RS57694B1

RS57694B1 - Pirolobenzodiazepin - anti-psma konjugati antitela

Info

Publication number: RS57694B1
Application number: RS20181128A
Authority: RS
Inventors: Berkel Patricius Hendrikus Cornelis Van; Philip Wilson Howard
Original assignee: Adc Therapeutics Sa; Medimmune Ltd
Priority date: 2012-10-12
Filing date: 2013-10-11
Publication date: 2018-11-30
Also published as: AU2013328619B2; TR201815418T4; KR101986404B1; DK2906253T3; US20150283258A1; CA2887894A1; EP2906253B9; BR112015008173A2; CN105102003A; US10751346B2; JP6270859B2; PL2906253T3; MX364326B; WO2014057113A1; LT2906253T; SI2906253T1; HRP20181646T1; ES2690067T9; CN105102003B; PT2906253T

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na pirolobenzodiazepine (PBD) koji imaju labilnu C2 ili N10 zaštitnu grupu u obliku veznika za antitelo.

Pozadina pronalaska

Pirolobenzodiazepini

[0002] Neki pirolobenzodiazepini (PBD) imaju sposobnost da prepoznaju i da se vežu na određene sekvence DNK; poželjna sekvenca je PuGPu. Prvi PBD anti-tumorski antibiotik, antramicin, otkriven je 1965. godine (Leimgruber, i dr., J. Am. Chem. Soc., 87, 5793-5795 (1965); Leimgruber, i dr., J. Am. Chem. Soc., 87, 5791-5793 (1965)). Od tada, prijavljeno je dosta PBD-a koji se javljaju u prirodi i razvijeno je više od 10 sintetičkih načina kroz različite analoge (Thurston, i dr., Chem. Rev.1994, 433-465 (1994); Antonow, D. i Thurston, D.E., Chem. Rev. 2011111 (4), 2815-2864). Članovi familije uključuju abeimicin (Hochlowski, i dr., J. Antibiotics, 40, 145-148 (1987)), hicamicin (Konishi, i dr., J. Antibiotics, 37, 200-206 (1984)), DC-81 (Japanese Patent 58-180487; Thurston, i dr., Chem. Brit., 26, 767-772 (1990); Bose, i dr., Tetrahedron, 48, 751-758 (1992)), mazetramicin (Kuminoto, i dr., J. Antibiotics, 33, 665-667 (1980)), neotramicine A i B (Takeuchi, i dr., J. Antibiotics, 29, 93-96 (1976)), porotramicin (Tsunakawa, i dr., J. Antibiotics, 41, 1366-1373 (1988)), protrakarcin (Shimizu, i dr, J. Antibiotics, 29, 2492-2503 (1982); Langley i Thurston, J. Org. Chem., 52, 91-97 (1987)), sibanomicin (DC-102)(Hara, i dr., J. Antibiotics, 41, 702-704 (1988); Itoh, i dr., J. Antibiotics, 41, 1281-1284 (1988)), sibiromicin (Leber, i dr., J. Am. Chem. Soc., 110, 2992-2993 (1988)) i tomamicin (Arima, i dr., J. Antibiotics, 25, 437-444 (1972)). PBD su generalne strukture:

[0003] Oni se razlikuju po broju, vrsti i položaju supstituenata, po svojim aromatskim A prstenovima i pirolo C prstenova, kao i po stepenu zasićenosti C prstena. U B prstenu nalazi se ili imin (N = C), karbinolamin (NH-CH (OH)), ili karbinolamin metil eter (NH-CH (OMe)) na N10-C11 položaju koji je elektrofilni centar odgovoran za alkiliranje DNK. Svi od poznatih prirodnih proizvoda imaju (S)-konfiguraciju na hiralnom C11, što je pozicija koja im pruža zakrivljenje u desno kada se gleda od C prstena prema A prstenu. To im daje odgovarajući trodimenzionalni oblik za izoheličnost sa manjim žljebom od B oblika DNK, što dovodi do prikladnog prianjanja na vezivnom mestu (Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, New York, pp. 3-11 (1975); Hurley i Needham-VanDevanter, Acc. Chem. Res., 19, 230-237 (1986)). Njihova sposobnost da obrazuju adukt unutar manjeg žljeba omogućuje im da se umešaju u DNK procesiranje, odakle proizilazi njihova upotreba kao anti-tumorski agensi.

[0004] Posebno povoljno pirolobenzodiazepin jedinjenje opisali su Gregson i dr. (Chem. Commun.

1999, 797-798) kao jedinjenje 1, i Gregson etal. (J. Med. Chem. 2001, 44, 1161-1174) kao jedinjenje 4a. Ovo jedinjenje, takođe poznato kao SG2000, prikazano je ispod:

WO 2007/085930 opisuje pripremu dimera PBD jedinjenja koji imaju grupe veznika za povezivanje na agens za vezivanje ćelija, kao što su antitela. Veznik je prisutan u mostu i povezuje monomerne jedinice PBD dimera.

[0005] Predmetni pronalazači opisali su dimere PBD jedinjenja koji imaju grupe veznika za povezivanje na agens za vezivanje ćelija, kao što su antitela u WO 2011/130613 i WO 2011/130616. Veznik ovih jedinjenja vezan je za PBD jezgro preko položaja C2 i generalno se cepa delovanjem enzima na vezničkoj grupi. U WO 2011/130598 veznik ovih jedinjenja vezan je na jedan od dostupnih N10 položaja u PBD jezgru, i uglavnom se cepa delovanjem enzima na grupi veznika.

Konjugati antitela i lekova

[0006] Terapija antitelima uspostavljena je za ciljano lečenje pacijenata sa karcinomom, imunološkim i angiogenetskim poremećajima (Carter, P. (2006) Nature Reviews Immunology 6:343-357). Upotreba konjugata antitela i lekova (ADC), tj. imunokonjugata za lokalnu isporuku citotoksičnih ili citostatskih agenasa, odnosno lekova koji ubijaju ili suzbijaju tumorske ćelije u lečenju kancera, cilja isporuku funkcionalne grupe leka na tumore i unutarćelijske akumulacije u njemu, a sistemska primena tih nekonjugovanih lek agenasa može dovesti do neprihvatljivih vrednosti toksičnosti u normalnim ćelijama (Xie i dr (2006) Expert. Opin. Biol. Ther. 6(3):281-291; Kovtun i dr (2006) Cancer Res.

66(6):3214-3121; Law i dr (2006) Cancer Res. 66(4):2328-2337; Wu i dr (2005) Nature Biotech.

23(9):1137-1145; Lambert J. (2005) Current Opin. in Pharmacol.5:543-549; Hamann P. (2005) Expert Opin. Ther. Patenti 15(9):1087-1103; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Trail i dr (2003) Cancer Immunol. Immunother.52:328-337; Syrigos i Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614).

[0007] Time je tražena maksimalna delotvornost uz minimalnu toksičnost. Napori da se dizajnira i rafinira ADC bili su usmereni na selektivnost monoklonskih antitela (mAb), kao i mehanizme delovanja lekova, povezivanje lekova, odnos lek/antitelo (unošenje), i svojstva otpuštanja leka (Junutula, i dr., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan i dr (2009) Blood 114(13):2721-2729; US 7521541; US 7723485; WO2009/052249; McDonagh (2006) Protein Eng. Design & Sel.19(7): 299-307; Doronina i dr (2006) Bioconj. Chem. 17:114-124; Erickson i dr (2006) Cancer Res. 66(8):1-8; Sanderson i dr (2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852; Jeffrey i dr (2005) J. Med. Chem. 48:1344-1358; Hamblett i dr (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070). Funkcionalne grupe leka mogu dati svoje citotoksične i citostatičke efekte koristeći mehanizme koji uključuju vezivanje tubulina, vezivanje DNA, proteazom i/ili inhibiciju topoizomeraze. Neki citotoksični lekovi imaju tendenciju da budu neaktivni ili manje aktivni kada se konjuguju na velika antitela ili proteinske receptorske ligande.

[0008] Pronalazači ovog pronalaska razvili su određene PBD dimere konjugate antitela.

Obelodanjivanje pronalaska

[0009] U prvom aspektu ovaj pronalazak sadrži konjugat formule

ConjA

ConjB

ConjC

ConjD

;or

ConjE

gde Ab predstavlja antitelo koje se vezuje za PSMA, antitelo koje sadrži VH domen koji ima sekvencu u skladu sa bilo kojom od SEQ ID NO.1, 3, 5, 7, 8, 9, ili 10, opciono dalje sadrži VL domen koji ima sekvencu u skladu sa bilo kojom od SEQ ID NO.2, 4, 6, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ili 18; i; gde unošenje (p) lekova (D) u antitelo (Ab) je celi broj od 1 do 8.

[0010] Postoji način dobijanja konjugata izabranog iz grupe koju čine ConjA, ConjB, ConjC, ConjD i ConjE koji sadrže konjugaciju jedinjenja koje je naročito odabrano od A:

C:

D:

i E:

gde je antitelo definisano niže.

[0011] WO 2011/130615 obelodanjuje jedinjenje 26:

koje je matično jedinjenje od jedinjenja A. Jedinjenje A sadrži ovaj PBD sa veznikom za vezivanje na agens za vezivanje ćelija. Agens za vezivanje ćelija obezbeđuje broj delova etilen glikola da bi se dobilo rastvorljivost koja je korisna u sintezi konjugata.

[0012] WO 2010/043380 i WO 2011/130613 obelodanjuju jedinjenje 30:

[0013] WO 2011/130613 takođe obelodanjuje jedinjenje 51:

[0014] Jedinjenje B se razlikuje od jedinjenja 30 samo samo time što ima (CH2)3lanac između PBD ćelija, umesto lanca (CH2)5, što smanjuje lipofilnost otpuštenog PBD dimera. Vezujuća grupa je vezana za C2-fenil grupu u paru umesto meta položaju.

[0015] WO 2011/130613 obelodanjuje jedinjenje 93:

Jedinjenje C se razlikuje od ovoga u dva aspekta. Agens za vezivanje ćelija obezbeđuje povećan broj etilen glikozinih ostataka kako bi se dobila rastvorljivost koja je korisna u sintezi konjugata, a fenil supstituent daje dva a ne jedan atom kiseonika koji takođe pomaže u rastvorljivosti. Struktura jedinjenja C takođe može značiti da se jače vezuje u manjem žljebu.

[0016] Jedinjenja A, B i C imaju 2 sp<2>centre u svakom C prstenu što može omogućiti jače vezivanje u manjem žljebu DNK, nego za jedinjenja sa samo jednim sp<2>centrom u svakom C-prstenu.

[0017] WO 2011/130598 obelodanjuje jedinjenje 80:

Jedinjenje D se od ovoga razlikuje tako što obuhvata jodoacetamidnu grupu za povezivanje sa agensom za vezivanje ćelija. Ova grupa može ponuditi prednost preko jedinjenja 80 u odnosu na njegovu stabilnost kada se vezuje za agens za vezivanje ćelija (videti dole). Grupa malemida u jedinjenju 80 može da prođe kroz retro-Michael reakciju, postajući nekonjugovana od agensa za vezivanje ćelija, te je stoga osetljiva za čišćenje drugih tiola koji sadrže biološke molekule, kao što su albumini i glutation. Ovakvo nesjedinjavanje ne može se desiti sa jedinjenjem A. Takođe, grupa jodoacetamida može izbeći druge neželjene sporedne reakcije.

[0018] Jedinjenje E se razlikuje od prethodno obelodanjenih PBD dimera sa veznikom za lekove koji ima C2-3 endo-dvostruku vezu, imajući manji, manje lipofilni supstituent C2, npr.4F-fenil, propilen. Kao takvi, konjugati jedinjenja B (videti dole) manje verovatno agregiraju jednom kada su sintetizovanim. Ovakva agregacija konjugata može se meriti pomoću hromatografije za isključivanje veličine (SEC).

[0019] Oba jedinjenja D i E imaju dva sp<2>centara u svakom C-prstenu, što može omogućiti jače vezivanje u malom žljebu DNK, nego za jedinjenja sa samo jednim sp<2>centrom u svakom C-prstenu.

Detaljan opis pronalaska

[0020] Predmetni pronalazak je pogodan za upotrebu u obezbeđivanju PBD jedinjenja na poželjnoj lokaciji kod ispitanika. Konjugat dozvoljava oslobađanje aktivnog PBD jedinjenja koji ne zadržava bilo koji deo veznika. Ne postoji prisustvo stubova koji može uticati na reaktivnost PBD jedinjenja. Tako će ConjA osloboditi jedinjenje RelA:

ConjB će osloboditi jedinjenje RelB:

ConjC će osloboditi jedinjenje RelC:

ConjD će osloboditi jedinjenje RelD:

i ConjE će osloboditi jedinjenje RelE:

[0021] Navedena veza između PBD dimera i antitela u predmetnom pronalasku poželjno je vanćelijski stabilna. Pre transporta i isporuke u ćeliju, konjugat antitela i leka (ADC) poželjno je stabilan i ostaje netaknut, tj. antitelo ostaje povezano sa funkcionalnom grupom leka. Veznici su stabilni izvan ciljane ćelije i mogu se otcepiti pri nekoj efikasnoj brzini unutar ćelije. Delotvorni veznik će: (i) održavati specifična svojstva vezivanja antitela; (ii) omogućiti intraćelijsku isporuku konjugata ili leka; (iii) ostati stabilan i netaknut, odnosno neće se otcepiti, dok konjugat nije isporučen ili transportovan do svog ciljanog mesta; i (iv) zadržati citotoksičnu delotvornost ubijanja ćelija ili citostatičnu delotvornost funkcionalne grupe leka PBD. Stabilnost ADC može se meriti standardnim analitičkim tehnikama kao što su masena spektroskopija, HPLC i tehnika LC/MS razdvajanja/analize.

[0022] Isporuka jedinjenja formula RelA, RelB, RelC, RelD ili RelE postiže se na željenom mestu aktivacije konjugata formule ConjA, ConjB, ConjC, ConjD ili ConjE delovanjem enzima, kao što je katepsin, na grupi veznika, a naročito na valin-alanin dipeptidnoj funkcionalnoj grupi.

Antitela

[0023] U jednom aspektu antitelo je antitelo koje se vezuje za PSMA, koje antitelo sadrži VH domen koji ima sekvencu prema SEQ ID NO.1, 3, 5, 7, 8, 9, ili 10.

[0024] Antitelo može dalje sadržati VL domen. U nekim otelotvorenjima antitelo dalje sadrži VL domen koji ima sekvencu prema SEQ ID NO.2, 4, 6, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ili 18.

[0025] U nekim otelotvorenjima antitelo sadrži VH domen uparen sa VL domenom, gde VH i VL domeni imaju sekvence izabrane iz grupe koju čine:

SEQ ID NO.1 uparena sa bilo kojom od SEQ ID NO.2, 4, 6, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ili 18; SEQ ID NO.3 uparena sa bilo kojom od SEQ ID NO.2, 4, 6, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ili 18; SEQ ID NO.5 uparena sa bilo kojom od SEQ ID NO.2, 4, 6, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ili 18; SEQ ID NO.7 uparena sa bilo kojom od SEQ ID NO.2, 4, 6, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ili 18; SEQ ID NO.8 uparena sa bilo kojom od SEQ ID NO.2, 4, 6, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ili 18; SEQ ID NO. 9 uparena sa bilo kojom od SEQ ID NO. 2, 4, 6, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ili 18; ili

SEQ ID NO. 10 uparena sa bilo kojom od SEQ ID NO.2, 4, 6, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ili 18. Na primer SEQ ID NO.1 uparena sa SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3 uparena sa SEQ ID NO.4, SEQ ID NO. 5 uparena sa SEQ ID NO.6, SEQ ID NO. 7 uparena sa SEQ ID NO.11, SEQ ID NO. 7 uparena sa SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 7 uparena sa SEQ ID NO.13, SEQ ID NO. 7 uparena sa SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.7 uparena sa SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.7 uparena sa SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 7 uparena sa SEQ ID NO.17, SEQ ID NO.7 uparena sa SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 8 uparena sa SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.8 uparena sa SEQ ID NO.

12, SEQ ID NO.8 uparena sa SEQ ID NO.13, SEQ ID NO.8 uparena sa SEQ ID NO.14, SEQ ID NO. 8 uparena sa SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO.8 uparena sa SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.

8 uparena sa SEQ ID NO.17, SEQ ID NO.8 uparena sa SEQ ID NO.18, SEQ ID NO.9 uparena sa SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 9 uparena sa SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.9 uparena sa SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 9 uparena sa SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.9 uparena sa SEQ ID NO.

15, SEQ ID NO.9 uparena sa SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.9 uparena sa SEQ ID NO.17, SEQ ID NO.9 uparena sa SEQ ID NO.18, SEQ ID NO.10 uparena sa SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.

10 uparena sa SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 10 uparena sa SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 10 uparena sa SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.10 uparena sa SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.10 uparena sa SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 10 uparena sa SEQ ID NO.17, ili SEQ ID NO. 10 uparena sa SEQ ID NO.18.

[0026] VH i VL domeni mogu da se uparuju tako da formiraju mesto vezanja antigena antitela koje veže PSMA.

[0027] U nekim otelotvorenjima antitelo je netaknuto antitelo koje sadrži VH domen uparen sa VL domenom, gde VH i VL domeni imaju sekvence izabrane iz grupe koju čine:

SEQ ID NO. 10 uparena sa bilo kojom od SEQ ID NO.2, 4, 6, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ili 18. Na primer SEQ ID NO.1 uparena sa SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3 uparena sa SEQ ID NO.4, SEQ ID NO. 5 uparena sa SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 uparena sa SEQ ID NO.11, SEQ ID NO. 7 uparena sa SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 7 uparena sa SEQ ID NO.13, SEQ ID NO. 7 uparena sa SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.7 uparena sa SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.7 uparena sa SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 7 uparena sa SEQ ID NO.17, SEQ ID NO.7 uparena sa SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 8 uparena sa SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.8 uparena sa SEQ ID NO.

10 uparena sa SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 10 uparena sa SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 10 uparena sa SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.10 uparena sa SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.10 uparena sa SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 10 uparena sa SEQ ID NO.17, ili SEQ ID NO.10 uparena sa SEQ ID NO.18.

[0028] U nekim otelotvorenjima, antitelo je u konkurenciji sa antitelom izlučenim iz hibridoma ATCC pristupni br. HB-12126 za vezivanje za PSMA. U drugom aspektu, antitelo je u konkurenciji sa antitelom izlučenim iz hibridoma ATCC pristupni br. HB-12109 za vezivanje za PSMA. U jednom otelotvorenju antitelo vezuje PSMA sa konstantom asocijacije (Ka) koja nije manja od 2, 5 ili 10 puta od one kod antitela izlučenog iz hibridoma.

[0029] U jednom aspektu antitelo je antitelo izlučeno iz hibridoma. U jednom otelotvorenju hibridom je ATCC pristupni br. HP-12126. U drugom otelotvorenju hibridom je ATCC pristupni br. HP-12109.

[0030] U nekim otelotvorenjima antitelo je J415 antitelo obelodanjeno u WO02/098897.

[0031] U nekim otelotvorenjima antitelo je J519 antitelo obelodanjeno u WO02/098897.

[0032] U aspektu antitelo je antitelo, kako je ovde opisano, koje je modifikovano (ili dodatno modifikovano) kako je opisano niže. U nekim otelotvorenjima antitelo je humanizovana, deimunizovana ili ponovo obrađena verzija antitela koje je ovde prikazano. Na primer, humanizovana, deimunizovana ili ponovo obrađena verzija (i) antitela koje sadrži VH domen SEQ ID NO.1 uparen sa VL domenom SEQ ID NO.2, (ii) J519 antitela obelodanjenog u WO02/098897, (iii) antitela izlučenog iz hibridoma ATCC pristupni br. HB-12109, (iv) antitela koje sadrži VH domen SEQ ID NO.5 uparen sa VL domenom SEQ ID NO.6, (v) J415 antitelo obelodanjeno u WO02/098897, (vi) antitelo izlučeno iz hibridoma ATCC pristupni br. HB-12126.

Terminologija

[0033] Izraz “antitelo” ovde se koristi u najširem smislu, i specifično pokriva monoklonska antitela, poliklonska antitela, dimere, multimere, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela), nepromenjena antitela i fragmente antitela, sve dok oni pokazuju željenu biološku aktivnost, na primer sposobnost da vezuje CDPSMA (Miller i dr (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861). Antitela mogu biti mišja, ljudska, humanizovana, himerna ili izvedena iz drugih vrsta. Antitelo je protein stvoren od strane imunog sistema koji je sposoban da prepozna i veže se na specifični antigen. (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York). Ciljani antigen obično ima više mesta za vezivanje, koji se nazivaju epitopima, prepoznatih od strane CDR-a na više antitela. Svako antitelo koje se specifično vezuje na drugi epitop ima različitu strukturu. Tako, jedan antigen može imati više od jednog odgovarajućeg antitela. Antitelo obuhvata imunoglobulnski molekul pune dužine ilimunološki aktivan deo imunoglobulnskog molekula pune dužine tj., molekul koji sadrži antigen vezujuće mesto koje se imunospecifično vezuje za antigen ciljnog molekula ili njegovog dela, gde takve ciljne mete uključuju ali nisu ograničene na, ćelije kancera ili ćelije koje produkuju autoimunska antitela asocirana sa autoimunskim bolestima. Imunoglobulin može biti bilo kog tipa (npr. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i), klase (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2) ili podklase, ili alotiopa (npr. humani G1m1, G1m2, G1m3, non-G1m1 [koji je bilo koji alotip koji nije G1m1] , G1m17, G2m23, G3m21, G3m28, G3m11, G3m5, G3m13, G3m14, G3m10, G3m15, G3m16, G3m6, G3m24, G3m26, G3m27, A2m1, A2m2, Km1, Km2 i Km3) molekula imunoglobulina. Imunoglobulini se mogu izvesti iz bilo kog tipa, uključujući i humano, mišje ili zečje poreklo.

[0034] Kako se ovde koristi, “vezuje PSMA” se koristi da označi da antitelo vezuje PSMA sa većim afinitetom nego nespecifični partner kao što je Bovine Serum Albumin (BSA, Genbank pristupni br. CAA76847, verzija CAA76847.1 GI: 3336842, datum zapisa ažuriranja: 7. Jan.201114:30). U nekim otelotvorenjima antitelo vezuje PSMA sa konstantom asocijacije (Ka) najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10<4>, 10<5>ili 10<6>puta većom od konstante asocijacije antitela za BSA, kada se meri u fiziološkim uslovima. Antitela pronalaska mogu vezati PSMA sa visokim afinitetom.

[0035] Na primer, u nekim otelotvorenjima antitelo može vezati PSMA sa KDjednakom ili manjom od oko 10<-6>M, kao što je 1 x 10<-6>, 10<-7>, 10<-8>, 10<-9>,10<-10>, 10<-11>, 10<-12>, 10<-13>ili 10<-14>.

[0036] Kao što se ovde koristi, PSMA se odnosi na membranski antigen specifičan za prostatu. U jednom otelotvorenju, PSMA polipeptid odgovara pristupu Genbank br. AAA60209, verzija br. AAA60209.1 GI:190664, datum zapisa ažuriranja: 23. Jun 2010, 08:48. U jednom otelotvorenju, PSMA polipeptid odgovara pristupu Genbank br. M99487, verzija br. M99487.1 GI:190663, datum zapisa ažuriranja: 23. Jun 2010, 08:48.

[0037] “Fragmenti antitela” obuhvataju deo antitela pune dužine, uglavnom regiju koja vezuje antigen ili varijabilnu regiju istih. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab’, F(ab’)2, i scFv fragmente; dijatela; linearna antitela; fragmente proizvedene od strane Fab eksprimujućih biblioteka, antiidiotipska (anti-Id) antitela, CDR (komplementarna određujuća regija), kao i bilo koji od gore navedenih fragmenata za vezivanje epitopa koji se imunospecifično vezuju za ćelijske antigene karcinoma, virusne antigene ili mikrobne antigene, jednolančane molekule antitela; i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela.

[0038] Termin “monoklonsko antitelo”, kako se ovde koristi, odnosi se na antitela dobijena iz populacije u osnovi homogenih antitela, tj. individualna antitela sadrže identičnu populaciju osim u slučaju prirodne pojave mutacija koje mogu biti prisutne u malim količinama. Monoklonska antitela su visoko specifična, usmerena protiv jednog antigenskog mesta. Nadalje, za razliku od pripreme poliklonskih antitela koja uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopa), svako monoklonsko antitelo je usmereno protiv jedne determinante na antigenu. Osim njihove specifičnosti, monoklonska antitela u prednosti su zbog toga što se mogu sintezovati nezagađena drugim antitelima. Modifikator “monoklonsko” ukazuje na karakter antitela kao što je dobijeno iz značajno homogene populacije antitela, i ne treba da se tumači da zahteva proizvodnju antitela bilo kojom posebnom metodom. Na primer, monoklonska antitela korišćena u skladu sa ovim pronalaskom mogu se proizvesti metodom hibridoma koju je prvi opisao Kohler i dr (1975) Nature 256:495, ili se mogu pripremiti metodama rekombinantne DNK (vidi, US 4816567). Monoklonska antitela mogu se izolovati iz biblioteke fag antitela pomoću tehnika opisanih u Clackson i dr (1991) Nature, 352:624-628; Marks i dr (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597 ili iz transgenih miševa koji nose potpuni ljudski sistem imunoglobulina (Lonberg (2008) Curr. Opinion 20(4):450-459).

[0039] Monoklonska antitela ovde specifično uključuju “himerna” antitela u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homologan sa odgovarajućim sekvencama u antitelima dobijenim iz posebnih vrsta ili pripadajućih posebnih klasa ili podklasa antitela, dok je ostatak lanca (lanaca) identičan ili homologan sa, odgovarajućim sekvencama u antitelima dobijenim iz drugih vrsta ili pripadajućih drugih klasa ili podklasa antitela, kao i fragmenata takvih antitela, sve dok oni pokazuju željenu biološku aktivnost (US 4816567; i Morrison i dr (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855). Himerna antitela od interesa ovde uključuju „primatizovana” antitela koja obuhvataju varijabilni domen antigenvezujućih sekvenci poreklom od ne-humanog primata (npr., majmuni starog sveta, bezrepi majmuni, itd) i konstantne regione humanih sekvenci.

[0040] “Netaknuto antitelo” ovde je ono koji sadrži VL i VH domene, kao i lak lanac konstantnog domena (CL) i teški lanac konstantnog domena, CH1, CH2 i CH3. Konstantni domeni mogu biti prirodna sekvenca konstantnih domena (npr. humana prirodna sekvenca konstantnih domena) ili varijanta aminokiselinske sekvence. Netaknuta antitela mogu imati jednu ili više “efektorsku funkciju” koja se odnose na one biološke aktivnosti koje se mogu pripisati u Fc regiji (prirodna sekvenca Fc regije

1

ili aminokiselinska sekvenca varijante Fc regije) antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju C1 q vezujuća; komplementarnu zavisnu citotoksičnost; vezivanje Fc receptora; citotoksičnost koja je posredovana ćelijama i zavisna od antitela (ADCC); fagocitoze; i donju regulaciju receptora na površini ćelije, kao što su receptori B ćelija i BCR.

[0041] Zavisno od aminokiselinske sekvencekonstantnog domena njihovih teških lanaca, netaknuta antitela mogu se dodeliti različitim “klasama”. Postoji pet glavnih klasa netaknutih antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu se dalje podeliti u “podklase” (izotipovi), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama antitela nazivaju se α, δ, ε, γ i µ, respektivno. Podjedinične strukture i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina dobro su poznate.

Izmene antitela

[0042] Ovde obelodanjeno antitelo može biti modifikovano. Na primer, da bi bili manje imunogeni prema ljudskom ispitaniku. Ovo se može postići korišćenjem bilo koje vrste tehnika poznatih u struci. Neke od ovih tehnika su detaljnije opisane u nastavku.

Humanizovanje

[0043] Tehnike za smanjivanje in vivo imunogenosti ne-humanog antitela ili fragmenta antitela uključuju one koje nazivamo “humanizovanjem”.

[0044] “Humanizovano antitelo” odnosi se na polipeptid koji se sastoji od najmanje jednog dela modifikovane varijabilne regije ljudskog antitela, gde je deo varijabilne regije, poželjno deo značajno manji od netaknutog humanog varijabilnog domena, supstituisan odgovarajućom sekvencom iz nehumanih vrsta, gde je da modifikovana varijabilna regija povezana sa bar jednim drugim delom drugog proteina, poželjno konstantnom regijom humanog antitela. Izraz “humanizovana antitela” obuhvata humana antitela kod kojih su jedna ili više regija koja određuje komplementarnost (“CDR”) ostataka aminokiselina i/ili jedna ili više okvirnih regija (“FW” ili “FR”) aminokiselinskih ostataka supstituisani aminokiselinski ostaci sa analognih mesta kod glodara ili drugih nehumanih antitela. Izraz “Humanizovano antitelo” takođe uključuje varijantu imunoglobulinske aminokiselinske sekvence ili njen fragment koji sadrži FR koji ima značajnu aminokiselinsku sekvencu humanog imunoglobulina, i CDR koji ima značajnu aminokiselinsku sekvencu nehumanog imunoglobulina.

[0045] “Humanizovani” oblici nehumanih (npr. mišjih) antitela su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvencu dobijenu iz nehumanog imunoglobulina. Ili, gledano na drugi način, humanizovano antitelo je humano antitelo koje sadrži sekvence odabrane od nehumanih (npr. mišjih) antitela umesto ljudskih sekvenci. Humanizovano antitelo može uključivati konzervativne supstitucije aminokiselina ili neprirodne ostatke od iste ili različite vrste, koje bitno ne menja svoje vezivanje i/ili biološku aktivnost. Takva antitela su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvencu dobijenu iz nehumanih imunoglobulina.

[0046] Postoji niz tehnika humanizovanja, uključujući 'CDR presađivanje', 'vođeni izbor', 'deimunizaciju', 'ponovno izlaženje na površinu' (takođe poznato kao 'furniranje'), 'kompozitna antitela', 'Human String Content Optimisation' i preslaganje okvira.

CRD presađivanje

[0047] U ovoj tehnici, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (antitelo primalac) u kojima su ostaci od komplementarno determinišuće regije (CDR) iz antitela primaoca zamenjeni ostacima iz CDR nehumanih vrsta (antitelo donor) kao što su miš, pacov, kamila, govedo, koza, ili zec, i koje ima željena svojstva (u praksi, nehumani CDR-ovi se “presađuju” na humane). U nekim slučajevima, okvirne regije (FR) ostataka humanog imunoglobulina zamenjene su odgovarajućim nehumanim ostacima (to se može dogoditi kada, na primer, određeni FR ostatak ima značajno dejstvo na vezivanje antigena).

[0048] Dalje, humanizovana antitela mogu sadržati ostatke koje se ne nalaze ni u antitelu primaocu, niti u uvezenim CDR ili okvirnim sekvenci. Te promene su napravljene kako bi se dodatno rafinisale i maksimizovale performanse antitela. Stoga, uglavnom, humanizovano antitelo sadržaće sve od barem jednog, a u jednom aspektu dva varijabilna domena, u kojima sve ili sve hipervarijabilne petlje odgovaraju onima nehumanog imunoglobulina i sve ili gotovo sve FR regije su one od sekvenci humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo će po izboru sadržati barem deo imunoglobulina konstantne regije (Fc), ili ono od humanog imunoglobulina.

Vođeni izbor

[0049] Metoda sadrži kombinovanje VHi VLdomena date specifičnosti nehumanog antitela za određeni epitop sa humanim VHili VLbibliotekama i specifične humane V domene izabrane protiv željenog antigena. Ovako odabran humani VH zatim se kombinuje sa VL bibliotekom kako bi se dobila potpuno humana VhxVL kombinacija. Metoda je opisana u Nature Biotechnology (N.Y.) 12, (1994) 899-903.

Kompozitna antitela

[0050] U ovoj metodi, dva ili više segmenata aminokiselinske sekvence iz humanih antitela kombinuju se u konačne molekule antitela. Oni su konstruisani kombinovanjem više ljudskih VL segmenata sekvenci u kombinacijama koje ograničavaju ili izbegavaju humane T ćelijske epitope u finalnim V regijama kompozitnih antitela. Tamo gde je potrebno, T ćelijski epitopi su ograničeni ili izbegnuti zamenom segmenata V regija što doprinosi ili kodira T ćelijske epitope sa alternativnim segmentima koji izbegavaju T ćelijske epitope. Ova metoda je opisana u US 2008/0206239 A1.

Deimunizacija

[0051] Ova metoda uključuje uklanjanje humanih (ili od druge vrste) T-ćelijskih epitopa iz V regija terapeutskog antitela (ili drugog molekula). Terapeutska antitela sekvence V-regije analiziraju se na prisutnost MHC vezivnih motifa klase II-, na primer, poređenje sa bazama podataka MHC-vezujućih motifa (kao što su baza podataka “motifa” hostovana na www.wehi.edu.au). Alternativno, MHC vezivni motifi klase II mogu biti identifikovani računarskim metodama prepletanja kao što su oni osmišljeni od strane Altuvia i dr. J. Mol. Biol.249244-250 (1995)); u ovim metodama, uzastopno preklapanje peptida iz sekvenci V-regiona testira se za njihovu energije vezivanja za proteine MHC klase II. Ovi podaci mogu zatim biti kombinovani sa informacijom na drugim svojstvima sekvence koja se odnose na uspešno predstavljene peptide, kao što su amfipaticitet, Rotbardovi motifi i mesta prekidanja za catepsin B i druge enzime za obradu.

[0052] Jednom kad se potencijalni T-ćelijski epitpoi druge vrste (npr. humani) identifikuju, oni se eliminišu izmenom jedne ili više aminokiselina. Modifikovane aminokiseline su obično unutar samog T-ćelijskog epitopa, ali mogu biti u susedstvu epitopa u smislu primarne ili sekundarne strukture proteina (i zbog toga ne mogu biti jedni pored drugih u primarnoj strukturi). Najtipičnije, promena se postiže pomoću supstitucije, ali u nekim slučajevima biće prikladnije dodavanje ili uklanjanje aminokiseline.

[0053] Sve promene mogu se postići rekombinantnom DNK tehnologijom, tako da se finalni molekul može pripremiti eksprimiranjem iz rekombinantnog domaćina koristeći dobro poznate metode kao što je „Mestom usmerena mutageneza”. Međutim, upotreba hemije proteina ili bilo kojih drugim sredstava molekularne izmene takođe je moguće.

Ponovno izlaganje

[0054] Ova metoda uključuje:

1. (a) određivanje konformacijske strukture varijabilne regije nehumanog (npr. od glodara) antitela (ili njegov fragment) izgradnjom trodimenzionalnog modela nehumanog antitela varijabilne regije;

2. (b) generisanje poravnanja sekvenci pomoću relativne raspodele pristupačnosti sa rendgenskih kristalografskih struktura dovoljnog broja nehumanih i humanih antitela varijabilne regije teškog i lakog lanca, čime se dobija niz položaja teških i lakih lanaca gde su položaji poravnanja jednaki u 98% od dovoljnog broja nehumanih antitela teškog i lakog lanca;

3. (c) za definisanje nehumanog antitela koji treba se humanizuje, set površina teškog i lakog lanca izlaže aminokiselinske ostatke koristeći set okvirnih položaja generisan u koraku (b); 4. (d) određivanje aminokiselinskih sekvenci iz humanog antitela, set teškog i lakog lanca na površini izlaže aminokiselinske ostatke koji su najbliže identični setu površinski izloženih aminokiselinskih ostataka koji su definisani u koraku (c), pri čemu su teški i laki lanac od humanog antitelo, i jesu ili nisu prirodno upareni;

5. (e) supstituisanje, u aminokiselinskoj sekvenci ne-humanog antitela koje treba da se humanizuje, set teškog i lakog lanca na površini izlaže aminokiselinske ostataka definisane u koraku (c) sa setom teškog i lakog lanca koji na površini izlaže aminokiselinske ostatke identifikovane u koraku (d);

6. (f) konstruisanje trodimenzionalnog modela varijabilne regije ne-humanog antitela dobijenog u supstituisanju navedenom u koraku (e);

7. (g) identifikovanje, poređenjem trodimenzionalnog modela konstruisanog u koracima (a) i (f), bilo koji aminokiselinski ostatak iz setova identifikovanih u koracima (c) ili (d), koji su unutar 5 Angstrema bilo kog atoma bilo kog ostatka u regijama koje određuju komplementarnost iz nehumanog antitela koje treba da se humanizuje; i

8. (h) menjanje bilo kojih ostataka utvrđenih u koraku (g) od humanog do izvornog nehumanog aminokiselinskog ostatka kako bi se time definisao set površinski izloženih aminokiselinskih ostataka za humanizovanje nehumanog antitela; uz uslov da korak (a) ne mora prvi da se izvede, ali mora da se izvede pre koraka (g).

Superhumanizacija

[0055] Metoda upoređuje nehumane sekvence sa funkcionalnim humanih embrionskim repertoarom gena. Izabrani su humani geni koji kodiraju kanonske strukture identične ili blisko povezane sa nehumanim sekvencama. Kao FR donori odabrani su ti humani geni sa najvišom homologijom unutar CDR-a. Konačno, nehumane CDR se umeću u ove humane FR. Ova metoda opisana je u patentu WO 2005/079479 A2.

Human String Content optimizacija

[0056] Ova metoda upoređuje nehumanu (npr. mišju) sekvencu sa repertoarom humanih embrionskih gena, a razlike su označene kao Human String Content (HSC) koji kvantifikuje sekvencu na nivou potencijalnih MHC/T-ćelijskih epitopa. Ciljana sekvenca se zatim humanizuje povećavanjem svoje HSC, pre nego pomoću globalne mere identiteta, kako bi se generisalo više različitih humanih varijanti (opisano u Molecular Immunology, 44, (2007) 1986-1998).

Preslaganje okvira

[0057] CDR-ovi iz nehumanog antitela su fuzionisani u okvir as cDNK bibliotekom koja obuhvata sve poznate teške i lake lance humanih okvira embrionskih gena. Humanizovana antitela su zatim odabrana po, npr., ispiranju faga prikazane biblioteke antitela. To je opisano u Metodama 36, 43-60 (2005).

Konjugati

[0058] Predmetni pronalazak obezbeđuje konjugate koji sadrže PBD jedinjenje povezano za antitelo putem Vezne Jedinice.

[0059] Veznici ADC-a poželjno sprečavaju agregaciju ADC molekula i zadržavaju ADC slobodno rastvorljiv u vodenim okruženjima i u monomernom stanju.

[0060] Veznici ADC-a su poželjno stabilni ekstracelularno. Pre transporta i isporuke u ćeliju, konjugat antitela i leka (ADC) poželjno je stabilan i ostaje netaknut, tj. antitelo ostaje povezano sa funkcionalnom grupom leka. Veznici su stabilni izvan ciljane ćelije i mogu se otcepiti pri nekoj efikasnoj brzini unutar ćelije. Delotvorni veznik će: (i) održavati specifična svojstva vezivanja antitela; (ii) omogućiti intraćelijsku isporuku konjugata ili leka; (iii) ostati stabilan i netaknut, odnosno neće se otcepiti, dok konjugat nije isporučen ili transportovan do svog ciljanog mesta; i (iv) zadržati citotoksičnu delotvornost ubijanja ćelija ili citostatičku delotvornost funkcionalne grupe leka PBD. Stabilnost ADC može se meriti standardnim analitičkim tehnikama kao što su masena spektroskopija, HPLC i tehnika LC/MS razdvajanja/analize.

1

Otelotvorenja

[0061] Otelotvorenja predmetnog pronalaska obuhvataju ConjA kako je antitelo definisano gore.

[0062] Otelotvorenja predmetnog pronalaska obuhvataju ConjB kako je antitelo definisano gore.

[0063] Otelotvorenja predmetnog pronalaska obuhvataju ConjC kako je antitelo definisano gore.

[0064] Otelotvorenja predmetnog pronalaska obuhvataju ConjD kako je antitelo definisano gore.

[0065] Otelotvorenja predmetnog pronalaska obuhvataju ConjE kako je antitelo definisano gore.

Unos leka

[0066] Unos leka je prosečan broj PBD lekova po antitelu., npr., antitela. Tamo gde su jedinjenja iz ovog pronalaska vezana na cisteine, unos leka može varirati od 1 do 8 lekova (DL) po antitelu, odnosno gde su 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 i 8 grupe lekova su kovalentno vezane na antitelo. Sastavi konjugata uključuju zbirke antitela konjugovana sa rasponom lekova, od 1 do 8.

[0067] Prosečan broj lekova po antitelu u pripremi ADC iz reakcije konjugacije može se okarakterisati uobičajenim načinima, kao što su UV, HPLC obrnute faze, HIC, masovna spektroskopija, ELISA test i elektroforeza. Kvantitativna raspodela ADC po p takođe može biti određena. Koristeći ELISA, srednja vrednost p može se odrediti u određenoj pripremi ADC (Hamblett i dr (2004) Clin. Cancer Res.

10:7063-7070; Sanderson i dr (2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852). Međutim, raspodela p (lek) vrednosti se ne primećuje po antitelo-antigen vezivanju i ograničenjima detekcije ELISA. Takođe, ELISA test za detektovanje konjugat antitela i leka ne određuje gde su grupe lekova vezane na antitela, kao što su fragmenti teškog ili lakog lanca, ili određenih aminokiselinski ostaci. U nekim slučajevima, odvajanje, pročišćavanje i karakterisanje homogenog ADC, gde je p određena vrednost od ADC sa drugim unošenjima leka može se postići sredstvima, kao što su obrnuta faza HPLC ili elektroforeza. Takve tehnike mogu se primeniti i na druge tipove konjugata.

[0068] Za neke konjugate antitela i leka, p može biti ograničen brojem mesta za spajanje na antitelu. Na primer, antitelo može imati samo jednu ili nekoliko cistein tiolnih grupa, ili može imati samo jednu ili nekoliko dovoljno reaktivnih tiolnih grupa kroz koje veznik može biti povezan. Veće unošenje leka i, na primer p> 5, može izazvati agregaciju, nerastvorljivost, toksičnost, ili gubitak ćelijske propustljivosti određenih konjugata antitelo-lek.

[0069] Tipično, manje od teoretskog maksimuma, delovi lekova konjugovaće se sa antitelima za vreme reakcije konjugacije. Antitelo može sadržati, na primer, mnogo lizinskih ostataka koji ne reaguju sa posrednikom veznika leka (DL) ili veznik reagensa. Samo najviše reaktivne lizinske grupe mogu reagovati sa amin-reaktivnim veznik reagensima. Takođe, samo vrlo reaktivne cisteinske tiolne grupe mogu reagovati sa tiol-reaktivnim veznik reagensima. Generalno, antitela ne sadrže mnogo, ako uopšte, slobodnih i reaktivnih cisteinskih tiolnih grupa koja mogu biti povezane sa delom leka. Većina cistein tiol ostataka u jedinjenjima antitela postoje kao disulfidni mostovi i moraju se redukovati koristeći redukcioni agens kao što je ditiotreitol (DTT) i TCEP, delimično ili potpuno pod redukcijskim uslovima. Punjenje (lek/antitelo odnos) ADC-a može se kontrolisati na nekoliko različitih načina, uključujući: (i) ograničavanjem molarnog viška posrednika veznika leka (DL) ili vezivnog reagensa u odnosu na antitela, (ii) ograničavajući vreme ili temperaturu konjugacione reakcije, i (iii) delimično ili potpuno ograničavanje reduktivnih uslova za modifikaciju cisteinskoh tiola.

[0070] Pojedina antitela moraju redukovati međulančane disulfide, odnosno cisteinske mostove. Antitela mogu da se naprave reaktivna za konjugaciju sa vezivnim reagensima obradom redukcionim sredstvom kao što je DTT (ditiotreitol). Svaki cisteinski most će na taj način formirati, teoretski, dva reaktivna tiolna nukleofila. Dodatne nukleofilne grupe mogu se uvesti u reakciju antitela preko lizina as 2-iminotiolanom (Trautov reagens), što dovodi do pretvaranja amina u tiol. Reaktivne tiolne grupe mogu biti uvedene u antitela (ili njegove fragmente) inženjeringom jednim, dva, tri, četiri ili više cisteinskih ostataka (na primer, pripremanjem mutantnih antitela koja sadrže jedan ili više neprirodni cisteinski ostatak aminokiselina). US 7521541 podučava inženjering antitela uvođenjem reaktivnih cisteinskih aminokiselina.

[0071] Cisteinske aminokiseline mogu se sintezovati na reaktivnim mestima u antitelima, i koji ne obrazuju intra ili intermolekularne disulfidne veze (Junutula, i dr., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan i dr (2009) Blood 114(13):2721-2729; US 7521541; US 7723485; WO2009/052249). Modifikovani cistein tiol može reagovati sa vezivnim reagensom ili lek-vezujućim reagensom iz ovog pronalaska, koje imaju tiol-reaktivne elektrofilne grupe kao što su maleimidi ili alfa-halo amidi da obrazuju ADC sa cisteinskim sintetičkim antitelom i PBD delom leka. Punjenje leka u konjugatu može se unapred odrediti, kontrolisati, i znati. Doziranje leka se može kontrolisati, jer modifikovane cisteinske tiolne grupe reaguju sa tiol-reaktivnim vezivnih reagensom ili lek-vezujućim reagensom sa visokim prinosom. Inženjering IgG antitela, kako bi se uvela cisteinska aminokiselina supstitucijom na jednom mestu teškog ili lakog lanca, daje dva nova cisteina na simetričnom antitelu. Punjenje leka u blizini 2 može se postići sa skoro potpunom homogenošću konjugacija ADC proizvoda.

[0072] Alternativno, konjugacija specifična za lokaciju može se postići projektovanim antitelima koja sadrže neprirodne aminokiseline u njihovim teškim i/ili lakim lancima kao što opisuje Axup i dr. ((2012), Proc Natl Acad Sci U S A.109(40):16101-16116). Neprirodne aminokiseline pružaju dodatnu prednost da ortogonalna hemija može korišćena da poveže veznik reagens i lek.

[0073] Kada više nukleofilnih ili elektrofilnih grupa antitela reaguje sa lek-veznik posrednikom, ili vezivnim reagensom praćenim reagensom dela leka, tada je dobijeni proizvod smesa ADC jedinjenja sa raspodelom delova leka pripojenih na antitelo, npr.1, 2, 3, itd. Metode tečne hromatografije, kao što su polimerne reverzne faze (PLRP) i hidrofobna interakcija (HIC), mogu razdvojiti jedinjenja u mešavini pomoću vrednosti unošenja leka. Pripreme ADC sa jednim doziranjem leka (p) mogu se izolovati, međutim, te pojedinačne vrednosti unošenja ADC još uvek mogu biti heterogene smese zato to delovi leka mogu biti pripojeni, pomoću veznika, za različita mesta na antitelu.

[0074] Stoga sastavi konjugata antitela i leka pronalaska obuhvataju mešavine konjugovanih konjugat antitela i leka jedinjenja gde antitelo ima jedan ili više PBD delova leka, gde delo leka mogu biti pripojeni za antitelo na različitim ostacima aminokiselina.

[0075] U jednom otelotvorenju, prosečni broj dimer pirolobenzodiazepin grupa po antitelu je u rasponu izabranom od 1 do 8, 2 do 8, 2 do 6, od 2 do 4, i 4 do 8.

[0076] U nekim otelotvorenjima, postoji jedna dimer pirolobenzodiazepin grupa po antitelu.

Obuhvatanje drugih oblika

[0077] Osim ako nije drugačije navedeno, gore obuhvaćeni su dobro poznati jonski, slani, solvatni i zaštićeni oblici tih supstituenata. Na primer, navođenje karboksilne kiseline (-COOH), takođe uključuje anjonski (karboksilni) oblik (-COO-), so ili solvat, kao i konvencionalne zaštićene oblike. Slično tome, pozivanje na amino grupu obuhvata protonirani oblik (-N<+>HR<1>R<2>), so ili solvat amino grupe, na primer, hidrohloridnu so, kao i konvencionalne zaštićene oblike amino grupa. Slično tome, pozivanje na hidroksilnu grupu uključuje anjonski oblik (-O-), so ili solvat, kao i konvencionalne zaštićene oblike.

Soli

[0078] Može biti pogodno ili poželjno pripremanje, pročišćavanje, i/ili obrada odgovarajuće soli aktivnog jedinjenja, na primer, farmaceutski prihvatljive soli. Primeri farmaceutski prihvatljivih soli razmatrani su u Berge, i dr., J. Pharm. Sci., 66, 1-19 (1977).

[0079] Na primer, ako je jedinjenje anjonsko, ili ima funkcionalnu grupu koja može biti anjonska (na primer COOH može biti -COO-), onda so može biti formirana sa odgovarajućim katjonom. Primeri pogodnih neorganskih katjona obuhvataju, ali nisu ograničeni na jone alkalnih metala kao što su Na<+>i K<+>, katjoni zemnoalkalnih metala kao što su Ca<2+>i Mg<2+>i drugi katjoni kao što je Al<+3>. Primeri pogodnih organskih katjona obuhvataju, ali nisu ograničeni na jon aluminijuma (tj. NH4<+>) i supstituisane jone amonijuma (npr. NH3R<+>, NH2R2<+>, NHR3<+>, NR4<+>). Primeri nekih pogodnih supstituisanih amonijum jona su oni dobijeni iz: etilamina, dietilamina, dicikloheksilamina, trietilamina, butilamina, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina, benzilamina, fenilbenzilamina, holina, meglumina, i trometamina, kao i aminokiselina, kao što su lizin i arginin. Primer zajedničkog kvaternarnog amonijum jona je N(CH3)4<+>.

1

[0080] Ako je jedinjenje katjonsko, ili ima funkcionalnu grupu koja može biti katjonska (na primer -NH2može biti -NH3<+>), onda so može biti formirana sa odgovarajućim anjonom. Primeri prikladnih neorganskih anjona uključuju, ali nisu ograničeni na one koji su izvedeni iz sledećih neorganskih kiselina: hlorovodična, bromovodična, jodovodična, sumporna, sumporasta, azotna, azotasta, fosforna i fosforasta.

[0081] Primeri prikladnih organskih anjona uključuju, ali nisu ograničeni na, one dobijene iz sledećih organskih kiselina: 2-acetioksibenzoična, octena, askorbinska, asparaginska, benzojeva, kamforsumporna, cinamična, limunska, edetična, etandisulfonska, etansulfonska, gluceptonska, glukonska, glutaminska, glikolna, hidroksimaleinska, hidroksinaftalen karboksilna, izetionska, mlečna, laktobionska, laurinska, maleinska, jabučna, metansulfonska, mucinska, oleinska, oksalna, palmitinska, pamoična, pantotenska, feniloctena, fenilsulfonska, propionska, piruvinska, salicilna, stearinska, jantarna, sulfanilna, vinska, toluensulfonska, trifluoroctena kiselina i valerijanska. Primeri pogodnih polimernih organskih anjona uključuju, ali nisu ograničeni na one dobijene iz sledećih polimernih kiselina: taninske kiseline, karboksimetil celuloze.

Solvati

[0082] To može biti zgodno ili poželjno dobijanje, pročišćavanje, i/ili obrada odgovarajućeg solvat aktivnog jedinjenja. Termin “solvat” ovde se koristi u konvencionalnom smislu i odnosi se na kompleks rastvora (npr. aktivno jedinjenje, so aktivnog jedinjenja) i rastvarača. Ako je rastvarač voda, solvat se može pogodno nazvati kao hidrat, na primer, mono-hidrat, di-hidrat, tri-hidrat, itd.

[0083] Ovaj pronalazak uključuje jedinjenja gde se rastvarač dodaje preko iminske veze PBD grupe, koja je prikazana u nastavku, gde je rastvarač voda ili alkohol (R<A>OH, gde R<A>predstavlja C1-4alkil):

Ovi oblici mogu se nazvati karbinolamini i karbinolamini eterski oblici PBD (kao što je opisano u delu koji se odnosi na R<10>gore). Balans tih ravnoteža zavisi od uslovima u kojima se nalaze jedinjenja, kao i prirodi samog dela.

[0084] Ova određena jedinjenja mogu se izolovati u čvrstom obliku, na primer, liofilizacijom.

Izomeri

[0085] Određena jedinjenja pronalaska mogu postojati u jednom ili više geometrijskih, optičkih, enantiomernih, diasteriomernih, epimernih, atropični, stereoizomernih, tautomernih, konformacijskih ili anomernih oblika, uključujući, ali ne ograničavajući na, cis- i trans-oblike; E- i Z-oblike; c-, t-, i R-oblike; endo- i egzo-oblike; R-, S-, i mezo-oblike; D- i L-oblike; d- i I-oblike; (+) I (-) oblike; keto-, enol-, i enolat-oblike; sinhrone i anti-oblike; sinlinalne- i antiklinalne oblike; α i β-oblike; aksijalne i ekvatorijalne oblkei; boat-, chair-, twist-, envelope-, i halfchair-oblike; i njihove kombinacije, u daljem tekstu kolektivno se nazivaju “izomeri” (ili “izomerni oblici”).

[0086] Termin “hiralan” odnosi se na molekule koji imaju svojstvo da se ne mogu preklopiti sa svojom odrazom, dok se termin “ahiralan” odnosi na molekule koji se mogu preklopiti sa svojom odrazom.

[0087] Termin “stereoizomeri” odnosi se na jedinjenja koja imaju istu hemijsku strukturu ali se razlikuju po rasporedu atoma ili grupa u prostoru.

[0088] “Dijastereomer” se odnosi na stereoizomer sa dva ili više hiralna centra, i čiji molekuli nisu odrazi jedan prema drugom. Dijastereomeri imaju različita fizikalna svojstva, npr. tačku topljenja, tačku ključanja, spektralna svojstva i reaktivnost. Smese dijastereomera mogu se razdvojiti analitičkim metodama kao što je elektroforeza i hromatografija.

[0089] “Enantiomeri” se odnose na dva stereoizomera spoja koji su odrazu jedan prema drugom.

1

[0090] Stereohemijske definicije i konvencije korišćene ovde u principu slede S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; iEliel, E. and Wilen, S., “Stereochemistry of Organic Compounds”, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994. Jedinjenja iz ovog pronalaska mogu sadržati asimetrične ili hiralne centre, te stoga postoje u različitim stereoizomernim oblicima. Namera je da svi stereoizomerni oblici jedinjenja ovog pronalaska, uključujući, ali ne ograničavajući se na, dijastereomere, enantiomere i atropizomere, kao i njihove smese, kao što su racemične smese, čine deo ovog pronalaska. Mnoga organska jedinjenja postoje u optički aktivnim oblicima, tj., oni imaju sposobnost da rotiraju ravan polarizovane svetlosti. U opisu optički aktivnog jedinjenja, prefiksi D i L, ili R i S koriste se da označe apsolutnu konfiguraciju molekula prema njihovom hiralnom centru(ima). Prefiksi d i I ili (+) i (-) koriste se da označe rotaciju ravni polariziranog svetla uzrokovanu jedinjenjem, gde (-) ili I znače da jedinjenje zakreće ravan ulevo. Jedinjenje sa prefiksom (+) ili d zakreće udesno. Za datu hemijsku strukturu, ti stereoizomeri su identični osim što su odrazi jedan prema drugom. Specifični stereoizomer može se takođe navesti i kao enantiomer, a smesa takvih izomera često se zove enantiomerna smesa.50:50 smesa enetiomera naziva se racemična smesa ili racemat, do kog može doći kad nije bilo stereoselektivnosti ili sterospecifičnosti u hemijskoj reakciji ili procesu. Pojmovi “racemična smesa” i “racemat” odnosi se na ekvimolarnu smesu dve vrsta, lišene optičke aktivnosti.

[0091] Treba voditi računa da, osim kako je opisano u nastavku za tautomerne oblike, posebno izuzeti iz termina “izomer”, kako se ovde koristi, su strukturalni (ili sastavni) izomeri (tj. izomeri koji se razlikuju po vezama između atoma više nego po samoj poziciji atoma u prostoru). Na primer, navođenje metoksi grupe,-OCH3, ne treba tumačiti kao referencu za svoj strukturni izomeri, hidroksimetil grupu, -CH2OH. Slično, upućivanje na ortohlorofenil ne treba tumačiti kao referencu za svoj strukturni izomera, meta-hlorofeml. Međutim, navođenje klasa struktura može uključivati i strukturno izomerne oblike koji potpadaju pod tu klasu (na primer C1-7 alkil uključuje n-propil i izo-propil, butil uključuje n-, izo-, sek- i terc-butil; metoksifenil uključuje orto-, meta-, i para-metoksifenil).

[0092] Gore navedena isključenja ne odnose se na tautomerne oblike, na primer, keto-, enol-, i enolatoblike, kao kod, na primer, sledećih tautomernih parova: keto/enol (prikazani u nastavku), imin/enamin, amid/imino alkohol, amidin/amidin, nitrozo/oksim, tioketon/enetiol, N-nitrozo/hyroxyazo, i nitro/acinitro.

[0093] Izraz “tautomer” ili “tautomerni oblik” odnosi se na strukturne izomere različitih energija koji se mogu međusobno konvertovati pomoću niske energetske barijere. Na primer, protonski tautomeri (takođe poznati i kao prototropni tautomeri) uključuju međusobne konverzije putem migracije protona, kao što su keto-enol i imin-enamin izomerizacije. Valentni tautomeri uključuju međusobno konvertovanje pomoću reorganizacije nekih od elektrona veze.

[0094] Treba voditi računa da su posebno obuhvaćeni u pojmom “izomer” jedinjenja sa jednim ili više izotopskom zamenom. Na primer, H može biti u bilo kojem izotopskom obliku, uključujući<1>H,<2>H (D), i<3>H (T); C može biti u bilo kojem izotopskom obliku, uključujući i<12>C,<13>C, i<14>C; O može biti u bilo kojem izotopskom obliku, uključujući i<16>O i<18>O; i slično.

[0095] Primeri izotopa koji mogu biti uključeni u jedinjenja pronalaska obuhvataju izotope vodonika, ugljenika, azota, kiseonika, fosfora, fluora i hlora, kao što su<2>H (deuterijum, D),<3>H (tricijum),<11>C,<13>C,<14>C,<15>N,<18>F,<31>P,<32>P,<35>S,<36>Cl, i<125>I. Različita izotopno obeležena jedinjenja prema ovom pronalasku su, na primer, ona u koja su ugrađeni radioaktivni izotopi kao što su 3H, 13C i 14C. Takva izotopno obeležena jedinjenja mogu biti korisna u studijama metabolizma, studijama kinetike reakcija, za tehnike detekcije ili slikanja, kao što je pozitron emisijska tomografija (PET) i kompjuterizovana tomografija emisijom jednog fotona (SPECT), uključujući lekove ili distribucije supstrata u tkivu, ili pri radioaktivnom lečenju pacijenata. Deuterijumom obeležena ili supstituisana terapeutska jedinjenja iz pronalaska mogu imati poboljšana DMPK (metabolizam i farmakokinetika leka) svojstva, koja se odnose na distribuciju, metabolizam, i lučenje (ADME). Supstitucija s težim izotopima kao što je

1

deuterijum može omogućiti određene terapijske prednosti koje proizlaze iz veće metaboličke stabilnosti, na primer povećanje in vivo poluživota ili smanjenje potrebne doze. 18F obeleženo jedinjenje može biti korisno za PET i SPECT ispitivanja. Izotopno obeležena jedinjenja ovog pronalaska i njihovi predlekovi mogu se uglavnom pripremiti sprovođenjem metoda opisanih u šemama i u primerima i dobijanjima u nastavku, zamenom lako dostupnih izotopno obeleženih reagensa sa neizotopno obeleženim reagensom. Nadalje, supstitucija težim izotopima, posebno deuterijumom (tj.2H ili D), može obezbediti određene terapeutske prednosti koje proizlaze iz veće metaboličke stabilnosti, na primer povećanje in vivo poluživota ili smanjenje potrebne doze ili poboljšanje terapeutskog indeksa. Podrazumeva se da se deuterijum u ovom kontekstu smatra kao supstituent. Koncentracija ovakvog težeg izotopom, posebno deuterijuma, može se definisati pomoću faktora obogaćenja izotopa. U jedinjenjima iz ovog pronalaska, bilo koji atom, koji nije označen kao posebno određeni izotop, podrazumeva se da predstavlja bilo koji stabilan izotop tog atoma.

[0096] Osim ako nije drugačije navedeno, referenca na određeno jedinjenje obuhvata sve takve izomerne oblike, uključujući (u celosti ili delimično) racemske i druge njihove smese. Metode za dobijanje (na primer asimetrična sinteza) i odvajanje (na primer, frakcijskom kristalizacijom i hromatografskim metodama) takvih izomernih oblika su ili poznati u struci ili se lako dobijaju prilagođavanjem na način prikazan ovde, ili poznatim metodama, na poznat način.

Biološka aktivnost

In vitro testiranje ćelijske proliferacije

[0097] Generalno, citotoksična ili citostatična aktivnost konjugata antitela i leka (ADC) merena je pomoću: izlaganja onih ćelija sisara koje imaju proteinske receptore za antitela za ADC u okruženju ćelijske kulture; uzgajanjem ćelija u trajanju od oko 6 sati do oko 5 dana; i merenju održivosti ćelija. In vitro testovi bazirani na ćelijama koriste se za merenje održivosti (proliferacije), citotoksičnosti i indukovanja apoptoze (aktivacije kaspaze) ADC-a pronalaska.

[0098] Aktivnost in vitro konjugata antitela i leka može se meriti u testu proliferacije ćelija. CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay tržišno je dostupan (Promega Corp., Madison, WI), homogen metoda testiranja koja se bazira na rekombinantnoj ekspresiji Coleoptera luciferaze (Patent SAD br 5583024; 5674713 and 5700670). Ovaj test proliferacija ćelija određuje broj živih ćelija u kulturi na temelju kvantifikacije prisutnog ATP, pokazatelj je metabolički aktivnih ćelija (Crouch i dr (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88; US 6602677). CellTiterGlo® Ispitivanje je sproveden u formatu sa 96 udubljenja, što je prikladno za automatsku trijažu sa visokim protokom (HTS) (Cree i dr (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404). Homogena metoda ispitivanja uključuje dodavanje jednog reagensa (CellTited-Glo® reagen) direktno u ćelije uzgajene u serumom obogaćenom okruženju. Ćelijsko pranje, uklanjanje srednjeg i vištestrukih pipetnih koraka nisu potrebni. Sistem prepoznaje najmanje 15 ćelija/udubljenja, u formatu sa 384 udubljenja unutar 10 minuta nakon dodavanja reagensa i mešanja. Ćelije mogu biti neprekidno tretirane sa ADC, ili mogu biti tretirane i odvojeno od ADC. Uglavnom, ćelije tretirane kratko, tj.3 sata, pokazale su istu potentnost učinaka kao kontinuirano tretirane ćelije.

[0099] Homogen “dodatak-mešavina-mera” format dovodi do razgradnje ćelija i stvaranja luminescentnog signala proporcionalnog količini prisutnog ATP. Količina ATP direktno je proporcionalna broju ćelija u kulturi. CellTitler-Glo® Assay stvara „sjajni” luminescentni signal proizveden luciferaznom reakcijom, koji ima vreme poluraspada po pravilu veće od pet sati, zavisno od tipa ćelije i okruženja koje se koristi. Održive ćelije se izražavaju u relativnim jedinicama luminiscencije (RLU). Supstrat, Beetle Luciferin, oksidativno je dekarboksiliran pomoću rekombinantne luciferaze svitca sa pratećom konverzijom ATP-a u AMP i generisanje fotona.

[0100] Aktivnost in vitro antitelo-lek konjugata može se takođe meriti testom citotoksičnosti. Uzgajane adherentne ćelije isprane PBS-om, odvojene tripsinom, razređene u kompletnom okruženju, koje sadrži 10% FCS, centrifugirane, ponovno suspendovane u svežoj podlozi i prebrojane hemocitometrom. Suspendovane kulture broje se direktno. Monodisperzne ćelijske suspenzije prikladne za brojanje mogu zahtevati agitaciju suspenzije ponovljenom aspiracijom kako bi se razbili ćelijski grumeni.

1

[0101] Suspenzija ćelija razređuje se na željenu gustinu sejanja i deli (100µl po udubljenju) u crne ploče sa 96 udubljenja. Ploče sa adherentnim ćelijskim linijama inkubiraju se preko noći kako bi se omogućilo prianjanje. Suspenzije ćelijskih kultura mogu se koristiti na dan sejanja.

[0102] Uobičajen rastvor (1 ml) ADC (20µg/ml), napravljen je u odgovarajućem okruženju za ćelijsku kulturu. Serijska 10-ostruka razređivanja uobičajenog ADC prave se u 15 ml epruvetama za centrifugu pomoću serijskog transfera 100µl do 900µl okruženja ćelijske kulture.

[0103] Četiri ponovljena udubljenja svakog razređenja ADC (100µl) dele se na 96 izvornih crnih ploča, prethodno postavljenih sa ćelijskom suspenzijom (100µl), što rezultuje u konačnoj zapremini od 200µl. Kontrolna udubljenja dobijaju okruženja ćelijske kulture (100µl).

[0104] Ako je vreme udvostručavanja ćelijske linije veće od 30 sati, ADC inkubacija je u trajanju od 5 dana, inače se sprovodi inkubacija od četiri dana.

[0105] Na kraju perioda inkubacije, ćelijska održivost procenjuje se Alamar Blue analizom. AlamarBlue (Invitrogen) se stavlja preko cele ploče (20µl po udubljenju) i inkubira tokom 4 sata. Alamar blue fluorescentnost meri se po uzdignutosti 570nm, emisiji 585nm na Varioskan Flash čitaču ploča. Procenat preživljavanja ćelija računa se iz srednje vrednosti fluorescentnosti kod ADC teretiranih udubljenja u odnosu na srednje vrednosti fluorescentnosti kod kontrolnih udubljenja.

Primena

[0106] Konjugati pronalaska mogu se koristiti da se dobije jedinjenje PBD na ciljanom mestu.

[0107] Ciljano mesto je poželjno populacija proliferativnih ćelija. Antitelo je antitelo za antigen prisutan na populaciji proliferativnih ćelija.

[0108] U jednom otelotvorenju antigen je odsutan ili prisutan pri smanjenom nivou populacije neproliferativnih ćelija u odnosu na količinu antigena prisutnog u populaciji proliferativnih ćelija, na primer populaciji ćelija tumora.

[0109] Na ciljanom mestu veznik se može otcepiti tako da se oslobodi jedinjenje RelA, RelB, RelC, RelD ili RelE. Prema tome, konjugat se može koristiti kako bi se selektivno dobilo jedinjenje RelA, RelB, RelC, RelD ili RelE na ciljanom mestu.

[0110] Veznik može biti rascepljen enzimom prisutnim na ciljnom mestu.

[0111] Ciljana lokacija može biti in vitro, in vivo ili ex vivo.

[0112] Jedinjenja konjugata antitela i leka (ADC) iz pronalaska uključuju ona koja se mogu koristiti za anti-kancerogenu aktivnost. Konkretno, jedinjenja uključuju konjugovana antitela, tj. kovalentno pripojena veznikom na PBD deo leka, odnosno toksina. Kada lek nije konjugovan na antitelo, PBD lek ima citotoksično dejstvo. Biološka aktivnost dela PBD leka PBD se tako modulira za konjugaciju antitela. Konjugat antitela i leka (ADC) prema ovom pronalasku selektivno isporučuju delotvorne doze citotoksičnog agensa do tumorskog tkiva, pri čemu se može postići veća selektivnost, odnosno manje delotvorna doza.

[0113] Prema tome, u jednom aspektu, ovaj pronalazak daje jedinjenje konjugata kako je ovde opisano za primenu u terapiji.

[0114] U daljem aspektu takođe se dobija jedinjenje konjugata kao što je opisano u ovom tekstu za upotrebu u lečenju proliferativnih bolesti. Drugi aspekt predmetnog pronalaska obezbeđuje upotrebu konjugatnog jedinjenja u proizvodnji medikamenta za lečenje proliferativnog oboljenja.

[0115] Osoba uobičajene veštine u ovoj oblasti može lako odrediti da li ili ne kandidat za konjugat tretira proliferativno stanje za bilo koju pojedinu vrstu ćelija. Na primer, testovi koji se mogu prikladno upotrebiti za ocenu aktivnosti ponuđenu od strane određenog jedinjenja opisani su u primerima niže.

[0116] Izraz “proliferativne bolesti” odnosi se na neželjene ili nekontrolisane ćelijske proliferacije viška ili abnormalnih ćelija, što je nepoželjno, kao što su, neoplastični ili hiperplastični rast, bilo in vitro ili in vivo.

1

[0117] Primeri proliferacionih stanja uključuju, ali nisu ograničeni na benigne, predmaligne i maligne ćelijske proliferacije, uključujući, ali bez ograničenja na neoplazme i tumore (npr. histokitoma, gliom, astrokioma, osteom), kancere (npr. karcinom pluća, karcinom malih ćelija pluća, gastrointestinalni karcinom, karcinom creva, karcinom debelog creva, karcinom dojke, karcinom jajnika, karcinom prostate, karcinom testisa, karcinom jetre, karcinom bubrega, karcinom mokraćnog mehura, karcinom gušterače, karcinom mozga, sarkoma, osteosarkoma, Kaposijev sarkom, melanom), limfome, leukemije, psorijaze, bolesti kostiju, fibroproliferativne bolesti (npr. vezivnog tkiva) i ateroskleroze. Karcinomi od posebnog interesa uključuju, ali nisu ograničeni na leukemije i karcinome jajnika.

[0118] Bilo koji tip ćelije može se tretirati, što uključuje, ali nije ograničeno na, pluća, gastrointestinalne organe (uključujući, npr. creva, debelo crevo), dojke (mlečne), jajnike, prostatu, jetru, bubrege, mokraćni mehur, pankreas, mozak, kožu.

[0119] Karcinomi od posebnog interesa uključuju, ali nisu ograničeni kancere prostate.

[0120] PSMA se takođe pokazalo da je široko izražen u neovaskulaturom čvrstih tumora koji nisu tumori prostate uključujući karcinome debelog creva, dojke, bešike, pankreasa, bubrega i melanom, ali ne normalne vaskulature. Stoga, PSMA specifični ADC može se koristiti za tretiranje tumora koji nisu tumori prostate sa PSMA pozitivnom neovaskulaturom.

[0121] Smatra se da konjugati antitela i leka (ADC) iz ovog pronalaska mogu da se koristite pri lečenju raznih bolesti ili poremećaja, npr. okarakterisanih prekomernom ekspresijom tumorskog antigena. Primeri stanja ili hiperproliferacijskih poremećaja uključuju benigne ili maligne tumore; leukemije, hematološke i limfne malignosti. Drugi uključuju neuralne, glijalne, astrocitne, hipotalamusni, glandularne, makrofagne, stromalne blastocelne, upalne, angiogene i imunoloških, uključujući i autoimune, bolesti.

[0122] Uglavnom, bolesti ili poremećaji koji se leče su hiperproliferativne bolesti kao što je karcinom. Primeri karcinoma koji se tretiraju ovde uključuju, ali nisu ograničeni na karcinom, limfom, blastom, sarkom i leukemiju ili limfoidne maligne bolesti. Više određenih primeri takvih karcinoma su karcinom pločastih ćelija (npr. karcinom epitelnih skvamoznih ćelija), karcinom pluća uključujući karcinom malih ćelija pluća, karcinom nemalih ćelija pluća, adenokarcinom pluća i karcinom pločast ćelijaih pluća, karcinom peritoneuma, hepatocelulami karcinom, karcinom želudca ili stomaka uključujući gastrointestinalni karcinom, karcinom gušterače, glioblastoma, karcinoma grlića materice, karcinom jajnika, karcinom jetre, karcinom mokraćnog mehura, hepatom, karcinom dojke, karcinom debelog creva, karcinom rektuma, karcinom debelog creva, karcinom endometrija ili karcinom materice, karcinom žlezda bubrega i karcinom bubrega, karcinom prostate, karcinom vulve, karcinom štitnjače, karcinom jetre, analni karcinom, karcinom penisa, i karcinom glave i vrata.

[0123] Autoimune bolesti za čije lečenje mogu da se koriste ADC jedinjenja uključuju reumatološke poremećaje (kao što je, na primer, reumatoidni artritis, Sjogren-ov sindrom, skleroderm, lupus poput SLE i lupus nefritis, polimiozitis/dermatomiozitis, krioglobulinemija, sindrom anti-fosfolipida antitela, kao i psorijatični artritis), osteoartritis, autoimune gastrointestinalne i jetrene bolesti (kao što su, na primer, upalne bolesti creva (na primer ulcerozni kolitis i Crohnova bolest), autoimuni gastritis i perniciozna anemija, autoimuni hepatitis, primarna bilijarna ciroza, primarni sklerozirajući kolangitis i celijakija), vaskulitis (kao što su, na primer, ANCA-povezan vaskulitis, uključujući Churg-Strauss vaskulitis, Wegenerova granulomatoza, i polyarteriitis), autoimune neurološke poremećaje (kao što su, na primer, multipla skleroza, opsoclonus mioklonus sindrom, myasthenia gravis, optički neuromijelitis, Parkinsonova bolest, Alzhajmerova bolesti i autoimune polineuropatije), bubrežne bolesti (kao što su, na primer, glomerulonefritis, Goodpastureov sindrom i Vergerova bolest), autoimuni dermatološki poremećaji (kao što su, na primer, psorijaza, urtikarija, koprivnjača, pemphigus vulgaris, bulozni pemfigoid, i kožni eritemski lupus), hematološke poremećaje (kao što su, na primer, trombocitopenijski purpur, tromboza trombocitopenijskog purpura, poslijetransfuzijski purpur, i autoimuna hemolitička anemija), ateroskleroza, uveitis, autoimune bolesti sluha (kao što su, na primer, bolest unutašnjeh uha i gubitak sluha), Behcetova bolest, Raynaudov sindrom, transplantacije organa i autoimuni endokrinih poremećaji (kao što su, na primer, sa dijabetesom povezane autoimune bolesti kao što su inzulin-zavisni dijabetes melitus (IDDM), Addisonova bolest, i autoimune bolesti štitne žlezde (npr. Gravesova bolest i tiroiditis)). Još poželjnije takve bolesti uključuju, na primer, reumatoidni artritis, ulcerativni kolitis,

2

vaskulitis u vezi sa ANCA, lupus, multiple skleroze, Sjogrenov sindrom, Gravesovu bolest, IDDM, pernicioznu anemiju, tiroiditis i glomeruloni fritis.

Metode lečenja

[0124] Konjugati predmetnog pronalaska mogu biti korišćeni u metodama lečenja.

[0125] Stvarna količina koja se daje, i stopa i vremenski tok davanja, zavisiće od prirode i ozbiljnosti onoga što se tretira. Propisivanje tretmana, npr., odlučivanje o doziranju, je u okviru odgovornosti opšteg lekara i drugih medicinskih doktora.

[0126] Jedinjenje prema pronalasku može se davati samostalno ili u kombinaciji sa drugim tretmanima, ili simultano ili sekvencijalno u zavisnosti od stanja koje se tretira. Primeri tretiranja i terapija obuhvataju ali nisu ograničeni na, hemoterapiju (davanje aktivnih agenasa, uključujući npr., lekove kao što su hemoterapeutici); operaciju; i terapiju sa zračenjem.

[0127] “Hemoterapeutski agens” je hemijsko jedinjenje koje je od koristi pri tretiranju kancera, nezavisno od mehanizma delovanja. Klase hemoterapeutskih agenasa obuhvataju ali nisu ograničene na: agense za alkilovanje, antimetabolite, alkaloide otrova deobenog vretena, citotoksične/antitumorske antibiotike, inhibitore topoizomeraze, antitela, fotosezitizere i inhibitore kinaze. Hemoterapeutski agensi obuhvataju jedinjenja korišćena u “ciljanoj terapiji” i konvencionalnoj hemoterapiji.

[0128] Primeri hemoterapijskih agenasa uključuju: (erlotinib. TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm), docetaksel (Taxotere®, Sanofi-Aventis), 5-FU (fluorouracil, 5-fluorouracil, CAS br. 51-21-8), gemcitabin (GEMZAR®, Lilly), PD-0325901 (CAS br. 391210-10-9, Pfizer), cisplatin (cis-diamin, dihlorplatina (II), CAS br. 15663-27-1), karboplatin (CAS br . 41575-94-4), paklitaksel (Taxol®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech), temozolomid (4-metil-5-okso-2,3,4,6, 8-pentazabicyclo [4.3.0] nona-2,7,9-triene- 9-karboksamid, CAS br. 85622-93-1, TEMODAR®, TEMODAL®, Schering Plough), tamoksifen ((Z) -2- [4- (1,2-1enil) fenoksi] -N, N-dimetiletanamin, NOLVADEX®, ISTUBAL®, VALODEX®) i doksorubicin (ADRIAmicin®), Akti-1/2, HPPD i rapamicin.

Više primeri hemoterapijskih agensa su: oksaliplatin (ELOXATIN®, Sanofi), bortezomib (VELCADE®, Millennium Pharm.), sutent (SUNITINIB®, SU11248, Pfizer), letrozol (FEMARA®, Novartis), imatinibmezilat (GLEEVEC®, Novartis ), XL-518 (inhibitor MEK, Exelixis, WO 2007/044515), ARRY-886 (inhibitor MEK, AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca), SF-1126 (inhibitor PI3K, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235 (inhibitor PI3K, Novartis), XL-147 (inhibitor PI3K, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), fulvestrant (FASLODEX®, AstraZeneca), leukovorin (folna kiselina), rapamicin (sirolimus, RAPAMUNE®, Wyeth), lapatinib (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), lonafarnib (SARASAR ™, SCH 66336, Schering Plough), sorafenib (Nexavar®, BAY43-9006, Bayer Labs), gefitinib (IRESSA®, AstraZeneca), irinotecan (Camptosar®, CPT-11, Pfizer), tipifarnib (ZARNESTRA™, Johnson & Johnson), ABRAXANE ™ (Crcmophor bez), albuminprojektovane nanočestične formulacije paklitakseloma (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, II), vandetaniba (Rinn, ZD6474, ZACTIMA®, AstraZeneca), hloranmbucil, AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), temsirolimus (TORISEL®, Wyeth), pazopaniba (GlaxoSmithKline), canfosfamide (TELCYTA®, Telik), tiotepa i ciklosfosfamid (CYTOXAN®, NEOSAR®); alkil sulfonati kao busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridini kao benzodop, karbokvon, meturedop i uredopa; etilenimini i metilamelamini uključujući altretamin trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilomelamin; acetogenini (pogotovo bullatacin i bullatacinone); kamptotecin (uključujući sintetičke analoge topotekana); briostatin; calistatin; CC-1065 (uključujući i njegov adozelesin, carzelesin i bizelesin sintetičke analoge); kriptoficine (posebno kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duocarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW-2189 i CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatin; sarcodictiin; spongistatin; azotne iperite kao hlorambucil, hlornafazin, hlorofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembichin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uramustin; nitrozouree kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin i ranimnustin; antibiotici kao što su antibiotici (npr. enedin kalikeamicin, kalikeamicin gamma1I, kalikeamicina omegal1 (Angew Chem Intl Ed Engl (1994) 33.

183-186), dinemicin, dinemicin A; bisfosfonatime, kao na primer esperamicin klodronata, kao i neokarzinostatin hromofor i srodni hromoprotein enedin antibiotski hromoforim), aklacinomisin, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicini, kactinomicin, karabicin, karminomicin, karzinofilin, hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, morfolinodoksorubicin, doksorubicin-cijanomorfolino, 2-pirolin-doksorubicin i deoksidoksorubicin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, nemorubicin, marcelomicin, mitomicine kao mitomicin C, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicin, peplomicin, porfiromicin, puromicin, quelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubericidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; antimetabolite kao što su metotreksat i 5-fluorouracil (5FU); analoge folne kiseline kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; analoge purina kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiogvanin, thiamiprin; analoge pirimidina kao što su, ancitabine azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgene kao što calusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostane, testolakton; anti-nadbubrežne žlezde, kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; folna kiselina, krema poput frolinic kiselina; aceglaton; aldogosphamid glikozida; aminolevulinska kiselina; eniluracil; amsakrin; bestrabucil; bizantren; edatraksate; defofamine; demecolcine; diazikvion; elfornithine; elliptinium acetata; epotilon; etoglucid; galij nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidainine; majtanzinoidi poput majtanzina i ansamitocina; mitoguazon; mitoksantron; mopidanmol; nitraerine; pentostatin; fenamet; pirarubicin; lozoksantron; podofilna kiselina; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK® polisaharid kompleks (JHS Prirodni proizvodi, Eugene, OR); razoksan; rizoksin; sizofiran; spirogermanium; tenuazonic kiselina; triazikvion; 2,2 ', 2 ", -trihlorotrietilamin trihotecen (pogotovo T-2 toksina, verracurin A, A i roridin anguidine), uretan, vindesin, dakarbazin, manomustin, mitobronitol, mitolactol, pipobroman, gacitozin, arabinozid (« Ara-C «), ciklofosfamid, tiotep, 6-tiogvanin, merkaptopurin, metotreksat, platinski analoge, kao što su cisplatin i karboplatin; vinblastina; etopozid (VP-16), ifosfamid, mitoksantron, vinkristin, vinorelbin (NAVELBINE®) novantron, tenipozid, Edatreksat, daunomicin, aminopterin, kapecitabin (XELODA®, Roche), ibandronat, CPT-11, inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometilornitin (DMFO); fraHj retinoične kiseline, i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline i derivati bilo čega od gore navedenog.

[0129] Takođe su uključeni u definiciju “hemoterapijskih agenasa”: (i) anti-hormonski agensi koja regulišu ili inhibiraju hormonsko delovanje na tumore kao što su anti-estrogeni i selektivne modulatori receptora estrogena (SERM), uključujući, na primer, tamoksifen (uključujući NOLVADEX®, tamoksifen citrat), raloksifen, droloksifen, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston i FARESTON® (toremifine citrat); (ii) inhibitori aromataze koje inhibiraju enzim aromatazu, koja reguliše proizvodnju estrogena u nadbubrežne žlezde, kao što su, na primer, 4 (5) -imidazoles, aminoglutetimid, MEGASE® (megestrol acetat), AROMASIN® (eksemestan, Pfizer), formestanie, fadrozol, RIVISOR® (vorozol), FEMARA® (letrozol, Novartis), i ARIMIDEX® (anastrozola, AstraZeneca); (iii) anti-androgeni kao što su flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid, i goserelin; kao troksacitabin (1,3-dioksolan nukleozid analog citozina); (iv) inhibitore protein kinaze, kao što su inhibitori MEK (WO 2007/044515); (v) inhibitori lipid kinaze; (vi) oligonukleotidi, posebno onih koji inhibiraju eksprimovanje gena u signalnim putevima imliciranim u aberantnim proliferacijama ćelija, na primer, PKC-alfa, Raf i H-Ras, kao što je oblimersen (GENASENSE®, Genta Inc.); (vii) ribozimi poput inhibitora VEGF eksprimovanja (npr. ANGIOZYME®) i HER2 inhibitori eksprimovanja; (viii), vakcine kao što su vakcine genske terapije, na primer, ALLOVECTIN®, LEUVECTIN® i VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; inhibitori topoizomeraze 1, kao što su LURTOTECAN®; ABARELIX® RMRH; (ix) anti-angiogeni agensi kao što su bevacizumab (AVASTIN®, Genentech); i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline i derivati bilo čega od gore navedenog.

[0130] Takođe uključeni u definiciju “hemoterapijskog agensa” su terapeutska antitela kao alemtuzumab (Campath), bevacizumab (AVASTIN®, Genentech); cetuksimab (ERBITUX®, Imclone); panitumumab (VECTIBIX®, Amgen), rituksimab (RITUXAN®, Genentech/Biogen Idec), ofatumumab (ARZERRA®, GSK), pertuzumab (PERJETA, OMNITARG™, 2C4, Genentech), trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech), tositumomab (Bexxar ™, Corixia), i antitelo-leka konjugat, getuzumab ozogamicin (MYLOTARG®, Wyeth).

[0131] Humanizovana monoklonska antitela sa terapeutskim potencijalom kao hemoterapeutski agens u kombinaciji sa konjugatima prema pronalasku obuhvataju: alemtuzumab apolizumab, aselizumab, infliksimab, bapineuzumab, bevacizumab, bivatuzumab mertanzin, kantuzumab mertanzin, cedelizumab, certolizumab pegol, cidfusituzumab, cidtuzumab, daklizumab, eculizumab, efalizumab, epratuzumab, erlizumab, felvizumab, fontolizumab, getuzumab ozogamicin, inotuzumab ozogamicin, ipilimumab, labetuzumab, lintuzumab Pantimumaba, Matuzimaba, mepolizumab, motavizumab, motovizumab, natalizumab, Nimotuzimaba, nolovizumab, numavizumab, ocrelizumab, omalizumab, palivizumab, paskolizumaba, pec- fusituzumab, pectuzumab, pertuzumab, pekselizumab, ralivizumab, ranibizumab, reslivizumab, reslizumab, resyvizumab, rovelizumab, ruplizumab, sibrotuzumab, siplizumab, sontuzumab, tacatuzumab tetraksetan, tadocizumab, talizumab, tefibazumab, tocilizumab, toralizumab, trastuzumab, tucotuzumab celmoleukin, tucusituzumab, umavizumab, urtoksazumab i visilizumab.

[0132] Farmaceutski sastavi prema ovom pronalasku, i za upotrebu u skladu s ovim pronalaskom, mogu sadržati, pored aktivnog sastojka, npr. konjugat jedinjenja, i farmaceutski prihvatljiv pomoćni agens, nosač, pufer, stabilizator ili druge materijale dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Takvi materijali treba da budu netoksični i ne smeju uticati na delotvornost aktivnog sastojka. Egzaktna priroda nosača ili drugog materijala zavisiće od načinu primene, koji može biti oralni, ili sa injekcijom, npr. kožno, potkožno, ili intravenski.

[0133] Farmaceutski sastavi za oralnu primenu mogu biti u obliku tableta, kapsula, praha ili u obliku tečnosti. Tableta može sadržati čvrsti nosač ili pomoćni agens. Tečni farmaceutski sastavi uglavnom sadrže tečni nosač kao što su voda, petrolej, životinjska ili biljna ulja, mineralno ulje ili sintetička ulja. Mogu se uključiti fiziološki slani rastvor, dekstroza ili drugi rastvor saharida, ili glikoli kao što je etilen glikol, propilen glikol ili polietilen glikol. Kapsula može sadržati čvrsti nosač kao želatin.

[0134] Za intravensku, kožnu ili potkožnu injekciju, ili injekciju na mestu tumora, aktivni sastojak će biti u obliku parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora, koji je bez pirogena i ima odgovarajući pH, izotoničnost i stabilnost. Oni sa relevantnom veštinom u oblasti mogu dobro pripremiti prikladne rastvore, na primer, izotonične agense kao što su natrijum hlorid injekcija, Ringerova injekcija, mlečna Ringerova injekcija. Konzervansi, stabilizatori, puferi, antioksidanti i/ili drugi dodaci mogu biti uključeni, po potrebi.

Formulacije

[0135] Iako je moguće da se konjugat jedinjenja koristiti (npr. daje) sam, često je poželjno da se predstavi u obliku sastava ili formulacije.

[0136] U jednom otelotvorenju, sastav je farmaceutski sastav (npr., formulacije, preparat, lek) koji sadrži jedinjenje konjugata, kao što je ovde opisano, i farmaceutski prihvatljivu podlogu, rastvarač ili ekscipijent.

[0137] U jednom otelotvorenju, sastav je farmaceutski sastav koji sadrži najmanje jedno jedinjenje konjugata, kao što je opisano ovde, zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih sastojaka koji su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti, uključujući, ali ne ograničavajući se na, farmaceutski prihvatljive nosače, rastvarače, ekscipijente, pomoćne agense, punila, pufere, konzervanse, antioksidante, agense za podmazivanje, stabilizatori, agense za otapanje, surfakante (npr., agense za kvašenje), agense za prikrivanje, bojila, agense za poboljšanje ukusa i zaslađivače.

[0138] U jednom otelotvorenju, sastav nadalje sadrži i druge aktivne agense, na primer, druga terapijska ili profilaktička sredstva.

[0139] Pogodne podloge, rastvarači, ekscipijensi itd, mogu se pronaći u standardnim farmaceutskim tekstovima. Videti, na primer, Handbook of Pharmaceutical Additives, 2nd Edition (eds. M. Ash and I. Ash), 2001 (Synapse Information Resources, Inc., Endicott, New York, USA), Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th edition, pub. Lippincott, Williams & Wilkins, 2000; and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd edition, 1994.

[0140] Drugi aspekt predmetnog pronalaska odnosi se na metode za pravljenje farmaceutskih sastava koji sadrže mešanje bar jednog [<11>C] -radiooznačenog konjugata i jedinjenja nalik konjugatu, kao što je ovde definisano, zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih sastojaka dobro poznatih stručnima u ovoj oblasti, npr., podloge, rastvarači, ekscipijensi, itd. Ukoliko su formulisane kao

2

diskretne jedinice (npr., tablete, itd.) svaka jedinica sadrži prethodno određenu količinu (dozu) aktivnog jedinjenja.

[0141] Izraz “farmaceutski prihvatljiv”, kao što se ovde koristi odnosi se na jedinjenja, sastojke, materijale, sastave, oblike za doziranje, itd., koji su, unutar okvira zdrave medicinske procene, pogodne za upotrebu u dodiru sa tkivom ispitanika (npr., čovek) bez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora ili drugog problema ili komplikacije srazmerno razumnom odnosu koristi/rizika. Svaki nosač, razređivač, ekscipijent itd mora biti “prihvatljiv” u smislu da je kompatibilan sa ostalim sastojcima formulacije.

[0142] Formulacije se mogu pripremiti bilo kojom metodom dobro poznatom u farmaceutskoj struci. Takve metode uključuju korak dovođenja u vezu aktivnog jedinjenja sa nosačem koji sadrži jedan ili više pomoćnih sastojaka. Uglavnom, sastavi se pripremaju uniformnim dovođenjem u kontakt aktivnih jedinjenja sa nosačima (npr., tečni nosači, fino usitnjenim čvrstim nosačima, itd), a zatim oblikovanjem proizvoda, ako je potrebno.

[0143] Formulacija se može pripremiti da obezbedi brzo i sporo otpuštanje; neposredna, odložena, vremenska, ili produžena otpuštanja; ili njihove kombinacije.

[0144] Formulacije prikladne za parenteralno davanje (npr. injekcijom), uključuju vodene i nevodene, izotonične, apirogene, sterilne tečnosti (npr., rastvore, suspenzije), u kojima je aktivni sastojak rastvoren, suspendovan ili obezbeđen na drugi način (npr., u liposomima ili drugim mikročesticama). Takve tečnosti mogu dodatno sadržati druge farmaceutski prihvatljive dodatke, kao što su antioksidansi, puferi, konzervansi, stabilizatori, bakteriostati, suspenzije, agensi za zgušnjavanje, i rastvori koji čine formulaciju izotoničnom sa krvlju (ili drugim telesne tečnostima) relevantnog predviđenog primaoca. Primeri ekscipijenasa obuhvataju, na primer, vodu, alkohole, poliole, glicerol, biljna ulja Primeri prikladnih izotoničnih nosača za upotrebu u takvim formulacijama obuhvataju natrijum hlorid za injekcije, Ringerov rastvor, ili mlečnu Ringerovu injekciju. Tipično, koncentracija aktivnog sastojka u tečnosti je od oko 1 ng/mL do oko 10 µg/ml, na primer od oko 10 ng/ml do 1 µg/ml. Formulacije mogu biti u jedinici doze ili više doza, na primer, ampule i bočice, i mogu biti čuvane u hladno-suvim (liofilizirani) uslovima koji zahtevaju samo dodatak sterilnog tečnog nosača, na primer vode za injekcije, neposredno pre upotrebe. Improvizovani injekcijski rastvori i suspenzije mogu se pripremiti od sterilnih prašaka, granula i tableta.

Doziranje

[0145] Biće uvaženo od stručnjaka u ovoj oblasti da odgovarajuće doze konjugata jedinjenja, i smese koje sadrže konjugat jedinjenja, mogu varirati od pacijenta do pacijenta. Određivanje optimalne doze će uglavnom uključivati balansiranje nivoa koristi terapijskog davanja prema bilo kojem riziku ili štetnoj nuspojavi. Veličina odabrane doze zavisiće od različitih faktora, uključujući, ali ne ograničavajući se na aktivnost određenog jedinjenja, način davanja, vreme davanja, brzinu lučenja jedinjenja, trajanje lečenja, ostale lekove, jedinjenja i/ili materijale koji se koriste u kombinaciji, ozbiljnost stanja, kao i od vrste, starosti, pola, težine, stanja, opšteg zdravlja, i prethodne medicinske istorije pacijenta. Količina jedinjenja i način primene će naposletku biti prepuštene nahođenju lekara, veterinara ili medicinskog osoblja, iako će generalno doziranje biti odabrano da bi se dobile lokalne koncentracije na mestu delovanja koje postižu željeni učinak bez uzrokovanja značajne štetne ili pogubne nuspojave.

[0146] Davanje se može sprovesti u jednoj dozi, kontinuirano ili sa prekidima (npr., u podeljenim dozama u odgovarajućim intervalima) tokom trajanja lečenja. Metode za određivanje najučinkovitijih načina i doza primene dobro su poznate stručnjacima u ovoj oblasti i variraće sa formulacijom korišćenom pri terapiji, svrsi terapije, ciljanim ćelijama koje se tretiraju, i pacijentom koji se leči. Same pojedinačne ili višestruke primene mogu se sprovesti sa nivoom doziranja i obrasca odabranog od lekara, veterinara ili medicinskog osoblja.

[0147] Uglavnom, odgovarajuća doza aktivnog jedinjenja je u rasponu od oko 100 ng do oko 25 mg (tipičnije, od oko 1 µg do oko 10 mg) po kilogramu telesne težine pacijenta dnevno. Kada je aktivno jedinjenje so, ester, amid, prolek ili slično, količina koja se daje računa se na temelju matičnog jedinjenja i tako stvarna masa koja se koristi proporcionalno raste.

[0148] U jednom otelotvorenju, aktivno jedinjenje se primenjuje na humanom pacijentu prema sledećem režimu doziranja: oko 100 mg, 3 puta dnevno.

[0149] U jednom otelotvorenju, aktivno jedinjenje se primenjuje na humanom pacijentu prema sledećem režimu doziranja: oko 150 mg, 2 puta dnevno.

[0150] U jednom otelotvorenju, aktivno jedinjenje se primenjuje na humanom pacijentu prema sledećem režimu doziranja: oko 200 mg, 2 puta dnevno.

[0151] Međutim, u jednom otelotvorenju, jedinjenje konjugata se primenjuje na humanom pacijentu prema sledećem režimu doziranja: 50, ili oko 75 mg, 3 ili 4 puta dnevno.

[0152] Međutim, u jednom otelotvorenju, jedinjenje konjugata se primenjuje na humanom pacijentu prema sledećem režimu doziranja: 50, ili oko 125 mg, 3 ili 4 puta dnevno.

[0153] Količine za doziranje opisane iznad mogu se primeniti na konjugate (uključujući PBD grupe i veznike za antitelo) ili na efikasne količine PBD jedinjenja datog, na primer količina jedinjenja koja je se može osloboditi nakon cepanja veznika.

[0154] Za prevenciju ili tretman oboljenja, prikladna doza od ADC pronalaska zavisiće od vrste bolesti koja se leči, kao što je gore definisano, ozbiljnost i toka bolesti, da li se molekul primenjuje za sprečavanje ili terapijske svrhe, prethodna terapija, pacijentova kliničke prošlost i odgovor na antitela, kao i odluke lekara. Molekul se prikladno daje pacijentu odjednom ili kroz seriju tretmana. Zavisno od vrste i težine bolesti, oko 1 µg/kg do 15 mg/kg (na primer 0,1-20 mg/kg) molekula je početna doza kandidat za davanje pacijentu, bilo da, na primer, ima jedan ili više zasebnih davanja, ili kontinuirana infuzija. Tipična dnevna doza može varirati od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, zavisno od gore navedenih faktora. Na primer doza ADC se daju pacijentu, u rasponu od oko 0.1 do oko 10 mg/kg telesne težine pacijenta. Za ponovnu primena tokom nekoliko dana ili duže, zavisno od stanja, terapija se održava dok se ne postigne željeno suzbijanje simptoma bolesti. Uzoran režim doziranja sastoji se od toka davanja početne doze od oko 4 mg/kg, a zatim dodatnih doza svake nedelje, dve nedelje, ili tri nedelje od ADC. Drugi režimi doziranja mogu biti korisni. Napredak terapije se lako prati uobičajenim metodama i ispitivanjima.

Tretman

[0155] Termin “tretman”, kako se ovde koristi u kontekstu tretiranja stanja, odnosi se generalno na tretman i terapiju, bilo čoveka ili životinje (na primer, u veterini) kod kojih se postiže neki željeni terapeutski efekat, na primer, sprečavanje napredovanja stanja, i uključuje smanjenje brzine napretka, zaustavljanje brzine napretka, regresije bolesti, poboljšanje bolesti, i lečenje bolesti. Tretman kao profilaktička mera (tj., profilaksa, prevencija) također je uključena.

[0156] Termin “terapeutski delotvorna količina”, kako se ovde koristi, odnosi se na količinu aktivnog jedinjenja, ili materijala, sastava ili doze koja sadrži aktivno jedinjenje, koji je delotvorno za dobijanje nekog željenog terapeutskog efekta, proporcionalno razumnom odnosu koristi/rizika kada se daje u skladu sa željenim režimom lečenja.

[0157] Isto tako, termin “profilaktički delotvorna količina”, kako se ovde koristi, odnosi se na količinu aktivnog jedinjenja, ili materijala, sastava ili doze koja sadrži aktivno jedinjenje, koji je delotvorno za dobijanje nekog željenog profilaktičkiog efekta, proporcionalno razumnom odnosu koristi/rizika kada se daje u skladu sa željenim režimom lečenja.

Priprema konjugata leka

[0158] Antitelo lek konjugati mogu se dobiti na nekoliko načina, koristeći organske hemijske reakcije, uslove i reagense koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti, uključujući reakcije nukleofilne grupe antitela ili agensa za vezivanje ćelija sa reagensom za veznikom za lek. Ova metoda može se koristiti u pripremi antitelo lek konjugata pronalaska.

[0159] Nukleofilne grupe na antitelima uključuju ali se ne ograničavaju na tiolne grupe bočnog lanca, npr. cistein. Tiolne grupe su nukleofilne i sposobne da reaguju u obliku kovalentne veze sa elektrofilnim grupama na vezivnim delovima kao što su oni iz ovoga pronalaska. Neki antitela imaju reduktivne međulančane disulfide, odnosno cisteinske mostove. Antitela se mogu napraviti da budu reaktivna za

2

konjugaciju sa vezivnim reagensima obradom sa reduktivnim agensom kao što je DTT (Clelandov reagens, ditiotreitol) ili TCEP (tris(2-karboksietil)fosfin hidrohlorid; Getz i dr (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA). Svaki cisteinski disulfid most će tako obrazovani, teoretski, dva reaktivna tiolne nukleofila. Dodatne nukleofilne grupe mogu se uvesti u reakciju antitela preko lizina as 2-iminotiolanom (Trautov reagens), što dovodi do pretvaranja amina u tiol.

Ispitanik/Pacijent

[0160] Ispitanik/pacijent može biti životinja, sisar, placentni sisar, torbar (npr., kengur, vombat), sisar sa kloakom (npr., kljunar), glodar (npr., zamorče, hrčak, pacov, miš), mišijeg porekla (npr., miš), dvozubac (npr., zec), letači (npr., ptice), psi (npr., domaći psi), mačke (npr., domaće mačke), konji (npr., domaći konj, svinje (npr., domaće svinje, ovce (npr., domaće ovce), goveda (npr., krava), primat, simijan (npr., majmun ili bezrepi majmun), majmun (npr., marmozet, babun), bezrepi majmun (npr., gorila, šimpanza, orangutan, gibon) ili čovek.

[0161] Nadalje, ispitanik/pacijent može biti bilo kog stupnja razvoja, na primer, na fetus. U jednom poželjnom otelotvorenju ispitanik/pacijent je čovek.

Primeri

Opšti eksperimentalni metodi

[0162] Optičke rotacije merene su na ADP 220 polarimetru (Bellingham Stanley Ltd.) dok su koncentracije (c) date u g/100 mL. Tačke topljenja merene su pomoću digitalnog aparata za tačke topljenja (Electrothermal). IR spektri su snimljeni na Spectrum 1000 FT IR Spectrometer.<1>H i<13>C NMR spektri su dobijeni na 300 K koristeći Bruker Avance NMR spektrometra na 400 i 100 MHz, respektivno. Hemijske promene su prijavljene u odnosu na TMS (δ = 0,0 ppm), a signali su označeni kao s (jednostruki), d (duplet), t (triplet), dt (dupli triplet), dd (dupli dupleta), ddd (dupli duplet dupleta), ili m (multiplet), sa uparenim konstantama datim u hercima (Hz). Podaci masene spektroskopije (MS) prikupljeni su na instrumentu Waters Micromass ZQ spojenim sa Waters 2695 HPLC sa Waters 2996 PDA. Waters Micromass ZQ parametri bili su: Kapilarno (kV), 3.38; konusno (V), 35; ekstraktor (V), 3.0; izvorna temperatura (°C), 100; temperatura desolvacije (°C), 200; konusni protok (L/h), 50; protok desolvatacije (L/h), 250. Podaci u visokoj rezoluciji masene spektroskopije (HRMS) snimljeni su na Waters Micromass QTOF Global pri pozitivnom W-modu koristeći borosilikatne vrhove stakla obloženog metalom kako bi se uzorci uveli u instrument. Tankoslojna hromatografija (TLC) je obavljena na silika gel aluminijumskim pločama (Merck 60, F254), dok je brza hromatografija koristila silika gel (Merck 60, 230-400 mesh ASTM). Osim za HOBt (Novabiochem) i čvrstih reagenasa (Argonaut), sve druge hemikalije rastvori kupljeni su od Sigma-Aldrich, i korišćeni su kao što su nabavljeni, bez daljeg pročišćavanja. Nevodeni rastvori dobijeni su destilacijom pod suvom atmosferom azota u prisustvu odgovarajućeg agensa za sušenje, i pohranjeni su iznad molekulskih sita 4A i natrijumske žice. Petroletar se odnosi na ključanje delova na 40-60°C.

Opšti LC/MS uslovi:

Metoda 1 (podrazumevana korišćena metoda, osim ako nije drugačije navedeno)

[0163] HPLC (Waters Alliance 2695) se izvode pomoću mobilne faze vode (A) (0.1% mravlja kiselina) i acetonitrila (B) (0.1% mravlja kiselina). Gradijent: inicijalni sastav 5% B u trajanju od 1,0 minuta, zatim 5% B do 95% B preko 3 min. Sastav je održan 0,1 min na 95% B, a zatim se vratio do 5% B u 0.03 minuta i održava tu 0.87 minuta. Ukupno vreme gradijenta iznosi 5 min.

Metoda 2

[0164] HPLC (Waters Alliance 2695) se izvode pomoću mobilne faze vode (A) (0.1% mravlja kiselina) i acetonitrila (B) (0.1% mravlja kiselina). Gradijent: inicijalni sastav 5% B u trajanju od 1.0 minuta, zatim 5% B do 95% B preko 2.5 min. Sastav je održan 0.5 min na 95% B, a zatim se vratio do 5% B u 0.1 minuta i održava tu 0.9 minuta. Ukupno vreme gradijenta iznosi 5 min.

Za obe metode

2

[0165] Brzina protoka 3.0 ml/min, 400 µL je podeljeno preko a komada nulte zapremine koji prolazi u maseni spektrometar. Opseg detekcije talasnih dužina: 220 do 400 nm. poredak dioda (535 skeniranja). Kolona: Phenomenex® Onyx Monolitni C1850 x 4.60 mm.

[0166] Uslovi prečišćavanja blica reverzne faze bili su kako sledi: Sistem za prečišćavanje blica (Varian 971-Fp) je radio pomoću mobilne faze vode (A) i acetonitrila (B). početni sastav 5% B preko 20 C.V. (obim kolone), zatim 5% B do 70% B u okviru 60 C.V. Sastav je održavan za 15 C.V. na 95% B, a zatim je vraćen na 5% B u 5 C.V. i zadržan je na 5% B za 10 C.V. Ukupno vreme gradijenta je 120 C.V. Protok 6.0 mL/ min. Opseg detekcije talasnih dužina: 254 nm. Kolona: Agilent AKS1372-1 SF10-5.5gC8.

[0167] Pripremna HPLC metoda: Reverzna-faza tečne hromatografije ultra-viskokih performansi (UPLC) sprovedena je na Fenomenex Gemini NX 5µ C-18 kolonama sedećih dimenzija: 150 x 4.6 mm za analizu i 150 x 21.20 mm za pripremni rad. Svi UPLC eksperimenti su sprovedeni pod uslovima gradijenta: Upotrebljeni eulenti bili su rastvarač A (H2O sa 0.1% mravlje kiseline) i rastvarač B (CH3CN sa 0.1% mravlje kiseline). Korišćene stope su 1.0 ml/min za analitičku i 20.0 ml/min za pripremnu HPLC. Detekcija je na 254 i 280 nm.

Sinteza međujedinjenja 12

[0168]

(a) 1’,3’-Bis[2-metoksi-4-(metoksikarbonil)fenoksi] propan (3)

[0169] Dijazopropil azodikarboksilat (71.3 mL, 73.2 g, 362 mmol) dodat je kapanjem tokom perioda od 60 min u rastvoru gornjeg rastvora metil vanilata 2 (60.0 g, 329 mmol) i Ph3P (129.4 g, 494 mmol) u anhidrovanom THF (800 mL) na 0-5 °C (led / aceton) u atmosferi azota. Reakciona smeša je ostavljena da se meša na od 0-5 °C u toku dodatnih sat vremena, nakon čega je dodan rastvor 1,3-propandiola (11.4 mL, 12.0 g, 158 mmol) u THF (12 mL) tokom perioda od 20 min. Reakciona smeša je ostavljena da se zagreje do sobne temperature i meša 5 dana. Dobijeni beli talog 3 je sakupljen vakuum filtracijom, ispran sa THF i osušen u vakuumskom sušilicom do konstantne težine. Prinos = 54.7 g (84% na bazi 1,3-propandiola). Čistoća zadovoljavajuća prema LC/MS (3.20 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 427 ([M Na]<+>, 10);<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.64 (dd, 2H, J = 1.8, 8.3 Hz), 7.54 (d, 2H, J = 1.8 Hz), 6.93 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 4.30 (t, 4H, J = 6.1 Hz), 3.90 (s, 6H), 3.89 (s, 6H), 2.40 (p, 2H, J = 6.0 Hz).

(b) 1’,3’-Bis[2-metoksi-4-(metoksicarbonil)-5-nitrofenoksil] propan (4)

[0170] Čvrsti Cu(NO3)2.3H2O (81.5 g, 337.5 mmol) se polako dodaje u gusti rastvor bis-estera 3 (54.7 g, 135 mmol) u anhidrid sirćetne kiseline (650 mL) at 0-5°C (led/aceton). Reakciona smeša je ostavljena da se meša 1 čas na 0-5 °C i zatim se ostavi da se zagreje do sobne temperature. U ovoj fazi je primećeno blago egzotermo (oko 40-50 °C), praćeno zgušnjavanjem smeše i evolucijom NO2. Dodatni anhidrid

2

anhidrida (300 mL) je dodat i reakciona smeša je ostavljena da se meša 16 sati na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je sipana na led (~ 1.5 L), mešana i dopušteno je da se vrati na sobnu temperaturu. Dobijeni žuti talog je sakupljen vakuum filtracijom i osušen u eksikatoru da bi se dobilo željeno bisnitro jedinjenje 4 kao žuta čvrsta supstanca. Prinos = 66.7 g (100%). Čistoća zadovoljavajuća prema LC/MS (3.25 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 517 ([M Na]<+>, 40);<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.49 (s, 2H), 7.06 (s, 2H), 4.32 (t, 4H, J = 6.0 Hz), 3.95 (s, 6H), 3.90 (s, 6H), 2.45-2.40 (m, 2H).

(c) 1',3'-Bis(4-karboksi-2-metoksi-5-nitrofenoksi)propan (5)

[0171] Suspenzija metil estra 4 (66.7 g, 135 mmol) u THF (700 mL) je tretirana sa 1 N NaOH (700 mL) i reakciona smeša je ostavljena da se snažno meša na sobnoj temperaturi. Posle 4 dana mešanja, suspenzija postaje tamno obojeni rastvor koji je podvrgnut rotacionom isparavanju pod redukovanim pritiskom da bi se uklonio THF. Dobijeni vodeni ostatak je acidificiran do pH 1 sa koncentrovanim HCl i bezbojni precipitat 5 je sakupljen i temeljno osušen u vakuumskoj pećnici (50 °C). Prinos = 54.5 g (87%). Čistoća zadovoljavajuća prema LC/MS (2.65 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 489 ([M Na]<+>, 30));<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.62 (s, 2H), 7.30 (s, 2H), 4.29 (t, 4H, J = 6.0 Hz), 3.85 (s, 6H), 2.30-2.26 (m, 2H).

(d) 1,1’-[[(propan-1,3diol)dioksi] bis[(5-metoksi-2-nitro-1,4-fenilen)karbonil] ] bis[(2S,4R)-metil-4-hidroksipirolidin-2-karboksilat] (6)

[0172] U mešanu suspenziju nitrobenzojeve kiseline 5 (43 g, 92.3 mmol) i DMF (6 mL) u anhidrovanom DCM (600 mL) dodat je oksalilhlorid (24.5 mL, 35.6 g, 281 mmol). Posle početne ekspresije, reakciona suspenzija postaje rastvor i smeša je ostavljena da se meša na sobnoj temperaturi 16 sati. Pretvaranje u hlorid kiseline potvrđen je tretiranjem uzorka reakcione smeše sa MeOH, a dobijeni bis-metil estar je primećen pomoću LC/MS. Većina rastvarača je uklonjen isparavanjem pod redukovanim pritiskom; dobijeni koncentrovani rastvor je ponovo rastvoren u minimalnoj količini suvog DCM i triturisan sa dietil etrom. Dobijeni žuti talog sakupljen je sa filtracijom, ispran sa hladnim dietil etrom i sušen u trajanju od 1 sata u vakuumskoj pećnici pri 40°C. Čvrsti kiseli hlorid je dodat u delovima u trajanju od 25 min u mešanu suspenziju (2S,4R)-metil-4-hidroksipirolidin-2-karboksilat hidrohlorida (38.1 g, 210 mmol) i TEA (64.5 mL, g, 463 mmol) u DCM (400mL) pri -40°C (suvi led/CH3CN). Trenutno je reakcija završena kako je procenjeno od LC/MS (2.47 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 721 ([M H] ., 100). Smeša se razblaži sa (200 mL) i opere sa 1N HCl (300 mL), zasićenim NaHCO3 (300 mL), rastvorom soli (400 mL), osuši (MgSO4), filtrira i rastvarač upari u vakumu da se dobije čist proizvod 6 kao čvrsta narandžasta supstanca (66.7 g, 100%). [α]<22>D= -46.1°(c = 0.47, CHCl3);<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) (rotameri) δ 7.63 (s, 2H), 6.82 (s, 2H), 4.79-4.72 (m, 2H), 4.49-4.28 (m, 6H), 3.96 (s, 6H), 3.79 (s, 6H), 3.46-3.38 (m, 2H), 3.02 (d, 2H, J = 11.1 Hz), 2.48-2.30 (m, 4H), 2.29-2.04 (m, 4H);<13>C NMR (100 MHz, CDCl3) (rotameri) δ 172.4, 166.7, 154.6, 148.4, 137.2, 127.0, 109.7, 108.2, 69.7, 65.1, 57.4, 57.0, 56.7, 52.4, 37.8, 29.0; IR (ATR, CHCl3) 3410 (br), 3010, 2953, 1741, 1622, 1577, 1519, 1455, 1429, 1334, 1274, 1211, 1177, 1072, 1050, 1008, 871 cm<-1>; MS (ES+) m/z (relativni intenzitet) 721 ([M H]<+>, 47), 388 (80); HRMS [M H]<+>teoretski C31H36N4O16m/z 721.2199, pronađeno (ES<+>) m/z 721.2227.

(e) 1,1'-[[(Propan-1,3-diil)dioksi] bis(11aS,2R)-2-(hidroksi)-7-metoksi-1,2,3,10,11,11a-heksahidro-5H-pirolo[2,1-c] [1,4] -benzodiazepin-5,11-dion] (7)

[0172] Metoda A: Rastvoru nitroestra 6 (44 g, 61.1 mmol) u MeOH (2.8 L) dodat je u sveže nabavljan Raney® nikl (∼ 50 g of a ∼ 50% mulja u H2O) i anti-bumping granule u 5L bocu sa 3-vrata sa okruglim dnom. Smeša je zagrevana refluksom, a zatim je u kapima rastvoren rastvor hidrazin hidrata (21.6 mL, 22.2 g, 693 mmol) u MeOH (200 mL), pri čemu je primećena snažna ekspresija. Kada je dodavanje završeno (~ 45 min.) pažljivo je dodan dodatni Ranei® nikal dok se ne isprazni, a početna žuta boja reakcione smeše je potrošena. Smeša je zagrevana na refluksu još 5 min pri čemu se reakcija zaključila sa TLC (90:10 v/v CHCl3/MeOH) i LC/MS (2.12 min (ES ) m / z (relativni intenzitet) 597 ([M H]<+>., 100)). Reakciona smeša je odmah vruća filtrirana kroz sinterni levak koji sadrži celit sa usisavanjem vakuuma. Filtrat je smanjen u zapremini isparavanjem u vakuumu, pri čemu se formirao bezbojni talog koji je sakupljen filtriranjem i osušen u vakuumskom eksikatoru da bi se obezbedio 7 (31 g, 85%). [α] 27

D= 404°(c = 0.10, DMF);<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.2 (s, 2H, NH), 7.26 (s, 2H), 6.73 (s, 2H), 5.11 (d, 2H, J = 3.98 Hz, OH), 4.32-4.27 (m, 2H), 4.19-4.07 (m, 6H), 3.78 (s, 6H), 3.62 (dd, 2H,

2

J = 12.1, 3.60 Hz), 3.43 (dd, 2H, J = 12.0, 4.72 Hz), 2.67-2.57 (m, 2H), 2.26 (p, 2H, J = 5.90 Hz), 1.99-1.89 (m, 2H);<13>C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 169.1, 164.0, 149.9, 144.5, 129.8, 117.1, 111.3, 104.5, 54.8, 54.4, 53.1, 33.5, 27.5; IR (ATR, blago) 3438, 1680, 1654, 1610, 1605, 1516, 1490, 1434, 1379, 1263, 1234, 1216, 1177, 1156, 1115, 1089, 1038, 1018, 952, 870 cm<-1>; MS (ES<+>) m/z (relativni intenzitet) 619 ([M Na]<+>, 10), 597 ([M H]<+>, 52), 445 (12), 326 (11); HRMS [M H]<+>teoretski C29H32N4O10m/z 597.2191, pronađeno (ES<+>) m/z 597.2205.

[0174] Metoda B: Suspenziji 10% Pd/C (7.5 g, 10% w / w) u DMF (40 mL) dodat je rastvor nitroestera 6 (75 g, 104 mmol) u DMF (360 mL). Suspenzija se hidrogenizovana u Parrovoj aparaturi za hidrogenizovanje tokom 8 sati. Napredovanje reakcije praćeno je s LC/MS nakon prestanka uzimanja vodonika. Čvrsti Pd/C je uklonjen filtriranjem i filtrat je koncentriran rotacijskim isparavanjem pod vakuumom (ispod 10 mbara) na 40°C da bi se dobilo tamno ulje koje sadrži tragove DMF i rezidualni uglja. Ostatak se razblaži u EtOH (500 mL) na 40°C na vodenoj kupci (rotaciona kupka za isparavanje), a dobijena suspenzija se filtrira kroz celit i ispere etanolom (500 mL) da se dobije čist filtrat. U rastvor je dodat hidrazin hidrat (10 mL, 321 mmol) i reakciona smeša je zagrevana pri refluksu. Posle 20 minuta je primećeno stvaranje belog taloga i refluksu je dozvoljeno da nastavi još 30 minuta. Smesa je ostavljena da se ohladi na sobnu temperaturu a precipitat je uklonjen filtracijom, ispran dietil-eterom (2:1 volumena precipitata) i sušen u vakuumskom desikatoru da bi se dobio 7 (50 g, 81%). Analitički podaci za metoda B: Identični onima dobijenim za Metodu A (optička rotacija,<1>H NMR, LC/MS i TLC).

(f) 1,1'-[[(Propan-1,3-diil)dioksi] bis(11aS, 2R)-2-(terc-butildimetilsililoksi)-7-metoksi-1,2,3,10,11,11a-heksahidro-5H-pirolo[2,1-c] [1,4] -benzodiazepin-5,11-dion] (8)

[0175] TBSCI (27.6 g, 182.9 mmol) i imidazol (29.9 g, 438.8 mmol) su dodati u mutni rastvor tetralaktama 7 (21.8 g, 36.6 mmol) u bezvodnom DMF (400 mL) pri 0°C (led/aceton). Smeša je ostavljena da se meša u atmosferi azota u trajanju od 3 sata, nakon čega je reakcija ocenjena kao kompletna prema LC/MS (3.90 min (ES ) m/z (relativni intenzitet) 825 ([M H]<+>., 100). Reakciona smeša je sipana na led (~ 1.75 L) i ostavljena da se zagreje do sobne temperature uz mešanje. Dobijeni bjeli talog je sakupljen vakuum filtracijom, ispran H2O, dietil etrom i osušen u vakuumskoj sušilici da bi se dobilo čisto 8 (30.1 g, 99%). [α]<23>D= 234°(c = 0.41, CHCl3);<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.65 (s, 2H, NH), 7.44 (s, 2H), 6.54 (s, 2H), 4.50 (p, 2H, J = 5.38 Hz), 4.21-4.10 (m, 6H), 3.87 (s, 6H), 3.73-3.63 (m, 4H), 2.85-2.79 (m, 2H), 2.36-2.29 (m, 2H), 2.07-1.99 (m, 2H), 0.86 (s, 18H), 0.08 (s, 12H);<13>C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 170.4, 165.7, 151.4, 146.6, 129.7, 118.9, 112.8, 105.3, 69.2, 65.4, 56.3, 55.7, 54.2, 35.2, 28.7, 25.7, 18.0, -4.82 and -4.86; IR (ATR, CHCl3) 3235, 2955, 2926, 2855, 1698, 1695, 1603, 1518, 1491, 1446, 1380, 1356, 1251, 1220, 1120, 1099, 1033 cm<-1>; MS (ES<+>) m/z (relativni intenzitet) 825 ([M H]<+>, 62), 721 (14), 440 (38); HRMS [M H]<+>teoretski C41H60N4O10Si2m/z 825.3921, pronađeno (ES<+>) m/z 825.3948.

(g) 1,1'-[[(Propan-1,3-diil)dioksi] bis(11aS,2R)-2-(terc-butildimetilsililoksi)-7-metoksi-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-1,2,3,10,11,11a-heksahidro-5H-pirolo[2,1-c] [1,4] -benzodiazepin-5,11-dion] (9)

[0175] Rastvoru n-BuLi-ja (68.3 mL 1.6 M rastvora u heksanu, 109 mmol) dodato je u kapima u mešanu suspenziju tetralaktama 8 (30.08 g, 36.4 mmol) u anhidrovanom THF (600 mL) na -30°C (Suvi led/etilen glikol) u atmosferi azota. Reakciona smeša je ostavljena da se meša na ovoj temperaturi tokom 1 sata (sada crvenkasto narandžasta boja), pri čemu se u kapima dodaju rastvor SEMCI (19.3 mL, 18.2 g, 109 mmol) u anhidrovanom THF (120 mL). Reakciona smeša je ostavljena da se lagano zagreje do sobne temperature i mešana 16 sati u atmosferi azota. Reakcija je ocenjena kao što je procenjeno sa TLC (EtOAc) i LC/MS (4.77 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 1085 ([M H] ., 100). THF je uklonjen isparavanjem u vakumu i nastali ostatak je rastvoren u EtOAc (750 mL), ispran sa H2O (250 mL), slanim rastvorom (250 mL), osušen (MgSO4) filtriran i uparen u vakuumu da bi se dobio sirovi N10-SEM-zaštićen tetralaktam 9 kao ulje (max<m>39.5 g, 100%). Proizvod se prenosi na sledeći korak bez prečišćavanja. [α]<23>D= 163°(c = 0.41, CHCl3);<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.33 (s, 2H), 7.22 (s, 2H), 5.47 (d, 2H, J = 9.98 Hz), 4.68 (d, 2H, J = 9.99 Hz), 4.57 (p, 2H, J = 5.77 Hz), 4.29-4.19 (m, 6H), 3.89 (s, 6H), 3.79-3.51 (m, 8H), 2.87-2.81 (m, 2H), 2.41 (p, 2H, J = 5.81 Hz), 2.03-1.90 (m, 2H), 1.02-0.81 (m, 22H), 0.09 (s, 12H), 0.01 (s, 18H);<13>C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 170.0, 165.7, 151.2,

2

147.5, 133.8, 121.8, 111.6, 106.9, 78.1, 69.6, 67.1, 65.5, 56.6, 56.3, 53.7, 35.6, 30.0, 25.8, 18.4, 18.1, -1.24, -4.73; IR (ATR, CHCl3) 2951, 1685, 1640, 1606, 1517, 1462, 1433, 1360, 1247, 1127, 1065 cm-<1>; MS (ES<+>) m/z (relativni intenzitet) 1113 ([M Na]<+>, 48), 1085 ([M H]<+>, 100), 1009 (5), 813 (6); HRMS [M H]<+>teoretski C53H88N4O12Si4m/z 1085.5548, pronađeno (ES<+>) m/z 1085.5542.

(h) 1,1'-[[(Propan-1,3-diil)dioksi] bis(11aS,2R)-2-hidroksi-7-metoksi-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-1,2,3,10,11,11a-heksahidro-5H-pirolo[2,1-c] [1,4] -benzodiazepin-5,11-dion] (10)

[0177] Rastvor TBAF (150 mL 1.0 M rastvora u THF, 150 mmol) je dodat u mešani rastvor sirovog bis-silil etera 9 [84.0 g (max<m>56.8 g), 52.4 mmol] u THF (800 mL) na sobnoj temperaturi. Nakon mešanja u trajanju od 1 sata, analiza reakcione smeše sa TLC (95:5 v/v CHCl3/MeOH) pokazala je završenu reakciju. THF je uklonjen evaporacijom pod redukovanim pritiskom na sobnoj temperaturi i dobijeni ostatak je rastvoren u EtOAc (500 mL) i ispran sa NH4Cl (300 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani sa slanim rastvorom (60 mL), osušeni (MgSO4), filtrirani i upareni pod redukovanim pritiskom da bi se dobio sirovi proizvod. Prečišćavanje fleš hromatografijom (gradijentna elucija: 100% CHCl3to 96:4 v/v CHCl3/MeOH) dalo je čist tetralaktam 10 kao bela pena (36.0 g, 79%). LC/MS 3.33 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 879 ([M Na]<+>, 100), 857 ([M H]<+>, 40); [α]<23>D= 202°(c = 0.34, CHCl3);<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.28 (s, 2H), 7.20 (s, 2H), 5.44 (d, 2H, J = 10.0 Hz), 4.72 (d, 2H, J = 10.0 Hz), 4.61-4.58 (m, 2H), 4.25 (t, 4H, J = 5.83 Hz), 4.20-4.16 (m, 2H), 3.91-3.85 (m, 8H), 3.77-3.54 (m, 6H), 3.01 (br s, 2H, OH), 2.96-2.90 (m, 2H), 2.38 (p, 2H, J = 5.77 Hz), 2.11-2.05 (m, 2H), 1.00-0.91 (m, 4H), 0.00 (s, 18H);<13>C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 169.5, 165.9, 151.3, 147.4, 133.7, 121.5, 111.6, 106.9, 79.4, 69.3, 67.2, 65.2, 56.5, 56.2, 54.1, 35.2, 29.1, 18.4, -1.23; IR (ATR, CHCl3) 2956, 1684, 1625, 1604, 1518, 1464, 1434, 1361, 1238, 1058, 1021 cm<-1>; MS (ES<+>) m/z (relativni intenzitet) 885 ([M 29]<+>, 70), 857 ([M H]<+>, 100), 711 (8), 448 (17); HRMS [M H]<+>teoretski C41H60N4O12Si2m/z 857.3819, pronađeno (ES<+>) m/z 857.3826.

(i) 1,1'-[[(Propan-1,3-diil)dioksi] bis(11aS)-7-metoksi-2-okso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-1,2,3,10,11,11a-heksahidro-5H-pirolo[2,1-c] [1,4] -benzodiazepin-5,11-dion] (11)

[0178] Diol 10 (25.6 g, 30 mmol, 1 ekv.), NaOAc (6.9 g, 84 mmol, 2.8 ekv.) iI TEMPO (188 mg, 1.2 mmol, 0.04 ekv.) su rastvoreni u DCM (326 mL) pod Ar. Ovo se ohladi na -8°C (unutrašnja temperatura) i TCCA (9.7 g, 42 mmol, 1.4 ekv.) je dodato u porcijama tokom 15 minuta. TLC (EtOAc) i LC/MS [3.60 min. (ES+) m/z (relativni intenzitet) 854.21 ([M H] ., 40), (ES-) m/z (relativni intenzitet) 887.07 ([M - H Cl] -., 10)] posle 30 minuta se pokazalo da je reakcija završena. Dodaje se hladan DCM (200 mL) i smeša se filtrira kroz sloj celita pre ispiranja sa rastvorom zasićenog natrijum hidrogen karbonat/natrijum tiosulfata (1:1 v/v; 200 mL x 2). Organski sloj je osušen sa MgSO4, filtriran i rastvarač je uklonjen u vakuumu a rezultat je žutom/narandžasta sunđerasta masa (25.4 g, 99%). LC/MS [3.60 min. (ES+) m/z (relativni intenzitet) 854.21 ([M H]<+>, 40); [α]<20>D= 291°(c = 0.26, CHCl3);<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.32 (s, 2H), 7.25 (s, 2H), 5.50 (d, 2H, J = 10.1 Hz), 4.75 (d, 2H, J = 10.1 Hz), 4.60 (dd, 2H, J = 9.85, 3.07 Hz), 4.31-4.18 (m, 6H), 3.89-3.84 (m, 8H), 3.78-3.62 (m, 4H), 3.55 (dd, 2H, J = 19.2, 2.85 Hz), 2.76 (dd, 2H, J = 19.2, 9.90 Hz), 2.42 (p, 2H, J = 5.77 Hz), 0.98-0.91 (m, 4H), 0.00 (s, 18H);<13>C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 206.8, 168.8, 165.9, 151.8, 148.0, 133.9, 120.9, 111.6, 107.2, 78.2, 67.3, 65.6, 56.3, 54.9, 52.4, 37.4, 29.0, 18.4, -1.24; IR (ATR, CHCl3) 2957, 1763, 1685, 1644, 1606, 1516, 1457, 1434, 1360, 1247, 1209, 1098, 1066, 1023 cm<-1>; MS (ES<+>) m/z (relativni intenzitet) 881 ([M 29]<+>, 38), 853 ([M H]<+>, 100), 707 (8), 542 (12); HRMS [M H]<+>teoretski C41H56N4O12Si2m/z 853.3506, pronađeno (ES<+>) m/z 853.3502.

(j) 1,1'-[[(Propan-1,3-diil)dioksi] bis(11aS)-7-metoksi-2-[[(trifluorometil)sulfonil] oksi] -10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-1,10,11,11a-tetrahidro-5H-pirolo[2,1-c] [1,4] -benzodiazepin-5,11-dion] (12)

[0179] Anhidrovan 2,6-lutidin (5.15 mL, 4.74 g, 44.2 mmol) je ubrizgan jednim delom u rastvor bisketona 11 (6.08 g, 7.1 mmol) u suvom DCM (180 mL) na -45°C (suvi led/acetonitril) u atmosferi azota. Anhidrovan triflicni anhidrid, uzet iz sveže otvorene ampule (7.2 mL, 12.08 g, 42.8 mmol), ubrizgava se brzo u kapima, uz održavanje temperature na -40°C ili niže. Reakciona smeša je ostavljena da se meša na -45°C tokom 1 sata, pri čemu je (50/50 v/v n-heksan/EtOAc) pokazao kompletnu potrošnju polaznog materijala. Hladna reakciona smeša je odmah razblažena sa DCM (200 mL) i, uz snažno trešenje, oprana vodom (1 x 100 mL), 5% rastvorom limunske kiseline (1 x 200 mL) zasićenim NaHCO3(200 mL), rastvorom soli ML) i sušen sa (MgSO4). Filtriranje i isparavanje rastvarača pod redukovanim pritiskom dalo je sirovi proizvod koji je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (gradijentno eluiranje: 90:10 v/v n-heksan/EtOAc to 70:30 v/v n-heksan/EtOAc) bis-enol triflata 12 kao žuta pena (5.5 g, 70%). LC/MS 4.32 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 1139 ([M Na]<+>, 20); [α]<24>D= 271°(c = 0.18, CHCl3);<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.33 (s, 2H), 7.26 (s, 2H), 7.14 (t, 2H, J = 1.97 Hz), 5.51 (d, 2H, J = 10.1 Hz), 4.76 (d, 2H, J = 10.1 Hz), 4.62 (dd, 2H, J = 11.0, 3.69 Hz), 4.32-4.23 (m, 4H), 3.94-3.90 (m, 8H), 3.81-3.64 (m, 4H), 3.16 (ddd, 2H, J = 16.3, 11.0, 2.36 Hz), 2.43 (p, 2H, J = 5.85 Hz), 1.23-0.92 (m, 4H), 0.02 (s, 18H);<13>C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 167.1, 162.7, 151.9, 148.0, 138.4, 133.6, 120.2, 118.8, 111.9, 107.4, 78.6, 67.5, 65.6, 56.7, 56.3, 30.8, 29.0, 18.4, -1.25; IR (ATR, CHCl3) 2958, 1690, 1646, 1605, 1517, 1456, 1428, 1360, 1327, 1207, 1136, 1096, 1060, 1022, 938, 913 cm<-1>; MS (ES<+>) m/z (relativni intenzitet) 1144 ([M 28]<+>, 100), 1117 ([M H]<+>, 48), 1041 (40), 578 (8); HRMS [M H]<+>teoretski C43H54N4O16Si2S2F6m/z 1117.2491, pronađeno (ES<+>) m/z 1117.2465.

Primer 1

[0180]

(a) (S)-8-(3-(((S)-2-(4-aminofenil)-7-metoksi-5,11-diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5,11-diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-2-il trifluorometanesulfonat (13)

[0181] Pd(PPh3)4(116.9 mg, 0.101 mmol) je dodat u mešanu smešu bis-enol triflata 12 (5.65 g, 5.06 mmol), pinakol estra 4-aminofenilboronske kiseline (1 g, 4.56 mmol) Na2CO3(2.46 g, 23.2 mmol), MeOH (37 mL), toluen (74 mL) i vode (37 mL). Reakciona smeša je ostavljena da se meša na 30°C u atmosferi azota u toku 24 sata, nakon kojeg vremena je potrošen sav borni ester. Reakciona smeša je uparena do suvog, pre nego što se talog prebaci u EtOAc (150 mL) i isprana je sa H2O (2 x 100 mL), slanim rastvorom (150 mL), osušena (MgSO4), filtrirana i uparena pod redukovanim pritiskom da bi se obezbedio sirovi proizvod. Prečišćavanje fleš hromatografijom (gradijentna elucija: 80:20 v/v Heksan/EtOAc to 60:40 v/v Heksan/EtOAc) daje proizvod 13 kao žućkastu penu (2.4 g, 45%). LC/MS 4.02 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 1060.21 ([M+ H] ., 100);<1>H-NMR: (CDCl3, 400 MHz) δ 7.40 (s, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.27 (bs, 3H), 7.24 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.15 (t, 1H, J = 2.0 Hz), 6.66 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 5.52 (d, 2H, J = 10.0 Hz), 4.77 (d, 1H, J = 10.0 Hz), 4.76 (d, 1H, J = 10.0 Hz), 4.62 (dd,

1

1H, J = 3.7, 11.0 Hz), 4.58 (dd, 1H, J = 3.4, 10.6 Hz), 4.29 (t, 4H, J = 5.6 Hz), 4.00-3.85 (m, 8H), 3.80 - 3.60 (m, 4H), 3.16 (ddd, 1H, J = 2.4, 11.0, 16.3 Hz), 3.11 (ddd, 1H, J = 2.2, 10.5, 16.1 Hz), 2.43 (p, 2H, J = 5.9 Hz), 1.1-0.9 (m, 4H), 0.2 (s, 18H).<13>C-NMR: (CDCl3, 100 MHz) δ 169.8, 168.3, 164.0, 162.7, 153.3, 152.6, 149.28, 149.0, 147.6, 139.6, 134.8, 134.5, 127.9, 127.5, 125.1, 123.21, 121.5, 120.5, 120.1, 116.4, 113.2, 108.7, 79.8, 79.6, 68.7, 68.5, 67.0, 66.8, 58.8, 58.0, 57.6, 32.8, 32.0, 30.3, 19.7, 0.25.

(b) (S)-2-(4-Aminofenil)-8-(3-(((S)-2-ciklopropil-7-metoksi-5,11-diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-5,11(10H,11aH)-dion (14)

[0182] U dioksanu (30 mL) je rastvoren trifenilarsin (0.24 g, 0.8 mmol), srebro (I) oksid (1.02 g, 4.4 mmol), ciklopropilboronska kiselina (0.47 g, 5.5 mmol) i polazni materijal 13 (1.15 g, 1.1 mmol) u atmosferi argona. Triazijski kalijum fosfat (2.8 g, 13.2 mmol) je premazan sa šljunkom i malterom i brzo se dodaje u reakcionu smešu. Reakciona smeša je uklonjena i isparena argonom 3 puta i zagrevana na 71°C. Dodat je paladijum (II) bis (benzonitril hlorid) (84 mg, 0.22 mmol) i reakcioni sud je uklonjen i ispran argonom 3 puta. Nakon 10 minuta uzima se mali uzorak za analizu pomoću TLC (80:20 v/v etilacetat/heksan) i LC/MS. Nakon 30 minuta reakcija je završena (LC/MS analiza pokazala je potpunu potrošnju polaznog materijala) i reakcija je filtrirana kroz celit, a podloga za filtriranje isprana etil acetatom (400 mL). Filtrat je ispran vodom (2 x 200 mL) i slanim rastvorom (2 x 200 mL). Organski sloj je osušen sa MgSO4, filtriran i rastvarač je uklonjen u vakuumu. Prečišćavanje hromatografijom na silika gel koloni (30:70 v/v heksan/etil acetat) dalo je proizvod 14 u vidu narandžasto/žute čvrste supstance (0.66 g, 63%). Metoda 1, LC/MS (3.85 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 952.17 ([M H] ., 100).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.36 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.30 (s, 1H), 7.25 - 7.19 (m, 4H), 6.68 (s, 1H), 6.62 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 5.49 (dd, 2H, J = 5.6, 10.0 Hz), 4.73 (app. t, 2H, J = 10.8 Hz), 4.54 (dd, 1H, J = 3.2, 10.4 Hz), 4.40 (dd, 1H, J = 3.2, 10.4 Hz), 4.29 - 4.23 (m, 4H), 3.91 - 3.85 (m, 7H), 3.80 - 3.71 (m, 2H), 3.70 - 3.61 (m, 2H), 3.38 - 3.32 (m, 1H), 3.12 - 3.01 (m, 1H), 2.50 - 2.69 (m, 1H), 2.40 (q, 2H, J = 5.6 Hz), 1.50 - 1.43 (m, 1H), 0.99 - 0.71 (m, 6H), 0.54 - 0.59 (m, 2H), 0.00 (s, 18H) ppm.

(c) (S)-2-(4-Aminofenil)-8-(3-(((S)-2-ciklopropil-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-5(11aH)-on (15)

[0183] SEM dilaktam 14 (0.66 g, 0.69 mmol) rastvoren je u THF (23 mL) i ohlađen na -78°C u atmosferi argona. Super-Hidride® rastvor (1.7 mL, 1 M u THF) je dodan kap po kap tokom 5 minuta dok se prati temperatura. Posle 20 minuta uzorak je uzet i ispran vodom za LC/MS analizu. Dodata je voda (50 mL) i hladna kupka je uklonjena. Organski sloj je ekstrahovan i ispran sa slanim rastvorom (60 mL). Kombinovani vodeni slojevi su isprani sa CH2Cl2/MeOH (90/10 v/v) (2 x 50 mL). Kombinovani organski slojevi su osušeni sa MgSO4, filtrirani i rastvarač je uklonjen u vakuumu. Sirovi proizvod je rastvoren u MeOH (48 mL), CH2Cl2(18 mL) i vode (6 mL) i dodan je dovoljno silika gela kako bi se dobila gusta suspenzija. Posle 5 dana mešanja suspenzija se filtrira kroz sinterovani levak i opere sa CH2Cl2/MeOH (9: 1) (~ 200 mL) dok proizvod ne prestane eluirati. Organski sloj je ispran rastvorom soli (2 x 70 mL), osušen sa MgSO4, filtriran i rastvarač je uklonjen u vakuumu. Prečišćavanje hromatografijom na koloni silika gela (100% CHCl3do 96/4 v/v CHCl3/MeOH) dalo je proizvod 15 u vidu žute čvrste supstance (302 mg, 66%). Metoda 1, LC/MS (2.42 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 660.74 ([M H] ., 30).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.86 (d, 1H, J = 3.6 Hz), 7.78 (d, 1H, J = 3.6 Hz), 7.58 - 7.44 (m, 3H), 7.34 - 7.20 (m, 3H), 6.88 - 6.66 (m, 4H), 4.35 - 4.15 (m, 6H), 3.95 - 3.75 (m, 7H), 3.39 - 3.22 (m, 1H), 3.14 - 3.04 (m, 1H), 2.93 - 2.85 (m, 1H), 2.46 - 2.36 (m, 2H), 1.49 - 1.41 (m, 1H), 0.80 - 0.72 (m, 2H), 0.58 - 0.51 (app. s, 2H) ppm.

(d) Alil ((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-ciklopropil-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat (16)

2

[0184] U degaziranoj posudi s okruglim dnom napunjenoj s argonom, HO-Ala-Val-raspored (149.6 mg, 0.549 mmol) i EEDQ (135.8 mg, 0.549 mmol) otopljeni su u 9:1 smeši suvog CH2Cl2/MeOH (5 mL). Boca je zavijena u aluminijumsku foliju i reakciona smeša je ostavljena da se meša na sobnoj temperaturi 1 sat pre nego što je početni materijal 15 (302 mg, 0,457 mmol) dodat. Reakciona smeša je ostavljena da se meša još 40 sati na sobnoj temperaturi pre nego što se isparivači uklanjaju rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom (reakcijom je praćena sa LC/MS, RT početni materijal 2.32 min, (ES+ 660.29 ([M+H] .,100)). Sirovi proizvod je direktno prečišćen kolonskom hromatografskom na silika gelu (100% CHCl3to 90/10 v/v CHCl3/MeOH ), čime se dobija čist proizvod (16) u 42% prinos (174 mg). Metoda 2 LC/MS (2.70 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 914.73 ([M+H] ., 60), 660.43 (60), 184.31 (100)).

(e) (2S)-2-amino-N-((2S)-1-((4-(8-(3-((2-ciklopropil-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)-3-metilbutanamid (17)

[0185] Početni materijal 16 (170 mg, 0.185 mmol) rastvoren je u suvom CH2Cl2(5 mL) u koloni sa okruglim dnom napunjenim argonom pre nego što je dodat pirolidin (41 µL, 0.21 mmol). Bočica je prečišćena / ponovo napunjena tri puta argonom pre dodavanja Pd(PPh3)4(14 mg, 0.084 mmol) i ponovljena je operacija ispiranja. Nakon 1 sata, primećena je potpuna potrošnja polaznog materijala (reakciji je pratila LC/MS) i dodan je Et2O (50 mL) reakcionoj smeši koja je ostavljena da se meša sve dok se proizvod ne izdvojio iz rastvora. Talog je filtriran kroz sinterovani levak i opran dva puta sa Et2O (2 x 25 mL). Boca za skupljanje je zamenjena i izolovana je čvrsta supstanca koja je rastvorena u CHCl3(100 mL sav proizvod prolazio kroz sinterirani levak). Hlađenje je zatim uklonjeno rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom, kako bi se dobio sirovi proizvod 17 koji je direktno korišćen u sledećem koraku (168 mg). LC/MS metoda 2 (2.70 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 830.27 ([M+H] ., 50), 660.13 (80), 171.15 (100)).

(f) N-((R)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-ciklopropil-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)-1-(3-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)propanamido)-3,6,9,12,15,18,21,24-oktaoksaheptacosan-27-amid (18)

[0186] Početni materijal 17 (154 mg, 0.185 mmol) i EDCl.HCl (110 mg, 0.185 mmol) su otopljeni u suvom CH2Cl2(5 mL) u bočici sa okruglim dnom, pročišćeni i napunjeni argonom. Smeša je ostavljena da se meša na sobnoj temperaturi 1 sat pre nego što je dodat PEG8-maleimid (35.6 mg, 0.185 mmol) i reakciona smeša je mešana još 16 sati (ili dok reakcija nije završena, praćeni je putem LC/MS). Reakcioni rastvor je razblažen sa CH2Cl2(50 mL), a organski slojevi su isprani sa H2O (50 mL) i slanim rastvorom (50 mL) pre sušenja sa MgSO4,filtrirani i rastvarač je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom, kako bi se dobio sirovi proizvod. Prečišćavanje na silika gel kolonskoj hromatografiji (100% CHCl3do 85/15 v/v CHCl3/MeOH) dala je željeni proizvod (135 mg), međutim ostali tragovi nereagovanog PEG8-maleimida su primećeni (LC/MS, 2.21 min, metoda 2). Automatska hromatografija silika gela sa povratnom fazom (H2O/CH3CN) (videti opšte informacije za uslove) uspešno je uklonila nečistoće čime se dobija čisti finalni proizvod (18, 37 mg čistog proizvoda počevši od 110 mg, 33%). Ukupan prinos = 17%. Metoda 2 LC/MS (2.58 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 1404.03 ([M+H] ., 20), 702.63 (100)).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.91 (t, J = 3.5 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.54 - 7.50 (m, 2H), 7.45 (s, 1H), 7.39 - 7.31 (m, 2H), 6.87 (d, J = 10.5 Hz, 2H), 6.76 (s, 1H), 6.72 - 6.68 (m, 2H), 4.74 - 4.62 (m, 1H), 4.45 - 4.17 (m, 7H), 3.95 (s, 3H), 3.94 (s, 3H), 3.67 - 3.58 (m, 34H), 3.54 (m, 2H), 3.42 (dd, J = 10.2, 5.2 Hz, 2H), 3.16 - 3.07 (m, 1H), 2.92 (dd, J = 16.1, 4.1 Hz, 1H), 2.62 - 2.49 (m, 4H), 2.48 - 2.39 (m, 2H), 2.37 - 2.25 (m, 1H), 1.92 (s, 1H), 1.52 - 1.44 (m, 3H), 1.10 - 0.93 (m, 6H), 0.79 (dd, J = 9.2, 5.3 Hz, 2H), 0.57 (dd, J = 9.2, 5.3 Hz, 2H), NH nije primećeno.

Primer 2

[0187]

(a) (R)-2-((R)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonilil)amino)-3-metilbutanamido) propionska kiselina (20b)

[0188] HO-Ala-Val-H 20a (350 mg, 1.86 mmol) i Na2CO3(493 mg, 4.65 mmol) rastvoreni su u destilovanom H2O (15 mL) i smeša je ohlađena na 0°C pre dodavanja dioksana (15 mL) (Došlo je do delimičnog taloženja soli aminokiseline). Rastvor Fmoc-Cl (504 mg, 1.95 mmol) u dioksanu (15 mL) dodat je kap po kap uz snažno mešanje tokom 10 minuta. Dobijena smeša je mešana na 0°C tokom 2 sata pre uklanjanja ledene kupke i mešanje je održavano 16 sati. Rastvarač je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom i ostatak je rastvoren u vodi (150 mL). PH je podešen od 9 do 2 sa 1N HCl i vodeni sloj je naknadno ekstrahovan sa EtOAc (3x100 mL). Kombinovane organske materije su isprane slanim rastvorom soli (100 mL), osušene sa MgSO4, filtrirane i isparavanjem uklonjene rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom, dajući čisti HO-Ala-Val-Fmoc 20b (746 mg, 97% prinos). LC/MS 2.85 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 410.60 ;<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.79 (d, J=7.77 Hz, 2H), 7.60(d, J=7.77 Hz, 2H), 7.43(d, J=7.5 Hz, 2H), 7.34 (d, J=7.5 Hz, 2H), 6.30 (bs, 1H), 5.30 (bs, 1H), 4.71-7.56 (m, 1H), 4.54-4.36 (m, 2H), 4.08-3.91 (m, 1H), 2.21-2.07 (m, 1H), 1.50 (d, J=7.1 Hz, 3H), 1.06-0.90 (m, 6H).

(b) (9H-fluoren-9-il)metil ((S)-3-metil-1-okso-1-(((S)-1-okso-1-((4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)fenil)amino)propan-2-il)amino)butan-2-il)karbamat (20)

4

[0189] Dodan je pinakol estar 4-aminofenilboronske kiseline (146.9 mg, 0.67 mmol) u rastvor HOAla-Val-Fmoc 20b (330 mg, 0.8 mmol), DCC (166 mg, 0.8 mmol) i DMAP (5 mg, kat.) u suvom DCM (8 mL), prethodno se meša 30 minuta na sobnoj temperaturi u boca ispranoj argonom. Reakciona smeša je zatim ostavljena da se meša na sobnoj temperaturi preko noći. Nakon reakcije sledili su LCMS i TLC. Reakciona smeša je razblažena sa CH2Cl2i organske materije isprane su sa H2O i slanim rastvorom pre sušenja sa MgSO4, filtrirane i rastvarač je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Sirovi proizvod je osušen na koloni hromatografije silikagela (Heksan/EtOAc, 6:4) i čist proizvod 20 je izolovan kao bela čvrsta supstanca u 88% prinos (360 mg).

(c) 8-(3-((2-(4-((S)-2-((S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-metilbutanamido)propanamido)fenil)-7-metoksi-5,11-diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5,11-diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-2-il trifluorometanesulfonat (21)

[0190] Bis-triflat 12 (2.03 g, 1.81 mmol), boronski pinakol estar (1 g, 1.63 mmol) i Na2CO3(881 mg, 8.31 mmol) rastvoreni su u smeši toluena/MeOH/H2O, 2:1:1 (40 mL). Reakciona boca je prečišćena i napunjena argonom tri puta pre nego što je dodat tetrakis(trifenilfosfin)paladijum(0) (41 mg, 0.035 mmol) i reakciona smeša je zagrevana do 30 °C preko noći. Rastvarači su uklonjeni pod redukovanim pritiskom, a ostatak je stavljen u H2O (100 mL) i ekstrahovan sa EtOAc (3x100 mL). Kombinovane organske materije su isprane rastvorom soli (100 mL), osušene sa Na2CO3, filtrirane i isparljive materije uklonjene rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen kolonskom kolonskom kolutom (Heksan/EtOAc, 8:2 do 25:75) da bi se dobilo čisto 21 u 33% prinos (885 mg). LC/MS 3.85 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 1452.90 ;<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.78 - 7.16 (m, 17H), 7.13 (s, 1H), 6.51 - 6.24 (m, 1H), 5.51 (dd, J = 10.0, 5.1 Hz, 2H), 5.36 - 5.11 (m, 1H), 4.74 (dd, J = 10.1, 4.4 Hz, 2H), 4.70 - 4.53 (m, 2H), 4.47 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 4.37 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.27 (m, 4H), 4.20 - 4.14 (m, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 3.77 (ddd, J = 16.7, 9.0, 6.4 Hz, 3H), 3.71 - 3.61 (m, 2H), 3.24 - 2.91 (m, 3H), 2.55 - 2.33 (m, 2H), 2.22 - 2.07 (m, 1H), 1.52 - 1.37 (m, 3H), 1.04 - 0.86 (m, 10H), 0.00 (s, 18H).

(d) (9H-fluoren-9-il)metil((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-ciklopropil-7-metoksi-5,11-diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5,11-diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat (22)

[0191] Trifenilarsin (42 mg, 0.137 mmol) je dodat u smešu PBD-triflata 21 (250 mg, 0.172 mmol), ciklopropilboronske kiseline (73.9 mg, 0.86 mmol), srebrovog oksida (159 mg, 0.688 mmol) i tribazije kalijum fosfata 438 mg, 2.06 mmol) u suvom dioksanu (10 mL) u atmosferi argona. Reakcija je isprana argonom 3 puta i dodan je bis(benzonitril)paladijum(II) hlorid (13.2 mg, 0.034 mmol). Reakcija je više puta isprana Argonom 3 pre nego što je zagrejana na 75°C i mešana 10 minuta. Reakciona smeša je filtrirana kroz podlogu celita koja je kasnije isprana etil acetatom. Rastvarač je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Nastali ostatak je podvrgnut fleš hromatografiji na koloni (silika gel, 1% metanol/hloroform). Čiste frakcije su sakupljene i kombinovane, a višak eluenta je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio željeni proizvod 22 (132 mg, 50% prinos). LC/MS 3.83 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 1345.91 ;<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.88 - 7.14 (m, 17H), 6.69 (s, 1H), 6.45 - 6.25 (m, 1H), 5.57 - 5.41 (m, 2H), 5.34 - 5.14 (m, 1H), 4.78 - 4.67 (m, 2H), 4.62 - 4.55 (m, 1H), 4.50 - 4.45 (m, 2H), 4.51 - 4.44 (m, 1H), 4.31 - 4.21 (m, 4H), 4.16 (m, 1H), 3.92 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 3.82 - 3.71 (m, 2H), 3.66 (m, 3H), 3.40 - 3.28 (m, 1H), 3.07 (m, 1H), 2.70 - 2.57 (m, 1H), 2.47 - 2.36 (m, 2H), 2.15 (m, 1H), 1.51 - 1.40 (m, 3H), 1.03 - 0.87 (m, 11H), 0.77 - 0.71 (m, 2H), 0.60 - 0.54 (m, 2H), 0.00 (t, J = 3.0 Hz, 18H).

(e) (9H-fluoren-9-il)metil((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-ciklopropil-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat (23)

[0192] Rastvor Super-Hydride® (0.5 mL, 1 M u THF) dodat je u kapima u rastvor SEM dilaktam 22 (265 mg g, 0.19 mmol) u THF (10 mL) na -78°C u atmosferi argona. Dodavanje je završeno tokom 5 minuta kako bi se održala unutrašnja temperatura reakcione mešavine konstantno. Nakon 20 minuta, alikvot je prekinut vodom za LC/MS analizu, koja je otkrila da je reakcija završena. U reakcionu smešu je dodata voda (20 mL) i uklonjena je hladna kupka. Organski sloj je ekstrahovan sa EtOAc (3 x 30 mL), a kombinovani organski slojevi su isprani sa slanim rastvorom (50 mL), osušeni sa MgSO4, filtrirani i rastvarač uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Sirovi proizvod je rastvoren u MeOH (12 mL), CH2Cl2(6 mL), vodi (2 mL) i dovoljnom silika gelu da bi se formirala gusta suspenzija za mešanje. Posle 5 dana suspenzija je filtrirana kroz sinterovani levak i oprana sa CH2Cl2/MeOH (9:1) (200 mL) sve dok elucija proizvoda nije dovršena. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom (2 x 70 mL), osušen sa MgSO4, filtriran i rastvarač uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Prečišćavanje hromatografijom na koloni silika gela (100% CHCl3do 96% CHCl3/ 4% MeOH) dalo je proizvod 23 u vidu žute čvrste supstance (162 mg, 78%). LC/MS 3.02 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 1052.37.

(f) (2S)-2-amino-N-((2S)-1-((4-(8-(3-((2-ciklopropil-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)-3-metilbutanamid (17)

[0193] Dodan je višak piperidina (0.2 ml, 2 mmol) u rastvor SEM-dilaktama 23 (76 mg, 0.073 mmol) u DMF (1 mL). Smeša je ostavljena da se meša na sobnoj temperaturi tokom 20 min, pri čemu se reakcija završila (kako je nadgledana pomoću LC/MS). Reakciona smeša je razblažena sa CH2Cl2(75 mL) i organska faza je isprana sa H2O (3x75 mL) do potpunog uklanjanja piperidina. Organska faza je osušena preko MgSO4, filtrirana i višak rastvarača uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom, kako bi se dobio sirovi proizvod 17 koji je u sledećem koraku korišćen kao takav. LC/MS 2.32 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 830.00.

(g) N-((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-ciklopropil-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)-1-(3-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)propanamido)-3,6,9,12,15,18,21,24-oktaoksaheptacosan-27-amid (18)

[0194] EDCI hidrohlorid (14 mg, 0.0732 mmol) je dodat u suspenziju maleimid-PEG8-kiseline (43.4 mg, 0.0732 mmol) u suvom CH2Cl2(5 mL) u atmosferi argona. Smeša je mešana 1 sat na sobnoj temperaturi pre dodavanja PBD 17 (60.7 mg, 0.0732 mmol). Mešanje se održava sve dok se reakcija ne završi (obično 5 sati). Reakcija je razblažena sa CH2Cl2i organska faza je isprana sa H2O i slanim rastvorom pre nego što se osuši putem MgSO4, filtrira i višak rastvarača uklanja se rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Proizvod je prečišćen pažljivom hromatografijom na silika gelu (sporo eluiranje počinje sa 100% CHCl3do 9:1 CHCl3/MeOH), nakon čega sledi hromatografija sa reverznom fazom kako bi se uklonila ne reagovana maleimid-PEG8-kiselina. Proizvod 18 je izolovan u 17.6% (21.8 mg). LC/MS 2.57 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 1405.30 ;<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.91 (t, J = 3.5 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.54 - 7.50 (m, 2H), 7.45 (s, 1H), 7.39 - 7.31 (m, 2H), 6.87 (d, J = 10.5 Hz, 2H), 6.76 (s, 1H), 6.72 - 6.68 (m, 2H), 4.74 - 4.62 (m, 1H), 4.45 - 4.17 (m, 7H), 3.95 (s, 3H), 3.94 (s, 3H), 3.67 - 3.58 (m, 34H), 3.54 (m, 2H), 3.42 (dd, J = 10.2, 5.2 Hz, 2H), 3.16 - 3.07 (m, 1H), 2.92 (dd, J = 16.1, 4.1 Hz, 1H), 2.62 - 2.49 (m, 4H), 2.48 - 2.39 (m, 2H), 2.37 - 2.25 (m, 1H), 1.92 (s, 1H), 1.52 - 1.44 (m, 3H), 1.10 - 0.93 (m, 6H), 0.79 (dd, J = 9.2, 5.3 Hz, 2H), 0.57 (dd, J = 9.2, 5.3 Hz, 2H), NH nije primećeno.

Primer 3

[0195]

(a) (S)-7-metoksi-8-(3-(((S)-7-metoksi-2-(4-(4-metilpiperazin-1-il)fenil)-5,11-diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirolo[2,1-c] [1,4] benzodiazepin-8-il)oksi)propoksi)-5,11-diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirolo[2,1-c] [1,4] benzodiazepin-2-il trifluorometanesulfonat (24)

[0196] Pd (PPh3) 4 (20.6 mg, 0.018 mmol) je dodat u pomešanu smešu bis-enol triflata 12 (500 mg, 0.44 mmol), N-metil piperazin bornog estra (100 mg, 0.4 mmol), Na2CO3Mg, 2,05 mmol), MeOH (2.5 mL), toluena (5 mL) i vode (2.5 mL). Reakciona smeša je ostavljena da se meša na 30°C u atmosferi azota u toku 24 sata, nakon kojeg vremena je potrošen sav borni ester. Reakciona smeša je uparena do suvog pre nego što je ostatak prebačen u EtOAc (100 mL) i ispran sa H2O (2 x 50 mL), slanim rastvorom (50 mL), osušen (MgSO4), filtriran i uparen pod redukovanim pritiskom da bi se obezbedio sirovi proizvod. Prečišćavanje fleš hromatografijom (gradijentna elucija: 80:20 v/v Heksan/EtOAc do 60:40 v/v Heksan/EtOAc) dala je proizvod 24 kao žućkasta pena (122.6 mg, 25%). LC/MS 3.15 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 1144 ([M H] ., 20%).

(b) (9H-fluoren-9-il)metil ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-metoksi-8-(3-(((S)-7-metoksi-2-(4-(4-metilpiperazin-1-il)fenil)-5,11-diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirolo[2,1-c] [1,4] benzodiazepin-8-il)oksi)propoksi)-5,11-diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirolo[2,1-c] [1,4] benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat (25)

[0197] PBD-triflat 24 (359 mg, 0.314 mmol), boronski pinakol estar 20 (250 mg, 0.408 mmol) i trietilamin (0.35 mL, 2.51 mmol) rastvoreni su u smeši toluena/MeOH/H2O, 2:1:1 (3 mL). Mikrotalasna posuda je prečišćena i napunjena argonom tri puta pre dodavanja tetrakisa (trifenilfosfin) paladijuma (0) (21.7 mg, 0.018 mmol) i reakciona smeša se postavlja u mikrotalasno na 80°C tokom 10 minuta. Zatim je dodato CH2Cl2(100 mL) i organske materije isprane vodom (2 x 50 mL) i slanim rastvorom (50 mL), pre nego što se osuše sa MgSO4, filtriraju i isparljive materije se uklanjaju rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen kolonom za hromatografiju na silika gelu (CHCI3/MeOH, 100% do 9:1) da bi se dobio čist 25 (200 mg, 43% prinos). LC/MS 3.27 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 1478 ([M H] ., 100%).

(c) (9H-fluoren-9-il)metil ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-metoksi-8-(3-(((S)-7-metoksi-2-(4-(4-metilpiperazin-1-il)fenil)-5-okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c] [1,4] benzodiazepin-8-il)oksi)propoksi)-5-okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c] [1,4] benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat (26)

[0198] Rastvor Super-Hidride® (0.34 mL, 1 M u THF) dodat je kapanjem u rastvor SEM-dilaktam 25 (200 mg, 0.135 mmol) u THF (5 mL) na -78°C u atmosferi argona. Dodavanje je završeno tokom 5 minuta kako bi se održala unutrašnja temperatura reakcione mešavine konstantno. Nakon 20 minuta, alikvot je prekinut vodom za LC/MS analizu, koja je otkrila da je reakcija završena. U reakcionu smešu je dodata voda (20 mL) i uklonjena je hladna kupka. Organski sloj je ekstrahovan sa EtOAc (3 x 30 mL), a kombinovani organski slojevi su isprani sa slanim rastvorom (50 mL), osušeni sa MgSO4, filtrirani i rastvarač uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Sirovi proizvod je rastvoren u MeOH (6 mL), CH2Cl2(3 mL), vodi (1 mL) i dovoljno silika gela kako bi se formirala gusta suspenzija mešanja. Nakon 5 dana suspenzija je filtrirana kroz sinterovani levak i oprana sa CH2Cl2/MeOH (9:1) (100 mL) sve dok elucija proizvoda nije završena. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom (2 x 50 mL), osušen sa MgSO4, filtriran i rastvarač uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Prečišćavanje hromatografijom na koloni silika gela (100% CHCI3do 96% CHCI3/4% MeOH) dalo je proizvod 26 u vidu žute čvrste supstance (100 mg, 63%). LC/MS 2.67 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 1186 ([M H] ., 5%).

(d) (S)-2-amino-N-((S)-1-((4-((R)-7-metoksi-8-(3-(((R)-7-metoksi-2-(4-(4-metilpiperazin-1-il)fenil)-5-okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c] [1,4] benzodiazepin-8-il)oksi)propoksi)-5-okso-5,11adihidro-1H-pirolo[2,1-c] [1,4] benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)-3-metilbutanamid (27)

[0199] Dodat je piperidin (0.1 ml, 1 mmol) u rastvor PBD 26 (36.4 mg, 0.03 mmol) u DMF (0.9 mL). Smeša je ostavljena da se meša na sobnoj temperaturi tokom 20 min, pri čemu se reakcija završila (kako je nadgledana pomoću LC/MS). Reakciona smeša je razblažena sa CH2Cl2(50 mL) i organska faza je isprana sa H2O (3 x 50 mL) do potpunog uklanjanja piperidina. Organska faza je osušena preko MgSO4, filtrirana i višak rastvarača uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom, kako bi se dobio sirovi proizvod 27 koji je u sledećem koraku korišćen kao takav. LC/MS 2.20 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 964 ([M H] ., 5%).

(e) 6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-N-((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-metoksi-8-(3-(((S)-7-metoksi-2-(4-(4-metilpiperazin-1-il)fenil)-5-okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c] [1,4] benzodiazepin-8-il)oksi)propoksi)-5-okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c] [1,4] benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)heksanamid (28)

[0200] EDCL hidrohlorid (4.7 mg, 0.03 mmol) je dodat u suspenziju 6-maleimidoheksanojske kiseline (6.5 mg, 0.03 mmol) u suvom CH2Cl2(3 mL) u atmosferi argona. Smeša je mešana 1 sat na sobnoj temperaturi pre dodavanja PBD 27 (34 mg, sirov). Mešanje je održavano sve dok se reakcija nije završila (6 sati). Reakcija je razblažena sa CH2Cl2i organska faza je isprana sa H2O i slanim rastvorom pre nego što se osuši putem MgSO4, filtrira i višak rastvarača uklanja se rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Proizvod je prečišćen pažljivom hromatografijom na silika gelu (sporo eluiranje počinje sa 100% CHCl3do 9:1 CHCl3/MeOH), nakon čega sledi hromatografija sa reverznom fazom kako bi se uklonila ne reagovana maleimid-PEG8-kiselina. Proizvod 28 je izolovan u 41% u dva koraka (14.6 mg). LC/MS 2.40 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 1157 ([M H] ., 5%)

Primer 4 – Alternativna sinteza jedinjenja 25

[0201]

[0202] PBD-triflata 21 (469 mg, 0.323 mmol), boronskog pinakol estra (146.5 mg, 0.484 mmol) i Na2CO3(157 mg, 1.48 mmol) rastvoren je u smeši toluena/MeOH/H2O, 2:1:1 (10 mL). Reakciona posuda tri puta je pročišćena argonom pre nego što je dodat tetrakis(trifenilfosfin)paladijum(0) (7.41 mg, 0.0064 mmol) i reakciona smeša je zagrevana do 30°C preko noći. Rastvarači su uklonjeni pod redukovanim pritiskom i ostatak je doveden u H2O (50 mL) i izvađen sa EtOAc (3 x 50 mL). Kombinovane organske materije su isprane rastvorom soli (100 mL), osušene sa Na2CO3, filtrirane i isparljive materije uklonjene rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela ( CHCl3100% do CHCl3/MeOH 95%: 5%) da bi se dobilo čisto 25 u 33% Prinosu (885 mg). LC/MS 3.27 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 1478 ([M H] ., 100%).

Primer 5

[0203]

(a) (S)-2-(4-Aminofenil)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d] [1,3] dioksol-5-il)-7-metoksi-5,11-diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirolo[2,1-c] [1,4] benzodiazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-1H-pirolo[2,1-c] [1,4] benzodiazepin-5,11(10H,11aH)-dion (29)

[0204] 3, 4-(metilendioksi)fenil borne kiseline (356 mg, 2.1 mmol, 1.3 ekv.), TEA (1.8 mL, 12.9 mmol, 8 ekv.) i triflat/anilin 13 (1.75 g, 1.7 mmol, 1 ekv.) su rastvoreni u smeši etanola (7 mL), toluena (13 mL) i vode (2 mL) u atmosferi argona. Reakciona smeša je uklonjena i isprana argonom 3 puta pre dodavanja tetrakis(trifenilfosfin)paladijuma(0) (114 mg, 0.1 mmol, 0.06 ekv.). Posuda je ponovo uklonjena i isprana argonom 3 puta i zagrevana u mikrotalasnoj pećnici na 80°C u trajanju od 8 minuta uz prethodno mešanje od 30 sekundi. Analiza pomoću TLC (80:20 v/v etil acetat/heksan) ukazala je na potpunu potrošnju polaznog materijala. Reakciona smeša razređena je diklormetanom (50 mL) i isprana s vodom (50 mL). Organski sloj je osušen sa MgSO4, filtriran i rastvarač je uklonjen u vakuumu. Prečišćavanje hromatografijom na silika gel koloni (60:40 do 20:80 v/v heksan/etilacetat) dalo je proizvod 29 u vidu žute čvrste supstance (1.21 g, 71%). LC/MS (3.92 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 1032.44 ([M H] ., 100).

(b) (S)-2-(4-Aminofenil)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d] [1,3] dioksol-5-il)-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c] [1,4] benzodiazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-1H-pirolo[2,1-c] [1,4] benzodiazepin-5(11aH)-on (30)

[0205] SEM dilaktam 29 (0.25 g, 0.24 mmol, 1 ekv.) je rastvoren u THF (8 mL) i ohlađen na -78°C u atmosferi argona. Super-Hidride® (0.6 mL, 1 M u THF, 2.5 ekv.) dodat je kapanjem tokom 5 minuta dok se prati temperatura. Posle 20 minuta uzet je mali uzorak i rastvoren za LC/MS analizu. Dodato je vode (50 mL), hladna kupka je uklonjena i rastvor ispran etil acetatom (50 mL). Organski sloj je ekstrahovan i ispran sa slanim rastvorom (60 mL), osušen sa MgSO4, filtriran i rastvarač je uklonjen u vakuumu. Sirovi proizvod je rastvoren u EtOH (15 mL), CH2Cl2(7.5 mL) i vodi (2.5 mL) i dodato je dovoljno silika gela sve do guste suspenzije. Posle 5 dana mešanja, filtrira se kroz sinterovani levak i opere sa CH2Cl2/MeOH (9: 1) (100 mL) dok proizvod ne prestane eluirati. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom (2 x 50 mL), osušen sa MgSO4, filtriran i rastvarač je uklonjen u vakuumu. Prečišćavanje hromatografijom na koloni silika gela ( CHCl3sa gradijentom od 1% do 4% MeOH) dalo je proizvod 30 u vidu žute čvrste supstance (94 mg, 53%). LC/MS (2.53 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 739.64 ([M] ., 70).

(c) Alil ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d] [1,3] dioksol-5-il)-7-metoksi-5-okso-5,11adihidro-1H-pirolo[2,1-c] [1,4] benzodiazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c] [1,4] benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat (31)

[0206] U atmosferi argona, Alanin-Valin-Aloc (180 mg, 0.66 mmol, 1.2 ekv.) je mešan sa EEDK (163 mg, 0.66 mmol, 1.2 ekv.) u anhidrovanom CH2Cl2 (21 mL) i metanolu (1 mL) za 1 sat. PBD 30 (407 mg, 0.55 mmol, 1 ekv.) je rastvoren u anhidrovanom CH2CI2(21 mL) i metanolu (1 mL) i dodan u reakciju. LC/MS posle 5 dana mešanja na sobnoj temperaturi pokazala je formiranje proizvoda. Rastvarač je uklonjen u vakuumu pre prečišćavanja hromatografijom na koloni (CH2Cl2sa gradijentom od 1% do 6% MeOH) do prinos proizvoda 31 kao žuta čvrsta supstanca (184 mg, 34%). LC/MS (2.95 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 994.95 ([M H] ., 60).

(d) (S)-2-Amino-N-((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d] [1,3] dioksol-5-il)-7-metoksi-5-okso-5,11adihidro-1H-pirolo[2,1-c] [1,4] benzodiazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c] [1,4] benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)-3 metilbutanamid (32)

[0207] Imin 31 (100 mg, 0.1 mmol, 1 ekv.) je rastvoren u anhidrovanom DCM (10 mL) (uz pomoć jedne kapi metanola kao pomoć pri rastvaranju) u atmosferi argona. Pirolidin (30 mL, 0.15 mmol, 1.5 ekv.) je dodat kapanjem pre nego što je posuda uklonjena i isprana argonom tri puta. Dodat je Pd(PPh3)4(7 mg, 6 µmol, 0.06 ekv.), a posuda je evakuisana i isprskana sa argonom tri puta. LC/MS analiza je nakon 1 sata ukazala na formiranje proizvoda i potpun gubitak početnog materijala. U reakcionu smešu je dodato Et2O (60 mL) i ostavljeno je da se meša sve dok se proizvod ne nestao iz rastvora. Talog je filtriran kroz sinterovani levak i opran dva puta sa Et2O (2 x 20 mL). Sabirna posuda je zamenjena i

4

izolovana je čvrsta supstanca koja je rastvorena i isprana kroz sinter sa CHCl3(100 mL). Rastvarač je uklonjen u vakuumu da bi se sirovi proizvod 32 dobio kao žuta čvrsta supstanca koja je direktno korišćena u sledećem koraku. LC/MS (1.14 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 910.40 ([M H] ., 67).

(e) N-((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(Benzo[d] [1,3] dioksol-5-il)-7-metoksi-5-okso-5,11adihidro-1H-pirolo[2,1-c] [1,4] benzodiazepin-8-iI)oksi)propoksi)-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c] [1,4] benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)-1-(3-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)propanamido)-3,6,9,12,15,18,21,24-oktaoksaheptacosan-27-amid (33)

[0208] Imin 32 (92 mg, 0.1 mmol, 1.1 ekv.) je rastvoren u CHCl3 (6 mL) sa jednom kapom bezvodnog MeOH da bi se olakšalo rastvaranje. Dodata je Maleimid-PEG8-kiselina (53 mg, 0.09 mmol, 1 ekv.), a zatim EEDK (33 mg, 0.14 mmol, 1.5 ekv.). Ovo je ostavljeno da se snažno meša na sobnoj temperaturi pod argonom tokom 4 dana, dok LC/MS analiza pokazuje formiranje proizvoda. Rastvarač je uklonjen u vakuumu, a sirovi proizvod je delimično prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (CHCl3sa gradijentom od 1% do 10% MeOH) prinos 33 (81mg). Materijal je dalje prečišćen preparativnom HPLC, dajući 33 kao žutu čvrstu supstancu (26.3 mg, 18%). Brzo prolaženje kroz mravlju kiselinu: LC/MS (1.39 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 1132.85 ([M H] ., 60).

Primer 6

[0209]

(a) 9H-Fluoren-9-il)metil ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d] [1,3] dioksol-5-il)-7-metoksi-5,11-diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirolo[2,1-c] [1,4] benzodiazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5,11-diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirolo[2,1-c] [1,4] benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat (34)

[0210] Triflat 21 (0.5 g, 0.35 mmol, 1 ekv.), 3, 4-(metilendioksi)fenil borne kiseline (75 mg, 0.45 mmol, 1.3 ekv.) i Na2CO3(0.17 g, 1.6 mmol, 4.5 ekv.) su rastvoreni u toluenu (11 mL), EtOH (5.5 mL) i vodi (5.5 mL) u atmosferi argona. Bočica je uklonjena i isprana argonom tri puta. Dodat je Pd(PPh3)4(24 mg, 0.02 mmol, 0.06 ekv.) I ponovo je uklonjena i isprana sa argonom tri puta. Ovo je zagrevano na 30°C i ostavljeno da se meša preko noći. Analiza LC/MS pokazala je potpun gubitak početnog materijala. Rastvarač je uklonjen u vakuumu, a ostatak rastvoren u vodi (60 mL) pre ispiranja sa etil acetatom (60 mL x 3). Kombinovani organski slojevi su isprani slanim rastvorom (50 mL), osušeni sa MgSO4, filtrirani i rastvarač uklonjen u vakuumu. Prečišćavanje hromatografijom na koloni (50:50 do 25:75 v/v heksan/etilacetat) dalo je proizvod 34 kao žutu čvrstu supstancu (310 mg, 64%). LC/MS (1.44 min (ES-) m/z (relativni intenzitet) 1423.35 ([M - H] -., 79).

(b) (9H-Fluoren-9-il)metil ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d] [1,3] dioksol-5-il)-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c] [1,4] benzodiazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c] [1,4] benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat (35)

[0211] SEM dilaktam 34 (0.31 g, 0.22 mmol, 1 ekv.) je rastvoren u THF (10 mL) i ohlađen na -78°C u atmosferi argona. Super-Hidride® (0.5 mL, 1 M u THF, 2.5 ekv.) dodat je kapanjem tokom 5 minuta uz praćenje temperature. Nakon 30 minuta uzet je mali uzorak i rastvoren za LC/MS analizu. Dodata je voda (50 mL), hladna kupka je uklonjena i rastvor ispran etil acetatom (50 mL). Organski sloj je ekstrahovan i ispran sa slanim rastvorom (60 mL), osušen sa MgSO4, filtriran i rastvarač je uklonjen u vakuumu. Sirovi proizvod je rastvoren u EtOH (13.2 mL), CH2Cl2(6.6 mL) i vodi (2.2 mL) i dodato je dovoljno silika gela sve dok nije dobijena gusta suspenzija. Posle 5 dana mešanja, filtrira se kroz sinterovani levak i opere sa CH2Cl2/MeOH (9: 1) (100 mL) dok proizvod ne prestane eluirati. Organski sloj je ispran sa slanim rastvorom (2 x 50 mL), osušen sa MgSO4, filtriran i rastvarač je uklonjen u vakuumu. Prečišćavanje hromatografijom na koloni silika gela ( CHCl3sa gradijentom od 1% do 4% MeOH) dalo je čist proizvod 35 u obliku žute čvrste supstance (185 mg, 75%). LC/MS (1.70 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 1132.85 ([M H] ., 60).

(c) (S)-2-Amino-N-((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d] [1,3] dioksol-5-il)-7-metoksi-5-okso-5,11adihidro-1H-pirolo[2,1-c] [1,4] benzodiazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c] [1,4] benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)-3-metilbutanamid (32)

[0212] Imin 35 (82 mg, 0.07 mmol, 1 ekv.) je rastvoren u DMF (1 mL) pre laganog dodavanja piperidina (0,2 mL, 2 mmol, viška). Ovaj rastvor je ostavljen da se meša na sobnoj temperaturi 20 minuta dok LC/MS analiza pokazuje potpunu potrošnju početnog materijala. Reakciona smeša je razblažena sa CH2Cl2(50 mL), isprana sa vodom (50 mL x 4), osušena sa MgSO4, filtrirana i rastvarač je uklonjen u vakuumu. Proizvod 33 je korišćen bez daljeg prečišćavanja u sledećem koraku. LC/MS (1.15 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 910.60 ([M H] ., 58).

Primer 7

(i) (S)-(2-amino-5-metoksi-4-((triizopropilsilil)oksi)fenil)(2-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)-4-metil-2,3-dihidro-1H-pirol-1-il)metanon (49)

[0213]

(a) 5-metoksi-2-nitro-4-((triizopropilsilil)oksi)benzaldehid (42)

[0214] Čist triizopropilsililhlorid (56.4 mL, 262 mmol) dodaje se u smesu imidazola (48.7 g, 715.23 mmol) i 4-hidroksi-5-metoksi-2-nitrobenzaldehida 41 (47 g, 238 mmol) (usitnjeni zajedno). Smesa se zagreva dok se fenol i imidazol ne istope i pređu u rastvor (100°C). Reakciona smesa ostavljena je da se meša tokom 15 minuta, a zatim je ostavljena da se ohladi, nakon čega je uočeno da se čvrsta materija dobija na dnu posude (imidazol-hlorid). Reakciona smesa razređena je sa 5% EtOAc/heksan, i prebačena pravo na silika gel, i posuda je isprana sa 5% EtOAc/heksan, praćeno sa 10% EtOAc/heksan (usled niskih viškova, vrlo malo nereagovanog TIPSCI je pronađeno u proizvodu). Željeni proizvod je ispran sa s 5%-tnim etil acetatom u heksanu. Višak eluenta uklonjen rotacionim isparavanjem pod smanjenim pritiskom, praćeno sušenjem u visokom vakuumu kako bi se dobilo kristalno čvrsto telo osetljivo na svetlost (74.4 g, 88%). Čistoća je zadovoljavajuća pomoću LC/MS (4.22 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 353.88 ([M H]<+>, 100));<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.43 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.40 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 1.35 - 1.24 (m, 3H), 1.10 (m, 18H).

(b) 5-metoksi-2-nitro-4-((triizopropilsilil)oksi)benzoeva kiselina (43)

[0215] Rastvor natrijum hlorita (47.3 g, 523 mmol, 80% tehničke kvalitete) i monobazičnog natrijum dihidrogenfosfat (35.2 g, 293 mmol) (NaH2PO4) u vodi (800 mL) dodat je u rastvor jedinjenja 2 (74 g, 209 mmol) u tetrahidrofuranu (500 ml) pri sobnoj temperaturi. Vodonikov peroksid (60% w/w, 140 ml, 2.93 mol), odmah je dodat u snažno mešanu dvofaznu smesu. Reakciona smesa je razvila gas (kiseonik), početni materijal se otopio, a temperatura reakcione smese porasla do 45°C. Nakon 30 minuta LC/MS je pokazala da je reakcija završena. Reakciona smesa je ohlađena u ledenoj kupki i dodata joj je hlorovodična kiselina (1 M) kako bi se pH snizio na 3 (otkriveno je da je ovaj korak nepotreban u mnogim slučajevima, kako je pH na kraju reakcije već kisela, proverite pH pre ekstrakcije). Reakciona smesa je zatim ekstrakovana sa etil-acetatom (1 L) i organska faza je isprana slanim rastvorom (2 x 100 ml) i osušena preko magnezijum sulfata. Organska faza je filtrirana, a višak rastvora uklonjen rotacionim isparavanjem pod smanjenim pritiskom, da se dobije proizvod 43 u kvantitativnom prinosu kao žuto čvrsto telo. LC/MS (3.93 min (ES-) m/z (relativni intenzitet) 367.74 ([M - H]<->, 100));<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.36 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 3.93 (s, 3H), 1.34 - 1.22 (m, 3H), 1.10 (m, 18H).

(c) ((2S,4R)-2-(((terc-butildimetilsilil)oksi)metil)-4-hidroksipirolidin-1-il)(5-metoksi-2-nitro-4-((triizopropilsilil)oksi)fenil)metanon (45)

[0216] DCC (29.2 g, 141 mmol, 1.2 ekv) dodat je u rastvor kiseline 3 (43.5 g, 117.8 mmol, 1 ekv), i hidroksibenzotriazol hidrat (19.8 g, 129.6 mmol, 1.1 ekv) u dihlorometan (200 mL ) na 0°C. Hladna kupka je uklonjena i reakcija je ostavljena da se nastavi tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi, dok su istovremeno rastvor (2S, 4R) -2-t-butildimetilsililoksimetil-4-hidroksipirolidin 44 (30 g, 129.6 mmol, 1.1 ekv ) i trietilamin (24.66 mL, 176 mmol, 1,5 ekv) u dihlorometanu (100 mL) brzo dodati, na -10°C u atmosferi argona (u velikom obimu, vreme za dodavanje može se skratiti daljim hlađenjem reakcione smese. Reakciona smesa ostavljena je da se meša na sobnoj temperaturi tokom 40 minuta do 1 sata i praćena sa LC/MS i TLC (EtOAc). Čvrste čestice uklonjene su filtriranjem kroz celite, a organska faza je isprana hladnim vodenim 0.1 M HCl dok pH nije izmeren na 4 ili 5. Organska faza je zatim isprana vodom, a potom zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata i slani rastvora. Organski sloj je osušen pomoću magnezijum sulfata, filtriran, dok je višak rastvora odstranjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Ostatak je podvrgnut brzoj koloni hromatografije (silika gel; gradijent 40/60 etil-acetat/heksan do 80/20 etil-acetat/heksan). Višak rastvora je uklonjen u rotacionom isparivaču pod smanjenim pritiskom što je dalo čisti proizvod 45, (45.5 g čistog proizvoda, 66% i 17 g blago nečistog proizvoda, 90% ukupno). LC/MS 4.43 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 582.92 ([M H]<+>, 100);<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.66 (s, 1H), 6.74 (s, 1H), 4.54 (s, 1H), 4.40 (s, 1H), 4.13 (s, 1H), 3.86 (s, 3H), 3.77 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 3.36 (dd, J = 11.3, 4.5 Hz, 1H), 3.14 - 3.02 (m, 1H), 2.38 - 2.28 (m, 1H), 2.10 (ddd, J = 13.3, 8.4, 2.2 Hz, 1H), 1.36 - 1.19 (m, 3H), 1.15 - 1.05 (m, 18H), 0.91 (s, 9H), 0.17 - 0.05 (m, 6H), (prisustvo rotamera).

(d) (S)-5-(((terc-butildimetilsilil)oksi)metil)-1-(5-metoksi-2-nitro-4-((triizopropilsilil)oksi)benzoil)pirolidin-3-on (46)

4

[0217] TCCA (8.82 g, 40 mmol, 0.7 ekv) je dodat u mešan rastvor 45 (31.7 g, 54 mmol, 1 ekv) i TEMPO (0.85 g, 5.4 mmol, 0.1 ekv) u suvom dihlormetanu (250 mL ) na 0°C. Reakciona smesa je snažno mešana tokom 20 minuta, kada TLC (50/50 etil-acetat/heksan) pokazao potpuni utrošak početnog materijala. Reakciona smesa je filtrirana kroz celit i filtrat je ispran zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (100 ml), natrijum tiosulfata (9 g u 300 ml), slanim rastvorom (100 ml) i osušen preko magnezijum sulfata. Rotacionim isparavanjem pod smanjenim pritiskom dobijen je proizvod 46 u kvantitativnom prinosu. LC/MS 4.52 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 581.08 ([M H]<+>, 100);<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.78 - 7.60 (m, 1H), 6.85 - 6.62 (m, 1H), 4.94 (dd, J = 30.8, 7.8 Hz, 1H), 4.50 - 4.16 (m, 1H), 3.99 - 3.82 (m, 3H), 3.80 - 3.34 (m, 3H), 2.92 - 2.17 (m, 2H), 1.40 -1.18 (m, 3H), 1.11 (t, J = 6.2 Hz, 18H), 0.97 - 0.75 (m, 9H), 0.15 - -0.06 (m, 6H), (prisustvo rotamera).

(e) (S)-5-(((terc-butildimetilsilil)oksi)metil)-1-(5-metoksi-2-nitro-4-((triizopropilsilil)oksi)benzoil)-4,5-dihidro-1H-pirol-3-il trifluorometanesulfonat (47)

[0218] Trifilik anhidrid (27.7 ml, 46.4 g, 165 mmol, 3 ekv) ubrizgan je (kontrolisana temperatura) u snažno mešanu suspenziju ketona 46 (31.9 g, 55 mmol, 1 ekv) u suvom dihlormetanu (900 ml) u prisustvu 2,6-lutidina (25.6 ml, 23.5 g, 220 mmol, 4 ekv, osušen preko sita) na -50°C (aceton/suvi led). Reakciona smesa je ostavljena da se meša tokom 1.5 sati pri LC/MS, nakon manjeg dorađivanja (voda/dihlormetan), koje je pokazalo da je reakcija završena. Voda je dodata u još uvek hladnu reakcionu smesu, a organski sloj je odvojen i ispran zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata, slani rastvora i magnezijum sulfata. Organska faza je filtrirana, a višak rastvora uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Ostatak je podvrgnut brzoj koloni hromatografije (silika gel, 10/90 v/v etil acetat/heksan), uklanjanje viška eluensom dalo je proizvod 47 (37.6 g, 96 %) LC/MS, metoda 2, 4.32 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 712.89 ([M H]<+>, 100);<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.71 (s, 1H), 6.75 (s, 1H), 6.05 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 4.78 (dd, J = 9.8, 5.5 Hz, 1H), 4.15 - 3.75 (m, 5H), 3.17 (ddd, J = 16.2, 10.4, 2.3 Hz, 1H), 2.99 (ddd, J = 16.3, 4.0, 1.6 Hz, 1H), 1.45 - 1.19 (m, 3H), 1.15 - 1.08 (m, 18H), 1.05 (s, 6H), 0.95 - 0.87 (m, 9H), 0.15 - 0.08 (m, 6H).

(f) (S)-(2-(((terc-butildimetilsilil)oksi)metil)-4-metil-2,3-dihidro-1H-pirol-1-il)(5-metoksi-2-nitro-4-((triizopropilsilil)oksi)fenil)metanon (48)

[0219] Trifenilarsin (1.71 g, 5.60 mmol, 0.4 ekv) je dodat u smesu triflata 47 (10.00 g, 14 mmol, 1 ekv), metilboronske kiseline (2.94 g, 49.1 mmol, 3.5 ekv), srebro oksida (13 g, 56 mmol, 4 ekv), i tribazičnog kalijum fosfata (17.8 g, 84 mmol, 6 ekv) u suvom dioksanu (80 mL) u atmosferi argona. Reakciona smesa je očišćena argonom 3 puta i dodat je bis (benzonitril) paladijum (II) hlorid (540 mg, 1.40 mmol, 0.1 ekv). Reakcija je isprana argonom 3 puta pre nego što je zagrejana u trenutku do 110°C (drizinski blok za zagrevanje je prethodno zagrejan na 110°C pre dodavanja boce). Nakon 10 minuta reakcija je ohlađena na sobnu temperaturu i filtrirana kroz sloj celita. Rastvor je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Dobijeni ostatak podvrgnut je vakuumskoj koloni hromatografije (silika gel, 10% etil-acetat/heksan). Čisti fragmenti skupljeni su i kombinovani, a višak eluenta uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom čime je dobijen proizvod 48 (4.5 g, 55%). LC/MS, 4.27 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 579.18 ([M H]<+>, 100);<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.70 (s, 1H), 6.77 (s, 1H), 5.51 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 4.77 - 4.59 (m, 1H), 3.89 (s, 3H), 2.92 - 2.65 (m, 1H), 2.55 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 1.62 (d, J = 1.1 Hz, 3H), 1.40 - 1.18 (m, 3H), 1.11 (s, 9H), 1.10 (s, 9H), 0.90 (s, 9H), 0.11 (d, J = 2.3 Hz, 6H).

(g) (S)-(2-amino-5-metoksi-4-((triizopropilsilil)oksi)fenil)(2-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)-4-metil-2,3-dihidro-1H-pirol-1-il)metanon (49)

[0219] Cinkani prah (28 g, 430 mmol, 37 ekv) dodat je u rastvor jedinjenja 48 (6.7 g, 11.58 mmol) u 5% mravljoj kiselini u etanol v/v (70 ml) na oko 15°C. Nastala egzotermna reakcija kontrolisana je korišćenjem ledene kupke kako bi se održala temperatura reakcione smese ispod 30°C. Nakon 30 minuta, reakciona smesa filtrirana je kroz sloj celita. Filtrat je razređen sa etil acetatom, a organska faza isprana vodom, zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen pomoću magnezijum sulfata, filtriran, dok je višak rastvora odstranjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Ostatak je podvrgnut brzoj koloni hromatografije (silika gel; 10% etil acetat u heksanu). Čisti fragmenti su skupljeni i kombinovani, a višak eluenta uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom čime je dobijen proizvod 49 (5.1 g, 80%). LC/MS, 4.23 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 550.21 ([M H]<+>, 100);<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.28 (s, 1H), 6.67 (s, 1H), 6.19 (s, 1H), 4.64 - 4.53 (m, J = 4.1 Hz, 1H), 4.17 (s, 1H), 3.87 (s, 1H), 3.77 - 3.69 (m, 1H), 3.66 (s, 3H), 2.71 - 2.60 (m, 1H), 2.53 - 2.43 (m, 1H), 2.04 - 1.97 (m, J = 11.9 Hz, 1H), 1.62 (s, 3H), 1.26 - 1.13 (m, 3H), 1.08 - 0.99 (m, 18H), 0.82 (s, 9H), 0.03 - -0.03 (m, J = 6.2 Hz, 6H).

(ii) (11S,11aS)-alil 11-((terc-butildimetilsilil)oksi)-8-((5-iodopentil)oksi)-7-metoksi-2-metil-5-okso-11,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat

[0221]

(a) (S)-alil (2-(2-(((terc-butildimetilsilil)oksi)metil)-4-metil-2,3-dihidro-1H-pirol-1-karbonil)-4-metoksi-5-((triizopropilsilil)oksi)fenil)karbamat (50)

[0222] Alil hloroformat (0.30 mL, 3.00 mmol, 1.1 ekv) dodat je u rastvor amina 49 (1.5 g, 2.73 mmol) u prisustvu suvog piridina (0.48 mL, 6.00 mmol, 2.2 ekv) u suvom dihlorometanu (20 mL) na -78°C (aceton/suvi led). Nakon 30 minuta, hladna kupka je uklonjena i reakciona smesa je ostavljena da se zagreje na sobnu temperaturu. Reakciona smesa je razređena dihlormetanom i dodat je zasićeni vodeni rastvor bakar sulfata. Organski sloj je zatim sekvencionalno opran zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen pomoću magnezijum sulfata, filtriran, dok je višak rastvora odstranjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom, čime je dobijen proizvod 50 koji je direktno korišćen u sledećoj reakciji. LC/MS, 4.45 min (ES ) m/z (relativni intenzitet) 632.91 ([M H] ·, 100)

(b) (S)-alil (2-(2-(hidroksimetil)-4-metil-2,3-dihidro-1H-pirol-1-karbonil)-4-metoksi-5-((triizopropilsilil)oksi)fenil)karbamat (51)

[0223] Sirov 50 je rastvoren u 7:1:1:2 smesi sirćetne kiseline/metanola/tetrahidrofurana/vode (28:4:4:8 mL) i ostavljen da se meša na sobnoj temperaturi. Nakon 3 sata, potpuni nestanak početnog materijala uočen je od strane LC/MS. Reakciona smesa je razređena etil acetatom i sekvencijalno isprana vodom (2 x 500 mL), zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (200 ml) i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen pomoću magnezijum sulfata, filtriran, dok je višak etil acetata odstranjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Ostatak je podvrgnut brzoj koloni hromatografije (silika gel; 10% etil acetat u heksanu). Čisti fragmenti su skupljeni i kombinovani, a višak eluenta uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom čime je dobijen proizvod 51 (1 g, 71%). LC/MS, 3.70 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 519.13 ([M H]<+>, 95);<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.34 (s, 1H), 7.69 (s, 1H), 6.78 (s, 1H), 6.15 (s, 1H), 5.95 (ddt, J = 17.2, 10.5, 5.7 Hz, 1H), 5.33 (dq, J = 17.2, 1.5 Hz, 1H), 5.23 (ddd, J = 10.4, 2.6, 1.3 Hz, 1H), 4.73 (tt, J = 7.8, 4.8 Hz, 1H), 4.63 (dt, J =

4

5.7, 1.4 Hz, 2H), 4.54 (s, 1H), 3.89 - 3.70 (m, 5H), 2.87 (dd, J = 16.5, 10.5 Hz, 1H), 2.19 (dd, J = 16.8, 4.6 Hz, 1H), 1.70 (d, J = 1.3 Hz, 3H), 1.38 - 1.23 (m, 3H), 1.12 (s, 10H), 1.10 (s, 8H).

(c) (11S, 11aS)-alil 11-hidroksi-7-metoksi-2-metil-5-okso-8-((triizopropilsilil)oksi)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat (52)

[0224] Dimetil sulfoksid (0.35 mL, 4.83 mmol, 2.5 ekv) je kapanjem dodat u rastvor oksalil hlorida (0.2 ml, 2.32 mmol, 1.2 ekv) u suvom dihlormetanu (10 ml) na -78°C (suvi led/aceton) u atmosferi argona. Nakon 10 minuta, polako dodat je rastvor 51 (1 g, 1.93 mmol) u suvom dihlorometanu (8 mL) još uvek na temperaturi od -78°C. Nakon 15 minuta dodat je trietilamin (1.35 mL, osušen iznad 4Å molekularnih sita, 9.65 mmol, 5 ekv) kapanjem i suvi led/aceton je odstranjen. Reakciona smesa je ostavljena da postigne sobnu temperaturu i ekstrakovana je hladnom hlorovodičnom kiselinom (0.1 M), zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen pomoću magnezijum sulfata, filtriran, dok je višak dihlormetana odstranjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom čime je dobijen proizvod 52 (658 mg, 66%). LC/MS, 3.52 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 517.14 ([M H]<+>, 100);<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.20 (s, 1H), 6.75 - 6.63 (m, J = 8.8, 4.0 Hz, 2H), 5.89 - 5.64 (m, J = 9.6, 4.1 Hz, 2H), 5.23 - 5.03 (m, 2H), 4.68 - 4.38 (m, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.83 - 3.77 (m, 1H), 3.40 (s, 1H), 3.05 - 2.83 (m, 1H), 2.59 (d, J = 17.1 Hz, 1H), 1.78 (d, J = 1.3 Hz, 3H), 1.33 - 1.16 (m, 3H), 1.09 (d, J = 2.2 Hz, 9H), 1.07 (d, J = 2.1 Hz, 9H).

(d) (11S,11aS)-alil 11-((terc-butildimetilsilil)oksi)-7-metoksi-2-metil-5-okso-8-((triizopropilsilil)oksi)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat (53)

[0225] Terc-butildimetilsililtriflat (0.70 mL, 3.00 mmol, 3 ekv) dodat je u rastvor jedinjenja 52 (520 mg, 1.00 mmol) i 2,6-lutidina (0.46 mL, 4.00 mmol, 4 ekv) u suvom dihlormetanu (40 ml) na 0°C pod argonom. Nakon 10 min, hladna kupka je uklonjena, a reakciona smesa se meša na sobnoj temperaturi 1 sat. Reakciona smesa je ekstrakovana vodom, zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen pomoću magnezijum sulfata, filtriran, dok je višak odstranjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Ostatak je podvrgnut brzoj koloni hromatografije (silika gel, gradijent 10% etil acetata u heksanu do 20% etil acetata u heksanu). Čisti fragmenti su skupljeni i kombinovani, a višak eluenta uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom čime je dobijen proizvod 53 (540 mg, 85%). LC/MS, 4.42 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 653.14 ([M Na]<+>, 100);<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.20 (s, 1H), 6.71 - 6.64 (m, J = 5.5 Hz, 2H), 5.83 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 5.80 - 5.68 (m, J = 5.9 Hz, 1H), 5.14 - 5.06 (m, 2H), 4.58 (dd, J = 13.2, 5.2 Hz, 1H), 4.36 (dd, J = 13.3, 5.5 Hz, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.71 (td, J = 10.1, 3.8 Hz, 1H), 2.91 (dd, J = 16.9, 10.3 Hz, 1H), 2.36 (d, J = 16.8 Hz, 1H), 1.75 (s, 3H), 1.31 - 1.16 (m, 3H), 1.12 - 1.01 (m, J = 7.4, 2.1 Hz, 18H), 0.89 - 0.81 (m, 9H), 0.25 (s, 3H), 0.19 (s, 3H).

(e) (11S, 11aS)-alil 11-((terc-butildimetilsilil)oksi)-8-hidroksi-7-metoksi-2-metil-5-okso-11,11adihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat (54)

[0226] Litijum acetat (87 mg, 0.85 mmol) dodat je rastvoru jedinjenja 53 (540 mg, 0.85 mmol) u vlažnom dimetilformamidu (6 mL, 50:1 DMF/voda). Nakon 4 sata, reakcija je završena, a reakciona smesa je razređena etil-acetatom (25 mL) i isprana s vodenim rastvorom limunske kiseline (pH ~ 3), vodom i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen iznad magnezijum sulfata filtrirani i višak etil acetat se odstrani rotacijskim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Ostatak je podvrgnut brzoj koloni hromatografije (silika gel, gradijent 25% do 75% etil acetata u heksanu). Čisti fragmenti su skupljeni i kombinovani, a višak eluenta uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom čime je dobijen proizvod 54 (400 mg, kvantitativno). LC/MS, (3.33 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 475.26 ([M+H] , 100).

(f) (11S,11aS)-alil 11-((terc-butildimetilsilil)oksi)-8-((5-iodopentil)oksi)-7-metoksi-2-metil-5-okso-11,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat (55)

[0227] Dijodpentan (0.63 mL, 4.21 mmol, 5 ekv), i kalijum karbonat (116 mg, 0.84 mmol, 1 ekv) dodati su rastvoru fenola 54 (400 mg, 0.84 mmol) u acetonu (4 mL, osušen iznad molekularnog sita). Reakciona smesa je zatim zagrejana na 60°C i mešana 6 sati. Aceton je uklonjen rotacioniim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Dobijeni ostatak je podvrgnut brzoj koloni hromatografije

4

(silika gel, 50:50, v/v, heksan/etil acetat). Čisti fragmenti su skupljeni i kombinovani, a višak eluenta je uklonjen kako bi se dobio 55 u 90% upotrebi. LC/MS, 3.90 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 670.91 ([M] , 100).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.23 (s, 1H), 6.69 (s, 1H), 6.60 (s, 1H), 5.87 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.83 - 5.68 (m, J = 5.6 Hz, 1H), 5.15 - 5.01 (m, 2H), 4.67 - 4.58 (m, 1H), 4.45 - 4.35 (m, 1H), 4.04 - 3.93 (m, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.73 (td, J = 10.0, 3.8 Hz, 1H), 3.25 - 3.14 (m, J = 8.5, 7.0 Hz, 2H), 2.92 (dd, J = 16.8, 10.3 Hz, 1H), 2.38 (d, J = 16.8 Hz, 1H), 1.95 - 1.81 (m, 4H), 1.77 (s, 3H), 1.64 -1.49 (m, 2H), 0.88 (s, 9H), 0.25 (s, 3H), 0.23 (s, 3H).

(iii) (11S,11aS)-4-(2-(1-((1-(aliloksi)-4-metil-1,2-dioksopentan-3-il)amino)-1-oksopropan-2-il)hidrazinil)benzil 11-((terc-butildimetilsilil)oksi)-8-hidroksi-7-metoksi-2-metil-5-okso-11,11adihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat (70)

[0228]

(a) Alil 3-(2-(2-(4-((((2-((S)-2-(((terc-butildimetilsilil)oksi)metil)-4-metil-2,3-dihidro-1H-pirol-1-karbonil)-4-metoksi-5-((triizopropilsilil)oksi)fenil)karbamoil)oksi)metil)fenil)hidrazinil)propanamido)-4-metil-2-oksopentanoat (56)

[0229] Trietilamin (2.23 mL, 18.04 mmol, 2.2 ekv) je dodat u pomešan rastvor amina 49 (4 g, 8.20 mmol) i trifosgena (778 mg, 2.95 mmol, 0.36 ekv) u suvom tetrahidrofuranu (40 mL) na 5°C (ledena kupka). Napredovanje reakcije izocijanata praćeno je povremenim uklanjanjem alikvota iz reakcione smese i gašenjem metanolom i izvođenjem LC/MS analize. Nakon što je završeno formiranje izocijanata, rastvor Alloc-Val-AlaPABOH (4.12 g, 12.30 mmol, 1.5 ekv) i trietilamina (1.52 mL, 12.30 mmol, 1.5 ekv) u suvom tetrahidrofuranu (40 ml) brzo je dodat ubrizgavanjem u sveže pripremljen izocijanat. Reakciona smesa ostavljena je da se meša na 40°C tokom 4 sata. Višak rastvora je uklonjen

4

u rotacionom isparivaču pod redukovanim pritiskom. Dobijeni ostatak je podvrgnut brzoj koloni hromatografije (silika gel, gradijent, 1% metanol do 5% metanola u dihlormetanu). (Alternativni uslovi hromatografije koristeći EtOAc i heksan takođe su bili uspešni). Čisti fragmenti su skupljeni i kombinovani, a višak eluenta uklonjen rotacionim isparavanjem kako bi se dobio proizvod 56 (3.9 g, 50%). LC/MS, 4.23 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 952.36 ([M H]<+>, 100);<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.62 (br s, 1H), 8.46 (s, 1H), 7.77 (br s, 1H), 7.53 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.32 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.76 (s, 1H), 6.57 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.17 (s, 1H), 6.03 - 5.83 (m, 1H), 5.26 (dd, J = 33.8, 13.5 Hz, 3H), 5.10 (s, 2H), 4.70 - 4.60 (m, 2H), 4.58 (dd, J = 5.7, 1.3 Hz, 2H), 4.06 - 3.99 (m, 1H), 3.92 (s, 1H), 3.82 - 3.71 (m, 1H), 3.75 (s, 3H), 2.79 - 2.64 (m, 1H), 2.54 (d, J = 12.9 Hz, 1H), 2.16 (dq, J = 13.5, 6.7 Hz, 1H), 1.67 (s, 3H), 1.46 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.35 - 1.24 (m, 3H), 1.12 (s, 9H), 1.10 (s, 9H), 0.97 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.94 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.87 (s, 9H), 0.07 - -0.02 (m, 6H).

(b) Alil 3-(2-(2-(4-((((2-((S)-2-(hidroksimetil)-4-metil-2,3-dihidro-1H-pirol-1-karbonil)-4-metoksi-5-((triizopropilsilil)oksi)fenil)karbamoil)oksi)metil)fenil)hidrazinil)propanamido)-4-metil-2-oksopentanoat (57)

[0230] TBS eter 56 (1.32 g, 1.38 mmol) je rastvoren u 7:1:1:2 smesi sirćetne kiseline / metanola / tetrahidrofurana / vode (14:2:2:4 mL) i ostavljen je da se meša na sobnoj temperaturi. Nakon 3 sata više nije preostao početni materijal posmatran pomoću LC/MS. Reakciona smesa razređena je sa etilacetatom (25 mL) i opran vodom, zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen pomoću magnezijum sulfata, filtriran, dok je višak etil acetata odstranjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Dobijeni ostatak je podvrgnut brzoj koloni hromatografije (silika gel, 2% metanol u dihlorometanu). Čisti fragmenti su skupljeni i kombinovani, a višak eluenta uklonjen rotacionim isparavanjem kako bi se dobio proizvod 57 (920 mg, 80%). LC/MS, 3.60 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 838.18 ([M+H]<+>, 100).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.55 (s, 1H), 8.35 (s, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.52 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.31 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.77 (s, 1H), 6.71 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 6.13 (s, 1H), 5.97 - 5.82 (m, J = 5.7 Hz, 1H), 5.41 - 5.15 (m, 3H), 5.10 (d, J = 3.5 Hz, 2H), 4.76 - 4.42 (m, 5H), 4.03 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 3.77 (s, 5H), 2.84 (dd, J = 16.7, 10.4 Hz, 1H), 2.26 - 2.08 (m, 2H), 1.68 (s, 3H), 1.44 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.30 (dt, J = 14.7, 7.4 Hz, 3H), 1.12 (s, 9H), 1.10 (s, 9H), 0.96 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.93 (d, J = 6.8 Hz, 3H).

(c) (11S,11as)-4-(2-(1-((1-(aliloksi)-4-metil-1,2-dioksopentan-3-il)amino)-1-oksopropan-2-il)hidrazinil)benzil 11-hidroksi-7-metoksi-2-metil-5-okso-8-((triizopropilsilil)oksi)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat (58)

[0231] Dimetil sulfoksid (0.2 mL, 2.75 mmol, 2.5 ekv) dodat je kapanjem u rastvor oksalil hlorida (0.11 mL, 1.32 mmol, 1.2 ekv) u suvom dihlorometanu (7 mL) na -78 C (suvi led/aceton) u atmosferi argona. Nakon 10 minuta, polako je dodat rastvor 57 (920 mg, 1,10 mmol) u suvom dihlormetanu (5 ml) na temperaturi od još uvek -78°C. Nakon 15 minuta dodat je kapanjem trietilamin (0.77 mL, osušen iznad 4A molekularnih sita, 5.50 mmol, 5 ekv) i odstranjen je suvi led/aceton. Reakciona smesa je ostavljena da postigne sobnu temperaturu i ekstrakovana hladnom hlorovodičnom kiselinom (0.1 M), zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen pomoću magnezijum sulfata, filtriran, dok je višak dihlormetana odstranjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Dobijeni ostatak je podvrgnut brzoj koloni hromatografije (silika gel, gradijent 2% metanol do 5% metanola u dihlormetanu). Čisti fragmenti su skupljeni i kombinovani, a višak eluenta uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio proizvod 58 (550 mg, 60%). LC/MS, 3.43 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 836.01 ([M] ., 100).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.39 (s, 1H), 7.52 - 7.40 (m, 2H), 7.21 - 7.08 (m, J = 11.5 Hz, 2H), 6.67 (s, 1H), 6.60 -6.47 (m, J = 7.4 Hz, 1H), 5.97 - 5.83 (m, 1H), 5.79 - 5.66 (m, 1H), 5.38 - 4.90 (m, 6H), 4.68 - 4.52 (m, J = 18.4, 5.5 Hz, 4H), 4.04 - 3.94 (m, J = 6.5 Hz, 1H), 3.87 - 3.76 (m, 5H), 3.00 - 2.88 (m, 1H), 2.66 -2.49 (m, 2H), 2.21 - 2.08 (m, 2H), 1.76 (s, 3H), 1.45 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.09 - 0.98 (m, J = 8.9 Hz, 18H), 0.96 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.93 (d, J = 6.9 Hz, 3H).

(d) (11S,11aS)-4-(2-(1-((1-(Aliloksi)-4-metil-1,2-dioksopentan-3-il)amino)-1-oksopropan-2-il)hidrazinil)benzil 11-((terc-butildimetilsilil)oksi)-7-metoksi-2-metil-5-okso-8-((triizopropilsilil)oksi)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat (59)

4

[0232] Terc-butildimetilsililtriflat (0.38 mL, 1.62 mmol, 3 ekv) dodat je u rastvor jedinjenja 58 (450 mg, 0.54 mmol) i 2,6-lutidina (0.25 mL, 2.16 mmol, 4 ekv) u suvom dihlormetanu (5 mL) na 0°C pod argonom. Nakon 10 min, hladna kupka je uklonjena, a reakciona smesa se meša na sobnoj temperaturi 1 sat. Reakciona smesa je ekstrakovana vodom, zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen pomoću magnezijum sulfata, filtriran, dok je višak rastvora odstranjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Dobijeni ostatak je podvrgnut brzoj koloni hromatografije (silika gel; 50/50 v/v heksan/etil acetat). Čisti fragmenti su skupljeni i kombinovani, a višak eluenta uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio proizvod 59 (334 mg, 65%). LC/MS, 4.18 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 950.50 ([M] ., 100).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.53 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.44 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.21 (s, 1H), 7.08 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.72 - 6.61 (m, J = 8.9 Hz, 2H), 6.16 (s, 1H), 5.97 - 5.79 (m, J = 24.4, 7.5 Hz, 2H), 5.41 - 5.08 (m, 5H), 4.86 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 4.69 - 4.60 (m, 1H), 4.57 (s, 1H), 4.03 (t, J = 6.7 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.74 (td, J = 9.6, 3.6 Hz, 1H), 2.43 - 2.09 (m, J = 34.8, 19.4, 11.7 Hz, 3H), 1.76 (s, 3H), 1.43 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.30 - 1.21 (m, 3H), 0.97 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.92 (t, J = 8.4 Hz, 3H), 0.84 (s, 9H), 0.23 (s, 3H), 0.12 (s, 3H).

(e) (11S,11aS)-4-(2-(1-((1-(Aliloksi)-4-metil-1,2-dioksopentan-3-il)amino)-1-oksopropan-2-il)hidrazinil)benzil 11-((terc-butildimetilsilil)oksi)-8-hidroksi-7-metoksi-2-metil-5-okso-11,11adihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat (60)

[0233] Litijum acetat (50 mg, 0.49 mmol) dodat je rastvoru jedinjenja 59 (470 mg, 0.49 mmol) u vlažnom dimetilformamidu (4 ml, 50:1 DMF/voda). Nakon 4 sata, reakcija je završena, a reakciona smesa je razređena etil acetatom i isprana limunskom kiselinom (pH ∼ 3), vodom i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen iznad magnezijum sulfata filtrirani i višak etil acetat se odstrani rotacijskim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Dobijeni ostatak je podvrgnut brzoj koloni hromatografije (silika gel, gradijent, 50/50 do 25/75 v/v heksan/etil acetat). Čisti fragmenti su skupljeni i kombinovani, a višak eluenta uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio proizvod 60 (400 mg, kvantitativno). LC/MS, 3.32 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 794.18 ([M+H] ., 100).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.53 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.44 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.21 (s, 1H), 7.08 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.72 - 6.61 (m, J = 8.9 Hz, 2H), 6.16 (s, 1H), 5.97 - 5.79 (m, J = 24.4, 7.5 Hz, 2H), 5.41 - 5.08 (m, 5H), 4.86 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 4.69 - 4.60 (m, 1H), 4.57 (s, 1H), 4.03 (t, J = 6.7 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.74 (td, J = 9.6, 3.6 Hz, 1H), 2.43 - 2.09 (m, J = 34.8, 19.4, 11.7 Hz, 3H), 1.76 (s, 3H), 1.43 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.30 - 1.21 (m, 3H), 0.97 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.92 (t, J = 8.4 Hz, 3H), 0.84 (s, 9H), 0.23 (s, 3H), 0.12 (s, 3H).

(iv) (11S,11aS)-4-((2S,5S)-37-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-5-izopropil-2-metil-4,7,35-triokso-10,13,16,19,22,25,28,31-oktaoksa-3,6,34-triazaheptatriakontanamido)benzil 11-hidroksi-7-metoksi-8-((5-(((S)-7-metoksi-2-metil-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-8-il)oksi)pentil)oksi)-2-metil-5-okso-11,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat (64)

[0234]

4

(a) (11S)-alil 8-((5-(((11S)-10-(((4-(2-(1-((1-(aliloksi)-4-metil-1,2-dioksopentan-3-il)amino)-1-oksopropan-2-il)hidrazinil)benzil)oksi)karbonil)-11-((terc-butildimetilsilil)oksi)-7-metoksi-2-metil-5-okso-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-8-il)oksi)pentil)oksi)-11-((terc-butildimetilsilil)oksi)-7-metoksi-2-metil-5-okso-11,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat (61)

[0235] Kalijum karbonat (70 mg, 0.504 mmol, 1 ekv) dodat je u rastvor 55 (370 mg, 0.552 mmol, 1.2 ekv) i fenola 66 (400 mg, 0,504 mmol) u suvom acetonu (25 mL). Reakcija je mešana 8 sati na 70°C. LC/MS je pokazala da nije potrošen sav početni materijal, pa je reakciona smesa ostavljena da se meša preko noći na sobnoj temperaturi i mešana je još 2 sata narednog dan. Aceton je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Dobijeni ostatak podvrgnut je brzoj koloni hromatografije (silika gel, 80% etil-acetata u heksanu do 100% etil acetata). Čisti fragmenti su skupljeni i kombinovani, a višak eluenta uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio proizvod 61 (385 mg, 57%). LC/MS, 4.07 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 1336.55 ([M+H] ., 50).

(b) (11S)-alil 8-((5-(((11S)-10-(((4-(2-(1-((1-(aliloksi)-4-metil-1,2-dioksopentan-3-il)amino)-1-oksopropan-2-il)hidrazinil)benzil)oksi)karbonil)-11-hidroksi-7-metoksi-2-metil-5-okso-5,10,11,11atetrahidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-8-il)oksi)pentil)oksi)-11-hidroksi-7-metoksi-2-metil-5-okso-11,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat (62)

[0236] Tetra-n-butilamonijak fluorid (1 M, 0.34 ml, 0.34 mmol, 2 ekv) dodat je u rastvor 61 (230 mg, 0.172 mmol) u suvom tetrahidrofuranu (3 mL). Početni materijal je potpuno potrošen nakon 10 minuta. Reakciona smesa je razređena etil-acetatom (30 mL) i oprana vodom i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen pomoću magnezijum sulfata, filtriran, dok je višak etil acetata odstranjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Dobijeni ostatak 62 koristi se kao sirova smesa za sledeću reakciju. LC/MS, 2.87 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 1108.11 ([M+H] ., 100).

(c) (11S)-4-(2-(1-((1-amino-3-metil-1-oksobutan-2-il)amino)-1-oksopropan-2-il)hidrazinil)benzil 11-hidroksi-7-metoksi-8-((5-((7-metoksi-2-metil-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a]

[1,4] diazepin-8-il)oksi)pentil)oksi)-2-metil-5-okso-11,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat (63)

[0237] Tetrakis (trifenilfosfin) paladijum (0) (12 mg, 0.01 mmol, 0.06 ekv) dodat je u rastvor sirovog 62 (0.172 mmol) i pirolidina (36 mL, 0.43 mmol, 2.5 ekv) u suvom dihlormetanu (10 mL). Reakciona smesa je mešana 20 minuta, razređena dihlormetanom i isprana sekvencijačno zasićenim vodenim rastvorom amonijak hlorida i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen pomoću magnezijum sulfata, filtriran, dok je višak odstranjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Dobijeni ostatak 63 koristi se kao sirova smesa za sledeću reakciju. LC/MS, 2.38 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 922.16 ([M+H] ., 40).

(d) (11S,11aS)-4-((2S,5S)-37-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-5-izopropil-2-metil-4,7,35-triokso-10,13,16,19,22,25,28,31-oktaoksa-3,6,34-triazaheptatriacontanamido)benzil 11-hidroksi-7-metoksi-8-((5-(((S)-7-metoksi-2-metil-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-8-il)oksi)pentil)oksi)-2-metil-5-okso-11,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat (64)

[0238] 1-etil-3- (3'-dimetilaminopropil) karbodiimid (EDCI, 33 mg, 0.172 mmol) dodat je u rastvor sirovog 63 (0.172 mmol) i Mal-(PEG)8-kiseline (100 mg, 0.172 mmol) u suvom dihlormetanu (10 ml). Reakcija je mešana tokom 2 sata, i prisutnost početnog materijala nije se više primećivala pomoću LC/MS. Reakcija je razređena dihlormetanom i sekvencijalno isprana vodom i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen pomoću magnezijum sulfata, filtriran, dok je višak dihlormetana odstranjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Dobijeni ostatak je podvrgnut brzoj koloni hromatografije (silika gel, 100% hloroform do 10% metanol u hloroformu). Čisti fragmenti skupljeni su i kombinovani, a višak eluenta uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio 64 (E) (60 mg, 25% preko 3 koraka).

Primer 8

[0239]

[0240] Jedinjenje 65 je jedinjenje 79 iz WO 2011/130598

(11S)-4-(1-iodo-20-izopropil-23-metil-2,18,21-triokso-6,9,12,15-tetraoksa-3,19,22-triazatetracosanamido)benzil 11-hidroksi-7-metoksi-8-(3-((7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-en-1-il)-5,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-8-il)oksi)propoksi)-5-okso-2-((E)-prop-1-en-1-il)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat (66)

[0241] N, N'-diizopropilkarbodiimid (DIC, 4.71 mL, 0.0304 mmol) se dodaje u rastvor amina 65 (0.0276 mmol) i jodo-(PEG)4-kiseline (13.1 mg, 0.0304 mmol) u suvom dihlorometanu (0.8 mL). Reakcija je mešana 3 sata i prisustvo početnog materijala više nije primećeno pomoću LS/MS. Reakciona smeša se direktno učitava na ploču tankoslojne hromatografije (TLC) i prečisti pomoću prep-TLC (10% metanola u hloroformu). Čiste trake su uklonjene sa TLC ploče, uz 10% metanola u hloroformu, filtrirane i višak eluenta uklonjen je rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom, dajući 66 (D) (20.9 mg, 56%). LC/MS, metoda 2, 3.08 min (ES+) m/z (relativni intenzitet) 1361.16 ([M+H] , 100).

Generalne eksperimentalne metode Primera 9

[0242] LCMS podaci su dobijeni korišćenjem LC/MS serije Agilent 1200 sa Agilent 6110 četvoropolog MS, sa elektrosprejnom jonizacijom. Mobilna faza A - 0.1% sirćetna kiselina u vodi. Mobilna faza B -0.1% u acetonitrilu. Protok od 1.00ml / min. Gradijent od 5% B porastao je do 95% B tokom 3 minuta, ostao na 95% B za 1 minut, a zatim se vratio na 5% B u toku 6 sekundi. Ukupno vreme metode je 5 minuta. Kolona: Phenomenex Gemini-NX 3µm C18, 30 x 2.00mm. Hromatogrami na bazi UV detekcije na 254nm. Masena spektroskopija je postignuta pomoću MS-a u pozitivnom režimu. Vrednosti hemijske smene Proton NMR-a su merene na skali delta na 400 MHz koristeći Bruker AV400. Koriste se sledeće skraćenice: s, singlet; D, dublet; T, triplet; K, kvartet; M, multiplet; Br, široko. Konstante

1

spajanja su prijavljene u Hz. Osim ako nije drugačije naznačeno, kolonska hromatografija (metodom blica) izvršena je na Merck Kieselgel silici (član 9385). Podaci o masenoj spektroskopiji (MS) sakupljeni su korišćenjem Vaters Micromass LCT instrumenta spojenog sa Vaters 2795 HPLC separacijskim modulom. Tanka slojna hromatografija (TLC) je izvedena na silikagelnim aluminijumskim pločama (Merck 60,F254). Sve druge hemikalije i rastvarači su nabavljeni od Sigma-Aldrich ili Fisher Scientific i korišćeni su kao isporučeni bez daljeg prečišćavanja.

[0243] Optičke rotacije izmerene su na ADP 220 polarimetru (Bellingham Stanley Ltd.) i koncentracije (c) su navedene u g/100 mL. Tačke topljenja merene su pomoću digitalnog aparata za tačke topljenja (Electrothermal). IR spektri su snimljeni na Spectrum 1000 FT IR Spectrometer.<1>H i<13>C NMR spektri su dobijeni na 300 K koristeći Bruker Avance NMR spektrometra na 400 i 100 MHz, respektivno. Hemijske promene su prijavljene u odnosu na TMS (δ = 0,0 ppm), a signali su označeni kao s (jednostruki), d (duplet), t (triplet), dt (dupli triplet), dd (dupli dupleta), ddd (dupli duplet dupleta), ili m (multiplet), sa uparenim konstantama datim u hercima (Hz). Podaci masene spektroskopije (MS) prikupljeni su na instrumentu Waters Micromass ZQ spojenim sa Waters 2695 HPLC sa Waters 2996 PDA. Waters Micromass ZQ parametri bili su: Kapilarno (kV), 3.38; konusno (V), 35; ekstraktor (V), 3.0; izvorna temperatura (°C), 100; temperatura desolvacije (°C), 200; konusni protok (L/h), 50; protok desolvatacije (L/h), 250. Podaci u visokoj rezoluciji masene spektroskopije (HRMS) snimljeni su na Waters Micromass QTOF Global pri pozitivnom W-modu koristeći borosilikatne vrhove stakla obloženog metalom kako bi se uzorci uveli u instrument. Tankoslojna hromatografija (TLC) je obavljena na silika gel aluminijumskim pločama (Merck 60, F254), dok je brza hromatografija koristila silika gel (Merck 60, 230-400 mesh ASTM). Osim za HOBt (Novabiochem) i čvrstih reagenasa (Argonaut), sve druge hemikalije rastvori kupljeni su od Sigma-Aldrich, i korišćeni su kao što su nabavljeni, bez daljeg pročišćavanja. Nevodeni rastvori dobijeni su destilacijom pod suvom atmosferom azota u prisustvu odgovarajućeg agensa za sušenje, i pohranjeni su iznad molekulskih sita 4A i natrijumske žice. Petroletar se odnosi na ključanje delova na 40-60°C.

[0244] Opšti LC/MS uslovi: HPLC (Waters Alliance 2695) se izvodi pomoću mobilne faze vode (A) (0.1% mravlja kiselina) i acetonitrila (B) (0.1% mravlja kiselina). Ukupno vreme gradijenta iznosi 5 min. Brzina protoka 3,0 ml/min, 400 µl je podeljeno preko t komada nulte zapremine koji prolazi u maseni spektrometar. Opseg detekcije talasnih dužina: 220 do 400 nm. poredak dioda (535 skeniranja). Kolona: Phenomenex® Onyx Monolitni C1850 x 4.60 mm.

Primer 9

(i) Ključna međujedinjenja

(a)

[0245]

(a-i) (S)-2-(aliloksikarbonilamino)-3-metilbuterna kiselina (I2)

[0246] Alil hloroformat (36.2 ml, 340.59 mmol, 1,2 ekv.) dodavan je kapanjem u mešani rastvor L-valina (11) (33.25 g, 283.82 mmol, 1.0 ekv.) i kalijum karbonata (59.27 g, 425.74 mmol, 1.5 ekv) u vodi (650 mL) i THF (650 mL). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 18 sati, zatim je rastvarač koncentrovan pod redukovanim pritiskom, a preostali rastvor je ekstrahovan sa dietil etrom

2

(3 x 100 ml). Vodeni deo je zakiseljen do pH 2 sa konc. HCl i ekstrahuje sa DCM (3 x 100 ml). Kombinovane organske materije su isprane rastvorom soli, osušene iznad MgSO4, filtrirane i koncentrovane pod redukovanim pritiskom, kako bi se proizvod dobio kao bezbojno ulje (57.1 g, pretpostavljeno 100% prinos). LC/MS (1.966 min (ES+)), m/z: 202.1 [M+H] .<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.57 (br s, 1H), 7.43 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 5.96 - 5.86 (m, 1H), 5.30 (ddd, 1H, J = 17.2, 3.4, 1.7 Hz), 5.18 (ddd, 1H, J = 10.4, 2.9, 1.6 Hz), 4.48 (dt, 2H, J = 5.3, 1.5 Hz), 3.85 (dd, 1H, J = 8.6, 6.0 Hz), 2.03 (oct, 1H, J = 6.6 Hz), 0.89 (d, 3H, J = 6.4 Hz), 0.87 (d, 3H, J = 6.5 Hz).

(a-ii) (S)-2,5-dioksopirolidin-1-il 2-(aliloksikarbonilamino)-3-metilbutanoat (I3)

[0247] U mešani rastvor zaštićene kiseline I2 (60.6 g, 301.16 mmol, 1.0 ekv.) i N-hidroksisukcinimida (34.66 g, 301.16 mmol, 1.0 ekv.) U suvom THF (800 ml) dodato je dicikloheksilkarbodiimid (62.14 g, 301.16 mmol, 1 ekv). Reakcija je mešana 18 sati na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je zatim filtrirana, čvrsta supstanca isprana sa THF i kombinovani filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je ponovo rastvoren u DCM i ostavljen da stoji na 0°C tokom 30 minuta. Suspenzija je filtrirana i isprana hladnim DCM. Koncentracija filtrata pod redukovanim pritiskom dala je proizvod kao viskozno bezbojno ulje (84.7 g, pretpostavljeno 100% Prinos) koji je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LC/MS (2.194 min (ES+)), m/z: 321.0 [M+Na] .<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.0 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 5.97 - 5.87 (m, 1H), 5.30 (ddd, 1H, J = 17.2, 3.0, 1.7 Hz), 5.19 (ddd, 1H, J = 10.4, 2.7, 1.4 Hz), 4.52 (dt, 2H, J = 5.3, 1.4 Hz), 4.32 (dd, 1H, J = 8.3, 6.6 Hz), 2.81 (m, 4H), 2.18 (oct, 1H, J = 6.7 Hz), 1.00 (d, 6H, J = 6.8 Hz),

(a-iii) (S)-2-((S)-2-(aliloksikarbonilamino)-3-metilbutanamido)propionska kiselina (I4)

[0248] Rastvor sukcinimid estra I3 (12.99 g, 43.55 mmol, 1.0 ekv.) U THF (50 mL) je dodat u rastvor lalanina (4.07 g, 45.73 mmol, 1.05 ekvivalenta) i NaHCO3(4.02 g, 47.90 mmol, 1.1 ekv) u THF (100 mL) i H2O (100 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 72 sata kada je THF uklonjen pod redukovanim pritiskom. PH je podešen na 3-4 sa limunskom kiselinom za taloženje bele gume. Nakon ekstrakcije etil acetatom (6 x 150 mL), kombinovani organski slojevi su isprani sa H2O (200 mL), osušeni preko MgSO4, filtrirani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Trituracija sa dietil etrom dala je proizvod kao beli prah koji je sakupljen filtriranjem i ispran dietil etrom (5.78 g, 49%). LC/MS (1.925 min (ES+)), m/z: 273.1 [M+H] .<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.47 (br s, 1H), 8.17 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 7.16 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 5.95 - 5.85 (m, 1H), 5.29 (dd, 1H, J = 17.2, 1.7 Hz), 5.17 (dd, 1H, J = 10.4, 1.5 Hz), 4.46 (m, 2H), 4.18 (quin, 1H, J = 7.2 Hz), 3.87 (dd, 1H, J = 9.0, 7.1 Hz), 1.95 (oct, 1H, J = 6.8 Hz), 1.26 (d, 3H, J = 7.3 Hz), 0.88 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 0.83 (d, 3H, J = 6.8 Hz).

(a-iv) Alil (S)-1-((S)-1-(4-(hidroksimetil)fenilamino)-1-oksopropan-2-ilamino)-3-metil-1-oksobutan-2-ilkarbamat (I5)

[0249] EEDQ (5.51 g, 22.29 mmol, 1.05 ekv) je dodat rastvoru p-aminobenzil alkohola (2.74 g, 22.29 mmol, 1.05 ekv) i kiseline I4 (5.78 g, 21.23 mmol, 1 ekv) u suvi THF (100 mL) i mešan je na sobnoj temperaturi 72 sata. Reakciona smeša je tada koncentrovana pod redukovanim pritiskom, a dobijena smeđa čvrsta supstanca je triturirana dietil etrom i filtrirana sa naknadnim pranjem sa viškom dietil etra da bi se proizvod dobio kao sivo bela čvrsta supstanca (7.1 g, 88%). LC/MS (1.980 min (ES+)), m/z: 378.0 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.89 (br s, 1H), 8.13 (d, 1H, J = 7.0 Hz), 7.52 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.26 (m, 1H), 7.23 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 5.91 (m, 1H), 5.30 (m, 1H), 5.17 (m, 1H), 4.46 (m, 2H), 5.09 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 4.48 (m, 2H), 4.42 (m, 3H), 3.89 (dd, 1H, J = 8.6, 6.8 Hz), 1.97 (m, 1H), 1.30 (d, 3H, J = 7.1 Hz), 0.88 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 0.83 (d, 3H, J = 6.7 Hz).

(b)

[0250]

1-jodo-2-okso-6,9,12,15-tetraoksa-3-azaoctadecan-18-ska kiselina (17)

[0251] Rastvor jodoacetatnog anhidrida (0.250 g, 0.706 mmol, 1.1 ekv.) u suvom DCM (1 mL) je dodan u aminoPEG(4)-kiselinu I6 (0.170 g, 0.642 mmol, 1.0 ekv.) u DCM (1 mL). Smeša je mešana u mraku na sobnoj temperaturi preko noći. Reakciona smeša je isprana sa 0.1 M HCI vodom, osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (silika gel, 3% MeOH i 0.1% mravlja kiseline u hloroformu do 10% MeOH i 0.1% mravlja kiseline u hloroformu) kako bi se proizvod dobio kao narandžasto ulje (0.118 g, 42%). LC/MS (1.623 min (ES<+>)), m/z: 433..98 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.069 (s, 1H), 7.22 (br s, 1H), 3.79 (t, 2H, J = 5.8 Hz), 3.74 (s, 2H), 3.72 - 3.58 (m, 14H), 3.50 - 3.46 (m, 2H), 2.62 (t, 2H, J = 5.8 Hz).

(ii) (11S,11aS)-alil 11-(terc-butildimetilsililoksi)-8-(3-iodopropoksi)-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat (74)

[0252]

(a) (S)-5-((terc-butildimetilsililoksi)metil)-1-(5-metoksi-2-nitro-4-(triizopropilsililoksi)benzoil)-4,5-dihidro-1H-pirol-3-il trifluorometansulfonat (47)

[0253] Triflični anhidrid (28.4 g, 100.0 mmol, 3.0 ekv.) je dodat u kapima tokom 25 min, sve do rastvora ketona 46 (19.5 g, 30.0 mmol, 1.0 ekv.) u DCM (550 mL), koji sadrži 2,6-Lutidin (14.4 g, 130.0 mmol, 4.0 ekv.) Pri -50°C. Reakciona smeša je mešana tokom 1.5 sata kada je LC/MS ukazala završenu reakciju. Organska faza je isprana sukcesivno sa vodom (100 mL), zasićenim natrijum bikarbonatom (150 mL), slanim rastvorom (50 mL), a organska faza je osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (silika gel, 90/10 v/v n-heksan/EtOAc) da bi se proizvod dobio kao bledo žuto ulje (19.5 g, 82%). LC/MS (4.391 min (ES<+>)), m/z: 713.25 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.68 (s, 1H), 6.72 (s, 1H), 6.02 (t, 1H, J = 1.9 Hz), 4.75 (m, 1H), 4.05 (m, 2H), 3.87 (s, 3H), 3.15 (ddd, 1H, J = 16.2, 10.3, 2.3 Hz), 2.96 (ddd, 1H, J = 16.2, 4.0, 1.6 Hz), 1.28 - 1.21 (m, 3H), 1.07 (d, 18H, J = 7.2 Hz), 0.88 (s, 9H), 0.09 (s, 3H), 0.08 (s, 3H).

(b) (S,E)-(2-((terc-butildimetilsililoksi)metil)-4-(prop-1-enil)-2,3-dihidro-1H-pirol-1-il)(5-metoksi-2-nitro-4-(triizopropilsililoksi)fenil)metanon (67)

[0254] Tetrakis(trifenilfosfin)paladijum(0) (0.41 g, 0.35 mmol, 0.03 ekvivalenta) dodat je u smešu triflata 47 (8.4 g, 11.8 mmol, 1.0 ekv.), E-1-propen-1-ilboronske kiseline (1.42 g, 16.5 mmol, 1.4 ekv) I kalijum fosfat (5.0 g, 23.6 mmol, 2.0 ekv.) u suvom dioksanu (60 ml) u atmosferi azota. Smeša je

4

mešana na 25°C 120 min kada je LC/MS pokazala potpunu reakciju. Dodati su etil acetat (120 mL) i voda (120 mL), organska faza je uklonjena, isprana sa slanim rastvorom (20 mL), osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (silika gel, 95/5 v/v n-heksan/EtOAc do 90/10 v/v n-heksan/EtOAc) da bi se proizvod dobio kao žuta pena (4.96 g, 70%). LC/MS (4.477 min (ES<+>)), m/z: 605.0 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.67 (s, 1H), 6.74 (s, 1H), 5.93 (d, 1H, J = 15.4 Hz), 5.67 (s, 1H), 4.65 (m, 1H), 4.04 (m, 2H), 3.86 (s, 3H), 2.85 (m, 1H), 2.71 (m, 1H), 1.72 (dd, 3H, J = 6.8, 1.0 Hz), 1.30 - 1.22 (m, 3H), 1.07 (d, 18H, J = 7.2 Hz), 0.87 (s, 9H), 0.08 (s, 3H), 0.07 (s, 3H).

(c) (S,E)-(2-amino-5-metoksi-4-(triizopropilsililoksi)fenil)(2-((terc-butildimetilsililoksi)metil)-4-(prop-1-enil)-2,3-dihidro-1H-pirol-1-il)metanon (68)

[0255] Cink prašina (22.0 g, 0.33 mol, 37 ekv) je dodata u porcijama preko 20 min u rastvor propanil međujedinjenja 67 (5.5 g, 9.1 mmol, 1.0 ekv.) u 5% v/v mravlje kiseline/etanolu (55 mL), koristeći hladnu kupku za održavanje temperature između 25-30°C. Nakon 30 minuta, reakciona smeša je filtrirana kroz kratak sloj celita® Celite® je ispran etil acetatom (65 mL), a kombinovani organski sastojci su isprani sukcesivno sa vodom (35 mL), zasićenim natrijum bikarbonatom (35 mL) i slanim rastvorom (10 mL). Organska faza je osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen brzom hromatografijom (silika gel, 90/10 v/v nheksan/EtOAc) da bi se proizvod dobio kao bledo žuto ulje (3.6 g, 69.0%). LC/MS (4.439 min (ES<+>)), m/z: 575.2 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.75 (m, 1H), 6.40 (br s, 1H), 6.28 (m, 1H), 6.11 (d, 1H, J = 15.4 Hz), 5.53 (m, 1H), 4.67 (m, 1H), 4.36 (m, 2H), 3.93 (br s, 1H), 3.84 (br s, 1H), 3.73 (s, 3H), 2.86 (dd, 1H, J = 15.7, 10.4 Hz), 2.73 (dd, 1H, J = 15.9, 4.5 Hz), 1.80 (dd, 3H, J = 6.8, 1.3 Hz), 1.35- 1.23 (m, 3H), 1.12 (d, 18H, J = 7.3 Hz), 0.89 (s, 9H), 0.08 (s, 3H), 0.07 (s, 3H).

(d) (S,E)-alil 2-(2-((terc-butildimetilsililoksi)metil)-4-(prop-1-enil)-2,3-dihidro-1H-pirol-1-karbonil)-4-metoksi-5-(triizopropilsililoksi)fenilkarbamat (69)

[0256] Alil hloroformat (0.83 g, 6.88 mmol, 1.1 ekv) dodan je rastvoru amina 68 (3.6 g, 6.26 mmol, 1.0 ekv) u suvi DCM (80 mL) koji sadrži suvi piridin (1.09 g, 13.77 mmol, 2.2 ekv) na -78°C. Suv led je uklonjen i reakciona smeša se zagreva do sobne temperature. Nakon mešanja još 15 minuta, LC/MS je pokazala potpunu reakciju. Organska faza se ispere sukcesivno sa 0.01 N HCI (50 mL), zasićenim natrijum bikarbonatom (50 mL), slanim rastvorom (10 mL), osuši preko MgSO4, filtrira i koncentriše pod redukovanim pritiskom da se ostavi bledo žuto ulje koje je korišćeno u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja (4.12 g, pretpostavljen 100% prinos). LC/MS (4.862 min (ES<+>)), m/z: 659.2 [M+H]<+>.

(e)(S,E)-alil 2-(2-(hidroksimetil)-4-(prop-1-enil)-2,3-dihidro-1H-pirol-1-karbonil)-4-metoksi-5-(triizopropilsililoksi)fenilkarbamat (70)

[0257] Sirovo međujedinjenje 69 (pretpostavljen 100% prinos, 4.12 g, 6.25 mmol, 1.0 ekv.) rastvoren je u smeši sirćetne kiseline (70 mL), metanola (10 mL), THF (10 mL) i vode (20 mL) i meša se na sobnoj temperaturi. Nakon 6 sati, reakciona smeša je razblažena etil acetatom (500 mL) i isprana sukcesivno sa vodom (2 x 500 mL), zasićenim natrijum bikarbonatom (300 mL) i slanim rastvorom (50 mL). Organska faza je osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (silika gel, 1/99 v/v metanol/DCM do 5/95 v/v metanol/DCM), kako bi se proizvod dobio kao žuto ulje, a još 1 g početnog materijala koji nije reagovao. Ovaj materijal je podvrgnut istim reakcionim uslovima kao što je gore navedeno, ali je ostalo mešanje 16 h. Posle rada i prečišćavanja izolovan je dodatni proizvod (2.7 g, 79%, 2 koraka) LC/MS (3.742 min (ES+)), m/z: 545.2 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.38 (m, 1H), 7.72 (m, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.37 (m, 1H), 6.10 (d, 1H, J = 15.8 Hz), 5.97 (m, 1H), 5.53 (m, 1H), 5.36 (ddd, 1H, J = 17.2, 3.1, 1.5 Hz), 5.25 (ddd, 1H, J = 10.4, 2.5, 1.3 Hz), 4.78 (m, 1H), 4.65 (dt, 2H, J = 5.7, 1.3 Hz), 3.84 (m, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.04 (dd, 1H, J = 16.7, 10.5 Hz), 2.40 (dd, 1H, J = 16.0, 4.5 Hz), 1.82 (dd, 3H, J = 6.8, 1.0 Hz), 1.36 - 1.26 (m, 3H), 1.14 (d, 18H, J = 7.3 Hz).

(f) (11S,11aS)-alil 11-hidroksi-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-8-(triizopropilsililoksi)-11,11adihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat (71)

[0258] Kapima je dodat suvi dimetil sulfoksid (1.16 g, 14.87 mmol, 3.0 ekv.) u rastvor oksalilhlorida (0.94 g, 7.43 mmol, 1.5 ekv.) u DCM (25 mL) na -78°C u atmosferi azota. Održava se temperatura na -78°C, posle 10 min kapima je dodat rastvor primarnog alkohola 70 (2.7 g, 4.96 mmol, 1.0 ekv.) u DCM (20 mL). Posle još 15 min dodat je suv trietilamin (2.5 g, 24.78 mmol, 5.0 ekv.) i reakciona smeša je ostavljena da se zagreje do sobne temperature. Reakciona smeša se ispere sukcesivno hladnom 0.1 N HCl (50 mL), zasićenim natrijum hidrogen karbonatom (50 mL) i slanim rastvorom (10 mL), a organski sloj je osušen preko MgSO4, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom, kako bi se dobio proizvod kao žuto ulje koje je korišćeno u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja (2.68 g, pretpostavljeno 100% prinos). LC/MS (3.548 min (ES<+>)), m/z: 543.2 [M+H]<+>.

(g) (11S,11aS)-alil 11-(terc-butildimetilsililoksi)-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-8-(triizopropilsililoksi)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat (72)

[0259] U rastvor karbinolamina 71 (pretpostavljen 100% prinos, 2.68 g, 4.96 mmol, 1,0 ekv.) i 2,6-lutidin (2.12 g, 19.83 mmol) dodat je terc-butildimetilsililtrifluormetan sulfonat (3.93 g, 14.87 mmol, 3.0 ekv. , 4.0 ek) u suvom DCM (40 mL) na 0°C u atmosferi azota. Posle 10 minuta, reakciona smeša je ostavljena da se zagreje do sobne temperature i meša još 60 minuta. Organska faza je isprana sukcesivno vodom (10 mL), zasićenim natrijum bikarbonatom (10 mL) i slanim rastvorom (5 mL), osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (silika gel, hloroform do 2/98 v / v metanol / hloroform), kako bi se proizvod dobio kao žuto ulje (2.0 g, 63%, 2 koraka). LC/MS (4.748 min (ES<+>)), m/z: 657.2 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.19 (s, 1H), 6.86 (m, 1H), 6.66 (s, 1H), 6.22 (d, 1H, J = 15.4 Hz), 5.81 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 5.78 (m, 1H), 5.48 (m, 1H), 5.11 (d, 1H, J = 5.0 Hz), 5.08 (m, 1H), 4.58 (dd, 1H, J = 13.4, 5.4 Hz), 4.35 (dd, 1H, J = 13.2, 5.7 Hz), 3.83 (s, 3H), 3.76 (s, 1H), 3.00 (dd, 1H, J = 15.6, 11.0 Hz), 2.53 (m, 1H), 1.81 (dd, 3H, J = 6.8, 0.9 Hz), 1.30 - 1.18 (m, 3H), 1.08 (d, 9H, J = 2.3 Hz), 1.06 (d, 9H, J = 2.3 Hz), 0.86 (s, 9H), 0.25 (s, 3H), 0.18 (s, 3H).

(h) (11S,11aS)-alil 11-(terc-butildimetilsililoksi)-8-hidroksi-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat (73)

[0260] Litijum acetat dihidrat (0.31 g, 3.04 mmol, 1.0 ekv) dodan je u rastvor diazepina 72 (2.0 g, 3.04 mmol, 1.0 ekv) u mokrom DMF (20 mL) na 25°C i mešan 4 sata. Reakciona smeša razređena je etil acetatom (200 mL) i isprana sukcesivno s 0,1 M limunskom kiselinom (50 mL, pH 3), vodom (50 mL) i slanom vodom (10 mL), sušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrirana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je pročišćen fleš hromatografijom (silikagel, 50/50 v/v n-heksan/EtOAc do 25/75 v/v nheksan/EtOAc) kako bi se dobio proizvod kao bledo žuta čvrsta supstanca (0.68 g, 45% ). LC/MS (3.352 min (ES<+>)), m/z: 501.1 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.02 (s, 1H), 6.66 (m, 1H), 6.53 (s, 1H), 6.03 (d, 1H, J = 15.5 Hz), 5.80 (s, 1H), 5.63 (d, 1H, J = 8.9 Hz), 5.55 (m, 1H), 5.29 (m, 1H), 4.87 (m, 2H), 4.39 (dd, 1H, J = 13.5, 4.2 Hz), 4.20 (dd, 1H, J = 13.2, 5.7 Hz), 3.73 (s, 3H), 3.59 (m, 1H), 2.81 (dd, 1H, J = 16.1, 10.5 Hz), 2.35 (d, 1H, J = 15.7 Hz), 1.61 (d, 3H, J = 6.4 Hz), 0.67 (s, 9H), 0.05 (s, 3H), 0.00 (s, 3H).

(i) (11S,11aS)-alil 11-(terc-butildimetilsililoksi)-8-(3-iodopropoksi)-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat (74)

[0261] Dijodopropan (0.295 g, 1.00 mmol, 5.0 ekv.) i kalijum karbonat (0.028 g, 0.20 mmol, 1.0 ekv.) dodati su u rastvor fenola 33 (0.100 g, 0.020 mmol, 1.0 ekv.) u suvi aceton (5 mL). Reakciona smeša je zagrevana na 60°C tokom 6 sati kada je LC/MS pokazala potpunu reakciju. Reakciona smeša je koncentrovana do suvog pod redukovanim pritiskom, a ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (silika gel, 75/25 v/v n-heksan/EtOAc do 50/50 v/v n-heksan/EtOAc) kako bi se dobio proizvod kao bezbojno ulje (0.074 g, 56%). LC/MS (3.853 min (ES<+>)), m/z: 669.0 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.26 (s, 1H), 6.90 (s, 1H), 6.68 (s, 1H), 6.24 (d, 1H, J = 15.3 Hz), 5.87 (d, 1H, J = 8.9 Hz), 5.78 (m, 1H), 5.53 (m, 1H), 5.12 (m, 2H), 4.65 (m, 2H), 4.41 (m, 1H), 4.11 (m, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.81 (m, 1H), 3.40 (t, 2H, J = 6.7 Hz), 3.05 (dd, 1H, J = 16.3, 10.1 Hz), 2.57 (m, 1H), 2.34 (m, 2H), 1.84 (d, 3H, J = 6.6 Hz), 0.92 (s, 9H), 0.28 (s, 3H), 0.26 (s, 3H).

(iii) (11S,11aS)-4-((S)-2-((S)-2-(aliloksikarbonilamino)-3-metilbutanamido)propanamido)benzil 11-(terc-butildimetilsililoksi)-8-hidroksi-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat 79)

(a) Alil ((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-((S)-2-(((terc-butildimetilsilil)oksi)metil)-4-((E)-prop-1-en-1-il)-2,3-dihidro-1H-pirol-1-karbonil)-4-metoksi-5-((triizopropilsilil)oksi)fenil)karbamoil)oksi)metil)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat (75)

[0263] U mešani rastvor amina 68 (0.480 g, 0.835 mmol, 1.0 ekv.) i trifosgena (0.089 g, 0.301 mmol, 0.36 ekv.) u suvom THF (15 mL) doda se trietilamin (0.256 mL, 1.84 mmol, Na 5°C (ledena kupka). Napredak izocijanatne reakcije nadgledan je periodičnim uklanjanjem alikvota iz reakcione smeše i gašenjem metanolom i obavljanjem LCMS analize. Kada je reakcija izocijanata završena, u suvom THF (10 mL) brzo je dodat rastvor Alloc-Val-Ala-PABOH I5 (0.473 g, 1.25 mmol, 1.5 ekv.) i trietilamina (0.174 mL, 1.25 mmol, 1.5 ek) injekcija u sveže pripremljeni izocijanat. Reakcija je ostavljena da se meša na 40 °C tokom 4 sata, a zatim se meša na sobnoj temperaturi preko noći. Smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom i prečišćena fleš hromatografijom (silikagel, 20/80 v/v n-heksan/EtOAc do 50/50 v/v n-heksan/EtOAc, zatim 1/99 v/v DCM/MeOH do 5/95 v/v DCM/MeOH), kako bi se proizvod dobio kao žuta čvrsta supstanca (0.579 g, 71%). LC/MS (4.468 min (ES<+>)), m/z: 978.55 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.63 (br s, 1H), 8.42 (s, 1H), 7.78 (br s, 1H), 7.53 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.31 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 6.76 (s, 1H), 6.59 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 6.36 (br s, 1H), 6.04 (d, 1H, J = 15.9 Hz), 5.90 (m, 1H), 5.55 (m, 1H), 5.33 - 5.21 (m, 3H), 5.10 (s, 2H), 4.66 (m, 2H), 4.57 (dd, 2H, J = 5.6, 1.0 Hz), 3.98 (dd, 1H, J = 7.3, 6.8 Hz), 3.90 (m, 1H), 3.81 (m, 1H), 3.78 (s, 3H), 2.82 (dd, 1H, J = 15.4, 9.6 Hz), 2.72 (dd, 1H, J = 15.9, 3.5 Hz), 2.17 (m, 1H), 1.78 (dd, 3H, J = 6.5, 0.8 Hz), 1.46 (d, 3H, J = 7.1 Hz), 1.29 (m, 3H), 1.11 (d, 18H, J = 7.1 Hz), 0.97 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 0.92 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 0.83 (s, 9H), 0.04 (s, 3H), 0.01 (s, 3H).

(b) Alil ((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-((S)-2-(hidroksimetil)-4-((E)-prop-1-en-1-il)-2,3-dihidro-1H-pirol-1-karbonil)-4-metoksi-5-((triizopropilsilil)oksi)fenil)karbamoil)oksi)metil)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat (76)

[0264] Silil etar 75 (1.49 g, 1.52 mmol, 1.0 ekv.) je rastvoren u smeši 7:1:1:2 sirćetne kiseline/metanol/tetrahidrofuran/voda (14:2:2:4 mL) i ostavljen da se meša na sobnoj temperaturi. Nakon 2 sata, reakcija je razblažena sa EtOAc (100 mL), isprana sekvencijalno vodom, vodenim natrijum bikarbonatom, zatim slanim rastvorom. Organska faza je zatim osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (silika gel, 100/0 tada 99/1 do 92/8 v/v DCM/MeOH) da bi se proizvod dobio kao narandžasta čvrsta supstanca (1.2 g, 92%). LC/MS (3.649 min (ES<+>)), m/z: 865.44 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.44 (s, 1H), 8.35 (s, 1H), 7.69 (br s, 1H), 7.53 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 7.32 (d, 2H, J = 8.3 Hz), 6.78 (s, 1H), 6.56 (m, 2H), 6.32 (br s, 1H), 6.05 (d, 1H, J = 14.9 Hz), 5.90 (m, 1H), 5.56 (m, 1H), 5.30 (m, 2H), 5.22 (m, 1H), 5.10 (d, 2H, J = 3.1 Hz), 4.73 (m, 1H), 4.64 (m, 1H), 4.57 (d, 2H, J = 5.8 Hz), 4.01 (m, 1H), 3.79 (m, 2H), 3.76 (s, 3H), 2.98 (dd, 1H, J = 16.3, 10.2 Hz), 2.38 (dd, 1H, J = 16.6, 4.1 Hz), 2.16 (m, 1H), 1.78 (dd, 3H, J = 6.8, 0.9 Hz), 1.46 (d, 3H, J = 7.1 Hz), 1.29 (m, 3H), 1.11 (d, 18H, J = 7.4 Hz), 0.97 (d, 3H, J = 6.7 Hz), 0.92 (d, 3H, J = 6.8 Hz).

(c) (11S,11aS)-4-((S)-2-((S)-2-(aliloksikarbonilamino)-3-metilbutanamido)propanamido)benzil 11-hidroksi-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-8-(triizopropilsililoksi)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat (77)

[0265] Kapima je dodan suvi dimetil sulfoksid (0.180 g, 2.3 mmol, 3.0 ekv.) u rastvor oksalil hlorida (0.147 g, 1.1mmol, 1.5 ekv.) u DCM (10 mL) na -78°C pod atmosferom azota. Održavanje temperature na -78°C, nakon 20 minuta, kapima je dodat rastvor primarnog alkohola 76 (0.666 g, 0.77 mmol, 1.0 ekv.) u DCM (10 mL). Posle dodatnih 15 minuta dodati su suv trietilamin (0.390 g, 3.85 mmol, 5.0 ekv.) i reakciona smeša se zagreje do sobne temperature. Reakciona smeša se ispere sukcesivno sa hladnim 0.1 N HCI (10 mL), zasićenim natrijum hidrogen karbonatom (10 mL) i slanim rastvorom (5 mL). Organski sloj je zatim osušen preko MgSO4, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je zatim prečišćen fleš hromatografijom (silika gel, 50/50 v/v n-heksan/EtOAc do 25/75 v/v nheksan/EtOAc) da bi se proizvod dobio kao bela čvrsta supstanca (0.356 g, 54% ). LC/MS (3.487 min (ES<+>)), m/z: 862.2 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.34 (br s, 1H), 7.47 (d, 2H, J = 7.6 Hz), 7.17 (s, 1H), 7.14 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 6.86 (br s, 1H), 6.65 (br s, 1H), 6.42 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 6.22 (d, 1H, J = 14.4 Hz), 5.80 (m, 1H), 5.40 (m, 1H), 5.53 (m, 1H), 5.32 (m, 1H), 5.21 (d, 2H, J = 9.6 Hz), 5.06 (d, 1H, J = 12.3 Hz), 4.90 (m, 1H), 4.58 (m, 3H), 3.98 (m, 1H), 3.84 (m, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.50 (m, 1H), 3.05 (dd, 1H, J = 16.0, 10.3 Hz), 2.76 (m, 1H), 2.15(m, 1H), 1.80 (dd, 3H, J = 6.7, 0.8 Hz), 1.44 (d, 3H, J = 7.1 Hz), 1.16 (m, 3H), 1.01 (d, 18H, J = 6.6 Hz), 0.96 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 0.92 (d, 3H, J = 6.8 Hz).

(d) (11S,11aS)-4-((S)-2-((S)-2-(aliloksikarbonilamino)-3-metilbutanamido)propanamido)benzil 11-(terc-butildimetilsililoksi)-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-8-(triizopropilsililoksi)-11,11adihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat (78)

[0266] Tert-butildimetilsililtrifluormetan sulfonat (0.46 g, 1.74 mmol, 3.0 ekv.) je dodat u rastvor sekundarnog alkohola 77 (0.5 g, 0.58 mmol, 1.0 ekv.) i 2,6-lutidina (0.25 g, 2.32 mmol, 4.0 ekv) u suvi DCM (10 mL) na 0°C pod atmosferom azota. Posle 10 minuta, reakciona smeša je ostavljena da se zagreje do sobne temperature i meša još 120 min. Organska faza je zatim isprana sukcesivno vodom (10 mL), zasićenim natrijum bikarbonatom (10 mL) i slanim rastvorom (5 mL), osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (silika gel, 50/50 v/v n-heksan/EtOAc) da bi se proizvod dobio kao bela čvrsta supstanca (0.320 g, 57%). LC/MS (4.415 min (ES<+>)), m/z: 976.52 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.31 (br s, 1H), 7.48 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 7.21 (s, 1H), 7.14 (d, 2H, J = 8.3 Hz), 6.89 (s, 1H), 6.65 (s, 1H), 6.38 (d, 1H, J = 7.3 Hz), 6.25 (d, 1H, J = 14.6 Hz), 5.93 (m, 1H), 5.85 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 5.50 (m, 1H), 5.34 (m, 1H), 5.24 (m, 2H), 5.15 (d, 1H, J = 12.5 Hz), 4.86 (d, 1H, J = 12.2 Hz), 4.62 (m, 3H), 4.01 (m, 1H), 3.86 (s, 3H), 3.78 (m, 1H), 3.04 (m, 1H), 2.56 (m, 1H), 2.20 (m, 1H), 1.84 (dd, 3H, J = 6.6, 0.7 Hz), 1.48 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 1.20 (m, 3H), 1.05 (d, 9H, J = 2.9 Hz), 1.03 (d, 9H, J = 2.9 Hz), 0.99 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 0.95 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 0.88 (s, 9H), 0.27 (s, 3H), 0.14 (s, 3H).

(e) (11S,11aS)-4-((S)-2-((S)-2-(aliloksikarbonilamino)-3-metilbutanamido)propanamido)benzil 11-(terc-butildimetilsililoksi)-8-hidroksi-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat (79)

[0267] Litijum acetat dihidrat (0.010 g, 0.10 mmol, 1.0 ekv.) dodat je u rastvor silil etra 78 (0.100 g, 0.10 mmol, 1.0 ekv.) u vlažnom DMF (2 mL) na 25°C tokom 3 sata. Reakciona smeša je zatim razblažena etil acetatom (20 mL) i isprana sukcesivno sa 0.1 M limunskom kiselinom (20 mL, pH 3), vodom (20 mL) i slanim rastvorom (5 mL), osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (silika gel, 5/95 v/v metanolom/DCM) da bi se proizvod dobio kao bledo žuto ulje (0.070 g, 83%). LC/MS (3.362 min (ES<+>)), m/z: 820.2 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.39 (s, 1H), 7.48 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.25 (s, 1H), 7.12 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 6.88 (s, 1H), 6.68 (s, 1H), 6.47 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 6.24 (d, 1H, J = 15.2 Hz), 6.03 (s, 1H), 5.92 (m, 1H), 5.84 (d, 1H, J = 8.9 Hz), 5.50 (m, 1H), 5.34 (m, 1H), 5.26 (m, 2H), 5.18 (d, 1H, J = 12.3 Hz), 4.80 (d, 1H, J = 12.4 Hz), 4.66 - 4.60 (m, 3H), 4.02 (m, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.81 (m, 1H), 3.03 (m, 1H), 2.57 (m, 1H), 2.19 (m, 1H), 1.84 (dd, 3H, J = 6.8, 0.8 Hz), 1.48 (d, 3H, J = 7.1 Hz), 1.00 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 0.95 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 0.87 (s, 9H), 0.26 (s, 3H), 0.12 (s, 3H).

(iv) (11S,11aS)-4-((20S,23S)-1-iodo-20-izopropil-23-metil-2,18,21-triokso-6,9,12,15-tetraoksa-3,19,22-triazatetracosanamido)benzil 11-hidroksi-7-metoksi-8-(3-((S)-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-5,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-8-iloksi)propoksi)-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat (66, D)

[0268]

(a) (11S,11aS)-alil 8-(3-((11S,11aS)-10-((4-((R)-2-((R)-2-(aliloksikarbonilamino)-3-metilbutanamido)propanamido)benziloksi)karbonil)-11-(terc-butildimetilsililoksi)-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-8-iloksi)propoksi)-11-(terc-butildimetilsililoksi)-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat (80)

[0269] U rastvor fenola 79 (0.175 g, 0.21 mmol, 1.0 ekv.) i jodo veznika 79 (0.214 g, 0.32 mmol, 1.5 ekv.) u acetonu (10) dodat je kalijum karbonat (0.030 g, 0.21 mmol, 1.0 ekv.) ML). Reakciona smeša je zagrevana u atmosferi azota na 75°C u zaptivenoj boci tokom 17 sati. Reakciona smeša je koncentrovana do suva pod redukovanim pritiskom i prečišćena fleš hromatografijom (silikagel, 2/98 v/v metanol/DCM do 5/95 v/v metanol/DCM) da bi se proizvod dobio kao bledo žuta čvrsta supstanca (0.100 G, 35%). LC/MS (4.293 min (ES<+>)), m/z: 1359.13 [M]<+>.

(b) (11S,11as)-alil 8-(3-((11S,11aS)-10-((4-((R)-2-((R)-2-(aliloksikarbonilamino)-3-metilbutanamido)propanamido)benziloksi)karbonil)-11-hidroksi-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-8-iloksi)propoksi)-11-hidroksi-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat (81)

[0270] Tetra-n-butilamonijum fluorid (1 M, 0.22 mL, 0.22 mmol, 2.0 ekv.) dodat je u rastvor silil etra 80 (0.150 g, 0.11 mmol, 1.0 ekv.) u suvom THF (2 mL). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 20 minuta, posle čega LC/MS pokazuje potpunu reakciju. Reakciona smeša je razblažena etil acetatom (10 mL) i isprana sekvencijalno vodom (5 mL) i slanim rastvorom (5 mL). Organska faza je osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrovana pod redukovanim pritiskom da bi se ostavila žuta čvrsta supstanca. Prečišćavanje fleš hromatografijom (silika gel, 6/94 v/v metanol/DCM do 10/90 v/v metanol/DCM) dodeljuje proizvod kao bledo žuta čvrsta supstanca (0.090 g, 73%). LC/MS (2.947 min (ES<+>)), m/z: 1154.0 [M+Na]<+>.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.39 (br s, 1H), 7.39 (d, 2H, J = 7.6 Hz), 7.18 (d, 2H, J = 10.6 Hz), 7.10 (m, 3H), 6.86 (d, 2H, J = 10.0 Hz), 6.74 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 6.22 (dd, 2H, J = 15.3, 6.6 Hz), 5.85 (m, 2H), 5.74 (m, 3H), 5.52 (m, 2H), 5.22 (m, 1H), 5.00 (m, 2H), 4.57 (m, 6H), 4.41 (m, 2H), 4.09 (m, 4H), 3.85 (m, 11H), 3.06 (m, 2H), 2.76 (m, 2H), 2.20 (m, 2H), 2.08 (m, 1H), 1.79 (d, 6H, J = 6.4 Hz), 1.40 (d, 3H, J = 6.1 Hz), 0.90 (m, 6H).

(c) (11S,11aS)-4-((R)-2-((R)-2-amino-3-metilbutanamido)propanamido)benzil 11-hidroksi-7-metoksi-8-(3-((S)-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-5,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a]

[1,4] diazepin-8-iloksi)propoksi)-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat (65)

[0271] Tetrahidrofuran (0) (0.005 g, 0.005 mmol, 0.06 ekvivalenta) dodat je u rastvor biskarbinolamina 81 (0.090 g, 0.08 mmol, 1.0 ekv.) i pirolidina (16 mL, 0.20 mmol, 2.5 ek) u tetrahidrofuran (0) (0.005 g, 0.005 mmol, 0.06 ekvivalenta) u suvi DCM (5 mL). Posle 20 minuta, reakciona smeša je razblažena DCM (10 mL) i isprana sekvencijalno zasićenim amonijum hloridom (5 mL) i slanim rastvorom (5 mL), osušena preko MgSO4, filtrirana i rastvarač je uklonjen pod redukovanim pritiskom da bi se ostavio sirovi Proizvod kao bledo žuta čvrsta supstanca koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja (0.075 g, pretpostavljen 100% prinos). LC/MS (2.060 min (ES<+>)), m/z: 947.2 [M+H]<+>.

(d) (11S,11aS)-4-((20S,23S)-1-iodo-20-izopropil-23-metil-2,18,21-triokso-6,9,12,15-tetraoksa-3,19,22-triazatetracosanamido)benzil 11-hidroksi-7-metoksi-8-(3-((S)-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-5,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-8-iloksi)propoksi)-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirolo[1,2-a] [1,4] diazepin-10(5H)-karboksilat (66, D)

[0272] EDCl (0.015 g, 0.08 mmol, 1.0 ekv) je dodat rastvoru amina 65 (pretpostavljen 100% Prinos 0.075 g, 0.08 mmol, 1.0 ekv.) i jodoacetamid-PEG4-kiselina I7 (0.034 g, 0.08 mmol, 1.0 ekv.) u suvom dihlorometanu (5 mL) i reakcija je mešana u mraku. Posle 50 minuta dodata je dodatna količina jodoacetamid-PEG4-kiselog I7 (0.007 g, 0.016 mmol, 0.2 ekv) zajedno sa dodatnom količinom EDCI (0.003 g, 0.016 mmol, 0.2 ekv.). Posle ukupno 2.5 sata, reakciona smeša je razblažena dihlorometanom (15 mL) i isprana se sekvencijalno vodom (10 mL) i slanim rastvorom (10 mL). Organska faza je osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Dobijeni ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (silika gel, hloroform 100% do 90:10 v/v hloroform:metanol). Čiste frakcije se kombinuju kako bi se dobio proizvod (0,0254 g, 23%, 2 koraka). Sirove frakcije su sakupljene i prečišćene preparativnim TLC (silika gel, 90:10 v/v hloroformom:metanol) da bi se dobila druga serija proizvoda (0.0036 g, 3%, 2 koraka). LC/MS (2.689 min (ES<+>)), m/z: 681.01/2[M+2H]<+>.

Primer 10: Aktivnost oslobođenih jedinjenja

K562 test

[0273] K562 humane hronične mijeloidne leukemije održavani su u RPM11640 okruženju uz 10% fetalnog telećeg seruma i 2 mM glutamina na 37°C u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2, i inkubirani su određenom dozom leka tokom 1 sata ili 96 sati na 37°C u mraku. Inkubacija je prekinuta centrifugiranjem (5 min, 300 g), i ćelije su jednom isprane okruženjem bez leka. Sledeći odgovarajući tretman leka, ćelije su prenesene u mikrotitarske ploče sa 96 udubljenja (10 ćelija po udubljenju, 8 udubljenja po uzorku). Ploče su zatim čuvane u mraku na 37°C u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2. Ispitivanje se temelji na sposobnosti vitalnih ćelija da smanje žutu rastvorivu tetrazolijevu so, 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazolij-bromid (MTT, Aldrich-Sigma) u netopiv ljubičast talog formazana. Nakon inkubacije ploča tokom 4 dana (kako bi kontrolne ćelje povećale broj otprilike 10 puta), 20 µl MTT rastvora (5 mg/ml u fosfatnom puferu) dodato je u svako udubljenje i ploče su dalje inkubirane 5 sati. Ploče su zatim podvrgnute centrifugi 5 minuta pri 300 g i većina okruženja je pipetirana od ćelijskog taloga, ostavljajući 10-20 µl po udubljenja. DMSO (200 mL) je dodat u svaki udubljenja, a uzorci mešani kako bi se osiguralo potpuno mešanje. Optička gustina je zatim očitana na talasnoj dužini od 550 nm na Titertek Multiscan ELISA čitaču, i kriva doza-odgovor je konstruisana. Za svaku krivu, IC50 vrednost je uzeta kao doza neophodna da se smanji konačna optičke gustina na 50% kontrolne vrednosti.

[0274] Jedinjenje RelC ima IC50manje od 0.1 pM u ovom testu.

[0275] Jedinjenje RelE ima IC50od 0.425 nM u ovom testu.

Primer 11: formiranje konjugata

Opšta procedura konjugovanja antitela

[0276] Antitela su razređena do 1-5 mg/ml u puferu za smanjenje (primeri: fosfatom puferovan fiziološki rastvor PBS, histidin pufer, natrijum boratni pufer, TRIS pufera). Sveže pripremljen rastvor TCEP (tris(2-karboksietil)fosfin hidrohlorid) dodat je kako bi se selektivno redukovali cistein disulfidni mostovi. Količina TCEP je proporcionalna ciljanom nivou smanjenja, sa 1 do 4 molarnih ekvivalenata po antitelu, što stvara 2 do 8 reaktivnih tiola. Nakon redukcije tokom nekoliko sati na 37°C, smesa je ohlađena na sobnu temperaturu i višak veznika za lek (A, B, C, D, E) dodat je kao razređen DMSO rastvor (konačni sadržaj DMSO do 10% volumena/volumen reakcione smese). Smeša je blago trešena na ili 4°C ili sobne temperature, u prikladnom trajanju, obično 1-3 sata. Višak reaktivnih tiola može reagovati sa “reagensom za ograničavanje tiola” kao što je N-etil maleimid (NEM) na kraju konjugacije. Konjugati antitela leka su koncentrisani pomoću centrifugalnih spin-filtera sa odsečkom molekulske mase od 10 kDa ili više, a zatim pročišćeni filtracijom tangencijalnog protoka (TFF) ili brzom proteinskom tečnom hromatografijom (FPLC). Odgovarajući konjugati antitela lekova mogu se odrediti analizom Tečnom hromatografijom velikog učinka (HPLC) ili Tečnom hromatografijom ultra-velikog učinka (UHPLC) kako bi se procenio odnos lek-po-antitelu (DAR) pomoću reverzno-fazne hromatografije (RP) ili hidrofobno-interakcijske hromatografije (HIC), u kombinaciji sa UV-vidljivom, fluorescentnom ili masa-spektrometar detekcijom; agregatn nivo i monomerska čistoća mogu se analizirati pomoću HPLC ili UHPLC koristeći hromatografiju koja isključuje po veličini sa UV-vidljivom, fluorescentnom ili masa-spektrometar detekcijom. Konačnu koncentraciju konjugata određuje kombinacija spektroskopske (apsorbcija na 280, 214 i 330) i biohemijske analize (test bicinhoninske kiseline Smith, P.K., i dr. (1985) Anal. Biochem.150 (1): 76-85; upotrebom IgG antitela poznate koncentracije kao referentne vrednosti). Konjugati antitela i leka su uglavnom sterilno filtrirani koristeći filtre od 0,2 mm u aseptičkim uslovima, i čuvani na 4°C, -20°C ili -80°C.

Određivanje DAR-a

1

[0277] Antitelo ili ADC (oko 35 µg u 35 µL) smanjen je dodavanjem 10 µL boratnog pufera (100 mM, pH 8.4) i 5 µL DTT (0.5 M u vodi) i zagrevano na 37°C tokom 15 minuta. Uzorak je razblažen sa 1 zapreminom acetonitrila: voda: 49%: 2% v / v) i injektirana na Widepore 3.6m KSB-C18150 k 2.1 mm (P/N 00F-4482-AN) kolone (Phenomenex Aeris) na 80°C u sistemu UPLC (Shimadzu Nekera) sa brzinom protoka od 1 ml/min uravnoteženo u 75% pufera A (voda, trifluorosirćetna kiselina (0,1% v/v) (TFA), 25% pufera B (acetonitril: TFA 90%: 10%: 0,1% v/v). Vezivni materijal eluira se pomoću gradijenta od 25% do 55% pufera B za 10 min. Sledeći pikovi su identifikovani za svaki ADC ili antitelo: laki lančani lanac antitela (L0), težak lanac antitela (H0) i svaki od ovih lanaca sa dodanim lekom-veznicima (označenim sa L1 za laki lanac sa jednim lekom i H1, H2, H3 za teški lanac sa vezanim lekom-veznicima od 1, 2 ili 3). UV-hromatogram na 330 nm korišćen je za identifikaciju fragmenata koji sadrže lek-veznike (tj. L1, H1, H2, H3).

[0278] Molarni odnos PBD/proteina izračunat je za lance i teške lance:

[0280] Merenje DAR-a vrši se na 214 nm jer minimizira smetnje od apsorpcije leka-veznika.

Stvaranje ADC protiv PSMA

[0281] Antitelo A (koje sadrži varijabilni domen koji je SEQ ID NO.3 uparena sa SEQ ID NO.4) je konjugovano sa veznikom leka A kako bi se dobio Conj A-A, i DAR je izmeren da je 2.62.

[0282] Antitelo A (koje sadrži varijabilni domen koji je SEQ ID NO.3 uparena sa SEQ ID NO.4) je konjugovano sa veznikom leka B kako bi se dobio Conj A-B, i DAR je izmeren da je 2.43.

[0281] Antitelo A (koje sadrži varijabilni domen koji je SEQ ID NO.3 uparena sa SEQ ID NO. 4) je konjugovano sa veznikom leka D kako bi se dobio Conj B-D, i DAR je izmeren da je 2.35.

[0281] Antitelo A (koje sadrži varijabilni domen koji je SEQ ID NO.3 uparena sa SEQ ID NO.4) je konjugovano sa veznikom leka E kako bi se dobio Conj E-D, i DAR je izmeren da je 2.34.

[0285] Dodatni ADC su opisani ispod.

[0286] deJ591 je anti-PSMA antitelo koje sadrži VH domen koji ima sekvencu prema SEQ ID NO.3 i VL domen koji ima sekvencu prema SEQ ID NO.4.

[0287] ADC ciljani PSMA stvoreni su konjugovanim deJ591 antitela za veznik leka A, E ili D. Dobijeni ADC izlistani su u tabeli ispod, uz izmerene DAR. B12 anti-HIV gp120 antitelo je korišćeno za stvaranje ADC koji nisu ciljani od strane PSMA.

2

PRIMER 12: in vitro citotoksičnost ADC

Ćelijska Kultura

[0288] LNCaP i PC3 ćelije su velikodušan poklon od profesora John Hartley (UCL) Okruženje ćelijske kulture je RPMI 1640 dopunjeno sa L-Glutaminom i 10% FBS. Ćelije su uzgajane na 37 °C, 5% CO2, u vlažnom inkubatoru.

Test citotoksičnosti

[0289] Koncentracija i održivost kultura suspendovanih ćelija (do 1 × 10<6>/ml) određena je mešanjem 1:1 sa Tripan plavim i prebrojavanjem jasnih (živih)/plavih (mrtvih) ćelija sa hemocitometrom. Suspenzija ćelije je razblažena do potrebne gustine zasejavanja (uglavnom 10<5>/ml) i izdvojena u ploče sa ravnim dnom sa 96 udubljenja. Za Alamar plavi test, 100 µl/udubljenju izdvojeno je na crnim pločama. Za MTS test, 50 µl/rupi izdvojeno je na pločama sa udubljenjima. Osnovni rastvor (1 ml) ADC (20 µg/ml) je napravljen razblaživanjem filter-sterilnog ADC u sredinu ćelijske kulture. Komplet od 8 x 10 puta razređenja ADC-a napravljen je na 24 ploča sa serijskim prenosom 100 µl na 900 µl okruženja ćelijske kulture. Svako ADC razblaženje (100 ml/rupi za Alamar plavo, 50 ml/rupi za MTS) izdvojeno je u 4 replikatna udubljenja ploče sa 96 udubljenja, koje sadrže suspenziju ćelija. Kontrolna udubljenja su primala istu količinu samo okruženja za kulturu. Nakon inkubacije u trajanju od 4 dana, preživljavanje ćelija je mereno bilo Alamar plavim ili MTS testom.

[0290] AlamarBlue® (Invitrogen, kataloški broj DAL1025) je izdvojen (20 µl po udubljenju) u svako udubljenje i inkubiran 4 časa na 37°C u inkubatoru sa CO2-gasom. Dobijena je fluorescencija na eksploataciji 570 nm, emisija 585 nm. Preživljavanje ćelija (%) izračunato je iz odnosa srednje vrednosti fluorescencije u 4 ADC tretirana udubljenja u poređenju sa srednjom fluorescencijom u 4 kontrolna udubljenja (100%).

[0291] MSP (Promega, katalog G5421) je izdvojen (20 ml po posudi) u svaku posudu i inkubiran 4 časa na 37°C u inkubatoru sa gasom CO2. Apsorbancija je merena na 490 nm. Preživljavanje ćelija (%) izračunato je iz srednje vrednosti apsorpcije u 4 ADC tretirane posude u poređenju sa srednjom apsorbancijom u 4 kontrolne posude (100%). Krive odziva doza su generisane iz srednjeg podataka 3 eksperimenta i EC50 je utvrđen pomoću podataka koji se uklapaju u sigmoidnu krivu doza-odziv sa promenljivim nagibom koristeći Prism (GraphPad, San Diego, CA).

In vitro citotoksičnost

[0292] Efikasnost deJ591 ADC od iznad testirana je u poređenju sa LNCaP ćelijama. Kao PSMA negativna kontrola, korišćene su PC3 ćelije.

[0293] Slika 1 prikazuje in vitro efikasnost deJ591 ADC u LNCaP ćelijama. Serijsko razblaženje od 10 puta (µg/mL) deJ591 ADC je inkubirano sa LNCap ćelijama. Alamar Blue test je izveden na kraju inkubacijskog perioda i izračunato je preživljavanje ćelija. Grafikoni predstavljaju prosek od tri ponovljena eksperimenta.

[0294] Sva tri testirana deJ591 ADC pokazala su značajnu citotoksičnost protiv LNCaP ćelija (Slika 1):

[0295] Isti eksperiment ponovljen sa PSMA -ve ćelijama, PC3, nije pokazao citotoksičnost zavisnu od koncentracije (Slika 2).

[0296] Anti-HIV gp120 antitelo, B12, povezano sa istim toksičnim materijalima je korišćeno kao negativna kontrola ADC. Kao iznad, serijsko razblaženje od 10 puta (µg/mL) B12 ADC je inkubirano sa LNCap ćelijama. Alamar Blue test je izveden na kraju inkubacijskog perioda i izračunato je preživljavanje ćelija. Grafikoni na Slikama 3 i 4 predstavljaju prosek tri ponovljena eksperimenta.

[0297] Tri B12 ADCs konjugata koji se ne vezuju pokazali su značajno manju potentnost od ekvivalentnih deJ591 konjugata sa A, E i D respektivno (Slika 3). Isti eksperiment ponovljen sa PSMA -ve ćelijama, PC3, opet nije pokazao citotoksičnost zavisnu od koncentracije (Slika 4).

PRIMER 13 - in vivo anti-tumorska aktivnost ADC

[0298] PSMA (ve) kancer prostate izveden iz ćelijske linije LNCaP kod ljudo korišćen je za procenjivanje efikasnost deJ591-A ADC kod mišijeg ksenograft modela. Kao ne-PSMA vezujuće kontrole, anti-HIV gp 120 antitelo, B12, povezano za isti veznik leka je korišćeno.

Dizajn ispitivanja

[0299] Lekovi i tretiranje:

Procedure:

[0300]

• Podešene CR ženke NCr nu/nu miševa sa l xl LNCaP-SPN ćelijama tumora u 0%.

• Matrigel sc u boku.

• Zapremina ćelijske injekcije je 0.1 mL po mišu.

• Starost pri početnom datumu: 8 do 12 nedelja.

• Izvršeno je poklapanje parova kada su tumori dostigli prosečnu veličinu od 100 - 150 mm<3>i započeto je tretiranje.

• Telesna težina: qd x 5 zatim bi-wk do kraja

• Merenje sa kaliperom: bi-wk do kraja

• Beleženje bilo kakvih štetnih reakcija ili neposredne smrti.

• Bilo koja pojedinačna životinja sa pojedinačnim osmatranjem >30% gubitka telesne težine ili tri uzastopna merenja >25% gubitka telesne težine će biti eutanazirana.

• Bilo koja grupa sa dva merenja srednjeg gubitka telesne težine >20% il i>10% smrtnosti će zaustaviti doziranje. Grupa nije eutanazirana i oporavak je dozvoljen. U grupi sa >20% gubitka težine, pojedinci koji dostignu pojedinačnu telesnu težinu telesne mase će biti eutanazirana. Ako se gubitak telesne mase u vezi sa grupom lečenja povrati u roku od 10% od prvobitnih težina, doziranje može da se nastavi sa nižim dozama ili manjim rasporedom doziranja. Izuzetak od obnavljanja telesne težine u % bez tretmana se može dozvoliti od slučaja do slučaja.

• Krajnja tačka TGD.

Životinje treba posmatrati pojedinačno. Krajnja tačka eksperimenta je zapremina tumora od 2000mm<3>ili 60 dana, u zavisnosti od toga koja je prva. Responderi se mogu pratiti duže. Kada se postigne krajnja tačka, životinje treba eutanizirati.

Opšti metodološki pristup

4

[0301] Za računanje srednjih zapremina tumora grupa sledeće pravilo je primenjeno: kada životinja napustila ispitivanje usled veličine tumora, krajnja zabeležena zapremina tumora za životinju je uključena sa podacima korišćenim za proračun srednje zapremine uzastopnih vremenskih tački. Kutijasti dijagram ukazuje standardnu gršku srednje vrednosti (SEM). Vrednosti zapremina tumora nisu korišćeni za računanje srednjih zapremina tumora grupe sa manje od 50% životinja u grupi koje su preostale u ispitivanju. Prism (GraphPad, San Diego, CA) je korišćen za grafičko predstavljanje i statističke analize.

Rezultati

[0302] Slika 5 prikazuje deJ591-A u LNCaP ksenograftovom modelu. Miševi su dozirani kada je srednja zapremina tumora po eksperimentalnog grupi dostigla 0.1 cm<3>i tretirane su sa jednom dozom ADC pri 0.3 i 1 mg/kg preko IV u venu u repi. Podaci predstavljaju srednju zapreminu tumora (+/-SEM) od deset miševa u svakoj grupi.

[0303] deJ591-A pri obe koncentracije pokazao je potentnu anti-tumorsku aktivnost (Slika 5). deJ591-A pokazao je značajno veću anti-tumorsku aktivnost od ADC kontrole koja se ne vezuje (B12-A).

Skraćenice

[0304]

Ac acetil

Acm acetamidometil

Alloc aliloksikarbonil

Boc di-tert-butil dikarbonat

t-Bu tert-butil

Bzl benzil, gde je Bzl-Ome methoksibenzil, a Bzl-Me je metilbenzen

Cbz ili Z benziloksi-karbonil, gde su Z-Cl i Z-Br hloro- i bromobenziloksi karbonil, respektivno DMF N,N-dimetilformamid

Dnp dinitrogenil

DTT ditiotreitol

Fmoc 9H-fluoren-9-ilmethoksikarbonil

imp N-10 imin zaštitna grupa: 3-(2-metoksiethoksi)propanoat-Val-Ala-PAB

MC-Osu maleimidokaproil-O-N-sucinimid

Moc metoksikarbonil

MP maleimidopropanamid

Mtr 4-metoksi-2,3,6-trimethtilbenzenesulfonil

PAB para-aminobenziloksikarbonil

PEG etileneoksi

PNZ p-nitrobenzil karbamat

Psec 2-(fenilsulfonil)etoksikarbonil

TBDMS tert-butildimetilsilil

TBDPS tert-butildifenilsilil

Teoc 2-(trimetilsilil)ethoksikarbonil

Tos tosil

Troc 2,2,2-trihlorethoksikarbonil hlorid

Trt tritil

Xan ksantil

Claims

Patentni zahtevi 1. Konjugat formule ConjA:

ConjC:

ConjD:

Ili ConjE:

gde Ab predstavlja antitelo koje se vezuje za PSMA, gde antitelo sadrži VH domen koji ima sekvencu u skladu sa bilo kojom od SEQ ID NO.1, 3, 5, 7, 8, 9, ili 10, opciono dalje sadrži VL domen koji ima sekvencu u skladu sa bilo kojom od SEQ ID NO.2, 4, 6, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ili 18; i gde je opterećenje leka (p) lekova (D) na antitelo (Ab) celi broj od 1 do oko 8. 2. Konjugat prema patentnom zahtevu 1 gde antitelo sadrži VH domen uparen sa VL domenom, VH i VL domeni imaju sekvence izabrane iz grupe koju čine: SEQ ID NO.1 uparena sa bilo kojom od SEQ ID NO.2, 4, 6, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ili 18; SEQ ID NO.3 uparena sa bilo kojom od SEQ ID NO.2, 4, 6, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ili 18; SEQ ID NO.5 uparena sa bilo kojom od SEQ ID NO.2, 4, 6, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ili 18; SEQ ID NO.7 uparena sa bilo kojom od SEQ ID NO.2, 4, 6, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ili 18; SEQ ID NO.8 uparena sa bilo kojom od SEQ ID NO.2, 4, 6, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ili 18; SEQ ID NO.9 uparena sa bilo kojom od SEQ ID NO.2, 4, 6, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ili 18; ili SEQ ID NO.10 uparena sa bilo kojom od SEQ ID NO.2, 4, 6, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ili 18. 3. Konjugat u skladu sa patentnim zahtevom 2 gde upareni VH i VL domeni imaju sekvence: SEQ ID NO. 1 uparena sa SEQ ID NO.
2, SEQ ID NO.
3 uparena sa SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 uparena sa SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 uparena sa SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 7 uparena sa SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.7 uparena sa SEQ ID NO.13, SEQ ID NO.7 uparena sa SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 7 uparena sa SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.7 uparena sa SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 7 uparena sa SEQ ID NO.17, SEQ ID NO.7 uparena sa SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO.8 uparena sa SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.8 uparena sa SEQ ID NO.12, SEQ ID NO. 8 uparena sa SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO.8 uparena sa SEQ ID NO.14, SEQ ID NO. 8 uparena sa SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.8 uparena sa SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.8 uparena sa SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 8 uparena sa SEQ ID NO.18, SEQ ID NO.9 uparena sa SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 9 uparena sa SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.9 uparena sa SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO.9 uparena sa SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.9 uparena sa SEQ ID NO.15, SEQ ID NO. 9 uparena sa SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO.9 uparena sa SEQ ID NO.17, SEQ ID NO. 9 uparena sa SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 10 uparena sa SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 10 uparena sa SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.10 uparena sa SEQ ID NO.13, SEQ ID NO.10 uparena sa SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.10 uparena sa SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.10 uparena sa SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 10 uparena sa SEQ ID NO. 17 ili SEQ ID NO.10 uparena sa SEQ ID NO. 18.
4. Konjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3 gde je antitelo nepromenjeno antitelo.
5. Konjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 gde je antitelo humanizovano, deimunizovano ili ponovo obrađeno.
6. Konjugat prema patentnom zahtevu 5 gde je antitelo humanizovana, deimunizovana ili ponovo obrađena verzija: (i) antitela koje sadrži VH domen SEQ ID NO.1 uparen sa VL domenom SEQ ID NO.2; (ii) J519 antitela obelodanjenog u WO02/098897; (iii) antitela izlučenog iz hibridoma ATCC pristupni br. HB-12109; (iv) antitela koje sadrži VH domen SEQ ID NO.5 uparen sa VL domenom SEQ ID NO.6, (v) J415 antitela obelodanjenog u WO02/098897, (vi) antitela izlučeno iz hibridoma ATCC pristupni br. HB-12126.
7. Konjugat prema patentnom zahtevu 1, gde p je 1, 2, 3 ili 4.
8. Konjugat prema patentnom zahtevu 7 sadrži smešu jedinjenja konjugata antitela i leka, gde je srednje opterećenje leka po antitelo u smeši jedinjenja konjugata antitela i leka od oko 2 do oko 5.
9. Konjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, za upotrebu u terapiji.
10. Konjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, za upotrebu pri tretiranju proliferativnog oboljenja kod ispitanika.
11. Konjugat prema patentnom zahtevu 10, gde je oboljenje rak.
12. Farmaceutski sastav koji sadrži konjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8 i farmaceutski prihvatljiv razređivač, nosač ili ekscipijent.
13. Farmaceutska sastav prema patentnom zahtevu 12 koji dalje sadrži terapeutski efikasnu količinu hemoterapeutskog agensa.