ES2472790T3 - Fracción de extracto de hoja de melisa que tiene actividades inhibidoras de MMP y de angiog�nesis, y composición que comprende la misma - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica para uso en inhibir actividades de MMP 2 o MMP 9 (metaloproteinasa de matriz) y angiogénesis que comprende una fracción de acetato de etilo de hoja de melisa junto con una vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que la hoja de melisa se extrae con etanol o metanol al 70-80 5 % y se concentra, y después el extracto de etanol o metanol concentrado se suspende en agua y se fracciona con acetato de etilo, y se seca para obtener la fracción de acetato de etilo de hoja de melisa.

Description

Fracci�n de extracto de hoja de melisa que tiene actividades inhibidoras de MMP y de angiog�nesis, y composición que comprende la misma 5

Campo técnico

La presente invención se refiere a una fracción de acetato de etilo de hoja de melisa que tiene excelentes actividades inhibidoras de MMP y de angiog�nesis, y una composición que comprende la misma. En particular, la fracción de acetato de etilo de hoja de melisa se caracteriza porque la hoja de melisa se extrae con alcohol C1∼C6 al 70∼80 % y después el extracto de alcohol concentrado se suspende en agua y se fracciona con acetato de etilo y se seca, obteniéndose la fracción de acetato de etilo de hoja de melisa.

T�cnica anterior

15 La melisa (Melissa officinalis), una hoja perenne de la familia de las lami�ceas, también se denomina hoja de limón, toronjil o cidronela, como denominaciones comunes y populares.

Los constituyentes claves de la Melissa officinalis son flavonoides, ácidos terp�nicos, aceites volátiles, glic�sidos de los compuestos alcohólicos y fen�licos y derivados de ácido cafeico. Especialmente, como flavonoides son componentes abundantes cinar�sido, cosmosina, ramnocitrina e isoquercitrina y como ácido terp�nico es un componente el ácido urs�lico. El ácido rosmar�nico como derivados de ácido cafeico es el componente más abundante (aproximadamente el 4,7 %), y geranial, neral, citronelal y eugenol son componentes bien conocidos como aceites volátiles contenidos en el extracto de hoja de melisa.

25 El ácido rosmar�nico, un componente no volátil abundante de la hoja de melisa, tiene un efecto potente antiinflamatorio y antipir�tico, y se han usado aceites esenciales contra la depresión, cefalea neurog�nica, disminución de la memoria, neuralgia, fiebre y también es bien conocido por tener efectos sedantes, antibacterianos, antiv�ricos, antioxidantes y antihormonales. Recientemente, el extracto de hoja de melisa se ha incluido entre los activadores de la circulación sanguínea, que fomentan la dilatación de vasos sanguíneos periféricos.

La angiog�nesis es el proceso de generación de nuevos vasos sanguíneos capilares. La neovascularizaci�n est� regulada estrechamente, y tiene lugar durante el desarrollo embrionario, la remodelación de tejido, la cicatrización de heridas y ciclos periódicos de desarrollo del cuerpo l�teo (Folkman y Cotran, Relation of vascular proliferation to

35 tumor growth, Int Rev Exp Pathol 16 207-248, 1976).

Las células endoteliales se desarrollan muy lentamente en comparación con otros tipos de células del organismo. Sin embargo, la proliferaci�n de células endoteliales est� inducida por citocinas de proangiog�nesis, enzimas hidrol�ticas activas que liberan mediadores angiog�nicos de la matriz extracelular o la estimulaci�n de factores angiog�nicos.

En general, el proceso de angiog�nesis es la degradación de la membrana basal de vasos sanguíneos, la migración de células endoteliales y la formación de lumen mediante proliferaci�n y diferenciación de células endoteliales. Uno de los eventos principales en el proceso de angiog�nesis es la ruptura de la matriz extracelular antes de la formación

45 de los vasos sanguíneos capilares. La enzima más importante de degradación de matriz es la metaloproteinasa de matriz (MMP).

Cuando tiene lugar un fallo en la regulaci�n de la angiog�nesis o las MMP est�n sobreactivadas, tiene lugar una angiog�nesis patológica (Polverini PJ, Critical Reviews in Oral Biology, 6(3), 230-247(1995); Arup Das y col., Progress in Retinal and Eye Research, 22 (2003) 721-748; Nick Di Girolamo y col., IOVS, agosto de 2001, Vol. 42, N� 9, 1963-1968; Patricia Lee y col., Survey of ophthalmology, Vol 43, N� 3, nov-dic 1998, 245-269; D.B. Holland y col., British Journal of Dermatology 2004, 150, 72-81; Anthony H Vagnucci Jr y col., The Lancet, Vol. 361, 15 de febrero, 2003, 605-608; Berislav V. Zlokovic, Trends in Neuroscience, Vol. 28, N� 4, abril de 2005, 202-208; Jaap G. Neels y col., The FASEB Journal express artículo 10. 1096/fj.03-1101fje. Publicado en línea el 14 de abril de 2004;

55 D.L. Crandall y col., Microcirculation, 4, 1997, 211-232; G. Voros y col., Endocrinology, 146, 2005, 4545-4554; M.A. Rupnick y col., PNAS, 99, 2002, 10730-10735; E. Brakenhielm y col., Circ. Res., 94, 2004, 1579-1588; H.R. Lijnen y col., Arterioscler Thromb Vasc Biol., 22. 2002, 374-379; D. Demeulemeester y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 329, 2005, 105-110, etc.).

Desarrollo de cáncer y metástasis

Angioma, angiofibroma, deformidad vascular y enfermedades cardiovasculares tales como aterosclerosis, angiostenosis, esclerosis ed�mica y estenosis;

65 Enfermedades oftalmol�gicas tales como retinopat�a diab�tica, degeneración macular (incluida la degeneración macular relacionada con la edad), pterigi�n, degeneración de la retina, angiog�nesis en implante de córnea, glaucoma angiog�nico, enfermedades angiog�nicas de la córnea tales como sinequia de la córnea y sinequia del iris, fibroplasias retrolentales, conjuntivitis granular, úlcera de córnea, retinopat�a de cuerpo vítreo proliferativa, retinopat�a inmadura, inflamación de ojo en ojos, córnea c�nica, síndrome de Sjogren, miopía, tumores oculares y rechazo en implante de córnea;

5 Obesidad;

Enfermedades crónicas tales como artritis, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis séptica, osteopatía mediada por MMP y pérdida degenerativa de cartílago después de una lesión traumática articular;

Enfermedades inflamatorias tales como inflamación del sistema nervioso central y enfermedad inflamatoria del intestino;

Enfermedades dermatol�gicas tales como psoriasis, telangiectasia, granuloma piog�nico, dermatitis seborreica y 15 acné;

Enfermedad de Alhzeimer;

Sinequia de la córnea, proteinuria, eneurisma a�rtico abdominal, tejido nervioso desmielinizado, fibrosis hepática, enfermedad nefroglomerular, ruptura prematura de la membrana fetal, enfermedades periodontales tales como gingivitis y periodontitis.

En particular, la angiog�nesis tiene un papel muy importante en el desarrollo y la metástasis de células cancerosas. Los nuevos vasos sanguíneos no solo suministran nutrientes y oxígeno para un desarrollo rápido de la células

25 cancerosas, sino que también proporcionan un acceso a la circulación para la evolución de metástasis [Folkman y Tyler, Cancer Invasion and metastasis, Biologic mechanisms and Therapy (S.B. Day ed.) Raven press, Nueva York, 94-103(1977); Polverini PJ, Critical Reviews in Oral Biology, 6(3), 230-247(1995)].

Los pacientes con cáncer mueren debido a la metástasis, y la quimioterapia y la inmunoterapia usadas actualmente en el tratamiento de cáncer no pueden contribuir a la supervivencia de pacientes con cáncer debido a la falta de efectos antimetast�sicos.

La artritis, una enfermedad inflamatoria bien conocida, se inicia como enfermedad autoinmunitaria. No obstante, el desarrollo de células endoteliales vasculares en la cavidad sinovial se activa mediante las citocinas inflamatorias,

35 que finalmente destruyen el cartílago en la articulación. En otras palabras, la proliferaci�n de células sinoviales y células endoteliales en la cavidad sinovial junto con citocinas que inducen la inflamación induce angiog�nesis y formación de pannus, que desempeñan el papel principal en la destrucción de cartílago (Kocb AE, Polverini PJ y Lcibovich SJ, Arth Rheum 29, 471-479,1986; Stupack DG, Storgard CM y Cheresh DA, Braz J Med Biol Rcs 32, 578581, 1999 Koch AE, Arthritis Rheum 41, 951-962, 1998). Mientras tanto, se ha demostrado también que la estromelisina, en artritis y en lesión traumática de las articulaciones, se reconoce que tiene un papel importante en la activación de procolagenasa para activar colagenasa [Murphy, G. y col., Biochem. J. 248, 265∼268 (1987)]. Por lo tanto, la regulaci�n a la baja de la actividad de MMP puede evitar el progreso de la artritis.

Mucha gente pierde la visión a lo largo del mundo debido a diversas enfermedades oculares. Muchos pacientes se

45 quedan ciegos debido a la infiltración de las células sanguíneas capilares en el humor vítreo (Jeffrey MI y Takayuki A, J Clin Invest 103, 1231-1236, 1999). Degeneración macular relacionada con la edad, retinopat�a diab�tica, retinopat�a de prematuridad, glaucoma angiog�nico, enfermedades angiog�nicas de la córnea son enfermedades angiog�nicas oculares típicas [Adamis AP, Aiello LP y D’Amato RA, Angiog�nesis 3, 9-14(1999)]. La retinopat�a diab�tica, una complicación de la diabetes, est� provocada por la ruptura de capilares y por el cubrimiento de la hemorragia de la superficie de la retina.

La colagenasa, la gelatinasa y la estromelisina se han implicado en la destrucción de la matriz extracelular de la córnea. Se piensa que este es un mecanismo importante de morbididad y pérdida de la vista en una serie de enfermedades oculares ulcerantes, en particular las seguidas por infección o daño químico (Bums, F.R. y col., Invest

55 Opthalmol and Visual Sci, 32, 1569-1575, 1989). Las MMP presentes en el ojo durante la ulceración se han derivado bien end�genamente de leucocitos o fibroblastos infiltrantes o ex�genamente de microbios.

La psoriasis est� provocada por la proliferaci�n extremadamente activa de queratinocitos. El desarrollo rápido de células requiere un suministro suficiente de sangre, y la angiog�nesis est� inducida anormalmente en la psoriasis (Folkman J., J Invest Dermatol 59, 40-48, 1972).

Las colagenasas, segregadas por la estimulaci�n inflamatoria y por microbios, descomponen el col�geno en el tejido conectivo gingival y, finalmente, provocan periodontitis. Las actividades de colagenasa y estromelisina se han identificado en fibroblastos aislados de encía inflamada y los niveles de enzima se han correlacionado con la

65 gravedad de la gingivitis observada (Beeley, N.R.A. y col., anteriormente, en general, C.M. y col., J Periodontal Res, 22, 81-88, 1987).

Las MMP se correlacionan con la patog�nesis del SNC (sistema nervioso central) que destruye mielina o la barrera hematoencef�lica. También se ha informado que la MMP est� relacionada con la acumulación de proteínas betaamiloides en la enfermedad de Alzheimer [Yong, VW. y col., Trends Neurosci 21(2), 75-80(1998)].

5 Se han asociado niveles excesivos de gelatinasa-B en el líquido cefalorraqu�deo con la incidencia de esclerosis múltiple y otros trastornos neurol�gicos [Beeley, N.R.A. y col., anteriormente; Miyazaki, K. y col., Nature 362, 839∼841(1993)], y contribuyen a la degradación y la acumulación de proteína beta-amiloide [Backstrom JR y col., J neurosci 16(24), 7910-9 (1996)].

Informes recientes han mostrado también que la actividad de MMP-1 est� muy inducida en el cerebro de pacientes con la enfermedad de Alzheimer y el MMP-3 que activa la proenzima de MMP también est� implicado en la patofisiolog�a de la enfermedad (Leake A, Morris CM, & Whateley, J Neurosci Lett 291, 201-3, 2000; Yoshiyama Y, Asahina M, & Hattori T, Acta Neuropathol (berl), 99, 91-5, 2000).

15 La degradación de la membrana basal por MMP es un procedimiento muy importante de invasión de cáncer, metástasis y también angiog�nesis. Por lo tanto, la sobreexpresi�n de MMP puede estimular angiog�nesis, invasión de cáncer y metástasis.

En caso de adenocarcinoma, las células cancerosas gástricas pr�ximales invasivas expresan la forma de 72 kD de colagenasa de tipo IV [Schwartz, G.K. y col., Cancer 73, 22∼27(1994)]. Células de embrión de rata transformadas con oncogenes Ha-ras y v-myc o con Ha-ras solo son metast�sicas en ratones atómicos y liberan la gelatinasa/colagenasa de 92 kDa (MMP-9) [Bernhard, E.J. y col., Proc. Natl. Acad. Sci 91,4293∼4597(1994)].

25 Por lo tanto, pueden desarrollarse inhibidores de angiog�nesis o inhibidores de MMP para los productos terapéuticos de estas enfermedades.

A este respecto, los inventores han divulgado en el registro KR N� 10-550.298 que el extracto de hoja de melisa tenía efecto antiangiog�nico mediante ensayos in vitro tales como formación de tubos por HUVEC (células endoteliales de la vena umbilical humana) y en ensayos in vivo tales como el modelo de Matrigel de ratón y el ensayo CAM.

Adem�s, los inventores han divulgado en el registro KR N� 10-473.688 que el extracto de hoja de melisa tenía un efecto de inhibición en la MMP (metaloproteinasa de matriz) que es importante para degradar la membrana basal en

35 el proceso de la angiog�nesis.

Exposici�n de la invención

Problema técnico

Los inventores completan la presente invención mediante las investigaciones para obtener una fracción de hoja de melisa más activa que tenga excelentes actividades inhibidoras de MMP y de angiog�nesis.

Soluci�n técnica

45 Es un objeto de la presente invención proporcionar una fracción de acetato de etilo de hoja de melisa que tenga excelentes actividades inhibidoras de MMP y de angiog�nesis ,y una composición que comprenda la misma.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un gráfico que muestra el efecto inhibidor de ALS-L1023 sobre la actividad de MMP;

la figura 2 es una fotografía que muestra el efecto inhibidor de ALS-L1023 sobre la formación de tubos por HUVEC;

55 la figura 3 es un gráfico que muestra el resultado de un ensayo de Matrigel de ratón para analizar el efecto inhibidor de ALS-L1023 sobre la angiog�nesis;

la figura 4 son fotografías microscópicas de tejido hepático que muestran la reducción de esteatosis hepática e infiltración de células inflamatorias después de la alimentación de ratas obesas inducidas con una dieta rica en grasas con una dosis alta de ALS-L1023 en comparación con el grupo control de vehículo;

la figura 5 son fotografías microscópicas de la zona de adipocitos en tejido adiposo retroperitoneal después de la alimentación de ratas obesas inducidas con una dieta rica en grasas con una dosis media y alta de ALS-L1023 en comparación con el grupo control de vehículo;

65 la figura 6 es una fotografía que muestra el efecto inhibidor de ALS-L1023 en el progreso de degeneración macular relacionada con la edad exudativa mediante la administración por vía oral de ALS-L1023;

la figura 7 es un gráfico que muestra los cambios en el peso corporal de ratas según el ensayo de toxicidad con una sola dosis por vía oral de 2000 mg/kg de ALS-L1023;

5 la figura 8 es un gráfico que muestra los cambios en la temperatura corporal de ratas según el ensayo de toxicidad con una sola dosis por vía oral de 2000 mg/kg de ALS-L1023; y

la figura 9 es un gráfico que muestra los valores de peso de órganos relativos, mostrados como porcentaje del peso corporal total según el ensayo de toxicidad con una sola dosis por vía oral de 2000 mg/kg de ALS-L1023.

Mejor forma de llevar a cabo la invención

En consecuencia, la presente invención proporciona una fracción de acetato de etilo de hoja de melisa que tiene 15 excelentes actividades inhibidoras de metaloproteinasas de matriz (MMP) y de angiog�nesis.

La presente invención también se refiere a proporcionar una composición que comprende la fracción de acetato de etilo de hoja de melisa para el tratamiento o la prevención de enfermedades relacionadas con la angiog�nesis y enfermedades mediadas por MMP.

A continuación, la presente invención se describir� en detalle.

La fracción de acetato de etilo de hoja de melisa según la presente invención se caracteriza porque la hoja de melisa se extrae con alcohol C1∼C6 al 70∼80 % y después el extracto de alcohol concentrado se suspende en agua y se

25 fracciona con acetato de etilo y se seca, obteniéndose la fracción de acetato de etilo de hoja de melisa.

En el procedimiento en la producción de una fracción de acetato de etilo de hoja de melisa según la presente invención, puede usarse hoja de melisa seca, sin secar o una mezcla de las mismas. Para una extracción eficaz, la hoja de melisa puede cortarse en trozos pequeños o pulverizarse.

Un extracto de alcohol de hoja de melisa puede extraerse mediante el procedimiento convencional, en este punto, el disolvente de extracción usado puede ser alcohol al 70∼80 % de 5∼10 volúmenes con respecto a la hoja de melisa. Los alcoholes pueden ser, preferentemente, metanol, etanol o una mezcla de los mismos.

35 En los ejemplos de la presente invención, el extracto de etanol al 75 % de hoja de melisa se suspende en agua y se fracciona con acetato de etilo y se seca, obteniéndose la fracción de acetato de etilo de hoja de melisa (denominada ALS-L1023).

Los materiales solubles en agua y los materiales insolubles en agua pueden extraerse eficazmente usando alcohol al 70∼80 % como disolvente de extracción. Y este procedimiento es eficaz para obtener materiales insolubles en agua que son solubles en acetato de etilo.

El acetato de etilo se selecciona como segundo disolvente de extracción considerando el rendimiento del producto, la toxicidad de los residuos y los contenidos relativos de sustancias de referencia.

45 Para la producción en masa de la fracción de hoja de melisa con actividad antiangiog�nica excelente, se suspende el extracto de alcohol al 70∼80 % de hoja de melisa en agua y se fracciona con acetato de etilo y se seca, obteniéndose la fracción de acetato de etilo de hoja de melisa (denominada ALS-L1023 en los ejemplos siguientes).

Adem�s, también puede ser que la hoja de melisa se extraiga con alcohol C1∼C2 al 70∼80 %, se seque y el extracto de alcohol se suspenda en agua y después se fraccione con acetato de etilo, se seque y la fracción de acetato de etilo se resuspenda en agua y se seque, obteniéndose la fracción de acetato de etilo de hoja de melisa.

La fracción de acetato de etilo de hoja de melisa obtenida se us� en ensayos animales y en ensayos precl�nicos.

55 Los inventores hallaron que una fracción de acetato de etilo de hoja de melisa en la presente invención es excelente en inhibir actividades de angiog�nesis y de MMP en comparación con otras fracciones obtenidas mediante otro reparto en disolvente. La fracción de acetato de etilo de hoja de melisa muestra las actividades más eficaces y excelentes en la inhibición de angiog�nesis mediante ensayo de inhibición de MMP, ensayo de formación de tubos por HUVEC y ensayo de implante de Matrigel en ratones. Los inventores también han hallado que esta fracción inhibió la obesidad reduciendo el tejido adiposo, el tamaño de las células adiposas e induciendo la expresión g�nica relacionada con la oxidación de ácidos grasos.

Por lo tanto, est� claro que una fracción de acetato de etilo de hoja de melisa según la presente invención puede 65 usarse como agente antiangiog�nico y agente inhibidor de MMP para el tratamiento o la prevención de enfermedades relacionadas con la angiog�nesis y enfermedades mediadas por MMP.

Por lo tanto, la presente invención proporciona una composición que comprende una fracción de acetato de etilo de hoja de melisa.

5 Las enfermedades relacionadas con la angiog�nesis y enfermedades mediadas por MMP que pueden tratarse o prevenirse mediante la composición de la presente invención incluyen, pero sin limitación, desarrollo de cáncer y metástasis; angioma, angiofibroma, deformidad vascular y enfermedades cardiovasculares tales como aterosclerosis, angiostenosis, esclerosis ed�mica y estenosis; enfermedades oftalmol�gicas tales como retinopat�a diab�tica, degeneración macular (incluida la degeneración macular relacionada con la edad), pterigi�n, degeneración de la retina, angiog�nesis en implante de córnea, glaucoma angiog�nico, enfermedades angiog�nicas de la córnea tales como sinequia de la córnea y sinequia del iris, fibroplasias retrolentales, conjuntivitis granular, úlcera de córnea, retinopat�a de cuerpo vítreo proliferativa, retinopat�a inmadura, inflamación de ojo en ojos, córnea c�nica, síndrome de Sjogren, miopía, tumores oculares y rechazo en implante de córnea; obesidad; enfermedades crónicas

15 inflamatorias tales como artritis, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis séptica, enfermedades inflamatorias tales como inflamación del sistema nervioso central y enfermedad inflamatoria del intestino; osteopatía mediada por MMP y pérdida degenerativa de cartílago regresiva; enfermedades dermatol�gicas tales como psoriasis, telangiectasia, granuloma piog�nico, dermatitis seborreica y acné; enfermedad de Alzheimer; sinequia de córnea, proteinuria, aneurisma a�rtica abdominal, tejido nervioso desmielinizado, fibrosis hepática, enfermedad nefroglomerular, ruptura prematura de la membrana fetal, enfermedades periodontales tales como gingivitis y periodontitis.

La composición de la presente invención puede usarse en combinación con agentes antiangiog�nicos conocidos o inhibidores de MMP conocidos.

25 En la presente invención, la composición que comprende la fracción de acetato de etilo de hoja de melisa que se usa como agente para el tratamiento o la prevención de enfermedades relacionadas con la angiog�nesis y enfermedades mediadas por MMP, puede ser una composición farmacéutica o una composición alimentaria.

La composición farmacéutica de la presente invención también puede comprender aditivos farmac�uticamente y fisiológicamente aceptable tales como diluyentes, agentes dispersantes, tensioactivos, disolventes, agentes disgregantes, aglutinantes, agentes de recubrimiento, agentes de expansión, lubricantes, deslizantes o agentes aromatizantes.

La composición farmacéutica que comprende la fracción de acetato de etilo de hoja de melisa de la presente

35 invención como un ingrediente activo puede formularse en combinación con excipientes, vehículos o diluyentes farmac�uticamente aceptables.

La composición farmacéutica de la presente invención puede formularse en cualquier forma tal como gránulos, polvos, comprimidos, comprimidos recubiertos, cápsulas, píldoras, jarabes, gotas, líquidos, soluciones, emulsiones o soluciones inyectables.

Por ejemplo, en la composición de tipo comprimido o cápsula, los ingredientes activos pueden unirse con vehículos farmac�uticamente aceptables inactivos y no tóxicos. Y pueden incluirse en caso de necesidad aglutinantes, lubricantes, disgregantes y formadores de color adecuados. Los ejemplos de aglutinantes adecuados incluyen, pero

45 sin limitación, almidón, gelatina, dextrina, maltodextrina, azúcar natural tal como glucosa o β-lactosa, edulcorante de maíz, goma acacia, goma natural y sintética tal como goma tragacanto y oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio. Los disgregantes incluyen, pero sin limitación, almidón, metilcelulosa, agar, bentonita, goma xantana, etc.

En la composición de tipo solución líquida, los vehículos farmac�uticamente aceptables son solución salina, agua estéril, solución de Ringer, solución salina tamponada, solución de inyección de albúmina, solución de dextrosa, solución de maltodextrina, glicerina, etanol o solución mixta. Y aditivos generales tales como antioxidantes, solución tamponada, producto bacteriost�tico, etc. pueden coadyuvar esta composición. Usando procedimientos convencionales o el texto escrito de Remington’s pharmaceutical Science (Mack Publishing co, Easton PA), la

55 composición de la presente invención puede formularse en cualquier forma deseable según la enfermedad o los ingredientes.

Adem�s, la composición alimentaria que comprende la fracción de acetato de etilo de hoja de melisa de la presente invención como ingrediente activo puede usarse como alimentos funcionales, suplementos dietéticos o aditivos alimentarios. En el caso de aditivos alimentarios, la composición alimentaria de la presente invención puede añadirse a carne, agua de bebida, chocolate, dulces, aperitivos, pizza, fideos instantáneos, fideos, goma de mascar, helados, bebidas alcohólicas, complejos vitamínicos o a comida saludable.

La presente invención proporciona el uso de una composición que comprende la fracción de acetato de etilo de hoja

65 de melisa para el tratamiento o la prevención de enfermedades relacionadas con la angiog�nesis y enfermedades mediadas por MMP. La composición de la presente invención puede usarse en alimentación y en medicina para el tratamiento o la prevención de enfermedades relacionadas con la angiog�nesis y enfermedades mediadas por MMP.

La presente invención también proporciona un procedimiento de tratamiento o de prevención de enfermedades relacionadas con la angiog�nesis y enfermedades mediadas por MMP que comprende administrar una cantidad 5 terapéuticamente eficaz de la fracción de acetato de etilo de hoja de melisa.

Tal como se usa en el presente documento, "mamífero" para fines de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, siendo preferentemente el mamífero un ser humano.

10 Tal como se usa en el presente documento, "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad que inducir� una respuesta biológica o m�dica en el animal o en el ser humano al que se le administra. Un personal m�dico capacitado puede determinar la cantidad terapéuticamente eficaz, as� como también la dosis apropiada y la frecuencia de administración para lograr un resultado cl�nico óptimo. Una cantidad terapéuticamente eficaz variar� en función de diversos factores tales como los tipos de enfermedad, la gravedad de los síntomas del paciente,

15 contenido de ingredientes, edad, peso corporal, sexo del paciente individual, alimento, tiempo de administración, vía de administración, la relación de la composición, el periodo de tratamiento y de fármacos adicionales administrados conjuntamente. La composición de la presente invención puede administrarse en una dosis única, o como parte de un régimen de administración tal como de dosis múltiples, pudiendo ser la dosificación deseada de la fracción de acetato de etilo de hoja de melisa de 3 mg/kg ∼ 250 mg/kg por día.

20 La composición de la presente invención puede administrarse por diversas vías, por ejemplo, pero sin limitación, por vía oral, rectal, intravenosa, intraarterial, intrerperiotoneal, intramuscular, intramucosal, subcutánea, intrad�rmica, transd�rmica, transcut�nea, intravaginal, intrarrectal, nasal, ocular y/o intestinal.

25 Modo de la invención

Los ejemplos siguientes simplemente pretenden ilustrar adicionalmente la presente invención. No obstante, los ejemplos y ejemplos experimentales se muestran solo para una mejor comprensión de la presente invención sin limitar su alcance.

30 [EJEMPLOS]

Ejemplo 1. Producción de la fracción de acetato de etilo de hoja de melisa

35 Para producir extracto de hoja de melisa con actividad antiangiog�nica potente, la hoja de melisa se extrae con agua destilada, etanol acuoso al 50 %, etanol acuoso al 75 %, etanol al 100 % y metanol, respectivamente. El extracto bruto se centrifug�, se filtr�, se concentr� y después se liofilizó, obteniéndose un extracto en polvo. El polvo se almacena a 4 �C hasta su uso. El efecto antiangiog�nico de los extractos se analizó mediante el ensayo de formación de tubos por HUVEC a una concentración de 50 μg/ml. Tal como se muestra en la tabla 1, tanto el

40 extracto que incluía agua como los extractos de etanol al 50 %, al 75 %, al 100 % y metanol al 100 % mostraron un efecto de inhibición en el ensayo de formación de tubos por HUVEC. Especialmente, el extracto de etanol al 75 % tiene una actividad inhibidora relativamente buena en comparación con otros extractos, por lo tanto se selecciona etanol al 75 % como disolvente de extracción principal.

45 Tabla 1

El efecto de extractos de melisa sobre la formación de tubos por HUVEC

Muestras

Inhibición de formación de tubos por HUVEC

Control negativo

-

Extracto de agua

+

Extracto de etanol al 50 %

(+)

Extracto de etanol al 75 %

+(+)

Extracto de etanol al 100 %

+

Extracto de metanol al 100 %

+(+)

-: tubos formados (sin inhibición), +/- : tubos casi parecidos al control (inhibición poco común),

+ : los tubos est�n ligeramente desconectados (inhibición leve),

++ : los tubos est�n muy desconectados (inhibición significativa), 50 +++ : ningún tubo formado,

Para encontrar la actividad antiangiog�nica más potente de fracciones de hoja de melisa, el extracto de etanol al 75 % de hoja de melisa se repartió secuencialmente con hexano, acetato de etilo y butanol. Cada fracción se centrifuga, se filtra, se concentra y después se liofiliza, obteniéndose una fracción en polvo. El polvo se almacena a 4 �C hasta su uso. El efecto antiangiog�nico se analizó mediante el ensayo de formación de tubos por HUVEC a una concentración de 50 μg/ml, respectivamente. Tal como se muestra en la tabla 2, el acetato de etilo tiene la actividad antiangiog�nica más potente.

Tabla 2

El efecto de fracciones sobre la formación de tubos por HUVEC

Muestras

Inhibición de formación de tubos por HUVEC

Control negativo

-

Extracto de etanol al 75%

+(+)

Fracci�n de hexano

+/-

Fracci�n de acetato de etilo

++(+)

Fracci�n de butanol

+

-: tubos formados (sin inhibición), +/- : tubos casi parecidos al control (inhibición poco común),

+ : los tubos est�n ligeramente desconectados (inhibición leve),

10 ++ : los tubos est�n muy desconectados (inhibición significativa), +++ : ningún tubo formado,

En base a los resultados de estos ensayos, la producción en masa de la fracción de hoja de melisa con actividad antiangiog�nica excelente se realizó tal como sigue; se suspende el extracto de alcohol al 75 % de hoja de melisa en

15 agua y se fracciona con acetato de etilo y se seca, obteniéndose la fracción de acetato de etilo de hoja de melisa (denominada ALS-L1023 en los ejemplos siguientes). Esta ALS-L1023 se us� en ensayos en animales y ensayos precl�nicos.

El procedimiento de producción en masa de ALS-L1023 se describe en detalle a continuación.

20 Se extrajeron dos veces 100 kg secos de hoja de melisa con 350 l de etanol acuoso al 75 % a 83 �C durante 4 horas. El extracto se filtr� con un filtro de 10 μm y se concentr� a 30 l y después se fraccion� con 40 l de acetato de etilo dos veces. Después de lavar esta fracción con agua destilada, se concentr� al volumen de 15 l y después se secó con aire caliente a 45 �C. Finalmente, se obtuvieron 5 kg de ALS-L1023 en forma de un polvo seco.

25 Ejemplo 2. Ensayo in vitro de ALS-L1023

(1) Ensayo de inhibición de MMP

30 Para investigar la inhibición de MMP por ALS-L1023 producida mediante producción en masa, se realizó un ensayo de actividad enzim�tica de MMP mediante un procedimiento espectrofluorom�trico (Perkin-Elmer LS50B).

Las enzimas MMP que se usaron en el ensayo se prepararon mediante producción de proteínas recombinantes usando un sistema de baculovirus de AngioLab, Inc. Se us� un sustrato fluorom�trico (Bachem N� de cat. M-2105)

35 como sustrato para MMP-2 y MMP-9. Se a�adi� ALS-L1023 con diversas concentraciones al tampón de reacción que contenía la enzima MMP y el sustrato, y se midió la intensidad de la fluorescencia. La CI50 de ALS-L1023 para MMP-2 y MMP-9 fue de 17,7 � 1,0 μg/ml y 12,3 � 1,4 μg/ml, respectivamente.

La CI50 del extracto de etanol al 75 % de hoja de melisa para MMP-2 y MMP-9 fue de 33,6 � 1,5 μg/ml y 26,0 � 1,7 40 μg/ml, respectivamente. Por lo tanto, se confirma que la actividad de inhibición de MMP de ALS-L1023 se potenci� en comparación con la del extracto de etanol al 75 % de hoja de melisa (figura 1).

(2) Actividad inhibidora en la formación de tubos por HUVEC

45 El ensayo de formación de tubos por HUVEC (células endoteliales de la vena umbilical humana) es un ensayo in vitro que est� estrechamente relacionado con la eficacia in vivo, y se investigó el efecto de ALS-L1023 sobre la formación de tubos por HUVEC.

Para realizar el ensayo de formación de tubos, las HUVEC se aislaron a partir de cordones umbilicales recién 50 obtenidos. Las células se cultivaron y se identificaron mediante tinción inmunocitoqu�mica con anticuerpo anti-Factor

VIII. Las HUVEC cultivadas dentro del pasaje 5 se cultivaron en Matrigel (BD Bioscience, Bedford, MA, Estados Unidos) a 37 �C en ausencia o presencia de diferentes concentraciones de ALS-L1023 durante 18 horas. La formación de tubos se observ� usando el microscopio. Tal como se muestra en la figura 2, la ALS-L1023 producida mediante la producción en masa inhibió la formación de tubos a 50 μg/ml. La red capilar de tubos se desconect� con la ALS-L1023 mientras que se observ� una red capilar de tubos. Además, la ALS-L1023 inhibió la formación de tubos por HUVEC de un modo dependiente de la dosis, tal como se muestra en la tabla 3.

Tabla 3

Inhibici�n de formación de tubos por HUVEC mediante ALS-L1023

muestra (μg/ml)

Inhibición de formación de tubos por HUVEC

0 (control)

-

100

+

50

++

25

++

(3) Ensayo de citotoxicidad celular

Para analizar la citotoxicidad de ALS-L1023 sobre las HUVEC, se sembraron 5.000-10.000 células HUVEC por pocillo en una placa de 96 pocillos y se añadieron a cada pocillo concentraciones diferentes de ALS-L1023. La

10 viabilidad de las células se analizó con el kit de proliferaci�n celular a base de tetrazolio XTT (hidrato del ácido sodio-3’-[1-(fenilaminocarbonil)-3,4-tetrazoio]-bis[4-metoxy-6-nitro]bencenosulf�nico) (Roche, Alemania) y las células viables se midieron con el lector de placas de ELISA. La ALS-L1023 no afect� a la viabilidad de HUVEC a la concentración de 50 μg/ml, lo que demuestra la inhibición de la formación de tubos de HUVEC.

15 (4) Ensayo de Matrigel de ratón

El ensayo de implante de Matrigel de ratón se realizó para medir la inhibición de angiog�nesis in vivo mediante ALS-L1023 cuantitativamente.

20 Se implantaron 0,4 ml de Matrigel que contenían 50 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y 50 unidades/ml de heparina mediante inyección por vía subcutánea a ratones C57BL/6. Se administraron por vía oral 0,5 mg de ALS-L1023 disuelta en etanol al 10 % por ratón dos veces al día durante 4 días. Se administr� por vía oral etanol al 10 % al grupo control. El día 5 se retir� la epidermis del ratón y se recuper� el Matrigel y después se determin� la cantidad de hemoglobina en el Matrigel usando reactivo de Drabkin (Sigma, Estados Unidos).

25 Como se muestra en la figura 3, el contenido de hemoglobina en los Matrigel recuperados del grupo tratado con ALS-L1023 era reducido en comparación con el grupo control de vehículo. El porcentaje de inhibición de la angiog�nesis mediante ALS-L1023 era del 33 %.

30 [Ejemplo de formulación]

Se añadieron excipientes adecuados a ALS-L1023 para mejorar su estabilidad y después se envasaron 250 mg del mismo en una cápsula dura. La relación de mezcla se describe en la tabla 4 siguiente.

35 Tabla 4

Relaci�n de formulación de ALS-L1023

Material bruto

Relación de mezcla (%)

ALS-L1023

60

Estearato de magnesio

1

Di�xido de silicio coloidal

1

Celulosa microcristalina

33

Laurilsulfato de sodio

5

Ejemplo 3. Efecto antiobesidad de la fracción de ALS-L1023

Con respecto a la obesidad inducida por dieta rica en grasas, se realizó el experimento siguiente para examinar el

40 efecto inhibidor de ALS-L1023 sobre la grasa abdominal. La ALS-L1023 formulada como ingrediente activo se mezcl� con un alimento rico en grasa de 45 kcal % (fabricado por Research Diets Inc., Estados Unidos) con un contenido del 0 (grupo control), el 0,1 % (bajo), el 0,25 % (medio) y el 0,5 % (alto) (forma formulada: 0, 0,17, 0,42, 0,83 %). Para la preparación del grupo control que no contenía ingrediente activo ALS-L1023, se mezclaron excipientes contenidos en la ALS-L1023 formulada con el alimento rico en grasas en un contenido del 0,33 % como

45 dosis elevada. Después de un periodo de aclimatación de una semana, las ratas SD macho de 7 semanas de edad se dividieron en grupos de 7 ratones por grupo y se alimentaron durante 12 semanas. Después, se midió su peso corporal y el peso de grasa abdominal, y se realizaron ensayos bioquímicos de la sangre y ensayos histopatol�gicos del hígado y el tejido adiposo.

5 (1) Peso corporal

Se midió el peso corporal el día de la adquisición, el día de inicio de la administración, una vez a la semana después del inicio de la administración y el día de la autopsia. Los resultados se resumen en la tabla 5, en la que el peso corporal medio del grupo control de vehículo aument� constantemente de 204,73 � 5,57 g (antes de la 10 administración) a 633,63 � 43,08 g (12 semanas después de la administración), y el peso corporal promedio del grupo de ALS-L1023 (grupos de dosis baja, media y alta) aument� constantemente de 210,10 � 5,19 g, 204,97 � 6,61 g y 208,01 � 7,65 g (antes de la administración) a 623,72 � 58,02 g, 588,69 � 33,76 g y 584,83 � 33,44 g (12 semanas después de la administración). No hubo ninguna significación estadística entre el grupo control y los grupos de ALS-L1023. No obstante, el peso corporal medio del grupo de ALS-L1023 disminuyó de un modo

15 dependiente de la dosis.

Tabla 5

Cambios en el peso corporal con la administración de ALS-L1023

Contenido de ALS-L1023 (%)

0 (grupo control) 0,1 (grupo dosis baja) 0,25 (grupo dosis media) 0,5 (grupo dosis alta)

Peso corporal antes de la administración (g)

204,73 � 5,57 210,10 � 5,19 204,97 � 6,61 208,01 � 7,65

Peso corporal después de la administración (g)

633,63 � 43,08 623,72 � 58,02 588,69 � 33,76 584,83 � 33,44

(2) Ingesta de alimento

20 La ingesta diaria de alimento se determin� como sigue. Los comederos se llenaron con alimento en polvo y después se midió su peso. A las 24 h después de alimentar a los animales con el comedero, se midieron los pesos y se determina la diferencia en los pesos medidos como ingesta de alimento diaria. La medición se realizó el día del inicio de la administración y una vez a la semana después del inicio de la administración.

25 La ingesta media de alimento del grupo control de vehículo estaba en el intervalo de 18,46 a 22,73 g durante 12 semanas, y la ingesta media de alimento de los grupos de dosis baja, media y alta estaba en los intervalos de 17,14 a 21,84 g, 17,29 a 22,03 g y 16,99 a 20,84 g, respectivamente. No hubo una diferencia significativa en comparación con el grupo control de vehículo.

(3) Pesos de órganos y tejidos adiposos

Antes de la autopsia y la recogida de sangre, los animales se mantuvieron en ayunas durante un periodo de 18 h o superior y se sometieron a anestesia con éter, seguida por recogida de sangre y flebotomía. Se escindieron los

35 tejidos adiposos mesent�ricos, los tejidos adiposos epididimales y los tejidos adiposos retroperitoneales de la cavidad abdominal, y se pesaron. Se pesaron el hígado, corazón, riñones, bazo y páncreas.

Como resultado no hubo una diferencia significativa en los pesos de corazón, hígado, páncreas, ri��n (derecho, izquierdo) y bazo entre los grupos control de vehículo y los grupos experimentales. Con respecto al peso del tejido

40 adiposa mesent�rico, en los grupos de dosis baja, media y alta fueron de 15,90 � 4,36 g, 12,64 � 1,69 g, y 11,23 � 3,32 g, respectivamente. Es decir, los grupos experimentales sufrieron una disminución de un modo dependiente de la dosis, en comparación con el grupo control de vehículo de 15,16 � 4,41 g. Con respecto al peso del tejido adiposo epididimal, en los grupos de dosis baja, media y alta fueron de 17,74 � 3,37 g, 16,29 � 2,62 g, y 15,67 � 3,83 g, respectivamente. Es decir, los grupos experimentales sufrieron una disminución de un modo dependiente de la

45 dosis, en comparación con el grupo control de vehículo de 20,80 � 4,41 g, y se observ� una diferencia estadísticamente significativa (p<0,05) en el grupo de dosis alta. Con respecto al peso del tejido adiposo retroperitoneal, en los grupos de dosis baja, media y alta fueron de 27,20 � 5,76 g, 21,36 � 4,03 g, y 23,94 � 6,24 g, respectivamente. Es decir, los grupos experimentales sufrieron una disminución de un modo dependiente de la dosis, en comparación con el grupo control de vehículo de 29,73 � 3,23 g, y se observ� una diferencia

50 estadísticamente significativa (p<0,05) en el grupo de dosis media. Con respecto al peso total del tejido adiposo abdominal, incluidos el tejido adiposo mesent�rico, el tejido adiposo apididimal y el tejido adiposo retroperitoneal, en los grupos de dosis baja, media y alta fueron de 60,84 � 11,66 g, 50,29 � 7,31 g y 50,84 � 11,84 g, respectivamente. Es decir, los grupos experimentales sufrieron una disminución, en comparación con el grupo control de vehículo de 65,69 � 10,13 g, y se observ� una diferencia estadísticamente significativa (p<0,05) en los grupos de dosis media y

55 alta (véase la tabla 6).

Tabla 6

Cambios en el peso de órganos y tejido adiposo con la administración de ALS-L1023

Contenido de ALS-L1023 (%)

0 (grupo control) 0,1 (grupo dosis baja) 0,25 (grupo dosis media) 0,5 (grupo dosis alta)

peso de tejido adiposo mesent�rico (g)

15,16 � 4,41 15,90 � 4,36 12,64 � 1,69 11,23 � 3,32

peso de tejido adiposo epididimal (g)

20,80 � 4,41 17,74 � 3,37 16,29 � 2,62 15,67 63,83**

peso de tejido adiposo retroperitoneal (g)

29,73 � 3,23 27,20 � 5,76 21,36 � 4,03** 23,94 � 6,24

peso total de tejido adiposo abdominal (g)

65,69 � 10,13 60,84 � 11,66 50,29 � 7,31** 50,84 � 11,84**

** : p<0,05 en comparación con el grupo control

(4) Ensayos de sangre bioquímicos

5 En los ensayos de sangre bioquímicos, no hubo una diferencia significativa en índices hepáticos tales como niveles en suero de AST (aspartato aminotransferasa), ALT (alanine aminotransferasa) y ALP(fosfatasa alcalina) entre el grupo control y los grupos experimentales. Con respecto al nivel de colesterol en sangre total, en los grupos de dosis baja, media y alta fueron de 88,07 � 14,35 mg/dl, 86,96 � 17,68 mg/dl y 79,90 � 10,45 mg/dl, respectivamente. Es

10 decir, los grupos experimentales sufrieron una disminución de un modo dependiente de la dosis, en comparación con el grupo control de vehículo de 102,09 � 21,82 mg/dl. Con respecto al nivel de triglic�ridos, en los grupos de dosis baja, media y alta fueron de 50,93 � 15,28 mg/dl, 46,63 � 11,77 mg/dl y 45,50 � 22,45 mg/dl, respectivamente. Es decir, los grupos experimentales sufrieron también una disminución de un modo dependiente de la dosis, en comparación con el grupo control de vehículo de 58,13 � 25,04 mg/dl. Con respecto al nivel de LDL, en los grupos

15 de dosis baja, media y alta fueron de 9,56 � 2,67 mg/dl, 9,11 � 2,92 mg/dl y 8,56 � 2,26 mg/dl, respectivamente. Es decir, los grupos experimentales sufrieron también una disminución de un modo dependiente de la dosis, en comparación con el grupo control de vehículo de 12,31 � 3,70 mg/dl. No obstante, no hubo una diferencia significativa en los niveles de glucosa, proteínas totales y albúmina entre el grupo control y los grupos experimentales. De este modo, con respecto a la administración de ALS-L1023, los niveles en suero de colesterol

20 total, triglic�ridos y LDL en los grupos experimentales sufrieron una disminución de un modo dependiente de la dosis, en comparación con el grupo control de vehículo (véase la tabla 7).

Tabla 7

Cambios en indices bioquímicos de la sangre con la administración de ALS-L1023

Contenido de ALS-L1023 (%)

0 (grupo control) 0,1 (grupo dosis baja) 0,25 (grupo dosis media) 0,5 (grupo dosis alta)

colesterol total (mg/dl)

102,09 � 21,82 88,07 � 14,35 86,96 � 17,68 79,90 � 10,45

triglic�ridos (mg/dl)

58,13 � 25,04 50,93 � 15,28 46,63 � 11,77 45,50 � 22,45

LDL (mg/dl)

12,31 � 3,70 9,56 � 2,67 9,11 � 2,92 8,56 � 2,26

25 (5) Ensayo histopatol�gico del hígado

Los hígados se pesaron y después se fijaron en solución de formalina tamponada neutra al 10 %, y después se realizó el procesamiento histopatol�gico rutinario. Las muestras de láminas de tejido se prepararon y después se tiñeron con H&E, y después se observaron en un microscopio para evaluar la esteatosis hepática. Como resultado, 30 en el grupo control de vehículo se observ� una acumulación excesiva de glóbulos de grasa en el lóbulo hepático de hepatocitos, que es el hallazgo de esteatosis hepática. Los cambios grasos microvesiculares o macrovesiculares se observaron principalmente alrededor de la vena portal hepática. La infiltración celular inflamatoria que tiene lugar en un estado avanzado de esteatosis hepática tuvo lugar principalmente entre hepatocitos hinchados o alrededor de los mismos, donde existía la esteatosis hepática. En un grado moderado de esteatosis hepática, tuvo lugar infiltración

35 celular inflamatoria alrededor de las venas centrales. No se observaron otros hallazgos patológicos anormales.

En el grupo de dosis baja, también se observ� esteatosis hepática, que fue similar a la observada en el grupo control de vehículo. En el grupo de dosis media, se observaron esteatosis hepática e infiltración celular inflamatoria ligeramente reducidas, en comparación con el grupo control de vehículo y el grupo de dosis baja.

En el grupo de dosis alta, se observ� la inhibición de la esteatosis hepático o infiltración celular inflamatoria reducida, que fue similar a la observada en el grupo de dosis media (véase la figura 4). Los resultados sugieren que la ALS-L1023 ejerce efectos inhibidores sobre la misma.

(6) área de adipocitos en el tejido adiposo

Los tejidos adiposos retroperitoneales escindidos se pesaron y después las muestras de tejido embebidas en parafina se prepararon mediante el procesamiento histológico rutinario y después se tiñeron con H&E. Se seleccionaron aleatoriamente 5 sitios de muestreo y el valor medio de 10 áreas de adipocitos adyacentes a cada sitio de muestreo se determinaron como área de adipositos de cada sujeto usando un programa inform�tico de investigador en estéreo (MicroBrigthField, VT, Estados Unidos) conectado a un microscopio electrónico. Como se muestra en la figura 5, se observ� la reducción en el área de adipocitos en los grupos de dosis media y alta, en comparación con el grupo control de vehículo. Se observ� una diferencia significativa (p<0,05) en el grupo de dosis

15 alta.

En conjunto, cuando se alimentaron ratas obesas inducidas con dieta rica en grasas con ALS-L1023 durante 12 semanas, la ALS-L1023 ejerció efectos inhibidores sobre la obesidad, incluidos la reducción en el peso de tejido adiposo abdominal y en los niveles en suero de colesterol total y triglic�ridos, el alivio de esteatosis hepática y la reducción del tamaño de adipocitos.

Ejemplo 4. Efecto de ALS-L1023 sobre enfermedades oculares neovasculares

Para evaluar la eficacia de ALS-L1023 sobre la neovascularizaci�n retinal, se inyect� a ratones con retinopat�a

25 inducida por oxígeno en el modelo animal de ROP (retinopat�a de prematuridad) por vía peritoneal ALS-L1023 diluida en DMSO a una dosis de 25 mg/kg el día 13 después del nacimiento durante un periodo de 5 días.

Como resultando, se observaron neovascularizaci�n retinal y muchos vasos sanguíneos anormales en el grupo control de ROP, mientras que las retinas normales muestran patrones uniformes y compactos de vasos sanguíneos. De forma notable, la neovascularizaci�n reducida en la retina central y la retina periférica y el número más reducido de vasos sanguíneos anormales se observ� en el grupo de ALSL1023, en comparación con el grupo control de ROP. De este modo, se espera que la ALS-L1023 sea eficaz en la prevención y el tratamiento de neovascularizaci�n ocular.

35 Ejemplo 5. Efecto de ALS-L1023 sobre la degeneración macular

La cápsula de ALS-L1023 formulada se administr� por vía oral a un paciente masculino al que se había diagnosticado degeneración macular relacionada con la edad exudativa tres veces al día con 2 cápsulas en cada ocasión durante 12 semanas. Después, se fotografi� el área macular del paciente y se compar� el tamaño del área de degeneración macular con la fotografía tomada antes de la administración. Como se muestra en la figura 6, no se observ� progresión en el área de degeneración macular. De este modo, se espera que la ALS-L1023 sea eficaz en la prevención y el tratamiento de degeneración macular relacionada con la edad.

[Ejemplo experimental] Ensayo de seguridad de ALS-L1023

45 Se us� la hoja de melisa, de la que se aisl� la sustancia de ensayo ALS-L1023, como alimento o medicina durante un periodo de tiempo largo, y se clasificó por US FDA como GRAS (considerada en general como segura). De este modo, la sustancia de ensayo ALS-L1023 se consider� como no tóxica y el presente experimento se realizó como un ensayo de toxicidad aguda (ensayo límite) mediante una dosis única por vía oral de 2000 mg/kg de ALS-L1023 según la instrucciones de OECD.

Se dividieron aleatoriamente diez ratas macho y diez ratas hembra en grupos control y experimentales, consistiendo cada uno en cinco animales, respectivamente. A los grupos control se administraron 1 ml/150 g (peso corporal) de aceite de maíz y a los grupos experimentales se administraron 2000 mg/kg de ALS-L1023 en aceite de maíz. Ya que

55 la sustancia de ensayo ALS-L1023 no se disolvió en agua, se suspendió en aceite de maíz para usarla en el ensayo. La sustancia de ensayo se prepare el día de administración y se suspendió mediante agitador vortex antes de su administración.

En primer lugar se administr� por vía oral a una rata, que se sometió a observación después durante 24 h. Después se administr� por vía oral a dos ratas, que se sometieron después a observación durante 72 h. Después, se administr� por vía oral a las 17 ratas restantes y se observaron para determinar hallazgos de toxicidad durante 30 min. Después, las observaciones se realizaron dos veces al día durante 14 días y el peso corporal y la temperatura se registraron cada día.

65 El último día del experimento, las ratos se sacrificaron usando CO2 y se realizaron las autopsias. Los tejidos anormales examinados visualmente por el pat�logo se escindieron y se sometieron a examen histológico.

Como resultado, en el caso de una dosis única por vía oral de 2000 mg/kg de ALS-L1023 en cada uno de las cinco ratas macho y hembra, no se observaron hallazgos de toxicidad significativos durante el transcurso del periodo de 14 días de observación.

5 No se observaron anormalidades clónicas distintas ni en el grupo control ni el grupo experimental. No obstante, una rata hembra se volvió ligeramente excitada 60 min después de la administración, pero se mantuvo estable a los 90 min después de la administración.

10 Además, la administración de ALS-L1023 no afect� al peso corporal y a la temperatura corporal ni el grupo control ni el grupo experimental (véanse las figuras 7 y 8).

Los pesos relativos (%) de timo, corazón, bazo, ri��n, hígado y cerebro con respecto al peso corporal total se muestran en la figura 9. Se observ� un ligero aumento, pero estadísticamente significativo en el peso del hígado de 15 la rata hembra del grupo control, en comparación con el de la rata hembra a la que se administr� ALS-L1023, pero no en el de las ratas macho. No se encontraron hallazgos de autopsia anormales ni otros hallazgos peculiares.

Adem�s, aunque algunos hallazgos anormales se detectaron visualmente por parte del pat�logo, el examen histológico de los mismos no mostr� evidencias de anormalidad.

20 En consecuencia una dosis única por vía oral de 2000 mg/kg de ALS-L1023 no indujo ningún síntoma tóxico a lo largo del transcurso del periodo de observación.

Aplicabilidad Industrial

25 Una fracción de acetato de etilo de hoja de melisa de la presente invención tiene una actividad potente y excelente antiangiog�nica e inhibidora de MMP. Por lo tanto, la composición que comprende la fracción de acetato de etilo de hoja de melisa de la presente invención puede usarse como agente para el tratamiento o la prevención de enfermedades relacionadas con la angiog�nesis y enfermedades mediadas por MMP, tal como se establece en las

30 reivindicaciones.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una composición farmacéutica para uso en inhibir actividades de MMP 2 o MMP 9 (metaloproteinasa de matriz) y angiog�nesis que comprende una fracción de acetato de etilo de hoja de melisa junto con una vehículo

   5 farmac�uticamente aceptable, en la que la hoja de melisa se extrae con etanol o metanol al 70-80 % y se concentra, y después el extracto de etanol o metanol concentrado se suspende en agua y se fracciona con acetato de etilo, y se seca para obtener la fracción de acetato de etilo de hoja de melisa.
2. 2. Una composición farmacéutica para usar en la prevención o el tratamiento de la obesidad, que comprende la

   10 fracción de acetato de etilo de hoja de melisa de la reivindicación 1 junto con un vehículo farmac�uticamente aceptable, causando dicha composición la reducción del tejido adiposo.
3. 3. Una composición farmacéutica para usar en la prevención o el tratamiento de retinopat�a diab�tica, degeneración macular, degeneración macular relacionada con la edad, pterigi�n, degeneración de la retina, neovascularizaci�n de

   15 injerto de córnea, glaucoma neovascular, enfermedad neovascular de la córnea, fibroplasia retrolental, tracoma, úlcera de la córnea, retinopat�a inmadura, queratocono, síndrome de Sjogren, miopía, tumor ocular o rechazo de injerto después de queratoplastia, que comprende la fracción de acetato de etilo de hoja de melisa de la reivindicación 1 junto con un vehículo farmac�uticamente aceptable.

   20 4. Una composición farmacéutica para usar en la prevención o el tratamiento del desarrollo de cáncer y de metástasis que comprende la fracción de acetato de etilo de hoja de melisa de la reivindicación 1 junto con un vehículo farmac�uticamente aceptable.
4. 5. Una composición farmacéutica para usar en la prevención o el tratamiento de hemangioma, angiofibroma,

   25 malformaci�n vascular, arteriosclerosis, adhesión vascular, escleroderma o reestenosis, que comprende la fracción de acetato de etilo de hoja de melisa de la reivindicación 1 junto con un vehículo farmac�uticamente aceptable.
5. 6. Una composición farmacéutica para usar en la prevención o el tratamiento artritis, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis séptica, osteopenia mediada por MMP o pérdida degenerativa de cartílago después de una lesión traumática

   30 articular, que comprende la fracción de acetato de etilo de hoja de melisa de la reivindicación 1 junto con un vehículo farmac�uticamente aceptable.
6. 7. Una composición farmacéutica para usar en la prevención o el tratamiento de psoriasis, telangiestasia, granuloma

   biog�nico, dermatitis seborreica o acné, que comprende la fracción de acetato de etilo de hoja de melisa de la 35 reivindicación 1 junto con un vehículo farmac�uticamente aceptable.
7. 8. Una composición farmacéutica para usar en la prevención o el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer que comprende la fracción de acetato de etilo de hoja de melisa de la reivindicación 1 junto con un vehículo farmac�uticamente aceptable.
8. 9. Una composición farmacéutica para usar en la prevención o el tratamiento de concrescencia anormal de heridas, proteinuria, aneurisma a�rtico abdominal, tejido nervioso desmielinizado, fibrosis hepática, enfermedades nefroglomerulares, ruptura prematura de la membrana fetal o enfermedades periodontales, que comprende la fracción de acetato de etilo de hoja de melisa de la reivindicación 1 junto con un vehículo farmac�uticamente

   45 aceptable.
9. 10. La composición farmacéutica para usar según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 10, estando formulada la composición en una forma de dosificación de gránulos, polvos, comprimidos, comprimidos recubiertos, cápsulas, píldoras, jarabes, gotas, líquidos, soluciones, suspensiones, emulsiones o soluciones inyectables.