ES2476996T3

ES2476996T3 - Tratamiento local de defectos óseos con matriz de liberación de PTH

Info

Publication number: ES2476996T3
Application number: ES06701133.8T
Authority: ES
Inventors: Jason Schense; John Watson; Isabelle Arrighi
Original assignee: Kuros Biosurgery AG
Current assignee: Kuros Biosurgery AG
Priority date: 2005-01-06
Filing date: 2006-01-06
Publication date: 2014-07-15
Anticipated expiration: 2026-01-06
Also published as: MX2007008329A; WO2006072623A1; WO2006073711A2; EP1833505A1; WO2006073711A3; US20070010440A1; JP2008526811A; AU2006204462A1; US8318674B2; KR20070108868A; EP1833505B1; RU2007129845A; CA2592877A1; BRPI0606408A2

Abstract

Uso de una formulación que comprende un factor bioactivo seleccionado del grupo que consiste de una hormona paratiroides PTH y un péptido de fusión que comprende una PTH en un primer dominio, y un dominio de sustrato covalentemente reticulable en un segundo dominio, y una composición capaz de formar una matriz que puede servir como matriz en crecimiento de células en un sitio en un hueso en necesidad de tratamiento, para la prevención o el tratamiento de una fractura en áreas de huesos no sanos afectadas por osteoporosis, en la que la formulación es para la administración local al área de huesos no sanos.

Description

Tratamiento local de defectos óseos con matriz de liberación de PTH

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método de tratamiento local de áreas en huesos no sanos afectados por osteoporosis.

Antecedentes de la invención

Osteoporosis

La pérdida ósea es una parte natural de envejecimiento con pérdida de masa ósea tanto en hombres como mujeres a una velocidad de 0,6 a 1,2% por año, partiendo en promedio entre las edades de 40 a 50. Después de la menopausia en mujeres, se acelera la pérdida ósea a 2-3% por año. Sin embargo, en particular en mujeres posmenop�usicas, la velocidad de pérdida ósea puede incrementarse dramáticamente. Este estado de enfermedad es llamado osteoporosis. La osteoporosis es de principal importancia en todo el mundo, afectando casi a 200 millones de personas. En la actualidad, 10 millones de personas en los Estados Unidos sufren de osteoporosis y además 18 millones tienen osteopenia que los pone en riesgo de desarrollar la enfermedad. De esta población en riesgo, 80% son mujeres. La osteoporosis es una enfermedad esquel�tica sist�mica, que afecta en general al esqueleto completo en el cual la masa total ósea se disminuye y la estructura ósea se deteriora, lo cual incrementa la porosidad ósea. Estos cambios en la masa y estructura ósea, reducen la resistencia total del hueso y lo hacen propenso a fracturas.

La osteoporosis es una interacción compleja entre las hormonas sist�micas y factores locales y los mecanismos celulares exactos de osteoporosis permanecen por definirse. Como un resultado de las terapias actuales, no se abordan directamente las causas de la condición. Por ejemplo, derivados de los terapéuticos más comúnmente usados, los bisfosfonatos son como máximo, solamente 50% eficaces en la reducción de la incidencia de fractura. Los bisfosfonatos actualmente aprobados para uso incluyen, alendronato (FOSAMAX�), etidronato (DIDROCAL�) y risedronato (ACTONEL�). Considerados ya sea en forma de tableta o intravenosamente, los bisfosfonatos son una familia de fármacos usados para prevenir y tratar osteoporosis mediante el revestimiento de huesos y la prevención de actividad de osteoclastos.

Quistes óseos

Los quistes óseos son áreas l�ticas uniloculares benignas usualmente en el extremo próximo de un hueso largo con márgenes endosteales estrechos y bien definidos. Un quiste óseo unicameral, de otro modo conocido como quiste óseo simple, es una cavidad llena de fluido en el hueso, revestida por tejido fibroso comprimido. Ocurre usualmente en los huesos largos de un niño en crecimiento, especialmente la parte superior del húmero (50-60% del tiempo) o parte superior del fémur (25-30% del tiempo). Otros huesos, sin embargo, pueden verse afectados. Estos quistes usualmente afectan a los niños principalmente entre las edades de 5 a 15, pero pueden afectar niños más grandes o adultos. En niños más grandes y adultos, tiende a ocurrir en huesos planos (tales como la pelvis, mandíbula, cráneo

o caja torácica) o en el hueso largo del tal�n (calcáneo).

Los quistes óseos unicamerales son considerados benignos. No son metastatizados (esparcidos) más all� del hueso. Algunos sanan espontáneamente, mientras otros se amplían. Los quistes más invasivos pueden crecer para llenar la mayoría de la met�fisis ósea (la zona de transición en donde el eje del hueso une el extremo del hueso) y causa lo que se conoce como fractura patológica. Un quiste más invasivo podría también destruir la placa de crecimiento óseo, conduciendo al acortamiento del hueso. Estos quistes son algunas veces, clasificados como o bien “activos” o bien “latentes”. Un quiste activo es adyacente a la placa de crecimiento y tiende a ampliarse, causando los problemas mencionados anteriormente. Un quiste latente es uno que es más apto para sanar con tratamiento debido a que la placa de crecimiento ha migrado lejos del quiste.

El tratamiento actual est� indicado principalmente en prevención de fracturas recurrentes. Se aplican actualmente los siguientes procedimientos quirúrgicos: Raspadas/Injerto óseo (un raspado quirúrgico del quiste con un instrumento especial llamado una cureta que tiene una cuchara, rizo o anillo en su punta), inyección de esteroide o inyección de médula ósea.

El quiste óseo subcondral periarticular, también referido como lesiones qu�sticas subcondrales (SCL), pueden ocurrir en caballos jóvenes y son una entidad clónica similar a quistes óseos unicamerales en humanos. Son entidades patológicas comúnmente reconocidas las cuales a menudo, conducen a cojera en caballos jóvenes. El sitio más común en el cual se encuentran SCL es en la babilla (el equivalente a la rodilla humana). Específicamente, los quistes óseos se encuentran en su mayoría en el aspecto que lleva el peso de la babilla (el c�ndilo femoral medio) y

rara vez en otras ubicaciones dentro de la articulación (tibia lateral próxima y c�ndilo femoral lateral). Los SCL son áreas radiolucentes del hueso que, dependiendo de su etapa de desarrollo, est�n bien demarcados del tejido circundante a través de un borde escler�tico y est�n, en general, llenos con tejido conjuntivo fibroso y fluido seroso que se asemeja al fluido sinovial. En caballos, una conexión de articulación a la superficie articular superpuesta puede encontrarse en un tercio de los casos. El tamaño de un quiste femoral medio varía desde defectos en forma de domo poco profundo (aproximadamente 8 mm x 3 mm) hasta quistes en forma ovoide grandes de 40 mm x 30 mm.

Las opciones de tratamiento para SCL que causan cojera incluyen reposo de largo plazo, terapia y cirugía corticoesteroide anti-artrítica e intra-articular. La terapia conservativa, la cual puede requerir de nueve a doce meses de reposo de ejercicios, ha sido asociada con la resolución de la cojera. Desafortunadamente, el número de caballos manejados por terapia conservativa que han sido evaluados en la literatura veterinaria es muy limitado, pero las relaciones de éxito son aproximadamente 50%.

Se han usado numerosas técnicas quirúrgicas en el tratamiento de quistes óseos equinos. El tratamiento recomendado actual involucra remoción artrosc�pica (raspada) de los contenidos qu�sticos, revestimiento de quiste y cartílago no soportado superpuesto. Técnicas adicionales usadas en un intento por intensificar la cicatrización y mejorar los resultados han incluido taladrado e injerto óseo, ambos de los cuales se considera ahora que no ofrecen beneficio. Además, los quistes óseos pueden continuar expandi�ndose y finalmente, conducir a osteoartritis secundaria en la articulación equina.

Durante los pasados veinte años, se han investigado varios factores bioactivos por su capacidad para influenciar la regeneración de tejido óseo. La hormona paratiroides (PTH) es un p�ptido de 84 amino�cidos que es elaborado y secretado por la glándula paratiroides. Esta hormona juega un papel principal en controlar los niveles de calcio en el suero a través de su acción en varios tejidos, que incluyen hueso. Estudios en humanos con varias formas de hormona paratiroides han demostrado un efecto anab�lico en el hueso cuando se aplica sist�micamente. Esto hace a la hormona paratiroides interesante para el tratamiento sist�mico de osteoporosis y trastornos óseos relacionados (patente estadounidense n.� 5.747.456 por Chorev, et al., y documento WO 00/10596 por Eli Lilly & Co.). La hormona paratiroides actúa en las células uniéndolas a un receptor de superficie celular. Este receptor es conocido por encontrarse en los osteoblastos, las células que son responsables de formar nuevos huesos.

El dominio de 34 amino�cidos N-terminal de la hormona paratiroides humana se ha notificado que es biol�gicamente equivalente a la hormona paratiroides de longitud completa. La hormona paratiroides1-34 y su modo de acción se notificaron por primera vez en la patente estadounidense n.� 4.086.196. La investigación se ha hecho en la hormona paratiroides1-34 y otras versiones truncadas de la forma de hormona paratiroides humana nativa, tal como por ejemplo, 1 a 25, 1 a 31 y 1 a 38 (véase por ejemplo, Rixon RH, et al., J Bone Miner. Res., 9(8): 1179-89 (Agosto de 1994).

El mecanismo por el cual la PTH influencia la remodelación ósea es complicado, el cual ha conducido a resultados conflictivos y subsecuentemente, a un número significativo de estudios en los mecanismos exactos involucrados. Se ha demostrado que si la PTH es administrada sist�micamente en una manera continua, tal densidad ósea disminuir�. Por el contrario, se ha reportado que si la misma molécula es administrada sist�micamente en forma puls�til, la densidad ósea se incrementar� (véase por ejemplo, documento WO 99/31137 por Eli Lilly & Co.). Esta contradicción aparente puede ser explicada por el mecanismo en el cual la PTH modula la remodelación ósea y subsecuentemente el parámetro observable de la densidad ósea. Dentro del hueso maduro, se ha mostrado sólo que el receptor de PTH est� presente en la superficie de las células del linaje de osteoblastos, pero no en osteoclastos. El papel que juega la PTH en la remodelación ósea, es dirigido a través de los osteoblastos, en contraposición a los osteoclastos. Sin embargo, las células a diferentes etapas del linaje de osteoblasto, responden diferentemente cuando se unen a la hormona paratiroides. Por lo tanto, las diferencias dramáticas que se observan cuando la PTH es administrada usando diferentes métodos, pueden ser explicadas por el entendimiento de los efectos diferentes que tiene la misma molécula en las células diferentes dentro del linaje de osteoblastos.

Cuando la PTH se une a una célula madre mesenquimal, la célula es inducida a diferenciarse en un preosteoblasto. De este modo, agregando PTH al sistema, existe un incremento en la población de preosteoblastos. Sin embargo, estas células de preosteoblastos tienen el receptor de PTH también, y el subsecuente enlace de la PTH al receptor en estas células conduce a una respuesta diferente. Cuando la PTH se une a los preosteoblastos, resulta en dos consecuencias separadas que conducen a la resorci�n ósea. Primero, inhibe la diferenciación adicional de los preosteoblastos en osteoblastos. Segundo, incrementa la secreción de interleucina 6 (IL-6) de los preosteoblastos. La IL-6 inhibe tanto la diferenciación de preosteoblastos as� como incrementa la diferenciación de preosteoclastos en osteoclastos. Esta respuesta dual a partir de las células dentro del linaje de osteoblastos, es la que proporciona la reacción compleja entre la remodelación ósea y exposición de PTH. Si la PTH se dosifica periódicamente por periodos cortos de tiempo, entonces las células madre mesenquimales son inducidas a diferenciarse en osteoblastos. Los periodos de dosificación cortos entonces previene que los preosteoblastos recientemente formados produzcan IL-6, previniendo la activación de los osteoclastos. Por lo tanto, durante los intervalos de dosificación, estos preosteoblastos recientemente formados pueden además diferenciarse en osteoblastos,

resultando en formación ósea. Sin embargo, si se aplica una dosis constante de PTH, entonces los preosteoblastos tendrán la oportunidad de comenzar a producir IL-6, activando de este modo los osteoclastos e inhibi�ndolos, conduciendo al efecto opuesto: resorci�n ósea.

Otro factor bioactivo el cual ha sido explorado es el grupo de las proteínas morfogenéticas óseas (BMP), y factores de crecimiento transformantes (TGF β). Existen al menos 20 BMP estructuralmente y funcionalmente relacionadas y varios TGF-β, los cuales son elementos de la superfamilia de TGF-beta. Las BMP fueron originalmente identificadas como reguladores de proteína de formación ósea y cartílago. También est�n involucradas en la embriog�nesis y morfogénesis de varios tejidos y órganos. Las BMP regulan el crecimiento, diferenciación, quimiotaxis y apoptosis de varios tipos celulares, que incluyen células mesenquimales, células epiteliales, células hematopoy�ticas y células neuronales. Similares a otras proteínas de la familia de TGF-beta, las BMP est�n altamente conservadas entre especies animales.

Las proteínas morfogenéticas óseas 2 y 7 (BMP 2 y 7) son de interés específico en las aplicaciones de formación de cartílago y hueso. La BMP 2 induce la formación de tanto cartílago como hueso. La proteína es sintetizada como un prepop�ptido. La BMP 2 prepop�ptido humana de longitud completa es un polip�ptido glicosilado que tiene una secuencia de 396 amino�cidos, que consiste de una secuencia señal de 19 amino�cidos, una proregi�n de 263 amino�cidos y un segmento maduro de 114 amino�cidos. La escisión de la proregi�n ocurre antes de la segregación. La forma madura tiene 7 restos ciste�na y un sitio de glicosilaci�n ligado a N. La forma funcional de la proteína consiste de dos cadenas maduras ligadas a disulfuro. Se ha encontrado que las variantes de BMP 2 que consistentemente solamente de la secuencia de amino�cidos madura de BMP 2, tal como los amino�cidos 283 a 396, también exhiben actividad biológica.

La BMP 7 humana, o proteína-1 osteog�nica (Op-1), es una preprote�na de 431 amino�cidos que se escinde, similarmente a BMP 2, en una preproregi�n de 292 amino�cidos y un segmento maduro de 139 amino�cidos. El segmento maduro contiene tres sitios de glicosilaci�n ligados a N posibles más siete residuos de ciste�na.

Para reparación o regeneración de tejido, las células deben migrar a un lecho de la herida, proliferar, expresar componentes de matriz o formar matriz extracelular, y formar una forma de tejido final. Las poblaciones de células múltiples a menudo participan en esta respuesta morfogenética, frecuentemente incluyendo células vasculares y nervios. Las matrices que tienen los factores bioactivos incorporados en las mismas, han demostrado que mejoran enormemente, y en algunos casos, se ha encontrado que son esenciales para que esto ocurra. Se han hecho enfoques en el desarrollo de matrices a partir de orígenes naturales o sintéticos o una mezcla de ambos. Las matrices en crecimiento de células naturales son sometidas a remodelación por influencias celulares, todas basadas en prote�lisis, por ejemplo, por plasmina (degradación de fibrina) y metaloproteinasas de matriz (degradación de col�geno, elastina, etc.). Tal degradación est� altamente localizada y ocurre solamente después del contacto directo con la célula migrante. Además, el suministro de proteínas de se�alizaci�n de células específicas tales como factores de crecimiento est� estrechamente regulado. En el modelo natural, las matrices en crecimiento de células macroporosas no se usan, en su lugar, se forman matrices microporosas que las células pueden degradar, localmente y después de la demanda, conforme las células migran a la matriz. Debido a problemas referentes a inmunogenicidad, producción costosa, disponibilidad limitada, variabilidad de lotes y purificación, matrices basadas en moléculas precursoras sintéticas, tales como polietilenglicol modificado, han sido desarrolladas para la regeneración de tejidos en y/o sobre el cuerpo.

Aunque se ha hecho mucho trabajo estudiando los efectos sist�micos de la PTH, como se describe anteriormente, la investigación apenas ha explorado la administración local o típica de la PTH. En el documento WO 03/052091, se ha descrito una forma para administrar localmente la PTH. El documento WO 03/052091 describe que la hormona paratiroides est� covalentemente unida a matrices naturales y sist�micas, en particular, matrices de polietilenglicol y fibrina. En tal forma, la hormona paratiroides puede administrarse localmente y liberarse en el sitio de necesidad de forma controlada. Se ha mostrado en el documento WO 03/052091 que este sistema activa la formación de tejido óseo en huesos sanos.

Es el objeto de la presente invención proporcionar un método de tratamiento local de áreas en huesos no sanos, es decir, huesos afectados por osteoporosis.

Sumario de la invención

Se ha encontrado sorprendentemente que áreas de huesos no sanos, por ejemplo, huesos o áreas de hueso específicas que est�n afectadas y debilitadas por osteoporosis, pueden tratarse eficazmente por la administración local de factores bioactivos.

De este modo, la presente invención se refiere al uso de una formulación que comprende un factor bioactivo seleccionado del grupo que consiste de una PTH y una BMP o un p�ptido de fusión que comprende una PTH o BMP en un primer dominio, y un dominio de sustrato covalentemente reticulable en un segundo dominio, y una

composici�n capaz de formar una matriz en un sitio en el hueso en necesidad de tratamiento, para la manufactura de un medicamento para tratar localmente áreas de huesos no sanos.

Las matrices que contienen un factor bioactivo (también denominado en este documento “matrices suplementadas”), que son adecuadas para la regeneración local de áreas de huesos no sanos o el incremento local de densidad ósea en áreas de huesos no sanos y métodos para elaborar y usar las matrices, se describen en este documento. En una realización preferida, el factor bioactivo se incorpora de manera liberable en la matriz. La matriz puede formarse in situ, en el sitio de áreas de huesos no sanos o, dependiente de la indicación, puede formarse fuera del cuerpo y aplicarse en el cuerpo en una forma pre-configurada a través de cirugía. El factor bioactivo es liberado de la matriz y activa la regeneración de tejido óseo localmente. Los factores bioactivos adecuados incluyen moléculas, p�ptidos y proteínas que tienen las capacidades de activar la regeneración de tejido óseo. El factor bioactivo es preferiblemente PTH o una BMP. Las hormonas paratiroides pueden ser PTH1-84 (nativa), PTH1-38, PTH1-34, PTH1-31, PTH1-28 � PTH1-25, o cualquiera de las versiones modificadas o al�licas de PTH que tienen las capacidades de activación de regeneración de tejido óseo. Los factores bioactivos más preferidos son PTHl-34 o BMP2. En una realización, el factor bioactivo es un p�ptido de fusión. El p�ptido de fusión contiene un primer dominio que comprende el factor bioactivo, preferiblemente PTH o BMP, y un segundo dominio que comprende un dominio de sustrato reticulable.

En una realización preferida adicional, el factor bioactivo forma parte de una composición precursora adecuada para formar una matriz suplementada en el sitio de necesidad en el hueso afectado. La composición para formar la matriz suplementada es preferiblemente inyectable y se forma a partir de componente(s) precursor(es) líquido(s) (a 25�C). Un método para administrar la matriz suplementada a y/o en áreas de huesos no sanos requiere al menos un componente precursor líquido capaz de formar una matriz a temperaturas fisiológicas y un factor bioactivo y aplicar el componente precursor y el factor bioactivo a y/o en el área de huesos no sanos. Los defectos óseos, es decir, las áreas de huesos no sanos, son en general áreas de huesos que est�n afectadas por osteoporosis. En el caso de hueso osteopor�tico, el tratamiento resulta en un incremento local de densidad ósea en la parte osteopor�tica del hueso, las cuales pueden ser, por ejemplo, el cuello femoral o vértebra (y de este modo, la tasa de fractura inferior del hueso o parte del hueso). En tal sentido, el método para tratar áreas no sanas de huesos con la matriz suplementada tal como se describe en la presente solicitud es un tratamiento profiláctico, en particular, para la prevención de fracturas óseas.

Preferiblemente, la matriz es una matriz de fibrina o una matriz a base de polietilenglicol.

Las células también pueden agregarse a la matriz antes de o al tiempo del implante, o incluso subsecuentemente al implante, ya sea en o subsecuente a la reticulación del pol�mero para formar la matriz. Esto puede ser además de o en lugar de la reticulación de la matriz para producir el espacio intersticial diseñado para promover la proliferaci�n celular o en crecimiento.

En una realización, la matriz contiene uno o más agentes de contraste, y también puede formarse en la ausencia de un factor de crecimiento. En general, los agentes de contraste permiten obtener imágenes de la distribución y posicionamiento de la formulación durante la inyección y gelificaci�n. Si se usa la formulación sin un factor bioactivo, la matriz puede usarse preferiblemente en el tratamiento de quistes llenos de fluido tales como quistes Tarlov, quistes de ovario, quistes aracnoides, quistes óseos aneurismales o quistes hepáticos.

Por lo tanto, la presente invención también da a conocer una formulación que comprende

i): una composición capaz de formar una matriz bajo condiciones fisiológicas;

ii): una PTH, una BMP o un p�ptido de fusión que comprende al menos dos dominios en donde el primer

dominio comprende una PTH y el segundo dominio comprende un dominio de sustrato reticulable; y

iii): un agente de contraste.

La presente invención también est� relacionada con una matriz suplementada que comprende un material de matriz natural o sintética, una PTH y un agente de contraste.

La presente invención también est� relacionada con un kit que comprende fibrin�geno, trombina, una fuente de calcio, PTH y un agente de contraste.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra la bioactividad de variantes de PTH. Las células transfectadas con un gen indicador ligado a un promotor para un receptor de PTH se trataron con cantidades iguales de o bien PTH1-34, TG-pl-PTH1-34 (descrito posteriormente) o bien el patrón internacional de 84 amino�cidos. La inhibición de la expresión del gen indicador de luciferasa se midió y compar� con células transfectadas que no se expusieron a PTH en solución (control).

La figura 2 muestra los resultados de un ensayo de liberación de PTH a partir de una matriz de fibrina.

Descripci�n detallada de la invención

Se describe en este documento un método para el tratamiento local de defectos y estructuras óseas en huesos no sanos (áreas resumidas de huesos no sanos). Preferiblemente, son áreas tratadas en hueso osteopor�tico. El método usa matrices naturales y sintéticas que tienen PTH, incorporada de manera liberable en la matriz. Las matrices suplementadas son inyectables, biocompatibles y biodegradables y pueden formarse in vitro o in vivo al tiempo del implante. El factor bioactivo puede incorporarse en las matrices y retener su bioactividad completa. El factor bioactivo particularmente preferido PTH1-34 puede ser incorporarse de manera liberable por interacción covalente o no covalente con la matriz, usando técnicas que proporcionan control sobre cómo y cuándo y a qué grado la PTH se libera, de manera que la matriz suplementada puede usarse para la reparación de tejido directamente o indirectamente, usando la matriz suplementada como un vehículo de liberación controlada.

Definiciones

“Sitio de adhesión o sitio de unión celular” como se usa en general en este documento, se refiere a una secuencia pept�dica en la cual una molécula, por ejemplo, un receptor que promueve la adhesión en la superficie de una célula, se enlaza. Ejemplos de sitios de adhesión incluyen, pero no se limitan a, la secuencia RGD a partir de fibronectina, y la secuencia YIGSR (SEQ ID NO: 1) de laminina. Los sitios de adhesión pueden incorporarse opcionalmente en la matriz, incluyendo un dominio de sustrato reticulable a la matriz de fibrina.

“Actividad biológica”, como se usa en general en este documento, se refiere a eventos funcionales mediados por una proteína de interés. En algunas realizaciones, esto incluye eventos ensayados midiendo las interacciones de un polip�ptido con otro polip�ptido. También incluye ensayar el efecto que la proteína de interés tiene en el crecimiento, diferenciación, muerte, migración, adhesión celular, interacciones con otras proteínas, actividad enzim�tica, fosforilaci�n o desfosforilaci�n de proteína, transcripción o traducción.

“Enlace insaturado conjugado”, como se usa en general en este documento, se refiere a la alternancia de enlaces múltiples carbono-carbono, carbono-hetero�tomo o hetero�tomo-hetero�tomo con enlaces únicos, o el enlace de un grupo funcional a una macromolécula, tal como un pol�mero sintético o una proteína. Tales enlaces pueden someterse a reacciones de adición.

“Grupo insaturado conjugado”, como se usa en general en este documento, se refiere a una molécula o una región de una molécula que contiene una alternancia de enlaces múltiples carbono-carbono, carbono-hetero�tomo o hetero�tomo-hetero�tomo con enlaces únicos, que tiene un enlace múltiple el cual puede someterse a reacción de adición. Ejemplos de grupos insaturados conjugados incluyen, pero no se limitan a vinilsulfonas, acrilatos, acrilamidas, quinonas y vinipiridinios, por ejemplo, 2- o 4-vinilpiridinio e itaconatos.

“Agentes de contraste”, como se usa en general en este documento, significa una molécula o sustancia usada para incrementar un contraste de una imagen y que permite monitorizar la sustancia o molécula en el cuerpo.

“Reticulación”, como se usa en general en este documento, significa la formación de enlaces covalentes.

“Densidad de reticulación”, como se usa en general en este documento, se refiere al peso molecular promedio entre dos reticulaciones (Mc) de las moléculas respectivas.

“Estado de equilibrio”, como se usa en general en este documento, como el estado en el cual un hidrogel no se somete a incremento o pérdida de masa cuando se almacena bajo condiciones constantes en agua.

“Peso equivalente”, como se usa en general en este documento, se refiere a mmol de grupo funcional/g de sustancia.

“Matriz de fibrina”, como se usa en general en este documento, significa el producto de un proceso en el cual, sustancialmente todo los componentes precursores fibrin�geno y trombina, se reticulan en la presencia de una fuente de calcio y factor XIIIa para formar una red tri-dimensional. Los términos matriz, gel y red polim�rica o tridimensional, se usan de manera sin�nima.

“Funcionalizar”, como se usa en general en este documento, se refiere a modificar una molécula en una manera que resulta en la unión de un grupo o porción funcional. Por ejemplo, una molécula puede ser funcionalizada por la introducción de una molécula que hace a la molécula un nucle�filo fuerte o una molécula insaturada conjugada. Preferiblemente, una molécula por ejemplo PEG, es funcionalizada para llegar a ser un tiol, amina, acrilato o quinona. Proteínas, en particular, pueden también ser efectivamente funcionalizadas por reducción parcial o completa de enlaces disulfuro para crear tioles libres.

“Funcionalidad”, como se usa en general en este documento, se refiere al número de sitios activos en una molécula.

“Funcionalidad de los puntos de ramificación”, como se usa en general en este documento, se refiere al número de ramas que se extienden de un punto en la molécula.

“Proteínas o p�ptidos de fusión”, como se usa en general en este documento, se refiere a un p�ptido o proteína que contiene al menos, un primer y un segundo dominio. Un dominio contiene un factor bioactivo, preferiblemente PTH 1-34, BMP 2 � BMP 7 y el otro dominio contiene un dominio de sustrato reticulable a una matriz durante o después de su formación. Un sitio de degradación hidrol�tica o enzim�tica, también puede estar presente entre el primer y el segundo dominio.

“Matriz”, como se usa en general en este documento, se refiere a un material destinado a interaccionar con sistemas biológicos para tratar, aumentar o reemplazar cualquier tejido o función del tejido, dependiendo del material ya sea permanentemente o temporalmente. La matriz puede servir como un dispositivo de suministro para factores bioactivos incorporados en este y/o como una matriz de crecimiento celular. Las matrices descritas aquí, se forman de componentes precursores líquidos los cuales son capaces de formar un andamiaje en el cuerpo en el sitio de necesidad. Los términos “matriz” y “gel” se usan de manera sin�nima en este documento. Los términos “matriz” y “gel”, se refieren a la composición formada después que los componentes precursores son mezclados en conjunto. De este modo, los términos “matriz” y “gel”, abarcan redes polim�ricas parcialmente o completamente reticuladas. Pueden estar en la forma de un líquido, semi-sólido, tal como pasta, o un sólido.

“Multifuncional”, como se usa en general en este documento, se refiere a más de un grupo funcional electr�filo y/o nucle�filo por molécula (es decir, mon�mero, oligo y pol�mero).

“Pol�meros o componentes precursores que se originan naturalmente”, como se usa en general en este documento, se refiere a moléculas las cuales podrían encontrarse en la naturaleza.

“Hueso no sano o áreas de huesos no sanos”, como se usa en general en este documento, se refiere a un hueso o partes del hueso, las cuales tienen trastornos causados por deterioro estructural o genético, causados por osteoporosis, inflamación local como en quistes óseos o crecimiento de tumor como en cáncer, es decir, a la estructura ósea en un estado enfermo, independientemente del tipo de enfermedad. Se contempla que las fracturas óseas en hueso osteopor�tico son un defecto óseo en el sentido de la presente invención.

“Osteoporosis”, como se usa en general en este documento, se refiere a una enfermedad esquel�tica, sist�mica caracterizada por masa ósea baja y deterioro estructural de tejido óseo, lo que incrementa la porosidad ósea y susceptibilidad a fracturas. La pérdida ósea es asintom�tica, algunas personas pueden no ser conscientes de que tienen osteoporosis hasta que sufren fracturas óseas. Se conocen dos tipos principales de osteoporosis: osteoporosis primaria y osteoporosis secundaria. La osteoporosis primaria es subdividida en osteoporosis tipo I, la cual afecta mujeres en quienes el comienzo de la menopausia ha causado pérdida ósea acelerada; y osteoporosis tipo II, la cual afecta personas en quienes el proceso de envejecimiento ha conducido a una reducción en la densidad ósea. La osteoporosis secundaria ocurre en personas quienes experimentan pérdida ósea secundaria a otras enfermedades o quienes usan ciertos tipos de fármacos. La muñeca, vértebras y cadera son principalmente susceptibles a fracturas relacionadas con osteoporosis. Se prefiere el tratamiento de osteoporosis tipo I.

“Matrices de polietilenglicol”, como se usa en general en este documento, significa el producto de un proceso en el cual al menos dos componentes de polietilenglicol precursores con grupos funcionales, se reticulan autoselectivamente entre s� para formar una red reticulada tri-dimensional. Estos sistemas se conocen y describen, tal como en el documento WO 03/052091.

“PTH”, como se usa en este documento, incluye la secuencia humana de PTH1-84 y todas las versiones truncadas, modificadas y al�licas de PTH, la cual exhibe propiedades de formación ósea, en particular, cuando se incorpora preferiblemente unida covalentemente a una matriz de fibrina. Las versiones truncadas preferidas de PTH son PTH138, PTH1-34, PTH1-31 o PTH1-25. Se prefiere más PTH1-34. Preferiblemente, la PTH es la PTH humana, aunque la PTH de otras fuentes, tales como PTH bovina, pueden ser adecuadas.

“Periostio”, como se usa en este documento, significa la capa externa de huesos que forma una capa fibrosa, densa, con la excepción de aquellas porciones que forman una estructura de articulación la cual cubre la estructura ósea completa y contiene la vasculatura que alimenta el tejido óseo exterior.

“Fisiológico”, como se usa en general en este documento, significa condiciones que se pueden encontrar en vertebrados vivos. En particular, las condiciones fisiológicas se refieren a las condiciones en el cuerpo humano, tales como temperatura y pH. Las temperaturas fisiológicas significan, en particular, un intervalo de temperatura de entre 35�C y 42�C, preferiblemente de aproximadamente 37�C.

“Red polim�rica”, como se usa en general en este documento, significa el producto de un proceso en el cual sustancialmente todos los mon�meros, oligos o pol�meros se unen por enlaces covalentes intermoleculares a través de sus grupos funcionales disponibles para dar como resultado una molécula inmensa.

“Nucle�filo fuerte”, como se usa en general en este documento, se refiere a una molécula la cual es capaz de donar un par de electrones a un electr�filo en una reacción que forma enlace polar. Preferiblemente, el nucle�filo fuerte es más nucle�filo que el agua a pH fisiológico. Ejemplos de nucle�filos fuertes son tioles y aminas.

“Moléculas precursoras sintéticas”, como se usa en general en este documento, se refiere a moléculas las cuales no existen en la naturaleza.

“Reacción auto-selectiva”, como se usa en general en este documento, significa que el primer componente precursor de una composición reacciona mucho más rápido que el segundo componente precursor de la composición y vice versa, que con otros compuestos presentes en una mezcla o en el sitio de la reacción. Como se usa en este documento, el nucle�filo preferencialmente se une a un electr�filo y un electr�filo preferencialmente se une a un nucle�filo fuerte, en vez de a otros compuestos biológicos.

“Hinchamiento” como se usa en general en este documento, se refiere al incremento en volumen y masa por captación de agua por la matriz. Los términos “captación de agua” e “hinchamiento”, son usados sin�nimamente a través de esta solicitud.

“Matriz suplementada” como se usa en general en este documento, se refiere a una matriz en la cual se incorporan de manera liberable factores bioactivos, opcionalmente p�ptidos de fusión. Los factores bioactivos son incorporados a través de interacción ya sea covalente o no covalente.

I. Matrices suplementadas

A. Materiales de matriz

La matriz se forma por reticulación i�nicamente, covalentemente, o por combinaciones de las mismas, de moléculas precursoras para dar una red polim�rica y/o por hinchamiento de uno o más materiales polim�ricos, es decir, matrices, para formar una red polim�rica que tiene suficiente espaciamiento entre pol�meros, para permitir crecimiento o migración en la matriz de células. En una realización, la matriz se forma de proteínas, preferiblemente proteínas naturalmente presentes en el paciente en el cual va a implantarse la matriz. Una proteína de matriz particularmente preferida es fibrina, aunque también pueden usarse matrices elaboradas de otras proteínas, tales como col�geno y gelatina. Polisac�ridos y glicoprote�nas, también pueden ser usados para formar la matriz. También es posible usar pol�meros sintéticos, los cuales son reticulables por enlace covalente o iónico.

Matrices de fibrina

La fibrina es un material natural, el cual se ha notificado para varias aplicaciones biom�dicas. La fibrina ha sido descrita como material para matrices en crecimiento celular en la patente estadounidense n.� 6.331.422 por Hubell et al. Los geles de fibrina han sido usados como sellantes debido a su capacidad para enlazarse a muchos tejidos y su papel natural en la cicatrización de heridas. Algunas aplicaciones específicas incluyen uso como un sellante para unión de injerto vascular, unión de válvula cardiaca, posicionamiento óseo en reparación de fracturas y tendón. Adicionalmente, estos geles han sido usados como dispositivos de suministro de fármacos, y para regeneración neuronal. Aunque la fibrina proporciona un soporte sólido para regeneración de tejido y crecimiento celular, existen pocas secuencias activas en el mon�mero que directamente mejoran estos procesos.

El proceso por el cual el fibrin�geno es polimerizado para dar fibrina, también ha sido caracterizado. Existen varias proteasas posibles que pueden escindir el fibrin�geno, que incluyen trombina, peptidasa y proteasa III, y cada una corta la proteína en un sitio diferente. Una vez escindido el fibrin�geno, ocurre una etapa de auto-polimerizaci�n en la cual los mon�meros de fibrin�geno se juntan y forman un gel de pol�mero no covalentemente reticulado. Este auto-montaje ocurre debido a que los sitios de enlace llegan a exponerse después de ocurrir la escisión de proteasa. Una vez que se exponen, estos sitios de enlace en el centro de la molécula pueden enlazarse a otros sitios en las cadenas de fibrin�geno, las cuales est�n presentes en los extremos de las cadenas pept�dicas. De esta manera, se forma una red polim�rica. El factor XIIIa, una transglutaminasa activada a partir del factor XIII por prote�lisis de trombina, puede entonces covalentemente reticular la red polim�rica. Existen otras transglutaminasas y también pueden estar involucradas en reticulación covalente e injerto a la red de fibrina.

Una vez que se forma un gel de fibrina reticulado, la degradación subsecuente es estrechamente controlada. Una de las moléculas claves en controlar la degradación de fibrina es el inhibidor de a2-plasmina. Esta molécula actúa por reticulación en la cadena a de fibrina a través de la acción del factor XIIIa. Al unirse al gel, una alta concentración de inhibidor puede ser localizado en el gel. El inhibidor entonces actúa previniendo el enlace de plasmin�geno a fibrina

e inactivando plasmina. El inhibidor de a2-plasmina contiene un sustrato de glutamina. La secuencia exacta ha sido identificada como NQEQVSPL (SEQ ID NO: 2), siendo la primera glutamina el amino�cido activo para reticulación.

Se ha demostrado que los p�ptidos bi-dominios, los cuales contienen una secuencia de sustrato del factor XIIIa y una secuencia pept�dica bioactiva, pueden ser reticulados en la matriz de fibrina y que este p�ptido bioactivo retiene su actividad celular in vitro.

Dependiendo de la indicación y sustancias mezcladas en la matriz de fibrina, la concentración de trombina podría variar. En una realización preferida, la matriz de fibrina contiene fibrin�geno en un intervalo de 5 a 65 mg por mililitro de matriz de fibrina, más preferiblemente de 15 a 60 mg por mililitro de matriz de fibrina, aún más preferiblemente desde 25 hasta 55 mg por mililitro de matriz de fibrina, y lo más preferiblemente de 30 a 45 mg por mililitro de matriz de fibrina. La trombina est� presente en un intervalo de 0,5 a 5 U.I. por mililitro de matriz de fibrina, más preferiblemente en un intervalo de entre 1,25 y 3,25 U.I. por mililitro de matriz de fibrina, lo más preferiblemente desde 1,5 hasta 2,5 U.I. por mililitro de matriz de fibrina. Adicionalmente, una fuente de i�n de calcio, ayuda a formar la matriz de fibrina. La fuente de i�n de calcio es preferiblemente CaCl2 * 2H2O en una concentración de 0,5 a 5 mg por ml de matriz de fibrina, aún más preferiblemente de 2 a 3,5 mg por ml de matriz de fibrina, lo más preferiblemente de 2,5 a 3 mg por ml de matriz de fibrina. U.I. representa una unidad internacional de trombina y est� definido como la actividad contenida en 0,0853 mg del Primer Estándar Internacional de Trombina Humana. Las matrices de fibrina suplementada formadas de materiales presentes en estos intervalos de concentración, son preferiblemente usadas para todas las indicaciones las cuales no requieren la adición de un agente de contraste, como quistes óseos y tumores óseos.

Cuando uno o más agentes de contraste est�n presentes en la matriz, la cantidad de trombina en la matriz de fibrina es en general mayor que la cantidad de trombina en la misma matriz de fibrina en la ausencia de un agente de contraste. Los agentes de contraste son preferiblemente agregados cuando se usa la matriz suplementada como un tratamiento profiláctico, para prevenir fracturas en huesos osteopor�ticos, es decir, inyección en la vértebra o cuello femoral. En estos casos, la matriz de fibrina típicamente contiene trombina en un intervalo de concentración de entre 7,5 y 125 U.I. de trombina por mililitro de matriz de fibrina, preferiblemente, en un intervalo de entre 25 y 50 U.I. de trombina por mililitro de matriz de fibrina y lo más preferido en un intervalo de entre 35 y 40 U.I. de trombina por mililitro de matriz de fibrina.

Soluciones precursoras para formar matrices de fibrina

Preferiblemente, se usan dos soluciones precursoras para formar una matriz de fibrina. La primera solución precursora contiene fibrin�geno, preferiblemente de 10 a 130 mg de fibrin�geno por mililitro de solución precursora, más preferiblemente de 30 a 120 mg de fibrin�geno por mililitro de solución precursora, aún más preferiblemente desde 50 hasta 110 mg de fibrin�geno por mililitro de solución precursora, y lo más preferiblemente de 60 a 90 mg de fibrin�geno por mililitro de solución precursora. Si tiene que agregarse trombina para formar la matriz y en aquellos casos en los cuales la indicación requiere uno o más agentes de contraste, la segunda solución precursora contiene trombina, preferiblemente de 15 a 250 U.I. de trombina por mililitro de solución precursora, más preferiblemente de 50 a 100 U.I. de trombina por mililitro de solución precursora, y lo más preferiblemente de 70 a 80 U.I. de trombina por mililitro de solución precursora. Adicionalmente, una fuente de i�n de calcio puede estar presente en al menos una de las soluciones precursoras. La fuente de i�n de calcio es preferiblemente CaCl2 * 2H2O, preferiblemente en una concentración de 1 a 10 mg por ml de solución precursora, aún más preferible de 4 a 7 mg por ml de solución precursora, lo más preferiblemente de 5 a 6 mg por ml de solución precursora. Opcionalmente, una enzima capaz de catalizar la formación de matriz, tal como el factor XIIIa, se agrega en al menos una solución precursora. Preferiblemente, el factor XIIIa est� presente en una concentración de 0,5 a 100 U.I. por mililitro de solución precursora, más preferiblemente de 1 a 60 U.I. por mililitro de solución precursora, y lo más preferiblemente de 1 a 10 U.I. por mililitro de solución precursora.

En casos en los cuales la presencia de un agente de contraste no se requiere, la matriz de fibrina es preferiblemente formada a partir de, preferiblemente, dos soluciones precursoras. La primera solución precursora típicamente contiene fibrin�geno, preferiblemente en un intervalo de concentración de desde 10 hasta 130 mg de fibrin�geno por mililitro de solución precursora, más preferiblemente desde 30 hasta 120 mg de fibrin�geno por mililitro de solución precursora, aún más preferiblemente desde 50 hasta 110 mg de fibrin�geno por mililitro de solución precursora, y lo más preferiblemente desde 60 hasta 90 mg de fibrin�geno por mililitro de solución precursora. Si tiene que agregarse trombina para formar la matriz, la segunda solución precursora contiene trombina, preferiblemente en un intervalo de concentración de desde 1 hasta 10 U.I. de trombina por mililitro de solución precursora, más preferiblemente desde 2,5 hasta 6,5 U.I. de trombina por mililitro de solución precursora, lo más preferiblemente desde 3 hasta 5 U.I. de trombina por mililitro de solución precursora. Adicionalmente, hay una fuente de i�n de calcio en una de las soluciones precursoras. La fuente de i�n de calcio es preferiblemente CaCl2 * 2H2O en un intervalo de concentración de desde 1 hasta 10 mg por ml de solución precursora, aún más preferiblemente, desde 4 hasta 7 mg por ml de solución precursora, lo más preferiblemente desde 5 hasta 6 mg por ml de solución precursora. Opcionalmente una enzima capaz de catalizar la formación de matriz, como el factor XIIIa, se agrega a una solución precursora. Preferiblemente, el factor XIIIa est� presente en un intervalo de concentración de desde 0,5 hasta

100 U.I. por mililitro de solución precursora, más preferiblemente desde 1 hasta 60 U.I. por mililitro de solución precursora, y lo más preferiblemente desde 1 hasta 10 U.I. por mililitro de solución precursora.

Matrices sintéticas y soluciones precursoras

Las reacciones de reticulación para formar matrices sintéticas para aplicación en el cuerpo incluyen (i) polimerizaci�n por radicales libres entre dos o más precursores que contienen enlaces dobles insaturados, como se describe en Hern et al., J. Biomed. Mater. Res. 39:266-276 (1998), (ii) reacción de sustitución nucle�fila tal como por ejemplo, entre un precursor que incluye un grupo amina y un precursor que incluye un grupo succinimidilo como se describe en la patente estadounidense n.� 5.874.500 por Rhee et al., (iii) reacciones de condensación y adición, y

(iv) reacciones de adición de tipo Michael entre un nucle�filo fuerte y un grupo o enlace insaturado conjugado (como un electr�filo fuerte). Se prefiere particularmente la reacción entre una molécula precursora que tiene un grupo tiol o amina como grupo nucle�filo y moléculas precursoras que incluyen grupos de acrilato o vinilsulfona como grupos electr�filos. El grupo nucle�filo más preferido es el grupo tiol. Las reacciones de adición de tipo Michael son descritas en el documento WO 00/44808 por Hubbell et al. Las reacciones de adición de tipo Michael, permiten reticulación in situ de al menos un primer y segundo componente precursor bajo condiciones fisiológicas en una manera auto-selectiva, incluso en la presencia de materiales biológicos sensibles. Cuando uno de los componentes precursores tiene una funcionalidad de al menos dos, y al menos uno de los otros componentes precursores tiene una funcionalidad mayor de dos, el sistema reaccionar� auto-selectivamente para formar una matriz tri-dimensional reticulada.

Preferiblemente, los grupos insaturados conjugados o enlaces insaturados conjugados son acrilatos, vinilsulfonas, metacrilatos, acrilamidas, metacrilamidas, acrilonitrilos, vinilsulfonas, 2- o 4-vinilpiridinio, maleimidas o quinonas.

Los grupos nucle�filos son preferiblemente grupos tiol, grupos amino o grupos hidroxilo. Los grupos tiol son sustancialmente más reactivos que los grupos amina no protonados. El pH es importante en esta consideración: el tiol desprotonado es sustancialmente más reactivo que el tiol protonado. Por lo tanto, las reacciones de adición que involucran una insaturaci�n conjugada, tal como un acrilato o una quinona, con un tiol para convertir dos componentes precursores en una matriz, a menudo ser�n mejor llevados a cabo más rápidamente y autoselectivamente a un pH de aproximadamente 8. A un pH de aproximadamente 8, la mayoría de los tioles de interés est�n desprotonados (y de este modo, son más reactivos) y la mayoría de las aminas de interés todavía est�n protonadas (y de este modo, son menos reactivas). Cuando se usa un tiol como la primera molécula precursora, una estructura conjugada que es selectiva en su reactividad para el tiol con relación a las aminas es altamente deseable.

Las primeras y segundas moléculas precursoras adecuadas incluyen proteínas, p�ptidos, polioxialquilenos, poli(alcohol vin�lico), poli(etileno-co-alcohol vin�lico), poli(ácido acr�lico), poli(etileno-co-ácido acr�lico), poli(etiloxazolina), poli(vinilpirrolidona), poli(etileno-co-vinilpirrolidona), poli(ácido maleico), poli(etileno-co-ácido maleico), poli(acrilamida), y copol�meros de bloque de poli(óxido de etileno)-co-poli(óxido de propileno). Una molécula precursora particularmente preferida es polietilenglicol.

El polietilenglicol (PEG), proporciona un bloque de construcción conveniente. Se pueden adquirir fácilmente o sintetizar PEG lineales (lo que significa con dos extremos) o ramificados (lo que significa más de dos extremos) y después funcionalizar los grupos de extremos PEG para introducir ya sea un nucle�filo fuerte, tal como tiol, o una estructura conjugada, tal como un acrilato o una vinilsulfona. Cuando estos componentes son mezclados ya sea entre s� o con un componente correspondiente en un ambiente ligeramente básico, se formar� una matriz por reacción entre el primer y segundo componente precursor. Se puede hacer reaccionar un componente PEG con un componente no PEG, y el peso molecular o hidrofilicidad de cualquier componente se puede controlar para manipular las características mecánicas, la permeabilidad, y el contenido de agua de la matriz resultante.

En la formación de matrices, especialmente matrices que se desea que se degraden in vivo, los p�ptidos proporcionan un bloque de construcción muy conveniente. Es directo sintetizar p�ptidos que contienen dos o más residuos de ciste�na, y este componente puede fácilmente servir como el primer componente precursor con grupos nucle�filos. Por ejemplo, un p�ptido con dos residuos de ciste�na libres puede fácilmente formar una matriz cuando se mezcla con una tri-vinilsulfona de PEG (un PEG que tiene tres ramas con vinilsulfonas en cada una de sus ramas), a pH fisiológico o ligeramente superior (por ejemplo, de 8 a 9). La gelificaci�n también puede proceder bien a pH aún superior, pero a costa posiblemente de la auto-selectividad. Cuando se mezclan juntos dos componentes precursores líquidos, reaccionan durante un periodo de algunos minutos para formar un gel elástico, que consiste en una red de cadenas de PEG, que portan los nodos de la red, con los p�ptidos como enlaces de conexión. Los p�ptidos pueden ser seleccionados como sustratos de proteasas, para hacer que la red capaz pueda infiltrarse y degradarse por las células, como se hace en una red a base de proteínas, tal como en una matriz de fibrina. Preferiblemente, las secuencias en los dominios son sustratos para enzimas que est�n involucradas en la migración celular (por ejemplo, como sustratos para enzimas tales como colagenasa, plasmina, metaloproteinasa (MMP) o elastasa), aunque los dominios adecuados no est�n limitados a estas secuencias. Una secuencia particularmente útil es un sustrato para la enzima plasmina. Las características de degradación de los geles pueden ser manipuladas cambiando los detalles del p�ptido que sirve como los nodos de reticulación. Se puede hacer un gel que es

degradable por colagenasa pero no plasmina, o por plasmina pero no colagenasa. Además, es posible hacer que el gel se degrade más rápidamente o más lentamente en respuesta a tal enzima, simplemente cambiando la secuencia de amino�cidos para alterar la Km o kcat, o ambas, de la reacción enzim�tica. Se puede hacer de este modo una matriz que es biomim�tica, ya que es capaz de ser remodelada por las características de remodelación normal de las células. Por ejemplo, tal estudio muestra sitios de sustrato para la proteasa importante plasmina. La gelificaci�n del PEG con el p�ptido es auto-selectiva.

Opcionalmente, pueden incorporarse agentes bifuncionales en la matriz para proporcionar enlaces químicos a otras especies (por ejemplo, una superficie de tejido). Tener sustratos de proteasas incorporados en la matriz es importante cuando se forma la matriz de la vinilsulfona de PEG. Aparte de las matrices formadas de la reacción de acrilatos de PEG y tioles de PEG, matrices formadas de vinilsulfonas de PEG y tioles de PEG, no contienen enlaces hidrol�ticamente degradables. Por lo tanto, la incorporación de sustratos de proteasas permite a la matriz degradarse en el cuerpo.

Las matrices sintéticas son operacionalmente simples de formar. Se mezclan dos precursores líquidos; un precursor contiene una molécula precursora con grupos nucle�filos y la otra molécula precursora contiene los grupos electr�filos. La solución salina fisiológica puede servir como el solvente. Se genera calor mínimo por la reacción. Por lo tanto, la gelificaci�n se puede llevar a cabo in vivo o in vitro, en contacto directo con tejido, sin toxicidad indeseada. De este modo, pol�meros distintos de PEG pueden ser usados, ya sea telequ�licamente modificados o modificados en sus grupos laterales.

Para la mayoría de las indicaciones de cicatrización, la velocidad de crecimiento celular o migración de células en la matriz en combinación con una velocidad de degradación adaptada de la matriz es crucial para la respuesta de cicatrización global. La posibilidad de que matrices hidrol�ticamente no degradables se invadan por células es principalmente una función de la densidad de red. Si el espacio existente entre los puntos o nodos de ramificación es demasiado pequeño con relación al tamaño de las células o si la velocidad de degradación de la matriz, la cual da como resultado la creación de más espacio dentro de la matriz, es demasiado lenta, se observar� una respuesta de cicatrización muy limitada. Se sabe que matrices de cicatrización encontradas en la naturaleza, como por ejemplo, matrices de fibrina, las cuales se forman como una respuesta a la lesión en el cuerpo, consisten en una red muy holgada la cual muy fácilmente puede ser invadida por las células. La infiltración es promovida por ligandos para adhesión celular, los cuales son una parte integrada de la red de fibrina.

Las matrices elaboradas a partir de moléculas precursoras hidrófilas sintéticas, como polietilenglicol, se hinchan en ambiente acuoso después de la formación de la red polim�rica. Para lograr un tiempo de gelificaci�n suficientemente corto (entre 3 y 10 minutos a un pH de entre 7 y 8 y una temperatura en un intervalo de 36 a 38�C) y reacción cuantitativa durante la formación in situ de la matriz en el cuerpo, la concentración de partida de las moléculas precursoras debe ser suficientemente alta. Bajo tales condiciones, el hinchamiento después de la formación de la red no tendr� lugar, y las concentraciones de partida necesarias conducirán a matrices demasiado densas para la infiltración celular cuando la matriz no es degradable en un ambiente acuoso. De este modo, el hinchamiento de la red polim�rica es importante para ampliar y ensanchar el espacio entre los puntos de ramificación.

Independientemente de la concentración de partida de las moléculas precursoras, los hidrogeles elaborados a partir de las mismas moléculas precursoras sintéticas, tales como una vinilsulfona de PEG de cuatro ramas y un p�ptido con grupos SH, se hinchan hasta el mismo contenido de agua en estado de equilibrio. Esto significa que cuanto mayor es la concentración de partida de las moléculas precursoras, mayor es el volumen final del hidrogel cuando alcanza su estado de equilibrio. Si el espacio disponible en el cuerpo es demasiado pequeño para permitir suficiente hinchamiento y en particular si el enlace formado a partir de los componentes precursores no es hidrol�ticamente degradable, la velocidad de infiltración celular y la respuesta de cicatrización disminuirán. Como consecuencia, debe encontrarse el punto óptimo entre dos requerimientos contradictorios para aplicación en el cuerpo. La buena infiltración celular y las subsecuentes respuestas de cicatrización han sido observadas con una red polim�rica tridimensional formada a partir de la reacción de un pol�mero ramificado trifuncional con al menos tres ramas sustancialmente similares en cuanto al peso molecular y una segunda molécula precursora que es al menos una molécula bifuncional. La relación de peso equivalente de los grupos funcionales de la primera y segunda moléculas precursoras es de entre 0,9 y 1,1. Los pesos moleculares de las ramas de la primera molécula precursora, el peso molecular de la segunda molécula precursora y la funcionalidad de los puntos de ramificación, son seleccionados de manera tal que el contenido de agua de la red polim�rica resultante es entre el % en peso en equilibrio y 92% en peso del peso total de la red polim�rica después de la terminación de captación de agua. Preferiblemente, el contenido de agua es de entre 93 y 95% en peso del peso total de la red polim�rica y el agua después de la terminación de la captación de agua. La terminación de la captación de agua se puede lograr ya sea cuando se alcanza la concentración de equilibrio o cuando el espacio disponible en la matriz no permite incremento de volumen adicional. Por lo tanto se prefiere elegir las concentraciones de partida de los componentes precursores tan bajas como sea posible. Esto es cierto para todas las matrices que se pueden hinchar, pero en particular, para aquellas matrices que experimentan degradación mediada por la célula y no contienen enlaces hidrol�ticamente degradables en la red polim�rica.

El equilibrio entre el tiempo de gelificaci�n y la concentración de partida baja, en particular para geles hidrol�ticamente no degradables, debe ser optimizado basándose en la estructura de las moléculas precursoras. En particular, el peso molecular de las ramas de la primera molécula precursora, el peso molecular de la segunda molécula precursora y el grado de ramificación, es decir, la funcionalidad de los puntos de ramificación, tienen que ajustarse por consiguiente. El mecanismo de reacción real tiene una influencia menor en esta interacción.

Si la primera molécula precursora es un pol�mero de tres o cuatro ramas con un grupo funcional en el extremo de cada rama y la segunda molécula precursora es una molécula bifuncional lineal, preferiblemente un p�ptido que contiene al menos dos grupos de ciste�na, entonces el peso molecular de las ramas de la primera molécula precursora y el peso molecular de la segunda molécula precursora son preferiblemente elegidos de manera tal que los enlaces entre los puntos de ramificación después de la formación de la red tienen un peso molecular en el intervalo de entre 10 y 13 kDa (bajo las condiciones que los enlaces son lineales, no ramificados), preferiblemente entre 11 y 12 kDa. Esto permite una concentración de partida de la suma de la primera y segunda moléculas precursoras en un intervalo de entre 8 y 12% en peso, preferiblemente entre 9 y 10% en peso del peso total de la primera y segunda molécula precursora en solución (antes de la formación de red). En el caso de que el grado de ramificación del primer componente precursor se incremente a ocho y la segunda molécula precursora sea todavía una molécula bifuncional lineal, el peso molecular de los enlaces entre los puntos de ramificación es preferiblemente incrementado hasta un peso molecular de entre 18 y 24 kDa. Cuando el grado de ramificación de la segunda molécula precursora se incrementa de un componente precursor lineal a uno de tres o cuatro ramas, el peso molecular, es decir, la longitud de los enlaces se incrementa por consiguiente. En una realización preferida, se elige una composición que incluye como primera molécula precursora un pol�mero de tres ramas trifuncional de 15 kD, es decir, cada rama tiene un peso molecular de 5 kD, y como la segunda molécula precursora una molécula lineal bifuncional de un peso molecular en el intervalo de entre 0,5 y 1,5 kD, aún más preferiblemente, aproximadamente 1 kD. Preferiblemente, el primer y segundo componente precursor es un polietilenglicol.

En una realización preferida, el primer componente precursor incluye como grupos funcionales grupos o enlaces insaturados conjugados, lo más preferido un acrilato o una vinilsulfona y los grupos funcionales de la segunda molécula precursora incluyen un grupo nucle�filo, preferiblemente un grupo tiol o amino. En otra realización preferida de la presente invención, la primera molécula precursora es un pol�mero de cuatro ramas de 15 a 20 kD, preferiblemente un pol�mero de 15 kD, que tiene grupos funcionales en el extremo terminal de cada rama y la segunda molécula precursora es una molécula lineal bifuncional de un peso molecular en el intervalo de entre 3 y 4 kDa, se prefiere entre 3,4 kDa. Preferiblemente, la primera molécula precursora es un polietilenglicol que tiene grupos acrilatos y la segunda molécula precursora es un polietilenglicol que tiene grupos tiol. En ambas realizaciones preferidas, la concentración de partida de la suma de la primera y segunda molécula precursora varía desde 8 hasta 11% en peso, preferiblemente entre 9 y 10% en peso del peso total de la primera y segunda molécula precursora y agua (antes de la formación de la red polim�rica), preferiblemente entre 5 y 8% en peso para lograr un tiempo de gelificaci�n por debajo de 10 minutos. Estas composiciones tienen un tiempo de gelificaci�n a pH 8,0 y 37�C de aproximadamente 3-10 minutos después del mezclado.

Cuando la matriz contiene enlaces hidrol�ticamente degradables, formados, por ejemplo, por la reacción preferida entres acrilatos y tioles, la densidad de red con respecto a infiltración celular es especialmente importante en el inicio, pero en ambiente acuoso, los enlaces ser�n hidrolizados y la red ser� aflojada, para permitir la infiltración celular. Con un incremento en el grado de ramificación global de la red polim�rica, el peso molecular de los interenlaces, es decir, la longitud de los enlaces, debe incrementar.

B. Sitios de unión celular

Las células interact�an con su ambiente a través de interacciones proteína-proteína, proteína-oligosac�rido y proteína-polisac�rido en la superficie celular. Las proteínas de matriz extracelular proporcionan una gran cantidad de señales bioactivas a la célula. Esta red densa es requerida por soportar las células, y se ha mostrado que muchas proteínas en la matriz controlan la adhesión celular, propagación, migración y diferenciación. Algunas de las proteínas específicas que se ha mostrado que son particularmente activas incluyen laminina, vitronectina, fibronectina, fibrina, fibrin�geno y col�geno. Se han realizado muchos estudios de laminina, y se ha mostrado que la laminina juega un papel vital en el desarrollo y regeneración de nervios in vivo y células nerviosas in vitro, as� como en angiog�nesis. Se han identificado algunas de las secuencias específicas que directamente interact�an con receptores celulares y causan ya sea adhesión, propagación o transducci�n de señal.

Se ha mostrado que la laminina, una proteína multidominio grande, consiste en tres cadenas con varios dominios que se unen al receptor. Estos dominios que se unen al receptor incluyen la secuencia YIGSR (SEQ ID NO: 1) de la cadena B1 de laminina, LRGDN (SEQ ID NO: 3) de la cadena A de laminina y PDGSR (SEQ ID NO: 4) de la cadena B1 de laminina. Varias otras secuencias de reconocimiento para células se han identificado. Estas incluyen IKVAV (SEQ ID NO: 5) de la cadena A de laminina y la secuencia RNIAEIIKDI (SEQ ID NO: 6) de la cadena B2 de laminina. Se prefiere particularmente la secuencia RGD de fibronectina.

En una realización preferida adicional, se incorporan en la matriz sitios de p�ptido para adhesión celular,

concretamente p�ptidos que se unen a receptores que promueven la adhesión en las superficies celulares. Tales p�ptidos que promueven la adhesión incluyen aquellos descritos anteriormente. Se prefieren particularmente la secuencia RGD de fibronectina, la secuencia YIGSR (SEQ ID NO: 1) de laminina. Se prefiere particularmente la incorporación de sitios de unión celular con matrices sintéticas. Sin embargo, los sitios de unión celular también pueden ser incluidos con algunas de las matrices naturales. La incorporación puede lograrse, por ejemplo, mezclando un p�ptido de unión celular que contiene ciste�na con la molécula precursora que incluye el grupo insaturado conjugado, tal como acrilato de PEG, acrilamida de PEG o vinilsulfona de PEG. Esta etapa puede ocurrir inmediatamente, por ejemplo, uno pocos minutos, antes del mezclado con el resto del componente precursor que incluye el grupo nucle�filo, tal como componente precursor que contiene tiol. Si el sitio de unión celular no incluye una ciste�na, puede ser químicamente sintetizado por incluir una. Durante esta etapa, el p�ptido que promueve la adhesión llegar� a ser incorporado en un extremo del precursor funcionalizado de manera múltiple con una insaturaci�n conjugada; cuando se agrega el resto del multi-tiol al sistema, se formar� una red reticulada.

La concentración de sitios de adhesión covalentemente unidos en la matriz, puede influenciar la velocidad de infiltración celular. Por ejemplo, para un hidrogel dado, se pueden incorporar un intervalo de concentración de RGD en la matriz que soporta el crecimiento celular y la migración celular de una manera óptima. El intervalo de concentración óptima de sitios de adhesión similar a RGD es de entre 0,04 y 0,05 mM y aún más preferible de 0,05 mM en particular para una matriz que tiene un contenido de agua entre concentración de equilibrio y 92% en peso después de la terminación de captación de agua.

Una realización preferida es una matriz suplementada que contiene un factor bioactivo, un polietilenglicol de cuatro ramas con un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da reticulado con un sitio GCRPQGIWGQDRC de degradación de proteasa (SEQ ID NO: 7) y 0,050 mM de RGD; esta matriz demuestra particularmente buenos resultados en crecimiento celular y cicatrización de defectos óseos. Preferiblemente la matriz contiene PTH 134 covalentemente unido a la matriz. La concentración de partida de PEG y p�ptido es inferior a 10% en peso del peso total de las moléculas y agua (antes de hincharse). Los geles tienen una consistencia indeseable y permiten a los osteoblastos y célula precursora fácilmente infiltrar la matriz.

C. Factores bioactivos

Factores bioactivos son los ingredientes activos para el tratamiento de áreas de defectos óseos específicos de huesos no sanos, por ejemplo, osteoporosis y quistes óseos. Se ha encontrado sorprendentemente que factores bioactivos específicos, es decir, PTH, en particular PTH1-34, son adecuados para tratamiento local de huesos y áreas de huesos osteopor�ticos. En el pasado, estos factores óseos se han explorado para tratamiento sist�mico. Sin embargo no hay sugerencia de que puedan ser ingredientes activos útiles de formulaciones localmente aplicadas, en cuanto al tratamiento de los defectos óseos. Se ha encontrado que cuando estos factores bioactivos se incorporan en una formulación de matriz inyectable y se inyectan en áreas de defectos óseos específicos de huesos no sanos, incrementan la densidad ósea en el área del hueso. Preferiblemente, el factor bioactivo es covalentemente unido a las matrices descritas anteriormente, as� asegurando una liberación controlada de factores bioactivos. El factor bioactivo puede estar en la forma de un p�ptido de fusión, el cual contiene el factor bioactivo en un primer dominio y un dominio de sustrato covalentemente reticulable en un segundo dominio. Opcionalmente, se localiza un sitio de degradación entre el primer y segundo dominios.

a. PTH

El término “PTH” como se usa en este documento, incluye la secuencia humana de PTH1-84 y todas las versiones truncadas, modificadas y al�licas de PTH, las cuales exhiben propiedades de formación de hueso cuando covalentemente se unen a matrices biodegradables naturales o sintéticas. Versiones truncadas preferidas de PTH son PTH1-38, PTH1-34, PTH1-31, PTH1-28 o PTH1-25. La más preferida es PTH1-34. Preferiblemente, la PTH es PTH humana, aunque puede ser adecuada PTH de otras fuentes, tal como PTH bovina.

c. P�ptidos de fusión

Dominios de sustrato reticulables

Los p�ptidos de fusión comprenden al menos dos dominios en donde el primer dominio comprende el factor bioactivo y el segundo dominio comprende un dominio de sustrato reticulable a la matriz antes de, durante o después de su formación. El dominio de sustrato puede ser un dominio para una enzima, preferiblemente un dominio de sustrato para una transglutaminasa (“dominio de sustrato de transglutaminasa”), más preferiblemente para una transglutaminasa de tejido (“dominio de sustrato de transglutaminasa de tejido”), y lo más preferiblemente es un dominio de sustrato para el factor XIIIa (“dominio de sustrato del factor XIIIa”).

Las transglutaminasas catalizan reacciones de transferencia de acilo entre el grupo gamma-carboxamida de residuos de glutaminilo unidos a la proteína y el grupo �psilon-amino de residuos de lisina, dando como resultado la

formaci�n de puentes de cadenas laterales de isop�ptidos de N-�psilon-(gamma-glutamil)lisina. Se puede diseñar la secuencia de amino�cidos del p�ptido de fusión para contener adicionalmente un sitio de escisión enzim�tica o hidrol�tica, as� el factor bioactivo puede ser liberado con poca o sin modificación de la estructura primaria. Los dominios de sustrato de transglutaminasa, y en particular los dominios del sustrato del factor XIIIa, son adecuados para unir el p�ptido de fusión a matrices de fibrina, pero también a matrices sintéticas en caso de que est�n presentes grupos amino primario colgantes en la molécula sintética. Cuando se usa con una matriz de fibrina, el sitio de degradación en el p�ptido de fusión es preferiblemente enzim�ticamente degradable, para que la liberación de PTH sea controlada por procesos específicos celulares, tales como prote�lisis localizada.

El dominio de sustrato reticulable puede incluir GAKDV (SEQ ID NO: 8), KKKK (SEQ ID NO: 9), YRGDTIGEGQQHHLGG (SEQ ID NO: 10) o NQEQVSPL (SEQ ID NO: 2).

El dominio de sustrato del factor XIIIa más preferido tiene una secuencia de amino�cidos NQEQVSPL (SEQ ID NO: 2) y en este documento se denomina “TG” y TG-PTH.

El p�ptido de fusión de PTH puede ser producido recombinantemente o por síntesis química. El p�ptido de fusión de PTH 1-34 es preferiblemente producido por síntesis química. El p�ptido de fusión de BMP es producido recombinantemente preferiblemente por procesos bacterianos.

Para la incorporación de PTH en una matriz formada a partir de componentes del precursor sintético, el p�ptido de fusión de PTH o cualquier otro p�ptido puede también ser incorporado cuando se sintetiza con al menos un grupo ciste�na adicional (-SH) preferiblemente en el extremo N-terminal de PTH1-34, como el dominio de sustrato reticulable. La ciste�na puede ser unida ya sea directamente al PTH1-34 o a través de una secuencia enlazadora. La secuencia enlazadora puede adicionalmente incluir una secuencia de amino�cidos enzim�ticamente o hidrol�ticamente degradable, para que el PTH pueda ser escindido de la matriz por enzimas en forma sustancialmente nativa. El grupo ciste�na libre reacciona con el grupo insaturado conjugado del componente precursor en una reacción de adición de tipo Michael. El grupo tiol de la ciste�na puede reaccionar con un enlace insaturado conjugado en el pol�mero sintético para formar un enlace covalente.

Estos sitios pueden ser degradables ya sea por hidrólisis no específica (es decir, un enlace éster), o pueden ser sustratos para degradación enzim�tica específica (ya sea degradación proteol�tica o polisac�ridos).

Los sitios de degradación permiten a la PTH ser liberada con poca o ninguna modificación en la secuencia pept�dica primaria, la cual puede dar como resultado actividad superior del factor. Además, permite a la liberación del factor ser controlada por procesos específicos celulares. Esto permite a los factores ser liberados a diferentes velocidades dentro del mismo material dependiendo de la ubicación de las células dentro del material. Esto también reduce la cantidad de PTH1-34 total necesario, puesto que su liberación es controlada por procesos celulares. En una explicación posible para la cicatrización fuerte de los defectos óseos mencionados anteriormente con PTH incorporada y preferiblemente unida a la matriz, se considera importante que la PTH se administre localmente a lo largo de un periodo prolongado de tiempo (es decir, no solo una dosis pulsada única), pero no de una forma continua. Esto es realizado por una degradación lenta, ya sea a través de escisión enzim�tica o escisión hidrol�tica de la matriz. De esta forma, la molécula es entonces suministrada a través de un efecto pseudo-pulsado que ocurre sobre un periodo sostenido de tiempo. Cuando una célula preosteobl�stica infiltra la matriz, encontrar� una molécula de PTH la cual inducir� una proliferaci�n adicional del preosteoblasto, as� como también una síntesis de factores de crecimiento múltiples cruciales para nueva formación ósea. Sin embargo, si tal célula particular no continua liberando PTH unida de la matriz, no comenzar� a producir interleucina-6, evitando con ello la etapa posterior de efectos catabólicos en la formación de osteoclastos. El resultado neto es entonces densidad mineral ósea superior y formación neta de matriz ósea. Finalmente, los efectos terapéuticos del p�ptido est�n localizados en la región de defecto y son subsecuentemente amplificados.

Sitios de degradación del p�ptido de fusión

Un sitio de degradación enzim�tica o hidrol�tica puede estar presente entre el primero y segundo dominios del p�ptido de fusión. Los sitios de degradación pueden ser degradables por degradación enzim�tica específica. Preferiblemente, el sitio de degradación es escindible por una enzima seleccionada del grupo que consiste de plasmina y metaloproteinasa de matriz. Por selección cuidadosa de Km y kcat de este sitio de degradación enzim�tica, la degradación puede ser controlada para que ocurra ya se antes o después de la formación de matriz y/o por utilización de enzimas similares o no similares para degradar la matriz. Estos sitios degradables permiten el diseño por ingeniería de liberación más específica de factores bioactivos a partir de matrices. El sitio degradable puede ser escindido por enzimas liberadas de células que invaden la matriz. El sitio de degradación permite variar la velocidad de suministro en diferentes ubicaciones dentro de la matriz, dependiendo de la actividad celular en la ubicación y/o dentro de la matriz. Los beneficios adicionales incluyen la dosis de fármaco total inferior dentro del sistema de suministro y la regulaci�n espacial de liberación la cual permite liberar un mayor porcentaje del fármaco en el momento de mayor actividad celular. El sitio de degradación es abreviado en este documento como “pl”.

Los sitios proteol�ticamente degradables pueden incluir sustratos para activadores de colagenasa, plasmina, elastasa, estromelisina o plasmin�geno. Sustratos ejemplares son listados abajo. N1-N5 denota posiciones de amino�cidos 1-5 hacia el extremo amino-terminal de la proteína a partir del sitio en donde ocurre la prote�lisis. N1’-N4’ denota posiciones 1-4 de amino�cidos hacia el extremo carboxilo-terminal de la proteína a partir del sitio en donde ocurre la prote�lisis.

Tabla 1: Secuencias de sustrato de muestra para proteasa

Proteasa: N5 N4 N3 N2 N1 N1’ N2’ N3’ N4’ SEQ ID NO:

Plasmina1: L I K M K P SEQ ID NO:

Plasmina1: N F K S Q L SEQ ID NO:

Estromelisina2: Ac G P L A L T A L SEQ ID NO:

Estromelisina2: Ac P F E L R A NH2 SEQ ID NO:

Elastasa3: Z- A A F A NH2 SEQ ID NO:

Colagenasa4: G P L G I A G P SEQ ID NO:

t-PA5: P H Y G R S G G SEQ ID NO:

u-PA5: P G S G R S A S G SEQ ID NO:

Referencia: 1. Tagaki and Doolittle, (1975) Biochem. 14:5149-5156. 2. Smith et al., (1995). J. Biol. Chem. 270:6440-6449. 3. Besson et al., (1996) Analytical Biochemistry 237:216-223. 4. Netzel-Arnett et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:6747-6755. 5. Coombs et al., 1998. J. Biol. Chem. 273:4323-4328

En una realización preferida, la secuencia YKNR (SEQ ID NO. 11), est� localizada entre el primer dominio y el segundo dominio y hace el enlace de plasmina degradable. 10 Un p�ptido de fusión de PTH particular preferido es TGp1PTH:

NQEQVSPLYKNRSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF (SEQ ID NO: 12). Las enzimas que podrían ser usadas para degradación proteol�tica son numerosas. Los sitios proteol�ticamente degradables podrían incluir sustratos para activadores de colagenasa, plasmina, elastasa, estromelisina o plasmin�geno.

15 En otra realización preferida, un dominio de oligo-éster puede ser insertado entre el primer y segundo dominio. Esto puede ser realizado usando un oligo-éster, tal como olig�meros de ácido l�ctico. Diseño de proteínas de fusión para incorporación Las proteínas de fusión preferidas incluyen: TG-PTH1-34: Esta es una forma modificada de PTH que comprende los amino�cidos 1-34 de la PTH nativa, as� como 20 también un dominio de sustrato de TG (transglutaminasa):

NQEQVSPLSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF (SEQ ID NO: 13).

TG-pl-PTH1-34: Esta forma corresponde a TG-PTH excepto que adicionalmente contiene una secuencia degradable por plasmina (pl) entre la secuencia TG y la PTH1-34: NQEQVS-PLYKNRSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF (SEQ ID NO: 12).

Tambi�n se da a conocer:

TG-BMP 2283-396: Esta es una forma modificada de BMP 2 que comprende los amino�cidos 283-396 de la PTH nativa, as� como también un dominio de sustrato de TG (transglutaminasa):

Met-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Pro-Val-Glu-Leu-Pro-Leu-Ile-Lys-Met-Lys-Pro-His-BMP 2283-396 (SEQ ID NO: 14).

Combinaci�n de matrices o componentes precursores y factores bioactivos

En una realización preferida, la matriz de fibrina o sintética suplementada (respectivamente sus soluciones precursoras), comprende la matriz y PTH o p�ptido de fusión de PTH, preferiblemente en un intervalo de concentración de entre 0,01 y 2 mg de PTH o p�ptido de fusión de PTH/ml de matriz o componentes precursores que forman la matriz, preferiblemente entre 0,02 y 1,0 mg de PTH o p�ptido de fusión de PTH/ml de matriz o componentes precursores que forman la matriz, más preferiblemente de entre 0,03 y 0,5 mg de PTH o p�ptido de fusión de PTH/ml de matriz o componentes precursores que forman la matriz y lo más preferiblemente en un intervalo de entre 0,05 y 0,2 mg de PTH o p�ptido de fusión de PTH/ml de matriz o componentes precursores que forman la matriz. Dependiendo de la edad del paciente, se prefieren ciertos subintervalos de la concentración de PTH o concentración de p�ptido de fusión de PTH. Si la matriz suplementada es aplicada para tratar quistes óseos en niños, la concentración de PTH o p�ptido de fusión de PTH est� preferiblemente en un intervalo de entre 0,01 y 0,35 mg de PTH o p�ptido de fusión de PTH/ml de matriz o componentes precursores que forman la matriz y lo más preferiblemente en un intervalo de concentración de entre 0,05 y 0,15 mg de PTH o p�ptido de fusión de PTH/ml de matriz o componentes precursores que forman la matriz. Mientras que si la formulación se aplica para incrementar localmente la densidad ósea de hueso osteopor�tico en adultos, la concentración preferida de PTH o p�ptido de fusión de PTH est� en un intervalo de entre 0,5 y 2 mg de PTH o p�ptido de fusión de PTH/ml de matriz o componentes precursores que forman la matriz, más preferiblemente entre 0,7 y 1,5 mg de PTH o p�ptido de fusión de PTH/ml de matriz o componentes precursores y lo más preferiblemente entre 0,9 y 1,1 mg de PTH o p�ptido de fusión de PTH/ml de matriz o componentes precursores que forman la matriz. En una realización preferida, la matriz es una matriz de fibrina.

II. Métodos para incorporación y/o liberación de factores bioactivos

En una realización preferida para incorporación de un factor bioactivo como PTH o un p�ptido de fusión dentro de la matriz, el factor bioactivo ser� incorporado, físicamente o químicamente, dentro de la matriz durante su gelificaci�n. En el caso de una matriz de fibrina, el factor XIIIa es una transglutaminasa que es activada durante la coagulación para dar fibrina. Esta enzima, formada naturalmente a partir del factor XIII por escisión por trombina o adicionalmente agregada a las soluciones precursoras de fibrina si se requieren concentraciones superiores, funciona para unir cadenas de fibrina entre s� vía enlaces amida, formados entre cadenas laterales de glutamina y cadenas laterales de lisina. La enzima también funciona para unir otros p�ptidos a fibrina durante la coagulación. Específicamente, se ha demostrado que la secuencia NQEQVSPL (SEQ ID NO: 2) funciona como un sustrato efectivo para el factor XIIIa. En el caso de matrices sintéticas, el p�ptido de fusión debe ser un grupo funcional que sea capaz de reaccionar con un grupo funcional de los componentes precursores que forman la matriz sintética bajo condiciones fisiológicas en el cuerpo. Por ejemplo, si la molécula precursora contiene grupos acrilato, el p�ptido de fusión debe contener los grupos tiol libres los cuales reaccionan con el grupo acrilato en una reacción de adición de tipo Michael. Dependiendo de la naturaleza del factor bioactivo, la mezcla de un factor no modificado también es posible para lograr una liberación sostenida a partir de la matriz.

III. Métodos de aplicación

Las matrices suplementadas pueden ser formadas in situ en la ubicación deseada después de la inyección de los componentes precursores separados, o pueden ser preformadas y después implantadas en la ubicación deseada. Dependiendo de la indicación, las matrices suplementadas son aplicadas o inyectadas en diferentes etapas de gelificaci�n. Si la inyección de la matriz suplementada est� en áreas de huesos no sanos los cuales son afectados por osteoporosis, son preferiblemente inyectadas en un estado pre-gelificado. Las soluciones precursoras son mezcladas y después de la gelificaci�n (usualmente después de aproximadamente 30 segundos a 2 minutos), el gel es inyectado a través de una aguja gruesa en el área afectada en el hueso. Esto se hace para prevenir el derrame de una matriz todavía líquida en la circulación sanguínea.

Para algunas de las indicaciones puede ser deseable la distribución del material en el área ósea en la cual es aplicada durante la inyección. En una realización preferida, un agente de contraste de rayos X, preferiblemente uno que es soluble en el material de matriz, se agrega al material precursor de matriz.

En general, los agentes de contraste son clasificados como agentes de contraste iónicos y no iónicos. Los agentes de contraste no iónicos son preferidos, aunque los agentes de contraste iónicos también pueden ser usados. Los agentes de contraste de rayos X que contienen yodo son preferidos.

Los agentes de contraste no iónicos preferidos incluyen iodixanol, iohexol, iopamidol, iopentol, iopromida, iorneprol, iosimida, iotasul, iotrolano, ioversol, ioxilano y metrizamida. El agente de contraste no iónico más preferido es iohexol (n.� CAS 66108-95-0). Si se agrega iohexol para visualizar el gel bajo fluoroscopia o rayos X, la matriz preferiblemente contiene de 100 a 600 mg por mililitro de la matriz o soluciones precursoras que forman la matriz, más preferiblemente de 250 a 500 mg por mililitro de la matriz o los componentes precursores que forman la matriz, lo más preferiblemente de 300 a 450 mg por mililitro en la matriz o los componentes precursores que forman la matriz.

Los agentes de contraste iónicos preferidos incluyen diatriazoato, iobenzamato, iocarmato, iocetamato, iodamida, iodipamida, iodoxamato, ioglicato, ioglicamato, iopanoato, iofendilato, iopronato, ioserato, iotalamato, iotroxato, ioxaglato, ioxitalamato y metrizoato.

Los agentes de contraste son comercialmente disponibles y pueden ser fácilmente sintetizados, como es bien sabido por el experto en la técnica.

El monitoreo de los agentes de contraste puede ser realizado con los métodos usados en general en la técnica, por ejemplo, por rayos X, formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) o formación de imágenes por ultrasonidos. Es bien sabido que los agentes de contraste funcionan modificando ya sea las características de absorción de rayos X de los sitios corporales en los cuales son distribuidos, modificando los tiempos de relajación de protones acuosos y de este modo son observables vía formación de imágenes por resonancia magnética, o modificando la velocidad de sonido o densidad en los sitios corporales en los cuales son distribuidos. De conformidad con la presente invención, se prefiere usar agentes de contraste los cuales pueden ser monitoreados por formación de imágenes por rayos X.

Como se describe en este documento, la formulación de matriz suplementada inyectada en el cuerpo en diferentes etapas de gelificaci�n puede gelificarse in situ o en el cuerpo. En otra realización, la matriz suplementada puede ser formada fuera del cuerpo y después aplicada en la forma preconfigurada. Independientemente del tipo de componente precursor usado, los componentes precursores deben ser separados antes de la aplicación de la mezcla al cuerpo para prevenir la combinación o contacto entre s� bajo condiciones que permiten la polimerizaci�n o gelificaci�n de los componentes. Para prevenir contacto previo a la administración, se puede usar un kit el cual separa las composiciones una de otra. Después de mezclar bajo condiciones que permiten la polimerizaci�n, las composiciones forman una red tridimensional suplementada con factor bioactivo. Dependiendo de los componentes precursores y sus concentraciones, puede ocurrir gelificaci�n casi instantáneamente después del mezclado.

En una realización, la matriz es formada a partir de fibrin�geno. El fibrin�geno, a través de una cascada de varias reacciones, se gelifica para formar una matriz, cuando se pone en contacto con trombina y una fuente de calcio a temperatura y pH apropiados. Los tres componentes, fibrin�geno, trombina y fuente de calcio, deben ser almacenados separadamente. Sin embargo, siempre que al menos uno de los tres componentes se mantenga separado, los otros dos componentes pueden ser combinados antes de la administración.

En una realización, el fibrin�geno se disuelve (el cual puede contener adicionalmente aprotinina para incrementar la estabilidad) en una solución tampón a pH fisiológico (en un intervalo de desde pH 6,5 hasta 8,0, preferiblemente desde pH 7,0 hasta 7,5) para formar una primera solución precursora y se almacena separadamente de una solución de trombina en un tampón de cloruro de calcio (por ejemplo, un intervalo de concentración de desde 40 hasta 50 mM). La solución tampón para el fibrin�geno puede ser una solución tampón de histidina a una concentración preferida de 50 mM que incluye NaCl adicionalmente a una concentración preferida de 150 mM o solución salina tamponada con TRIS (preferiblemente a una concentración de 33 mM).

En una realización preferida, un kit contiene una proteína de fusión, fibrin�geno, trombina y una fuente de calcio. Opcionalmente, el kit puede contener una enzima de reticulación, tal como el factor XIIIa. La proteína de fusión contiene un factor bioactivo, un dominio de sustrato para una enzima de reticulación y, opcionalmente, un sitio de degradación entre el dominio de sustrato y el factor bioactivo. La proteína de fusión puede estar presente ya sea en el fibrin�geno o la solución precursora de trombina. En una realización preferida, la solución precursora de fibrin�geno contiene la proteína de fusión.

Las soluciones son preferiblemente mezcladas por un dispositivo de jeringa de dos vías, en el cual ocurre el

mezclado apretando los contenidos de ambas jeringas a través de una cámara de mezclado y/o aguja y/o mezclador est�tico.

En una realización preferida, tanto el fibrin�geno como la trombina son almacenados separadamente en forma liofilizada. Cualquiera de los dos puede contener el factor bioactivo, el cual es preferiblemente una proteína de fusión. Antes del uso, se agrega tampón tris o histidina al fibrin�geno, el tampón puede adicionalmente contener aprotinina. La trombina liofilizada es disuelta en la solución de cloruro de calcio. Subsecuentemente, las soluciones de fibrin�geno y trombina son colocadas en recipientes separados/viales/cuerpos de jeringa y mezcladas por un dispositivo de conexión de dos vías, tal como una jeringa de dos vías. Opcionalmente, los recipientes/viales/cuerpos de jeringa son bipartitos, teniendo de este modo dos cámaras separadas por una división ajustable la cual es perpendicular a la pared del cuerpo de jeringa. Una de las cámaras contiene el fibrin�geno liofilizado o trombina, mientras que la otra cámara contiene una solución tampón apropiada. Cuando el émbolo se presiona hacia abajo, la división se mueve y libera el tampón en la cámara de fibrin�geno para disolver el fibrin�geno. Una vez que tanto el fibrin�geno como la trombina est�n disueltos, ambos cuerpos de jeringa bipartitos se unen a un dispositivo de conexión de dos vías y los contenidos son mezclados apret�ndolos a través de la aguja de inyección unida al dispositivo de conexión. Opcionalmente, el dispositivo de conexión contiene un mezclador est�tico para mejorar el mezclado de los contenidos.

En una realización preferida, el fibrin�geno es diluido ocho veces y la trombina es diluida 20 veces antes del mezclado. Esta relación da como resultado un tiempo de gelificaci�n de aproximadamente un minuto.

En otra realización preferida, la matriz suplementada est� formada por componentes precursores sintéticos capaces de experimentar una reacción de adición Michael. Puesto que el componente precursor nucle�filo (el multi-tiol), solamente reacciona con el componente multi-aceptor (el grupo insaturado conjugado), a pH básico, los tres componentes que tienen que ser almacenados separadamente antes del mezclado son: la base, el componente nucle�filo y el componente multi-aceptor. Tanto el componente multi-aceptor como el componente multi-tiol, son almacenados como soluciones en tampones. Ambas composiciones pueden incluir el sitio de unión celular y adicionalmente la molécula bioactiva. De este modo, la primera composición del sistema puede incluir, por ejemplo, la solución del componente nucle�filo y la segunda composición del sistema puede incluir la solución del componente multi-aceptor. Cualquiera o ambas de las dos composiciones pueden incluir la base. En otra realización, el multi-aceptor y el multi-tiol, pueden ser incluidos como solución en la primera composición y la segunda composición puede incluir la base. La conexión y el mezclado ocurren de la misma forma que la descrita previamente para el fibrin�geno. El cuerpo de jeringa bipartito es igualmente adecuado para los componentes precursores sintéticos. En lugar del fibrin�geno y la trombina, los componentes multi-aceptor y multi-tiol son almacenados en forma pulverizada en una de las cámaras y la otra cámara contiene el tampón básico.

Adicionalmente, otros componentes, además de los ingredientes mencionados anteriormente, pueden ser incorporados en los sistemas de la presente invención. Por ejemplo, un material que contiene un mineral de calcio, es decir, una sustancia homogénea que se origina naturalmente que contiene iones de calcio tal como hidroxiapatita, puede ser usado.

Ejemplos

Ejemplo 1: Bioactividad de PTH1-34 y TGpIPTH1-34

El p�ptido PTH1-34, que muestra actividad similar a la PTH1-84 de longitud completa, y proteínas de esta longitud pueden ser sintetizados por métodos de síntesis pept�dica de estado sólido estándar.

Todos los p�ptidos son sintetizados en resina sólida usando un sintetizador pept�dico automatizado usando química estándar de 9-fluorenilmetoxicarbonilo. Los p�ptidos fueron purificados por cromatograf�a de c18 y analizados usando cromatograf�a de fase inversa vía HPLC para determinar la pureza, as� como también espectroscop�a de masas (MALDI), para identificar el peso molecular de cada producto. Usando este método, la PTH1-34, as� como también TG-pl-PTH1-34 (NQEQVSPLYKNRSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWL- RKKLQDVHNF (SEQ ID NO: 12)) y TGPTHl-34 (NQEQVSPLSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF (SEQ ID NO: 13)), fueron sintetizadas. Las TGplTPH1-34 y TGPTH1-34, difieren de PTH1-34 en que adicionalmente comprenden el dominio del sustrato del factor XIIIa, el cual est� ligado a PTH1-34 vía la secuencia pl degradable por plasmina YKNR (SEQ ID NO: 15), en el caso de TGplPTH1-34, y directamente en el caso de TGPTH1-34.

Para estudiar la bioactividad de los p�ptidos de fusión de PTH, se estableció un ensayo de gen indicador. En este ensayo, un pl�smido que contiene el gen indicador de luciferasa, el cual est� ligado al promotor para el receptor de la hormona paratiroides, es transfectado en las células. Entonces, si la célula es expuesta a PTH y la PTH subsecuentemente se enlaza a su receptor en la célula, se inicia una cascada de señales, dirigida a través de los niveles elevados de cAMP. A través de una regulaci�n de retroalimentación natural, entonces esto conduce a una reducción de los niveles del receptor de PTH. Como la reducción se dirige a través del promotor, entonces también

conduce a una disminución en la producción del gen indicador ligado. Usando este ensayo, la actividad tanto de PTH1-34 nativa as� como también de TG-pl-PTH1-34, se estudiaron y se compararon con un estándar internacional. Se observ� que ambas de estas moléculas mostraron un nivel de actividad similar, ya que la reducción en la expresión del gen indicador para ambos fue la misma, y este nivel de actividad fue el mismo que para el estándar internacional. Los resultados se muestran en la figura 1.

Ejemplo 2: Liberación de PTH a partir de una matriz de fibrina

Se hizo una matriz de fibrina a partir de componentes precursores de fibrina del kit TISSEEL� (Baxter AG, CH-8604 Volketswil/ZH). La composición se lista en la tabla 2. En la presencia de 0,1 μg/ml de PTH1-34 o TGPTH1-34 entonces se agregó a la trombina, y se mezcl� para formar una concentración homogénea. La TGPTH1-34, solamente tiene una secuencia de transglutaminasa en el extremo amino-terminal, sin un sitio de degradación. De este modo, la TGPTH1-34 solamente puede ser liberada por degradación de la propia matriz de fibrina. Este p�ptido se sintetizó como se describe anteriormente en el ejemplo 1.

Para el primer ensayo de liberación, se incub� una matriz de fibrina de 50 μl con 0,1 mg de PTH o TGPTH por ml de fibrina, a 37�C en 10 ml de tampón. Por lo tanto, la concentración de PTH o TGPTH en el tampón en el caso de una liberación total sería de 0,5 μg de PTH o TGPTH/ml de matriz de fibrina. Para comparar la estabilidad de PTH o TGPTH durante el ensayo, se diluyeron directamente en el tampón muestras de PTH o TGPTH, a una concentración de 0,5 μg de PTH o TGPTH/ml de matriz de fibrina. Se probaron tampones diferentes: agua destilada, solución salina tamponada con fosfato, solución salina tamponada con tris.

Se tomaron alícuotas en los días 0, 1, 2, 4 y 6 y se analizaron directamente por ELISA. Los resultados mostraron que la PTH no fue estable durante más de 2 días en ninguno de los tampones. Por lo tanto, no pudo extraerse ninguna conclusión sobre los datos de liberación. La estabilidad de PTH se vio ciertamente afectada por su baja concentración y tampones que no fueron óptimos.

El experimento de liberación se repitió usando un tampón de estabilizaci�n que contenía 50 mM de manitol en 10 mM de tampón de acetato de sodio. Además, el tampón se intercambi� cada 2 días para prevenir cualquier degradación pept�dica. La concentración de PTH o TGPTH se increment� hasta 1 mg de PTH o TGPTH/ml de matriz de fibrina en una matriz de fibrina de 100 μl y la incubaci�n se logr� en 1 ml de tampón. La concentración de PTH o TGPTH en el tampón en el caso de una liberación total sería de 100 μg/ml de matriz de fibrina (200 veces más que anteriormente). Como en el primer experimento, muestras con adiciones conocidas (la misma cantidad de PTH o TGPTH disuelta en el tampón como control) se prepararon para evaluar la estabilidad de PTH o TGPTH durante el experimento (100 μg/ml). Las muestras se recogieron cada 2 a 4 días (con un cambio de tampón) durante 2 semanas y se analizaron por ELISA directo. Las muestras con adiciones conocidas también se recogieron cada 2 días. Los resultados mostraron que bajo estas condiciones, la PTH y TGPTH son estables durante 2 semanas.

Como se puede ver de la figura 2, la liberación principal de la matriz de fibrina se logra en el plazo de 3 días. Casi 60% de PTH y 13% de TGPTH fueron liberados después del día 3. Estos datos demuestran que la retención de PTH en la matriz de fibrina es altamente mejorada por la adición de la secuencia de TG.

Ejemplo 3: Síntesis de una matriz de fibrina suplementada que comprende un p�ptido de fusión de PTH

La matriz de fibrina se form� partiendo del kit TISSEEL� (Baxter AG, CH-8604 Volkestwil/ZH) dando 4 ml de matriz de fibrina. El TISSEEL� se produjo de plasma combinado derivado de ser humano, y el contenido de los ingredientes activos puede variar de lote a lote dentro de intervalos predefinidos. La tabla 2 lista la composición final usada.

Tabla 2: Composición final que comprende TISSEEL� y componente activo

Ingredientes: Dosis por 2 ml de gel

Jeringa 1

Componente activo: P�ptido de fusión de PTH1-34 (TGplPTH1-34): de 0,2 a 20 mg

Agentes coagulantes

Fibrin�geno Otras prote�nas: 66-100 mg

Aprotinina (bovina): 2046-3409 KIE

Albúmina humana Componentes tampones: 9,1-18,2 mg

Niacinamida: 2,7-8,2 mg

L-histidina: 9,1-22,7 mg

Citrato de sodio: 4,4-8,8 mg

Polisorbato 80: 0,6-1,7 mg

Agua para inyección: hasta 1 ml

Jeringa 2

Agentes coagulantes

Trombina (humana) Componentes tampones: 2,5-6,5 U.I.

Cloruro de calcio: 5,8 + 0,6 mg

Cloruro de sodio: 3,5-5,5 mg

Proteína (albúmina de suero humano): 45-55 mg

Agua para inyección: hasta 1 ml

El fibrin�geno se suspendió en una solución con aprotinina, un inhibidor de serina proteinasa el cual ayuda a reducir la fibr�lisis para retener la integridad de la matriz de fibrina. Esta solución se insert� en una primera cámara de una jeringa de dos vías (jeringa 1). La trombina se proporciona separadamente en una solución de cloruro de calcio en una segunda cámara de una jeringa de dos vías (jeringa 2). Los sellantes de fibrina también contienen otros componentes de andamiajes de fibrina, tales como fibronectina plasm�tica, factor XIII, plasmin�geno y albúmina

humana. La TGpl-PTH1-34 se formul� en el componente de fibrin�geno para dar una concentración final en la matriz de 0,1 mg/ml a 10 mg/ml en la matriz. La composición exacta usada se proporciona en la tabla 2.

Cuando los componentes de fibrin�geno y trombina se mezclaron en volúmenes iguales, ocurrió un proceso de coagulación para formar fibrina, una matriz extracelular natural. Durante el proceso de gelificaci�n, la TGp-PTH1-34 se reticul� en la matriz. El proceso de coagulación tuvo lugar durante 45-60 segundos lo que permitió la inyección simultánea de líquidos, a través de una punta mezcladora, en el defecto, en donde el gel se solidific�.

Ejemplo 4: Tratamiento de lesiones qu�sticas subcondrales en caballos usando PTH1-34 reticulada en una matriz de fibrina inyectable.

Los quistes óseos subcondrales en caballos son una entidad clónica similar a quistes óseos unicamerales en seres humanos y, por lo tanto, han sido usados como un modelo para valorar el potencial de cicatrización de PTH1-34 reticulada en matrices de fibrina.

Se sometieron a cirugía 12 caballos (12 quistes) por medio de lo cual el contenido del quiste se extrajo por cureta de drenaje. Los quistes se localizaron en varias articulaciones en la pata delantera, as� como también en la pata trasera.

La composición del ejemplo 3 que contiene volúmenes iguales de fibrin�geno y trombina se inyect� en el SCL junto con TGplPTH1-34 a concentraciones finales de 10, 1 y 0,4 mg/ml y se dej� polimerizar in situ. Se us� un volumen promedio de 2 ml de matriz suplementada para llenar los defectos, con volúmenes que variaron desde 0,2-5 ml de matriz suplementada. La edad de los caballos variaba desde 2 meses hasta 11 años. Los seguimientos se realizaron a 2, 4, 6 y 12 meses post-operativamente investigando radiografías, as� como también la cicatrización clónica.

La administración intralesional dio como resultado cicatrización muy buena del SCL. Todos los caballos analizados mostraron progreso significativo en cicatrización clónica y radiogr�fica. La cicatrización radiogr�fica se reflej� por una densidad superior del contenido del quiste y una reducción en el tamaño de quistes y ocurrió 2-6 meses postoperativamente con una tendencia a cicatrización más rápida a concentraciones inferiores de PTH1-34. Casi todos los caballos fueron cl�nicamente curados después de solamente 2-4 meses post-operativamente, y de este modo ya no mostraron ninguna cojera.

Estos resultados son especialmente alentadores ya que se logr� una cura satisfactoria en caballos adultos con una edad de 3 años o más, que se sabe que tienen un pronóstico particularmente malo de regeneración ósea.

Las concentraciones de 0,4 a 10 mg/ml han mostrado ser efectivas con una tendencia de mejor cicatrización a concentraciones inferiores.

Los tratamientos con la matriz suplementada que contenía dosis inferiores de TGplPTH1-34 (0,1 mg/ml), también han mostrado promover la cicatrización de SCL.

TABLA 3: Información general del paciente y ubicación del SCL

N.� interno: Raza Sexo Edad Ubicación del SCL

1: Inl�nder Yegua 1 año 1era falange/articulación de cuartilla, izquierda frontal

2: Inl�nder Yegua 10 años Hueso de ca�a/articulación de espolón, derecha frontal

3: W�rttemberger Yegua 11 años Radio, derecho

5: Pinto Yegua 3 años R�tula/babilla, derecha

7: Vollblut Yegua 3 años Hueso sesamoide/articulación de espolón, derecha frontal

(continuación)

N.� interno: Raza Sexo Edad Ubicación del SCL

12: Olden-burger Yegua 3 años Hueso sesamoide/articulación de espolón, izquierda frontal

13: Inl�nder Yegua 3 años Fémur/babilla, derecha

15: Inl�nder Yegua 2 meses Osteomielitis de fémur/babilla, derecha

16: Inl�nder Castrado 2 meses Osteomielitis de fémur/babilla, derecha

18: Araber Castrado 5 años Hueso de ca�a/articulación de espolón, izquierda frontal

19: Inl�nder Semental 3 años Hueso de ca�a/articulación de espolón, derecha frontal

20: Inl�nder Castrado 9 años Hueso calcáneo, articulación de corvejón, derecha

TABLA 4: Grado de cojera antes y durante el tratamiento

N.� interno: TGplPTH134 en matriz de fibrina [mg/ml] Antes del tratamiento Cicatrización clónica (grado de cojera) 2 meses 4 meses 6 meses 12 meses

2: 10 3 2 Curado Curado Curado

1: 3-4 1 Curado - Curado

3: 1 2 Curado Curado - -

5: 1 3 Curado - Curado

7: 1 2 1 Curado -

19: 1 1 Curado Curado

12: 0,4 3 Curado Curado -

13: 0,4 2 Curado -

15: 0,4 5 2 - curado

16: 0,4 4 1

18: 0,4 1 Curado

20: 0,4 3 - 1

Curado = sin cojera presente - = sin visita de control

La cojera se gradu� usando el criterio expuesto en la tabla 5. TABLA 5: Grados de cojera y criterios correspondientes

Grado de cojera: Criterio

1 - menor, no clara: Cojera no consistentemente aparente: sin cojera al caminar, solamente irregular al trotar

2 – menor, clara: Cojera consistentemente aparente bajo circunstancias especiales: sin cojera al caminar, cojera en cada paso al trotar

3 – media: Cojera consistentemente aparente: cojera clara caminando y trotando

4 – cojera de grado alto: Cojera severa

5 – cojera de grado superior: Sin cargar nada

Ejemplo 5: Modelo de Hueso trabecular de conejo

5 Para estudiar el potencial de fibrina-TGplPTH para inducir el engrosamiento intra�seo de hueso trabecular, se estableció un modelo de ratón. Se inyectaron 150 μl de varias dosis de TGplPTH en fibrina en los fémures distales de dieciséis conejos blancos de Nueva Zelanda. Los conejos se anestesiaron y se expuso el c�ndilo femoral. Se taladr� un pequeño agujero a través del hueso cortical en el lado del c�ndilo y el material se introdujo en el hueso a través de una aguja de 22G conectada a una jeringa de 1 ml. Las dosis probadas fueron 0, 0,1, 0,4 y 1,0 mg de

10 TGplPTH1-34/ml de matriz de fibrina siendo la pierna opuesta de cada conejo un control no tratado. Después de 8 semanas, los animales fueron sacrificados y los c�ndilos femorales se sometieron a μCT para valorar la densidad ósea después del tratamiento. La densidad ósea increment� en aproximadamente 10% después del tratamiento con 1 mg de TGP1PTH1-34/ml de matriz de fibrina.

Ejemplo 6: Visualización, monitoreo y pruebas de manipulación de fibrina radioopaca inyectada en hueso ovino

15 Para visualizar el flujo de una matriz de fibrina con hueso bajo fluoroscop�a y rayos-X, se incorpor� un agente de contraste a base de yodo, iohexol, en la matriz de fibrina. Se disolvieron 600-800 mg de iohexol en la solución precursora de trombina para dar concentraciones finales de 300-400 ml de iohexol por matriz de fibrina. Se prob� un intervalo de trombina en la composición precursora de trombina (4-10 U/ml). Los otros componentes de la matriz de fibrina son como se describen en la tabla 2.

20 Una prueba de gelificaci�n mostr� que se requerían concentraciones superiores de trombina para formar el gel. Ambos componentes se inyectaron como líquidos simultáneamente en la vértebra de ovejas y fémur distal vía una jeringa doble y una aguja colocada en el hueso y se dejaron polimerizar in situ. El gel podía ser claramente visualizado usando rayos X y fluoroscop�a.

Ejemplo 7: Fibrina pre-polimerizada inyectada en hueso ovino, visualización y pruebas de manejo

25 Para visualizar y probar el manejo de una matriz de fibrina pre-polimerizada dentro del hueso bajo fluoroscop�a y rayos-X, se incorpor� un agente de contraste a base de yodo, iohexol, en el gel. Se disolvieron 600-800 mg de iohexol en el tampón de dilución de trombina para dar la concentración final de 300-400 mg/ml de iohexol en la matriz de fibrina. El precursor de trombina se agregó a la solución de tampón-iohexol a una concentración de 75 U/ml de solución tampón. Los otros componentes de la matriz de fibrina son como se describen en la tabla 2.

Una prueba de gelificaci�n mostr� que había una formación rápida de la matriz después del mezclado de los componentes precursores que comprendían los componentes de trombina y fibrin�geno. Ambas soluciones precursoras se inyectaron como líquidos simultáneamente en una tercera jeringa con una rosca de tornillo y se dejaron polimerizar completamente. La matriz que contenía agente de contraste se introdujo en vértebras ovinas a

5 través de una aguja grande colocada en el hueso. El gel podía ser claramente visualizado usando rayos-X y fluoroscop�a.

Lista de secuencias

<110> SCHENSE, JASON WATSON, JOHN ARRIGHI, ISABELLE

<120> Tratamiento local de defectos óseos 10 <130> KUROS 132

<150> Documento US 60/641.830

<151>

<150> Documento US 60/642.848

<151> 15 <160> 22

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 5

<212> PRT 20 <213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 8 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3 30 <211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

10 <210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens 20 <400> 6

<210> 7

<211> 13

<212> PRT 25 <213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 4 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10 15 <211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

20 <210> 11

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Acetilado

<222> (1)..(1)

<400> 13

<210> 14

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Acetilado

<222> (1)..(1)

<400> 14

<210> 15

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

10 <210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens 20 <400> 18

<210> 19

<211> 4

<212> PRT 25 <213> Homo sapiens

<400> 19

<210> 20

<211> 46

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Hormona paratiroides modificada (PHT), que comprende los amino�cidos 1-34 de la PTH nativa as� como también un dominio de sustrato de transglutaminasa y una secuencia degradable por plasmina

<400> 20

<210> 21

<211> 42

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 15 <220>

<223> Hormona paratiroides modificada (PHT), que comprende los amino�cidos 1-34 de la PTH nativa as� como también un dominio de sustrato de transglutaminasa

<400> 21

<210> 22

<211> 21

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína de fusión que comprende los amino�cidos 283-396 de la hormona paratiroides nativa y un dominio de sustrato de transglutaminasa

<400> 22

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Uso de una formulación que comprende un factor bioactivo seleccionado del grupo que consiste de una hormona paratiroides PTH y un p�ptido de fusión que comprende una PTH en un primer dominio, y un dominio de sustrato covalentemente reticulable en un segundo dominio, y una composición capaz de formar una matriz que puede servir como matriz en crecimiento de células en un sitio en un hueso en necesidad de tratamiento, para la prevención o el tratamiento de una fractura en áreas de huesos no sanos afectadas por osteoporosis, en la que la formulación es para la administración local al área de huesos no sanos.
2.

Formulaci�n para su uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el p�ptido de fusión est� covalentemente unido a la matriz durante su formación.
3.

Formulaci�n de conformidad con la reivindicación 1 � 2, en donde la formulación es inyectable.
4.

Formulaci�n para su uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el p�ptido de fusión además comprende un sitio de degradación entre el primer y segundo dominio.
5.

Formulaci�n para su uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la PTH se selecciona del grupo que consiste de PTH1-84, PTH1-28, PTH1-34, PTH1-31 y PTH1-25.
6.

Formulaci�n para su uso de conformidad con la reivindicación 5, en donde la PTH es PT1-34.
7.

Formulaci�n para su uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el segundo dominio del p�ptido de fusión comprende un dominio de sustrato de transglutaminasa.
8.

Formulaci�n para su uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la formulación además comprende un agente de contraste.
9.

Formulaci�n para su uso de conformidad con la reivindicación 7, en donde el dominio de sustrato de transglutaminasa es un dominio de sustrato de factor XIIIa.
10.

Formulaci�n para su uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la composición capaz de formar una matriz comprende fibrin�geno, trombina y una fuente de calcio.
11.

Formulaci�n para su uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la matriz se forma por una reacción de adición de tipo Michael entre al menos una primera molécula precursora que comprende n grupos nucle�filos y al menos una segunda molécula precursora que comprende m grupos electr�filos, en donde n y m son al menos dos y la suma de n+m es al menos cinco.
12.

Formulaci�n para su uso de conformidad con la reivindicación 11, en donde la primera molécula precursora es un polietilenglicol que comprende grupos nucle�filos y la segunda molécula precursora es un polietilenglicol que comprende grupos electr�filos.
13.

Formulaci�n para su uso de conformidad con la reivindicación 12 � 13, en donde los grupos electr�filos son grupos insaturados conjugados y los grupos nucle�filos se seleccionan del grupo que consiste de tioles y aminas.
14.

Formulaci�n para su uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el segundo dominio del p�ptido de fusión comprende al menos una ciste�na.
15.

Formulaci�n para su uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la concentración de PTH o el p�ptido de fusión que comprende una PTH en la formulación oscila entre 0,01 y 2 mg de PTH o p�ptido de fusión de PTH/ml de composición capaz de formar la matriz.
16.

Formulaci�n para su uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde la composición capaz de formar una matriz comprende más de al menos dos componentes, y en donde la formulación se proporciona en un kit en el cual un primer componente de la composición capaz de formar una matriz se almacena por separado de un segundo componente de la composición.
17.

Formulaci�n para su uso de conformidad con la reivindicación 16, en donde el kit además comprende una enzima de reticulación.