ES2475540T3 - Procedimiento de diagnóstico de poliquistosis renal - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de diagnóstico de un trastorno renal, que comprende detectar una proteína relacionada con Frizzled secretada (sFRP) en una muestra que contiene orina o suero obtenida de un individuo que sufre del trastorno renal o que es sospechoso de sufrir del trastorno renal, en el que dicha sFRP es proteína relacionada con Frizzled secretada 5 (sFRP5) y en el que dicho trastorno renal es poliquistosis renal (PQR).
Description
Procedimiento de diagnóstico de poliquistosis renal
La presente invención se refiere al diagnóstico de poliquistosis renales (PQR). La invención proporciona procedimientos de diagnóstico de poliquistosis renales.
La poliquistosis renal (PQR) es una enfermedad hereditaria común asociada a insuficiencia renal. Aunque el crecimiento de quistes y la compresión del tejido circundante pueden explicar algo de pérdida de tejido renal, la naturaleza de la insuficiencia renal progresiva en pacientes con PQR es desconocida.
La poliquistosis renal dominante autos�mica (PQRAD) se produce en aproximadamente 1 de 1000 seres humanos y produce enfermedad renal terminal (IRT) en más del 50 % de todos los pacientes afectados. La formación de quistes se inicia durante la embriog�nesis, pero normalmente no pone en peligro la función renal hasta más tarde en la vida. Las mutaciones de tanto PQR1 como PQR2 producen la enfermedad, pero sigue siendo inalcanzable por qué los quistes presentes en menos de un uno por ciento de todas las nefronas producen insuficiencia renal. Aunque la proliferaci�n persistente, la secreción de fluido y la expansión de quistes pueden dañar el tejido circundante por cambios reactivos de la matriz extracelular, la apoptosis aumentada del par�nquima sano parece ser el principal culpable de la insuficiencia renal progresiva. Las células epiteliales aisladas de riñones qu�sticos muestran un aumento de los niveles de expresión proto-oncog�nica, una localización errónea de proteínas de la membrana integrales y una secreción de fluidos activa, pero estas alteraciones no explican la pérdida acelerada de tejido acelerada in vivo.
Se est�n desarrollando medicamentos de los que puede esperarse un efecto terapéutico en el tratamiento de PQR (por ejemplo, antagonistas del receptor de vasopresina 2 e inhibidores de mTOR). Los estudios cl�nicos de fase II/III para estas sustancias se iniciarán el próximo año. Sin embargo, todavía no se sabe cómo podría monitorizarse la eficiencia terapéutica a corto plazo (es decir, dentro de un periodo de aproximadamente uno a aproximadamente cuatro años). Como la enfermedad se desarrolla durante el transcurso de muchos años, es difícil determinar si una intervención terapéutica inhibir� eficientemente o no la progresión de la enfermedad. Actualmente, la medición de la cantidad de creatinina en suero (eliminación de creatinina) como marcador de la función renal es el único procedimiento disponible. Sin embargo, este procedimiento tiene la desventaja de que la función renal sigue normal aunque los quistes ya se hayan desarrollado espectacularmente con el transcurso de los años. Como consecuencia, la medición de creatinina en suero no es adecuada para monitorizar la progresión de PQR o para determinar la eficiencia terapéutica de un medicamento.
Por tanto un objeto de la presente divulgación es proporcionar un procedimiento para determinar la eficiencia de un tratamiento terapéutico de PQR. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para diagnosticar PQR.
Se ha descubierto de manera sorprendente que la formación de quistes est� asociada a un aumento de la producción y la acumulación de proteína relacionada con Frizzled secretada 4 (sFRP4). La sFRP4 es un miembro de una familia en desarrollo de moléculas solubles que se unen tanto a moléculas de Wnt como de Frizzled. La sFRP4 es un factor soluble que antagoniza la se�alizaci�n de Wnt y produce apoptosis. Además, se ha encontrado inesperadamente que la sFRP4 y otros miembros de la familia de las proteínas relacionadas con Frizzled secretadas est�n presentes en el suero y se excretan en la orina de pacientes con PQR y que la producción de sFRP4 establece una correlación con el grado del volumen de quistes y la fase de insuficiencia renal. Además, la sFRP5 puede detectarse específicamente en la orina de pacientes con PQR.
Por tanto la presente invención se refiere a un procedimiento para diagnosticar un trastorno renal, que comprende detectar al menos sFRP5 en una muestra que contiene orina o suero obtenida de un individuo que sufre del trastorno renal o que se sospecha de que sufre del trastorno renal; en el que el trastorno renal es poliquistosis renal (PQR). La PQR puede asociarse a o producirse por mutaciones en el (los) gen(es) PQR1 y/o PQR2.
Donauer y col. (2003), Journal of the American Society of Nephrology, vol. 14, Abstracts issue, página 106A, describen que el ARNm de sFRP4 est� regulado al alza en riñones extirpados de pacientes con poliquistosis renal (PQR). Sin embargo, solo se detect� ARNm, pero no proteína. En muchos casos, la verificación de datos de micromatrices ha revelado que el ARNm de genes regulados al alza no se traduce necesariamente en un aumento de la producción de proteína. Segundo, los riñones examinados en ese documento se extirparon de pacientes con insuficiencia renal terminal (IRT). Los hallazgos en esta población no reflejan necesariamente los cambios en la expresión g�nica y la producción de riñones con PQRAD funcionantes. Tercero, la detección de sFRP4 por RT-PCR no implica complejos anticuerpoant�geno, pero se basa completamente en la transcripción inversa de ARNm en ADNc y la detección de este ADNc por PCR y electroforesis en gel. La inmunoqu�mica no se realizó para sFRP4. La presente divulgación no se refiere al descubrimiento de que el ARNm est� regulado al alza en pacientes con PQR con insuficiencia renal terminal, sino que se basa en un aumento de la producción de sFRP4 en pacientes con PQR con riñones funcionantes. Es probable que numerosos genes sean inducidos por uremia y/o terapia de reemplazo renal y la especificidad sigue siendo cuestionable. En la técnica anterior no se ha informado del hallazgo de que la sFRP4 as� como otros miembros de la familia de sFRP, sean detectables en la orina y la sangre de pacientes con riñones funcionantes.
Berndt y col. (2003) The Journal of Clinical Investigation 112(5), 785 describen estudios sobre la actividad fosfat�rica de sFRP4. Sin embargo, estos estudios no se relacionaron con PQR. Además, este documento no revela que la sFRP4 pueda estar presente en el suero o la orina de sujetos que sufren de una enfermedad renal.
Zheng y col. (J. Am. Soc. Nephrol. 14: 2588-2595, 2003) describen estudios sobre la excreci�n urinaria de la proteína quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-1) en PQRAD. Esta publicación no divulga la detección de sFRP4 ni de sFRP5.
5 El documento US 2003/0143610 A1 describe procedimientos de diagnosticar y tratar trastornos metabólicos que incluyen diabetes caracterizada por actividad SARP3 aberrante.
El documento EP 879 885 A1 describe un gen humano novedoso similar a una proteína murina secretada sFRP-1. También se divulgan procedimientos para producir polip�ptidos llamados ATG-1009 y procedimientos para utilizar estos polip�ptidos en tratar diversos trastornos y ensayos diagnósticos para tales afecciones.
10 Los términos “proteína relacionada con Frizzled secretada” y “sFRP” se usan indistintamente en este documento. Las sFRP incluyen, pero no se limitan a, sFRP1, sFRP2, sFRP3, sFRP4 y sFRP5. La sFRP puede unirse preferentemente tanto a moléculas de Wnt como a una o más de Frizzled.
El término “proteína relacionada con Frizzled secretada 1” o “sFRP1” denota una proteína que tiene sustancialmente la secuencia de amino�cidos que se muestra en SEC ID N.�: 1 (Figura 7). Preferentemente, la sFRP1 es una proteína que 15 consiste sustancialmente en la secuencia de amino�cidos que se muestra en SEC ID N.�: 1. La sFRP1 también incluye variantes de proteínas de la secuencia que se muestra en SEC ID N.�: 1 por ejemplo debidas a variación al�lica. Las variantes pueden tener mutaciones con respecto a la secuencia que se muestra en SEC ID N.�: 1 por ejemplo sustituciones, adiciones y/o deleciones. Uno de 30, o uno de 20, o uno de diez, o uno de cinco, o uno de tres amino�cidos pueden estar sustituidos, delecionados y/o añadidos con respecto a la secuencia que se muestra en SEC
El término “proteína relacionada con Frizzled secretada 2” o “sFRP2” denota una proteína que tiene sustancialmente la secuencia de amino�cidos que se muestra en SEC ID N.�: 2 (Figura 7). Preferentemente, la sFRP2 es una proteína que consiste sustancialmente en la secuencia de amino�cidos que se muestra en SEC ID N.�: 2. La sFRP2 también incluye variantes de proteínas de la secuencia que se muestra en SEC ID N.�: 2 por ejemplo debidas a variación al�lica. Las
25 variantes pueden tener mutaciones con respecto a la secuencia que se muestra en SEC ID N.�: 2 por ejemplo sustituciones, adiciones y/o deleciones. Uno de 30, o uno de 20, o uno de diez, o uno de cinco, o uno de tres amino�cidos pueden estar sustituidos, delecionados y/o añadidos con respecto a la secuencia que se muestra en SEC ID N.�: 2.
El término “proteína relacionada con Frizzled secretada 3” o “sFRP3” denota una proteína que tiene sustancialmente la
30 secuencia de amino�cidos que se muestra en SEC ID N.�: 3 (Figura 7). Preferentemente, la sFRP3 es una proteína que consiste sustancialmente en la secuencia de amino�cidos que se muestra en SEC ID N.�: 3. La sFRP3 también incluye variantes de proteínas de la secuencia que se muestra en SEC ID N.�: 3 por ejemplo debidas a variación al�lica. Las variantes pueden tener mutaciones con respecto a la secuencia que se muestra en SEC ID N.�: 3 por ejemplo sustituciones, adiciones y/o deleciones. Uno de 30, o uno de 20, o uno de diez, o uno de cinco, o uno de tres
35 amino�cidos pueden estar sustituidos, delecionados y/o añadidos con respecto a la secuencia que se muestra en SEC ID N.�: 3.
El término “proteína relacionada con Frizzled secretada 4” o “sFRP4” denota una proteína que tiene la secuencia de amino�cidos que se muestra en SEC ID N.�: 4 (Figura 7). Preferentemente, la sFRP4 es una proteína que consiste en la secuencia de amino�cidos que se muestra en SEC ID N.�: 4. La sFRP4 también incluye variantes de proteínas de la
40 secuencia que se muestra en SEC ID N.�: 4 por ejemplo debidas a variación al�lica. Las variantes pueden tener mutaciones con respecto a la secuencia que se muestra en SEC ID N.�: 4 por ejemplo sustituciones, adiciones y/o deleciones. Uno de 30, o uno de 20, o uno de diez, o uno de cinco, o uno de tres amino�cidos pueden estar sustituidos, delecionados y/o añadidos con respecto a la secuencia que se muestra en SEC ID N.�: 4.
El término “proteína relacionada con Frizzled secretada 5” o “sFRP5” denota una proteína que tiene sustancialmente la
45 secuencia de amino�cidos que se muestra en SEC ID N.�: 5 (Figura 7). Preferentemente, la sFRP5 es una proteína que consiste sustancialmente en la secuencia de amino�cidos que se muestra en SEC ID N.�: 5. La sFRP5 también incluye variantes de proteínas de la secuencia que se muestra en SEC ID N.�: 5 por ejemplo debidas a variación al�lica. Las variantes pueden tener mutaciones con respecto a la secuencia que se muestra en SEC ID N.�: 5 por ejemplo sustituciones, adiciones y/o deleciones. Uno de 30, o uno de 20, o uno de diez, o uno de cinco, o uno de tres
50 amino�cidos pueden estar sustituidos, delecionados y/o añadidos con respecto a la secuencia que se muestra en SEC ID N.�: 5.
En una realización, el procedimiento de la invención comprende detectar sFRP5 en la muestra según la reivindicación 1. Alternativamente, el procedimiento según la reivindicación 1 puede comprender detectar al menos dos sFRP diferentes en la muestra. En realizaciones adicionales, el procedimiento según la reivindicación 1 puede comprender detectar al
55 menos tres, al menos cuatro o al menos cinco sFRP diferentes en la muestra. Preferentemente, el procedimiento comprende detectar sFRP4 y sFRP5 en la muestra.
El término “muestra” como se usa en este documento designa una composición que se deriva del cuerpo de un individuo.
Normalmente, el individuo tiene riñones que funcionan. En una realización específica, el individuo no tiene enfermedad renal terminal (ERT). Las muestras son muestras de sangre, muestras de orina y muestras de tejido del individuo. La muestra puede ser una composición que se ha procesado para estar en una condición adecuada para el procedimiento según la invención. Por ejemplo, una muestra de sangre puede someterse a centrifugaci�n de forma que se obtenga suero, o una muestra de orina puede diluirse antes del análisis (por ejemplo, a 1:2 a 1:100, o a 1:5 o 1:50 o a 1:10 a 1:20). El procesamiento puede incluir centrifugaci�n, precipitación, concentración, filtración, di�lisis y/o dilución. El tipo de procesamiento puede depender de la técnica que se use para detectar la sFRP en la muestra.
El procedimiento de la invención solo comprende etapas que se llevan a cabo in vitro. La etapa de obtener la muestra del cuerpo del individuo no est� englobada por la presente invención.
La etapa de detectar sFRP (por ejemplo sFRP4 o sFRP5) en la muestra puede incluir determinar la presencia o la ausencia de sFRP (por ejemplo sFRP4 o sFRP5) en la muestra en un modo cualitativo. Sin embargo, la etapa de detectar la sFRP (por ejemplo sFRP4 o sFRP5) también puede incluir determinar la cantidad o concentración de sFRP (por ejemplo sFRP4 o sFRP5) en la muestra en un modo cuantitativo o semicuantitativo. La etapa de detectar sFRP4 o sFRP5 incluye detectar fragmentos de sFRP4 o de sFRP5, respectivamente.
La cantidad de sFRP4 en la orina de un individuo sano no es detectable por análisis de transferencia Western. La cantidad de sFRP4 en la orina de un paciente que padece PQR oscila de < 10 ng/ml a > 50 μg/ml, por ejemplo de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 50 μg/ml. Por tanto, un paciente con PQR puede excretar entre < 1 μg y > 50 mg por día, por ejemplo, de aproximadamente 1 μg a aproximadamente 50 mg por día. Como la concentración de orina varía, la cantidad de sFRP4 excretada por día puede establecer una correlación más exacta con la fase de la enfermedad. En la enfermedad qu�stica renal, la mayoría de los quistes se desconectan del sistema tubular de drenaje. Por tanto, las mediciones de sFRP4 en el suero en vez de en la orina pueden proporcionar un cálculo aproximado más preciso del volumen de quistes y de la progresión de la enfermedad. En el suero, la concentración de sFRP4 puede oscilar de < 10 ng/ml a > 100 ng/ml, por ejemplo de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml en pacientes que padecen PQR y no es detectable en pacientes sin enfermedad renal.
La detección de un nivel elevado de al menos una sFRP, por ejemplo sFRP4, en la muestra, del individuo con respecto a muestras de control indica un diagnóstico de PQR. Asimismo, el grado de elevación de la sFRP, por ejemplo sFRP4, en la muestra del individuo con respecto a muestras de control puede establecer una correlación con la progresión de PQR en el individuo. Las muestras de control han sido obtenidas de individuos que no padecen enfermedades renales tales como PQR. Las concentraciones de sFRP4 en la muestra > 50 ng/ml est�n normalmente asociadas a quistes renales independientes de la etiolog�a.
Los intervalos de concentración mencionados anteriormente en este documento con respecto a la sFRP4 también pueden aplicarse a la sFRP5.
El procedimiento de la invención comprende preferentemente al menos un inmunoensayo directo o indirecto. Estos ensayos incluyen, pero no se limitan a, ensayos de unión competitiva, ensayos de unión no competitiva, radioinmunoensayos, enzimoinmunoan�lisis de adsorción (ELISA), ensayos tipo s�ndwich, reacciones de precipitina, ensayos de inmunodifusi�n de difusión en gel, ensayos de aglutinación, inmunoensayos de fluorescencia, inmunoensayos de quimioluminiscencia, inmunoensayos de inmunoPCR, inmunoensayos de proteína A o proteína G y ensayos de inmunoelectroforesis. Entre todos, el inmunoensayo de enzimas, en particular el enzimoinmunoan�lisis de adsorción (ELISA), se usa apropiadamente en hospitales, etc., ya que la sFRP4 puede detectarse con alta sensibilidad y as� pueden ensayarse automáticamente varios especímenes.
El inmunoensayo comprende el uso de un anticuerpo policlonal o monoclonal capaz de unirse a una sFRP, por ejemplo a sFRP4 o a sFRP5 humanas. Como se usa en este documento, el término “anticuerpo” designa una inmunoglobulina o un derivado de la misma que tiene la misma especificidad de unión. El anticuerpo usado en la invención puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo derivado a partir de o que est� comprendido en un antisuero policlonal, se prefieren anticuerpos monoclonales. El término “anticuerpo” como se usa en este documento, comprende además derivados tales como fragmentos Fab, F(ab')2, Fv o scFv: véase, por ejemplo, Harlow y Lane, “Antibodies, A Laboratory Manual” CSH Press 1988, Cold Spring Harbor N.Y. Los fragmentos Fab, F(ab')2 y Fv pueden obtenerse digiriendo un anticuerpo completo con papa�na, pepsina, etc. en el modo convencional. El anticuerpo o el derivado del mismo puede ser de origen natural o puede producirse (semi)sintéticamente. Tales productos sintéticos también comprenden material no protein�ceo o semi-protein�ceo que tiene la misma o esencialmente la misma especificidad de unión que el anticuerpo divulgado. Tales productos pueden por ejemplo, obtenerse por peptidomim�ticos.
El anticuerpo puede unirse a uno o más de sFRP1, sFRP2, sFRP3, sFRP4 y sFRP5.
El anticuerpo contra una sFRP (por ejemplo contra sFRP4 o sFRP5) que va a usarse en la presente invención puede producirse inmunizando un animal tal como conejo, rata, cabra, oveja o ratón con la sFRP (por ejemplo sFRP4 o sFRP5)
o un fragmento de la misma o un derivado de la misma mediante un procedimiento bien conocido por aquellos expertos en la materia (Harlow y Lane, “Antibodies, A Laboratory Manual” CSH Press 1988, Cold Spring Harbor N.Y.). Para preparar un anticuerpo contra sFRP4, el ant�geno que va a usarse para la inmunizaci�n es preferentemente sFRP4 humana o un fragmento de la misma o un derivado de la misma. Sin embargo, también puede usarse sFRP4 de otras
especies. El ant�geno puede prepararse mediante expresión recombinante en un huésped, por ejemplo, en bacterias, células de insectos o células de mamíferos, o puede prepararse mediante síntesis química por el procedimiento en fase sólida. Las técnicas para producir anticuerpos monoclonales se conocen por aquellos expertos en la materia.
El anticuerpo que va a usarse según esta divulgación puede reconocer solo una de sFRP1, sFRP2, sFRP3, sFRP4 y sFRP5. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse a sFRP4, pero no se une a sFRP1, sFRP2, sFRP3 ni a sFRP5. Alternativamente, el anticuerpo puede reconocer solo dos, solo tres o solo cuatro de sFRP1, sFRP2, sFRP3, sFRP4 y sFRP5. En todavía otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo pan-reactivo que reconoce cada una de sFRP1, sFRP2, sFRP3, sFRP4 y sFRP5. La presente divulgación se refiere a tales anticuerpos descritos anteriormente.
Un anticuerpo puede ser específico para sFRP4 humana, es decir, no reconoce otras proteínas en la muestra. Lo más preferentemente, el anticuerpo no reconoce otras proteínas en la orina humana. El anticuerpo específico de sFRP4 puede unirse a un ep�tope en una de las siguientes regiones de la molécula de sFRP4: p�ptido carboxiterminal de sFRP4 -(amino�cidos 307 -326): RTSRSNPPKPKGKPPAPKPA (SEC ID N.�: 6), (amino�cidos 328 -343): PKKNIKTRSARKRTNP (SEC ID N.�: 7) y p�ptido aminoterminal de sFRP4 -(amino�cidos 110-124): PLMKMYNHSWPESLA (SEC ID N.�: 14).
En el procedimiento de ELISA, un anticuerpo, preferentemente un anticuerpo monoclonal, o un fragmento del mismo contra sFRP se inmoviliza normalmente primero sobre un vehículo como anticuerpo primario. El vehículo preferido es un vehículo sólido, tal como un recipiente de placa de ELISA moldeado a partir de un pol�mero de vehículo tal como estireno
o poliestireno. El anticuerpo monoclonal o su fragmento puede inmovilizarse, por ejemplo, disolviendo el anticuerpo monoclonal o su fragmento en un tampón tal como un tampón carbonato o un tampón borato seguido de la adsorción sobre el vehículo.
Por separado, un anticuerpo (un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal, o un fragmento de los mismos) usado como el anticuerpo secundario se marca preferentemente con una marca no radiactiva. Como la marca no radiactiva pueden usarse marcas de enzimas, marcas fluorescentes, marcas de emisión de luz, etc. Se prefiere que se use una marca de enzima tal como fosfatasa alcalina, β-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante.
En un aspecto de la invención, al menos dos muestras, o al menos 3 muestras, o al menos 4 muestras, o al menos 5 muestras obtenidas del mismo individuo en momentos diferentes, se prueban para la presencia o la cantidad de sFRP (por ejemplo sFRP4 o sFRP5). Esto puede incluir recoger datos durante un periodo de tiempo. Las muestras de un paciente pueden tomarse a intervalos regulares. El intervalo puede oscilar de aproximadamente 2 a aproximadamente 12 meses, preferentemente oscila de aproximadamente 4 a aproximadamente 8 meses, más preferentemente oscila de aproximadamente 5 a aproximadamente 7 meses (por ejemplo, aproximadamente 6 meses). Esto debería permitir la monitorización de la progresión de PQR durante diversos periodos de tiempo.
Otro aspecto de la presente invención es el uso de un medio para la detección de una sFRP5 para diagnosticar PQR en un procedimiento según se define en las reivindicaciones adjuntas. Medios adecuados para la detección de una sFRP incluyen pero no se limitan a anticuerpos contra sFRP, moléculas de ácidos nucleicos que pueden hibridarse con un ácido nucleico que codifica sFRP y similares. Los anticuerpos según esta realización se corresponden con aquellos descritos anteriormente.
Las moléculas de ácidos nucleicos (ADN o ARN) adecuadas que pueden hibridarse con un ácido nucleico que codifica sFRP4 o sFRP5 pueden ser diseñadas por un experto habitual usando la secuencia de nucleótidos publicada del gen sFRP4 (Abu-Jawdeh G, Comella N, Tomita Y, Brown LF, Tognazzi K, Sokol SY, Kocher O. Differential expression of frpHE: a novel human stromal protein of the secreted frizzled gene family, during the endometrial cycle and malignancy. Lab Invest. abril de 1999; 79(4): 439-47.). Las moléculas de ácidos nucleicos normalmente adecuadas tienen una longitud de al menos diez nucleótidos, preferentemente de al menos 15 nucleótidos, más preferentemente de al menos 20 nucleótidos, incluso más preferentemente de al menos 25 nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede tener aproximadamente 15 a 35 nucleótidos de longitud. La molécula de ácido nucleico puede usarse como un cebador en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o como una sonda en un ensayo de hibridación. Una molécula de ácido nucleico es “hibridable” con otra molécula de ácido nucleico tal como un ADNc, ADN gen�mico o ARN cuando una forma monocatenaria de la molécula de ácido nucleico puede hibridarse con la otra molécula de ácido nucleico según las condiciones apropiadas de temperatura y fuerza iónica de la disolución. Las condiciones de hibridación y de lavado se conocen bien y se ejemplifican en Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), particularmente el capítulo 11 en su interior. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación rigurosas es incubaci�n durante la noche a 42 �C en una disolución que comprende: formamida al 50 %, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x disolución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10 % y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado, seguido de lavado del soporte de hibridación en 0,1 x SSC a aproximadamente 65 �C. En un aspecto de la invención podría usarse RT-PCR para monitorizar la expresión de sFRP4 en células epiteliales tubulares presentes en la orina de pacientes con enfermedad renal qu�stica. Estas realizaciones descritas con respecto a sFRP4 se aplican a las otras sFRP tales como sFRP1, sFRP2, sFRP3 y sFRP5.
Otro aspecto de la divulgación es el uso de al menos una sFRP como marcador para la progresión de un trastorno renal descrito en el presente documento, por ejemplo una enfermedad renal qu�stica tal como PQR. Las realizaciones
preferidas de este aspecto se corresponden con las realizaciones preferidas del procedimiento descrito anteriormente. De acuerdo con un aspecto preferido de la presente invención, sFRP4 o sFRP5 se usan como un marcador para la progresión de PQR.
Todav�a otro aspecto de la presente invención es un kit de diagnóstico para diagnosticar un trastorno renal descrito en este documento (por ejemplo, PQR) o para monitorizar la progresión del trastorno renal, que comprende al menos un anticuerpo que puede unirse específicamente a una o más sFRP, por ejemplo a sFRP4 o sFRP5. Preferentemente, el kit de prueba es un kit de prueba de ELISA. En una realización, el anticuerpo no reacciona de forma cruzada con otras proteínas presentes en la orina humana. Los anticuerpos preferidos de este kit se han descrito anteriormente a propósito del procedimiento de la invención. En una realización, el anticuerpo en el kit de prueba reconoce sFRP (por ejemplo sFRP4 o sFRP5) tanto en su forma nativa como en su forma desnaturalizada. En otra realización, el anticuerpo en el kit reconoce sFRP (por ejemplo sFRP4 o sFRP5) en la muestra en un ensayo de ELISA y en transferencias Western. En otra realización, la capacidad o especificidad de unión del anticuerpo no depende significativamente del estado de glucosilaci�n de la sFRP (por ejemplo sFRP4 o sFRP5). En otra realización, el anticuerpo reconoce sFRP (por ejemplo sFRP4 o sFRP5) en orina humana o suero humano en un ensayo de ELISA (por ejemplo un ensayo de tipo s�ndwich t�pico). El anticuerpo puede inmovilizarse sobre una fase sólida tal como una placa de microtitulaci�n o una tira reactiva. El kit puede comprender un anticuerpo adicional otro anticuerpo que puede unirse específicamente a dichas uno o más sFRP (por ejemplo sFRP4 o sFRP5). Normalmente, el segundo anticuerpo est� dirigido contra la misma proteína que el primer anticuerpo (especialmente en el caso de un kit de prueba de ELISA). Este segundo anticuerpo puede usarse en un ELISA de tipo s�ndwich como se conoce por s� mismo en la materia. El segundo anticuerpo (un anticuerpo monoclonal o uno policlonal) puede marcarse con una marca no radiactiva. Como marca no radiactiva pueden usarse marcas de enzimas, marcas fluorescentes, marcas de emisión de luz, etc. Se prefiere que se use una marca de enzima tal como fosfatasa alcalina, β-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante. En una realización específica, el kit no contiene el anticuerpo mAb 3.1 o 3.4 mencionado en Berndt y col. (2003). También es posible que el segundo anticuerpo reconozca el primer anticuerpo en el kit de prueba, o que el segundo anticuerpo reconozca una sFRP distinta de la sFRP reconocida por el primer anticuerpo en el kit de prueba.
El kit de diagnóstico puede comprender adicionalmente otros componentes tales como un concentrado de tampón de lavado, una composición que comprende sFRP4 o sRRP5 como patrón, una disolución de parada (por ejemplo, disolución de HCl) y similares. La composición que comprende la sFRP como patrón normalmente comprende sFRP sustancialmente pura. El kit puede comprender adicionalmente material informativo referente al uso del kit, por ejemplo, en forma de una hoja, un panfleto o un folleto. El material informativo puede proporcionar información sobre los materiales del kit, la preparación de muestras y/o el procedimiento de ensayo. En particular, el material informativo puede contener indicaciones sobre cómo tiene que prepararse la muestra de orina para el ensayo que va a llevarse a cabo. Preferentemente, las partes contenidas en el kit est�n dispuestas en un recipiente que puede cerrarse.
La divulgación se refiere además a miembros de la familia de genes sFRP (véanse las Figuras 7 y 8). Actualmente, se han descrito al menos cinco proteínas sFRP estrechamente relacionadas. Todas estas proteínas se expresan en el ri��n y est�n posiblemente reguladas al alza en poliquistosis renal. Como se muestra en la Figura 6, varias especies diferentes de proteínas relacionadas con Frizzled secretadas est�n presentes en la orina de pacientes con poliquistosis renal. Todas las cinco proteínas sFRP contienen secuencias proteicas conservadas que se solapan (véase la Figura 8: Alineamiento de sFRP1-5). Por tanto, otro aspecto de la divulgación es el desarrollo de anticuerpos monoclonales panreactivos y sistema(s) de detección (como se han descrito anteriormente) que detectan las cinco (y potencialmente más) proteínas relacionadas con Frizzled secretadas y/o una combinación definida de proteínas sFRP. En algunos casos (por ejemplo, para detectar subtipos de poliquistosis renales u otras enfermedades asociadas a la expresión de proteínas sFRP), también puede ser útil desarrollar anticuerpos monoclonales y kits de detección que reconocen específicamente sFRP1, sFRP2, sFRP3 o sFRP5.
La divulgación se refiere a un procedimiento de cribado para identificar compuestos eficaces en el tratamiento de PQR que comprende (a) poner en contacto un compuesto de prueba con una célula; y (b) determinar la expresión por la célula de uno o más genes que se inducen por fluido qu�stico o se regulan al alza en riñones de pacientes con PQRAD, o determinar la actividad promotora del (de los) promotor(es) de dicho(s) gen(es).
Los genes inducidos por fluido qu�stico o regulados al alza en riñones de pacientes con PQRAD pueden seleccionarse de los genes enumerados en la Tabla 1 más adelante. En el procedimiento de cribado de esta divulgación puede determinarse la expresión o la actividad promotora de al menos 2, o al menos 5, o al menos 10, o al menos 20, o al menos 50 genes enumerados en la Tabla 1.
La divulgación se refiere además a un procedimiento de cribado para identificar compuestos eficaces en el tratamiento de PQR que comprende (a) poner en contacto un compuesto de prueba con una célula; y (b) determinar la expresión por la célula de sFRP4 o sFRP5 (y/u otras proteínas sFRP), o determinar la actividad promotora del promotor de sFRP4 o sFRP5 (u otro promotor de sFRP) en la célula.
C�lulas adecuadas que pueden usarse en los procedimientos de cribado de la divulgación incluyen, pero no se limitan a, células HEK 293, COS, HeLa, etc.
El procedimiento de cribado puede comprender adicionalmente la etapa de seleccionar el compuesto de prueba, si el
compuesto de prueba inhibe la expresión por la célula de al menos una sFRP o la actividad promotora del promotor de al menos una sFRP. A modo de ejemplo, el procedimiento de cribado puede comprender adicionalmente la etapa de seleccionar el compuesto de prueba, si el compuesto de prueba inhibe la expresión por la célula de sFRP4 o la actividad promotora del promotor de sFRP4. Los procedimientos para determinar el nivel de expresión o la actividad promotora son conocidos para aquellos expertos en la materia y se describen en Wong y col. (2003).
Puede considerarse que un compuesto de prueba inhibe la expresión por la célula de la sFRP, si la expresión por la célula de la sFRP en presencia del compuesto de prueba se reduce al menos el 10 %, preferentemente al menos el 20 %, más preferentemente al menos el 30 %, incluso más preferentemente al menos el 40 %, todavía más preferentemente al menos el 50 %, lo más preferentemente al menos el 75 %, con respecto a la expresión por la célula de la sFRP en ausencia del compuesto de prueba.
Puede considerarse que un compuesto de prueba inhibe la expresión por la célula de sFRP4, si la expresión por la célula de sFRP4 en presencia del compuesto de prueba se reduce al menos el 10 %, preferentemente al menos el 20 %, más preferentemente al menos el 30 %, incluso más preferentemente al menos el 40 %, todavía más preferentemente al menos el 50 %, lo más preferentemente al menos el 75 %, con respecto a la expresión por la célula de sFRP4 en ausencia del compuesto de prueba.
Puede considerarse que un compuesto de prueba inhibe la expresión por la célula de sFRP5 si la expresión por la célula de sFRP5 en presencia del compuesto de prueba se reduce al menos el 10 %, preferentemente al menos el 20 %, más preferentemente al menos el 30 %, incluso más preferentemente al menos el 40 %, todavía más preferentemente al menos el 50 %, lo más preferentemente al menos el 75 %, con respecto a la expresión por la célula de sFRP5 en ausencia del compuesto de prueba.
Las realizaciones descritas en este documento con respecto a PQR pueden aplicarse a otros trastornos renales u otras enfermedades renales qu�sticas. Las realizaciones descritas en este documento con respecto a sFRP4 pueden aplicarse a otros miembros de la familia de proteínas de sFRP.
Figura 1
A. Expresión de sFRP4 en riñones normales y tejido de pacientes con PQRAD. La parte superior representa la expresión relativa obtenida por análisis de micromatrices. B. Se realizó RT-PCR semicuantitativa para confirmar los datos de micromatrices (parte inferior). C. Inmunorreactividad de sFRP4 en riñones normales y con PQRAD. Obsérvese que la sFRP4 est� presente en algunas, pero no en todas las células epiteliales tubulares que revisten los quistes representados. D. El fluido qu�stico estimula la expresión de sFRP4 en células del CCMI diferenciadas (cultivo de 5 días) (panel izquierdo), pero no en células del CCMI senescentes (cultivo de 10 días) (panel derecho). E. El fluido qu�stico estimula sFRP4 en células tubulares proximales (TP) diferenciadas (cultivo de 5 días) (panel izquierdo), pero no en células TP senescentes (cultivo de 10 días) (panel derecho).
Figura 2
A. El fluido qu�stico de pacientes con PQRAD estimula el promotor de sFRP4. B. Dos fragmentos del promotor de sFRP4, -238/+83 y 1417/+83, se activan por el fluido qu�stico, mientras que el fragmento -144/+83 muestra poca respuesta al fluido qu�stico. C. El fluido qu�stico de pacientes con PQRAD contiene grandes cantidades de sFRP4. El fluido qu�stico se diluyó como se indica y se compar� con sFRP4 recombinante para estimar la concentración. En algunos quistes, se observaron concentraciones de sFRP4 de hasta 1 mg/ml. D. El peso molecular de sFRP4 en fluido qu�stico se reduce por F-desglucosidasa, que indica que la sFRP4 secretada est� altamente glucosilada. E. El fluido qu�stico bloquea la actividad estimulada por XWnt8 del indicador TOPFLASH, sugiriendo que la sFRP4 en fluido qu�stico conserva su actividad biológica (panel izquierdo). El fluido qu�stico no tiene efecto sobre la activación de TOPFLASH mediada por Disheveled (panel derecho). F. La purificación parcial de fluido qu�stico revela que la actividad inhibidora de Xwnt8 establece una correlación con las fracciones inmunorreactivas.
Figura 3
A. El análisis de micromatrices separa CCMI tratadas con medios de control (n=3) y medios que contienen 5 μg/ml de sFRP4 recombinante (panel izquierdo: agrupamiento jerárquico y dendograma; panel derecho: mapa de riesgo). B. GASP1 (panel izquierdo) y GASP9 (panel derecho) en células del CCMI tratadas bien con medio de control o bien con medio que contiene sFRP4. Los datos del panel izquierdo se derivan del análisis de micromatrices, el panel derecho se gener� usando medios acondicionados a partir de células HEK 293T que expresan sFRP4. Las células del CCMI se incubaron bien con medios de células transfectadas con MOCK, o bien con los medios acondicionados durante 24 horas. Se realizó RT-PCR semicuantitativa y la señal de GASP9 se normalizó para la expresión de GAPDH. C. La sFRP4 se excreta en la orina de pacientes con PQRAD. D. La expresión de sFRP4 est� regulada al alza en ratones deficientes en PQR2. Se realizaron RT-PCR y el análisis de transferencia Western en E21 tanto de ratones PQR2 (+/-) como de ratones PQR2 (-/-). Como se muestra en el panel izquierdo, hay un fuerte aumento de la sFRP4 en embriones, que carecen de PQR2. E. La inmunorreactividad de sFRP4 se encuentra en células epiteliales, que revisten los quistes de ratones PQR2 (-/-) (panel izquierdo), mientras que puede encontrarse poca sFRP4 en ratones de tipo silvestre (panel derecho). F. Los ratones INV revelaron una regulaci�n al alza similar de sFRP4, demostrando que la producción excesiva de sFRP4 no se limita a la PQRAD, sino que probablemente acompaña a la formación de quistes.
Figura 4
A. Regulaci�n al alza de sFRP4 detectada por RT-PCR 5 y 10 días tras la nefrectom�a de 5/6 ratones. B. La gráfica representa el promedio de expresión de sFRP4 detectada por RT-PCR y normalizada para β-gal de dos experimentos independientes, demostr� que la nefrectom�a de 5/6 induce expresión de sFRP4.
5 Figura 5
A. El fragmento de sFRP4 -144/+83 no se activa ni por subunidades Gα ni Disheveled. B. El fragmento de sFRP4 238/+83 puede activarse tanto por subunidades Gα como Dishevel. Como el fragmento de sFRP4 corto no contiene un sitio de unión a TCF, la activación mediada por Wnt est� probablemente mediada en parte por la se�alizaci�n dependiente de la proteína G.
10 Figura 6
A. Detección de sFRP4 en la orina de pacientes con IRT con enfermedad renal qu�stica en comparación con sFRP4 humana recombinante (ng por hilera como se indica). Las muestras A, B, C son orinas de control de voluntarios sanos. Los n.�s 1-6 son muestras de orina de pacientes con IRT con tanto PQRAD como enfermedad renal qu�stica adquirida.
B. Detección de sFRP4 en la orina de pacientes con PQRAD y diversos grados de insuficiencia renal en comparación
15 con sFRP4 humana recombinante (ng por hilera como se indica). Obsérvense las diferentes magnitudes de peso molecular, que indican que los pacientes con PQRAD secretan varias proteínas sFRP estrechamente relacionadas.
C. Detección de sFRP4 en la sangre de pacientes con PQRAD. Las hileras 1 y 3 son orina y suero de un voluntario sano, las hileras 2 y 4 son la orina y el suero de un paciente con PQRAD. Para detectar la sFRP4 en el suero, la sFRP4 se inmunoprecipit� a partir de 50 μl de suero usando un antisuero policlonal específico de sFRP4. La proteína precipitada se
20 detect� posteriormente por análisis de transferencia Western.
La Figura 7 muestra las secuencias de amino�cidos de sFRP1, sFRP2, sFRP3, sFRP4 y sFRP5. Mediante los números de registro indicados, puede obtenerse información adicional sobre las sFRP. En particular, pueden recuperarse las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las sFRP (por ejemplo de la publicación indicada, o a modo de un enlace con la secuencia de ADNc), permitiendo el diseño de cebadores y sondas adecuados.
25 La Figura 8 muestra un alineamiento de las secuencias de amino�cidos de sFRP1, sFRP2, sFRP3, sFRP4 y sFRP5. El alineamiento muestra regiones conservadas y regiones únicas de las sFRP.
La Figura 9 representa la detección de sFRP4 y sFRP5 humanas en la orina de pacientes con poliquistosis renal (PQR). La orina de controles sanos (A-C) no contiene cantidades detectables de sFRP4 ni de sFRP5 en la orina. En contraste, los pacientes con PQR (1-6) excretan elevadas cantidades de sFRP4 y sFRP5.
30 Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran adicionalmente la invención. Sin embargo, debe entenderse que la invención según se reivindica no debe limitarse excesivamente a tales realizaciones específicas.
Procedimientos
Materiales. Se obtuvieron muestras de pacientes (material desechado, suero y orina) después de la aprobación del protocolo del estudio por el comité de ética local. Especímenes de tejido de ri��n bien se congelaron rápidamente en 35 nitrógeno líquido para el aislamiento de ARN, o bien se fijaron inmediatamente en paraformaldeh�do al 4 % para inmunohistoqu�mica. El fluido qu�stico se recogió por aspiración y se almacen� bien a 4 �C (corto plazo) o bien a -20 �C (largo plazo). Las muestras de sangre se recogieron en tubos colectores y se centrifugaron a 4 �C durante 10 min a 1200 rpm para obtener suero. El suero y la orina se almacenaron a -20 �C (largo plazo). Para el aislamiento del ARN, el tejido congelado se homogeneiz� en isotiocianato de guanidinio 4 M/β-mercaptoetanol al 0,72 % usando un Polytron (PT
40 MR2100, Kinematica AG, Lucerna, Suiza). El ARN total se purificó posteriormente en un gradiente de cloruro de cesio. El anticuerpo monoclonal de sFRP-4 se ha descrito recientemente (1).
Identificaci�n de la expresión g�nica y RT-PCR semicuantitativa. El análisis de micromatrices se realizó como se ha descrito recientemente (2). Para la RT-PCR semicuantitativa, se purificó el ARN total (1 μg) con el conjunto de ADNsa libre de RNasa (Qiagen, Hilden, Alemania) y se transcribi� de forma inversa en ADNc usando un cebador oligo(dT) 12-18 45 y la transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Para cada reacción de PCR se us� la expresión de β-actina o GAPDH como control de patrón interno (22). Los siguientes cebadores se usaron para la amplificación de sFRP4 -5' atcggtgcaagtgcaaaaag 3' (SEC ID N.�: 8) y 5' tatgtggacactggcaggag 3' (SEC ID N.�: 9), para la amplificación de GASP2 -5' cttcaggtgtacatgaataaa 3' (SEC ID N.�: 10) y 5' gaggtcgtggtgatttgctaaggc 3' (SEC ID N.�: 11) y la amplificación de GASP9 -5' gcctctgctaatggcggacaggc 3' (SEC ID N.�: 12) y 5' gggaggcctcccaattggcgg 3' (SEC ID
50 N.�: 13), respectivamente. El ciclo de amplificación consistía en un inicio en caliente a 94 �C durante 2 min, seguido de múltiples ciclos de desnaturalización a 94 �C a 1 min, hibridación a 58 �C durante 1 min y extensión a 72 �C durante 1 min. El número de ciclos se ajust� al nivel de expresión de ARNm de los diferentes genes. Los productos de PCR se separaron en un gel de agarosa al 2 % y se analizaron en relación con la banda de control correspondiente.
Cultivo celular. Células epiteliales tubulares proximales (TP) condicionalmente inmortalizadas del ImmortoMouse de
SV40 (amablemente proporcionado por H. Pavenst�dt, M�nster) se mantuvieron a 33 �C en DMEM-F12 complementado con suero bovino al 2 %. Para la diferenciación de las células TP, la temperatura se aument� hasta 37 �C. Se cultivaron células mCCMI-3 inmortalizadas (denominadas en lo sucesivo células CCMI) (ATCC) en medio DMEM-F12 complementado con suero bovino al 10 %. Se cultivaron células renales embrionarias humanas (denominadas en lo sucesivo células HEK-293T) en DMEM complementado con suero bovino al 10 %.
An�lisis de transferencia Western. Se realizaron análisis de inmunoprecipitaci�n y de transferencia Western como se han descrito (3).
Inmunoqu�mica. Muestras de tejido obtenidas de materiales de pacientes se fijaron en paraformaldeh�do al 4 %, se deshidrataron y se incorporaron en parafina. Se tiñeron secciones de tejido (5 μ) usando el kit Vectasta�na-ABC (Vector Laboratories). Se prepararon embriones de ratones, usando el kit de incorporación Technovit 7100 (Heraeus-Kulzer, Alemania). Todas las secciones se examinaron usando un microscopio Zeiss.
Ensayos indicadores. Se sembraron células HEK 293T en placas de 12 pocillos durante 24 horas antes de la transfecci�n. Para determinar la actividad de la luciferasa o la fosfatasa alcalina, 2 μg de construcciones indicadoras TOPFLASH o pSEAP2B se transfectaron con 1 μg de pl�smido de β-galactosidasa, usando el procedimiento del fosfato de calcio. Las transfecciones se realizaron por triplicado. Después de 24 horas, los lisados celulares y los sobrenadantes se ensayaron para la actividad de la luciferasa y la fosfatasa alcalina, respectivamente (Great EscAPe SEAP, BD Bioscience). Los resultados se presentan como actividad relativa de la luciferasa o de la fosfatasa alcalina, normalizada para la actividad de β-galactosidasa.
Cromatograf�a en columna. Se concentr� fluido qu�stico que contenía sFRP4 a 5000 xg durante 45 min, usando un dispositivo de filtración centrífugo YM-30 Centricon seguido de prepurificaci�n a 45000 rpm y 4 �C durante 30 minutos. Se dializ� fluido qu�stico concentrado durante la noche a 4 �C contra tampón de equilibrio (NaH2PO4 20 mM, NaCl 30 mM, pH 7,5). Se cargó un ml del fluido qu�stico dializado sobre una columna de intercambio cati�nico Sephadex HighPrep 16/10 SP-FF. Después de lavar la columna con 58 ml de tampón de equilibrio, la eluci�n se llev� a cabo con un gradiente continuo empezando con NaH2PO4 20 mM, NaCl 30 mM, pH 7,5 y terminando con NaH2PO4 20 mM, NaCl 1 M, pH 7,5. Durante la eluci�n se recogieron fracciones de 2 ml y se dializaron durante la noche a 4 �C frente a PBS. Las fracciones se probaron para la presencia de sFRP4 por análisis de transferencia Western.
Resultados
Para entender el mecanismo molecular asociado a IRT en PQRAD, los inventores generaron perfiles de genes de riñones con PQRAD y se identificó sFRP4 como un gen diferencialmente regulado (Fig. 1a). La sFRP4 (proteína relacionada con Frizzled secretada 4) es un miembro de una familia en desarrollo de moléculas solubles que se unen tanto a moléculas de Wnt como de Frizzled (4). La RT-PCR confirm� que la mayoría de los riñones con PQRAD expresaron cantidades aumentadas de sFRP4 (Fig. 1b). La sFRP4 inmunorreactiva fue detectable en células epiteliales tubulares que revisten los quistes en riñones con PQRAD, mientras que las células epiteliales tubulares de riñones normales no expresaron sFRP4 (Fig. 1c). La sFRP4 no se expres� uniformemente en todas las células epiteliales de quistes y los experimentos in vitro usando células del CCMI y MT1, dos líneas celulares epiteliales tubulares, sugirieron que el fluido qu�stico desencadena sFRP4 en células menos de terminalmente diferenciadas (Figs. 1d y 1e).
El fluido qu�stico contiene una sustancia lip�fila que estimula la generación de cAMP (5), además de varios factores de crecimiento y hormonas tales como vasopresina. Dado que hay dos elementos sensibles a cAMP presentes en el promotor de sFRP4 (Fig. 2a) (6), los inventores analizaron la activación mediada por fluido qu�stico de diferentes fragmentos de promotores de sFRP4. Como se muestra en la Fig. 2b, el fluido qu�stico activ� significativamente el promotor de sFRP4 -238/83 y -1417/83, pero fracas� al estimular sFRP4 -144/83 que carece de los elementos sensibles a cAMP. Por tanto, la actividad estimulante de cAMP previamente descrita de fluido qu�stico parece estimular la expresión g�nica de sFRP4.
Como la sFRP4 es una proteína secretada, los inventores probaron si esta molécula se acumulaba en el fluido qu�stico. El análisis de transferencia Western revel� que el fluido qu�stico contiene grandes cantidades de sFRP4 altamente glicosilada (Figs. 2c y 2d). La sFRP4 bloquea la se�alizaci�n de Wnt canónica y evita la formación del doble eje mediada por XWnt8 durante el desarrollo temprano de Xenopus. Como se muestra en la Fig. 2e, el fluido qu�stico, que contiene grandes cantidades de sFRP4, bloque� muy eficazmente la activación mediada por XWnt8 de la construcción indicadora TOPFLASH dependiente de TCF, pero tuvo muy poco efecto sobre la molécula Disheveled (dsh) de activador Wnt citopl�smico. Los inventores purificaron parcialmente sFRP4 para demostrar adicionalmente que la sFRP4 qu�stica conserva su bioactividad. Como se muestra en la Fig. 2e, las fracciones que contenían sFRP4 inmunorreactiva bloquearon la activación de TOPFlash mediada por XWnt8, mientras que las fracciones negativas de sFRP4 no tuvieron efecto significativo. Considerados en conjunto, estos hallazgos muestran que los quistes contienen grandes cantidades de sFRP4 biol�gicamente activa. Varios informes han ligado la expresión incrementada de sFRP4 a tasas de apoptosis aceleradas. Aunque el mecanismo de apoptosis inducida por sFRP4 es desconocido, el aumento de la expresión de sFRP4 en PQRAD coincide con apoptosis incrementada del tejido renal normal circundante, indicando que la sFRP4 qu�stica puede contribuir a la progresión de insuficiencia renal.
Para entender los efectos de la sFRP4 sobre células epiteliales tubulares renales, los inventores incubaron células del
CCMI con sFRP4 recombinante y determinaron los genes diferencialmente regulados en células tratadas con sFRP4 por análisis de micromatrices usando un chip de ADNc murino de 22,5 k. Como se demuestra en la Fig. 3a, el tratamiento de sFRP4 separ� los perfiles de genes de los dos conjuntos de cultivo, pero solo proporcion� unos pocos genes significativamente regulados (FDR < 0,05 y p < 0,05). Una posible diana del tratamiento de sFRP4 era un miembro de la familia de GASP. Para confirmar la regulaci�n diferencial de GASP, los inventores trataron células del CCMI con medios acondicionados con sFRP4 y observaron la regulaci�n por disminución de GASP9, un miembro de la familia de GASP específico de ri��n (Fig. 3b). Las proteínas GASP median en la endocitosis de receptores acoplados a proteínas G (GPCR), mientras que la falta de proteínas GASP produce acumulación de GPCR en la superficie celular. Por tanto, la exposición persistente a sFRP4 podría establecer un bucle de retroalimentación perjudicial en el que el fluido qu�stico activa sFRP4, que a su vez previene la endoquistosis de GPCR mediante la regulaci�n por disminución de proteínas GASP.
Los quistes normalmente pierden su conexión con los t�bulos drenantes. Sin embargo, los inventores detectaron sFRP4 en la orina de pacientes con PQRAD. La Fig. 3c muestra que el grado de excreci�n de sFRP4 correlaciona con la fase de insuficiencia renal. Estos hallazgos sugieren que la excreci�n de sFRP4 urinaria es un marcador potencial para monitorizar la progresión de enfermedad renal en pacientes con PQRAD.
Como PQR2 est� mutado en algunos pacientes con PQRAD, los inventores examinaron la expresión de sFRP4 en ratones PQR2 (-/-). Normalmente los animales homocigotos mueren entre E15 y E20 de embriog�nesis. Como se muestra en las Fig. 3d y 3e, niveles elevados de sFRP4 son detectables en ratones PQR2 (-/-), pero no en ratones PQR2 (+/-) o en ratones de tipo silvestre. Para determinar si la regulaci�n al alza de sFRP4 se limita a PQRAD, los inventores realizaron experimentos similares en ratones INV homocigotos. Estos ratones son deficientes en NPH2 (inversina), un gen mutado en nefronoptisis recesiva autos�mica de tipo II (forma infantil). Los ratones INV revelaron una regulaci�n al alza similar de sFRP4, demostrando que la producción excesiva de sFRP4 no se limita a la PQRAD, pero probablemente acompaña a la formación de quistes (Fig. 3F). Como el aumento de sFRP4 también es detectable después de nefrectom�a parcial (véase la Figura 4), los inventores postulan que la expresión de sFRP4 se estimula por compuestos secretados en el fluido qu�stico, pero también se producen durante respuestas regenerativas.
Considerados en conjunto, los hallazgos de los inventores revelan que la formación de quistes est� asociada a un aumento de la producción y la acumulación de sFRP4, un antagonista de Wnt relacionado con Frizzled que implicado en apoptosis incrementada. La sFRP4 regula por disminución las proteínas GASP en células epiteliales tubulares y por tanto, podría conferir un susceptibilidad incrementada a ligandos que unen y estimulan GPCR. Como la PQRAD es una enfermedad lentamente progresiva, el éxito de las intervenciones terapéuticas ha sido difícil de monitorizar. Como la sFRP4 se excreta en la orina de pacientes con PQRAD, puede representar un marcador novedoso para la progresión de la enfermedad y ayudar a monitorizar la respuesta a intervenciones terapéuticas que tienen como objetivo ralentizar el desarrollo de quistes.
En un análisis de micromatrices adicional, usando un chip de ADNc humano de 38 k, se identificaron moléculas adicionales que est�n altamente reguladas al alza en ri��n con PQRAD. Los productos g�nicos, en particular proteínas y fragmentos de las mismas, de los genes regulados al alza en PQRAD son útiles para detectar o monitorizar pacientes con PQR u otros trastornos renales.
Tabla 1: Genes significativamente regulados en PQRAD. Los genes enumerados est�n significativamente regulados al alza en riñones con PQRAD. El número de veces de aumento se expresa como log 2. Los p�ptidos de genes sombreados en gris se han identificado en la orina de individuos sanos. (continuación) (continuación) 5
- Gen
- Descripción Símbolo del gen Número de veces de aumento (log 2)
- H25590
- Suero amiloide A1 SAA1 8,825
- N28788
- Trombospondina 2 THBS2 8,418
- H47153
- Col�geno, tipo VI, alfa 3 COL6A3 7,828
- R46444
- Proteína 1 de unión a AE AEBP1 5,91
- CR746674
- Tubulina, alfa 3 TUBA3 5,674
- BX093514
- Transgelina TAGLN 5,618
- R72711
- Sinaptopodina 2 SYNP02 5,502
- H58645
- Receptor 1 de la toxina del ántrax ANTXR1 5,341
- W86529
- Proteína 5 asociada a microfibrilar MFAP5 5,292
- Gen
- Descripción Símbolo del gen Número de veces de aumento (log 2)
- AA011468
- Col�geno, tipo XIV, alfa 1 (undulina) COL14A1 5,258
- W57893
- Fibronectina 1 FN1 5,045
- T97662
- Sushi, factor de von Willebrand de tipo A, EGF y proteína 1 que contiene dominio de pentraxina SVEP1 4,27
- R97974
- Molécula de CD53 CD53 4,253
- R22873
- Catepsina S CTSS 4,18
- BX110513
- Integrina, beta 6 ITGB6 4,176
- W40296
- Proteína 1 de unión al factor de crecimiento transformante latente beta LTBP1 4,076
- H77318
- Metionina-sulf�xido-reductasa B3 MSRB3 4,051
- BX101810
- Proteína hipotética FLJ21986 FLJ21986 4,048
- R21642
- Fibulina 1 FBLN1 4,034
- H64964
- 4 dominios que atraviesan la membrana, subfamilia A, miembro 6A MS4A6A 3,859
- H69049
- Molécula de CD36 (receptor de trombospondina) CD36 3,837
- AA029988
- Sulfatasa 1 SULF1 3,815
- BX115823
- Proteasa, serina, 23 PRSS23 3,715
- BX092184
- Proteína relacionada con Frizzled secretada 4 SFRP4 3,7
- T95571
- Col�geno, tipo XII, alfa 1 COL12A1 3,465
- N78528
- Proteína 3 que contiene repeticiones similares a EGF y dominios similares a discoidina I EDIL3 3,396
- R27079
- Componente de fusión del lipoma HMGIC LHFP 3,353
- R06034
- Pleckstrina PLEK 3,205
- R82964
- Proteína 4 de unión a ácido graso, adipocito FABP4 3,121
- BX090914
- Familia de la aldeh�do-deshidrogenasa 1, miembro A3 ALDH1A3 3,089
- BX279620
- Cinasa 2 similar a Polo (Drosophila) PLK2 3,063
- R72689
- Miosina, polip�ptido 11 pesado, músculo liso MYH11 3,036
- AA134668
- Proteína 1 de cuatro dominios y medio LIM FHL1 2,866
- T70850
- Perilipina PLIN 2,776
- BX283933
- Región variable de cadena pesada de la inmunoglobulina reactiva con miosina LOC652106 2,647
- BG104623
- Gen sobreexpresado en nefroblastoma NOV 2,636
- H67479
- Biglicano BGN 2,575
- T89391
- Caveolina 2 CAV2 2,557
- H46619
- Miosina, polip�ptido 9 ligero, regulador MYL9 2,526
- Gen
- Descripción Símbolo del gen Número de veces de aumento (log 2)
- N44001
- (Lisina-metiltransferasa) 7 que contiene el dominio SET SETD7 2,501
- BX282272
- Proteína 3 (de unión a Rho GTPasa) efectora de CDC42 CDC42EP3 2,394
- BX093905
- Proteína 22 que contiene el motivo tripartito TRIM22 2,345
- W79256
- Proteína 2 similar a la banda de la proteína de membrana de eritrocito 4.1 EPB41 L2 2,326
- BX114634
- Tropomiosina 4 TPM4 2,287
- AA035192
- Carboxipeptidasa X (familia M14), miembro 2 CPXM2 2,257
- AA039256
- Asporina (clase 1 de LRR) ASPN 2,228
- R83765
- Proteína 10 que contiene dominios de tetramerizaci�n de canales de potasio KCTD10 2,221
- N57594
- Proteína transmembrana 47 TMEM47 2,2
- AA292054
- Proteína 1 específica de la detención del crecimiento GAS1 2,17
- H56349
- Proteína 2 similar a fibrin�geno FGL2 2,166
- AA027246
- Glicerinol-3-fosfato-aciltransferasa, mitoc�ndrica GPAM 2,164
- BX090875
- Homólogo a pelota (Drosophila) PELO 2,115
- BX114711
- Proteoglicano 1, gránulo secretor PRG1 2,042
- BG697186
- Canal de potasio dependiente de potasio, subfamilia H (relacionado con eag), miembro 2 KCNH2 1,936
- H90971
- Familia de las polimerasas poli(ADP-ribosa), miembro 14 PARP14 1,919
- R12367
- Subunidad de proteasoma (prosoma, macropa�na), tipo beta, 8 (peptidasa 7 multifuncional grande) PSMB8 1,913
- H74106
- Proteína 2 de unión al dominio LIM LDB2 1,894
- H13471
- Syndecan 2 (heparano-sulfato-proteoglicano 1, fibroglicano asociado a la superficie celular) SDC2 1,89
- BM921371
- Fibulina 5 FBLN5 1,882
- R97862
- Proteína 1 que contiene repeticiones de WD y la caja SOCS WSB1 1,881
- BX098913
- Transductor de señales y activador de la transcripción de 1,91 kDa STAT1 1,818
- R08415
- Dominio sema, dominio de inmunoglobulina (Ig), dominio transmembrana (TM) y dominio citopl�smico corto, (semafrina) 4G SEMA4G 1,795
- BG679464
- Inductor angiog�nico rico en ciste�na, 61 CYR61 1,7
- R27042
- Proteína que interact�a con la proteína del síndrome de Wiskott-Aldrich WASPIP 1,629
- BM473315
- Interactuador N-myc (y STAT) NMI 1,564
35 (continuación)
- Gen
- Descripción Símbolo del gen Número de veces de aumento (log 2)
- AA054773
- Proteína combinada con GRINL1A Gcom1 1,504
La presente divulgación se refiere a un procedimiento para diagnosticar o monitorizar la progresión de un trastorno renal, que comprende detectar uno o más de los productos g�nicos codificados por los genes enumerados en la tabla 1 en una muestra de orina o de suero de un individuo que padece el trastorno renal o que se sospecha que padece el trastorno renal. Las diversas realizaciones de este procedimiento se corresponden con aquellas descritas para sFRP4 y sFRP5 en este documento, cambiando lo que se deba cambiar. El procedimiento puede comprender detectar al menos uno, al menos dos, al menos 5, al menos 10, al menos 20 o al menos 50 productos g�nicos codificados por los genes respectivos enumerados en la Tabla 1. El término “producto g�nico” incluye proteínas y fragmentos de las mismas.
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Lista de secuencias
<110> Universitaetsklinikum Freiburg
<120> Procedimiento para diagnosticar poliquistosis renal
<130> Prof. Dr. Walz
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 314
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 295
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 325
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
<210> 4
<211> 346
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
<210> 5
<211> 317
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> P�ptido C-terminal de sFRP4
<400> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220> 15 <223> P�ptido C-terminal de sFRP4
<400> 7
<210> 8
<211> 20
<212> ADN
5 <213> Artificial
<220>
<223> Cebador 1 para la amplificación de sFRP4
<400> 8
atcggtgcaa gtgcaaaaag 20 10 <210> 9
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 15 <223> Cebador 2 para la amplificación de sFRP4
<400> 9
tatgtggaca ctggcaggag 20
<210> 10
<211> 21 20 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador 1 para la amplificación de GASP2
<400> 10 25 cttcaggtgt acatgaataa a 21
<210> 11
<211> 24
<212> ADN
<213> Artificial 30 <220>
<223> Cebador 2 para la amplificación de GASP2
<400> 11 gaggtcgtgg tgatttgcta aggc 24
<210> 12 35 <211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador 1 para la amplificación de GASP9
5 <400> 12
gcctctgcta atggcggaca ggc 23
<210> 13
<211> 21
<212> ADN 10 <213> Artificial
<220>
<223> Cebador 2 para la amplificación de GASP9
<400> 13
gggaggcctc ccaattggcg g 21 15 <210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> P�ptido del N-terminal de sFRP4
<400> 14
Claims (8)
- REIVINDICACIONES1.-Un procedimiento de diagnóstico de un trastorno renal, que comprende detectar una proteína relacionada con Frizzled secretada (sFRP) en una muestra que contiene orina o suero obtenida de un individuo que sufre del trastorno renal o que es sospechoso de sufrir del trastorno renal, en el que dicha sFRP es proteína relacionada con Frizzled secretada 55 (sFRP5) y en el que dicho trastorno renal es poliquistosis renal (PQR).
- 2.-Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha muestra es una muestra de orina.
- 3.-Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha muestra es una muestra de suero.
- 4.-Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la detección de un nivel elevado de la sFRP5 en la muestra del individuo con respecto a muestras de control indica un diagnóstico del trastorno10 renal.
- 5.-Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la detección comprende poner en contacto la muestra con al menos un anticuerpo que puede unirse a la sFRP5 para permitir la formación de complejos anticuerpo-ant�geno y detectar la presencia de complejos anticuerpo-ant�geno formados.
- 6.-Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el procedimiento comprende al menos15 un inmunoensayo directo o indirecto seleccionado del grupo que consiste en un ensayo de unión competitiva, un ensayo de unión no competitiva, un radioinmunoensayo, un enzimoinmunoan�lisis de adsorción (ELISA), un ensayo de tipo s�ndwich, una reacción de precipitina, un ensayo de inmunodifusi�n de difusión en gel, un ensayo de aglutinación, un inmunoensayo fluorescente, inmunoensayo de quimioluminiscencia, inmunoensayo de inmunoPCR, un inmunoensayo de proteína A o proteína G y un ensayo de inmunoelectroforesis.20 7.-Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que al menos dos muestras obtenidas del mismo individuo en momentos diferentes se criban para la presencia de la sFRP5; y/o en el que dicho procedimiento comprende detectar tanto sFRP4 como sFRP5 en dicha muestra.
- 8.-El uso de medios para la detección de una proteína relacionada con Frizzled secretada (sFRP) para diagnosticar poliquistosis renal en el procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha sFRP es proteína relacionada con25 Frizzled secretada 5 (sFRP5).
- 9.-El uso según la reivindicación 8, en el que el medio para la detección de sFRP5 es un anticuerpo capaz de unión a la sFRP5.25 26
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