ES2502940T3

ES2502940T3 - Composición farmacéutica para el tratamiento y la prevención del cáncer

Info

Publication number: ES2502940T3
Application number: ES09805009.9T
Authority: ES
Inventors: Fumiyoshi Okano; Takayoshi Ido; Takanori Saito; Shinichi Kobayashi
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2008-08-05
Filing date: 2009-08-05
Publication date: 2014-10-06
Anticipated expiration: 2029-08-05
Also published as: US20210188998A1; WO2010016526A1; EP2322221A1; AU2009278386A1; RU2011108260A; JP2015034173A; EP2322221A4; DK2322221T3; PL2322221T3; JPWO2010016526A1; US9982059B2; RU2498819C2; KR20110039475A; CN102170907A; KR101667319B1; EP2322221B1; CA2733223C; JP5691172B2; AU2009278386B2; US20110256144A1

Abstract

Un anticuerpo o un fragmento del mismo para su uso en un método para el tratamiento y/o la prevención del cáncer, teniendo el anticuerpo o el fragmento una reactividad con una proteína CAPRINA-1 que tiene una secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEC ID Nº 2 to 30 pares.

Description

Composición farmacéutica para el tratamiento y la prevención del cáncer

5 Campo de la técnica

La presente invención se refiere a un nuevo uso médico que los anticuerpos contra la CAPRINA-1 o fragmentos de la misma, por ejemplo, como agentes terapéuticos y/o preventivos para el cáncer.

Antecedentes de la invención

El cáncer es la causa más destacada de muerte. El tratamiento que se lleva a cabo actualmente para el cáncer es principalmente la terapia quirúrgica, que se puede combinar con radioterapia o quimioterapia. A pesar del desarrollo de nuevos métodos quirúrgicos y el descubrimiento de nuevos agentes anti-cáncer en los últimos años, los

15 resultados del tratamiento de cánceres no se han mejorado mucho hasta ahora excepto para algunos cánceres. Aunque recientes progresos en biología molecular e inmunología del cáncer, han identificado, anticuerpos que son reactivos específicamente con los cánceres, antígenos que son reconocidos por células T citotóxicas, así como los genes que codifican antígenos del cáncer, y han aumentado las expectativas de inmunoterapias dirigidas contra antígenos del cáncer (Tsuyoshi AKIYOSHI, "Gan To Kagaku-Ryoho (Cancer and Chemotherapy)," 1997, vol. 24, pp. 551-519 (Jp) (Cancer and Chemotherapy Publishers, Inc., Japón)).

En los métodos de tratamiento del cáncer, con el fin de reducir los efectos secundarios, es deseable que los péptidos, polipéptidos, o proteínas que se reconocen como antígenos del cáncer estén ausentes en casi todas las células normales y que estén presentes específicamente en las células cancerosas. En 1991, Boon y col del Instituto 25 Ludwig en Bélgica aislaron el antígeno MAGE 1 del melanoma humano que era reconocido por células T CD8 positivas por el método de clonación de expresión de ADNc utilizando una línea celular de cáncer autóloga y células reactivas contra el cáncer (Bruggen P. y col., Science, 254:1643-1647 (1991)). De esta manera, se informó del método SEREX (identificación serológica de antígenos por clonación de expresión recombinante), en el que se podían identificar los antígenos tumorales reconocidos por anticuerpos producidos por medio de una respuesta a un cáncer autólogo en el cuerpo de un paciente con cáncer, utilizando una técnica de clonación de expresión genética (Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU, 92:11810-11813 (1995); y Patente de EE. UU. Nº 5.698.396). Por el método SEREX, se aislaron algunos antígenos del cáncer, que no se expresan sustancialmente en células normales pero que se expresan específicamente en las células cancerosas (Int. J. Cancer, 72: 965-971 (1997); Cancer Res., 58: 10341041 (1998); Int. J. Cancer, 29: 652-658 (1998); Int. J. Oncol., 14: 703-708 (1999); Cancer Res., 56: 4766-4772

35 (1996); y Hum. Mol. Genet 6: 33-39, 1997). Además, se llevaron a cabo ensayos clínicos de terapias celulares utilizando inmunocitos que reaccionan específicamente con antígenos del cáncer, que son algunos de los antígenos aislados del cáncer, e inmunoterapias específicas del cáncer que utilizan vacunas que comprenden antígenos del cáncer o similares.

Al mismo tiempo, en años recientes, han aparecido varias medicinas con anticuerpos para el cáncer que se dirigen a antígenos proteicos sobre las células cancerosas. Tales medicinas que se usan como agentes terapéuticos específicos del cáncer muestran una eficacia farmacológica hasta cierto punto, y por tanto han llamado la atención. Sin embargo, la mayoría de las antígenos proteicos diana también se expresan en células normales. Por lo que el resultado de la administración de anticuerpos es que pueden dañarse no solo las células cancerosas, sino también

45 las células normales, en las que se expresa un antígeno diana, con lo que se produce un efecto secundario (o adverso), lo que llega a ser problemático. Además, se espera que si es posible identificar antígenos del cáncer que se expresan específicamente en la superficie de una célula cancerosa para usar anticuerpos que se dirijan a tales antígenos como medicamentes, entonces se podría realizar el tratamiento con medicinas con anticuerpos que produzcan pocos efectos secundarios.

La proteína citoplasmática y asociada a la proliferación 1 (CAPRINA-1) es una proteína intracelular que se expresa cuando células normales que están en fase de reposo se activan para experimentar la división celular. La CAPRINA1 también se conoce por estar implicada en la regulación del transporte y traducción de ARNm por medio de la formación de gránulos de estrés citoplasmático con ARN en una célula. La CAPRINA-1 tiene diferentes nombres, 55 tales como proteína 1 de membrana anclada a GPI y proteína 1 marcador de superficie de un componente de membrana (M11S1), ya que se sabe que esta es una proteína de membrana. Estos diferentes nombres se derivan del informe (J. Biol. Chem., 270: 20717-20723, 1995) en el que la secuencia de CAPRINA-1 tiene originalmente una región de unión a GPI y la CAPRINA-1 es una proteína de membrana que se expresa en las células del cáncer de colon. Se informó posteriormente de que la secuencia genética de la CAPRINA-1 en dicho informe no era correcta; es decir, se producía un cambio de fase por eliminación de un solo nucleótido de la secuencia genética de la CAPRINA-1 que está registrada actualmente en el GenBank o similar, de forma que se eliminaban 80 aminoácidos del extremo C y el artefacto resultante (de 74 aminoácidos) eral la parte de unión a GPI en el informe; y había otro error presente en el lado 5’ de la secuencia genética, de manera que resultaba en la eliminación de 53 aminoácidos del extremo N (J. Immunol., 172: 2389-2400, 2004). Además, se ha informado de que la proteína codificada por la

65 secuencia genética de la CAPRINA-1 registrada actualmente en el GenBank o similar no era una proteína de membrana celular (J. Immunol., 172: 2389-2400, 2004).

Además, basándose en el informe en J. Biol. Chem., 270: 20717-20723, 1995 en el que la CAPRINA-1 es una proteína de membrana celular, en los documentos US2008/0075722 y WO2005/100998 se desvela que la CAPRINA-1 bajo el nombre de M11S1 se puede utilizar como diana de medicinas con anticuerpos para la terapia del cáncer y como una de las proteínas de membrana celular; sin embargo, los Ejemplos no contienen la descripción de

5 la terapia del cáncer utilizando un anticuerpo contra la proteína. Sin embargo, como se informa en J. Immunol., 172: 2389-2400, 2004, se cree comúnmente, desde que se presentó el documento US2008/0075722 hasta ahora, que la CAPRINA-1 no se expresa en la superficie de una célula, y por lo tanto, es obvio que el contenido de los documentos US2008/0075722 y WO2005/100998 que se basan solo en la mala información de que la CAPRINA-1 es una proteína de membrana celular no debería entenderse como un conocimiento técnico común de los expertos en la técnica.

Sumario de la invención

Problema a resolver por la invención

15 Un objetivo de la presente invención es identificar antígenos proteicos del cáncer que se expresan específicamente en la superficie de las células cancerosas y proporcionar el uso de anticuerpos dirigidos a tales proteínas como agentes terapéuticos y/o preventivos (o profilácticos) para el cáncer.

Medios de resolver el problema

Como resultado de estudios intensivos, los presentes inventores han obtenido ahora un ADNc que codifica una proteína que se une a un anticuerpo presente en el suero de un organismo que alberga un tumor por el método SEREX utilizando bibliotecas de ADNc derivadas de tejido testicular y suero de perros con cáncer de pulmón. Con el

25 uso de los genes caninos obtenidos y genes homólogos de estos de seres humanos, bovinos, de caballo, de ratón y de pollo, proteínas CAPRINA-1 que tienen secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEC ID Nº 2 a 30 pares (es decir, SEC ID Nº 2 a 30 con números pares) y anticuerpos contra proteínas CAPRINA-1 que se han preparado. Además, los presentes inventores han encontrado ahora que la CAPRINA-1 se expresa específicamente en células de cáncer de mama, tumor cerebral, leucemia, linfoma, cáncer de pulmón, cáncer de esófago, cáncer de colon, cáncer gástrico, y cáncer de riñón, y que partes de proteína CAPRINA-1 se expresan específicamente en la superficie de tales células cancerígenas. Además, los presentes inventores han descubierto ahora anticuerpos contra partes de la CAPRINA-1 que se expresan en superficies celulares, que pueden dañar (o incapacitar) las células cancerosas que expresen CAPRINA-1. Estos hallazgos completan la presente invención.

35 La invención proporciona anticuerpos o fragmentos de los mismos y composiciones farmacéuticas, se utilizan todos ellos en un método para el tratamiento y/o prevención del cáncer, y todo como se define en las reivindicaciones.

Efectos de la invención

Los anticuerpos contra la CAPRINA-1 que se utilizan en la presente invención dañan (o incapacitan) la células cancerosas. Por lo tanto tales anticuerpos contra CAPRINA-1 son útiles para el tratamiento de cánceres.

Breve descripción de los dibujos

45 La Fig. 1 muestra los patrones de expresión de los genes que codifican proteínas CAPRINA-1 en tejidos normales y en líneas celulares tumorales. En esta Fig.1 la referencia nº 1 muestra el patrón de expresión de cada gen codificante de CAPRINA-1, y la referencia nº 2 muestra el patrón de expresión del gen GAPDH. La Fig. 2 muestra la actividad citotóxica de un anticuerpo contra CAPRINA-1 (o anticuerpo anti-CAPRINA-1) en la línea celular de cáncer de mama que expresa el gen CAPRINA-1 (T47D). En esta Fig., la referencia nº 3 muestra la actividad tras la adición del anticuerpo anti-CAPRINA-1, la referencia nº 4 muestra la actividad tras la adición del anticuerpo control, y la referencia nº 5 muestra la actividad de la ausencia de cualquier antibiótico. La Fig. 3 muestra la actividad citotóxica de un anticuerpo contra la CAPRINA-1 (o anticuerpo anti-CAPRINA-1) contra la línea celular de cáncer de mama que expresa el gen CAPRINA-1 (MDA-MB-157). En esta Fig., la referencia nº 6 muestra la actividad tras la adición del anticuerpo anti-CAPRINA-1, la referencia nº 7 muestra la

55 actividad tras la adición del anticuerpo control y la referencia nº 8 muestra la actividad en ausencia de cualquier anticuerpo. La Fig. 4 muestra la citotoxicidad contra la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-157 que expresa CAPRINA-1, en la que se muestra citotoxicidad por los anticuerpos monoclonales contra CAPRINA-1 (es decir, los anticuerpos monoclonales nº 1 a nº 11), que reaccionan con la superficie de la célula cancerosa. Específicamente, esta Fig. muestra los niveles de actividad tras la adición del anticuerpo monoclonal nº 1 contra CAPRINA-1 (referencia nº 9), el anticuerpo monoclonal nº 2 contra CAPRINA-1 (referencia nº 10), el anticuerpo monoclonal nº 3 contra CAPRINA-1 (referencia nº 11), el anticuerpo monoclonal nº 4 contra CAPRINA-1 (referencia nº 12), el anticuerpo monoclonal nº 5 contra CAPRINA-1 (referencia nº 13), el anticuerpo monoclonal nº 6 contra CAPRINA-1 (referencia nº 14), el anticuerpo monoclonal nº 7 contra CAPRINA-1 (referencia nº 15), el

65 anticuerpo monoclonal nº 8 contra CAPRINA-1 (referencia nº 16), el anticuerpo monoclonal nº 9 contra CAPRINA-1 (referencia nº 17), el anticuerpo monoclonal nº 10 contra CAPRINA-1 (referencia nº 18), y el

anticuerpo monoclonal nº 11 contra CAPRINA-1 (referencia nº 19), el nivel de actividad tras la adición de un anticuerpo monoclonal que reacciona con la proteína CAPRINA-1 en sí misma pero no con la superficie de la célula cancerosa (referencia nº 20), y el nivel de actividad tras la adición de PBS en vez de los anticuerpos (referencia nº 21).

5 Las Figs. 5a a 5c muestran el efecto antitumoral de los anticuerpos monoclonales contra CAPRINA-1 (es decir los anticuerpos monoclonales nº 1 a nº 11) reaccionan con la superficie de una célula cancerosa, en ratones Balb/c en los que se trasplantó la línea celular CT26 de carcinoma de ratón que expresa CAPRINA-1. Estas Figs. muestran los tamaños de tumor de ratón tras la administración de anticuerpo monoclonal nº 1 contra CAPRINA-1 (referencia nº 22), el anticuerpo monoclonal nº 2 contra CAPRINA-1 (referencia nº 23), el anticuerpo monoclonal nº 3 contra CAPRINA-1 (referencia nº 24), el anticuerpo monoclonal nº 4 contra CAPRINA-1 (referencia nº 25), el anticuerpo monoclonal nº 5 contra CAPRINA-1 (referencia nº 26), el anticuerpo monoclonal nº 6 contra CAPRINA-1 (referencia nº 27), el anticuerpo monoclonal nº 7 contra CAPRINA-1 (referencia nº 28), el anticuerpo monoclonal nº 8 contra CAPRINA-1 (referencia nº 29), el anticuerpo monoclonal nº 9 contra CAPRINA-1 (referencia nº 30), el anticuerpo monoclonal nº 10 contra CAPRINA-1 (referencia nº 31), y el anticuerpo

15 monoclonal nº 11 contra CAPRINA-1 (referencia nº 32), el tamaño del tumor del ratón tras la administración de un anticuerpo monoclonal que reacciona con una proteína CAPRINA-1 en sí misma pero no con la superficie de la célula cancerosa (referencia nº 33), y el tamaño del tumor del ratón tras la administración de PBS en vez de anticuerpo (referencia nº 34). Las Figs. 6a a 6c muestran el efecto antitumoral de los anticuerpos monoclonales contra CAPRINA-1 (es decir los anticuerpos monoclonales nº 1 a nº 11) reaccionan con la superficie de una célula cancerosa, en ratones Balb/c en los que se trasplantó la línea celular CT26 de carcinoma de ratón que expresa CAPRINA-1. Estas Figs. muestran los tamaños de tumor de ratón tras la administración de anticuerpo monoclonal nº 1 contra CAPRINA-1 (referencia nº 35), el anticuerpo monoclonal nº 2 contra CAPRINA-1 (referencia nº 36), el anticuerpo monoclonal nº 3 contra CAPRINA-1 (referencia nº 37), el anticuerpo monoclonal nº 4 contra CAPRINA-1 (referencia nº 38), el

25 anticuerpo monoclonal nº 5 contra CAPRINA-1 (referencia nº 39), el anticuerpo monoclonal nº 6 contra CAPRINA-1 (referencia nº 40), el anticuerpo monoclonal nº 7 contra CAPRINA-1 (referencia nº 41), el anticuerpo monoclonal nº 8 contra CAPRINA-1 (referencia nº 42), el anticuerpo monoclonal nº 9 contra CAPRINA-1 (referencia nº 43), el anticuerpo monoclonal nº 10 contra CAPRINA-1 (referencia nº 44), y el anticuerpo monoclonal nº 11 contra CAPRINA-1 (referencia nº 45), el tamaño del tumor del ratón tras la administración de un anticuerpo monoclonal que reacciona con una proteína CAPRINA-1 en sí misma pero no con la superficie de la célula cancerosa (referencia nº 46), y el tamaño del tumor del ratón tras la administración de PBS en vez de anticuerpo (referencia nº 47).

Modo para llevar a cabo la invención

35 Como se describe más adelante, la actividad antitumoral de los anticuerpos contra los polipéptidos que se muestran en las SEC ID Nº 2 a 30 pares que se utiliza en la presente invención se puede evaluar examinando in vivo la inhibición del crecimiento tumoral en un animal que alberga un tumor, o examinando in vitro si se inhibe o no la citotoxicidad inmunocítica o medada por complemento contra las células tumorales que muestran el polipéptido.

Además, las secuencias de nucleótidos de los polinucleótidos que codifican las proteínas que consisten en las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEC ID Nº 2 a 30 pares (es decir las SEC ID Nº 2, 4, 6…28, y 30) se muestran en las SEC ID Nº 1 a 29 impares (es decir, las SEC ID Nº 1, 2, 5…27, y 29), respectivamente.

45 Las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEC ID Nº 6, 8, 19, 12, y 14 del Listado de Secuencias desvelado de acuerdo con la presente invención son las secuencias de aminoácidos de las proteínas CAPRINA-1, que se aislaron por el método SEREX utilizando bibliotecas de ADNc derivado de tejidos testiculares caninos y suero de perros con cáncer de mama, como polipéptidos capaces de unirse a los antibióticos que se encuentran específicamente en el suero de perros que albergan tumores; las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC ID Nº 2 y 4 son las secuencias de CAPRINA-1 aisladas como homólogas humanas de dichos polipéptidos caninos; la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 16 es la secuencia de aminoácidos de la proteína CAPRINA-1 aislada como una homóloga bovina de dicho polipéptido canino; la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 18 es la secuencia de aminoácidos de la proteína CAPRINA-1 aislada como una homólogo equino de dicho polipéptido canino; las secuencias mostradas (pares) en las SEC ID Nº 20 a 28 son las secuencias

55 de aminoácidos de la proteína CAPRINA-1 aisladas como homólogas murinas de dichos polipéptidos caninos; y la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 30 es la secuencia de aminoácidos de proteína CAPRINA-1 aislada como una homóloga de pollo de dicho polipéptido canino (véase el Ejemplo 1 descrito más adelante). Se sabe que la CAPRINA-1 se expresa cuando tiene lugar la activación o la división celular de células normales en reposo.

Se sabía que la CAPRINA-1 no se expresa en las superficies de las células. Sin embargo, como resultado del examen de acuerdo con la presente invención, se ha revelado ahora que ciertas porciones de la proteína CAPRINA1 se expresa sobre las superficies de varias células cancerosas. De acuerdo con la presente invención, se utiliza preferentemente un anticuerpo que se une a una parte de la proteína CAPRINA-1 que se expresa en las superficies

65 de las células cancerosas. Ejemplos de péptidos parciales de la proteína CAPRINA-1 que se expresan en las superficies de las células cancerosas incluyen polipéptidos que consisten en una secuencia de 7 o más aminoácidos

consecutivos de la región de restos de aminoácidos Nº (o los aminoácidos (aa) 50-98 o los restos de aminoácidos Nº (aa) 233-305 en una secuencia de aminoácidos que se muestra en cualquiera de las SEC ID Nº 2 a 30 pares, excluyendo las SEC ID Nº 6 y 18, del Listado de Secuencias. Ejemplos específicos de las mismas incluyen las secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 37 o 136 (preferentemente, la región de la secuencia de

5 aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 137 o 138 en la secuencia mostrada en la SEC ID Nº 136). Los anticuerpos de la presente invención incluyen todos los anticuerpos capaces de unirse a los péptidos anteriores y tienen una actividad antitumoral.

Los anticuerpos contra CAPRINA-1 que se utilizan en la presente invención como se ha descrito anteriormente pueden ser cualquier tipo de los mismos, siempre y cuando puedan mostrar una actividad antitumoral. Ejemplos de los mismos incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos sintéticos, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos monocatenarios (scFv), y fragmentos de los mismos tales como Fab y F(ab’)2. Estos anticuerpos y fragmentos de los mismos se pueden preparar por métodos conocidos por los expertos. En la presente invención, se desean los

15 anticuerpos capaces de unirse específicamente a la proteína CAPRINA-1. Tales anticuerpos son preferentemente anticuerpos monoclonales; sin embargo, siempre que sean anticuerpos homogéneos que se puedan producir establemente, también se pueden utilizar anticuerpos policlonales. Además, si el sujeto es un ser humano es deseable utilizar un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado con el fin de evitar o inhibir el inmunorechazo.

La expresión “que se une específicamente a la proteína CAPRINA-1” como se utiliza en el presente documento significa que un anticuerpo de interés se une específicamente a la proteína CAPRINA-1 y no se une sustancialmente a otras proteínas.

Como se describe más adelante, la actividad antitumoral de un anticuerpo utilizado en la presente invención se

25 puede evaluar examinando in vivo la inhibición del crecimiento tumoral en un animal que alberga el tumor, o examinando in vitro si se muestra o no una actividad inmunocítica o mediada por complemento contra las células tumorales que expresan el polipéptido.

Además, los sujetos que tienen necesidad de tratamiento y/o prevención de un cáncer de acuerdo con la presente invención son mamíferos tales como el ser humano, animales de compañía, animales de granja, o animales deportivos. El sujeto preferido es un ser humano.

La producción de antígenos, la producción de anticuerpos, y las composiciones farmacéuticas, relacionadas con la presente invención, se explicarán a continuación.

35 Producción de antígenos utilizados para la producción de anticuerpos

Las proteínas o fragmentos de las mismas que se utilizan como antígenos sensibilizantes para obtener anticuerpos contra la CAPRINA-1 que se utilizan en la presente invención no están limitados en términos de sus orígenes tal como animales incluyendo, por ejemplo, seres humanos, caninos, bovinos, caballos, ratones, ratas y pollos. Sin embargo, tales proteínas o fragmentos de las mismas se seleccionan preferentemente en vista de su compatibilidad con las células parentales utilizadas para la fusión celular. Son generalmente preferibles las proteínas derivadas de mamíferos y las proteínas derivadas de seres humanos son particularmente preferibles. Por ejemplo, si la CAPRINA1 es una CAPRINA-1 humana, se puede utilizar una proteína CAPRINA-1 humana, un péptido parcial de la misma, o

45 células capaces de expresar una CAPRINA-1 humana.

Se pueden obtener secuencias de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos de la CAPRINA-1 humana y homólogas de las mismas por ejemplo por el registro del GenBank (NCBI, EE. UU.) y utilizando el algoritmo BLAST

o FASTA (Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU, 90:5873-5877,1993; Altschul y col., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997).

De acuerdo con la presente invención, cuando se utiliza la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 1 o 3) o la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 2 o 4) de la CAPRINA-1 humana como una secuencia básica, las dianas son ácidos nucleicos o proteínas consistiendo cada una en una secuencia que tiene una identidad de secuencia del 70 55 % al 100 %, preferentemente del 80 % al 100 %, más preferentemente del 90 % al 100 %, y más preferentemente del 95 % al 100 % (por ejemplo, del 97 % al 100 %, 98 % al 100 %, 99 % al 100 % o 99,5 % al 100 %) con la secuencia de nucleótido o la secuencia de aminoácidos de la ORF o la parte madura de la secuencia de nucleótidos

: o la secuencia de aminoácidos básicas. La expresión “% de identidad de secuencia” como se utiliza en el presente documento significa un porcentaje (%) del número de aminoácidos idénticos (o nucleótidos) con el número total de aminoácidos (o nucleótidos) en el caso de que dos secuencias se alineen tal que se alcance la máxima similitud con

: o sin la introducción de huecos.

Los fragmentos de una proteína CAPRINA-1 tienen longitudes que varían desde la longitud en aminoácidos de un epítopo (o un determinante antigénico), que es la unidad más pequeña de un antígeno que reconoce un anticuerpo, 65 a menos de la longitud total de la proteína. El epítopo se refiere a fragmento polipeptídico que tiene antigenicidad o inmunogenicidad en mamíferos preferentemente en seres humanos. La unidad más pequeña de un fragmento

polipeptídico consisten en aproximadamente 7 a 12 aminoácidos, y por ejemplo, 8 a 11 aminoácidos. Un ejemplo específico del mismo es la secuencia de aminoácidos que se muestra en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 37, SEC ID Nº 137, o SEC ID Nº 138.

Los polipéptidos que comprenden la proteína CAPRINA-1 humana mencionada anteriormente y los péptidos parciales de la misma se pueden sintetizar según los métodos de síntesis química tales como el método Fmoc (método fluoroenilmetiloxicarbonilo) o el método tBoc (método t-butiloxicarbonilo) (the Japanese Biochemical Society (ed.), "Biochemical Experimentation Course (Seikagaku Jikken Koza) 1," Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, Kagaku-dojin Publishing Company, Inc. (Japón), 1981). También se pueden sintetizar por métodos generales utilizando varios sintetizadores de péptidos disponibles comercialmente. Además, los péptidos de interés se pueden obtener preparando los polinucleótidos que codifican los polipéptidos anteriores utilizando métodos conocidos de modificación genética (Sambrook y col., Molecular Cloning, 2ª edición, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology, 3ª edición, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, etc.), incorporando cada uno de los polinucleótidos en un vector de expresión e introduciendo el vector en una células huésped para que de esa manera la célula huésped produzca el polipéptido. Por tales vías, se pueden obtener los péptidos que se desean.

Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos mencionados anteriormente se pueden preparar fácilmente por técnicas conocidas de modificación genética o métodos generales que utilizan sintetizadores de ácidos nucleicos disponibles comercialmente. Por ejemplo, el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº 1 se puede preparar por PCR utilizando un ADN cromosómico humano o una biblioteca de ADNc como matriz y un par de cebadores diseñados para hacer posible la amplificación de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº 1. Las condiciones de la PCR se puede determinar apropiadamente, Por ejemplo, tales condiciones pueden comprender la realización de 30 ciclos de etapas de reacción (como un ciclo) que consisten en : 94 ºC, 30 segundos (desnaturalización); 55 ºC, 30 segundos a 1 minuto (hibridación) y 72 ºC, 2 minutos (elongación) utilizando una ADN polimerasa termoestable (por ejemplo polimerasa Taq) y un tampón de PCR que contenga Mg2+ , seguido por una reacción a 72 ºC durante 7 minutos tras completar los 30 ciclos. Sin embargo, la presente invención no se limita a las condiciones de PCR ejemplificadas anteriormente. Se describen técnicas y condiciones de PCR en, por ejemplo, Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd edition, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons (en particular, el Capítulo 15).

Además, se puede aislar el ADN deseado preparando sondas y cebadores apropiados basándose en la información de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos que se muestra en las SEC ID Nº 1 a 30 en el listado de Secuencias descrito en el presente documento, y explorando una biblioteca de ADNc humano o similar con el uso de tales sondas y cebadores. Preferentemente, tal biblioteca de ADNc se produce a partir de una célula, órgano, o tejido en los que se expresa la proteína con cualquiera de las SEC ID Nº 2 a 30 pares. Ejemplos de células o tejidos incluye las células o tejidos testiculares y cánceres o tumores, tales como leucemia, cáncer de mama, linfoma, tumor cerebral, cáncer de pulmón y cáncer de colon. Las operaciones tales como la preparación de sondas o cebadores, la construcción de bibliotecas de ADNc, la exploración de bibliotecas de ADNc, y la clonación de los genes de interés, como se han descrito anteriormente, se conocen por los expertos en la técnica, y pueden llevarse a cabo de acuerdo, por ejemplo, con los métodos descritos en Sambrook y col., Molecular Cloning, the 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989) y Ausbel metal. (ibid.). Los ADN que codifican una proteína CAPRINA-1 humana y los péptidos parciales de la misma se pueden obtener de los ADN obtenidos de esta manera.

Las células huésped descritas anteriormente pueden ser cualquier célula, siempre que puedan expresar los polipéptidos descritos anteriormente. Un ejemplo de célula procariota incluye, pero no se limita a esta, Escherichia coli. Ejemplos de células huésped eucariotas incluyen, pero no se limitan a estas, células de mamífero tales como células de riñón de mono (COS1), células de ovario de hámster chino (CHO), línea celular de riñón embrionario humano (HEK293), y línea celular de piel embrionaria de ratón (NIH3T3), las células de levaduras tales como levaduras en gemación y células de levadura en división, células de gusano de seda, y células de huevo Xenopus.

Cuando se utilizan las células procariotas como células huésped, se puede utilizar un vector de expresión que tiene un origen replicable en células procariotas, un promotor, un sitio de unión al ribosoma, un sitio de multiclonación, un terminador, un gen de resistencia a fármacos, un gen complementario auxotrófico, y similares. Como vectores de expresión para Escherichia coli, se pueden ejemplificar, vectores pUC, pBluescript II, sistemas de expresión pET, sistemas de expresión pGEX, y similares. Un ADN que codifica el polipéptido anterior se incorpora en tal vector de expresión, se transforma una célula huésped con el vector y luego la célula transformada obtenida de esta manera se cultiva, de forma que se pueda expresar el polipéptido codificado por el ADN en la célula huésped procariota. En este momento, el polipéptido también se puede expresar como una proteína de fusión con otra proteína.

Cuando se utilizan células eucariotas como célula huésped, se pueden utilizar vectores de expresión para células eucariotas que tienen un promotor, una región de corte y empalme, una sitio de adición poli(A), o similares. Ejemplos de tales vectores de expresión incluyen pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, vector EBV, pRS, pcDNA3, y pYES2. Por procedimientos similares a los que se mencionaron anteriormente un ADN que codifica el polipéptido mencionado anteriormente se incorpora en tal vector de expresión, se transforma una células huésped

eucariota con el vector y luego la células transformada obtenida de esta manera se cultiva, de forma que se puede expresar el polipéptido codificado por el ADN anterior en la célula huésped eucariota. Cuando se utilizan como vector de expresión pIND/V5-His, pFLAGCMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1, o similares, el polipéptido anterior e puede expresar como una proteína de fusión con un indicador, tal como indicador His (por ejemplo, (His)6 a (His) 10),

5 marcador FLAG, marcador myc, marcador HA, o GFP.

Para la introducción de un vector de expresión en una célula huésped, se pueden emplear métodos bien conocidos, tales como electroporación, un método de fosfato de calcio, un método con liposomas, un método DEAE dextrano, microinyección, infección vírica, lipofección, y unión con un péptido permeable a la membrana celular.

10 El aislamiento y purificación de un polipéptido de interés de células huésped se puede llevar a cabo utilizando técnicas conocidas de aislamiento en combinación. Ejemplos de tales técnicas conocidas incluyen, pero no se limitan a estas, tratamiento utilizando un agente desnaturalizante tal como urea o un tensioactivo, ultrasonicación, digestión enzimática, precipitación de proteínas (por adición de sal), fraccionamiento en disolvente y precipitación,

15 diálisis, centrifugación, ultrafiltración, filtración en gel, SDS-PAGE, electroforesis de enfoque isoeléctrico, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, cromatografía de afinidad, y cromatografía en fase inversa.

Estructura del anticuerpo

20 En general, los anticuerpos son glucoproteínas heteromultiméricas que comprenden cada uno al menos dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Al mismo tiempo, los anticuerpos excepto las IgM son glucoproteínas heterotetraméricas (de aproximadamente 150 kDa) que comprenden dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H). Normalmente, cada una de las cadenas ligeras se conectan a un cadena pesada por

25 medio de un enlace covalente disulfuro. Sin embargo, el número de enlaces disulfuro entre las cadenas pesadas varían entre los distintos tipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y cadena ligera también hay puentes disulfuro intracatenarios. Cada cadena pesada tiene un dominio variable (región VH) y un extremo de la misma, al que se unen en serie algunas de las regiones constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (región VL) en un extremo de la misma y tiene una única región constante en el extremo opuesto de la misma. La región

30 constante de una cadena ligera se alinea con la primera región constante de una cadena pesada y el dominio y el dominio variable de cadena ligera se alinea con el domino variable de la cadena pesada. Una región específica de un dominio variable del anticuerpo, que se llama “región determinante de complementariedad (CDR)”, muestra una variabilidad específica de forma que da lugar a la especificidad de unión a un anticuerpo. Una parte relativamente conservada en una región variable e llama “una región de armazón (FR)”. Un dominio variable completo de cadena

35 pesada o cadena ligera comprende 4 FR conectadas unas con otras por medio de 3 CDR. Tales CDR se llaman "CDRH1," "CDRH2," y "CDRH3," respectivamente. La CDRH3 tiene el papel más importante en términos de especificidad de unión de anticuerpo al antígeno. Además, las CDR en cada cadena son retenidas por regiones FR en el estado en que están cercanas unas a otras, y contribuyen a la formación de sitios de unión del anticuerpo al antígeno con las CDR en una cadena correspondiente. Las regiones constantes no contribuyen directamente a la

40 unión del anticuerpo al antígeno. Sin embargo, muestran varias funciones efectoras tales como la asociación con la toxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis por medio de la unión a un receptor Fcγ, tasa de semivida/aclaramiento por medio del receptor Fc neonatal (FcRn), y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) por medio del componente C1q en la cascada del complemento.

45 Producción de anticuerpos

La expresión “anticuerpo anti-CAPRINA-1” que se utiliza en la presente invención se refiere a un anticuerpo que tiene la reactividad con una proteína CAPRINA-1 de longitud completa o un fragmento de la misma, como se define en las reivindicaciones.

50 La expresión “reactividad inmunológica” que se utiliza en el presente documento indica las características de unión de un anticuerpo in vivo a un antígeno CAPRINA-1. La función perjudicial de tumores (por ejemplo, muerte, inhibición, o regresión) se puede expresar como un resultado de tal unión. Específicamente, se puede utilizar cualquier tipo de anticuerpo en la presente invención siempre y cuando el anticuerpo se pueda unir a la proteína

55 CAPRINA-1 para perjudicar un cáncer o tumor tal como la leucemia, linfoma, cáncer de mama, tumor cerebral, cáncer de pulmón cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer renal, o cáncer de colon.

Ejemplos de tales anticuerpos incluyen los anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos sintéticos, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos,

60 anticuerpos monocatenarios, y fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab y F(ab’)2). Además, los ejemplos de clases arbitrarias de inmunoglobulinas de tales anticuerpos incluyen IgG, IgE, IgM, IgA, IgD, e IgY, y ejemplos de subclases arbitrarias de inmunoglobulinas incluyen IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2.

Los anticuerpos se pueden además modificar por medio de acetilación, formilación, amidación, fosforilación, o 65 pegilación (PEG), además de la glucosilación.

La producción de ejemplos de varios anticuerpos se describe más adelante.

En un caso en el que un anticuerpo de interés es un anticuerpo monoclonal, se les administró a ratones una línea celular SK-BR3 de cáncer de mama que expresa CAPRINA-1 o similar para inmunizarlos, y a continuación se

5 extrajeron los bazos de los ratones. Se separaron las células de cada bazo y se fusionaron con células de mieloma de ratón. Se seleccionaron los clones capaces de producir un anticuerpo que tuviera acción de inhibición del crecimiento de las células cancerosas a partir de las células de fusión (hibridomas) obtenidas. Se aisló y cultivó un hibridoma que producía un anticuerpo monoclonal que tiene una acción de inhibición del crecimiento de células cancerosas. El anticuerpo de interés se puede preparar por medio de purificación del sobrenadante del cultivo por un método de purificación de afinidad general.

También, se puede producir un anticuerpo monoclonal, por ejemplo de la manera que se describe a continuación. Primero se inmuniza un animal con un antígeno sensibilizante por un método conocido. En un método general, se lleva a cabo la inmunización inyectando intraperitonealmente o subcutáneamente un antígeno sensibilizante a un

15 mamífero. Específicamente, se diluye el antígeno sensibilizante o se suspende en PBS (solución salina tamponada de fosfato), solución salina fisiológica, o similar hasta una cantidad resultante apropiada. Si se desea, se puede mezclar con una cantidad apropiada de un adyuvante convencional (por ejemplo, el adyuvante completo de Freund Después de que tenga lugar la emulsificación se administra el resultado a n mamífero varias veces cada 4 a 21 días. Además, se puede utilizar un vehículo adecuado para la inmunización con un antígeno sensibilizante.

Como se describe anteriormente, después de la inmunización de un mamífero y la confirmación de un aumento del nivel de anticuerpo deseado en el suero, se recolectan los inmunocitos del mamífero y se someten a fusión celular. Particularmente los ejemplos preferidos de inmunocitos son los esplenocitos.

25 Las células de mieloma de mamífero se utilizan como células parentales relevantes sometidas a fusión con los inmunocitos anteriores. Para tales células de mieloma, se utilizan preferente mente los siguientes varios ejemplos de líneas celulares conocidas: P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. y Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976). 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D. H. y col., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. y col., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, S. F. y col., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), y R210 (Galfre, G. y col., Nature (1979) 277, 131-133).

Básicamente, la célula de fusión de inmunocitos y células de mieloma descrita anteriormente se puede conseguir de acuerdo con un método conocido tal como el método de Kohler y Milstein y col. (Kohler, G. y Milstein, C. Methods

35 Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Más específicamente, la célula de fusión descrita anteriormente se lleva a cabo en presencia de un promotor de la célula de fusión en una solución de cultivo que contiene los nutrientes convencionales, por ejemplo. Ejemplos de un promotor de fusión que se utilizan incluyen polietilenglicol (PEG) y virus Sendai (HVJ: virus hemaglutinante de Japón). Si se desea se puede añadir además un adyuvante con el dimetilsulfóxido para mejorar la eficacia de fusión.

La proporción de inmunocitos que se utiliza con las células de mieloma se puede determinar arbitrariamente. Por ejemplo, la relación de inmunocitos con respecto a células de mieloma es preferentemente 1:1 a 10:1. Ejemplos de una solución de cultivo que se puede utilizar para la fusión celular descrita anteriormente incluye una solución de

45 cultivo RPMI1640 y una solución de cultivo MEM adecuada para el cultivo de las anteriores líneas celulares de mieloma así como otras soluciones de cultivo convencionales utilizadas para esta clase de cultivo celular. Además, se puede utilizar un remplazo de suero tal como suero fetal bovino (FCS) en combinación con ellas.

Para la fusión celular, los inmunocitos anteriores y las células de mieloma se mezclan suficientemente en cantidades predeterminadas en una solución de cultivo. Se añade una solución PEG (por ejemplo de media de peso molecular de aproximadamente 1000 a 6000) que se había calentado previamente a aproximadamente 37 ºC a la misma a una concentración de generalmente el 30 % al 60 % (p/v), y a continuación se mezclan. Esto da como resultado la formación de los hibridomas de interés. Posteriormente, se llevan a cabo repetidamente etapas operacionales de una adición secuencial de una solución de cultivo apropiada y retirada del sobrenadante por medio de centrifugación

55 para eliminar el agente de fusión celular y similar que no son preferibles para el crecimiento de hibridomas.

Los hibridomas obtenidos de esta manera se cultivan en una solución de cultivo de selección convencional tal como una solución de cultivo HAT (una solución de cultivo que comprende hipoxantina, aminopterina, y timidina) para la selección. El cultivo en tal solución de cultivo HAT se lleva a cabo continuamente durante un periodo de tiempo suficiente (generalmente de varios días a varias semanas) para la muerte de las células (células no fusionadas) distintas de las del hibridoma de interés. Luego, se emplea un método de dilución limitante convencional para seleccionar los hibridomas que producen los anticuerpos de interés y llevar a cabo una simple clonación.

Además, también es posible obtener hibridomas que producen anticuerpos humanos que tengan la actividad

65 deseada (por ejemplo, actividad de inhibición del crecimiento) de la siguiente manera, así como obtener los hibridomas anteriores por medio de inmunización de animales no humanos con antígenos. Los linfocitos humanos

(por ejemplo los linfocitos humanos infectados con virus EB) se sensibilizan in vitro con una proteína, células que expresan proteína, o un lisado de las mismas y los linfocitos sensibilizados se fusionan con células de mieloma derivado de humanos que tienen la capacidad de dividirse permanentemente (por ejemplo, U266) (Nº de registro TIB 196).

5 Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales producidos como anteriormente se pueden subcultivar en una solución de cultivo convencional. Además, se pueden conservar en nitrógeno líquido durante un largo periodo de tiempo.

Específicamente, la inmunización se lleva a cabo utilizando un antígeno deseado o células que expresan un antígeno deseado como antígeno sensibilizante de acuerdo con un método de inmunización convencional. Los inmunocitos obtenidos se fusionan con células parentales conocidas por un método convencional de fusión celular. Luego las células productoras de anticuerpos monoclonales (hibridomas) se seleccionan por un método de selección convencional. De esta manera se puede llevar a cabo la producción de anticuerpos.

15 Otros ejemplos de los anticuerpos que se pueden utilizar en la presente invención incluyen los anticuerpos policlonales. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales se pueden utilizar de una manera que se describe más adelante.

Se obtiene suero por inmunización de animales pequeños tales como ratones, ratones productores de anticuerpos humanos, o ratones con una proteína CAPRINA-1 que se encuentra naturalmente, una proteína CAPRINA-1 recombinante que se ha expresado como una proteína fusionada con GST o similar en un microorganismo tal como Escherichia coli, o un péptido parcial de la misma. El suero se purifica por precipitación con sulfato amónico, cromatografía en columna de proteína A/proteína G, cromatografía de intercambio iónico DEAE, cromatografía en

25 columna de afinidad con una columna en la que una proteína CAPRINA-1 o un péptido sintético se acopla, o una técnica similar para la preparación de anticuerpos policlonales. En los Ejemplos descritos más adelante, se produjo un anticuerpo policlonal de conejo, y se confirmaron los efectos antitumorales del mismo, tal anticuerpo era contra un péptido parcial (con la secuencia que se muestra en la SEC ID Nº 37) de un dominio en una secuencia de aminoácidos de la proteína CAPRINA-1 que se expresa en las superficies de las células cancerosas.

Un ratón que produce un conocido anticuerpo humano utilizado en el presente documento, por ejemplo, es un ratón KM (Kirin Pharma/Medarex) o un XenoMouse (Amgen) (por ejemplo, los documentos WO02/43478 y WO02/092812). Cuando tales ratones se inmunizaron con proteínas CAPRINA-1 o fragmentos de la misma, se pueden obtener anticuerpos policlonales completos humanos de la sangre. Además, los anticuerpos monoclonales

35 humanos se pueden producir por un método de fusión de esplenocitos recolectados de los ratones inmunizados con las células de mieloma.

La preparación de antígenos se puede llevar a cabo de acuerdo con un método tal como un método que utiliza células animales (Publicación de patenteJP (Kohyo) Nº 2007-530068) o un método que utiliza baculovirus (por ejemplo, el documento WO98/46777). Si la inmunogenicidad de un antígeno es baja, se une un antígeno a una macromolécula que tiene inmunogenicidad tal como la albúmina. Luego, el antígeno se puede utilizar para la inmunización.

Además, es posible utilizar un anticuerpo recombinante genético producido clonando un gen de anticuerpo de un

45 hibridoma, incorporando el clon en un vector adecuado, introducir el vector en un huésped y utilizando una técnica recombinante genética. (Véase por ejemplo, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Publicado en el Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990.). Específicamente, el ADNc de una región variable (V) de un anticuerpo se sintetiza a partir del ARNm de un hibridoma con el uso de una transcriptasa inversa. Después se obtiene el ADN que codifica una región V de un anticuerpo de interés, tal ADN se liga al ADN deseado que codifica una región constante de anticuerpo (región C). El resultado se incorpora en un vector de expresión. De manera alternativa, el ADN que codifica una región V de anticuerpo se puede incorporar en un vector de expresión que comprende ADN de una región C de anticuerpo. Tal ADN se incorpora en un vector de expresión de manera que se expresa bajo el control de una región de control de expresión tal como un potenciador o un promotor. Luego, se transforman las células huésped con tal vector de

55 expresión, permitiendo de esta manera que el anticuerpo se exprese.

Los anticuerpos anti-CAPRINA-1 de la presente invención son preferentemente anticuerpos monoclonales. Sin embargo, pueden ser anticuerpos policlonales, anticuerpos modificados genéticamente (tales como anticuerpos quiméricos, y anticuerpos humanizados), y similares.

Los anticuerpos monoclonales incluyen los anticuerpos monoclonales humanos y los anticuerpos monoclonales animales no humanos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de ratón, anticuerpos monoclonales de rata, anticuerpos monoclonales de conejo, y anticuerpos monoclonales de pollo). Los anticuerpos monoclonales se pueden producir cultivando los hibridomas obtenidos por medio de la fusión de células de mieloma y esplenocitos de 65 mamíferos no humanos (por ejemplo ratones o ratones que producen anticuerpos humanos) inmunizados con proteínas CAPRINA-1. En los Ejemplos descritos más adelante, se produjeron anticuerpos monoclonales de ratón y

se confirmaron los efectos antitumorales de los mismos. Tal anticuerpo monoclonal comprende una región variable (VH) de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEC ID Nº 43, SEC ID Nº 73, SEC ID Nº 83, SEC ID Nº 93, SEC ID Nº 103, SEC ID Nº 113, o SEC ID Nº 123 y una región variable (VL) de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEC ID Nº 47, SEC ID Nº 53, SEC ID Nº 58, SEC 5 ID Nº 63, SEC ID Nº 68, SEC ID Nº 77, SEC ID Nº 87, SEC ID Nº 97, SEC ID Nº 107, SEC ID Nº 117, o SEC ID Nº

127. En el presente documento, la región VH comprende una CDR1 representada por la SEC ID Nº 40, SEC ID Nº 70, SEC ID Nº 80, SEC ID Nº 90, SEC ID Nº 100, SEC ID Nº 110, o SEC ID Nº 120; una CDR2 representada por la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 41, SEC ID Nº 71, SEC ID Nº 81, SEC ID Nº 91, SEC ID Nº 101, SEC ID Nº 111, o SEC ID Nº 121; y una CDR3 representada por la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 42, SEC ID Nº 72, SEC ID Nº 82, SEC ID Nº 92, SEC ID Nº 102, SEC ID Nº 112, o SEC ID Nº 122. La región VL comprende una CDR1 representada por la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 44, SEC ID Nº 50, SEC ID Nº 55, SEC ID Nº 60, SEC ID Nº 65, SEC ID Nº 74, SEC ID Nº 84, SEC ID Nº 94, SEC ID Nº 104, SEC ID Nº 114, o SEC ID Nº 124; una CDR2 representada por la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 45, SEC ID Nº 51, SEC ID Nº 56, SEC ID Nº 61, SEC ID Nº 66, SEC ID Nº 75, SEC ID Nº 85, SEC ID Nº 95, SEC ID Nº 105, SEC ID Nº 115, o SEC ID Nº 125; y una CDR3

15 representada por la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 46, SEC ID Nº 52, SEC ID Nº 57, SEC ID Nº 62, SEC ID Nº 67, SEC ID Nº 76, SEC ID Nº 86, SEC ID Nº 96, SEC ID Nº 106, SEC ID Nº 116, o SEC ID Nº 126.

Un anticuerpo quimérico es un anticuerpo que se produce por la combinación de secuencias de animales diferentes. Un ejemplo del mismo consiste en regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera de un anticuerpo de ratón y regiones constantes de cadena pesada y pesada de un anticuerpo humano. Por ejemplo, se puede obtener uniendo el ADN que codifica una región V de anticuerpo con el ADN que codifica una región C de anticuerpo humano, incorporando el resultado en un vector de expresión e introduciendo el vector en un huésped para la producción de anticuerpos.

25 Los anticuerpos policlonales incluyen anticuerpos que se obtienen por inmunización con proteínas CAPRINA-1, de animales que producen anticuerpos humanos (por ejemplo, ratones).

Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo modificado, y a veces se le designa como un “anticuerpo humano remodelado”. Se sabe que un anticuerpo humanizado se construye trasplantando CDR de un anticuerpo de un animal inmunizado en regiones determinantes de complementariedad de un anticuerpo humano. También, se conoce una técnica general de recombinación genética para esto.

Específicamente, se sintetiza por métodos de PCR una secuencia de ADN diseñada de manera que permita que las CDR de un anticuerpo de ratón se una a regiones de armazón de anticuerpos humanos (FR) utilizando varios 35 oligonucleótidos preparados de tal menara que los oligonucleótidos tienen partes que se solapan unas con otras en el extremo de cada uno. Un anticuerpo humanizado se puede obtener uniendo el ADN obtenido anterior con ADN que codifica una región constante de anticuerpo humano, incorporando el resultado en un vector de expresión, e introduciendo el vector en un huésped para la producción de anticuerpos (véase los documentos EP-A-239400 y WO96/02576). Las FR de anticuerpos unidas unas a otras por medio de CDR se seleccionan asumiendo que las regiones determinantes de complementariedad puedan formar un buen sitio de unión al antígeno. Si fuera necesario, los aminoácidos de las regiones de armazón de una región variable de anticuerpo se pueden sustituir de manera que las regiones determinantes de complementariedad en un anticuerpo humano remodelado formen un sitio de unión al antígeno apropiado (Sato K. y col., Cancer Research 1993, 53: 851-856). Además, las regiones de armazón se pueden sustituir con regiones de armazón de un anticuerpo humano diferente (véase el documento

45 WO99/51743).

Las regiones de armazón de anticuerpo humano unidas unas a otras por medio de CDR se seleccionan asumiendo que las regiones determinantes de complementariedad puedan formar un buen sitio de unión al antígeno. Si fuera necesario, los aminoácidos de las regiones de armazón de una región variable de anticuerpo se pueden sustituir de manera que las regiones determinantes de complementariedad en un anticuerpo humano remodelado formen un sitio de unión al antígeno apropiado (Sato K. y col., Cancer Research 1993, 53: 851-856).

Después de que se produce un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado, se pueden sustituir los aminoácidos de la región variable (por ejemplo, FR) o la región constante, por aminoácidos diferentes.

55 Aquí, la sustitución de aminoácidos es una sustitución, or ejemplo, de menos de 15, menos de 10, no más de 8, no más de 7, no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, o no más de 2 aminoácidos, preferentemente de 1 a 5 aminoácidos, y más preferentemente 1 o 2 aminoácidos. Un anticuerpo sustituido debería ser funcionalmente equivalente a un anticuerpo no sustituido. La sustitución es preferentemente una sustitución de aminoácidos conservadora, que es una sustitución entre aminoácidos que tienen características similares en términos de carga, cadenas laterales, polaridad, aromaticidad, y similares. Por ejemplo, los aminoácidos característicamente similares se pueden clasificar en los siguientes tipos: aminoácidos básicos (arginina, lisina ,e histidina); aminoácidos ácidos (ácido aspártico y ácido glutámico); aminoácidos sin carga polar (glicina, asparagina, glutamina, serina , treonina, cisteína, y tirosina); aminoácidos no polares (leucina, isoleucina, alanina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano, y

65 metionina); aminoácidos ramificados (treonina, valina, isoleucina); y aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptófano, e histidina).

Un ejemplo de un modificador de anticuerpos en un anticuerpo que se une a una molécula tal como el polietilenglicol (PEG). Con respecto a los modificadores de anticuerpos de la presente invención, no hay limitación en sustancias que se unen a un anticuerpo. Tal modificador de anticuerpo se puede obtener modificando químicamente un anticuerpo obtenido. Un método de tal modificación se ha establecido ya en el campo relativo a la presente invención.

La expresión “funcionalmente equivalente” como se utiliza en el presente documento indica una situación en la que un anticuerpo de interés tiene una actividad biológica o bioquímica similar a la del anticuerpo de la presente invención. Específicamente, tal anticuerpo tiene una función de dañar tumores y no produce esencialmente una reacción de rechazo cuando se aplica en seres humanos. Un ejemplo de tal actividad es la actividad de inhibición del crecimiento o la actividad de unión.

Un método conocido para preparar un polipéptido funcionalmente equivalente a un polipéptido determinado que se conoce bien por los expertos en la técnica es un método que comprende la introducción de una mutación en un polipéptido. Por ejemplo, un experto en la técnica puede introducir adecuadamente una mutación en un anticuerpo de la presente invención utilizando un método de mutagénesis de sitio específico (Hashimoto-Gotoh, T. y col., (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ., y Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. y col., (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer, W. y Fritz, HJ., (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492; o Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) o un método similar. Por lo tanto, se puede preparar un anticuerpo funcionalmente equivalente al anticuerpo de la presente invención.

Un anticuerpo mencionado anteriormente capaz de reconocer un epítopo de una proteína CAPRINA-1 reconocida por un anticuerpo anti-CAPRINA-1 se puede obtener por un método conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede obtener por: un método que comprende la determinación de un epítopo de una proteína CAPRINA-1 que es reconocida por anticuerpo anti-CAPRINA-1 por un método general (por ejemplo, mapeado de epítopos) y produciendo un anticuerpo utilizando un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos contenida en al epítopo como un inmunógeno; o un método que comprende la determinación de un epítopo de un anticuerpo producido por un método general y seleccionando un anticuerpo que tenga un epítopo idéntico a un epítopo de un anticuerpo anti-CAPRINA-1. En el presente documento, el término “epítopo” se refiere a un fragmento de polipéptido que tiene antigenicidad o inmunogenicidad en mamíferos y preferentemente en seres humanos. La unidad más pequeña del mismo consiste en aproximadamente 7 a 12 aminoácidos y preferentemente 8 a 11 aminoácidos.

7-18

La constante de afinidad Ka (kon/koff) de un anticuerpo de la presente invención es al menos de 10M, al menos 10

-18-19-19-110 -110 -1

M,almenos5x10M,almenos10M,almenos5x10M,almenos10M,almenos5x10M,al

11 -111 -112 -113 -1

menos10M,almenos5x10M,almenos10M,oalmenos10M.

Un anticuerpo de la presente invención se puede conjugar con un agente antitumoral. La unión entre un anticuerpo y un agente antitumoral se puede llevar a cabo por medio de un espaciador que tiene un grupo reactivo con un grupo amino, un grupo 2-piridiltio, un grupo maleimidilo, un grupo alcoxicarbonilo, o un grupo hidroxilo).

Ejemplos de agentes antitumorales incluye los siguientes agentes antitumorales conocidos en las referencias o similares: paclitaxel, doxorubicina, daunorrubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracilo, tiotepa, busulfán, improsulfán, piposulfán, benzodopa, carbocona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida, trimetilolomelamina, bullatacina, bullatacinona, camptotecina, briostatina, calistatina, criptoficina 1, criptoficina 8, dolastatinas, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictina, spongistatina, clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloruro óxido de mecloretamina, melfalán, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza uracilo, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, calicheamicina, danamicina, clodronato, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorbicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMYCIN, epirrubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicina, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridine, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona, aminoglutetimide, mitotano, trilostano, ácido frolínico, aceglatona, glucósidos de aldofosfamida, ácido aminolevulínico, eniluracilo, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diazicona, elfornitina, acetato de eliptinio, epotilona, etoglucida, lentinan, lonidamina, maitansina, ansamitocina, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarrubicina, losoxantrona, ácido podofilínico, 2etilhidrazida, procarbazina, razoxano, rizoxín, esquizofilán, espirogermanio, ácido tenuazónico, triazicona, roridina A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina, manomustina, mitobronitol, mitolactol, pipobromán, gacitosina, docetaxel, clorambucil, gemcitabina, 6-tioguanina, mercaptopurina, cisplatino, oxaliplatino, carboplatino, vinblastina, etopósido, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, noventona, tenipósido, edatrexato, daunomicina, aminopterina, xeloda, ibandronato, irinotecan, inhibidor de topoisomerasa, difluorometilornitina (DMFO), retinoic acid, capecitabina, y sales farmacéuticamente aceptables o derivados de los mismos.

De manera alternativa, también es posible unir un isótopo radioactivo tales como 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 175Lu, o 176Lu conocidos en las referencias y similares para un anticuerpo de la presente invención. Es deseable que tales isótopos radioactivos sean eficaces en el tratamiento o diagnóstico del tumor.

5 Un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo que tiene una reactividad inmunológica con la CAPRINA-1. Tal anticuerpo debería se r un anticuerpo que tenga una estructura que permita al sujeto animal al que se administra el anticuerpo que evite completamente o casi completamente una reacción de rechazo. Si el animal sujeto es un ser humano, los ejemplos de anticuerpos anteriores incluyen anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos (por ejemplo, anticuerpos quiméricos humano-ratón), cadenas simples de anticuerpos, y anticuerpos biespecíficos. Tal anticuerpo es un anticuerpo recombinante que tiene regiones variables de cadena pesada y regiones variables de cadena ligera derivadas de anticuerpos humanos, un anticuerpo recombinante que tiene regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada de anticuerpos recombinantes que consisten en regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) derivadas de un anticuerpo animal no

15 humano, y regiones de armazón derivadas de anticuerpos humanos, o un anticuerpo recombinante que tiene regiones variables de cadena ligera y cadena pesada derivadas de anticuerpos animales no humanos y regiones constantes de cadena pesada y cadena ligera derivadas de anticuerpos humanos. Los primeros dos anticuerpos son preferibles.

El anticuerpo recombinante anterior se puede producir de la manera descrita a continuación. Se clona el ADN que codifica un anticuerpo monoclonal contra la CAPRINA-1 humana (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal de ratón, un anticuerpo monoclonal de rata, un anticuerpo monoclonal de conejo, o un anticuerpo monoclonal de pollo) a partir de una célula productora de anticuerpos tal como un hibridoma. Se producen los ADN que codifican una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada del

25 anticuerpo or el método de RT-PCR o similar utilizando el clon obtenido como matriz. Luego, se determinan las secuencias de una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada o las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 por el sistema de numeración Kabat EU (Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)).

Además, se producen tales ADN que codifican regiones variables o los ADN que codifican las CDR por una técnica recombinante genética (Sambrook y col., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) o en un sintetizador de ADN. Aquí, se puede producir el hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal humano anterior inmunizando un animal que produce anticuerpos humanos (por ejemplo, un ratón) con CAPRINA-1 humana y fusionando esplenocitos de los bazos retirados del animal con células de mieloma. Además

35 de lo anterior, si es necesario, los ADN que codifican regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpos humanos se producen por técnicas recombinantes genéticas o un sintetizador de ADN.

En el caso de un anticuerpo humanizado, se produce un ADN en el que se han sustituido las secuencias que codifican CDR en un ADN que codifica una región variable de cadena pesada o cadena ligera derivada de un anticuerpo humano por las secuencias de CDR correspondientes de un anticuerpo de un animal no humano (por ejemplo, un ratón, una rata, o un pollo). El ADN obtenido anteriormente se une a una cadena pesada o ligera derivada de un anticuerpo humano. Por lo tanto, se puede producir un ADN que codifica un anticuerpo humanizado.

En el caso de un anticuerpo quimérico, el ADN que codifica una región variable de cadena pesada o cadena ligera

45 de un anticuerpo de un animal no humano (por ejemplo, un ratón, una rata, o un pollo) se une al ADN que codifica una región constante de cadena ligera o cadena pesada de un anticuerpo humano. Por lo tanto, se puede producir el ADN que codifica un anticuerpo quimérico.

Un anticuerpo monocatenario es un anticuerpo en el que la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera están unidas linealmente una a otra por medio de un enlazador. El ADN que codifica un anticuerpo monocatenario se puede producir uniendo el ADN que codifica una región variable de cadena pesada, un ADN que codifica un enlazador, y un ADN que codifica una región variable de cadena ligera. Aquí, la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera son de un anticuerpo humano o son de un anticuerpo humano en el que solo se han sustituido las CDR por CDR de un anticuerpo de un animal no humano (por ejemplo, un ratón,

55 una rata, o un pollo). Además, el enlazador consiste en 12 a 19 aminoácidos. Un ejemplo del mismo es (G4S)3 que consiste en 15 aminoácidos (G. B. Kim y col., Protein Engineering Design and Selection 2007, 20 (9): 425-432).

Un anticuerpo biespecífico (diacuerpo) es un anticuerpo capaz de unirse específicamente a dos epítopos diferentes en el que, por ejemplo, el ADN que codifica una región variable de cadena pesada A, el ADN que codifica la región variable de cadena ligera B y el ADN que codifica una región variable de cadena pesada B, y el ADN que codifica una región variable de cadena ligera A están unidos entre ellos en tal orden (siempre y cuando el ADN que codifica una región variable de cadena ligera B y el ADN que codifica una región de cadena pesada B están unidos entre ellos por medio de una ADN que codifique un enlazador como se ha descrito anteriormente). Por tanto, el ADN que codifica un anticuerpo biespecífico se puede producir. Aquí, tanto la región variable de cadena pesada y región

65 variable de cadena ligera son de un anticuerpo humano o son de un anticuerpo humano en el que solo se han sustituido las CDR por CDR de un anticuerpo de un animal no humano (por ejemplo, un ratón, una rata, o un pollo).

El ADN recombinante producido de la manera anterior se incorpora en un o una pluralidad de vectores. Cada uno de tales vectores se introduce en una célula huésped (por ejemplo, una célula de mamífero, una célula de levadura, o una célula de insecto) para la (co)expresión. De esta manera se puede producir un anticuerpo recombinante (P. J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P. Shepherd y C. Dean., Monoclonal

5 Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; J. W. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice., 1993 ACADEMIC PRESS).

Ejemplos de un anticuerpo de la presente invención por el método anterior incluye los siguientes anticuerpos (a) a (k).

(a) Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en las SEC ID Nº 40, 41, y 42 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias que se muestran en SEC ID Nº 44, 45, y 46 (preferentemente un anticuerpo compuesto de una región variable de cadena pesada de la SEC ID Nº 43 y una región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 47).

15 (b) Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 40, 41, y 42 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en las SEC ID Nº 50, 51, y 52 (preferentemente un anticuerpo compuesto por una región variable de cadena pesada de la SEC ID Nº 43 y una región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 53).

(c): Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 40, 41, y 42 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 55, 56, y 57 (y preferentemente un anticuerpo compuesto por una región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 43 y una región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 58).

(d): Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 40, 41, y 42 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias

25 que se muestran en las SEC ID Nº 60, 61, y 62 (y preferentemente un anticuerpo compuesto por una región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 43 y una región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 63).

(e): Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 40, 41, y 42 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias que se muestran en las 65, 66, y 67 (y preferentemente un anticuerpo compuesto por una región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 43 y una región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 68).

(f): Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 70, 71, y 72 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 74, 75, y 76 (y preferentemente un anticuerpo compuesto por una región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 73 y una región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 77).

35 (g) Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 80, 81, y 82 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 84, 85, y 86 (y preferentemente un anticuerpo compuesto por una región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 83 y una región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 87).

(h): Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 90, 91, y 92 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 94, 95, y 96 (y preferentemente un anticuerpo compuesto por una región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 93 y una región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 97).

(i): Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 100, 101, y 102 y una región variable de cadena ligera que comprende las

45 secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 104, 105, y 106 (y preferentemente un anticuerpo compuesto por una región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 103 y una región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 107).

(j): Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 110, 111, y 112 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 114, 115, y 116 (y preferentemente un anticuerpo compuesto por una región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 113y una región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 117).

(k): Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 120, 121, y 122 y una región variable de cadena ligera que comprende las

55 secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 124, 125, y 126 (y preferentemente un anticuerpo compuesto por una región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 123 y una región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 127).

Aquí, las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEC ID Nº 40, 41, y 42, las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEC ID Nº 70, 71, y 72, las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEC ID Nº 80, 81, y 82, las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEC ID Nº 90, 91, y 92, las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEC ID Nº 100, 101, y 102, las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEC ID Nº 110, 111, y 112, o las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEC ID Nº 120, 121, y 122 corresponden a las CDR1, CDR2, y CDR3 de las regiones variables de cadena pesada de un 65 anticuerpo de ratón, respectivamente. Además, las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEC ID Nº 44, 45, y 46, las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEC ID Nº 50, 51, y 52, las secuencias de

aminoácidos que se muestran en las SEC ID Nº 55, 56, y 57, las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEC ID Nº 60, 61, y 62, las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEC ID Nº 65, 66, y 67, las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEC ID Nº 74, 75, y 76, las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEC ID Nº 84, 85, y 86, las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEC ID Nº 94, 95, y

5 96, las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEC ID Nº 104, 105, y 106, las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEC ID Nº 114, 115, y 116, o las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEC ID Nº 124, 125, y 126 corresponden a la CDR1, CDR2, y CDR3 de las regiones variables de cadena ligera de un anticuerpo de ratón, respectivamente.

Además, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monocatenario, o un anticuerpo biespecífico de la presente invención es, por ejemplo el siguiente anticuerpo (i) o (ii) (un ejemplo de anticuerpo (a) se describe más adelante).

(i) Un anticuerpo que comprende: una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de

15 aminoácidos SEC ID Nº 40, 41, y 42 y una secuencia de aminoácidos de una región de armazón derivada de un anticuerpo humano; y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 44, 45, y 46 y secuencias de aminoácidos de regiones de armazón derivadas de anticuerpo humano (y preferentemente un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 43 en una región variable de cadena pesada y la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 47 en una región variable de cadena ligera).

(ii) Un anticuerpo que comprende: una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 40, 41, y 42 y una secuencia de aminoácidos de regiones de armazón derivadas de un anticuerpo humano; una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de un anticuerpo humano; una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de

25 aminoácidos SEC ID Nº 44, 45, y 46 y secuencias de aminoácidos de regiones de armazón derivadas de anticuerpo humano; y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de un anticuerpo humano (y preferentemente un anticuerpo que comprende: una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 43; una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de un anticuerpo humano; una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 47; y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de un anticuerpo humano).

Además, las secuencias de la región constante y variable de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo humano se pueden obtener por ejemplo en NCBI (U.S.A: GenBank, UniGene, etc.). Por ejemplo, se pueden utilizar las

35 siguientes secuencias como secuencias de referencia para las regiones correspondientes: la secuencia con nº de registro J00228 para una región constante de cadena pesada de; la secuencia con nº de registro IgG1 humana J00230 para la región constante de cadena pesada de IgG2 humana; la secuencia con nº de registro X03604 para la región constante de cadena pesada de IgG3 humana; la secuencia con nº de registro K01316 para la región constante de cadena pesada de IgG4; la secuencia con nº de registro V00557, X64135, o X64133 para la región constante de la cadena ligera κ humana; y la secuencia con nº de registro X64132 o X64134 para una región constante de la cadena ligera λ.

Los anticuerpos anteriores tienen preferentemente una actividad citotóxica, de manera que muestran efectos antitumorales.

45 Además, las secuencias específicas anteriores de regiones variables de cadena ligera y cadena pesada y las CDR de un anticuerpo se describen meramente para ejemplificar. Es obvio que la presente invención no se limita a secuencias particulares. Se produce un hibridoma capaz de producir diferentes anticuerpos humanos y anticuerpos de animales no humanos (por ejemplo, un anticuerpo de ratón) contra la CAPRINA-1. Se recolecta un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma. Entonces se determina si el anticuerpo obtenido es un anticuerpo de interés

o no utilizando, como indicadores, la actividad de unión y actividad citotóxica con respecto a la CAPRINA-1 humana. De esta manera se identifica el hibridoma de interés que produce anticuerpo monoclonal. A partir de entonces, como se ha descrito anteriormente, se producen los ADN que codifican las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo de interés a partir del hibridoma por determinación de secuencia. Los ADN se utilizan para la

55 producción de diferentes anticuerpos.

Además, el anticuerpo anterior de la presente invención puede ser cualquiera de los anticuerpo (i) a (iv) anteriores que tienen una sustitución, eliminación o adición de uno o varios (y preferentemente de 1 o 2) aminoácidos, particularmente en una secuencia de armazón y/o secuencia de región constante, siempre y cuando tenga la propiedad específica o reconozca específicamente la CAPRINA-1. En el presente documento la expresión “varios aminoácidos” indica de 2 a 5 y preferentemente 2 o 3 aminoácidos.

Además, de acuerdo con la presente invención, el ADN que codifica el anticuerpo anterior de la presente invención, se proporciona el ADN que codifica la cadena pesada o la cadena ligera del anticuerpo, o el ADN que codifica la 65 región variable de cadena pesada o cadena ligera del anticuerpo. Por ejemplo, en el caso del anticuerpo (a), ejemplos de tales ADN incluyen: el ADN que codifica una región variable de cadena pesada que comprende las

secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 40, 41, y, 42; y el ADN que codifica una región variable de cadena ligera que comprende secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 44, 45, y 46.

Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) codificadas por los ADN de las secuencias anteriores son las regiones que determinan la especificidad del anticuerpo. Por lo tanto, las secuencias que codifican las otras regiones (es decir, las regiones constantes y las regiones de armazón) en un anticuerpo pueden ser secuencias de un anticuerpo diferente. En el presente documento, diferentes anticuerpos incluyen anticuerpos de organismos no humanos. Sin embargo, con el fin de la reducción de efectos secundarios, son preferibles los anticuerpos derivados de seres humanos. Esto quiere decir, en el caso anterior, que las regiones que codifican regiones de armazón y regiones constantes de cadenas pesada y ligera comprenden preferentemente secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos relevantes de un anticuerpo humano.

Además, los diferentes ejemplos de un ADN que codifica un anticuerpo de la presente invención, tal como el anticuerpo (a), incluyen el ADN que codifica una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 43 y un ADN en el que una región que codifica una región variable de cadena ligera comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 47. En el presente documento, un ejemplo de una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 43 es la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 48. Además, un ejemplo de una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 47 es la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 49.También, los ADN anteriores que codifican las regiones constantes de cadena pesada y cadena ligera comprenden preferentemente las secuencias de nucleótidos que codifican las correspondientes secuencias de aminoácidos derivadas de un anticuerpo humano.

El ADN de la presente invención se puede obtener, por ejemplo, or los métodos mencionados anteriormente o los siguientes métodos. Primero, se prepara el ARN total a partir de un hibridoma para un anticuerpo de la presente invención utilizando un kit de extracción de ARN disponible comercialmente. Luego, se sintetiza el ADNc con una transcriptasa inversa utilizando cebadores aleatorios y similares. A continuación, el ADNc que codifica un anticuerpo se amplifica por un método PCR utilizando, como cebadores, oligonucleótidos que tienen las secuencias conservadas en las regiones variables de genes de cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo de ratón. Las secuencias que codifican las regiones constantes se pueden obtener amplificando secuencias conocidas por un método PCR. La secuencia de nucleótidos de ADN se puede determinar por un método general que implica, por ejemplo, la incorporación en un plásmido o un fago para la determinación de la secuencia.

Se cree que los efectos antitumorales de un anticuerpo anti-CAPRINA-1 utilizado en la invención en las células cancerosas que expresan CAPRINA-1 se muestran por mecanismos de citotoxicidades que se describen más adelante. Las citotoxicidades son citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo mediada por efectores celulares (ADCC) contra células que expresan CAPRINA-1 y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) contra células que expresan CAPRINA-1.

En consecuencia, la actividad de un anticuerpo anti-CAPRINA-1 que se utiliza en la presente invención se puede evaluar ex vivo por medio de determinación de la actividad ADCC o la actividad CDC contra las células cancerosas que expresan CAPRINA-1 como se describe específicamente en los Ejemplos mencionados más adelante.

Un anticuerpo anti-CAPRINA-1 que se usa en la presente invención se une a la proteína CAPRINA-1 en una célula cancerosa y muestra efectos antitumorales basándose en la actividad mencionada anteriormente. Por lo tanto, se cree que tal anticuerpo es útil para el tratamiento o prevención del cáncer. Específicamente, de acuerdo con la presente invención, se proporciona la composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención del cáncer que comprende, como principio activo, un anticuerpo anti-CAPRINA-1. Cuando se utiliza un anticuerpo anti-CAPRINA-1 con el fin de administrar un anticuerpo a seres humanos (tratamiento con anticuerpos), se usa preferentemente en forma de anticuerpo humano o anticuerpo humanizado con el fin de reducir la inmunogenicidad.

Además, cuanto mayor es la afinidad de unión entre un anticuerpo anti-CAPRINA-1 y la proteína CAPRINA-1 de la superficie de células cancerosas más fuerte es la actividad antitumoral que puede mostrar un anticuerpo anti-CAPRINA-1. Por lo tanto, si se puede obtener un anticuerpo anti-CAPRINA-1 que tenga una alta afinidad de unión para una proteína CAPRINA-1, se puede esperar que muestre efectos antitumorales incluso más fuertes. En consecuencia, es posible utilizar tal anticuerpo como una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención del cáncer. Como se ha descrito anteriormente, para la alta afinidad de unión, la constante de afinidad

7-18-18-19-1

Ka (konkoff) es preferentemente al menos de 10M, al menos 10M, al menos 5 x 10M, al menos 10M, al

9-110 -110 -111 -111 -112

menos5x10M,almenos10M,almenos5x10M,almenos10M,almenos5x10M,almenos10

-113 -1

M,oalmenos10M.

Unión a las células de expresión antigénica

La capacidad de un anticuerpo para unirse a la CAPRINA-1 se puede especificar por medio del ensayo de unión, por ejemplo, ELISA, un método de transferencia de Western, inmunofluorescencia, o análisis de citometría de flujo como se describe en los Ejemplos.

5 Tinción inmunohistoquímica

Se puede ensayar un anticuerpo que reconoce la CAPRINA-1 en términos de reactividad con la CAPRINA-1 por un método inmunohistoquímico conocido por los expertos en la técnica utilizando una sección congelada de tejido fijada con paraformaldehído o acetona o una sección embebida en parafina fijada con paraformaldehído. Tal sección se

10 prepara a partir de un paciente durante una cirugía o de un animal que lleva un tejido de xenoinjerto que se ha inoculado con una célula natural o una línea celular transfectada que expresa CAPRINA-1.

Para la tinción inmunohistoquímica, un anticuerpo reactivo contra la CAPRINA-1 se puede teñir por varios métodos. Por ejemplo, se puede visualizar reaccionando con anticuerpos anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de 15 rábano rusticano o con un anticuerpo anti-conejo de cabra.

Composición farmacéutica

Una diana de la composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención del cáncer de la presente invención no 20 se limita particularmente mientras que la diana sea un cáncer (una célula) que exprese el gen de la CAPRINA-1.

Ambos términos “tumor” y “cáncer” se utilizan en el presente documento para referirse a una neoplasia maligna, y por lo tanto se utilizan de manera intercambiable.

25 Un cáncer que puede ser una diana en la presente invención es un cáncer que expresa un gen que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEC ID Nº 2 a 30 pares o una parte de la secuencia que consiste en 7 o más aminoácidos consecutivos de dicha secuencia de aminoácidos. Los ejemplos preferidos de los mismos incluyen el cáncer de mama, tumor cerebral, leucemia, cáncer de pulmón, linfoma, mastocitoma, cáncer de esófago, y cáncer de colon.

30 Ejemplos de estos cánceres incluyen, pero no se limitan a estos, adenocarcinoma de mama, adenocarcinoma de mama tipo compuesto, tumor mixto maligno mamario, adenocarcinoma papilar intraductal, adenocarcinoma pulmonar, cáncer de células escamosas, cáncer de células pequeñas, cáncer de células grandes, glioma que es un tumor del tejido neuroepitelial, ependimoma, tumor neuronal, tumor embrionario neuroectodérmico, schwanoma,

35 neurofibroma, meningioma, leucemia linfocítica crónica, linfoma, linfoma gastrointestinal, linfoma digestivo, linfoma de células pequeñas a células medianas, cáncer cecal, cáncer de colon ascendente, cáncer de colon descendente, cáncer de colon transverso, cáncer de colon sigmoideo, y cáncer rectal.

Además, el sujeto animal de la presente invención es un mamífero. Ejemplos de los mismos incluyen mamíferos 40 tales como primates, animales de compañía, animales de granja y animales deportivos. Se prefieren particularmente, seres humanos, perros, y gatos.

Cunado un anticuerpo que se usa en la presente invención se utiliza en una composición farmacéutica, se puede formular por un método conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar por vía parenteral en 45 forma de inyección parenteral de: una solución aséptica que comprende agua o una solución no acuosa farmacológicamente aceptable; o un líquido en suspensión. Por ejemplo, en un caos posible se puede formular con el uso combinado de un vehículo o medio farmacológicamente aceptable y específicamente, agua esterilizada, solución salina fisiológica, aceite vegetal, un emulsionante, una suspensión, un tensioactivo, un estabilizante, un agente saborizante, un excipiente, un vehículo, un conservante, o un aglutinante de una manera apropiada

50 mezclando en una forma de unidad de dosificación que se necesita para una formulación farmacéutica generalmente aceptable. La cantidad de un principio activo en una formulación se determina tal que se alcance una dosificación apropiada en el intervalo indicado.

Una composición aséptica para una inyección se puede formular según la práctica general de formulación utilizando 55 un vehículo tal como agua destilada para inyección.

Ejemplos de una solución acuosa para inyección incluye solución salina fisiológica y soluciones isotónicas que comprenden glucosa y otros adyuvantes tales como el D-sorbitol, D-manosa, D-manitol, y cloruro sódico. Tal solución se puede utilizar como una ayuda apropiada para la disolución. Ejemplos de tal ayuda a la disolución

60 incluye los alcoholes tales como etanol y polialcohol, propilenglicol, polietilenglicol, y tensioactivos no iónicos tales como polisorbato 80 ™ y HCO-60.

Ejemplos de líquidos oleosos incluyen el aceite de soja y el aceite de sésamo. Tal líquido oleoso se puede utilizar en combinación con un auxiliar de disolución tal como el bencil benzoato o alcohol bencílico. Además se pueden 65 mezclar con un agente tamponante tal como una solución tampón de fosfato, una solución tampón de acetato

sódico, un agente de inyección tal como hidrocloruro de procaína, un estabilizante tal como el alcohol bencílico, fenol, o un antioxidante. En general, una solución formulada para inyección se introduce en una ampolla adecuada.

La composición farmacéutica anterior se administra por vía parenteral o por vía oral. Preferentemente, se administra

5 por vía parenteral. Ejemplo específicos de formas de dosificación incluyen agentes inyectables, agentes administrados por vía intranasal, agentes administrados por vía transpulmonar, y agentes que se administran por vía percutánea. Por ejemplo, se pueden administrar agente inyectables localmente o sistémicamente por medio de inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, o inyección subcutánea.

10 Además, el método de administración se puede determinar apropiadamente dependiendo de la edad, el peso, género, y síntomas del paciente. Una dosis única de una composición farmacéutica comprende un anticuerpo o un polinucleótido que codifica un anticuerpo que se puede seleccionar en un intervalo de, por ejemplo 0,0001 mg a

1.000 mg por kg de peso corporal. De manera alternativa, la dosis se puede seleccionar en un intervalo de, por ejemplo, 0,001 a 100.000 mg por paciente; sin embargo no se limitan a este necesariamente. La dosis y el método

15 de administración se cambian dependiendo de la edad del paciente, el peso, género, y síntomas. Sin embargo, los expertos en la técnica pueden seleccionar apropiadamente la dosis y el método.

Polipéptido y ADN

20 Según la presente invención, se proporcionan además los siguientes polipéptidos y ADN para los anticuerpos (a) a

(k) descritos anteriormente.

(i) Un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 43, SEC ID Nº 73, SEC ID Nº 83, SEC ID Nº 93, SEC ID Nº 103, SEC ID Nº 113, y SEC ID Nº 123, y el ADN que codifica el polipéptido.

25 (ii) Un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 47, SEC ID Nº 53, SEC ID Nº 58, SEC ID Nº 63, SEC ID Nº 68, SEC ID Nº 77, SEC ID Nº 87, SEC ID Nº 97, SEC ID Nº 107, SEC ID Nº 117, y SEC ID Nº 127, y el ADN que codifica el polipéptido.

(iii) Un ADN que comprende las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº 48, SEC ID Nº 78, SEC ID Nº 88, SEC ID Nº 98, SEC ID Nº 108, SEC ID Nº 118, y SEC ID Nº 128.

30 (iv) Un ADN que comprende las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº 49, SEC ID Nº 54, SEC ID Nº 59, SEC ID Nº 64, SEC ID Nº 69, SEC ID Nº 79, SEC ID Nº 89, SEC ID Nº 99, SEC ID Nº 109, SEC ID Nº 119, y SEC ID Nº

129.

(v) Un polipéptido CDR de cadena pesada que comprende secuencias de aminoácidos seleccionadas de entre el grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 40, 41, y 42, las secuencias de aminoácidos

35 SEC ID Nº 70, 71, y 72, las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 80, 81, y 82, las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 90, 91, y 92, las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 100, 101, y 102, las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 110, 111, y 112, y las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 120, 121, y 122, y el ADN que codifica el polipéptido.

(vi) Un polipéptido CDR de cadena ligera que comprende secuencias de aminoácidos seleccionades de entre el

40 grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 44, 45, y 46, las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 50, 51, y 52, las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 55, 56, y 57, las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 60, 61, y 62, las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 65, 66, y 67, las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 74, 75, y 76, las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 84, 85, y 86, las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 94, 95, y 96, las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 104, 105, y 106, las secuencias de

45 aminoácidos SEC ID Nº 114, 115, y 116, y las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 124, 125, y 126, y el ADN que codifica el polipéptido.

Estos polipéptidos y ADN pueden producirse por una técnica recombinante genética como se ha descrito anteriormente.

50 Ejemplos

La presente invención de aquí en adelante se describe con más detalle en referencia a los siguientes ejemplos, aunque el ámbito de la presente invención no se limita a los mismos. 55 Ejemplo1: Identificación de un nuevo antígeno proteico por el método SEREX

(1) Construcción de la biblioteca de ADN

60 Se extrajo el ARN total de un tejido testicular de un perro sano con el método ácido guanidio-Fenol-Cloroformo y luego se purificó una ARN poliA según los protocolos incluidos con un kit de purificación de ARNm Oligotex-dT30 (Takara Shuzo Co., Ltd.).

Se sintetizó una biblioteca de fagos ADNc de testículo canino utilizando el ARNm obtenido de esta manera (5 µg). La 65 biblioteca de fagos ADNc se construyó utilizando el Kit de síntesis de ADNc, un Kit de síntesis de ADNc ZAP, y un

Kit de ADNc-ZAP GigapackIII Gold Cloning Kit (STRATAGENE) según los protocolos incluidos en los kits. El tamaño de la biblioteca de fagos ADNc construida así era de 7,73 x 105 ufp/ml.

(2) Exploración de la biblioteca de ADNc utilizando suero

Se llevó a cabo la inmunoexploración utilizando la biblioteca de fagos ADNc de testículo canino construida anteriormente. Específicamente, se infectó Escherichia coli (XL-1-BlueMRF’) huésped con el fago en una placa agarosa NZY (Φ 90 x 15 mm) de forma que se obtienen 2210 clones. Las células de E. coli se cultivaron a 42 ºC durante 3 a 4 horas hasta formación de placas. La placa se cubrió con una membrana de nitrocelulosa (Hybond C Extra: GE Healthcare Bio-Science) impregnada con IPTG (isopropil-β-D-tiogalactósido) a 37 ºC durante 4 horas, hasta que se induce, se expresa y se transfiere la proteína a la membrana. Posteriormente, la membrana se recoge y se sumerge en TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, y pH 7,5) que contiene un 0,5 % de leche desnatada en polvo, a continuación se deja una noche en agitación a 4 ºC, suprimiendo de esta manera una reacción no específica. El filtro se hizo reaccionar con suero diluido 500 veces de un paciente canino a temperatura ambiente durante 2 a 3 horas.

Como suero de paciente mencionado anteriormente, se utilizó suero recolectado de un paciente canino con cáncer de mama. Estos sueros se almacenaron a -80 ºC y luego se sometieron a un pretratamiento inmediatamente antes de su uso. Un método de pre-tratamiento es el siguiente. Específicamente, la Escherichia coli (XL-1-BlueMRF’) huésped se infectó con el fago λ ZAP Express en el que o se había insertado ningún gen ajeno y luego se cultivaron una noche en una placa con medio NZY a 37 ºC. Posteriormente, se añadió a la placa tampón (0,2 M NaHCO2 y pH 8,2) que contiene 0,5 M NaCl, la placa se dejó permanecer a 4 ºC durante 15 horas, y luego se recolectó el sobrenadante como un extracto Escherichia coli/fago. Luego el extracto Escherichia coli/fago se aplicó a una columna NHS (GE Healthcare Bio-Science), de forma que se inmovilizó una proteína derivada de Escherichia colifago. Se aplicó el suero de un paciente canino a la columna con la proteína inmovilizada para la reacción y luego se retiró del suero la Escherichia coli y un anticuerpo adsorbido al fago. La fracción de suero que había pasado a través de la columna se diluyó 500 veces con TBS que contenía un 0,5 % de leche desnatada en polvo. El resultado se utilizó como material de inmunoexploración.

La membrana en la que se había transferido el suero tratado y la proteína de fusión anterior que se había transferido se lavó cuatro veces con TBS-T (0,05 % Tween20/TBS) y luego se hizo reaccionar con IgG de cabra anti-perro (IgGh+I HRP de cabra anti-perro conjugada (BETHYL Laboratories)) diluido 5000 veces con TBS que contenía un 0,5 % de leche desnatada en polvo como anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente. Se llevó a cabo la detección por medio de una reacción de coloración enzimática utilizando una solución NBT/BCIP (Roche). Las colonias que coincidían con sitios positivos para la reacción de coloración se recolectaron de la placa de agarosa NZY (Φ 90 x 15 mm) y después se destruyeron en 500 µl de un tampón SM (100 mM de NaCl, 10 mM de MgClSO4, 50 mM Tris-HCl, 0,01 % de gelatina, y pH 7,5). Hasta que se unificaron las colonias positivas a la reacción de coloración, se repitieron, exploraciones secundarias y exploraciones terciarias de forma que se seleccionaron 30.940 clones fagos que reaccionaban con IgG del suero por un método similar al anterior. De esta forma, se aislaron 5 clones positivos.

(3) Búsqueda de homología del gen de antígeno aislado

Para el análisis de secuencia de nucleótidos de los 5 clones positivos aislados por el método anterior, se llevó a cabo un procedimiento para la conversión de los fagos vectores a plásmidos vectores. Específicamente, se prepararon 200 µl de una solución que contenía Escherichia coli (XL-1-BlueMRF’) huésped de forma que la absorbancia a DO600 era 1,0. La solución se mezcló con 250 µl de solución de fago purificado y luego con 1 µl de un fago auxiliar ExAssist (STRATAGENE), seguido por 15 minutos de reacción a 37 ºC. Se añadieron tres (3) ml de medio LB y luego se llevó a cabo un cultivo a 37 ºC durante 2,5 a 3 horas. Inmediatamente después del cultivo, la temperatura del cultivo se mantuvo a 70 ºC en baño de agua durante 20 minutos, se llevó a cabo la centrifugación a 4 ºC y 1000 x g durante 15 minutos, y luego se recolectó el sobrenadante como una solución fagémida. Posteriormente se prepararon 200 µl de una solución que contenía la Escherichia coli fagémida (SOLR) de forma que la absorbancia a una DO600 era 1,0. La solución se mezcló con 10 µl de una solución purificada de fagos, seguido por una reacción durante 15 minutos a 37 ºC. La solución (50 µl) se sembró sobre medio LB agar que contenía ampicilina (concentración final de 50 µg/ml) y se cultivó durante una noche a 37 ºC. La única colonia SOLR transformada se recolectó y luego se cultivó en medio LB que contenía ampicilina (concentración final: 50 µg/ml) a 37 ºC. Se purificó un plásmido ADN que contenía la inserción de interés utilizando un kit QIAGEN plasmid Miniprep (QIAGEN).

El plásmido purificado se sometió a un análisis de la secuencia insertada de longitud completa por un método de cebador en avance utilizando un cebador T3 con la SEC ID Nº 31 y el cebador T7 con la SEC ID Nº 32. Como resultado del análisis de secuencia, se obtuvieron las secuencias genéticas SEC ID Nº 5, 7, 9, 11, y 13. Se llevó a cabo un programa de búsqueda de homología BLAST search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), utilizando las secuencias de nucleótidos de los genes y las secuencias de aminoácidos correspondientes (SEC ID Nº 6, 8, 10, 12, y 14). Como resultado de la búsqueda de homología con genes conocidos, se reveló que todos los 5 genes

obtenidos codificaban CAPRINA-1. Con respecto a las regiones que se traducen en proteínas, la identidad de secuencias entre los 5 genes era del 100 % en términos de secuencia de nucleótidos y del 99 % en términos de secuencias de aminoácidos. También, con respecto a las regiones que se traducen en proteínas, la identidad de secuencia entre los genes y los genes que codificaban factores humanos homólogos de estos (homólogos humanos) era de 94 % en términos de secuencia de nucleótidos y del 98 % en términos de secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos de los homólogos humanos se muestran en las SEC ID Nº 1 y 3 y las secuencias de aminoácidos de los mismos se muestran en las SEC ID Nº 2 y 4. También con respecto a las regiones que se traducen en proteínas, la identidad de secuencia entre los genes así obtenidos y un gen que codifica un homólogo bovino rea del 94 % en términos de secuencia de nucleótidos y del 97 % en términos de secuencias de aminoácidos. La secuencia de nucleótidos del homólogo bovino se muestra en la SEC ID Nº 15 y la secuencia de aminoácidos del mismo se muestra en la SEC ID Nº 16. Además, con respecto a las regiones que se traducen en proteínas la identidad de secuencia entre los genes que codifican homólogos humanos y el gen que codifica el homólogo humano era del 94 % en términos de secuencia de nucleótidos y variaba entre el 93 % y el 97 % en términos de secuencia de aminoácidos. También, con respecto en las regiones que se traducen en proteínas, la identidad de secuencia de los genes caninos obtenidos y un gen que codifica un homólogo equino era del 93 % en términos de secuencia de nucleótidos y del 97 % en términos de secuencia de aminoácidos. La secuencia de nucleótidos del homólogo equino se muestra en la SEC ID Nº 17 y la secuencia de aminoácidos del mismo se muestra en la SEC ID Nº 18. Además, con respecto a las regiones que se traducen en proteínas, la identidad de secuencia entre los genes que codifican homólogos humanos y el gen que codifica el homólogo equino era del 93 % en términos de secuencia de nucleótidos y del 96 % en términos de secuencia de aminoácidos. También, con respecto a las regiones que se traducen en proteínas, la identidad de secuencia entre los genes caninos obtenidos y los genes que codifican homólogos de ratón variaba entre el 87 % y el 89 % en términos de secuencia de nucleótidos y variaba entre el 95 % y el 97 % en términos de secuencia de aminoácidos. Las secuencias de aminoácidos de los homólogos de ratón se muestran en las SEC ID Nº 19, 21, 23, 25, y 27 y las secuencias de aminoácidos de los mismos se muestran en las SEC ID Nº 20, 22, 24, 26, y 28. Además, con respecto a las regiones que se traducen en proteínas, la identidad de secuencia entre los genes que codifican los homólogos humanos y los genes que codifican los homólogos de ratón varían entre el 89 % y el 91 % en términos de secuencia de nucleótidos y variaba entre el 95 % y el 96 % en términos de secuencia de aminoácidos. También, con respecto a las regiones que se traducen en proteínas, la identidad de secuencia entre los genes caninos obtenidos y un gen que codifica un homólogo de pollo era del 82 % en términos de secuencia de nucleótidos y del 87 % en términos de secuencia de aminoácidos. La secuencia de nucleótidos del homólogo de pollo se muestra en la SEC ID Nº 29 y la secuencia de aminoácidos del mismo se muestra en la SEC ID Nº 30. Además, con respecto a las regiones que se traducen en proteínas, la identidad de secuencia entre los genes que codifican homólogos humanos y el gen que codifica el homólogo de pollo varía del 81 % al 82 % en términos de secuencia de nucleótidos y era del 86 % en términos de secuencia de aminoácidos.

(4) Análisis de expresión genética en cada tejido

Se examinó por un método RT-PCR la expresión de los genes obtenida por el método anterior en tejidos normales caninos y humanos y varias líneas celulares. La reacción de transcripción inversa se llevó a cabo de la siguiente manera. Específicamente, se extrajo el ARN total de cada tejido (50 mg a 100 mg) y cada línea celular (5 a 10 x 106 células) utilizando un reactivo TRIZOL (Invitrogen) según los protocolos incluidos en el mismo. Se sintetizó el ADNc utilizando el ARN total en el Sistema de Síntesis para RT-PCR de primera cadena Superscript (Invitrogen) según los protocolos incluidos en el mismo. Se llevó a cabo la PCR de la manera siguiente utilizando cebadores específicos para los genes obtenidos (SEC ID Nº 33 y 34).Específicamente, se llevó a cabo la PCR repitiendo 30 veces un ciclo de 94 ºC/30 segundos, 60 ºC/30 segundos, y 72 ºC/30 segundos utilizando un Thermal Cycler (BIO RAD) y una solución de reacción ajustada a una cantidad total de 25 µl por medio de la adición de cada reactivo y un tampón añadido (0,25 µl de una muestra preparada por reacción de transcripción inversa, los cebadores anteriores (2 µM cada uno), dNTP (0,2 mM), y 0,65 U de polimerasa ExTaq (Takara Shuzo)). Además, se utilizaron los cebadores específicos de gen mencionados anteriormente para amplificar la región entre el nucleótido número 206 y el número de nucleótido 632 de la secuencia de nucleótidos (gen CAPRINA-1 canino) SEC ID Nº 5 y la región entre el nucleótido número 698 y el nucleótido número 1124 de la secuencia de nucleótidos (gen CAPRINA-1 humano) SEC ID Nº 1. Para control de comparación, se utilizaron al mismo tiempo, cebadores específicos de GAPDH (SEC ID Nº 35 y 36). Como resultado, como se muestra en la Fig. 1, se observó una fuerte expresión en los tejidos testiculares en el caso de tejidos caninos sanos, mientras que se observó expresión en cáncer de mama canino y tejidos de adenocarcinoma. Además, se confirmó también la expresión de los homólogos humanos a los genes obtenidos. Como resultado, al igual que en el caso de los genes CAPRINA-1 caninos, la expresión se podía confirmar solo en los tejidos testiculares en al caso de tejidos normales. Sin embargo, en el caso de células cancerosas la expresión se detectaba en muchos tipos de líneas celulares tumorales, tales como líneas celulares de cáncer de mama, tumor cerebral, leucemia, cáncer de pulmón, y cáncer de esófago. Se confirmó expresión en un número particularmente grande de líneas celulares de cáncer de mama. Basándose en estos resultados, se confirmó que la expresión de CAPRINA-1 no se observaba en tejidos normales distintos de los testiculares mientras que se expresaba CAPRINA1 en muchas células cancerosas y particularmente en líneas celulares de cáncer de mama.

Además, en la Fig. 1, Referencia nº 1 en el eje longitudinal indica el patrón de expresión de cada uno de los genes identificados anteriormente y la Referencia nº 2 a lo largo del mismo indica el patrón de expresión del gen GAPDH para el control de comparación.

(5): Preparación del anticuerpo policlonal contra el péptido derivado de CAPRINA-1

Para obtener un anticuerpo que se una a CAPRINA-1, se sintetizó un péptido derivado de CAPRINA-1 (Arg-Asn-Leu-Glu-Lys-Lys-Lys-Gly-Lys-Leu-Asp-Asp-Tyr-Gln (SEC ID Nº 37)). Se mezcló el péptido (1 mg) como antígeno con solución de adyuvante incompleto de Freund (IFA) en una cantidad equivalente al péptido. Se administró la mezcla a un conejo por vía subcutánea 4 veces cada dos semanas. Posteriormente se recolectó sangre, de forma que se obtuvo un antisuero que contenía un anticuerpo policlonal. Además, el antisuero se purificó utilizando un soporte de proteína G (GE Healthcare Bio-Sciences) y luego se obtuvo un anticuerpo policlonal contra el péptido derivado de la CAPRINA-1. Además, se designó como anticuerpo control un anticuerpo obtenido por purificación des suero de conejos a los que no se había administrado antígeno con el uso de un soporte de proteína G de la manera descrita anteriormente.

(6): Análisis de expresión del antígeno proteico en células cancerosas

A continuación, se examinó si la proteína CAPRINA-1 se expresaba o no en las superficies celulares de 7 tipos de líneas celulares de cáncer de mama (MDA-MB-157, T47D, MRK-nu-1, MDA-MB-231V, BT20, SK-BR-3, y MDA-MB231T) en los que la expresión del gen CAPRINA-1 se ha confirmado fuertemente. Cada una de las líneas celulares de cáncer de mama humano en las que se confirmó la expresión genética (106 células) como se describió anteriormente se centrifugó en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Se añadió al mismo el anticuerpo policlonal contra el péptido derivado de CAPRINA-1 (2 µg) (5 µl) preparada en el punto anterior (5). El resultado se suspendió además en PBS que contenía un 0,1 % de suero fetal bovino (95 µl) y luego se dejó estar en hielo durante 1 hora. Después de lavar con PBS, se suspendió el resultado en PBS que contenía anticuerpo IgG de cabra anti-conejo marcado con FITC (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) (5 µl) y 0,1 % de suero fetal bovino (FBS) (95 µl) y se dejaron estar en hielo durante 1 hora. Después de lavar con PBS se midió la intensidad utilizando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Al mismo tiempo, se llevó a cabo un procedimiento similar al anterior utilizando un anticuerpo control preparado en el punto anterior (5) en vez el anticuerpo policlonal contra un péptido derivado de CAPRINA-1, de esta forma se preparó el control. Como resultado, la intensidad de fluorescencia se encontró que era al menos un 30 % más fuerte en todas las células contra las que se había añadido el anticuerpo anti-CAPRINA-1 humana que en las células control. Específicamente, se confirmaron los siguientes aumentos de intensidad de fluorescencia: MDA-MB-157: 184 %; T47D: 221 %; MRK-nu-1: 115 %; MDA-MB-231V: 82 %; BT20: 32 %; SK-BR-3: 279 %; y MDA-MB-231T: 80 %. Basándose en lo anterior, se confirmó que la proteína CAPRINA-1 se expresaba en las superficies celulares de las líneas celulares de cáncer humano anteriores. Además, la tasa de aumento en la intensidad de fluorescencia se representa por la tasa de aumento en la intensidad de fluorescencia media (valor MFI) en las células. Se calculó por la siguiente ecuación.

La tasa de aumento de la intensidad de fluorescencia media (tasa de aumento de intensidad de fluorescencia) (%) = ((valor MFI de las células que se hacen reaccionar con anticuerpo anti-CAPRINA-1 humana) – (valor de MFI control)) / (valor de MFI control) x 100

(7) Tinción Inmunohistoquímica

(7)-1 Expresión de CAPRINA-1 en tejidos normales de ratón y caninos

Se exsanguinaron ratones (Balb/c, hembras) y perros (perros beagle, hembras) bajo anestesia con éter y anestesia con ketamina, isofluorano. Tras laparotomía, se transfirieron cada uno de los órganos (estómago, hígado, globo ocular, glándula timo, músculo, médula ósea, útero, intestino delgado, esófago, corazón, glándulas salivares, intestino grueso (colon), glándula mamaria, cerebro, pulmones, piel, glándula adrenal, ovario, páncreas, bazo y vejiga) a un plato de 10 cm que contenía PBS. Cada órgano se cortó y abrió en PBS y luego se sometió a fijación por perfusión durante una noche con 0,1 M de tampón fosfato (pH 7,4) que contenía un 4 % de paraformaldehído (PFA). Se desechó el perfundido, la superficie tisular de cada órgano se aclaró con PBS, y luego se añadió una solución de PBS que contenía un 10 % de sacarosa a un tubo de centrífuga. Cada tejido se colocó entonces en cada tubo y se agitó utilizando un rotor a 4 ºC durante 2 horas. Cada solución se sustituyó con una solución que contenía un 20 % de sacarosa y se dejó en reposo a 4 ºC hasta que los tejidos precipitaron. Cada solución se sustituyó con una solución de PBS que contenía un 30 % de sacarosa y se dejó en reposo a 4 ºC hasta que los tejidos precipitaron. Cada tejido se retiró y se escindió una parte necesaria con un escalpelo. Luego se aplicó un compuesto OCT (Tissue Teck) y se esparció por toda la superficie del tejido, y luego se dejaron los tejidos en Cryomold. El Cryomold se colocó en hielo seco para su rápida congelación. Los tejidos se cortaron en secciones de 10 a 20 µm de grosor utilizando un criostato (LEICA) y luego las secciones de tejido cortadas se secaron al aire sobre portaobjetos de cristal durante 30 minutos con un secador de pelo, de forma que los portaobjetos de cristal en los que se habían colocado las secciones de tejido estaban preparados. A continuación, cada portaobjetos de cristal se colocó en una botella de tinción llena con PBS-T (solución salina que contenía 0,05 % de Tween 20), con un procedimiento que implicaba el cambio de PBS-T cada 5 minutos que se llevó a cabo en 3 veces. Se retiró el agua en exceso alrededor de cada especimen utilizando kimwipes y luego cada sección se circundó utilizando DAKOPEN (DAKO). Como soluciones bloqueantes, se aplicó un reactivo bloqueante de Ig de ratón MOM (VECTASTAIN) en el tejido de ratón y se aplicó una solución de PBS-T que contenía un 10 % de FBS en el tejido canino. Los resultantes

se dejaron en reposo en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 1 hora. Después, se preparó una solución para contener un anticuerpo monoclonal (anticuerpo monoclonal nº 6) contra CAPRINA-1 que tenía una región variable de cadena pesada de la SEC ID Nº 73 y una región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 77 y se dejó reaccionar con las superficies celulares preparadas en el Ejemplo 4, cuyo anticuerpo se ajustó a una 5 concentración de 10 µg/ml en la solución de bloqueo. La solución se aplicó en cada portaobjeto de cristal y luego se dejó en reposo en una cámara de humedad a 4 ºC durante una noche. Tras lavar 3 veces, cada 10 minutos, con PBS-T, se aplicó un anticuerpo MOM anti-IgG marcado con biotina (VECTASTAIN) diluido 250 veces con la solución de bloqueo en cada portaobjetos de cristal y entonces se dejó en reposo en una cámara de humedad a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de tres lavados, cada 10 minutos, con PBS-T, se aplicó una solución de 10 tinción DAB (DAB 10 mg+ H2O2 10 µl/0,05 M Tris-HCl (pH 7,6) 50 ml) y luego los portaobjetos se dejaron reposar en una cámara de humedad a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los portaobjetos de cristal se aclararon con agua destilada y luego se aplicó un reactivo de hematoxilina (DAKO). Después de dejarlos reposar a temperatura ambiente durante un minuto, los portaobjetos se aclararon con agua destilada. Los portaobjetos de cristal se sumergieron en soluciones de etanol al 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, y 100 % en ese orden durante un minuto cada uno 15 y luego se dejaron reposar en xileno una noche. Se retiraron los portaobjetos de cristal, se cubrieron con Medio de Montaje Glycergel (DAKO), y luego se observaron. Como resultado, se observó la expresión de CAPRINA-1 en un grado ligero en células de todos los tejidos de las glándulas salivares, riñón, colon, y estómago, pero nunca se observó expresión de CAPRINA-1 en las superficies celulares. Tampoco se observó en absoluto la expresión de CAPRINA-1 en tejidos de otros órganos. Además, se obtuvieron resultados similares cuando se utilizaron

20 anticuerpos monoclonales contra CAPRINA-1 que tenían la región variable de cadena pesada de la SEC ID Nº 103 y la región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 107 (anticuerpo monoclonal nº 9).

(7)-2 Expresión de CAPRINA-1 en tejido de cáncer de mama canino

25 Se prepararon con 108 especímenes de tejido de cáncer de mama canino de perros diagnosticados por diagnóstico patológico como que tenían cáncer maligno de mama, portaobjetos con secciones congeladas por un método similar al anterior y se llevó a cabo una tinción inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo monoclonal nº 6 preparado en el Ejemplo 4. Como resultado, se confirmó la expresión de CAPRINA-1 en 100 de los 108 especímenes (92,5 %). La CAPRINA-1 se expresó con fuerza particularmente en las superficies de las células de cáncer altamente atípicas.

30 Además, se obtuvieron resultados similares cuando se utilizó el anticuerpo monoclonal nº 9 producido en el Ejemplo

4.

(7)-3 Expresión de CAPRINA-1 en tejido de cáncer de mama humano

35 Se llevó a cabo la tinción inmunohistoquímica utilizando 188 especímenes de tejido de cáncer de mama de una matriz de tejido de cáncer de mama humano embebido en parafina (BIOMAX). Después de 3 horas de tratamiento a 60 ºC, se añadió la matriz de tejido de cáncer de mama humano a una botella de tinción llena de xileno y luego se remplazó en xileno cada 5 minutos 3 veces. A continuación, se llevó a cabo un procedimiento similar utilizando etanol y PBS-T en vez de xileno. La matriz de tejido de cáncer de mama humano se añadió a una botella de tinción

40 llena de tampón de citrato 10 mM (pH 6,0) que contenía 0,05 % de Tween 20, se trató durante 5 minutos a 125 ºC, y luego se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 40 minutos o más. Se retiró el agua en exceso alrededor de cada especimen utilizando Kimwipes, cada sección se circundó utilizando DALOPEN, y luego se añadió gota a gota una cantidad apropiada de bloqueante peroxidasa (DAKO). El resultante se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego se añadió a una botella de tinción llena con PBS-T. Se llevó a cabo el remplazo

45 de PBS-T cada 5 minutos 3 veces. Como solución de bloqueo se aplicó una solución de PBS-T que contenía un10 % de FBS y luego se dejó en reposo en una cámara de humedad a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, se preparó una solución que contenía el anticuerpo monoclonal nº 6 que reaccionó con las superficies celulares del cáncer preparada en el Ejemplo 5 a una concentración de 10 µg/ml ajustada utilizando una solución de PBS-T que contenía un 5 % de FBS. La solución se aplicó y entonces se dejó en reposo durante una noche en una

50 cámara de humedad a 4 ºC. Tras 3 lavados cada 10 minutos, con PBS-T, se añadió gota a gota una cantidad apropiada de Polímero Conjugado Marcado con Peroxidasa (DAKO), y entonces se dejaron los portaobjetos en reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos en una cámara de humedad. Después de 3 lavados, cada 10 minutos, con PBS-T, se aplicó una solución de tinción DAB (DAKO) y luego se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 10 minutos. La solución de tinción DAB se desechó y luego se llevó a cabo 10 minutos de lavado

55 con PBS-T durante 3 veces. Los portaobjetos de cristal se aclararon con agua destilada y luego se sumergieron en soluciones de etanol al 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, y 100 % en ese orden durante 1 minuto cada una y luego se dejó en reposo en xileno una noche. Los portaobjetos de cristal se retiraron, se cubrieron con Medio de Montaje Glycergel (DAKO), y entonces se observaron. Como resultado, se observó una fuerte expresión de CAPRINA-1 en 138 (73 %) del total de especímenes de tejido de cáncer de mama. Además, se obtuvieron resultados similares cuando se utilizó

60 el anticuerpo monoclonal nº 9 preparado en el Ejemplo 4.

(7)-4 Expresión de CAPRINA-1 en el tumor cerebral maligno humano

Se llevó a cabo la tinción inmunohistoquímica utilizando 247 especímenes de tejido de tumor cerebral maligno de

65 matrices de tejido de tumor cerebral maligno humano embebido en parafina (BIOMAX), por un método similar al del punto (7)-3 anterior utilizando el anticuerpo monoclonal nº 6 preparado en el Ejemplo 4. Como resultado, se observó

una fuerte expresión de CAPRINA-1 en 227 (92 %) del total de 247 especímenes de tejido de tumor cerebral maligno. Además, se obtuvieron resultados similares cuando se utilizó el anticuerpo monoclonal nº 9 preparado en el Ejemplo 4.

(7)-5 Expresión de CAPRINA-1 en ganglios linfáticos con metástasis de cáncer de mama

Se llevó a cabo la tinción inmunohistoquímica utilizando 150 especímenes de ganglios linfáticos con metástasis de cáncer de mama humano en matrices de tejido de ganglios linfáticos con metástasis de cáncer de mama embebido en parafina (BIOMAX), por un método similar al del punto (7)-3 anterior utilizando el anticuerpo monoclonal nº 6 preparado en el Ejemplo 4. Como resultado, se observó una fuerte expresión de CAPRINA-1 en 136 (90 %) del total de 150 especímenes de ganglios linfáticos con metástasis de cáncer de mama humano. Específicamente, se reveló que la CAPRINA-1 también se expresaba fuertemente en un tejido canceroso que había metastatizado de un cáncer de mama. Además, se obtuvieron resultados similares cuando se utilizó el anticuerpo monoclonal nº 9 preparado en el Ejemplo 4.

Ejemplo 2: Efectos antitumorales (actividad ADCC) o los anticuerpos contra CAPRINA-1 en las células cancerosas

A continuación, se examinó si un anticuerpo contra CAPRINA-1 era capaz o no de dañar las células tumorales que expresan CAPRINA-1. Se llevó a cabo la evaluación utilizando el anticuerpo policlonal contra el péptido derivado de la CAPRINA-1 humana que se preparó en el Ejemplo 1. Se recogieron por separado dos tipos de líneas celulares de cáncer de mama humano (T47D y MDA-MB-157) (106 células de cada una), en las que se había confirmado la expresión de CAPRINA-1, en un tubo de centrífuga de 50 ml. Se añadió al mismo Cromo 51 (100 µCi), y a continuación se incubó a 37 ºC durante 2 horas. Después, se lavaron las células 3 veces con un medio RPMI1640 que contenía un 10 % de suero fetal bovino y se añadieron a los pocillos (103 células por pocillo) de placas con el fondo en V de 96 pocillos. Se añadió a estas el anticuerpo policlonal anterior contra el péptido derivado de la CAPRINA-1 humana (1 µg por pocillo). Posteriormente, se añadió a estos linfocitos separados de sangre periférica de conejo (2 x 105 células por pocillo), y a continuación se cultivaron bajo condiciones de 37 ºC y un 5 % de CO2 durante 4 horas. Tras el cultivo, se determinó el nivel de cromo (Cr) 51 liberado por las células tumorales dañadas en el sobrenadante de los cultivos. Luego, se calculó la actividad ADCC del anticuerpo policlonal contra el péptido derivado de CAPRINA-1 humana contra las células cancerosas. Como resultado, se confirmaron las actividades contra T47D (15,4 %) y MDA-MB-157 (17,3 %) (Véase las Figs. 2 y 3). Mientras, no se observó sustancialmente ninguna actividad en el caso en el que un procedimiento similar al anterior se llevó a cabo utilizando el anticuerpo de control preparado de sangre periférica de un conejo que no se había inmunizado con un antígeno (Ejemplo 1 (5)) o en el caso en el que no se había añadido ningún anticuerpo (Véase las Figs. 2 y 3). En consecuencia, se reveló que las células tumorales que expresan CAPRINA-1 pueden dañarse induciendo la actividad ADCC con el uso de un anticuerpo contra la CAPRINA-1.

Además, para apreciar la actividad citotóxica, se mezclaron juntos un anticuerpo contraCAPRINA-1 que se usa en la presente invención, linfocitos de ratón, y 103 células que incorporaban cromo 51 de una línea celular de leucemia, y se cultivaron durante 4 horas. Después, se determinó el nivel de cromo 51 liberado en el medio. Luego, se calculó la actividad citotóxica contra la línea celular de leucemia por la siguiente ecuación*.

*Ecuación: Actividad citotóxica (%) = [(nivel de cromo 51 liberado deT47D o MDA-MB-157 a las que se había añadido un anticuerpo contra CAPRINA-1 y linfocitos de ratón) / (nivel de cromo 51 liberado por células diana a las que se había añadido ácido clorhídrico 1 N)] x 100

Ejemplo 3: Preparación de nuevos antígenos proteicos para el cáncer humano

(1) Preparación de la proteína recombinante

Se preparó una proteína recombinante de un gen homólogo humano según el siguiente método basándose en el gen de SEC ID Nº 1 obtenido en el Ejemplo 1. Se llevó a cabo una PCR repitiendo 30 veces un ciclo de 98 ºC/10 segundos y 68 ºC/2,5 minutos utilizando un Thermal Cycler (BIO RAD) y una solución de reacción ajustada a una cantidad total de 50 µl por medio de la adición de cada reactivo y un tampón fijado (1 µl de ADNc (que era de varios ADNc derivados de tejidos/células preparado en el Ejemplo 1 y que se había observado su expresión por RT-PCR), 2 tipos de cebadores (0,4 µM cada uno; SEC ID Nº 38 y 39) que contenía secuencias de escisión de enzimas de restricción SacIy XhoI, 0,2 mM dNTP, 1,25 U de polimerasa PrimeSTAR HS (Takara Shuzo)). Los dos tipos de cebadores anteriores se utilizaron para amplificar la región que codifica la secuencia de aminoácidos de longitud completa SEC ID Nº 2. Tras la PCR el ADN amplificado de esta manera se sometió a una electroforesis en gel de agarosa 1 % y luego se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 2,1 kpb utilizando un Kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN).

El fragmento de ADN purificado se unió a un vector de clonación pCR-Blunt (Invitrogen). Se transformó el vector en Escherichia coli y luego se recolectó el plásmido. Se confirmó basándose en la secuencia que el fragmento genético amplificado coincidía con la secuencia diana. El plásmido que coincidía con la secuencia de interés se trató con las

enzimas de restricción SacIy XhoI y se purificó entonces el resultante utilizando un Kit QIAquick Gel Extraction. Luego, la secuencia genética de interés se insertó en un vector de expresión pET30a (Novagen) para Escherichia coli tratada con las enzimas de restricción SacIy XhoI. Se puede producir una proteína recombinante fusionada marcada con His utilizando el vector. El plásmido se transformó en Escherichia coli BL21 (DE3) por expresión y

5 luego se llevó a cabo la inducción de la expresión utilizando IPTG 1 mM, de forma que se expresa la proteína diana en Escherichia coli.

(2) Purificación de la proteína recombinante

10 Cada recombinante de Escherichia coli obtenido anteriormente que expresa la SEC ID Nº 1 se cultivó a 37 ºC en medio LB que contenía 30 µg/ml de kanamicina hasta que se alcanzó una absorbancia a 600 nm alrededor de 0,7. Entonces se añadió isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido a una concentración final de 1 mM y a continuación se cultivó 4 horas a 37 ºC. Posteriormente, se recolectaron las células por centrifugación durante 10 minutos a 4800 rpm. El aglomerado celular se suspendió en solución salina tamponada de fosfato y luego se centrifugó a 4800 rpm

15 durante 10 minutos para lavar las células.

Las células se suspendieron en solución salina tamponada de fosfato y entonces se sometieron a ultrasonicación sobre hielo. El lisado de Escherichia coli ultrasonicado de esta manera se centrifugó a 6000 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante así obtenido se utilizó como fracción soluble y el precipitado así obtenido se utilizó como fracción

20 insoluble.

La fracción se añadió a una columna de níquel quelado (portador: Sepharosa de quelación (Marca Registrada) Fast Flow (GE Healthcare), capacidad de la columna: 5 ml, con tampón de ácido clorhídrico 50 mM (pH 8,0) como tampón equilibrado)) preparada según un método convencional. La fracción no absorbida se lavó con tampón de 25 ácido clorhídrico 50 mM (pH 8,0) en una cantidad de 10 veces la capacidad de la columna y 20 mM de tampón fosfato (pH 8,0) que contenía 20 mM de imidazol. Inmediatamente después del lavado, se eluyeron 6 lechos con tampón de fosfato 20 mM (pH 8,0) que contenía 100 mM de imidazol. Se añadió la fracción de elución de 20 mM de tampón fosfato (pH 8,0) que contenía 100 mM de imidazol (para el que la elución de la proteína de interés se había confirmado con tinción con Coomasie) a una columna de intercambio fuertemente aniónica (portador: Q Sepharose 30 (Marca Registrada) Fast Flow (GE Healthcare), capacidad de columna: 5 ml, y tampón fosfato 20 mM (pH 8,0) como tampón equilibrado). La fracción que no se absorbe se lavó con 20 mM de tampón fosfato (pH 7,0) en una cantidad de 10 veces la capacidad de la columna y tampón de fosfato 20 mM (pH 7.0) que contenía 200 mM de cloruro sódico. Inmediatamente después del lavado, se eluyeron 5 lechos utilizando tampón fosfato 20 mM (pH 7,0) que contenía 400 mM de cloruro sódico. De esta manera se obtuvieron las fracciones purificadas de proteínas que tenían

35 cada una la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 2.

Se dispersaron 200 µl de cada preparación purificada obtenida por el método anterior en 1 ml de tampón de reacción (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2, pH 7,4) y luego se añadieron 2 µl de enteroquinasa (Novagen). La preparación se dejó en reposo a temperatura ambiente durante una noche para que reaccionara, se escindió la His

40 tag, y luego se llevó a cabo la purificación de acuerdo con los protocolos adjuntos utilizando el kit Enterokinase Cleavage Capture (Novagen). Luego 1,2 ml de cada preparación purificada obtenida por el método anterior se sustituyó con tampón de fosfato fisiológico (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) utilizando ultrafiltración NANOSEP 10K OMEGA (PALL). La esterilización por filtración se llevó a cabo utilizando 0,22 µm HT Tuffryn Acrodisc (PALL) y entonces se utilizaron los resultantes para los siguientes experimentos.

Ejemplo 4: Preparación de anticuerpos monoclonales contra CAPRINA-1

El antígeno proteico (CAPRINA-1 humana) (100 µg) que se muestra en la SEC ID Nº 2 preparada en el Ejemplo 3 se mezcló con un adyuvante MPL+TDM (Sigma) en una cantidad equivalente a la del antígeno proteico. La mezcla se 50 utilizó como una solución de antígeno para ratón. La dilución de antígeno se administró intraperitonealmente a ratones Balb/c de 6 semanas de edad (Japan SLC Inc.) y entonces se administraron 3 veces más o 24 veces cada semana hasta completar la inmunización. Se extrajo el bazo a los 3 días tras la inmunización final y entonces se colocó entre dos portaobjetos de cristal esterilizados. Cada resultante se lavó en PBS (-) (Nissui) y luego se centrifugó a 1500 rpm durante 10 minutos, de forma que se repitió 3 veces este procedimiento para retirar los 55 sobrenadantes. Se obtuvieron las células esplénicas de esta manera. Las células esplénicas obtenidas se mezclaron con la línea celular SP2/0 de mieloma de ratón (adquirida en el ATCC) con una proporción de 10:1. La solución PEG se preparó mezclando 200 µl de medio RPMI1640 que contenía un 10 % de FBS calentado a 37 ºC y se añadieron 800 µl de PEG1500 (Boehringer) a las células. Se dejó en reposo la solución durante 5 minutos para la fusión celular. Se llevó a cabo una centrifugación a 1700 rpm durante 5 minutos para retirar los sobrenadantes. Se 60 suspendieron las células en 150 ml de medio RPMI1640 (medio selectivo HAT) que contenía un 15 % de FBS, a la que se añadió un 2 % equivalente de solución HAT (Gibco) y entonces se sembraron en quince placas de 96 pocillos (Nunc) a 100 µl por pocillo. Las células se cultivaron durante 7 días bajo condiciones de 37 ºC y un 5 % de

CO2 de forma que se obtuvieron los hibridomas resultantes de la fusión de las células esplénicas con las células de mieloma. 65

Los hibridomas se seleccionaron utilizando un indicador de afinidad de unión del anticuerpo producido por los hibridomas preparados de esta manera a la proteína CAPRINA-1. Se añadió la solución de proteína CAPRINA-1 (1 µg/ml) que se preparó en el Ejemplo 3 a 100 µl por pocillo de placas de 96 pocillos y luego se dejaron en reposo a 4 ºC durante 18 horas. Cada pocillo se lavó 3 veces con PBS-T, 0,5 % de solución de seroalbúmina bovina (BSA) (Sigma) a 400 µl por pocillo, y luego las placas se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución se retiró y luego cada pocillo se lavó 3 veces con 400 µl de PBS-T. Cada sobrenadante de los cultivos de hibridomas que se obtuvo anteriormente, se añadió a 100 µl por pocillo y luego se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 2 horas. Cada pocillo se lavó 3 veces con PBS-T, se añadió un anticuerpo IgG (H+L) anti-ratón marcado con HRP (Invitrogen) diluido 5000 veces con PBS a 100 µl por pocillo y entonces se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavó 3 veces con PBS-T, se añadió una solución sustrato TMB (Thermo) a 100 µl por pocillo y entonces se dejó en reposo durante 15-30 minutos, hasta que se llevó a cabo una reacción de color. Después del desarrollo del color se añadió ácido sulfúrico 1 N a 100 µl por pocillo para parar la reacción. Se midió la absorbancia a 450 nm y la absorbancia a 595 nm utilizando un espectrómetro de absorción. Como resultado, se seleccionó una pluralidad de hibridoma que producían anticuerpos con alta absorbancia.

Los hibridomas seleccionados se añadieron a 0,5 hibridomas por pocillo de placas de 96 pocillos y luego se cultivaron. Tras 1 semana, se observaron hibridomas que formaban colonias sencillas en los pocillos. Las células en estos pocillos se cultivaron más. Los hibridomas se seleccionaron utilizando la afinidad de unión como indicador (del anticuerpo producido por los hibridomas clonados) con la proteína CAPRINA-1. La solución de proteína CAPRINA-1 (1 µg/ml) preparada en el Ejemplo 3 se añadió a 100 µl por pocillo de placas de 96 pocillos y entonces se dejó en reposo a 4 ºC durante 18 horas. Cada pocillo se lavó 3 veces con PBS-T, se añadió una solución de BSA al 0,5 % a 400 µl por pocillo, y luego se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 3 horas. Se retiró la solución y luego cada pocillo se lavó 3 veces con 400 µl de PBS-T. Cada sobrenadante del cultivo de los hibridomas que se obtuvo anteriormente se añadió a 100 µl por pocillo y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 3 horas. Cada pocillo se lavó 3 veces con PBS-T. Se añadió un anticuerpo IgG (H+L) anti-ratón marcado con HRP (Invitrogen) diluído 5000 veces con PBS a 100 µl por pocillo y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavó 3 veces con PBS-T, se añadió una solución sustrato TMB (Thermo) a 100 µl por pocillo y se dejó en reposo durante 15-30 minutos, hasta que se llevó a cabo la reacción de color. Tras el desarrollo de color, se añadió ácido sulfúrico 1 N a 100 µl por pocillo para parar la reacción. Se midieron la absorbancia a 450 nm y la absorbancia a 595 nm utilizando un espectrómetro de absorción. Como resultado, se obtuvieron 150 líneas de hibridoma que producían anticuerpos monoclonales que ejercían reactividad con la proteína CAPRINA-1.

A continuación, de entre estos anticuerpos monoclonales, se seleccionaron los anticuerpos monoclonales que ejercían reactividad con las superficies de las células de cáncer de mama que expresaban CAPRINA-1. Específicamente, se sometieron a centrifugación en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml 106 células de línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231V. El sobrenadante (100 µl) de cada hibridoma anterior se añadió y se dejó reposar en hielo durante 1 hora. Después del lavado con PBS, se añadió un anticuerpo IgG de cabra anti-ratón marcado con FITC (Invitrogen) diluido 500 veces con PBS que contenía un 0,1 % de FBS y se dejó reposar en hielo durante 1 hora. Después de lavar con PBS, se midió la intensidad de fluorescencia utilizando un FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Al mismo tiempo, se llevó a cabo un procedimiento similar al anterior utilizando un suero sin tratar de ratones Balb/c de 6 semanas de edad diluido 500 veces con un medio de cultivo de hibridoma en vez del anticuerpo para preparar un control. Como resultado, se seleccionaron 11 anticuerpos monoclonales (nº 1 a nº 11) tenían una intensidad de fluorescencia más fuerte que la del control; es decir, reaccionaban con las superficies de las células de cáncer de mama.

Ejemplo 5. Caracterización de los anticuerpos seleccionados

(1) Clonación de un gen de región variable del anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1

Se extrajeron los ARNm de las líneas celulares de hibridoma que producían los 11 anticuerpos monoclonales seleccionados en el Ejemplo 4. Se obtuvieron el gen de la región variable de cadena pesada (VH) y el gen de la región variable de cadena ligera (VL) de cada anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 por RT-PCR utilizando cebadores específicos de una secuencia derivada de FR1 de ratón y una secuencia derivada de FR4 de ratón. Para la secuenciación, los genes se clonaron separadamente en vectores pCR2.1 (Invitrogen).

(1)-1 RT-PCR

Se preparó el ARNm de cada línea celular de hibridoma (106 células) utilizando el kit mARN micro purification kit (GE Healthcare). Cada ARNm obtenido se sometió a transcripción inversa utilizando un SuperScriptII 1st strand synthesis kit (Invitrogen) para la síntesis de ADNc. Los procedimientos anteriores se llevaron de acuerdo con los protocolos adjuntos a los kits.

Cada ADNc obtenido se utilizó para la amplificación genética de anticuerpos por PCR.

Con el fin de obtener el gen de la región VH, se utilizaron un cebador específico de secuencia FR1 de cadena pesada de ratón (SEC ID Nº 130) y un cebador específico de secuencia FR4 de cadena pesada de ratón SEC ID Nº 131). Además con el fin de obtener el gen de la región VL, se utilizaron un cebador específico de la secuencia FR1 de cadena ligera de ratón (SEC ID Nº 132) y un cebador específico de secuencia FR4 de cadena ligera de ratón (SEC ID Nº 133). Estos cebadores se diseñaron con referencia a Jones, S. T. y Bending, M. M. Bio/Technology 9, 88-89 (1991). Para la PCR se utilizó el Ex-taq (Takara Bio Inc.). Cada muestra de ADNc se mezcló con 10 x tampón EX Taq (5 µl), mezcla de dNTPs (2.5 mM) (4 µl), cebadores (1,0 µM) (2 µl de cada), y Ex Taq (5U/ml) (0,25 µl). El volumen total se ajustó a 50 µl con agua estéril. Se llevó a cabo la PCR bajo condiciones que comprendían, tras el tratamiento a 94 ºC durante 2 minutos, 30 ciclos de una combinación de reacción de desnaturalización a 94 ºC durante 1 minuto, hibridación a 58 ºC durante 30 segundos, y elongación a 72 ºC durante 1 minuto.

(1)-2 Clonación

Cada producto de PCR obtenido anteriormente se sometió a electroforesis en gel de agarosa, y a continuación a escisión de bandas de ADN de la región VH y región VL. El ADN se purificó utilizando el kit QIAquick Gel purification kit (QIAGEN). Cada vector ligado a ADN se transformó en células competentes DH5a (TOYOBO) según un método convencional. Cada transformante (10 clones) se cultivaron una noche en un medio (100 µg/ml de ampicilina) a 37 ºC. El plásmido ADN obtenido se purificó utilizando un Qiaspin Miniprep kit (QIAGEN).

(1)-3 Secuenciación

El análisis de secuencias genéticas de la región VH y la región VL en cada plásmido obtenido anteriormente se llevó a cabo utilizando un cebador directo M13 (SEC ID Nº 134) y un cebador inverso M13 (SEC ID Nº 135) con un secuenciador de fluorescencia (ABI; DNA sequencer 3130XL) y un kit BigDye terminater Ver. 3.1 cycle sequencing (ABI) según los protocolos adjuntos al kit. Como resultado, se determinó cada secuencia genética (idéntica en 10 clones).

Las secuencias de aminoácidos obtenidas de las regiones variables de cadena pesada se muestran en las SEC ID Nº 43, SEC ID Nº 73, SEC ID Nº 83, SEC ID Nº 93, SEC ID Nº 103, SEC ID Nº 113, y SEC ID Nº 123. Las secuencias de aminoácido obtenidas de las regiones variables de cadena ligera se muestran en las SEC ID Nº 47, SEC ID Nº 53, SEC ID Nº 58, SEC ID Nº 63, SEC ID Nº 68, SEC ID Nº 77, SEC ID Nº 87, SEC ID Nº 97, SEC ID Nº 107, SEC ID Nº 117, y SEC ID Nº 127.

Específicamente, un anticuerpo monoclonal nº 1 comprende la región variable de cadena pesada de SEC ID Nº 43 y la región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 47. Un anticuerpo monoclonal nº 2 comprende la región variable de cadena pesada de la SEC ID Nº 43 y la región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 53. Un anticuerpo monoclonal nº 3 comprende una región variable de cadena pesada de la SEC ID Nº 43 y la región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 58. Un anticuerpo monoclonal nº 4 comprende una región variable de cadena pesada de la SEC ID Nº 43 y la región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 63. Un anticuerpo monoclonal nº 5 comprende una región variable de cadena pesada de la SEC ID Nº 43 y la región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 68. Un anticuerpo monoclonal nº 6 comprende una región variable de cadena pesada de la SEC ID Nº 73 y la región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 77. Un anticuerpo monoclonal nº 7 comprende una región variable de cadena pesada de la SEC ID Nº 83 y la región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 87. Un anticuerpo monoclonal nº 8 comprende una región variable de cadena pesada de la SEC ID Nº 93 y la región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 97. Un anticuerpo monoclonal nº 9 comprende una región variable de cadena pesada de la SEC ID Nº 103 y la región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 107. Un anticuerpo monoclonal nº 10 comprende una región variable de cadena pesada de la SEC ID Nº 113 y la región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 117. Un anticuerpo monoclonal nº 11 comprende una región variable de cadena pesada de la SEC ID Nº 123 y la región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 127.

(2) Expresión producida de CAPRINA-1 en las superficies celulares de diferentes células con el uso de los anticuerpos monoclonales obtenidos

A continuación se examinó si se expresaba proteína CAPRINA-1 o no en las superficies celulares de 7 tipos de líneas celulares de cáncer de mama (MDA-MB-157, T47D, MRK-nu-1, MDA-MB-231V, BT20, SK-BR-3, y DA-MB231T) en las que se había confirmado la expresión genética de CAPRINA-1, 3 tipos de otras líneas celulares de cáncer de mama (MDA-MB-231C, MCF-7, y ZR75-1), 6 tipos de líneas celulares de glioma (T98G, SNB19, U251, y U87G), 3 tipos de líneas celulares de cáncer de riñón (Caki-1, Caki2, y A498), 1 tipo de líneas celulares de cáncer de estómago (MKN45), 1 tipo de líneas celulares de cáncer de colon (Caco2), 3 tipos de líneas celulares de cáncer de pulmón (A549, QG56, y PC8), y 3 tipos de líneas celulares de leucemia (Namalwa, BDCM, y RPI1788). Se centrifugó cada línea celular (106 células) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Se añadió por separado a estas el sobrenadante de hibridomas (100 µl) que contenían los anticuerpos monoclonales nº 1 a nº 11 contra la CAPRINA-1 preparada en el Ejemplo 4 que reaccionaban con las superficies celulares del cáncer y se dejaron en reposo durante 1 hora. Tras lavar con PBS, cada resultante se suspendió en anticuerpo IgG de cabra anti-ratón marcado con FITC (Invitrogen Corporation) diluido 500 veces en PBS que contenía un 0,1 % de FBS y luego se dejó en reposo sobre hielo 1 hora. Después de lavar con PBS, se midió la intensidad de fluorescencia utilizando el FACSCalibur (Becton,

Dickinson and Company). Entre tanto, se llevó a cabo un procedimiento similar al anterior utilizando, como control, el anticuerpo control preparado en (5) anteriormente en vez de los sobrenadantes de hibridoma que contenía los anticuerpos monoclonales nº 1 a nº 11 contra CAPRINA-1, preparando así el control. Como resultado, se encontró que la intensidad de fluorescencia era al menos un 30 % más fuerte en todas las células a las que se había añadido los anticuerpos monoclonales nº 1 a nº 11 que en las células control. Específicamente, se confirmaron aumentos en la intensidad de frecuencias cuando se utilizó por ejemplo, el anticuerpo nº 9: MDA-MB-157: 211 %; T47D: 145 %; MRK-nu-1: 123 %; MDA-MB-231V: 251 %; BT20: 168 %; y MDA-MB-231T: 94 %. Basándose en lo anterior, se confirmó que la proteína CAPRINA-1 se expresaba en las superficies de las células de las líneas celulares de cáncer humanas. Además, la tasa de aumento en la intensidad de fluorescencia se representaba por la tasa de aumento en la intensidad de fluorescencia media (valor MFI) en las células. Esta se calcula por la siguiente ecuación.

Tasa de aumento en la intensidad de fluorescencia media (tasa de aumento en la intensidad de fluorescencia) (%) = ((valor de MFI de las células que reaccionan con un anticuerpo anti-CAPRINA-1 humana) – (valor MFI del control) / (valor MFI del control) x 100

(3): Efectos antitumorales (actividad ADCC) de los anticuerpos contra CAPRINA-1 en las células cancerosas

Se evaluaron los anticuerpos monoclonales seleccionados anteriormente nº 1 a nº 11 en términos de actividad citotóxica (actividad ADCC) en las células cancerosas. Los hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales nº 1 a nº 11 se cultivaron utilizando medio de hibridoma SFM (Invitrogen). Cada sobrenadante obtenido se purificó utilizando Hitrap ProteinA Sepharose FF (GE Healthcare), y a continuación se sustituyó con PBS (-) y se purificó con un filtro de 0,22 µm (Millipore). Cada resultante se utilizó como un anticuerpo para determinar la actividad. La línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-157 (106 células) se recolectaron en un tubo de centrífuga de 50 ml. Se les añadió cromo 51 (100 µCi), y se incubó a continuación a 37 ºC durante 2 horas. Entonces, se lavaron las células 3 veces con un medio RPMI1640 que contenía una 10 % de FBS. Se añadieron las células a los pocillos (103 células por pocillo) en placas de fondo en V de 96 pocillos. Así, se prepararon las células diana. Se les añadieron los anticuerpos purificados anteriormente (1 µg por pocillo). Se les añadió además, linfocitos de ratón separados del bazo de ratón (2 x 105 células) (1 µg por pocillo), y a continuación se cultivaron bajo condiciones de 37 ºC y un 5 % de CO2 durante 4 horas. Después del cultivo, se determinó el nivel de cromo (Cr) 51 liberado por las células tumorales dañadas en cada sobrenadante del cultivo. Entonces se calculó la actividad ADCC de cada anticuerpo policlonal contra el péptido derivado de CAPRINA-1 humana en las células cancerosas. Como resultado, todos los anticuerpos monoclonales nº 1 a nº 11 mostraban actividad ADCC contra MDA-MB-157 (20 % o más). Específicamente, por ejemplo, se obtuvieron los siguientes resultados de actividad citotóxica: nº 1: 22,1 %; nº 2: 29,1 %; nº 6: 30,2 %; y nº 9: 32,4 % (véase la Fig. 4). Al mismo tiempo se confirmó la actividad no citotóxica en un caso en el que un procedimiento similar al anterior se llevó a cabo utilizando el anticuerpo monoclonal reactivo contra la proteína CAPRINA-1 en sí misma pero no a las superficies celulares del cáncer preparado en el Ejemplo 4 (véase la Fig. 4). Los resultados anteriores mostraron que los anticuerpos monoclonales anti-CAPRINA-1 (nº 1 a nº 11) dañaban las células cancerosas que expresaban CAPRINA-1 demostrando una actividad ADCC.

(4): Efectos antitumorales (actividad CDC) de anticuerpos contra CAPRINA-1 en las células cancerosas

Los anticuerpos monoclonales seleccionados anteriormente nº 1 a nº 11contra CAPRINA-1 se evaluaron en términos de actividad citotóxica (actividad CDC) en las células cancerosas. Se añadió la sangre recolectada de conejos por muestreo sanguíneo en un tubo de Eppendorf y luego se dejaron en reposos a temperatura ambiente durante 60 minutos, y a continuación se centrifugó a 3000 rpm durante 5 minutos. Así se preparó el suero para la determinación de la actividad CDC. Se recolectó la línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231V (105 células) en un tubo de centrífuga de 50 ml. Se le añadió cromo 51 (100 µCi), y a continuación se incubó a 37 ºC durante 2 horas. Entonces se lavaron las células 3 veces con un medio RPMI que contenía FBS al 10 % y se suspendió en un suero RPMI que contenía un 50 % de suero de ratón preparado anteriormente. Se añadieron las células a los pocillos (103 células por pocillo) en placas con fondo en V de 96 pocillos. Se añadieron separadamente los anticuerpos nº 1 a nº 11 obtenidos en (3) anteriormente a los pocillos (1 µg por pocillo), y a continuación se cultivaron bajo condiciones de 37 ºC y un 5 % de CO2 durante 4 horas. Tras el cultivo, se determinó el nivel de cromo (Cr) 51 liberado por las células tumorales dañadas en cada sobrenadante de cultivo. Se calculó la actividad CDC contra MDA-MB-231V que demostraba el anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 en cada sobrenadante de hibridoma. Como resultado, todos los anticuerpos monoclonales nº 1 a nº 11 mostraban una actividad CDC (30 % o más). Al mismo tiempo, se confirmó la actividad no citotóxica en un caso en el que se llevó a cabo un procedimiento similar al anterior utilizando el anticuerpos monoclonal reactivo contra una proteína CAPRINA-1 en sí misma pero no contra las superficies celulares del cáncer preparado en el Ejemplo 4 (véase la Fig. 4). En consecuencia, se ha revelado que los anticuerpos contra CAPRINA-1 (nº 1 a nº 11) pueden dañar las células que expresan CAPRINA-1 también demostrando una actividad CDC.

Ejemplo 6: Efectos antitumorales in vivo de los anticuerpos monoclonales anti-CAPRINA-1 en los ratones

A continuación se evaluó los efectos antitumorales in vivo de los anticuerpos monoclonales obtenidos nº 1 a nº 11 contra la CAPRINA-1en ratones que soportaban un tumor. Los anticuerpos que se utilizaron en este Ejemplo se obtuvieron sometiendo el sobrenadante de cada hibridoma a una columna de purificación de la manera descrita anteriormente.

Los efectos antitumorales de los anticuerpos monoclonales nº 1 a nº 11 contra CAPRINA-1 se examinaron utilizando ratones que soportaban un tumor en los que se había trasplantado una línea celular de cáncer derivado de ratón que expresaba CAPRINA-1. Se trasplantaron células CT26 (adquiridas en el ATCC) subcutáneamente en las porciones dorsales de 70 ratones Balb/c (Japan SLC, Inc.)(106 células por ratón). Cada tumor se dejó crecer hasta que el diámetro del mismo llegó a aproximadamente 7 mm. Los ratones que soportaban el tumor (60 de 70) se sometieron a administración vía intraperitoneal de anticuerpos monoclonales nº 1 a nº 11 contra CAPRINA-1 y un tipo de anticuerpo monoclonal (reactivo a la proteína CAPRINA-1 en sí misma pero no a las superficies celulares del cáncer) preparado en el Ejemplo 4 (5 ratones por anticuerpo) a una dosis de 300 µg (300 µl) por ratón. Entonces, cada anticuerpo se administró por vía intraperitoneal a la misma dosis que los ratones que soportaban tumores relevantes 3 veces en total durante 2 días. El tamaño del tumor se midió cada día para observar los efectos antitumorales. Los 10 ratones que soportaban tumores restantes se sometieron a la administración de PBS (-) en vez de un anticuerpo. El grupo de estos ratones se designó como grupo control. Como resultado de la observación de los efectos antitumorales, en el caso del grupo de ensayo en el que se administraron los anticuerpos monoclonales nº 1 a nº 11 contra CAPRINA-1, se produjo regresión tumoral tal que el volumen tumoral al principio de la administración de los anticuerpos (100 %) descendió al 50 % el día 4, a aproximadamente el 10 % el día 6, y varios porcentajes el día 8. Una regresión tumoral completa tuvo lugar los días 11 a 14 (véase la Fig. 5). Por otro lado. en el grupo de control, aumentó el volumen tumoral a aproximadamente el 260 %, 350 %, 550 %, y 800 % del volumen original los días 4, 6, 8, y 11, respectivamente (véase la Fig. 5). Además, en el grupo de ratones en el que se había administrado el anticuerpo monoclonal (reactivo a la CAPRINA-1 en sí misma pero no con las superficies celulares del cáncer), no se pudieron demostrar efectos tumorales y el crecimiento tumoral se produjo como en el grupo de control. Los resultados indican que los anticuerpos monoclonales obtenidos nº 1 a nº 11 contra la CAPRINA-1 muestran fuertes efectos antitumorales in vivo en las células cancerosas que expresan CAPRINA-1. Además, se obtuvo el tamaño del tumor calculando el volumen tumoral por la siguiente fórmula: diámetro largo x diámetro corto x diámetro corto x 0,5.

Además, los anticuerpos monoclonales nº 1 a nº 11 contra la CAPRINA-1 se administraron de la manera descrita anteriormente para los ratones (Balb/c) que soportaban un tumor en los que se habían trasplantado células cancerosas N1E de ratón (adquiridas en el ATCC). Esto resultó en regresión tumoral completa el día 15 tras la administración de anticuerpos. Por otro lado, en el grupo de control, el volumen tumoral aumento hasta aproximadamente el 950 % del volumen original (véase la Fig. 6).

Ejemplo 7: Identificación de un péptido de proteína CAPRINA-1, al que se une un anticuerpo que reacciona contra la superficie celular del cáncer

Con el uso de anticuerpos monoclonales nº 1 a nº 11 contra CAPRINA-1, que reaccionan con las superficies celulares del cáncer (obtenidas anteriormente), se identificaron las secuencias parciales en la proteína CAPRINA-1 que reconocen estos anticuerpos monoclonales.

Primero, se añadió DTT (Fluka) a 100 µl de una solución preparada disolviendo una proteína CAPRINA-1 recombinante a una concentración de 1 µg/µl con PBS a una concentración final de 10 mM, y a continuación se hizo reaccionar a 95 ºC, hasta que se llevó a cabo la reducción de los puentes disulfuro en la CAPRINA-1. Luego se añadió yodoacetato (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) con una concentración final de 20 mM y se llevó a cabo una reacción de alquilación por grupos tiol a 37 ºC durante 30 minutos bajo condiciones de sombra. Se añadieron cincuenta (50) µg de cada anticuerpo monoclonal nº 1 a nº 11 contra CAPRINA-1 a 40 µg de la proteína CAPRINA-1 alquilada reducida. El volumen de la mezcla se ajustó a 1 ml de tampón fosfato 20 mM (pH 7,0) y luego la mezcla se dejó reaccionar una noche a 4 ºC mientras se agitaba y mezclaba cada mezcla.

A continuación se añadió tripsina (Promega) a una concentración final de 0,2 µg. Tras 1 hora, 2 horas, 4 horas, y después a la as 12 horas de reacción a 37 ºC, se mezclaron los resultantes con perlas de cristal de proteína A (GE), que se habían sometido anteriormente a bloqueo con PBS que contenía un 1 % de BSA (Sigma) y luego se lavó con PBS , en 1 mM de carbonato cálcico y tampón NP-40 (20 mM de tampón fosfato (pH 7,4), 5 mM de EDTA, 150 mM de NaCl y 1 % de NP-40) y después 30 minutos de reacción.

Las mezclas de reacción se lavaron cada una con 25 mM de tampón de carbonato amónico (pH 8,0) y luego se eluyeron los complejos antígeno-anticuerpo utilizando 100 µl de ácido fórmico al 0,1 %. Se realizó un ensayo LC-MC con los productos eluídos utilizando QTOF Premier (Waters-MicroMass) según los protocolos adjuntos al instrumental.

Como resultado, se identificó el polipéptido con la SEC ID Nº 136 como una secuencia parcial de la CAPRINA-1, que había sido reconocida por todos los anticuerpos monoclonales nº 1 a nº 11 contra la CAPRINA-1. Además, se identificó el péptido de la SEC ID Nº 137 como una secuencia parcial del polinucleótido de la SEC ID Nº 136 anterior, péptido que reconocían los anticuerpos monoclonales nº 2 a nº 5, nº 6 a nº 8, y nº 10. Se reveló además que los

5 anticuerpos monoclonales nº 2 a nº 5 reconocían el péptido de la SEC ID Nº 138 que era un péptido con una secuencia parcial del péptido SEC ID Nº 137.

Aplicabilidad industrial

10 Los anticuerpos de la presente invención son útiles para el tratamiento y/o prevención de cánceres.

Texto libre del listado de secuencias

Cebadores: SEC ID Nº 31 a 39 y 130 a 135 15

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> TORAY INDUSTRIES, INC.

20 <120> Composición farmacéutica para el tratamiento y la prevención del cáncer

<130> PH-4051-PCT

<150> JP 2008-201928 25 <151>

<150> JP 2009-87285

<151>

30 <160> 138

<170> PatentIn versión 3.1

<210> 1

<211> 5562 35 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS 40 <222> (190)..(2319)

<223>

<400> 1

<210> 2

<211> 709

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 3553 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS 10 <222> (190)..(2274)

<223>

<400> 3

<210> 4

<211> 694

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 1605 5 <212> ADN

<213> Canis familiaris

<220>

<221> CDS 10 <222> (46)..(1392)

<223>

<400> 5

<210> 6

<211> 448

<212> PRT

<213> Canis familiaris

<400> 6

<210> 7

<211> 4154 5 <212> ADN

<213> Canis familiaris

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(2154)

<223>

<400> 7

<210> 8

<211> 717

<212> PRT

<213> Canis familiaris

<400> 8

<210> 9

<211> 4939 5 <212> ADN

<213> Canis familiaris

<220>

<221> CDS 10 <222> (1) .. (2109)

<223>

<400> 9

<210> 10

<211> 702

<212> PRT

<213> Canis familiaris

<400> 10

<210> 11

<211> 3306 5 <212> ADN

<213> Canis familiaris

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(2090)

<223>

<400> 11

<210> 12

<211> 679

<212> PRT

<213> Canis familiaris

<400> 12

<210> 13

<211> 2281

<212> ADN

<213> Canis familiaris

<220> 5 <221> CDS

<222> (1)..(2154)

<223>

<400> 13 10

<210> 14

<211> 717

<212> PRT

<213> Canis familiaris

<400> 14

<210> 15

<211> 3386 5 <212> ADN

<213> Bos taurus

<220>

<221> CDS 10 <222> (82)..(2208)

<223>

<400> 15

<210> 16

<211> 708

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 16

<210> 17

<211> 3150 5 <212> ADN

<213> Equus caballus

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1917)

<223>

<400> 17

<210> 18

<211> 638

<212> PRT

<213> Equus caballus

<400> 18

<210> 19

<211> 6181 5 <212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS 10 <222> (179)..(2302)

<223>

<400> 19

<210> 20

<211> 707

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 20

<210> 21

<211> 6141 5 <212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS 10 <222> (139)..(2262)

<223>

<400> 21

<210> 22

<211> 707

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 22

<210> 23

<211> 6114 5 <212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS 10 <222> (139)..(2235)

<223>

<400> 23

<210> 24

<211> 698

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 24

<210> 25

<211> 3548 5 <212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS 10 <222> (179)..(2257)

<223>

<400> 25

<210> 26

<211> 692

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 26

<210> 27

<211> 3508 5 <212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS 10 <222> (139)..(2217)

<223>

<400> 27

<210> 28

<211> 692

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 28

<210> 29

<211> 2109 5 <212> ADN

<213> Gallus gallus

<220>

<221> CDS 10 <222> (1) .. (2109)

<223>

<400> 29

<210> 30

<211> 702

<212> PRT

<213> Gallus gallus

<400> 30

<210> 31 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador T3

<400> 31 aattaaccct cactaaaggg: 20

<210> 32 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador T7

<400> 32 taatacgact cactatagg: 19

<210> 33 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 33 aaggtttgaa tggagtgc: 18

<210> 34 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 34 tgctcctttt caccactg: 18

<210> 35 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador GAPDH

<400> 35 gggctgcttt taactctg: 18

<210> 36 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador GAPDH

<400> 36 ccaggaaatg agcttgac: 18

<210> 37 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial

<220> <223> péptidos

<400> 37

<210> 38

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 38 aggtsharct gcagsagtcw gg 22

<210> 39

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 39 ctcgagttaa ttcacttgct gag 23

<210> 40

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 40

<210> 41

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 41

15 20: <210> 42 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 42

25: <210> 43 <211> 148 <212> PRT <213> Mus musculus

30: <400> 43

<210> 44

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 44

<210> 45

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 45

<210> 46

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 46

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400>: 47 10

<210> 48

<211> 444

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 48

<210> 49

<211> 444

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 49

<210> 50

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 50

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400>: 53 10

20 25: <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51

30: <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus

35: <400> 52

<210> 54

<211> 398

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 54

<210> 55

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 55

<210> 56

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 56

<210> 57

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 57

<210> 58

<211> 117

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 58

<210> 59

<211> 353

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 59

<210> 60

<211> 11

<212> PRT 15 <213> Mus musculus

<400> 60

<210> 61

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 61 5

<210> 62

<211> 9 10 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 62

<210> 63

<211> 94

<212>: PRT 20 <213> Mus musculus

<400> 63

<210> 65

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 65

<210> 66

<211> 6

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 66

<210> 67

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 67

<210> 68

<211> 105

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 68

<210> 69

<211> 317

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 69

<210> 72

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 72

<210> 73

<211> 100

<212>: PRT 15 <213> Mus musculus

25

<210> 64

<211> 283

<212> ADN

<213> Mus musculus

30

<400> 64

15: <210> 70 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 70

20 25: <210> 71 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 71

<400> 73

20

<210> 74

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

25

<400> 74

30 <210> 75

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 75

5

10: <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 76

15 20: <210> 77 <211> 90 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 77

25 <210> 78

<211> 301

<212> ADN

<213> Mus musculus

30 <400> 78

<210> 79

<211> 290

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 79

15: <210> 80 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 80

20 25: <210> 81 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 81

30 <210> 82

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

35 <400> 82

<210> 83

<211> 116

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 83 <400> 86

10: <210> 84 <211> 11 <212> PRT

<213> Mus musculus

15: <400> 84

20: <210> 85 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 85

25

30: <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus

5 <210> 87

<211> 100

<212> PRT

<213> Mus musculus

10 <400> 87

<210> 88 15 <211> 352

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 88 20

<210> 89

<211> 302

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 89

5 <210> 90

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

10 <400> 90

<210> 91 15 <211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 91 20

<210> 92

<211> 14

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 92

<210> 93

<211> 108

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 93

<210> 94

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 94

<210> 95

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 95

<210> 96

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 96

<210> 97

<211> 104 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 97

<210> 98

<211> 326

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 98

<210> 99

<211> 313

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 99

<210> 100

<211> 5 5 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 100

<210> 101

<211> 17

<212> PRT 15 <213> Mus musculus

<400> 101

20 25: <210> 102 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 102

30: <210> 103 <211> 109 <212> PRT <213> Mus musculus

35: <400> 103

<210> 104

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 104

<210> 105

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 105

<210> 106

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 106

<210> 107

<211> 94

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 107

<210> 108

<211> 329

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 108

15

<210> 109

<211> 284

<212> ADN

<213> Mus musculus

20

<400> 109

<210> 110

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 110

<210> 111

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 111

<210> 112

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 112

<210> 113

<211> 111

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 113 <210> 114

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 114

<210> 115

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 115

<210> 116

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 116

<210> 117 <211> 102

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 117

<210> 118 10 <211> 340

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 118 15

<210> 119

<211> 306

<212> ADN.

<213> Mus musculus

<400> 119

<210> 120

<211> 5 5 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 120

<210> 121

<211> 17

<212> PRT 15 <213> Mus musculus

<400> 121

20

<210> 122

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

25

<400> 122

30 <210> 123

<211> 101

<212> PRT

<213> Mus musculus

35 <400> 123 <210> 124

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 124

<210> 125

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 125

<210> 126

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 126

<210> 127

<211> 99

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 127

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 128 10

<210> 129

<211> 298 15 <212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 129 20

<210> 130

<211> 22 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 130 aggtsharct gcagsagtcw gg: 22

<210> 131 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 131 tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc ccag: 34

<210> 132 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 132 tccgatatcc agctgaccca gtctcca: 27

<210> 133 <211> 31 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 133 gtttgatctc cagcttggta cchscdccga a: 31

<210> 134 <211> 15 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 134 agtcacgacg ttgta: 15

<210> 135 <211> 17 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador

<400> 135 caggaaacag ctatgac: 17

<210> 136

<211> 58

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 136

<210> 137 10 <211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 137 15

<210> 138

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 138

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un anticuerpo o un fragmento del mismo para su uso en un método para el tratamiento y/o la prevención del cáncer, teniendo el anticuerpo o el fragmento una reactividad con una proteína CAPRINA-1 que tiene una secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEC ID Nº 2 to 30 pares.
2.

El anticuerpo o el fragmento de acuerdo con la reivindicación 1, que tienen reactividad inmunológica contra un fragmento de la proteína CAPRINA-1 que es un polipéptido que consiste en los restos de aminoácidos Nº 50 – 98 o los restos de aminoácidos Nº 233 – 305 de la secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEC ID Nº 2 to 30 pares, excluyendo las SEC ID Nº 6 y 18.
3.

El anticuerpo o el fragmento de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene reactividad inmunológica contra un polipéptido parcial de CAPRINA-1 que tiene una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 37 o la SEC ID Nº 136.
4.

El anticuerpo o el fragmento con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal.
5.

El anticuerpo o el fragmento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monocatenario o un anticuerpo biespecífico.
6.

Un anticuerpo o un fragmento del mismo para su uso en un método para el tratamiento y/o la prevención del cáncer que tiene reactividad inmunológica contra la proteína CAPRINA-1, y que comprende:

(i)

una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 40, 41 y 42 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 44, 45y 46; o

(ii)

una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 40, 41 y 42 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 50, 51y 52; o

(iii) una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 40, 41 y 42 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 55, 56y 57; o

(iv)

una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 40, 41 y 42 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 60, 61y 62; o

(v)

una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 40, 41 y 42 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 65, 66y 67; o

(vi)

una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 70, 71 y 72 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 74, 75y76; o

(vii) una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 80, 81 y 82 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 84, 85y86; o

(viii) una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 90, 91 y 92 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 94, 95 y96; o

(ix)

una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 100, 101 y 102 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 104, 105 y 106; o

(x)

una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 110, 111 y 112 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 114, 115 y 116; o

(xi)

una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 120, 121 y 122 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias que se muestran en las SEC ID Nº 124, 125 y 126.
7.

El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 6, que es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monocatenario o un anticuerpo biespecífico.
8.

El anticuerpo o el fragmento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el cáncer es cáncer de mama, tumor cerebral, leucemia, linfoma, cáncer de pulmón, cáncer de esófago o cáncer de colon.
9.

Una composición farmacéutica para su uso en un método para el tratamiento y/o la prevención del cáncer, que comprende como principio activo, o bien:

(a)

el anticuerpo o el fragmento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o

(b)

el anticuerpo o el fragmento de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7.