DESCRIPCIÓN Conjugados de dímeros de pirrolo[1,4]benzodiazepina como agentes anticancerígenos La presente invención se refiere a conjugados de dímeros de la pirrolo[1,4]benzodiazepina (PBD), a las composiciones que los contienen y a su aplicación terapéutica, principalmente como compuestos anticancerosos. La invención se refiere también al procedimiento de preparación de los conjugados a su aplicación como compuestos 5 anticancerosos, así como a los propios dímeros. [Área técnica] Los dímeros de las pirrolo[1,4]benzodiazepinas son compuestos anticancerosos que actúan uniéndose de forma covalente al ADN de las células. Estos derivados han sido descritos en las solicitudes WO 00/12508 y WO 2005/085260 así como en las publicaciones siguientes: Eur.J.Med.Chem. 2005, 40, 641-654; Tetrahedron 10 Letters 1988, 29 (40), 5105-51108. La química de los conjugados es conocida desde hace muchos años y ha sido aplicada a varias familias de citotóxicos como por ejemplo los maitansinoides (WO 04103272), los taxanos (WO 06061258), las leptomicinas (WO 07144709), el CC-1065 y sus análogos (WO 2007102069); véase también a propósito de los conjugados, los documentos Monneret C., et al., Bulletin du Cancer 2000, 87 (11), 829-38; Ricart A. D. et al., Nature Clinical Practice 15 Oncology 2007, 4, 245-255; Singh R. y Rickson H. K., Therapeutic Antibodies: Methods and Protocols, 2009, 525, 445-467. [Técnica anterior] Conjugados de dímeros de la pirrolo[1,4]benzodiazepina ya han sido descritos en las solicitudes WO 07085930 o WO 2009/016516. Los dímeros usados tienen más particularmente como fórmulas: 20 NONY'HNONYX-An-T-A'n'-X'HNONY'HNONYX-An-T-A'n'-X'H en las que T puede representar un grupo arilo o heteroarilo sustituido con –G-D-(Z)p-SZa o –G-D-(Z)p-C(=O)ZbRb. G representa un enlace sencillo o doble o bien –O-, -S- o –NR-. D representa un enlace sencillo o bien uno de los grupos siguientes: –E-, -E-NR-, -E-NR-F-, -E-O-, -E-O-F-, -E-NR-CO-, -E-NR-CO-F-, -E-CO-, -CO-E-, -E-CO-F, -E-S-, -E-S-F-, -E-NR-CS-, -E-NR-CS-F- para los que E y F se eligen entre -(OCH2CH2)ialquil(OCH2CH2)j-, 25 -alquil(OCH2CH2)i-alquil-, -(OCH2CH2)i-, -(OCH2CH2)icicloalquil(OCH2CH2)j-, -(OCH2CH2)iheterociclil(OCH2CH2)j-, -(OCH2CH2)iaril(OCH2CH2)j-, -(OCH2CH2)iheteroaril(OCH2CH2)j-, –alquil-(OCH2CH2)ialquil(OCH2CH2)j-, -alquil-(OCH2CH2)i-, -alquil-(OCH2CH2)icicloaquil(OCH2CH2)j-, -alquil(OCH2CH2)iheterociclil(OCH2CH2)j-, -alquil-(OCH2CH2)iaril(OCH2CH2)j-, -alquil(OCH2CH2)iheteroaril(OCH2CH2)j-, -cicloalquil-alquil-, -alquil-cicloalquil-, -heterociclil-alquil-, -alquil-heterocicliclil-, -alquil-aril-, -aril-alquil-, -alquil-heteroaril-, -heteroaril-alquil-. i y j representan 30 números enteros que van de 0 a 2.000. Z representa un grupo alquilo y p es un número entero que vale 0 ó 1. El grupo L2 = -CH2C(=O)NR3-(CH2CH2O)i-ALK- que caracteriza algunos de los compuestos de la presente invención comprende el resto amida (-CONR3-) y no puede corresponder en WO 07085930 o en WO 2009/016516 más que al resto -E-CONR-F- siendo E = alquil y F = -(CH2CH2O)i-alquil-. Sin embargo, el grupo L1 que está unido al ciclo fenilo o piridinilo y que está unido a L2 no ha sido descrito ni sugerido en estas dos solicitudes. En efecto, no podría 35 corresponder más que al resto G. Ahora bien, G no puede ser más que un enlace (sencillo, doble o triple) o bien –O-, -S- o –NR-. Si se trata de los otros compuestos de la presente invención que se caracterizan por el grupo de enlace -O-ALK-NR3-ALK-S-(CH2CH2O)i-ALK-, ninguno de los restos D de WO 07085930 o de WO 2009/016516 prevén la combinación de un grupo amina NR3 y de un enlace –S-. Los dímeros siguientes se describen en el documento WO 2009/016516: 40 NONOOONONOHHOOOOONOOO(ej. 3)NONOONONONOHHOOOOOO(ej. 5)
(ej.10) ONOOONONOOONONOHH(ej. 7) pero ninguno de estos dímeros comprende un grupo de enlace similar a los descritos en la presente invención (en particular, no incluye el resto –ALK-S-). Por lo tanto, las dos solicitudes WO 07085930 y WO 2009/016516 no describen ni sugieren los compuestos de la 5 presente invención. [Problema técnico] El problema técnico que pretende resolver la presente invención es el de proponer nuevos conjugados de dímeros de la pirrolo[1,4]benzodiazepina. [Definiciones] 10 Se entiende por: conjugado: un agente de selección de la diana celular al que está unido de forma covalente al menos una molécula de un compuesto citotóxico; agente de selección de la diana celular (o "cell binding agent" en inglés): una molécula que tiene afinidad por una diana biológica: se puede tratar por ejemplo de un ligando, una proteína, un anticuerpo, más particularmente 15 monoclonal, un fragmento de proteína o de anticuerpo, un péptido, un oligonucleótido o un oligosacárido. El agente de selección de la diana tiene como función dirigir el compuesto biológicamente activo como un citotóxico hacia la diana biológica; diana biológica: un antígeno (o grupo de antígenos) localizado preferiblemente en la superficie de las células cancerosas o células estromales asociadas a este tumor; estos antígenos pueden ser por ejemplo, un 20 receptor del factor de crecimiento, un producto de un oncogén o de un gen "supresor del tumor" mutado, una molécula relacionada con la angiogénesis, o una molécula de adhesión; grupo alquilo : un grupo hidrocarbonado alifático saturado obtenido quitando un átomo de hidrógeno de un alcano. El grupo alquilo puede ser lineal o ramificado. A título de ejemplos, se pueden citar los grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, iso-butilo, ter-butilo, pentilo, 2,2-dimetilpropilo o hexilo; 25 grupo cicloalquilo : un grupo alquilo cíclico que comprende entre 3 y 8 átomos de carbono implicados en la estructura cíclica. A título de ejemplos, se pueden citar los grupos ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo; grupo arilo: un grupo aromático que no contiene ningún heteroátomo, mono- o bicíclico. Se trata más particularmente de grupos fenilo y naftilo; grupo heteroarilo: un grupo aromático que comprende al menos un heteroátomo (O, S, N) implicado en el 30 ciclo y unido a los átomos de carbono que forman el ciclo, mono- o bicíclico. Se trata más particularmente de los grupos piridinilo, pirrolilo, tienilo, furanilo, pirimidinilo o triazolilo; grupo heterocicloalquilo: un grupo cicloalquilo que comprende al menos un heteroátomo (O, S, N) implicado en el ciclo y unido a los átomos de carbono que forman el ciclo; grupo alcoxi: un grupo -O-alquilo, en el que el grupo alquilo es tal como se ha definido anteriormente; 35 grupo alcanoiloxi: un grupo –O-CO-alquilo, en el que el grupo alquilo es tal como se ha definido anteriormente; grupo alquileno: un grupo divalente saturado de fórmula general -CnH2n-, obtenido quitando dos átomos de hidrógeno de un alcano. El alcano puede ser lineal o ramificado. A título de ejemplos, se pueden citar los grupos metileno (-CH2-), etileno (-CH2CH2-), propileno (-CH2CH2CH2-), butileno (-CH2CH2CH2CH2-), isobutileno 40
,(), hexileno (-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-). Un grupo alquileno lineal puede ser más particularmente de fórmula –(CH2)m-, representando m un número entero; en los intervalos de valores se incluyen los extremos, (por ejemplo, un intervalo de tipo « i que va de 1 a 6 » incluye los extremos 1 y 6. Abreviaturas utilizadas: 5 AcOEt: acetato de etilo; ALK: grupo alquileno (C1-C12), más particularmente alquileno (C1-C6); CCM: cromatografía en capa fina (TLC por sus iniciales en inglés); DAR: relación fármaco-anticuerpo, por sus iniciales en inglés: Drug Antibody Ratio; DBU: 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno; DCC: N,N’-diciclohexilcarbodiimida; DCM: diclorometano; DEAD: dietilazodicarboxilato; DIC: N,N’-diisopropilcarbodiimida; DIPEA: N,N-diisopropiletilamina; DMA: dimetilacetamida; DMAP: 4-dimetilaminopiridina; DME: dimetoxietano; DMF: dimetilformamida; DMSO: sulfóxido de 10 dimetilo; ε: coeficiente de extinción molar; EEDQ: 2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-dihidroquinolina; EDCI: N-(3-dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodiimida; EDTA: ácido etilen-diamino-tetraacético; Fmoc: fluorenilmetoxicarbonilo; GP: grupo protector; Hal: átomo de halógeno; HOBt: 1-hidroxibenzotriazol; HEPES: ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico; LG: grupo saliente; NHS: N-hidroxisuccinimida; NMP: N-metilpirrolidinona; PR: presión reducida; Rf : factor de retención; SEC : cromatografía de exclusión estérica; TA: temperatura ambiente; TBDMS: 15 terc-butildimetilsililo; TEA: trietilamina; TFA: ácido trifluoroacético; TIPS: triisopropilsililo; THF: tetrahidrofurano; tR : tiempo de retención. [Figuras] Fig. 1: espectro de masas de alta resolución del conjugado del ejemplo 1 después de desglicosilación; Fig. 2: espectro de masas de alta resolución del conjugado del ejemplo 2 después de desglicosilación; 20 Fig. 3: espectro de masas de alta resolución del conjugado del ejemplo 3 después de desglicosilación; Fig. 4: espectro de masas de alta resolución del conjugado del ejemplo 4 después de desglicosilación; Fig. 5: espectro de masas de alta resolución del conjugado no desglicosilado del ejemplo 6. Estas figuras muestran para cada conjugado, después de deconvolución, la distribución de las especies que llevan de 0 a 8 dímeros de tomaimicina (D0: ningún dímero; Dx: x dímeros). 25 [Descripción de la invención] La invención se refiere a compuestos de fórmula: en la que: ---- representa un enlace sencillo o un enlace doble con la condición de que si 30 ---- representa un enlace sencillo entonces: ---- representa un enlace sencillo; U y/o U’, idéntico o diferente, representa(n) independientemente el uno del otro, H; W y/o W’, idéntico o diferente, representa(n) independientemente el uno del otro: OH, -OR, –OCOR, -COOR, -OCOOR, –OCONRR’, un carbamato cíclico tal que N10 y C11 estén incluidos en un ciclo, 35 -NRCONRR’, -OCSNHR, un tiocarbamato cíclico tal que N10 y C11 estén incluidos en un ciclo, -SH, -SR, -SOR, -SOOR, –SO3-, -NRSOOR’, –NRR’, una amina cíclica tal que N10 y C11 estén incluidos en un ciclo, -NROR’, –NRCOR’, –N3, -CN, Hal, un grupo trialquilfosfonio o triarilfosfonio;
R1, R2, R1’, R2’, idénticos o diferentes, representan independientemente el uno del otro: H, Hal o un grupo alquilo(C1-C6) sustituido opcionalmente con uno o varios sustituyentes elegidos entre: Hal, CN, NRR’, CF3, OR, un grupo arilo o heteroarilo, S(O)qR con q = 0,1 ó 2; o bien R1 y R2 y/o R1’ y R2’ forman juntos respectivamente un enlace doble =CH2 o =CH-CH3; 5 Y e Y’, idénticos o diferentes, representan independientemente el uno del otro H u -OR; M representa CH o N; ALK y ALK’, idénticos o diferentes, representan independientemente uno del otro un grupo alquileno (C1-C6); R y R’ representan, independientemente el uno del otro, H o un grupo alquilo(C1-C6) o arilo sustituido 10 opcionalmente con uno o varios sustituyentes elegidos entre: Hal, CN, NRR’, CF3, OR, un grupo arilo o heteroarilo; L representa: el grupo -L1-L2- en el que L1 está unido al ciclo aromático que comprende M por el grupo ALK u OALK y representa uno de los grupos siguientes: -ALK-S- 15 -O-ALK-NR3-ALK-SNOOCH2 ‐O‐ALK‐NR3‐ALK‐S‐ NNOALK-S--O-ALK- NOALK-S--O-ALK- -O-ALK-ALK-S-NN 20 y L2 representa el grupo -CH2C(=O)-NR3-(CH2CH2O)i-ALK- unido a L1 por –CH2C(=O)- o bien el grupo –O-ALK-NR3-ALK-S-(CH2CH2O)i-ALK- unido al ciclo aromático que comprende M por el grupo OALK R3 representa H o un grupo alquilo (C1-C6); 25 i representa un número entero que va de 1 a 40, mejor de 1 a 20, preferentemente de 1 a 10; Zb representa un enlace sencillo, -O- o -NH-, representando Rb H o un grupo alquilo (C1-C6), cicloalquilo (C3-C7), arilo, heteroarilo o heterocicloalquilo (C3-C7) o bien Zb representa un enlace sencillo y Rb representa Hal. Los compuestos de fórmula (I), incluidos los indicados como ejemplo, pueden existir en estado de bases o de sales de adición con ácidos farmacéuticamente aceptables o también de hidratos o solvatos de estas bases o de estas 30 sales.
Más particularmente, los dos grupos ALK y ALK’ unidos al núcleo fenilo o piridinilo designan ambos un grupo metileno: Más particularmente, entre los compuestos de fórmula (I) se distinguen los de fórmula (IA) o (IB): 5 Y e Y’ representan más particularmente un grupo alcoxi(C1-C4), principalmente el grupo metoxi. R y R’ pueden representar más particularmente, independientemente el uno del otro, H o un grupo alquilo(C1-C6). Según un modo particular, U = U’ y/o W = W’ y/o R1 = R1’ y/o R2 = R2’ y/o Y = Y’ y/o los dos grupos ALK y ALK’ unidos al núcleo fenilo o piridinilo son idénticos. L se puede elegir más particularmente entre uno de los siguientes: 10 ALK-S-CH2C(=O)-NH-(CH2CH2O)i-CH2CH2- O-ALK-NR3-ALK-S-CH2C(=O)-NH-(CH2CH2O)i-CH2CH2 15 O-ALK-NR3-ALK-S-(CH2CH2O)i-CH2CH2- Entre estos, ALK representa más particularmente un grupo alquileno (C1-C4). En particular, ALK puede ser uno de los siguientes: -CH2CH2-, -CH2CMe2-, -CH2CH2CMe2-. L puede ser también uno de los descritos en la Tabla I más abajo o en la Tabla II. 20 i representa un número entero que va de 1 a 40, mejor de 1 a 20, preferentemente de 1 a 10. i puede tomar cada uno de los valores que van de 1 a 40, en particular i puede valer 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10. La Tabla I describe ejemplos representativos de los compuestos según la fórmula (IA). Cada compuesto de esta tabla puede existir en la forma con M = CH (benceno) o M = N (piridina). Los compuestos con M = N son más solubles en agua. 25
TABLA I Compuesto de fórmula (Ia) Los compuestos según la invención comprenden el grupo químico –C(=O)ZbRb (GCR1) que es reactivo frente a un grupo químico reactivo (GCR2) presente en el agente de selección. La reacción entre GCR1 y GCR2 asegura la unión del compuesto en el agente de selección mediante la formación de un enlace covalente. Así, el compuesto es 5 apto para ser conjugado con un agente de selección. Más particularmente, Zb representa O; en este caso, GCR1
representa una función ácido (Rb = H) o éster. Más particularmente, -C(=O)ZbRb representa -COOH, -COO-alquilo (C1-C6), principalmente -COOCH3, o -COOCH2CH=CH2. Entre las funciones éster, se prefieren los ésteres denominados "activos" que presentan una buena reactividad frente a los grupos GCR2, principalmente frente a los grupos amino presentes en los anticuerpos. Ejemplos de ésteres activados son los siguientes: ONOOCO,ONOOCOSO3MM=H o catión,ONCONN, o el grupo enOCOGI el que GI representa al menos 5 un grupo inductivo tal como -NO2 o -Hal, particularmente -F. Se puede tratar por ejemplo de los grupos siguientes: OCONO2 o OCOFFFFF. Otro tipo de grupo –C(=O)ZbRb es el siguiente: NNO. Como ejemplo de GCR2, se pueden citar los grupos -amino de las lisinas portados por las cadenas laterales de los restos de lisina que están presentes en la superficie de un anticuerpo, los grupos sacáridos de la región bisagra o los tioles de las cisteínas por reducción de los enlaces de disulfuro intra-cadenas (Garnett M. C. et al., Advanced Drug 10 Delivery Reviews 2001, 53, 171-216). Más recientemente se han considerado otros métodos como la introducción de cisteínas por mutación (Junutula J. R., et al., Nature Biotechnology 2008, 26, 925-932; WO 09026274) o la introducción de aminoácidos no naturales que permitan otro tipo de reacciones químicas (de Graaf A. J. et al., Bioconjugate Chem. 2009, 3 de febrero de 2009 DOI: 10.1021/bc800294a; WO 2006/069246 y según Chin J. W., et al., JACS 2002, 124, 9026-9027 (tecnología ReCode®)). Estos modos de unión utilizados con los anticuerpos son 15 aplicables al conjunto de los agentes de selección de la diana conocidos, en función de su estructura. Los compuestos según la invención pueden utilizarse, por lo tanto, para la preparación de un agente de selección de la diana al que esté unido de forma covalente, en la posición para de M, el dímero de fórmula: NONYUWR1R2HONONY'OU'W'R1'R2'HMALK'ALK10111341341011 Más particularmente, el agente de selección de la diana es un anticuerpo. Más particularmente, el dímero tiene por 20 fórmula: NONY'HNONYHMOONONY'HNONYHMOO Procedimiento de preparación de los compuestos de fórmula general (I) Los compuestos de fórmula (I), pueden prepararse según el Esquema 1: LGLG'MALK'ALKL3NONYUWR1R2HOHNONY'OHU'W'R1'R2'HNONYUWR1R2HONONY'OU'W'R1'R2'HMALK'ALKL3P1P2P'1P3++25 Esquema 1
Se hacen reaccionar juntos los compuestos P1, P’1 y P2 para conducir a P3. LG y LG’ designan un grupo saliente. L3 puede representar el grupo –L-C(=O)ZbRb, en este caso P3 representa por lo tanto un compuesto de fórmula (I). En el caso en el que P3 no represente el grupo –L-C(=O)ZbRb, es necesario transformar L3 en el grupo –L-C(=O)ZbRb mediante una o varias reacciones. En particular, en el caso en el que –C(=O)ZbRb = ONOOO, se puede introducir el grupo L3 terminado en el 5 grupo –C(=O)ZbRb = -C(=O)O-alquilo (C1-C4)o –C(=O)O-alquilo, el cual es transformado a continuación en el grupo -C(=O)OH, el cual reacciona finalmente con el carbonato N-N’-disuccinimidilo o con el NHS. La transformación -COOalquilo/alilo en –COOH se puede realizar mediante un tratamiento con litina. Es particularmente ventajoso utilizar en particular un éster metílico. La reacción con el carbonato de N,N’-disuccinimidilo se realiza en presencia de una base, por ejemplo la DIPEA; con el NHS en presencia de un agente de acoplamiento, por ejemplo el DCC. 10 Igualmente, en el caso en que se pueda introducir un grupo -C(=O)ZbRb=-COOH que reacciona a continuación con el N,N'-carbonildiimidazol (JACS 1958, 80, 4423; JACS 1960, 82, 4596). Los compuestos P1 y P’1 se describen en las solicitudes de patente WO 00/12508, WO 00/12507, WO 2005/040170, WO 2005/085260, WO 07085930 o WO 2009/016516 o se pueden preparar por síntesis total (Mori M. et al., Tetrahedron, 1986, 42, 3793-3806). En el caso en el que P1 y/o P’1 representa(n) la tomaimicina de fórmula: 15 Tomaimicina, esta última puede prepararse mediante la cepa de Streptomyces croceus siguiendo las enseñanzas del documento FR 1516743 o bien por síntesis total (véase J. Antibiotics 1983, XXXVI (3), 276-282. Z.Tozuka “Studies on tomaymycin. Total syntheses of the antitumor antibiotics E- and Z- tomaymycins”). Igualmente existen compuestos comerciales P1/P’1. Para la introducción de los grupos W/W’, la función imina (---- = enlace doble) es susceptible de añadir varios compuestos HW/HW’ (por ejemplo H2O o alcohol ROH). 20 A propósito de los compuestos de fórmula P2 Estos tienen como fórmula: en la que: ■ L, M, ALK, ALK’, Zb y Rb son tales como se han definido anteriormente; 25 ■ E y E’ representan, independientemente uno del otro, un grupo –OH o un grupo saliente. L puede representar más particularmente uno de los descritos en los esquemas 2, 2’, 3, 3’, 3’’, 4, 5, 5’, 6, 6’, 6’’ y 7. Así se distinguen los intermediarios de fórmula:
en la que L* se elige entre: ‐ALK‐SH; ‐O‐ALK‐NR3‐ALK‐SH; NNOALK-SH-O-ALK-; NOALK-SH-O-ALK-;-O-ALK-ALK-SHNN. En esta invención, se denomina "grupo saliente" un átomo o un grupo de átomos que, en la reacción heterolítica entre P2 y P1 o P’1, sale llevándose el par de electrones del enlace covalente que une ALK y LG o LG’. El grupo saliente se elige más particularmente entre un átomo de halógeno, principalmente cloro o bromo, un grupo mesilato, 5 tosilato, nosilato o -OPPh3+. Para los otros esquemas siguientes, se usan las abreviaturas siguientes para simplificar: NONYUWR1R2HONONY'OU'W'R'1R'2HTom1 =Tom'1 = L1 = ‐ALK‐S‐ y L2 = ‐CH2C(=O)‐NH‐(CH2CH2O)i‐ALK‐ ONR3LGMALK'ALKALK-SLG'P2+ P1 + P'1(I)(CH2CH2O)i-ALK-C(=O)ZbRb Esquema 2 10 Preparación de P2P2 se obtiene a partir del diol halogenado que corresponde a la fórmula OHMALK'ALKHALOH según las enseñanzas del ejemplo 3 (Esquema 2’): ONR3OHMALK'ALKALK-SOHONR3HalP4ONR3LGMALK'ALKALK-SLG'P2OHMALK'ALKHALOHTBSOMALK'ALKLiOTBSTBSOMALK'ALKALK-OHOTBSOHMALK'ALKALK-SHOH(CH2CH2O)i-ALK-C(=O)ZbRb(CH2CH2O)i-ALK-C(=O)ZbRb(CH2CH2O)i-ALK-C(=O)ZbRbvi. introducción de LG y LG'i. protecciónii. n-BuLiiii. cetonaiv. transformación de OH en SHv. desprotección Esquema 2’
i. protección de dos funciones alcohol mediante un grupo protector, tal como por ejemplo el ter-butil-dimetil-sililoxi (TBS); ii. preparación del compuesto organolítico u organomagnesiano correspondiente mediante n-BuLi o magnesio respectivamente; iii. adición nucleofílica sobre una cetona para formar una función alcohol; 5 iv. preparación del tiol mediante la formación del tioacetato correspondiente (véanse los ejemplos 3.7 y 3.8); v. desprotección; vi. introducción de LG y LG’. En el caso de un grupo mesilato, se usa el cloruro de metanosulfonilo en presencia de una base, tal como una amina terciaria (por ejemplo, TEA o DIPEA); véase el ejemplo 1.4. Un ejemplo de diol halogenado y de diol protegido correspondiente es el descrito en el esquema 1 en la página 48 10 del documento WO 2009/016516 (compuestos 2 y 3 del esquema 1). Dos ejemplos de dioles protegidos son los de N° CAS 181225-40-1 y 181225-41-2. El diol halogenado puede obtenerse por reducción del compuesto diácido o diéster correspondiente, por ejemplo el de N° CAS 193010-40-1. Véase igualmente en el caso de una piridina (M = N): Liebigs Annalen der Chemie 1991, 10, 987-988 o Tetrahedron 2005, 61 (7), 1755-1763 (compuesto 3 del Esquema 1). 15 Preparación de P4 Caso en que ALK = CH2CH2 Caso en que R3 = H OHOONH2Oi OOONHOi NOOOHal(i)Hal = Br o I Etapa (i): formación de la amida y activación del ácido; las dos etapas se realizan sucesivamente en un disolvente 20 polar aprótico como el DCM: reacción entre la función amina y el halogenoacetato de N-hidroxisuccinimidilo y después adición in situ de un agente de acoplamiento como el DIC. Caso en que R3 ≠H OHOONH2Oi OOONHOi OFFFOHOONHR15Oi OOONR3Oi NOOOHal(ii)(iii)(i)Hal = Br o I Etapa (ii): protección del ácido carboxílico en forma de éster metílico y de la amina en forma de trifluoroacetamida; la 25 reacción se lleva a cabo en dos etapas sucesivas en un disolvente polar aprótico como el DCM: protección del ácido por tratamiento con trimetilsilildiazometano en presencia de metanol y después protección de la amina por adición de anhídrido trifluoroacético y de una base como la TEA. Etapa (iii): alquilación de la amina y saponificación del éster; la reacción se lleva a cabo en dos etapas sucesivas en un disolvente polar aprótico anhidro como el THF: alquilación de la amina por tratamiento con una base como NaH 30 en presencia de un reactivo portador de un grupo nucleófugo como un halogenuro de alquilo R12Hal y después adición de litina y de agua;
Etapa (i): a continuación de la etapa (iii), se repiten las reacciones de la etapa (i) para el caso R12 = H. Caso en que ALK ≠ CH2CH2 Caso en que R3 = H OALKOOALKOHalOHONi OHALKOONH2Oi OALKOONHOi NOOOHalOONi +(iv)(v)(i)Hal= Br o I Caso en que R3 ≠H 5 OALKOOHALKOOALKOOALKOHalOHONi ALKOOOALKONOOOONi OONH2i OONHi COCF3OONHR3i OONi OHalR3(i)+(iv)(v)(vi)Hal= Br o I(iii) Etapa (iv): elongación de la cadena de PEG; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar aprótico anhidro como el THF o la DMF por tratamiento de un éster halogenado con el alcoholato de un benzofenona-imina-PEG-alcohol generado por la acción de NaH o de naftalenuro de potasio como se describe en el documento WO 2007/127440; 10 Etapa (v): escisión selectiva de la imina por hidrogenación en presencia de paladio sobre carbón véase Wessjohann, L. et al., Synthesis 1989, 5, 359-63; Etapa (vi): protección de la amina por adición de anhídrido trifluoroacético y de una base como la TEA. Los amino-PEG-alcoholes están comercialmente disponibles por ejemplo para i = 3,4,7,8 o se pueden preparar a partir de los dioles PEG, comercialmente disponibles para i = 3 a 12, según el procedimiento descrito en el 15 documento US 7230101. La protección de la función amina por la benzofenona se puede realizar por deshidratación azeotrópica en presencia de un ácido de Lewis como el eterato de BF3. L1 =-O-ALK-NR3-ALK-SNOOCH2 y L2 = ‐CH2C(=O)‐NR3‐(CH2CH2O)i‐ALK‐ LGMALK'ALKO-ALK-NR3-ALK-SSMeLG'O-ALK-NR3-ALK-SSMeONHNOOMALK'ALKO-ALK-NR3-ALK-SHMALK'ALK(CH2CH2O)i-ALK-C(=O)ZbRbP1 + P'1+Tom1Tom'1Tom1Tom'1(I)P2P5 Esquema 3 20
Preparación de P2 GPOMALK'ALKOHOGP'OHMALK'ALKO-ALK-NH2OHOHMALK'ALKO-ALK-NH-CH2ALK-SSMeOHHALK-SSMeOi. Br-ALK-NHbocii. desproteccióniii.iv. cianoborohidruro de sodio + Ti3+v. introducción de LG/LG'P2 Esquema 3’ i. reacción nucleófila entre una de las funciones –OH (estando las otras dos protegidas por GP y GP’ que designan grupos protectores) y una bromo-amina protegida con Boc de fórmula Br-ALK-NHBoc en presencia de una base, tal 5 como por ejemplo el K2CO3, en un disolvente polar, tal como la DMF, el THF o el MeCN (véase, por ejemplo, las condiciones en la página 63 del documento WO 07085930). Según una variante, se puede realizar la sustitución nucleofílica de la bromo-amina con el hidroxi-diéster de fórmula: MOHOEtEtOOO y después reducir a continuación la función éster a función –CH2OH, por ejemplo con borohidruro de sodio; para ello se pueden aplicar las condiciones de la sustitución nucleófila y de la reducción 10 mostradas en las páginas 62-63 del documento WO 2007/085930; ii. desprotección de los grupos protectores; iii. aminación reductora con el aldehído de fórmula HC(=O)-ALK-SSMe en presencia de isopropóxido de titanio; la reacción se lleva a cabo a temperatura ambiente en un disolvente polar aprótico anhidro como el THF; iv. se forma un complejo intermedio que se reduce in situ con un agente reductor como por ejemplo el 15 cianoborohidruro de sodio; v. introducción de LG y LG’. En el caso de un grupo mesilato, se usa el cloruro de metanosulfonilo en presencia de una base, tal como una amina terciaria (por ejemplo, TEA); véase el ejemplo 1.4. Una variante representada en el Esquema 3’’ consiste en introducir el grupo -ALK-SSMe sobre el grupo NHboc, inspirándose en particular en el método descrito por Kitagawa T. et al.; JACS, 2006, 128 (45), 14448-14449 usado 20 para introducir cadenas de acetiltioalquilo en una amina secundaria: GPOMALK'ALKOHOGP'MALK'ALKO-ALK-NHbocOGP'GPOLGMALK'ALKO-ALK-NH-CH2ALK-SSMeLG'HalALK-SCOMeO-ALK-Nboc-ALK-SCOMeMALK'ALKOGP'GPOO-ALK-Nboc-ALK-SSMeMALK'ALKOGP'GPOi. Br-ALK-NHbocvi.x. introducción de LG/LG'ix. hidrolisisP2vii. OH-viii. MeSSO2Me Esquema 3’’ Según esta variante se realiza la alquilación mediante un intermedio Hal-ALK-SCOMe (Hal = I, por ejemplo) y a continuación se libera el tiol mediante un tratamiento en medio básico: 25 vi. alquilación con un halogenuro de alquilo portador de un grupo tioacetilo en presencia de carbonato de cesio en un disolvente aprótico polar como la DMF; vii. escisión selectiva del grupo acetilo en medio básico débil; viii. formación del grupo –SSMe por reacción del tiol intermedio con MeSSO2Me;
ix. escisión de los grupos protectores GP y GP’; x. transformación de los grupos hidroxilos en grupos nucleófugos LG/LG’, preferentemente grupos mesilatos. OHMALK'ALKO-ALK-NH-ALK-SSMeOHOHMALK'ALKO-ALK-NR3-ALK-SSMeOH Esquema 3’’’ La introducción de un grupo R3 = alquilo (C1-C4) en un grupo NH es posible en diferentes etapas de la síntesis (un 5 ejemplo se muestra en el Esquema 3’’’). Se realiza por ejemplo empleando la reacción de Wallach que usa un aldehído (véase el ejemplo 1.5 en el que la alquilación NH→NMe utiliza el formaldehído). A propósito de P5 Las sociedades Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL. 61105, Estados Unidos, Jenkem Technology USA Inc., 2033, W. Mc Dermott Dr., Allen Tx 75013-4675, Estados Unidos y Quanta BioDesign, Ltd.195, West Olentangy Street, 10 Suite O, Powell, Ohio 43065-8720, Estados Unidos, comercializan compuestos de fórmula general designados por NHS-PEG-maleimida. Se puede tratar, más particularmente, del compuesto de N° CAS 756525-99-2. La adición del tiol sobre el resto maleimida se describe en la página 721 de "Bioconjugate Techniques", Greg T. 15 Hermanson, 2ª Ed, Elsevier Inc. (ISBN-13: 978-0-12-370501-3; ISBN-10: 0-12-370501-0). L1 = ‐O‐ALK‐NR3‐ALK‐S‐ y L2 = ‐CH2C(=O)‐NR3‐(CH2CH2O)i‐ALK‐ LGMALK'ALKO-ALK-NR3-ALK-SSMeLG'ONR3HalP4Tom1MALK'ALKO-ALK-NR3-ALK-SSMeTom'1Tom1MALK'ALKO-ALK-NR3-ALK-SHTom'1P1 + P'1(I)P2+(CH2CH2O)i-ALK-C(=O)ZbRb Esquema 4 La preparación es similar a la descrita en el Esquema 3 remplazando P5 por P4. Una variante descrita en el Esquema 4’ corresponde a una preparación parecida a la descrita en los Esquemas 2 y 20 2’: ONR3HalP4OHMALK'ALKO-ALK-NR3-ALK-SOHONR3OHMALK'ALKO-ALK-NR3-ALK-SHOHLGMALK'ALKO-ALK-NR3-ALK-SLG'ONR3OHMALK'ALKO-ALK-NR3-ALK-SSMeOH(I)+(CH2CH2O)i-ALK-C(=O)ZbRb(CH2CH2O)i-ALK-C(=O)ZbRb(CH2CH2O)i-ALK-C(=O)ZbRb(i)
Esquema 4’ i. desprotección por reducción del disulfuro. L1 = NNOALK-S--O-ALK- y L2 = ‐CH2C(=O)‐NR3‐(CH2CH2O)i‐ALK‐ ALKNMOALKLGALK'LG'CO-ALKSSMeNALKNNMOALKALK'CO-ALKSSMeHalONR3ALKNNMOALKALK'CO-ALKSHP1 + P'1Tom1(I)(CH2CH2O)i-ALK-C(=O)ZbRbTom1P2Tom'1Tom'1 Esquema 5 Preparación de P2 5 Se usa el compuesto P2 de fórmula: ALKNMOALKLGALK'LG'CO-ALKSSMeNque se obtiene según el Esquema 5’ siguiente: MOHALKGPOALK'OGP'NNALKLGbocALKNNbocMOALK'OGP'ALKGPOALKNNMOALKOHALK'OHCO-ALKSSMeALKSSMeOOHALKNNHMOALKOHALK'OHALKNMOALKLGALK'LG'CO-ALKSSMeN+(i)(ii)(iii)(iv)P2 Esquema 5’ i. alquilación del hidróxido del ciclo aromático con una piperazina mono-protegida en posición 1- y portadora en 4- de 10 una cadena de alquilo funcionalizada en posición terminal con el grupo LG nucleófugo. Preferentemente, el grupo nucleófugo es un grupo mesilato y se realiza la reacción de Williamson en presencia de un hidruro en un disolvente polar aprótico anhidro, como el THF o la DMF; ii. desprotección de los grupos Boc, GP y GP’, preferentemente en medio ácido, por ejemplo en presencia de ácido clorhídrico o de TFA cuando los grupos GP y GP’ son TBDMS. 15 Según una variante de las etapas i y ii, se puede realizar la sustitución nucleofílica de la bromo-amina con el hidroxi-diéster de fórmula: MOHOEtEtOOO y después reducir a continuación la función éster a función –CH2OH, por
ejemplo con borohidruro de sodio; para ello se pueden aplicar las condiciones de la sustitución nucleófila y de la reducción mostradas en las páginas 62-63 del documento WO 2007/085930; iii. acoplamiento realizado después de la activación inicial del ácido en éster de NHS; iv. introducción de los grupos salientes LG y LG’. En el caso de un grupo mesilato, se usa el cloruro de metanosulfonilo en presencia de una base, tal como una amina terciaria (por ejemplo, TEA); 5 L1 =NNALK-S--O-ALK- y L2 = ‐CH2C(=O)‐NR3‐(CH2CH2O)i‐ALK‐ ALKNMOALKLGALK'LG'ALKSSMeNALKNNMOALKALK'ALKSSMeHalONR3ALKNNMOALKALK'ALKSHP1 + P'1Tom1(I)(CH2CH2O)i-ALK-C(=O)ZbRbTom1P2Tom'1Tom'1 Esquema 6 Preparación de P2 Se usa el compuesto P2 de fórmula: ALKNMOALKLGALK'LG'ALKSSMeN que se obtiene por aminación reductora según el Esquema 6’ siguiente. 10 MOHALKGPOALK'OGPNNALKLGbocALKNNbocMOALK'OGP'ALKGPOALKNNMOALKOHALK'OHCH2ALKSSMeALKSSMeOHALKNNHMOALKOHALK'OHALKNMOALKLGALK'LG'CH2ALKSSMeN+(i)(ii)(v)(iv)P2 Esquema 6’ v. introducción del grupo -ALK-SSMe por aminación reductora realizada por ejemplo en presencia de cianoborohidruro de isopropóxido de titanio; Una variante similar a la representada en el Esquema 3’’ y que usa el método de alquilación descrito por Kitagawa T. 15 et al., JACS, 2006, 128 (45), 14448-14449 se muestra en el Esquema 6’’:
MOHALKGPOALK'OGP'NNALKLGbocALKNNbocMOALK'OGP'ALKGPOALKNNMOALKGPOALK'OGP'ALKSCOMeHalALKSCOMeALKNMOALKGPOALK'OGP'ALKSSMeNALKNNHMOALK'OGP'ALKGPOALKNMOALKLGALK'LG'ALKSSMeN+(i)(vi)(vii)(viii)P2(ix) Esquema 6” i. alquilación con piperazina mono-protegida (véase la etapa i. del Esquema 5’); vi. desprotección selectiva del grupo Boc en medio ácido; 5 vii. alquilación con un halogenuro de alquilo portador de un grupo tioacetilo en presencia de carbonato de cesio en un disolvente aprótico polar como la DMF; viii. escisión selectiva del grupo acetilo en medio básico débil y formación del grupo –SSMe por reacción del tiol intermedio con MeSSO2Me en presencia de una base tal como la TEA; ix. escisión de los grupos protectores GP y GP’ y transformación de los grupos hidroxilo preferentemente en 10 mesilatos con cloruro de metanosulfonilo. L = –O‐ALK‐NR3‐ALK‐S‐(CH2CH2O)i‐ALK‐ LGMALK'ALKO-ALK-NR3-ALK-SSMeLG'O-ALK-NR3-ALK-SSMeMALK'ALKO-ALK-NR3-ALK-SHMALK'ALKHal-(CH2CH2O)i-ALK-C(=O)ZbRbP1 + P'1+Tom1Tom'1Tom1Tom'1(I)P2P6 Esquema 7 Este esquema se inspira en el Esquema 3 anterior. El compuesto P6 puede ser por ejemplo el compuesto de N° CAS 564476-32-0 que se prepara según el documento WO 03068144 (véase el compuesto 10a de la figura 7) o bien el 15 compuesto de N° CAS 309916-91-4. Se pueden preparar compuestos análogos con longitudes de cadena i diferentes según el mismo principio de la figura 7 del documento WO 03068144 a partir del compuesto PEG correspondiente. A propósito de P6 20 se puede preparar según los esquemas siguientes: Caso en que ALK = CH2CH2
OHOOOi MsOOOOi OOOi zOOHOi zOOOi NOOzZ= Br ou I(i)(ii)(iii)(iv) Caso en que ALK ≠ CH2CH2 OOOALKOMsi OHOOzALKi OOONOOzALKi OOOzALKi OOOOHALKi OHOTHPi OOOOTHPALKi OOALK-Hal(vi)(v)(ii)(i)(iii)(iv)Z= Br ou I+ Etapa (i): activación del alcohol en forma de mesilato; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar aprótico 5 anhidro como el DCM por tratamiento con el cloruro de mesilo en presencia de una base como la TEA. Etapa (ii): intercambio mesilato/halógeno; la reacción se lleva a cabo a reflujo en un disolvente polar aprótico como la acetona con un halogenuro de sodio como el yoduro de sodio. Etapa (iii): desprotección por medio de una disolución de ácido clorhídrico (por ejemplo, disolución en dioxano) o de ácido trifluoroacético. 10 Etapa (iv): activación del ácido; la reacción se lleva a cabo a temperatura ambiente en un disolvente polar aprótico como el DCM por tratamiento con NHS en presencia de un agente de acoplamiento como el DCC. Etapa (v): elongación de la cadena PEG; la reacción se lleva a cabo en un disolvente polar aprótico anhidro como el THF o la DMF por tratamiento de un éster halogenado con el alcoholato de un diol PEG monoprotegido en forma de éter de tetrahidropirano (THP). La preparación de este tipo de diol PEG monoprotegido está bien descrita en la 15 bibliografía, véase por ejemplo, Richard A. et al., Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 o Sakellariou E. G., et al., Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090. Etapa (vi): desprotección por medio de una disolución de ácido clorhídrico 0,1N (por ejemplo, solución en dioxano) o de etanol. Los expertos en la técnica podrán inspirarse en las condiciones de operación descritas a continuación. procedimiento de preparación del conjugado 20 El conjugado se obtiene por el procedimiento que consiste en: (i) poner en contacto y dejar reaccionar una disolución acuosa del agente de selección opcionalmente tamponada y una disolución de un compuesto de la fórmula (I); (ii) después separar opcionalmente el conjugado formado en la etapa (i) del compuesto de fórmula (I) y/o del agente de selección que no haya reaccionado y/o de los agregados que se hayan formado. 25 Según una variante, se separa en la etapa (ii) el conjugado que se ha formado en la etapa (i) del agente de selección de la diana que no haya reaccionado y de los agregados opcionalmente presentes en la disolución. Según otra variante, no se separa en la etapa (ii) el conjugado de la etapa (i) del compuesto de fórmula (I) que no haya reaccionado ni de los agregados que se formarían y se deja en la disolución el agente de selección de la diana que opcionalmente no haya reaccionado. 30 El compuesto de fórmula (I) comprende preferentemente una función activada, –C(=O)ZbRb, reactiva frente a los grupos GCR2, principalmente frente a los grupos amino presentes en los anticuerpos. Un grupo químico poco reactivo o insuficientemente reactivo se puede transformar fácilmente en un grupo más reactivo por medio de una o varias reacciones químicas conocidas por los expertos en la técnica; por ejemplo, –COOH + N-hidroxisuccinimida o bien –COO-alquilo (C1-C6) → -COOH → –COOH + N-hidroxisuccinimida 35 Un ejemplo del procedimiento aplicable en el caso de un anticuerpo y de un compuesto de fórmula (I) es el que se da en el ejemplo 1.
La disolución acuosa del agente de selección puede estar tamponada mediante, por ejemplo, tampones tales como por ejemplo el fosfato de potasio o el ácido N-2-hidroxietelpiperazina-N’-2-etanosulfónico (tampón HEPES). El tampón depende de la naturaleza del agente de selección de la diana. El compuesto de fórmula (I) se disuelve en un disolvente orgánico polar, por ejemplo el DMSO o la DMA. La reacción tiene lugar a una temperatura comprendida generalmente entre 20 y 40°C. La duración de la reacción 5 puede variar entre 1 a 24 h. La reacción entre el agente de selección de la diana y el compuesto de fórmula (I) puede ser seguida por SEC con un detector refractométrico y/o ultravioleta con el fin de determinar el avance. Si la tasa de sustitución es insuficiente, se puede dejar reaccionar durante un tiempo más largo y/o añadir más compuesto de fórmula (I). Se puede referir al método general dado en la parte de los ejemplos para más detalles sobre las condiciones particulares que se pueden usar para la conjugación. 10 El experto en la técnica disponen de diferentes técnicas cromatográficas para la separación de la etapa (ii): el conjugado se puede purificar por ejemplo por cromatografía de exclusión estérica (SEC), por cromatografía de adsorción (como la de intercambio de iones, IEC), por cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), por cromatografía de afinidad, por cromatografía sobre soportes mixtos como la hidroxiapatita cerámica o por HPLC. Se puede utilizar igualmente la purificación por diálisis o diafiltración. 15 Se entiende por « agregados » las asociaciones que se pueden formar entre dos agentes de selección de la diana o más, habiendo sido o no modificados los agentes de selección de la diana por conjugación. Los agregados son susceptibles de formarse bajo la influencia de un gran número de parámetros tales como una concentración elevada de agente de selección de la diana en la disolución, el pH de la solución, fuerzas de cizallamiento elevadas, el número de dímeros injertados y su carácter hidrófobo, la temperatura (véase las referencias citadas en la 20 introducción de J. Membrane Sci. 2008, 318, 311–-316), no habiéndose aclarado a veces con precisión la influencia de algunos de ellos. En el caso de las proteínas o de los anticuerpos, se puede referir a AAPS Journal, «Protein Aggregation and Bioprocessing» 2006, 8 (3), E572-E579. El contenido en agregados se puede determinar por medio de técnicas conocidas tales como la SEC (véase a este propósito, Analytical Biochemistry 1993, 212 (2), 469-480). Después de la etapa (i) o (ii), la disolución del conjugado puede sufrir una etapa (iii) de ultrafiltración y/o de 25 diafiltración. Se obtiene así como resultado de estas etapas el conjugado en disolución acuosa. anticuerpo El anticuerpo (véase a este propósito, Janeway et al., « Immunobiology », 5ª edición, 2001, Garland Publishing, Nueva York) se podrá elegir entre los descritos principalmente en las solicitudes de patente WO 04043344, WO 08010101, WO 08047242, WO 05009369 (anti CA6). El anticuerpo puede ser principalmente monoclonal, 30 policlonal o multiespecífico. Se puede tratar también de un fragmento de anticuerpo. Se puede tratar también de un anticuerpo murino, humano, humanizado o quimérico.
conjugado Un conjugado comprende generalmente del orden de 1 a 10 dímero(s) de pirrolo[1,4]benzodiazepina unido(s) al agente de selección de la diana (se trata de tasas de inserción o DAR por sus iniciales en inglés: drug-to-antibody ratio). Este número varía en función de la naturaleza del agente de selección de la diana y del dímero, así como de las condiciones de operación utilizadas para la conjugación (por ejemplo, el número de equivalentes de dímero con 5 respecto al agente de selección de la diana, el tiempo de reacción y la naturaleza del disolvente y del eventual codisolvente). La puesta en contacto del agente de selección de la diana y del dímero lleva a una mezcla que comprende: varios conjugados que se distinguen individualmente unos de otros por diferentes DAR; opcionalmente, el agente de selección de la diana que no haya reaccionado (en el caso de una reacción incompleta); opcionalmente los agregados. La DAR que se determina en la disolución final por ejemplo por espectroscopía UV corresponde por 10 lo tanto a una DAR media. En el caso en que el agente de selección de la diana sea un anticuerpo, la espectroscopía UV puede ser un método utilizado para determinar la DAR. Este método se inspira en el presentado en Antony S. Dimitrov (ed), LLC, 2009, « Therapeutic Antibodies and Protocols », vol. 525, 445, Springer Science. Consiste en medir la absorbancia de una disolución de conjugado después de la etapa de separación (ii) a dos longitudes de onda denominadas LO1 y LO2. 15 Se utilizan los coeficientes de extinción molares siguientes del anticuerpo desnudo y del dímero de pirrolo[1,4]benzodiazepina medidos previamente a la conjugación. Las absorbancias de la disolución de conjugado a LO1 y LO2 (ALO1) y (ALO2) se miden sobre el pico correspondiente del espectro SEC (lo que permite calcular una “DAR(SEC)”) o utilizando un espectrofotómetro UV clásico (lo que permite calcular una “DAR(UV)”). Las absorbancias se pueden expresar en la forma: 20 ALO1 = (cD x eD LO1) + (cA x eA LO 1) ALO2 = (cD x eD LO 2) + (cA x eA LO 2) ecuaciones para las que: cD y cA designan respectivamente las concentraciones en la disolución de la parte del conjugado relativa al derivado de la pirrolo[1,4]benzodiazepina y de la parte del conjugado relativa al anticuerpo; 25 eDLO1 y eDLO2 designan respectivamente los coeficientes de absorción molares del dímero de pirrolo[1,4]benzodiazepina antes de conjugación a las dos longitudes de onda LO1 y LO2; eALO1 y eALO2 designan respectivamente los coeficientes de absorción molares del anticuerpo desnudo a las dos longitudes de onda LO1 y LO2. Se entiende por anticuerpo desnudo, el anticuerpo al que no está unido ningún dímero de 30 pirrolo[1,4]benzodiazepina, es decir el anticuerpo antes de la etapa de conjugación. La resolución de estas dos ecuaciones lleva a: cD = [(eA LO1 x A LO 2) - (eA LO 2 x A LO 1)] / [(eD LO 2 x eA LO 1) - (eA LO 2 x eD LO 1)] cA = [ALO1 – (cD x eD LO 1)] / eA LO 1 La DAR media corresponde entonces a cD/cA. En el caso de dímeros de la pirrolo[1,4]benzodiazepina, se consideran 35 las dos longitudes de onda: LO1= 280 nm y LO2= 320 nm. La DAR media, medida en el espectro de SEC, está comprendida preferentemente entre 1 y 10, preferentemente 1,5 y 7. El conjugado se puede utilizar como compuesto anticanceroso. Por la presencia del agente de selección de la diana, el conjugado se vuelve muy selectivo frente a las células tumorales en vez de las células sanas. Esto permite dirigir el compuesto de fórmula (I) que tiene una actividad anticancerosa en un entorno próximo a éstas o directamente al 40 interior de las mismas (a este propósito, véanse las publicaciones siguientes que describen la utilización de conjugados de anticuerpos monoclonales en el tratamiento de cánceres: « Antibody-drug conjugates for cancer therapy » Carter P. J., et al., Cancer J. 2008, 14, 154–-169; « Targeted cancer therapy: conferring specificity to cytotoxic drugs” Chari R., Acc. Chem. Res. 2008, 41, 98–-107). Es posible tratar cánceres sólidos o líquidos. El conjugado se formula en forma de una disolución acuosa tamponada a una concentración comprendida 45 generalmente entre 1 y 10 mg/ml. Esta disolución se puede inyectar en forma de perfusión tal cual o bien se puede rediluir para formar una disolución de perfusión.
[Ejemplos] Los desplazamientos químicos ( en ppm) se expresan en ppm. Método A: Cromatografía Líquida de Alta presión – Espectrometría de masas (LCMS) Los espectros se han obtenido con un dispositivo Waters UPLC-SQD en modo de electropulverización positiva y/o negativa (ES+/-). Condiciones cromatográficas: columna: ACQUITY BEH C18- 1,7 μm -2,1x50 mm; disolventes: A: 5 H2O (ácido fórmico al 0,1%) B : CH3CN (ácido fórmico al 0,1%); temperatura de la columna: 50°C; caudal: 1 ml/min; gradiente (2 min): de 5% a 50% de B en 0,8 min; 1,2 min: 100% de B; 1,85 min: 100% de B; 1,95: 5% de B. Método B: Cromatografía Líquida de Alta presión – Espectrometría de masas (LCMS) Los espectros se han obtenido con un dispositivo Waters ZQ en modo de electropulverización positiva y/o negativa (ES+/-). Condiciones cromatográficas: columna: XBridge C18 2,5 μm 3 x 50 mm; disolventes: A: H2O (ácido fórmico 10 al 0,1%). B: CH3CN (ácido fórmico al 0,1%; temperatura de la columna: 70°C; caudal: 0,9 ml/min; gradiente (7 min): de 5% a 100% de B en 5,3 min; 5,5 min: 100% de B; 6,3 min : 5% de B. Método C: Espectrometría de masas (MS) Los espectros han sido realizados por ionización química (gas reactivo: amoniaco) en un aparato WATERS GCT of (introducción directa sin LC). 15 Método D: Cromatografía Líquida de Alta presión – Espectrometría de masas (LCMS) Los espectros se han obtenido con un dispositivo Waters UPLC-SQD en modo de electropulverización positiva y/o negativa (ES+/-). Condiciones cromatográficas: columna: ACQUITY BEH C18- 1,7 μm -2,1x50 mm; disolventes: A: H2O (ácido fórmico al 0,1%) B : CH3CN (ácido fórmico al 0,1%); temperatura de la columna: 70°C; caudal: 1 ml/min; gradiente (2 min): de 5% a 50% de B en 1 min; 1,3 min: 100% de B; 1,45 min: 100% de B; 1,75: 5% de B. 20 Método E: Cromatografía Líquida de Alta presión – Espectrometría de masas (LCMS) Los espectros se han obtenido con un dispositivo Waters UPLC-SQD en modo de ionización: electropulverización en modo positivo y/o negativo (ES+/-) Condiciones cromatográficas: columna: ACQUITY BEH C18- 1,7 μm 2,1x50 mm; disolventes: A: H2O (ácido fórmico al 0,1%). B: CH3CN (ácido fórmico al 0,1%); temperatura de la columna: 70°C; caudal: 1 ml/min; gradiente (4 min): de 5% a 100% de B en 3,15 min; 3,75: 5% de B. 25 Método F: Cromatografía Líquida de Alta presión – Espectrometría de masas (LCMS) Los espectros se han obtenido con un dispositivo Waters UPLC-SQD en modo de ionización por electropulverización positiva y/o negativa (ES+/-). Condiciones cromatográficas: columna: ACQUITY BEH C18 1,7 µm, 2,1 x 50 mm; disolventes: A: H2O (ácido fórmico al 0,1%) B : CH3CN (ácido fórmico al 0,1%); temperatura de la columna: 45°C; caudal: 0,6 ml/min; gradiente (2 min): de 5% a 50% de B en 1 min; 1,3 min: 100% de B; 1,45 min: 100% de B; 1,75 30 min: 5% de B. Método G: desglicosilación y espectrometría de masas (HRMS) de un conjugado La desglucosilación es una técnica de digestión enzimática con ayuda de glucosidasa. Se hace a partir de 500 µl de conjudado + 100 µl de tampón Tris HCl 50 mM + 10 µl de enzima F-glucanasa (100 unidades de enzima liofilizada/100 µl de agua). La mezcla se pasa con un vórtex y se mantiene una noche a 37°C. La muestra 35 desglicosilada está lista para ser analizada por HRMS. Según el caso, el análisis por HRMS de la muestra también se puede realizar sin desglicosilación previa. En los dos casos, los espectros de masas han sido obtenidos con un aparato Waters Q-Tof-2 en modo de electropulverización positiva (ES+). Condiciones cromatográficas: columna: 4 µm BioSuite 250 URH SEC 4,6 x 300 mm (Waters); disolventes: A: formiato de amonio 25mM +1% de ácido fórmico: B: CH3CN; temperatura de la columna: 30°C: caudal 0,4 mL/min; isocrático 70% de A + 30% de B (15 min). 40 Todos los compuestos intermedios descritos en esta solicitud se reivindican para su utilización en la preparación de un compuesto de fórmula (I). Más particularmente para cada ejemplo, todos los compuestos intermedios descritos se reivindican para su utilización en la preparación del compuesto de fórmula (I) respectivo. Ejemplo 1 1.1 Preparación del conjugado 45 Se prepara un conjugado haciendo reaccionar el hu2H11 (denominado también hu53 2H11 en la página 15 del documento WO 2008010101; se trata de un anticuerpo que comprende una Vh que va de la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 24)) y el 3-(2-{2-[2-(2-{3-[3-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etil]-metil-amino}-1,1-dimetil-etilsulfanil)-2,5-dioxo-pirrolidin-1-il]-propanoilamino}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propanoato de N-hidroxisuccinimidilo. 50
A 8,19 mg de hu2H11 en 2,16 mL de un tampón acuoso de concentración 0,05M en ácido N-(2-hidroxietil)-piperazin-N'-2-etanosulfónico (HEPES), 0,05M en NaCl y 2mM en ácido etilen-diamin-tetra-acético (EDTA) de pH = 8, se le añaden 516 µg de 3-(2-{2-[2-(2-{3-[3-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etil]-metil-amino}-1,1-dimetil-etilsulfanil)-2,5-dioxo-pirrolidin-1-il]-propanoilamino}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propanoato de N-hidroxisuccinimidilo en disolución en 540 µL 5 de DMA. Después de 3 horas de agitación a TA, la mezcla se filtra sobre MillexR-SV 0,45µM (PVDF Durapore Millipore) y se purifica sobre una columna de SuperdexTM 200 de grado preparativo (Columna HiloadTM 26/60 GE) previamente equilibrada en una disolución tampón de fosfato salino llevada a pH = 6,5 por adición de HCl. Las fracciones de interés se reúnen y se concentran sobre Amicon Ultra-15 (Ultracel 50k Millipore) y a continuación se filtran sobre Sephadex G-25 (Columnas NAP-5 y NAP-10 GE) previamente equilibrada en una disolución tampón 10 acuosa de concentración 10mM en histidina que contenía 10% de sacarosa y 5% de NMP. El conjugado obtenido (2,5 mL) se dosifica por espectrometría usando los coeficientes de extinción de la 4-{2-[metil-(2-metil-2-mercapto-propil)-amino]-etoxi}-2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridina ( ε319nm = 8848 M-1·cm-1 y ε280nm = 8634 M-1·cm-1) y del hu2H11 ( ε280nm = 208380 M-1·cm-1): se ha determinado una media de 3,8 dímeros de tomaimicina por molécula 15 de anticuerpo a la concentración de 1,52 mg/mL. 1.2. 3-(2-{2-[2-(2-{3-[3-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etil]-metil-amino}-1,1-dimetil-etilsulfanil)-2,5-dioxo-pirrolidin-1-il]-propanoilamino}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propanoato de N-hidroxisuccinimidilo NNONOONONONOHHOSHNNONOONONONOHHOSNNHOOOOOOONOOOO 20 A 3,3 mg de diisopropiletilamina sobre soporte de resina (3,72 mmol/g), se le añade una disolución de 9,82 mg de 4-{2-[metil-(2-metil-2-mercapto-propil)-amino]-etoxi}-2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridina en 50 µL de DMA así como una disolución de 6,8 mg de 3-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-pirrol-1-il)-propanoilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoato de N-hidroxisuccinimidilo en 50 µL de DMA. La mezcla obtenida se agita durante 24 horas a TA y después se filtra 25 sobre sílice (Interchrom Puriflash Silice 15/35U 2G) usando un gradiente de 0 a 10% de metanol en DCM. Las fracciones que contienen el producto buscado se reúnen, se concentran a PR y a continuación se purifican por cromatografía ultrarrápida sobre sílice (Interchrom Puriflash Silice 15/35U 2G) usando un gradiente de 0 a 10% de MeOH en DCM. Las fracciones que contienen el producto investigado se reúnen y se concentran bajo PR. Se obtienen así 1,16 mg de 3-(2-{2-[2-(2-{3-[3-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-30 pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etil]-metil-amino}-1,1-dimetil-etilsulfanil)-2,5-dioxo-pirrolidin-1-il]-propanoilamino}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propanoato de N-hidroxisuccinimidilo. LC/MS (E): tr = 1,38 min; [M+H]+: m/z 1322. 1.3. 4-{2-[metil-(2-metil-2-mercapto-propil)-amino]-etoxi}-2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridina 35 NNONOONONONOHHOSHNNONOONONONOHHOSS A 40 mg de 4-{2-[metil-(2-metil-2-metildisulfanil-propil)-amino]-etoxi}-2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridina en disolución en 2,1 mL de metanol y 930 µL de DMF, se le añade una disolución de 40 mg de hidrocloruro de tris(2-carboxietil)fosfina y de 36,6 mg de NaHCO3 en 680 µL de agua. La mezcla se agita durante 45 minutos a TA y a continuación se concentra a PR y se 40 purifica por cromatografía ultrarrápida sobre sílice (Merck SuperVarioFlash 15 g columna, Si60 15-40 µm), usando un gradiente de 0 a 10% de MeOH en una mezcla de DCM/acetonitrilo 9:1. Las fracciones que contienen el producto investigado se reúnen y se concentran bajo PR. Se obtienen así 21 mg de 4-{2-[metil-(2-metil-2-mercapto-propil)-amino]-etoxi}-2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridina. LC/MS (E): tr = 1,28 min; [M+H]+: m/z 809; [M+H2O+H]+: m/z 827. 45
1.4. 4-{2-[metil-(2-metil-2-metildisulfanil-propil)-amino]-etoxi}-2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridina NNONOONONONOHHOSSNOHNOHOSS A una disolución de 22 mg de 4-{2-[metil-(2-metil-2-metildisulfanil-propil)-amino]-etoxi}-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina y de 53 µL de TEA en 0,5 mL de DCM enfriada a -25°C, se le añaden 19,6 µL de cloruro de metanosulfonilo. Después 5 de 30 minutos de agitación, la mezcla se hidroliza y la fase orgánica se lava con agua y después se seca sobre MgSO4 y se concentra a PR. El residuo así obtenido (22 mg) se añade a una disolución de 20 mg de tomaimicina en 0,7 mL de DMF, así como 30 mg de K2CO3 y 12 mg de KI. Se agita la mezcla de reacción durante 2 horas a 30°C y después se hidroliza con 4 mL de agua. El precipitado resultante se lava con agua, se seca a vacío y a continuación se disuelve en DCM, se concentra a PR y se purifica por cromatografía ultrarrápida sobre sílice (Merck 10 SuperVarioFlash 15 g columna, Si60 15-40 µm), usando un gradiente de 0 a 5% de MeOH en DCM. Las fracciones que contienen el producto investigado se reúnen y se concentran bajo PR. Se obtienen así 8 mg de 4-{2-[metil-(2-metil-2-metilsulfanil-propil)-amino]-etoxi}-2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridina. RMN 1H (500 MHz, CLOROFORMO-d): 1,28 (s, 6 H); 1,76 (d, J = 6,4 Hz, 6 H); 2,39 (s, 3 H); 2,43 (s, 3 H); 2,60 (s, 2 H); 2,91 (s, 2 H); 2,97 (s, 4 H); 3,91 (d, J = 4,2 Hz, 2 H); 15 4,00 (s, 6 H); 4,09 (s, 2 H); 4,27 (s, 4 H); 5,27 (s, 4 H); 5,61 (q, J = 6,4 Hz, 2 H); 6,85 (s, 2 H); 7,00 (s, 2 H); 7,56 (s, 2 H); 7,65 (d, J = 4,2 Hz, 2 H). LC/MS (A) : tr = 0,74 min; [M+H]+: m/z 855; [M-H]-: m/z 853. 1.5. 4-{2-[metil-(2-metil-2-metildisulfanil-propil)--amino]-etoxi}-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina NOHNOHOSSNHOHNOHOSS A una suspensión de 322 mg de 4-[2-(2-metil-2-metildisulfanil-propilamino)-etoxi]-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina en 20 262 µL de formaldehído enfriado a 0°C, se le añaden 365 µL de ácido fórmico. Se calienta la mezcla durante 1 hora y cuarto a 100°C. Después de volver a temperatura ambiente, la mezcla se hidroliza y a continuación se le añade una disolución acuosa de sosa 5N hasta la obtención de un pH = 12. La fase acuosa se extrae 3 veces con AcOEt y las fases orgánicas se reúnen y se secan sobre MgSO4 y se concentran a PR. Se obtienen así 310 mg de 4-{2-[metil-(2-metil-2-metildisulfanil-propil)-amino]-etoxi}-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina. RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6): 25 1,26 (s, 6 H); 2,39 (s, 3 H); 2,40 (s, 3 H); 2,60 (s, 2H); 2,88 (t, J=5,7 Hz, 2 H); 4,13 (t, J=5,7 Hz, 2 H); 4,45 (d, J = 6,0 Hz, 4 H); 5,31 (t, J=6,0 Hz, 2 H); 6,85 (s, 2 H). LC/MS (A) : tr = 0,22 min; [M+H]+: m/z 333; [M+HCO2H-H]-: m/z 377. 1.6. 4-[2-(2-metil-2-metildisulfanil-propilamino)-etoxi]-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina NHOHNOHOSSNH2OHNOHO A una suspensión de 390 mg de 4-[2-amino-etoxi]-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina (preparada después de la 30 desprotección del grupo boc de la 4-(2-terc-butoxicarbonilamino-etoxi)-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina descrita en la página 101 de WO 07085930) en 2 mL de THF, se le añaden 270 µL de 2-(metilditio)-isobutiraldehído y 730 µL de isopropóxido de titanio. Después de 20 minutos, se añaden 270 µL de 2-(metilditio)-isobutiraldehído y 730 µL de isopropóxido de titanio suplementarios y la mezcla se agita a TA durante 2 horas. A continuación se le añaden a la mezcla 6 mL de etanol, se agita durante 20 minutos a TA y después se le añaden 124 mg de cianoborohidruro de 35 sodio. Después de 45 min de agitación, se añaden 124 mg de cianoborohidruro de sodio adicionales y después de 1 hora de agitación, la mezcla se concentra bajo PR y se diluye en AcOEt y agua. El precipitado resultante se filtra y se disuelve en una disolución acuosa de HCl 1M. La fase acuosa obtenida se lleva a pH básico con una disolución acuosa de sosa 5M, se extrae tres veces con DCM y las fases orgánicas juntas se concentran a PR. Se obtienen así 322 mg de 4-[2-(2-metil-2-metildisulfanil-propilamino]-etoxi]-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina. RMN 1H (400 MHz, DMSO-40 d6): 1,26 (s, 6 H); 1,81 (m ancho, 1 H); 2,39 (s, 3 H); 2,67 (s ancho, 2 H) 2,94 (t ancho, J=5,7 Hz, 2 H); 4,11 (t, J=5,7 Hz, 2 H); 4,45 (d, J = 5,5 Hz, 4 H); 5,32 (t, J=5,5 Hz, 2 H); 6,85 (s, 2 H). LC/MS (A) : tr = 0,24 min; [M+H]+: m/z 347.
EJEMPLO 2 2.1 Preparación del conjugado Se prepara un conjugado como para el ejemplo 1 haciendo reaccionar el hu2H11 y el 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etil]-metil-amino}-1,1-dimetiletilsulfanil)-acetilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoato de N-hidroxisuccinimidilo. El 5 conjugado obtenido se dosifica por espectrometría usando los coeficientes de extinción de la 4-{2-[metil-(2-metil-2-mercapto-propil)-amino]-etoxi}-2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8--iloximetil]-piridina (ε319nm = 8848 M-1·cm-1 y ε280nm = 8634 M-1·cm-1) y del hu2H11 (ε280 nm= 208380 M-1·cm-1): se ha determinado una media de 5,6 dímeros de tomaimicina por molécula de anticuerpo. 10 2.1 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etil]-metil-amino}-1,1-dimetil-etilsulfanil)-acetilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoato de N-hidroxisuccinimidilo NNONOONONONOHHOSNHOOOOOOONOONNONOONONONOHHOSNHOOOOOHOO A 12 mg de ácido 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-15 pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etil]-metil-amino}-1,1-dimetil-etilsulfanil)-acetilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoico en disolución en 1 mL de THF y 1 mL de DMC se le añaden 5,5 mg de carbonato de N,N-disuccinimidilo y 15 µL de DIPEA. Después de 3 horas a TA, se añaden 4 mL de DCM y la fase orgánica resultante se lava dos veces con agua, se seca sobre MgSO4, se concentra a PR y se purifica por cromatografía ultrarrápida sobre sílice (Interchrom Puriflash Silice 15/35U 2G), usando un gradiente de 3 a 8% de 20 metanol en DCM. Se obtienen así 8 mg de 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etil]-metil-amino}-1,1-dimetil-etilsulfanil)-acetilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoato de N-hidroxisuccinimidilo. LC/MS (E): tr = 1,36 min; [M+2 H2O+Na]+: m/z 1270; [M+H2O+Na]+: m/z 1252; [M+H2O+H]+: m/z 1229; [M+H]+: m/z 1211. 2.2. Ácido 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-25 pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etil]-metil-amino}-1,1-dimetil-etilsulfanil)-acetilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoico NNONOONONONOHHOSNHOOOOOOONNONOONONONOHHOSNHOOOOOHOO A 18 mg de ácido 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etil]-metil-amino}-1,1-dimetil-etilsulfanil)-acetilamino]-30 etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoato de metilo en disolución en 270 µL de THF se le añaden 17,5 µL de una disolución acuosa de litina y 100 µL de agua. Después de 2 horas, la mezcla se diluye en DMC y se le añade una disolución tampón de fostato a pH = 3. La fase acuosa resultante se extrae 3 veces con DCM y las fases orgánicas se reúnen y se secan sobre MgSO4, se concentran a PR y se purifican por cromatografía ultrarrápida sobre sílice (Interchrom Puriflash Silice 15/35U 2G), usando un gradiente de 3 a 15% de metanol en DCM. Se obtienen así 35 11,5 mg de ácido 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etil]-metil-amino}-1,1-dimetil-etilsulfanil)-acetilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoico LC/MS (D): tr = 0,88 min; [M+H2O+Na]+: m/z 1154; [M+H2O+H]+: m/z 1133; [M+H]+: m/z 1115; 2.3 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-40 5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etil]-metil-amino}-1,1-dimetil-etilsulfanil)-acetilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoato de metilo Se prepara según el ejemplo 1 a partir del 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-hidroximetil-piridin-4-iloxi)-etil]-metil-amino}-1,1-dimetil-etilsulfanil)-acetilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoato de metilo:
NOHNOHOSNHOOOOOOONNONOONONONOHHOSNHOOOOOOO LC/MS (D): tr = 0,93 min; [M+H2O+H]+: m/z 1146; [M+H]+: m/z 1128 2.4 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-hidroximetil-piridin-4-iloxi)-etil]-metil-amino}-1,1-dimetil-etilsulfanil)-acetilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoato de metilo 5 NOHNOHOSHNOHNOHOSNHOOOOOOO A 45 mg de 4-{2-[(2-mercapto-2-metil-propil)-metil-amino]-etoxi}-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina en disolución en 1 mL de DMF, se le añaden 73,7 mg de 3-[2-(2-{2-[2-(2-yodo-acetilamino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-propanoato de metilo en disolución en 1 mL de DMF y 39 µL de DIPEA. Después de 24 horas a TA, la mezcla se concentra a PR y se purifica por cromatografía ultrarrápida sobre sílice (Analogix Super Flash SiO2 SF25-8g), usando un gradiente de 0 a 10 10% de metanol en DCM. Se obtienen así 53 mg de 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-hidroximetil-piridin-4-iloxi)-etil]-metil-amino}-1,1-dimetil-etilsulfanil)-acetilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoato de metilo. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1,21 (s, 6 H); 2,40 (s, 3 H); 2,50 (t, J = 5,8 Hz, 2 H); 2,87 a 2,56 (m, 4 H); 3,15 a 3,23 (m, 4 H); 3,40 (t, J = 5,8 Hz, 2 H); 3,47 a 3,52 (m, 12 H); 3,59 (s, 3 H); 3,62 (t, J=6,2 Hz, 2 H); 4,13 (t, J=5,8 Hz, 2 H); 4,45 (d, J = 5,8 Hz, 4 H); 5,31 (t, J=5,8 Hz, 2 H); 6,85 (s, 2 H); 7,98 (t, J = 5,8 Hz, 1 H). LC/MS (A) : tr = 0,35 min; [M+H]+: m/z 620; 15 [M+2H]2+: m/z 310,5 (pico base); [M-H+HCO2H]-: m/z 664. 2.5 3-2-[2-(2-{2-[(2-yodo-acetilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi]-propanoato de metilo INHOOOOOOONH2OOOOOHO A 100 mg de ácido 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propanoico se le añaden 117,4 mg de yodoacetato 20 de N-hidroxisuccinimidilo en disolución en 3 mL de DCM. Después de 2 horas a TA, se añaden 330 µL de MeOH y la mezcla se enfría a 0°C. Se añaden 3360 µL de una disolución 2M de trimetilsilildiazometano en hexano. Después de 1 hora, la mezcla se neutraliza por adición de 50 µL de ácido acético y a continuación se le añade una disolución acuosa saturada de NaHCO3 hasta la obtención de pH = 8. La fase orgánica se seca sobre MgSO4 y se concentra a PR y se purifica por cromatografía ultrarrápida sobre sílice (Interchrom Puriflash Silice 15/35U 10G), usando un 25 gradiente de 0 a 10% de metanol en DCM. Se obtienen así 132 mg de 3-[2-(2-{2-[2-(2-yodo-acetilamino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-propanoato de metilo. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 2,54 (t, J=6,4 Hz, 2 H); 3,20 (q, J = 5,8 Hz, 2 H); 3,41 (t, J=5,8 Hz, 2 H); 3,48 a 3,53 (m, 12 H); 3,60 (s, 3 H); 3,63 (t, J=6,4 Hz, 2 H); 3,65 (s, 2 H); 8,27 (t ancho, J = 5,8 Hz, 1 H). LC/MS (A) : tr = 0,54 min; [M+H]+: m/z 448; [M+HCO2H-H]-: m/z 492. 2.6. 4-{2-[(2-mercapto-2-metil-propil)-metil-amino]-etoxi}-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina 30 NOHNOHOSSNOHNOHOSH A 80 mg de 4-{2-[metil-(2-metil-2-metildisulfanil-propil)-amino]-etoxi}-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina en disolución en 1,95 mL de metanol, se le añade una disolución de 198 mg de hidrocloruro de tris(2-carboxietil)fosfina en 730 µL de agua. Después de 2 horas a TA, la mezcla se concentra a PR y se recoge en 10 mL de agua. La fase acuosa se lleva a pH = 8 por adición de una disolución acuosa de sosa y a continuación se extrae 2 veces con AcOEt. Las 35 fases orgánicas reunidas se lavan con una disolución acuosa saturada de NaCl y se concentra a PR. Se obtienen 68 mg de 4-{2-[(2-mercapto-2-metil-propil)-metil-amino]-etoxi}-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1,28 (s, 6 H); 2,43 (s, 3 H); 2,54 (s, 2 H); 2,62 (s, 1H); 2,91 (t, J=5,7 Hz, 2 H); 4,15 (t, J=5,7 Hz, 2 H); 4,45 (d, J = 5,8 Hz, 4 H); 5,30 (t, J=5,8 Hz, 2 H); 6,85 (s, 2 H). LC/MS (A) : tr = 0,11 min; [M+H]+: m/z 301. 40
EJEMPLO 3 3.1Preparación del conjugado Se prepara un conjugado como para el ejemplo 1 haciendo reaccionar el hu2H11 y el 3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-1-metil-etilsulfanil]-acetilamino}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propanoato de N-hidroxisuccinimidilo. 5 El conjugado obtenido se dosifica por espectrometría usando los coeficientes de extinción de la 1-(1-metil-1-metildisulfanil-etil)-3,5-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8--iloximetil]-benceno ( ε319nm = 8460 M-1·cm-1 y ε280nm = 10531 M-1·cm-1) y del hu2H11 ( ε280nm = 208380 M-1·cm-1): se ha determinado una media de 4,2 derivados de tomaimicina por molécula de anticuerpo. 3.2 3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-10 ona-8-iloximetil]-1-metil-etilsulfanil]-acetilamino}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propanoato de N-hidroxisuccinimidilo Preparado como para el ejemplo 2, a partir del ácido 3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-1-metil-etilsulfanil]-acetilamino}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propanoico: NONOOONONOHHSNHOOOOOHOONONOOONONOHHSNHOOOOOOONOO 15 LC/MS (F): tr = 1,27 min; [M+H]+: m/z 1123 3.3. Ácido 3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-1-metil-etilsulfanil]-acetilamino}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propanoico Preparado como para el ejemplo 2, a partir del 3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-20 tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-1-metil-etilsulfanil]-acetilamino}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propanoato de metilo: NONOOONONOHHSNHOOOOOOONONOOONONOHHSNHOOOOOHOO LC/MS (F): tr = 1,19 min; [M+H]+: m/z 1026. 3.4 3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-25 ona-8-iloximetil]-1-metil-etilsulfanil]-acetilamino}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propanoato de metilo Preparado como para el ejemplo 2 a partir del 3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-bis-hidroximetil-fenil)-1-metil-etilsulfanil]-acetilamino}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propanoato de metilo: NONOOONONOHHSNHOOOOOOOOHOHSNHOOOOOOO 30 LC/MS (F): tr = 1,28 min; [M+H]+: m/z 1040 3.5 3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-bis-hidroximetil-fenil)-1-metil-etilsulfanil]-acetilamino}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propanoato de metilo Preparado como se describe para el ejemplo 2, a partir de 3,5-bis-hidroximetil-1-(1-mercapto-1-metil-etil)-benceno:
OHOHSNHOOOOOOOOHOHSH RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1,64 (s, 6 H); 2,53 (t, J=6,2 Hz, 2 H); 2,93 (s, 2 H); 3,15 (q, J = 6,0 Hz, 2 H); 3,37 (t, J=6,0 Hz, 2 H); 3,49 (m, 12 H); 3,59 (s, 3 H); 3,62 (t, J=6,2 Hz, 2 H); 4,49 (d, J = 5,6 Hz, 4 H); 5,13 (t, J=5,6 Hz, 2 H); 7,14 (s, 1 H); 7,32 (s, 2 H); 7,84 (t, J = 6,0 Hz, 1 H). LC/MS (B) : tr = 2,98 min; [M+H]+: m/z 532; pico base: m/z 354; [M-H+HCO2H]-: m/z 576. 5 3.8. 3,5-bis-hidroximetil-1-(1-mercapto-1-metil-etil)-benceno OHOHSHOHOSHSi Una disolución de 43 mg de 5-hidroximetil-1-(1-mercapto-1-metil-etil)-3-(ter-butil-dimetil-silaniloxi metil)-benceno en 1 mL de una mezcla de ácido acético/THF/agua (3/1/1) se agita a TA durante 4,5 horas, se concentra a PR y a continuación se recoge en 3 mL de agua. El pH de la fase acuosa se lleva a 7 por adición de una disolución acuosa 10 al 10% de Na2CO3 y a continuación la fase acuosa se extrae con AcOEt. La fase orgánica se seca sobre MgSO4 y se concentra bajo PR. Se obtienen así 18 mg de 3,5-bis-hidroximetil-1-(1-mercapto-1-metil-etil)-benceno. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1,76 (s, 6 H); 3,19 (s, 1 H); 4,48 (d, J = 5,9 Hz, 4 H); 5,14 (t, J = 5,9 Hz, 2 H); 7,13 (s, 1 H); 7,36 (s, 2 H). MS (C): Cl : [M+NH4]+: m/z 230. 3.9. 5-hidroximetil-1-(1-mercapto-1-metil-etil)-3-(ter-butil-dimetil-silaniloxi metil)-benceno 15 OHOSSiOOHOSHSi A 336 mg de tioacetato de 1-[3-(ter-butil-dimetil-silaniloximetil)-5-hidroximetil-fenil]-1-metil-etilo en disolución en 3,7 mL de acetonitrilo se le añaden 114 µL de hidrato de hidrazina. Después de 3 horas a TA, la mezcla se concentra a PR y se purifica por cromatografía ultrarrápida sobre sílice (Biotage 25+M), usando un gradiente de 0 a 55% de AcOEt en heptano. Se obtienen así 230 mg de 5-hidroximetil-1-(1-mercapto-1-metil-etil)-3-(ter-butil-dimetil-20 silaniloximetil)-benceno. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 0,08 (s, 6 H); 0,92 (s, 9 H); 1,76 (s, 6 H); 3,19 (s, 1H); 4,48 (d, J = 5,7 Hz, 2 H); 4,71 (s, 2 H); 5,14 (t, J=5,7 Hz, 1 H); 7,10 (s, 1 H); 7,33 a 7,42 (m, 2 H). MS (C): Cl : [M+NH4]+: m/z 344. 3.10. Tioacetato de 1-[3-(ter-butil-dimetil-silaniloximetil)-5-hidroximetil-fenil]-1-metil-etilo OOOHSiSiOHOSSiO 25 A 1 g de 1-(1-hidroxi-1-metil-etil)-3,5-bis-(ter-butil-dimetil-silaniloximetil)-benceno en disolución en 4,7 mL de 1,2-dicloroetano se le añaden 404 µL de ácido tioacético y 376 mg de yoduro de zinc. Se calienta la mezcla a 50°C durante 40 minutos. Después de volver a TA, las sales se eliminan por filtración y la fase orgánica se concentra a PR y se purifica por cromatografía ultrarrápida sobre sílice (Biotage 40+M), usando un gradiente de 0 a 30% de AcOEt en heptano. Se obtienen así 248 mg de tioacetato de 1-[3-(ter-butil-dimetil-silaniloximetil)-5-hidroximetil-fenil]-1-metil-30 etilo. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 0,08 (s, 6 H); 0,91 (s, 9 H); 1,79 (s, 6 H); 2,17 (s, 3H); 4,48 (d, J = 5,6 Hz, 2 H); 4,70 (s, 2 H); 5,16 (t, J=5,6 Hz, 1 H); 7,11 (s, 1 H); 7,33 (s, 1 H); 7,35 (s, 1 H). LC/MS (A) : tr = 1,23 min; [M+Na]+: m/z 391.
3.11. 1-(1-hidroxi-1-metil-etil)-3,5-bis-(ter-butil-dimetil-silaniloximetil)-benceno OOBrSiSiOOOHSiSi A 4,32 g de 1-bromo-3,5-bis-(ter-butil-dimetil-silaniloximetil)-benceno (G. T. Crisp, P. D. Turner Tetrahedron 2000, 56 (42), 8335) en disolución en 150 mL de THF enfriado a -71°C se le añaden gota a gota 10,5 mL de n-BuLi en disolución 1,6M en hexano. Después de 1 hora y 30 minutos, se añaden gota a gota 4,27 mL de acetona. Se deja 5 que la temperatura de la mezcla suba a TA y a continuación se hidroliza con una disolución acuosa saturada de NH4Cl. La fase acuosa se extrae con 100 mL de AcOEt y las fases orgánicas reunidas se secan sobre MgSO4, se concentran a PR y se purifican por cromatografía ultrarrápida sobre sílice (Biotage 65+M), usando un gradiente de 0 a 20% de AcOEt en heptano. Se obtienen así 2,48 mg de 1-(1-hidroximetil-1-metil-etil)-3,5-bis-(ter-butil-dimetil-silaniloximetil)-benceno. RMN 1H (400 MHz, CLOROFORMO-d): 0,11 (s, 12 H); 0,96 (s, 18 H); 1,59 (s, 6H); 1,69 (s, 10 1 H); 4,76 (s, 4 H); 7,21 (s, 1 H); 7,33 (s, 2 H). LC/MS (B) : tr = 6,43 min; [M+Na]+: m/z 447; pico base: m/z 407. EJEMPLO 4 4.1. Preparación del conjugado Se prepara un conjugado como para el ejemplo 1 haciendo reaccionar el hu2H11 y el 3-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{4-[2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-15 iloxi)-etil]-piperazin-1-il}-1,1-dimetil-4-oxo-butilsulfanil)-acetilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoato de N-hidroxisuccinimidilo. El conjugado obtenido se dosifica por espectrofotometría usando los coeficientes de extinción ε320nm= 7876 M-1·cm-1 y ε280nm= 4334 M-1cm-1 para el dímero de tomaimicina y ε280nm= 208,380 M-1·cm-1 para el hu2H11: se ha determinado una media de 3,13 dímeros de tomaimicina por molécula de anticuerpo. 4.2 3-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{4-[2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-20 pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etil]-piperazin-1-il}-1,1-dimetil-4-oxo-butilsulfanil)-acetilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoato de N-hidroxisuccinimidilo: Preparado según el ejemplo 2 a partir del ácido 3-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{4-[2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etil]-piperazin-1-il}-1,1-dimetil-4-oxo-butilsulfanil)-acetilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoico. 25 NNONOONONONOHHONOSNHOOOOOOONOONNONOONONONOHHONOSNHOOOOOHOO LC/MS (B) : tr = 3,27 min; [M+H]+: m/z 1309; [M+2H]2+: m/z 655. 4.3. Ácido 3-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{4-[2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etil]-piperazin-1-il}-1,1-dimetil-4-oxo-butilsulfanil)-30 acetilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoico Preparado según el ejemplo 2 a partir del 3-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{4-[2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etil]-piperazin-1-il}-1,1-dimetil-4-oxo-butilsulfanil)-acetilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoato de metilo. NNONOONONONOHHONOSNHOOOOOHOONNONOONONONOHHONOSNHOOOOOOO 35 LC/MS (B) : tr = 3,16 min; [M+H]+: m/z 1212; [M+2H]2+: m/z 606.
4.4 3-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{4-[2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etil]-piperazin-1-il}-1,1-dimetil-4-oxo-butilsulfanil)-acetilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoato de metilo Preparado según el ejemplo 2, a partir del 3-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{4-[2-(2,6-bis-hidroximetil-piridin-4-iloxi)-etil]-piperazin-1-il}-1,1-dimetil-4-oxo-butil sulfanil)-acetilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoato de metilo 5 NNONOONONONOHHONOSNHOOOOOOONOHNOHONOSNHOOOOOOO RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 1,22 (s, 6 H); 1,69 (m, 8 H); 2,37 (m, 2 H); 2,40 (m, 2 H); 2,48 (m, 2 H); 2,53 (t, J=6,1 Hz, 2 H); 2,72 (m, 2 H); 2,92 (m, 2 H); 3,04 (m, 2 H); 3,11 (s, 2 H); 3,19 (q, J = 5,4 Hz, 2 H); 3,39 (t, J=5,4 Hz, 2 H); 3,42 (m, 4 H); 3,49 (m, 12 H); 3,59 (s, 3 H); 3,62 (t, J=6,1 Hz, 2 H); 3,86 (s, 6 H); 3,88 (m, 2 H); 4,10 (m, 4 H); 4,22 (m, 2 H); 5,17 (d, J = 13,0 Hz, 2 H); 5,22 (d, J = 13,0 Hz, 2 H); 5,55 (m, 2 H); 6,94 (s, 2 H); 7,09 (s, 2 H); 7,38 (s, 2 H); 10 7,77 (d, J = 3,9 Hz, 2 H); 8,01 (t, J = 5,4 Hz, 1 H). LC/MS (B) : tr = 3,30 min; [M+H]+: m/z 1225; [M+2H]2+: m/z 613 (pico base): 4.5 3-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{4-[2-(2,6-bis-hidroximetil-piridin-4-iloxi)-etil]-piperazin-1-il}-1,1-dimetil-4-oxo-butilsulfanil)-acetilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoato de metilo Preparado según el ejemplo 2 a partir de la 4-(2-[4-(4-mercapto-4-metil)-pentanoil)-piperazin-1-il]-etoxi)-2,6-bis-15 (hidroximetil)-piridina. NOHNOHONOSNHOOOOOOONOHNOHONOSH RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): todas las señales del espectro son anchas con 1,22 (s, 6H); 1,71 (m, 2 H); 2,20 a 2,58 (m parcialmente enmascarado, 8 H); 2,75 (m, 2 H); 3,12 (m, 2 H); 3,19 (m, 2 H); 3,47 a 3,53 (m, 18 H); 3,60 (m, 5 H); 4,18 (m, 2 H); 4,46 (m, 4 H); 5,31 (m, 2 H); 6,86 (s, 2 H); 8,00 (m, 1 H). LC/MS (B) : tr = 2,20 min; [M+H]+: m/z 20 717; [M-H+CO2H]-: m/z 761. 4.6. 4-(2-[4-(4-metil-4-metildisulfanil)-pentanoil)-piperazin-1-il]-etoxi)-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina Preparado según el ejemplo 2 a partir de la 4-(2-[4-(4-metil-4-metildisulfanil)-pentanoil)-piperazin-1-il]-etoxi)-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina. NOHNOHONOSSNOHNOHONOSH 25 RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1,32 (s, 6 H); 1,76 (m, 2 H); 2,36 a 2,53 (m parcialmente enmascarado, 6 H); 2,66 (s, 1 H); 2,75 (t, J=5,5 Hz, 2 H); 3,40 a 3,52 (m, 4 H); 4,18 (t, J=5,5 Hz, 2 H); 4,46 (s, 4 H); 5,30 (m muy extendido, 2 H); 6,86 (s, 2 H). LC/MS (B) : tr = 0,76 min; [M+H]+: m/z 398; [M-H]- : m/z 396. 4.7. 4-(2-[4-(4-metil-4-metildisulfanil)-pentanoil)-piperazin-1-il]-etoxi)-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina NOHNOHONOSSNOHNOHONH 30 A 600 mg de 4-(2-piperazin-1-il-etoxi)-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina en disolución en 12 mL de DMF se le añaden 344 µL de TEA y después de 10 minutos de agitación, 748 mg de ácido 4-metil-4-metildisulfanil-pentanoico, 417 L de diisopropilcarbodiimida y 69 mg de hidrato de 1-hidoxibenzotriazol. Después de 15 horas a TA, la mezcla se concentra a PR, se le añaden 15 mL de agua y se extrae 2 veces con AcOEt. Las fases orgánicas reunidas se secan
sobre MgSO4, se concentran a PR y se purifican por cromatografía ultrarrápida sobre sílice (Analogix Super Flash SiO2 SF25-80 g) usando un gradiente de 2 a 10% de MeOH en DCM. Se obtienen así 390 mg de 4-(2-[4-(4-metil-4-metildisulfanil)-pentanoil)-piperazin-1-il]-etoxi)-2,6-bis-(hidroximetil –piridina. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1,26 (s, 6 H); 1,79 (m, 2 H); 2,36 (m, 2 H); 2,39 (s, 3 H); 2,40 a 253 (m parcialmente enmascarado, 4 H); 2,75 (t, J=5,6 Hz, 2 H); 3,45 (m, 4 H); 4,18 (t, J=5,6 Hz, 2 H); 4,46 (d, J = 5,9 Hz, 4 H); 5,30 (t, J=5,9 Hz, 2 H); 6,86 (s, 2 H). LC/MS (A) : 5 tr = 0,42 min; [M+H]+: m/z 444; [M-H+CO2H]-: m/z 488. 4.8. 4-(2-piperazin-1-il-etoxi)-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina NOHNOHONOONOHNOHONH A 2,3 mg de 4-(2-(4-ter-butoxicarbonil-piperazin-1-il)-etoxi)-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina en disolución en 33 mL de dioxano se le añaden 19 mL de una disolución de HCl 4M en dioxano. Después de 12 horas a TA, el precipitado 10 resultante se recupera por filtración sobre una frita de vidrio, se recoge en MeOH y a continuación se concentra a PR y se diluye en 40 mL de una mezcla de MeOH/agua 1/1. La disolución resultante se deposita sobre Mega BE-SCX, 25GM 150ML (Varian). Después de lavado de la fase con MeOH, el producto de interés se eluye con una disolución de amoniaco 2N en metanol. La fase de MeOH/NH3 se concentra a PR. Se obtienen así 1,6 g de 4-(2-piperazin-1-il-etoxi)-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 2,40 (m, 4 H); 2,68 (m, 6 H); 4,15 (t, J = 5,7 Hz, 15 2H); 4,44 (m, 4 H); 5,29 (m, 2 H); 6,85 (s, 2 H). LC/MS (A) : tr = 0,10 min; [M+H]+: m/z 268; [M+2H]2+: m/z 134,5; pico base: m/z 113. 4.9. 4-(2-(4-ter-butoxicarbonil-piperazin-1-il)-etoxi)-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina NNONOOOOOONOHNOHONOO A 3,1 g de 4-[2-(4-ter-butoxicarbonil-piperazin-1-il)-etoxi]-piridina-2,6-dicarboxilato de dietilo en disolución en 105 mL 20 de EtOH, se le añaden 779 mg de borohidruro de sodio y 2,29 g de CaCl2. Después de 3 horas a TA, la mezcla se hidroliza y se concentra a PR. Al residuo obtenido se le añade agua y la fase acuosa resultante se extrae 4 veces con AcOEt. Las fases orgánicas reunidas se lavan con una disolución acuosa saturada de NaCl y a continuación se concentra a PR. Se obtienen así 2,4 g de 4-(2-(4-ter-butoxicarbonil-piperazin-1-il)-etoxi)-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1,39 (s, 9 H); 2,43 (m, 4 H); 2,73 (t, J = 5,6 Hz, 2 H); 3,30 (m parcialmente 25 enmascarado, 4 H); 4,17 (t, J=5,6 Hz, 2 H); 4,45 (d, J = 5,9 Hz, 4 H); 5,30 (t, J = 5,9 Hz, 2H); 6,86 (s, 2 H). LC/MS (A) : tr = 0,24 min; [M+H]+: m/z 368. 4.10. 4-[2-(4-ter-butoxicarbonil-piperazin-1-il)-etoxi]-piridina-2,6-dicarboxilato de dietilo NNONOOOOOONOHOOOO A una disolución de 5 g de 1-ter-butoxicarbonil-4-(2-hidroxietil)-piperazina en 102 mL de DCM enfriado a 0°C se le 30 añaden 4,5 mL de TEA y a continuación 2 mL de cloruro de metanosulfonilo. Después de 1 hora, la mezcla se lleva a TA. Después de 1 hora de agitación suplementaria, la mezcla se hidroliza y la fase orgánica se lava 2 veces con agua y después se seca sobre MgSO4 y se concentra a PR. Al residuo así obtenido (6,7 g) se le añaden 140 mL de DMF y se lleva a 60°C. Entonces se añaden 190 mg de diéster de etilo del ácido quelidámico (Scrimin, P.; Tecilla, P.; Tonellato, U.; Vendrame, T., J. Org. Chem. 1989, 54, 5988) y 549 mg de K2CO3 y la mezcla se calienta a 80°C 35 durante 20 horas. Después de concentración a PR, la mezcla se hidroliza, se extrae 3 veces con AcOEt y las fases orgánicas reunidas se lavan con una disolución saturada de NaCl, se concentran a PR y se purifican por cromatografía ultrarrápida sobre sílice (Analogix Super Flash SiO2 SF25-150 g) usando un gradiente de 60 a 85% de AcOEt en heptano. Se obtienen así 3,1 g de 4-[2-(4-ter-butoxicarbonil-piperazin-1-il)-etoxi]-piridina-2,6-dicarboxilato de dietilo. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1,34 (t, J = 7,2 Hz, 6 H); 1,39 (s, 9 H); 2,44 (m, 4 H); 2,76 (t, J=5,7 Hz, 2 40
H); 3,30 (m parcialmente enmascarado, 4 H); 4,34 (t, J=5,7 Hz, 2 H); 4,38 (q, J = 7,1 Hz, 4 H); 7,74 (s, 2 H). LC/MS (B) : tr = 2,81 min; [M+H]+: m/z 452; [MH+HCO2H]-: m/z 496. Ejemplo 5 5.1 4-{2-[4-(2-metil-2-metildisulfanil-propil)-piperazin-1-il]-etoxi}-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina Se prepara según el ejemplo 1, a partir de la 4-(2-piperazin-1-il-etoxi)-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina. 5 NOHNOHONSSNOHNOHONH RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1,25 (s, 6 H); 2,39 (s, 3 H); 2,40 (s, 2 H); 2,44 a 2,57 (m parcialmente enmascarado, 8 H); 2,69 (t, J=5,7 Hz, 2 H); 4,14 (t, J=5,7 Hz, 2 H); 4,45 (d, J = 5,7 Hz, 4 H); 5,29 (t, J=5,7 Hz, 2 H); 6,85 (s, 2 H). LC/MS (B) : tr = 0,51 min; [M+H]+: m/z 402. EJEMPLO 6 10 6.1 Preparación del conjugado Se prepara un conjugado como para el ejemplo 1 haciendo reaccionar el hu2H11 y el 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etil]-metil-amino}-1,1-dimetiletilsulfanil)-acetilmetilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoato de N-hidroxisuccinimidilo. El conjugado obtenido se dosifica por espectrofotometría utilizando los coeficientes de 15 extinción ε319nm= 7789 M-1cm-1 y ε280nm= 4362 M-1cm-1 para el dímero de tomaimicina y ε280nm= 208380 M-1cm-1 para hu2H11: se ha determinado una media de 2,90 dímeros de tomaimicina por molécula de anticuerpo. 6.2 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etil]-metil-amino}-1,1-dimetil-etilsulfanil)-acetil-metilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoato de N-hidroxisuccinimidilo 20 Preparado según el ejemplo 2 a partir del ácido 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2,1c][1,4] benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etil]-metil-amino}-1,1-dimetil-etilsulfanil)-acetil-metilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoico: LC/MS (F): tr = 1,02 min; [M+H]+: m/z 1225; [M+H2O+H]+: m/z 1243 25 6.3 Ácido 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etil]-metil-amino}-1,1-dimetil-etilsulfanil)-acetil-metilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoico Preparado según el ejemplo 2 a partir del 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etil]-metil-amino}-1,1-dimetil-etilsulfanil)-30 acetil-metilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoato de metilo: LC/MS (F): tr = 0,97 min; [M+H]+: m/z 1129 6.4 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetoxi-1,2,3,11a-tetra hidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etil]-metil-amino}-1,1-dimetil-etilsulfanil)-acetil-35 metilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoato de metilo Se prepara según el ejemplo 2 a partir del 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-hidroximetil-piridin-4-iloxi)-etil]-metil-amino}-1,1-dimetil-etilsulfanil)-acetil-metilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoato de metilo:
RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): todas las señales del espectro son anchas con 1,20 (s, 6H); 1,58 a 1,73 (m, 6 H); 2,38 (s, 3 H); 2,52 a 3,07 (m, 13 H); 3,36 a 3,63 (m, 23 H); 3,67 a 3,91 (m, 8 H); 4,06 a 4,26 (m, 6 H); 5,02 a 5,26 (m, 4 H); 5,33 a 5,60 (m, 2 H); 6,39 a 7,42 (m, 6 H); 7,76 (m, 2 H). LC/MS (A) : tr = 0,77 min; [M+H]+: m/z 1142; [M+2H]2+: m/z 571,5 (pico base). 5 6.5 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-bis-hidroximetil-piridin-4-iloxi)-etil]-metil-amino}-1,1-dimetil-etilsulfanil)-acetil-metilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoato de metilo Preparado según el ejemplo 2 a partir del 3-{2-[2-(2-{2-[(2-yodo-acetil)-metilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoato de metilo. 10 RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): desdoblamiento 50-50 de rotámeros con: 1,22 (s, 3H); 1,24 (s, 3 H); 2,41 (s, 3 H); 2,53 (t, J=6,2 Hz, 2 H); 2,56 (m, 2 H); 2,80 (s, 1 H); 2,88 (t, J=5,9 Hz, 2 H); 3,05 (s, 2 H); 3,35 a 3,58 (m, 18 H); 3,59 (s, 3 H); 3,62 (t, J=6,2 Hz, 2 H); 4,13 (t, J=5,9 Hz, 2 H); 4,45 (d, J = 5,9 Hz, 4 H); 5,29 (t, J=5,9 Hz, 2 H); 6,85 (s, 2 H). LC/MS (B) : tr = 2,18 min; [M+H]+: m/z 634; [M-H+CO2H]-: m/z 678. 6.6. 3-{2-[2-(2-{2-[(2-yodo-acetil)-metil-amino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoato de metilo 15 A 215 mg de 3-(2-{2-[2-(2-metilamino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propanoato de metilo se le añaden 117,4 mg de yodoacetato de N-hidroxisuccinimidilo en disolución en 6,5 mL de DCM. Después de 2 horas a TA, la mezcla se concentra a PR y se purifica por cromatografía ultrarrápida sobre sílice (Analogix Super Flash SiO2 SF25-24 g), usando un gradiente de 0 a 6% de MeOH en DCM. Se obtienen así 210 mg de 3-[2-(2-{2-[2-(2-yodo-acetil)-20 metilamino]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propanoato de metilo. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): desdoblamiento 55-45 de rotámeros con 2,54 (t, J = 6,2 Hz, 2 H); 2,83 (s, 1,35 H); 3,02 (s, 1,65 H); 3,36 a 3,55 (m, 16 H); 3,60 (s, 3 H); 3,63 (t, J=6,2 Hz, 2 H); 3,83 (s, 1,1 H); 3,88 (s, 0,9 H). LC/MS (A) : tr = 0,62 min; [M+H]+: m/z 462. 6.7. 3-(2-{2-[2-(2-metilamino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propanoato de metilo : 25 A 390 mg de 3-[2-(2-{2-[2-(ter-butoxicarbonil-metil-amino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-propanoato de metilo en disolución en 5,3 mL de dioxano se le añaden 3 mL de una disolución de HCl 4M en dioxano. Después de 12 horas a TA, la mezcla se concentra a PR, se pone en disolución en un mínimo de metanol y se deposita sobre Mega BE-SCX, 10GM 60ML (Varian). Después de lavado de la fase con MeOH, el producto de interés se eluye con una disolución de amoniaco 2N en metanol. La fase de metanol/NH3 se concentra a PR. Se obtienen así 270 mg de 3-(2-30 {2-[2-(2-metilamino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propanoato de metilo. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 2,28 (s, 3 H); 2,54 (t, J = 6,2 Hz, 2 H); 2,59 (t, J=5,9 Hz, 2 H); 3,44 (t, J=5,9 Hz, 2 H); 3,47 a 3,54 (m, 12 H); 3,60 (s, 3 H); 3,63 (t, J = 6,2 Hz, 2 H). LC/MS (A): tr = 0,30 min; [M+H]+: m/z 294. 6.8. 3-[2-(2-{2-[2-(ter-butoxicarbonil-metil-amino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-propanoato de metilo 35 A una disolución de 500 mg de ácido 3-[2-(2-{2-[2-(ter-butoxicarbonil-metil-amino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-propanoico en 4,8 mL de MeOH enfriado a 0°C, se le añaden 2 mL de una disolución 2M de trimetilsilildiazometano en hexano. Después de 2 horas, la mezcla se neutraliza por adición de 120 L de ácido acético y a continuación se concentra a PR y se purifica por cromatografía ultrarrápida sobre sílice (Analogix Super Flash SiO2 SF25-40 g), usando un gradiente de 0 a 5% de metanol en DCM. Se obtienen así 400 mg de 3-[2-(2-{2-[2-(ter-butoxicarbonil-40
metil-amino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-propanoato de metilo. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1,38 (s, 9 H); 2,54 (t, J = 6,2 Hz, 2 H); 2,80 (s ancho, 3 H); 3,29 (t parcialmente enmascarado, J =5,9 Hz, 2 H); 3,45 a 3,55 (m, 14 H); 3,59 (s, 3 H); 3,63 (t, J = 6,2 Hz, 2 H). LC/MS (A) : tr = 0,84 min; [M+Na]+: m/z 416 (pico base); LC/MS (A) : tr = 0,84 min; [M+Na]+: m/z 416 (pico base). 6.9. Ácido 3-[2-(2-{2-[2-(terc-butoxicarbonil-metil-amino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-propanoico 5 A una disolución de 520 mg de ácido 3-[2-(2-{2-[2-(ter-butoxicarbonil-amino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-propanoico en 14 mL de THF enfriado a 0°C, se le añaden en porciones 85,4 mg de NaH. Después de 5 minutos de agitación, se le añaden 150 µL de yodometano. La mezcla se agita entonces durante 2 horas a TA y a continuación se le añaden 150 µL de yodometano suplementarios. Después de 12 horas a TA, la mezcla se hidroliza y a continuación se lleva a 10 pH ácido por adición de ácido acético acuoso a 0°C. La fase acuosa se extrae 3 veces con AcOEt, las fases orgánicas se reúnen y se secan sobre MgSO4, se concentran a PR y el producto bruto obtenido se vuelve a hacer reaccionar según el mismo protocolo con 85 mg de NaH y 176 µL de yodometano durante 2 horas suplementarias. Se obtienen así 500 mg de ácido 3-[2-(2-{2-[2-(ter-butoxicarbonil-metil-amino)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-propanoico. LC/MS (F): tr = 1,01 min; [M+H]+: m/z 380. 15 Evaluación de la inhibición de la proliferación de las líneas celulares MDA-MB-231, MDA-A1 y HCT116 para los compuestos de fórmula (IA) con ZbRb = -OMe e Y=Y'= -OMe Las células MDA-MB-231, MDA-A1 o HCT116 en su fase de crecimiento exponencial se tripsinizan y se ponen en suspensión en su medio de cultivo respectivo (DMEM/F12 Gibco #21331, SVF al 10 % Gibco #10500-056, Glutamina 2 nM Gibco #25030 para las células MDA; DMEM Gibco #11960, SVF al 10 % Gibco #10500-056, 20 Glutamina 2 mM Gibco #25030 para las células HCT116). La suspensión celular se siembra en placas de cultivo de 96 pocillos Cytostar (GE Healthcare Europe, #RPNQ0163) en el medio de cultivo completo que contiene suero a una densidad de 5.000 células/pocillo (MDA-MB-231, MDA-A1, HCT116). Después de 4 horas de incubación, se añaden diluciones sucesivas de los dímeros de tomaimicina en los pocillos por triplicado para cada concentración. Se cultivan las células durante 3 días a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5% en presencia de citotóxicos. El 4º día, se 25 añaden a cada pocillo 10 µL de una disolución de timidina 14C (0,1 µCi/pocillo, Perkin Elmer #NEC56825000). La incorporación de timidina 14C se mide 96 h después del principio del experimento con un contador radioactivo microbeta (Perkin Elmer). Los datos se expresan en forma de % de supervivencia calculando la relación entre el recuento obtenido con las células tratadas con el citotóxico y el obtenido con las células de los pocillos de control (tratados con el medio de cultivo solo). 30 Tabla II Inhibición de la proliferación (pulso de 14C timidina a las 96 h) IC50 [nM] Estructura del compuesto de fórmula (IA) HCT116 MDA-A1 MDA-MB231 0,030 1,991 0,009 0,120 2,260 0,070 0,127 >10 0,084
Inhibición de la proliferación (pulso de 14C timidina a las 96 h) IC50 [nM] Estructura del compuesto de fórmula (IA) HCT116 MDA-A1 MDA-MB231 1,250 >10 0,450 Se constata que los compuestos ensayados para los que ZbRb = -OMe tienen una actividad anticancerosa potente; esto hace pensar que los compuestos similares caracterizados por otro grupo ZbRb son susceptibles de presentar una actividad idéntica. Evaluación de la inhibición de la proliferación de las líneas celulares MDA-MB-231 por los conjugados de hu2H11-5 citotóxico Las células MDA-MB-231 en su fase de crecimiento exponencial se tripsinizan y se ponen en suspensión en su medio de cultivo (DMEM/F12 Gibco #21331, SVF al 10 % Gibco #10500-056, Glutamina 2nM Gibco #25030). La suspensión celular se siembra en placas de cultivo de 96 pocillos Cytostar (GE Healthcare Europe, #RPNQ0163) en el medio de cultivo completo que contiene suero con una densidad de 5.000 células/pocillo. Después de 4 h de 10 incubación, se añaden a los pocillos diluciones sucesivas de los inmunoconjugados anticuerpo-citotóxico con concentraciones decrecientes de 10-7 a 10-12 M (por triplicado para cada concentración). Las células se cultivan a 37°C en una atmósfera con CO2 al 5% en presencia de los inmunoconjugados anticuerpo-citotóxico durante 3 días. El 4º día, se añaden a cada pocillo 10 µL de una disolución de timidina 14C (0,1 µCi/pocillo, Perkin Elmer #NEC56825000). La incorporación de timidina 14C se mide 96 h después del principio del experimento con un 15 contador radioactivo microbeta (Perkin Elmer). Los datos se expresan en la forma de % de supervivencia calculando la relación entre el recuento obtenido con las células tratadas con el inmunoconjugado y el obtenido con las células de los pocillos de control (tratados con el medio de cultivo solo). En algunos experimentos, se ha añadido el anticuerpo desnudo a los pozos con una concentración de 1µM al principio del experimento y la inhibición de la proliferación ha sido medida como se ha descrito precedentemente. 20 Tabla III Inhibición de la proliferación (pulso de 14C timidina a las 96 h) CI50 [pM] Estructura CI50 media IC50 media (+hu2H11 desnudo*) relación entre las CI50 31 540 17 910 5095 6 54 3981 74 conjugado C2
Inhibición de la proliferación (pulso de 14C timidina a las 96 h) CI50 [pM] Estructura CI50 media IC50 media (+hu2H11 desnudo*) relación entre las CI50 1255 9125 7 68,5 1119 16 Estabilidad monomérica de los conjugados de los dímeros de tomaimicina no escindibles Los conjugados de hu2H11 no escindibles preparados con dímeros de la tomaimicina descritos en los ejemplos 3 y 5 de la solicitud internacional WO 09016516 tienden a que su pureza monomérica disminuya con el tiempo después de varios meses de almacenamiento a 3-5°C. En efecto, estos conjugados, formulados en una disolución tampón 5 acuosa a pH 6,5 de concentración 10mM en histidina que contiene 10% de sacarosa y 5% de NMP, presentan una media de 3 a 3,5 dímeros de tomaimicina por molécula de anticuerpo, de pureza monomérica inicial del orden de 97,5%, pueden perder de 6 a 15% de pureza monomérica en 6 a 8 meses. Este fenómeno no ha sido observado con el conjugado del ejemplo 2 que, con una media de 3,5 dímeros de tomaimicina por molécula de anticuerpo, conserva una pureza monomérica superior a 99% tras 4 meses en las mismas condiciones de almacenamiento, sugiriendo así 10 una mejor estabilidad de este conjugado particular. Se trata de un objetivo general buscado en el campo de los conjugados el de poder disponer de un conjugado que conserve una pureza monomérica a lo largo del tiempo. Evaluación de la actividad antitumoral de los conjugados de hu2H11-citotóxico en ratones SCID hembra portadores de un adenocarcinoma humano avanzado de mama, MDA-MB-231 Se han evaluado dos conjugados del mismo anticuerpo hu2H11, denominados C1 (preparado con el dímero de 15 tomaimicina descrito en el ejemplo 5 de la solicitud internacional WO 09016516) y C2 (conjugado del ejemplo 2), a 4 niveles de dosis sobre tumores de mama medibles MDA-MB-231 implantados s. c. en ratones SCID hembra. Los grupos de control no han sido tratados. Las dosis de los dos conjugados se dan en µg de dímero de tomaimicina/kg. Han sido administradas a 80, 40, 20 y 10 µg/kg por inyección del tipo bolo intravenoso (IV) en el día 13 para C1 y en el día 24 para C2. 20 En lo que se refiere a la evaluación de la actividad antitumoral de los conjugados, los animales se han pesado diariamente y se han medido los tumores 2 veces por semana por medio de un calibre. La evaluación de la actividad antitumoral se ha realizado a la Dosis Máxima Tolerada (DMT). Una dosis que induce una pérdida de peso del 20% a la concentración más baja o 10% (o más) de mortalidad relacionada con el conjugado se considera como tóxica. El peso corporal de los animales incluye el peso de los tumores. El peso de los tumores se calcula según la fórmula: 25 masa (mg) = [longitud (mm) × anchura (mm)2]/2. Los parámetros de eficacia son el ∆T/∆C, el porcentaje medio de regresión, las regresiones parciales y completas (RP y RC) y el número de ratones sin tumor al final del estudio (RST). La evolución del volumen de los tumores para cada ratón tratado (T) y control (C) se calcula para cada tumor por sustracción del volumen del tumor el día del inicio del estudio al volumen del tumor el día de la observación 30 específica. La media ∆T se calcula para el grupo tratado y la media ∆C se calcula para el grupo de control. A continuación se calcula la relación ∆T/∆C y se expresa en porcentaje: ∆T/∆C = (delta T/delta C) x 100 Se considera que una dosis es terapéuticamente activa para un valor de ∆T/∆C inferior a 40% y muy activa para un valor de ∆T/∆C inferior a 10%. Cuando el valor de ∆T/∆C es inferior a 0, la dosis se considera altamente activa y entonces se calcula el porcentaje de regresión (según Plowman J, Dykes DJ, Hollingshead M, Simpson-Herren L y 35 Alley MC. Human tumor xenograft models in NCI drug development: Feibig HH BA, editor. Basel: Karger.; 1999 p 101-125): El porcentaje de regresión tumoral se define como el porcentaje de disminución del volumen tumoral en el grupo tratado el día de la observación específica en comparación con su volumen el primer día de tratamiento. A un tiempo
t específico y para cada animal, se calcula el porcentaje de regresión tumoral. Entonces se calcula el porcentaje de regresión medio para el grupo. Porcentaje de regresión (al tiempo t) = 100volumenvolumenvolument0tt0 Regresión parcial (RP): Las regresiones se definen como parciales cuando la disminución del volumen tumoral alcanza el 50% del volumen del tumor al principio del tratamiento. 5 Regresión completa (RC): La regresión completa se obtiene cuando el volumen del tumor = 0 mm3 (se considera que se está en presencia de una RC cuando el volumen del tumor no se puede medir). RST: Los ratones sin tumor se definen como los ratones que no presentan tumor detectable al final del estudio (más allá de 100 días de tratamiento). 10
Tabla IV – Evaluación de la actividad antitumoral de los conjugados C1 y C2 en ratones SCID hembra portadores de un adenocarcinoma humano avanzado de mama, MDA-MB-231. Conjugado Vía de administración/Dosis en mL/kg por inyección Dosis en µg/kg de dímero de tomaimicina (mg prot/kg) Día de administración MortalidadPérdida de peso media en % a la concentración mínima (día) ∆T/∆C medio en %(día) Porcentaje de regresión media (día) Regresiones Parcial Completa C2 IV 80 (2,98) 24 4/6 - - - - - - Tóxico DAR 3,5 10 mL/kg 40 (1,49) 0/6 -5,0 (31) <0 (46) 96,2 (46) 6/6 1/6 1/6DMT.altamente activo 20 (0,75) 0/6 -4,4 (31) <0 (46) 66,4 (46) 4/6 0/6 0/6Altamente activo 10 (0,37) 0/6 -4,0 (31) 14 (46) - 0/6 0/6 0/6Activo Abreviaturas: DMT = Dosis Máxima Tolerada, RST = Ratón sin tumor al final del estudio
Según un esquema de administración de dosis única, se ha demostrado que la dosis mayor ensayada para estos dos conjugados en este estudio (80 µg/kg) es tóxica, induciendo pérdida de peso y mortalidad. A la DMT (40 µg/kg), C1 es muy activo e induce una pérdida de peso de 9,6% con la concentración más baja, un ∆T/∆C de 7% y 3 RP para 5 ratones SCID. También se ha observado actividad antitumoral a dosis más pequeñas de 20 y 10 µg/kg sin inducir RP. A la DMT (40 µg/kg), C2 es altamente activo e induce una pérdida de peso de 5% con la concentración más baja, una regresión tumoral de 96,2% con 6 RP para 6 ratones, de los que 1 fue RST. Igualmente es muy activo a la dosis inferior de 20 µg/kg con una regresión tumoral de 66,4% y 4 RP para 6 ratones. También se ha observado una actividad antitumoral para la dosis más baja de 10 µg/kg sin inducir, sin embargo, regresión o RP. En conclusión, se constata que C2 presenta una actividad anticancerosa grande y ha demostrado una mejor actividad que C1 con una regresión tumoral, RP y RST a la DMT, no observados con C1 a las mismas dosis.