ES2459192T3 - Introducción selectiva de genes para la vacunación con células dendríticas - Google Patents

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ES2459192T3 ES12158282.9T ES12158282T ES2459192T3 ES 2459192 T3 ES2459192 T3 ES 2459192T3 ES 12158282 T ES12158282 T ES 12158282T ES 2459192 T3 ES2459192 T3 ES 2459192T3
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Abstract

Procedimiento para preparar un virus recombinante que comprende un gen de interés, en donde dicho método comprende a) proporcionar una línea celular de empaquetamiento que está transfectada con un vector retrovírico que comprende un polinucleótido que comprende un gen de interés, y un vector que comprende un gen que codifica una molécula orientadora; en donde dicha molécula orientadora comprende una glucoproteína de alfavirus que reconoce selectiva y específicamente la DC-SIGN (proteína no-integrina fijadora de ICAM-3 [moléculas de adhesión intracelular de tipo 3] específica de las células dendríticas); en donde dicha glucoproteína es una glucoproteína E2 de alfavirus que está mutada en un sitio de fijación a sulfato de heparano para disminuir o eliminar su capacidad de fijación al sulfato de heparano, b) cultivar la línea celular de empaquetamiento; y c) recuperar el virus recombinante de la línea celular de empaquetamiento.

Description

Introducción selectiva de genes para la vacunación con células dendríticas
Antecedentes de invención
La invención se refiere de forma general a la introducción selectiva de genes, y más en particular, al uso de un virus 5 recombinante que comprende una molécula orientadora que se dirige selectivamente a las células dendríticas y se fija a ellas, y puede, por lo tanto, utilizarse para vacunación con células dendríticas.
La inmunización es una de las herramientas más productivas en la práctica médica moderna, pero permanece plagada de limitaciones. Algunas enfermedades infecciosas, tales como el VIH/sida, la malaria y la tuberculosis, siguen sin poderse controlar del todo mediante inmunización, mientras que otras enfermedades infecciosas están 10 controladas por pautas complejas de inmunización. El cáncer es una diana prometedora para los tratamientos inmunoterápicos, pero los resultados clínicos en los ensayos experimentales han sido desalentadores (Rosenberg, S.
A. et al, 2004, Nat. Med. 10: 909-915). Se necesitan nuevos procedimientos de inmunización, por ejemplo, para inducir de forma fiable la inmunidad antitumoral.
Las células dendríticas (CD) desempeñan funciones críticas en la inmunidad innata y en la adaptativa. Las CD son
15 células presentadoras de antígeno especializadas con la única capacidad de capturar y procesar los antígenos, migrar desde la periferia hacia un órgano linfático y presentar los antígenos a los linfocitos T en reposo de una manera restringida por el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) (Banchereau, J. & Steinman, R. M. 1998. Nature 392: 245-252; Steinman, R. M. et al., 2003. Ann. Rev. Immunol. 21: 685-711). Estas células proceden de la médula ósea (MO) y se caracterizan por la forma dendrítica y su gran movilidad. Las CD inmaduras son duchas en
20 la ingestión de antígenos y se distribuyen a modo de centinelas por los tejidos periféricos de todo el cuerpo. Sin embargo, es necesario que las CD maduren para montar una respuesta inmunitaria eficaz (Steinman, R. M. et al. 2003. véase más arriba). Las CD maduras expresan una gran cantidad del complejo CMH-antígeno y otras moléculas coestimuladoras (tales como CD40, B7-1, B7-2 y CD1a) (Steinman, R. M., 1991. Ann. Rev. Immunol. 9: 271-296; Banchereau, J. y R. M. Steinman, 1998, véase más arriba). Estas moléculas desempeñan funciones
25 importantes a la hora de estimular los linfocitos T.
El descubrimiento de que las CD funcionan como células presentadoras de antígeno (CPA) especializadas ha impulsado la investigación sobre la inmunización/vacunación basada en las CD que implican cargar las CD con antígenos específicos (Banchereau, J. y Palucka, A. K. 2005. Nat. Rev. Immunol. 5: 296-306; Figdor, C. G. et al. 2004, Nat. Med. 10: 475-480). Sin embargo, todos estos estudios implican hay que cargar ex vivo las CD con los
30 antígenos específicos. A continuación, las CD generadas ex vivo se administran al paciente. La generación ex vivo de las CD para cada paciente es un procedimiento muy laborioso.
En comparación, la presente invención se refiere, entre otros, al reconocimiento selectivo, la carga de antígenos y la activación de las CD in vivo, lo que da lugar al tratamiento in vivo de enfermedades mediante la generación de una respuesta inmunitaria beneficiosa en el paciente. Así pues, la invención satisface una antigua necesidad de
35 tratamientos eficaces y efectivos para la inmunización/vacunación.
Compendio de la invención
La invención da a conocer un procedimiento para preparar un virus recombinante que comprende un gen de interés, en donde dicho procedimiento comprende: a) dar a conocer una línea de células de empaquetamiento que se transfecta con un vector retrovírico que comprende un polinucleótido que comprende un gen de interés, y un vector 40 que comprende un gen que codifica una molécula orientadora; en donde dicha molécula orientadora comprende una glucoproteína de alfavirus que se dirige específicamente a la la DC-SIGN (proteína no-integrina fijadora de ICAM-3 [moléculas de adhesión intracelular de tipo 3] específica de las células dendríticas), en donde el virus recombinante comprende una glucoproteína de alfavirus que reconoce selectivamente dicha célula que expresa la DC-SIGN, en donde dicha glucoproteína es una glucoproteína E2 de alfavirus que está mutada en un sitio de fijación del sulfato de
45 heparano para disminuir o eliminar su fijación al sulfato de heparano, b) cultivar la línea de células de empaquetamiento; y c) recuperar el virus recombinante del cultivo de células de empaquetamiento.
El algunos aspectos de la invención, el vector retrovírico puede ser un vector lentivírico, opcionalmente un vector lentívirico que comprende las secuencias de un genoma del virus de la leucemia murina (VLM) o de un genoma del VIH.
50 En algunos aspectos la glucoproteína E2 de alfavirus es una glucoproteína del virus de Sindbis. En algunos aspectos, el virus comprende una proteína E1 del Sindbis y una proteína E2 del Sindbis que actúa selectivamente de forma específica sobre la DC-SIGN.
La invención se define adicionalmente en las reivindicaciones que la acompañan.
En algunas realizaciones, la molécula orientadora es SINmu, también conocida como SVGmu (SEQ ID n.º 11).
En algunas realizaciones, el polinucleótido a introducir a una célula dendrítica comprende al menos uno de lo siguiente: un gen que codifica una proteína de interés, un gen que codifica un siRNA, y un gen que codifica un microRNA. El gen que codifica una proteína de interés puede codificar un antígeno, tal como un antígeno tumoral o
5 un antígeno del VIH.
El virus recombinante se puede producir mediante la transfección de una línea celular de empaquetamiento con un vector vírico que comprende el polinucleótido a introducir y un vector que comprende un gen que codifica la molécula orientadora; el cultivo de la línea celular de empaquetamiento; y la recuperación del virus recombinante a partir del cultivo de las células de empaquetamiento. En algunas realizaciones, la línea celular de empaquetamiento
10 es una línea celular 293.
El virus recombinante preparado mediante el presente procedimiento se puede utilizar para introducir un polinucleótido in vitro en una célula dendrítica, o in vivo en una célula dendrítica de un sujeto. El sujeto es típicamente un mamífero, tal como un humano, un ratón o un conejillo de Indias.
La descripción da a conocer un virus recombinante que comprende: un polinucleótido de interés; y una molécula
15 orientadora que se fija a la DC-SIGN. La molécula orientadora se fija específicamente a la DC-SIGN. El virus recombinante puede comprender secuencias de un genoma de lentivirus, tales como secuencias de un genoma de VIH. En otras realizaciones, el virus recombinante comprende secuencias de un genoma de gammarretrovirus, tales como secuencias de un genoma del virus de las células madre de ratón (VCMR) o un genoma del virus de la leucemia murina (VLM).
20 La molécula orientadora puede comprender una glucoproteína vírica procedente de al menos un virus seleccionado del grupo de: virus de Sindbis, virus de la selva de Semliki, virus del río Ross y virus de Aura. En algunas realizaciones, la molécula orientadora es una glucoproteína vírica procedente del virus de Sindbis. En realizaciones particulares, la molécula orientadora es la SVGmu (SEQ ID n.º 11).
El polinucléotido puede ser, por ejemplo, al menos uno de lo siguiente: un gen que codifica una proteína de interés,
25 un gen que codifica un siRNA, y un gen que codifica un microRNA de interés. En algunas realizaciones, el polinucléotido codifica un antígeno, tal como un antígeno tumoral o un antígeno del VIH.
La descripción da a conocer procedimientos para estimular una respuesta inmunitaria de un mamífero. Un polinucleótido que codifica un antígeno contra el cual se desea una respuesta inmunitaria se introduce en las células dendríticas que expresan la DC-SIGN al poner en contacto las células dendríticas con un virus recombinante que
30 comprende el polinucleótido y una molécula orientadora que se fija a la DC-SIGN. En algunas realizaciones, la molécula orientadora es específica de la DC-SIGN y no se fija apreciativamente a otras moléculas. En otras realizaciones, la molécula orientadora se fija preferiblemente a la DC-SIGN.
La descripción da a conocer vectores que codifican moléculas orientadoras que se fijan a la DC-SIGN. En algunas realizaciones, la molécula orientadora es una glucoproteína vírica modificada. En otras realizaciones, la molécula
35 orientadora es la SVGmu (SEQ ID n.º 11). La molécula orientadora se fija específicamente a la DC-SIGN en algunas realizaciones. El vector puede adicionalmente codificar uno o más genes de interés, tal como un gen que codifica un antígeno y/o un gen que codifica un factor de maduración de las células dendríticas.
La descripción da a conocer procedimientos de tratamiento de un paciente con una enfermedad. Al paciente se le administra un virus recombinante, en donde el virus recombinante comprende un polinucleótido que codifica un
40 antígeno relacionado con la enfermedad y una molécula orientadora que se fija a la DC-SIGN. La molécula orientadora puede proceder de una glucoproteína vírica. En algunas realizaciones, la molécula orientadora es la SVGmu (SEQ ID n.º 11).
La enfermedad a tratar es por lo general una para la cual se conoce o se puede identificar un antígeno. En algunas realizaciones de la invención, la enfermedad a tratar es cáncer. En otras realizaciones, la enfermedad es VIH/sida.
45 También se dan a conocer las células dendríticas transducidas con un virus recombinante, en donde el virus recombinante comprende un polinucleótido de interés y una molécula orientadora que se fija a la DC-SIGN. En algunas realizaciones, la molécula orientadora comprende una glucoproteína vírica procedente de al menos un virus seleccionado del grupo de: virus de Sindbis, virus de la selva de Semliki, virus del río Ross, virus de Aura. En algunas realizaciones, la molécula orientadora es la SVGmu (SEQ ID n.º 11).
50 La descripción da a conocer procedimientos para la inmunización de un mamífero mediante la introducción de un polinucleótido, que codifica un antígeno, en las células dendríticas que expresan la DC-SIGN en la cual las células dendríticas se ponen en contacto con un virus recombinante que comprende un polinucleótido que codifica un antígeno y una molécula orientadora que se fija a la DC-SIGN. En algunas realizaciones, las células dendríticas se ponen en contacto ex vivo con el virus recombinante. En otras realizaciones, las células dendríticas se ponen en contacto in vivo con el virus recombinante.
Los procedimientos descritos en la presente memoria también pueden utilizarse para estimular una respuesta inmunitaria contra un antígeno específico en un mamífero mediante la introducción de un vector retrovírico que codifica el antígeno en las células dendríticas mediante un virus recombinante que comprende el polinucleótido y
5 una molécula orientadora que se fija a la DC-SIGN. La respuesta inmunitaria se puede modular mediante la dotación de otro polinucleótido más cuya expresión en la célula dendrítica modula la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, se puede introducir un polinucleótido que codifica un factor de maduración de las células dendríticas.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una representación esquemática de una estrategia general para dirigirse selectivamente a las células
10 dendríticas (CD) para la introducción de antígenos. La glucoproteína de tipo silvestre del virus de Sindbis está mutada en el sitio de fijación del sulfato de heparano para destruir su capacidad de fijación. La glucoproteína mutante que se obtiene (SVGmu) se fija a la DC-SIGN, pero no se fija al sulfato de heparano. DC-SIGN: no-integrina fijadora de ICAM-3 [moléculas de adhesión intracelular de tipo 3] específica de las células dendríticas.
La figura 2 ilustra imágenes de microscopia láser confocal de partículas de virus recogidas de células productoras
15 del virus transfectadas transitoriamente con vector lentivírico, plásmidos que codifican GFP-vpr y SVGmu, y otras construcciones de empaquetamiento necesarias. Las partículas del virus están marcadas con GFP (verde). La incorporación de SVGmu en la superficie se detectó mediante inmunotinción con un anticuerpo contra la etiqueta HA (rojo) que marca la SVGmu. En el portaobjetos «GFP», las partículas víricas marcadas con GFP son verdes. En el portaobjetos «SVGmu», las partículas víricas que han incorporado la SVGmu en la superficie se tiñen de rojo. En el
20 portaobjetos «Combinación», las partículas víricas donde sólo se expresa la GFP son verdes, las partículas víricas donde sólo se incorpora la SVGmu en la superficie son rojas y las partículas víricas que expresan la GFP y que contienen la SVGmu son amarillas. La superposición de los colores verde y rojo (amarillo) señala las partículas víricas que contienen SVGmu, y representan la mayor parte de las partículas de virus. La barra de escala representa 2 μm.
25 La figura 3A muestra el análisis por citometría de flujo de líneas construidas de células diana 293T.hDCSIGN que expresan la DC-SIGN humana, y 293T.mDCSIGN que expresan DC-SIGN murina. Línea continua: expresión de la DC-SIGN en las líneas de células diana; área sombreada: tinción de fondo de las células 293T.
La figura 3B muestra los resultados de la citometría de flujo para la detección de la GFP expresada en las células 293T transducidas con el lentivector envuelto con la glucoproteína de Sindbis de tipo silvestre (FUGW/SVG) o la 30 glucoproteína de Sindbis mutante (FUGW/SVGmu). Se utilizó 1 ml de los sobrenadantes víricos recién obtenidos de FUGW/SVG y FUGW/SVGmu para transducir las células 293T (2 x 105) que expresan la DC-SIGN humana (293T.hDCSIGN) o la DC-SIGN murina (293T.mDCSIGN). Las células 293T originales que no expresan la DC-SIGN se incluyeron como control. Tal y como se puede observar, el lentivector envuelto con la glucoproteína mutante del virus de Sindbis (SVGmu) es capaz de transducirse específicamente en las células 293T que expresan la DC-SIGN
35 de humano o de ratón. El título de la transducción específica de FUGW/SVGmu se estimó que era aproximadamente 1 x 106 UT/ml para 293T.hDC-SIGN y aproximadamente 0,8 x 106 UT/ml para 293T.mDC-SIGN.
La figura 4A muestra los resultados de citometría de flujo que ilustran la capacidad que tiene el lentivirus FUGW envuelto con la glucoproteína de Sindbis mutante(FUGW/SVGmu) a la hora de transducir específicamente las células dendríticas de ratón que expresan la DC-SIGN en un cultivo primario mixto de médula ósea. Las células de
40 la médula ósea completa aisladas de los ratones B6 se expusieron al sobrenadante vírico recién preparado de FUGW/SVGmu. El lentivector FUGW seudotipado con la glucoproteína ecótropa (FUGW/Eco) se incluyó a modo de control sin capacidad orientadora. Los antígenos de superficie de las células que expresan GFP se valoraron mediante tinción con los anticuerpos anti-CD11c y anti-DC-SIGN.
La figura 4B muestra los resultados de citometría de flujo que indican que el lentivirus FUGW envuelto con la
45 glucoproteína mutante de Sindbis (FUGW/SVGmu) no se transduce en otros tipos de células, entre ellos los linfocitos T primarios (CD3+, panel superior) y los linfocitos B (CD19+, panel inferior). Los linfocitos T CD3+ primarios y los linfocitos B CD19+ se aislaron de bazo de ratón y se transdujeron con el sobrenadante vírico recién preparado del vector con reconocimiento selectivo FUGW/SVGmu o del vector sin reconocimiento selectivo FUGW/Eco. La expresión de la GFP se analizó por citometría de flujo. Línea continua: células expuestas al vector lentivírico
50 indicado; área sombreada: células sin transducción (a modo de control negativo).
La figura 5 muestra los resultados de citometría de flujo que ilustran la capacidad que tiene el lentivirus FUGW envuelto con la glucoproteína mutante de Sindbis (FUGW/SVGmu) para transducirse específicamente en las CD procedentes de la médula ósea (CDMO). Las CDMO se generaron mediante el cultivo de células de la médula ósea recién aisladas en presencia de la citocina GM-CSF durante 6 días. A continuación, las células se transdujeron con
55 el sobrenadante vírico recién preparado del vector con reconocimiento selectivo FUGW/SVGmu, o bien del vector sin reconocimiento selectivo FUGW/Eco. La expresión de GFP y de CD11c se midió mediante citometría de flujo.
La figura 6 muestra la activación de las CDMO tras la transducción selectiva con FUGW/SVGmu. La activación de las CD se valoró con el análisis de la expresión de CD86 y de I-Ab en la superficie mediante citometría de flujo. La adición de LPS (1 μg/ml) durante una noche se utilizó como estimulador sinérgico para la activación de las CDMO transducidas. Área sombreada: sin GFP (sin transducir); línea continua: con GFP (transducidas).
5 Las figuras 7A, 7B y 7C ilustran el reconocimiento selectivo in vivo de las CD mediante el uso del lentivirus FUGW/SVGmu. A los ratones B6 se les inyectaron 50 x 106 UT de FUGW/SVGmu y se analizaron 3 días después. A modo de control se incluyeron ratones no inmunizados. En la figura 7A, las imágenes muestran el tamaño de un ganglio linfático inguinal representativo cercano al sitio de inyección en comparación con el del ganglio linfático equivalente lejano al sitio de inyección. La figura 7B ilustra el número total de células de los ganglios linfáticos
10 indicados en la figura 7A. La figura 7C ilustra el análisis representativo por citometría de flujo de las células CD11c+ de los dos ganglios linfáticos mostrados en la figura 7A. Las cifras indican la fracción de la población de CD que es GFP+.
La figura 8 da a conocer una representación esquemática del lentivector que codifica el antígeno OVA (FOVA) (arriba) y el lentivector que codifica la GFP (FUGW) como control (abajo).
15 La figura 9 ilustra la estimulación in vitro de linfocitos T OT1 CD8+ debida a las células dendríticas que están transducidas con el lentivector FOVA/SVGmu (DC/FOVA) o el lentivector FUGW/SVGmu (DC/FUGW) o mediante CDMO sin transducir y sensibilizadas con el péptido OVAp (SIINFEKL) (DC/OVAp). Los patrones de los marcadores de activación de la superficie de los linfocitos T OT1 cocultivados con CDMO se valoraron mediante tinción con anticuerpos contra CD25, CD69, CD62L y CD44. Área sombreada: linfocitos T OT1 indiferenciados recogidos de
20 animales transgénicos; línea continua: linfocitos T OT1 cocultivados con las CDMO indicadas.
La figura 10A ilustra la medición del IFN-γ mediante ELISA en los linfocitos T OT1 mezclados con diferentes diluciones de CDMO transducidas con FOVA/SVGmu (■), FUFW/SVGmu (●) o sensibilizadas con el péptido OVAp (▲) y cultivadas durante 3 días.
La figura 10B ilustra la respuesta de proliferación de los linfocitos T OT1 de la figura 10A medida mediante el ensayo 25 de incorporación de [3H]-timidina durante 12 horas.
La figura 11 ilustra la estimulación in vitro de los linfocitos T OT2 CD4+ debida a las células dendríticas que están transducidas con el lentivector FOVA/SVGmu (DC/FOVA) o FUGW/SVGmu (DC/FUGW) o mediante CDMO sin transducir y sensibilizadas con el péptido OVAp* ( ) (DC/OVAp*). Los patrones de los marcadores de activación de la superficie de los linfocitos T OT2 transgénicos cocultivados con CDMO se valoraron
30 mediante tinción con anticuerpos contra CD25, CD69, CD62L y CD44. Área sombreada: linfocitos T OT2 indiferenciados recogidos de animales transgénicos; línea continua: linfocitos T OT2 cocultivados con CDMO.
La figura 12 ilustra la medición del IFN-γ mediante ELISA en la mezcla de linfocitos T OT2 con diferentes diluciones de CDMO transducidas con FOVA/SVGmu (■), FUGW/SVGmu (●) o sensibilizadas con el péptido OVAp* (▲) y cultivadas durante 3 días.
35 La figura 13A da a conocer una representación esquemática del vector retrovírico MIG-OT1 utilizado para la modificación genética de células madre hematopoyéticas de ratón (HSC, por su nombre en inglés).
La figura 13B ilustra cómo los linfocitos T OT1 CD8+ procedentes de las HSC modificadas con MIG-OT1 en los ratones reconstituidos se identificaron mediante la coexpresión de GFP y TCR Vα2 o Vβ5. Las HSC de los ratones B6 se infectaron con MIG-OT1 seudotipado con Eco (MIG-OT1/Eco) y transferido al interior de los ratones B6
40 destinatarios irradiados. Los linfocitos T OT1 CD8+ se identificaron por citometría de flujo ocho semanas después de la transferencia.
La figura 14A ilustra la valoración de los patrones de los marcadores de activación de la superficie de los linfocitos T OT1+ GFP+ aislados del bazo de ratones inmunizados y reconstituidos. Las HSC modificadas murinas reconstituidas con MIG-OT1 se inmunizaron mediante inyección subcutánea directa de 10 x 106 UT de bien FOVA/SVGmu o bien
45 FUGW/SVGmu (como control) y se analizaron siete días después. Se llevó a cabo la detección de la tinción superficial para CD69, CD62L y CD44. Línea continua: linfocitos T OT1+ GFP+ de los ratones inmunizados con FOVA/SVGmu; línea discontinua; linfocitos T OT1+ GFP+ de los ratones inmunizados con FUGW/SVGmu de control; área sombreada: linfocitos T OT1+ GFP+ de ratones sin inmunizar.
La figura 14B ilustra el número total de linfocitos OT1 recogidos de los ganglios linfáticos (GL,□) o de bazo (BZ, ■) de 50 ratones sin inmunizar (sin inm) o de ratones inmunizados con FUGW/SVGmu o FOVA/SVGmu.
La figura 15 ilustra la estimulación in vivo de los linfocitos T específicos de antígeno y la respuesta mediante anticuerpos en los ratones de tipo silvestre tras la inyección subcutánea del lentivector FOVA/SVGmu que reconoce selectivamente las CD. Los ratones B6 se inmunizaron por vía subcutánea con 50 X 106 UT de FOVA/SVGmu o bien de FUGW/SVGmu (como control). Los ratones sin inmunizar (sin inm) se incluyeron como control negativo. Se recogieron los esplenocitos 14 días después de la inmunización y se analizaron para detectar la presencia de linfocitos T específicos de OVA mediante la medición del tetrámero H-2Kb-SIINFEKL-PE y tinción para CD44. Los porcentajes indicados son el porcentaje de los linfocitos T CD8+ totales.
5 Las figuras 16A y 16B ilustran las respuestas in vivo de los linfocitos T específicos de OVA que se observan en los ratones que reciben diferentes dosis subcutáneas de FOVA/SVGmu. Los linfocitos T específicos de OVA se identificaron mediante tinción de tetrámeros como en la figura 17. La figura 16A muestra el porcentaje medido de linfocitos T específicos de OVA tras la inmunización con 100 x 106 UT de FOVA/SVGmu. La figura 16B muestra la respuesta a la dosis que presentan los linfocitos T específicos de OVA tras la inyección de las dosis indicadas de
10 FOVA/SVGmu.
La figura 17A ilustra los patrones de los marcadores de activación de la superficie de los linfocitos T CD8+ específicos de OVA (identificados como células positivas para el tetrámero) que se aislaron de ratones inmunizados con FOVA/SVGmu a las 2 semanas de la inyección. Los marcadores de activación de superficie se valoraron mediante tinción con anticuerpos contra CD25, CD69, CD62L y CD44. Línea continua: linfocitos T CD8+ tetrámero+
15 de los ratones inmunizados con FOVA/SVGmu; área sombreada: linfocitos T CD8+ indiferenciados de los ratones sin inmunizar.
La figura 17B ilustra el título de IgG en el suero específica de OVA que hay en los ratones B6 tras la inmunización con 50 x 106 UT de FOVA/SVGmu. Se recogió suero a los 7 y 14 días de la inmunización y se les determinó el título de IgG específicas de OVA mediante ELISA con diluciones seriadas 10x, comenzando en 1:100. Los valores del
20 título se determinaron mediante la dilución más alta en la cual la densidad óptica era 2X desviaciones estándares más alta que la del suero basal en la dilución equivalente.
La figura 18 ilustra el tamaño del tumor en función del tiempo en un modelo murino E.G7 de tumor. Los ratones B6 se inmunizaron con la inyección subcutánea de 50 x 106 UT de FOVA/SVGmu (▲) o bien del vector vacío FUW/SVGmu (●). Se incluyó como control la ausencia de inmunización (■). En cada grupo se incluyeron cuatro
25 ratones. El día 14 tras la inmunización, los ratones se expusieron por vía subcutánea a 5 x 106 de, o bien células tumorales E.G7 (que expresan el antígeno OVA, panel izquierdo), o bien las células tumorales EL4 originales (que carecen del antígeno OVA, como control, panel derecho). El crecimiento tumoral se midió con un calibrador muy preciso y se muestra como el producto de los dos diámetros perpendiculares más largos (mm2).
La figura 19 ilustra la cinética del crecimiento in vivo de los tumores en un modelo murino de erradicación del tumor
30 E.G7. Una cepa albina de ratones B6 se implantó con 5 x 106 células tumorales E.G7 que expresaban de forma estable un gen basado en la luciferasa de luciérnaga (E.G7.luc) para la adquisición de imágenes. A modo de control se incluyó un ratón (#1) sin implantación de tumor. Los ratones portadores de tumores se trataron sin inmunización (#2) o con inmunización mediante la inyección de 50 x 106 UT de FOVA/SVGmu los días 3 y 10 (#3, #4) tras la exposición al tumor. La cinética del crecimiento de los tumores se observó mediante la adquisición de imágenes en
35 vivo de los animales por BLI. La unidad p/s/cm2/sr representa fotones por segundo por cm2 y estereorradián.
La figura 20 muestra la cuantificación de las señales de luminiscencia generadas por los tumores E.G7 en la figura
19. (□) para el ratón #2; (●) para el ratón #3; (▲) para el ratón #4.
La figura 21 ilustra el porcentaje de linfocitos T específicos de OVA presentes tras la inmunización con 100 x 106 UT de FOVA/SVGmu en la cepa albina de ratones B6. Los ratones B6 albinos se inmunizaron por vía subcutánea con
40 50 x 106 UT de FOVA/SVGmu. Los ratones sin inmunización (sin inm) se incluyeron como control negativo. Los esplenocitos se recogieron 14 días después de la inmunización y se analizaron para detectar la presencia de linfocitos T específicos de OVA y medirlos mediante el tetrámero H-2Kb-SIINFEKL-PE y tinción para CD44. Los porcentajes indicados corresponden al porcentaje de linfocitos T CD8+ totales.
La figura 22A da a conocer una representación esquemática de un lentivector que reconoce selectivamente las CD y
45 que codifica un gen basado en la luciferasa de luciérnaga (Luc) para la adquisición de imágenes, que se denomina Fluc/SVGmu.
La figura 22B ilustra las imágenes de bioluminiscencia de los ratones inyectados por vía subcutánea con 50 x 106 UT de, o bien el lentivector Fluc/SVGmu que reconoce selectivamente las CD (mostrado en la figura 25A), o bien el lentivector Fluc/VSVG que no es selectivo. La imagen representativa se obtuvo al cabo de 30 días de la inyección
50 con IVIS200® (Xenogen).
La figura 23 ilustra que la administración de una única dosis del lentivector recombinante FOVA/SVGmu específico de las CD puede generar linfocitos T CD8+ IFN-γ+ en los ratones B6. Los ratones B6 que no se han sometido previamente a experimentación se inmunizaron con una inyección subcutánea de 50 x 106 UT del lentivector FOVA/SVGmu, o la misma dosis de FUGW/SVGmu como control. Los ratones B6 sin inmunizar (sin inm) se 55 incluyeron como control negativo. Dos semanas después se recogieron los esplenocitos de los ratones del
experimento y se les analizó la producción de IFN-γ intracelular por citometría de flujo con o sin la reestimulación con el péptido OVAp. Los porcentajes indicados son el porcentaje de linfocitos T CD8+ IFN-γ+ del total de linfocitos T CD8+.
La figura 24 ilustra una representación esquemática de las construcciones lentivíricas para la preparación de los 5 virus recombinantes que reconocen selectivamente las CD.
La figura 25 muestra una representación esquemática de una realización de la vacunación in situ contra el VIH/sida.
Descripción detallada de la realización preferida
La ingeniería genética ha resultado ser un medio eficaz y potente para convertir las células dendríticas (CD) en células inmunitarias especiales para inducir las respuestas inmunitarias específicas de antígeno. Se hah invertido 10 muchos esfuerzos de investigación en relación con la manipulación in vitro de las CD para la vacunación/inmunización contra el cáncer, el VIH y otras enfermedades. Sin embargo, hasta ahora, no ha sido posible introducir específica y eficazmente un gen de interés, tal como un gen que codifica un antígeno, en las células dendríticas in vitro e in vivo. Los inventores han descubierto nuevos procedimientos y composiciones para el reconocimiento selectivo, eficaz y específico de las CD in vitro e in vivo. Los procedimientos y composiciones se
15 pueden utilizar para inducir respuestas inmunitarias específicas de antígeno, por ejemplo para inmunoterapia.
Las realizaciones de la invención incluyen procedimientos y composiciones para el reconocimiento selectivo de las células dendríticas (CD) mediante el uso de un virus recombinante que introduce un polinucleótido en las CD. Esto se consigue mediante el reconocimiento selectivo de la molécula DC-SIGN (no-integrina fijadora de ICAM-3 [moléculas de adhesión intracelular de tipo 3] específica de las células dendríticas; también se conoce como CD209) 20 que es específica de la superficie de las CD. La DC-SIGN es un receptor de tipo lectina de tipo C capaz de de llevar a cabo rápidamente la fijación y la endocitosis de los materiales (Geijtenbeek, T. B. et al., 2004. Annu. Rev. Inmunol.
22: 33-54). Los virus recombinantes están envueltos con una molécula orientadora de diseño que comprende una glucoproteína E2 de alfavirus en un sitio de fijación de sulfato de heparano que es específica del reconocimiento de la DC-SIGN. El polinucleótido puede incluir, pero no se limita a ellos, un gen de interés, uno o más siRNA y/o uno o
25 más microRNA. En las realizaciones preferidas, el polinucleótido codifica un antígeno. En algunas realizaciones, el virus recombinante introduce más de un gen en las CD. Por ejemplo, se podrían introducir genes que codifican dos o más antígenos. La administración de más de un gen se puede conseguir, por ejemplo, conectando los genes con un sitio interno de entrada del ribosoma (IRES, por su nombre en inglés) y/o con secuencias 2A, e impulsando la expresión mediante un único promotor/potenciador.
30 Tal y como se explica con más detalle más adelante, la invención se basa en la preparación de virus recombinantes, tales como lentivirus y gammarretrovirus, porque estos virus son capaces de incorporar en su cubierta un gran número de proteínas que se encuentran en la superficie de las células productoras del virus. Sin embargo, según se explica más adelante, se pueden utilizar otros tipos de virus y los procedimientos se codifican en consecuencia. Por lo general, una línea de células de empaquetamiento está transfectada con un vector vírico que codifica un
35 polinucleótido de interés (que típicamente codifica un antígeno), con al menos un plásmido que codifica componentes de empaquetamiento del virus (tal como gag y pol) y con una molécula orientadora que está modificada genéticamente para que se fije a las células dendríticas. La molécula orientadora está modificada genéticamente para que se fije específicamente al marcador de la superficie celular DC-SIGN de las células dendríticas. Durante la gemación del virus, la molécula orientadora, que se expresa en la membrana de las células
40 de empaquetamiento, se incorpora a la envoltura vírica. Como resultado, las partículas retrovíricas comprenden un núcleo que incluye el polinucleótido de interés y una envoltura que comprende la molécula orientadora en su superficie.
La molécula orientadora es capaz de fijarse a la DC-SIGN de una célula dendrítica, y el virus es capaz de introducir el gen de interés en la célula dendrítica. Sin desear comprometerse con la teoría, se cree que la fijación induce la 45 endocitosis, lo que mete al virus en un endosoma, desencadena la fusión de la membrana y permite que el núcleo del virus pase al citosol. Tras la transcripción inversa y la migración del producto al núcleo, el genoma del virus se integra en el genoma de la célula diana, con lo que se incorpora el polinucleótido de interés en el genoma de la célula diana. Entonces, la CD expresa el el polinucleótido de interés (que típicamente codifica un antígeno). Después, el antígeno se procesa y las CD se lo presentan a los linfocitos B y T, lo que genera una respuesta inmunitaria
50 específica del antígeno. No de necesita la vía específica que se acaba de describir siempre que la célula dendrítica sea capaz de estimular una respuesta inmunitaria específica del antígeno.
La presente invención puede utilizarse para dar a conocer composiciones para enviar in vitro e in vivo de forma selectiva y directa un gen de interés a las CD. En algunas realizaciones preferidas in vivo, el gen de interés se administra a las CD sin el cultivo in vitro de las CD. Por ejemplo, el gen de interés se puede administrar a las CD 55 mediante una administración directa del virus de reconocimiento selectivo a un sujeto vivo. El gen de interés codifica preferiblemente un antígeno contra el cual se desea estimular una respuesta inmunitaria. Los antígenos de ejemplo incluyen: antígenos específicos de tumores, antígenos asociados a tumores, antígenos específicos de tejidos,
antígenos bacterianos, antígenos víricos, antígenos de levadura, antígenos de hongos, antígenos de protozoos, antígenos de parásitos, mitógenos y similares. Otros antígenos serán evidentes para el experto en la técnica y se pueden utilizar sin demasiada experimentación.
Los procedimientos descritos en la presente memoria se pueden adaptar fácilmente para utilizar las moléculas
5 orientadoras que son específicas de las CD y que se pueden manipular para proporcionar la especificidad deseada. La molécula orientadora es una glucoproteína E2 de alfavirus, mutada en un sitio de fijación del sulfato de heparano, que se fija a la DC-SIGN de las células dendríticas y que facilita la introducción del gen de interés en las células dendríticas. Las moléculas orientadoras de ejemplo incluyen, pero sin limitarse a ellas, glucoproteínas procedentes de los siguientes virus: virus de Sindbis, virus de la selva de Semliki, virus del río Ross y virus de Aura.
10 Para modificar genéticamente la molécula orientadora y proporcionar la especificidad deseada, puede utilizarse cualquier procedimiento conocido en la técnica. Los procedimientos de ejemplo incluyen, pero sin limitarse a ellos, la modificación genética racional de proteínas y el barajado de ADN. Por lo general, para modificar genéticamente una molécula orientadora que sea específica de las CD, se proporciona una glucoproteína vírica que interacciona con un marcador de superficie específico de las células dendríticas. La glucoproteína E2 de alfavirus interacciona con la
15 DC-SIGN. La glucoproteína vírica también puede interaccionar con al menos un segundo marcador de la superficie celular tal como, por ejemplo, sulfato de heparano (SH), que se expresa en la superficie de tipos celulares diferentes a las CD. La glucoproteína vírica está modificada de tal forma que se mantiene su capacidad para interaccionar con el marcador de superficie específico de las CD mientras que tiene disminuida o eliminada su capacidad para interaccionar con el sulfato de heparano. La modificación puede ser una mutación en al menos un resto de la
20 secuencia de aminoácidos de la glucoproteína vírica. La mutación puede ser una deleción, adición o sustitución del resto, y se puede llevar a cabo mediante los procedimientos estándares conocidos en la técnica. La especificidad deseada puede confirmarse con facilidad. Por ejemplo, una vez que la glucoproteína vírica está modificada, se puede utilizar para preparar un virus recombinante mediante la contransfección con un vector vírico que contiene un gen indicador y al menos un plásmido que codifica componentes de empaquetamiento del virus en una línea celular
25 de empaquetamiento. La glucoproteína se incorpora en la envoltura vírica durante la gemación del virus. El virus puede utilizarse para transfectar una población pura de CD así como una población mixta de células que contiene las CD, y la especificidad de la transducción vírica de las CD puede confirmarse mediante el análisis de las células para detectar la expresión del gen indicador en las CD, pero en una cantidad no significativa en otros tipos de células. Si la especificidad no es suficientemente rigurosa (por ejemplo, si se observa una cantidad indeseada de
30 infección de los otros tipos de células), la glucoproteína vírica se puede modificar adicionalmente y analizarla como se describe hasta que se consigue la especificidad deseada.
Las realizaciones de la presente invención incluyen la introducción, en las CD, de activadores y/o factores de maduración de las CD junto con los antígenos. Los activadores y los factores de maduración de las CD de ejemplo incluyen, pero sin limitarse a ellos, moléculas de estimulación, citocinas, quimiocinas, anticuerpos y otros agentes
35 tales como ligandos Flt-3. Por ejemplo, los factores de maduración de las CD pueden incluir al menos uno de los siguientes: GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNFα, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando de CD40 (CD40L) y CD40 inducible por fármacos (iCD40) (Hanks, B. A., et al., 2005. Nat. Med. 11: 130-137).
Las realizaciones de la presente invención también incluyen procedimientos y composiciones relacionadas con la introducción en los pacientes del virus recombinante tal y como se describe más arriba, o de CD infectadas con el 40 virus recombinante, para estimular respuestas inmunitarias específicas del antígeno tales como, por ejemplo, respuestas de linfocitos T (respuestas inmunitarias celulares) y respuestas de linfocitos B (respuestas inmunitarias humorales). Por ejemplo, los linfocitos T CD4 activados pueden coordinar y orquestar que los linfocitos T citotóxicos CD8+ y los linfocitos B intervengan en una respuesta específica del antígeno. En las realizaciones preferidas, el virus recombinante y/o las CD infectadas con el virus recombinante se utilizan para estimular respuestas inmunitarias para
45 la prevención y el tratamiento de enfermedades tales como, pero sin limitarse a ellas, el cáncer y el sida/VIH. Cualquier enfermedad puede tratarse, con tal de que una respuesta inmunitaria contra un antígeno particular sea beneficiosa, e incluye, pero sin limitarse a ellas, enfermedad neoplásica, enfermedad infecciosa y enfermedades relacionadas con la inmunidad.
Tal y como se describe en la presente memoria, se llevaron a cabo estudios que dieron lugar al descubrimiento de
50 procedimientos y composiciones que pueden utilizarse para dirigir los virus recombinantes al interior de las CD para que proporcionen genes que codifican antígenos concretos. La modificación genética de las CD para que desencadenen respuestas inmunitarias productivas puede utilizarse para la prevención y el tratamiento de enfermedades y ofrece un procedimiento eficaz para inducir con eficacia inmunidad celular de linfocitos T, así como una fuerte producción de anticuerpos. Los procedimientos y composiciones descritos en la presente memoria
55 pueden proporcionar medios potentes para la inmunización con los antígenos deseados. Tal inmunización puede prevenir y tratar enfermedades tales como, por ejemplo, el cáncer y el sida/VIH.
Definiciones
A menos que se defina de otra manera, las terminologías técnica y científica utilizadas en la presente memoria tienen el mismo significado que suele adjudicarles el experto en la técnica al cual pertenece esta invención. Véase, p. ej., Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2.ª ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, NY 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY, 1989). En la práctica de esta invención se pueden utilizar cualquier procedimiento, dispositivo y material similares o
5 equivalentes a los descritos en la presente memoria.
Tal y como se utilizan en la presente memoria, la terminología ácido nucleico, polinucleótido y nucleótido son intercambiables y se refieren a cualquier ácido nucleico, ya sea compuestos de enlaces fosfodiéster o enlaces modificados tales como fosfotriéster, fosforamidato, siloxano, carbonato, carboximetiléster, acetamidato, carbamato, tioéter, fosforamidato puenteado, fosfonato de metileno puenteado, fosforamidato puenteado, fosforamidato
10 puenteado, fosfonato de metileno puenteado, fosforotioato, metilfosfonato, fosforoditioato, fosforotioato puenteado o enlaces sulfona, y combinaciones de tales enlaces.
La terminología ácido nucleico, polinucleótido y nucleótido también incluyen específicamente ácidos nucleicos compuestos de bases diferentes de las cinco bases que se aparecen en la biología (adenina, guanina, timina, citosina y uracilo).
15 Tal y como se utiliza en la presente memoria, se dice que una molécula de ácido nucleico está «aislada» cuando la molécula de ácido nucleico se ha separado sustancialmente de las moléculas de ácido nucleico contaminantes que codifican otros polipéptidos.
La «inmunización» se refiere a la provisión del antígeno a un hospedador. En algunas realizaciones, el antígeno se proporciona a las células presentadoras del antígeno, tal como las células dendríticas. Tal y como se describe a
20 continuación, el virus recombinante que comprende un gen que codifica un antígeno se puede dirigir selectivamente a las células dendríticas con una molécula que tiene afinidad específica por la DC-SIGN de las células dendríticas. Así pues, el antígeno para el cual se desea estimular una respuesta inmunitaria se puede introducir en las células dendríticas. Otros procedimientos de inmunización se conocen bien en la técnica.
La terminología respuesta «inmunológica» o «inmunitaria» es el desarrollo de una respuesta beneficiosa humoral
25 (mediada por anticuerpos) y/o celular (mediada por linfocitos T específicos del antígeno o sus productos de secreción) dirigida contra un péptido amiloide en un paciente destinatario. Tal respuesta puede ser una respuesta activa inducida por la administración de inmunógeno o una respuesta pasiva inducida por la administración de anticuerpos o linfocitos T sensibilizados. Se desencadena una respuesta inmunitaria celular mediante la presentación de epítopos polipeptídicos asociados a moléculas del CMH de clase I o de clase II para activar los
30 linfocitos específicos del antígeno T cooperadores CD4+ y/o T citotóxicos CD8+. La respuesta también puede implicar la activación de monocitos, macrófagos, linfocitos citolíticos naturales, basófilos, células dendríticas, astrocitos, células de microglía, eosinófilos u otros componentes de la inmunidad innata. La presencia de una respuesta inmunológica mediada por células se puede determinar mediante ensayos de proliferación (linfocitos T CD4+) o ensayos de LTC (linfocitos T citotóxicos) (Burke et al., J. Inf. Dis. 170, 1110-19 (1994)), mediante muerte
35 dependiente de antígeno (ensayo de linfocitos T citotóxicos, Tigges et al., J. Immunol. 156, 3901-3910) o mediante la secreción de citocinas. La contribución relativa de las respuestas humoral y celular al efecto protector o terapéutico que tiene un inmunógeno puede diferenciarse aislando por separado las IgG y los linfocitos T de un animal singénico inmunizado y midiendo el efecto protector o terapéutico en un segundo sujeto.
Un «agente inmunógeno» o «inmunógeno» es capaz de inducir una respuesta inmunológica contra sí mismo cuando 40 se administra a un paciente, opcionalmente con un adyuvante.
La terminología «adyuvante» se refiere a un compuesto que, cuando se administra junto a un antígeno, aumenta, refuerza y/o amplifica la respuesta inmunitaria al antígeno, pero cuando se administra solo, no genera una respuesta inmunitaria contra el antígeno. Puede administrarse un adyuvante con el virus recombinante de la invención como una única composición o puede administrarse antes, a la vez, o después de la administración del virus recombinante
45 de la invención. Los adyuvantes pueden mejorar una respuesta inmunitaria mediante varios mecanismos, entre ellos la incorporación de linfocitos, la estimulación de linfocitos B y/o T y la estimulación de macrófagos.
Los «anticuerpos» (Ac) y las «inmunoglobulinas» (Ig) son glucoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos muestran una especificidad de fijación por un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas de tipo anticuerpo que carecen de especificidad
50 antigénica. Los polipéptidos de la última clase, por ejemplo, los producen el sistema linfático en poca cantidad y los mielomas los producen en gran cantidad.
La terminología «anticuerpo» se utiliza en el sentido más amplio y abarca específicamente los anticuerpos humanos, no humanos (p. ej., murino), quiméricos y monoclonales humanizados (entre ellos los anticuerpos monoclonales completos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos), anticuerpos de 55 una sola cadena y fragmentos de anticuerpo, siempre y cuando presenten la actividad biológica deseada. Típicamente, los fragmentos compiten por la fijación específica a un antígeno con el anticuerpo intacto del cual
proceden.
La terminología «epítopo» o «determinante antigénico» se refiere a un sitio en un antígeno al cual responden los linfocitos B y/o T. Los epítopos de linfocitos B pueden estar formados por aminoácidos contiguos o aminoácidos no contiguos yuxtapuestos en la estructura terciaria de una proteína. Es típico que los epítopos formados por 5 aminoácidos contiguos se mantengan al exponerlos a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por el plegamiento terciario típicamente se pierden con el tratamiento con los disolventes desnaturalizantes. Un epítopo incluye típicamente al menos 3, y con más frecuencia, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una única conformación espacial. Los procedimientos para determinar la conformación espacial de los epítopos incluyen, por ejemplo, la cristalografía de rayos x y la resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, p. ej., 10 Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, vol. 66, Glenn. E. Morris, Ed. (1996). Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo se pueden identificar en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la fijación de otro anticuerpo a un antígeno deseado. Los linfocitos T reconocen los epítopos continuos de aproximadamente nueve aminoácidos en los linfocitos CD8 o de aproximadamente 13-15 aminoácidos en los linfocitos CD4. Los linfocitos T que reconocen el epítopo se pueden identificar por ensayos in
15 vitro que miden la proliferación dependiente del antígeno, tal y como se determina por la incorporación de 3H-timidina en los linfocitos T sensibilizados en respuesta a un epítopo (véase Burke, véase más arriba; Tigges, véase más arriba).
Las «células diana» son toda célula en la que se desea introducir un polinucleótido o expresar un gen de interés. Preferiblemente, las células diana son células dendríticas, en particular células dendríticas que expresan la DC
20 SIGN.
La terminología «mamífero» se define como un individuo que pertenece a la clase de Mammalia e incluye, sin limitación, humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, para deporte y mascotas, tales como ovejas, perros, caballos, gatos y vacas.
La terminología «sujeto» o «paciente» incluye sujetos humanos y otros mamíferos que reciben un tratamiento o bien 25 preventivo o bien terapéutico.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, «tratamiento» es una intervención clínica que puede ser terapéutica o preventiva. En las aplicaciones terapéuticas, a un paciente que se sospecha que tiene, o que ya padece, una tal enfermedad se le administran las composiciones farmacéuticas o medicamentos en una cantidad suficiente para curar, o al menos detener parcialmente, los síntomas de la enfermedad y sus complicaciones. En las aplicaciones 30 preventivas, las composiciones farmacéuticas o medicamentos se administran a un paciente sensible a, o que si no corre el riesgo de padecer, una enfermedad determinada en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo,
o retrasar el comienzo, de la enfermedad. Una cantidad adecuada para cumplir esto se define como una dosis terapéutica o farmacéuticamente eficaz. Tal cantidad se puede administrar como una dosis única o se puede administrar de acuerdo a una pauta posológica, por medio de lo cual resulta eficaz. La cantidad puede curar una 35 enfermedad, pero, típicamente, se administra para mejorar los síntomas de una enfermedad, o para prevenir el desarrollo de una enfermedad o trastorno. Tanto en los tratamientos terapéuticos como en los profilácticos, los fármacos normalmente se administran en varias dosis hasta que se logra una respuesta inmunitaria suficiente. Típicamente, la respuesta inmunitaria se supervisa y se repiten las dosis si la respuesta inmunitaria comienza a desvanecerse. El «tratamiento» no necesita eliminar por completo una enfermedad, ni necesita impedir por completo
40 que un sujeto enferme con la enfermedad o el trastorno.
«Tumor», tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a toda proliferación y crecimiento celulares
neoplásicos, bien malignos o benignos, y toda célula y tejido precanceroso y canceroso.
La terminología «cáncer» se refiere a una enfermedad o trastorno que se caracteriza por el crecimiento celular sin desregulado. Ejemplos de cáncer incluyen, pero sin limitarse a ellos, carcinoma, linfoma, blastoma y sarcoma. 45 Ejemplos de cánceres específicos incluyen, pero sin limitarse a ellos, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de testículo, cáncer de estómago, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer colorrectal y cáncer de próstata. Los expertos en la técnica conocen bien otros cánceres, que incluyen, pero sin limitarse a ellos: leucemia, linfoma, cáncer cervical, gliomas tumorales, adenocarcinomas y cáncer de piel. Cánceres de ejemplo incluyen, pero sin limitarse a ellos, tumor de vejiga, tumor de mama, tumor de próstata, 50 carcinoma de células basales, cáncer de las vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, cáncer de cerebro y del SNC (p. ej., glioma tumoral), cáncer cervical, coriocarcinoma, cáncer de colon y de recto, cáncer del tejido conjuntivo, cáncer del aparato digestivo; cáncer endometrial, cáncer de esófago; cáncer de ojo; cáncer de cabeza y cuello; cáncer de estómago; neoplasia intraepitelial; cáncer de riñón; cáncer de laringe; leucemia; cáncer de hígado; cáncer de pulmón (p. ej., microcítico y no microcítico); linfoma que incluye linfoma de Hodgkin y no de Hodgkin; 55 melanoma; mieloma, neuroblastoma, cáncer de la cavidad bucal (p. ej., labios, lengua, boca y faringe); cáncer de ovario; cáncer de páncreas; retinoblastoma; rabdomiosarcoma; cáncer rectal; cáncer renal, cáncer del aparato respiratorio; sarcoma; cáncer de piel; cáncer de estómago; cáncer de testículo; cáncer de tiroides; cáncer de útero; cáncer del aparato urinario, así como otros carcinomas y sarcomas. El cáncer también incluye neoplasias y
trastornos malignos en los mamíferos que se conocen bien en la técnica.
Un «vector» es un ácido nucleico que es capaz de trasportar otro ácido nucleico. Los vectores pueden ser, por ejemplo, plásmidos, cósmidos o fagos. Un «vector de expresión» es un vector que es capaz de dirigir la expresión de una proteína o proteínas codificadas por uno o varios genes que lleva el vector cuando está presente en el
5 entorno apropiado.
La terminología «elemento regulador» y «elemento de control de la expresión» se utilizan indistintamente y se refieren a moléculas de ácido nucleico que pueden influir en la transcripción y/o traducción de una secuencia codificante unida operativamente en un entorno concreto. Esta terminología se utiliza ampliamente y cubre todos los elementos que promueven o regulan la transcripción, entre ellos promotores, elementos mínimos necesarios para la
10 interacción básica de la ARN polimerasa y los factores de transcripción, elementos secuencia arriba, potenciadores y elementos de respuesta (véase, p. ej., Lewin, «Genes V» (Oxford University Press, Oxford) páginas 847-873). Los elementos reguladores de ejemplo en los procariotas incluyen promotores, secuencias operadoras y sitios de fijación del ribosoma. Los elementos reguladores que se utilizan en las células eucariotas pueden incluir, sin limitación, promotores, potenciadores, señales de ayuste y señales de poliadenilación.
15 La terminología «transfección» se refiere a la introducción de un ácido nucleico en una célula hospedadora.
Los «retrovirus» son virus que tienen un genoma de ARN.
«Lentivirus» se refiere a un género de retrovirus que son capaces de infectar las células en división y las que no están dividiéndose. Varios ejemplos de lentivirus incluyen el VIH (virus de la inmunodeficiencia humana: que incluye el VIH de tipo 1 y el VIH de tipo 2), que es el agente etiológico del síndrome de inmunodeficiencia adquirida de los 20 humanos (sida); el visna-maedi, que provoca la encefalitis (visna) o la neumonía (maedi) en las ovejas; el virus de la artritis-encefalitis caprina, que provoca inmunodeficiencia, artritis y encefalopatía en las cabras; el virus de la anemia infecciosa equina, que provoca anemia hemolítica autoinmunitaria y encefalopatía en los caballos; el virus de la inmunodeficiencia felina (VIF), que provoca inmunodeficiencia en los gatos: el virus de la inmunodeficiencia bovina (VIB), que provoca linfadenopatía, linfocitosis y posiblemente infección del sistema nervioso central en el ganado; y
25 el virus de la inmunodeficiencia del simio (VIS), que provoca inmunodeficiencia y encefalopatía en los primates subhumanos.
Un genoma lentivírico está organizado generalmente en una repetición terminal larga (LTR, por su nombre en inglés) en 5', el gen gag, el gen pol, el gen env, los genes accesorios (nef, vif, vpr, vpu) y una LTR en 3'. La LTR vírica se divide en tres regiones denominadas U3, R y U5. La región U3 contiene los elementos potenciador y promotor. La
30 región U5 contiene las señales de poliadenilación. La región R (repetición) separa las regiones U3 y U5 y las secuencias transcritas de la región R aparecen en ambos extremos 5' y 3' del ARN vírico. Véase, por ejemplo, «RNA viruses: A practical approach» (Alan J. Cann, Ed. Oxford University Press, (2000)), O. Narayan y Clements J. Gen. Virology 70: 1617-1639 (1989), Fields et al. Fundamental Virology, Raven Press (1990), Miyoshi H., Blomer U., Takahashi M., Gage F. H., Verma I. M. J. Virol. 72(10): 8150-7 (1998) y patente de los EE.UU. n.º 6.013.516.
35 «Gammarretrovirus» se refiere al género de la familia Retroviridae. Los gammarretrovirus de ejemplo incluyen, pero sin limitarse a ellos, el virus de las células madre de ratón, el virus de la leucemia murina, el virus de la leucemia felina, el virus del sarcoma felino y los virus de la reticuloendoteliosis aviar.
Un «virus híbrido» tal y como se utiliza en la presente memoria se refiere a un virus que tiene componentes de uno o varios vectores víricos diferentes, entre ellos, elemento de vectores no retrovíricos, por ejemplo, híbridos
40 adenovírico-retrovírico. Tal y como se utiliza en la presente memoria, los vectores híbridos que tienen un componente retrovírico se deben considerar dentro del alcance de los retrovirus.
«Virión», «partícula vírica» y «partícula retrovírica» se utilizan en la presente memoria para referirse a un único virus que comprende un genoma de ARN, proteínas procedentes del gen pol, proteínas procedentes del gen gag y una bicapa lipídica que muestra una (gluco)proteína de la envoltura. El genoma de ARN suele ser un genoma de ARN
45 recombinante y, así pues, puede contener una secuencia de ARN que es exógena al genoma vírico nativo. El genoma de ARN también puede comprender una secuencia vírica endógena defectuosa.
Un retrovirus «seudotipado» es una partícula retrovírica que tiene una proteína de envoltura que procede de un virus diferente al virus del cual procede el genoma de ARN. La proteína de envoltura puede ser, por ejemplo y sin limitación, de un retrovirus diferente o de un origen no retrovírico. La proteína de la envoltura puede ser una proteína 50 de la envoltura en estado nativo o una proteína de envoltura que está modificada, mutada o alterada genéticamente tal y como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones, una proteína de envoltura es una glucoproteína vírica específica de DC-SIGN que procede de una glucoproteína de uno de los siguientes: virus de Sindbis, virus de la gripe, virus de la fiebre de Lassa, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus del dengue, virus de la hepatitis B, virus de la rabia, virus de la selva de Semliki, virus del río Ross, virus de Aura, virus
55 de la enfermedad de Borna, virus de Hantaán y coronavirus del SARS.
«Transformación», tal y como se define en la presente memoria, describe un proceso mediante el cual el ADN exógeno entra en una célula diana. La transformación puede realizarse mediante cualquier procedimiento conocido para la inserción de secuencias foráneas de ácido nucleico en una célula hospedadora procariota o eucariota y puede incluir, pero sin limitarse a ellos, infección vírica, electroporación, choque térmico, lipofección y bombardeo de
5 partículas. Las células «transformadas» incluyen células transformadas de forma estable en las cuales el ácido nucleico insertado es capaz de replicarse, bien como un plásmido de replicación autónoma, o bien como parte del cromosoma del hospedador. También se incluyen las células que expresan un gen de interés de forma transitoria.
Una «molécula para fusión», tal y como se describe en la presente memoria, es cualquier molécula que puede desencadenar la fusión de las membranas cuando está presente en la superficie de un virus y permite que el núcleo 10 de un virus atraviese la membrana y, típicamente, entre en el citosol de una célula diana. Las moléculas para fusión pueden ser, por ejemplo, glucoproteínas víricas. Las glucoproteínas víricas de ejemplo contempladas como moléculas para fusión incluyen, pero sin limitarse a ellas, hemaglutinina, hemaglutinina mutante, SIN, y glucoproteínas víricas de los virus siguientes: virus de Sindbis, virus de la gripe, virus de la fiebre de Lassa, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus del dengue, virus de la hepatitis B, virus de la rabia, virus de la selva
15 de Semliki, virus del río Ross, virus de Aura, virus de la enfermedad de Borna, virus de Hantaán y coronavirus del SARS. Las glucoproteínas pueden ser nativas o estar modificadas para que tengan la actividad deseada.
Con «transgén» se hace referencia a cualquier secuencia nucleotídica, en particular una secuencia de ADN, que está integrada en uno o varios cromosomas de una célula hospedadora por intervención humana, tal como mediante los procedimientos de la presente invención. El transgén comprende preferiblemente un «gen de interés».
20 Un «gen de interés» no está limitado de ningún modo y puede ser todo ácido nucleico, sin limitación, que se desee administrar, integrar, transcribir, traducir y/o expresar en una célula diana. El gen de interés puede codificar un producto funcional, tal como una proteína o una molécula de ARN. Preferiblemente, el gen de interés codifica una proteína u otra molécula cuya expresión se desea que se produzca en la célula diana. El gen de interés está unido operativamente, por lo general, a otras secuencias que son útiles para obtener la expresión deseada del gen de
25 interés, tal como secuencias reguladoras de la transcripción. En algunas realizaciones, un gen de interés es preferiblemente uno que codifica un antígeno contra el cual se desea estimular una respuesta inmunitaria. Otros genes de interés que se pueden utilizar en algunas realizaciones son los genes que codifican activadores y/o factores de maduración de las células dendríticas.
Una «relación funcional» y «unido operativamente» significan, con respecto al gen de interés, que el gen está en la
30 posición y orientación correctas con respecto al promotor y/o potenciador, y que la expresión del gen se verá afectada cuando el promotor y/o potenciador esté en contacto con las moléculas adecuadas.
Elementos o «secuencias 2A» son péptidos pequeños que se introducen como conectores entre dos proteínas, lo que permite el autoprocesamiento intrarribosómico autónomo de las poliproteínas (de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2: 13 (2004); de Felipe et al. Traffic 5: 616-626 (2004)). Los péptidos pequeños permiten la coexpresión de
35 muchas proteínas desde un único vector, tal como la coexpresión de una molécula para fusión y de una molécula de afinidad desde el mismo vector. Así pues, en algunas realizaciones, los polinucleótidos que codifican los elementos 2A están incorporados en un vector entre los polinucleótidos que codifican las proteínas a expresar.
Los «factores de maduración de las CD» (también conocidos como «activadores de las CD») son compuestos que pueden inducir la activación o estimulación de las CD de tal forma que las CD facilitan la inducción de las respuestas 40 inmunitarias humoral y celular. Se conocen en la técnica los factores de maduración de las CD típicos e incluyen, pero sin limitarse a ellos, moléculas de estimulación, citocinas, quimiocinas, anticuerpos y otros agentes tales como los ligandos Flt-3 (Figdor, C. G et al,. 2004. Nat. Med. 10: 475-480; Pulendran, B. et al., 2000. J. Immunol. 165: 566572; Maraskovsky, E. et al. 2000. Blood 96: 878-884). Los factores de maduración de las CD de ejemplo pueden incluir, pero sin limitarse a ellos, GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15. IL-21, IL-23, TNF-α, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando
45 de CD40 (CD40L) y CD40 inducible por fármacos (iCD40).
Moléculas orientadoras
Según se explicó más arriba, una molécula orientadora es una glucoproteína E2 de alfavirus mutada en un sitio de fijación del sulfato de heparano, que se incorpora en un virus recombinante para enviar selectivamente el virus hacia las células dendríticas que expresan la DC-SIGN. La molécula orientadora se fija específicamente a la DC-SIGN. Es
50 decir, la molécula orientadora dirige preferiblemente el virus recombinante hacia las células dendríticas que expresan la DC-SIGN y no a otros tipos de células. Aunque algunas se fijan inespecíficamente a otras moléculas, y así pues a otros tipos de células, y puede producirse incluso si la molécula orientadora es específica de DC-SIGN, las moléculas orientadoras se modifican para que tengan suficiente especificidad para evitar efectos secundarios indeseados, tales como efectos secundarios que pueden reducir la respuesta inmunitaria deseada.
55 Las moléculas orientadoras son por lo general moléculas que son capaces de seudotipar el virus y así incorporarse en la envoltura de los virus recombinantes, células dendríticas diana y, en las condiciones correctas, inducir la fusión de la membrana y permitir la entrada de un gen de interés en las células dendríticas. Además, las moléculas diana son preferiblemente resistentes a la ultracentrifugación para permitir que se concentren, lo que puede ser importante para la administración génica in vivo.
Las moléculas orientadoras inducen preferiblemente la fusión de membranas a pH bajo, independientemente de la
5 fijación. Así pues, en las realizaciones preferidas, la fusión de membranas inducida por la molécula orientadora se produce una vez que el virus que comprende la molécula orientadora está dentro del endosoma de una célula diana y el componente del núcleo vírico, que incluye un polinucleótido de interés, está introducido en el citosol.
En algunas realizaciones se incorpora una secuencia etiquetadora en una molécula orientadora para que en las partículas víricas se pueda detectar la expresión de la molécula orientadora y la presencia de la molécula
10 orientadora.
Los alfavirus, tales como el virus de la selva de Semliki (VSS), virus del río Ross (VRR) y el virus de Aura (VA) comprenden glucoproteínas de superficie tales como E1, E2 y E3. La glucoproteína E2 procedente del virus de Sindbis (SIN) es una glucoproteína no retrovírica que se fija específicamente a una molécula particular de la superficie celular (glucosaminoglucano de sulfato de heparano para E2, ácido siálico para HA) y se puede utilizar
15 para crear moléculas orientadoras en algunas realizaciones. Su fusión es relativamente independiente de la fijación a las moléculas del receptor, y la activación de la fusión se lleva a término a través de la acidificación en el endosoma (Skehel y Wiley, Annu. Rev. Biochem. 69, 531-569 (2000); Smit, J. et al. J. Virol. 73, 8746-8484 (1999)). Además, puede tolerar algunas modificaciones genéticas y permanecer ensamblada con eficacia en la superficie retrovírica (Morizono et al., J. Virol. 74, 8016-8020).
20 Se utiliza una glucoproteína E2 de alfavirus mutada en un sitio de fijación del sulfato de heparano, preferiblemente la glucoproteína del virus de Sindbis de la familia de alfavirus (K. S. Wang, R. J. Kuhn, E. G. Strauss, S. Ou, J. H. Strauss, J. Virol. 66, 4992 (1992)), en la presente memoria denominada también SVG. La SVG incluye dos proteínas transmembranarias (S. Mukhopadhyay, R, J. Kuhn, M. G. Rossmann, Nature Rev. Microbiol. 3, 13 (2005)), una primera proteína responsable de la fusión (E1), y una segunda proteína para la fijación celular (E2). La SVG se sabe
25 que seudotipa los oncorretrovirus y los lentivirus.
Tal y como se explica más abajo, en algunas realizaciones preferidas se utiliza una SVG modificada que preferiblemente se fija a la DC-SIGN. En otras realizaciones, se puede utilizar una SVG competente para fusión y deficiente de fijación, SVGmu, como la molécula fusogénica en combinación con una molécula orientadora independiente, tal como un anticuerpo contra la DC-SIGN u otra proteína específica de las células dendríticas. Por
30 ejemplo, se puede utilizar una molécula fusogénica SVG en la que el dominio de fijación a la inmunoglobulina G de la proteína A (dominio ZZ) se incorpora en la proteína E2 y se realizan una o más mutaciones adicionales para inactivar los sitios de fijación al receptor (K. Morizono et al., Nature Med. 11, 346 (2005)).
El gen que codifica la molécula orientadora está clonado preferiblemente en un vector de expresión, tal como pcDNA3 (Invitrogen). Las células de empaquetamiento, tales como las células 293T, se cotransfectan entonces con 35 el vector vírico que codifica un gen de interés (que codifica típicamente un antígeno), al menos un plásmido que codifica componentes para el empaquetamiento del virus, y un vector para la expresión de la molécula orientadora. Si la función orientadora se separa de la función de fusión, también se proporcionan uno o varios vectores que codifican una molécula de afinidad y otros componentes asociados. La molécula orientadora se expresa en la membrana de la célula de empaquetamiento y se incorpora en el virus recombinante. La expresión de las moléculas 40 orientadoras sobre la superficie de las células de empaquetamiento se puede analizar, por ejemplo, mediante FACS.
A partir de la información obtenida, por ejemplo, de estudios estructurales y de modelización molecular, se puede emplear la mutagénesis para generar las formas mutantes de la glucoproteína que mantienen su capacidad de fusión, pero que tienen la especificidad de fijación y/o el nivel de fijación deseados. Se pueden crear varios mutantes para cada glucoproteína y analizarlos con los procedimientos descritos más adelante, u otros procedimientos
45 conocidos en la técnica, para identificar las MF con las características más deseables. Por ejemplo, a las moléculas orientadoras se les puede analizar la capacidad para introducir antígenos específicamente en las células dendríticas mediante la determinación de su capacidad para estimular una respuesta inmunitaria sin ocasionar efectos secundarios indeseados en un mamífero. También se puede comprobar directamente la capacidad orientadora sobre las células dendríticas, por ejemplo, en los cultivos celulares tal y como se describe a continuación.
50 Para seleccionar las moléculas orientadoras adecuadas (bien de tipo silvestre o mutantes), se preparan virus que portan la molécula orientadora (y una molécula de afinidad cuando sea adecuado) y se les analiza su selectividad y/o su capacidad para facilitar la penetración de la membrana de la célula diana. Los virus que muestran una glucoproteína de tipo silvestre se pueden utilizar como controles para examinar el efecto del título en los mutantes. Las células que expresan el compañero de fijación de la molécula orientadora (o molécula de afinidad, cuando sea
55 apropiado) son transducidas por el virus mediante un ensayo de infección estándar. Después un tiempo determinado, por ejemplo 48 después de la transducción, se pueden recoger las células y se puede determinar el porcentaje de células infectadas por el virus que comprenden la molécula orientadora (o molécula de afinidad y molécula para fusión) mediante, por ejemplo, FACS. La selectividad se pude puntuar calculando el porcentaje de células infectadas por el virus. De igual forma, el efecto de las mutaciones sobre el título del virus se puede cuantificar dividiendo el porcentaje de células infectadas por el virus que comprende una molécula orientadora mutante entre el porcentaje de células infectadas por el virus que comprende la correspondiente molécula orientadora de tipo silvestre. Un
5 mutante preferido dará la mejor combinación de selectividad y de título infeccioso. Una vez que se selecciona una molécula orientadora, se pueden realizar ensayos de concentración vírica para confirmar que se pueden concentrar los virus envueltos por la MF. Los sobrenadantes víricos se recogen y concentran mediante ultracentrifugación. El título de los virus se puede determinar mediante la dilución límite de la solución madre de virus y la transducción de las células que expresan el compañero de fijación de la molécula de afinidad.
10 En algunas realizaciones puede utilizarse la proteína para fusión BlaM-Vpr para evaluar la penetración vírica y de esta forma también la eficacia de una molécula para fusión (de tipo silvestre o mutante). Los virus se pueden preparar, por ejemplo, mediante transfección transitoria de las células de empaquetamiento con uno o más vectores que comprenden los elementos víricos, BlaM-Vpr, y la MF interés (y una molécula de afinidad si es apropiado). Los virus resultantes se pueden utilizar para infectar las células que expresan una molécula, en donde la molécula
15 orientadora (o molécula de afinidad) se fija específicamente en ausencia o presencia del inhibidor libre de fijación (tal como un anticuerpo). A continuación, las células se lavan con medio independiente de CO2 y se cargan con el colorante CCF2 (Aurora Bioscience). Tras la incubación a temperatura ambiente para permitir que se termine la reacción de escisión, las células se pueden fijar mediante paraformaldehído y se pueden analizar mediante FACS y microscopia. La presencia de células azules indica la penetración de virus en el citoplasma; se esperarían menos
20 células azules cuando se añade el anticuerpo de bloqueo.
Para investigar si la penetración es dependiente de un pH bajo, y seleccionar moléculas orientadoras (o moléculas para fusión) con la dependencia de pH deseada, en la etapa de infección se puede añadir NH4Cl u otro compuesto que altere el pH (el NH4Cl neutralizará los compartimentos ácidos de los endosomas). En el caso del NH4Cl, la desaparición de las células azules indicará que la penetración de los virus es dependiente de un pH bajo.
25 Además, para confirmar que la actividad depende del pH, en el tampón de incubación se pueden añadir agentes lisosomótropos, tales como cloruro de amonio, cloroquina, concanamicina, bafilomicina A1, monensina, nigericina, etc. Estos agentes pueden elevar el pH dentro de los compartimentos endosómicos (p. ej., Drose y Altendorf, J. Exp. Biol. 200, 1-8, 1997). El efecto inhibidor de estos agentes revelará la importancia del pH para la fusión y la entrada del virus. Se pueden comparar las diferentes cinéticas de entrada entre los virus que exponen diferentes moléculas
30 para fusión y se pueden seleccionar las más adecuadas para una aplicación particular.
Los ensayos de entrada por PCR se pueden utilizar para seguir por transcripción inversa y, por lo tanto, medir la cinética de la síntesis del ADN vírico como una indicación de la cinética de la entrada del virus. Por ejemplo, las partículas víricas que comprenden una molécula orientadora concreta se pueden incubar con las células de empaquetamiento, tales como las células 293T, que expresan el análogo apropiado para la molécula orientadora (o
35 una molécula de afinidad distinta en algunas realizaciones). Bien inmediatamente o bien tras la incubación (para permitir que se produzca la infección), se retiran los virus sin fijar y se analizan alícuotas de las células. A continuación, se puede extraer el ADN de estas alícuotas y se puede realizar una PCR semicuantitativa con los cebadores específicos de las LTR. La aparición de productos de ADN específicos de la LTR indicará el éxito de la entrada del virus y no de la cubierta.
40 Aunque la molécula orientadora puede tener funciones de fijación y fusión víricas a la vez, la descripción también da a conocer una molécula orientadora en la que las funciones de fijación y fusión víricas están separadas en dos componentes diferentes. Típicamente, el virus recombinante comprende (i) una molécula de afinidad que interviene en la fijación vírica y dirige al virus con precisión hacia las células dendríticas, y (ii) una molécula fusogénica (FM) diferente que interviene en la transducción e introducción eficaces del polinucleótido deseado dentro de las células
45 dendríticas. Los procedimientos descritos en la presente memoria se pueden adoptar fácilmente para utilizar cualquiera de una serie de moléculas de afinidad y moléculas fusogénicas. Además de las descritas en la presente memoria, se describen otras moléculas fusogénicas y procedimientos relacionados, por ejemplo, en la solicitud de patente de los EE.UU. n.º 11/071.785 registrada el 2 de marzo de 2005 (publicada como publicación de solicitud de patente de los EE.UU. 2005-0238626) y en la solicitud de patente de los EE.UU. n.º 11/446.353 registrada el 1 de
50 junio de 2006 (publicada como publicación de solicitud de patente de los EE.UU. 2007/0020238).
La molécula de afinidad es la que se fija al marcador de superficie de las células dendríticas. En las realizaciones preferidas, la molécula de afinidad se fija a la DC-SIGN con especificidad. Es decir, la fijación de la molécula de afinidad a la DC-SIGN es preferiblemente lo suficientemente específica para evitar los efectos secundarios indeseados debidos a la interacción con los marcadores en otros tipos celulares. La molécula de afinidad puede ser,
55 por ejemplo, un anticuerpo que se fija específicamente a la DC-SIGN.
En algunas realizaciones preferidas, la molécula de fusión es una glucoproteína vírica que interviene en la fusión o si no facilita la introducción del gen de interés en la célula dendrítica, preferiblemente en respuesta al medio con pH bajo del endosoma. La molécula de fusión muestra preferiblemente una cinética lo suficientemente rápida de modo que el contenido vírico puede vaciarse en el citosol antes de que se degrade la partícula vírica. Además, la molécula de fusión puede modificarse para reducir o eliminar cualquier actividad de fijación y así reducir o eliminar cualquier fijación inespecífica. Es decir, al reducir la capacidad de fijación de las moléculas de fusión, la fijación del virus a la célula diana está determinada de manera predominante o total por la molécula de afinidad, lo que permite una
5 elevada especificidad de la diana y la reducción de los efectos indeseables. Las moléculas de fusión de ejemplo incluyen, pero sin limitarse a ellas, glucoproteínas víricas procedentes de uno de los virus siguientes: virus de Sindbis, virus de la selva de Semliki, virus del río Ross, virus de Aura.
Vectores
En una realización preferida se utilizan uno o varios vectores para introducir secuencias polinucleotídicas en una
10 línea de células de empaquetamiento para preparar un virus recombinante tal y como se describe en la presente memoria. Los vectores pueden contener secuencias polinucleotídicas que codifican los diferentes componentes del virus recombinante, entre ellos la molécula orientadora específica de las CD, uno o varios genes de interés (que codifican típicamente un antígeno) y los componentes necesarios para producir el virus que no proporciona la célula de empaquetamiento. En algunas realizaciones, los vectores que contienen las secuencias polinucleotídicas que
15 codifican una molécula de afinidad específica de las CD y una molécula para fusión distinta sustituyen a un vector que codifica una molécula orientadora específica de las CD en la preparación del virus. Los vectores de expresión de las células eucariotas se conocen bien en la técnica y están disponibles de una serie de fuentes comerciales.
En un aspecto de la invención también se utilizan para la preparación del virus los vectores que contienen las secuencias polinucleotídicas que codifican los factores de maduración de las CD. Estos polinucleótidos están 20 típicamente bajo el control de uno o más elementos reguladores que dirigen la expresión de las secuencias codificantes en la célula de empaquetamiento y en la célula diana, cuando sea apropiado. Varias líneas de resultados han demostrado que el éxito de la vacunación con CD depende del estado de maduración de las CD (Banchereau J. y Palucka, A. K. Nat. Rev. Immunol. 5: 296-306 (2005); Schuler, G. et al. Curr. Opin. Immunol. 15: 138-147 (2003); Figdor, C. G. et al. Nat. Med. 10: 475-480 (2004)). La maduración puede transformar las CD desde
25 células implicadas activamente en la captura del antígeno a células especializadas para la sensibilización de los linfocitos T. En un aspecto de la invención, el vector incluye genes que codifican las moléculas estimuladoras que inducen la maduración deseada de las CD. Tales moléculas estimuladoras también se denominan factores de maduración o factores de estimulación de la maduración.
En algunas realizaciones, las células de empaquetamiento se cotransfectan con un vector vírico que codifica un
30 antígeno y uno o varios vectores más. Por ejemplo, además del vector vírico que codifica un antígeno, un segundo vector lleva preferiblemente un gen que codifica una molécula orientadora que se fija a las células dendríticas, tal como SVGmu, tal y como se describe en otro lugar de la solicitud. La molécula orientadora codifica una glucoproteína E2 de alfavirus modificada que está mutada en un sitio de fijación del sulfato de heparano para disminuir o eliminar su fijación al sulfato de heparano que es específica de la DC-SIGN. La glucoproteína vírica
35 modificada procede preferiblemente de al menos uno de los siguientes: virus de Sindbis, virus de la selva de Semliki, virus del río Ross, virus de Aura. En algunas realizaciones, el vector vírico que codifica un antígeno también incluye una secuencia polinucleotídica que codifica un factor de maduración de las CD. En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica que codifica un factor de maduración de las CD está contenida en un tercer vector que está cotransfectado con el vector vírico que codifica un antígeno y uno o varios vectores más en las células de
40 empaquetamiento.
En otras realizaciones se utilizan uno o varios vectores de expresión multicistrónicos que incluyen dos o más de los elementos (p. ej., los genes víricos, el o los genes de interés, la molécula orientadora, los factores de maduración de las CD) necesarios para la producción del virus recombinante deseado en las células de empaquetamiento. El uso de vectores multicistrónicos reduce el número total de vectores requeridos y así elude las posibles dificultades 45 asociadas a la coordinación de la expresión de varios vectores. En un vector multicistrónico, los diferentes elementos a expresar están operativamente unidos a uno o más promotores (y otros elementos de control de la expresión que sean necesarios). En otras realizaciones se utiliza un vector multicistrónico que comprende un gen de interés, un gen indicador y elementos víricos. El gen de interés codifica un antígeno y, opcionalmente, un factor de maduración de las CD. Tal vector se puede contransfectar, por ejemplo, junto con un vector que codifica una
50 molécula orientadora o, en algunas realizaciones, un vector multicistrónico que codifica tanto una MF como una molécula de afinidad. En algunas realizaciones, el vector multicistrónico comprende un gen que codifica un antígeno, un gen que codifica un factor de maduración de las CD y elementos víricos.
Cada componente a expresar en un vector de expresión multicistrónico puede estar separado, por ejemplo, mediante un elemento IRES o un elemento 2A vírico, para permitir la expresión independiente de las diferentes 55 proteínas a partir del mismo promotor. Los elementos IRES y los elementos 2A se conocen en la técnica (patente de los EE.UU. n.º 4.937.190; de Felipe et al. 2004. Traffic 5: 616-626). En una realización, los oligonucleótidos que codifican las secuencias del sitio de escisión (RAKR) de la furina (Fang et al. 2005. Nat. Biotech. 23: 584-590), unido a secuencias de tipo 2A del virus de enfermedades de pies y boca (VEPB), virus A de la rinitis equina (VARE) y virus
de Thosea asigna (TaV) (Szymczak et al. 2004. Nat. Biotechnol. 22: 589-594) se utilizan para separar los elementos genéticos en un vector multicistrónico. La eficacia de un vector multicistrónico determinado para el uso a la hora de sintetizar el virus recombinante deseado se puede analizar fácilmente mediante la detección de la expresión de cada uno de los genes con los protocolos estándares.
5 La generación del o de los vectores puede llevarse a cabo con cualquier técnica adecuada de ingeniería genética conocida en la técnica, entre ellas, pero sin limitarse a ellas, las técnicas estándares de digestión con endonucleasas de restricción, ligación, transformación, purificación de plásmidos y secuenciación del ADN, por ejemplo como se describe en Sambrook et al., (1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press,
N. Y.), Coffin et al. (Retroviruses. Col Spring Harbor Laboratory Press, N. Y. (1997)) y «RNA Viruses: A Practical 10 Approach» (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000)).
El vector o vectores pueden incorporar secuencias del genoma de cualquier organismo conocido. Las secuencias pueden incorporarse en su forma nativa o pueden estar modificadas de algún modo. Por ejemplo, las secuencias pueden comprender inserciones, deleciones o sustituciones.
En la técnica se conocen los elementos de control de la expresión que pueden utilizarse para regular la expresión de
15 los componentes e incluyen, pero sin limitarse a ellos, promotores inducibles, promotores constitutivos, señales de secreción, potenciadores y otros elementos reguladores.
En una realización, un vector puede incluir un replicón procariota, a saber, una secuencia de ADN que tiene la capacidad de dirigir la replicación autónoma y el mantenimiento de la molécula de ADN recombinante de forma extracromosómica en una célula hospedadora procariota, tal como una célula hospedadora bacteriana, transformada
20 con éste. Tales replicones se conocen bien en la técnica. Además, los vectores que incluyen un replicón procariota pueden incluir también un gen cuya expresión confiere un marcador detectable tal como una resistencia a fármaco. Los genes bacterianos típicos de resistencia a fármacos son los que confieren resistencia a la ampicilina o a la tetraciclina.
El vector o vectores pueden incluir uno más genes de marcadores de selección que son eficaces en una célula
25 eucariota, tal como un gen de un marcador de selección de resistencia a fármaco. Este gen codifica un factor necesario para la supervivencia o crecimiento de las células hospedadoras transformadas que crecen en un medio de cultivo selectivo. Las células hospedadoras que no están transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que confieren resistencia a antibióticos o a otras toxinas, p. ej., ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, complementan
30 deficiencias auxótrofas, o suministran nutrientes críticos retirados del medio. El marcador de selección puede opcionalmente estar presente en un plásmido distinto e introducirse mediante cotransfección.
Los vectores contendrán normalmente un promotor que es reconocido por la célula de empaquetamiento y que está unido operativamente al polinucleótido o polinucleótidos que codifican la molécula orientadora, componentes víricos y similares. Un promotor es un elemento de control de la expresión formado por una secuencia de ácido nucleico 35 que permite que se dé la fijación de la ARN polimerasa y la transcripción. Los promotores son secuencias sin traducir que se localizan secuencia arriba (5') del codón de inicio de un gen estructural (por lo general a menos de unos 100 a 1000 pb) y controlan la transcripción y la traducción de la secuencia polinucleotídica específica del antígeno a la cual están unidos operativamente. Los promotores pueden ser inducibles o constitutivos. La actividad de los promotores inducibles es inducida por la presencia o ausencia de factores bióticos o abióticos. Los 40 promotores inducibles pueden ser una herramienta útil en la ingeniería genética porque la expresión de los genes a los cuales están operativamente unidos se puede encender o apagar en determinadas etapas del desarrollo de un organismo o en un tejido concreto. Los promotores inducibles se pueden agrupar como promotores regulados químicamente y promotores regulados físicamente. Los promotores regulados químicamente típicos incluyen, pero sin limitarse a ellos, promotores regulados por alcohol (p. ej., el promotor del gen de la alcohol deshidrogenasa I 45 (alcA)), promotores regulados por la tetraciclina (p. ej., el promotor que responde a la tetraciclina), promotor regulado por esteroides (p. ej., promotor basado en el receptor de glucocorticoides (RG) de rata, promotor basado en el receptor de estrógenos (RE) humano, promotor basado en el receptor de la ecdisona de polilla, y los promotores basados en la superfamilia de receptores de esteroides/retinoides/hormonas tiroideas), promotores regulados por metales (p. ej., promotores basados en el gen de la metalotioneína) y promotores relacionados con la patogenia (p.
50 ej., promotores basados en la proteína relacionada con patógenos (RP) del maíz y de Arabidopsis). Los promotores típicos entre los regulados físicamente incluyen, pero sin limitarse a ellos, los promotores regulados por la temperatura (p. ej., promotores del choque térmico) y los promotores regulados por la luz (p. ej., promotor SSU de la soja). Otros promotores de ejemplo se describen en otros textos, por ejemplo, en el protocolo de transferencia de hipertexto://www.patentlens.net/daisy/promoters/768/271.html.
55 El experto en la técnica será capaz de seleccionar un promotor adecuado basándose en las circunstancias específicas. Se conocen bien en la técnica muchos promotores diferentes, al igual que lo son los procedimientos para unir operativamente el promotor al gen a expresar. Para dirigir la expresión en la célula de empaquetamiento y en la célula diana se pueden utilizar tanto las secuencias promotoras nativas como muchos promotores heterólogos.
Sin embargo, se prefieren los promotores heterólogos, ya que suelen permitir una mayor transcripción y dan un
mayor rendimiento de la proteína deseada en comparación con el promotor nativo.
El promotor se puede obtener, por ejemplo, del genoma de muchos virus tal como el virus del polioma, virus de la difteroviruela aviar, adenovirus, virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, 5 virus de la hepatitis B y virus 40 de los simios (SV40). El promotor puede ser también, por ejemplo, un promotor heterólogo de mamífero, p. ej., el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulina, un promotor del choque térmico, o el promotor que suele estar asociado a la secuencia nativa, siempre y cuando tales promotores sean compatibles con la célula diana. En una realización, el promotor es el promotor vírico que aparece de forma natural en un sistema de expresión vírico. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor específico de las células
10 dendríticas. El promotor específico de las células dendríticas puede ser, por ejemplo, el promotor de CD11c.
La transcripción se puede incrementar mediante la introducción de una secuencia potenciadora en el vector o vectores. Los potenciadores son típicamente elementos de ADN que actúan en cis, normalmente de aproximadamente 10 a 300 pb de longitud, que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. En la actualidad se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, α
15 fetoproteína e insulina). Preferiblemente se utilizará un potenciador de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 de la parte tardía del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma en la parte tardía del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. El potenciador se puede empalmar en el vector en la posición 5' o 3' de la secuencia polinucleotídica específica del antígeno, pero preferiblemente se localiza en el sitio 5' del promotor.
20 Los vectores de expresión contendrán también las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Estas secuencias a menudo se encuentran en las regiones sin traducir en 5' y, de vez en cuando, en 3' de los ADN o los ADNc víricos o eucariotas, y se conocen bien en la técnica.
Los vectores plasmídicos que contienen uno o más de los componentes descritos más arriba se construyen
fácilmente mediante las técnicas estándares bien conocidas en la técnica.
25 Para el análisis de confirmación de que las secuencias en los plásmidos construidos son correctas, el plásmido se puede replicar en E. coli, purificar y analizar mediante digestión con endonucleasas de restricción, y/o secuenciar mediante los procedimientos convencionales.
También se pueden utilizar los vectores que proporcionan la expresión transitoria en las células de mamífero. La
expresión transitoria implica el uso de un vector de expresión que es capaz de replicarse con eficacia en una célula
30 hospedadora, de tal forma que la célula hospedadora acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza una gran cantidad del polipéptido codificado por el polinucleótido específico del antígeno en el vector de expresión. Véase Sambrook et al., véase más arriba, págs. 16.17-16.22.
Se conocen bien en la técnica otros vectores y procedimientos adecuados para la adaptación a la expresión de los
polipéptidos víricos y resulta fácil adaptarlos a las circunstancias específicas.
35 Mediante las enseñanzas dadas a conocer en la presente memoria, el experto en la técnica reconocerá que la eficacia de un sistema de expresión concreto se puede analizar mediante la transformación de las células de empaquetamiento con un vector que comprende un gen que codifica una proteína indicadora y mediante la medición de la expresión con una técnica adecuada, por ejemplo, medir la fluorescencia de un conjugado con la proteína fluorescente verde. Se conocen bien en la técnica los genes indicadores adecuados.
40 La transformación de las células de empaquetamiento con vectores de la presente invención se lleva a cabo mediante procedimientos bien conocidos, y el procedimiento a utilizar no está limitado de ninguna manera. Se conocen en la técnica una serie de sistemas no víricos de introducción, entre ellos, por ejemplo, electroporación, sistemas de introducción basados en lípidos que incluyen liposomas, introducción de ADN «desnudo» e introducción con compuestos de policiclodextrina, tales como los descritos en Schatzlein A. G. (2001. «Non-viral vectors in cancer
45 gene therapy: principles and progresses». Anticancer Drugs). Los procedimientos de tratamiento con sales o lípidos catiónicos se emplean típicamente, véase, por ejemplo, Graham et al. (1973. Virol. 52: 456); Wigler et al. (1979. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76. 1373-76). Se prefiere el procedimiento de precipitación con fosfato del calcio. Sin embargo, también pueden utilizarse otros procedimientos para introducir el vector en las células, entre ellos la microinyección nuclear y la fusión de protoplastos bacterianos.
50 Vector vírico y células de empaquetamiento
Uno de los vectores codifica el núcleo vírico (el «vector vírico»). Hay un gran número de vectores víricos disponibles que son adecuados para ser usados con la invención, entre ellos los identificados para aplicaciones de genoterapia humana, tal como los descritos por Pfeifer y Verma (Pfeifer, A. y I. M. Verma. 2001. Annu. Rev. Genomics. Hum. Genet. 2: 177-211). Los vectores víricos adecuados incluyen los vectores basados en virus de ARN, tales como vectores procedentes de retrovirus, p. ej, vectores procedentes del virus de la leucemia murina de Moloney (VLMM), e incluyen vectores más complejos procedentes del retrovirus, p. ej, vectores procedentes de lentivirus. Los vectores procedentes del virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1) pertenecen a esta categoría. Otros ejemplos incluyen vectores de lentivirus procedentes del VIH-2, virus de la inmunodeficiencia felina (VIF), virus de la anemia infecciosa
5 equina, virus de la inmunodeficiencia de los simios (VIS) y virus de maedi/visna.
El vector vírico comprende preferiblemente uno o varios genes que codifican componentes del virus recombinante, así como uno o más genes de interés, tal como, por ejemplo, un antígeno y/o un factor de maduración de las CD. El vector vírico también puede comprender elementos genéticos que facilitan la expresión del gen de interés en una célula diana, tal como secuencias promotoras y potenciadoras. Para prevenir la replicación en la célula diana, los
10 genes víricos endógenos requeridos para la replicación se pueden retirar y proporcionarlos por separado a la línea celular de empaquetamiento.
En una realización preferida, el vector vírico comprende una LTR retrovírica intacta en 5' y una LTR en 3' que se puede autoinactivar.
Cualquier procedimiento conocido en la técnica se puede utilizar para producir partículas retrovíricas infecciosas
15 cuyo genoma comprende una copia de ARN del vector vírico. Para este fin, el vector vírico (junto con otros vectores que codifican el gen de interés, la molécula orientadora específica de las CD, etc.) se introduce preferiblemente en una línea celular de empaquetamiento que empaqueta el ARN genómico vírico basándose en el vector vírico contenido en las partículas víricas.
La línea celular de empaquetamiento proporciona las proteínas víricas que se necesitan en trans para el
20 empaquetamiento del ARN genómico del virus en las partículas víricas. La línea celular de empaquetamiento puede ser cualquier línea celular que es capaz de expresar proteínas retrovíricas. Las líneas celulares de empaquetamiento preferidas incluyen 293 (ATCC CCL X), HeLa (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) y Cf2Th (ATCC CRL 1430). La línea celular de empaquetamiento expresa de forma estable las proteínas víricas necesarias. Tal línea celular de empaquetamiento se describe, por ejemplo, en la patente de los
25 EE.UU. n.º 6.218.181. Alternativamente, una línea celular de empaquetamiento se puede transfectar transitoriamente con plásmidos que comprenden un ácido nucleico que codifica una o varias proteínas víricas necesarias, entre ellas la molécula orientadora específica de las CD (o, alternativamente, una molécula con afinidad específica por las CD y molécula para fusión) junto a los vectores víricos que codifican el gen de interés, que típicamente codifica un antígeno y puede adicionalmente codificar un factor de maduración de las CD.
30 Se recogen las partículas víricas que comprenden un polinucleótido con el gen de interés y una molécula orientadora que es específica de las células dendríticas y se deja que infecten la célula diana. En algunas realizaciones preferidas, el seudotipado del virus ha conseguido darle especificidad por la célula diana. Los procedimientos para el seudotipado se conocen bien en la técnica y también se describen en la técnica.
En una realización, el virus recombinante utilizado para introducir el gen de interés es un lentivirus modificado y el
35 vector vírico se basa en un lentivirus. Como los lentivirus son capaces de infectar tanto las células que se dividen como las que no se dividen, en esta realización no es necesario que las células diana estén dividiéndose (ni estimular a las células diana para que se dividan).
En otra realización, el virus recombinante utilizado para introducir el gen de interés es un gammarretrovirus modificado y el vector vírico se basa en un gammarretrovirus.
40 En otra realización, el vector se basa en el virus de las células madre de ratón (VCMR); (Hawley, R. G. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10297-10302; Keller, G. et al. (1998) Blood 92: 877-887; Hawley, R. G. et al. (1994) Gene Ther. 1: 136-138). El vector del VCMR proporciona una expresión estable a largo plazo en las células diana, en particular en las células precursoras hematopoyéticas y su progenie diferenciada.
En otra realización, el vector se basa en un virus de Moloney modificado, por ejemplo, un virus de la leucemia
45 murina de Moloney. El vector vírico también se puede basar en un virus híbrido tal como el descrito en Choi, J. K. et al. (2001. Stem cells 19, n.º 3, 236-246).
Puede utilizarse un vector de virus de ADN, entre ellos, por ejemplo, vectores basados en adenovirus y vectores basados en el virus adenoasociado (VAA). Asimismo, los vectores adenovíricos-retrovíricos también se pueden utilizar con los procedimientos de la invención.
50 También se pueden utilizar otros vectores para la introducción de polinucleótidos, que incluyen vectores procedentes del virus del herpes simple (VHS), que incluyen vectores de amplicones, VHS de replicación defectuosa y VHS atenuado (Krisky D. M., Marconi P. C., Oligino T. J., Rouse R. J., Fink D. J. et al. 1998. «Development of herpes simplex virus replication-defective multigene vectors for combination gene therapy applications». Gene Ther. 5: 1517-30).
Otros vectores que se han desarrollado recientemente para los usos de la terapia génica también se pueden utilizar con los procedimientos de la invención. Tales vectores incluyen los procedentes de baculovirus y alfavirus (Jolly D. J. 1999. Emerging viral vector. Págs. 209-40 en Friedmann T., ed. 1999. The development of human gene therapy. Nueva York: Cold Spring Harbor Lab).
5 En algunas realizaciones preferidas, la construcción vírica comprende secuencias de un genoma de lentivirus, tal como el genoma del VIH o el genoma del VIS. La construcción vírica comprende preferiblemente secuencias de las LTR en 5' y 3' de un lentivirus. Más preferiblemente, la construcción vírica comprende las secuencias R y U5 de la LTR en 5' de un lentivirus y una LTR en 3' de un lentivirus que está inactivada o que es capaz de autoinactivarse. Las secuencias LTR pueden ser las secuencias de LTR de cualquier lentivirus de cualquier especie. Por ejemplo,
10 pueden ser las secuencias LTR del VIH, VIS, VIF o VIB. Preferiblemente, las secuencias LTR son las secuencias LTR del VIH.
La construcción vírica comprende preferiblemente una LTR en 3' que está inactivada o que puede autoinactivarse. La LTR en 3' se puede autoinactivar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. En la realización preferida, el elemento U3 de la LTR en 3' contiene una deleción de su secuencia potenciadora, preferiblemente la
15 caja TATA, y los sitios de Spl y NF-κB. Como resultado de la LTR en 3' que se puede inactivar, el provirus que se integra en el genoma de la célula hospedadora comprenderá una LTR en 5' inactivada.
Opcionalmente, la secuencia de U3 de la LTR en 5' lentivírica se puede reemplazar con una secuencia del promotor en la construcción vírica. Esto puede incrementar el título del virus recuperado de la línea celular de empaquetamiento. También puede incluirse una secuencia potenciadora. Se puede utilizar cualquier combinación de
20 potenciador/promotor que incrementa la expresión del ARN genómico del virus en la línea celular de empaquetamiento. En una realización preferida, se utiliza la secuencia potenciadora/promotora del CMV.
En algunas realizaciones preferidas, la construcción vírica comprende secuencias de un genoma de gammarretrovirus, tal como el genoma del virus de células madre de ratón (VCMR) o el genoma del virus de la leucemia murina (VLM). La construcción vírica comprende preferiblemente secuencias de las LTR en 5' y 3' de un
25 gammarretrovirus. Las secuencias LTR pueden ser las secuencias LTR de cualquier gammarretrovirus de cualquier especie. Por ejemplo, pueden ser las secuencias LTR del virus de las células madre de ratón (VCMR), del virus de la leucemia murina (VLM), del virus de la leucemia felina (VLF), del virus del sarcoma felino (VSF) y del virus de la reticuloendoteliosis aviar (VRA). Preferiblemente, las secuencias LTR son las secuencias LTR del VCMR y del VLM.
En algunas realizaciones, la construcción vírica comprende preferiblemente una LTR en 3' inactivada o que se
30 puede autoinactivar. La LTR en 3' se puede volver autoinactivable mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. En la realización preferida, el elemento U3 de la LTR en 3' contiene una deleción de su secuencia potenciadora, preferiblemente de la caja TATA, y de los sitios de Spl y NF-κB. Como resultado de la autoinactivación de la LTR en 3', el provirus que está integrado en el genoma de la célula hospedadora comprenderá una LTR en 5' inactivada.
35 Opcionalmente, la secuencia de U3 de la LTR en 5' gammarretrovírica se puede reemplazar con una secuencia promotora en la construcción vírica. Esto puede incrementar el título del virus recuperado de la línea celular de empaquetamiento. También se puede incluir una secuencia potenciadora. Se puede utilizar cualquier combinación de potenciador/promotor que incremente la expresión del ARN genómico del virus en la línea celular de empaquetamiento. En una realización preferida se utiliza la secuencia del potenciador/promotor del CMV.
40 La construcción vírica comprende por lo general un gen que codifica un antígeno que se expresa deseablemente en una o varias células diana. Preferiblemente, el gen de interés se ubica entre la secuencia de la LTR en 5' y de la LTR en 3'. Además, el gen de interés está preferiblemente en una relación funcional con otros elementos genéticos, por ejemplo, secuencias reguladoras de la transcripción tales como promotores y/o potenciadores, para regular la expresión del gen de interés de una manera concreta una vez que el gen está incorporado en la célula diana. En
45 algunas realizaciones, las secuencias útiles reguladoras de la transcripción son las que están muy reguladas con respecto a la actividad, tanto temporal como espacialmente.
En algunas realizaciones, el gen de interés se encuentra en una relación funcional con las secuencias reguladoras promotoras/potenciadoras internas. Un promotor/potenciador «interno» es uno que está localizado entre las secuencias de la LTR en 5' y de la LTR en 3' en la construcción vírica y está unido operativamente al gen que se
50 desea expresar.
El promotor/potenciador interno puede ser cualquier promotor, potenciador o combinación de promotor/potenciador conocido por incrementar la expresión de un gen con el cual está en una relación funcional. Una «relación funcional» y «unido operativamente» significan, sin limitación, que el gen está en una localización y orientación correctas con respecto al promotor y/o potenciador, en donde la expresión del gen resultará afectada cuando el promotor y/o
55 potenciador se ponga en en contacto con las moléculas adecuadas.
El promotor/potenciador interno se selecciona preferiblemente basándose en el patrón de expresión deseado del gen de interés y las propiedades específicas de los promotores/potenciadores conocidos. Así pues, el promotor interno puede ser un promotor constitutivo. Los ejemplos no limitantes de promotores constitutivos que se pueden utilizar incluyen el promotor de la ubicuitina, CMV (Karasuyama et al. 1989. J. Exp. Med. 169: 13), β-actina (Gunning
5 et al. 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4831-4835) y pgk (véase, por ejemplo, Adra et al, 1987, Gene. 60: 65-74; Singer-Sam et al. 1984. Gene. 32: 409-417; y Dobson et al. 1982. Nucleic Acids Res. 10: 2635-2637).
Alternativamente, el promotor puede ser un promotor específico de tejido. En algunas realizaciones preferidas, el promotor es un promotor específico de la célula diana. Por ejemplo, el promotor puede ser el promotor CD11c específico de las células dendríticas (Masood R. et al. 2001. Int. J. Mol. Med. 8: 335-343; Somia, N. V. et al. 1995. 10 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 7570-7574). Además, los promotores se pueden seleccionar para permitir la expresión inducible del gen. En la técnica se conocen una serie de sistemas para la expresión inducible, que incluyen el sistema que responde a la tetraciclina y el sistema represor-operador de lac. También se contempla que pueda utilizarse una combinación de promotores para obtener la expresión deseada del gen de interés. El experto en la técnica será capaz de seleccionar un promotor basándose en el patrón de expresión deseado del gen en el
15 organismo y/o en la célula diana de interés.
En algunas realizaciones, la construcción vírica comprende preferiblemente al menos un promotor de la ARN polimerasa II o III. El promotor de la ARN polimerasa II o III está unido operativamente al gen de interés y puede también estar unido a una secuencia de terminación. Además, se pueden incorporar más de un promotor de la ARN polimerasa II o III.
20 Los promotores de la ARN polimerasa II y III los conoce bien el experto en la técnica. Se pueden encontrar un abanico adecuado de promotores de la ARN polimerasa III, por ejemplo, en Paule y White, Nucleic Acids Research. Vol. 28, págs. 1283-1298 (2000). La definición de los promotores de la ARN polimerasa II o III, respectivamente, también incluyen cualquier fragmento de ADN sintético o manipulado genéticamente que puede conseguir que la ARN polimerasa II o III, respectivamente, transcriba su secuencia codificante de ARN cadena abajo. Además, el
25 promotor o promotores de la ARN polimerasa II o III (Pol II o III) utilizados como parte del vector vírico pueden ser inducibles. Con los procedimientos de la invención se puede utilizar cualquier promotor de Pol II o III inducible adecuado. Los promotores de Pol II o III particularmente adecuados incluyen los promotores que responden a la tetraciclina descritos en Ohkawa y Taira, Human Gene Therapy, vol. 11, págs. 577-585 (2000) y en Meissner et al. Nucleic Acids Research, vol. 29, págs, 1672-1682 (2001).
30 En la construcción vírica también puede estar presente un potenciador interno para incrementar la expresión del gen de interés. Por ejemplo, se puede utilizar el potenciador del CMV (Karasuyama et al. 1989. J. Exp. Med. 169: 13). En algunas realizaciones se puede utilizar el potenciador del CMV en combinación con el promotor de la β-actina de pollo. El experto en la técnica será capaz de seleccionar el potenciador apropiado basándose en el patrón de expresión deseado.
35 El polinucleótido o gen de interés no está limitado de ningún modo e incluye cualquier ácido nucleico que el experto en la técnica desee integrar, transcribir, traducir y/o expresar en la célula diana. En algunas realizaciones, el polinucleótido puede ser un gen que codifica un antígeno contra el cual se desea una respuesta inmunitaria. En algunas realizaciones, el polinucleótido puede ser un gen que codifica un ARN inhibidor pequeño (siRNA) o un microRNA (miRNA) de interés que disminuye la expresión de una molécula. Por ejemplo, el gen que codifica un
40 siRNA o un microRNA se puede utilizar para disminuir la expresión de los reguladores negativos en una célula, entre ellos los que inhiben la activación o maduración de las células dendríticas. Los siRNA y los microRNA se conocen bien en la técnica y se describen en otros lugares (Shen, L. et al. 2004. Nat. Biotech. 22 (12): 1546-1553; Zhou, H. et al. 2006. Biochemical and Biophysical Research Communications 347: 200-207; Song, X-T et al. 2006. PloS Medicine 3(1): e11; Kobayashi, T. y A. Yoshimura. 2005. TRENDS in Immunology 26(4): 177-179; Taganov, K. et al.
45 2007. Immunity 26: 133-137; Dahlberg, J. E. y E. Lund. 2007. Sci. STKE 387: pe25).
Además, en algunas realizaciones, el polinucleótido puede contener más de un gen de interés, que pueden colocarse en una relación funcional con el promotor vírico. El gen de interés puede codificar una proteína, un siRNA,
o un microRNA. En algunas realizaciones, el polinucleótido a introducir puede comprender varios genes que codifican al menos una proteína, al menos un siRNA, al menos un microRNA o cualesquiera combinaciones de los 50 mismos. Por ejemplo, el polinucleótido a introducir puede incluir uno o varios genes que codifican uno o varios antígenos contra los cuales se desea estimular una respuesta inmunitaria. El uno o varios antígenos pueden estar asociados a una única enfermedad o trastorno, o pueden estar asociados a varias enfermedades y/o trastornos. En algunas realizaciones, se puede construir un gen que codifica una proteína reguladora inmunitaria con un gen primario que codifica un antígeno contra el cual se desea estimular una respuesta inmunitaria, y la combinación
55 puede desencadenar y regular la respuesta inmunitaria en la dirección y magnitud deseadas. En algunas realizaciones se puede construir un gen que codifica un siRNA o microRNA con un gen primario que codifica un antígeno contra el cual se desea estimular una respuesta inmunitaria, y la combinación puede regular el alcance de la respuesta inmunitaria (véase, por ejemplo, las realizaciones de los polinucleótidos de la figura 24c y de la figura 24d, con las secuencias acompañantes SEQ ID n.º 9 y SEQ ID n.º 10, respectivamente). En algunas realizaciones, un gen que codifica una proteína marcadora se puede colocar detrás de un gen primario de interés para permitir la identificación de las células que expresan la proteína deseada. En una realización, una proteína marcadora fluorescente, preferiblemente la proteína fluorescente verde (GFP), se incorpora en la construcción junto con el gen
5 de interés (que codifica típicamente un antígeno). Si se incluye más de un gen, también se incluyen preferiblemente las secuencias del sitio interno de entrada del ribosoma (IRES) o los elementos 2A, para separar el gen primario de interés de un gen indicador y/o cualquier otro gen de interés. Las IRES y las secuencias 2A pueden facilitar la expresión del gen indicador, o de otros genes.
La construcción vírica también puede contener otros elementos genéticos. Los tipos de elementos que se pueden
10 incluir en la construcción no están limitados de ningún modo y los elegirá el experto en la técnica para conseguir un resultado determinado. Por ejemplo, se puede incluir una señal que facilita la entrada del genoma viral en el núcleo de la célula diana. Un ejemplo de tal señal es la señal del colgajo del VIH-1.
Además, se pueden incluir elementos que facilitan la caracterización del sitio de integración del provirus en la célula diana. Por ejemplo, se puede incluir una secuencia del ARNt supresoror ámbar en la construcción.
15 Además, la construcción puede contener uno o varios elementos genéticos diseñados para estimular la expresión del gen de interés. Por ejemplo, se puede colocar en la construcción un elemento que responde al virus de la hepatitis de la marmota (WRE, por su nombre en inglés) (Zufferey et al. 1999. J. Virol. 74: 3668-3681; Deglon et al. 2000. Hum. Gene. Ther. 11: 179-190).
También puede incluirse en la construcción vírica un aislador de la β-globina del pollo. Se ha demostrado que este
20 elemento reduce la posibilidad de silenciar el provirus integrado en la célula diana debido a los efectos de la metilación y de la formación de heterocromatina. Además, el aislador puede proteger al potenciador interno, al promotor interno y al gen exógeno de los efectos posicionales positivos o negativos del ADN que rodea al sitio de integración en el cromosoma.
Cualquier otro elemento genético se insertará preferiblemente en 3' del gen de interés.
25 En una realización específica, el vector vírico comprende: una secuencia del potenciador/promotor del citomegalovirus (CMV); las secuencias R y U5 de la LTR en 5' del VIH; la señal del colgajo del VIH-1; un potenciador interno; un promotor interno; un gen de interés; el elemento que responde al virus de la hepatitis de la marmota (WRE); una secuencia del ARNt supresor ámbar; un elemento U3 con una deleción de su secuencia potenciadora; el aislador de la β-globina de pollo; y las secuencias R y U5 de la LTR en 3' del VIH.
30 La construcción vírica está clonada preferiblemente en un plásmido que se puede transfectar en una línea celular de empaquetamiento. El plásmido preferido comprende preferiblemente secuencias útiles para la replicación del plásmido en las bacterias.
Introducción del virus
El virus se puede introducir en una célula diana de cualquier manera que permita que el virus entre en contacto con
35 las células dendríticas (CD) destinatarias en las cuales se desea introducir un polinucleótido de interés. En las realizaciones preferidas se introduce directamente una cantidad adecuada del virus en un animal (in vivo), por ejemplo, mediante inyección en el cuerpo. En algunas realizaciones preferidas, las partículas víricas se inyectan en el torrente circulatorio periférico de un mamífero. En otras realizaciones preferidas, las partículas víricas se inyectan en un mamífero a través de la inyección intradérmica, inyección subcutánea, inyección en la cavidad intraperitoneal
40 o inyección intravenosa. El virus se puede administrar con un dispositivo de inyección subdérmica tal como los dispositivos descritos en las patentes de los EE.UU. n.º 7.241.275, 7.115.108, 7.108.679, 7.083.599, 7.083.592, 7.047.070, 6.971.999, 6.808.506, 6.780.171, 6.776.776, 6.689.118, 6.670.349, 6.569.143, 6.494.865, 5.997.501, 5.848.991, 5.328.483, 5.279.552, 4.886.499. Otros sitios de inyección también son adecuados, tal como directamente en los órganos que comprenden las células destinatarias. Por ejemplo, se puede utilizar la inyección en
45 el ganglio linfático, la inyección en el bazo o la inyección en la médula ósea para introducir el virus en el ganglio linfático, en el bazo y en la médula ósea, respectivamente. Según las circunstancias concretas y la naturaleza de las células destinatarias, se puede llevar a cabo la introducción por otros medios que incluyen, por ejemplo, la inhalación
o el contacto directo con los tejidos epiteliales, por ejemplo, los del ojo, de la boca o de la piel.
En otras realizaciones se proporcionan las células diana y se ponen en contacto con el virus in vitro, tal como en las
50 placas de cultivo. Las células diana son típicamente células dendríticas obtenidas de un sujeto sano o de un sujeto que necesita tratamiento. Preferiblemente, las células diana son células dendríticas obtenidas de un sujeto en quien se desea estimular una respuesta inmunitaria contra un antígeno. Los procedimientos para obtener células de un sujeto se conocen bien en la técnica. El virus se puede suspender en los medios y añadir a los pocillos de una placa de cultivo, a un tubo o a otro contenedor. Los medios que contienen el virus se pueden añadir antes de la siembra
55 de las células en la placa o después de haber sembrado las células en las placas. Preferiblemente, las células se incuban en una cantidad apropiada de los medios para proporcionar viabilidad y permitir concentraciones adecuadas
del virus en los medios de tal forma que se produzca la infección de las células del hospedador.
Las células se incuban preferiblemente con el virus durante una cantidad de tiempo suficiente para permitir que el virus infecte las células. Preferiblemente, las células se incuban con el virus durante al menos 1 hora, más 5 preferiblemente al menos 5 horas e incluso más preferiblemente al menos 10 horas.
En las realizaciones de introducción in vivo e in vitro, puede utilizarse cualquier concentración de virus que sea suficiente para infectar las células diana deseadas, como puede determinar fácilmente el experto en la técnica. Cuando se ha de cultivar la célula diana, la concentración de las partículas víricas es de al menos 1 UFP/μL, más preferiblemente al menos 10 UFP/μl, incluso más preferiblemente al menos 400 UFP/μl e incluso más
10 preferiblemente al menos 1 x 104 UFP/μl.
En algunas realizaciones, tras la infección in vitro con el virus, se pueden introducir (o reintroducir) las células diana en un animal. En algunas realizaciones, las células se pueden introducir en la dermis, bajo la dermis o en el torrente circulatorio periférico. Las células introducidas en un animal son preferiblemente células procedentes de ese animal, para evitar una respuesta inmunitaria adversa. También pueden utilizarse células que proceden de un animal
15 donante que tiene una compatibilidad inmunitaria similar. Se pueden usar otras células, entre ellas las diseñadas para eludir una respuesta inmunógena adversa.
Se puede analizar las células diana, por ejemplo, para determinar si han integrado, transcrito y/o expresado el polinucleótido o gen(es) de interés, cuál es el número de copias del gen integrado y cuál es la posición de la integración. Tal análisis se puede llevar a cabo en cualquier momento y se puede llevar a cabo mediante cualquier
20 procedimiento conocido en la técnica.
A los sujetos en los cuales se administra un virus recombinante o las CD infectadas por un virus se les puede analizar la posición de las células infectadas, la expresión del polinucleótido o gen de interés introducido con el virus, la estimulación de una respuesta inmunitaria y se les pueden vigilar los síntomas asociados a una enfermedad o trastorno mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica.
25 Los procedimientos para infectar las células descritos más arriba no dependen de las características específicas de cada una de las células. Como resultado, se extienden fácilmente a todos los mamíferos. En algunas realizaciones, el virus recombinante se introduce en un humano o en las células dendríticas humanas. En otras realizaciones, el virus recombinante se introduce en un ratón o en las células dendríticas de ratón. Aún en otras realizaciones, el virus recombinante se introduce en un animal que no es un humano ni un ratón, o en las células dendríticas de un animal
30 que no es un humano ni un ratón.
Tal y como se explicó más arriba, el virus recombinante puede estar seudotipado para conferirle un amplio abanico de huéspedes, así como especificidad por la célula diana. El experto en la técnica también tendrá presentes los promotores internos adecuados con los que se consigue la expresión deseada de un polinucleótido o gen de interés en una especie animal concreta. Así pues, el experto en la técnica será capaz de modificar el procedimiento de
35 infección de las células dendríticas procedentes de cualquier especie.
Se puede evaluar el virus recombinante para determinar la especificidad de la molécula orientadora incorporada en el virus que reconoce selectivamente las células dendríticas. Por ejemplo, de un sujeto se puede obtener una población mixta de células de la médula ósea y cultivarla in vitro. El virus recombinante se puede administrar a la población mixta de células de la médula ósea, y en las células diana se puede analizar la expresión de un gen
40 indicador incorporado en el virus. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 50%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 60%, 70%, 80% o 90%, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% de las células transducidas en la población mixta de células son células dendríticas que expresan la DC-SIGN.
Tratamiento
45 Los procedimientos de la presente invención se pueden utilizar para prevenir o tratar una amplia gama de enfermedades o trastornos, en particular aquéllos para los cuales sería beneficiosa la activación de una respuesta inmunitaria de un paciente. Muchas de estas enfermedades se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, las enfermedades o trastornos que se pueden tratar o prevenir con los procedimientos de la presente invención incluyen, sin limitación, cánceres, enfermedades autoinmunitarias e infecciones, entre ellas infecciones víricas, bacterianas,
50 micóticas y parasitarias. En las realizaciones de la invención, una enfermedad se trata con virus recombinantes para introducir un gen de interés en las células dendríticas, en donde la expresión del gen produce un antígeno específico de la enfermedad y conduce a la estimulación de respuestas inmunitarias celulares y respuestas inmunitarias humorales específicas del antígeno.
En las realizaciones de la invención se utiliza un virus recombinante para introducir en células dendríticas polinucleótidos que codifican un antígeno contra el cual se desea estimular una respuesta inmunitaria. En algunas realizaciones, la introducción se puede conseguir poniendo en contacto in vitro las células dendríticas con el virus recombinante, después de lo cual las células dendríticas transducidas se administran a un paciente. En algunas realizaciones, la introducción se puede conseguir mediante la introducción del virus en un sujeto para que entre en
5 contacto in vivo con las células dendríticas. A continuación, las células dendríticas estimulan los linfocitos T o los linfocitos B específicos del antígeno en un paciente para inducir las respuestas inmunitarias celular y humoral contra el antígeno expresado. En tales realizaciones, un paciente que padece un trastorno o enfermedad se trata mediante la generación de células inmunitarias con una especificidad deseada.
En las células dendríticas se puede introducir cualquier antígeno que está asociado a una enfermedad o trastorno
10 mediante el uso de los virus recombinantes tal y como se describe en la presente memoria. Se identifica un antígeno que está asociado a la enfermedad o trastorno para la preparación de un virus recombinante que reconoce selectivamente las células dendríticas. Se conocen bien en la técnica los antígenos asociados a muchas enfermedades y trastornos. Se puede saber con anterioridad que un antígeno está asociado a la enfermedad o trastorno, o se puede identificar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Por ejemplo, se puede
15 saber que un antígeno está asociado a un tipo de cáncer como el que padece un paciente, tal como un antígeno asociado a un tumor. En un aspecto, la invención da a conocer un procedimiento para introducir in vivo genes que codifican antígenos tumorales y otras proteínas necesarias en las CD mediante lentivirus recombinantes modificados genéticamente. En otras realizaciones, en el paciente a tratar se identifica un antígeno relacionado con la enfermedad o trastorno. Por ejemplo, un antígeno asociado a un tumor puede identificarse en el propio tumor
20 mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Los antígenos asociados a tumores no están limitados de ninguna manera e incluyen, por ejemplo, los antígenos que se identifican en las células cancerosas del paciente a tratar.
Los antígenos asociados a tumores se conocen en muchos cánceres distintos, entre ellos, por ejemplo, el cáncer de próstata y el cáncer de mama. En algunos cánceres de mama, por ejemplo, el receptor Her-2 está sobreexpresado 25 en la superficie de las células cancerosas. Los antígenos tumorales de ejemplo incluyen, pero sin limitarse a ellos: MAGE, BAGE, RAGE y NY-ESO, que son antígenos no mutados que se expresan en las regiones inmunoprivilegiadas de los testículos y en una serie de células tumorales; antígenos tumorales específicos de estirpe ceular, tales como los antígenos de la estirpe de melanoma-melanocitos MART-1/Melan-A, gp100, gp75, mda-7, tirosinasa y proteína relacionada con la tirosinasa, o el antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA, por 30 su nombre en inglés) y antígeno específico de la próstata (PSA, por su nombre en inglés), que son antígenos que se expresan en las células neoplásicas y normales procedentes del mismo tejido; proteínas/péptidos con epítopos procedentes de genes mutados en las células tumorales o genes transcritos a diferentes niveles entre los tumores y las células normales, tal como ras mutado, reorganización bcr/abl, Her2/neu, p53 de tipo silvestre o mutado, citocromo P450 IB1, y secuencias intrónicas que se expresan anormalmente, tal como N35 acetilglucosaminiltransferasa-V; reorganizaciones clonales de los genes de inmunoglobulina que generan idiotipos únicos en los mielomas y linfomas de linfocitos B; proteínas/péptidos con epítopos procedentes de procesos oncovíricos, tal como las proteínas E6 y E7 del virus del papiloma humano; proteínas oncofetales sin mutar con una expresión selectiva en el tumor, tal como el antígeno carcinoembrionario y la α-fetoproteína. Se han revisado una serie de antígenos asociados a tumores (véase, por ejemplo, «Tumor-antigens recognized by T-lymphocytes», Boon
40 T., Cerottini J. C., Vandeneynde B., Vanderbruggen P., Vanpel A,. Annual Review of Immunology, 12: 337-365, 1994; «A listing of human tumor antigens recognized by T cells», Renkvist N., Castelli C., Robbins P. F., Parmiani G. Cancer Immunology Immunotherapy 50: (1) 3-15 marzo de 2001).
El antígeno puede ser también un antígeno asociado con una enfermedad infecciosa, tal como, por ejemplo,
VIH/sida. El antígeno puede ser, por ejemplo, gp120 (Klimstra, W. B. et al. 2003. J. Virol. 77: 12022-12032; Bernard,
45 K. A., et al. 2000. Virology 276: 93-103; Bymes, A. P et al. 1998. J. Virol. 72: 7349-7356). Otros antígenos de ejemplo incluyen, pero sin limitarse a ellos: gag, pol, env, tat, nef y rev (Lieberman, J. et al. 1997. AIDS Res Hum Retroviruses 13 (5): 383-392; Menéndez-Arias, L. et al. 1998. Viral Immunol 11(4): 167-181).
Los ejemplos de antígenos víricos incluyen, pero sin limitarse a ellos, polipéptidos de adenovirus, polipéptidos de alfavirus, polipéptidos de calicivirus, p. ej., un antígeno de la cápsida de calicivirus, polipéptidos de coronavirus, 50 polipéptidos del virus del moquillo, polipéptidos del virus del Ébola, polipéptidos de enterovirus, polipéptidos de flavivirus, polipéptidos (AE) de virus de la hepatitis, p, ej., un antígeno de la superficie o del núcleo de la hepatitis B, polipéptidos del virus del herpes, p. ej., virus del herpes simple o glucoproteína del virus de la varicela zóster, polipéptidos de virus de la inmunodeficiencia, p. ej., la envoltura o la proteasa del virus de la inmunodeficiencia humana, polipéptidos del virus de la peritonitis infecciosa, polipéptidos del virus de la gripe, p, ej., una hemaglutinina, 55 neuraminidasa o nucleoproteína de la gripe A, polipéptidos del virus de la leucemia, polipéptidos del virus de Marburg, p. ej., polipéptidos de ortomixovirus, polipéptidos del virus del papiloma, polipéptido del virus paragripal, p. ej., la hemaglutinina/neuraminidasa, polipéptidos de paramixovirus, polipéptidos de parvovirus, polipéptidos de pestivirus, polipéptidos de picornavirus, p. ej., un polipéptido de la cápsida del virus de la polio, polipéptidos del virus de la viruela, p. ej., polipéptido del virus de la variolovacuna, polipéptidos del virus de la rabia, p. ej., glucoproteína G
60 del virus de la rabia, polipéptidos de reovirus, polipéptidos de retrovirus y polipéptidos de rotavirus.
Ejemplos de antígenos bacterianos incluyen, pero sin limitarse a ellos, polipéptidos de Actinomyces, polipéptidos de
Bacillus, polipéptidos de Bacterioides, polipéptidos de Bordetella, polipéptidos de Bartonella, polipéptidos de Borrelia,
p. ej. OspA de B. bugdorferi, polipéptidos de Brucella, polipéptidos de Campylobacter, polipéptidos de Capnocytophaga, polipéptidos de Chlamydia, polipéptidos de Clostridium, polipéptidos de Corynebacterium, 5 polipéptidos de Coxiella, polipéptidos de Dermatophilus, polipéptidos de Enterococcus, polipéptidos de Ehrlichia, polipéptidos de Escherichia, polipéptidos de Francisella, polipéptidos de Fusobacterium, polipéptidos de Haemobartonella, polipéptidos de Haemophilus, p. ej., proteína de la membrana externa de tipo b de H. influenzae, polipéptidos de Helicobacter, polipéptidos de Klebsiella, polipéptidos de bacterias con forma de L, polipéptidos de Leptospira, polipéptidos de Listeria, polipéptidos de Mycobacteria, polipéptidos de Mycoplasma, polipéptidos de
10 Neisseria, polipéptidos de Neorickettsia, polipéptidos de Nocardia, polipéptidos de Pasteurella, polipéptidos de Peptococcus, polipéptidos de Peptostreptococcus, polipéptidos de Pneumococcus, polipéptidos de Proteus, polipéptidos de Pseudomonas, polipéptidos de Rickettsia, polipéptidos de Rochalimaea, polipéptidos de Salmonella, polipéptidos de Shigella, polipéptidos de Staphylococcus, polipéptidos de Streptococcus, p. ej., proteínas M de S. pyogenes, polipéptidos de Treponema y polipéptidos de Yersinia, p. ej., antígenos F1 y V de Y. pestis.
15 Ejemplos de antígenos de hongos incluyen, pero sin limitarse a ellos, polipéptidos de Absidia, polipéptidos de Acremonium, polipéptidos de Alternaria, polipéptidos de Aspergillus, polipéptidos de Basidiobolus, polipéptidos de Bipolaris, polipéptidos de Blastomyces, polipéptidos de Candida, polipéptidos de Coccidioides, polipéptidos de Conidiobolus, polipéptidos de Cryptococcus, polipéptidos de Curvalaria, polipéptidos de Epidermophyton, polipéptidos de Exophiala, polipéptidos de Geotrichum, polipéptidos de Histoplasma, polipéptidos de Madurella,
20 polipéptidos de Malassezia, polipéptidos de Microsporum, polipéptidos de Moniliella, polipéptidos de Mortierella, polipéptidos de Mucor, polipéptidos de Paecilomyces, polipéptidos de Penicillium, polipéptidos de Phialemonium, polipéptidos de Phialophora, polipéptidos de Prototheca, polipéptidos de Pseudallescheria, polipéptidos de Pseudomicrodochium, polipéptidos de Pythium, polipéptidos de Rhinosporidium, polipéptidos de Rhizopus, polipéptidos de Scolecobasidium, polipéptidos de Sporothrix, polipéptidos de Stemphylium, polipéptidos de
25 Trichophyton, polipéptidos de Trichosporon y polipéptidos de Xylohypha.
Ejemplos de antígenos de parásitos protozoarios incluyen, pero sin limitarse a ellos, polipéptidos de Babesia, polipéptidos de Balantidium, polipéptidos de Besnoitia, polipéptidos de Cryptosporidium, polipéptidos de Eimeria, polipéptidos de Encephalitozoon, polipéptidos de Entamoeba, polipéptidos de Giardia, polipéptidos de Hammondia, polipéptidos de Hepatozoon, polipéptidos de Isospora, polipéptidos de Leishmania, polipéptidos de Microsporidia, 30 polipéptidos de Neospora, polipéptidos de Nosema, polipéptidos de Pentatrichomonas, polipéptidos de Plasmodium,
p. ej., circunesporozoito de P, falciparum (PfCSP), proteína 2 de la superficie de esporozoito (PfSSP2), extremo del carboxilo del antígeno 1 del estado del hígado (PfLSA1 c-term) y proteína 1 exportada (PfExp-1), polipéptidos de Pneumocystis, polipéptidos de Sarcocystis, polipéptidos de Schistosoma, polipéptidos de Theileria, polipéptidos de Toxoplasma y polipéptidos de Trypanosoma.
35 Ejemplos de antígenos de parásitos helmínticos incluyen, pero sin limitarse a ellos, polipéptidos de Acanthocheilonema, polipéptidos de Aelurostrongylus, polipéptidos de Ancylostoma, polipéptidos de Angiostrongylus, polipéptidos de Ascaris, polipéptidos de Brugia, polipéptidos de Bunostomum, polipéptidos de Capillaria, polipéptidos de Chabertia, polipéptidos de Cooperia, polipéptidos de Crenosoma, polipéptidos de Dictyocaulus, polipéptidos de Dioctophyme, polipéptidos de Dipetalonema, polipéptidos de Diphyllobothrium, polipéptidos de Diplydium,
40 polipéptidos de Dirofilaria, polipéptidos de Dracunculus, polipéptidos de Enterobius, polipéptidos de Filaroides, polipéptidos de Haemonchus, polipéptidos de Lagochilascaris, polipéptidos de Loa, polipéptidos de Mansonella, polipéptidos de Muellerius, polipéptidos de Nanophyetus, polipéptidos de Necator, polipéptidos de Nematodirus, polipéptidos de Oesophagostomum, polipéptidos de Onchocerca, polipéptidos de Opisthorchis, polipéptidos de Ostertagia, polipéptidos de Parafilaria, polipéptidos de Paragonimus, polipéptidos de Parascaris, polipéptidos de
45 Physaloptera, polipéptidos de Protostrongylus, polipéptidos de Setaria, polipéptidos de Spirocerca, polipéptidos de Spirometra, polipéptidos de Stephanofilaria, polipéptidos de Strongyloides, polipéptidos de Strongylus, polipéptidos de Thelazia, polipéptidos de Toxascaris, polipéptidos de Toxocara, polipéptidos de Trichinella, polipéptidos de Trichostrongylus, polipéptidos de Trichuris, polipéptidos de Uncinaria y polipéptidos de Wuchereria.
Ejemplos de antígenos de ectoparasitarios incluyen, pero sin limitarse a ellos, polipéptidos (entre ellos los antígenos
50 protectores así como los alérgenos) de pulgas; garrapatas, entre ellas garrapatas duras y garrapatas blandas; moscas, tales como mosquitos pequeños, mosquitos zancudos, mosquito transmisor de la leishmaniosis, moscas negras, tábanos, moscas de los cuernos, tábanos, moscas tse-tsé, moscas mordedoras, moscas que provocan miasis y insectos chupadores; hormigas; arañas; piojos; ácaros; y chinches, tales como las de la cama y las chupasangre.
55 Una vez que se ha identificado y/o seleccionado un antígeno, se identifica un polinucleótido que codifica el antígeno deseado. Preferiblemente, el polinucleótido comprende un ADNc. Los polinucleótidos que codifican el antígeno se introducen preferiblemente en las células dendríticas diana mediante un virus recombinante, más preferiblemente un lentivirus o gammarretrovirus recombinante, que incluye una molécula orientadora que se fija a la DC-SIGN como se describe más arriba. El virus recombinante se fija primero a la membrana de las células dendríticas por medio de la molécula orientadora de la DC-SIGN, y el núcleo vírico que contiene un polinucleótido que codifica el antígeno pasa posteriormente al citosol. El polinucleótido (p. ej., uno que codifica el antígeno) a continuación se integra preferiblemente en el genoma de la célula y se expresa. Si se pone en contacto ex vivo, las células dendríticas diana se devuelven luego al paciente, por ejemplo mediante inyección, en donde interaccionan con las células inmunitarias
5 que son capaces de generar una respuesta inmunitaria contra el antígeno deseado. En las realizaciones preferidas, el virus recombinante se inyecta en el paciente y se transduce en las células dendríticas diana in situ. A continuación, las células dendríticas expresan el antígeno concreto asociado a una enfermedad o trastorno a tratar, y el paciente es capaz de montar una respuesta inmunitaria eficaz contra la enfermedad o trastorno.
En algunas realizaciones, el virus recombinante contiene una secuencia polinucleotídica que codifica más de un
10 antígeno, y tras la transducción de una célula dendrítica diana, genera respuestas inmunitarias contra la multitud de antígenos introducidos en la célula. En algunas realizaciones, los antígenos están relacionados con una única enfermedad o trastorno. En otras realizaciones, los antígenos están relacionados con varias enfermedades o trastornos.
En las realizaciones de la invención, los factores de maduración de las CD que activan y/o estimulan la maduración
15 de las CD se introducen junto con el virus recombinante que lleva el polinucleótido o gen de interés. En algunas realizaciones, las CD se activan mediante la introducción de los factores de maduración de las CD antes de la introducción del virus. En algunas realizaciones, las CD se activan mediante la introducción de los factores de maduración de las CD tras la introducción del virus. En algunas realizaciones, las CD se activan mediante la introducción de los factores de maduración de las CD a la vez que se introduce el virus. En algunas realizaciones,
20 los factores de maduración de las CD se proporcionan junto con la administración del virus. En otras realizaciones, los factores de maduración de las CD se proporcionan de forma independiente a la administración del virus.
En algunas realizaciones, uno o más factores de maduración de las CD pueden estar codificados por uno o más genes que están contenidos en el virus y que se expresan después de que el virus se transduce en una célula dendrítica. En algunas realizaciones, el uno o los varios genes que codifican los factores de maduración de las CD
25 se pueden incluir en un vector vírico que codifica un antígeno. En otras realizaciones, el gen o los varios genes que codifican los factores de maduración de las CD se pueden proporcionar en un vector distinto que se cotransfecta con el vector vírico que codifica uno o varios antígenos en una línea celular de empaquetamiento.
En algunas realizaciones, los procedimientos de la presente invención se pueden utilizar para la inmunoterapia
adoptiva en un paciente. Tal y como se describe más arriba, se identifica un antígeno contra el cual se desea
30 estimular una respuesta inmunitaria. Se obtiene un polinucleótido que codifica el antígeno deseado y se empaqueta en un virus recombinante. Las células dendríticas diana se obtienen del paciente y se transducen con un virus recombinante que contiene un polinucleótido que codifica el antígeno deseado. A continuación, las células dendríticas se transfieren de vuelta al paciente.
Vacunación
35 Tal y como se explica más arriba, para el uso en la producción de un virus recombinante que introduce un gen que codifica un antígeno en las CD, se contemplan distintas moléculas orientadoras manipuladas genéticamente que se fijan al marcador de superficie de las células dendríticas DC-SIGN. El virus puede utilizarse para transducir las CD in vitro o in vivo para la prevención de una enfermedad o trastorno. Por ejemplo, la glucoproteína de la envoltura del virus de Sindbis puede manipularse genéticamente para que se fije preferiblemente a la DC-SIGN y puede utilizarse
40 para el seudotipado de un virus recombinante. Un gen que codifica un antígeno contra el cual se desea estimular una respuesta inmunitaria, tal como contra el cáncer (por ejemplo, Mart-1) u otra enfermedad/trastorno (tal como una infección vírica), puede introducirse en las CD mediante los procedimientos descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones se pueden introducir en las CD varios genes que codifican varios antígenos mediante los procedimientos descritos en la presente memoria, mediante el uso de varios vectores víricos o, preferiblemente, un
45 sistema de vector multicistrónico. El uno o varios genes para el uno o varios antígenos puede estar acompañado por los genes que codifican moléculas estimuladoras (tales como GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNFα, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando de CD40 (CD40L), CD40 inducible por fármacos (iCD40) y similares) y/o una molécula indicadora (tal como GFP, luciferasa y similares) mediante varios vectores o, preferiblemente, un sistema de vector multicistrónico.
50 En algunas realizaciones de la invención, las CD humanas se generan obteniendo progenitores hematopoyéticos humanos CD34α+ y utilizando un procedimiento de cultivo in vitro como el descrito en otro documento (p. ej., Banchereau et al. Cell 106, 271-274 (2001)). Los virus que llevan una molécula orientadora que se fija a la DC-SIGN se sintetizan comprendiendo un gen que codifica un antígeno contra el cual se desea estimular una respuesta inmunitaria y se utilizan para transducir las CD humanas. La especificidad y eficacia de la transducción se pueden
55 cuantificar por FACS. La maduración de las CD puede caracterizarse mediante el análisis por FACS de la inducción de marcadores de superficie tal como el CMH II.
En otras realizaciones, el virus puede inyectarse in vivo, donde entra en contacto con las CD naturales e introduce un polinucleótido de interés, típicamente un gen que codifica un antígeno. La cantidad de partículas víricas es de al menos 50 x 106 UT, y puede ser de al menos 1 x 107 UT, al menos 2 x 107 UT, al menos 3 x 107 UT, al menos 4 x 107 UT o al menos 5 x 107 UT. A determinados intervalos, las CD de los órganos linfáticos del destinatario se pueden utilizar para medir la expresión, por ejemplo, mediante la observación de la expresión de marcadores, tal como la
5 GFP o la luciferasa. Los linfocitos T de los ganglios linfáticos y del bazo de los pacientes tratados con el virus se pueden medir a partir de la magnitud y durabilidad de la respuesta a la estimulación del antígeno. En las células del tejido que no son las CD, tal como las células epiteliales y las células linfocíticas, se puede analizar la especificidad de la introducción génica in vivo.
Hay amplio acuerdo en que el procedimiento posiblemente más eficaz para acabar con la epidemia del sida (u otras
10 enfermedades víricas) es una vacuna. Hasta la fecha, ningún procedimiento de vacunación contra el VIH ha pasado con éxito un estudio de fase III. Así pues, hay una necesidad urgente de nuevas y eficaces estrategias de vacunación. En algunas realizaciones de la invención se utiliza la vacunación con las CD. Se clona un gen que codifica una proteína vírica, tal como las descritas más arriba, en un vector vírico. Los pacientes se infectan con virus que comprenden una molécula orientadora que se fija a la DC-SIGN en las CD, preferiblemente con una
15 especificidad tal que se eluden los efectos secundarios indeseados. La molécula orientadora puede ser, por ejemplo, una glucoproteína de la envoltura del virus de Sindbis manipulada genéticamente, y la administración del virus puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante inyección. En un modelo animal, los virus indicadores del VIH clonados molecularmente (NFNSZ-r-HSAS, NL-r-HSAS) y los aislados clínicos se pueden utilizar para sensibilizar a los animales mediante una inyección en la vena de la cola. Que la infección ha tenido lugar se puede seguir en el
20 tiempo en los esplenocitos, en los ganglios linfáticos y en la sangre periférica. La PCR de la proteína HIV-gag y el FACS de HAS en los virus indicadores se pueden utilizar para comprobar la integración y replicación víricas. La vacunación productiva con CD in situ puede incrementar la resistencia a una prueba de provocación con el VIH. Véanse los ejemplos 17-20.
En algunas realizaciones, se dan a conocer las células dendríticas transducidas con un virus recombinante tal y
25 como se describe en la presente memoria para la prevención o el tratamiento de una enfermedad o trastorno. En las realizaciones preferidas, las células dendríticas expresan un antígeno contra el cual se desea estimular una respuesta inmunitaria. El antígeno es típicamente uno que normalmente no se expresa en una célula dendrítica, sino que se expresa después de que la célula diana se haya transducido con el virus recombinante que contiene un polinucleótido que codifica el antígeno. En algunas realizaciones, las células dendríticas expresan además un factor
30 de maduración de las CD que se proporciona a la célula dendrítica mediante un virus recombinante tal y como se describe en la presente memoria.
En algunos aspectos de la invención, se administra un adyuvante junto con un virus recombinante de la invención. El adyuvante se puede administrar con el virus recombinante, antes del virus recombinante o después del virus recombinante.
35 Se pueden utilizar una gama de adyuvantes en combinación con el virus recombinante de la invención para desencadenar una respuesta inmunitaria contra el antígeno codificado por el virus recombinante. Los adyuvantes preferidos aumentan la respuesta intrínseca a un antígeno sin ocasionar cambios conformacionales en el antígeno que afectan a la forma cualitativa de la respuesta. Los adyuvantes preferidos incluyen alumbre, lípido A monofosforilado y 3-des-O-acilado (MPL, por su nombre en inglés) (véase la patente del Reino Unido GB 2220211).
40 El QS21 es un glucósido triterpénico o saponina aislado de la corteza del árbol Quillaja saponaria Molina encontrado en América del Sur (véase Kensil et al., en Vaccine Design: The subunit and adjuvant approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); patente de los EE.UU. n.º 5.057.540). Otros adyuvantes son emulsiones de aceite en agua (tal como escualeno o aceite de cacahuete), opcionalmente en combinación con estimulantes inmunitarios, tal como el lípido A monofosforilado (véase Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Otro
45 adyuvante es CpG (Bioworld Today, 15 de noviembre de 1998). Otra posibilidad sería conjugar Aβ a un adyuvante. Por ejemplo, una versión lipopeptídica de Aβ se puede preparar conjugando ácido palmítico u otros lípidos directamente al extremo amino de Aβ como se describe para la vacunación del antígeno de la hepatitis B (Livingston,
J. Immunol, 159, 1383-1392 (1997)). No obstante, tal conjugación no debe cambiar sustancialmente la conformación de Aβ de modo que no se afectará la naturaleza de la respuesta inmunitaria contra éste. Los adyuvantes se pueden
50 administrar como un componente de una composición terapéutica con un agente activo o se pueden administrar por separado, antes, a la vez o después de la administración del agente terapéutico.
Una clase preferida de adyuvantes son las sales de aluminio (alumbre), tal como el hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio. Tales adyuvantes pueden utilizarse con o sin otros agentes inmunoestimuladores específicos, tales como MPL o 3-DMP, QS21, aminoácidos poliméricos o monoméricos, tal como ácido poliglutámico 55 o polilisina. Otra clase de adyuvantes son las formulaciones de emulsiones de aceite en agua. Tales adyuvantes se pueden usar con o sin otros agentes inmunoestimuladores específicos tales como péptidos de muramilo (p. ej., Nacetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), Nacetimuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), N-acetilglucosaminil-N-acetilmuramil-L-Al-D-isoglu-L-Ala-diplamitoxi-propilamida (DTP-DPP) teramidaTM), u otros componentes de la pared de las células bacterianas. Las emulsiones de aceite en agua incluyen (a) MF59 (patente internacional WO 90/14837), que contiene escualeno al 5%, Tween 80 al 0,5% y Span 85 al 0,5% (que contiene opcionalmente distintas cantidades de MTP-PE) formuladas en partículas de rango submicrométrico mediante un microfluidificador tal como el microfluidificador de modelo 110Y (Microfluidics, Newton MA), (b) SAF, que contiene 5 escualeno al 10%, Tween 80 al 0,4%, polímero L121 bloqueado con plurónico al 5% y thr-MDP, bien microfluidificado en una emulsión de rango submicrométrico o agitado vorticialmente para generar una emulsión con un tamaño de partículas más grande, y (c) sistema adyuvante RibiTM (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene escualeno al 2%, Tween 80 al 0,2% y uno o varios componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en lípido A monofosforilado (MPL, por su nombre el inglés), dimicolato de trehalosa (TDM, por su 10 nombre en inglés) y esqueleto de la pared celular (CWS, por su nombre en inglés), preferiblemente MPL + EPC (DetoxTM). Otra clase de adyuvantes preferidos son los adyuvantes de saponina, tal como StimulonTM (QS21, Aquila, Worcester, MA) o las partículas generadas de éstos, tal como ISCOM (complejos inmunoestimuladores) e ISCOMATRIX. Otros adyuvantes incluyen adyuvante completo de Freund (ACF) y adyuvante incompleto de Freund (AIF). Otros adyuvantes incluyen citocinas, tales como interleucinas (IL-1, IL-2 e IL-12), factor estimulador de las
15 colonias de macrófagos (M-CSF, por su nombre en inglés), factor de la necrosis tumoral (TNF, por su nombre en inglés).
Se puede administrar un adyuvante con el virus recombinante de la invención como una única composición, o se puede administrar antes, a la vez o después de la administración del virus recombinante de la invención. El inmunógeno y el adyuvante se pueden envasar y suministrar en el mismo vial o se pueden envasar en viales 20 distintos y mezclarlos antes de su uso. El inmunógeno y el adyuvante se envasan típicamente con una etiqueta que indica la aplicación terapéutica para la que se han diseñado. Si el inmunógeno y el adyuvante se envasan por separado, el envase incluye típicamente las instrucciones para el mezclado antes de su uso. La elección de un adyuvante y/o vehículo depende de la estabilidad de la vacuna cuando contiene el adyuvante, la vía de administración, la pauta posológica, la eficacia del adyuvante para las especies que hay que vacunar y, en los 25 humanos, un adyuvante farmacéuticamente aceptable es uno que se ha autorizado o que se puede autorizar para la administración humana por las autoridades reguladoras pertinentes. Por ejemplo, el adyuvante completo de Freund no es adecuado para la administración a los humanos. Se prefieren alumbre, MPL y QS21. Opcionalmente, se pueden utilizar simultáneamente dos o más adyuvantes diferentes. Las combinaciones preferidas incluyen alumbre con MPL, alumbre con QS21, MPL con QS21, y alumbre, QS21 y MPL juntos. De igual forma, se puede utilizar el
30 adyuvante incompleto de Freund (Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)), opcionalmente en combinación con cualquiera de alumbre, QS21 y MPL y todas las combinaciones de los mismos.
Composiciones farmacéuticas y kits
También se contemplan en la presente memoria las composiciones farmacéuticas y kits que contienen un virus recombinante dado a conocer en la presente memoria y uno o más componentes. Las composiciones farmacéuticas
35 pueden incluir un virus recombinante dado a conocer en la presente memoria y un vehículo farmacéutico. Los kits pueden incluir las composiciones farmacéuticas y/o las combinaciones dadas a conocer en la presente memoria, y uno o más componentes, tal como las instrucciones de uso, un dispositivo para administrar un compuesto a un sujeto y un dispositivo para administrar un compuesto a un sujeto.
En la presente memoria se dan a conocer las composiciones farmacéuticas que contienen un virus dado a conocer
40 en la presente memoria y un vehículo farmacéutico adecuado. Las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en la presente memoria pueden estar en varias formas, p. ej., en forma de sólido, líquido, polvo, acuosa o liofilizada. En la técnica se conocen ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados. Tales vehículos y/o aditivos se pueden formular mediante los procedimientos convencionales y se puede administrar al sujeto en una dosis adecuada. Los estabilizantes tales como lípidos, inhibidores de nucleasas, polímeros y quelantes pueden preservar las
45 composiciones de la degradación cuando están dentro del cuerpo.
Los virus recombinantes dados a conocer en la presente memoria se pueden envasar como kits. Los kits pueden incluir opcionalmente uno o varios componentes tal como las instrucciones de uso, dispositivos y otros reactivos, y componentes, tales como tubos, recipientes y jeringuillas para la práctica de los procedimientos. Los kits de ejemplo incluyen los virus dados a conocer en la presente memoria y pueden incluir opcionalmente las instrucciones de uso,
50 un dispositivo para detectar un virus en un sujeto, un dispositivo para administrar el virus a un sujeto y un dispositivo para administrar un compuesto a un sujeto.
En la presente memoria también se contemplan los kits que comprenden polinucleótidos que codifican un gen de interés (típicamente un antígeno). En algunas realizaciones, el kit incluye al menos un plásmido que codifica componentes de empaquetamiento del virus y un vector que codifica una molécula orientadora que está manipulada
55 genéticamente para que se fije a células dendríticas, preferiblemente con especificidad. En algunas realizaciones, el kit incluye al menos un plásmido que codifica componentes de empaquetamiento del virus, un vector que codifica una molécula orientadora que está manipulada genéticamente para que se fije a las células dendríticas y un vector que codifica al menos un factor de maduración de las CD.
También se contemplan en la presente memoria los kits que comprenden un vector vírico que codifica un gen de interés (típicamente un antígeno) y, opcionalmente, una secuencia polinucleotídica que codifica un factor de maduración de las CD. En algunas realizaciones, el kit incluye al menos un plásmido que codifica componentes de empaquetamiento del virus y un vector que codifica una molécula orientadora que está manipulada genéticamente
5 para que se fije a las células dendríticas.
En un ejemplo, un kit puede contener instrucciones. Las instrucciones incluyen típicamente una expresión tangible que describe el virus y, opcionalmente, otros componentes incluidos en el kit, y los procedimientos para la administración, que incluyen los procedimientos para determinar el estado correcto del paciente, la cantidad de dosis correcta y el procedimiento de administración correcto, para administrar el virus. Las instrucciones pueden también
10 incluir la guía para el seguimiento del sujeto a lo largo de la duración del tratamiento.
Los kits dados a conocer en la presente memoria también pueden incluir un dispositivo para administrar un virus a un paciente. Se puede incluir en los kits dados a conocer en la presente memoria cualquiera entre una gama de dispositivos conocidos en la técnica que sirven para administrar medicación o vacunas. Los dispositivos de ejemplo incluyen, pero sin limitarse a ellos, una aguja hipodérmica, una aguja intravenosa, un catéter, un dispositivo de
15 inyección sin aguja, un inhalador y un dispensador líquido, tal como un cuentagotas. Típicamente, el dispositivo del kit para administrar un virus será compatible con el virus del kit; por ejemplo, un dispositivo de inyección sin aguja tal como un dispositivo de inyección de alta presión puede estar incluido en los kits con virus que no resultan dañados por la inyección a alta presión, pero típicamente no estará incluido en los kits con virus que resultan dañados por la inyección a alta presión.
20 Los kits dados a conocer en la presente memoria también pueden incluir un dispositivo para administrar a un sujeto un compuesto, tal como un activador o estimulador de las CD. En los kits dados a conocer en la presente memoria se pueden incluir cualquiera de una gama de dispositivos conocidos en la técnica para administrar fármacos a un sujeto. Los dispositivos de ejemplo incluyen una aguja hipodérmica, una aguja intravenosa, un catéter, un dispositivo de inyección sin aguja, pero no se limitan a ellos, una aguja hipodérmica, una aguja intravenosa, un catéter, un
25 dispositivo de inyección sin aguja, un inhalador y un dispensador líquidos tal como un cuentagotas. Típicamente, el dispositivo para administrar el compuesto del kit será compatible con el procedimiento de administración del compuesto que se desea.
Los ejemplos siguientes se ofrecen sólo a efectos ilustrativos, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención de ningún modo. De hecho, a partir de la descripción que viene a continuación, a los expertos en la
30 técnica les resultarán evidentes una serie de modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en la presente memoria, y que caen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
Ejemplo 1
Manipulación genética de una molécula orientadora específica de las CD
35 Los vectores lentivíricos se pueden manipular genéticamente de forma racional para hacerlos capaces de transducirse en las CD de una manera específica de célula. Algunos grupos de CD llevan en la superficie la proteína DC-SIGN (Geijtenbeek, T. B., et al. 2000; Geijtenbeek, T. B., et al., 2000, véase más arriba), un receptor de tipo lectina C capaz de fijarse y endocitar rápidamente los materiales (Geijtenbeek, T. B., et al. 2004, véase más arriba), que puede utilizarse en las CD a modo de receptor diana. El virus de Sindbis (VS) —un miembro del género
40 Alphavirus y de la familia Togaviridae— es capaz de infectar las CD a través de la DC-SIGN (Klimstra, W. B., et al. 2003. J. Virol. 77: 12022-12032). Sin embargo, el receptor vírico canónico para la cepa de laboratorio del VS es el sulfato de heparano (SH) de la superficie celular, que expresan muchos tipos de células (Strauss, J. H., et al. 1994. Arch. Virol. 9: 473-484; Byrnes, A. P. y D. E. Griffin. 1998. J. Virol. 72: 7349-7356). Aprocehando que los dos sitios de fijación al receptor están separados en la glucoproteína de la envoltura del VS (de aquí en adelante se
45 denominará SVG por su nombre en inglés), se manipuló genéticamente el receptor para que no se fijara a su diana de fijación canónica SH y quedase intacta su capacidad para interaccionar con la DC-SIGN (figura 1). Una vez que se incorpora en una superficie vírica, esta glucoproteína mutante puede intervenir en la infección de las CD, pero no en la de otras células.
El ADNc para la SVG de tipo silvestre se obtuvo del laboratorio del Dr. J. H. Strauss en el Instituto de Tecnología de
50 California y se clonó en el vector pcDNA3 (Invitrogen) por PCR para generar el plásmido pSVG. Una etiqueta con diez restos (MYPYDVPDYA) se introdujo en la proteína E2 entre los aminoácidos 71 y 74 mediante mutagénesis por PCR para romper el sitio de fijación al SH (Karavans, G., et al. 1998. Crit. Rev. Oncol. Hemat. 28: 7-30; Lavillete, D., et al. 2001. Curr. Opin. Biotech. 12: 461-466; Russell, S. J., y F. L. Cosset. 1999. J. Gene Med 1: 300-311; Sandrin, V., et al. 2003. Curr Top Microbiol 281: 137-178; Verhoeyen, E. y F. L. Cosset. 2004. J. Gene Med 6: S83-S94). Un
55 anticuerpo disponible contra la secuencia de etiqueta insertada proporcionó la capacidad de seguimiento de la expresión de la SVG modificada. Para disminuir más la infección específica del SH, se identificaron varios restos críticos que estaban implicados en la fijación a las moléculas de SH (Coffin, J. M., et al. 1997. Retroviruses. Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; Battini, J. L., et al. 1998. J. Virol 72: 428-435; Valsesiawittmann, S., et al. 1994. J Virol 68: 4609-4619; Wu, B. W., et al. 2000. Virology 269: 7-17; Cosset, F. L. et al. 1995. J. Virol. 69: 63146322; Kayman, S. C., et al. 1999. J. Virol 73: 1802-1808; Lorimar, I. A. J. y S. J. Lavictoire. 2000. J. Immunol
5 Methods 237: 147-157; Barnett, A. L. et al. 2001. Proc. Nat Acad Sci USA 98: 4113-4118; Benedict, C. A. et al. 2002. Hum Gene Ther 10: 545-557; Gollan, T. J. y M. R. Green. 2002. J. Virol. 76: 3558-3563). Dos de tales restos se mutaron en alaninas (157KE158 a 157AA158).
Se introdujo una deleción adicional en la glucoproteína E3 de la SVG para retirar los aminoácidos 61-64. Esta SVG modificada se denominó SVGmu (SEQ ID n.º 11). El ADNc de la SVGmu se clonó cadena abajo del promotor del
10 CMV en el vector pcDNA3 (denominado pSVGmu, SEQ ID n.º 3).
Ejemplo 2
Preparación de virus recombinantes que contienen la molécula orientadora específica de las CD
La preparación del lentivirus recombinante seudotipado con SVGmu se llevó a cabo mediante transfección transitoria estándar mediada por fosfato de calcio de las células 293T con el vector lentivírico FUGW (SEQ ID n.º 1) o con sus 15 derivados, en donde las construcciones empaquetadas codifican los genes gag, pol y rev, y pSVGmu (ejemplo 1). FUGW es un vector lentivírico que se puede autoinactivar que lleva el promotor de la ubicuitina C humana para impulsar la expresión de un gen indicador, la GFP (Lois, C. et al. 2002. Science. 295: 868-872). Los vectores lentivíricos de transferencia (FUGW y sus derivados) utilizados en estos estudios son vectores lentivíricos basados en el VIH de tercera generación, en los cuales se ha eliminado la mayor parte de la región U3 de la LTR en 3', lo que
20 da lugar a la capacidad de autoinactivación de la LTR en 3' (SIN, por su nombre en inglés).
Para la transfección transitoria de las células 293T, las células 293T cultivadas en placas de cultivo de tejidos de 6 cm (Corning o BD Biosciences) se transfectaron con el plásmido del vector de transferencia lentivírico adecuado (5 μg) junto con 2,5 μg cada uno de los plásmidos de envoltura (SVG, SVGmu, Eco o VSVG) y los plásmidos de empaquetamiento (pMDLg/pRRE y pRSV-Rev). Los sobrenadantes víricos se recogieron 48 y 72 horas tras la
25 transfección y se filtraron por un filtro de 0,45 μm (Corning). Para preparar vectores víricos concentrados para el estudio in vivo, se ultracentrifugaron los sobrenadantes víricos (ultracentrífuga preparativa Optima L-80 K, Beckman Coulter) a 50.000 x g durante 90 min. A continuación, los sedimentos se resuspendieron en un volumen apropiado de PBS frío.
Los virus resultantes seudotipados con SVGmu se denominarán de aquí en adelante FUGW/SVGmu. Los virus de 30 control envueltos con la glucoproteína SVG de tipo silvestre se denominarán de aquí en adelante FUGW/SVG.
Ejemplo 3
Adquisición de imágenes confocales de los virus recombinantes empaquetados
Se produjeron lentivectores marcados con GFP-vpr tal y como se describió en el ejemplo 2, excepto que se utilizó el lentivector FUW (que no contiene el gen indicador de GFP) y que se usó un plásmido distinto que codifica la GFP35 vpr (2,5 μg). El sobrenadante vírico recién preparado se depositó sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos con polilisina en una placa de cultivo de 6 pocillos y se centrifugó a 3700 x g a 4 ºC durante 2 horas en una centrifuga Sorvall Legend RT. Los cubreobjetos de vidrio se enjuagaron con PBS frío dos veces y se inmunotiñeron con un anticuerpo anti-HA-biotina (Miltenyi Biotec) y Cy5-estrepatividina (Invitrogen). Se tomaron imágenes fluorescentes mediante un microscopio confocal de barrido con láser Zeiss LSM 510 equipado con conjuntos de filtros para
40 fluoresceína y Cy5. Se utilizó un objetivo apocromático plano de inmersión en aceite (63x/1,4) para la adquisición de las imágenes.
La figura 2 muestra los resultados de la adquisición de imágenes confocales del virus recombinante producido por el protocolo (la barra de escala representa 2 μm). Las partículas del portaobjetos «GFP» se tiñen de verde, las partículas del portaobjetos «SVGmu» se tiñen de rojo y las partículas del portaobjetos «Combinación» se tiñen de
45 verde si únicamente se expresa la GFP, de rojo si únicamente se expresa la SVGmu y de amarillo/amarilloanaranjado si se expresan la GFP y la SVGmu. Más del 90% de las partículas marcadas con GFP contenían SVGmu. Así pues, la producción de las partículas lentivíricas que muestran SVGmu se confirmó mediante la adquisición de imágenes confocales.
Ejemplo 4
50 Preparación de líneas celulares con DC-SIGN
Para facilitar el estudio de la transducción de reconocimiento selectivo, se construyeron líneas celulares con DC-SIGN que expresan la DC-SIGN humana (de aquí en adelante se denominará 293T.hDCSIGN) y la DC-SIGN murina (de aquí en adelante se denominará 293T.mDCSIGN). Las líneas celulares 293T.hDCSIGN y 293T.mDCSIGN se generaron mediante la transducción estable de las células 293T parentales con un lentivector seudotipado con VSVG. Los ADNc para la DC-SIGN humana y la DC-SIGN murina se amplificaron a partir de los plásmidos pUNOhDCSIGN1Aa y pUNO-mDCSIGN (InvivoGene) y se clonaron cadena abajo del promotor de la ubicuitina C humana en el plásmido lentivírico FUW para generar el FUW-hDCSIGN (SEQ ID n.º 5) y el FUW-mDCSIGN (SEQ ID n.º 6),
5 respectivamente. A continuación se realizó la seudotipia de los lentivectores con VSVG y se utilizaron para transducir las células 293T. Las células resultantes se sometieron a tinción con anticuerpos (anticuerpo contra la DC-SIGN humana de BD Biosciences y contra la DC-SIGN murina de eBioscience) y a clasificación celular para producir una población uniforme de líneas celulares DC-SIGN+ 293T.hDCSIGN y mDC-SIGN+ 293T.mDCSIGN.
La citometría de flujo mostró que la DC-SIGN se expresaba en prácticamente todas las células 293T.hDCSIGN y
10 293T.mDCSIGN de las líneas celulares (figura 3A). En cada diagrama, las líneas continuas (región sin rellenar) representan la expresión de DC-SIGN en las líneas celulares 293T.hDCSIGN, y la región sombreada representa la tinción de fondo de las células 293T sin transducir.
Ejemplo 5
Evaluación del virus recombinante específico de DC-SIGN mediante la transducción de las líneas celulares con DC15 SIGN
Para valorar la eficacia y la especificidad de la transducción con FUGW/SVG o FUGW/SVGmu (ejemplo 2), los virus se usaron para transducir las líneas celulares 293T.hDCSIGN y 293T.mDCSIGN (ejemplo 4). La eficacia de la transducción se midió mediante la expresión de GFP dentro de las líneas celulares.
Las células diana (células 293T.hDCSIGN, 293T.mDCSIGN o 293T; 0,2 x 106 por pocillo) se inocularon en una placa
20 de cultivo de 24 pocillos (Corning o BD Biosciences) y se infectaron por centrifugación con sobrenadantes víricos (1 ml por pocillo) a 2500 rpm y 30 ºC durante 90 min utilizando una centrifuga Sorvall Legend. Posteriormente, los sobrenadantes se reemplazaron con un medio de cultivo nuevo y se incubaron durante 3 días a 37 ºC con CO2 al 5%. El porcentaje de células GFP+ se midió por citometría de flujo. El título de la transducción se determinó mediante el margen de dilución que mostró una respuesta lineal.
25 La citometría de flujo demostró que el FUGW/SVG (que contiene la glucoproteína de envoltura SVG de tipo silvestre) tenía una eficacia de transducción similar (transducción del 11~16%) en las tres líneas celulares destinatarias (293T, 293T.hDCSIGN y 293T.mDCSIGN) (figura 3B). Esto indica que esa SVG tenía una amplia especificidad y la presencia de DC-SIGN en la superficie celular no alteraba notablemente la capacidad de transducción de un vector lentivírico seudotipado con SVG. En cambio, el vector FUGW/SVGmu (que contiene la glucoproteína SVG mutante
30 de la envoltura) podría transducir específicamente las células 293T.hDCSIGN y 293T.mDCSIGN con una eficacia de transducción del 42% y el 34%, respectivamente, pero no las células 293T (figura 3B). Estos resultados demuestran que un vector lentivírico seudotipado que presenta la SVGmu en su superficie puede transducir específicamente las células que expresan tanto la DC-SIGN humana como la murina. Además, la SVG mutante proporcionó una transducción más eficaz de las células que expresaban la DC-SIGN que la SVG de tipo silvestre.
35 La integración estable del vector lentivírico FUGW en las células transducidas se confirmó mediante análisis por PCR de la integración genómica del gen indicador GFP. Para demostrar que la transducción específica se debía a la DC-SIGN, la adición del anticuerpo soluble contra la DC-SIGN humana al sobrenadante vírico de FUGW/SVGmu antes de su exposición a las células 293T.hDCSIGN redujo la eficacia de la transducción (no se muestran los datos). El título específico de FUGW/SVGmu para 293T.mDCSIGN se estimó que era de 1 x 106 UT (unidades de
40 transducción)/ml. El título de FUGW/SVGmu para 293T.hDCSIGN se estimó que era de 1-2 x 106 UT/ml.
Ejemplo 6
Evaluación del virus recombinante in vitro
Para investigar la especificidad del lentivector modificado genéticamente a la hora de transducir las células dendríticas (CD) que expresan la DC-SIGN, se aislaron de los ratones las células totales de la médula ósea (MO) y
45 se transdujeron directamente con el vector vírico FUGW/SVGmu (ejemplo 2). Para el uso en el experimento, se adaptó un protocolo para generar CD de ratón a partir de progenitores que se hicieron crecer en cultivos de MO (Buchholz, C. J., et al. 1998. Nat Biotech 16: 951-954).
Las células totales de la médula ósea se recogieron de ratonas hembra B6 (Charles River Breeding Laboratories) y se generaron CDMO tal y como se describe en otro documento (Yang, L. y D. Baltimore. 2005. Proc. Natl. Acad. Sci.
50 USA 102: 4518-4523). O bien las células totales de la MO o bien las CDMO se sembraron en una placa de cultivo de 24 pocillos (2 x 106 células por pocillo) y se infectaron por centrifugación con el sobrenadante vírico (1 ml por pocillo) a 2500 rpm y 30 ºC durante 90 min utilizando una centrifuga Sorvall RT7. Tras la centrifugación, se retiró el sobrenadante y se reemplazó por medio RPMI nuevo que contiene FBS al 10% y GM-CSF (medio acondicionado J558L a 1:20). Las células se cultivaron durante 3 días y se les analizó la expresión de GFP por citometría de flujo.
Las células de la MO aisladas de los ratones se transdujeron directamente con el vector vírico FUGW/SVGmu o con un vector de control. Para el control se utilizó un lentivector cuya envoltura llevaba la glucoproteína (Eco) del virus ecótropo de la leucemia murina (FUGW/Eco); el vector envuelto con Eco puede infectar las células de los roedores con una amplia especificidad. Tres días después de la infección se analizó la eficacia de la transducción mediante 5 citometría de flujo (figura 4A). Aproximadamente el 9% de las células en los cultivos mixtos de MO eran CD (como indicaba la expresión de CD11c), de las cuales la mayoría (aproximadamente el 80%) expresaban DC-SIGN en una cantidad elevada (no se muestran los datos). Se observó que el 12% de las células totales de la MO expresaban la GFP (GFP+) tras la transducción con FUGW/SVGmu (figura 4A). Cuando se sincroniza para las células GFP+, se observó que hasta el 95% de las células transducidas expresaban tanto DC-SIGN como CD11c (DC-SIGN+CD11c+),
10 lo que indica que FUGW/SVGmu transduce específicamente las CD que expresan la DC-SIGN y no otros tipos de células de la médula ósea. Por el contrario, aunque el 68% de las células totales de la MO expresaban la GFP tras la exposición al FUGW/Eco, sólo el 9% de las células transducidas eran CD, de las cuales el 6,5% eran DC-SIGN+.
La transducción estable de FUGW/SVGmu se verificó mediante análisis por PCR de Alu (Butler, S. L., et al. 2001. Nat. Med. 7: 631-634) de la integración genómica de la LTR del esqueleto del lentivector. Además, se utilizó el
15 FUGW/SVGmu para transducir los linfocitos B y T primarios recogidos del bazo de los ratones y no se detectó virtualmente ninguna transducción (figura 4B), lo que indica una especificidad de transducción notable.
También se ensayó la eficacia del lentivector que lleva SVGmu para la transducción de las CD procedentes de médula ósea (MO) (CDMO) cultivadas in vitro. Las CD procedentes de la médula ósea (MO) (CDMO) se generaron tal y como se describe más arriba mediante el cultivo en presencia del factor estimulador de colonias de macrófagos 20 y granulocitos (GM-CSF, por su nombre en inglés) durante 6 días. A continuación se expusieron las células al lentivector FUGW/SVGmu o al FUGW/Eco. La citometría de flujo de las CDMO el día 3 después de la transducción demostró que FUGW/Eco se transducía en las CD CD11c+ (33%) y en las células CD11c– (7,6%) (figura 5), lo que está en concordancia con el amplio tropismo de Eco. Por al contrario, el FUGW/SVGmu sólo se transdujo en las CD CD11c+ (32,7%) y no se detectó ninguna célula GFP+ entre las células CD11c- (figura 5), lo que indica que el
25 FUGW/SVGmu modifica específicamente las CDMO.
Así pues, estos resultados en su conjunto demuestran que los lentivectores recombinantes manipulados genéticamente que llevan SVGmu pueden transducirse específicamente en las CD in vitro y que la transducción selectiva se correlaciona con la expresión de la DC-SIGN en la superficie de las CD.
Ejemplo 7
30 Efecto del virus recombinante sobre la activación in vitro de las células dendríticas
El lentivirus recombinante se examinó adicionalmente para determinar si podría, específicamente, reconocer selectivamente, transducirse y activar las CD en CD maduras. En las CD expuestas al virus recombinante se midió la inducción en la superficie de la molécula coestimuladora B7.2 (CD86) y de la molécula del CMH de clase II I-Ab, que se considera que son distintivos de la activación de las CD (Steinman, R. M., et al. 2003. Annu. Rev. Immunol. 21:
35 685-711). Las CDMO se generaron y se infectaron con FUGW/SVGmu tal y como se describe en el ejemplo 6. Para otra activación de las CDMO transducidas también se añadió LPS a una concentración de 1 μg/ml durante una noche.
La citometría de flujo de las CDMO 3 días después de la transducción demostró que el tratamiento con FUGW/SVGmu aumentaba la expresión de los marcadores de activación de las CD, CD86 y I-Ab , en las CD que 40 expresan la GFP, en comparación con las CD que no expresan la GFP (figura 6, panel superior). La región sombreada indica las células que no expresan la GFP (sin transducir) y la línea continua (región sin relleno) indica las células que expresan la GFP (transducidas). Se observó que la transducción selectiva de las CDMO entraba en sinergia con el tratamiento con el lipopolisacárido (LPS) para la maduración adicional de las CD (figura 6, panel inferior). Esto indica que, para inducir la activación de las CD, la transducción selectiva puede funcionar sola o bien
45 en combinación con otros factores de maduración de las CD.
Ejemplo 8
El virus recombinante reconoce selectivamente las células dendríticas in vivo
La prueba de si esta metodología puede utilizarse para la vacunación se puede examinar mediante experimentación in vivo. Para comprobar si los lentivectores manipulados genéticamente que llevan SVGmu podían actuar 50 selectivamente sobre las CD in vivo, el lentivector recombinante y concentrado FUGW/SVGmu (50 x 106 UT resuspendido en 200 μl de PBS) se inyectó por vía subcutánea en el lado izquierdo de las ratonas hembra C57BL/6 (B6, Charles River Breeding Laboratories) cerca de un ganglio linfático inguinal (a menos de 1 cm). El ganglio linfático inguinal izquierdo y el ganglio linfático equivalente del lado opuesto se aislaron 3 días después de la inyección para la evaluación de su tamaño. Las células se recogieron de estos ganglios y se contó su número total. 55 El porcentaje de las CD GFP+ se analizó mediante citometría de flujo en las células teñidas con el anticuerpo anti
CD11c (BD Biosciences).
El día 3 se observó un aumento de tamaño significativo del ganglio linfático inguinal izquierdo próximo al sitio de la inyección (figura 7A, imagen izquierda), y el número de células de este ganglio linfático se incrementó más de 10 veces en comparación con el ganglio linfático equivalente del lado contrario o con los ganglios linfáticos de un ratón
5 no sometido previamente a experimentación (figura 7B). Esto indica que la administración del vector puede reforzar el tráfico y la proliferación de los linfocitos en un ganglio linfático cercano.
La citometría de flujo indicó que aproximadamente el 3,8% del total de los linfocitos CD11c+ de las células del ganglio linfático inguinal izquierdo eran CD GFP+ (figura 7C) que parecen haber migrado desde el sitio de la inyección. Esto se considera un efecto notablemente grande para una inyección subcutánea del vector y demuestra
10 que el virus recombinante infecta con eficacia las CD in vivo.
Ejemplo 9
Evaluación de la especificidad del virus recombinante mediante transducción in vivo
Para examinar la especificidad in vivo del lentivector que reconoce selectivamente las CD, se construyó un vector lentivírico que codificaba una luciferasa de luciérnaga. El ADNc de la luciferasa de luciérnaga se amplificó a partir del
15 pGL4.2LucP (Promega) y se clonó en el FUGW (Lois, C. et al. 2002. véase más arriba) para reemplazar la GFP, lo que produjo la construcción Fluc (SEQ ID n.º 4) (figura 22A). A continuación se utilizó el gen de la luciferasa como indicador para visualizar la transducción in vivo de las células del tejido mediante los protocolos estándares de adquisición de imágenes de bioluminiscencia (BLI).
El lentivector recombinante (de aquí en adelante denominado Fluc/SVGmu) se inyectó por vía subcutánea en el
20 costado izquierdo del ratón. En otro ratón, un lentivector seudotipado con la glucoproteína del virus de la estomatitis vesicular (de aquí en adelante denominada Fluc/VSVG) se inyectó como control de vector inespecífico. A continuación, se tomaron imágenes de los ratones tratados con el vector de forma no invasiva mediante BLI. Los ratones tratados con Fluc/VSVG tenían una señal fuerte y permanente en el sitio de la inyección, lo que indica que había tejidos inespecíficos transducidos que expresaban la luciferasa (figura 22B). Esto está en concordancia con el
25 hecho de que el virus en cuya envoltura está la VSVG tiene una amplia especificidad. En cambio, no se detectó ninguna señal significativa en el sitio de inyección de los ratones tratados con Fluc/SVGmu (figura 22B), lo que indica que el lentivector que lleva SVGmu tenía una especificidad de diana relativamente rigurosa. En ningún momento se pudo detectar la señal de luminiscencia en los ratones diana, probablemente debido a la distribución rara y escasa de las CD, que está fuera del alcance de la sensibilidad del procedimiento actual de BLI.
30 Después de un mes, los ratones inyectados con Fluc/SVGmu se sometieron a un análisis de biodistribución mediante RT-PCR cuantitativa y no se observó ninguna copia detectable del lentivector en ninguno de los órganos aislados (corazón, hígado, bazo, riñón, gónada, pulmón, piel, ganglio linfático), lo que verifica la ausencia de infección inespecífica en los animales y, así pues, que el vector selectivo es específico de las CD.
Ejemplo 10
35 Introducción del antígeno in vitro mediante el virus recombinante
Para determinar si la transducción selectiva de las CD debida al lentivector recombinante podía utilizarse para introducir con eficacia genes de antígeno en las CD para estimular las respuestas de linfocitos T CD8+ y CD4+ específicos del antígeno, se construyó un lentivector que expresaba el antígeno modelo, la ovalbúmina de pollo (OVA). En los ratones C57BL/6J (B6), la OVA es un antígeno diana bien caracterizado para el receptor OT1 de los
40 linfocitos T CD8+, que se fija específicamente a la OVA257-269 (denominada OVAp) y al receptor OT2 de los linfocitos T CD4+, que se fija específicamente a la OVA323-339 (denominada OVAp*) (Yang, L. y D. Baltimore. 2005. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 4518-4523). El lentivector que expresa la OVA (FOVA (SEQ ID n.º 2), figura 8, arriba) se construyó a partir del FUGW (figura 8, abajo) mediante el reemplazo de la GFP con el ADNc de la ovalbúmina de pollo.
45 Las CDMO (ejemplo 6) se transdujeron el día 6 de cultivo bien con el lentivirus recombinante FOVA/SVGmu o bien con el lentivirus recombinante de control FUGW/SVGmu (que codifica un gen indicador irrelevante de GFP). El día 6, las CDMO se infectaron por centrifugación con el sobrenadante vírico, y se cultivaron durante 3 días más. El día 9, las células no adherentes se recogieron y se volvieron a cultivar en el medio RPMI con FBS al 10%, GM-CSF (medio condicional J558L a 1:20) y LPS a 1 μg/ml (Sigma). El día 10 se recogieron las células y se utilizaron para la
50 estimulación de los linfocitos T. Las CDMO modificadas se denominaron DC/FOVA y DC/FUGW, según el lentivector utilizado para la transducción. En paralelo, las células no adherentes se recogieron del cultivo de CDMO el día 9 sin transducir y se volvieron a cultivar en el mismo medio (RPMI que contiene FBS al 10%, GM-CSF y LPS). El día 10, las células se recogieron y se cargaron bien con OVAp (OVA257-269, específicamente fijada por los receptores OT1 de los linfocitos T, de aquí en adelante denominadas DC/OVAp) o bien OVAp* (OVA323-339, específicamente fijada por los receptores OT2 de los linfocitos T, de aquí en adelante denominadas DC/OVAp*) y se utilizaron como controles positivos para estimular los linfocitos T. Para examinar la capacidad que tienen las CDMO transducidas con el vector para procesar y presentar el antígeno de OVA transgénico, se recogieron esplenocitos de ratones transgénicos con OT1 y OT2 y se cultivaron con las CDMO transducidas con el lentivector, o con las CDMO cargadas con OVAp o
5 bien con OVAp*, en la proporción indicada. Tres días después se recogió el sobrenadante y se le ensayó por ELISA la producción de IFN-γ, y se recogieron las células y se les analizaron sus marcadores de activación de superficie por citometría de flujo. La proliferación de linfocitos T se analizó por la incorporación de [3H]-timidina.
Tras un cocultivo de tres días con diferentes proporciones de DC/FOVA y linfocitos T transgénicos, los linfocitos T OT1 respondieron vigorosamente cuando se midió mediante la liberación de IFN-γ (figura 10A) y la proliferación de 10 los linfocitos T (figura 10B). Como se esperaba, no se detectó ninguna respuesta obvia a la OVA cuando se usó DC/FUGW (figuras 10A y 10B). También se observó que la expresión transgénica de la OVA era incluso más eficaz que la carga de péptidos para estimular una respuesta de los linfocitos T OT1, lo que está en concordancia con la noción de que el CMH de clase I favorece la presentación de los péptidos producidos de modo endógeno. La citometría de flujo mostró que los linfocitos T OT1 activados mostraban el fenotipo típico de linfocitos T citotóxicos
15 efectores (CD25+ CD69+ CD62Lbajo CD44alto) tras la estimulación con DC/FOVA o bien con DC/OVAp (figura 9).
Cuando las CD se cocultivaron con los linfocitos T CD4+ OT2, también se observó la activación de los linfocitos T, como indicaban los cambios de los marcadores de superficie (figura 11) y la producción de IFN-γ (figura 12). Sin embargo, la estimulación de los linfocitos CD4+ no fue tan pronunciada como la de los linfocitos CD8+, supuestamente debido a la presentación menos eficaz de los péptidos del antígeno endógeno a las moléculas del
20 CMH de clase II. Al modificar la localización celular del antígeno OVA para dirigirlo a la vía de presentación del CMH de clase II, se reforzó la estimulación de CD4 que era incluso mejor que la de las CD sensibilizadas con los péptidos (no se muestran los datos).
Estos resultados muestran que el procedimiento de acción selectiva sobre las CD a través de la infección con el lentivector puede introducir con eficacia antígenos en las CD y estimular las respuestas de los linfocitos T tanto CD8+
25 como CD4+.
Ejemplo 11
Introducción in vivo del antígeno por el virus recombinante
Para determinar si las CD destinatarias de los lentivectores podían activar in vivo a los linfocitos T específicos del antígeno, se utilizó un procedimiento de transferencia génica del receptor de los linfocitos T (TCR, por su nombre en
30 inglés) a las células madre hematopoyéticas (HSC) murinas para generar en los ratones linfocitos T específicos del antígeno y con el TCR manipulado genéticamente, tal y como se describe en otro documento (Yang, L. y D. Baltimore, D. 2005. véase más arriba). Se construyó un vector retrovírico tricistrónico MIG-OT1 que coexpresaba OT1, TCRα y TCRβ, junto con el marcador GFP (figura 13A).
Brevemente, las ratonas hembra B6 (Charles River Breeding Laboratories) se trataron con 250 μg de 5-fluorouracilo
35 (Sigma). Cinco días después, las células de la médula ósea (MO) enriquecidas con HSC se recogieron de la tibia y el fémur y se cultivaron en una placa de cultivo de 24 pocillos (2 x 106 células por pocillo) en un medio de cultivo de MO (RPMI que contiene FBS al 10%, 20 ng/ml de rmIL-3, 50 ng/ml de rmIL-6 y 50 ng/ml de rmSCF (PeproTech)). El día 1 y el día 2 del cultivo, las células se infectaron por centrifugación con el vector retrovírico MIG-OT1 seudotipado con Eco (2 ml de sobrenadante vírico por pocillo) a 2500 rpm y 30 ºC durante 90 min. Tras cada centrifugación, se
40 retiraba el sobrenadante y se reemplazaba con un medio de cultivo de MO nuevo. El día 3, las células de MO transducidas se recogieron y se transfirieron a los ratones B6 destinatarios que recibieron 1200 rads de irradiación corporal total. Ocho semanas después de la transferencia, los ratones se utilizaron para el estudio de inmunización in vivo. Cada ratón recibió una dosis de inyección subcutánea de 10 x 106 UT del lentivector de acción selectiva. Siete días después se recogieron células del bazo y de los ganglios linfáticos y se analizó la presencia de linfocitos T
45 OT1 y sus marcadores de activación de la superficie por citometría de flujo.
Ocho semanas después de la transferencia, el análisis de los linfocitos T periféricos de los ratones reconstituidos mostró que aproximadamente el 5% de los linfocitos T CD8+ eran GFP+ OT1+ (figura 13B). Algunos de los ratones reconstituidos se inmunizaron mediante inyección subcutánea con la misma dosis (10 x 106 UT) de FOVA/SVGmu (ejemplo 10) o bien FUGW/SVGmu (ejemplo 2). El análisis de los linfocitos T GFP+ OT1+ recogidos de los órganos
50 linfáticos periféricos 7 días más tarde demostró que la inmunización de las CD diana por el FOVA/SVGmu doblaba el número de linfocitos T OT1 respecto a los ratones de control, que o bien no estaban inmunizados o bien estaban inmunizados con FUGW/SVGmu (figura 14B). Los linfocitos T GFP+ OT1+ procedentes de los ratones inmunizados con FOVA/SVGmu mostraron un fenotipo de memoria efectora (CD69bajo CD62alto CD44alto), lo que indica que estos linfocitos han experimentado una respuesta inmunitaria productiva (figura 14A).
55 Estos resultados demuestran que un lentivector recombinante que lleva la SVGmu en la superficie puede dirigirse selectivamente a las CD in vivo para estimular con eficacia los linfocitos T específicos del antígeno e inducir una respuesta inmunitaria fuerte.
Ejemplo 12
Inducción respuestas in vivo de LTC y de anticuerpos mediante la administración directa del virus recombinante
Se llevaron a cabo estudios sobre la eficacia del reconocimiento selectivo in vivo de las CD para inducir una
5 respuesta de linfocitos T citotóxicos (LTC) CD8+ específica del antígeno y una respuesta de anticuerpos mediante la administración del lentivector de reconocimiento selectivo a ratones de tipo silvestre que no se han sometido previamente a experimentación.
A los ratones B6 de tipo silvestre (Charles River Breeding Laboratories) se les dio una sola inyección del lentivector de reconocimiento selectivo (50 x 106 UT de FUGW/SVG o de FOVA/SVGmu) por vía subcutánea en el costado
10 derecho a la dosis indicada. El día 7 y el día 14 después de la inmunización se recogió sangre de los ratones inmunizados por extracción de sangre de la cola, y se midió la IgG anti-OVA del suero por ELISA. El día 14 se recogieron células del bazo y de ganglios linfáticos y se analizó por citometría de flujo la presencia de linfocitos T específicos de OVA y sus marcadores de activación de la superficie.
La presencia de los linfocitos T específicos de OVA se midió mediante la medición de la secreción de citocinas y la
15 tinción del tetrámero. El día 14 después de la inyección se analizaron los linfocitos T recogidos de los órganos linfáticos periféricos. El lentivector que reconoce selectivamente las CD nativas fue capaz de inducir los linfocitos T CD8+ que responden a la OVA en el ganglio linfático (no se muestran los datos) y en el bazo (figura 23). La administración de una única dosis de FOVA/SVGmu recombinante fue suficiente para generar los linfocitos T CD8+, que se podrían sensibilizar para que secretaran el IFN-γ tras la reestimulación con OVAp (figura 23). La
20 administración del vector de control FUGW/SVGmu no consiguió generar ninguna respuesta específica de OVAp (figura 23). Para evaluar adicionalmente la magnitud de las respuestas, los linfocitos T CD8+ específicos de OVAp se midieron mediante la tinción del tetrámero del CMH de clase I. Se obtuvo una alta frecuencia de linfocitos T específicos de OVAp (> 6%) tras la inyección de una única dosis (figura 15); no se detectaron células positivas para el tetrámero en los ratones tratados con FUGW/SVGmu (figura 15). Los datos generados por la cuantificación de
25 tetrámeros se correlacionaban bien con el análisis de los linfocitos efectores CD8+ analizados mediante tinción del IFN-γ intracelular (figura 23). El análisis del fenotipo de estos linfocitos T positivos para OVAp demostró que estas células presentaban en la superficie las características de los linfocitos T efectores de memoria (CD25bajo CD69bajo CD62Lalto CD44alto) (figura 17A).
Para investigar la respuesta a la dosis de la administración del lentivector, se inyectaron dosis de FOVA/SVGmu que
30 oscilaban de 100 x 106 UT a 3 x 106 UT por vía subcutánea y el día 14 después de la inyección se midieron los linfocitos T específicos de OVAp del bazo. Se detectó una frecuencia excepcionalmente alta (12%) de linfocitos T CD8+ específicos de OVAp con la dosis de 100 x 106 UT (figura 16A). El porcentaje de linfocitos específicos de OVAp se correlacionó proporcionalmente con la cantidad del vector recombinante administrado (figura 16B). No se consiguió un valor meseta en la respuesta a la dosis con las dosis que se utilizaron, lo que indica que se puede
35 mejorar todavía más mediante el incremento de la cantidad de vector inyectado y/o la frecuencia de la inyección.
Además, la cantidad de IgG sérica específica de OVA en los ratones se examinó los días 7 y 14 después de la inmunización con FOVA/SVGmu (50 x 106 UT). El título de IgG en el suero fue de 1:10.000 el día 7 y 1:30.000 el día 14 (figura 17B). Se trata de una respuesta de anticuerpos más bien impresionante para la inyección de una única dosis sin más adyuvante ni otros estímulos, lo que indica que la inmunización con el lentivector selectivo también
40 puede desencadenar una secreción significativa de anticuerpos específicos del antígeno desde los linfocitos B.
Estos resultados demuestran que la administración in vivo de un lentivector que reconoce selectivamente las CD puede inducir respuestas inmunitarias tanto humoral como celular contra el antígeno introducido.
Ejemplo 13
Generación de inmunidad antitumoral: protección preventiva
45 Se evaluó la inmunidad antitumoral generada tras una administración in vivo del lentivector selectivo de las CD. Se utilizó un modelo tumoral E.G7 (Wang, L .y D. Baltimore. 2005. véase más arriba) en el cual la OVA sirve de antígeno tumoral.
Para la exposición de los ratones al tumor se utilizaron las líneas celulares tumorales EL4 (C57BL/6J, H-2b, timoma) y E.G7 (células EL4 que expresan de forma estable una copia del ADNc de la OVA de pollo). Para el experimentos 50 de protección contra el tumor, los ratones B6 (Charles River Breeding Laboratories) recibieron una única inyección de 50 x 106 UT del lentivector selectivo (FOVA/SVGmu o FUGW/SVGmu) en el costado derecho. Dos semanas después, 5 x 106 células EL4 o E.G7 se inyectaron por vía subcutánea en la costado izquierdo de los ratones. Se midió el tamaño del tumor en días alternos con compás calibrador de precisión y se muestra como el producto de los dos diámetros perpendiculares más largos a x b (mm2). Se sacrificaron los ratones cuando los tumores alcanzaron
los 400 mm2.
La vacunación con 50 x 106 UT de FOVA/SVGmu protegió completamente a los ratones expuestos al tumor E.G7 (figura 18, izquierda), mientras que los tumores crecieron con rapidez en los ratones que recibían una vacunación falsa con un lentivector que carecía del transgén de OVA (figura 18, izquierda). Esta protección era específica de
5 OVA porque los ratones vacunados desarrollaron tumores EL4 de control que no expresaban la OVA (figura 18, derecha), independientemente del lentivector utilizado para la inmunización.
Ejemplo 14
Generación de inmunidad antitumoral: tratamiento del tumor
La inmunidad antitumoral generada tras una administración in vivo del lentivector selectivo de las CD se evaluó
10 donde se introdujeron las células tumorales antes de la administración del lentivector. Las etapas de la inyección tumoral y la administración del lentivector estaban invertidas respecto a las del ejemplo 13 para comprobar si se podía eliminar un tumor establecido, en un ensayo de «vacunación terapéutica». Con esta finalidad, las células tumorales E.G7 que expresan el gen de la luciferasa de luciérnaga (E.G7.luc) se utilizaron para la exposición de los ratones, lo que permite el estrecho seguimiento de la cinética del crecimiento del tumor por BLI en los animales vivos.
15 Para facilitar la adquisición de imágenes, se utilizó una cepa albina de ratones B6 (The Jackson Laboratory). Estos ratones carecen de pigmentación y, por lo tanto, tienen una absorción de fondo baja a la señal de luminiscencia. La inyección de 100 x 106 UT de FOVA/SVGmu (ejemplo 10) a estos ratones mostró una respuesta similar a la observada en los ratones B6 canónicos (figura 21). Células tumorales E.G7.luc (5 x 106) se implantaron subcutáneamente en los ratones B6 albinos. Los ratones se inmunizaron con FOVA/SVGmu (50 x 106 UT por ratón
20 por vez) dos veces los días 3 y 10 después de la exposición al tumor mediante una inyección subcutánea. El experimento se repitió tres veces, y en las figuras 19 y 20 se muestra un experimento representativo.
Los ratones que recibieron la inmunización con el lentivector selectivo de las CD mostraron un declive del crecimiento de los tumores comenzando el día 9, a lo que seguía una regresión tumoral y una reducción de la luminiscencia por debajo del nivel de detección el día 11 (figuras 19 y 20). Aunque se observó una recurrencia 25 mínima del tumor desde el día 12 al día 16, los ratones tratados con FOVA/SVGmu estaban libres de la enfermedad al final del día 18 y de ahí en adelante; no se observó ninguna recidiva del tumor mientras duró el experimento (> 60 días). En cambio, los tumores crecieron progresivamente en los ratones que no recibieron tratamiento y los ratones tuvieron que ser eliminados del experimento después del día 16 debido al gran tamaño que tenían los tumores. Fue interesante observar que la regresión tumoral se observó que comenzaba a los 7 días de la inmunización del
30 lentivector. La cinética de la regresión del tumor se correlaciona bien con la cinética de una respuesta inmunitaria específica de antígeno inducida por la vacunación.
Ejemplo 15
Introducción in vitro del antígeno y de factores de maduración mediante un virus recombinante
El éxito de la vacunación con CD puede depender del estado de maduración de las CD (Banchereau, J. y A. K.
35 Palucka. 2005. Nat Rev Immunol 5: 296-306; Schuler, G. et al. 2003. Curr Opin Immunol 15: 138-147; Figdor, C. G. et al. 2004. Nat Med 10: 475-480). Por consiguiente, en los vectores lentivíricos se pueden incluir genes que codifican las moléculas estimuladoras que desencadenan la maduración deseada de las CD. Las citocinas que pueden utilizarse incluyen, pero sin limitarse a ellas, GM-CSF, IL-4, TNFα, IL-6 y similares. En algunas realizaciones, el agente de maduración que se utiliza es el ligando de CD40 (CD40L), que se expresa típicamente en los linfocitos
40 T CD4 y sirve de ligando para el receptor CD40 de las CD (Matano, T. et al. 1995. J Gen Virol 76: 3165-3169; Nguyen, T. H. et al. 1998. Hum Gene Ther 9: 2469-2479). Para manipular adicionalmente las CD para que sean una potente vacuna para tratamientos, se acomoda un receptor CD40 inducible por fármaco (iCD40) en el sistema de introducción génica en algunas realizaciones. Tal y como se describe en otro documento, se diseñó el iCD40 y consistía en un dominio citoplasmático de CD40 fusionado a los dominios de fijación al ligando y una secuencia de
45 localización membranaria (Hanks, B. A. et al. 2005. Nat Med 11: 130-137). Cuando se expresa el iCD40, la maduración y la activación de las CD se regula con un fármaco liposoluble capaz de dimerizarse.
Para examinar el efecto de incluir los factores de maduración de las CD, se obtuvieron los ADNc para la ovalbúmina (OVA, como se describe en el ejemplo 10), GM-CSF, IL-4, TNFα, IL-6 y CD40L. El iCD40 se construye como se describe en otro documento (Hanks, B. A. et al. 2005. véase más arriba). Gracias a la IRES y a las secuencias de 50 tipo 2A, se construyen vectores lentivíricos multicistrónicos capaces de traducir con eficacia hasta cuatro proteínas. Este sistema se adapta para construir vectores lentivíricos que coexpresan los genes siguientes: la OVA y una molécula de factor de maduración (GM-CSF, IL-4, TNFα, IL-6, CD40L o iCD40) (figura 24a, rotulada como «FUOIM»). Una secuencia de vector de ejemplo se da a conocer en la SEQ ID n.º 7. Se preparan lentivirus cuya envoltura lleva SVGmu (tal y como se describe en el ejemplo 2) y los lentivirus se transducen in vitro en las CDMO 55 de ratón cultivadas (generadas como se describe en el ejemplo 6) para introducir específicamente estos genes en las células. La maduración de las CDMO se mide mediante análisis por FACS en forma de inducción de varias
moléculas clave que tienen funciones esenciales en el proceso de estimulación de los linfocitos T. Los marcadores representativos típicos son ICAM-1 (CD54), B7.1 (CD80), CMH de clase I, CMH de clase II y CD40 endógeno. Las CDMO transducidas con lentivirus que codifican sólo los genes de OVA y GFP sirven de control para el experimento. Se observa que la inducción de los marcadores de maduración se consigue cuando las CD modificadas con iCD40
5 se exponen a una cantidad eficaz del fármaco dimérico AP20187.
Además, dos rasgos característicos de las CD maduras son la menor capacidad de endocitosis y una mejor capacidad de activación de los linfocitos T. La captación del dextrano etiquetado con FITC se utiliza para cuantificar la endocitosis de las CD transducidas. Las CD maduras también se utilizan para estimular los linfocitos T que expresan los receptores de los linfocitos T OT1 (TCR) (como se describe en el ejemplo 10) para evaluar su 10 capacidad para montar una respuesta inmunitaria. Se observa que cuando las CD modificadas con iCD40 se exponen a una cantidad eficaz del fármaco dimérico AP20187, la captación del dextrano etiquetado con FITC se reduce respecto al captado por las CD modificadas sin iCD40. Además, se observa que tras el cocultivo con proporciones diferentes de CD modificadas con iCD40 (tratadas con el fármaco dimérico) por linfocitos T transgénicos, los linfocitos T OT1 responden más vigorosamente, según se mide por la liberación del IFN-γ y la
15 proliferación de los linfocitos T, que los que se cocultivan con CD modificadas sin iCD40.
Longevidad de las CD es otro parámetro que determina la inmunidad dependiente de los linfocitos T. Los efectos de las moléculas estimuladoras sobre la supervivencia de las CD mediante un ensayo in vitro de ayuno de suero se compararán mediante el procedimiento que se describe en Hanks et al. (Hanks, B. A. et al. 2005. véase más arriba).
Sin fuera necesario, se pueden introducir dos moléculas de factor de maduración en las CD diana mediante el vector 20 lentivírico, ya que la configuración del vector tiene la capacidad de expresar cuatro proteínas.
Ejemplo 16
Introducción in vivo del antígeno y de los factores de maduración mediante un virus recombinante
Los virus recombinantes empaquetados con el vector lentivírico FUOIM (SEQ ID n.º 7) se preparan tal y como se describe en el ejemplo 15. Los virus se administran a ratones B6 que no se han sometido previamente a
25 experimentación para introducir el antígeno OVA y las moléculas de factor de maduración en las CD, y la inducción de la inmunidad a dosis escalonadas de virus se evalúa tal y como se describe en el ejemplo 11.
Se observa que la inmunización selectiva de las CD por los lentivirus que contienen iCD40 incrementa el número de linfocitos T que responden a la OVA en comparación con los ratones de control, que o bien no están inmunizados, o bien están inmunizados con un lentivirus que no contiene OVA (p. ej., FUGW/SVGmu) o bien están inmunizados con
30 el lentivirus que no contiene iCD40 (p. ej., FOVA/SVGmu).
Además, la resistencia de los animales a una exposición tumoral se valora con los lentivectores que contienen iCD40, tal y como se describe en el ejemplo 13. A los ratones se les inyectan los siguientes lentivectores en el experimento de exposición tumoral: FUOIM/SVGmu, FOVA/SVGmu o FUGW/SVGmu. Las siguientes líneas celulares se utilizan para la exposición tumoral: EL4 (C57BL/6J, H-2b, timoma) y E.G7 (células EL4 que expresan 35 establemente una copia del ADNc de la OVA de pollo). Se observa que los ratones que reciben la inmunización mediante los lentivectores selectivos de las CD FUOIM/SVGmu y FOVA/SVGmu están protegidos ante la exposición al tumor. En cambio, se observa que los tumores crecen con rapidez en los ratones que reciben una vacunación falsa con un lentivector que carece del transgén de la OVA (FUGW/SVGmu). Esta protección es específica de OVA porque los ratones vacunados desarrollan tumores EL4 de control que no expresan la OVA, independientemente del
40 lentivector utilizado para la inmunización.
Finalmente, el potencial de este procedimiento para erradicar un tumor establecido se evalúa con los lentivectores que contienen iCD40, como se describe en el ejemplo 14. Los lentivectores siguientes se utilizan para la inmunización en el experimento: FUOIM/SVGmu y FOVA/SVGmu. Las siguientes líneas celulares se utilizan para el tratamiento tumoral: EL4 y E.G7. Se observa que los ratones inyectados con células tumorales que reciben
45 inmunización mediante los lentivectores selectivos de las CD (FUOIM/SVGmu y FOVA/SVGmu) muestran un declive del crecimiento tumoral, seguido de regresión tumoral y una reducción de la luminiscencia por debajo del nivel de detección. Además, no se observó ninguna recidiva del tumor mientras duró el experimento (> 60 días). En cambio, los tumores van creciendo en los ratones que no reciben el tratamiento.
Ejemplo 17
50 Presentación del antígeno del VIH/sida mediante virus recombinantes in vitro
Para tratar el VIH/sida, se generan CD «funcionales duales» basándose en la estrategia de introducción génica descrita. Las CD «funcionales duales» son eficaces a la hora de desencadenar anticuerpos neutralizantes (AcN) e inducir inmunidad celular de linfocitos T (figura 25). Para desencadenar con eficacia los AcN, en las CD se introduce un gen que codifica la gp120 quimérica que se fija a la membrana (gp120m). La gp120 es una glucoproteína de la envoltura del VIH y se considera que es el inmunógeno más potente (Klimstra, W. B. et al. 2003. J. Virol. 77: 1202212032; Bernard, K. A. et al. 2000. Virology 276: 93-103; Byrnes, A. P., et al,. 1998. J. Virol 72: 7349-7356). Tal y como se describe en otro documento, la gp120 fusionada con el dominio transmembranario de la glucoproteína del virus de la estomatitis vesicular se puede expresar en la superficie celular en forma de trímero, imitando el trímero
5 maduro de la superficie del virión del VIH (Klimstra, W. B. et al. 1998. J. Virol. 72: 7357-7366). Esta forma de inmunógeno se expondrá en la superficie de las CD. Además de la expresión en la superficie, las CD pueden también presentar a los linfocitos T péptidos de epítopos procedentes de la gp120 de forma restringida por el CMH.
Dado que la infección con el VIH puede deteriorar significativamente el funcionamiento de las CD a través de la desaparición de los linfocitos T CD4, resulta deseable manipular genéticamente las CD para que funcionen con
10 independencia de los linfocitos T. La expresión de CD40L o iCD40 puede dar lugar a la maduración y activación de las CD en ausencia de los linfocitos T CD4. Así pues, el CD40L o iCD40 manipulado genéticamente, tal y como se describe en el ejemplo 16, que funciona como una molécula estimuladora y de maduración, se incorpora en el virus que reconoce selectivamente las CD.
La construcción lentivírica para modificar genéticamente las CD se ilustra en la figura 24b y se rotula como FUGmID
15 (SEQ ID n.º 8). Se obtienen ADNc de la gp120 con los codones optimizados del Programa de Reactivos de Referencia e Investigación del Sida del NIH. La secuencia con los codones optimizados puede conseguir expresar el gen a un nivel excepcionalmente alto fuera del contexto del genoma del VIH-1. La construcción se prepara mediante la fusión de la gp120 con el dominio transmembranario de la glucoproteína del virus de la estomatitis vesicular.
Se llevan a cabo ensayos in vitro para evaluar la eficacia que tienen las CD con genes modificados a la hora de
20 desencadenar AcN. Se aíslan linfocitos B CD19+ del bazo de ratones B6 que no se han sometido previamente a experimentación mediante microperlas anti-CD19 (MiHenyi Biotech, Auburn, CA) y se cocultivan con las CD modificadas en presencia de IL-4 e IL-6. El vector lentivírico FUmGID se contransfecta con SVGmu en las líneas celulares para preparar el virus FUmGID/SVGmu, tal y como se describe en el ejemplo 2. Los virus resultantes se transducen en las CD procedentes de la médula ósea (CDMO). Las CD transducidas se irradian (3000 rad) y se
25 utilizan como células presentadoras de antígeno (CPA) en cocultivo con los linfocitos B. Se mide la cinética de la proliferación de los linfocitos B en respuesta a las CDMO transducidas. Se observa que los linfocitos B proliferan más en cocultivo con las CDMO transducidas que cuando se cocultivan con las CDMO transducidas sin nada.
Para investigar el efecto de las CD modificadas genéticamente sobre la diferenciación de los linfocitos B en las células secretoras de inmunoglobulinas específicas, se emplea el procedimiento de cocultivo que se describe más
30 arriba con la excepción de que no se irradian las CD. Después de 14 días, el título de los distintos isotipos de anticuerpo específico contra el VIH en los sobrenadantes de cultivo se determina mediante ELISA con la gp120 recombinante (disponible del NIB: Programa de Reactivos de Referencia e Investigación del Sida) como antígeno. La expresión de los diferentes isotipos del anticuerpo específico contra el VIH es mayor en los linfocitos B cocultivados con las CDMO transducidas que en los cocultivados con las CDMO transducidas sin nada.
35 Para valorar la eficacia de las CD modificadas genéticamente a la hora de activar los linfocitos T in vitro, se aíslan linfocitos T CD3+ de ratones B6 que no se han sometido previamente a experimentación y se cocultivan con CD irradiadas e infectadas con lentivirus. Se mide la cinética de la proliferación de los linfocitos T. La proliferación de los linfocitos T se encuentra que es mayor en los cultivos de linfocitos T cocultivados con CD irradiadas y transducidas que en los cocultivados con CD transducidas sin nada.
40 Los resultados en su conjunto se espera que demuestren que las CDMO transducidas con el lentivector FUmGID/SVGmu son eficaces tanto para estimular a los linfocitos B que producen anticuerpos neutralizantes (AcN) como para inducir inmunidad celular de linfocitos T contra el VIH/sida.
Ejemplo 18
Presentación in vivo del antígeno del VIH/sida mediante virus recombinantes
45 Para evaluar la activación de los linfocitos B in vivo, los ratones B6 se inmunizan mediante una inyección subcutánea con los lentivirus recombinantes preparados tal y como se describe en el ejemplo 17. Los controles incluyen ratones inyectados con lentivirus que sólo codifican antígenos, lentivirus que sólo codifican moléculas de maduración y ratones sin ningún tratamiento que no se han sometido previamente a experimentación. Dos semanas después de la inyección del virus, los anticuerpos contra el VIH del suero se miden por ELISA. El título del
50 anticuerpo se encuentra que es más alto en los ratones en los que se inyectó el virus FUmGID/SVGmu, así como en los que se inyectó el lentivirus que sólo codifica antígenos. En cambio, el título del anticuerpo es relativamente bajo en los ratones inmunizados con el lentivirus que sólo codifica moléculas de maduración y en los ratones que no se han sometido previamente a experimentación.
Para la activación in vivo de los linfocitos T, en los ratones B6 se inyectan los virus recombinantes que se han 55 descrito. Los linfocitos T se aíslan 7 días después y se mide su proliferación y la secreción de citocinas, tras la reestimulación in vitro con las CD modificadas genéticamente, tal y como se describe en el ejemplo 12. También se sigue la duración de las respuestas de linfocitos T efectores. El lentivector que reconoce selectivamente las CD nativas es capaz de desencadenar linfocitos T que responden al VIH tanto en el ganglio linfático como en el bazo. La administración de FUmGID/SVGmu recombinante es suficiente para generar linfocitos T que secretan IFN-γ. En
5 cambio, la administración de un vector de control vacío (p. ej., FUGW/SVGmu) no logra desencadenar una respuesta específica contra el VIH.
Ejemplo 19
Vacunación in situ contra el VIH/sida mediante virus recombinantes: protección contra la exposición al VIH
Para comprobar la estrategia de vacunación in situ con CD para enfrentarse al VIH, se desarrolla un nuevo modelo
10 de ratón de patogenia del VIH que implica quimeras humano/ratón. Tal y como se describe en otro documento, el ratón RAG2–/– γc–/– se puede reconstituir con un sistema inmunitario adaptativo humano (Strauss, J. H., et al. 1994. Archives of Virology 9: 473-484). Los ratones RAG2–/– γc–/– carecen de linfocitos B, T y citotóxicos (Morizono, K. et al. 2001. J. Virol. 75: 8016-8020). La inyección de sangre de cordón umbilical humano CD34+ en el hígado de los ratones irradiados parcialmente de un día de edad conduce a la generación y maduración de CD , linfocitos B y
15 linfocitos T humanos funcionalmente diversos con restricción del CMH humano. Adicionalmente, este modelo gobierna el desarrollo de órganos linfáticos primarios y secundarios, y la producción de una respuesta inmunitaria celular de linfocitos T CD8+ funcionales contra una exposición al virus. Además, la observación del cambio de isotipo de Ig desde IgM a IgG indica la existencia de inmunidad celular de linfocitos T CD4+ funcionales.
Para determinar la eficacia de la protección preventiva contra el VIH mediante la inmunización que reconoce
20 selectivamente las CD, las quimeras humano/ratón son virus recombinantes que se administran envueltos con SVGmu mediante inyección. Los virus recombinantes codifican el antígeno gp120m (ejemplo 17) junto con un estimulador de la maduración (por ejemplo, CD40L o iCD40 como en el ejemplo 15), y se preparan y concentran como se describe en el ejemplo 2. A continuación, los ratones inmunizados se inoculan con el VIH de acuerdo con los procedimientos bien conocidos en la técnica, tal como, por ejemplo, por las vías intraperitoneal o intravenosa. Ya
25 que los ratones reconstituidos mantienen los linfocitos T CD4 humanos, los animales se exponen a virus indicadores del VIH clonados molecularmente, NFNSX-r-HSAS (CCR5-tropo), NL-r-HSAS (CXCR4-tropo) y aislados clínicos (Baezinger et al. 2006. Proc Natl Acad Sci USA 103: 15951-15956). Los virus indicadores capaces de replicarse también contienen el antígeno termoestable (HSA, por su nombre en inglés) en la región vpr. Además, para establecer una infección productiva antes de la inoculación, los linfocitos mononucleares de la sangre periférica
30 (LMSP) singénicos infectados se inyectan en el espacio peritoneal de la quimera humano/ratón reconstituida.
Las pruebas de la infección del VIH se obtienen a lo largo del tiempo de bazo, ganglios linfáticos, CMSP y sangre periférica. El FACS para el HSA en los virus indicadores del VIH se utiliza para analizar la integración y la replicación del VIH. También se mide por RT-PCR la carga vírica del VIH a partir del plasma. Mediante la evaluación de la infección del VIH con estos procedimientos, se observa que la vacunación productiva in situ con las CD hace que los
35 ratones inmunizados sean más resistentes a la exposición al VIH que los que no están inmunizados.
Ejemplo 20
Vacunación del VIH/sida in situ mediante virus recombinantes: eliminación de la infección del VIH
Para comprobar la capacidad que tiene la estrategia de vacunación in situ con las CD a la hora de eliminar una infección activa del VIH, las quimeras humano/ratón se exponen primero al virus indicador del VIH molecularmente 40 clonado, NFNSX-r-HSAS (CCR5-tropo), tal y como se describe en el ejemplo 19. La infección activa del VIH se sigue analizando por FACS la expresión del HSA en los linfocitos T CD4 humanos. Una vez que se ha confirmado el éxito de la infección del VIH, los virus recombinantes manipulados genéticamente (ejemplo 19) se inyectan en los animales mediante una inyección subcutánea o mediante una vía óptima determinada por un experto en la técnica (por ejemplo, s.c., i.d., i.v. , o i.p). A continuación, la carga vírica del VIH se sigue mediante RT-PCR, y se cuentan 45 los CD4 periféricos. Se observa que la vacunación con las CD es capaz de disminuir la carga vírica del VIH y de eliminar una infección establecida del VIH en los ratones inmunizados en comparación con los controles sin vacunar.
El tratamiento antirretrovírico de gran actividad (TARGA), que utiliza una estrategia con tres fármacos, ha mejorado significativamente la morbimortalidad del sida. La estrategia esquematizada más arriba se puede adaptar a este paradigma mediante la transdución simultánea de las células CD in vivo con virus recombinantes manipulados
50 genéticamente. Los estudios anteriores se repiten junto con el TARGA para evaluar la capacidad para prevenir o reducir la infección tras la exposición al VIH (ejemplo 19) y para eliminar una infección activa del VIH.
Ejemplo 21
Tratamiento de un tumor maligno en un humano mediante un virus recombinante
An un paciente humano se le diagnostica un tumor maligno. Al paciente se le administra una cantidad adecuada del virus recombinante que contiene un gen que codifica un antígeno específico del tumor y en cuya envoltura hay una molécula orientadora específica de la DC-SIGN, tal como, por ejemplo, SVGmu. El virus contiene opcionalmente un gen que codifica un factor de maduración de las CD, tal y como se describe en el ejemplo 15. El virus se administra mediante una inyección intravenosa semanal mientras dura del tratamiento. Con periodicidad regular durante y tras
5 la pauta posológica del tratamiento, se valora la carga tumoral mediante la adquisición de imágenes de resonancia magnética nuclear (RMN). Se encuentra una reducción significativa del tamaño del tumor a medida que progresa el tratamiento.
Ejemplo 22
Prevención de la formación del tumor en un humano mediante un virus recombinante
10 A un grupo de pacientes humanos se les administra una cantidad adecuada de virus recombinante que contiene al menos un gen que codifica un antígeno que está asociado habitual y específicamente a las células tumorales y que contiene opcionalmente un gen que codifica un factor de maduración de las CD, como se describe en el ejemplo 15. El virus se envuelve con una molécula orientadora específica de la DC-SIGN, tal como, por ejemplo, SVGmu (ejemplo 2). A los pacientes del grupo experimental y del grupo de control se les observa el crecimiento tumoral con
15 regularidad. Se observa que la incidencia de la formación del tumor maligno es más baja en los pacientes a los que se administra el virus que en el grupo de control.
Ejemplo 23
Tratamiento del sida/VIH en un humano mediante un virus recombinante
Un paciente humano se diagnostica con VIH/sida. Al paciente se le administra una cantidad adecuada del virus
20 recombinante que contiene un gen que codifica la Gp120 (ejemplo 17) y que está envuelto con una molécula orientadora específica de la DC-SIGN, tal como, por ejemplo, SVGmu (ejemplo 2). El virus contiene opcionalmente un gen que codifica un factor de maduración de las CD, tal y como se describe en el ejemplo 15. El virus se administra mediante una inyección intravenosa semanal mientras dura el tratamiento. A intervalos regulares durante y tras la pauta posológica del tratamiento, se valora por ELISA la carga vírica del VIH midiendo los anticuerpos de la
25 sangre del paciente contra el VIH. También se valora el número de linfocitos T del paciente. Se observa que se consigue una reducción significativa de la carga vírica del VIH a medida que avanza el tratamiento. Además, se observa que el número de linfocitos T del paciente deja de disminuir a medida que progresa el tratamiento.
Ejemplo 24
Prevención del VIH/sida en un humano mediante un virus recombinante
30 A un grupo de pacientes humanos que se considera que corren el riesgo de contraer una infección del VIH se le administra una cantidad adecuada del virus recombinante que contiene un gen que codifica la GP120 (ejemplo 17) y que contiene opcionalmente un gen que codifica un factor de maduración de las CD, como se describe en el ejemplo
15. El virus está envuelto con una molécula orientadora específica de la DC-SIGN, tal como, por ejemplo, SVGmu (ejemplo 2). A los pacientes del grupo experimental y del grupo de control se les analiza cada 6 meses la infección
35 del VIH, y si dan positivo, se comprueba la carga vírica del VIH y el número de linfocitos T. En los pacientes infectados positivamente dentro del grupo vacunado se observa que la carga vírica del VIH permanece baja y que el número de linfocitos T permanece alto respecto a los pacientes infectados positivamente del grupo de control.
La invención además se define por las siguientes realizaciones numeradas:
1. Procedimiento para introducir un polinucleótido en una célula dendrítica que expresa la DC-SIGN, en donde
40 el procedimiento comprende: la transducción de la célula dendrítica con un virus recombinante, en donde el virus recombinante comprende el polinucleótido a introducir y una molécula orientadora que se fija a la DC-SIGN.
2. Procedimiento de acuerdo con la realización 1, en donde el virus recombinante comprende secuencias de un genoma de lentivirus.
45 3. Procedimiento de acuerdo con la realización 2, en donde el virus recombinante comprende secuencias del un genoma del VIH.
4.
Procedimiento de acuerdo con la realización 1, en donde el virus recombinante comprende secuencias de un genoma de gammarretrovirus.
5.
Procedimiento de acuerdo con la realización 4, en donde el virus recombinante comprende secuencias de
50 un genoma del virus de las células madre de ratón (VCMR) o un genoma del virus de la leucemia murina (VLM).
6.
Procedimiento de acuerdo con la realización 1, en donde la molécula orientadora comprende una glucoproteína vírica procedente de un virus de una familia de virus seleccionada del grupo de: Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Filoviridae y Herpesviridae.
7.
Procedimiento de acuerdo con la realización 1, en donde la molécula orientadora comprende una
5 glucoproteína vírica procedente de al menos un virus seleccionado del grupo de: virus de Sinbdbis, virus de la gripe, virus de la fiebre de Lassa, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus del dengue, virus de la hepatitis B, virus de la rabia, virus de la selva de Semliki, virus del río Ross, virus de Aura, virus de la enfermedad de Borna, virus de Hataan y coronavirus del SARS,
8. Procedimiento de acuerdo con la realización 7, en donde la molécula orientadora comprende una 10 glucoproteína vírica modificada procedente del virus de Sindbis.
9.
Procedimiento de acuerdo con la realización 8, en donde la molécula orientadora es la SVGmu (SEQ ID n.º 11).
10.
Procedimiento de acuerdo con la realización 1, en donde el virus recombinante está seudotipado.
11.
Procedimiento de acuerdo con la realización 1, en donde el polinucleótido comprende al menos uno de lo
15 siguiente: un gen que codifica una proteína de interés, un gen que codifica un siRNA, y un gen que codifica un microRNA de interés.
12.
Procedimiento de acuerdo con la realización 11, en donde el gen que codifica una proteína de interés codifica un antígeno.
13.
Procedimiento de acuerdo con la realización 12, en donde el antígeno es un antígeno tumoral.
20 14. Procedimiento de acuerdo con la realización 12, en donde el antígeno es un antígeno del VIH.
15. Procedimiento de acuerdo con la realización 1, que además comprende las etapas de: transfectar una línea de células de empaquetamiento con un vector vírico que comprende el polinucleótido a introducir y un vector que comprende un gen que codifica la molécula orientadora; el cultivo de la línea de células de empaquetamiento transfectadas; y la recuperación del virus recombinante del cultivo de células de
25 empaquetamiento.
16.
Procedimiento de acuerdo con la realización 15, en donde dicha línea de células de empaquetamiento es una línea de células 293.
17.
Procedimiento de acuerdo con la realización15, en donde el polinucleótido se introduce en in vitro una célula dendrítica.
30 18. Procedimiento de acuerdo con la realización 15, en donde el polinucleótido se introduce in vivo en una célula dendrítica de un sujeto.
19.
Procedimiento de acuerdo con la realización 18, en donde el sujeto es un mamífero.
20.
Procedimiento de acuerdo con la realización 19, en donde el sujeto es un humano.
21.
Procedimiento de acuerdo con la realización 19,en donde el sujeto es un ratón.
35 22. Virus recombinante que comprende: un polinucleótido de interés; y una molécula orientadora que preferiblemente se fija a la DC-SIGN.
23. Virus recombinante de acuerdo con la realización 22, en donde el virus recombinante comprende secuencias de un genoma de lentivirus.
24. Virus recombinante de acuerdo con la realización 23, en donde el recombinante comprende secuencias de 40 un genoma del VIH.
25.
Virus recombinante de acuerdo con la realización 22, en donde el virus recombinante comprende secuencias de un genoma de gammarretrovirus.
26.
Virus recombinante de acuerdo con la realización 25, en donde el virus recombinante comprende
secuencias de un genoma del virus de las células madre de ratón (VCMR) o de un genoma del virus de la 45 leucemia murina (VLM).
27.
Virus recombinante de acuerdo con la realización 22, en donde la molécula orientadora comprende una
glucoproteína vírica procedente de un virus de una familia de virus seleccionada del grupo de: Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Filoviridae y Herpesviridae.
28.
Virus recombinante de acuerdo con la realización 22, en donde la molécula orientadora comprende una glucoproteína vírica procedente de al menos un virus seleccionado del grupo de: virus de Sindbis, virus de
5 la gripe, virus de la fiebre de Lassa, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus del dengue, virus de la hepatitis B, virus de la rabia, virus de la selva de Semliki, virus del río Ross, virus de Aura, virus de la enfermedad de Borna, virus de Hantaán y coronavirus del SARS.
29. Virus recombinante de acuerdo con la realización 28, en donde la molécula orientadora comprende una glucoproteína vírica procedente del virus de Sindbis.
10 30. Virus recombinante acuerdo con de la realización 29, en donde la molécula orientadora es la SVGmu (SEQ ID n.º 11).
31.
Virus recombinante de acuerdo con la realización 22, en donde el virus recombinante está seudotipado.
32.
Virus recombinante de acuerdo con la realización 22, en donde el polinucleótido comprende al menos uno
de lo siguiente: un gen que codifica una proteína de interés, un gen que codifica un siRNA, y un gen que 15 codifica un microRNA de interés.
33.
Virus recombinante de acuerdo con la realización 30, en donde la proteína de interés es un antígeno.
34.
Virus recombinante de acuerdo con la realización 33, en donde el antígeno es un antígeno tumoral.
35.
Virus recombinante de acuerdo con la realización 33, en donde el antígeno es un antígeno del VIH.
36. Virus recombinante de acuerdo con la realización 21, en donde el polinucleótido de interés codifica un gen 20 indicador.
37. Uso de un virus recombinante en la preparación de un medicamento para estimular una respuesta inmunitaria de un mamífero al introducir un polinucléotido que codifica un antígeno en las células dendríticas que expresan la DC-SIGN, en donde el virus recombinante comprende el polinucleótido y una molécula orientadora que se fija específicamente a la DC-SIGN.
25 38. Vector que codifica una molécula orientadora que se fija específicamente a la DC-SIGN.
39.
Vector de acuerdo con la realización 38, en donde la molécula orientadora procede de una glucoproteína vírica.
40.
Vector de acuerdo con la realización 39, en donde la molécula orientadora es la SVGmu (SEQ ID n.º 11).
41.
Uso de un virus recombinante en la preparación de un medicamento para tratar a un paciente con una
30 enfermedad mediante la administración del virus recombinante al paciente, en donde el virus recombinante comprende al menos un gen de interés que codifica un antígeno asociado a la enfermedad y una molécula orientadora que se fija a la DC-SIGN.
42.
Uso de acuerdo con la realización 41, en donde el virus recombinante codifica un segundo gen de interés.
43.
Uso de acuerdo con la realización 42, en donde el segundo gen de interés codifica un factor de maduración.
35 44. Uso de acuerdo con la realización 43, en donde el factor de maduración se selecciona del grupo que consiste en GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNF!, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando de CD40 (CD40L) y un CD40 inducible con fármacos (iCD40).
45. Uso de acuerdo con la realización 41, en donde la molécula orientadora procede de una glucoproteína vírica.
40 46. Uso de acuerdo con la realización 45, en donde la molécula orientadora es la SVGmu (SEQ ID n.º 11).
47.
Uso de acuerdo con la realización 41, en donde la enfermedad es cáncer.
48.
Uso de acuerdo con la realización 41, en donde la enfermedad es VIH/sida.
49.
Célula dendrítica transducida con un virus recombinante, en donde el virus recombinante comprende un polinucleótido de interés y una molécula orientadora que se fija a la DC-SIGN.
45 50. Célula dendrítica de acuerdo con la realización 49, en donde la molécula orientadora comprende una 41
glucoproteína vírica procedente de un virus de una familia de virus seleccionada del grupo de: Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Filoviridae y Herpesviridae.
51. Célula dendrítica de acuerdo con la realización 49, en donde la molécula orientadora comprende una glucoproteína vírica procedente de al menos un virus seleccionado del grupo de: virus de Sindbis, virus de
5 la gripe, virus de la fiebre de Lassa, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus del dengue, virus de la hepatitis B, virus de la rabia, virus de la selva de Semliki, virus del río Ross, virus de Aura, virus de la enfermedad de Borna, virus de Hantaán y coronavirus del SARS.
52. Célula dendrítica de acuerdo con la realización 49, en donde la molécula orientadora es la SVGmu (SEQ ID n.º 11).
10 53. Uso de un virus recombinante en la preparación de un medicamento para inmunizar un mamífero mediante la inserción de un polinucleótido que codifica un antígeno en las células dendríticas que expresan la DC-SIGN, en donde el virus recombinante comprende un polinucleótido que codifica un antígeno y una molécula orientadora que se fija a la DC-SIGN.
Aunque la invención anterior se ha descrito en detalle con el propósito de facilitar la comprensión, será obvio que se 15 pueden practicar determinadas modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
LISTA DE SECUENCIAS
<110> CALIFORNIA INSTITUTE OF TECHNOLOGY 5 <120> Introducción selectiva de genes para la vacunación con células dendríticas
<130> 59.15.101444
<140> EP07799765.8 10 <141>
<150> PCT/US2007/074142
<151>
15 <150> U.S. 60/832.497
<151>
<150> U.S. 60/920.260
<151>
20
<160> 11
<170> FastSEQ para Windows versión 4.0 25 <210> 1
<211> 9941
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial 30 <220>
<223> Vector plasmídico construido
<400> 1
<210> 2
<211> 9206 5 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
46 <220>
<223> Vector plasmídico construido 5 <400> 2
<210> 3 5 <211> 8435
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220> 10 <223> Vector plasmídico construido
<400> 3
<210> 4
<211> 11092 5 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Vector plasmídico construido 10
<400> 4
<210> 5 5 <211> 10401
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220> 10 <223> Vector plasmídico construido
<400> 5
<210> 6
<211> 9903 5 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Vector plasmídico construido 10
<400> 6
<210> 7
<211> 11586 5 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Vector plasmídico construido 59 <220>
<221> característica miscelánea
<222> 3907 5 <223> n=a, t, c o g
<400> 7
<210> 8
<211> 11893 5 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
62 <220>
<223>
Vector plasmídico construido 5 <400> 8
<210> 11
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223>
Glucoproteína mutada del virus de Sindbis 10
<210> 9
<211> 9569
5
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Vector plasmídico construido
10
<220>
<221> característica miscelánea
<222> 4189
<223> n=a, t, c o g
15
<400> 9
<210> 10
<211> 9394
5
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Vector plasmídico construido
10
<220>
<221> característica miscelánea
<222> 7971
<223> n=a ,t, c o g
15
<400> 10
<400> 11

Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento para preparar un virus recombinante que comprende un gen de interés, en donde dicho método comprende
    a) proporcionar una línea celular de empaquetamiento que está transfectada con un vector retrovírico que comprende un polinucleótido que comprende un gen de interés, y un vector que comprende un gen que codifica una molécula orientadora;
    en donde dicha molécula orientadora comprende una glucoproteína de alfavirus que reconoce selectiva y específicamente la DC-SIGN (proteína no-integrina fijadora de ICAM-3 [moléculas de adhesión intracelular de tipo 3] específica de las células dendríticas); en donde dicha glucoproteína es una glucoproteína E2 de alfavirus que está mutada en un sitio de fijación a sulfato de heparano para disminuir o eliminar su capacidad de fijación al sulfato de heparano,
    b) cultivar la línea celular de empaquetamiento; y
    c) recuperar el virus recombinante de la línea celular de empaquetamiento.
  2. 2.
    Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el vector retrovírico es un vector lentivírico.
  3. 3.
    Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el vector lentivírico comprende secuencias de un genoma del virus de la leucemia murina (VLM) o de un genoma del VIH.
  4. 4.
    Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la glucoproteína de alfavirus es una glucoproteína del virus de Sindbis.
  5. 5.
    Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el virus comprende una proteína E1 del Sindbis y una proteína E2 del Sindbis que reconocen selectiva y específicamente a la DC-SIGN.
  6. 6.
    Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el gen de interés codifica una proteína de interés.
  7. 7.
    Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la proteína de interés es un antígeno.
  8. 8.
    Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el antígeno es un antígeno tumoral o un antígeno del VIH.
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