5cm 6
\hskip0,5cm 7
Claims (14)
1. Polipéptido anticomplemento que presenta más
del 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEC ID nº
2.
2. Polipéptido anticomplemento según la
reivindicación 1, que presenta más del 90% de identidad con la
secuencia de aminoácidos SEC ID nº 2.
3. Polipéptido anticomplemento según la
reivindicación 1 ó 2, que presenta más del 95% de identidad con la
secuencia de aminoácidos SEC ID nº 2.
4. Polipéptido anticomplemento según cualquiera
de las reivindicaciones anteriores 1 a 3, que presenta más del
98-99% de identidad con la secuencia de aminoácidos
SEC ID nº 2.
5. Polipéptido anticomplemento según cualquiera
de las reivindicaciones anteriores 1 a 4, que presenta la secuencia
de aminoácidos SEC ID nº 2.
6. Polinucleótido que codifica el polipéptido
anticomplemento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores
1 a 5.
7. Vector que comprende el polipéptido
anticomplemento o el polinucleótido según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 6.
8. Célula transfectada o que comprende el vector
según la reivindicación 7.
9. Anticuerpo o una parte hipervariable activa
del mismo dirigido contra el polipéptido o el polinucleótido según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 6.
10. Célula de hibridoma que expresa el
anticuerpo o su parte activa según la reivindicación 9.
11. Composición farmacéutica que comprende un
vehículo farmacéutico adecuado y un elemento seleccionado de entre
el grupo constituido por el polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 5, el polinucleótido según la
reivindicación 6, el vector según la reivindicación 7, la célula
según la reivindicación 8 y/o el anticuerpo según la reivindicación
9.
12. Utilización de la composición farmacéutica
según la reivindicación 11, para la preparación de un medicamento
en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades inducidas por
una garrapata o agentes patógenos transmitidos por garrapatas,
especialmente pero no sólo Ixodes ricinus.
13. Utilización de la composición farmacéutica
según la reivindicación 11, para la preparación de un medicamento
en el tratamiento y/o la prevención de inflamaciones o enfermedades
cardiacas relacionadas.
14. Utilización de la composición farmacéutica
según la reivindicación 12, para la preparación de un medicamento
en el tratamiento y/o la prevención de inflamaciones o enfermedades
cardiacas relacionadas.
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-
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