ES2500651T3

ES2500651T3 - Proteínas utilizadas para el diagnóstico de una borreliosis de Lyme

Info

Publication number: ES2500651T3
Application number: ES10763756.3T
Authority: ES
Inventors: Lionel Levet; Odile Mejan-Letourneur
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 2009-08-28
Filing date: 2010-08-26
Publication date: 2014-09-30
Anticipated expiration: 2030-08-26
Also published as: US9977020B2; FR2949472A1; US20120135027A1; EP2470907A1; US20180238874A1; US20170205407A1; WO2011023909A1; PL2470907T3; RU2549698C2; EP2470907B1; FR2949472B1; US9347943B2; RU2012111811A

Abstract

Proteína quimérica de fusión DbpA-OspC de Borrelia, seleccionada del grupo que consiste en: (a) una proteína cuya secuencia en aminoácidos comprende en su extremo N-terminal, la secuencia SEC ID nº 1 y en su extremo C-terminal, la secuencia SEC ID nº 2 o una variante de dicha proteína cuya secuencia en aminoácidos comprende una secuencia que presenta al menos el 40% de identidad con la SEC ID nº 1 y una secuencia que presenta al menos el 50% de identidad con la SEC ID nº 2, con la condición de que dicha variante sea capaz de formar un complejo inmunológico con unos anticuerpos producidos tras una infección por Borrelia o que dicha variante sea capaz de inducir a la producción de anticuerpos anti-Borrelia; (b) una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende en su extremo N-terminal la secuencia SEC ID nº 3 y en su extremo C-terminal la secuencia SEC ID nº 4 o una variante de dicha proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende una secuencia que presenta al menos el 40% de identidad con la SEC ID nº 3 y una secuencia que presenta al menos el 50% de identidad con la SEC ID nº 4, con la condición de que dicha variante sea capaz de formar un complejo inmunológico con unos anticuerpos producidos tras una infección por Borrelia o que dicha variante sea capaz de inducir a la producción de anticuerpos anti-Borrelia; (c) una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende en su extremo N-terminal la secuencia SEC ID nº 5 y en su extremo C-terminal la secuencia SEC ID nº 7 o una variante de dicha proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende una secuencia que presenta al menos el 40% de identidad con la SEC ID nº 5 y una secuencia que presenta al menos el 50% de identidad con la SEC ID nº 7, con la condición de que dicha variante sea capaz de formar un complejo inmunológico con unos anticuerpos producidos tras una infección por Borrelia o que dicha variante sea capaz de inducir a la producción de anticuerpos anti-Borrelia; (d) una proteína que comprende en su extremo N-terminal la secuencia SEC ID nº 6 y en su extremo C-terminal la secuencia SEC ID nº 7 o una variante de dicha proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende una secuencia que presenta al menos el 40% de identidad con la SEC ID nº 6 y una secuencia que presenta al menos el 50% de identidad con la SEC ID nº 7, con la condición de que dicha variante sea capaz de formar un complejo inmunológico con unos anticuerpos producidos tras una infección por Borrelia o que dicha variante sea capaz de inducir a la producción de anticuerpos anti-borrelia; (e) una proteína que comprende en su extremo N-terminal la secuencia SEC ID nº 5, la secuencia SEC ID nº 6 y en su extremo C-terminal la secuencia SEC ID nº 7 o una variante de dicha proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende una secuencia que presenta al menos el 40% de identidad con la SEC ID nº 5, una secuencia que presenta al menos el 40% de identidad con la SEC ID nº 6 y una secuencia que presenta al menos el 50% de identidad con la SEC ID nº 7, con la condición de que dicha variante sea capaz de formar un complejo inmunológico con unos anticuerpos producidos tras una infección por Borrelia o que dicha variante sea capaz de inducir a la producción de anticuerpos anti-Borrelia; (f) una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende una secuencia seleccionada entre las SEC ID nºs 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14.

Description

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DESCRIPCIÓN

Proteínas utilizadas para el diagnóstico de una borreliosis de Lyme

La borreliosis de Lyme (LB) es una enfermedad infecciosa no contagiosa, debida a una espiroqueta denominada Borrelia burgdoferi, transmitida al hombre por una picadura de garrapata del género Ixodes. La LB, sin tratamiento, conlleva unos trastornos patológicos diversos (dermatológicos, artríticos, cardiacos, neurológicos y a veces oculares). Es la enfermedad por vector más frecuente en los EE.UU. y en algunos países templados del hemisferio norte.

Varias especies de borrelias, actualmente denominadas bajo el término de grupo burgdorferi o Borrelia burgdorferi sensu lato (que incluye Borrelia burgdorferi sensu stricto, B. garinii y B. afzelii) están implicadas en esta infección. Estas especies son patógenas para el hombre.

En los Estados Unidos, la especie infecciosa implicada es Borrelia burgdorferi sensu stricto. En Europa, a esta especie, se añaden B. garinii y B. afzelii. En Asia, las especies implicadas son B. garinii y B. afzelii.

En los Estados Unidos, hay declarados aproximadamente 10.000 casos anuales. En Europa, las tasas de incidencia varían en menos de 5 por 100.000.

La borreliosis de Lyme evoluciona pasando por tres fases distintas, desde la infección precoz hasta la fase tardía. La fase precoz (fase I), puede ser asintomática o traducirse en un cuadro pseudogripal. En el 50-80% de los casos, se observa la aparición de una erupción cutánea inflamatoria varios días después de la picadura de la garrapata, de aspecto muy particular, denominada eritema migratorio (EM). En ausencia de tratamiento, la diseminación de la Borrelia por vía sanguínea se traduce algunas semanas más tarde en la aparición de artritis inflamatorias, de afecciones neurológicas (neuroborreliosis) y meníngeas, de manifestaciones cutáneas y cardiacas (fase II). Después de varios meses o años, la enfermedad evoluciona hacia una forma crónica atrofiante, encefalopatía, encefalomielitis y artritis crónica (Fase III).

Existe un tropismo orgánico particular de cada una de las especies de Borrelia burgdorferi. Si la primera fase de eritema migratorio está relacionada indistintamente a las tres especies, la evolución hacia una forma neurológica está asociada preferiblemente a la especie B. garinii, las artritis lo está más a B-burgdorferi sensu stricto, y la acrodermatitis crónica atrofiante es específica de B-afzelii.

El parecido de los síntomas clínicos entre la borreliosis de Lyme y otras enfermedades no relacionadas, así como la variabilidad de las manifestaciones, hacen difícil el diagnóstico clínico. El diagnóstico de la borreliosis puede ser particularmente difícil en base a observaciones clínicas, si las pruebas de anamnesis están ausentes (picadura de garrapata o EM). La fase precoz de la enfermedad puede no ser aparente hasta el momento en el que alcanza fases clínicas muy avanzadas.

Es por ello que el diagnóstico de LB se basa en signos clínicos, pero también en la detección de los anticuerpos específicos de patógenos de Borrelia burgdorferi en el suero, generalmente por ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) o también EIA, IFA. Los anticuerpos IgM anti-borrelia burgdorferi aparecen en general algunos días o semanas después del comienzo de la infección y pueden persistir durante la evolución de la enfermedad. La respuesta IgG es más tardía. La mayoría de los pacientes tienen las IgG aproximadamente un mes después del comienzo de la infección activa y estas IgG pueden también persistir durante años después de la exposición inicial y de la resolución de los síntomas.

En Europa, la evaluación de la respuesta serológica es complicada debido a la existencia de tres especies patógenas y de la variabilidad inter-especies para los antígenos inmunodominantes principales. Los antígenos actualmente utilizados de forma rutinaria para la detección de las IgG e IgM de LB son unas muestras celulares tratadas con ultrasonidos de Borrelia burgdorferi sensu lato. Los rendimientos de los ensayos serológicos con estos antígenos en términos de especificidad y de sensibilidad son muy variables. Así, debido a una especificidad insuficiente, que implica unas reactividades cruzadas con unos anticuerpos asociados a diferentes bacterias patógenas, en particular Treponema pallidium (agente etiológico de la sifilis), unas espiroquetas, rickettisies, erchilia

o Helicobacter pylori, el diagnóstico de las muestras ensayadas positivas en ELISA debe ser confirmado por inmunotransferencia. La sensibilidad es también un factor importante. En efecto, Borrelia burgdorferi sensu lato expresa diferentes proteínas de superficie por adaptación a diversos microentornos, de manera que la diversidad genética y la expresión diferencial de los genes de Borrelia burgdorferi en los pacientes tienen unas implicaciones importantes para el desarrollo de ensayos serológicos de LB. La lipoproteína OspC (Outer-surface protein C) y la proteína DbpA (Decorin-binding protein A) pertenecen a estas proteínas. La DbpA aparece principalmente expresada en el mamífero después de la infección. Estas proteínas presentan una gran variabilidad de secuencias según las especies de Borrelia burgdorferi e Inter-especies. Las proteínas DbpA son particularmente variables y se reparten en cuatro grupos: un grupo que corresponde a la genoespecie Borrelia afzelli, otro grupo que corresponde a la genoespecie Borrelia sensu stricto y dos grupos que corresponden a la genoespecie Borrelia burgdorferi garinii.

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La identidad de las secuencias de aminoácidos inter-especie entre las proteínas DbpA es sólo del 40-44%. Es del 54-72% para las proteínas OspC. El documento WO 00/78800 describe una combinación de proteínas que comprenden DbpA y OspC, y su utilización en un procedimiento de diagnóstico de una Borreliosis de Lyme.

Por lo tanto, es necesario desarrollar un kit que responda a los criterios de especificidad y de sensibilidad esperados y en particular que mejora la detección de las IgM, en términos de sensibilidad, en el caso de infección reciente.

La presente invención se propone resolver el conjunto de los inconvenientes del estado de la técnica, mediante nuevas proteínas recombinantes quiméricas, fácilmente sintetizables y purificables, y que presentan una fuerte inmunorreactividad frente a sueros de pacientes susceptibles de ser infectados por una o varias especies patógenas de Borrelia burgdorferi. Estas proteínas de fusión quiméricas permiten paliar los problemas de sensibilidad y de especificidad relacionados: con la presencia de varias especies patógenas de Borrelia burgdorferi, con la gran variabilidad de las secuencias de los antígenos de superficie de Borrelia burgdorferi y con la necesidad de utilizar varios antígenos representativos de las especies B. garinii, B. burgdorferi sensu stricto y B, afzelii para elaborar un ensayo de diagnóstico de la borreliosis de Lyme basado al menos en la detección de los anticuerpos anti-OspC y anti-DbpA.

Las proteínas de fusión quiméricas de la invención permiten por otra parte resolver las dificultades encontradas para expresar ciertos antígenos en forma recombinante a un nivel elevado. En efecto, a pesar de un trabajo importante sobre la construcción de los genes para obtener una expresión optimizada de estos en E. coli, los inventores han mostrado por primera vez que las proteínas OspC están poco expresadas en forma recombinante en E. coli, mientras que de manera muy imprevisible, han encontrado que las proteínas DbpA podían ser expresadas en las mismas condiciones en forma soluble en condiciones no desnaturalizantes y con unos rendimientos más elevados. La facilidad de expresión de las proteínas DbpA se ha explotado para crear unas proteínas quiméricas compuestas de DbpA y de OspC y los inventores han podido demostrar que las proteínas quiméricas estaban mejor expresadas que las proteínas OspC aisladas, lo que era completamente inesperado ya que no se ha descrito jamás, ni se ha sugerido, que las proteínas DbpA podían tener las propiedades de proteínas de fusión. Asimismo, a fin de mejorar los niveles de expresión, los inventores han concebido unas proteínas quiméricas DbpA-OspC utilizando las propiedades de fusión inesperadas de las proteínas DbpA para mejorar la expresión y la solubilidad de las proteínas quiméricas. En la construcción molecular para la expresión de una proteína quimérica de la invención, el gen que codifica para la proteína DbpA está integrado secuencia arriba del o de los que codifican para una o más proteínas OspC. En función de esta construcción molecular, la proteína quimérica de la invención presenta en su extremo Nterminal una secuencia que pertenece a una secuencia proteica DbpA, y en su extremo C-terminal una secuencia que pertenece a una secuencia proteica OspC. Este tipo de construcción, además del hecho de que permite facilitar y optimizar la expresión y la solubilidad de la proteína quimérica, presenta además otra ventaja, que es mejorar el reconocimiento de la quimérica por unos anticuerpos anti-Borrelia debido a la mejor presentación de estos de la región inmunodominante de la proteína OspC. Una ventaja suplementaria de las proteínas quiméricas de la invención es limitar el número de proteínas recombinantes en la constitución de un kit de diagnóstico de la Borreliosis de Lyme. Por otra parte, las propiedades de fusión de las proteínas DbpA hacen de ellas excelentes candidatas para la expresión de proteínas vaccíneas quiméricas DbpA-OspC para prevenir una infección por Borrelia. En consecuencia, las proteínas quiméricas de la invención son útiles como agente activo en una vacuna preventiva contra la borreliosis.

Asimismo, la presente invención tiene por objeto una proteína quimérica de fusión DbpA-OspC de Borrelia, no natural, de síntesis, es decir obtenida por ingeniería genética (proteína recombinante) o por síntesis peptídica, siendo dicha proteína seleccionada del grupo que consiste en:

(a): una proteína cuya secuencia en aminoácidos comprende en su extremo N-terminal (o consiste en) la secuencia SEC ID nº 1, y en su extremo C-terminal la SEC ID nº 2, o una variante de dicha proteína cuya secuencia en aminoácidos comprende (o consiste en) una secuencia que presenta al menos el 40% de identidad con la SEC ID nº 1 y una secuencia que presenta al menos el 50% de identidad con la SEC ID nº 2, con la condición de que dicha variante sea capaz de formar un complejo inmunológico con unos anticuerpos producidos tras una infección por Borrelia, o que dicha variante sea capaz de inducir a la producción de anticuerpos anti-Borrelia;

(b): una proteína cuya secuencia en aminoácidos comprende en su extremo N-terminal (o consiste en) la secuencia SEC ID nº 3, y en su extremo C-terminal la secuencia SEC ID nº 4, o una variante de dicha proteína cuya secuencia en aminoácidos comprende (o consiste en) una secuencia que presenta al menos el 40% de identidad con la SEC ID nº 3 y una secuencia que presenta al menos el 50% de identidad con la SEC ID nº 4, con la condición de que dicha variante sea capaz de formar un complejo inmunológico con unos anticuerpos producidos tras una infección por Borrelia o que dicha variante sea capaz de inducir a la producción de anticuerpos anti-Borrelia;

(c): una proteína, cuya secuencia en aminoácidos comprende en su extremo N-terminal (o consiste en) la secuencia SEC ID nº 5, y en su extremo C-terminal la secuencia SEC ID nº 7, o una variante de dicha proteína cuya secuencia en aminoácidos comprende (o consiste en) una secuencia que presenta al menos el 40% de identidad con la SEC ID nº 5 y una secuencia que presenta al menos el 50% de identidad con la SEC ID nº 7, con la condición de que dicha variante sea capaz de formar un complejo inmunológico con unos anticuerpos producidos tras una infección por Borrelia o que dicha variante sea capaz de inducir a la producción de anticuerpos anti-Borrelia;

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(d): una proteína, cuya secuencia en aminoácidos comprende en su extremo N-terminal (o consiste en) la secuencia SEC ID nº 6, y en su extremo C-terminal la secuencia SEC ID nº 7, o una variante de dicha proteína cuya secuencia en aminoácidos comprende (o consiste en) una secuencia que presenta al menos el 40% de identidad con la SEC ID nº 6 y una secuencia que presenta al menos el 50% de identidad con la SEC ID nº 7, con la condición de que dicha variante sea capaz de formar un complejo inmunológico con unos anticuerpos producidos tras una infección por Borrelia o que dicha variante sea capaz de inducir a la producción de anticuerpos anti-Borrelia;

(e): una proteína, cuya secuencia en aminoácidos comprende en su extremo N-terminal (o consiste en) la secuencia SEC ID nº 5, la secuencia SEC ID nº 6 y en su extremo C-terminal la secuencia SEC ID nº 7, o una variante de dicha proteína cuya secuencia en aminoácidos comprende (o consiste en) una secuencia que presenta al menos el 40% de identidad con la SEC ID nº 5, una secuencia que presenta al menos el 40% de identidad con la SEC ID nº 6 y una secuencia que presenta al menos el 50% de identidad con la SEC ID nº 7, con la condición de que dicha variante sea capaz de formar un complejo inmunológico con unos anticuerpos producidos tras una infección por Borrelia o que dicha variante sea capaz de inducir a la producción de anticuerpos anti-Borrelia; y

(f): una proteína cuya secuencia en aminoácidos comprende (o consiste en) una secuencia seleccionada entre las SEC ID nºs 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14.

Cada una de las proteínas identificadas anteriormente comprende al menos una secuencia del dominio extracelular de una proteína DbpA de una especie de borrelia seleccionada entre B. afzelii (SEC ID nº 1), B. burgdorferi sensu lato (SEC ID nº 3) y B. garinii (grupo III: SEC ID nº 5) (grupo IV: SEC ID nº 6) o una secuencia que presenta al menos el 40% de identidad con dichas secuencias y al menos una secuencia de una proteína OspC de B. afzelii (SEC ID nº 2), B. burgdorferi sensu stricto (SEC ID nº 4) y B. garinii (SEC ID nº 7) o una secuencia que presenta al menos el 50% de identidad con dichas secuencias. Preferiblemente, la(s) secuencia(s) DbpA está(n) colocada(s) en el lado N-terminal de la proteína recombinante quimérica y la secuencia OspC está colocada del lado C-terminal de la proteína recombinante quimérica

Una secuencia de al menos 6 histidinas puede ser añadida a nivel del extremo N-terminal o C-terminal de la proteína quimérica para permitir su purificación sobre resina de metal-quelato. La secuencia de 6 histidinas, identificada en la SEC ID nº 22 está colocada preferiblemente en el lado N-terminal de la construcción. Esto se ilustra, a título de ejemplo, por las secuencias SEC ID nºs 9, 11, 13 y 14 que comprenden en el lado N-terminal una cola poly-His (6). La cola poly-His puede ser codificada por cualquiera de las secuencias identificadas en las SEC ID nºs 23, 24 y 25.

Unos aminoácidos adicionales pueden estar presentes secuencia arriba de la cola poly-His debido a la inserción en la secuencia de ADN codificante de una pequeña secuencia que permite facilitar la clonación de la secuencia de interés en el plásmido de expresión. Este es el caso, en particular, en las secuencias SEC ID nºs 9, 11, 13 y 14 que comprenden una unidad "MRGS" (SEC ID nº 26) secuencia arriba de la cola poly-His. La unidad "MRGS" está codificada por ATGAGGGGATCC (SEC ID nº 27).

Se puede introducir una región de unión entre cada una de las secuencias DbpA y OspC que componen una proteína recombinante quimérica. Este tipo de región corresponde a una región de espaciamiento, flexible, que asegura una mejor accesibilidad de los anticuerpos potenciales a cada uno de los dominios. Es rica en aminoácidos Gly y Ser, aminoácidos descritos como que aportan una flexibilidad en la estructura terciaria de la proteína. Es asimismo posible introducir en una secuencia de interés codificante un brazo ADN (o linker) para favorecer la unión entre las secuencias que codifican dos proteínas de interés. Este es el caso en particular en la secuencia SEC ID nº 14 que comprende una unidad "GSGG" (SEC ID nº 28) codificada por la secuencia GGTTCCGGGGGT (SEC ID nº 29) que actúa como brazo de unión entre las proteínas DbpA grupo IV y OspC de B. garinii.

Las proteínas preferidas son identificadas en las SEC ID nºs 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14. Están respectivamente codificadas por las secuencias de ADN correspondientes identificadas en las SEC ID nºs 15, 16, 17, 18, 19, 20 y 21.

La invención tiene también por objeto las secuencias de ADN que codifican las proteínas tales como se han definido anteriormente y en particular las secuencias identificadas SEC ID nºs 15, 16, 17, 18, 19, 20 y 21.

La invención tiene asimismo por objeto un casete de expresión que es funcional en una célula derivada de un organismo procariota (por ejemplo Escherichia coli) o eucariota, tal como la levadura (por ejemplo Pichia, Schizosaccharomyces) que permite la expresión del ácido nucleico descrito anteriormente (ADN), cuando está colocada bajo el control de los elementos que permiten su expresión, así como el vector que comprende tal casete.

Las proteínas de la invención son utilizables en particular para el diagnóstico de una infección de Borrelia. Así, la presente invención tiene por objeto un procedimiento para el diagnóstico in vitro de una Borreliosis de Lyme en una muestra biológica (por ejemplo una muestra de suero, de sangre, de plasma, etc.) según el cual se pone en contacto la muestra biológica con al menos una proteína tal como se ha definido antes, y se determina si hay formación de un complejo inmunológico entre dicha proteína y los anticuerpos de la muestra biológica (IgG y/o IgM), por ejemplo, por adición de al menos una anti-inmunoglobulina humana marcada por cualquier marcador apropiado. Por marcador, se entiende un trazador capaz de generar una señal. Una lista no limitativa de estos trazadores comprende las enzimas que producen una señal detectable, por ejemplo por colorimetría, fluorescencia o luminiscencia, como la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina, la -galactosidasa, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa; los cromóforos

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como los compuestos fluorescentes, luminiscentes o colorantes; los grupos de densidad electrónica detectables por microscopía electrónica o por sus propiedades eléctricas como la conductividad, mediante los métodos de amperometría o de voltametría, o por unas mediciones de impedancia; los grupos detectables por unos métodos ópticos como la difracción, la resonancia plasmón de superficie, la variación de ángulo de contacto o por unos métodos físicos como la espectroscopía de fuerza atómica, el efecto túnel, etc.; las moléculas radioactivas como 32P,35S o 125I. Preferentemente, la o las proteína(s) está(n) inmovilizadas sobre un soporte sólido que puede ser el cono de un aparato Vidas®, el pocillo de una placa de microtitulación, un gel, una partícula, etc.

En un modo de realización de la invención, la muestra biológica se pone además en contacto con al menos una proteína quimérica VlsE, tal como se describe a continuación.

La proteína VlsE (surface expressed lipoprotein with Extensive antigenic Variation) es principalmente expresada in vivo, de manera transitoria y rápidamente después de la infección del hospedante. Es muy inmunogénica en el hospedante infectado, implicando la producción de IgG y de IgM. El locus de Vls está localizado en un plásmido lineal de 28 kb (Ip28-1) presente en las tres genoespecies de borrelia responsables de Lyme y compuesto de casetes silenciosos y de un sitio de expresión (VlsE). In vivo, se producen unas recombinaciones aleatorias entre casetes de expresión y casetes silenciosos durante la infección y son el origen de la variabilidad antigénica de VlsE. La proteína VlsE está compuesta de seis regiones variables VR1-VR6, situadas en la superficie de la proteína VlsE, espaciadas por regiones denominadas invariables IR1-IR6.

La proteína VslE quimérica comprende (o consiste esencialmente en):

(i): al menos una secuencia seleccionada ente las secuencias identificadas en las SEC ID nºs 30, 31, 32, 33 y 34 y las secuencias que presentan al menos el 50% de identidad, preferentemente el 60% o el 70% de identidad y ventajosamente al menos el 80% o el 85% de identidad con las SEC ID nº 30, 31, 32, 33 y 34, y

(ii): al menos una secuencia que comprende la secuencia SEC ID nº 35 o una secuencia que presenta al menos el 80% de identidad, preferentemente al menos el 85% de identidad y ventajosamente al menos el 90% de identidad con la SEC ID nº 35, la secuencia SEC ID nº 36 o una secuencia que presenta al menos el 80% de identidad, preferentemente al menos el 85% de identidad y ventajosamente al menos el 90% de identidad con la SEC ID nº 36, la secuencia SEC ID nº 37 o una secuencia que presenta al menos el 80% de identidad, preferentemente al menos el 85% de identidad y ventajosamente al menos el 90% de identidad con la SEC ID nº 37, y facultativamente, la secuencia SEC ID nº 43. La proteína quimérica VlsE, preferentemente comprende la secuencia SEC ID nº 43.

Como se ha descrito anteriormente, se puede añadir una cola poli-histidina (x6) a nivel del extremo N-terminal de la proteína quimérica para permitir su purificación sobre resina de metal-quelato, así como unos aminoácidos adicionales secuencia arriba de la cola poly-his.

Una proteína quimérica preferida comprende (o consiste esencialmente en, o también consiste en):

(i): la secuencia SEC ID nº 30 o una secuencia que presenta al menos el 50% de identidad, preferentemente al menos el 60% o el 70% de identidad y ventajosamente al menos el 80 o el 85% de identidad con la SEC ID nº 30; y

(ii): la secuencia que comprende la secuencia SEC ID nº 35 o una secuencia que presenta al menos el 80% de identidad, preferentemente al menos el 85% de identidad y ventajosamente al menos el 90% de identidad con las SEC ID nº 35, la secuencia SEC ID nº 36 o una secuencia que presenta al menos el 80% de identidad, preferentemente al menos el 85% de identidad y ventajosamente al menos el 90% de identidad con las SEC ID nº 36, la secuencia SEC ID nº 37 o una secuencia que presenta al menos el 80% de identidad, preferentemente al menos el 85% de identidad y ventajosamente al menos el 90% de identidad con la SEC ID nº 37, y la secuencia SEC ID nº 43.

La proteína quimérica preferida comprende (o consiste esencialmente en, o también consiste en):

(i): la secuencia SEC ID nº 30; y

(ii): la secuencia que comprende las secuencias SEC ID nºs 35, 36, 37 y 43.

La proteína comprende o consiste en una secuencia identificada como la SEC ID nº 38

La SEC ID nº 30 corresponde a la secuencia del dominio extracelular de VlsE de B. garinii (cepa pBi) separada de su secuencia señal (aa 1-19) y de la región C-terminal de la proteína madura situada después del dominio IR6.

La SEC ID nº 31 corresponde a la secuencia del dominio extracelular de VlsE de B. garinii (cepa pBr) separada de su secuencia señal y de la región C-terminal de la proteína madura situada después del dominio IR6.

La SEC ID nº 32 corresponde a la secuencia del dominio extracelular de VlsE de B. garinii (cepa pLi) separada de su secuencia señal y de la región C-terminal de la proteína madura situada después del dominio IR6.

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La SEC ID nº 33 corresponde a la secuencia del dominio extracelular de VlsE de B. afzelli (cepa pKo) separada de su secuencia señal y de la región C-terminal de la proteína madura situada después del dominio IR6.

La SEC ID nº 34 corresponde a la secuencia del dominio extracelular de VlsE de B. burgdorferi sensu stricto (cepa B31) separada de su secuencia señal y de la región C-terminal de la proteína madura situada después del dominio IR6.

La SEC ID nº 35 corresponde a la secuencia del dominio IR6 de B. burgdorferi sensu stricto (cepa B31).

La SEC ID nº 36 corresponde a la secuencia del dominio IR6 de B. afzelii (cepa ACA-1).

La SEC ID nº 37 corresponde a la secuencia del dominio IR6 de B. garinii (cepa Ip90).

La SEC ID nº 43 corresponde a la secuencia de la región variable VR6 de B. burgdorferi sensu stricto (cepa B31).

La invención tiene también por objeto un equipo para el diagnóstico in vitro de una Borrelisis de Lyme que comprende al menos una proteína quimérica DbpA-OspC tal como se ha definido anteriormente, que comprende preferentemente al menos una anti-inmunoglobulina humana marcada por cualquier marcador apropiado que responde a las definiciones dadas anteriormente. El equipo puede comprender además una proteína VlsE quimérica tal como se ha definido anteriormente.

Las proteínas de la invención son igualmente utilizables como ingrediente activo para la preparación de una composición vaccínea para prevenir una infección por Borrelia. Asimismo, la presente invención tiene también por objeto una composición vaccínea que comprende al menos una proteína tal como se ha definido anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los ejemplos siguientes, se dan a título ilustrativo y no tienen carácter limitativo. Permiten entender mejor la invención. El orden de las secuencias que codifican las diferentes regiones epitópicas inmunodominantes de las proteínas recombinantes quiméricas puede ser eventualmente modificado. Los epítopos pueden también presentar unas variaciones con respecto a las secuencias descritas en los ejemplos según la especie de Borrelia burgdorferi y la o las cepas que representan. La longitud de las regiones de unión puede también ser modificada para mejorar la flexibilidad entre dos dominios. Finalmente, las regiones de fijación pueden ser insertadas dentro de las regiones de unión.

Ejemplos

Ejemplo 1: preparación de construcciones plasmídicas que codifican para las proteínas recombinantes quiméricas DpbA-OspC.

Las secuencias de ADN que codifican para las diferentes secuencias DpbA y OspC descritas son identificadas en la tabla 1. Las secuencias de ADN se optimizaron para favorecer la expresión en E. coli utilizando GeneOptimizerTM y sintetizadas respectivamente por GenScript corporation (Scotch Plains, NJ, USA) o GeneArt GmbH Regensburg, Alemania).

Tabla 1: origen de las secuencias

Especies de B. burgdorferi "Isolat; ** aminoácidos (aa); ***N° de acceso GenBank

proteína: B. sensu stricto B. afzelii B. garinii

DbpA: *B31; **aa 2-192; ***AF069269 *PKo; **aa 2-150; ***AJ131967 *40; **aa 2-187; ***AF441832 *PBi; **aa 2-176; ***AJ841673

OspC: *B31; **aa 26-210; ***X73622 *PKo; **aa 2-212; ***X62162 *PEi; **aa 32-208; ***AJ749866

Cada proteína recombinante quimérica comprende al menos una región epitópica que corresponde al dominio extracelular de una secuencia DbpA de Borrelia burgdorferi sensu stricto o B. afzelii o B. garinii y al menos una región epitópica que corresponde al dominio extracelular de una secuencia OspC de Borrelia burgdorferi sensu stricto o B. afzelii o B. garinii.

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Las asociaciones de diferentes secuencias nucleotídicas que codifican para unas secuencias DbpA y/o OspC así como las modificaciones de secuencias nucleotídicas, tales como deleciones, adición de secuencia de unión o adición de secuencia linker se realizaron por ingeniería genética utilizando las técnicas de PCR bien conocidas por el experto en la materia y descritas por ejemplo en Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.

Las secuencias de ADN que codifican para las proteínas quiméricas de interés se han introducido en el vector de expresión pMR [2] entre el sitio de restricción BamHI en dirección 5' y el sitio EcoRI o HindIII en dirección 3'. Las construcciones plasmídicas y las proteínas correspondientes citadas en ejemplo (bLYM114, bLYM120 y bLYM121) se describen en la tabla 2. La presencia de MRGS en N-terminal de las proteínas recombinantes y la secuencia nucleotídica ATG AGG GGA TCC correspondiente se ha introducido mediante la técnica de clonación utilizada en el vector de expresión pMR. Sólo el codón de iniciación ATG y por lo tanto el aminoácido Met es realmente indispensable en esta secuencia.

Se introdujo una secuencia poli-histidina (6xHis) en el lado N-terminal de cada proteína recombinante. Esta secuencia permite la purificación de las proteínas recombinantes sobre columna de afinidad de metal-quelato. Es una región de fijación sobre el gel Ni-NTA que permite facilitar posteriormente la etapa de purificación de la proteína recombinante quimérica. Este péptido HHHHHH (SEC ID nº 22) está codificado por las secuencias nucleotídicas CATCATCATCATCATCAT (SEC ID nº 23) o CATCATCATCATCATCAC (SEC ID nº 24) o CATCATCACCACCATCAT (SEC ID nº 25) o por cualquier otra secuencia que codifica para la secuencia SEC ID nº

22. Esta región de fijación particular, que comprende una sucesión de histidina, permite en particular la fijación orientada de la proteína recombinante sobre un soporte constituido de sílice o de óxidos metálicos.

Tabla 2: construcciones plasmídicas y proteínas recombinantes

Características de las proteínas recombinantes: Características de las construcciones plasmídicas

Nombre: N-terminal Tag Secuencia B. burgdorferi Vector parental Sitio de inserción en el vector de la secuencia inserto

bLYM114 SEC ID nº 9: 6 x His B. afzelii strain PKo DbpA aa 2-150 + OspC aa 2-212 pMR78* 5'BamHI / 3'EcoRI

bLYM120 SEC ID nº 11: 6 x His B. sensu stricto strain B31 DbpA aa 28-192 + OspC aa 26-210 pMR78* 5'BamHI / 3'HindIII

bLYM121 SEC ID nº 14: 6 x His B. gariniï DbpA III aa 25187 strain 40 + DbpA IV aa 24-176 strain PBi + OspC aa 32-208 strain PEi pMR78* 5'BamHI / 3'HindIII

* [2]

Ejemplo 2: Expresión de las proteínas recombinantes bLYM114, bLYM120 y bLYM121 del ejemplo 1 y purificación.

Una construcción plasmídica que corresponde a una secuencia SEC ID nº 16, 18 ó 21 insertada en un vector de expresión (pMR) se utilizó para transformar una bacteria de E. coli (cepa BL21) según un protocolo clásico conocido por el experto en la materia. Las bacterias transformadas se seleccionaron gracias a su resistencia a la ampicilina llevada por el vector pMR.

Un clon de bacteria recombinante se seleccionó entonces para sembrar un pre-cultivo de 40 ml de medio 2xYT (triptona 16 g/l; extracto de levadura 10 g/l; NaCl 5 g/l, pH 7,0) que contiene 100 µg/ml de ampicilina. Después de 15 a 18 horas de incubación a 30°C bajo agitación a 250 rpm, este pre-cultivo se utilizó para sembrar 1 litro de medio 2xYT que contenía el 2% de glucosa y 100 µg/ml de ampicilina. Este cultivo se incubó a 30°C bajo agitación a 250 rpm hasta que la DO a 600 nm alcanzó 1,0/1,2. El cultivo se mantuvo durante 3 horas 30 minutos o 4 horas a 30°C añadiendo isopropil-β-D-tiogalactopiranosido (IPTG) 0,4 mM y se recogió por centrifugación a 6000 g durante 30 minutos. El residuo celular se almacenó a -60°C. Para la purificación, la biomasa húmeda se descongeló y se resuspendió en un tampón de lisis que contiene unos inhibidores de proteasas sin EDTA (Roche) y de benzonasa nucleasa (Novagen) y se sometió a una ruptura celular a 1,6 kBar en un destructor de células (Constant System Ltd, Daventry, REINO UNIDO). El lisado se centrifugó después a 10,000 rpm durante 45 minutos a 2-8°C. El sobrenadante obtenido contiene las proteínas solubles. Este sobrenadante se filtró sobre un filtro de 0,45 µ y se purificó por cromatografía de afinidad sobre una columna de quelación de metales (matrice nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA, Qiagen). Para ello, el sobrenadante se depositó (1 ml/min) a 18-25°C sobre una columna de 8 ml de gel Ni-NTA equilibrada en tampón A (véase la tabla 3). La columna se lavó después en tampón A, hasta obtener en salida

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de columna una DO280nm=0. La elución de la proteína recombinante se obtiene de un tampón B, según las indicaciones detalladas en la tabla 3, y la proteína purificada se dializó en casete de diálisis 10000 o 20000 MWCO (Slide-A-Lyser®, Pierce) contra un tampón de diálisis. Las condiciones de purificaciones sobre gel Ni-NTA son descritas en la tabla 3.

Tabla 3: purificación de las proteínas recombinantes

Proteína: bLYM114 bLYM120 bLYM121

SEC ID nº 14: SEC ID nº 11
SEC ID nº 14

Tampón de lisis y de lavado: Tampón A1

Tampón de elución: Tampón B2

Etapa de elución 1: 90% Tampón A + 10% Tampón B (4CV) 92% Tampón A + 8% Tampón B (4CV) 100 % Tampón B

Etapa de elución 2: 100 % Tampón B 100 % Tampón B NA

Rendimiento de purificación mg proteína/ g biomasa húmeda: 12 13 20

Rendimiento de purificación mg proteína /L de cultivo: 80 122 245

1fosfato sódico 50 mM, Imidazol 30 mM, NaCl 500 mM, Tween 20 0,1%, Glicerol 5 %, pH = 7,8

2fosfato sódico 50 mM, Imidazol 325 mM, NaCL 500 mM, Glicerol 5 %, pH = 7,5

Las muestras se analizaron sobre NuPAGE® Novex® 4-12% en un tampón NuPAGE® MES-SDS, según las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Las proteínas se colorearon con azul brillante de Coomasie o se transfirieron electroforéticamente sobre una membrana de nitrocelulosa. La membrana se bloqueó con leche en polvo al 5% (w/v) en PBS y se incubó con un anticuerpo anti-pentahistidina (Qiagen) en PBS que contiene Tween 20 al 0,05%. Se utilizó un conjugado IgG anti-ratón de cabra marcado con peroxidasa de rábano picante (Jackson Immunoresearch laboratories) en PBS/Tween como anticuerpo secundario.

La determinación de la concentración en proteínas se efectuó utilizando el kit Bradford (Pierce Coomassie Plus, Perbio Science) con la BSA como referencia proteica.

Ejemplo 3: detección de las IgG y de las IgM humanas con las proteínas recombinantes quiméricas mediante una técnica Immunotransferencia en línea

Cada proteína recombinante se depositó en una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF, Immobilon, Millipore, Bedford, Mass. USA) según el protocolo siguiente:

La concentración en proteína se ajusta a 1 mg/ml en PBS pH 7,2 y se diluye en PBS pH 7,2 adicionado de Tween 20 al 0,03% (dilución 1/200). La membrana PVDF se humidificó en metanol, se lavó en agua desmineralizada y se puso sobre un papel de transferencia húmedo. Una regla de plástico se sumergió en la dilución de proteínas y se fijó sobre la membrana PVDF. Después del depósito de las proteínas y del secado de las membranas, las membranas se cortaron verticalmente en bandas. Antes de usarlas, las bandas se incubaron con gelatina al 5% en TBS pH 7,5 durante 1 hora a 37ºC. Los protocolos de inmunotransferencia se realizaron a temperatura ambiente, tal como se describe por Bretz A.G. et al. [3]. Las bandas se incubaron durante 2 horas con unos sueros humanos diluidos al 1/200 en TBS con gelatina al 1%, se lavaron e incubaron con un anticuerpo anti-IgG o anti-IgM humanas marcado con fosfatasa alcalina (Sigma, St-Louis USA) diluidos al 1/1000 en TBS con gelatina al 1%. Después del lavado, las bandas se incubaron con el sustrato BCIP-NBT de la fosfatasa alcalina (KPL, Gaithersburg, MD, USA) durante 30 minutos, y después se lavaron en agua destilada y se secaron.

Panel de sueros ensayados

Los sueros humanos se recogieron a partir de pacientes de LB típicos bien definidos clínicamente, que correspondían a las diferentes fases de LB (22 con un eritema migratorio [EM], 5 con una carditis, 20 con una

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neuroborreliosis [NB], 20 con artritis de Lyme [LA], 20 con una acrodermatitis crónica atrófica [ACA] y 10 con linfocitoma de cutis benigno [LCB]. Se han encontrado unas IgG anti-Lyme mediante inmunotransferencia, descrita anteriormente y utilizando unos lisados de células enteras [4], en los sueros de pacientes con LA, ACA y carditis. EM, NB y LCB se identificaron clínicamente, pero no se encontraron todos los sueros correspondientes positivos por inmunotransferencia casera [4], ni por los kits disponibles comercialmente (VIDAS® Lyme (biomérieux), Borrelia IgG, (Diasorin®) y Borrelia IgM (r-biopharm®). Por el contrario, todos los casos de NB incluidos en el estudio tenían unos anticuerpos detectables en el líquido cefalorraquídeo [LCR] (índice que se extiende de 2 a 27,1 por VIDAS® Lyme (biomérieux). La presencia de IgM se buscó sólo en los casos clínicos de fase I y II y no en las fases crónicas.

El grupo de control negativo consistía en 31 sueros anteriormente encontrado como negativos para la presencia de anticuerpos anti-Lyme en los ensayos clásicos. Además, se enseyaron 64 sueros de donantes de sangre sanos residentes en una región endémica para Lyme (Monthley, Valais, Suiza) con la proteína recombinante.

La intensidad de la reacción se evaluó de la siguiente manera: [+], [++], [+++], [-] o resultados equívocos. Los resultados equívocos se consideraron como negativos.

Los resultados se presentan en la tabla 4.

Tabla 4: Reactividad en inmunotransferencia en línea de los sueros humanos de pacientes con borreliosis de Lyme con 3 proteínas recombinantes quiméricas bLYM114 (SEC ID nº 9), bLYM120 (SEC ID nº 11) y bLYM121 (SEC ID nº 14)

Proteína: IgG IgM

Fase I: Fase II Fase III Fase I Fase II

EM (n=22): NB (n=20) Carditis (n=5) LA (n=19) ACA (n=20) LCB (n=10) EM (n=22) NB (n=20) Carditis (n=5)

bLYM114: 5 10 0 7 12 2 7 7 2

bLYM120: 6 7 0 8 6 0 11 7 2

bLYM121: 2 10 5 9 8 0 7 7 2

∑ bLYM 114+120+121: 9 13 5 18 17 2 11 7 2

Sueros positivos (%) e intensidad de la reacción: 40,9% 1[+++] 4[++] 4[+] 59,1% 8[+++] 2[++] 3[+] 100% 4[+++] 1[+] 94,7% 7[+++] 8[++] 3[+] 85% 8[+++] 5[++] 4[+] 20% 1[++] 1[+] 50% 1[+++] 7[++] 5[+] 35% 5[++] 2[+] 40% 2[++]

Total de los positivos e intensidad de la reacción: 66,7% 28[+++] 20[++] 16[+] 42,5% 1[+++] 14[++] 7[+]

La especificidad es del 100% en base a 31 sueros procedentes de sujetos sanos determinados Lyme negativos por los ensayos comercializados estándares.

Detección de las IgG

Los resultados indican que las proteínas de fusión quiméricas recombinantes son unas herramientas de diagnóstico sensibles a todas las fases de la infección para las IgG y las IgM. Ponen en evidencia un efecto complementario de las tres proteínas recombinantes basadas respectivamente en secuencias de Borrelia afzelii, B. sensu stricto y B.garinii para la detección de las IgG. La utilización combinada de las tres proteínas recombinantes quiméricas permite en la fase I de la infección detectar unas IgG en 9 casos de los pacientes con un EM de 22 (es decir el 40,9% de sensibilidad).

Detección de las IgM

Unas IgM antiproteínas quiméricas se encontraron en 11 casos de 22 (es decir el 50% de sensibilidad). Por lo tanto, estas proteínas quiméricas detectan más frecuentemente las IgM que las IgG en los sueros de pacientes LB en las fases I. Los ensayos efectuados en los controles: immunotransferencia casera [4], y el kit comercializado Borrelia

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IgM (r-biopharm®) no detectan más los sueros IgM positivos. Además, 3 sueros encontrados negativos por el ensayo de imunotransferencia y Borrelia IgM (r-biopharm®) son detectados por las tres proteínas quiméricas citadas en el ejemplo (3/3) o por una de las tres proteínas citadas en el ejemplo (1/3). La utilización combinada de las tres proteínas recombinantes permite mejorar, en la fase I de la infección, un 13,6% la sensibilidad de detección de las

5 IgM.

Ejemplo 4: preparación de las construcciones plasmídicas que codifican para las proteínas recombinantes quiméricas VlsE.

Las secuencias de ADN que codifican las diferentes secuencias de la proteína son identificadas en la tabla 5.

Tabla 5: origen de las secuencias

Especies de B. burgdorferi *Isolat; **aminoácidos (aa); ***n° de acceso GenBank

proteína: B. sensu stricto B. afzelii B. garinii

VlsE: - - *PBi; **aa 20-293; ***AJ630106 (GenScript Corp)

IR6: *B31; **aa 274-305; ***U76405 (GeneArt GmbH) *ACA-1; **aa 172-188; ***U76405 (GeneArt GmbH) *Ip90; **aa 167-191; ***AAN87834 (GeneArt GmbH)

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Las secuencias se optimizaron para su expresión en E. coli utilizando GeneOptimizerTM y se sintetizaron respectivamente por GenScript corporation (Scotch Plains, NJ, USA) o GeneArt GmbH (Regensburg, Alemania).

Se realizaron unas modificaciones complementarias en el ADN, deleciones o asociaciones de diferentes secuencias mediante la PCR por ingeniería genética utilizando las técnicas de la PCR bien conocidas por el experto en la 15 materia y descritas por ejemplo en Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989. Las secuencias de ADN se enlazaron en el vector de expresion pMR [2] o pET-3d (Novagen®). Las construcciones plasmídicas y las proteínas correspondientes citadas en ejemplo (bLYM110, bLYM125) están descritas en la tabla 6.

Tabla 6: Construcciones plasmídicas y proteínas correspondientes

bLYM110 SEC ID nº 39: 6 x His vlsE garinii pBi aa 20293 + 3 IR6 [sensu pMR78 5'BamHI / 3'HindIII

bLYM125 SEC ID nº 41: 8 x His stricto B21 aa 274-305 + afzelii ACA-1aa 172-188 + garinii Ip90 aa 167191] pET-3d 5'NcoI / 3'BamHI

20 Ejemplo 5: Expresión de las proteínas recombinantes del ejemplo 4 y purificación.

Se utilizó una construcción plasmídica descrita en el ejemplo 4 para transformar una bacteria E. coli (cepa BL21) según un protocolo clásico conocido por el experto en la materia. Las bacterias transformadas se seleccionaron gracias a su resistencia a la ampicilina llevada por el vector pMR o pET.

Después se seleccionó un clon de bacteria recombinante entonces para sembrar un pre-cultivo de 40 ml de medio

25 2xYT (triptona 16 g/l; extracto de levadura 10 g/l; NaCl 5 g/l, pH 7,0) que contienía 100 µg/ml de ampicilina. Después de 15 a 18 horas de incubación a 30°C bajo agitación a 250 rpm, este pre-cultivo se utilizó para sembrar 1 litro de medio 2xYT que contenía 2% de glucosa y 100 µg/ml de ampicilina. Este cultivo se incubó a 30°C bajo agitación a 250 rpm hasta que la DO a 600 nm alcanzó 1,0/1,2. El cultivo se mantuvo durante 3 horas 30 minutos o 4 horas a 30°C añadiendo isopropil-β-D-tiogalactopiranosido (IPTG) 0,4 mM y se recogió por centrifugación a 6000 g durante

30 30 minutos. El residuo celular se almacenó a -60°C. Para la purificación, la biomasa húmeda se resuspendió en un tampón de lisis que contenía unos inhibidores de proteasas sin EDTA (Roche) y de benzonasa nucleasa (Novagen)

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y se sometió a una ruptura celular a 1,6 kBar en un destructor de células (Constant System Ltd, Daventry, REINO UNIDO). El lisado se centrifugó entonces a 10000 rpm durante 45 minutos a 2-8°C. Después de la filtración sobre un filtro de 0,22 m, el sobrenadante se cargó sobre una columna NiNTA (Quiagen®) equilibrada en tampón de lisis. La resina se lavó entonces con el mismo tampón hasta que el A280nm alcanzó la línea de base. Se efectuó una elución con el tampón de elución y la proteína purificada se dializó sobre un casete Pierce de diálisis Slide-A-Lyser® 10000 o 20000 MWCO contra un tampón de diálisis. Las condiciones de las purificaciones sobre gel Ni-NTA son descritas en la tabla 7.

Tabla 7: purificación de las proteínas recombinantes

Proteína: bLYM110 SEC ID nº 39 bLYM125 SEC ID nº 41

Tampón de lisis y de lavado: Tampón A 1 Tampón A 1+ Urea 2M

Tampón de elución: Tampón B 2 Tampón B 2 modificado con 600 mM de imidazol

Etapa de elución 1: 86% Tampón A + 14% Tampón B (4CV) 92% Tampón A + 8% Tampón B (4CV)

Etapa de elución 2: 100 % Tampón B 100 % Tampón B

Rendimiento de purificación mg proteína /g biomasa húmeda: 0,5 0,8

Rendimiento de purificación mg proteína /L de cultivo: 8,7 17

1fosfato sódico 50 mM, Imidazol 30 mM, NaCl 500 mM, Tween 20 0,1%, Glicerol 5%, pH = 7,8

2 fosfato sódico 50 mM, Imidazol 325 mM, NaCl 500 mM, Glicerol 5%, pH = 7,5

Las muestras se analizaron sobre NuPAGE® Novex® 4-12% en un tampón circulante NuPAGE® MES-SDS, según las instrucciones del fabricante (InvitrogenTM). Las proteínas se colorearon con azul brillante de Coomasie o se transfirieron electroforéticamente sobre una membrana de nitrocelulosa. La membrana se bloqueó con leche en polvo al 5% (w/v) en PBS y se incubó con un anticuerpo anti-pentahistidina (Qiagen®) en PBS que contiene Tween 20 al 0,05%. Se utilizó un conjugado IgG anti-ratón de cabra marcado con peroxidasa de rábano picante (Jackson Immunoresearch laboratories) en PBS/Tween como anticuerpo secundario.

La determinación de la concentración en proteínas se efectuó utilizando el kit de ensayo Bradford (Pierce Coomassie Plus, Perbio Science) con la BSA como referencia proteica.

Ejemplo 6: Detección de las IgG y de las IgM humanas con la proteína recombinante quimérica bLYM110 del ejemplo 5 mediante una técnica Inmonotransferencia en línea

La proteína recombinante se ha depositado sobre una membrana de difluorouro de polivinilideno (PVDF, Immobilon, Millipore®, Vedford, Mass. USA) según el protocolo siguiente:

Se ajustó la concentración en proteína a 1 mg/ml en PBS pH 7,2 y se diluyó en el PBS pH 7,2 adicionado de Tween 20 0,03% (dilución 1/200) La membrana PVDF se humidificó en metanol, se lavó en agua desmineralizada y se puso sobre un papel de transferencia húmedo. Una regla de plástico se sumergió en la dilución de proteínas y se fijó sobre la membrana PVDF. Después del depósito de las proteínas y del secado de las membranas, las membranas se cortaron verticalmente en bandas. Antes de la utilización, las bandas se incubaron con gelatina al 5% en TBS pH 7,5 durante 1 hora a 37ºC. Los protocolos de inmunotransferencia se realizaron a temperatura ambiente, tal como se describe por Bretz A.G. et al. [3]. Las bandas se incubaron durante 2 horas con unos sueros humanos diluidos al 1/200 en TBS con gelatina al 1%, se lavaron e incubaron con una IgG o IgM anti-humanas marcada con fosfatasa alcalina (SigmaTM, St-Louis USA) diluidas al 1/1000 en TBS con gelatina al 1%. Después del lavado, las bandas se incubaron con el sustrato BCIP-NBT (KPL, Gaithersburg, MD, USA) durante 30 minutos, y después se lavaron en agua destilada y se secaron.

Panel de sueros ensayados

Los sueros humanos se recogieron a partir de pacientes de LB típicos bien definidos clínicamente que corresponden a las fases de LB (22 con un eritema migratorio [EM], 5 con una carditis, 20 con una neuroborreliosis [NB], 20 con artritis de Lyme [LA], 20 con una acrodermatitis crónica atrófica [ACA] y 10 con un linfocitoma de cutis benigno [LCB]. Se encontraron unas IgG anti-Lyme por inmunotransferencia, descrita anteriormente y utilizando unos lisados de células enteras [4], en los sueros de pacientes con LA, ACA y carditis. Las EM, NB y LCB se identificaron

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clínicamente, pero no se encontraron todos los sueros correspondientes positivos por inmunotransferencia casera [4], ni por los kits disponibles comercialmente (VIDAS® Lyme (biomérieux), Borrelia IgG, (Diasorin®) y Borrelia IgM (rbiopharm®). Por el contrario, todos los casos de NB incluidos en el estudio tenían unos anticuerpos detectables en el líquido cefalorraquídeo [LCR] (índice que se extiende de 2 a 27,1).

El grupo de control negativo consistía en 31 sueros anteriormente encontrados como negativos para la presencia de anticuerpos anti-Lyme en los ensayos clásicos. Además, se ensayaron 64 sueros de donantes de sangre sanos residentes en una región endémica para Lyme (Monthley, Valais, Suiza) con la proteína recombinante. La intensidad de la reacción se evaluó de la siguiente manera: [+], [++], [+++], [-] o resultados equívocos. Los resultados equívocos se consideraron como negativos.

Los resultados son presentados en la tabla 8 siguiente

Tabla 8

IgG

Fase I: Fase II Fase III Donantes

EM (n=22): NB (n=20) Carditis (n=5) LA (n=19) ACA (n=20) Limf. (n=10) (n=64)

17: 20 5 19 20 9 6

77,3%: 100% 100% 100% 100% 90% 9,4%

12[+++]: 11[+++] 4[+++] 13[+++] 20[+++] 3[+++] 6[+]

4[++]: 7[++] 1[++] 4[++] 2[++]

1[+]: 2[+] 2[+] 4[+]

Total positivos IgG 93,7%

IgM

EM (n=22): NB (n=20) Carditis (n=5) (n=64)

5: 4 2 1

22%: 20% 40% 1,5%

1[++]: 2[++] 1[++] 1[+]

4[+]: 1[+] 1[+]

Total positivos IgM 23,4%

Detección de las IgG

Los resultados indican que la proteína recombinante bLYM110 es un antígeno de diagnóstico altamente sensible a todas las fases de la infección para las IgG. En la fase I de la infección, las IgG se detectaron en 17 de 22 casos de pacientes con un EM (es decir, el 77,3% de sensibilidad). Cinco de los pacientes con EM que se encontraron negativos con la proteína recombinante lo eran también con la inmunotransferencia casero y con los kits disponibles en el comercio. Siete sueros EM encontrados positivos con la proteína recombinante no se detectaron por inmunotransferencia, lo que representa una mejora del 31,8% de la sensibilidad con la proteína recombinante. En la fase primaria de la infección, en ausencia de enrojecimiento característico, el diagnóstico puede ser difícil, ya que las otras manifestaciones clínicas de la enfermedad de Lyme no son específicas. Además, sólo algunos pacientes que tienen un EM son detectados por los ensayos clásicos. Por lo tanto, la proteína de la invención mejora la detección de las IgG en la fase I de la infección, llevando su detección a más del 77% en los pacientes que presentan un EM.

Detección de las IgM

Se encontraron unas IgM anti-proteína quimérica en el 23,4% de los sueros de LB. La proteína detecta más frecuentemente las IgG que las IgM en los sueros de pacientes de LB en las fases I y II.

Ejemplo 7: Evaluación y validación de las proteínas recombinantes quiméricas bLYM114, bLYM120, bLYM121 y bLYM125 en un ensayo VIDAS® (bioMérieux)

Esta validación se realiza en ensayo VIDAS® mediante la utilización:

1) de las proteínas quiméricas recombinantes bLYM114, bLYM120, bLYM121, obtenidas según los ejemplos 1, 2 para la detección de las IgM, y

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2) unas proteínas quiméricas recombinantes bLYM114, bLYM120, obtenidas según los ejemplos 1, 2, y de la proteína quimérica bLYM125, obtenida según los ejemplos 4, 5, para la detección de las IgG.

El principio del ensayo VIDAS® es el siguiente: un cono constituye el soporte sólido que sirve también de sistema de pipeteo para los reactivos presentes en el pasador. La o las proteínas recombinantes se fijan sobre el cono. Después de una etapa de dilución, la muestra se aspira y se descarga varias veces en el interior del cono. Esto permite a las inmunoglobulinas anti-Lyme de la muestra unirse a las proteínas recombinantes. Los componentes no se han unido se eliminan por lavado. Un anticuerpo anti-inmunoglobulinas humanas conjugado con la fosfatasa alcalina (PAL) se incuba en el cono, en el que se fija a las inmunoglobulinas anti-Lyme. Las etapas de lavado eliminan el conjugado no fijado. Durante la última etapa de revelación, el sustrato de la fosfatasa alcalina (PAL), el 4metil-umbeliferilfosfato, se hidroliza en 4-metil-umberliferona cuya fluorescencia emitida a 450 nm se mide. La intensidad de la fluorescencia se mide por el sistema óptico de Vidas® y es proporcional a la presencia de inmunoglobulinas anti-Lyme presentes en la muestra. Los resultados son analizados automáticamente por el VIDAS® y se expresan en RFV (Relative Fluorescent Value).

Se ensayaron así 255 sueros positivos (sueros equívocos + sueros positivos) y 298 sueros negativos (equívocos + negativos) con el sistema Vidas®.

Los conos Vidas® Lyme IgG son sensibilizados por 300 l de solución que comprende las proteínas bLYM114, bLYM120 y bLYM125 de la invención a una concentración de 1 g/ml cada una en una solución de sensibilización común.

En la primera etapa, los sueros se incuban durante 5,3 minutos para la formación de los complejos antígenosanticuerpos. En la segunda etapa, unas anti-IgG humanas marcadas con PAL se incuban durante 5,3 minutos.

Los resultados son dados en índice en relación a un umbral de positividad situado a 135 RFV en el protocolo.

-entre los 255 sueros positivos ensayados, 246 son positivos y 9 son falsos negativos, lo que corresponde a una sensibilidad del 96,5%.

-entre los 298 sueros negativos ensayados, 284 son negativos y 14 son falsos positivos, lo que corresponde a una especificidad del 95,3%.

Referencias bibliográficas

1.: Göttner G. et al., Int. J. Microbiol. 293, Supl. 37, 172-173 (2004)

2.: Arnaud N. et al., Gene 1997; 199:149-156.

3.: Bretz A.G., K. Ryffel, P. Hutter, E. Dayer y O. Péter. Specificities and sensitivities of four monoclonal antibodies for typing of Borrelia burgdorferi sensu lato isolates. Clin. Diag. Lab. Immunol. 2001; 8: 376-384.

4.: Ryffel K., Péter O., Rutti B. and E. Dayer. Scored antibody reactivity by immunoblot suggests organotropism of Borrelia burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. afzelii and B. valaisiana in human.J. Clin. Microbiol. 1999; 37:4086-92

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> bioMérieux

<120> Proteínas utilizadas para el diagnóstico de una borreliosis de Lyme

<130> Lyme DbpA-OspC PCT

<160> 43

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 149

<212> PRT

<213> Borrelia sp.

<400> 1

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<210> 2

<211> 211

<212> PRT

<213> Borrelia sp.

<400> 2

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<210> 3

<211> 164

<212> PRT

<213> Borrelia sp.

<400> 3

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<210> 4

<211> 185

<212> PRT

<213> Borrelia sp.

<400> 4

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<210> 5

<211> 162

<212> PRT

<213> Borrelia sp.

<400> 5

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<210> 6

<211> 154

<212> PRT

<213> Borrelia sp.

<400> 6

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<210> 7

<211> 176

<212> PRT

E10763756

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<213> Borrelia sp.

<400> 7

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<210> 8

<211> 361

<212> PRT

<213> Borrelia sp.

<400> 8

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Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

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REIVINDICACIONES

1. Proteína quimérica de fusión DbpA-OspC de Borrelia, seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

una proteína cuya secuencia en aminoácidos comprende en su extremo N-terminal, la secuencia SEC ID nº 1 y en su extremo C-terminal, la secuencia SEC ID nº 2 o una variante de dicha proteína cuya secuencia en aminoácidos comprende una secuencia que presenta al menos el 40% de identidad con la SEC ID nº 1 y una secuencia que presenta al menos el 50% de identidad con la SEC ID nº 2, con la condición de que dicha variante sea capaz de formar un complejo inmunológico con unos anticuerpos producidos tras una infección por Borrelia o que dicha variante sea capaz de inducir a la producción de anticuerpos anti-Borrelia;

(b)

una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende en su extremo N-terminal la secuencia SEC ID nº 3 y en su extremo C-terminal la secuencia SEC ID nº 4 o una variante de dicha proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende una secuencia que presenta al menos el 40% de identidad con la SEC ID nº 3 y una secuencia que presenta al menos el 50% de identidad con la SEC ID nº 4, con la condición de que dicha variante sea capaz de formar un complejo inmunológico con unos anticuerpos producidos tras una infección por Borrelia o que dicha variante sea capaz de inducir a la producción de anticuerpos anti-Borrelia;

(c)

una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende en su extremo N-terminal la secuencia SEC ID nº 5 y en su extremo C-terminal la secuencia SEC ID nº 7 o una variante de dicha proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende una secuencia que presenta al menos el 40% de identidad con la SEC ID nº 5 y una secuencia que presenta al menos el 50% de identidad con la SEC ID nº 7, con la condición de que dicha variante sea capaz de formar un complejo inmunológico con unos anticuerpos producidos tras una infección por Borrelia o que dicha variante sea capaz de inducir a la producción de anticuerpos anti-Borrelia;

(d)

una proteína que comprende en su extremo N-terminal la secuencia SEC ID nº 6 y en su extremo C-terminal la secuencia SEC ID nº 7 o una variante de dicha proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende una secuencia que presenta al menos el 40% de identidad con la SEC ID nº 6 y una secuencia que presenta al menos el 50% de identidad con la SEC ID nº 7, con la condición de que dicha variante sea capaz de formar un complejo inmunológico con unos anticuerpos producidos tras una infección por Borrelia o que dicha variante sea capaz de inducir a la producción de anticuerpos anti-borrelia;

(e)

una proteína que comprende en su extremo N-terminal la secuencia SEC ID nº 5, la secuencia SEC ID nº 6 y en su extremo C-terminal la secuencia SEC ID nº 7 o una variante de dicha proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende una secuencia que presenta al menos el 40% de identidad con la SEC ID nº 5, una secuencia que presenta al menos el 40% de identidad con la SEC ID nº 6 y una secuencia que presenta al menos el 50% de identidad con la SEC ID nº 7, con la condición de que dicha variante sea capaz de formar un complejo inmunológico con unos anticuerpos producidos tras una infección por Borrelia o que dicha variante sea capaz de inducir a la producción de anticuerpos anti-Borrelia;

(f)

una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende una secuencia seleccionada entre las SEC ID nºs 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14.
2.

Ácido nucleico que codifica para una proteína tal como se ha definido en la reivindicación 1.
3.

Casete de expresión que es funcional en una célula derivada de un organismo procariota o eucariota, que permite la expresión de un ácido nucleico tal como se ha definido en la reivindicación 2, colocada bajo el control de los elementos necesarios para su expresión.
4.

Vector que comprende un casete de expresión, tal como se define en la reivindicación 3.
5.

Procedimiento para el diagnóstico in vitro de una Borreliosis de Lyme en una muestra biológica, según el cual se pone en contacto la muestra biológica con al menos una proteína tal como se define en la reivindicación 1, y se determina si hay formación de un complejo inmunológico entre dicha proteína y unos anticuerpos de la muestra biológica.
6.

Procedimiento según la reivindicación 5, en el que los anticuerpos de la muestra biológica son unas IgG y/o unas IgM.
7.

Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la formación del complejo inmunológico se determina por adición de al menos una anti-inmunoglobulina humana marcada por cualquier marcador apropiado.
8.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que la proteína está inmovilizada sobre un soporte sólido.
9.

Equipo para el diagnóstico in vitro de una Borreliosis de Lyme que comprende al menos una proteína tal como se define en la reivindicación 1.
10.

Equipo según la reivindicación 9, que comprende al menos una anti-inmunoglobulina humana marcada por

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cualquier marcador apropiado.
11. Composición vaccínea que comprende al menos una proteína tal como se ha definido en la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

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