ES2462944T3 - Método para determinar en un rosal silvestre la presencia de cruzamiento con un rosal cultivado - Google Patents
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Abstract
Un método para determinar si una rosa silvestre de interés está cruzada o no con una rosa cultivada, comprendiendo dicho método la investigación de la presencia de un gen KSN que contiene un transposón indicador, en donde se determina que la rosa silvestre de interés no está cruzada con una rosa cultivada cuando no está presente un gen KSN que contiene un transposón indicador en dicha rosa silvestre de interés; o en donde se determina que la rosa silvestre de interés está cruzada con una rosa cultivada cuando está presente un gen KSN que contiene un transposón indicador en dicha rosa silvestre de interés.
Description
Método para determinar en un rosal silvestre la presencia de cruzamiento con un rosal cultivado
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método para determinar la presencia de cruzamiento con una rosa cultivada en una rosa silvestre.
Puesto que siempre se favorecen las flores que tienen nuevos rasgos de la industria de las flores, el desarrollo de tal tipo de plantas con flores es industrialmente importante. La mejora de la raza basada principalmente en cruzamiento ha producido especies con una variedad de rasgos. Sin embargo, en la mejora de la raza basada en el cruzamiento, los recursos genéticos disponibles se limitan a plantas susceptibles de cruzamiento estrechamente relacionadas, y de este modo los colores y los rasgos que se pueden introducir son limitados en la mayoría de los casos, y además es raro que las especies de plantas individuales tengan diversos colores y rasgos. En términos de color, por ejemplo, era imposible producir rosas y claveles de color azul, campanillas o geranios de color amarillo mediante mejora de la raza basada en el cruzamiento.
Sin embargo, el uso de la tecnología recombinante de genes puede conseguir el desarrollo de una variedad de rasgos mediante la introducción de varios genes en las plantas que superen la barrera de la especie y mediante la alteración artificial de los metabolismos de plantas, etc. Por ejemplo, hay un ejemplo en el que en las rosas y los claveles que no pueden producir delfinidina en el pétalo de la flor, se expresó el gen de la enzima flavonoide 3',5'hidroxilasa que es requerido para sintetizar delfinidina para producir delfinidina, permitió la creación de flores de color azul que no están presentes en la naturaleza (Tanaka 2006).
Sin embargo, en Japón, la investigación y el desarrollo, el cultivo, la distribución, etc. de tales plantas recombinantes de genes creados artificialmente son necesarios para cumplir con las regulaciones establecidas en la "Ley sobre la Conservación y Uso Sostenible de la Diversidad Biológica a través de las Regulaciones sobre el Uso de Organismos Vivos Modificados" (Protocolo de Cartagena). En otros países también, el cultivo en campos, etc. de las plantas recombinantes de genes ha sido regulado basándose en leyes similares. En concreto, para las plantas cuyos pólenes son fértiles y para las que existen una multitud de plantas susceptibles de cruzamiento estrechamente relacionadas que existen en Japón, es obligatoria la evaluación de la capacidad de cruzamiento, o de la posibilidad de proliferación de genes de una planta recombinante con respecto a una especie silvestre estrechamente relacionada.
En el caso de las rosas para las que se producen a una multitud de especies estrechamente relacionadas en Japón y que son de varias flores y fructíferas, las cantidades que se deben analizar para determinar la presencia de cruzamiento entre especies cultivadas y silvestres se convierten en enormes, y de este modo se está buscando el establecimiento de tecnologías analíticas simples y precisas. Hasta ahora, se ha informado sobre la que utiliza microsatélites como marcador molecular (Debener 2003, 2006). Además, el análisis también se puede llevar a cabo con un método de identificación basado en la determinación de la ploidía por medio de citometría de flujo. Sin embargo, cualquiera de los métodos anteriores tenía el problema de que carecían de precisión, versatilidad y/o simplicidad. Además, dado que las rosas cultivadas hoy en día fueron creadas mediante cruzamiento artificial de aproximadamente 8 especies silvestres, no fue fácil obtener marcadores de ADN que pudieran distinguir las especies cultivadas de las especies silvestres.
De acuerdo con la presente invención, el gen KSN, un gen diana, es un gen implicado en la floración perpetua de las rosas obtenidas a partir de Rosa chinensis spontanea, y el gen se creó insertando un transposón aproximadamente 9 kb en el gen KSN de una rosa de floración estacional. Se ha informado de que la inserción de un transposón sirve para inhibir la expresión de dicho gen, lo que condujo a la desregulación del control de la antogénesis en el ápice del brote, lo que dio como resultado la naturaleza de floración perpetua (Iwata et al., Publicación de Patente Japonesa No Examinada (Kokai) Núm. 2006-149202).
Ya se ha dilucidado que las rosas de las especies cultivadas contienen, en la configuración homóloga, dicho gen que tiene un transposón insertado en el mismo. Por otro lado, las rosas de la especie silvestre tienen, en la configuración homóloga, un gen KSN que, en principio, no contiene un transposón.
Según se utiliza en la presente memoria, la Rosa chinensis es una de las especies silvestres que se convirtieron en un antepasado de las rosas cultivadas y una rosa de floración estacional R. chinensis spontanea es un linaje mutante de la misma y una rosa de floración perpetua.
Documento de Patente 1: Publicación de Patente Japonesa No Examinada (Kokai) Núm. 2006-149202.
Se ha informado sobre métodos para determinar la presencia de cruzamiento con rosas cultivadas en rosas silvestres, pero carecen de la versatilidad. Otros métodos pueden ser concebibles, pero carecen de simplicidad y precisión. Por lo tanto, existe la necesidad de un método que pueda resolver estos problemas y pueda determinar si las rosas silvestres se cruzan con las rosas cultivadas para que las plantas sean fructíferas y para las cuales se produce una multitud de especies silvestres estrechamente relacionadas.
En los casos en que se va a determinar un número enorme de plantas individuales para determinar la presencia de cruzamiento con el fin de examinar la posibilidad de proliferación de genes de plantas recombinantes, se requiere específicamente un método que permita una fácil determinación de si una rosa silvestre se cruza con una rosa transformante como planta parental polinífera. Por lo tanto, la presente invención tiene como objetivo proporcionar un método que permita determinar fácilmente si una rosa silvestre de interés se cruza con el polen de una rosa transformante.
Después de una investigación intensiva y exhaustiva con el fin de alcanzar el objetivo anterior, los autores de la presente invención han concebido la idea de que en una rosa silvestre, solo se puede detectar un gen KSN que contiene un transposón cuando la rosa silvestre se cruza con una rosa cultivada, y han descubierto que utilizando un gen KSN que contiene un transposón como indicador, se puede lograr el objetivo anterior, y de ese modo han completado la presente invención.
De este modo, la presente invención proporciona un método para determinar si una rosa silvestre de interés se cruza o no con una rosa cultivada, comprendiendo dicho método las etapas de: examinar si un gen KSN que contiene un transposón (indicador) está contenido o no en la rosa de interés; y determinar que la rosa de interés está cruzada con una rosa cultivada cuando el individuo tiene el gen KSN que contiene el transposón.
Normalmente, en el cruzamiento de una rosa cultivada con una especie silvestre en un estudio para evaluar el efecto de las plantas transgénicas en la diversidad biológica, la dispersión de pólenes de especies cultivadas que da como resultado el cruzamiento con especies silvestres en las proximidades presenta problemas. Así, en el método de la presente invención, típicamente la planta parental semillera es una rosa silvestre y la planta parental polinífera es una rosa cultivada. Asimismo, típicamente la rosa cultivada anterior es una rosa transformante que tiene un gen introducido en la misma, en la que el gen puede ser un gen relacionado con el color tal como el gen de la enzima flavonoide 3',5'-hidroxilasa derivada del pensamiento de la familia Violaceae .
Breve explicación de los dibujos
La Figura 1 muestra el resultado de la detección del gen KSN mediante un método de PCR. La posición de los productos amplificados específicos del gen KSN que contienen intrones y del gen GAPDH (control interno) se muestra mediante flechas.
Especies cultivadas y especies silvestres
En general, las rosas cultivadas son tetraploides (4x) y de floración perpetua. En contraste, rosas silvestres son generalmente diploides (2x) y de floración estacional.
Las rosas cultivadas se pueden clasificar en híbrido de té, floribunda y miniatura, y todas contienen, en la configuración homóloga, un gen KSN que tiene un transposón insertado en el mismo. Por lo tanto, rosas cultivadas, según se utiliza en la presente memoria indica rosas que contienen, en la configuración homóloga, un gen KSN que tiene un transposón insertado en el mismo.
Por otro lado, las rosas silvestres nativas de Japón incluyen NOIBARA (R. multiflora Thunb. ex Murray), TERIHANOIBARA (R. wichuraiana Crep.), Hamanasu (R. rugosa Thunb. ex Murray), OOTAKANEBARA (R. acicularis Lindl.), KARAFUTOIBARA (R. marretii Lev.), OOFUJIIBARA, AZUMAIBARA, YAMATERIHANOIBARA (R. luciae Franch. et Rochebr.), YAMAIBARA (R. sambucina Koidz.), KAKAYANBARA, YAEYAMANOIBARA (R. bracteata Wendl.), NANIWAIBARA (R. laevigata Michx.), SANSHOUBARA (R. roxburghii Tratt. var. hirtula (Regel) Rehd. et Wils.), TAKANEBARA (R. acicularis var. nipponensis (Crép.) Koehne.), TSUKUSHIIBARA (R. multiflora var. adenochaeta (Koidz.) Makino), MORIIBARA (R. luciae var. hakonensis Franch. et Sav.), FUJIIBARA (R. luciae var. fujisanensis Makino), YABUIBARA, NIOIIBARA (R. luciae var. onoei (Makino) Momiyama), MIYAKOIBARA (R. luciae var. paniculgera (Makino) Momiyama) y normalmente tienen, en la configuración homóloga, un gen KSN que no tiene ningún transposón insertado en el mismo. De este modo, rosas silvestres utilizadas en la presente memoria indican plantas de rosa que tienen, en la configuración homóloga, un gen KSN que no tiene un transposón insertado en el mismo.
Gen indicador
De acuerdo con el método de la presente invención, preferiblemente el gen indicador es tal que:
- (1)
- el gen indicador está siempre presente en rosas cultivadas y no en rosas silvestres nativas.
- (2)
- Las rosas cultivadas son tetraploides (4x), y debe estar presente un gen indicador para el cruzamiento en al menos tres de los cuatro cromosomas homólogos, y puede estar presente preferiblemente en los cuatro cromosomas homólogos. Las rosas cultivadas son tetraploide (4x), mientras que las rosas silvestres nativas son diploides (2x). Por lo tanto, los gametos producidos a partir de rosas cultivadas pueden ser generalmente 2x, las rosas silvestres pueden ser x, y los híbridos producidos a partir del cruzamiento de las mismas pueden llegar a ser triploides (3x). Basándose en esto, es imperativo que el gen indicador del cruzamiento esté presente en al menos tres de los genes homólogos de las rosas cultivadas. Teniendo en cuenta la posibilidad de que se pueda producir un gameto haploide (x) por medio de meiosis heterogénea a partir de rosas cultivadas, sin embargo, se prefiere, para una determinación exacta, que el gen indicador está presente en los cuatro cromosomas homólogos.
- (3)
- La misma secuencia que la secuencia parcial de la secuencia de bases del gen indicador no está presente en las otras regiones del cromosoma.
Con el fin de determinar la presencia de un gen indicador en la planta de interés, dicho gen debe ser amplificada normalmente. Para este fin, resulta conveniente utilizar un método de PCR utilizando un par de cebadores que sean homólogos para la región del gen diana. En este caso, cuando está presente una secuencia que se hibrida con dicho cebador en otro gen distinto del gen diana, se puede obtener un resultado que indique la presencia del gen, incluso si el gen diana nativo está ausente. De este modo, este requisito es importante con respecto al diseño del cebador.
Gen indicador específico
En cuanto al gen que satisface el requisito anterior, se puede mencionar un gen KSN que tiene un transposón insertado en el mismo. Se ha demostrado que el gen KSN referido como gen relacionado con la propiedad de floración perpetua de las rosas (Publicación de Patente Japonesa No Examinada (Kokai) Núm. 2006-149202) existe como un gen completo que codifica 519 aminoácidos en las especies silvestres mientras que en las especies cultivadas se ha insertado un transposón de aproximadamente 9 kb en el segmento del intrón. Por lo tanto, puesto que este transposón no está presente en las especies silvestres, pero presente en las especies cultivadas, el gen KSN que contiene este transposón satisface el requisito expuesto en el apartado (1) anterior.
Asimismo, el gen KSN que contiene este transposón está presente en los cuatro genes de las rosas cultivadas. De este modo, este gen satisface el requisito establecido en el apartado (2) anterior.
El gen KSN que contiene este transposón también satisface el requisito expuesto en el apartado (3) anterior de selección de cebadores.
Cebadores y sondas
La secuencia de bases del gen KSN (SEQ ID NO: 1) y la de un transposón (SEC ID NO: 2) insertado en el mismo son ya conocidos. El gen KSN que tiene este transposón insertado en el mismo está específicamente presentes solo en las rosas cultivadas. Con el fin de detectar el gen KSN que tiene este transposón insertado en el mismo mediante PCR, es necesario utilizar, como par, un cebador que tiene una secuencia idéntica o sustancialmente homóloga a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1 y un cebador que tiene un secuencia idéntica o sustancialmente homóloga a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 2. Además, las condiciones generales que deben cumplir el cebador, y cualquiera de los cebadores son un oligonucleótido con un tamaño de 10 bases o más, preferiblemente 15 bases o más, y 50 bases o menos, preferiblemente 30 bases o menos.
Teniendo en cuenta el propósito de la presente invención, se prefiere que ninguno del par de cebadores hibride con una región distinta de dicho transposón, aunque la región que se va amplificar en el transposón no está limitada específicamente. Como ejemplo de un par de cebadores que satisface tales requisitos, se pueden mencionar un cebador directo: CATATTATGGCATAGGGTGTGGC (SEC ID NO: 3) y un cebador inverso: TGTAATCTGTAGGAGATCCCATGC (SEQ ID NO: 4).
Detección del gen indicador
La extracción de ADN de las rosas, la amplificación por PCR, etc., y la detección de los productos amplificados se pueden llevar a cabo de acuerdo con los métodos convencionales.
Ejemplos
De aquí en adelante, se explicarán los detalles de la presente invención con referencia a los ejemplos. A menos que se especifique lo contrario, los métodos de biología molecular utilizados están basados en Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001), Plant Physiol. (2003) 132, 1652-1663.
Ejemplo de Referencia 1.
Adquisición de un gen específico para una rosa cultivada mediante el análisis de ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD)
Con el fin de determinar la presencia de cruzamiento de una rosa cultivada con una rosa silvestre, se utilizó la detección de polimorfismo de genes mediante el análisis RAPD en un intento de obtener un gen que esté específicamente presente solo en la cultivada rosa. De cada hoja de una especie silvestre (R. paniculigera) y una especie cultivada (lavande y WKS82), se extrajo ADN genómico usando DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) de acuerdo con un método recomendado por el fabricante. Se preparó una reacción de PCR que comprendía 10 ng del ADN genómico extraído, 2 µM de cualquier cebador (grupo de cebadores de Common de BEX, CMN-A00), 0,4 mM de una mezcla de dNTP, 1 x tampón Ex Taq, y 0,05 U de Takara Ex Taq.
La reacción comprendía, después de reaccionar a 94°C durante 5 minutos, 25 ciclos de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos, y finalmente se hizo reaccionar a 72°C durante 7 minutos. El producto de PCR obtenido se sometió a una electroforesis en gel de agarosa al 0,8% para comparar el patrón electroforético entre las especies silvestres y las especies cultivadas. Las bandas que fueron detectadas específicamente en las especies cultivadas se escindieron del gel de agarosa, y se purificaron mediante el GENECLEAN Turbo Kit (Funakoshi KK) de acuerdo con un método recomendado por el fabricante. Finalmente, se subclonaron por medio del vector pCR2.1 TOPO (Invitrogen) de acuerdo con un método recomendado por el fabricante, y se sometieron a análisis de secuencia para determinar la secuencia.
Se analizó la secuencia de cada fragmento amplificado. Se crearon los cebadores Oligo de aproximadamente 20 unidades que contenían una secuencia de cebador común presente en ambos extremos de cada fragmento, y se examinaron las combinaciones de cebadores oligo para los cuales se detectaron específicamente los productos amplificados solo en las especies cultivadas (lavande, WKS82). Con 10 ng de cada ADN genómico de R. paniculigera, lavande y WKS82 como la molde, se preparó una reacción de PCR que comprendía 2 µM de cada cebador oligo, 1 × mezcla dNTP, y 0,05 µM de tampón Ex Taq. La reacción comprendía, después de reaccionar a 94°C durante 5 minutos, 25 ciclos de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos, y finalmente se hizo reaccionar a 72°C durante 7 minutos. Los productos de PCR obtenidos se sometieron a una electroforesis en gel de agarosa al 0,8% para comparar las combinaciones de cebadores oligo para las cuales se examinaron los productos amplificados detectados específicamente solo en las especies cultivadas. Como resultado, se seleccionaron las combinaciones de cebadores oligo que se cree que proporcionan bandas solo en las especies cultivadas, y se sometieron a un experimento que se muestra en el Ejemplo de Referencia 2 siguiente.
Ejemplo de Referencia 2.
Determinación de la presencia de cruzamiento en la progenie con la detección de un gen específico como un indicador
Para las plantas obtenidas polinizando artificialmente con polen de una rosa cultivada una rosa silvestre, se determinó la presencia de cruzamiento utilizando como indicador la detección de un gen específico para la combinación de cebadores oligo que se pensaba que eran especies cultivadas específicas obtenidas en el Ejemplo de Referencia 1. De la hoja de cada progenie obtenida, se extrajo ADN genómico usando el DNeasy Plan Mini Kit (Qiagen) de acuerdo a un método recomendado por el fabricante.
A continuación, utilizando esto como molde, se sometieron a la reacción 2 µM del cebador, 0,4 mMI de una mezcla de dNTP, 1 x tampón Ex Taq y 0,05 U de Ex Taq. La reacción comprendía, después de reaccionar a 94°C durante 5 minutos, 25 ciclos de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos, y finalmente se hizo reaccionar a 72°C durante 7 minutos. El producto de PCR obtenido se sometió a una electroforesis en gel de agarosa al 0,8% para confirmar la detección de bandas específicas. Sin embargo, aunque la morfología de la planta individual aparentemente mostraba un rasgo intermedio, no se obtuvo ninguna correlación con la presencia de bandas específicas. Esto sugirió que el marcador RAPD obtenido aquí puede no ser el contenido los cuatro cromosomas homólogos, pero puede derivar de una secuencia génica presente solamente en algunos de los cuatro cromosomas homólogos de las especies cultivadas. De este modo, se determinó que era apropiado como indicador para la presencia de cruzamiento.
Ejemplo de trabajo 1.
Determinación de la presencia de cruzamiento en la progenie con la detección del gen KSN como indicador
Se polinizó una rosa silvestre con polen de una rosa cultivada, y para la planta obtenida, se determinó la presencia de cruzamiento utilizando como indicador la detección del gen KSN (documento WO2004/070036) que contenía un transposón que se sabe que se detectada específicamente en rosas de floración perpetua. Se diseñaron un cebador de hebra + de este gen y un cebador de cadena inversa en el transposón insertado y prepararon con el fin de permitir la determinación de la presencia de la inserción de un transposón.
De la hoja de cada progenie obtenida por medio de cruzamiento artificial, se extrajo ADN genómico utilizando el DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) de acuerdo a un método recomendado por el fabricante. Utilizando éste como molde, se prepararon un total de 2,5 ml de una disolución de reacción que comprendía 0,2 µM de cada uno de un cebador directo KSN1F3: 5'-CAT ATT GCA TAG GGT GTG GC-3' (SEC ID NO: 3) y un cebador inverso KSN1nsR3: 5'-TGT AAT CTG TAG GAG ATC CCA TGC-5' (SEQ ID NO: 4), 0,2 µM de una mezcla de dNTP, 1 x tampón Ex Taq, y 0,625 U de Ex Taq y se sometieron a reacción. La reacción comprendía, después de reaccionar a 94°C durante 5 minutos, 25 ciclos de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos, y finalmente se hicieron reaccionar a 72°C durante 7 minutos. El producto de PCR obtenido se sometió a una electroforesis en gel de agarosa al 0,8% para confirmar la detección de una banda específica de aproximadamente 1,2 kb. Asimismo, se confirmó que la morfología de la planta individual obtenida mostraba un rasgo intermedio entre los de las especies cultivadas y las especies silvestres.
De este modo, para las plantas implicadas a partir de cuya morfología se puede determinar que son un cruce de la especie cultivada y la especie silvestre, se confirmó la presencia del gen KSN que contenía el transposón. Basándose en esto, se determinó que las plantas individuales que tienen un gen KSN que no contiene el transposón no son un cruce de la especie cultivada y la especie silvestre. Teniendo en cuenta esta característica, se indicó que, cuando se utilizó una especie que tenía un gen KSN que no contenía un transposón por línea materna, se puede determinar la identidad del cruzamiento confirmando la presencia de un gen KSN que contiene un transposón en la planta individual progenie.
Ejemplo de Trabajo 2.
Determinación de la presencia de un gen KSN en rosas silvestres
Con el fin de determinar si una rosa silvestre podría ser un sujeto para el método de determinación de la presente invención, se evaluó la presencia de un gen KSN que contiene un transposón en cada rosa silvestre. Como rosas silvestres, se utilizaron NOIBARA (R. multiflora Thunb. ex Murray), TERIHANOIBARA (R. wichuraiana Crep.), Hamanasu (R. rugosa Thunb. ex Murray), OOTAKANEBARA (R. acicularis Lindl.), KARAFUTOIBARA (R. marretii Lev.), OOFUJIIBARA, AZUMAIBARA, YAMATERIHANOIBARA (R. luciae Franch. et Rochebr.), YAMAIBARA (R. sambucina Koidz.), YAEYAMANOIBARA (R. bracteata Wendl.), NANIWAIBARA (R. laevigata Michx.), SANSHOUBARA (R. roxburghii Tratt. var. hirtula (Regel) Rehd. et Wils.), TSUKUSHIIBARA (R. multiflora var. adenochaeta (Koidz.) Makino), MORIIBARA (R. luciae var. hakonensis Franch. et Sav.), FUJIIBARA (R. luciae var. fujisanensis Makino), YABUIBARA (R. luciae var. onoei (Makino) Momiyama), MIYAKOIBARA (R. luciae var. paniculgera (Makino) Momiyama) para determinar la presencia de un gen KSN que contiene un transposón (documento WO2004/070036) de acuerdo con un método descrito en el Ejemplo de Trabajo 1.
Como resultado, no se detectó ningún producto específico amplificado (tamaño amplificado pronosticado: aproximadamente 1,2 kb) del gen KSN que contiene un transposón en ninguna de las rosas silvestres. Por otro lado, el producto amplificado del gen GAPDH que servía como control interno se detectó en todas las especies silvestres. Por lo tanto, en estas rosas silvestres, no se reconoció la presencia de un gen KSN que contiene un transposón.
A partir de lo anterior, se determinó que el método de la presente invención que utiliza un gen KSN que contiene transposón como indicador puede utilizar favorablemente una rosa silvestre como sujeto de ensayo.
Ejemplo de Trabajo 3.
Validación de la presencia de cruzamiento con una rosa cultivada en la progenie obtenida por cruzamiento artificial
Para un individuo progenie para el cual la planta parental semillera es una rosa silvestre y la planta parental polinífera es una rosa cultivada, la presencia de cruzamiento se evaluó utilizando el método de determinación de la presente invención.
De acuerdo con un método convencional, inmediatamente antes de la floración de las especies silvestres, se llevaron a cabo la emasculación y el embolsado, y cuando el estambre alcanzó la plena madurez, los pólenes del anfitrión (WKS82) y un transformante (WKS82/130-4-1 y WKS82/130-9-1) se acoplaron la mañana de un día agradable. A continuación, se llevó a cabo de nuevo el embolsado para evitar el acoplamiento de otros pólenes, y se examinó la presencia de la formación de semillas. El polen utilizado se obtuvo mediante la recuperación de la antera antes de la escisión, que se dejó que reposara en un desecador que tenía gel de sílice, y a continuación se obtuvo el polen fresco de la antera que escindió el día siguiente.
Como planta madre para el cruzamiento, las especies silvestres utilizadas fueron R. multiflora Thunb. ex Murray, R. wichuraiana Crep., y R. rugosa Thunb. ex Murray.
La presencia de la formación de semillas fue confirmada para el fruto para el que no se observó una caída de frutos fisiológica, sino que se observó el cuajado del fruto en el punto temporal de más de 2 meses después del cruzamiento. Además, se recuperaron las semillas obtenidas, y después de un tratamiento de enfriamiento a 4°C durante 3 meses, se sembraron. Con el fin de confirmar la presencia de cruzamiento con el anfitrión o el transformante y la presencia de la transmisión del transgén en los mismos, se realizó un método de PCR de acuerdo con un método descrito en el Ejemplo de Trabajo 1 para el análisis.
Cuando las semillas se sometieron a un tratamiento de enfriamiento, la brotación, que se observa por lo general en aproximadamente un mes, no se observó ni siquiera después del paso de 3 meses. Por lo tanto, se recuperó de nuevo una parte de las semillas sembradas que no brotaban, y se sembraron para un análisis similar. De las semillas recuperadas de nuevo, se extrajo ADN genómico usando Nucleon PHYTOPURE for PLANT DNA EXTRACTION KIT (Amersham Biosciences) de acuerdo con un método recomendado por el fabricante. Además, después de su amplificación mediante REPLI-g Midi Kit (QIAGEN), se analizó la presencia de cruzamiento con el anfitrión o el transformante y la presencia de la transmisión del gen introducido en los mismos mediante un método de PCR utilizando como indicador la presencia de un gen KSN que tiene un transposón insertado en el mismo. Como control interno, se utilizó el gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH).
Cebador especifico del gen GAPDH
Rh GAPDH-237F: 5'-TGT CAT CTC TGC CCC AAG TAA GG-3' (SEQ ID NO: 5)
Rh GAPDH-724R: 5'-CAA CAT CCT CAT CGG TGT AAC CC-3' (SEC ID NO: 6)
Los resultados se muestran en la Tabla 1 y la Tabla 2. La tasa de cuajado de fruto fue muy baja incluso cuando se utilizaron cualquiera del anfitrión y el recombinante como el plantas parentales poliníferas. La plántula obtenida se analizó por medio de un método de PCR, en el que se detectó un gen KSN que contenía un transposón y se reconoció el cruzamiento de las especies silvestres con el anfitrión o el transformante, pero no se detectó el transgén derivado del transformante. Además, cuando se recuperaron de nuevo las semillas sembradas que no brotaban y se observó si eran válidas o no, la mayoría de ellas estaban "vacías (sin contenido de semilla)" y solo se confirmaron embriones normales para una fracción de las plantas. Para éstas, se llevó a cabo un análisis similar mediante el método de PCR, en el que se detectó un gen KSN que contenía un transposón y se reconoció el cruzamiento de las especies silvestres con el anfitrión o el transformante, pero no se detectó el transgén derivado del transformante. Se pensaba a partir de esto que el transgén no se transmitía a la progenie, debido a que, por ejemplo, el transgén no estaba contenido en la célula de polen del transformante.
Por lo tanto, se pensó que incluso si el transformante se cruzaba con las especies silvestres (R. multiflora, R. wichuraiana, y R. rugosa), no hay posibilidad de que el transgén sea transmitido a la progenie, debido a que, por ejemplo, el transgén no estaba contenido en la célula de polen del transformante.
Para R. wichuraiana, no se confirmaron embriones normales en ninguna semilla.
Por lo tanto, utilizando el método de determinación de la presente invención, se puede evaluar muy fácilmente la presencia de cruzamiento entre una rosa silvestre y una rosa cultivada. Asimismo cuando el transgén no puede ser transmitido a la progenie, debido a que, por ejemplo, el transgén no está contenido en la célula de polen del transformante, generalmente es a menudo difícil el análisis de cruzamiento. Sin embargo, utilizando el método de determinación de la presente invención, se puede determinar fácilmente la presencia de cruzamiento. Por lo tanto, la presencia de cruzamiento se determina primero utilizando el método de determinación de la presente invención y cuando se determina que ha habido cruzamiento, es posible estimar si el transgén está presente en la célula germinal del parental de cruzamiento mediante la investigación de la presencia de la transmisión del transgén.
Tabla 1. Tasa de cuajado de frutos con la especie silvestre (R. multiflora, R. wichuraiana, R. rugosa) mediante cruzamiento artificial y tasa de detección del transgén en individuos en brotación
- Anfitrión (WKS82)
- Transformante (WKS82/130-4-1)
- Núm. defrutos cuajados/Núm. deflorescruzadas
- Tasa decuajado defrutos (%) Núm.total desemillas Núm. deindividuoscruzados/Núm. debrotes Tasa decruzamiento (%) Núm. defrutos cuajados/Núm. deflorescruzadas Tasa decuajado defrutos (%) Núm. desemillastotales Núm. deindividuoscruzados/Núm. debrotes Tasa decruzamiento (%) Núm. deindividuospara loscuales sedetectó el transgén/Núm. debrotes Tasa dedetección deltransgén (%)
- R. multiflora
- 18/251 7,1 27 1/2 50,0 45/256 17,6 65 3/3 100,0 0/3 0,0
- R. wichuraiana
- 23/260 8,8 44 1/1 100,0 11/260 4,2 24 0/0 - - -
- R. rugosa
- 2/74 2,7 263 0/0 - 5/79 6,3 427 3/3 100,0 0/3 0,0
- Anfitrión (WKS82)
- Transformante (WKS82/130-9-1)
- Núm. defrutos cuajados/Núm. deflorescruzadas
- Tasa decuajado defrutos (%) Núm.total desemillas Núm. deindividuoscruzados/Núm. debrotes Tasa decruzamiento (%) Núm. defrutos cuajados/ Núm. deflorescruzadas Tasa decuajado defrutos (%) Núm. desemillastotales Núm. deindividuoscruzados/Núm. debrotes Tasa decruzamiento (%) Núm. deindividuospara loscuales sedetectó el transgén/Núm. debrotes Tasa dedetección deltransgén (%)
- R. multiflora
- 18/251 7,1 27 1/2 50,0 34/255 13,3 59 1/4 25,0 0/4 0,0
- R. wichuraiana
- 23/260 8,8 44 1/1 100,0 14/261 5,4 44 0/0 - 0/0 -
- R. rugosa
- 2/74 2,7 263 0/0 - 4/71 5,6 283 0/0 - 0/0 -
Tabla 2. Tasa de detección del transgén en semillas obtenidas mediante cruzamiento artificial con especies silvestres (R. multiflora, R. wichuraiana, R. rugosa)
- Anfitrión (WKS82)
- Transformante (WKS82/130-4-1)
- 1) Núm. de semillasrecuperadas
- Núm. desemillascruzadas/2) Núm. de semillasanalizadas Tasa decruzamiento (%) 1) Núm. de semillasrecuperadas Núm. desemillascruzadas/2) Núm. de semillasanalizadas Tasa decruzamiento (%) Núm. desemillas en las que fue detectado el transgén/Núm. desemillasanalizadas Tasa dedetección deltransgén (%)
- R. multiflora
- 23 11/12 91,7 58 10/10 100,0 0/10 0,0
- R. wichuraiana
- 43 0/0 - 24 0/0 - 0/0 -
- R. rugosa
- 257 30/33 90,9 271 28/30 93,3 0/30 0,0
- Anfitrión (WKS82)
- Transformante (WKS82/130-9-1)
- Núm. defrutos cuajados/Núm. deflorescruzadas
- Tasa decuajado defrutos (%) Núm.total desemillas Núm. deindividuoscruzados/Núm. debrotes Tasa decruzamiento (%) Núm. defrutos cuajados/ Núm. deflorescruzadas Tasa decuajado defrutos (%) Núm. desemillastotales Núm. deindividuoscruzados/Núm. debrotes Tasa decruzamiento (%) Núm. deindividuospara loscuales sedetectó el transgén/Núm. debrotes Tasa dedetección deltransgén (%)
- R. multiflora
- 18/251 7,1 27 1/2 50,0 34/255 13,3 59 1/4 25,0 0/4 0,0
- R. wichuraiana
- 23/260 8,8 44 1/1 100,0 14/261 5,4 44 0/0 - 0/0 -
- R. rugosa
- 2/74 2,7 263 0/0 - 4/71 5,6 283 0/0 - 0/0 -
1), 2): Se produjo una diferencia en el Núm. de semillas recuperadas y el Núm. de semillas analizadas debido a que las semillas vacías (sin contenido en la semilla), las *semillas para las cuales fue imposible la extracción del ADN, y las semillas para las cuales no se observó amplificación del gen de control mediante PCR, se excluyeron del sujeto del presente análisis.
Ejemplo de trabajo 4.
Validación de la presencia de cruzamiento entre una rosa silvestre y una rosa cultivada en condiciones naturales
Utilizando el método de determinación de la presente invención, se evaluó la presencia de cruzamiento entre una rosa silvestre y una rosa cultivada en condiciones naturales.
Al aire libre, la especie silvestre (R. multiflora) se colocó a una distancia de 1m y 5m del anfitrión o el transformante para investigar el cruzamiento con la especie silvestre en condiciones naturales. Este estudio se llevó a cabo en condiciones en las que el anfitrión y el transformante y R. multiflora florecían simultáneamente. Las flores de R. multiflora que florecieron antes del inicio de este estudio se retiraron todas antes del inicio de este estudio, y a continuación se colocaron en una posición predeterminada.
La presencia de la formación de semillas se confirmó para el fruto para el cual no se había observado una caída de frutos fisiológica, pero se había observado cuajado de fruto el punto temporal de más de 3 meses después de la finalización del estudio. Además, las semillas obtenidas se recuperaron, y después de un tratamiento de enfriamiento a 4°C durante 3 meses, se sembraron. Con el fin de confirmar la presencia de cruzamiento con el anfitrión o el transformante y la presencia de la transmisión del transgén en los mismos, se llevó a cabo de acuerdo un método de PCR de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Trabajo 1 para el análisis.
El resultado se muestra en la Tabla 3. Para las plántulas obtenidas a partir de las semillas cosechadas a partir de cualquier posición, no se detectó ningún gen KSN que contuviera el transposón o no se observó cruzamiento del anfitrión o el transformante con R. multiflora.
Esto sugirió una posibilidad nula o muy baja de cruzamiento del presente transformante con la especie silvestre (R. multiflora) en condiciones naturales.
Por lo tanto, mediante el uso del método de determinación de la presente invención, se pudo evaluar muy fácilmente la presencia de cruzamiento entre una rosa silvestre y una rosa cultivada. Asimismo cuando el transgén no puede ser transmitido a la progenie, debido a que, por ejemplo, el transgén no está contenido en la célula de polen del transformante, en general, el análisis de cruzamiento es a menudo difícil. Sin embargo, mediante el uso del método de determinación de la presente invención, se puede determinar fácilmente la presencia de cruzamiento, y de este modo, también se podría analizar fácilmente la presencia de la transmisión del transgén en el cruzamiento.
Tabla 3.Tasa decruzamientoconunaespecie silvestre (R. multiflora) en condiciones naturales y tasa dedeteccióndel transgén
- cianstaDi
- )28SKW(nóinfitrA 1)-4-03/128SKW(tenamrosfnaTr
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- se.sodNúmdoltjatauatofrcu eNúm.dlasliltam tose sseooddu.dzaiviliNúmindnaa eotdciaiennmsezaeuPrcr otedien) sam%(azaTucr sedsa.Númlecidtarerflotoflo seso.Númddoltjataautofrcu e.dlasNúmiltalmseto sseooddu.zadiviliaNúmindna eodtciaiennmsezaeurcrP ot deien)sam%aza(Tucr négsnartedciasenerP
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- m1
- 466 206 1101 300 0 300 ,00 485 117 648 129 0 129 ,00 0 ,00
- m5
- 484 145 751 148 0 148 ,00 484 40 199 28 0 28 ,00 0 ,00
- cianstaDi
- )28SKW(nfitriónA 1)-9-03/128SKW(tenamrosfnarT
- .s-lciNúmtadeeretodasflorflo
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- m1
- 466 206 1101 300 0 300 ,00 484 205 7601 192 0 192 ,00 0 ,00
- m5
- 484 145 751 148 0 148 ,00 485 120 592 158 0 158 ,00 0 ,00
Ejemplo de Trabajo 5.
Validación de la presencia de cruzamiento con una rosa cultivada en semillas cosechadas de una rosa silvestre nativa
Utilizando el método de determinación de la presente invención, se evaluó la presencia de cruzamiento entre un 5 silvestre nativa con un cultivada rosa en condiciones normales.
De acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Trabajo 3, a partir de la semilla cosechada de un rosa silvestre nativa, se llevó a cabo un análisis de PCR utilizando la presencia de un gen KSN que tiene un transposón insertado en el mismo como indicador para validar la presencia de cruzamiento con un rosa cultivada. Como control interno, se utilizó el gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH).
10 Resultados y Discusión
Los resultados se muestran en la Fig. 1 y en la Tabla 4.
En el análisis de aproximadamente 1.800 semillas cosechadas de un total de 17 sitios, no se detectaron productos amplificados específicos (tamaño amplificado pronosticado: aproximadamente 1,2 kb) de un gen KSN que contenía un transposón a partir de cualquiera de las semillas. Por otro lado, el gen GAPDH que servía como control interno se
15 detectó en todos los individuos.
A partir de lo anterior, se determinó que no existe cruzamiento con una especie cultivada en todas las semillas cosechadas de las rosas silvestres nativas.
Por lo tanto, mediante el uso del método de determinación de la presente invención, se pudo evaluar muy fácilmente la presencia de cruzamiento entre una rosa silvestre y una rosa cultivada.
Tabla 4. Resultado del análisis de las semillas cosechadas de rosas silvestres nativas
- Núm. de Muestra
- Nombre de la especie Número de plantas florecidas Núm. de frutos *1)Núm. total de semillas *2)Núm de semillas analizadas Presencia de cruzamiento con una rosa cultivada Tasa de cruzamiento con una especie cultivada (%)
- Núm. de frutos cuajados
- Núm. de análisis Número de individuos cruzados Número de individuos no cruzados
- 1
- R. paniculigera 30 5 5 23 13 0 13 0,0
- 2
- R. paniculigera 50 37 37 227 79 0 79 0,0
- 3
- R. paniculigera 10 3 3 15 12 0 12 0,0
- 4
- R. paniculigera 5 2 2 20 16 0 16 0,0
- 5
- R. paniculigera 100 46 46 270 233 0 233 0,0
- 6
- R. paniculigera 10 2 2 3 1 0 1 0,0
- 7
- R. paniculigera 20 4 4 27 5 0 5 0,0
- 8
- R. paniculigera 300 176 176 695 380 0 380 0,0
- 9
- R. paniculigera 100 102 102 428 75 0 75 0,0
- 10
- R. paniculigera 10 7 7 40 22 0 22 0,0
- 11
- R. paniculigera 300 200 20 169 109 0 109 0,0
- 12
- R. paniculigera 50 34 10 100 88 0 88 0,0
- 13
- R. paniculigera 50 18 10 67 42 0 42 0,0
- 14
- R. paniculigera 40 18 10 80 27 0 27 0,0
- 15
- R. paniculigera 100 15 10 86 65 0 65 0,0
- 16
- R. paniculigera 5000 1000 100 792 600 0 600 0,0
- 17
- R. onoei 500 29 29 129 52 0 52 0,0
- -
- -
- 6675 1698 573 3171 1819 0 1819
- -
- *1), 2): Se produjo una diferencia en el núm. total de semillas recuperadas y el núm. de semillas analizadas debido a que las semillas vacías (sin contenido de semillas), las semillas para las cuales fue imposible la extracción de ADN, y las semillas para las cuales no se observó una amplificación del gen de control mediante PCR se excluyeron del sujeto del presente análisis.
LISTA DE SECUENCIAS
<110> Método para determinar si rosas silvestres se han cruzado o no con rosas cultivadas
<120>
<130> R2369 EP S3
<140> EP 08 72 2920.9
<141> 2008-03-21
<160> 6
<210> 1
<211> 519
<212> ADN
<213> Rosa sp.
<221> CDS
<222> (1)...(516)
<223> Secuencia de nucleótidos del gen KSN de rosa
<400> 1
<210> 2
<211> 8925
5
<212> ADN
<213> Rosa sp. 10 <221> CDS
<222> (1)...(516)
<223> Secuencia de nucleótidos del transposón en gen KSN de rosa
<400> 2
<210> 3
<211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<221> fuente
<222>
<223> / nota = "Descripción de secuencia artificial: Cebador directo"
<400> 3
<210> 4
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<221> fuente
<222>
<223> / nota = "Descripción de secuencia artificial: Cebador inverso"
<400> 4
<210> 5
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<221> fuente
<222>
<223> / nota = "Descripción de secuencia artificial: Cebador
<400> 5
<210> 6
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<221> fuente
<222>
<223> / nota = "Descripción de secuencia artificial: Cebador
<400> 6
Claims (14)
- REIVINDICACIONES1. Un método para determinar si una rosa silvestre de interés está cruzada o no con una rosa cultivada, comprendiendo dicho método la investigación de la presencia de un gen KSN que contiene un transposón indicador,en donde se determina que la rosa silvestre de interés no está cruzada con una rosa cultivada cuando no está presente un gen KSN que contiene un transposón indicador en dicha rosa silvestre de interés; oen donde se determina que la rosa silvestre de interés está cruzada con una rosa cultivada cuando está presente un gen KSN que contiene un transposón indicador en dicha rosa silvestre de interés.
-
- 2.
- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la planta parental semillera es una rosa silvestre y la planta parental polinífera es una rosa cultivada.
-
- 3.
- El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicha rosa cultivada es una rosa que tiene un gen insertado en la misma.
-
- 4.
- El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicho gen es un gen relacionado con el color de la flor.
-
- 5.
- El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el gen relacionado con el color de la flor es el gen de la enzima flavonoide 3',5'-hidroxilasa derivada del pensamiento de la familia Violaceae.
-
- 6.
- El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la detección de dicho gen indicador se lleva a cabo a través de hibridación de ácidos nucleicos de dicho gen.
-
- 7.
- El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha detección se lleva a cabo a través de la amplificación específica mediante PCR.
-
- 8.
- El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicha PCR se lleva a cabo a través de un cebador directo: CATATTATGGCATAGGGTGTGGC (SEC ID NO: 3) y un cebador inverso: TGTAATCTGTAGGAGATCCCATGC (SEQ ID NO: 4).
-
- 9.
- El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicha rosa silvestre es una planta de rosa que tiene, en la configuración homóloga, un gen KSN que no contiene un transposón.
-
- 10.
- El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha rosa silvestre es NOIBARA (R. multiflora Thunb. ex Murray), TERIHANOIBARA (R. wichuraiana Crep.), Hamanasu (R. rugosa Thunb. ex Murray), OOTAKANEBARA (R. acicularis Lindl.), KARAFUTOIBARA (R. marretii Lev.), OOFUJIIBARA, AZUMAIBARA, YAMATERIHANOIBARA (R. luciae Franch. et Rochebr.), YAMAIBARA (R. sambucina Koidz.), KAKAYANBARA, YAEYAMANOIBARA (R. bracteata Wendl.), NANIWAIBARA (R. laevigata Michx.), SANSHOUBARA (R. roxburghii Tratt. var. hirtula (Regel) Rehd. et Wils.), TAKANEBARA (R. acicularis var. nipponensis (Crép.) Koehne.), TSUKUSHIIBARA (R. multiflora var. adenochaeta (Koidz.) Makino), MORIIBARA (R. luciae var. hakonensis Franch. et Sav.), FUJIIBARA (R. luciae var. fujisanensis Makino), YABUIBARA, NIOIIBARA
(R. luciae var. onoei (Makino) Momiyama), MIYAKOIBARA (R. luciae var. paniculgera (Makino) Momiyama). -
- 11.
- El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha rosa cultivada es una planta de rosa que tiene, en la configuración homóloga, un gen KSN que tiene un transposón insertado en el mismo.
-
- 12.
- El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicha rosa cultivada es híbrido de té, floribunda o miniatura.
-
- 13.
- El uso de un par de cebadores para amplificar un gen KSN que contiene un transposón indicador en un método para determinar si una rosa silvestre de interés se cruzó o no con una rosa cultivada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, comprendiendo dicho par un cebador que tiene una secuencia de bases idéntica o sustancialmente homóloga a la región de la secuencia de bases mostrada en el SEC ID NO: 1 y un cebador que tiene una secuencia de bases idéntica o sustancialmente homóloga a la región de la secuencia de bases mostrada en el SEQ ID NO: 2.
-
- 14.
- El uso del par de cebadores de acuerdo con la reivindicación 13 que comprende un cebador directo: CATATTATGGCATAGGGTGTGGC (SEC ID NO: 3) y un cebador inverso: TGTAATCTGTAGGAGATCCCATGC (SEQ ID NO: 4).
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-
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