ES2473596T3 - Loci de inmunoglobulina humanizada - Google Patents

Abstract

Un vector transgénico que comprende un locus de Ig humanizada, donde dicho locus de Ig humanizada procede de un locus de Ig o de una porción de un locus de Ig de un conejo, que comprende múltiples segmentos génicos de Ig, donde: (a) dichos segmentos génicos son de la SEC ID Nº: 189, 190, 191 y 192; (b) dichos segmentos génicos están yuxtapuestos en una configuración no reordenada, parcialmente reordenada o totalmente reordenada, y (c) dicho locus de Ig humanizada es capaz de someterse a reordenamiento génico, si es necesario, y conversión génica y/o hipermutación, y de producir un repertorio de inmunoglobulinas humanizadas en dicho conejo.

Description

Loci de inmunoglobulina humanizada

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos y a medios para producir anticuerpos humanizados a partir de animales transg�nicos no humanos. La invención se refiere en concreto a nuevas construcciones de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina, a vectores de recombinación y transg�nicos útiles para producir animales transg�nicos no humanos que expresen anticuerpos humanizados, y a animales transg�nicos. Los vectores transg�nicos contienen loci de inmunoglobulina humanizada que son capaces de someterse a reordenamiento g�nico, a conversión g�nica y a hipermutaci�n en animales transg�nicos no humanos para producir anticuerpos humanizados diversificados, mientras se deja la maquinaria reguladora end�gena y de producción de anticuerpos del animal no humano sustancialmente intacta. Los anticuerpos humanizados obtenidos tienen una inmunogenicidad mínima en los seres

15 humanos y son apropiados para usarse en el tratamiento terapéutico de sujetos humanos.

Antecedentes de la invención

Los anticuerpos son una clase importante de productos farmacéuticos que se han usado con éxito en el tratamiento de varias enfermedades y afecciones humanas, tales como c�nceres, enfermedades alérgicas, prevención del rechazo a trasplantes y la enfermedad injerto contra huésped.

Un problema importante asociado con las preparaciones de anticuerpos obtenidas a partir de animales es la inmunogenicidad intrínseca de las inmunoglobulinas no humanas en pacientes humanos. Para reducir la

25 inmunogenicidad de anticuerpos no humanos, se ha demostrado que mediante la fusión de exones de región variable (V) de animal con exones de región constante (C) humana, se puede obtener un gen de anticuerpo quimérico.

Tambi�n se han desarrollado anticuerpos monoclonales humanizados y est�n en uso cl�nico. Los anticuerpos monoclonales humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales se sustituyen algunos restos de CDR y posiblemente algunos restos de FR por restos de sitios análogos en anticuerpos de animales no humanos, por ejemplo roedores. La humanización puede realizarse sustancialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534 (1988)), sustituyendo CDR o secuencias de CDR de animales no humanos, por ejemplo

35 roedores, por las secuencias correspondientes de un anticuerpo monoclonal humano.

Se ha descrito que la eliminación homocig�tica del gen de la región de unión de cadena pesada (JH) de un anticuerpo en ratones quiméricos y en ratones con mutaciones en la línea germinal, da como resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpos end�genos. La transferencia del conjunto de genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana en este tipo de ratones mutantes de línea germinal ocasionar� la producción de anticuerpos humanos tras la exposición a ant�genos. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci Estados Unidos 90: 2551 (1993); Jakobovitset al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993). Aunque este enfoque de ingeniería genética daba como resultado la expresión de polip�ptidos de inmunoglobulina humana en ratones genéticamente modificados, el nivel de expresión de inmunoglobulina humana

45 fue bajo. Esto puede ser debido a elementos reguladores específicos de especie en los loci de inmunoglobulina que son necesarios para la expresión eficaz de inmunoglobulinas. Como se ha demostrado en líneas celulares transfectadas, los elementos reguladores que est�n presentes en los genes de inmunoglobulina humana pueden dejar de funcionar debidamente en animales no humanos.

De hecho, se han descrito varios elementos reguladores en los genes de inmunoglobulina. Son de especial importancia los potenciadores cadena abajo (3') de regiones constantes de cadena pesada y los potenciadores intr�nicos en los genes de cadenas ligeras. Además, hay otros elementos de control, aun por identificar, que pueden estar presentes en los genes de inmunoglobulina. Ciertos estudios en ratones han demostrado que la cola de membrana y la cola citopl�smica de la forma de membrana de las moléculas de inmunoglobulina juegan un papel

55 importante en los niveles de expresión de los anticuerpos quiméricos de ratón-humano en el suero de ratones homocig�ticos para el gen Cy1 humano. Por esta razón, para la expresión de genes de inmunoglobulina heter�logos en animales es deseable reemplazar secuencias que contienen elementos potenciadores y exones que codifican la cola transmembrana (ex�n M1) y la cola citopl�smica (ex�n M2) con secuencias que se encuentran normalmente en el animal en posiciones similares.

Adem�s de las cuestiones planteadas por la inmunogenicidad potencial de los anticuerpos no humanos, el uso de anticuerpos monoclonales en general, ya sean quiméricos, humanizados o humanos, est� limitado adicionalmente por el hecho de que enfermedades devastadoras tales como el cáncer e infecciones con pat�genos virulentos, son difíciles de tratar atacando una sola diana debido a su complejidad, etiolog�a multifactorial y adaptabilidad. Los 65 anticuerpos monoclonales que se dirigen contra dianas singularmente definidas fallan cuando esas dianas cambian, evolucionan y mutan. Por esta razón, las malignidades pueden ganar resistencia a las terapias de anticuerpos

monoclonales estándar. Una solución para este problema es el uso de anticuerpos policlonales, que tienen la capacidad de dirigirse y atacar a una pluralidad de dianas en evolución asociadas con enfermedades complejas. Los anticuerpos policlonales también tienen la capacidad de neutralizar toxinas bacterianas y virales, y dirigir respuestas inmunes directas para destruir y eliminar pat�genos.

5 Por consiguiente, hay una gran necesidad clónica de un nuevo enfoque adecuado para la producción a gran escala de anticuerpos policlonales y monoclonales humanizados de alto título y alta afinidad.

La introducción de genes de inmunoglobulina humana en el genoma de los ratones tuvo como resultado la expresión de un repertorio de anticuerpos humanos diversificados en ratones genéticamente modificados. Tanto en ratones como en seres humanos, la diversidad de anticuerpos primarios se genera mediante reordenación g�nica. Este proceso da como resultado la generación de muchos segmentos V(D)J recombinados diferentes que codifican un gran número de moléculas de anticuerpo con diferentes sitios de unión a ant�genos. Sin embargo, en otros animales como los conejos, los cerdos, las vacas y las aves, la diversidad de anticuerpos primarios se genera mediante

15 mecanismos sustancialmente diferentes, particularmente mutaciones de la cadena molde o conversión g�nica y mutaciones fuera de la cadena molde o hipermutaci�n. Por ejemplo, est� bien establecido que en conejos y en pollos, la reordenación de VDJ est� muy limitada (se genera casi un 90 % de inmunoglobulina con el elemento VH1 3’ proximal) y la diversidad de anticuerpos se genera mediante conversión g�nica e hipermutaci�n. Por el contrario, la conversión g�nica de ratón y humana se produce muy raramente, si es que se produce. Por lo tanto, es de esperar que en animales que diversifican su repertorio de anticuerpos primarios mediante conversión g�nica e hipermutaci�n, un enfoque de ingeniería genética basado en reordenación g�nica dé como resultado animales con títulos bajos de anticuerpos y una diversidad de anticuerpos limitada. De este modo, la ingeniería genética de animales grandes para la producción de preparaciones de anticuerpos sin inmunogenicidad para terapia humana requiere estrategias alternativas de ingeniería genética.

25 La producción de anticuerpos humanizados en animales transg�nicos no humanos se describe en la publicación PCT N� WO 02/12437, publicada el 14 de febrero, 2002. El documento WO 02/12437 describe animales no humanos genéticamente modificados que contienen uno o más loci de inmunoglobulina humanizada que son capaces de someterse a reordenación g�nica y a conversión g�nica en animales no humanos transg�nicos, incluyendo animales en los cuales la diversidad de anticuerpos se genera principalmente mediante conversión g�nica para producir anticuerpos humanizados diversificados. Los anticuerpos humanizados que se obtienen tienen una inmunogenicidad mínima en seres humanos y son apropiados para su uso en el tratamiento terapéutico de sujetos humanos. Se describen adicionalmente nuevas secuencias de nucleótidos de las regiones flanqueantes 5’ y 3’ de segmentos de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de varios mamíferos no humanos tales como pollos, vacas,

35 ovejas y conejos. Se ha demostrado que los vectores recombinantes en los cuales los segmentos g�nicos de cadena pesada de inmunoglobulina humana est�n flanqueados por secuencias homólogas a tales secuencias 5’ y 3’ son útiles para reemplazar un segmento g�nico de cadena pesada de inmunoglobulina de un animal no humano con el correspondiente segmento g�nico de cadena pesada de inmunoglobulina humana.

Sumario de la invención

En un aspecto, la invención se refiere a un vector transg�nico que comprende un locus de inmunoglobulina (Ig) humanizada, donde el locus de Ig humanizada deriva de un locus de Ig o de una porción de un locus de Ig de conejo, que comprende múltiples segmentos de Ig en los que:

(a)

los segmentos g�nicos son de SEC ID N�: 189 (Figura 13a), 190 (Figura 13b), 191 (Figura 13c), 192 (Figura 13d);

(b)

los segmentos g�nicos est�n yuxtapuestos en una configuración que no est� reordenada, que est� parcialmente reordenada o que est� totalmente reordenada, y

(c)

el locus de Ig humanizada es capaz de someterse a reordenación g�nica, si fuese necesario, as� como a conversión g�nica y/o a hipermutaci�n, si el animal no humano es un gen (Figura conversión del animal y producción de un repertorio de inmunoglobulinas humanizadas en el animal no humano.

En una realización específica, el locus de cadena pesada de Ig humanizada comprende más de un segmento g�nico 55 V humano.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para producir un vector transg�nico que comprende un locus de inmunoglobulina (Ig) humanizada capaz de producir un repertorio funcional de anticuerpos humanizados en un animal no humano, que comprende:

(a)

la obtención de un fragmento de ADN que comprende un locus de Ig o una porción del mismo del animal no humano que comprende por lo menos un segmento g�nico V, por lo menos un segmento g�nico J y por lo menos un segmento g�nico de región constante; y

(b)

la integración del segmento g�nico de SEC ID N�: 189 (Figura 13a), 190 (Figura 13b), 191 (Figura 13c) y 192

65 (Figura 13d) en un fragmento de ADN de la etapa (a) para producir una Ig humanizada; en la que (i) los segmentos g�nicos est�n yuxtapuestos en una configuración que no est� reordenada, que est� parcialmente reordenada o que est� totalmente reordenada, y (ii) el locus de Ig humanizada es capaz de someterse a reordenación g�nica, si fuese necesario, y de producir un repertorio de inmunoglobulinas humanizadas en el animal no humano.

5 El locus de Ig humanizada puede ser un locus de cadena pesada de Ig humanizada o un locus de cadena ligera de Ig humanizada. En el caso de que sea un locus de cadena pesada de Ig humanizada, el fragmento de ADN que se obtiene en la etapa (a) comprende adicionalmente por lo menos un segmento g�nico D.

En otro aspecto, la invención se refiere a un conejo transg�nico que comprende un locus de inmunoglobulina humanizada como se describe anteriormente.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un linfocito B de un conejo transg�nico que se produce de acuerdo con la presente invención.

15 En otro aspecto adicional, la invención se refiere a un método para producir una inmunoglobulina humanizada usando un animal transg�nico de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una representación esquemática del locus de cadena pesada del gen de inmunoglobulina de conejo. Las figuras 2-4 muestran una comparación de las secuencias espaciadoras de cadena pesada de conejo. La figura 5 es una representación esquemática del locus de cadena ligera de inmunoglobulina de conejo. La figura 6 ilustra la construcción de un locus de gen V de inmunoglobulina usando VH humana y elementos

25 espaciadores de conejo. Figura 7: inserción de dos cassettes mediante recombinación homóloga usando el sistema red�1y. El cassette superior contiene dos sitios de restricción (Fsel y Ascl) que flanquean un cassette de gentamicina. El cassette inferior contiene un sitio loxP invertido (i) y mutado (71), un sitio FRT y un sitio de restricción Mlul. Después de la modificación, el BAC se dirigiere con Fsel y Ascl. La figura 8 muestra un locus de cadena ligera de conejo humanizada (rLC3-B) basado en el locus de cadena ligera K1 de conejo. Se reemplazó CK1 de conejo con CKhumano. Se insert� VKJKreordenado humano. El VKJK humano sintético comparte más del 80 % de homología de secuencia con elementos VK de conejo. La figura 9a muestra la secuencia de un clon BAC que comprende un locus gen�mico de cadena ligera de pollo cuya secuencia de nucleótidos se muestra en la figura 9b (SEC ID N�: 186).

35 Figura 10: un esquema que muestra la construcción de un locus de inmunoglobulina humanizada usando secuencias espaciadora de inmunoglobulina de pollo y elementos V humanos. Figura 11: un esquema que muestra la construcción de un locus de inmunoglobulina humanizada usando secuencias espaciadoras de inmunoglobulina de ratón o conejo y elementos V humanos. Las figuras 12a a 12c muestran un locus de cadena ligera humanizada. En (a) se muestra una secuencia sintética (Figura 12a, unidad 1, 12.235 pb, SEC ID N�: 187) que contiene 17 pseudogenes V humanos y 18 secuencias espaciadoras de pollo. En (b) se muestra una segunda secuencia sintética (Figura 12b, Unidad 2,

13.283 pb, SEC ID N�: 188) que contiene un fragmento de gen VkJk humano reordenado funcional, 11 pseudogenes V humanos, 12 secuencias espaciadoras de pollo y 2 intrones. Se combinaron las unidades 1 y 2 con un fragmento derivado del BAC 179L 1 que contenía Ck humano e intr�n de conejo y secuencias

45 espaciadoras (Figura 12c). La figura 13a-e muestra un locus de cadena pesada humanizada. Cuatro fragmentos sintéticos de ADN (Unidad 1-4, Figura 13 a-d, SEC ID N�: 189, 190, 191,192) que consistían en fragmentos de gen VH3 humano, espaciador de conejo y secuencias intr�n se combinaron con partes de BAC 219D23, 27N5 y Fos15B como se muestra en (la Figura 13e).

Descripci�n detallada de la invención

A. Definiciones

55 Los "anticuerpos" (Ab) y las "inmunoglobulinas" (Ig) son glicoprote�nas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos muestran especificidad de unión a un ant�geno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a anticuerpos que carecen de especificidad de ant�geno. Los polip�ptidos del último tipo son, por ejemplo, aquellos que se producen en bajos niveles por el sistema linfático y en altos niveles por los mielomas.

Los "anticuerpos e inmunoglobulina nativas" son normalmente glicoprote�nas heterotetram�ricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera est� unida a una cadena pesada mediante uno o más enlaces disulfuro covalentes, aunque el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. 65 Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes de disulfuro intracatenarios separados por distancias regulares. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de varios dominios constantes. Cada

cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en el otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera est� alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera est� alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que ciertos restos de amino�cidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de la cadena ligera y pesada (Clothia et

5 al., J. Mol. Biol. 186:651 (1985); Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 82:4592 (1985)).

El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren considerablemente en la secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su ant�geno particular. Sin embargo, la variabilidad no est� distribuida uniformemente a través de los dominios variables de los anticuerpos. Est� concentrada en tres segmentos llamados regiones determinantes de complementariedad (CDR) o regiones hipervariables tanto en los dominios variables de las cadenas pesadas como en los de las cadenas ligeras. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se llaman regiones marco (FR). Cada uno de los dominios variables de cadenas nativas pesadas y ligeras comprende cuatro regiones FR, conectadas mediante tres CDR. Las CDR de cada cadena se mantienen juntas y muy próximas

15 mediante las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a ant�geno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Rational Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Los dominios constantes no est�n involucrados directamente en la unión de un anticuerpo con un ant�geno, pero presentan varias funciones efectoras tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpo.

La expresión "anticuerpo monoclonal" se usa para referirse a una molécula de anticuerpo sintetizada por un clon único de linfocitos B.

La expresión "anticuerpo policlonal" se usa para referirse a una población de moléculas de anticuerpos sintetizadas

25 por muchos clones de linfocitos B. En una realización específica, los anticuerpos policlonales reconocen varios ep�topos.

Las expresiones "un anticuerpo humanizado" y "una inmunoglobulina humanizada", como se usan en el presente documento, significan una molécula de inmunoglobulina que comprende al menos una porción de una secuencia de polip�ptido de inmunoglobulina humana (o una secuencia de polip�ptido codificado por un segmento g�nico de inmunoglobulina humana). Las moléculas de inmunoglobulina humanizadas se pueden aislar de un animal transg�nico no humano modificado por ingeniería genética para producir moléculas de inmunoglobulina humanizadas. Estas moléculas de inmunoglobulina humanizadas son menos inmunog�nicas en primates, especialmente en seres humanos, con respecto a las moléculas de inmunoglobulina no humanizadas preparadas a

35 partir del animal o preparadas a partir de células derivadas del animal.

La expresión "animal no humano" como se usa en el presente documento incluye, pero no est� limitada a los mamíferos, e incluye, por ejemplo, primates no humanos, conejos, cerdos, aves (por ejemplo, pollos, pavos, patos, gansos y similares), ovejas, cabras, vacas, caballos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). Los animales no humanos preferentes son los animales que crean diversidad de anticuerpos sustancialmente mediante conversión g�nica y/o hipermutaci�n somática, por ejemplo, conejos, cerdos, pájaros (por ejemplo, pollo, pavo, patos, ganso y similares), ovejas, cabras, y vacas. Los animales no humanos particularmente preferentes son el conejo y el pollo.

La expresión "animal no primate" como se usa en el presente documento incluye, pero no est� limitada a, mamíferos 45 distintos de los primates, incluyendo los descritos previamente.

La frase "animales que crean diversidad de anticuerpos sustancialmente mediante conversión g�nica y/o hipermutaci�n" se usa para referirse a animales en los cuales el mecanismo predominante de diversificación de anticuerpos es la conversión g�nica y/o la hipermutaci�n en lugar de la reordenación g�nica.

La expresión "segmento g�nico de Ig" como se usa en el presente documento se refiere a segmentos de ADN que codifican varias porciones de una molécula de Ig, que est�n presentes en la línea germinal de animales y humanos, y que se juntan en linfocitos B para formar genes de Ig reordenados. Por lo tanto, los segmentos g�nicos de Ig, como se usa en el presente documento, incluyen segmentos g�nicos V, segmentos g�nicos D, segmentos g�nicos J

55 y segmentos g�nicos de la región C.

El término "segmento g�nico de Ig humana" como se usa en el presente documento incluye las secuencias que existen naturalmente de un segmento g�nico de Ig humana, formas degeneradas de secuencias que existen naturalmente de un segmento g�nico de Ig humana, as� como también secuencias sintéticas que codifican una secuencia de polip�ptido sustancialmente idéntica al polip�ptido codificado por una secuencia que existe naturalmente de un segmento g�nico de Ig humana. Por "sustancialmente" se entiende que el grado de identidad de secuencias de amino�cidos es de al menos aproximadamente 85 %-95 %. En una realización particular, el segmento g�nico de Ig humana hace que la molécula de inmunoglobulina no tenga inmunogenicidad en seres humanos.

65 Una molécula de inmunoglobulina humanizada específica contiene al menos una porción de una secuencia de polip�ptido de región variable de cadena pesada o ligera humana. Otra molécula de inmunoglobulina específica contiene al menos una porción de una secuencia de polip�ptido de región variable de cadena pesada o ligera humana, y al menos una porción de una secuencia de polip�ptido de dominio constante humano.

5 Por "una preparación de anticuerpos humanizados" se entiende un producto de anticuerpo aislado o un producto anticuerpo purificado preparado a partir de un animal transg�nico no humano (por ejemplo, suero, leche, o yema de huevo, del animal) o a partir de células que proceden de un animal transg�nico no humano (por ejemplo, un linfocito B o una célula de hibridoma).

Una preparación de anticuerpos humanizados puede ser una preparación de anticuerpos policlonales, la cual incluye un repertorio de moléculas de inmunoglobulina humanizada. Una preparación de anticuerpos humanizados también puede ser una preparación de un anticuerpo monoclonal.

Las expresiones "diversidad de anticuerpos" y "repertorio de anticuerpos" se usan indistintamente, y se refieren al 15 total de todas las especificidades de anticuerpos que un organismo es capaz de expresar.

La expresión "secuencia espaciadora" se usa en el presente documento para referirse a cualquier secuencia de nucleótidos no codificante presente en un gen de cadena pesada o ligera de inmunoglobulina. De este modo, el término específicamente incluye secuencias intr�nicas y cualquier otras secuencia no codificante que separe las regiones codificantes dentro de los segmentos V, D, J y segmentos de la región C en un gen de cadena pesada de inmunoglobulina, secuencias intr�nicas y cualquier otra secuencia no codificante que separe las regiones codificantes dentro de los segmentos V y J y segmentos de región C en un gen de cadena ligera de inmunoglobulina, as� como elementos reguladores flanqueantes de secuencias no codificantes, tales como potenciadores, en un gen de cadena pesada o ligera de inmunoglobulina. Además, se incluyen específicamente

25 secuencias no codificantes entre partes codificantes de los exones de una hélice que atraviesa la membrana y potenciadores de cadena pesada y ligera.

Un locus de Ig que tiene la capacidad de someterse a reordenamiento g�nico gen y conversión g�nica también se denomina en el presente documento locus de Ig "funcional", y los anticuerpos con una diversidad generada por un locus de Ig funcional también se denominan en el presente documento anticuerpos "funcionales" o un repertorio de anticuerpos "funcionales".

B. Literatura relevante

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15 Immunol 156: 2163 se describe la diversificación de anticuerpos en ovejas.

C. Descripción detallada

Los genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina comprenden varios segmentos que se codifican por genes individuales y separados mediante secuencias intr�nicas. De este modo, los genes para la cadena pesada de inmunoglobulina humana se encuentran en el cromosoma 14. La región variable de la cadena pesada (VH) comprende tres segmentos g�nicos: Segmentos V, D y J, seguidos por múltiples genes que codifican la región C. La región V est� separada de la región C por un gran espaciador, y los genes individuales que codifican los segmentos V, D y J también est�n separados por espaciadores.

25 Hay dos tipos de cadenas ligeras de inmunoglobulina: K y A. Los genes para la cadena ligera K humana se encuentran en el cromosoma 2 y los genes para la cadena ligera A se encuentran en el cromosoma 22. La región variable de las cadenas ligeras del anticuerpo incluye un segmento V y un segmento J, codificado por segmentos g�nicos separados. En la configuración de línea germinal del gen de cadena ligera K, hay aproximadamente de 100 a 200 genes de región V en reordenamiento lineal, teniendo cada gen su propia secuencia líder, seguidos por aproximadamente 5 segmentos g�nicos J, y el segmento g�nico de región C. Todas las regiones V est�n separadas por intrones, y también hay intrones que separan los segmentos g�nicos V, J y la región C.

La capacidad del sistema inmunitario para proteger contra una infección se basa en una maquinaria genética

35 especializada para crear un repertorio diverso de anticuerpos. Los genes codificantes de anticuerpos en los linfocitos B est�n ensamblados de una manera que permite innumerables combinaciones de sitios de unión en la región variable (V). Se estima que con dichos mecanismos se pueden producir más de 1012 estructuras de unión. En todos los animales, incluyendo los seres humanos, el proceso de creación de anticuerpos comienza mediante la recombinación de segmentos variables (V), de segmentos de diversidad (D) y de segmentos de unión (J) del locus de inmunoglobulina (Ig). Después de esta etapa, dependiendo de las especies animales, se usan dos mecanismos generales para producir las diversas estructuras de unión de los anticuerpos.

En algunos animales, tales como los seres humanos y los ratones, hay múltiples copias de segmentos g�nicos V, D y J en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina y, múltiples copias de segmentos g�nicos V y J en el locus de 45 cadena ligera de inmunoglobulina. La diversidad de anticuerpos en estos animales se genera principalmente por reordenamiento g�nico, es decir, que diferentes combinaciones de segmentos g�nicos forman una región variable de cadena pesada y de cadena ligera reordenadas. En otros animales (por ejemplo conejo, aves, por ejemplo pollo, ganso y pato, oveja, cabra y vaca), sin embargo, el reordenamiento g�nico juega un papel más pequeño en la generación de diversidad de anticuerpos. Por ejemplo, en conejos, solo se usa un número muy limitado de segmentos g�nicos V, la mayoría de las veces los segmentos g�nicos V en el extremo 3’ de la región V, en el reordenamiento g�nico para formar un segmento VDJ contiguo. En pollos, solamente se usan un segmento g�nico V (el que est� adyacente a la región D, o "el segmento g�nico V 3’ proximal"), un segmento D y un segmento J en el reordenamiento de la cadena pesada; y solamente se usan un segmento g�nico V (el segmento V 3’ proximal) y un segmento J en el reordenamiento de la cadena ligera. De este modo, en estos animales hay muy poca diversidad

55 dentro de las secuencias de región variable inicialmente reordenadas que resultan de la diversificación de las regiones de unión. La diversificación adicional de los genes de Ig reordenados se consigue mediante conversión g�nica, un proceso en el cual secuencias cortas que proceden de los segmentos g�nicos V cadena arriba reemplazan secuencias cortas dentro del segmento g�nico V en el gen de Ig reordenado. Se puede generar una diversificación adicional de secuencias de anticuerpo mediante hipermutaci�n.

Las inmunoglobulinas (anticuerpos) se clasifican en cinco clases (IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, cada una con distintos papeles biológicos en la defensa inmunitaria. La más abundante en la sangre y la más potente en respuesta a la infección es la clase IgG. Dentro de la clase IgG humana, hay 4 subclases (isotipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) determinadas por la estructura de las regiones constantes de cadena pesada que constituyen el dominio Fc. Los 65 dominios F(ab) de los anticuerpos se unen a secuencias específicas (ep�topos) presentes sobre los ant�genos, mientras que el dominio Fc de los anticuerpos recluta y activa otros componentes del sistema inmunitario con el fin

de eliminar los ant�genos.

Los anticuerpos se han usado con éxito como agentes terapéuticos desde la década de 1890 cuando se descubrió que el antisuero policlonal obtenido a partir de animales podía tratar infecciones potencialmente mortales en los

5 seres humanos. Se produjo un avance significativo en la investigación de anticuerpos con el desarrollo de métodos para la producción recombinante de anticuerpos, seguido por el desarrollo de técnicas y métodos de humanización de anticuerpos para crear anticuerpos monoclonales totalmente humanos en animales no humanos.

Como consecuencia, recientemente han aparecido anticuerpos monoclonales quiméricos, humanizados y humanos como una clase importante de productos farmacéuticos. Aunque que los fármacos basados en anticuerpos monoclonales son muy eficaces para bloquear una diana particular (por ejemplo, receptor o ligando), ciertas enfermedades devastadores, tales como el cáncer e infecciones con pat�genos virulentos, pueden ser difíciles de tratar debido a su complejidad, a su etiolog�a multifactorial y a su adaptabilidad. Los anticuerpos monoclonales se dirigen a dianas definidas singularmente que cambian, evolucionan y mutan durante la propagación de

15 enfermedades a través de una población o dentro de un individuo. Este tipo de evolución adaptativa es el desafío de los fármacos monoespec�ficos (por ejemplo, los anticuerpos monoclonales), que son eludidos rápidamente por cepas resistentes. Abundan los ejemplos de resistencia bacteriana y viral a los antibióticos de alta potencia, y de c�nceres malignos que desarrollan resistencia a fármacos anticancerosos convencionales, tales como terapias con anticuerpos monoclonales.

Por el contrario, los anticuerpos policlonales tiene la capacidad de unirse y eliminar una pluralidad de dianas en evolución asociadas a enfermedades complejas. Mediante la unión de múltiples ant�genos, los anticuerpos policlonales saturan a la diana y retienen la actividad incluso en caso de mutación del ant�geno. Seguidamente, a través de una cascada de señales, los anticuerpos policlonales inducen una respuesta inmunitaria potente para

25 eliminar el ant�geno, el pat�geno o la célula diana. Estas propiedades hacen que los anticuerpos policlonales sean ideales para el tratamiento de enfermedades infecciosas y cáncer.

Hasta ahora, el uso de anticuerpos policlonales ha estado muy limitado por problemas de suministro o por reacciones no deseadas frente a proteínas no humanas.

La presente invención proporciona un nuevo enfoque de humanización, basado en la humanización selectiva de los elementos codificantes de inmunoglobulinas del translocus de inmunoglobulina (Ig). La creación de este tipo de translocus humano-animal permite la creación de animales transg�nicos que expresen en altos rendimientos anticuerpos (policlonales) humanizados de alta afinidad y diversificados.

35 Como primera etapa, se identifican y se secuencian los loci gen�micos de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina de no humanos, incluyendo no primates. Se determinaron, por ejemplo, las secuencias gen�micas de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina de conejo y pollo, y se muestran en las Figuras 1, 5, y 9.

El análisis del locus gen�mico de cadena pesada de Ig de conejo ha demostrado que la región variable (Vh) de cadena pesada de inmunoglobulina contiene numerosos genes, incluyendo genes funcionales y pseudogenes no funcionales. El alineamiento de 18 genes de Vh ha puesto de manifiesto un alto grado (80-90 %) de identidad de secuencia entre las secuencias g�nicas de región variable de cadena pesada de conejo (Vh1-Vh18). Se ha descubierto que los genes de la región variable de cadena pesada de conejo comparten la máxima homología con el

45 grupo Vh3 de los genes de región variable de cadena pesada humana. Concretamente, la comparación de la secuencia del gen Vh1-a2 de conejo con las secuencias de Vh3-23 humana ha puesto de manifiesto una identidad de secuencia del 72,8 %.

Adem�s, se analizaron las secuencias no codificantes (por ejemplo, intrones) separando las secuencias g�nicas de región variable de cadena pesada de conejo. Las Figuras 2-4 muestran una comparación de secuencias intr�nicas de cadena pesada de conejo. Se ha descubierto que este tipo de secuencias intr�nicas se dividen en dos grupos, y est�n altamente conservadas. Particularmente los miembros de los intrones del Grupo 1 muestran una identidad de secuencia sorprendentemente alta (80-90 %).

55 Se hicieron descubrimientos similares mediante el análisis de secuencias gen�micas de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina de conejo. En particular, los análisis del locus de cadena ligera de inmunoglobulina de conejo han demostrado que la región variable de cadena ligera (VI) contiene numerosos segmentos g�nicos, lo cual muestra un alto grado (80-90 % de identidad de secuencia). Se ha descubierto además que la región variable de cadena ligera de conejo (VK) presenta una alta homología con el grupo VK1 de las secuencias g�nicas de región variable de cadena ligera humana. Se ha descubierto que casi todas las secuencias VK son funcionales y est�n altamente conservadas. A diferencia de lo que ocurre en los genes de región variable de cadena pesada de conejo, se ha descubierto que en los genes de región variable de cadena ligera de conejo las secuencias intr�nicas son heterogéneas.

65 Los estudios similares con secuencias gen�micas de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina de pollo proporcionan resultados análogos.

En el presente documento se han presentado secuencias espaciadoras, las cuales separan las regiones codificantes en un gen de cadena pesada o ligera de un animal no primate. En el presente documento se presentan secuencias espaciadoras de genes de cadena pesada y ligera de animales que crean diversidad de anticuerpos esencialmente

5 mediante conversión g�nica, incluyendo, por ejemplo, los conejos y los pollos. Estas secuencias espaciadoras se usan después para flanquear segmentos g�nicos de cadena pesada o ligera de inmunoglobulina humana usados en el proceso de creación de un locus de inmunoglobulina humanizada.

Las secuencias espaciadoras normalmente comprenden al menos aproximadamente 20 nucleótidos, o al menos aproximadamente 30 nucleótidos, o al menos aproximadamente 40 nucleótidos, o al menos aproximadamente 50 nucleótidos, y normalmente tienen una longitud comprendida entre aproximadamente 20 y 10.000 nucleótidos. Las secuencias espaciadoras pueden contener un tramo contiguo de nucleótidos de longitud apropiada procedente de una secuencia intr�nica natural en un animal no humano (por ejemplo, no primate), o pueden incluir una secuencia artificial, que puede ser, por ejemplo, una secuencia consenso de dos o más secuencias intr�nicas naturales.

15 Las secuencias espaciadoras pueden comprender al menos aproximadamente 20 nucleótidos contiguos (30, 40, 50, etc. hasta 1000 en incrementos de 10 nucleótidos) procedentes de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N�: 1 a 185 (Tabla 1), o procedentes de una secuencia consenso de dos o más secuencias de este tipo. Es posible, pero no es necesario, separar secuencias de cadena pesada o ligera humanas (por ejemplo, secuencias de regiones V, D, J, C) usadas para la humanización mediante secuencias espaciadoras que separan las regiones correspondientes dentro de la secuencia gen�mica del animal no humano (no primate) cuya inmunoglobulina est� humanizada.

En general, la humanización de un locus de inmunoglobulina (Ig) en un animal no humano implica la integración de

25 uno o más segmentos g�nicos de Ig humana en el genoma del animal para crear loci de inmunoglobulina humanizada. De este modo, la creación de un locus de cadena pesada de Ig humanizada implica la integración de uno o más segmentos V y/o D y/o J, y/o segmentos de región C dentro del genoma del animal. De manera similar, la creación de un locus de cadena ligera de Ig humanizada implica la integración de uno o más segmentos V y/o J, y/o segmentos de región C dentro del genoma del animal.

Dependiendo del enfoque que se va a usar, el segmento o segmentos g�nicos de Ig humana pueden integrarse en una localización cromos�mica donde normalmente reside el locus de Ig end�gena del animal, o en un locus diferente del animal. Independientemente de la localización cromos�mica, el locus de Ig humanizada tiene la capacidad de someterse a reordenación g�nica, a conversión g�nica y a hipermutaci�n en el animal no humano, produciendo de

35 esta manera un repertorio diversificado de moléculas de Ig humanizada. Un locus de Ig que tenga la capacidad de someterse a reordenación g�nica y a conversión g�nica también puede denominarse locus de Ig "funcional" y los anticuerpos con una diversidad generada por un locus de Ig funcional también se denominan anticuerpos "funcionales" o repertorio "funcional" de moléculas de anticuerpo.

En el presente documento se presentan moléculas de ácido nucleico que comprenden un segmento g�nico de Ig humana, flanqueado por secuencias de nucleótidos que comprenden al menos aproximadamente 20 nucleótidos contiguos procedentes de una secuencia espaciadora que separa las regiones codificantes en un gen de cadena pesada o ligera de Ig de animal no primate, o procedentes de una secuencia consenso de dos o más secuencias espaciadoras de este tipo. Las secuencias flanqueantes as� como las secciones derivadas de las secuencias

45 espaciadoras dentro de las secuencias flanqueantes pueden ser idénticas o diferentes. Los nucleótidos contiguos derivados de una secuencia espaciadora o de una secuencia consenso de dos o más secuencias espaciadoras se pueden fusionar directamente al segmento g�nico de Ig humana. De forma alternativa, podría haber una secuencia intermedia entre el segmento g�nico de Ig humana y por lo menos una de las secuencias de nucleótidos que originan los espacios. De este modo, por ejemplo, una secuencia flanqueante en el extremo 5’ del segmento g�nico V humano puede incluir una región promotora, que est� unida directamente al segmento g�nico V humano, y la separa de la secuencia espaciadora derivada de la región del nucleótido de al menos 20 nucleótidos.

En el presente documento se presenta un locus de cadena pesada de Ig humanizada en el cual est�n presentes segmentos g�nicos V, D y/o J de cadena pesada humana y/o segmentos de región C en la misma configuración que

55 en el gen original de inmunoglobulina animal no humana, y est�n separados por secuencias que incluyen al menos aproximadamente 20 nucleótidos contiguos procedentes de una secuencia intr�nica que separa las regiones codificantes en un gen de cadena pesada o ligera de Ig de animal no primate.

En el presente documento se presenta un locus de cadena ligera humanizada en el cual segmentos de región C de cadena ligera humana y/o segmentos g�nicos J, y/o segmentos de región V est�n separados por secuencias intr�nicas de animales no humanos (por ejemplo, no primates) en la misma configuración que en el gen original de inmunoglobulina animal no humana original. Las secuencias espaciadoras se diseñan basándose en secuencias no codificantes, por ejemplo intr�nicas, del animal no humano (no primate). Los espaciadores pueden retener las secuencias no codificantes apropiadas del animal no humano (no primate). De forma alternativa, para simplificar la 65 construcción, puede diseñarse una secuencia consenso, diseñada basándose en las secuencias (intrones) no codificantes altamente homólogas, y usarse como una secuencia espaciadora uniforme para la preparación de

m�ltiples segmentos g�nicos de cadena pesada o ligera.

Los fragmentos de ADN que contienen el locus de Ig a humanizar se aíslan a partir de animales que generan diversidad de anticuerpos mediante conversión g�nica, por ejemplo, conejos y pollos. Estos fragmentos grandes de

5 ADN se puede aislar mediante la exploración de una biblioteca de pl�smidos, c�smidos, cromosomas artificiales de levadura (YAC) o cromosomas artificiales bacterianos (BAC), y similares, preparados a partir del ADN gen�mico del animal no humano, por ejemplo, no primate. En un clon de pl�smido o c�smido puede estar contenida una región C entera de animal, que posteriormente se somete a humanización. Los clones de YAC pueden llevar fragmentos de ADN de hasta 2 megabases, por lo tanto, un locus entero de cadena pesada de animal o una porción grande del mismo se puede aislar en un clon de YAC, o se puede reconstruir de manera que est� contenido en un clon de YAC. Los clones de BAC son capaces de llevar fragmentos de ADN de menor tamaño (aproximadamente 150-450 kb). Sin embargo, múltiples clones de BAC que contienen fragmentos solapantes de un locus de Ig pueden humanizarse por separado y posteriormente inyectarse juntos dentro de una célula animal receptora, recombin�ndose los fragmentos solapantes en la célula animal receptora para generar un locus de Ig continuo.

15 Los segmentos g�nicos de Ig humana se pueden integrar en el locus de Ig sobre un vector (por ejemplo, un clon de BAC) por una diversidad de métodos, incluyendo ligamiento de fragmentos de ADN, o la inserción de fragmentos de ADN mediante recombinación homóloga. La integración de los segmentos g�nicos de Ig humana se hace de tal manera que el segmento g�nico de Ig humana se una operativamente a la secuencia del animal hospedador en el transg�n para producir un locus de Ig humanizada funcional, es decir, un locus de Ig con capacidad de reordenamiento g�nico y de conversión g�nica e hipermutaci�n que lleve a la producción de un repertorio diversificado de anticuerpos humanizados.

En una realización, los segmentos g�nicos de Ig humana pueden integrarse en el locus de Ig mediante

25 recombinación homóloga. La recombinación homóloga puede llevarse a cabo en bacterias, levaduras y otras células con una alta frecuencia de acontecimientos de recombinación homóloga. Por ejemplo, una célula de levadura se transforma con un YAC que contiene un locus de Ig de un animal o una porción grande del mismo. Posteriormente, dicha célula de levadura se transforma adicionalmente con un vector de recombinación como se ha descrito anteriormente en el presente documento, que lleva un segmento g�nico de Ig humana unido a una secuencia flanqueante 5’ y a una secuencia flanqueante 3’. Las secuencias flanqueantes 5’ y 3’ en el vector recombinante son homólogas a las secuencias flanqueantes del segmento g�nico de Ig de animal en el YAC. Como resultado de una recombinación homóloga, el segmento g�nico de Ig de animal en el YAC se reemplaza por el segmento g�nico de Ig humana. Como alternativa, una célula bacteriana tal como E. coli se transforma con un BAC que contiene un locus de Ig de animal o una porción grande del mismo. Dicha célula bacteriana se transforma adicionalmente con un

35 vector de recombinación que lleva un segmento g�nico de Ig humana unido a una secuencia flanqueante 5’ y a una secuencia flanqueante 3’. Las secuencias flanqueantes 5’ y 3’ en el vector de recombinación median la recombinación homóloga y el intercambio entre el segmento g�nico de Ig humana en el vector de recombinación y el segmento g�nico de Ig animal en el BAC. Los YAC y BAC humanizados se pueden aislar fácilmente a partir de las células y pueden usarse en la producción de animales transg�nicos.

En el presente documento se proporcionan métodos para producir animales transg�nicos capaces de producir inmunoglobulinas humanizadas.

De acuerdo con la presente invención, un animal transg�nico capaz de fabricar inmunoglobulinas humanizadas se

45 produce introduciendo en una o más células receptoras de un animal uno o más de los vectores transg�nicos descritos anteriormente en el presente documento, que llevan un locus de Ig humanizada, y obteniendo un animal a partir de la célula o células receptoras modificadas genéticamente.

Las células receptoras pueden proceder, por ejemplo, de animales no humanos que generan diversidad de anticuerpos mediante conversión g�nica y/o hipermutaci�n, por ejemplo, aves (tales como pollo), conejos, vacas y similares. En estos animales se usa preferentemente el segmento g�nico V 3’ proximal para la producción de inmunoglobulinas. La integración de un segmento g�nico V humano en el locus de Ig en el vector del transg�n, mediante la sustitución del segmento g�nico V 3’ proximal del animal o al estar situado muy cerca del segmento g�nico V 3’ proximal, da como resultado la expresión de secuencias polipept�dicas de región V humana en la

55 mayoría de las inmunoglobulinas. Como alternativa, se puede insertar un segmento V(D)J humano reordenado en el locus J del locus de inmunoglobulina sobre el vector del transg�n.

Los vectores transg�nicos que contienen un locus de Ig humanizada se introducen en la célula o células receptoras y luego se integran en el genoma de la célula o células receptoras mediante integración aleatoria o mediante integración dirigida.

Para la integración aleatoria, un vector transg�nico que contiene un locus de Ig humanizada puede introducirse en la célula receptora del animal mediante tecnología transg�nica estándar. Por ejemplo, un vector transg�nico puede inyectarse directamente en el pron�cleo de un ovocito fertilizado. También se puede introducir un vector transg�nico 65 mediante la coincubaci�n de esperma con el vector transg�nico antes de la fertilización del ovocito. Se pueden desarrollar animales transg�nicos a partir de ovocitos fertilizados. Otra forma de introducir un vector transg�nico es

transfectando células madre embrionarias y posteriormente inyectando las células madre embrionarias modificadas genéticamente en embriones en desarrollo. Como alternativa, un vector transg�nico (desnudo o en combinación con reactivos facilitadores) puede inyectarse directamente en un embrión en desarrollo. Finalmente, se producen animales transg�nicos quiméricos a partir de los embriones que contienen el transg�n de Ig humanizada integrado en el genoma de por lo menos algunas células somáticas del animal transg�nico.

Un transg�n que contiene un locus de Ig humanizada se integra aleatoriamente en el genoma de las células receptoras (tales como ovocitos fertilizados o embriones en desarrollo) que proceden de cepas de animales con una expresión alterada de genes de inmunoglobulina end�gena. El uso de estas cepas animales permite la expresión preferente de moléculas de inmunoglobulina a partir de locus de Ig transg�nica humanizada. Los ejemplos de estos animales incluyen las cepas de conejo Alicia y Basilea, as� como la cepa de pollo Agammaglobulin�mico, as� como ratones knockout para inmunoglobulina. Como alternativa, pueden emparejarse animales transg�nicos con loci o transgenes de inmunoglobulina humanizada con cepas de animales con alteraciones en la expresión de inmunoglobulinas end�genas. Se puede obtener una descendencia homocig�tica para un locus de Ig end�gena alterada y para un locus de Ig transg�nica humanizada.

Para la integración dirigida, se puede introducir un vector transg�nico en células receptoras de animal apropiadas tales como células madre embrionarias o células somáticas ya diferenciadas. Después, pueden seleccionarse las células en las cuales se ha integrado el transg�n en el genoma animal y ha reemplazado el locus de Ig end�gena correspondiente mediante recombinación homóloga por métodos estándar. Véase, por ejemplo, Kuroiwa et al, Nature Genetics 2004, 6 de junio. Las células seleccionadas después pueden fusionarse con células individuales de transferencia nuclear enucleadas, por ejemplo, ovocitos o células madre embrionarias, células que son totipotentes y capaces de formar un neonato funcional. La fusión se lleva a cabo de acuerdo con técnicas convencionales que est�n bien establecidas. La enucleaci�n de ovocitos y la transferencia nuclear también se pueden llevar a cabo mediante microcirug�a usando pipetas de inyección. (Véase, por ejemplo Wakayama et al., Nature (1998) 394:369.) Las células huevo resultantes después se cultivan en un medio apropiado, y se transfieren a receptores sincronizados para la generación de animales transg�nicos. Como alternativa, las células modificadas genéticamente seleccionadas se pueden inyectar en embriones en desarrollo que posteriormente se convertirán en animales quiméricos.

Adem�s, también puede obtenerse un animal transg�nico capaz de producir inmunoglobulinas humanizadas introduciendo en una o más células receptoras uno o más de los vectores de recombinación descritos anteriormente en el presente documento, que llevan un segmento g�nico de Ig humana, unidos a secuencias flanqueantes 5’ y 3’ que son homólogas a las secuencias flanqueantes del segmento g�nico de Ig end�gena, seleccionando las células en las cuales el segmento g�nico de Ig end�gena se ha reemplazado por el segmento g�nico de Ig humana mediante recombinación homóloga, y produciendo un animal a partir de la célula o células receptoras modificadas genéticamente que han sido seleccionadas.

De manera similar a la inserción diana de un vector transg�nico, en este enfoque las células apropiadas que se usan como células receptoras incluyen células madre embrionarias o células somáticas ya diferenciadas. Un vector de recombinación que lleva un segmento g�nico de Ig humana puede introducirse en dichas células receptoras por cualquier medio factible, por ejemplo, transfecci�n. Después de esto, las células en las que el segmento g�nico de Ig humana ha reemplazado el correspondiente segmento g�nico de Ig end�gena mediante recombinación homóloga, pueden seleccionarse por métodos estándar. Estas células modificadas genéticamente pueden servir como células donadoras de núcleos en un procedimiento de transferencia nuclear para la clonaci�n de un animal transg�nico. Como alternativa, las células madre embrionarias modificadas genéticamente seleccionadas pueden inyectarse dentro de embriones en desarrollo que posteriormente se convertirán en animales quiméricos.

Los animales transg�nicos producidos por cualquiera de los métodos anteriores constituyen otra realización de la presente invención. Los animales transg�nicos tienen por lo menos un, es decir, uno o más, loci de Ig humanizada en el genoma, a partir del cual se produce un repertorio funcional de anticuerpos humanizados.

En una realización específica, la presente invención proporciona conejos transg�nicos que tienen uno o más loci de Ig humanizada en el genoma. Los conejos transg�nicos de la presente invención tienen capacidad de reordenación y conversión g�nica del locus de Ig humanizada y pueden expresar un repertorio funcional de anticuerpos humanizados.

Los pollos transg�nicos tienen capacidad de reordenación y conversión g�nica de loci de Ig humanizada y pueden expresar un repertorio funcional de anticuerpos humanizados.

La región V humanizada comprende al menos dos segmentos g�nicos V humanos flanqueados por secuencias espaciadoras no humanas. Los ratones transg�nicos son capaces de reordenar los elementos V humanos y de expresar un repertorio funcional de anticuerpos.

Una vez creado un animal transg�nico no humano capaz de producir moléculas de inmunoglobulina humanizada diversificadas, se pueden obtener con facilidad inmunoglobulinas humanizadas y preparaciones de anticuerpos humanizados contra un ant�geno mediante la inmunizaci�n del animal con el ant�geno. Se puede usar una variedad de ant�genos para inmunizar un animal hospedador transg�nico. Estos ant�genos incluyen, sin limitación, microorganismos, por ejemplo virus y organismos unicelulares (tales como bacterias y hongos), que est�n vivos, atenuados o muertos, fragmentos de los microorganismos, o moléculas antig�nicas aisladas de los

5 microorganismos.

Los ant�genos bacterianos ejemplares para su uso en la inmunizaci�n de un animal incluyen ant�genos purificados a partir de Staphyloccocus aureus tales como polisac�ridos capsulares de tipo 5 y 8, versiones recombinantes de factores de virulencia tales como la toxina alfa, proteínas de unión a adhesina, proteínas de unión al col�geno y proteínas de unión a fibronectina. Los ant�genos bacterianos ejemplares también incluyen una versión atenuada de

S. aureus, Pseudomonas aeruginosa, enterococos, Enterobacter y Klebsiella pneumoniae, o sobrenadantes de cultivo de estas células bacterianas. Otros ant�genos bacterianos que pueden usarse en la inmunizaci�n incluyen lipopolisac�ridos purificados (LPS), ant�genos capsulares, polisac�ridos capsulares y/o versiones recombinantes de las proteínas de la membrana externa, proteínas de unión a fibronectina, endotoxinas y exotoxinas de Pseudomonas

15 aeruginosa, enterococos, Enterobacter y Klebsiella pneumoniae.

Los ant�genos ejemplares para la generación de anticuerpos contra hongos incluyen versiones atenuadas de hongos

o proteínas de la membrana externa de los mismos, incluyendo dichos hongos, pero sin estar limitados a, Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida tropicalis y Cryptococcus neoformans.

Los ant�genos ejemplares para su uso en la inmunizaci�n para poder generar anticuerpos contra virus incluyen las proteínas de la envuelta y versiones atenuadas de virus que incluyen, entre otros, el virus sincitial respiratorio (VSR) (particularmente la Proteína F), el virus de la Hepatitis C (VHC), el virus de la hepatitis B (VHB), el citomegalovirus (CMV), VEB y VHS.

25 Se pueden generar anticuerpos terapéuticos para el tratamiento del cáncer mediante la inmunizaci�n de animales transg�nicos con células tumorales aisladas o líneas de células tumorales; ant�genos asociados a tumores que incluyen, entre otros, ant�geno Her2-neu (cuyos anticuerpos correspondientes son útiles para el tratamiento del cáncer de mama); ant�genos CD19, CD20, CD22 y CD53 (cuyos anticuerpos correspondientes son útiles para el tratamiento de linfomas de linfocitos B), (3) ant�geno prost�tico específico de membrana (PMSA) (cuyos anticuerpos correspondientes son útiles para el tratamiento del cáncer de pr�stata), y molécula 17-1 A (cuyos anticuerpos correspondientes son útiles para el tratamiento del cáncer de col�n).

Los ant�genos se pueden administrar a un animal hospedador transg�nico de cualquier manera conveniente, con o 35 sin un adyuvante, y pueden administrarse de acuerdo con un programa predeterminado.

Despu�s de la inmunizaci�n, el suero o la leche de los animales transg�nicos inmunizados pueden fraccionarse para la purificación de anticuerpos policlonales de calidad farmacéutica específicos para el ant�geno. En el caso de aves transg�nicas, también se pueden crear anticuerpos fraccionando las yemas de los huevos. Se puede obtener una fracción de inmunoglobulina purificada concentrada mediante cromatograf�a (afinidad, intercambio iónico, filtración en gel, etc.), precipitación selectiva con sales tales como sulfato am�nico, disolventes orgánicos tales como etanol, o pol�meros tales como polietilenglicol.

Para producir un anticuerpo monoclonal, se aíslan células de bazo del animal transg�nico inmunizado y se usan en

45 fusión celular con líneas celulares transformadas para la producción de hibridomas, o se clonan ADNc que codifican anticuerpos mediante técnicas de biología molecular estándar y se expresan en células transfectadas. Los procedimientos para producir anticuerpos monoclonales est�n bien establecidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente Europea 0 583 980 A1 ("Method For Generating Monoclonal Antibodies From Rabbits"), Patente de Estados Unidos N� 4.977.081 ("Stable Rabbit-Mouse Hybridomas And Secretion Products Thereof"), documento WO 97/16537 ("Stable Chicken B-cell Line And Methods of Use Thereof "), y documento EP 0 491 057 B1 ("Hybridoma Which Produces Avian Specific Immunoglobulin G"). Se ha descrito la producción in vitro de anticuerpos monoclonales a partir de moléculas de ADNc clonadas por Andris-Widhopf et al; "Methods for the generation of Chicken monoclonal antibody fragments by phage display", J Immunol Methods 242:159 (2000), y por Burton, D. R., "Phage display", Immunotechnology 1:87 (1995).

55 También son parte de la presente invención las células que proceden de los animales transg�nicos de la presente invención, tales como linfocitos B o líneas celulares establecidas a partir de un animal transg�nico inmunizado contra un ant�geno.

Los anticuerpos monoclonales o policlonales purificados se mezclan con un vehículo farmacéutico apropiado para la administración en primates, especialmente en seres humanos, para proporcionar composiciones farmacéuticas. Los vehículos farmac�uticamente aceptables que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser todos y cada uno de los siguientes: disolventes, medios de dispersi�n, agentes isot�nicos y similares. Salvo en el caso de que cualquier medio convencional, agente, diluyente o vehículo sea perjudicial para el

65 receptor o para la eficacia terapéutica de los anticuerpos contenidos en el mismo, es apropiado su uso en composiciones farmacéuticas. El vehículo puede ser un vehículo líquido, semis�lido, por ejemplo, una pasta, o sólido. Los ejemplos de vehículos incluyen aceites, agua, soluciones salinas, alcohol, azúcar, gel, lípidos, liposomas, resinas, matrices porosas, aglutinantes, cargas, revestimientos, conservantes y similares, o combinaciones de los mismos.

5 Las composiciones de anticuerpos policlonales humanizados usados para la administración generalmente se caracterizan por contener una población de anticuerpos policlonales que tienen concentraciones de inmunoglobulina de 0,1 a 100 mg/ml, más habitualmente de 1 a 10 mg/ml. La composición de anticuerpos puede contener inmunoglobulinas de varios isotipos. Como alternativa, la composición de anticuerpos puede contener anticuerpos de un solo isotipo o de varios isotipos seleccionados.

En casi todos los casos, la composición de anticuerpos consiste en inmunoglobulinas sin modificar, es decir, anticuerpos humanizados preparados a partir del animal sin ninguna modificación adicional, por ejemplo, mediante agentes químicos o enzimas. Como alternativa, la fracción de inmunoglobulina puede someterse a un tratamiento tal como digestión enzim�tica (por ejemplo, con pepsina, papa�na, plasmina, glicosidasas, nucleasas, etc.),

15 calentamiento, etc. y/o fraccionarse adicionalmente.

Las composiciones de anticuerpos generalmente se administran dentro del sistema vascular, convenientemente por vía intravenosa mediante inyección o infusión a través de un catéter implantado en una vena apropiada. La composición de anticuerpos se administra a un ritmo apropiado, que generalmente varía de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 24 horas, más comúnmente de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 6 horas, de acuerdo con el ritmo al que el líquido pueda ser aceptado por el paciente. La administración de la dosis eficaz puede realizarse en una sola infusión o en una serie de infusiones. Se pueden administrar Infusiones repetidas una vez al día, una vez a la semana, una vez al mes o una vez cada tres meses, dependiendo de la vida media de la preparación de anticuerpos y de la indicación clónica. Para aplicaciones en superficies epiteliales, las

25 composiciones de anticuerpos se aplican a la superficie que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para proporcionar el resultado final deseado, y puede repetirse cuando sea necesario. Además, los anticuerpos pueden, por ejemplo, administrarse como una inyección en embolada intramuscular, que puede, pero no necesariamente, ir seguida de una administración continua, por ejemplo, mediante infusión.

Las composiciones de anticuerpos pueden usarse para unirse a y neutralizar entidades antig�nicas presentes en tejidos del cuerpo humano, que causan enfermedades o que provocan respuestas inmunitarias no deseadas o anormales. En el presente documento, una "entidad antig�nica" se define como una entidad que incluye cualquier molécula soluble o unida a la superficie celular, incluyendo proteínas, as� como células, organismos que producen enfermedades infecciosas o agentes que son al menos capaces de unirse a un anticuerpo y preferentemente

35 también son capaces de estimular una respuesta inmunitaria.

La administración de una composición de anticuerpos contra un agente infeccioso como una monoterapia o en combinación con quimioterapia da como resultado la eliminación de partículas infecciosas. Una sola administración de anticuerpos disminuye el número de partículas infecciosas generalmente de 10 a 100 veces, y más comúnmente más de 1000 veces. De manera similar, la terapia con anticuerpos en pacientes con enfermedades malignas empleada como monoterapia o en combinación con quimioterapia reduce el número de células malignas generalmente de 10 a 100 veces, o más de 1000 veces. La terapia se puede repetir durante un periodo de tiempo prolongado para asegurar la completa eliminación de partículas infecciosas, células malignas, etc. En algunos casos, la terapia con preparaciones de anticuerpos se continuar� durante periodos de tiempo prolongados en ausencia de

45 cantidades detectables de partículas infecciosas o de células indeseables. De manera similar, el uso de una terapia de anticuerpos para la modulación de respuestas inmunitarias puede consistir en una administración única o en múltiples administraciones de anticuerpos terapéuticos. La terapia puede continuarse durante periodos de tiempo prolongados en ausencia de cualquier síntoma de enfermedad.

El tratamiento objeto puede emplearse junto con quimioterapia en dosificaciones suficientes para inhibir la enfermedad infecciosa o malignidad. En pacientes con enfermedades autoinmunitarias o que sean receptores de trasplantes, la terapia con anticuerpos puede emplearse junto con una terapia inmunosupresora a dosificaciones suficientes para inhibir las reacciones inmunitarias. La invención se ilustra adicionalmente, pero no est� limitada por ello, por los siguientes ejemplos.

55 Ejemplo 1

Aislamiento y secuenciaci�n de clones de BAC que contienen loci de inmunoglobulina de conejo

Se aisl� ADN de alto peso molecular de conejos a2b5 macho. Los conejos se sacrificaron, se les extrajo el bazo y los riñones y se aclararon en PBS enfriado con hielo. Se extrajeron la grasa y los tejidos conectivos y se procesaron por separado. Los órganos se cortaron en trozos y se homogeneizaron en un homogeneizador Dounce previamente enfriado. El sobrenadante se transfirió a tubos falcon de 50 ml enfriados, se mezclaron con PBS frío y se dej� que los restos de tejido grandes se depositaran en el fondo durante 2 minutos. Las células presentes en el sobrenadante 65 se sedimentaron a 200 g durante 10 min a 4 �C, se lavaron una vez con PBS, se resuspendieron en 1 ml de PBS y se contaron. Se incluyeron en bloques de agarosa grupos de 5 x 106, 5 x 107 y 5 x 108 células usando el kit de

bloques de ADN gen�mico de mamífero CHEF (BIORAD). Para optimizar las condiciones para la digestión parcial con HindIII, los bloques se cortaron en 5 partes iguales y se digirieron con 1 a 10 unidades de HindIII durante varios tiempos y temperaturas. Los mejores resultados se obtuvieron con 2 unidades de HindIII a 4 �C durante 3 horas, o a 37 �C durante 25 minutos. El ADN digerido se fraccion� dos veces su tamaño en un aparato de Electroforesis en Gel

5 de Campo Pulsado (PFGE) usando los siguientes parámetros: retroceso de 6 horas, tiempos de cambio de 15 s; avance de 6 horas, tiempos de cambio de 15 s; avance de 20 horas, tiempos de cambio de 90 segundos; 200 V a 14 � C. El área del gel con el tamaño deseado del ADN parcialmente digerido se cort� y el ADN se aisl� usando gelasa. Se ligaron 11 ng del inserto con 1 ng de pBELOBAC 11 digerido con HindIII y se introdujeron por electroporaci�n en células DH10B. El 1 % de las colonias resultantes se midió usando Notl y revel� un tamaño medio de inserto de 124 Kb. Se aplicaron 1 x 105 clones en filtros de Nylon y se exploraron mediante hibridación con sondas específicas.

Las sondas para la exploración se amplificaron mediante PCR usando ADN gen�mico de conejos, se clonaron en pBlueScript y se verificaron mediante secuenciaci�n. Se diseñaron pares de cebadores (SEC ID N�: 193-208, Tabla 2) de acuerdo con secuencias publicadas. Se aislaron varios BAC que representaban loci de inmunoglobulina de

15 cadena pesada y ligera de conejo y se mapearon (Figuras 1 y 5). Se secuenciaron los BAC 219D23 219D23 (N� de Acceso del GenBank AY386695), 225P18 (N� de Acceso del GenBank AY386697), 27N5 (N� de Acceso del GenBank AY386696), 38A2 (N� de Acceso del GenBank AY386694), 179L1 (N� de Acceso del GenBank AY495827), 215M22 (N� de Acceso del GenBank AY495826), 19 (N� de Acceso del GenBank AY495828) y el F�smido Fos 15 B (N� de Acceso del GenBank AY3866968). Se construyeron bibliotecas gen�micas para secuenciaci�n en pCR-Blunt con un tamaño de inserto de 1,5-2 Kb. Para el análisis de las secuencias se us� el paquete STADEN (Roger Staden, Cambridge, RU). Para la unión y cierre de huecos se usaron los módulos de software pregap y gap4. Para conseguir un ajuste de secuencias de calidad se usaron los paquetes PHRED (Universidad de Washington) y STADEN.

Ejemplo 2

25 Construcción de un loci de cadena pesada de inmunoglobulina de conejo humanizada

Se aislaron clones de BAC y f�smidos que contenían secuencias de loci de cadena pesada de inmunoglobulina de conejo a partir de bibliotecas de ADN gen�mico usando sondas específicas para los segmentos g�nicos constante, variable y de unión o para la región potenciadora 3’. Se secuenciaron los BAC aislados (Figura 1) 27N5 (N� de Acceso del GenBank AY386696), 219D23 (N� de Acceso del GenBank AY386695), 225P18 (N� de Acceso del GenBank AY386697), 38A2 (N� de Acceso del GenBank AY386694) y el f�smido Fos 15B (N� de Acceso del GenBank AY3866968) (Ros et al., Gene 330, 49-59).

35 Se intercambiaron secuencias codificantes de inmunoglobulina seleccionadas por sus equivalentes humanas correspondientes mediante recombinación homóloga en el E. coli mediante clonaci�n ET (E-Chiang Lee et al., Genomics 73, 56-65 (2001); Daiguan Yu et al., PNAS 97, 5978-5983 (2000); Muyrers et al., Nucleic Acids Research 27, 1555-1557 (1999); Zhang et al., Nature Biotechnology 18, 1314-1317 (2000)).

Como alternativa, los fragmentos de ADN se recombinaron mediante ligamiento in vitro y posterior transformación de

E. coli. Los BAC y/o Fos 15B o partes de los mismos se combinaron mediante ligamiento in vitro y transformación, clonaci�n ET, o mediante integración mediada por Cre recombinasa.

Para la clonaci�n ET, los vectores que contenían secuencias diana se utilizaron para transformar una cepa de E. coli 45 resistente a la estreptomicina que contenía las enzimas de recombinación inducibles del fago lambda Reda, Red1 y

y. Estas proteínas de recombinación se expresaron a partir de un pl�smido cotransfectado (células E. coli DH10B con el pl�smido pSC101) o a partir de un profago lambda integrado gen�micamente (cepa DY380 de E. coli). El procedimiento de clonaci�n ET incluía dos etapas de recombinación homóloga.

En una primera etapa, el locus diana se reemplazó por un cassette de selección-contraselecci�n (por ejemplo, neorpsL, que confiere resistencia a neomicina (neo) y sensibilidad a estreptomicina (rpsL)). Después del aislamiento de colonias resistentes a neomicina, se confirm� mediante análisis de enzimas de restricción y secuenciaci�n parcial la inserción del cassette de selección por recombinación homóloga.

55 En una segunda etapa, el cassette de selección rpsL-neo se intercambi� por una nueva secuencia. Se analizaron los clones resistentes a estreptomicina mediante análisis de restricción y secuenciaci�n. Los fragmentos que se usaron para el procedimiento de clonaci�n ET tenían secuencias flanqueantes de 20 a 50 pb de longitud, que eran idénticas a las secuencias diana. Las secuencias que se usaron para el ligamiento tenían sitios apropiados para enzimas de restricción en sus extremos 3’ y 5’. Estos sitios eran sitios que existían de manera natural o se introdujeron mediante PCR usando cebadores que contenían sitios apropiados.

Como alternativa, se generaron las secuencias sintéticamente.

Se construyó una cadena pesada humanizada reemplazando JH de conejo, CI en BAC 219D23 y Cy en BAC 27N5

65 por sus equivalentes humanos correspondientes mediante clonaci�n ET. Las secuencias humanas usadas para los procedimientos de clonaci�n ET se amplificaron mediante PCR a partir de ADN gen�mico humano.

Los segmentos g�nicos humanos CI, C y y JH se amplificaron usando cebadores (SEC ID N�: 209-214, Tabla 2) con homologías de 50 pb con respecto a las secuencias diana de conejo.

5 Después del ligamiento del clon BAC 225P18 con el clon 219D23 y BAC 27N5 con el f�smido 15B, las construcciones ligadas se utilizaron para transformar E. coli y se conectaron mediante inserción mediada por Cre recombinasa. Esto dio como resultado un locus funcional que consistía en 18 genes variables de conejo, una región D de conejo, una región J humana, CI humana, C y humana, Cs de conejo, Co4 de conejo y el elemento potenciador 3’.

Para la generación de animales transg�nicos, los clones BAC humanizados se co-inyectaron por separado como tres BAC solapantes (225 P 18 y 219D23 y BAC 27N5) o como dos BAC solapantes combinados (225P18-219D23 y BAC 27N5-f�smido 15B), o como un BAC (225P18-219D23-27N5-f�smido 15B). Los animales fundadores con transgenes se identificaron mediante PCR.

15 Ejemplo 3

Construcci�n de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada usando fragmentos sintéticos

Se sintetizaron químicamente cuatro fragmentos denominados Unidad 1, Unidad 2, Unidad 3 y Unidad 4 (Figura 13, SEC ID N�: 189-192) con secuencias de V humana y espaciadores de conejo. Cada fragmento estaba flanqueado en posición 5’ por una secuencia de reconocimiento por endonucleasas de restricción Ascl, en posición 3’ por una secuencia lox71 de reconocimiento por Cre recombinasa, seguida por las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción Fse I y Mlul. La Unidad 2 consistía en los genes variables VH3-49, VH3-11, VH3-7, y VH3-15

25 humanos separados por espaciadores de conejo I29-30, I3-4, I2-3 y la mitad 3’ de I1-2 (I1-2B). La Unidad 3 consistía en VH3-48, VH3-43, VH3-64 humanos separados por espaciadores de conejo I1-2A (la mitad 5’ del I1-2), I7-8, I6-7 y la mitad 3’ de I4-5 (I4-5B). La Unidad 4 consistía en VH3-74, VH3-30 y VH3-9 humanos separados por secuencias espaciadoras de conejo I4-5B, I26-27, I11-12 y I17-18.

La Unidad 4 tenía, además de los flancos cadena arriba mencionados anteriormente, una secuencia diana Flp de reconocimiento para recombinasas (FRT), seguida por una secuencia de reconocimiento para endonucleasas de restricción SglfI que precede al sitio Ascl ya mencionado.

La Unidad 1 tenía el gen VH3-23 humano flanqueado en posición 5’ por el espaciador de conejo I1-2, una secuencia

35 diana lox66 para Cre recombinasa y una secuencia de reconocimiento para endonucleasas de restricción Ascl, y flanqueado en posición 3’ por la secuencia espaciadora de conejo IV-C (la mitad 5’) seguida por una secuencia de reconocimiento por endonucleasa Mlul.

Se amplificó por PCR un cassette de selección de gentamicina usando los cebadores SEC ID N�: 215 y 216 (Tabla 2) que contenían sitios Ascl y Fsel y se ligaron en un vector pGEM con un sitio de clonaci�n modificado que incluía los sitios de reconocimiento de endonucleasas Ascl, Fsel y Mlul (pGEM.Genta se modificó mediante PCR usando SEC ID N�: 217 y 218, Tabla 2).

Las Unidades 1, 2 y 3 se clonaron en vectores pGEM.Genta (Promega).

45 La Unidad 4 se subclon� en un vector pBELOBAC11 adaptado (NEB) linealizado con Hind III y amplificado mediante PCR. El cebador directo (SEC ID N�: 219, Tabla 2) tenía sitios de restricción para HindIII, PacI y AatII, y el cebador inverso (SEC ID N�: 220) tenía sitios para Bam HI, MluI y AscI. Los cebadores se diseñaron de tal forma que se elimin� el cassette de selección de cloranfenicol de pBELOBAC11. Además, se amplificó un cassette de selección de neomicina mediante PCR con los cebadores de SEC ID N�: 221 y 222 (Tabla 2) que llevan sitios de restricción Bam HI y Hind III, y se ligó al vector pBELOBAC11 modificado (pBB 11.1).

Las Unidades 1-4 se ensamblaron mediante recombinación mediada por cre como se describe (Mejia et al, Genomics 70(2) 165-70 (2000)). La primera Unidad 1 se clon� en el vector pgem.Genta adaptado, se digirió con Fse

55 I y posteriormente se recirculariz� mediante ligamiento. Esta construcción sin vector se utilizó para transformar E. coli que contenía pBB11.1.Unidad 4 y el pl�smido p706-Cre. Tras la recombinación de la Unidad 1 con pBB11.1.Unidad 4, se seleccionaron los clones positivos (Unidad 4/1) en un medio que contenía kanamicina y gentamicina. Los clones se caracterizaron mediante análisis de restricción usando varias enzimas.

Para la recombinación de la Unidad 2, el inserto de la Unidad 4/1 se escindi� mediante doble digestión con Ascl y Pacl y se clon� en pBELOBAC11 con un enlazador modificado (pBB11.2: modificado mediante PCR usando los cebadores con SEC ID N�: 223 y 224, Tabla 2).

Se linealiz� pBELOBAC11 con HindIII y se amplificó por PCR con un cebador directo que codificaba los sitios de

65 reconocimiento de endonucleasas Pacl y AatII y un cebador inverso que codificaba los sitios de reconocimiento de endonucleasas Mlul y Notl y un sitio diana lox66 para Cre recombinasa. Para el ligamiento con la Unidad 1/4, el

vector pBB11.2 se abrió con Mlul y Pacl.

El pGEM.Genta.Unidad2 se convirtió en una construcción circular sin vector tal como se describe para pGEM.Genta.Unidad1 y se conect� con PBB11.2.Unidad1/4 mediante recombinación mediada por Cre in vivo. 5 Posteriormente, la construcción resultante PBB11.2.Unidad1/4 se prepar� para la recombinación mediada por Cre con la Unidad 3 mediante el reemplazo del sitio loxp de tipo silvestre por un sitio diana lox66 mediante clonaci�n ET (Muyrers et al., Nucleic Acids Research 27, 1555-1557 (1999); Muyers et al Trends Biochem. Sci. 26(5):325-31 (2001)). Se amplificó un cassette de selección de cloranfenicol mediante PCR con cebadores (SEC ID N�: 225 y 226, Tabla 2) que contenían secuencias de 50 pb homólogas a la secuencia diana en BAC. El cebador inverso incluía un sitio lox66. El producto de PCR purificado en gel se utilizó para transformar células que llevaban el BAC diana as� como el pl�smido pSC101, necesario para la recombinación homóloga. Los clones positivos se seleccionaron con cloranfenicol y se confirmaron mediante análisis de restricción y secuenciaci�n. pGEM.Genta.Unidad 3 Se prepar� para la recombinación in vivo tal como se ha descrito anteriormente para las Unidades 1 y 2, y se us� para transformar células que llevaban BAC receptor, as� como el pl�smido P706-Cre. Los clones positivos

15 pBB11.2.Unidad4/1/2/3 se seleccionaron con gentamicina y se confirmaron mediante análisis de restricción. pBB11.2.Unidad4/1/2/3 se modificó adicionalmente mediante clonaci�n ET para generar un sitio diana lox 71. Posteriormente, pBB11.2.Unidad4/1/2/3 se conect� con fragmentos de los BAC 219D23, 27N5 y Fos15B.

Ejemplo 4

Construcci�n de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada usando fragmentos amplificados por PCR

Se amplificaron elementos VH humanos usando ADN gen�mico (ClonTech) y los cebadores de SEC ID N�: 227-248

25 (Tabla 2). Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis en gel y se purificaron en gel usando el kit GENECLEAN (Q-Biogen). Posteriormente, los productos de amplificación se subclonaron en Zero-Blunt TOPO™ (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se confirmaron las secuencias de todos los elementos V amplificados. Para la construcción de la región V humanizada, se amplificaron los elementos V usando ADN plasm�dico como molde y cebadores de SEC ID N�: 249-270 (Tabla 2). Los cebadores directos contenían un sitio Ascl, seguido por un sitio de corte y empalme de conejo. Los cebadores inversos contenían una secuencia señal de recombinación de conejo (RSS) y un sitio de restricción Mlul. Los productos de PCR se purificaron en gel usando el kit GENECLEAN.

Los VH humanos, V3-33, V3-74, V3-49, V3-21, V3-48, V3-73, V3-7 y V3-D no se pudieron aislar mediante PCR y se

35 sintetizaron químicamente (BlueHeron, Bothel, WA). Durante la síntesis se añadieron sitios de restricción y secuencias reguladoras de conejo.

Las secuencias espaciadoras de conejo se amplificaron usando los BAC 38A2 y 225P18 como moldes y los cebadores de SEC ID N�: 271-288 (Tabla 2). BAC 225P18 se sometió a doble digestión con Nhel y se purificó en gel un fragmento de 41 kb. Este fragmento sirvió como molde para la amplificación de los espaciadores V1-2, V2-3, V34, V4-5 y V5-6.

Se digirió BAC 225P18 con BstBI y el molde para los espaciadores V6-7 y V7-8 se purificó en gel. Una doble digestión de BAC 38A2 con PacI y RsrlI permitió la purificación en gel del molde para los espaciadores V21-22 y

45 V22-23.

Las secuencias espaciadoras amplificadas se purificaron en gel y se subclonaron en XL-PCR-TOPO™ (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los elementos VH y las secuencias espaciadoras de conejo se subclonaron en los vectores pGEM modificado (Promega) y pBS (Strategene). El vector pGEM se cort� con NotI y Hind III y se ligó con secuencias de oligonucle�tidos sintetizadas químicamente que contenían sitios FseI, AscI y MluI (Oligo 1: SEC ID N�: 289; Oligo 2: SEC ID N�: 290; Tabla 2). El vector pBS se cort� con SacI y KpnI y se ligó con una secuencia de oligonucle�tidos sintetizada químicamente que contenía los sitios de restricción FseI, AscI y MluI (Oligo1: (SEC ID N�: 291; Oligo 2:

55 SEC ID N�: 292, Tabla 2).

Los cassettes de selección con gentamicina y neomicina se amplificaron usando cebadores (SEC ID N�: 293-296, Tabla 2) con sitios Fsel o Ascl y se ligaron en los vectores pBS y pGEM modificado.

La construcción final se ensambl� en un vector pBeloBAC II modificado. El vector pBeloBAC II se abrió con BamHI y HindIII y los sitios de clonaci�n se modificaron de manera que contuvieran sitios FseI, AscI, MluI, usando una secuencia de oligonucle�tidos sintetizada químicamente (Oligo1: SEC ID N�: 297; Oligo 2: SEC ID N�: 298, Tabla 2).

BAC 219D23 se modificó mediante la introducción de sitios de restricción usando la clonaci�n ET (Muyrers et al.,

65 Nucleic Acids Research 27, 1555-1557 (1999); Muyers et al Trends Biochem. Sci. 26(5): 325-31 (2001)). El cassette de selección de neomicina se amplificó con los cebadores de SEC ID N�: 299 y SEC ID N�: 300 (Tabla 2). El cebador directo contenía un sitio Fsel, y el cebador inverso contenía un sitio Ascl.

El producto de PCR purificado se utilizó para transformar células E. coli que llevaban BAC 219D23 y el pl�smido pSC101 necesario para la recombinación homóloga. Después de la recombinación homóloga del cassette y de los

5 sitios diana en el BAC, se confirmaron los sitios de restricción introducidos mediante análisis de restricción. Posteriormente, el BAC 219D23 modificado se digirió con Fsel y Mlul y el fragmento de 17 Kb resultante (que contenía el cassette de Fsel-Neo-Ascl) se separ� mediante PFGE y se purificó mediante electroeluci�n. Este fragmento purificado se ligó con el vector pBeloBAC II modificado y se abrió con FseI y MluI.

Un fragmento de ADN purificado que codificaba un elemento VH humano se ligó con el vector pGEM.neo modificado abierto con AscI y MluI. De manera similar, una secuencia espaciadora se subclon� en el vector pGEM.genta modificado. Posteriormente, el vector pGEM.genta que llevaba la secuencia espaciadora se cort� con Fsel y Mlul y el inserto se ligó con el vector pGEM.neo.VH abierto con Fsel y Ascl. Esta etapa se repitió varias veces para construir un fragmento que consistía en varios segmentos espaciadores y segmentos VH. Dichos fragmentos se escindieron

15 con Fsel y Mlul y se ligaron con el vector pBbeloBAC II modificado linealizado con Fsel y Ascl. Estos procesos se repitieron para construir una región grande de inmunoglobulina V (Figura 6). El locus de cadena pesada humanizada se us� para la producción de animales transg�nicos.

Ejemplo 5

Construcci�n de un locus de cadena ligera de conejo humanizada que contiene Ck humanizado y VJ reordenado humanizado

La exploración de bibliotecas gen�micas de BAC de conejo dio como resultado la identificación de 3 BAC (215M22,

25 179L1 y 19602; N� de Acceso del GenBank: AY 495826, AY 495827 y AY 495828, respectivamente) que contenían segmentos del gen K1 de la cadena ligera de conejo. Se intercambi� CK1 de conejo por CK humano del alotipo Km3 mediante clonaci�n ET tal como se ha descrito (E-Chiang Lee et al., Genomics 73, 56-65 (2001); Daiguan Yu et al., PNAS 97, 5978-5983 (2000); Muyrers et al., Nucleic Acids Research 27, 1555-1557 (1999); Zhang et al., Nature Biotechnology 18, 1314-1317 (2000)). El CK humano (alotipo Km3) se amplificó mediante PCR con cebadores (SEC ID N�: 301 y 302, Tabla 2) que contenían secuencias de 50 pb homólogas a secuencias diana. Se diseñaron brazos de homología basándose en la secuencia publicada de kappa de línea germinal de conejo (b5; N� de Acceso del GenBank K01363) y coincidían en el límite intr�n-ex�n de CK. El intercambio de CK de conejo frente al CK humano en BAC 179L1 se verificó mediante secuenciaci�n.

35 BAC 179L1-huCk se modificó mediante dos clonaciones ET. Un cassette de selección con neomicina se amplificó con cebadores (SEC ID N�: 303 y 304, Tabla 2) que contenían secuencias de 50 pb homólogas a BAC 179L1. El cebador directo tenía además un sitio i-Ceul para meganucleasas. El producto de PCR se us� para la clonaci�n ET. Se seleccionaron los clones positivos con neomicina y se comprob� que fueran correctos mediante digestión con enzimas de restricción y secuenciaci�n. Un cassette de selección con zeocina se amplificó con cebadores (SEC ID N�: 305 y 306, Tabla 2) que contenían secuencias de 50 pb homólogas a BAC 179L1. El cebador directo tenía además un sitio i-Scel para meganucleasa. El producto de PCR se us� para la clonaci�n ET. Se seleccionaron los clones positivos con zeocina y se comprob� que eran correctos mediante digestión con enzimas de restricción y secuenciaci�n.

45 Se modificó BAC 215M22 mediante una clonaci�n ET. Se amplificó un gen de resistencia a la gentamicina con cebadores (SEC ID N�: 307 y 308, Tabla 2) que contenían secuencias de 50 pb homólogas a BAC215M22. El cebador directo tenía además un sitio i-Ceul para meganucleasa y el cebador inverso tenía un sitio i-Scel para meganucleasa. El producto de PCR se us� para la clonaci�n ET. Los clones resultantes se seleccionaron con gentamicina y se analizaron mediante digestión con enzimas de restricción y secuenciaci�n.

Los BAC179L1 y 225M22 modificados se cortaron con i-Ceul y i-Scel. Se purificaron y se ligaron los fragmentos de 98 kb y de 132 kb. Los clones resultantes se seleccionaron con kanamicina y cloranfenicol y se comprob� que fueran correctos mediante digestión con enzimas de restricción, PCR de las regiones que contenían los sitios de restricción i-Scel y i-Ceul, y secuenciaci�n. El BAC resultante se denomin� 179-215-huCk.

55 Los JK1 y JK2 de conejo del BAC 179-215-huCk se reemplazaron mediante clonaci�n ET por un gen VKJK humano reordenado sintético. Se sintetizó químicamente un fragmento de ADN con un promotor de conejo, un líder de conejo, un intr�n de conejo y un gen VKJK humano. El uso de los codones de VJ humano sintético se optimizó para conseguir la máxima homología de secuencia del ADN para los genes kappa V de conejo.

El VJ humano sintético se amplificó mediante PCR con un cebador directo (SEC ID N�: 309, Tabla 2) que contenía secuencias de 50 pb homólogas a BAC 179L1 y un cebador inverso (SEC ID N�: 310, Tabla 2) que contenía una secuencia homóloga al gen de resistencia a la gentamicina y un sitio FRT. El gen de resistencia a la gentamicina se amplificó con un cebador directo (SEC ID N�: 311, Tabla 2) que contenía un sitio FRT y un cebador inverso (SEC ID 65 N�: 312, Tabla 2) con una homología de 50 pb con BAC 179L1 y un sitio FRT. El VJ humano sintético y el gen de

resistencia a la gentamicina se combinaron mediante PCR de extensión solapada usando el cebador directo para el gen VJ humano sintético y el cebador inverso para el gen de resistencia a la gentamicina. El fragmento resultante se us� para la clonaci�n ET. Los clones positivos se seleccionaron con gentamicina y se comprob� que eran correctos mediante digestión con enzimas de restricción y secuenciaci�n.

5 El gen de resistencia a la gentamicina se elimin� mediante recombinación específica de sitio a través de la expresión de Flp recombinasa. Después de la recombinación se dej� un FRT. El sitio FRT se elimin� mediante clonaci�n ET. A partir del VJ humano sintético se amplificó un fragmento de 232 pb mediante PCR (usando los cebadores de SEC ID N�: 313 y 314, Tabla 2) y se us� para la clonaci�n ET. Las colonias resultantes se exploraron mediante PCR (usando los cebadores con SEC ID N�: 315 y 316, Tabla 2) para comprobar la pérdida del sitio FRT y se confirmaron mediante secuenciaci�n.

Se reemplazó el gen de resistencia a la neomicina de BAC179-215-huCk mediante clonaci�n ET. El gen de resistencia a la gentamicina (pRep-Genta; Genebridges) se amplificó mediante PCR con cebadores (SEC ID N�: 317

15 y 318, Tabla 2) que contenían secuencias de 50 pb homólogas al BAC 179-215-huCk. El cebador directo tenía adicionalmente un sitio loxP, un sitio attB y un sitio de restricción Pvul. Los clones resultantes se seleccionaron con gentamicina y se comprob� que eran correctos mediante digestión con enzimas de restricción y secuenciaci�n.

El BAC resultante (rLC3-B; de la Figura 8) se us� para la generación de animales transg�nicos.

Ejemplo 6

Construcci�n de un locus de cadena ligera de conejo humanizada que contiene múltiples elementos Vk humanos, elementos espaciadores de pollo y un segmento VJ humano reordenado

25 La exploración de bibliotecas gen�micas de conejo de BAC tuvo como resultado la identificación de tres BAC (215M22, 179L1 y 19602; N� de Acceso del GeneBank: AY495826, AY495827 y AY495828, respectivamente) que contenían segmentos del gen K1 de cadena ligera de conejo. Se intercambi� CK1 de conejo por CK humano del alotipo Km3 mediante clonaci�n ET como se ha descrito (E-Chiang Lee et al., Genomics 73, 56-65 (2001); Daiguan Yu et al., PNAS 97, 5978-5983 (2000); Muyrers et al., Nucleic Acids Research 27, 1555-1557 (1999); Zhang et al., Nature Biotechnology 18, 1314-1317 (2000)). Se amplificó CK humano (alotipo Km 3) por PCR con cebadores (SEC ID N�: 301 y 302, Tabla 2) que contenían secuencias de 50 pb homólogas a secuencias diana. Se diseñaron brazos de homología basándose en la secuencia publicada de kappa de la línea germinal de conejo (b5; N� de Acceso del GenBank: K01363) y coincidían con el límite intr�n-ex�n de CK. El intercambio de CK de conejo frente a CK humano

35 en el BAC 179L1 se verificó mediante secuenciaci�n.

Se sintetizaron químicamente dos fragmentos de ADN, Unidad 1 (12.235 pb, Figura 12a, SEC ID N�: 187) que contenía 17 pseudogenes V humanos y 18 secuencias espaciadoras de pollo, y Unidad 2 (13.283 pb, Figura 12b, SEC ID N�: 188) que contenía un gen VJ kappa humano reordenado funcional con líder, 11 pseudogenes V humanos, 12 secuencias espaciadoras de pollo, intr�n 1 y partes del intr�n 2, y se clonaron dentro del vector pBR322.

Las Unidades 1 y 2 se digirieron con la enzima de restricción NgoMIV y AsiSI o NgoMIV y Ascl, respectivamente, y se ligaron dentro de pBELOBAC11 con un enlazador modificado mediante un ligamiento de tres fragmentos. El

45 enlazador modificado contenía un sitio de restricción BsiWI, un sitio FRT5, un cassette rpsl-Neo, un sitio Ascl y un sitio AsiSI. El fragmento enlazador se amplificó con una polimerasa de alta fidelidad (Roche), cebadores CE_1_001_012904 (SEC ID N�: 319, Tabla 2) y CE_1_on005_013004 (SEC ID N�: 320, Tabla 2) y, como molde, el pl�smido pRpsL-Neo (Genebridges). Posteriormente, el producto amplificado se ligó en sitios BamHI y HindIII de pBELOBAC11. Para el ligamiento con las Unidades 1 y 2, el pBELOBAC11 modificado se abrió con AsiSI y Ascl. Los clones positivos se comprobaron mediante productos de digestión de enzimas de restricción.

Se modificó BAC 179L1 (N� de Acceso del GenBank: AY495827) mediante la inserción de dos cassettes de selección modificados por clonaci�n ET. El cassette 1 era un gen de resistencia a la gentamicina amplificado con cebadores (SEC ID N�: 321 y 322, Tabla 2) que contenía secuencias de 50 pb homólogas a BAC 179L1 y un sitio

55 Ascl en el cebador inverso. El cassette 2 era un cassette de selección rpsl-Neo amplificado con cebadores (SEC ID N�: 323 y 324, Tabla 2) que contenían secuencias de 50 pb homólogas a BAC 179L1 y un sitio attB, un sitio FRT5 y un sitio BsiWI en el cebador directo.

Los productos de PCR purificados se utilizaron para transformar células E. coli que llevaban el BAC y el pl�smido pSC101 necesario para la recombinación homóloga. Después de la recombinación homóloga, se confirm� la modificación con éxito del BAC mediante análisis de productos de digestión de restricción, transferencia de Southern y secuenciaci�n.

El BAC 179L1 modificado se cort� con las enzimas de restricción Ascl y BsiWI. Se purificó el fragmento que contenía

65 el CK humano y se ligó con la Unidad 1/2 de pBELOBAC11 abierta con las mismas enzimas de restricción. Los clones positivos se comprobaron mediante productos de digestión de enzimas de restricción. La construcción final (Figura 12c) se us� para la generación de animales transg�nicos.

Ejemplo 7

5 Construcción de un locus de cadena ligera de conejo humanizada que contiene múltiples elementos VK humanos, espaciadores de pollo y un locus J kappa humano no reordenado

La construcción descrita en el ejemplo 6 se modificó mediante clonaci�n ET como se indica a continuación. La secuencia VJ funcional reordenada se intercambi� por un V1 funcional flanqueado por una secuencia señal de recombinación (RSS) funcional. La RSS se amplificó por PCR a partir de BAC 179L1 con un cebador directo (SEC ID N�: 325, Tabla 2) que contenía una secuencia de 50 pb homóloga a V1 de la Unidad 1/2 de pBELOBAC11 y un cebador inverso (SEC ID N�: 326, Tabla 2) que contenía un sitio de enzima de restricción Ascl y homología con el gen de resistencia a la gentamicina. Se amplificó el gen de resistencia a la gentamicina con un cebador directo (SEC ID N�: 327, Tabla 2) que contenía una secuencia homóloga al cebador inverso usado para la amplificación de RSS y

15 un cebador inverso (SEC ID N�: 328, Tabla 2) que contenía una secuencia de 50 pb homóloga a la Unidad 1/2 de pBELOBAC11 y un sitio de enzima de restricción BsiWI.

Se combinaron la RSS y el gen de resistencia a la gentamicina mediante PCR de extensión de solapamiento usando el cebador directo para la amplificación de la RSS y el cebador inverso para la amplificación del gen de resistencia a la gentamicina. El fragmento resultante se us� para modificar la Unidad 1/2 de pBELOBAC11 mediante clonaci�n ET. Los clones positivos se seleccionaron con gentamicina y se analizaron mediante productos de digestión de enzimas de restricción y secuenciaci�n.

BAC 179L1 con CK humano se modificó adicionalmente mediante clonaci�n ET. Se amplificó un cassette de

25 selección por kanamicina con cebadores (SEC ID N�: 329 y 330, Tabla 2) que contenían secuencias de 50 pb homólogas a BAC 179L1. El cebador inverso también contenía un sitio de enzimas de restricción Asel y un sitio FRT. El producto de PCR se us� para la clonaci�n ET. Se amplificó un cassette de selección por ampicilina con cebadores (SEC ID N�: 331 y 332, Tabla 2) que contenían secuencias de 50 pb homólogas a BAC 179L1. El cebador directo también contenía un sitio attB, un sitio de enzimas de restricción AsiSI y un sitio FRT5. El cebador inverso contenía un sitio de enzimas de restricción BsiWI y un sitio FRT. El producto de PCR se us� para la clonaci�n ET. Se amplificó la región J humana a partir de ADN gen�mico humano con cebadores (SEC ID N�: 333 y 334, Tabla 2) que contenían secuencias de 50 pb homólogas a BAC 179L1. El producto de PCR se us� para la clonaci�n ET. Los clones resultantes se analizaron mediante productos de digestión de enzimas de restricción y secuenciaci�n.

35 Un clon positivo se cort� con Ascl y BsiWI. El fragmento resultante se purificó y se ligó en la Unidad 1/2 de pBELOBAC11 modificada cortada con las mismas enzimas. Los clones positivos se seleccionaron con ampicilina y se analizaron mediante productos de digestión de enzimas de restricción y secuenciaci�n. Los clones correctos se usaron para generar animales transg�nicos.

Ejemplo 8

Construcci�n de un locus de cadena ligera de conejo humanizada que contiene múltiples elementos VK humanos.

La exploración de bibliotecas gen�micas de conejo de BAC dio como resultado la identificación de tres BAC

45 (215M22, 179L1 y 19602; N� de Acceso del GenBank: AY495826, AY495827 y AY495828, respectivamente) que contenían segmentos g�nicos K1 de cadena ligera de conejo. Se intercambi� CK1 de conejo por CK humano del alotipo Km 3 mediante clonaci�n ET como se describe (E-Chiang Lee et al., Genomics 73, 56-65 (2001); Daiguan Yu et al., PNAS 97, 5978-5983 (2000); Muyrers et al., Nucleic Acids Research 27, 1555-1557 (1999); Zhang et al., Nature Biotechnology 18, 1314-1317 (2000)). Se amplificó CK humano (alotipo Km3) mediante PCR con cebadores (SEC ID N�: 301 y 302, Tabla 2) que contenían secuencias de 50 pb homólogas a las secuencias diana. Se diseñaron brazos de homología basándose en la secuencia publicada de kappa de la línea germinal de conejo (b5; N� de Acceso del GenBank: K 01363) y coincidían con el límite intr�n-ex�n de CK. El intercambio de CK de conejo frente a CK humano en BAC 179L1 se verificó mediante secuenciaci�n.

55 Se amplificaron los elementos VK humano de la familia VK1 (02, L8, L4, A30, L11, L1, L5, L15, O8, L19, L12, A20, 04, L14, L23, L9, A4, L24, 06, L22, A9, A25, A15, 09) mediante PCR usando cebadores (SEC ID N�: 335-382, Tabla 2) y usando ADN gen�mico humano como molde.

Los productos de amplificación se analizaron mediante electroforesis en gel, se purificaron en gel usando GENECLEAN (Q-Biogen), se subclonaron en vectores Zero-Blunt TOPO™ (Invitrogen) y se secuenciaron. Se produjo un elemento VK (02) JK (J4) humano reordenado mediante amplificación por PCR, se subclon� y se secuenci�. Para combinar elementos VK humanos con espaciadores de conejo, se amplificaron elementos VK humano mediante PCR con cebadores (SEC ID N�: 383-430, Tabla 2) usando ADN plasm�dico como molde. Los cebadores contenían sitios Ascl o Mlul.

65 Las secuencias espaciadoras de conejo se amplificaron mediante PCR usando cebadores SEC ID N�: 431-450 (Tabla 2). Se digirieron los BAC 179L1 y 215 M22 con SpeI, NheI, AclI, SfoI, MluI, y SalI/XhoI. Los fragmentos se purificaron en gel y se usaron como moldes de amplificación.

5 La secuencia espaciadora localizada en el extremo 5 se amplificó por un oligonucle�tido cadena arriba que contenía un FRT y un sitio attB. Los productos de la PCR se purificaron en gel usando el kit GENECLEAN y se subclonaron en XL-PCR-TOPO™ (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los elementos VK humanos y las secuencias espaciadoras de conejo se clonaron en pGEM (Promega) modificado como se describe en el Ejemplo 4.

Se digirieron kappa V humano y el vector pGEM.genta modificado con Ascl y Mlul y se ligaron. De manera similar, se clonaron secuencias espaciadoras de conejo en pGEM.neo. Posteriormente, se cort� VK de pGEM.neo con Fsel y Ascl y se ligó con un inserto purificado del espaciador de pGEM.genta escindido con Fsel y Mlul. El ligamiento de los

15 extremos complementarios Ascl y Mlul destruye el sitio de la enzima de restricción y permite el uso repetido de Ascl y Mlul para la construcción de un locus de VK que comprenda varios VK y elementos espaciadores. La construcción final, que consiste en fragmentos de un BAC 179L1 y 215M22 humanizado y una región VK humanizada se forma en pBeloBAC. Se modificaron BAC 179L1 y el 215M22 y se combinaron. Posteriormente, se modificó adicionalmente BAC 179L1-215M22-huCk mediante clonaci�n ET. Se insertaron dentro del vector dos cassettes que contenían el sitio de la enzima de restricción, marcadores de selección y sitios funcionales adicionales, mediante clonaci�n ET como se muestra en la Figura 7. Los cebadores (SEC ID N�: 451-454) usados para la amplificación de los cassettes se presentan en la Tabla 2.

Para formar la construcción final, se escindieron de pGEM las unidades que consistían en elementos V humanos,

25 elementos espaciadores de conejo y un marcador de resistencia usando Fsel y Mlul, y se ligaron con BAC 179L1215M22 digerido con Fsel y Ascl. Posteriormente, el marcador de resistencia se reemplazó por un nuevo inserto que consistía en elementos V humanos, elementos espaciadores de conejo y otro marcador de resistencia. Después de varias repeticiones, la construcción final consistir� en muchos segmentos Vk (L8, L4, A30, L11, L1, L5, L15, O8, L19, L12, A20, 04, L14, L23, L9, A4, L24, 06, L22, A9, A25, A15, 09) separados por secuencias espaciadoras de conejo. El locus de cadena ligera humanizada se usa para la generación de animales transg�nicos.

Ejemplo 9

Construcci�n de un locus de cadena pesada humanizada con secuencias espaciadoras de un locus de cadena 35 pesada de pollo

Se construyó un locus de cadena pesada humanizada sintético que contenía una región D de conejo, una región J humana, CI humana, Cy humana, Co4 de conejo, el potenciador 3'o de conejo y elementos VH humanos (que incluían secuencias promotoras y secuencias nonam�ricas/heptam�ricas) separadas por secuencias espaciadoras de pollo.

El BAC 27N5 de conejo modificado (véase el Ejemplo 2) se modificó adicionalmente mediante clonaci�n ET. La construcción contenía CI y Cy humanizada y dos sitios de restricción únicos, BsiWI y AsiSI cadena abajo del ex�n de la membrana o-4. El ADN se amplificó con oligonucle�tidos SEC ID N�: 455 y 456 (Tabla 2).

45 El f�smido Fos15B se digirió con Nhel y el fragmento de 13 kb resultante que contenía el potenciador 3'o se subclon� en un vector de clonaci�n de tal forma que el inserto estaba flanqueado por sitios BsiWI y AsiSI. Posteriormente, el inserto se escindi� con BsiWl y AsiSl y se ligó con BAC 27N5 modificado para formar BAC 27N5Fos.

Se intercambi� la región J de conejo en BAC219D23 por la región J humana correspondiente mediante clonaci�n ET. La región J humana se amplificó mediante PCR usando cebadores SEC ID N�: 457 y 458 (Tabla 2).

Se insertaron sitios de enzimas de restricción únicos en BAC219D23 cadena arriba de la región D (A) y cadena

55 arriba de CI (B). En BAC27N5Fos se insert� un sitio de restricción A cadena arriba de la región enlazadora y se insert� un sitio de restricción B en secuencias homólogas a BAC219D23. Después de la digestión con enzimas A y B, se aisl� el fragmento que contenía regiones J humana y D de conejo y se ligó con BAC 27N5Fos para crear BAC 219D23/27N5Fos.

Se amplificaron secuencias espaciadoras de cadena pesada de pollo a partir de ADN gen�mico de pollo mediante PCR usando cebadores (SEC ID N�: 459 y 460, Tabla 2) específicos para los pseudogenes V de cadena pesada de pollo (Mansikka et al., J Immunol 145(11), 3601-3609 (1990), Reynaud et al., Cell 59(1), 171-183 (1989)). Como alternativa, se sintetizaron químicamente secuencias espaciadoras.

65 Los productos de PCR se purificaron en gel, se clonaron en pTOPO (Invitrogen) y se secuenciaron.

Se amplificaron los elementos variables de cadena pesada humana mediante PCR usando cebadores diseñados de acuerdo con las secuencias publicadas en GENBANK (por ejemplo, N� de Acceso NG_001019) o se sintetizaron químicamente. Los elementos V humanos contenían la región promotora humana, la secuencia líder humana y el

5 intr�n humano entre la región líder y la región codificante de V, la región codificante de V humana y la secuencia señal de recombinación humana. Los fragmentos amplificados o sintetizados estaban flanqueados por endonucleasas de restricción específicas para el reconocimiento. Las secuencias espaciadoras de pollo y los elementos V humanos se combinaron en uno o en varios fragmentos grandes de ADN que comprendían un locus de inmunoglobulina humanizada. La construcción se us� para generar animales transg�nicos.

Ejemplo 10

Construcci�n de un locus de inmunoglobulina humanizada que contiene elementos V humanos y secuencias espaciadoras no humanas (sin región promotora y RSS)

15 Se explor� una biblioteca de BAC generada con ADN gen�mico no humano con sondas específicas para inmunoglobulina y se identificaron clones de BAC que contenían regiones C, J y D de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera. Los clones de BAC se modificaron de manera que contuvieran sitios de enzimas de restricción. Se amplificaron elementos variables de cadena pesada y ligera humana mediante PCR usando cebadores diseñados de acuerdo con las secuencias publicadas en GenBank (por ejemplo, N� de Acceso NG_001019). Se amplificaron secuencias a partir de ADN gen�mico o se sintetizaron químicamente. Los elementos V humanos contenían la región promotora humana, la secuencia líder humana, el intr�n humano entre la región líder y la región codificante de V, la región codificante de V humana y la secuencia señal de recombinación humana (RSS). Los fragmentos amplificados o sintetizados tenían en los extremos sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción

25 específicas. Las secuencias espaciadoras no humanas se amplificaron mediante PCR o se sintetizaron químicamente. Se combinaron secuencias espaciadoras no humanas y elementos V humanos en uno o varios fragmentos grandes de ADN que comprendían un locus de inmunoglobulina humanizada. La construcción se us� para generar animales transg�nicos. En la Figura 10 se muestra un ejemplo para la construcción de una región V humanizada usando secuencias espaciadoras de pollo.

Ejemplo 11

Construcci�n de un locus de inmunoglobulina humanizada que contiene elemento V humanos y secuencias espaciadoras no humanas

35 Se explor� una biblioteca de BAC generada con ADN gen�mico no humano con sondas específicas para inmunoglobulina y se identificaron los clones de BAC que contenían regiones C, J y D de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera. Los clones de BAC se modificaron de manera que contuvieran sitios de enzimas de restricción. Se amplificaron los elementos variables de cadena pesada y ligera humana mediante PCR usando cebadores diseñados de acuerdo con las secuencias publicadas en GenBank (por ejemplo, N� de Acceso NG_001019). Las secuencias se amplificaron a partir de ADN gen�mico o se sintetizaron químicamente. Los elementos V humanos contenían la región codificante de V humana. Las secuencias espaciadoras no humanas se amplificaron mediante PCR o se sintetizaron químicamente y contenían una secuencia señal de recombinación, una secuencia espaciadora, una región promotora, una secuencia líder y el intr�n entre la región líder y la región

45 codificante de V. Estas secuencias espaciadoras no humanas se combinaron con elementos V humanos en uno o varios fragmentos grandes de ADN y se usaron para la generación de animales transg�nicos. En la Figura 11 se muestra un ejemplo para la construcción de una región V humanizada usando secuencias espaciadoras de ratón o conejo.

Ejemplo 12

Conejos transg�nicos que expresan inmunoglobulinas humanizadas

Se generaron conejos transg�nicos como se describe por Fan et al. (Pathol. Int 49: 583-594, 1999). En resumen, se

55 estimul� la ovulaci�n de los conejos hembra usando métodos estándar y se aparearon con conejos macho. Se recogieron cigotos en fase pronuclear de los oviductos y se pusieron en un medio apropiado tal como solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco suplementada con suero bovino fetal al 20%. Se microinyectaron BAC que contenían loci de inmunoglobulina humanizada dentro del pron�cleo masculino con la ayuda de un par de manipuladores. Los cigotos supervivientes morfológicamente se transfirieron a los oviductos de conejas pseudopre�adas. El pseudoembarazo se indujo mediante la inyección de gonadotropina cori�nica humana (hCG). Después de la inyección de una construcción de cadena ligera humanizada dentro de 4645 pron�cleos de ovocitos fertilizados, se transfirieron 4043 ovocitos a 132 receptores. En total, nacieron 253 crías vivas, 11 de las cuales eran transg�nicas. Se detect� la expresión de la cadena ligera kappa humana mediante ELISA usando reactivos específicos de cadena ligera kappa humana (por ejemplo, anti-kappa humana de ratón, Southern Biotech, 9220-01;

65 anti-Kappa humana de cabra, Southern Biotech 2063-08).

Se inyect� una construcción de cadena pesada humanizada en 4083 pron�cleos de ovocitos fertilizados. Se trasfirieron 3485 ovocitos a 119 receptores, los cuales produjeron 433 crías. El análisis mediante PCR y FISH revel� que 20 de estos animales eran transg�nicos. Se detect� la cadena pesada humanizada en la sangre de los animales fundadores mediante ELISA, usando anticuerpos específicos para IgM/IgG humana (por ejemplo, anti-IgM humana

5 de conejo, Rockland 609-4131; anti-IgM humana de conejo, Rockland 609-4631; anti-IgG humana de conejo, Pierce 31142, anti-IgG humana de conejo, Southern Biotech 6145-08; anti-IgG humana de conejo, Pierce 31784).

Los ELISA de tipo s�ndwich que detectaron cadenas K, I y y humanizadas se realizaron usando procedimientos estándar. En resumen, se recubrieron placas de microtitulaci�n con anticuerpos de captura y se incubaron con

10 muestras de suero diluido. La inmunoglobulina humana unida se detect� usando un anticuerpo secundario marcado y un conjugado de peroxidasa-estreptavidina (Sigma, S2438).

Se generaron animales bitransg�nicos que expresaban cadenas de inmunoglobulina humanizadas tanto pesadas como ligeras mediante la reproducción de los animales fundadores.

15 Ejemplo 13

Ratones transg�nicos que expresan inmunoglobulinas humanizadas

20 Se generaron ratones transg�nicos como se describe por Nagy et al. (Manipulating The Mouse Embryo: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 2003). En resumen, se estimul� la ovulaci�n de ratones hembra usando métodos estándar y se aparearon con ratones macho. Se recogieron cigotos en fase pronuclear de los oviductos y se pusieron en un medio apropiado tal como el medio M2. Se microinyectaron BAC que contenían loci de inmunoglobulina humanizada en el pron�cleo masculino con la ayuda de un par de

25 manipuladores. Los cigotos supervivientes morfológicamente se transfirieron a los oviductos de hembras de ratón pseudopre�adas. El pseudoembarazo se indujo mediante el apareamiento con machos estériles. Después de la inyección de una construcción de cadena ligera humanizada en 1325 pron�cleos de ovocitos fertilizados, se transfirieron 787 ovocitos a 29 receptores. En total, nacieron 55 crías vivas, 11 de las cuales eran transg�nicas.

30 Se inyect� una construcción de cadena pesada humanizada en 1050 pron�cleos de ovocitos fertilizados. Se transfirieron 650 ovocitos a 25 receptores, que produjeron 64 crías vivas. El análisis mediante PCR revel� que 19 de estos animales eran transg�nicos.

Se generaron animales bitransg�nicos que expresaban cadenas de inmunoglobulina humanizadas tanto pesadas

35 como ligeras mediante la reproducción de los animales fundadores. La expresión de cadenas K, I y y humanizadas se detect� mediante ELISA usando procedimientos estándar. En resumen, se recubrieron placas de microtitulaci�n con anticuerpos de captura y se incubaron con muestras de suero diluido. La inmunoglobulina humana unida se detect� usando un anticuerpo secundario marcado y un conjugado peroxidasa-estreptavidina (Sigma, S2438).

40 Tabla 1

ID

BAC N� de Acceso Comienzo Fin Descripción

1

38A2 AY386694 1 2137 Espaciador inicio 5’-V34

2

38A2 AY386694 2433 9504 Espaciador V34-V33

3

38A2 AY386694 9798 19384 Espaciador V33-V32

4

38A2 AY386694 19690 35164 Espaciador V32-V31

5

38A2 AY386694 35447 47669 Espaciador V31-V30

6

38A2 AY386694 47973 52521 Espaciador V30-V29

7

38A2 AY386694 52819 61798 Espaciador V29-V28

8

38A2 AY386694 62100 74264 Espaciador V28-V27

9

38A2 AY386694 74566 79145 Espaciador V27-V26

10

38A2 AY386694 79449 84800 Espaciador V26-V25

11

38A2 AY386694 85103 95717 Espaciador V25-V24

12

38A2 AY386694 96009 102226 Espaciador V24-V26

13

38A2 AY386694 102504 105307 Espaciador V23-V22

14

38A2 AY386694 105603 107583 Espaciador V22-V24

ID

BAC N� de Acceso Comienzo Fin Descripción

15

38A2 AY386694 107769 118033 Espaciador V24-V20

16

38A2 AY386694 118334 125546 Espaciador V20-V19

17

38A2 AY386694 125849 128059 Espaciador V19-extremo 3'

18

225P18 AY386697 1 4333 Espaciador inicio 5’-V18

19

225P18 AY386697 4629 9255 Espaciador V18-V17

20

225P18 AY386697 9561 15841 Espaciador V17-V16

21

225P18 AY386697 16135 22502 Espaciador V16-V15

22

225P18 AY386697 22794 32821 Espaciador V15-V14

23

225P18 AY386697 33118 37738 Espaciador V14-V13

24

225P18 AY386697 38044 44571 Espaciador V13-V12

25

225P18 AY386697 44865 49447 Espaciador V12-V11

26

225P18 AY386697 49745 56909 Espaciador V11-V10

27

225P18 AY386697 57205 63678 Espaciador V10-V9

28

225P18 AY386697 63977 71204 Espaciador V9-V8

29

225P18 AY386697 71507 76261 Espaciador V8-V7

30

225P18 AY386697 76560 79012 Espaciador V7-V6

31

225P18 AY386697 79308 83467 Espaciador V6-V5

32

225P18 AY386697 83768 88013 Espaciador V5-V4

33

225P18 AY386697 88314 91233 Espaciador V4-V3

34

225P18 AY386697 91531 95929 Espaciador V3-V2

35

225P18 AY386697 96233 100963 Espaciador V2-V1

36

225P18 AY386697 101262 133721 Espaciador V1-D3

37

225P18 AY386697 133752 135212 Espaciador D3-D1a

38

225P18 AY386697 135237 136922 Espaciador D1a-D4

39

225P18 AY386697 136947 139446 Espaciador D4-extremo 3'

40

219D23 AY386695 8151 40612 Espaciador V1-D3

41

219D23 AY386695 40643 42102 Espaciador D3-D1a

42

219D23 AY386695 42127 43812 Espaciador D4-D1b

43

219D23 AY386695 43837 48553 Espaciador D1b-D6

44

219D23 AY386695 48577 48753 Espaciador D6-D8

45

219D23 AY386695 48769 51181 Espaciador D8-D2x

46

219D23 AY386695 51213 55826 Espaciador D1c-Df

47

219D23 AY386695 55852 61112 Espaciador Df-D1d

48

219D23 AY386695 61237 62445 Espaciador D1d-D5

49

219D23 AY386695 62471 97024 Espaciador D5-DQ52

50

219D23 AY386695 97036 97831 Espaciador DQ52-J1

51

219D23 AY386695 97871 98090 Espaciador J1-J2

ID

BAC N� de Acceso Comienzo Fin Descripción

52

219D23 AY386695 98140 98430 Espaciador J2-J3

53

219D23 AY386695 98483 98642 Espaciador J3-J4

54

219D23 AY386695 98690 98981 Espaciador J4-J5

55

219D23 AY386695 99032 99550 Espaciador J5-J6

56

219D23 AY386695 99604 106867 Espaciador J6-IgM ex�n1

57

219D23 AY386695 107185 107290 Espaciador IgM ex�n1-ex�n2

58

219D23 AY386695 107635 107863 Espaciador IgM ex�n2-ex�n3

59

219D23 AY386695 108181 108268 Espaciador IgM ex�n3-ex�n4

60

219D23 AY386695 108664 110499 Espaciador IgM ex�n4-ex�nM1

61

219D23 AY386695 110615 110741 Espaciador ex�nMl-ex�nM2

62

219D23 AY386695 108664 137302 Espaciador IgM ex�n4-extremo 3'

63

27N5 AY386696 5099 55582 Espaciador IgM ex�n4-IgG ex�n1

64

27N5 AY386696 55867 56071 Espaciador IgG ex�n1-ex�n2

65

27N5 AY386696 56104 56201 Espaciador IgG ex�n2-ex�n3

66

27N5 AY386696 56531 56623 Espaciador IgG ex�n3-ex�n4

67

27N5 AY386696 56946 58984 Espaciador IgG ex�n4-ex�nM1

68

27N5 AY386696 56946 59205 Espaciador IgG ex�n4-ex�nM2

69

27N5 AY386696 56946 69246 Espaciador IgG ex�n4-IgE ex�n1

70

27N5 AY386696 69546 69719 Espaciador IgE ex�n1-ex�n2

71

27N5 AY386696 70037 70132 Espaciador IgE ex�n2-ex�n3

72

27N5 AY386696 70453 70532 Espaciador IgE ex�n3-ex�n4

73

27N5 AY386696 70873 73061 Espaciador IgE ex�n4-ex�nM1

74

27N5 AY386696 70873 73292 Espaciador IgE ex�n4-ex�nM2

75

27N5 AY386696 70873 86059 Espaciador IgE ex�n4-IgA4 ex�n1

76

27N5 AY386696 86362 86498 Espaciador IgA4 ex�n1-ex�n2

77

27N5 AY386696 86876 87059 Espaciador IgA4 ex�n2-ex�n3

78

27N5 AY386696 87450 89577 Espaciador IgA4 ex�n3-ex�nM

79

27N5 AY386696 87450 103798 Espaciador IgA4 ex�n3-IgAb ex�n1

80

27N5 AY386696 104101 104231 Espaciador IgA5b ex�n1-ex�n2

81

27N5 AY386696 104609 104787 Espaciador IgA5b ex�n2-ex�n3

82

27N5 AY386696 105182 107227 Espaciador IgA5b ex�n3-ex�nM

83

27N5 AY386696 105182 112077 Espaciador IgA5b ex�n3-ex�nM

84

27N5 AY386696 105182 119223 Espaciador IgA5b ex�n3-IgA1 ex�n1

85

27N5 AY386696 119511 119644 Espaciador IgA1 ex�n1-ex�n2

86

27N5 AY386696 119984 120162 Espaciador IgA1 ex�n2-ex�n3

87

27N5 AY386696 120557 122823 Espaciador IgA1 ex�n3-ex�nM

88

27N5 AY386696 120557 127750 Espaciador IgA1 ex�n3-ex�nM*

ID

BAC N� de Acceso Comienzo Fin Descripción

89

27N5 AY386696 120557 135838 Espaciador IgA1 ex�n3-IgA2 ex�n1

90

27N5 AY386696 136138 136274 Espaciador IgA2 ex�n1-ex�n2

91

27N5 AY386696 136652 136831 Espaciador IgA2 ex�n2-ex�n3

92

27N5 AY386696 137229 139433 Espaciador IgA2 ex�n3-ex�nM

93

27N5 A386696 137229 146676 Espaciador IpA2 ex�n3-extremo 3'

94

Fos15B AY386698 1 828 Espaciador inicio 5’-IgA ex�nM

95

Fos15B AY386698 1043 3596 Espaciador IgA ex�nM-extremo c�ntigo 1

96

Fos15B AY386698 1 3596 Espaciador inicio 5'-extremo c�ntigo 1

97

Fos15B AY386698 7404 7541 Espaciador IgA ex�n1-ex�n2

98

Fos15B AY386698 7908 8086 Espaciador IgA ex�n2-ex�n3

99

Fos15B AY386698 8481 10538 Espaciador IgA ex�n3 -ex�nM

100

Fos15B AY386698 8481 13140 Espaciador IgA ex�n3 extremo c�ntigo2

101

Fos15B AY386698 8481 15871 Espaciador IgA ex�n3 – 1,2 hs pot 3’

102

Fos15B AY386698 8481 21447 Espaciador IgA ex�n3 - 4hs pot

103

Fos15B AY386698 21484 33297 Espaciador 4hs pot-extremo c�ntigo4

104

Fos15B AY386698 16633 33297 Espaciador 1,2hs 3’ pot-extremo c�ntigo4

105

179L1 AY495827 1 124285 Espaciador extremo 5'-pot

106

179L1 AY495827 125411 131350 Potenciador-C

107

179L1 AY495827 131664 134637 EspaciadorC -J5

108

179L1 AY495827 134684 134915 Espaciador J5-J4

109

179L1 AY495827 134952 135196 Espaciador J4=J3

110

179L1 AY495827 135241 135485 Espaciador J3-J2

111

179L1 AY495827 135525 135863 Espaciador J2-J1

112

179L1 AY495827 135897 155257 Espaciador J1-V1

113

179L1 AY495827 155572 170621 Espaciador V1-V2

114

179L1 AY495827 170936 173443 Espaciador V2-V3

115

179L1 AY495827 173752 177227 Espaciador V3-V4

116

179L1 AY495827 177536 185356 Espaciador V4-V5

117

179L1 AY495827 185664 200758 Espaciador V5-V6

118

179L1 AY495827 201064 203580 Espaciador V6-V7

119

179L1 AY495827 203886 205144 Espaciador V7-extremo 3'

120

215M22 AY495826 1 12829 Espaciador 5’ extremo -V6

121

215M22 AY495826 13136 15653 Espaciador V6-V7

122

215M22 AY495826 15957 22241 Espaciador V7-V8

123

215M22 AY495826 22551 32876 Espaciador V8-V9

124

215M22 AY495826 33188 38276 Espaciador V9-V10

125

215M22 AY495826 38582 41476 Espaciador V10-V11

ID

BAC N� de Acceso Comienzo Fin Descripción

126

215M22 AY495826 41780 47827 Espaciador V11-V12

127

215M22 AY495826 48133 48547 Espaciador V12-V13

128

215M22 AY495826 48841 51408 Espaciador V13-V14

129

215M22 AY495826 51638 55438 Espaciador V14-V15

130

215M22 AY495826 55745 67437 Espaciador V15-V16

131

215M22 AY495826 67743 77805 Espaciador V16-V17

132

215M22 AY495826 78120 80628 Espaciador V17-V18

133

215M22 AY495826 80937 84009 Espaciador V18-V19

134

215M22 AY495826 84315 87339 Espaciador V19-V20

135

215M22 AY495826 87648 89399 Espaciador V20-V21

136

215M22 AY495826 89711 95414 Espaciador V21-V22

137

215M22 AY495826 95720 106650 Espaciador V22-V23

138

215M22 AY495826 106956 110940 Espaciador V23-V24

139

215M22 AY495826 111246 117877 Espaciador V24-V25

140

215M22 AY495826 118183 122396 Espaciador V25-V26

141

215M22 AY495826 122706 126496 Espaciador V26-V27

142

215M22 AY495826 126802 133358 Espaciador V27-V28

143

196O2 AY495828 37134 48826 Espaciador V15-V16

144

196O2 AY495828 49032 59195 Espaciador V16-V17

145

196O2 AY495828 115057 125885 Espaciador V28-V29

146

196O2 AY495828 126195 130012 Espaciador V29-V30

147

196O2 AY495828 130318 136966 Espaciador V30-V31

148

196O2 AY495828 137272 144512 Espaciador V31-V32

149

196O2 AY495828 144819 148617 Espaciador V32-V33

150

196O2 AY495828 148923 155402 Espaciador V33-V34

151

196O2 AY495828 155714 171415 Espaciador V34-V35

152

196O2 AY495828 171572 177676 Espaciador V35-V36

153

196O2 AY495828 177979 178083 Espaciador V36-extremo 3'

154

CLC* NA 1 443 Espaciador extremo 5'-pV28**

155

CLC* NA 486 1203 Espaciador pV28-Pv27**

156

CLC* NA 1528 1635 Espaciador pV27-pV26**

157

CLC* NA 1818 2242 Espaciador pV26-pV25**

158

CLC* NA 2585 2676 Espaciador pV25-pV24**

159

CLC* NA 2781 3327 Espaciador pV24-pV23**

160

CLC* NA 3464 3659 Espaciador pV23-pV22**

161

CLC* NA 3985 4241 Espaciador pV22-pV21**

162

CLC* NA 4578 4994 Espaciador pV21-pV20**

ID

BAC N� de Acceso Comienzo Fin Descripción

163

CLC* NA 5366 5425 Espaciador pV20-pV19**

164

CLC* NA 5749 5842 Espaciador pV19-pV18**

165

CLC* NA 6034 7043 Espaciador pV18-pV17**

166

CLC* NA 7266 7493 Espaciador pV17-pV16**

167

CLC* NA 7625 7625 Espaciador pV16-pV15**

168

CLC* NA 7988 8758 Espaciador pV15-pV14**

169

CLC* NA 9100 9410 Espaciador pV14-pV13**

170

CLC* NA 9787 10057 Espaciador pV13-pV12**

171

CLC* NA 10441 11022 Espaciador pV12-pV11**

172

CLC* NA 11380 11911 Espaciador pV11-pV10**

173

CLC* NA 12162 12349 Espaciador pV10-pV9**

174

CLC* NA 12691 13357 Espaciador pV9-pV8**

175

CLC* NA 13708 13882 Espaciador pV8-pV7**

176

CLC* NA 14229 14406 Espaciador pV7-pV6**

177

CLC* NA 14599 15338 Espaciador pV6-pV5**

178

CLC* NA 15613 16578 Espaciador pV5-pV4**

179

CLC* NA 16916 18219 Espaciador pV4-pV3**

180

CLC* NA 18439 18879 Espaciador pV3-pV2**

181

CLC* NA 19248 19343 Espaciador pV2-pV1**

182

CLC* NA 19609 22208 Espaciador pV1-V**

183

CLC* NA 22506 24313 Espaciador V-J

184

CLC* NA 24350 26088 Espaciador J-C

185

CLC* NA 26402 36259 Espaciador C-extremo 3'

* CLC - locus de cadena ligera de pollo SEC ID N�: 184, Figura 9 ** pV - pseudogen de V (no funcional)

Comentarios:

Las secuencias BAC presentadas en el GenBank se modificaron mediante la eliminación de secuencias de vectores en el extremo 5' y 3' como se indica a continuación:

BAC

N� de Acceso Eliminada del extremo 5’ Eliminada del extremo 3’

38A2

AY386694 1-125 1281285-128225

219D23

AY386695 1-54 137357-137389

Fos15B*

AY3866968 1-97 33395-33427

179L1

AY495827 0 205145-205968

196O2

AY495828 1-32 178117-178171

* Adicionalmente, los c�ntigos en el GenBank est�n separados por 50 nt. En la secuencia de Fos15B presentada con la solicitud provisional, los c�ntigos estaban separados por 10 nt.

Tabla 2

ID

Región Secuencia

193

VH1

194

VH1

195

JH

196

JH

197

C y

198

Cy

199

Pot 3’

200

Pot 3’

201

VK

202

VK

203

JK

204

JK

205

C

206

C

207

Pot K3’

208

Pot K3’

209

C

210

C

211

C

212

C y

213

JH

214

JH

215

Genta

216

Genta

217

Enlazador

218

Enlazador

219

pBB11.1

220

pBB11.1

221

Neo

222

Neo

223

pBB11.2

ID

Región Secuencia

224

pBB11.2

225

CA

226

CA

227

VH3-9

228

VH3-9

229

VH3-11

230

VH3-11

231

VH3-13

232

VH3-13

233

VH3-15

234

VH3-15

235

VH3-20

236

VH3-20

237

VH3-23

238

VH3-23

239

VH3-30

240

VH3-30

241

VH3-43

242

VH3-43

243

VH3-64

244

VH3-64

245

VH3-66

246

VH3-66

247

VH3-72

248

VH3-72

249

VH3-9

250

VH3-9

251

VH3-11

252

VH3-11

253

VH3-13

254

VH3-13

255

VH3-15

ID

Región Secuencia

256

VH3-15

257

VH3-20

258

VH3-20

259

VH3-23

260

VH3-23

261

VH3-30

262

VH3-30

263

VH3-43

264

VH3-43

265

VH3-64

266

VH3-64

267

VH3-66

268

VH3-66

269

VH3-72

270

VH3-72

271

V1-2

272

V1-2

273

V2-3

274

V2-3

275

V3-4

276

V3-4

277

V4-5

278

V4-5

279

V5-6

280

V5-6

281

V6-7

282

V6-7

283

V7-8

284

V7-8

285

V21-22

286

V21-22

ID

Región Secuencia

287

V22-23

288

V22-23

289

Enlazador

290

Enlazador

291

Enlazador

292

Enlazador

293

Genta

294

Genta

295

Neo

296

Neo

297

Enlazador

298

Enlazador

299

Neo

300

Neo

301

CK Km3

302

CK Km3

303

Neo

304

Neo

305

Zeo

306

Zeo

307

Genta

308

Genta

309

VJ

ID

Región Secuencia

310

VJ

311

Genta

312

Genta

313

FRT

314

FRT

315

FRT

316

FRT

317

Genta

318

Genta

319

Enlazador

320

Enlazador

321

Genta

322

Genta

323

Neo

324

Neo

325

RSS

326

RSS

327

Genta

328

Genta

ID

Región Secuencia

329

Kana

330

Kana

331

Amp

332

Amp

333

Región J

334

Región J

335

02

336

O2

337

L8

338

L8

339

L4

340

L4

341

A30

342

A30

343

L11

344

L11

345

L1

346

L1

347

L5

348

L5

349

L15

350

L15

351

O8

352

O8

353

L19

354

L19

355

L12

356

L12

357

A20

358

A20

ID

Región Secuencia

359

O4

360

O4

361

L14

362

L14

363

L23

364

L23

365

L9

366

L9

367

A4

368

A4

369

L24

370

L24

371

O6

372

O6

373

L22

374

L22

375

A9

376

A9

377

A25

378

A25

379

A15

380

A15

381

O9

382

O9

383

O2

384

O2

385

L8

386

L8

387

L4

388

L4

389 7

A30

390

A30

391

L11

ID

Región Secuencia

392

L11

393

L1

394

L1

395

L5

396

L5

397

L15

398

L15

399

O8

400

O8

401

L19

402

L19

403

L12

404

L12

405

A20

406

A20

407

O4

408

O4

409

L14

410

L14

411

L23

412

L23

ID

Región Secuencia

413

L9

414

L9

415

A4

416

A4

417

L24

418

L24

419

O6

420

O6

421

L22

422

L22

423

A9

424

A9

425

A25

426

A25

427

A15

428

A15

429

O9

430

O9

431

V7-8

432

V7-8

433

V11-10

434

V11-10

435

V15-14

ID

Región Secuencia

436

V15-14

437

V18-17

438

V18-17

439

V19-18

440

V19-18

441

V20-19

442

V20-19

443

V21-20

444

V21-20

445

V24-23

446

V24-23

447

V26-25

448

V26-25

449

V27-26

450

V27-26

451

Genta

452

Genta

453

Higro

454

Higro

455

456

457

JH

458

JH

459

Espaciador

460

Espaciador

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un vector transg�nico que comprende un locus de Ig humanizada, donde dicho locus de Ig humanizada procede

   de un locus de Ig o de una porción de un locus de Ig de un conejo, que comprende múltiples segmentos g�nicos de 5 Ig, donde:

   (a)

   dichos segmentos g�nicos son de la SEC ID N�: 189, 190, 191 y 192;

   (b)

   dichos segmentos g�nicos est�n yuxtapuestos en una configuración no reordenada, parcialmente reordenada

   o totalmente reordenada, y

   10 (c) dicho locus de Ig humanizada es capaz de someterse a reordenamiento g�nico, si es necesario, y conversión g�nica y/o hipermutaci�n, y de producir un repertorio de inmunoglobulinas humanizadas en dicho conejo.
2. 2. Un método para fabricar un vector transg�nico que comprende un locus de inmunoglobulina humanizada capaz

   de producir un repertorio funcional de anticuerpos humanizados en un conejo, que comprende: 15

   (a)

   obtener un fragmento de ADN que comprende un locus de Ig o una porción del mismo a partir de dicho conejo, que comprende al menos un segmento g�nico V, al menos un segmento g�nico J y al menos un segmento g�nico de región constante; y

   (b)

   integrar el segmento g�nico de SEC ID N�: 189, 190, 191 y 192 dentro del fragmento de ADN de la etapa (a)

   20 para producir un locus de Ig humanizada; donde (i) los segmentos g�nicos est�n yuxtapuestos en una configuración no reordenada, parcialmente reordenada o totalmente reordenada, y (ii) el locus de Ig humanizada es capaz de someterse a reordenamiento g�nico, si es necesario, conversión g�nica y/o hipermutaci�n, y de producir un repertorio de inmunoglobulinas humanizadas en dicho conejo.

   25 3. Un conejo transg�nico que comprende el locus de inmunoglobulina humanizada presente en el vector transg�nico de la reivindicación 1, y que conserva una maquinaria de regulaci�n end�gena y de producción de anticuerpos esencialmente intacta.

3. 4.

   Un linfocito B procedente del conejo transg�nico de la reivindicación 3, que comprende el locus de 30 inmunoglobulina humanizada presente en el vector transg�nico de la reivindicación 1.

4. 5. Un método para producir una inmunoglobulina humanizada usando el animal transg�nico de la reivindicación 3.

5. 6.

   El método de la reivindicación 5, caracterizado por que la inmunoglobulina humanizada es un anticuerpo. 35

6. 7. El método de la reivindicación 6, caracterizado por que la inmunoglobulina humanizada es un anticuerpo policlonal.
7. 8. El método de la reivindicación 6, caracterizado por que la inmunoglobulina humanizada es un anticuerpo 40 monoclonal.