ITTO950545A1 - Vaccino/composizioni terapautica di helycobacter pylori, loro preparazione ed impiego. - Google Patents

Description

Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo:

"Metodo per la diagnosi di infezioni da Helvcobacter nylori e relativo corredo diagnostico"

PROTEINA TIPO ANIDRASI-CARBONICA DI HELYCOBACTER PYLORI La presente invenzione si riferisce alla proteina tipo anidrasi carbonica (CAL) di Helycobacter nylori (H. pylori) e, in particolare, all'impiego di tale proteina nella diagnosi di infezione da H. pylori.

H. oylori (precedentemente Camnylobacter pyloridis o C. oyloridis) è un patogeno gastrico umano Gram negativo spiraliforme . H. pylori è ben documentato nella sua associazione con l'ulcera gastrica e duodenale, così come con il tumore gastrico. Il microrganismo è stato descritto come l'agente infettivo cronico più comune dell'uomo. Malgrado la sua diffusione, non è nota la gran parte del meccanismo patogeno che riguarda H . nylori nella patologia gastroduodenale .

L'azione di autoanticorpi diretti contro specifici tessuti bersaglio è nota per avere ramificazioni eziologiche in malattie autoimuuni organo-specifiche . esempi noti includono: il recettore di acetilcolina nella miastenia grave; antigeni streptococcali nella malattia cardiaca reumatica; glutammato-decarbossilasi nel diabete mellito insulina-dipendente (IDDM); malattia di Lyme; e sindrome di Goodpasture .

La produzione di anticorpi a reazione incrociata con autoantigeni gastrici è stata proposta come meccanismo patologico che collega H. pylori e la gastrite (Negrini et al, Gastroenterolocrv. 1991, 101.-437-445), sebbene a tutt'oggi tali autoantigeni gastrici non siano stati identificati. Peraltro, è stato anche suggerito il contrario, dal momento che la gastrite associata a H. pylori è rara nei pazienti con AIDS, forse come risultato della immunodeficienza (Marano et al. Am. J. Gastroenterol., 1993, 8B, 887-890).

L'anidrasi carbonica (CA) è un metalloenzima gastrico ubiquitario che ha tre isoforme nel tessuto umano, CAI e CAII che sono presenti nella maggior parte dei tessuti, incluso lo stomaco e CAIII che è presente solo nei muscoli scheletrici. Le strutture terziarie di tutte e tre le CA e le sequenze amminoacidiche coinvolte nel legame con zinco sono conservate. L'anidrasi carbonica è stata anche implicata nella formazione e secrezione di succhi gastrici e pancreatici.

Abbiamo ora sorprendentemente trovato che H. nylori possiede proteine tipo anidrasi carbonica. Abbiamo mostrato che pazienti con elevati titoli anticorpali contro H. oylori hanno mostrato una risposta anticorpale contro anidrasi carbonica (CA).

La tecnica precedente nella diagnosi di patologia gastrica associata ad H. pylori include sonde di DNA di Campylobacter in grado di ibridarsi con rRNA di H. oylori (EP-A-0350205); oligonucleotidi di H. pylori specifici per sequenze del gene ureasi di H. pylori (WO 91/09049); rilevamento e diagnosi sierologica di infezione da H. oylori mediante sieroimmunosaggi ; e rilevamento di antigeni e frammenti antigenici di H. pylori (WO 89/08843; WO 89/9497 e EP-A-0329570) .

Sarebbe, tuttavia, altamente desiderabile avere mezzi affidabili e rapidi per diagnosticare l'infezione da H, pylori da un campione clinico di un paziente, come mezzi per la diagnosi precoce di ulcera gastrica o peptica o di tumore gastrico.

Analogamente, la presente invenzione fornisce un procedimento per la diagnosi di infezione da H. oylori rilevando la presenza di anticorpi contro la proteina anidrasi carbonica o un suo frammento, comprendente il contatto di un campione da saggiare con la proteina anidrasi carbonica o un suo frammento e rilevando la presenza del complesso antigene anticorpo.

La presente invenzione fornisce inoltre un procedimento per la diagnosi di infezione da H. pylori rilevando la presenza di anticorpi contro la anidrasi carbonica o un suo frammento, comprendente il porre a contatto un campione da saggiare con la proteina anidrasi carbonica o un suo frammento, quindi ponendo inoltre a contatto il campione che ha reagito con la proteina anidrasi carbonica o un suo frammento con un secondo anticorpo anti-umano e rilevando sia la presenza di complesso antigene-anticorpo secondario sia rilevando 1'anticorpo secondario legato mediante reazione con un terzo anticorpo marcato.

Verrà compreso che il termine "proteina anidrasi carbonica" si riferisce alla proteina anidrasi carbonica o alla proteina tipo anidrasi carbonica. Il termine "frammento" verrà compreso includere una qualsiasi anidrasi carbonica o proteina anidrasi carbonica che sia in grado di sviluppare una risposta immunitaria nell'ospite.

Il rilevamento del complesso antigene-anticorpo può avvenire con un qualsiasi procedimento noto nella tecnica. Tali procedimenti includono l'identificazione con un marcatore attaccato alla proteina anidrasi carbonica o suo frammento oppure mediante immunoprecipitazione. Marcatori possono includere marcatori radioattivi, fluorescenti, chemiluminescenti, molecole coloranti o marcatori enzimatici. Il rilevamento del complesso antigene-anticorpo può includere un sistema di amplificazione quale quelli che utilizzano biotina o avidina.

Il secondo anticorpo anti-umano può essere una miscela di anticorpi di coniglio anti-uomo oppure lina miscela di anticorpi di capra anti-uomo. Alternativamente, l'anticerpo secondario anti-uomo può essere anti-IgA umana, anti-IgG umana, oppure anti IgM umana.

Il terzo anticorpo che può essere utilizzato per rilevare 1'anticorpo secondario legato è selezionato in modo da reagire con 1'anticorpo secondario. Ad esempio, se 1'anticorpo secondario è un anticorpo di coniglio anti-uomo, il terzo anticorpo può essere un anticorpo di cavallo anticoniglio o un anticorpo di capra anti-coniglio.

Il campione da saggiare può comprendere mucosa gastrica, placca dentaria, saliva, succo gastrico, un campione di biopsia gastrica o feci. Preferibilmente la proteina anidrasi carbonica o un suo frammento è anidrasi carbonica di H. pylori. sebbene possa essere CAI o CAII umana, o altre proteine anidrasi carboniche o loro frammenti.

La presente invenzione fornisce inoltre un corredo per la diagnosi dell'infezione da H. oylori mediante il rilevamento di anticorpi contro l'anidrasi carbonica, comprendente la proteina anidrasi carbonica o un suo frammento. Corredi secondo la presente invenzione possono includere reagenti appropriatamente marcati e sostanze addizionali, quali soluzioni tampone, altre proteine di IL.

pylori, quali ureasi, citossine di H. oylori e flagelli, mezzi per rilevare i risultati del procedimento diagnostico e istruzioni per il saggio. I componenti del corredo possono essere confezionati in un contenitore di corredo appropriato.

La presente invenzione verrà ora descritta in maggiore dettaglio con riferimento ai seguenti esempi.

Esempio l

Crescita di un ceppo di H. oylori e estrazione di proteine .

Il ceppo di H. pylori NCTC 11683 è stato fatto crescere in coltura liquida aggiungendo una piastra di coltura raccolta a 100 mi di brodo per Brucella (Difco) contenente 2% beta-ciclodestrina (Sigma) e 0.2 mi di supplemento selettivo per H. oylori ricostituito (Oxoid) in una beuta conica da 500 mi. La beuta è stata incubata con debole agitazione (100 r.p.m.) per tre giorni in condizioni microaerofile (Campypak, BBL) a 37 C. Le cellule di H. pylori sono state raccolte mediante centrifugazione e le proteine del supernatante precipitate come precedentemente descritto da Milton D.L., Norqvist A. e Wolf Watz H., (1992), J. Bacteriol.. 174:7235-7244. Le proteine cellulari sono state estratte risospendendo due piastre di crescita in 1.5 mi di tampone per estrazione di proteine (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM MgCl2, 0.15 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 2 mg/ml pepstatina A (Sigma) 0.5 mg/ml leupeptina (Sigma), aggiungendo 200 ugml di 10% SDS e bollendo per 5 minuti. La sospensione è stata quindi raffreddata in ghiaccio per 5 minuti e il supem atante raccolto mediante centrifugazione a 12500 r.p.m. per 5 minuti. La concentrazione di proteine è stata determinata secondo Bradford, M:, (1976), Anal. Biochem.. 72:248-252 (1976).

Identificazione di proteine tipo anidrasi carbonica in estratti proteici di H. pylori.

40 ug di estratti proteici solubili totali (HpT) e extracellulari (HpE) di H. pylori sono stati analizzati su minigel verticali (Hoefer Scientific), comprendenti un gel di impaccamento al 5% di acrilammide e un gel di risoluzione al 13%, secondo il procedimento di Laemli U.K., 1970, Nature.

227, 680-685.

L'elettroforesi è stata effettuata a 20 mA. Le proteine sono state trasferite su una membrana di nitrocellulosa mediante trasferimento semi-secco, utilizzando tampone di trasferimento (48 mM Tris, pH 8, 39 mM glieina, 20% metanolo, 1.3 mM SDS) ed una unità di trasferimento ATTO AE-6675 Horizoblot (Genetic Research International), secondo le istruzioni del produttore. La membrana di nitrocellulosa è. stata quindi seccata e posta in soluzione bloccante (1% sieroalbumina bovina, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20) per 1 ora a temperatura ambiente con agitazione costante. L'anticorpo primario (sia anti-CAI umana di coniglio che anti-CAII umana di coniglio preparati come sotto descritto) è stato aggiunto al tampone di bloccaggio a una concentrazione di 1:1000 e l'incubazione è stata proseguita per 1 ora. La membrana è stata quindi brevemente lavata due volte con tampone di lavaggio, una volta per 15 minuti e una volta per 5 minuti con agitazione. L'anticorpo marcato con HRP (anti-coniglio di capra) è stato aggiunto alla membrana ad una concentrazione di 1:1000 in tampone di lavaggio e incubato per un'ora come sopra. La membrana è stata quindi lavata una volta per 15 minuti e quattro volte per 5 minuti con tampone di lavaggio come sopra. La membrana è stata quindi sviluppata utilizzando i reagenti per substrato ECL (Amersham) ed esposta a una pellicola per raggi X Fuji, secondo le istruzioni del produttore. La reibridazione delle membrane è stata effettuata dopo il distacco degli anticorpi legati alle proteine trasferite, incubandola in 20 mM glieina pH 2.5, 0.055% Tween 20, durante la notte a temperatura ambiente con agitazione costante.

Il risultato dei Western blot delle due separazioni in SDS-PAGE di proteine totali (HpT) ed extracellulari (HpE) di H. pylori è mostrato nella Fig. 1. La anidrasi carbonica bovina è stata chiaramente rilevabile nella traccia del marcatore di peso molecolare (MWM).

Gli estratti di proteine totali (Hpt) di H. nylori contengono tre proteine principali che reagivano con entrambi gli anticorpi anti-CAI e anti-CAII. Il peso molecolare relativo di queste proteine CAL di H. oylori era di 57 (la principale) , 42 e 34 kDa (indicate con una freccia con i pesi molecolari in Figura 1). Solo la proteina da 57 era la principale negli estratti proteici extracellulari di H. pylori (HpE). Le proteine cellulari totali di H, pylori sono state frazionate su una colonna di affinità di Sefarosio AH coniugato con beta-amminometilbenzene solfonammide idrogeno cloruro. Quando sottoposte a analisi in SDS-PAGE e Western blot, solo le frazioni con potassio tiocianato ed urea reagivano con gli anticorpi anti-CAI (non mostrato) , indicando che queste proteine si legavano fortemente alla solfonammide con un sito attivo per CA.

Non è stato mostrato che le proteine CAL di H. pylori siano essenziali per la crescita, dal momento che nove collezioni colturali e sette isolati clinici erano resistenti a tre inibitori solfonammidici di CA, così come alla solfanilammide antimicrobica (MIC >64 mg/1).

Preparazioni di anticorpi primari di coniglio anti-CAI umana e di coniglio anti-CAII umana.

500 mi di globuli rossi umani sono stati estratti con cloroformio a 4 C e separati mediante centrifugazione. I globuli rossi sono stati quindi purificati su una colonna di affinità di Sefarosio AH coniugata con beta-amminometil benzen solfonammide idrogeno cloruro. La frazione in ioduro di potassio conteneva la proteina CAI e la frazione in azide conteneva la proteina CAII. Le frazioni sono state dializzate contro 10 mM Tris, pH 8.3 e purificate su una colonna per FPLC MonoQ (Pharmacia) secondo le istruzioni del produttore. La proteina CAI è stata eluita dalla frazione in ioduro di potassio con 0.1M NaCl e la proteina CAII è stata eluita dalla frazione con azide con 0.1M NaCl. Gli estratti sono stati liofilizzati e il contenuto di proteina è stato valutato con il reagente analitico per proteine BCA di Pierce secondo le istruzioni del produttore (Pierce (UK), Ltd.).

Sono state preparate preparazioni comprendenti 300 ug delle proteine CAI o CAII sciolte in 1.5 mi di acqua e in 1.5 mi di adiuvante completo di Freund e 1 mi è stato iniettato per via sottocutanea in conigli. Dopo un mese i conigli sono stati iniettati per via intramuscolare con 300 ug di proteina CAI o CAII assorbita su alum e il procedimento è stato ripetuto dopo 6 mesi.

I conigli sono stati quindi salassati e gli anticorpi recuperati secondo procedimenti ordinari noti nella tecnica.

Esempio 2

Correlazione di proteine CAL in estratti proteici di H. oylori con siero di pazienti infetti.

Per correlare le proteine CAL di H. pylori con le proteine anticorpali in pazienti infetti da questo microrganismo, le separazioni di proteine dell'Esempio 1 sono state deibridate durante la notte a temperatura ambiente e reibridate con i sieri riuniti da sette pazienti (assorbiti con Escherichia coli), siero-positivi o siero-negativi (in ELISA) per H. oylori (come mostrato in Fig. 2). I sieri da pazienti infettati con H, pylori (rilevati con un anticorpo coniugato con HRP anti-Ig umana alla diluizione 1:1000) hanno fortemente identificato le proteine di 57 e 34 kDa, rispettivamente CAL e HAP, tra altre di H. oylori. così come il marcatore di peso molecolare anidrasi carbonica (30 kDa). Sieri da pazienti siero-negativi non hanno reagito con il marcatore CA o altre proteine nelle corsie di H. pylori (non mostrato) . Ciò suggerisce che pazienti infetti da H, oylori producano una risposta anticorpale significativa a entrambi i metalloenzimi di H. pylori (CAL e HAP) e poiché CAL è un enzima gastrico nativo predominante, ciò risulterebbe in una infiammazione gastroduodenale mediata da anticorpi.

Esempio 3

Bloccaggio dì anticorpi di coniglio anti CAI da parte di siero di pazienti infetti da H. oylori.

Per confermare che gli epitopi CA erano simili negli anticorpi policlonali di coniglio ed umani, un Western blot di proteine totali di H. oylori come descritto nell'Esempio 2 è stato dapprima bloccato con sieri di pazienti con elevato o basso titolo anticorpale contro H. oylori.

Tre separazioni identiche di proteine cellulari di H. pylori (HpT) sono state pre-bloccate sia con sieri da pazienti con elevato o basso titolo anticorpale contro H. pylori in soluzioni di bloccaggio (diluizione 1:250), o in soluzione di bloccaggio da sola. Il marcatore di peso molecolare CA (MWM) è servito come controllo positivo.

Dopo lavaggio nella maniera descritta per 1’anticorpo CAI nell'esempio 1, la separazione è stata quindi ibridata e rilevata utilizzando l’anti-CAI di coniglio come nella Figura 1 (eccetto che i sieri sono stati preadsorbiti con E. coli e con normal siero umano). La Figura 4 mostra una riduzione di segnale generale nella corsia bloccata con siero da pazienti infetti rispetto a quella di controllo (senza bloccaggio) o con sieri da pazienti con bassi titoli anticorpali contro H. pylori . In particolare, il segnale dalla proteina predominante di 57 kDa CAL di H . pylori (freccia) è ridotto in modo significativo nella traccia siero-positiva, ma non nel controllo o nelle tracce siero-negative. Ciò conferma che pazienti infetti da H. pylori producono anticorpi contro gli stessi epitopi dell1anticorpo policlonale di coniglio anti-CAI umana.

Claims (9)

1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la diagnosi di infezione da H, pylori rilevando la presenza di anticorpi contro la proteina anidrasi carbonica o suo frammento comprendente il contatto di un campione da saggiare con la proteina anidrasi carbonica o suo frammento e rilevando la presenza di complesso antigene-anticorpo .
2. 2. Procedimento per la diagnosi di infezione di H. pylori rilevando la presenza di anticorpi contro anidrasi carbonica o suo frammento, comprendente il contatto di un campione da saggiare con proteina anidrasi carbonica o suo frammento e quindi ponendo ulteriormente a contatto il campione che ha reagito con la proteina anidrasi carbonica o suo frammento con un secondo anticorpo anti-umano e rilevando sia la presenza di complesso antigene-anticorpo secondario, sia rilevando 1'anticorpo secondario legato mediante reazione con un terzo anticorpo.
3. 3. Procedimento come rivendicato nella Rivendicazione 2, in cui l'anticorpo secondario anti-umano è marcato.
4. 4. Procedimento come rivendicato nella Rivendicazione 2 o nella Rivendicazione 3 in cui l'anticorpo secondario è una miscela di anticorpi di coniglio anti-umani.
5. 5. Procedimento come rivendicato nella Rivendicazione 2 o nella Rivendicazione 3 in cui l'anticorpo secondario antiumano è anti-IgA umana, anti-IgG umana, o anti-IgM umana.
6. 6. Procedimento come rivendicato in una qualsiasi della Rivendicazioni da 1 a 5, in cui il campione da saggiare comprende mucosa gastrica, placca dentaria, saliva, succo gastrico, campione di biopsia gastrica o feci.
7. 7. Processo come rivendicato in una qualsiasi della Rivendicazioni da 1 a 6, in cui la proteina anidrasi carbonica o un suo frammento è derivata da H. nylori.
8. 8. Corredo per la diagnosi di infezione da H. pylori, comprendente la proteina anidrasi carbonica o un suo frammento.
9. 9. Corredo come rivendicato nella Rivendicazione 8, comprendente ulteriormente metodi per rilevare un complesso antigene-anticorpo.