ES2476253T3 - P�ptidos de neublastina para su uso en el aumento de la vascularizaci�n en tejido con flujo sanguíneo deteriorado - Google Patents

Abstract

Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 % idéntica a los aminoácidos 15-113 de SEC ID Nº: 1, y en el que el polipéptido, cuando se dimeriza, se une con un complejo que contiene GFRalfa3 y RET, para su uso en el aumento de la vascularización en un tejido en un mamífero que muestra flujo sanguíneo deteriorado o inadecuado en el tejido, en el que: a) el mamífero tiene una enfermedad isquémica; b) el mamífero tiene una enfermedad cardiovascular; c) el mamífero ha recibido un órgano trasplantado; d) el tejido se localiza en una extremidad del mamífero y el mamífero tiene diabetes; o e) el tejido comprende una lesión cutánea asociada con una úlcera diabética.

Description

P�ptidos de neublastina para su uso en el aumento de la vascularizaci�n en tejido con flujo sanguíneo deteriorado

Campo técnico

La invención se refiere a química proteica, biología molecular y biología vascular.

Antecedentes

La neublastina, también conocida como artemina y enovina, es una proteína secretada, homodim�rica de 24 kDa que promueve la extensión y supervivencia de neuronas en el sistema nervioso central y periférico (Baudet et al., 2000, Development, 127: 4335; Masure et al., 1999, Eur. J. Biochem., 266: 892; Rosenblad et al., 2000, Mol. Cell Neurosci., 15(2): 199). El ARNm de neublastina se expresa predominantemente en ri��n y pulmón embrionario, y en adultos se expresa más en la glándula hip�fisis, tráquea y placenta (Baudet et al., 2000, Development, 127: 4335).

La neublastina es un miembro de la familia de ligandos del factor neurotr�fico derivado de línea celular glial (GDNF). Los ligandos GDNF activan tanto Ras como las vías de transducci�n de señal de fosfatidilinositol-3-quinasa interaccionando con la tirosina quinasa receptora c-RET unida a membrana. Esta se�alizaci�n mediada por c-RET requiere un co-receptor adicional, una proteína de receptor alfa de la familia GDNF (GFR!) anclado a glicosilfosfatidilinositol (GPI), que confiere especificidad al ligando a c-RET. Se han identificado cuatro proteínas de co-receptores GFR! (GFR!1-4). La neublastina muestra la mayor afinidad por GFR!3 in vitro, sin embargo en estudios que usan fibroblastos humanos, la neublastina puede estimular la se�alizaci�n dependiente de c-RET mediante GFR!3 o GRF!1 (Baudet et al., 2000, Development, 127: 4335; Masure et al., 1999, Eur. J. Biochem. 266: 892; Rosenblad et al., 2000, Mol. Cell Neurosci., 15(2): 199).

La neublastina y los otros miembros de la familia GDNF son miembros de la s�per familia del factor de crecimiento transformante beta (TGF beta) y por lo tanto se caracterizan por la presencia de siete restos de ciste�na conservados con separación similar que forman la estructura de un nudo de ciste�na (Saarma, 1999, Microsc. Res. Tech., 45: 292). Cada mon�mero contiene dos enlaces disulfuro que forman una estructura en bucle cerrado que rodea el tercer disulfuro para formar una estructura de nudo estrecho. La séptima ciste�na contenida dentro de cada mon�mero forma un enlace disulfuro intermolecular, que une covalentemente los mon�meros para formar el producto dim�rico final (Rattenholl et al 2000, J. Mol. Biol., 305: 523).

Sumario

La presente invención, se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que la administración de neublastina a un mamífero promueve la neovascularizaci�n y aumento de flujo sanguíneo a tejido muscular isqu�mico después de oclusión arterial.

En un aspecto, la invención presenta un método para aumentar la vascularizaci�n en un tejido, incluyendo dicho método las siguientes etapas: seleccionar un mamífero que muestra flujo sanguíneo deteriorado o inadecuado en un tejido (por ejemplo, un tejido isqu�mico tal como un tejido muscular isqu�mico); y administrar al mamífero una cantidad de un polip�ptido eficaz para aumentar la vascularizaci�n en el tejido, en el que el polip�ptido contiene una secuencia de amino�cidos que es el al menos el 80 % idéntica a los amino�cidos 15-113 de SEC ID N�: 1, y en el que el polip�ptido, cuando se dimeriza, se une con un complejo que contiene GFRalfa3 y RET. También se desvela el uso de un polip�ptido que contiene una secuencia de amino�cidos que es al menos el 80 % idéntica a los amino�cidos 15-113 de SEC ID N�: 1, en el que el polip�ptido, cuando se dimeriza, se une con un complejo que contiene GFRalfa3 y RET para la preparación de una composición farmacéutica para aumentar la vascularizaci�n en un tejido de un mamífero que muestra flujo sanguíneo deteriorado o inadecuado.

La secuencia de amino�cidos contenida en el polip�ptido de los métodos y usos descritos en el presente documento puede ser opcionalmente al menos 90 % idéntica (por ejemplo, al menos 95 % o 98% idéntica) a los amino�cidos 15-113 de SEC ID N�: 1. El polip�ptido contiene o consiste en los amino�cidos 10-113 de SEC ID N�: 1, los amino�cidos 15-113 de SEC ID N�: 1, los amino�cidos 15-113 de SEC ID N�: 2, los amino�cidos 15-113 de SEC ID N�: 3, los amino�cidos 15-113 de SEC ID N�: 4, los amino�cidos 15-113 de SEC ID N�: 5, los amino�cidos 15-113 de SEC ID N�: 8 o los amino�cidos 15-113 de SEC ID N�: 9. Por ejemplo, el polip�ptido puede contener o consistir en la secuencia de amino�cidos de SEC ID N�: 1, la secuencia de amino�cidos de SEC ID N�: 2, la secuencia de amino�cidos de SEC ID N�: 3, la secuencia de amino�cidos de SEC ID N�: 4, la secuencia de amino�cidos de SEC ID N�: 5, la secuencia de amino�cidos de SEC ID N�: 8 o la secuencia de amino�cidos de SEC ID N�: 9.

El polip�ptido puede administrarse al mamífero, por ejemplo, mediante administración sist�mica (por ejemplo, administración subcutánea o intravenosa) o administración local.

El tejido que tiene flujo sanguíneo deteriorado o inadecuado puede localizarse opcionalmente en una extremidad (por ejemplo, manos o pies) del mamífero. El tejido que tiene flujo sanguíneo deteriorado o inadecuado contiene una

lesi�n cut�nea (por ejemplo, una lesión cut�nea asociada con una úlcera diab�tica, tal como una úlcera diab�tica del pie).

El mamífero tratado de acuerdo con los métodos y usos descritos en el presente documento puede ser, por ejemplo, un ser humano, un ratón, una rata, una vaca, un cerdo, un perro, un gato o un mono.

En algunos aspectos de los métodos y usos descritos en el presente documento, el corazón del mamífero muestra flujo sanguíneo deteriorado y la administración del polip�ptido aumenta la vascularizaci�n del corazón, el mamífero ha padecido un ictus y muestra flujo sanguíneo deteriorado o inadecuado en el tejido como resultado del ictus, el mamífero ha padecido un infarto de miocardio y muestra flujo sanguíneo deteriorado o inadecuado en el tejido como resultado del infarto de miocardio, el mamífero tiene una enfermedad de las arterias coronarias y muestra flujo sanguíneo deteriorado o inadecuado en el tejido como resultado de la enfermedad de las arterias coronarias, y/o el mamífero ha recibido un órgano trasplantado (por ejemplo, un corazón o dermis) y la administración del polip�ptido aumenta la vascularizaci�n en el órgano trasplantado.

Un mamífero tratado de acuerdo con los métodos y usos descritos en el presente documento puede tener una enfermedad o trastorno tal como una enfermedad isqu�mica, una enfermedad cardiovascular y/o diabetes.

Los métodos y usos descritos en el presente documento pueden incluir además administrar al mamífero uno o más de un agente antitromb�tico, un factor distinto de neublastina que aumenta la vascularizaci�n, un agente reductor del colesterol, un beta bloqueador, un agente anti-hipertensor o un agente inmunosupresor.

Los métodos y usos descritos en el presente documento pueden incluir además determinar si se ha producido vascularizaci�n aumentada después de la administración del polip�ptido.

En algunos aspectos de los métodos y usos descritos en el presente documento, no se ha diagnosticado al mamífero un trastorno neurol�gico y/o no se le ha diagnosticado un trastorno ocular.

A no ser que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto habitual en la materia. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o ensayo, los métodos y materiales ejemplares se describen posteriormente.

Otras características y ventajas resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un alineamiento de polip�ptidos de pre pro neublastina de tipo silvestre humana (SEC ID N�: 10), de ratón (SEC ID N�: 11) y de rata (SEC ID N�: 12). Las líneas verticales izquierda y derecha indican, respectivamente, el inicio de las formas maduras de 113 amino�cidos y 104 amino�cidos. El motivo de unión a heparina RRXR est� encuadrado. La Figura 2 es una gráfica de barras que representa el efecto de la administración de neublastina en vascularizaci�n post-isqu�mica en las extremidades posteriores del ratón. El eje Y corresponde a la densidad capilar, que se mide como la relación del número de capilares en la pierna isqu�mica en comparación con una pierna no isqu�mica normal. “SEM” se refiere al error t�pico de la media. Los P valores menores de 0,05 (en comparación con el control de vehículo) se indican por “*”. La Figura 3 es una gráfica de barras que representa el efecto de la administración de neublastina en flujo sanguíneo cut�neo post-isqu�mico. El eje Y indica el flujo sanguíneo como se mide por la relación de perfusi�n en la pierna isqu�mica en comparación con una pierna no isqu�mica normal. “SEM” se refiere al error t�pico de la media. Los P valores menores de 0,01 se indican por “**” y los P valores menores de 0,001 se indican por “***”.

Descripci�n detallada

La presente invención proporciona composiciones para su uso en el aumento de la vascularizaci�n en tejidos que muestran flujo sanguíneo deteriorado o inadecuado. Como se desvela en los ejemplos adjuntos, se descubrió que la administración de neublastina promovía la neovascularizaci�n y aumentaba el flujo sanguíneo a tejido muscular isqu�mico en un mamífero.

Polip�ptidos de neublastina

La neublastina humana de tipo silvestre madura es de 113 amino�cidos de longitud y tiene la siguiente secuencia de amino�cidos: AGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELV RFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTW RTVDRLSATACGCLG (SEC ID N�: 1). Los polip�ptidos que tienen la secuencia de amino�cidos de SEC ID N�: 1 o variantes

biol�gicamente activas de la misma pueden usarse en los métodos descritos en el presente documento. Un polip�ptido de neublastina variante puede contener una o más adicciones, sustituciones y/o deleciones, como se detalla en las siguientes secciones. Los polip�ptidos de neublastina de tipo silvestre y variantes biol�gicamente activas de los mismos se denominan colectivamente en el presente documento “polip�ptidos de neublastina”.

Un polip�ptido de neublastina variante puede variar de longitud con respecto al polip�ptido de tipo silvestre correspondiente. Aunque el polip�ptido de neublastina humana madura (SEC ID N�: 1) consiste en los 113 amino�cidos carboxilo terminales de pre pro neublastina (SEC ID N�: 10), no todos de los 113 amino�cidos son necesarios para conseguir actividad biológica de neublastina útil. Es permisible un truncamiento amino terminal. Por lo tanto, un polip�ptido de neublastina variante puede contener, por ejemplo, los 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 o 113 amino�cidos carboxilo terminales de SEC ID N�: 1 (es decir, su longitud puede ser de 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 o 113 amino�cidos).

Un polip�ptido de neublastina variante también puede variar de secuencia con respecto al polip�ptido de tipo silvestre correspondiente. En particular, ciertas sustituciones de amino�cidos pueden introducirse en las secuencias de neublastina sin pérdida apreciable de una actividad biológica de neublastina. En realizaciones ejemplares, un polip�ptido de neublastina variante (i) contiene una o más sustituciones de amino�cidos y (ii) es al menos 70 %, 80 %, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntico a SEC ID N�: 1 (o 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99 % idéntico a los amino�cidos 15-113 de SEC ID N�: 1). Un polip�ptido de neublastina variante que difiere en secuencia con respecto a SEC ID N�: 1 (o difiere en secuencia con respecto a los amino�cidos 15-113 de SEC ID N�: 1) puede incluir una o más sustituciones de amino�cidos (conservativas o no conservativas), una o más deleciones y/o una o más inserciones.

La Figura 1 es un alineamiento de los polip�ptidos de pre pro neublastina de tipo silvestre humana, de ratón y de rata. Las líneas verticales en la Figura 1 indican el inicio de la forma de 113 amino�cidos madura (línea vertical izquierda) y forma de 104 amino�cidos (línea vertical derecha) de neublastina. El motivo de unión a heparina RRXR est� encuadrado. Este alineamiento de formas bioactivas, de origen natural, de neublastina indica restos ejemplares específicos (es decir, los que no se conservan entre las formas humana, de ratón y de rata) que pueden sustituirse sin eliminar la bioactividad.

El porcentaje de identidad entre las secuencias de amino�cidos puede determinarse usando el programa BLAST

2.0. Puede realizarse comparación de secuencias usando un alineamiento sin huecos y usando los parámetros por defecto (matriz Blossom 62, coste de existencia de huecos de 11, coste de hueco por resto de 1 y una relación lambda de 0,85). El algoritmo matemático usado en programas BLAST se describe en Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research 25: 3389-3402.

Una sustitución conservativa es la sustitución de un amino�cido por otro con características similares. Las sustituciones conservativas incluye sustituciones dentro de los siguientes grupos: valina, alanina y glicina; leucina, valina e isoleucina; ácido asp�rtico y ácido glut�mico; asparagina y glutamina; serina, ciste�na y treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y tirosina. Los amino�cidos hidrófobos no polares incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, tript�fano y metionina. Los amino�cidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, ciste�na, tirosina, asparagina y glutamina. Los amino�cidos con carga positiva (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los amino�cidos con carga negativa (ácidos) incluyen ácido asp�rtico y ácido glut�mico. Cualquier sustitución de un miembro de los grupos anteriormente mencionados polar, básico o ácido por otro miembro del mismo grupo puede considerarse una sustitución conservativa.

La sustituciones no conservativas incluyen en las que (i) un resto que tiene una cadena lateral electropositiva (por ejemplo, Arg, His o Lys) sustituye a, o se sustituye por, un resto electronegativo (por ejemplo, Glu o Asp), (ii) un resto hidrófilo (por ejemplo, Ser o Thr) sustituye a, o se sustituye por, un resto hidrófobo (por ejemplo, Ala, Leu, Ile, Phe o Val), (iii) una ciste�na o prolina sustituye a, o se sustituye por, cualquier otro resto, o (iv) un resto que tiene una cadena lateral hidrófoba o aromática voluminosa (por ejemplo, Val, Ile, Phe o Trp) sustituye a, o se sustituye por, uno que tenga una cadena lateral más pequeña (por ejemplo, Ala, Ser) o ninguna cadena lateral (por ejemplo, Gly).

Un polip�ptido de neublastina variante biol�gicamente activo, cuando se dimeriza, se une con un complejo ternario que contiene GFR!3 y RET. Puede usarse cualquier método para detectar la unión con este complejo para evaluar la actividad biológica de un polip�ptido de neublastina variante. Se describen ensayos ejemplares para detectar la capacidad de unión con el complejo ternario de un polip�ptido de neublastina variante en el documento WO00/01815.

Un polip�ptido de neublastina variante también puede valorarse para evaluar su capacidad para desencadenar la cascada de se�alizaci�n de neublastina. Por ejemplo, puede usarse el ensayo de Activación de Receptor Quinasa (KIRA) para evaluar la capacidad de un polip�ptido de neublastina variante para inducir la autofosforilaci�n de RET (Véase también, Sadick et al., 1996, Anal. Biochem., 235(2): 207).

Se espera que las sustituciones en uno o más de los siguientes restos de amino�cidos den como resultado un polip�ptido de neublastina variante que tenga capacidad de unión a heparina reducida o ausente en comparación con neublastina de tipo silvestre: Arg 48, Arg 49, Arg 51, Ser 46, Ser 73, Gly 72, Arg 39, Gln 21, Ser 20, Arg 68, Arg 33, His 32, Val 94, Arg 7, Arg 9 o Arg 14. La referencia a un resto de amino�cido de neublastina por el número de posición se refiere a la numeración de los restos en relación con SEC ID N�: 1. Un resto de amino�cido de neublastina designado para sustitución (por ejemplo, un resto de arginina en la posición 48, 49 y/o 51) puede

5 sustituirse con un resto de amino�cido no conservativo (por ejemplo, ácido glut�mico) o un resto de amino�cido conservativo. Los amino�cidos ejemplares que pueden sustituirse en un resto identificado en el presente documento (por ejemplo, posición 48, 49 y/o 51) incluyen ácido glut�mico, ácido asp�rtico y alanina.

Se desvelan ejemplos de polip�ptidos de neublastina variantes que muestran unión con heparina reducida o ausente

10 en la Tabla 1 y en el documento WO 2006/023781. Los restos de amino�cidos de los polip�ptidos de neublastina variantes que est�n mutados en comparación con la posición de tipo silvestre correspondiente est�n en negrita y subrayados en la Tabla 1. Además, el polip�ptido de neublastina (por ejemplo, de 113, 99 o 104 amino�cidos de longitud) usado como el fondo para la sustitución se representa en la Tabla 1.

15 Tabla 1: Polip�ptidos de neublastina variantes

SEC ID N�

Posición sustituida Longitud del polip�ptido Secuencia de amino�cidos

2

Arg 48 113

3

Arg 49 113

4

Arg 51 113

5

Arg 48 y Arg 49 113

6

Arg 48 y Arg 49 99

7

Arg 48 y Arg 49 104

8

Arg 49 y Arg 51 113

SEC ID N�

Posición sustituida Longitud delpolip�ptido Secuencia de amino�cidos

9

Arg 48 y Arg 51 113

Un polip�ptido de neublastina puede acoplarse opcionalmente con un pol�mero (por ejemplo, un resto de polialquilenglicol tal como un resto de polietilenglicol). En algunos aspectos, el pol�mero se acopla con el polip�ptido en un sitio en el polip�ptido de neublastina que es un extremo N terminal. Un polip�ptido de neublastina variante incluye al menos una sustitución de amino�cidos con respecto a SEC ID N�:1 (o con respecto a los amino�cidos 15113 de SEC ID N�: 1), lo que proporciona un sitio de conjugación de pol�mero interno con el que puede conjugarse un pol�mero. En algunos aspectos, el pol�mero se acopla con un polip�ptido de neublastina variante en un resto (numerado de acuerdo con la secuencia de SEC ID N�: 1) seleccionado del grupo que consiste en la posición 14, la posición 39, la posición 68 y la posición 95. Se describen variantes de neublastina ejemplares que proporcionan sitios de conjugación con pol�meros internos en los documentos WO 02/060929 y WO 04/069176.

Un polip�ptido puede contener opcionalmente secuencias de amino�cidos heter�logas además de un polip�ptido de neublastina. “Heter�logo”, como se usa cuando se hace referencia a una secuencia de amino�cidos, se refiere a una secuencia que se origina de una fuente ajena a la célula hospedadora particular, o, si es de la misma célula hospedadora, se modifica con respecto a su forma original. Las secuencias heter�logas ejemplares incluyen una secuencia señal heter�loga (por ejemplo, secuencia señal de albúmina de rata nativa, una secuencia señal de rata modificada o una secuencia señal de hormona del crecimiento humana) o una secuencia usada para purificación de un polip�ptido de neublastina (por ejemplo, un marcador de histidina).

Los polip�ptidos de neublastina pueden aislarse usando métodos conocidos en la técnica. Pueden aislarse polip�ptidos de neublastina producidos de forma recombinante o de origen natural de células o fuentes tisulares usando técnicas de purificación de proteínas convencionales. Como alternativa, pueden sintetizarse químicamente polip�ptidos de neublastina mutada usando técnicas de síntesis pept�dica convencionales. La síntesis de secuencias de amino�cidos cortas est� bien establecida en la técnica de p�ptidos. Véase, por ejemplo, Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis (2� ed., 1984).

En algunos aspectos, se producen polip�ptidos de neublastina por técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, puede insertarse una molécula de ácido nucleico que codifica un polip�ptido de neublastina en un vector, por ejemplo, un vector de expresión, y el ácido nucleico puede introducirse en una célula. Las células adecuadas incluyen, por ejemplo, células de mamífero (tales como células humanas o células CHO), células f�ngicas, células de levadura, células de insecto y células bacterianas (por ejemplo, E. coli). Cuando se expresa en una célula recombinante, la célula se cultiva preferentemente en condiciones que permitan la expresión de un polip�ptido de neublastina. El polip�ptido de neublastina puede recuperarse de una suspensión celular si se desea. Como se usa en el presente documento “recuperarse” significa que el polip�ptido mutado se retira de los componentes de una célula o medio de cultivo en los que est� presente antes del proceso de recuperación. El proceso de recuperación puede incluir una o más etapas de replegamiento o purificación. Se describen tampones y métodos para inducir el plegamiento de un polip�ptido de neublastina desnaturalizado en, por ejemplo, el documento WO 2006/023782.

Pueden construirse polip�ptidos de neublastina variantes usando cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Uno de dichos métodos es la mutag�nesis dirigida, en la que se cambia un nucleótido específico (o, si se desea, un número pequeño de nucleótidos específicos) para cambiar un único amino�cido (o, si se desea, un número pequeño de restos de amino�cidos predeterminados) en el polip�ptido de neublastina variante codificado. Muchos kits de mutag�nesis dirigida est�n disponibles en el mercado. Uno de dichos kits es el “kit de mutag�nesis dirigida de sitio transformador” vendido por Clontech Laboratories (Palo Alto, CA).

Composiciones farmacéuticas

Puede incorporarse un polip�ptido de neublastina en una composición farmacéutica que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz del polip�ptido y uno o más adyuvantes, excipientes, vehículos y/o diluyentes. Los diluyentes, vehículos y excipientes aceptables típicamente no afectan de forma adversa a la homeostasis de un receptor (por ejemplo, equilibrio de electrolitos). Los vehículos aceptables incluyen sales biocompatibles, inertes o bioabsorbibles, agentes tamponantes, oligo-o polisac�ridos, pol�meros, agentes que mejoran la viscosidad, conservantes y similares. Un vehículo ejemplar es solución salina fisiológica (NaCl 0,15 M, pH 7,0 a 7,4). Otro vehículo ejemplar es fosfato sádico 50 mM, cloruro sádico 100 mM. Pueden encontrarse detalles adicionales sobre técnicas para formulación y administración de composiciones farmacéuticas en, por ejemplo, REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Maack Publishing Co., Easton, Pa.).

La administración de una composición farmacéutica que contiene un polip�ptido de neublastina puede ser sist�mica

o local. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse de tal modo que sean adecuadas para administración parenteral y/o no parenteral. Las modalidades de administración específicas incluyen administración subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transd�rmica, intratecal, oral, rectal, bucal, típica, nasal, oft�lmica, intraarticular, intra-arterial, sub-aracnoidea, bronquial, linfática, vaginal e intra-uterina.

La administración puede ser por inyecciones periódicas de una embolada de la composición farmacéutica o puede hacerse más continua por administración intravenosa o intraperitoneal a partir de un depósito que es externo (por ejemplo, una bolsa de IV) o interno (por ejemplo, un implante bioerosionable, un órgano bioartificial o una colonia de células de producción de neublastina implantadas). Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N� 4.407.957,

5.798.113 y 5.800.828. Puede conseguirse administración de una composición farmacéutica usando medios de suministro adecuados tales como: una bomba (véase, por ejemplo, Annals of Pharmacotherapy, 27: 912 (1993); Cancer, 41: 1270 (1993); Cancer Research, 44: 1698 (1984)); microencapsulaci�n (véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N� 4.352.883; 4.353.888; y5.084.350; implantes de pol�meros de liberación continua (véase, por ejemplo, Sabel, Patente de Estados Unidos N� 4.883.666); macroencapsulaci�n (véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N� 5.284.761. 5.158.881. 4.976.859 y4.968.733 y solicitudes de Patente de PCT Publicadas WO92/19195, WO 95/05452), inyección, bien por vía subcutánea, intravenosa, intra-arterial, intramuscular o en otro sitio adecuado; o administración oral, en cápsula, líquido, comprimido, píldora o formulación de liberación prolongada.

Los ejemplos de sistemas de suministro parenteral incluyen partículas de copol�mero de etilen-vinil acetato, bombas osm�ticas, sistemas de infusión implantables, suministro por bomba, suministro en células encapsuladas, suministro lipos�mico, inyección suministrada por aguja, inyección sin aguja, nebulizador, aerosolizador, electroporaci�n y parche transd�rmico.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral convenientemente contienen una preparación acuosa estéril del polip�ptido de neublastina, que preferentemente es isot�nica con la sangre del receptor (por ejemplo, solución salina fisiológica). Pueden presentarse formulaciones en formas de dosis unitaria o multidosis.

Una formulación ejemplar contiene un polip�ptido de neublastina descrito en el presente documento y los siguientes componentes del tampón: succinato sádico (por ejemplo, 10 mM); NaCl (por ejemplo, 75 mM); y L-arginina (por ejemplo, 100 mM).

Las formulaciones adecuadas para administración oral pueden presentarse como unidades discretas tales como cápsulas, obleas, comprimidos o grageas, conteniendo cada una una cantidad predeterminada del polip�ptido de neublastina; o una suspensión en un licor acuoso o un líquido no acuoso, tal como un jarabe, un elixir, una emulsión

o una corriente.

Un polip�ptido de neublastina adecuado para administración típica pueda administrarse a un mamífero (por ejemplo, paciente humano) como, por ejemplo, una crema, una pulverización, una espuma, un gel, un ungüento, una pomada o una aplicación seca. Una aplicación seca puede rehidratarse en el sitio de administración. Los polip�ptidos de neublastina también pueden infundirse directamente en (por ejemplo, empaparse en y secarse) una venda, gasa o parche, que después puede aplicarse por vía típica. Los polip�ptidos de neublastina también pueden mantenerse en un estado semil�quido, gelificado o completamente líquido en una venda, gasa o parche para administración típica (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N� 4.307.717).

Pueden administrarse cantidades terapéuticamente eficaces de una composición farmacéutica a un sujeto que lo necesite en un régimen de dosificación determinable por un experto en la materia. Por ejemplo, puede administrarse una composición a un sujeto, por ejemplo, por vía sist�mica a una dosificación de 0,01 ∀g/kg a 1000 ∀g/kg de peso corporal del sujeto, por dosis. En otro ejemplo, la dosificación es de 1 ∀g/kg a 100 ∀g/kg de peso corporal del sujeto, por dosis. En otro ejemplo, la dosificación es de 1 ∀g/kg a 30 ∀g/kg de peso corporal del sujeto, por dosis, por ejemplo, de 3 ∀g/kg a 10 ∀g/kg de peso corporal del sujeto, por dosis.

Para optimizar la eficacia terapéutica, puede administrarse en primer lugar un polip�ptido de neublastina en diferentes regímenes de dosificación. La dosis unitaria y el régimen dependen de factores que incluyen, por ejemplo, la especie de mamífero, su estado inmunitario, el peso corporal del mamífero. Típicamente, los niveles de proteína en tejido se controlan usando ensayos de exploración apropiados como parte de un procedimiento de ensayo cl�nico, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado.

La frecuencia de dosificación para un polip�ptido de neublastina est� dentro de la experiencia y el criterio cl�nico de los m�dicos. Típicamente, el régimen de administración se establece por ensayos cl�nicos que pueden establecer parámetros de administración óptimos. Sin embargo, el practicante puede variar dichos regímenes de administración de acuerdo con la edad, salud, peso, sexo y estado m�dico del sujeto. La frecuencia de dosificación puede variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico.

M�todos de tratamiento

Los polip�ptidos de neublastina descritos en el presente documento pueden usarse para aumentar la vascularizaci�n en un mamífero que muestre flujo sanguíneo deteriorado o inadecuado en un tejido. Por ejemplo, un polip�ptido de neublastina puede usarse para tratar un mamífero (por ejemplo, un ser humano) que tenga, se sospeche que tenga, o est� en riesgo de desarrollar, un trastorno isqu�mico tal como isquemia muscular, corazón isqu�mico (por ejemplo, resultante de infarto de miocardio), una úlcera de dec�bito, isquemia resultante de venas varicosas, complicaciones isqu�micas de la diabetes (por ejemplo, una lesión cut�nea tal como lesión del pie), ri��n isqu�mico, cerebro isqu�mico (por ejemplo, resultante de un ictus) o hígado isqu�mico. Además, puede usarse un polip�ptido de neublastina para aumentar la vascularizaci�n en un mamífero que ha recibido un órgano trasplantado y que necesita vascularizaci�n del órgano. Se revisan ejemplos de afecciones m�dicas específicas que pueden tratarse o prevenirse por la administración de un polip�ptido de neublastina en las siguientes secciones.

(i) Ictus

El ictus (por ejemplo, ictus isqu�mico, ictus tromb�tico, ictus emb�lico, ictus de hipoperfusi�n sist�mica, ictus hemorrágico, ictus hemorrágico intracerebral o ictus hemorrágico subaracnoideo) es un trastorno caracterizado por flujo sanguíneo deteriorado o inadecuado a una o más regiones del cerebro. La alteración de la perfusi�n puede ser venosa, pero es más frecuentemente arterial. La pérdida o reducción del flujo sanguíneo al cerebro da como resultado daño a las áreas isqu�micas, que puede deteriorar gravemente la función cerebral local o global. Puede administrarse un polip�ptido de neublastina descrito en el presente documento (por ejemplo, por vía intravenosa, por vía subcutánea, por vía intranasal o por suministro local intracraneal) a un sujeto para aumentar el flujo sanguíneo a una o más regiones del cerebro para prevenir o reducir de este modo el daño provocado por un ictus. Cuando el sujeto est� en riesgo de tener un ictus (por ejemplo, un sujeto al que se ha diagnosticado que tiene una oclusión parcial de una arteria en el cerebro), puede administrarse neublastina al sujeto para evitar la aparición, o reducir la gravedad, de un ictus.

Los factores de riesgo para desarrollar un ictus incluyen, por ejemplo, un historial familiar de ictus, mayor edad, raza, hipertensión, niveles de colesterol elevados (particularmente LDL elevado), tabaquismo, diabetes y obesidad.

El ictus puede diagnosticarse o evaluarse, por ejemplo, por la gravedad y/o número de síntomas presentados por un sujeto. Los síntomas de ictus pueden variar dependiendo de la región específica del cerebro que se vea afectada. Los síntomas de ictus incluyen, por ejemplo, debilidad (hemiplejia), entumecimiento, reducción de la sensación sensorial o vibratoria, sentidos alterados (por ejemplo, olfato, gusto, oído o vista (total o parcial)), caída de un párpado (ptosis), reflejos reducidos (por ejemplo, náuseas, degluci�n), sensación reducida y debilidad muscular de la cara, problemas de equilibrio, respiración alterada, ritmo cardiaco alterado, afasia (incapacidad de hablar o entender el lenguaje), apraxia (movimientos voluntarios alterados), vértigo y/o desequilibrio.

El ictus también puede diagnosticarse y evaluarse (por ejemplo, la gravedad del ictus o el alcance del cerebro afectado) usando una diversidad de técnicas cuantitativas incluyendo tomografía axial computarizada (CAT) tomografía computarizada (CT) o exploraciones de imágenes de resonancia magnética (MRI). Un profesional m�dico también puede usar diagnósticos más cualitativos para diagnosticar o evaluar a un sujeto que tiene un ictus, por ejemplo, evaluando la capacidad de un sujeto para sonreír, elevar una o ambas extremidades, decir frases sencillas y/o complejas de forma coherente, capacidad para andar o mantener el equilibrio o cualquier otro síntoma del ictus descrito en el presente documento.

Adem�s de la administración de un polip�ptido de neublastina descrito en el presente documento, el ictus también puede tratarse por una diversidad de técnicas dependiendo del sujeto y la naturaleza de la afección. Los tratamientos habituales incluyen tromboectom�a mecánica o administración de activador de plasmin�geno tisular (tPA) u otros métodos de trombolisis.

(ii) Enfermedad cardiaca isqu�mica

La enfermedad cardiaca isqu�mica se caracteriza por flujo sanguíneo deteriorado o insuficiente al músculo cardiaco y puede estar causada por, por ejemplo, aterosclerosis en una o más arterias coronarias (enfermedad de las arterias coronarias), arritmias cardiacas, infarto de miocardio agudo, pérdida de la actividad del músculo cardiaco, o válvulas cardiacas defectuosas. La pérdida o reducción de flujo sanguíneo al corazón da como resultado daño al tejido muscular cardiaco isqu�mico, lo que puede provocar daño permanente al corazón y/o muerte del sujeto aquejado. Puede administrarse un polip�ptido de neublastina descrito en el presente documento (por ejemplo, por vía intravenosa, por vía subcutánea, o localmente por inyección mioc�rdica o epic�rdica) a un sujeto para aumentar el flujo sanguíneo a una o más regiones isqu�micas del corazón para de este modo evitar o reducir el daño provocado por la isquemia. Cuando el sujeto sea uno en riesgo de desarrollar enfermedad cardiaca isqu�mica, puede administrarse neublastina para evitar la aparición, o reducir la gravedad, de isquemia cardiaca.

Los factores de riesgo para desarrollar enfermedad cardiaca isqu�mica incluyen, por ejemplo, mala dieta, obesidad, tabaquismo, periodos de tensión elevados y/o prolongados, historial familiar (por ejemplo, una predisposición

gen�tica), estilo de vida sedentario, niveles de colesterol elevados y/o diabetes.

La enfermedad cardiaca isqu�mica puede diagnosticarse y/o evaluarse, por ejemplo, la gravedad y/o el número de síntomas de enfermedad cardiaca isqu�mica presentados por el sujeto. Los síntomas de enfermedad cardiaca isqu�mica varían y se distribuyen en gravedad e incluyen, pero sin limitación, uno o más de: dolor en el pecho, dolor del brazo izquierdo, dolor de la mandíbula, dolor del cuello, dolor de la espalda, sensación similar a ardor de estómago, apnea, piel p�lida, sudoraci�n profusa, debilidad, mareo, náuseas, vómitos, palpitaciones y/o fatiga. La enfermedad cardiaca isqu�mica puede diagnosticarse o evaluarse usando varias técnicas conocidas en este campo, incluyendo electrocardiograma (ECG), angiograma coronario, radiografía del pecho, ecocardiograma, y/o exploración de adquisición seleccionada múltiple (MUGA). La enfermedad cardiaca isqu�mica también puede diagnosticarse o evaluarse usando biomarcadores tales como el nivel de una o más enzimas cardiacas (por ejemplo, creatina quinasa, troponina I e isozimas de lactato deshidrogenasa) en la sangre de un sujeto. Los métodos adicionales para diagnosticar o evaluar a un sujeto que tiene enfermedad cardiaca isqu�mica incluyen ensayo de tensión en ejercicio, en el que se controla el corazón de un sujeto mientras que el sujeto se est� ejercitando. Puede controlarse el ritmo cardiaco del sujeto, la respiración y la presión sanguínea. También puede realizarse un ECG (mencionado anteriormente).

Adem�s de la administración de un polip�ptido de neublastina descrito en el presente documento, el tratamiento para un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad cardiaca isqu�mica puede incluir la administración de oxígeno, ácido acetilsalic�lico (aspirina), gliceril trinitrato y analgésicos. Se puede administrar a los pacientes en riesgo de desarrollar enfermedad cardiaca isqu�mica uno o más de agentes reductores de colesterol (por ejemplo, estatinas), bloqueadores beta o anti-hipertensores (por ejemplo, diuréticos, inhibidores de la enzima conversora de angiotensina, vasodilatadores o bloqueadores alfa).

(iii) úlceras

Las úlceras son lesiones cut�neas que resultan de flujo sanguíneo deteriorado o inadecuado al área afectada (por ejemplo, un pie). Dichas úlceras pueden ser el resultado de complicaciones vasculares de diabetes (por ejemplo, úlceras diab�ticas del pie), insuficiencia venosa (úlceras crurales), o presión excesiva (por ejemplo, úlceras de dec�bito o llagas de dec�bito). La pérdida o reducción de flujo sanguíneo a un área de la piel da como resultado daño y/o muerte de esa área de la piel y de tejido circundante. Puede administrarse un polip�ptido de neublastina descrito en el presente documento (por ejemplo, administrado por vía típica a la úlcera de un sujeto) a un sujeto para aumentar el flujo sanguíneo en el sitio de la úlcera o tejido circundante, reduciendo de este modo la gravedad o duración de la úlcera. Cuando el sujeto est� en riesgo de desarrollar una úlcera (por ejemplo, un sujeto paralizado en una posición prona o supina prolongada o un sujeto que tiene complicaciones cardiovasculares debido a la diabetes), puede administrarse neublastina al sujeto (por ejemplo, por administración típica a las piernas y pies de pacientes diabéticos) para evitar la aparición, o reducir la gravedad, de una úlcera.

Los factores de riesgo para desarrollar úlceras cut�neas incluyen, por ejemplo, periodos prolongados de estar sentado o tumbado (por ejemplo, posiciones supina o prona), diabetes, venas varicosas (véase posteriormente), infección y/o escasa higiene.

Los métodos para diagnosticar y/o evaluar una úlcera en un sujeto incluyen inspección visual, por ejemplo, la aparición de la úlcera en s� misma, enrojecimiento, molestias o dolor. La inspección visual también puede usarse para comprobar con respecto a síntomas indicativos del desarrollo de úlceras incluyendo, por ejemplo, reducción del sudor, piel seca y formación de fisuras, y propensión a desarrollar infecciones en el área afectada. Los síntomas de flujo sanguíneo reducido al pie (y riesgo de desarrollar úlceras del pie, por ejemplo, resultantes con frecuencia de complicaciones de la diabetes) incluyen uñas frágiles, callos y dedos en martillo. La inspección visual también puede incluir evaluar el tamaño de la úlcera y/o si la úlcera est� infectada o no. Un profesional m�dico puede administrar uno o más ensayos para determinar el nivel de flujo sanguíneo en un área que se sospecha que tiene flujo sanguíneo deteriorado o inadecuado incluyendo medición de oxígeno transcut�neo (TCOM) y un ensayo de monofilamento de nailon. La TCOM requiere la colocación de electrodos directamente en el área sospechosa de la piel. Generalmente una presión de oxígeno medida de menos de 40 mm de Hg es un indicio de que el área es deficiente en un flujo sanguíneo. El ensayo de monofilamento de nailon es un ensayo de sensación que implica el uso de un monofilamento de nailon de calibre 10 para pinchar suavemente la piel afectada. El ensayo es anómalo si el sujeto no puede sentir el tacto del monofilamento cuando se presiona contra el pie con la presión justa suficiente para doblar el filamento.

Adem�s de la administración de un polip�ptido de neublastina descrito en el presente documento, los tratamientos para úlceras cut�neas pueden implicar cirugía para retirar tejido muerto o infectado y la administración de antibióticos, cuando se requiera.

(iv) Venas varicosas

Las venas varicosas (insuficiencia venosa) es un trastorno caracterizado por una incapacidad de las venas (generalmente de las piernas) para transportar oxígeno desoxigenado de vuelta al corazón. La insuficiencia venosa

puede resultar de un trombo (coágulo sanguíneo) o daño a, o pérdida de elasticidad de, válvulas venosas. Puede administrarse un polip�ptido de neublastina descrito en el presente documento (por ejemplo, por vía típica a las piernas del sujeto, por vía subcutánea o por vía intravenosa a las venas afectadas) a un sujeto para aumentar el flujo sanguíneo en las piernas de vuelta al corazón, reduciendo de este modo la gravedad de, o complicaciones debidas a, venas varicosas. Cuando el sujeto est� en riesgo de desarrollar venas varicosas (por ejemplo, un sujeto que tiene uno o más factores de riesgo para venas varicosas), puede administrarse neublastina al sujeto para evitar la aparición, o reducir la gravedad, de las venas varicosas.

Los factores de riesgo para desarrollar venas varicosas incluyen, por ejemplo, edad avanzada, sexo del sujeto (las mujeres tienen más probabilidades que los hombres de desarrollar venas varicosas), historial familiar (por ejemplo, una predisposición genética), obesidad y/o profesiones que impliquen estar de pie durante periodos prolongados de tiempo.

La insuficiencia venosa puede diagnosticarse y/o evaluarse en un sujeto, por ejemplo, por la gravedad y/o número de síntomas presentados por el sujeto incluyendo, por ejemplo, dolor o pesadez en la pierna, pies y tobillos, hinchazón, úlceras de la piel o hemorragia grave si se daña la vena. Puede diagnosticarse o evaluarse VI en un sujeto usando una diversidad de técnicas incluyendo Ultrasonido doble o de Doppler, una técnica no invasiva que usa ultrasonidos para visualizar coágulos u otras anomalías en los vasos sanguíneos. Otros métodos para diagnosticar/evaluar la insuficiencia venosa incluyen exploración de CT, venograf�a, angiograf�a tal como rayos X o angiograf�a por resonancia magnética (MRA).

Adem�s de la administración de un polip�ptido de neublastina descrito en el presente documento, los tratamientos para insuficiencia venosa pueden incluir, por ejemplo, cirugía con láser, seleroterapia/microescleroterapia, separación quirúrgica de las venas, flebectom�a ambulatoria y cirugía venosa endosc�pica. Las terapias no quirúrgicas incluyen, cuando se produce insuficiencia venosa en las piernas, elevación de las piernas, terapia de compresión (calcetines o medias de compresión), ejercicio, pérdida de peso y cuidado de la piel.

(v) órganos trasplantados

Un trasplante de órganos es un proceso en el que un órgano completo o parcial se transfiere de un sujeto a otro sujeto. Los órganos trasplantados incluyen, por ejemplo, corazón, pulmón, hígado, ri��n, intestino delgado, páncreas, mano, dedo (del pie o de la mano), o piel (por ejemplo, un injerto cut�neo tal como un trasplante de cara; véase posteriormente). Para que un trasplante de órgano sea exitoso, debe producirse vascularizaci�n entre el órgano trasplantado y el hospedador. Por lo tanto, puede administrarse un polip�ptido de neublastina descrito en el presente documento a un sujeto para promover la vascularizaci�n entre el órgano trasplantado y el hospedador y un aumento del flujo sanguíneo al órgano trasplantado, evitando de este modo el fallo del injerto.

Un trasplante de órgano común es un injerto cut�neo, en el que se retira quirúrgicamente una región de la dermis de un área del cuerpo y se trasplanta a otra. Los injertos cut�neos pueden ser aut�logos (del mismo sujeto) o pueden ser heter�logos (de un sujeto diferente). En algunos casos, el tejido cut�neo puede obtenerse de un animal de una especie diferente del sujeto receptor (por ejemplo, xenotrasplante). Pueden realizarse injertos cut�neos en un sujeto que haya, por ejemplo, padecido quemaduras extensivas o tenga infecciones cut�neas con áreas de pérdida de piel. En estos casos, se usan con frecuencia injertos cut�neos para minimizar la concentración bacteriana en el sitio de pérdida de piel y/o evitar la pérdida de fluidos. También se usan injertos cut�neos en cirugía cosm�tica, tal como cirugías electivas o las que acompañan procedimientos quirúrgicos tales como una mastectom�a o reconstrucción de la pared torácica. Los injertos cut�neos pueden ser extensivos tales como un trasplante de cara completo o parcial. Como se ha analizado anteriormente, para que un injerto cut�neo sea exitoso, debe producirse vascularizaci�n entre el sitio de injerto y el tejido injertado. Por lo tanto, un polip�ptido de neublastina descrito en el presente documento puede administrarse a un sujeto para promover la vascularizaci�n entre la piel injertada y el hospedador para aumentar el flujo sanguíneo a la piel injertada, evitando de este modo el fallo del injerto.

El control del éxito de un injerto cut�neo puede realizarse de una diversidad de maneras incluyendo inspección visual, por ejemplo, comprobando el color de la piel injertada, controlando con respecto a un retorno de las sensaciones al área injertada, o controlando la temperatura de la piel injertada. El flujo sanguíneo en una región o regiones de la piel injertada puede medirse directamente, por ejemplo, usando control de perfusi�n de láser Doppler (véase posteriormente).

Un sujeto que se sospecha que tiene un trastorno caracterizado por flujo sanguíneo deteriorado o inadecuado, como se usa en el presente documento, es un sujeto que tiene uno o más síntomas para un trastorno particular caracterizado por flujo sanguíneo deteriorado o inadecuado (tal como cualquiera de los descritos en el presente documento). Por ejemplo, un sujeto que se sospecha que tiene un ictus puede ser uno que tenga uno o más síntomas de un ictus tales como, pero sin limitación: debilidad, entumecimiento, caída de un párpado (ptosis), reflejos reducidos (por ejemplo, náuseas, degluci�n), sensación reducida y debilidad muscular de la cara, afasia, apraxia o cualquier otro síntoma descrito en el presente documento.

Un sujeto en riesgo de desarrollar un trastorno caracterizado por flujo sanguíneo deteriorado o inadecuado, como se usa en el presente documento, es un sujeto que tiene uno o más factores de riesgo de un trastorno particular caracterizado por flujo sanguíneo deteriorado o inadecuado. Por ejemplo, un sujeto en riesgo de desarrollar enfermedad cardiaca isqu�mica puede ser un sujeto con uno o más factores de riesgo para desarrollar enfermedad cardiaca isqu�mica incluyendo, por ejemplo, mala dieta, obesidad, tabaquismo, periodos de tensión prolongados y/o elevados, estilo de vida sedentaria, niveles de colesterol elevados, diabetes o cualquier otro factor de riesgo descrito en el presente documento.

Puede administrarse un polip�ptido de neublastina a un sujeto de diversas maneras dependiendo, al menos en parte, del tipo de trastorno que se trate y la localización en el cuerpo del flujo sanguíneo deteriorado o inadecuado. Es decir, en realizaciones en las que un trastorno es de naturaleza cut�nea, tal como una lesión cut�nea, una úlcera de dec�bito o una úlcera diab�tica (por ejemplo, úlcera de pie diabético), puede administrarse por vía típica un polip�ptido de neublastina. Por ejemplo, puede administrarse un polip�ptido de neublastina a un sujeto en una crema, pomada o ungüento. Las composiciones de neublastina descritas en el presente documento también pueden infundirse en una venda, gasa o parche (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N� 4.307.717). En realizaciones en las que un trastorno caracterizado por flujo sanguíneo deteriorado o inadecuado en un sujeto es interno (por ejemplo, un ictus, enfermedad cardiaca isqu�mica o trasplante de órganos), puede administrarse neublastina al sujeto por vía intravenosa, por vía subcutánea o localmente en el sitio en el que se necesita vascularizaci�n aumentada. Por ejemplo, puede administrarse neublastina a un ri��n o corazón trasplantado y/o el tejido hospedador circundante durante una operación de trasplante.

Terapia de combinación

Puede administrarse un polip�ptido de neublastina descrito en el presente documento a un sujeto como una monoterapia o como parte de un régimen multiterap�utico junto con uno o más agentes adicionales que proporcionan un beneficio terapéutico a un sujeto que tiene un trastorno caracterizado por flujo sanguíneo deteriorado o inadecuado. Por ejemplo, puede coadministrarse un polip�ptido de neublastina con un factor angiog�nico adicional tal como Angiogenina, Angiopoyetina-1, Del-1, un factor de crecimiento de fibroblastos (por ejemplo, aFGF, bFGF o FGF2), Folistatina, Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos (G-CSF), Factor de Crecimiento de Hepatocitos (HGF), Interleucina-8 (IL-8), Leptina Midkina, Factor de Crecimiento Placentario, Factor de Crecimiento de Células Endoteliales Derivado de Plaquetas (PD-ECGF), Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas BB (PDGF-BB), Pleiotropina (PTN), Progranulina, Proliferina, Factor de Crecimiento Transformante Alfa (TGF-alfa), Factor de Crecimiento Transformante Beta (TGF-beta), Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNFalfa), y/o Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF). Además puede administrarse un polip�ptido de neublastina en combinación con uno o más agentes terapéuticos que no aumentan la vascularizaci�n pero son de otro modo beneficiosos para un sujeto que tiene un trastorno caracterizado por flujo sanguíneo deteriorado o inadecuado. Por ejemplo, puede coadministrarse un polip�ptido de neublastina con uno cualquiera de un agente antitromb�tico (por ejemplo, aspirina, estreptoquinasa, uroquinasa, activador de plasmin�geno tisular, heparina o hirudina), un analgésico, un antibiótico, un agente reductor del colesterol (por ejemplo, una estatina), un beta bloqueador y/o un antihipertensor (por ejemplo, un diurético, un inhibidor de enzima conversora de angiotensina, un vasodilatador o un alfa bloqueador). Cuando se usa un polip�ptido de neublastina para aumentar la vascularizaci�n de un órgano que se ha trasplantado a un receptor (por ejemplo, un corazón, hígado, ri��n, pulmón, extremidad tal como un dedo, o dermis trasplantado), el polip�ptido de neublastina puede coadministrarse opcionalmente con uno o más agentes inmunosupresores.

El polip�ptido de neublastina y el o los agentes adicionales pueden administrarse al mismo tiempo, el polip�ptido de neublastina puede administrarse en primer lugar y el o los agentes adicionales administrarse en segundo lugar, o el

o los agentes adicionales pueden administrarse en primer lugar y el polip�ptido de neublastina administrarse en segundo lugar.

La neublastina puede opcionalmente reemplazar o aumentar una terapia administrada previamente o simultáneamente. Por ejemplo, tras tratar con un polip�ptido de neublastina, la administración del o los agentes adicionales puede cesar o reducirse (por ejemplo, administrarse a menores niveles). En algunos casos, puede mantenerse una terapia previa hasta que el nivel de neublastina (por ejemplo, la dosificación o programa) alcance un nivel suficiente para proporcionar un efecto terapéutico al sujeto. En casos en los que una terapia previa es particularmente tóxica o se tolera escasamente por un sujeto, puede usarse la administración de un polip�ptido de neublastina para compensar y/o reducir la cantidad de la terapia previa (por ejemplo, una terapia angiog�nica) hasta un nivel suficiente para proporcionar el mismo beneficio terapéutico o uno mejorado, pero sin la toxicidad.

En algunos casos en los que un sujeto no responde a una primera terapia, puede administrarse a un sujeto neublastina. Por ejemplo, si el sujeto (por ejemplo, un paciente humano) no responde a un primer tratamiento tal como VEGF (u otro factor angiog�nico descrito en el presente documento), puede administrarse al sujeto un polip�ptido de neublastina. Como se usa en el presente documento, un “sujeto no sensible a un tratamiento” se refiere a un paciente en el que el tratamiento con una o más terapias angiog�nicas por s� solas (es decir, no combinadas con neublastina) no da como resultado mejora clónica significativa, más particularmente no da como resultado una mejora significativa (y preferentemente a largo plazo) de los parámetros usados para medir la eficacia

angiog�nica (tales como, pero sin limitación ensayo de ejercicio de cinta de correr (ETT o ensayo de tensión de ejercicio), tiempo de angina y frecuencia de angina) (véase, por ejemplo, Fam et al. (2003) Circulation 108: 2613). Un ejemplo de dicho grupo de sujetos que no responden a una terapia angiog�nica de VEGF se describe en Henry et al. (2003) Circulation 107: 1359 1365.

Evaluaci�n de la eficacia de los tratamientos

La eficacia de un tratamiento de neublastina puede evaluarse por cualquiera de los métodos descritos en el presente documento (por ejemplo, controlando directamente el nivel de crecimiento de nuevos vasos sanguíneos o evaluando una característica o síntoma particular de un trastorno caracterizado por flujo sanguíneo deteriorado o inadecuado). Por ejemplo, la cantidad o densidad de vasculatura en el cerebro de un sujeto puede medirse (por ejemplo, antes y después del tratamiento) usando MRI (véase, por ejemplo, Dunn et al. (2004) Magn Reson. Med. 51(1): 55-61) o técnicas de ultrasonido tales como adaptaciones de las descritas en Fosberg et al. (2004) Ultrasonics 42(1): 325

330. El efecto del tratamiento con neublastina en la promoción de la neovascularizaci�n también puede evaluarse controlando un aumento en el flujo sanguíneo usando, por ejemplo, técnicas de láser Doppler como se describen en, por ejemplo, Freccero et al. (2003) Microvasc Res. 66(3): 183-9; y Rendell et al. (1989) Diabetes 38(7): 819-824. Un dispositivo ejemplar útil para medir el flujo sanguíneo cut�neo por técnica de láser Doppler es el DRT4 (Moor Instruments, Devon, Reino Unido). Además, la eficacia de la neublastina para promover la vascularizaci�n de un órgano trasplantado (por ejemplo, un ri��n, corazón o piel trasplantado) puede medirse por un aumento en la función del órgano trasplantado o un aumento en la salud del órgano (por ejemplo, por biopsia) después del tratamiento.

La eficacia de un tratamiento puede valorarse evaluando al sujeto antes y después del tratamiento (por ejemplo, comparando la tensión de oxígeno en un área afectada antes o después del tratamiento). Cuando va a evaluarse la progresión de mejora en un trastorno después de uno o más tratamientos con neublastina, un sujeto puede evaluarse en múltiples puntos temporales después del tratamiento con neublastina (por ejemplo, una evaluación de un día, dos días y una semana; una evaluación de una semana, un mes y seis meses; una evaluación de un mes, seis meses y un año).

Cuando la administración de neublastina se usa para prevenir la aparición de un trastorno caracterizado por flujo sanguíneo deteriorado o inadecuado (por ejemplo, una lesión tal como una úlcera del pie debida a complicaciones vasculares de la diabetes), la eficacia puede evaluarse como un retardo en la presentación de, o una incapacidad para presentar, uno o más síntomas del trastorno. La eficacia de un tratamiento a lo largo del tiempo para aliviar uno

o más síntomas de un trastorno puede determinarse evaluando, por ejemplo, el número o gravedad de uno o más síntomas en múltiples puntos temporales después del tratamiento. Por ejemplo, un sujeto puede tener una evaluación inicial de la gravedad de su trastorno, administr�rsele un tratamiento y después evaluarse dos o más veces después del tratamiento (por ejemplo, a una semana y un mes; a un mes y dos meses; a dos semanas, un mes y seis meses; o seis semanas, seis meses y un año). Cuando se administran uno o más tratamientos de neublastina a un sujeto durante un periodo de tiempo limitado (por ejemplo, una duración predeterminada) o número de administraciones, el efecto del tratamiento en el alivio de uno o más síntomas de un trastorno caracterizado por flujo sanguíneo deteriorado o inadecuado puede evaluarse en diversos puntos temporales después del tratamiento final. Por ejemplo, después de la última administración de una dosis de neublastina, el número o gravedad de los síntomas de un paciente puede evaluarse en 1 mes (por ejemplo, en 2 meses, en 6 meses, en un año, en dos años, en 5 años o más) después del tratamiento final.

Modelos animales de trastornos caracterizados por flujo sanguíneo deteriorado o inadecuado

Los Ejemplos posteriores describen un sistema de modelo animal in vivo útil para estudiar el efecto del tratamiento con neublastina en un trastorno isqu�mico. La eficacia de dicho tratamiento puede evaluarse por análisis directo del tejido isqu�mico, por ejemplo, midiendo la necesidad capilar en un músculo isqu�mico usando técnicas de inmunohistoqu�mica y/o midiendo el flujo sanguíneo en un músculo isqu�mico. Para evaluar la prevención o aparición retardada de un trastorno caracterizado por el flujo sanguíneo deteriorado o inadecuado, también puede administrarse un polip�ptido de neublastina a un animal antes de inducir el trastorno. Los modelos animales adicionales (por ejemplo, modelos de ratón) útiles para evaluar la eficacia de los tratamientos de neublastina para aumentar la vascularizaci�n incluyen los descritos en, por ejemplo, Couffinhal et al. (1988) Am J. Pathol. 152(6): 1667-1679; Cao et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(24): 14389-14394; y Salven et al. (2002) FASEB J. 16: 1471-1473. Se describe un modelo animal para curación de heridas deteriorada en diabetes en, por ejemplo, Tsuboi et al. (1992) J. Dermatol. 19(11): 673-75.

Ejemplos

Ejemplo 1: La neublastina promueve la neovascularizaci�n post-isqu�mica

Se us� un modelo murino de isquemia de las extremidades posteriores para determinar si la administración de neublastina aumenta la vascularizaci�n en mamíferos. Se ligaron quirúrgicamente las arterias femorales derechas de las extremidades posteriores de ratones. Se administr� neublastina por vía subcutánea tres veces por semana a una dosificación de 1 miligramo por kilogramo (mg/kg) o 0,1 mg/kg. Como alternativa, se administr� a un conjunto de ratones solamente vehículo (sin neublastina) como un control. Se evaluaron diez ratones en cada grupo. Veintiún días (3 semanas) después, los ratones se sacrificaron y se retiraron los músculos gastrocnemio.

Se evalu� la densidad de vasos por microangiograf�a de alta definición al final del periodo de tratamiento, como se

5 describe en Silvestre et al. (2005) Nat. Med. 11(5): 499-506. Brevemente, se anestesi� a los ratones (inhalaci�n de isoflurano) y se inyect� un medio de contraste (sulfato de bario, 1 g/ml) a través de un catéter introducido en la aorta abdominal. Se ensamblaron imágenes (dos por animal) adquiridas por un transductor de rayos X digital para obtener una vista completa de las extremidades posteriores. La densidad de vasos se expres� como un porcentaje de p�xeles por imagen ocupada por vasos en el área de cuantificación. La zona de cuantificación se deline� por el lugar

10 de la ligadura en la arteria femoral, la rodilla, el extremo del fémur, y el límite externo de la pierna. Ambas dosificaciones de neublastina aumentaron la puntuación angiogr�fica en músculos de extremidades posteriores isqu�micas en comparación con el control solamente con vehículo (Fig. 2). Estos resultados indican que la administración de neublastina induce vascularizaci�n en tejido isqu�mico.

15 Ejemplo 2: La neublastina promueve el flujo sanguíneo cut�neo post-isqu�mico

Para determinar si el tratamiento con neublastina aumenta el flujo sanguíneo en tejido isqu�mico (por ejemplo, piel), se ligaron arterias femorales de ratón como se ha descrito anteriormente. Se administr� neublastina de rata (la forma de 113 amino�cidos madura de la proteína) por vía subcutánea tres veces por semana durante tres semanas a un 1

20 mg/kg o 0,1 mg/kg. Como control, se trat� un conjunto de ratones solamente con vehículo.

A los 7, 14 y 21 días, se retir� el pelo de un superficie pequeña de la piel de las extremidades posteriores isqu�micas, y se evalu� el tejido expuesto para flujo sanguíneo usando control por perfusi�n de láser Doppler como se describe en, por ejemplo, Hisaka et al. (2004) J. Am. Coll. Cardiol. 43(10): 1915-22. Se realizaron mediciones

25 solamente en la pata. Se detect� un aumento de la perfusi�n de sangre cut�nea de las extremidades isqu�micas tratadas con neublastina a los 14 y 21 días (Fig. 3). Estos resultados indican que la administración de neublastina da como resultado aumento del flujo sanguíneo en tejido isqu�mico.

LISTA DE SECUENCIAS 30

<110> Biogen Idec MA Inc.

<120> COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA AUMENTAR LA VASCULARIZACI�N

35 <130> BIO13463PCTEP

<140> EP08747382.3

<141>

40 <150> PCT/US2008/062265

<151>

<150> 60/915,293

<151> 45

<160> 12

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

50 <210> 1

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

55 <400> 1 <210> 2

<211> 113 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> P�ptido generado sintéticamente 10

<400> 2

15 <210> 3

<211> 113

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> P�ptido generado sintéticamente

<400> 3

<210> 4

<211> 113 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> P�ptido generado sintéticamente 10

<400> 4

15 <210> 5

<211> 113

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> P�ptido generado sintéticamente

<400> 5

<210> 6

<211> 99 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> P�ptido generado sintéticamente 10

<400> 6

15 <210> 7

<211> 104

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> P�ptido generado sintéticamente

<400> 7

<210> 8

<211> 113

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> P�ptido generado sintéticamente

<400> 8

10

<210> 9

<211> 113 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> P�ptido generado sintéticamente 20

<400> 9

25 <210> 10

<211> 220

<212> PRT

<213> Homo sapiens

30 <400> 10

<210> 11

<211> 224

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 11

<210> 12

<211> 224

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 12

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un polip�ptido que comprende una secuencia de amino�cidos que es al menos 80 % idéntica a los amino�cidos 15-113 de SEC ID N�: 1, y en el que el polip�ptido, cuando se dimeriza, se une con un complejo que contiene GFRalfa3 y RET, para su uso en el aumento de la vascularizaci�n en un tejido en un mamífero que muestra flujo sanguíneo deteriorado o inadecuado en el tejido, en el que:

   a) el mamífero tiene una enfermedad isqu�mica; b) el mamífero tiene una enfermedad cardiovascular; c) el mamífero ha recibido un órgano trasplantado; d) el tejido se localiza en una extremidad del mamífero y el mamífero tiene diabetes; o e) el tejido comprende una lesión cut�nea asociada con una úlcera diab�tica.

2. 2.

   El polip�ptido para uso como en la reivindicación 1, en el que el tejido es un tejido isqu�mico.

3. 3.

   El polip�ptido para uso como en la reivindicación 2, en el que el tejido isqu�mico es un tejido muscular isqu�mico.

4. 4.

   El polip�ptido para uso como en la reivindicación 1, en el que el mamífero ha padecido un ictus.

5. 5.

   El polip�ptido para uso como en la reivindicación 1, en el que el mamífero tiene una enfermedad cardiaca isqu�mica.

6. 6.

   El polip�ptido para uso como en la reivindicación 1, en el que el mamífero tiene isquemia resultante de venas varicosas.

7. 7.

   El polip�ptido para uso como en la reivindicación 1, en el que el mamífero tiene complicaciones isqu�micas de diabetes.

8. 8.

   El polip�ptido para uso como en la reivindicación 1, en el que el mamífero ha padecido un infarto de miocardio.

9. 9.

   El polip�ptido para uso como en la reivindicación 1, en el que el mamífero tiene una enfermedad de las arterias coronarias.

10. 10.

    El polip�ptido para uso como en la reivindicación 1(c), en el que el órgano trasplantado es un corazón o dermis.

11. 11.

    El polip�ptido para uso como en la reivindicación 1(e), en el que la úlcera diab�tica es una úlcera de pie diabético.

12. 12.

    El polip�ptido para uso como en una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que uno o más de un agente antitromb�tico, un agente reductor del colesterol, un beta bloqueador, un agente antihipertensor o un agente inmunosupresor van a administrarse al mamífero.

13. 13.

    El polip�ptido para uso como en una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que después de la administración del polip�ptido, se determina si se ha producido vascularizaci�n aumentada.

14. 14.

    El polip�ptido para uso como en una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el polip�ptido va a administrarse al mamífero mediante administración sist�mica, subcutánea o local.

15. 15.

    El polip�ptido para uso como en una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que

    a) la secuencia de amino�cidos es al menos 90 % idéntica a los amino�cidos 15-113 de SEC ID N�: 1; b) la secuencia de amino�cidos es al menos 95 % idéntica a los amino�cidos 15-113 de SEC ID N�: 1; c) la secuencia de amino�cidos es al menos 98 % idéntica a los amino�cidos 15-113 de SEC ID N�: 1; d) el polip�ptido comprende los amino�cidos 15-113 de SEC ID N�: 1, los amino�cidos 15-113 de SEC ID N�: 2, los amino�cidos de 15-113 de SEC ID N�: 3, los amino�cidos 15-113 de SEC ID N�: 4, los amino�cidos 15-113 de SEC ID N�: 5, los amino�cidos 15-113 de SEC ID N�: 8 o los amino�cidos 15-113 de SEC ID N�: 9; o e) el polip�ptido comprende la secuencia de amino�cidos de SEC ID N�: 1, la secuencia de amino�cidos de SEC ID N�: 2, la secuencia de amino�cidos de SEC ID N�: 3, la secuencia de amino�cidos de SEC ID N�: 4, la secuencia de amino�cidos de SEC ID N�: 5, la secuencia de amino�cidos de SEC ID N�: 8 o la secuencia de amino�cidos de SEC ID N�: 9.

16. 16.

    El polip�ptido para uso como en una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que el polip�ptido comprende los amino�cidos 10-113 de SEC ID N�: 1.

17. 17.

    El polip�ptido para uso como en una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en el que no se ha diagnostico al mamífero un trastorno neurol�gico.

18. 18.

    El polip�ptido para uso como en una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en el que no se ha diagnosticado al mamífero un trastorno ocular.

19. 19.

    El polip�ptido para uso como en una cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en el que el mamífero es un ser humano.