ES2464192B1

ES2464192B1 - Extractos fenólicos de Mangifera indica Linn, procedimiento de obtención y usos.

Info

Publication number: ES2464192B1
Application number: ES201201201A
Authority: ES
Inventors: Enrique José MARTÍNEZ DE LA OSSA FERNÁNDEZ; Daniel Araujo Gay; Lourdes CASAS CARDOSO; Maria Teresa FERNANDEZ PONCE
Original assignee: Universidad de Cadiz
Current assignee: Universidad de Cadiz
Priority date: 2012-11-30
Filing date: 2012-11-30
Publication date: 2015-06-11
Anticipated expiration: 2032-11-30
Also published as: ES2464192A1

Abstract

Extractos fenólicos de Mangifera indica Linn, procedimiento de obtención y usos.#La invención contempla extractos fenólicos de Mangifera indica Linn, ricos en mangiferina y quercetina, obtenidos mediante disolventes verdes a alta presión. El procedimiento de obtención comprende en: a) una etapa de preparación de la materia prima que comprende operaciones de secado, congelación y molienda, b) una extracción a altas presiones con disolventes verdes como dióxido de carbono supercrítico y mezclas de agua/alcohol en ausencia de luz y oxígeno, c) una etapa de concentración supercrítica en columna, d) una evaporación del disolvente a vacio o con nitrógeno. También se contempla el empleo de los extractos con actividad antioxidante y contenido en mangiferina y quercetina, para su uso cosmético y/o alimentario.

Description

EXTRACTOS FENÓLlCOS DE MANGIFERA INDICA LlNN, PROCEDIMIENTO DE OBTENCiÓN Y USOS.

SECTOR DE LA TÉCNICA

Extractos fenólicos bioactivos de aplicación en la industria alimentaria, nutracéutica y cosmética.

ESTADO DE LA TÉCNICA

los compuestos fen6licos constituyen uno de los grupos de metabolitos secundarios de las plantas más numerosos, con más de 8000 estructuras conocidas (Sobratte el al. (2005) Phenolics as potencial anlioxidant therapeutic agents: Mechanism and Belicns. Mutation Research 579, 200·213). El interés en estos compuestos radica en los efeclos biológicos beneficiosos que poseen, tales como: propiedades antiinflamatorias, antialérgicas, antimicrobianas, antifúngicas, antivirales, anticancerígenas, antidiabéticas, entre olras

(Nijveftdt el al. (2001) Flavonoides: a review of probable mechanisms o( action and potential applications. American Journal Clinical Nutrition 74, 418-25). Muchas de estas funciones se atribuyen a su capacidad antioxidante y a otros mecanismos implicados en la protección contra el estrés oxidativo como son su actividad antiradical, la quelación de iones metálicos, la modulación de la expresión genética y la prevención del daño oxidativo del AON.

Debido a estas propiedades, actualmente se considera que los compuestos fenólicos pueden actuar como agentes terapéuticos-en un amplio número de patologías relacionadas con el daño de radicales libres, dentro de las cuales se incluyen el cáncer, enfermedades neurodegenerativas, diabetes, disfunciones cardiovasculares, enfermedades inmunológicas, y el envejecimiento (Soobratte el al. (2005) Phenolics as polencial antioxidanl therapeulic agenls: Mechanism and actions. Mulation Research 579, 200-213).

Los compuestos fenólicos pueden encontrarse en casi cualquier parte de las plantas, por tanto los subproductos agroindustriales son una fuente rica en este tipo de compuestos. En el caso de los subproductos agricolas de la planta de Mangffera indica Linn, su interés se atribuye a su alta concentración en compuestos fen61icos de alto poder antioxidante (Teng Un el al. (2000) Slandardised Mangffera indica extracl is an ideal antioxidant. Food Chemistry 113, 1154-1159), considerados como los compuestos responsables de las múltiples propiedades farmacológicas de esta planta. En la bibliografía se describen propiedades antiespasmódicas, antipiréticas, antiinflamatorias, antimicrobianas, antifúngicas, antidiabéticas, inmunomoduladoras, analgésicas, antioxidantes y antidiarreicas

(Aderibigbe el al. (2001) Evaluation of antidiabetic action of Mangifera indica in mice. Phytolherapy Research 15, 456-458; Amazzal et al. (2007) Mangiferin protects against 1melhyl-4-phenyfpyridinium toxicity mediatt'Jd by oxidative stress in N2a cel/s. Neuroscience Left 428, 159-164; Caravalho el al. (2007) Gastroprotective effecl of mangiferin, a xanlhonoid from Mangifera indica, 8f.,ainst gastric injury induced by ethanol and indornethacin in rodents. Plant Medicine 73, 1372-1376; Garrido et al. (2004) In vivo and in vitro anti-inflamatory activity of Mangifera indica L. extracl (VIMANG). Pharmacologicaf Research 50, 143-149; Massibo el al. (2008) Major Mango Pofyphenols and Iheir Polential Significance to Human Heaflh. Compreht'Jnsive review in foad science and food safety 7, 309-318).

Entre los polifenoles más importantes dEl la planta de mango, en términos de capacidad antioxidante y cantidad, se encuentran la mangiferina y quercetina; aunque esta planta contiene otros polifenoles en menor proporción como catequinas, kaempferol, antocianinas, ácido gálico y ácido benzoico.

La mangiferina, de la familia de las xantonas, presenta interesantes propiedades nutraceúticas y farmacológicas, y se considera un agente prometedor en el tratamiento de enfermedades degenerativas como el cáncer. La quercetina es un f1avonoide que posee propiedades antioxidantes y anticanceríoenas así como efectos en la regulación de la expresión genética (Rocha et al. (2010) 13ioactive Compounds in Mango (Mangifara indica L.). Bioactive foods in promoting hea/th. Fruils and vegetablas. El Sevier Chapter 34, 507514; Massibo et al. (2008) Major Mango Polyphenols and their Polantial Significance lo Human Health. Comprehensive review in l'ood science and food safety 7, 309-318}.

Las aplicaciones cosméticas de los extractos de mango y de sus componentes mayoritarios (mangiferina y quercetina) también han sido descritas en patentes de aplicación.

EP0793476: Utilisation de mangiferine o uses dérivés pour une applicaction cosmetique, Rouillard, F; Josse, A, Robin, J-R. Describe diferentes propiedades cosméticas de la mangiferina como efecto fotoprotector, actividad anti-colagenasa y actividad antirradicalaria.

US 2006/0088560 A1 : Cosmetic use of mangiferin, Charrier, L; Poirier, F; Maillet, G; Lubrano, C. Esta patente se refil~re al uso de la mangiferina obtenida a partir de extractos polares de Mangifera indica para prevenir y/o reducir los efectos del estrés térmico en la piel causado por var~ciones de temperatura.

Los extractos comerciales de las hojas \' corteza de Mangifera indica Unn se obtienen principalmente por medio de técnicas de extracción sólido·líquido, como por ejemplo se describe en la patente P0793476: Utilisi3tion de mangiferine o uses dérivés pour une applicaction cosmetique, Rouillard, F; Jos5;e, A, Robin, J·R Sin embargo, la extracción con solventes orgánicos presenta diversos inconvenientes como largos procesos de extracción, uso de grandes cantidades de disolventes orgánicos considerados como perjudiciales pa-a la salud y el ambiente, as! como largos procesos de concentración/evaporación que en ocasiones degradan los compuestos bioactivos y no pennlten retirar completamente los disolventes del producto.

También se han descrito métodos para extraer mangiferina a partir de Mangifera indica Unn utilizando métodos de extracción con aglJa o mezclas hidro..alcohólicas a alta presión y temperatura (CN 101429222 A: Method for extracting mangiferin, 2009). Este método tiene ventajas frente a la extracción convencional como la reducción de tiempos de extracción y gastos de energia. Pero la extracción por medio de líquidos presurizados utilizando disolventes orgánicos sigue teniendo el inconveniente de obtener productos con restos de disolventes.

Continúa existiendo en el estado de la técnica, por tanto, la necesidad de un procedimiento que permita obtener extractos de Man~,ifera indica Unn enriquecidos en compuestos fenólicos, como mangiferina y quercetina, que supere los inconvenientes de los procedimientos del estado de la técnica.

la invención objeto de esta patente consi~ste en un método de extracción y purificación de compuestos fenólicos a partir de Mang;lera indica Unn utilizando CO2 supercrítico en presencia de modificadores polares como 1:11gua y etanol. La extracción con CO2 superaítico se ha desarrollado ampliamente en los últimos arios para una gran variedad de aplicaciones debido a la escasa contaminación a la que da lugar, a que opera bajo condiciones en las que se evitan reacciones de oxidación y/o degradación y a que su poder de solvatación puede fácilmente modificarse con cambios de presión y temperatura, o adicionando disolventes polares para el caso de extracc~ón de compuestos polares.

El proceso descrito en la presente invención presenta ventajas adicionales como el uso de solventes verdes (C02, agua Y etanol), la mducción de la cantidad de disolventes líquidos, la reducción de las etapas de concentmción, y la obtención de extractos con alta concentración en compuestos fenólicos y sin restos de disolventes orgánicos.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

La invención se refiere a extractos de las hojas y/o ramas de Mangifera indica Unn, conteniendo mangiferína, quercetina y otn:l5 compuestos fenólicos minoritarios, y teniendo potentes propiedades antioxidantes. También se protege su procedimiento de obtención, y su uso como ingrediente en la industria cosmética y/o alimentaria.

El problema a resolver es la obtención tje extractos de Mangifera indica Linn, ricos en compuestos fen6licos, mediante una tecl1ologla verde y eficiente. En particular, se quieren conseguir extractos de mango 100% né;lturales, libres de disolventes orgánicos y con elevadas propiedades antioxidantes.

Se describen los extractos de Mangifera indica Unn caracterizados por su contenido en polifenoles, particularmente mangiferina y quercetina, y sus potentes propiedades antioxidantes. El procedimiento de obtención, que también se protege, se basa en el empleo de disolventes verdes, como son dióxido ele carbono, agua, y etanol, bajo condiciones sub

o supercrfticas a elevada presión y temperatura. Se consigue con este nuevo proceso aumentar la eficiencia del proceso, reducir tiempos de operación y obtener extractos libres de disolventes orgánicos. Además, es importante resaltar que el uso de dióxido de carbono minimiza el empleo de disolventes líquidos, lo que reduce las etapas de concentración y la posible degradación de los compuestos fenólicos.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: Análisis LC-ES-MS de compuestos fenólicos ¡:res entes en extractos de Mangifera indica Unn.

Figura 2: Análisis LC-ES-MS y LC-UV para los patrones de compuestos fen6licos presentes en los extractos de sub-o supercrfticos de Mangifera indica Unn.

Figura 3: Análisis HPLC por columna de fase reversa Sinergy Hidro RP para el extracto

fen61ico obtenido en el ejemplo 1, ccln identificación de los picos cromatográficos correspondientes a los compuestos fen61icos mangiferina y 3-j)-D-glucosil-quercetina de acuerdo a su tiempo de retención (1,.=2Q."in para mangiferina y 1,.=34,4 min para 3-j)-Dglucosil-quercetina).

Figura 4: Análisis lC-ES-MS en cuadrupolo-ES Modo Scan para el extracto obtenido en el ejemplo 1. Se comprueba la presencia de los compuestos fenólicos ácido gálico, metil galato, 3-D-galactosil-quercetina, 3-P-D-glucosil-quercetina, 3-0-a-l-arabinopiranosil quercetina y 1,2,3,4,6-penta-O-galoil-j3-D-glucosa (m/z= 169, 183, 421 , 463, 463, 433 Y 939 5 respectivamente). No se observa presencia de quercetina (m/z= 301 y t.-= 47,7 min).

DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN

la presente invención consiste en extractos de las hojas y/o ramas de Mangffera indica Linn caracterizados por presentar un contenido fenólico mínimo de mangiferina y quercetina de

10 1,93 Y 0,88 % respectivamente, as; COl1l0 la presencia de compuestos minoritarios. la sinergia entre tos diferentes compuestos presentes en el extracto le otorgan potentes propiedades antioxidantes, con un Indice de Actividad Antioxidante mínimo de 4,0, superior al del tocoferol (IAA=3,65), considerado un potente antioxidante.

las características de los extractos obttmidos permiten que puedan ser utilizados en la

15 industria cosmética para el cuidado de la piel y/o el cabello, por ejemplo como agentes para combatir el envejecimiento. Y en el cas'o de la industria alimentaria, como antioxidantes naturales en reemplazo de antioxidantes sintéticos como el BHT (butirohidroxitolueno) o el BHA (butirohidroxianisoi).

Las hojas y corteza de Mangifera indica Linn son un subproducto agroalimentario que

20 generalmente es quemado después de la poda. Por lo que este procedimiento de obtención de extractos supondría una valorización de dicho subproducto al obtenerse productos de mayor valor añadido.

Caracterización de los extractos sub-o supercríticos de Mangifera indica Linn

Los extractos de Mangifera indica Linn se caracterizan teniendo en cuenta su contenido fenólico y su capacidad antioxidante, para determinar su posible uso en la industria cosmética yalimentaria.

5: i) Determinación del contenido fenólico de los extractos sub-o supercríticos de Mangdera indica Linn:

10: La determinación del contenido fenólico del extracto se realiza por medio de cromatografía líquida de alta resolución HPLC (High Pmformance Liquid Chromatography), en un equipo Agilent HPLC series 1100 (Agitent TechnDlogies, Estados Unidos), con una columna C18 de fase reversa (Thermo Electron Corporation) y un detector UV/vis.

15: El método de separación utiliza como fase móvil una disolución de ácido acético en agua al 2% (solvente A) y metanol (solvente B), ,a una tasa de flujo de 0,9 mUmin, un volumen de inyección de SO IJmL, y utilizando las siguientes condiciones de elución: 0-2 min, S% B isocrático; 2-7 min, gradiente lineal 5-~!S% B; 7-11 min, 25% B ¡socrático; 11-19 min, gradiente lineal 2S-32% B; 19-27 min, 32% B isocrático; 27-28 min, gradiente lineal 32-40% B; 28-38 min, 40% B isocrático y finalmente se incluye una etapa de lavado y reacondicionamiento de la columna (38-·S0 min, gradiente lineat 40-100% B; 50-60 min, 100% B isocrático; 60-70 min, gradiente Iinea1100-S% B; y 5 min, 5% B isocrático).

20: Los compuestos fenólicos se detectan a una longitud de onda de 340 nm de acuerdo a su tiempo de retención, y se cuantifican utilizando curvas de catibración para los patrones correspondientes.

2S: Las curvas de calibración de los compuestos mayoritarios presentes en los extractos, mangiferina y 3-j3-D-glucosil-quercetina, se expresan como Abs = 54.252 . e 100.12, Y Abs = 87.077 . e 130,11, respectivamente. Donde e es la concentración expresada en IJg/ml. Para cada muestra se realizan mediciones por triplicado.

Finalmente el rendimiento de extracción de los compuestos fenólicos se expresa en términos de g/100g extracto seco. Los eJ<tractos de Mangifera indica Linn obtenidos según el procedimiento de extracción, presentan un contenido mínimo en mangiferina y quercetina de 1,93 % Y 0,88 % respectivamente.

30: Sin embargo la actividad antioxidante de los extractos no depende únicamente del alto contenido de estos dos compuestos, sino de la sinergia entre los diferentes compuestos fenólicos extraídos durante el proceso.

ii) Determinación cualitativa de los compuestos tenó/icos presentes en los extractos sub-o supercriticos de Mangifera indica Unn:

Para confirmar que los extractos contiE~nen mangiferina y 3-13-D-glucosil-quercetina, así como la presencia de otros compuestos fenólicos se realiza un análisis por cromatografía 5 líquida acoplada a espectrometría de masas LC-MS utilizando un detector de masas cuadrupolo-ES de alta resolución (Quadn.lpolar-ionization time-of-fIight mass spectrometry).

Para este anátisis se contó con patrones comerciales de ácido gálico, metil galato, mangiferina, 3-D-galactosil-quercetina. 3'-I3-D-glucosil-quercetina, 3-0-o-L-arabinopiranosilquercetina, 1 ,2,3,4,6-penta-O-galoil-I3-D~llucosa, y quercetina. Con objeto de optimizar las 10 condiciones de ionización, se inyectaron los patrones de manera individual, uno por uno, directamente en el espectrómetro de masas. Se utilizó una fase móvil compuesta por una disolución A de agua al 0,1% de ácido fó¡rrnico y una disolución B de acetonitrilo al 0,1% de ácido fórmico, en modo isocrático 50:50, a una tasa de flujo de 1,0 mUmin, y un volumen de inyección de 10~L, en modo de ionización ES (Electro Spray) Negativo con un rango mIz de

15 50-2000 u.m.a.

En la tabla siguiente se indican las masalS de los iones correspondientes para cada patrón de compuesto fenótico (mIz) obtenidos del análisis LC-ES-MS correspondiente para cada patrón. (Figura 1: Análisis LC-ES-MS de compuestos fen61icos presentes en extractos de

Mangitera indica Linn).

20 Señales LC-ES-MS (M-HT (miz)

Compuesto fenólico: mIz (M-Hr Ir (mln)

Acido gálico: 169 4,06

metil galato: 183 10,13

mangiferina: 421 25,94

3-D-galactosil-quercetina: 463 38,81

3-j3-D-glucosil-quercetina: 463 39,66

3-0-u-L-arabinopiranosil-quercetina: 433 42,39

1,2,3,4,6-penta-O-galoil-I3-D-glucosa: 939 43,50

quercetina: 301 47,86

S 10 1S: Además del análisis LC-ES-MS para los patrones, los extractos se analizaron por cromatografia líquida acoplada a espec:trometria de masas HPLC-MS para separar los distintos compuestos fenÓlicos. Se utilizó un HPLC con una columna Phenomenex C18 de fase reversa Synergi 4 ~m Hydro -RP 150x3mm con precolumna C18. Como fase móvil se empleó una disolución A de agua al 0,1% de ácido fórmico y una disolución B de acetonitrilo al 0,1% de ácido fórmico, a una tasa de flujo de 0,8 mUmin, y utilizando un gradiente de elución de: 0-0,2 min, 0% B; 0,2-0,3 min, gradiente lineal 0-7% B; 0,3-14,7 min, gradiente lineal 7-8,5% B; 14,7-40 min, gradiente lineal 8,5-19% B; 40-45 min, gradiente lineal 1933% B; 45-48 min, gradiente lineal 33-50% B; 48-50 min, gradiente lineal 50-95% B Y finalmente una etapa de lavado y reacondicionamiento de la columna (50-57 min, gradiente lineal 95-0% B; 57-63 min, 0% B), a una longitud de onda fijada a t=O min 278 nm, t=18 min a 340 nm, t=43 min a 278 nm, t=45 min 340 nm, un volumen de inyección de 20~L. Como detector se empleó un cuadrupolo en modo de ionización SIM ES Negativo y ventanas de fragmentor de los iones seleccionados de los espectros de masas de los patrones: 0-7 min: 100V (169,125), 7-18 min: 120V (183,124), 18-33 min: 150V (421 ,301) 33-41 ,1 min: 160V (463,301 ,300), 41 ,1-43 mino 150V (433,301 ,300), 43-45 mino 240V (939,769,617), 45-63 mino150V (301 ,151 ,179).

20: Un cromatograma tipo de una mezcla dEl los patrones se muestra en la Figura 2: Análisis LC-ES-MS y LC-UV para los patrones d4: posibles compuestos fenólicos presentes en los extractos de sub-o supercríticos de Manriifera indica Linn.

iii) Determinación de la actividad antioxidante con el radical a-a-difenil-{3-picrifhidraci/o (OPPH) de los extractos sub-o supercríticos de Mangifera indica Linn:

25 30: Para medir la actividad antioxidante con el radical a-a-difenil-{3-picrilhidraci/o (OPPH) (Brand Williams el al. (1995) Use of a free radical method lo evaluate antioxidanl activity. Lebensmittel. Wissenschaft. Und Technologie 28, 25-30), se mide la disminución de la absorbancia a 515 nm, cada dos minutos hasta el estado estacionario, de una disolución de 3,9 ml de OPPH 6 10-5 M en metanol y 10 IJl del extracto antioxidante. El extracto se evalúa a diferentes concentraciones entn~ O y 5000 ppm. Para obtener la referencia de un antioxidante, se evalúa igualmente fa actividad antioxidante del patrón comercial de 0tocoferol.

La concentración de DPPH* (COPPH ) en el medio de reacción se calcula de la curva de calibrado determinada por regresión linear con la siguiente ecuación:

Abs = 12.709' CDPPH + 0,002

El porcentaje de OPPH remanente se calcula según la siguiente ecuación:

%DPPH remanente = CDPPH/CDPPHo x 100

La EC50 o concentración que inhibe el 50% del radical DPPH se calcula gráficamente

5 utilizando una regresión no linear de la curva de concentración vs. % DPPH remanente en el estado estacionario. La actividad antioxidante de los extractos se expresa como Indice de Actividad Antioxidante (IAA) que se calcula considerando la concentración final de DPPH y la EC50 como lo expresa la siguiente ecuación:

[AA = Concentration Final de DPPH (~~)/EC50 (~~)

10 Los extractos de planta presentan actividad antioxidante baja cuando IAA < 0,5, moderada cuando IAA se encuentra entre 0,5 y 1,0, potente cuando IAA se encuentra entre 1,0 Y 2,0, Y muy fuerte cuando ¡AA > 2,0.

Los extractos objeto de esta patente pres'entan un valor de IAA mlnimo de 4,0, y superior al valor IAA obtenido para el a-tocoferol (AAI=3,65). Esto nos indica la potente actividad 15 antioxidante de los extractos sub-o supercriticos de Mangifera indica Linn, y su potencial uso como antioxidanle en alimentos y cosméticos. En cualquier caso, estos extractos también pueden presentar otras actividades/propiedades de interés para la industria alimentaria, dietética, cosmética y farmaoéutica que también se incluirían en esta invención. Asi, por ejemplo, es de esperar que los e)<!ractos conteniendo alto contenido en mangiferina

20 y quercetina presenten actividades descritas para las moléculas aisladas como actividades anticancerígenas, antibacterianas, antifüngicas, o cierta capacidad de prevención de enfermedades neurológicas o cardíacas.

Estos extractos se podrían emplear como ingredientes en alimentos, para elaboración de 25 suplementos dietéticos y de cosméticos, alsi como antioxidante natural para conservación de productos alimenticios.

Procedimiento de obtención

Otro aspecto de la invención es el procedimiento caracterizado porque comprende los siguientes pasos:: de obtención de los extractos

5: i) Preparación de las hojas y ramas de Mangifera indica Linn:

Se parte de hojas y corteza de Mangifer;~ indica unn húmeda o seca. El secado se puede realizar al ambiente o en horno. la materia prima se almacena en condiciones de refrigeración o congelación y posteriormente es molida para reducir su tamaño.

10: ii) Extracción supercríticos: de hojas y ramas de Mangifera indica Linn con disolventes sub o

la corteza y hojas secas y molidas se someten a un proceso de extracción en continuo con disolventes verdes a alta presión.

1S 20: Como sistema disolvente se emplean mezclas de dióxido de carbono supercrítico (COrSC) con agua y/o disolventes hidro-alcohólicos y/o alcohólicos. Como alcoholes se utilizan metanol o etanol, utilizando preferentE!mente el etanol por ser un disolvente GRAS (Generally Recognized as Sale). El porcentaje de CO2 se fija entre 0-100 % w/w, el de agua entre 0-100 %, Y de igual forma el de etanol, dando lugar a diferentes mezclas de disolventes. El sistema disolvente se somete a un flujo entre 5-40 g/min dependiendo del tamaño de la planta de extracción.

El uso de CO2 en el proceso de extracción aumenta la eficiencia del proceso, reduce los tiempos de extracción, minimiza el uso de disolventes líquidos, reduce las etapas de concentración, y permite conservar las propiedades de los compuestos bioactivos.

2S: la temperatura de extracción se fija entre un rango de 35-140 OC, considerando una temperatura superior al punto critico del CO2 y no muy elevada para evitar degradación de compuestos termolábUes. Se utiliza preferiblemente un rango entre 80-10°C

la presión se fija entre 1Q--40 MPa, con:siderando una presión superior al punto critico del CO2, preferentemente en un rango entre 100-200bar.

30: El tiempo de extracción está en el intenlalo de 1 a 3 horas, preferentemente entre 1,5-2 horas, para un flujo de disolvente en un rango de 5-40g/min dependiendo del tamaño de la planta de extracción

El proceso extractivo con CO2-SC se realiza protegido de la luz y en ausencia de oxígeno, esto previene el inicio de reacciones de I:)xidación y evita posibles degradaciones de los compuestos fen6licos. Ventaja adicional qUle ofrece el uso de CO2 en el sistema disolvente.

El rendimiento de extracción global obtenido con el proceso extractivo oscila entre el 1-50

g/100g de materia seco. El uso de CO:<, SC como disolvente unico permite muy bajos rendimientos de extracci6n. La adición de modificadores polares como agua y/o etanol permite obtener mayores rendimientos de extracción, llegando a rendimientos del 42% cuando se utiliza como sistema disolvente una mezcla de CO2 1 :0,5:0,5.

Los extractos obtenidos en esta etapa ya pueden ser utilizados en aplicaciones cosméticas y alimentarias por que presentan contenido fen61ico mínimo entre 1,93% Y 0,88% de mangiferina y quercetina respectivamentet, así como potentes propiedades antioxidantes con un 1M mínimo de 4,0, superior allAA del tocoferol.

jii) Obtención de los extractos secos de ~nqifera indica Unn:

Los extractos sub-o supercríticos de Manrgifera indica Linn obtenidos se pueden secar de diversas formas, teniendo en cuenta que siempre se realice preferentemente a temperaturas inferiores a 40 oC. Se contemplan como formas de secado la evaporación a vació, secado con nitrógeno, la liofilización o el secado por precipitaci6n empleando fluidos supercríticos.

Los extractos se almacenan refrigerados o congelados, preferentemente a -4 oC, y protegidos de la luz para evitar posibles a:lteraciones en el contenido fen6lico, así como en las propiedades antioxidantesJantirradicalarias de los extractos.

Ejemplos

Ejemplo 1

Preparación del extracto de hojas de Manadera indica Unn obtenido con una mezcla CO:lagua/etanol en una relación de 1,O:O,!i:O,5 como sjstema disolvente.

Las hojas secas, congeladas y molidas ele Mangifera indica Unn de la variedad Kent se someten a un proceso de extracción en continuo en un equipo de alta presión Thar Tehcnologies Modelo SF100 de 100 mL de capacidad. Se utiliza como sistema disolvente una mezcla de CO~agualetanol en una mlación 1,0:0,5:0,5 a un flujo de CO2 de 5 g/mino las condiciones de extracción se fijan a UM temperatura de 80 oC y una presión de 120 bar. la extracción se realiza por un tiempo de 3. horas, en una atmósfera inerte y protegido de la luz.

Posterior a la etapa de extracción, el E~xtracto obtenido se evapora con nitrógeno a temperatura ambiente hasta sequedad. Se almacena en congelación a -4 oC protegido de la luz para evitar su degradación.

El rendimiento de la extracción para este ejemplo 1 es de 38,Sg de extracto/l00g hojas secas.

El contenido de mangiferina y quercetina en el extracto de este ejemplo 1 se determinó inyectando 50iJl de extracto a 1000 ppm on un equipo Agilent HPlC series 1100, con una columna C 18 de fase reversa Thermo Electron. Se utilizó como método de separación una fase móvil Solvente A: ácido acético en agua al 2% y Solvente B; metanol a una tasa de flujo de 0,9 mUmin, y con un gradiente de: 0--2 min, 5% B; 2-7 min, 5-25% B; 7-11 min, 25% B; 11-19 min, 25-32% B; 19-27 min, 32% B; 27-28 min, 32-40% B; 28-38 min, 40% B; 38-50 min, 40--100% B; 50-60 min, 100% B; 60-,'0 min, 100--5°'" B; 5 min, 5°A. B ¡socrático, a una longitud de onda de 340nm.

Cada compuesto fue identificado de aCUJElrdo a su tiempo de retención (1,.=20min para mangiferina y 1,.=34,4 min para 3-13-D-glucosil-quercetina), y cuantificado de acuerdo a la curva de calibración respectiva, Abs = 54.252' e -100,12 para mangiferina, y Abs = 87.077 ' e -130,11 para quercetina.

El extracto obtenido del ejemplo 1 tuvo un contenido de 3,78 ± 0,01 g de mangiferina/l00g de extracto y 1,23 ± 0,02 9 de 3-~O-glucosil..quercetinaJ1oog de extracto. (Figura 3: Análisis HPlC por columna de fase reversa Sinelrgy Hidro RP para el extracto obtenido en el ejemplo 1, con identificación de los picos dI~ mangiferina y 3-J3-D-glucosil-quercetina ).

Se identificaron también otros compuesto!:; fenólicos presentes en el extracto mediante el método lC-MS. Se inyectaron 100iJl de lJna dilución del extracto a una concentración de 300 ppm en un equipo Q-TOF de alta reso,lución, utilizando una columna Phenomenex C 18 de fase reversa Synergi 4 iJm Hydro -RP l5Ox3mm con precolumna C18, una fase móvil de

A: Agua 0,1% de ácido fórmico y B: Acetonitrilo al 0,1% de ácido fórmico, a 0,8 mUmin, utilizando un gradiente de elución de: 0-0,2 min, 0% B; 0,2-0,3 min, 0-7% B; 0,3-14,7 min, 7-8,5% B; 14,7-40 min, 8,5-19°A, B; 40-45 min, 19-33°M B; 45-48 min, 33-50% B; 48-50 min, 50-95% B; 50-57 min, 95-0% B; 57-63 min, 0% B; a una longitud de onda de 278 nm 0-18 min, 340 nm 18-43 min, 278 nm 43-45 min, 340 nm hasta 5Omin. la ionización se realizó en modo sean negativo a l00V. La identificaci6n de los compuestos fen61icos se realizó teniendo en cuenta el tiempo de retención y los iones de cada compuesto determinados por su respectivo espectro de masas.

En el extracto obtenido en este ejemplo 1 se identificó la presencia además de mangiferina y3-¡3·0-glucosil-quercetina , de ácido gálicc), metil galalo, 3·0-galactosil-quercetina, a-.O-o-L

5 arabinopiranosil-quercetina y 1,2,3,4,6--penta·O..galoil-f3-0-glucosa , más no de quercetina (Figura 4: Análisis LC-ES~S en Q·TOF modo Scan para el extracto obtenido en el ejemplo 1 )

También·se determinó la capacidad antioxidante del extracto de Mangifera indica Linn con el ensayo de OPPH·, expresada en términos de indice de Actividad Antioxidante IAA. Este

10 extracto del ejemplo 1 presentó una potente actividad antioxidante con un valor IAA=4,84, superior al del tocoferollAA=3,65.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de obtención de extractos de Mangifera indica Linn, caracterizado por el empleo de disolventes verdi~s, como son dióxido de carbono. agua, y etanol, bajo condiciones sub-o supercríticas a elevada presión y temperatura.
2. Procedimiento de obtención de extractos de Mangifera indica LJnn, segun reivindicación 1, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: i) Preparación de la materia prima, compuesta por hojas ylo corteza de Mangifera indica linn, que comprende operaciones de secado, congelación y molienda. ii) Extracción sub-o supEM"critica en continuo de la corteza ylo hojas secas y molidas de Mangifera indica Unn con mezclas de CO2 y disolventes acuosos, alcohólicos o hidroalcohólicos.

iii) Obtención de los extr,actos secos de Mangifera indica Linn, pudiendo realizarse este secadcl preferentemente a temperaturas inferiores a 40 oC, mediante cualquiera de los procedimientos siguientes: evaporación a vació, secado con nitrógeno, la liofilización o el secado por precipitación empleando fluidos supercriticos.
3.

Procedimiento de obtención de extractos de Mangitera indica Linn, según la reivindicación 2, caracterizado porque el proceso de extracción en continuo se realiza con disolventes verdes él alta presión, como CO2, agua Y etanol, en condiciones sub--o supercríticas;
4.

Procedimiento de obtendón de extractos de Mangifera indica Unn, segun la reivindicación 2, caracterizado porque la temperatura de la extracción superior a la del punto critico del C02, está en ~,I rango de 35-140 oC, utilizando preferentemente un rango entre S0-1000C.
5.

Procedimiento de obtención de edrados de Mangifera indica Unn, según la reivindicación 2, caracterizado porque la presión de extracción esta en el rango de 100-400bar, utilizando preferentemente un rango entre 1 00-20~ar.
6.

Procedimiento de obtención de extractos de Mangifera indica Linn, según la reivindicación 2, caracterizado porque el flujo de disolvente está en el rango de 5-40 glmin según el tamario de la planta: de extracción.
7.

Procedimiento de obtención de extractos de Mangitera indica Linn, según la reivindicación 2, caracterizado porque el tiempo de extracción está en el intervalo de 1-3 horas, preferentemente entre 1,5 -2 horas.
8.

Procedimiento de obtención de extractos de Mangitera indica Unn, según la reivindicación 2, caracterizado porque el proceso extractivo se realiza en ausencia de luz y de oxigeno.
9.

Procedimiento de obtención de extractos de Mangifera indica Unn, según la reivindicación 3, caracterizado porque el disolvente de extracción es una mezcla de CO:i'agua/etanol, utilizando preferElntemente un porcentaje de codisolvente del 50% w/w, que mezcla las ventajas de la extracción con líquidos presurizados y de la extracción supercrítica.
10.

Procedimiento de obtención de extractos de Mangitera indica Unn, según la reivindicación 1, caracterizado porque el secado de los extractos de Mangifera indica Unn, se realiza preferentemente con nitrógeno a temperatura ambiente para evitar la degradación de los compuestos fenólicos presentes en el extracto.
11 . Extractos secos de Mangitera indica Unn obtenidos según las reivindicaciones 1 a
10.
12.

Extractos secos de Mangitera indica Linn, según la reivindicación 11 , caracterizados por poseer un contenido fenólico mínimo de mangiferina de 1,93% Y de 3-13-0glucosil-quercetina de 0,88%, con presencia de otros compuestos fenólioos como ácido gálico, metil galato, 3-D-galactosil-quercetina, 3-0-o-L-arabinopiranosilquercetina y 1,2,3,4,6-penta-01;;aloil-j3-D-glucosa , y con potente actividad antioxidante con valor minimo de IJ~ de 4,0, superior allAA del tocoferol de 3,65.
13.

Uso de los extractos de Mangifera indica Unn, según la reivindicación 12, como agente cosmético para el cuidado de la piel ylo el cabello, destinado a actuar como agente anti-envejecimiento y antiClxidante, por prevenir las alteraciones derivadas de la oxidación celular o el estrés oxidativo, y por actuar como inhibidor de radicales

5 libres.
14. Uso de los extractos de Mangifera indica Unn, según la reivindicación 12, en la industria alimentaria como consElrvante natural en reemplazo de antioxidantes sintéticos como BHA y BHT.