ES2704909T3 - Composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención del cáncer - Google Patents

Composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención del cáncer Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 1, 2 y 3 y una región variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 4, 5 y 6, y tiene reactividad inmunológica con una proteína CAPRINA-1, o un fragmento de la misma.

Description

DESCRIPCIÓN
Composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención del cáncer
Campo técnico
La presente invención se refiere a un anticuerpo contra CAPRINA-1 o un fragmento del mismo y al novedoso uso farmacéutico del mismo como agente terapéutico y/o preventivo para un cáncer, etc.
Antecedentes de la técnica
Los cánceres son enfermedades que representan la causa principal de muerte. El tratamiento actual del mismo consiste principalmente en terapia quirúrgica, que puede combinarse con radioterapia y/o quimioterapia. A pesar del reciente desarrollo de novedosas técnicas quirúrgicas o el descubrimiento de novedosos agentes anticancerosos en los últimos años, el tratamiento actual del cáncer tiene un resultado insuficientemente mejorado, a excepción de para algunos tipos de cáncer. Con los recientes avances en biología molecular o inmunología del cáncer, en los últimos años se han identificado anticuerpos que reaccionan específicamente con cáncer, antígenos de cáncer que son reconocidos por los linfocitos T citotóxicos, genes que codifican tales antígenos de cáncer y similares, lo que genera expectativas acerca de una terapia para el cáncer específica dirigida a los antígenos del cáncer.
La proteína asociada a la activación citoplásmica y a la proliferación 1 (CAPRINA-1) se conoce como una proteína intracelular que se expresa tras la activación o división celular de las células normales que están en fase de reposo y forma gránulos de estrés citoplasmáticos con los ARN intracelulares para participar en la regulación del transporte y la traducción de los ARNm. Se ha descubierto que esta proteína se expresa específicamente en la superficie de las células cancerosas y se está estudiando como diana para fármacos de anticuerpos para el tratamiento del cáncer (bibliografía de patente 1 y 19).
Lista de citas
Bibliografía de patente
Bibliografía de patente 1: WO2010/016526
Bibliografía de patente 2: WO2011/096517
Bibliografía de patente 3: WO2011/096528
Bibliografía de patente 4: WO2011/096519
Bibliografía de patente 5: WO2011/096533
Bibliografía de patente 6: WO2011/096534
Bibliografía de patente 7: WO2011/096535
Bibliografía de patente 8: WO2013/018886
Bibliografía de patente 9: WO2013/018894
Bibliografía de patente 10: WO2013/018892
Bibliografía de patente 11: WO2013/018891
Bibliografía de patente 12: WO2013/018889
Bibliografía de patente 13: WO2013/018883
Bibliografía de patente 14: WO2013/125636
Bibliografía de patente 15: WO2013/125654
Bibliografía de patente 16: WO2013/125630
Bibliografía de patente 17: WO2013/125640
Bibliografía de patente 18: WO2013/147169
Bibliografía de patente 19: WO2013/147176
Sumario de la invención
Problema técnico
Un objetivo de la presente invención es producir un anticuerpo dirigido a la CAPRINA-1 que se exprese específicamente en la superficie de las células cancerosas y tenga mejor actividad antitumoral que los anticuerpos convencionales, y proporcionar el anticuerpo para su uso como agente para el tratamiento y/o la prevención del cáncer.
Solución al problema
La invención proporciona un anticuerpo o un fragmento del mismo, como se define en las reivindicaciones; y productos relacionados y productos para su uso, también como se define en las reivindicaciones.
La presente invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención del cáncer, que comprende un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende las SEQ ID NO: 1, 2 y 3, y una región variable de la cadena ligera que comprende las SEQ ID NO: 4, 5 y 6, y tiene reactividad inmunológica con una proteína CAPRINA-1, o un fragmento de la misma como principio activo.
En una realización de la misma, el cáncer es cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, tumor cerebral, cáncer de estómago, cáncer de útero, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de esófago, leucemia, linfoma, cáncer de hígado, cáncer de vesícula biliar, sarcoma, mastocitoma, melanoma, cáncer de la corteza suprarrenal, tumor de Ewing, linfoma de Hodgkin, mesotelioma, mieloma múltiple, cáncer de testículo, cáncer de tiroides, o cáncer de cabeza y cuello.
En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monocatenario o un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico).
La presente memoria descriptiva abarca los contenidos descritos en la memoria descriptiva y/o los dibujos de la solicitud de patente japonesa número 2013-166164 en los que se basa la prioridad de la presente solicitud.
Efectos ventajosos de la invención
El anticuerpo contra la CAPRINA-1 de acuerdo con la presente invención daña las células cancerosas. Por tanto, el anticuerpo contra la CAPRINA-1 de acuerdo con la presente invención es útil en el tratamiento y/o prevención del cáncer.
Descripción de las realizaciones
El anticuerpo contra el polipéptido CAPRINA-1 usado en la presente invención puede evaluarse por su actividad antitumoral, tal como se describe más adelante, examinando ex vivo la presencia o ausencia de actividad citotóxica mediada por inmunocitos contra las células tumorales que expresan el polipéptido o examinando in vivo la inhibición del crecimiento tumoral en un animal con cáncer.
El anticuerpo contra CAPRINA-1 de acuerdo con la presente invención puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal y es, preferentemente, un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo contra CAPRINA-1 según la presente invención puede ser cualquier tipo de anticuerpo que puede ejercer actividad antitumoral e incluye, por ejemplo, anticuerpos recombinantes (por ejemplo, anticuerpos sintéticos, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y anticuerpos monocatenarios (scFv)), anticuerpos humanos y sus fragmentos de anticuerpo, (por ejemplo, Fab, F(ab')2 y Fv). Estos anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden prepararse mediante procedimientos generalmente conocidos por los expertos en la materia. En el caso de un sujeto humano, es deseable un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado para inhibir o suprimir reacciones de rechazo.
La frase "que se une específicamente a la proteína CAPRINA-1" significa que el anticuerpo se une específicamente a la proteína CAPRINA-1 sin unirse sustancialmente a otras proteínas.
El sujeto de acuerdo con la presente invención, cuyo cáncer se va a tratar y/o prevenir es un mamífero, tal como un ser humano, un animal de compañía, ganado o un animal de deporte, y un sujeto preferente es un ser humano.
En lo sucesivo en el presente documento, se describirán la preparación del antígeno,la preparación del anticuerpo y la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención.
<Preparación del antígeno para la preparación de anticuerpos>
Una proteína o fragmento de la misma usada como antígeno sensibilizante para obtener el anticuerpo contra la CAPRINA-1 de acuerdo con la presente invención no se limita por la especie animal que sirve de origen, incluyendo seres humanos, perros, gatos, ganado bovino, caballos, ratones, ratas y pollos. Sin embargo, se prefiere seleccionar el antígeno sensibilizante en vista de su compatibilidad con las células progenitoras para su uso en la fusión celular. En general, se prefiere una proteína procedente de mamífero. Particularmente, se prefiere una proteína procedente de ser humano. Por ejemplo, cuando la CAPRINA-1 es CAPRINA-1 humana, pueden usarse la proteína CAPRINA-1, un péptido parcial de la misma, células que expresan CAPRINA-1 humana o similares.
Pueden obtenerse secuencias de nucleótidos y secuencias de aminoácidos de una CAPRINA-1 humana y homólogas de las mismas, por ejemplo, accediendo a GenBank (NCBI, EE.UU.) y usando un algoritmo tal como BLAST o FASTA (Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993; y Altschul y col., Nucleic Acids Res. 25: 3389­ 3402, 1997).
En la presente invención, en referencia a la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 16 o 18) o la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 17 o 19) de la CAPRINA-1 humana, la CAPRINA-1 diana es un ácido nucleico o una proteína que consiste una secuencia que tiene del 70 % al 100 %, preferentemente del 80 % al 100 %, más preferentemente de un 90 % a un 100 %, aún más preferentemente de un 95 % a un 100 %, por ejemplo, del 97 % al 100 %, del 98 % al 100 %, del 99 % al 100 % o del 99,5 % al 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos o la secuencia de aminoácidos del ORF o porción madura de la referencia (las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 19 en comparación una con otra difiere en los restos de aminoácidos en la siguiente posición 690). En este contexto, la expresión "% de identidad de secuencia" significa un porcentaje ( %) del número de aminoácidos (o bases) idénticos respecto del número total (incluido el número de huecos) de aminoácidos (o bases) cuando se alinean dos secuencias de tal forma que pueda lograrse el máximo grado de similitud o identidad con o sin huecos introducidos.
El fragmento de la proteína CAPRINA-1 tiene una longitud que va desde la longitud del aminoácido de un epítopo (determinante antigénico), que es la unidad más pequeña reconocida por el anticuerpo, hasta menos de la longitud completa de la proteína. El epítopo se refiere a un fragmento polipeptídico que tiene antigenicidad o inmunogenicidad en mamíferos, preferentemente, de seres humanos. Su unidad más pequeña consiste en aproximadamente 7 a 12 aminoácidos, por ejemplo, de 8 a 11 aminoácidos.
Un fragmento de polipéptido que comprende la proteína CAPRINA-1 humana mencionada anteriormente o un péptido parcial de la misma se pueden sintetizar de acuerdo con un procedimiento de síntesis química, por ejemplo, un procedimiento Fmoc (fluorenilmetiloxicarbonilo) o tBoc (t-butiloxicarbonilo) (Seikagaku Jikken Koza 1 (Biochemical Experimentation Course 1 in English), the Japanese Biochemical Society ed., Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd. (Japón), 1981). También, la proteína CAPRINA-1 humana o el fragmento polipeptídico se pueden sintetizar mediante un procedimiento de rutina utilizando varios sintetizadores de péptidos disponibles comercialmente. Como alternativa, puede prepararse un polinucleótido que codifica el polipéptido usando estrategias de ingeniería genética conocidas en la materia (Sambrook y col., Molecular Cloning, 2a edición, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology, 3a edición, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons; etc.), y este polinucleótido se incorpora en vectores de expresión, que luego se transfieren a las células huésped para que el polipéptido se produzca en las células huésped. De esta manera, se puede obtener la proteína CAPRINA-1 humana o el fragmento de polipéptido de la misma de interés.
El polinucleótido que codifica el polipéptido puede prepararse fácilmente mediante estrategias de ingeniería genética conocidas en la técnica o procedimientos rutinarios usando sintetizadores de ácidos nucleicos disponibles en el mercado. Por ejemplo, puede prepararse un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos del gen de la CAPRINA-1 mediante la PCR usando un ADN cromosómico humano o una biblioteca de ADNc como molde y un par de cebadores diseñados para que puedan amplificar la secuencia de nucleótidos. Las condiciones de reacción para esta PCR pueden determinarse de manera adecuada. Ejemplos de las condiciones pueden incluir, aunque no de forma limitativa, 30 ciclos que implican cada uno etapas de reacción que consisten en 94 °C durante 30 segundos (desnaturalización), 55 °C durante de 30 segundos a 1 minuto (hibridación) y 72 °C durante 2 minutos (elongación) usando ADN polimerasa termoestable (por ejemplo, Taq polimerasa o Pfu polimerasa) y un tampón de PCR que contiene Mg2+, seguido de reacción a 72 °C durante 7 minutos. La estrategia de la PCR, condiciones, etc., se describen en, por ejemplo, Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology, 3a edición, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons (particularmente, capítulo 15).
También, pueden prepararse sondas o cebadores adecuados basándose en información acerca de la secuencia de nucleótidos del gen de CAPRINA-1 y la secuencia de aminoácidos de la proteína CAPRINA-1 y usarse en la exploración de, por ejemplo, una biblioteca de ADNc humano, para aislar el ADN deseado. Es preferente que la biblioteca de ADNc se produzca a partir de células, órganos o tejidos que expresan la proteína CAPRINA-1. Ejemplos de dichas células o tejidos incluyen células o tejidos procedentes de los testículos así como de cánceres o tumores, tales como leucemia, cáncer de mama, linfoma, tumor cerebral, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de estómago, cáncer de útero, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de esófago, sarcoma, mastocitoma, cáncer de hígado, cáncer de vesícula biliar, melanoma, cáncer de la corteza suprarrenal, tumor de Ewing, linfoma de Hodgkin, mesotelioma, mieloma múltiple, cáncer de testículo, cáncer de tiroides y cáncer de cabeza y cuello. Estos procedimientos, que incluyen la preparación de sondas o cebadores, la construcción de una biblioteca de ADNc, la exploración de la biblioteca de ADNc y la clonación del gen de interés, son conocidos por los expertos en la técnica y pueden realizarse de acuerdo con los procedimientos descritos en, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning, 2a edición, Current Protocols in Molecular Biology (1989), and Ausubel y col., (ibid.). El ADN que codifica la proteína CAPRINA-1 humana y el péptido parcial de la misma puede obtenerse a partir del ADN obtenido de este modo.
Las células huésped en las que se introducen los vectores de expresión pueden ser cualquier célula capaz de expresar el polipéptido. Ejemplos de células procariotas incluyen, aunque no de forma limitativa, E. coli. Ejemplos de células eucariotas incluyen, aunque no de forma limitativa: células de mamífero, tales como células de riñón de mono COS1 y células de ovario de hámster chino CHO; una línea celular de riñón embrionario humano HEK293; la línea celular de piel embrionaria de ratón NIH3T3; células de levadura, tales como células de levadura en gemación y de levadura en fisión; células de gusano de seda; y células de huevo de Xenopus.
En caso de usar células procariotas como células huésped, vectores de expresión que tienen un origen que permite la replicación en las células procariotas, un promotor, un sitio de unión al ribosoma, un sitio de clonación múltiple, un terminador, un gen de resistencia a fármacos, un gen complementario auxótrofo, etc., se utilizan como vectores de expresión. etc. Ejemplos de vectores de expresión para E. coli pueden incluir la serie pUC, pBluescript II, sistemas de expresión pET y sistemas de expresión pGEX. El ADN que codifica el polipéptido se incorpora en dichos vectores de expresión, y las células huésped procariotas se pueden transformar con estos vectores, seguido del cultivo de los transformantes obtenidos de tal forma que el polipéptido codificado por el ADN se expresa en las células huésped procariotas. A este respecto, el polipéptido puede expresarse como una proteína de fusión con otra proteína.
En caso de usar células eucariotas como células huésped, se pueden usar vectores de expresión para células eucarióticas que tengan un promotor, una región de cote y empalme, un sitio de adición de poli (A), etc., se utilizan como vectores de expresión. Ejemplos de tales vectores de expresión pueden incluir los vectores pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV, pRS, pcDNA3 y pYES2. De la misma manera que anteriormente, el ADN que codifica el polipéptido se incorpora en dichos vectores de expresión y las células huésped eucariotas se pueden transformar con estos vectores, seguido del cultivo de los transformantes obtenidos de tal forma que el polipéptido codificado por el ADN se expresa en las células huésped eucariotas. En el caso de utilizar vectores de expresión tales como pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1 o pEGFP-C1, el polipéptido puede expresarse como varias proteínas de fusión marcadas con el marcador His (por ejemplo, (His)a a (His)10), el marcador FLAG, el marcador myc, el marcador HA, GFP o similares.
La transferencia de los vectores de expresión a las células huésped puede emplear un procedimiento bien conocido, tal como electroporación., un procedimiento de fosfato de calcio, un procedimiento de liposomas, un procedimiento de DEAE dextrano, microinyección, infección viral, lipofección o unión con péptidos que penetran en las células.
Los tratamientos de separación conocidos en la técnica se pueden llevar a cabo en combinación para aislar y purificar el polipéptido de interés de las células huésped. Ejemplos del mismo incluyen, aunque no de forma limitativa, tratamiento con un desnaturalizante (por ejemplo, urea) o un tensioactivo, ultrasonidos, digestión enzimática, extracción por saturación de sal, fraccionamiento y precipitación de disolventes, diálisis, centrifugación, ultrafiltración, filtración en gel, SDS-PAGE, electroforesis de isoelectroenfoque, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, cromatografía de afinidad y cromatografía de fase inversa.
El antígeno preparado de este modo puede usarse como un antígeno sensibilizante como se menciona más adelante para producir el anticuerpo de acuerdo con la presente invención.
<Estructura del anticuerpo>
Los anticuerpos (inmunoglobulinas) normalmente son glucoproteínas heteromultiméricas que comprenden cada una al menos dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Las inmunoglobulinas, a excepción de las IgM, son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150 kDa, cada una compuesta por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Normalmente, Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada mediante un puente disulfuro covalente, aunque el número de puentes disulfuro entre cadenas pesadas varía entre diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada una de las cadenas pesada y ligera también tienen puentes disulfuro intracatenarios. Cada cadena pesada tiene un dominio variable (región VH) en un extremo, seguido de una serie de regiones constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (región VL) en un extremo y tiene una región constante sencilla en el otro extremo. La región constante de la cadena ligera se alinea con la primera región constante de la cadena pesada, mientras que el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Regiones particulares denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en los dominios variables del anticuerpo exhiben una variabilidad específica e imparten especificidad de unión al anticuerpo. Las porciones relativamente conservadas en las regiones variables se denominan regiones marco (FR). Los dominios variables completos de cadena pesada y de cadena ligera tienen cada uno una estructura en la que cuatro regiones marco están conectadas a través de tres regiones determinantes de complementariedad, es decir, una estructura en la que FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 están conectados en este orden desde el extremo N. Estas tres regiones determinantes de la complementariedad en la cadena pesada se llaman CDRH1, CDRH2 y CDRH3 en este orden desde el extremo N de la misma. Asimismo, las regiones determinantes de la complementariedad en la cadena ligera se denominan CDRL1, CDRL2 e CDRL3. La CDRH3 es la más importante para la especificidad de unión del anticuerpo por su antígeno. Además, las CDR en cada cadena se mantienen próximas entre sí mediante las regiones marco y contribuyen a la formación de un sitio de unión a antígeno en el anticuerpo, junto con las regiones determinantes de la complementariedad derivadas de la otra cadena. Las regiones constantes no contribuyen directamente a la unión anticuerpo-antígeno, pero muestran varias funciones efectoras, por ejemplo, implicación en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), fagocitosis mediada por la unión a un receptor Fcy, semivida/velocidades de eliminación mediada por un receptor Fc neonatal (FcRn) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) mediada por un componente C1q en la cascada de complemento.
<Preparación de anticuerpos>
El anticuerpo anti-CAPRINA-1 de acuerdo con la presente invención significa un anticuerpo que tiene reactividad inmunológica con una proteína CAPRINA-1 de longitud completa o con un fragmento de la misma.
En este contexto, la "reactividad inmunológica" significa la propiedad del anticuerpo de unirse al antígeno de CAPRINA-1 (una proteína CAPRINA-1 de longitud completa o un polipéptido parcial de la misma) in vivo. Mediante dicha unión a CAPRINA-1, el anticuerpo de la presente invención ejerce la función de dañar (por ejemplo, matar, suprimir, o causar la regresión de) las células tumorales. El anticuerpo de la presente invención puede dañar el tumor, por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer pancreático, cáncer colorrectal (por ejemplo, cáncer de colon), cáncer de pulmón, tumor cerebral, cáncer de estómago, cáncer de útero, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de esófago, leucemia, linfoma, cáncer de hígado, cáncer de vesícula biliar, sarcoma, mastocitoma, melanoma, cáncer de la corteza suprarrenal, tumor de Ewing, linfoma de Hodgkin, mesotelioma, mieloma múltiple, cáncer de testículo, cáncer de tiroides o cáncer de cabeza y cuello a través de la unión a la proteína CAPRINA-1.
El anticuerpo de la presente invención no está particularmente limitado, preferentemente, siempre que el anticuerpo sea un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo de la presente invención incluye anticuerpos sintéticos, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, diacuerpos y triacuerpos), anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos monocatenarios, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, F(ab')2 y Fv), y similares. También, el anticuerpo es una molécula de inmunoglobulina de cualquier clase, por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgA, IgD o IgY, o de cualquier subclase, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 o IgA2.
El anticuerpo puede modificarse además mediante desglicosilación, acetilación, formilación, amidación, fosforilación, PEGilación o similares, además de glicosilación.
En lo sucesivo en el presente documento, se mostrarán ejemplos de preparación de diversos anticuerpos monoclonales.
Por ejemplo, una línea celular de cáncer de mama SK-BR-3 que expresa CAPRINA-1 se administra a cada ratón para la inmunización. Se extrae el bazo de este ratón. Después de la separación de los esplenocitos, se fusionan las células con células de mieloma de ratón. Los clones que producen anticuerpos que tienen un efecto inhibidor del crecimiento de células cancerosas se seleccionan de entre las células de fusión obtenidas (hibridomas). Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales que tienen un efecto inhibidor del crecimiento de células cancerosas se aíslan y estos hibridomas se cultivan. El anticuerpo de la presente invención puede prepararse mediante purificación a partir del sobrenadante de cultivo de acuerdo con un procedimiento general de purificación por afinidad.
Los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales se pueden preparar, por ejemplo, como se establece a continuación: en primer lugar, los animales se inmunizan con el antígeno sensibilizante de acuerdo con un procedimiento conocido en la técnica. Este procedimiento de inmunización implica generalmente, inyectar por vía intraperitoneal o subcutánea el antígeno sensibilizante a mamíferos. Específicamente, se mezcla el antígeno sensibilizante diluido con PBS o suspendido en PBS (solución salina tamponada con fosfato) solución salina fisiológica o similar en una cantidad apropiada, si se desea, con una cantidad apropiada de un adyuvante convencional, por ejemplo, adyuvante completo de Freund. Después de la emulsificación, la emulsión resultante se administra a cada mamífero varias veces cada 4 a 21 días. Como alternativa, se puede usar un vehículo apropiado para la inmunización con el antígeno sensibilizante.
Después de la confirmación de un aumento del nivel del anticuerpo deseado en el suero del animal inmunizado de este modo, los inmunocitos se recogen del animal y se someten a fusión celular. Ejemplos preferentes de los inmunocitos incluyen, particularmente, esplenocitos.
Las células de mieloma de mamífero se usan como células progenitoras asociadas para fusionarse con los inmunocitos. En la materia se conocen varias líneas celulares, por ejemplo, P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. y Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D.H. y col., Cell (1976) 8, 405­ 415), SP2/0 (Shulman, M. y col., Nature (1978) 276, 269-270), FO (deSt. Groth, S.F. y col., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I.S. J. Exp.Med. (1978) 148, 313-323), R210 (Galfre, G. y col., Nature (1979) 277, 131­ 133), 240E-1, 240E-W y 240E-W2 se usan preferentemente como células de mieloma.
La fusión celular entre los inmunocitos y las células de mieloma puede realizarse básicamente de acuerdo con un procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, el procedimiento de Kohler y Milstein (Kohler, G. y Milstein, C. Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).
Más específicamente, la fusión celular se lleva a cabo, por ejemplo, en presencia de un promotor de fusión celular en un medio nutriente convencional. Por ejemplo, como promotor de fusión se usa polietilenglicol (PEG virus de hemaglutinante de Japón (VHJ)). Si se desea, se puede añadir adicionalmente para su uso un auxiliar tal como dimetilsulfóxido para mejorar la eficacia de la fusión.
La proporción entre los inmunocitos y las células de mieloma puede ajustarse de manera arbitraria. Por ejemplo, se puede usar un medio RPMI1640 o un medio MEM adecuado para el crecimiento de las líneas celulares de mieloma, o un medio convencional para su uso en este tipo de cultivo celular como medio para usar en la fusión celular. Además, puede usarse un complemento de suero, tal como suero de ternero fetal (FCS) en combinación con el medio.
Para la fusión celular, se mezclan exhaustivamente los inmunocitos y las células de mieloma en una cantidad predeterminada del medio. Normalmente se añade una solución de PEG (peso molecular promedio: por ejemplo, de aproximadamente 1000 a 6000) precalentada a aproximadamente 37 °C a la mezcla a una concentración del 30 al 60 % (p/v) y se mezcla con la misma para formar los hibridomas de interés. Posteriormente, se prefiere eliminar los agentes de fusión celular o similares desfavorables para el crecimiento de los hibridomas, repitiendo los procedimientos de adición secuencial de un medio apropiado y eliminando el sobrenadante por centrifugación.
Los hibridomas obtenidos de este modo se cultivan en un medio selectivo convencional, por ejemplo, un medio HAT (un medio que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina) para la selección. Se continúa este cultivo en el medio HAT durante un periodo (normalmente, de varios días a varias semanas) suficiente para la muerte de las células (células no fusionadas) distintas de los hibridomas de interés. Posteriormente, los hibridomas que producen el anticuerpo de interés se someten a detección y se clonan como clones individuales mediante un procedimiento de dilución límite convencional.
Además de tal obtención de los hibridomas mediante la inmunización de animales no humanos con el antígeno, se pueden obtener hibridomas productores de anticuerpos humanos que tienen la actividad deseada (por ejemplo, actividad inhibidora del crecimiento celular) sensibilizando linfocitos humanos, por ejemplo, linfocitos humanos infectados con el virus EB, con la proteína, células que expresan proteínas, o lisados de las mismas in vitro y fusionando los linfocitos sensibilizados con células de mieloma de origen humano capaces de dividirse permanentemente, por ejemplo, U266 (n.° de registro TIB 196).
Los hibridomas productores de anticuerpo monoclonal preparados de este modo pueden subcultivarse en un medio convencional y también pueden almacenarse durante un largo periodo en nitrógeno líquido.
Específicamente, el antígeno deseado o las células que expresan el antígeno deseado se usan como antígeno sensibilizante en la inmunización de acuerdo con un procedimiento de inmunización convencional. Los inmunocitos obtenidos se fusionan con células progenitoras conocidas en la materia de acuerdo con un procedimiento de fusión celular convencional. Las células productoras de anticuerpos monoclonales (hibridomas) pueden explorarse mediante un procedimiento de exploración convencional para preparar el anticuerpo de interés.
El antígeno puede prepararse de acuerdo con, por ejemplo, un procedimiento que usa células animales (publicación de patente JP (Kohyo) n.° 2007-530068 A (2007)) o un procedimiento que usa baculovirus (por ejemplo, publicación internacional n.° WO98/46777). Cuando el antígeno tiene baja inmunogenicidad, este antígeno se puede unir a una macromolécula inmunogénica, tal como la albúmina para la inmunización. El antígeno se puede administrar junto con un adyuvante para la inmunización.
Como alternativa, el anticuerpo de la presente invención se puede obtener como un anticuerpo recombinante génico producido utilizando una técnica de recombinación de genes que implica: clonar un gen del anticuerpo desde un hibridoma; incorporar el gen del anticuerpo en vectores adecuados; y transferir los vectores a huéspedes (véase, por ejemplo, Carl, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIe S, publicado en el Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Específicamente, los ADNc de la región variable (región V) del anticuerpo se sintetizan a partir de los ARNm del hibridoma utilizando transcriptasa inversa. Después de obtener los ADN que codifican las regiones V del anticuerpo de interés, los ADN se ligan con ADN que codifican las regiones constantes de anticuerpos deseadas (regiones C). Los productos de ligamiento resultantes se incorporan en vectores de expresión. Como alternativa, los ADN que codifican la región V del anticuerpo pueden incorporarse en vectores de expresión que contienen ADN de la región C del anticuerpo. Estos ADN se incorporan en los vectores de expresión para expresarse bajo el control de regiones de control de la expresión, por ejemplo, un potenciador y un promotor. A continuación, las células huésped se pueden transformar con los vectores de expresión resultantes y se les permite expresar el anticuerpo.
El anticuerpo anti-CAPRINA-1 de la presente invención es, preferentemente, un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo monoclonal incluye anticuerpos monoclonales humanos, anticuerpos monoclonales de animales no humanos (por ejemplo, ratón, rata, de conejo y de pollo), anticuerpos monoclonales quiméricos y similares. El anticuerpo monoclonal puede prepararse mediante el cultivo de hibridomas obtenidos mediante la fusión entre esplenocitos de mamíferos no humanos (por ejemplo, ratones, ratones productores de anticuerpos humanos, pollos o conejos) inmunizados con la proteína CAPRINA-1 o un fragmento de la misma y células de mieloma. El anticuerpo quimérico es un anticuerpo preparado a partir de una combinación de secuencias derivadas de distintos animales y es, por ejemplo, un anticuerpo compuesto por regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera de un anticuerpo de ratón y regiones constantes de cadena ligera y de cadena pesada de un anticuerpo humano. El anticuerpo quimérico se puede preparar usando un procedimiento conocido en la técnica y se obtiene, por ejemplo: ligando los ADN que codifican las regiones V del anticuerpo con los ADN que codifican las regiones C del anticuerpo humano; incorporando los productos del ligado resultantes en vectores de expresión; y transfiriendo los vectores a huéspedes para la producción de anticuerpos.
En los ejemplos mencionados más adelante, una pluralidad de anticuerpos monoclonales humanizados y un anticuerpo monoclonal quimérico de conejo-ser humano se prepararon y se confirmó que tenían un fuerte efecto antitumoral. Todos estos anticuerpos monoclonales tienen una región variable de cadena pesada (región VH) que comprende CDR1 representada por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1, c DR2 representada por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 y CDR3 representada por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:3, y una región variable de la cadena ligera (región VL) que comprende CDR1 representada por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO. 4, CDR2 representado por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:5 y CDR3 representada por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:6. Estos anticuerpos monoclonales incluyen el anticuerpo humanizado N.° 0 que consiste en una región VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7 y una región VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:11, el anticuerpo humanizado N.° 1 que consiste en una región VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8 y una región VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:11, el anticuerpo humanizado N.° 2 que consiste en una región VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8 y una región VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:12, el anticuerpo humanizado N.° 3 que consiste en una región VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8 y una región VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:13, el anticuerpo humanizado N.° 4 que consiste en una región VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7 y una región VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:12, el anticuerpo humanizado N.° 5 que consiste en una región VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7 y una región VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:13, el anticuerpo humanizado N.° 6 que consiste en una región VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7 y una región VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:15, el anticuerpo humanizado N.° 7 que consiste en una región VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8 y una región VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:15, el anticuerpo humanizado N.° 8 que consiste en una región VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una región VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:15, el anticuerpo humanizado N.° 9 que consiste en una región VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10 y una región VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:14, el anticuerpo humanizado N.° 10 que consiste en una región VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10 y una región VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:15, y un anticuerpo quimérico de ser humano-conejo que consiste en una región VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:20 y una región VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:21.
El anticuerpo humanizado, también denominado anticuerpo humano reformado, es un anticuerpo diseñado por ingeniería. El anticuerpo humanizado se construye injertando regiones determinantes de la complementariedad de un anticuerpo humano con regiones determinantes de la complementariedad de un anticuerpo derivado de un animal inmunizado. También se conoce un enfoque general de recombinación génica.
Específicamente, las secuencias de ADN diseñadas para unir las regiones determinantes de la complementariedad de, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, de conejo o de pollo, y regiones marco de un anticuerpo humano se sintetizan por PCR a partir de varios oligonucleótidos preparados que tienen porciones terminales que se superponen entre sí. Los ADN obtenidos se ligan con ADN que codifican regiones constantes de anticuerpos humanos. Posteriormente, los productos de ligamiento resultantes se incorporan en vectores de expresión, que después se transfieren a huéspedes para la producción de anticuerpos para obtener el anticuerpo de interés (véase la publicación de solicitud de patente europea n.° EP239400 y la publicación internacional n.° WO96/02576). Las regiones marco de un anticuerpo humano conectado a través de las regiones determinantes de la complementariedad se seleccionan de manera que las regiones determinantes de la complementariedad formen un sitio de unión a antígeno favorable. En caso necesario, los aminoácidos en las regiones marco de las regiones variables de anticuerpo se pueden sustituir de tal forma que las regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo humano reformado resultante formen un sitio de unión a antígeno adecuado (Sato K. y col., Cancer Research 1993, 53: 851-856). Además, pueden reemplazarse estas regiones marco con regiones marco procedentes de diversos anticuerpos humanos (véase la publicación internacional n.° WO99/51743).
Para preparar el anticuerpo quimérico o el anticuerpo humanizado, los aminoácidos en las regiones variables (por ejemplo, FR) o las regiones constantes pueden estar sustituidos, por ejemplo, por otros aminoácidos.
La sustitución de aminoácidos es la sustitución de uno o más, por ejemplo, menos de 15, menos de 10, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos o 2 o menos aminoácidos, preferentemente de 1 a 9 aminoácidos. El anticuerpo sustituido debe ser funcionalmente equivalente al anticuerpo no sustituido.
En este contexto, la expresión "funcionalmente equivalente" significa que un anticuerpo específico tiene actividad biológica o bioquímica similar a la del anticuerpo de la presente invención, específicamente, el anticuerpo involucrado tiene la función de dañar el tumor y esencialmente no causa rechazo cuando se aplica a humanos, por ejemplo. Ejemplos de tal actividad pueden incluir actividad inhibidora del crecimiento celular y actividad de unión.
Un procedimiento de sustitución de aminoácidos que implica la introducción de una mutación en un polipéptido es bien conocido por los expertos en la técnica como un procedimiento para preparar un polipéptido funcionalmente equivalente a un determinado polipéptido. Por ejemplo, los expertos en la técnica pueden introducir apropiadamente la sustitución de aminoácidos en el anticuerpo de la presente invención usando mutagénesis dirigida al sitio (Hashimoto-Gotoh, T. y col., (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ. y Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468­ 500; Kramer, W. y col., (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer, W. y Fritz, HJ., (1987) Methods Enzymol.
154, 350-367; Kunkel, TA., (1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492; Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763­ 2766) o similares, preparando de ese modo un anticuerpo funcionalmente equivalente al anticuerpo de la presente invención.
En el caso de introducción de sustitución de aminoácidos, deseablemente, la sustitución es una sustitución conservadora de aminoácidos. La sustitución conservadora de aminoácidos es la sustitución entre aminoácidos similares en propiedades tales como la carga, las cadenas laterales, polaridad y carácter aromático. Los aminoácidos se pueden clasificar en términos de propiedades similares en, por ejemplo: aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina); aminoácidos ácidos (ácido aspártico y ácido glutámico); aminoácidos polares no cargados (glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, cisteína y tirosina); aminoácidos no polares (leucina, isoleucina, alanina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina); aminoácidos ramificados (leucina, valina e isoleucina); y aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptófano e histidina).
Ejemplos de anticuerpos modificados pueden incluir anticuerpos unidos con diversas moléculas, tales como polietilenglicol (PEG). En el anticuerpo modificado de la presente invención, la sustancia a unir no está limitada. Para obtener dicho anticuerpo modificado, el anticuerpo obtenido puede modificarse químicamente. Un procedimiento para esto ya se ha establecido en la técnica.
El anticuerpo que reconoce una proteína CAPRINA-1 o un polipéptido del fragmento de RINA-1 puede obtenerse mediante un procedimiento generalmente conocido por los expertos en la técnica. El anticuerpo puede ser obtenido por, por ejemplo, un procedimiento que implica determinar un epítopo de la proteína CAPRINA-1 reconocida por un anticuerpo anti-CAPRINA-1 por un procedimiento convencional (por ejemplo, mapeo de epítopos o un procedimiento de identificación de epítopos mencionado más adelante) y preparar un anticuerpo usando un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos contenida en el epítopo como un inmunógeno, o un procedimiento que implica determinar un epítopo para un anticuerpo preparado por un procedimiento convencional y seleccionar un anticuerpo que reconozca el mismo epítopo que el de un anticuerpo anti-CAPRINA-1.
El anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo que tiene reactividad inmunológica con CAPRINA-1, un anticuerpo que reconoce específicamente la CAPRINA-1, o un anticuerpo que se une específicamente a la CAPRINA-1 y exhibe actividad citotóxica contra un cáncer o un efecto inhibidor del crecimiento tumoral. Es preferente que el anticuerpo sea un anticuerpo que tenga una estructura que cause poco o ningún rechazo en los animales receptores. Ejemplos de dichos anticuerpos incluyen anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos (por ejemplo, anticuerpos quiméricos de ser humano-ratón), anticuerpos monocatenarios y anticuerpos multiespecíficos cuando los animales receptores son seres humanos. Estos anticuerpos son anticuerpos recombinantes que tienen regiones variables de cadena pesada y ligera derivadas de un anticuerpo humano, que tienen regiones variables de cadena pesada y ligera que comprenden regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) derivadas de un anticuerpo animal no humano y regiones marco (FR1, FR2, FR3 y FR4) derivadas de un anticuerpo humano, o que tienen regiones variables de cadena pesada y ligera derivadas de un anticuerpo animal no humano y regiones constantes de cadena pesada y ligera derivadas de un anticuerpo humano. Los anticuerpos preferentes son los dos primeros anticuerpos.
Dichos anticuerpos recombinantes pueden producirse del modo siguiente: un ADN que codifica el anticuerpo monoclonal (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de ser humano, ratón, rata, conejo o pollo) contra la CAPRINA-1 humano se clona a partir de células productoras de anticuerpos, tales como los hibridomas, y se usa como molde en la RT-PCR o similar para preparar ADN que codifica las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de el anticuerpo. Las secuencias respectivas de las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada, las respectivas secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 en cada región, o las secuencias respectivas de FR1, FR2, FR3 y FR4 en cada región se pueden determinar sobre la base de, por ejemplo, el sistema de numeración de la UE de Kabat (Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).
Dicho ADN que codifica cada una de estas regiones variables o un ADN que codifica cada región determinante de la complementariedad se prepara adicionalmente mediante una técnica de recombinación de genes (Sambrook y col., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) o un sintetizador de ADN. En este contexto, los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales humanos mencionados anteriormente se pueden preparar inmunizando a animales productores de anticuerpos humanos (por ejemplo, ratones) con CAPRINA-1 humana y, después, fusionando esplenocitos extirpados de los animales inmunizados con células de mieloma. Aparte de esto, se preparan ADN que codifican regiones variables y constantes de cadena ligera o cadena pesada derivadas de anticuerpos humanos, si es necesario, utilizando una técnica de recombinación de genes o un sintetizador de ADN.
Para el anticuerpo humanizado, las secuencias de codificación de CDR en el ADN que codifica la región variable de cadena ligera o cadena pesada derivada de anticuerpo humano pueden sustituirse por las secuencias de codificación de CDR correspondientes de un animal no humano (por ejemplo, anticuerpo derivado de ratón, rata, conejo o pollo) para preparar así un ADN que codifica un anticuerpo humanizado. En el caso de, por ejemplo, un anticuerpo humanizado en el que las secuencias codificantes de CDR derivadas de un anticuerpo humano se sustituyen por las correspondientes secuencias codificantes de CDR derivadas de un anticuerpo de ratón, cada región variable está constituida por FR1 humano, CDR1 de ratón, FR2 humano, CDR2 de ratón, FR3 humano, CDR4 de ratón y FR4 humano en este orden desde el extremo N.
Para el anticuerpo quimérico, el ADN que codifica la región variable de la cadena ligera o cadena pesada de un animal no humano (por ejemplo, el anticuerpo de ratón, rata, conejo o pollo puede ligarse con el ADN que codifica una región constante de cadena ligera o cadena pesada derivada de un anticuerpo humano para preparar un ADN codificante de anticuerpo quimérico.
En el caso de un anticuerpo monocatenario, este anticuerpo se refiere a un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera unidas linealmente a través de un enlazador. Se puede preparar un ADN que codifica el anticuerpo monocatenario ligando un ADN que codifica la región variable de la cadena pesada, un ADN que codifica el enlazador y un ADN que codifica la región variable de la cadena ligera. En este contexto, tanto de la región variable de la cadena pesada como la región variable de la cadena ligera derivan de un anticuerpo humano o derivan de un anticuerpo humano que tiene regiones determinantes de la complementariedad solo sustituidas por regiones determinantes de la complementariedad de un animal no humano (por ejemplo, anticuerpo de ratón, rata, conejo o pollo). El enlazador consiste en de 12 a 19 aminoácidos. Ejemplos de los mismos incluyen (G4S)3 que consiste en 15 aminoácidos (G.-B. Kim y col., Protein Engineering Design and Selection 2007, 20 (9): 425-432).
En el caso del anticuerpo biespecífico (por ejemplo, diacuerpo), este anticuerpo se refiere a un anticuerpo capaz de unirse específicamente a dos epítopos diferentes. Puede prepararse un ADN que codifica el anticuerpo biespecífico ligando, por ejemplo, un ADN que codifica una región variable A de la cadena pesada, un ADN que codifica una región variable B de la cadena ligera, un ADN que codifica la región variable B de la cadena pesada y un ADN que codifica la región variable A de la cadena ligera en este orden (siempre que el ADN que codifica una región variable B de la cadena ligera y el ADN que codifica una región variable A de la cadena pesada se ligan a través de un ADN que codifica una enlazador como se ha descrito anteriormente). En este contexto, todas las regiones variables de la cadena pesada y las regiones variables de la cadena ligera derivan de un anticuerpo humano o derivan de un anticuerpo humano que tiene regiones determinantes de la complementariedad solo sustituidas por regiones determinantes de la complementariedad de un animal no humano (por ejemplo, ratón, rata, conejo o pollo).
Los ADN recombinantes preparados de este modo pueden incorporarse en uno o más vectores apropiados, que luego se transfieren a las células huésped (por ejemplo, células de mamífero, células de levadura y células de insecto) para que los ADN se (co)expresan para producir el anticuerpo recombinante de interés (P.J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES, 1997 WILEY; P. Shepherd y C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; J.W. Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS).
Ejemplos del anticuerpo de la presente invención preparados por cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente incluyen los siguientes anticuerpos (a) a (1 ) que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende las SEC ID NO: 1, 2 y 3, y una región variable de la cadena ligera que comprende las SEQ ID NO: 4, 5 y 6, obtenidas en los ejemplos mencionados más adelante:
(a) un anticuerpo constituido por una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:8 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:15,
(b) un anticuerpo constituido por una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:10 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:15,
(c) un anticuerpo constituido por una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:7 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:15,
(d) un anticuerpo constituido por una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:8 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:13,
(e) un anticuerpo constituido por una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:7 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:12,
(f) un anticuerpo constituido por una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:8 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:12,
(g) un anticuerpo constituido por una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:7 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:13,
(h) un anticuerpo constituido por una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:10 y una región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO:14,
(i) un anticuerpo constituido por una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:8 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:11,
(j) un anticuerpo constituido por una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:7 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:11,
(k) un anticuerpo constituido por una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:9 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 15, y
(l) un anticuerpo constituido por una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:20 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:21.
En este contexto, las secuencias de aminoácidos mostradas por las SEQ ID NO: 1,2 y 3 corresponden a CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, de la región variable de cadena pesada del anticuerpo de conejo y las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NO: 4, 5 y 6 corresponden a CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo de conejo.
El anticuerpo humanizado, el anticuerpo quimérico, el anticuerpo monocatenario o el anticuerpo biespecífico de la presente invención es, por ejemplo, cualquiera de los siguientes anticuerpos (i) a (xiv):
(i) un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1, 2 y 3, y las secuencias de aminoácidos de las regiones marco conservadas procedentes de anticuerpo humano, o formas sustituidas de las mismas, y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 4, 5 y 6 y las secuencias de aminoácidos de las regiones marco derivadas de anticuerpo humano, o formas sustituidas de las mismas,
(ii) un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1, 2 y 3 y las secuencias de aminoácidos de las regiones marco derivadas de anticuerpo humano, o formas sustituidas de las mismas, y una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de anticuerpo humano, y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 5 y 6, y las secuencias de aminoácidos de regiones marco derivadas de anticuerpo humano, o formas sustituidas de las mismas, y una región constante de la cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos derivadas de anticuerpo humano,
(iii) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8 y una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de anticuerpo humano, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:15 y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos procedente de anticuerpo humano,
(iv) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10 y una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de anticuerpo humano, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:15 y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos procedente de anticuerpo humano,
(v) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7 y una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de anticuerpo humano, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:15 y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos procedente de anticuerpo humano,
(vi) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8 y una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de anticuerpo humano, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13 y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos procedente de anticuerpo humano,
(vii) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7 y una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de anticuerpo humano, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12 y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos procedente de anticuerpo humano,
(viii) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8 y una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de anticuerpo humano, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12 y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos procedente de anticuerpo humano,
(ix) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7 y una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de anticuerpo humano, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13 y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos procedente de anticuerpo humano,
(x) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10 y una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de anticuerpo humano, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:14 y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos procedente de anticuerpo humano,
(xi) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8 y una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de anticuerpo humano, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de anticuerpo humano,
(xii) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7 y una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de anticuerpo humano, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11 y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos procedente de anticuerpo humano,
(xiii) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de anticuerpo humano, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de anticuerpo humano, y
(xiv) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID n O:20 y una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de anticuerpo humano, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de anticuerpo humano.
Las secuencias de las regiones marco de la cadena pesada y ligera del anticuerpo humano y las regiones variables y constantes de la cadena ligera están disponibles en, por ejemplo, NCBI (EE.UU.; GenBank, UniGene, etc.). Por ejemplo, las siguientes secuencias se pueden encontrar en: n.° de acceso J00228 para una región constante de la cadena pesada de IgG1 humana; n.° de acceso J00230 para una región constante de la cadena pesada de IgG2 humana; n.° de acceso X03604 para una región constante de la cadena pesada de IgG3 humana; n.° de acceso K01316 para una región constante de la cadena pesada de IgG4 humana; n.° de acceso V00557, X64135, X64133, etc., para una región constante k de la cadena ligera humana; y números de acceso X64132, X64134, etc., para una región constante A de cadena ligera.
Preferentemente, estos anticuerpos tienen actividad citotóxica y, por lo tanto, pueden ejercer un efecto antitumoral (o actividad antitumoral).
Los anticuerpos antes mencionados pueden tener cada uno la sustitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos en una secuencia de región determinante de la complementariedad, una secuencia de la región marco y/o una secuencia de la región constante, siempre que el anticuerpo resultante tenga una especificidad tal que pueda reconocer específicamente a la CAPRINA-1. En este contexto, el término "varios" significa, preferentemente, de 1 a 9.
La constante de afinidad Ka (kon/koff) del anticuerpo de la presente invención para una proteína CAPRINA-1 o un fragmento de la misma es, preferentemente, al menos 5 * 108 M-1, al menos 109 M-1, al menos 5 x 109 M-1, al menos 1010 M-1, al menos 5 x 1010 M-1, al menos 1011 M-1, al menos 5 x 1011 M-1, al menos 1012 M-1, al menos 1013 M-1, o al menos 1014 M-1.
Un mecanismo que subyace al efecto antitumoral del anticuerpo de la presente invención sobre las células cancerosas que expresan CAPRINA-1 es la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) de las células efectoras contra las células que expresan CAPRINA-1. La actividad antitumoral del anticuerpo de la presente invención a través de ADCC puede mejorarse sustituyendo uno o varios aminoácidos en la región constante de la cadena pesada del anticuerpo de la presente invención o eliminando la fucosa agregada a la N-acetilglucosamina en una cadena de azúcar unida a N-glucósido unida a la región constante de la cadena pesada. La actividad antitumoral del anticuerpo de la presente invención a través de ADCC puede potenciarse aún más combinando la sustitución de aminoácidos y la eliminación de fucosa de la región constante de la cadena pesada.
Un anticuerpo de este tipo que carece de fucosa añadida a N-acetilglucosamina en una cadena de azúcar unida a N-glucósido unida a la región constante de la cadena pesada de acuerdo con la presente invención puede usarse sola o puede ser una composición con un anticuerpo fucosilado. Se prefiere que la composición del anticuerpo esté compuesta principalmente por el anticuerpo que carece de fucosa.
El anticuerpo en el que uno o varios aminoácidos en la región constante de la cadena pesada están sustituidos se puede preparar con referencia a, por ejemplo, la publicación internacional n.° WO2004/063351, la publicación internacional n.° WO2011/120135, la patente de EE.u U. n.° 8388955, la publicación internacional n.° WO2011/005481, la patente de Estados Unidos n.° 6737056 y la publicación internacional WO 2005/063351. El anticuerpo que carece de fucosa agregada a la N-acetilglucosamina en una cadena de azúcar ligada a N-glucósido en la región constante de la cadena pesada, o las células que producen el anticuerpo pueden prepararse con referencia a, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.° 6602684, la patente europea n.° 1914244 y la patente de Estados Unidos n.° 7579170. La composición del anticuerpo que carece de fucosa agregada a la N-acetilglucosamina en una cadena de azúcar unida a N-glucósido unida a la región constante de la cadena pesada, y el anticuerpo fucosilado, o las células que producen la composición, se pueden preparar con referencia a, por ejemplo, la atente de Estados Unidos n.° 8642292.
El anticuerpo de la presente invención se puede conjugar con un agente antitumoral. La conjugación del anticuerpo con el agente antitumoral se puede llevar a cabo a través de un espaciador que tiene un grupo (por ejemplo, un grupo succinimidilo, un grupo formilo, un grupo 2-piridiltio, un grupo maleimidilo, un grupo alcoxicarbonilo o un grupo hidroxi) reactivo con un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo hidroxi, un grupo tiol o similar.
Ejemplos del agente antitumoral incluyen los siguientes agentes antitumorales conocidos públicamente en las bibliografías, etc.: paclitaxel, doxorrubicina, daunorubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracilo, tiotepa, busulfán, improsulfán, piposulfán, benzodopa, carbocuona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida, trimetilolmelamina, bulatacina, butalacinona, camptotecina, briostatina, calistatina, criptoficina 1 , criptoficina 8, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictina, espongistatina, clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, caliqueamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carcinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorbicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, adriamicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicina, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, andrógenos (por ejemplo, calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano y testolactona), aminoglutetimida, mitotano, trilostano, ácido frolínico, aceglatona, glucósido de aldofosfamida, ácido aminolevulínico, eniluracilo, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diazicuona, elfornitina, acetato de eliptinio, epotilona, etoglúcido, lentinano, lonidamina, maitansina, ansamitocina, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarrubicina, losoxantrona, ácido podofilínico, 2-etilhidrazida, procarbazina, razoxano, rizoxina, esquizofilano, espirogermanio, ácido tenuazónico, triazicuona, roridina
A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina, manomustina, mitobronitol, mitolactol, pipobromano, gacitosina, docetaxel, clorambucilo, gemcitabina, 6-tioguanina, mercaptopurina, cisplatino, oxaliplatino, carboplatino, vinblastina, etopósido, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, novantrona, tenipósido, edatrexato, daunomicina, aminopterina, Xeloda, ibandronato, irinotecán, inhibidores de topoisomerasas, difluorometilornitina (DMFO), ácido retinoico, capecitabina y sales y derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos.
Cuando el anticuerpo es un anticuerpo conjugado con un agente antitumoral, un procedimiento para evaluar si ejercer actividad antitumoral puede implicar, por ejemplo, para el anticuerpo anti-CAPRINA-1 derivado de ratón, haciendo reaccionar un anticuerpo secundario unido al fármaco a un anticuerpo de ratón junto con el mismo para evaluar ex vivo el efecto antitumoral en células cancerosas humanas. Esta evaluación puede ser conducida usando, por ejemplo, un anticuerpo anti-IgG humano (Hum-ZAP (Advanced Targeting Systems, Inc.)), que es una segunda inmunotoxina unida con saporina.
Como alternativa, el anticuerpo de la presente invención puede administrarse en combinación con un agente antitumoral para producir de este modo un mayor efecto terapéutico. Este enfoque es adaptable a un paciente con un cáncer que expresa CAPRINA-1 antes o después del tratamiento quirúrgico. Esta estrategia puede aplicarse, particularmente después de la cirugía, a un cáncer que expresa CAPRINA-1, que se ha tratado convencionalmente solo con un agente antitumoral solo, para producir una mayor prevención de la recidiva del cáncer o para la prolongación del tiempo de supervivencia.
Por ejemplo, se puede usar cualquiera de los agentes antitumorales descritos anteriormente como agente antitumoral para su uso en la administración combinada con el anticuerpo de la presente invención. Particularmente, se utiliza preferentemente ciclofosfamida, paclitaxel, docetaxel o vinorelbina.
Como alternativa, el anticuerpo de la presente invención puede unirse a un radioisótopo conocido públicamente en la bibliografía, etc., tales como 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153SM, 212Bi, 32P, 175Lu, 176Lu, 89Sr, 64Cu Saji, YAKUGAKU ZASSHI 128 (3) 323-332, 8 (2008), Jpn). Es deseable un radioisótopo eficaz para el tratamiento o diagnóstico de un tumor. Dicho radioisótopo también se incluye en el agente antitumoral según la presente invención.
<Efecto antitumoral>
El efecto antitumoral del anticuerpo anti-CAPRINA-1 utilizado en la presente invención en células cancerosas que expresan CAPRINA-1 se considera que tiene lugar bajo el siguiente mecanismo o similar: la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) de las células efectoras contra las células que expresan CAPRINA-1 mencionada anteriormente y la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) de las células que expresan CAPRINA-1.
Sin embargo, el alcance de la presente invención no pretende estar limitado por este mecanismo.
Por tanto, la actividad del anticuerpo anti-CAPRINA-1 utilizado en la presente invención puede evaluarse, como se muestra específicamente a continuación en los ejemplos, midiendo ex vivo la actividad ADCC o la actividad ADCP contra las células cancerosas que expresan CAPRinA-1.
El anticuerpo anti-CAPRINA-1 usado en la presente invención se une a la proteína CAPRINA-1 en las células cancerosas y muestra un efecto antitumoral a través de la actividad o similar. Por tanto, el anticuerpo anti-CAPRINA
1 de la presente invención es, presumiblemente, útil en el tratamiento o prevención de un cáncer. Específicamente, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención del cáncer, que comprende el anticuerpo anti-CAPRINA-1 como principio activo. El anticuerpo anti-CAPRINA-1 que se va a utilizar para el propósito de administración a cuerpos humanos (terapia de anticuerpos) es, preferentemente, un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado para reducir la inmunogenicidad.
Un anticuerpo anti-CAPRINA-1 con mayor afinidad de unión a la proteína CAPRINA-1 en la superficie de las células cancerosas ejerce una actividad antitumoral más fuerte. Por tanto, el anticuerpo de la presente invención tiene una alta afinidad de unión para la proteína CAPRINA-1 y, por lo tanto, se puede esperar que tenga un efecto antitumoral más fuerte. En consecuencia, el anticuerpo de la presente invención es adaptable a una composición farmacéutica destinada al tratamiento y/o prevención de un cáncer. Dicha alta afinidad de unión del anticuerpo de la presente invención es, preferentemente, al menos 5 * 108 M-1, al menos 109 M-1, al menos 5 x 109 M-1, al menos 1010 M-1, al menos 5 x 1010 M-1, al menos 1011 M-1, al menos 5 x 1011 M-1, al menos 1012 M-1, al menos 1013 M-1, o al menos 1014 M-1, en términos de una constante de asociación (constante de afinidad) Ka (kon/koff), tal como se ha descrito anteriormente.
<Unión a células que expresan antígeno>
Puede determinarse la capacidad del anticuerpo para unirse a CAPRINA-1 mediante el uso de un ensayo de unión usando, por ejemplo, ELISA, transferencia Western, inmunofluorescencia y análisis por citometría de flujo, como se describe en los ejemplos.
<Tinción inmunohistoquímica>
El anticuerpo que reconoce la CAPRINA-1 puede usarse en inmunohistoquímica por un procedimiento bien conocido por los expertos en la técnica. El anticuerpo que reconoce CAPRINA-1 puede probarse para determinar su reactividad con CAPRINA-1, por ejemplo, utilizando una sección congelada fijada con paraformaldehído o acetona o una sección fijada con paraformaldehído e incrustada en parafina de un tejido obtenido de un paciente durante el tratamiento quirúrgico o un tejido obtenido de un animal que porta un tejido de xenoinjerto inoculado con una línea celular que expresa CAPRINA-1 espontáneamente o después de la transfección.
Para la tinción inmunohistoquímica, puede teñirse el anticuerpo reactivo con CAPRINA-1 mediante diversos procedimientos. Por ejemplo, el anticuerpo puede visualizarse mediante la reacción con un anticuerpo de cabra anti­ ratón, un anticuerpo de cabra anti-conejo o un anticuerpo de cabra anti-pollo, conjugado a peroxidasa de rábano picante.
<Composición farmacéutica y procedimiento para tratar y/o prevenir el cáncer>
Una diana de la composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención del cáncer de la presente invención no está particularmente limitada en tanto que la diana sea cáncer (células) que expresa un gen de CAPRINA-1.
Los términos "tumor" y "cáncer" utilizados en la presente memoria descriptiva significan neoplasias malignas y se usan indistintamente entre sí.
El cáncer objetivo de la presente invención puede ser cualquier cáncer que expresa la proteína CAPRINA-1 en la superficie de la membrana celular. El cáncer es, preferentemente, cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, tumor cerebral, cáncer de estómago, cáncer de útero, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de esófago, leucemia, linfoma, cáncer de hígado, cáncer de vesícula biliar, sarcoma, mastocitoma, melanoma, cáncer de la corteza suprarrenal, tumor de Ewing, linfoma de Hodgkin, mesotelioma, mieloma múltiple, cáncer de testículo, cáncer de tiroides, o cáncer de cabeza y cuello como se ha mencionado anteriormente.
Más específicamente, ejemplos de estos cánceres incluyen, aunque no de forma limitativa, adenocarcinoma de mama, adenocarcinoma de mama de tipo complejo, tumor maligno mixto de la glándula mamaria, adenocarcinoma papilar intraductal, adenocarcinoma de pulmón, cáncer de células escamosas, cáncer microcítico, cáncer macrocítico, glioma que es tumor de tejido neuroepitelial, glioblastoma, neuroblastoma, ependimoma, tumor neuronal, tumor neuroectodérmico embrionario, neurilemoma, neurofibroma, meningioma, leucemia linfocítica crónica, linfoma gastrointestinal, linfoma alimentario, linfoma de células pequeñas a medias, cáncer cecal, cáncer de colon ascendente, cáncer de colon descendente, cáncer de colon transverso, cáncer de colon sigmoide, cáncer rectal, cáncer de ovarios epitelial, tumor de células germinales, tumor de células estromales, carcinoma ductal pancreático, carcinoma ductal pancreático invasivo, adenocarcinoma pancreático, carcinoma de células acinares, carcinoma adenoescamoso, tumor de células gigantes, neoplasia papilar-mucinoso intraductal, neoplasia quística mucinosa, pancreatoblastoma, adenoma de las células del islote, tumor de Frants, cistadenocarcinoma seroso, tumor pseudopapilar sólido, gastrinoma, glucagonoma, insulinoma, neoplasia endocrina múltiple de tipo 1 (síndrome de Wermer), tumor de células de los islotes no funcionales, somatostatinoma, VIPpoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de cuerpo uterino, fibrosarcoma, sarcoma de huesos o articulaciones, sarcoma de Ewing, tumor de Wilms, hepatoblastoma, sarcoma de tejidos blandos, leucemia aguda, leucemia crónica, tumor de la médula espinal, tumor maligno de tejidos blandos, tumor del grupo de teratoma y cáncer de cabeza y cuello, incluido el cáncer de hipofaringe, cáncer de orofaringe, cáncer de lengua, cáncer de epifaringe, cáncer oral, cáncer de labios, cáncer sinusal y cáncer de garganta.
Los sujetos receptores (pacientes) son, preferentemente, mamíferos, por ejemplo, mamíferos, incluyendo primates, animales de compañía, ganado y animales de deporte, y, de manera particularmente preferente, seres humanos, perros y gatos.
En el caso de usar el anticuerpo de la presente invención como una composición farmacéutica, la composición farmacéutica puede formularse mediante un procedimiento conocido por los expertos en la materia. Por ejemplo, la composición farmacéutica se puede usar en forma de una inyección parenteral de una solución o suspensión aséptica con agua o cualquier otro líquido farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede formularse con el anticuerpo mezclado en una forma de dosificación unitaria requerida para la práctica farmacéutica generalmente aceptada, en combinación adecuada con vehículos o medios farmacológicamente aceptables, específicamente, agua esterilizada, solución salina fisiológica, un aceite vegetal, un emulsionante, un agente de suspensión, un tensioactivo, un estabilizante, un agente aromatizante, un excipiente, un vehículo, un conservante, un aglutinante, etc. La cantidad del principio activo en dicha preparación se determina de tal forma que puede lograrse una dosis adecuada dentro del intervalo prescrito.
Una composición aséptica para inyección se puede formular de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional usando un vehículo tal como agua destilada inyectable.
Ejemplos de soluciones acuosas para inyección incluyen solución salina fisiológica, soluciones isotónicas que contienen glucosa y otros adyuvantes, por ejemplo, D-sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro sódico. Estas soluciones se pueden usar en combinación con un solubilizante apropiado, por ejemplo, un alcohol (específicamente, etanol) o un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol y polietilenglicol), o un tensioactivo no iónico, por ejemplo, Polysorbate 80(TM) o HCO-60.
Ejemplos de soluciones oleosas incluyen aceite de sésamo y aceite de soja. Estas soluciones se pueden usar en combinación con benzoato de bencilo o alcohol bencílico como solubilizante. Las soluciones se pueden mezclar adicionalmente con un tampón (por ejemplo, una solución de tampón fosfato y una solución de tampón acetato de sodio), un agente calmante (por ejemplo, clorhidrato de procaína), un estabilizante (por ejemplo, alcohol bencílico y fenol), y un antioxidante. Las soluciones para inyección preparadas de este modo se cargan normalmente en ampollas adecuadas.
La composición farmacéutica de la presente invención se administra por vía oral o parenteral, preferentemente por vía parenteral. Ejemplos específicos de sus formas de dosificación incluyen inyecciones, agentes de administración intranasal, agentes de administración transpulmonar y agentes de administración percutánea. Ejemplos de las inyecciones incluyen inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal e inyección subcutánea, a través de las cuales la composición farmacéutica se puede administrar sistémica o localmente.
También, el procedimiento de administración puede seleccionarse adecuadamente basándose en la edad, el peso, el sexo, los síntomas, etc., de un paciente. La dosis de una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo o un polinucleótido que codifica el anticuerpo puede seleccionarse dentro de un intervalo de, por ejemplo, 0,0001 a 1000 mg/kg de peso corporal por dosis. Como alternativa, la dosis se puede seleccionar dentro de un intervalo de, por ejemplo, 0,001 a 100000 mg/cuerpo de un paciente, aunque la dosis no se limita necesariamente a estos valores numéricos. Aunque la dosis y el procedimiento de administración varían dependiendo del peso, la edad, el sexo, los síntomas, etc., de un paciente, los expertos en la técnica pueden seleccionar apropiadamente la dosis y el procedimiento.
La composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la presente invención o el fragmento de la misma puede administrarse a un sujeto para tratar y/o prevenir el cáncer, preferentemente cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, tumor cerebral, cáncer de estómago, cáncer de útero, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de esófago, leucemia, linfoma, cáncer de hígado, cáncer de vesícula biliar, sarcoma, mastocitoma, melanoma, cáncer de la corteza suprarrenal, tumor de Ewing, linfoma de Hodgkin, mesotelioma, mieloma múltiple, cáncer de testículo, cáncer de tiroides, o cáncer de cabeza y cuello.
La presente invención abarca además medios para tratar y/o prevenir el cáncer, mediante la administración de la composición farmacéutica de la presente invención en combinación con el agente antitumoral como se ha ejemplificado anteriormente o una composición farmacéutica que contiene dicho agente antitumoral a un sujeto. El anticuerpo de la presente invención o el fragmento del mismo se puede administrar simultáneamente con el sujeto o por separado del agente antitumoral al sujeto. En el caso de la administración separada, cualquiera de sus composiciones farmacéuticas se puede administrar primero o más tarde. Sus intervalos de dosificación, dosis, vías de administración y número de dosis pueden seleccionarse de manera adecuada por un especialista. En el caso de administración simultánea, la forma de dosificación también incluye, por ejemplo, una composición farmacéutica formulada cada una mezclando el anticuerpo de la presente invención o un fragmento del mismo y el agente antitumoral en un vehículo (o medio) farmacológicamente aceptable. Las descripciones anteriores sobre la prescripción, la formulación, las vías de administración, dosis, los cánceres, etc., referentes a las composiciones farmacéuticas y las formas de dosificación que contienen el anticuerpo de la presente invención también pueden aplicarse a cualquiera de las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación que contienen el agente antitumoral.
Por tanto, la presente invención también proporciona un producto farmacológico de combinación para el tratamiento y/o prevención de un cáncer, que comprende la composición farmacéutica de la presente invención y una composición farmacéutica que comprende el agente antitumoral tal como se ha ilustrado anteriormente y medios para tratar y/o prevenir un cáncer, administrando el producto farmacológico de combinación. La presente invención también proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de un cáncer, que comprende el anticuerpo de la presente invención o el fragmento del mismo y el agente antitumoral junto con un vehículo farmacológicamente aceptable.
<Polipéptido y ADN>
La presente invención proporciona además un ADN que codifica el anticuerpo de la presente invención, un ADN que codifica la cadena pesada o la cadena ligera del anticuerpo, y un ADN que codifica la región variable de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. Tales ADN incluyen, en el caso del anticuerpo (a), por ejemplo, un ADN que codifica una región variable de la cadena pesada, que comprende secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 2 y 3, y un ADN que codifica una región variable de cadena ligera, que comprende secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 5 y 6.
Dado que las regiones determinantes de la complementariedad codificadas por los ADN que tienen estas secuencias son regiones que determinan la especificidad del anticuerpo, las secuencias que codifican las otras regiones (es decir, regiones constantes y regiones marco) del anticuerpo pueden ser secuencias derivadas de un anticuerpo diferente. En este contexto, el anticuerpo diferente también incluye un anticuerpo derivado de un organismo no humano, pero es, preferentemente, uno derivado de un ser humano desde el punto de vista de la reducción de la reacción adversa. Específicamente, para los ADN mencionados anteriormente, se prefiere que las regiones que codifican las regiones marco respectivas de la cadena pesada y la cadena ligera y cada región constante comprendan secuencias de nucleótidos que codifiquen las secuencias de aminoácidos correspondientes derivadas de un anticuerpo humano.
Otros ejemplos del ADN que codifica el anticuerpo de la presente invención incluyen un ADN que codifica una región variable de cadena pesada, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8, y un ADN en el que una región que codifica una región variable de cadena ligera comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:15. En este contexto, un ejemplo de la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8 es la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:23. También, un ejemplo de la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:15 es la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:30. Para estos ADN, también se prefiere que las regiones que codifican las regiones constantes respectivas de la cadena pesada y la cadena ligera comprendan secuencias de nucleótidos que codifiquen las secuencias de aminoácidos correspondientes derivadas de un anticuerpo humano.
Estos ADN de anticuerpo se pueden obtener mediante, por ejemplo, el procedimiento mencionado anteriormente o el siguiente procedimiento: en primer lugar, el ARN total se prepara a partir del hibridoma relacionado con el anticuerpo de la presente invención utilizando un kit de extracción de ARN disponible comercialmente, y el ADNc se sintetiza con transcriptasa inversa utilizando cebadores aleatorios o similares. Posteriormente, el ADNc que codifica el anticuerpo se amplifica mediante PCR usando, como cebadores, oligonucleótidos que tienen secuencias respectivamente conservadas en las respectivas regiones variables de un gen de cadena pesada y un gen de cadena ligera de anticuerpo de ratón conocido. Las secuencias que codifican regiones constantes se pueden obtener amplificando secuencias conocidas por PCR. La secuencia de nucleótidos del ADN resultante se puede determinar mediante un procedimiento de rutina, por ejemplo, mediante integración en un plásmido o un fago para secuenciación.
La presente invención proporciona además polipéptidos y ADN descritos en los siguientes (i) a (xv) relacionados con los anticuerpos (i) a (xiv):
(i) un polipéptido de la CDR de la cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos mostradas por las SEQ ID NO: 1, 2 y 3, y un ADN que codifica el polipéptido,
(ii) un polipéptido la CDR de la cadena ligera seleccionado de las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ iD No : 4, 5 y 6, y un ADN que codifica el polipéptido,
(iii) un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO:8 o la SEQ ID NO:15, y un ADN que codifica el polipéptido, por ejemplo, un ADN que comprende las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 30, respectivamente,
(iv) un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 15 y un ADN que codifica el polipéptido, por ejemplo, un ADN que comprende las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 30, respectivamente,
(v) un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO:15 y un ADN que codifica el polipéptido, por ejemplo, un ADN que comprende las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 30, respectivamente,
(vi) un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO:13 y un ADN que codifica el polipéptido, por ejemplo, un ADN que comprende las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 28, respectivamente,
(vii) un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO:7 o la SEQ ID NO:12, y un ADN que codifica el polipéptido, por ejemplo, un ADN que comprende las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 27, respectivamente,
(viii) un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO:8 o la SEQ ID NO:12, y un ADN que codifica el polipéptido, por ejemplo, un ADN que comprende las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 27, respectivamente,
(ix) un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO:7 o la SEQ ID NO:13, y un ADN que codifica el polipéptido, por ejemplo, un ADN que comprende las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 28, respectivamente,
(x) un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO:10 o la SEQ ID NO:14, y un ADN que codifica el polipéptido, por ejemplo, un ADN que comprende las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 29, respectivamente,
(xi) un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO:8 o la SEQ ID NO:11, y un ADN que codifica el polipéptido, por ejemplo, un ADN que comprende las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 26, respectivamente,
(xii) un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO:7 o la SEQ ID NO:11, y un ADN que codifica el polipéptido, por ejemplo, un ADN que comprende las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 26, respectivamente,
(xiii) un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 o la SEQ ID NO:15, y un ADN que codifica el polipéptido, por ejemplo, un ADN que comprende las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 30, respectivamente,
(xiv) un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO:20 o la SEQ ID NO:21, y un ADN que codifica el polipéptido, por ejemplo, un ADN que comprende las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 32, respectivamente, y
(xv) un polipéptido derivado de cualquiera de los polipéptidos descritos en (i) a (xiv) comprendiendo la sustitución de uno o más aminoácidos en la región constante de la cadena pesada, o un fragmento de la misma, y un ADN que codifica el polipéptido o el fragmento del mismo.
Estos polipéptidos y ADN se pueden preparar, tal como se han descrito anteriormente, Utilizando una técnica de recombinación génica.
<Sumario de la presente invención>
La presente invención descrita anteriormente se resumirá a continuación.
(1) Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad de las SEC ID NO: 1, 2 y 3, y una región variable de la cadena ligera que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 4, 5 y 6, y tiene reactividad inmunológica con una proteína CAPRINA-1, o un fragmento de la misma.
(2) El anticuerpo o el fragmento del mismo según (1), en el que la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8, y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:15.
(3) El anticuerpo o el fragmento del mismo según (1), en el que la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10, y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:15.
(4) El anticuerpo o el fragmento del mismo según (1), en el que la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7, y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:15.
(5) El anticuerpo o el fragmento del mismo según (1), en el que la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8, y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:13.
(6) El anticuerpo o el fragmento del mismo según (1), en el que la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7, y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:12.
(7) El anticuerpo o el fragmento del mismo según (1), en el que la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8, y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:12.
(8) El anticuerpo o el fragmento del mismo según (1), en el que la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7, y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:13.
(9) El anticuerpo o el fragmento del mismo según (1), en el que la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10, y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:14.
(10) El anticuerpo o el fragmento del mismo según (1), en el que la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8, y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:11.
(11) El anticuerpo o el fragmento del mismo según (1), en el que la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7, y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:11.
(12) El anticuerpo o el fragmento del mismo según (1), en el que la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9, y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:15.
(13) El anticuerpo o el fragmento del mismo según (1), en el que la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:20, y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:21.
(14) El anticuerpo o el fragmento del mismo según cualquiera de (1) a (13), en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monocatenario o un anticuerpo multiespecífico.
(15) El anticuerpo o el fragmento del mismo según cualquiera de (1) a (13), en el que el anticuerpo o el fragmento está conjugado con un agente antitumoral.
(16) El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de (1) a (15), en el que el anticuerpo comprende la sustitución de uno o más aminoácidos en la región constante de la cadena pesada del mismo.
(17) El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de (1) a (16), en el que el anticuerpo es un anticuerpo que carece de fucosa agregada a N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar de una cadena de azúcar unida a N-glucósido unida a la región constante de la cadena pesada.
(18) Una composición de anticuerpo que comprende un anticuerpo de acuerdo con (17) y un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de (1) a (16) que tiene fucosa agregada a N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar de una cadena de azúcar unida a N-glucósido unida a la región constante de la cadena pesada.
(19) Una célula que produce un anticuerpo de acuerdo con (17) o una composición de anticuerpo de acuerdo con (18).
(20) Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo según cualquiera de (1) a (15), un anticuerpo de acuerdo con (16) o (17), o una composición de anticuerpo de acuerdo con (18) como principio activo.
(22 ) Un producto farmacológico de combinación que comprende una composición farmacéutica de acuerdo con (20) o (21 ) y una composición farmacéutica que comprende un agente antitumoral.
(23) Un ADN que codifica un anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de (1) a (16). (24) Un anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de (1) a (16), un anticuerpo de acuerdo con (17), una composición de anticuerpo de acuerdo con (18), una composición farmacéutica de acuerdo con (20), o un producto farmacéutico de combinación de acuerdo con (22 ), para su uso en un procedimiento para tratar y/o prevenir un cáncer.
(25) El anticuerpo, fragmento, composición de anticuerpo, composición farmacéutica o producto farmacéutico de combinación para su uso de acuerdo con (24), en el que el cáncer es cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, tumor cerebral, cáncer de estómago, cáncer de útero, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de esófago, leucemia, linfoma, cáncer de hígado, cáncer de vesícula biliar, sarcoma, mastocitoma, melanoma, cáncer de la corteza suprarrenal, tumor de Ewing, linfoma de Hodgkin, mesotelioma, mieloma múltiple, cáncer de testículo, cáncer de tiroides, o cáncer de cabeza y cuello.
Ejemplos
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá más específicamente con referencia a los Ejemplos. Sin embargo, el alcance de la presente invención no pretende estar limitado por estos ejemplos específicos.
Ejemplo 1: Preparación de anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 utilizando conejo
Se mezclaron 300 |jg de proteína CAPRINA-1 humana preparada en el Ejemplo 3 del documento WO2010/016526 con una cantidad igual de un adyuvante completo de Freund, y se usó como solución de antígeno por conejo. Se usó una mezcla con un adyuvante incompleto de Freund en la segunda o posterior inmunización. La solución de antígeno se administró por vía intraperitoneal a cada conejo de 12 semanas de edad, y, después, se administró 8 veces cada 2 a 3 semanas para completar la inmunización. Los linfocitos se obtuvieron del bazo de cada conejo extirpado 4 días después de la inmunización final y se mezclaron con células de mieloma de conejo 240E-W2 en una proporción de 1:2. Se añadió una solución de PEG (calentada a 37 °C) preparada mezclando 200 j l de un medio RPMI que contenía FBS al 10 % y 800 j l de PEG1500, y la mezcla se dejó reposar durante 5 minutos en para fusión celular. Después de la centrifugación y eliminación del sobrenadante, las células se suspendieron en 300 ml de un medio RpMI que contenía FBS al 10 % suplementado con una solución de HAT (medio selectivo HAT) a una concentración del 2 % y se inocularon a 100 jl/pocillo en 80 placas de 96 pocillos. Los hibridomas generados por la fusión de las células de bazo y las células de mieloma de conejo se obtuvieron cultivando a 37 °C durante 7 días en condiciones de CO2 al 5 %.
Los hibridomas se seleccionaron en función de la reactividad de los anticuerpos producidos por los hibridomas preparados con la proteína CAPRINA-1. Se añadió una solución de proteína CAPRINA-1 de 1 pg/ml a 100 pl/pocillo a las placas de 96 pocillos, y las placas se dejaron en reposo a 4 °C durante 18 horas. Cada pocillo se lavó con PBS-T tres veces. Después, se añadió una solución de seroalbúmina bovina (BSA) al 0,5 % a 400 pl/pocillo y las placas se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución se eliminó y los pocillos se lavaron con 400 pl/pocillo de PBS-T tres veces. Después, cada sobrenadante de cultivo del hibridoma obtenido anteriormente se añadió a 100 pl/pocillo, y las placas se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante 2 horas. Cada pocillo se lavó con PBS-T tres veces. Después, se añadió un anticuerpo anti-conejo marcado con HRP diluido 5.000 veces con PBS a 100 pl/pocillo y las placas se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavó con PBS-T tres veces. Después, se añadió una solución de sustrato TMB a 100 pl/pocillo y las placas se dejaron en reposo durante 15 a 30 minutos para la reacción cromogénica. Después del desarrollo del color, la reacción se terminó mediante la adición de ácido sulfúrico 1 N a 100 pl/pocillo, y los valores de absorbancia se midieron a 450 nm y 595 nm utilizando un espectrómetro de absorción. Como resultado, se seleccionó una pluralidad de hibridomas que producen anticuerpos que exhibían altos valores de absorbancia.
Los hibridomas seleccionados se añadieron a 0,5 células/pocillo a placas de 96 pocillos y se cultivaron. Después de 1 semana, se observaron los hibridomas que formaban colonias únicas en los pocillos. Las células en estos pocillos se cultivaron adicionalmente y los hibridomas se seleccionaron basándose en la reactividad de los anticuerpos producidos por los hibridomas clonados con la proteína CAPRINA-1. Como resultado de evaluar la reactividad de cada anticuerpo con la proteína CAPRINA-1 mediante el mismo procedimiento anterior, se obtuvo una pluralidad de líneas de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales de conejo que exhibían reactividad con la proteína CAPRINA-1.
A continuación, estos anticuerpos monoclonales de conejo que mostraron reactividad con la proteína CAPRINA-1 fueron seleccionados para detectar aquellos que exhiben reactividad con la superficie de las células cancerosas humanas en las que se expresó CAPRINA-1. Específicamente, se centrifugaron 2 * 105 células de cada línea celular de cáncer de pulmón humano QG56 y una línea celular de cáncer de mama humano BT-474 (obtenida de ATCC) en cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, a los que luego se agregaron 100 pl del sobrenadante de cultivo de cada uno de los hibridomas. El tubo se dejó en reposo en hielo durante 1 hora. Después de lavar con PBS, a ello se añadió un anticuerpo anti-IgG de conejo (H L) marcado con FITC o anti-IgG de conejo (H L) marcado con Alexa 488 diluido 100 veces con PBS (-) que contiene FBS al 0,5 % (FBS al 0,5 %-PBS (-)) y el tubo se dejó en reposo en hielo durante 1 hora. Después de lavar con FBS al 0,5 %-PBS (-), las células se suspendieron en 0,2 pg/ml de yoduro de propidio y FBS al 0,5 %-PBS (-) y la intensidad de la fluorescencia se midió utilizando FACSCalibur(TM) o FACSVerse(TM) (Becton, Dickinson and Company). Por otro lado, el mismo procedimiento que el anterior se llevó a cabo utilizando un medio para el cultivo de hibridomas y la resultante se usó como muestra para un control negativo. Como resultado, se seleccionó un anticuerpo monoclonal de conejo anti-CAPRINA-1 que exhibió una intensidad de fluorescencia más fuerte que la del control negativo, es decir, reaccionó fuertemente con la superficie celular de las células cancerosas QG56 y BT-474 al expresar CAPRINA-1.
A continuación, los fragmentos de amplificación de los genes que codifican la región variable como el anticuerpo monoclonal de conejo anti-CAPRINA-1 obtenido anteriormente se obtuvieron de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 5 del documento WO2010/016526, y se analizaron para determinar sus secuencias de genes y las secuencias de aminoácidos codificadas por los mismos. Específicamente, se extrajo ARNm del hibridoma que producía el anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 de conejo, y los genes de la región variable de la cadena pesada (VH) y la región variable de la cadena ligera (VL) de este anticuerpo se obtuvieron mediante RT-PCR utilizando cebadores específicos para las secuencias de la región variable de conejo. Estos genes se insertaron en vectores de clonación y sus respectivas secuencias de nucleótidos se determinaron de acuerdo con un procedimiento de rutina.
Se confirmó que el anticuerpo monoclonal de conejo anti-CAPRINA-1 resultante tenía una región variable de cadena pesada representada por la SEQ ID NO:20, consistiendo la región variable de la cadena pesada que contiene CDR1, CDR2 y CdR3 en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, respectivamente, y que tenía una región variable de cadena ligera representada por la SEQ ID NO:21, consistiendo la región variable de la cadena pesada que contiene CDR1, CDR2 y CDR3 en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente.
A continuación, se confirmó la reactividad del anticuerpo monoclonal de conejo anti-CAPRINA-1 obtenido con varias células cancerosas humanas. El anticuerpo obtenido se hizo reaccionar con células cancerosas humanas que se había confirmado que expresaban el gen de CAPRINA-1, es decir, células de cáncer de mama (BT-474 y MDA-MB-361), células de cáncer colorrectal (HT-29), células de cáncer de pulmón (QG56), células de cáncer de estómago (NCI-N87), células de cáncer de útero (HEC-1-A), células de cáncer de próstata (22Rv1), células de cáncer de páncreas (Panc10.5), células de cáncer de hígado (Hep3B), células de cáncer de ovario (SKOV3), células de cáncer de riñón (Caki-2), células de tumor cerebral (U-87MG), células cáncer de vejiga (T24 y HT-1376), células de cáncer de esófago (OE33), células de leucemia (OCI-AML5), células de linfoma (Ramos), células de cáncer de vesícula biliar (TGBC14TKB), células de fibrosarcoma (HT-1080), células de melanoma (G-361), células de cáncer de la corteza suprarrenal (A-673), células de tumor de Ewing (RD-ES), células de linfoma de Hodgkin (RPMI1666), células de mesotelioma (NCI-H2452), células de mieloma múltiple (IM-9), células de cáncer de testículo (NT/D1), células de cáncer de tiroides (TT) o células de cáncer de cabeza y cuello (FaDu) y la intensidad de fluorescencia se evaluó mediante citometría de flujo. Se recogieron 106 células de cada línea celular de cáncer en cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, y el sobrenadante de cultivo (100 j l) del hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de conejo anti-CAPRINA-1 obtenido anteriormente se añadió a cada tubo y se hizo reaccionar a 4 °C durante 1 hora. Después de lavar con FBS al 0,5 %-PBS (-), se añadió un anticuerpo IgG de cabra anti-conejo (H L) marcado con FITC (fabricados por Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) diluido 50 veces con FBS al 0,5 %-PBS (-) y el tubo se dejó en reposo a 4 °C durante 60 minutos. Después de lavar con FBS al 0,5 %-PBS (-), las células se suspendieron en FBS al 0,5 %-PBS(-) que contenía 0,2 jg/m l (concentración final) de yoduro de propidio, y la intensidad de fluorescencia se midió utilizando FACSCalibur(TM) o FACSVerse(TM) (Becton, Dickinson and Company). Por otro lado, el mismo procedimiento que el anterior se llevó a cabo para un control negativo utilizando un medio para el cultivo de hibridomas y la resultante preparada se usó como muestra para un control negativo. Como resultado, en todas las células cancerosas utilizadas en la evaluación, la intensidad de la fluorescencia cuando se usó el sobrenadante de cultivo del hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 de conejo fue más fuerte que cuando se usó el control negativo. A partir de estos resultados, se confirmó que el anticuerpo monoclonal de conejo anti-CAPRINA-1 reaccionaba con c A p RINA-1 en la superficie de la membrana de la célula cancerosa de las células cancerosas humanas.
Ejemplo 2: Preparación de anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 quimérico de ser humano-conejo
El gen para expresar la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada representada por la SEQ ID NO:20 del anticuerpo monoclonal de conejo anti-CAPRINA-1 confirmado en el Ejemplo 1 y el gen para expresar la región variable de la cadena ligera representada por la SEC ID NO 21 del mismo, se insertaron respectivamente en un vector para la expresión en células de mamíferos que tienen un inserto génico de la región constante de la cadena pesada de la IgG1 humana y un vector para la expresión en células de mamíferos que tienen un inserto génico de la región constante de la cadena ligera de la IgG1 humana. Los dos vectores de expresión recombinantes preparados se transfirieron a células de mamífero de acuerdo con un procedimiento de rutina y se obtuvo un sobrenadante de cultivo que contenía un anticuerpo anti-CAPRINA-1 quimérico de ser humano-conejo (anticuerpo quimérico de ser humano-conejo). El sobrenadante de cultivo obtenido que contenía el anticuerpo quimerizado se purificó de acuerdo con un procedimiento de rutina utilizando Hitrap Protein A Sepharose FF (fabricado por GE Healthcare Japan Corp.). El tampón se reemplazó con PBS(-) y la resultante se filtró a través de un filtro de 0,22 jm (fabricado por Merck Millipore Corp.) para preparar el anticuerpo quimérico.
Ejemplo 3: Preparación de anticuerpos monoclonales anti-CAPRINA-1 humanizados
A continuación, sobre la base de la información sobre las secuencias de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos de CDR1 a CDR3 en la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal de conejo anti-CAPRINA-1 confirmado en el Ejemplo 1 y de CDR1 a CDR3 en la región variable de la cadena ligera del mismo, se diseñó una secuencia de nucleótidos para poder expresar la secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada representada por la SEQ ID NO:7 en la que las CDR1, CDR2 y CDR3 de la s región variable de cadena pesada consistían en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, respectivamente. Esto se insertó en un vector para la expresión en células de mamíferos que tienen un inserto génico de la región constante de la cadena pesada de la IgG1 humana. De manera similar, se diseñó una secuencia de nucleótidos para poder expresar la secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera representada por la SEQ ID NO:11 en la que las CDR1, CDR2 y CDR3 de la s región variable de cadena ligera consistían en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente. Esto se insertó en un vector para la expresión en células de mamíferos que tienen un inserto génico de la región constante de la cadena ligera de la IgG1 humana. Estos dos vectores de expresión recombinante se transfirieron a células de mamífero de acuerdo con un procedimiento de rutina, y se obtuvo un sobrenadante de cultivo que contenía el anticuerpo N.° 0 humanizado que consiste en la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la cadena pesada representada por la SEQ ID n O:7 y la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la cadena ligera representada por la SEQ ID NO:11.
De manera similar, se obtuvo un sobrenadante de cultivo que contenía el anticuerpo humanizado N.° 1 consistente en la secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada representada por la SEQ ID NO:8 en la cual las CDR1, CDR2, and CDR3 de la región variable de la cadena pesada consistían en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, and SEQ ID NO:3, respectivamente, y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera representada por la SEQ ID n O:11.
De manera similar, adicionalmente se obtuvieron los sobrenadantes de cultivo que contienen los siguientes anticuerpos humanizados N.° 2 a 10:
el anticuerpo N.° 2 humanizado que consiste en la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada representada por la SEQ ID NO:8 y la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la cadena ligera representada por la SEQ ID NO:12 en la cual las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera consistían en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente; el anticuerpo N.° 3 humanizado que consiste en la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada representada por la SEQ ID NO:8 y la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la cadena ligera representada por la SEQ ID NO:13 en la cual las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera consistían en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente; el anticuerpo humanizado N.° 4 que consiste en la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada representada por la SEQ ID NO:7 y la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la cadena ligera representada por la SEQ ID NO:12;
el anticuerpo humanizado N.° 5 que consiste en la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada representada por la SEQ ID NO:7 y la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la cadena ligera representada por la SEQ ID NO:13;
el anticuerpo N.° 6 humanizado que consiste en la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada representada por la SEQ ID NO:7 y la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la cadena ligera representada por la SEQ ID NO:15 en la cual las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera consistían en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente; el anticuerpo humanizado N.° 7 que consiste en la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada representada por la SEQ ID NO:8 y la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la cadena ligera representada por la SEQ ID NO:15;
el anticuerpo humanizado N.° 8 que consiste en la secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada representada por la SEQ ID NO:9 en la cual las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada consistían en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, respectivamente, y la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la cadena ligera representada por la SEQ ID NO:15.
el anticuerpo humanizado N.° 9 que consiste en la secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada representada por la SEQ ID NO:10 en la cual las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada consistían en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, respectivamente, y la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la cadena ligera representada por la SEQ ID NO:14 en la cual las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera consistían en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente; y
el anticuerpo humanizado N.° 10 que consiste en la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada representada por la SEQ ID NO:10 y la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la cadena ligera representada por la SEQ ID NO:15;
Los sobrenadantes de cultivo obtenidos que contenían los anticuerpos humanizados N.° 0 a N.° 10 se purificaron cada uno de acuerdo con un procedimiento de rutina utilizando Hitrap Protein A Sepharose FF (fabricado por GE Healthcare Japan Corp.). El tampón se reemplazó con PBS (-) y la resultante se filtró a través de un filtro de 0,22 pm (fabricado por Merck Millipore Corp.) para preparar los anticuerpos humanizados.
Ejemplo 4: Especificidad de antígeno del anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y anticuerpos humanizados N.° 0 a N.° 10 y reactividad de los mismos con células cancerosas
A continuación, la reactividad específica del anticuerpo quimérico de ser humano-conejo preparado en el Ejemplo 2 y los anticuerpos humanizados N.° 0 a N.° 10 preparados en el Ejemplo 3 con la proteína CAPRINA-1 se confirmó mediante ELISA de acuerdo con un procedimiento de rutina. Específicamente, en primer lugar, se añadió una solución de PBS que contenía 5 pg/ml de proteína CAPRINA-1 a 100 pl/pocillo en placas de 96 pocillos, y las placas se dejaron en reposo a 4 °C durante 18 horas. Cada pocillo se lavó con PBS-T. Después, se añadió una solución de bloqueo que consistía en una solución de PBS que contenía leche desnatada al 5 % a 400 pl/pocillo, y las placas se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución se retiró y cada pocillo se lavó con p BS-T. A continuación, se añadió una solución que contenía cada uno de los anticuerpos quiméricos de ser humano-conejo y los anticuerpos humanizados N.° 0 a N.° 10 ajustados a 1 pg/ml con PBS que contenía 0,2 % de leche desnatada a 50 pl/pocillo en cada pocillo, y las placas se dejaron en reposo. a temperatura ambiente durante 1 hora. Como controles negativos se prepararon un pocillo en el que se añadió un anticuerpo IgG humano del que se había confirmado que no reaccionaba con la proteína CAPRINA-1 a la misma concentración de anticuerpo que la anterior y un pocillo al que no se añadió anticuerpo. Cada pocillo se lavó con PBS-T tres veces. Después, se añadió un anticuerpo anti-IgG humano marcado con HRP diluido 3000 veces con PBS que contenía 0,2 % de leche desnatada a 50 pl/pocillo, y las placas se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavó con PBS-T tres veces. Después, se añadió una solución de sustrato TMB (fabricada por Thermo Fischer Scientific, Inc.) a 100 pl/pocillo, y las placas se dejaron en reposo durante de 1 a 30 minutos para la reacción cromogénica. Después del desarrollo del color, la reacción se terminó mediante la adición de ácido sulfúrico 1 N a 100 pl/pocillo, y los valores de absorbancia se midieron a 450 nm y 630 nm utilizando un espectrómetro de absorción. Además, los pocillos en los que no se inmovilizó la proteína CAPRINA-1 (pocillos no inmovilizados) se prepararon juntos y cada anticuerpo se añadió y se analizó de manera similar. Como resultado, el valor de absorbancia del pocillo utilizado como control negativo al que se agregó un anticuerpo IgG humano confirmado que no reaccionaba con la proteína CAPRINA-1, fue tan baja como la del pocillo al que no se agregó anticuerpo, mientras que los pocillos a los que se añadió los respectivos anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y los anticuerpos humanizados N.° 0 a N.° 10 exhibieron valores de absorbancia equivalentemente altos. El anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y los anticuerpos humanizados N.° 0 a N.° 10 en los pocillos en los que no se inmovilizó la proteína CAPRINA-1 simplemente mostraron un valor de absorbancia equivalente al del control negativo. A partir de estos resultados, se confirmó que el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y los anticuerpos humanizados N.° 0 a N.° 10 reaccionaban específicamente con la proteína CAPRINA-1.
A continuación, se confirmó la reactividad del anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y los anticuerpos humanizados N.° 0 a N.° 10 que reaccionan específicamente con la proteína CAPRINA-1, con varias células cancerosas humanas y células de cáncer de ratón. El anticuerpo quimérico de ser humano-conejo purificado y los anticuerpos humanizados N.° 0 a N.° 10 se hicieron reaccionar cada uno con células cancerosas humanas que se había confirmado que expresaban el gen de CAPRINA-1, es decir, células de cáncer de mama (BT-474 y MDA-MB-361), células de cáncer colorrectal (HT-29), células de cáncer de pulmón (QG56), células de cáncer de estómago (NCI-N87), células de cáncer de útero (HEC-1-A), células de cáncer de próstata (22Rv1), células de cáncer de páncreas (Panc10.5), células de cáncer de hígado (Hep3B), células de cáncer de ovario (SKOV3), células de cáncer de riñón (Caki-2), células de tumor cerebral (U-87MG), células cáncer de vejiga (T24 y HT-1376), células de cáncer de esófago (OE33), células de leucemia (OCI-AML5), células de linfoma (Ramos), células de cáncer de vesícula biliar (TGBC14TKB), células de fibrosarcoma (HT-1080), células de melanoma (G-361), células de cáncer de la corteza suprarrenal (A-673), células de tumor de Ewing (RD-ES), células de linfoma de Hodgkin (RPMI1666), células de mesotelioma (NCI-H2452), células de mieloma múltiple (IM-9), células de cáncer de testículo (NT/D1), células de cáncer de tiroides (TT) o células de cáncer de cabeza y cuello (FaDu) y la intensidad de fluorescencia se evaluó mediante citometría de flujo. Específicamente, se recogieron 5 * 105 células de cada línea celular de cáncer en cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, y cada uno del anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y los anticuerpos humanizados N.° 0 a N.° 10 se añadieron a 50 pg/ml (concentración final) a cada tubo y reaccionó a 4 °C durante 1 hora. Después de lavar con FBS al 0,5 %-PBS (-) dos veces, se añadió un anticuerpo IgG antihumano de cabra marcado con Alexa 488 (H L) (fabricado por Life Technologies Corp.) diluido 100 veces con FBS al 0,5 %-PBS (-), y el tubo se dejó en reposo a 4 °C durante 60 minutos. Después de lavar con FBS al 0,5 %-PBS (-), las células se suspendieron en FBS al 0,5 %-PBS(-) que contenía 0,2 pg/ml (concentración final) de yoduro de propidio, y la intensidad de fluorescencia se midió utilizando FACSCalibur(TM) o FACSVerse(TM) (Becton, Dickinson and Company). Por otro lado, el mismo procedimiento que el anterior se llevó a cabo utilizando un medio para el cultivo de hibridomas y la resultante preparada se usó como control negativo. Como resultado, en todas las células cancerosas utilizadas en la evaluación, la intensidad de fluorescencia del anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y los anticuerpos humanizados N.° 0 a N.° 10 fue más fuerte que en el caso de usar el control negativo. A partir de estos resultados, se confirmó que el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y los anticuerpos humanizados N.° 0 a N.° 10 reaccionaban con la proteína CAPRINA-1 expresada sobre la superficie de membrana de las células cancerosas humanas.
Ejemplo 5: Actividad antitumoral del anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y los anticuerpos humanizados N.° 0 a N.° 10 contra varias células cancerosas humanas
A continuación, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo preparado en el Ejemplo 2 y los anticuerpos humanizados N.° 0 a N.° 10 preparados en el Ejemplo 3 se evaluaron por sus efectos antitumorales en varias células cancerosas humanas sobre la base de la actividad ADCC.
Los siguientes anticuerpos anti-CAPRINA-1 se usaron como anticuerpos comparativos para el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y los anticuerpos humanizados N.° 0 a N.° 10:
anticuerpos descritos en el documento WO2010/016526, es decir, el anticuerpo comparativo 1 que tiene una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO:26 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:27 en esta bibliografía, el anticuerpo comparativo 2 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:28 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:29 en la misma, el anticuerpo comparativo 3 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:30 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:31 en la misma, el anticuerpo comparativo 4 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:32 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:33 en la misma, el anticuerpo comparativo 5 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:34 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:35 en la misma, el anticuerpo comparativo 6 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:36 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:37 en la misma, el anticuerpo comparativo 7 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:38 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:39 en la misma, el anticuerpo comparativo 8 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:40 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:41 en la misma, el anticuerpo comparativo 9 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:42 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:43 en la misma, el anticuerpo comparativo 10 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:44 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:45 y un anticuerpo comparativo 11 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:46 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:47 en la misma;
anticuerpos descritos en el documento WO2011/096517, es decir, el anticuerpo comparativo 12 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:43 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:47 en esta bibliografía, y el anticuerpo comparativo 13 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:43 y una región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 53 en la misma;
anticuerpos descritos en el documento WO2011/096528, es decir, el anticuerpo comparativo 14 que tiene una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO:43 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:47 en esta bibliografía, el anticuerpo comparativo 15 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:51 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:55 en la misma, el anticuerpo comparativo 16 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:59 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:63 en la misma, el anticuerpo comparativo 17 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:76 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:80 en la misma, el anticuerpo comparativo 18 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:84 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:88 y un anticuerpo comparativo 19 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:92 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:96 en la misma; un anticuerpo descrito en el documento WO2011/096519, es decir, el anticuerpo comparativo 20 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:42 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:46 en esta bibliografía;
anticuerpos descritos en el documento WO2011/096533, es decir, el anticuerpo comparativo 21 que tiene una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO:43 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:51 en esta bibliografía, el anticuerpo comparativo 22 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:47 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:51 y un anticuerpo comparativo 23 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:63 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:67 en la misma;
anticuerpos descritos en el documento WO2011/096534, es decir, el anticuerpo comparativo 24 que tiene una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO:43 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:47 en esta bibliografía, el anticuerpo comparativo 25 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:43 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:51 y un anticuerpo comparativo 26 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:63 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:67 en la misma;
anticuerpos descritos en el documento WO2013/018894, es decir, el anticuerpo comparativo 27 que tiene una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO:9 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:13 en esta bibliografía, el anticuerpo comparativo 28 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:19 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:23 en la misma, el anticuerpo comparativo 29 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:9 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:53 en la misma, el anticuerpo comparativo 30 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:58 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:62 en la misma, el anticuerpo comparativo 31 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:63 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:65 en la misma, el anticuerpo comparativo 32 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:69 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:73 y un anticuerpo comparativo 33 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:77 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:81 en la misma;
un anticuerpo descrito en el documento WO2013/018892, es decir, el anticuerpo comparativo 34 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:8 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:12 en esta bibliografía;
un anticuerpo descrito en el documento WO2013/018891, es decir, el anticuerpo comparativo 35 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:8 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:12 en esta bibliografía;
un anticuerpo descrito en el documento WO2013/018889, es decir, el anticuerpo comparativo 36 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:8 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:12 en esta bibliografía;
un anticuerpo descrito en el documento WO2010/018883, es decir, el anticuerpo comparativo 37 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:8 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:12 en esta bibliografía;
un anticuerpo descrito en el documento WO2013/125636, es decir, el anticuerpo comparativo 38 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:6 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:7 en esta bibliografía;
anticuerpos descritos en el documento WO2013/125654, es decir, el anticuerpo comparativo 39 que tiene una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO:52 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:54 en esta bibliografía, el anticuerpo comparativo 40 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:21 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:23 en la misma, el anticuerpo comparativo 41 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:25 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:23 en la misma, el anticuerpo comparativo 42 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:16 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:18 en la misma, el anticuerpo comparativo 43 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:29 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:33 en la misma, el anticuerpo comparativo 44 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:39 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:43 y un anticuerpo comparativo 45 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:49 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:43 en la misma;
un anticuerpo descrito en el documento WO2013/125630, es decir, el anticuerpo comparativo 46 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:11 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:15 en esta bibliografía; y
anticuerpos descritos en el documento WO2013/125640, es decir, el anticuerpo comparativo 47 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:11 y una región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:15 en esta bibliografía, y el anticuerpo comparativo 48 que tiene una región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:21 y una región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO:25 en ella.
Los anticuerpos comparados mencionados anteriormente (anticuerpos comparativos 1 a 48) se prepararon cada uno como sigue: el gen para expresar la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada y el gen para expresar la región variable de la cadena ligera se insertaron, respectivamente, en un vector pcDNA4/myc-His para la expresión en células de mamíferos (fabricado por Life Technologies Corp.) con un la inserción génica de la región constante de la cadena pesada de IgG1 humana y un vector pcDNA3.1/myc-His para la expresión en células de mamífero (fabricado por Life Technologies Corp.) que tiene una inserción génica de la región constante de la cadena ligera de la IgG1 humana; los dos vectores de expresión recombinantes preparados se transfirieron a células de mamífero de acuerdo con un procedimiento de rutina; el anticuerpo quimerizado humano o humanizado obtenido se purificó utilizando Hitrap Protein A Sepharose FF (fabricado por GE Healthcare Japan Corp.); el tampón se reemplazó con PBS (-); y la resultante se filtró a través de un filtro de 0,22 pm (fabricado por Merck Millipore Corp.).
Como controles negativos se prepararon un pocillo al que se añadió un anticuerpo de control de isotipo, un pozo al que no se añadió anticuerpo y un pocillo al que se añadió un anticuerpo que reacciona con la proteína CAPRINA-1 pero que no muestra reactividad con la superficie de las células cancerosas humanas sobre las que se expresó CAPRINA-1. Cada anticuerpo se añadió a 5 pg/ml (concentración final) a placas de 96 pocillos con fondo en V.
Las células NK humanas separadas de las células mononucleares de sangre periférica humanas utilizando un procedimiento de rutina se usaron como células efectoras. Las células mononucleares de sangre periférica humanas se separaron utilizando una solución de separación por gravedad específica Histopaque para la separación de células mononucleares de sangre periférica (Sigma-Aldrich Corp.) y se hicieron reaccionar con anticuerpos (anticuerpo CD3 antihumano, anticuerpo anti-CD20 humano, anticuerpo anti-CD19 humano, anticuerpo anti-CD11 c humano, anticuerpo anti-HLA-DR (BD Pharmingen) marcado con un colorante fluorescente FITC. Una población celular que contenía células NK que no se tiñeron con estos anticuerpos se separó usando un clasificador de células (FACS Vantage SE (Becton, Dickinson and Company)). Como alternativa, se utilizó una población celular separada utilizando un kit de separación de células NK humanas (fabricado por Miltenyi Biotec K.K.). Se prepararon placas de 96 pocillos con fondo en V a las que se añadió cada uno de los anticuerpos y las células NK humanas se añadieron a 0,4 a 2,0 x 105 células/pocillo.
Las células de cáncer de mama (BT-474 y MDA-MB-361), células de cáncer colorrectal (HT-29), células de cáncer de pulmón (QG56), células de cáncer de estómago (NCI-N87), células de cáncer de útero (HEC-1-A), células de cáncer de próstata (22Rv1), células de cáncer de páncreas (Panc10.5), células de cáncer de hígado (Hep3B), células de cáncer de ovario (SKOV3), células de cáncer de riñón (Caki-2), células de tumor cerebral (U-87MG), células cáncer de vejiga (T24 y HT-1376), células de cáncer de esófago (OE33), células de leucemia (OCI-AML5), células de linfoma (Ramos), células de cáncer de vesícula biliar (TGBC14TKB), células de fibrosarcoma (HT-1080), células de melanoma (g -361), cáncer de la corteza suprarrenal (A-673), tumor de Ewing (RD-ES), linfoma de Hodgkin (RPMI1666), mesotelioma (NCI-H2452), mieloma múltiple (IM-9), cáncer de testículo (NT/D1), cáncer de tiroides (TT) y cáncer de cabeza y cuello (FaDu) se utilizaron como células diana. Se recogieron 106 células de cada línea celular de cáncer humano mencionada anteriormente en cada tubo centrífugo de 50 ml. Se añadieron 100 pCi de cromo 51 (fabricado por PerkinElmer, Inc.) y el tubo se incubó a 37 °C durante 1 hora. Después, las células se lavaron con un medio RPMI1640 que contenía FBS al 10 % tres veces, se añadieron a 2 * 10 células/pocillo a las placas de 96 pocillos con fondo en V a las que se añadieron las células efectoras y cada anticuerpo como se ha descrito anteriormente, y se hizo reaccionar a 37 °C durante 4 horas en condiciones de CO2 al 5 %. Después de la reacción, se recuperaron 50 pl de un sobrenadante de cultivo que contenía cromo 51 liberado en el sobrenadante de cultivo de células cancerosas dañadas de cada pocillo, se añadieron a LumaPlate-96 (fabricado por PerkinElmer, Inc.) con el fondo de cada pocillo recubierto con un centelleador sólido y se secaron. La cantidad de cromo 51 liberado en el sobrenadante del cultivo de las células cancerosas dañadas se midió para calcular los efectos antitumorales de los anticuerpos anti-CAPRINA-1 en las células cancerosas.
Como resultado, para las células de cáncer de mama (BT-474), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 54 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo humanizado N.° 4, el anticuerpo humanizado N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron 50 % o más de actividad, y el anticuerpo humanizado N.° 9, el anticuerpo humanizado N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo humanizado n. ° 8 mostraron una actividad del 46 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 25 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 10 % o menor.
Para las células de cáncer de mama (MDA-MB-361), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 52 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo humanizado N.° 4, el anticuerpo humanizado N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron 45 % o más de actividad, y el anticuerpo humanizado N.° 9, el anticuerpo humanizado N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo humanizado n. ° 8 mostraron una actividad del 40 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 25 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 6 % o menor.
Para las células de cáncer colorrectal (HT-29), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 43 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo humanizado N.° 4, el anticuerpo humanizado N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron 40 % o más de actividad, y el anticuerpo humanizado N.° 9, el anticuerpo humanizado N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo humanizado n. ° 8 mostraron una actividad del 35 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 20 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 3 % o menor.
Para las células de cáncer de pulmón (QG56), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 46 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo humanizado N.° 4, el anticuerpo humanizado N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron 42 % o más de actividad, y el anticuerpo humanizado N.° 9, el anticuerpo humanizado N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo humanizado n. ° 8 mostraron una actividad del 38 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 22 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 10 % o menor.
Para las células de cáncer de estómago (NCI-N87), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 45 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo humanizado N.° 4, el anticuerpo humanizado N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron una actividad del 38 % o mayor, y el anticuerpo N.° 9, el anticuerpo humanizado N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo humanizado n. ° 8 mostraron una actividad del 34 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 15 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 8 % o menor.
Para las células de cáncer de útero (HEC-1-A), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 52 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo humanizado N.° 4, el anticuerpo humanizado N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron 45 % o más de actividad, y el anticuerpo humanizado N.° 9, el anticuerpo humanizado N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo humanizado n. ° 8 mostraron una actividad del 40 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 20 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 5 % o menor.
Para las células de cáncer de próstata (22Rv1), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 49 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo N.° 4, el anticuerpo humanizado N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron 45 % o más de actividad, y el anticuerpo humanizado N.° 9, el anticuerpo humanizado N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo humanizado n. ° 8 mostraron una actividad del 38 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 20 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 12 % o menor.
Para las células de cáncer de páncreas (Panc10.5), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 35 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo humanizado N.° 4, el anticuerpo humanizado N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron 30 % o más de actividad, y el anticuerpo humanizado N.° 9, el anticuerpo humanizado N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo humanizado n. ° 8 mostraron una actividad del 24 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 10 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 2 % o menor.
Para las células de cáncer de hígado (Hep3B), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 28 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo humanizado N.° 4, el anticuerpo humanizado N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron 25 % o más de actividad, y el anticuerpo humanizado N.° 9, el anticuerpo humanizado N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo humanizado n. ° 8 mostraron una actividad del 21 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 12 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 5 % o menor.
Para las células de cáncer de ovario (SKOV3), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 35 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo humanizado N.° 4, el anticuerpo humanizado N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron 31 % o más de actividad, y el anticuerpo humanizado N.° 9, el anticuerpo humanizado N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo humanizado n. ° 8 mostraron una actividad del 27 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 15 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 5 % o menor.
Para las células de cáncer de riñón (Caki-2), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 37 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo humanizado N.° 4, el anticuerpo humanizado N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron 33 % o más de actividad, y el anticuerpo humanizado N.° 9, el anticuerpo humanizado N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo humanizado n. ° 8 mostraron una actividad del 26 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 15 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 5 % o menor.
Para las células de tumores cerebrales (U-87MG), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 36 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo humanizado N.° 4, el anticuerpo humanizado N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron 29 % o más de actividad, y el anticuerpo humanizado N.° 9, el anticuerpo humanizado N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo humanizado n. ° 8 mostraron una actividad del 24 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 10 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 6 % o menor.
Para las células de cáncer de vejiga (T24), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 36 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo humanizado N.° 4, el anticuerpo humanizado N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron 33 % o más de actividad, y el anticuerpo humanizado N.° 9, el anticuerpo humanizado N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo humanizado n. ° 8 mostraron una actividad del 30 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 15 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 6 % o menor.
Para las células de cáncer de vejiga (HT-1376), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 45 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo humanizado N.° 4, el anticuerpo humanizado N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron 40 % o más de actividad, y el anticuerpo humanizado N.° 9, el anticuerpo humanizado N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo humanizado n. ° 8 mostraron una actividad del 28 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 20 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 7 % o menor.
Para las células de cáncer de esófago (OE33), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 35 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo humanizado N.° 4, el anticuerpo humanizado N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron 33 % o más de actividad, y el anticuerpo humanizado N.° 9, el anticuerpo humanizado N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo humanizado n. ° 8 mostraron una actividad del 30 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 15 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 6 % o menor.
Para las células de leucemia (OCI-AML5), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 20 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo humanizado N.° 4, el anticuerpo humanizado N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron 18 % o más de actividad, y el anticuerpo humanizado N.° 9, el anticuerpo humanizado N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo humanizado n. ° 8 mostraron una actividad del 15 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 10 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 6 % o menor.
Para las células de linfoma (Ramos), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 20 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo humanizado N.° 4, el anticuerpo humanizado N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron una actividad del 18 % o mayor, y el anticuerpo N.° 9, el anticuerpo N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo humanizado n. ° 8 mostraron una actividad del 15 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 10 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 6 % o menor.
Para las células de cáncer de vesícula biliar (TGBC14TKB), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 35 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo humanizado N.° 4, el anticuerpo humanizado N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron 30 % o más de actividad, y el anticuerpo humanizado N.° 9, el anticuerpo humanizado N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo humanizado n. ° 8 mostraron una actividad del 25 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 15 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 6 % o menor.
Para las células de fibrosarcoma (HT-1080), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 30 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo N.° 4, el anticuerpo humanizado N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron 25 % o más de actividad, y el anticuerpo humanizado N.° 9, el anticuerpo humanizado N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo humanizado n. ° 8 mostraron una actividad del 20 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 10 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 6 % o menor.
Para el melanoma (G-361), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 25 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo humanizado N.° 4, el anticuerpo humanizado N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron 21 % o más de actividad, y el anticuerpo humanizado N.° 9, el anticuerpo humanizado N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo humanizado n. ° 8 mostraron una actividad del 15 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 8 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 6 % o menor.
Para las células de cáncer de la corteza suprarrenal (A-673), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 50 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo humanizado N.° 4, el anticuerpo humanizado N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron 46 % o más de actividad, y el anticuerpo humanizado N.° 9, el anticuerpo humanizado N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo humanizado n. ° 8 mostraron una actividad del 40 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 20 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 8 % o menor.
Para las células de tumor de Ewing (RD-ES), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 48 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo humanizado N.° 4, el anticuerpo humanizado N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron 40 % o más de actividad, y el anticuerpo humanizado N.° 9, el anticuerpo humanizado N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo humanizado n. ° 8 mostraron una actividad del 31 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 15 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 6 % o menor.
Para las células de linfoma de Hodgkin (RPMI1666), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 40 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo humanizado N.° 4, el anticuerpo humanizado N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron 36 % o más de actividad, y el anticuerpo humanizado N.° 9, el anticuerpo humanizado N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo humanizado n. ° 8 mostraron una actividad del 30 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 20 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 5 % o menor.
Para las células de mesotelioma (NCI-H2452), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 35 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo humanizado N.° 4, el anticuerpo humanizado N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron 39 % o más de actividad, y el anticuerpo humanizado N.° 9, el anticuerpo humanizado N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo humanizado n. ° 8 mostraron una actividad del 31 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 10 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 5 % o menor.
Para las células de mieloma múltiple (IM-9), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 35 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo humanizado N.° 4, el anticuerpo N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron una actividad del 30 % o más, y el anticuerpo humanizado N.° 9, el anticuerpo N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo humanizado n. ° 8 mostraron una actividad del 27 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 10 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 6 % o menor.
Para las células de cáncer de testículo (NT/D1), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 37 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo humanizado N.° 4, el anticuerpo humanizado N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron 30 % o más de actividad, y el anticuerpo humanizado N.° 9, el anticuerpo humanizado N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo humanizado n. ° 8 mostraron una actividad del 25 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 11 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 5 % o menor.
Para las células de cáncer de tiroides (TT), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 42 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo humanizado N.° 4, el anticuerpo humanizado N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron 35 % o más de actividad, y el anticuerpo humanizado N.° 9, el anticuerpo humanizado N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo humanizado n. ° 8 mostraron una actividad del 30 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 15 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 5 % o menor.
Para las células de cáncer de cabeza y cuello (FaDu), el anticuerpo humanizado N.° 7, el anticuerpo humanizado N.° 10 y el anticuerpo humanizado N.° 6 mostraron un efecto antitumoral del 50 % o superior, el anticuerpo humanizado N.° 3, el anticuerpo humanizado N.° 4, el anticuerpo humanizado N.° 2 y el anticuerpo humanizado N.° 5 exhibieron 40 % o más de actividad, y el anticuerpo humanizado N.° 9, el anticuerpo humanizado N.° 1, el anticuerpo humanizado N.° 0, el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo y el anticuerpo n. ° 8 mostraron una actividad del 35 % o superior. Por el contrario, todos los anticuerpos comparativos 1 a 48 mostraron una actividad del 20 % o inferior, y todos los grupos de control negativo mostraron una actividad del 8 % o menor.
Estos resultados demostraron que los anticuerpos humanizados N.° 0 a N.° 10 y el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo exhiben un efecto antitumoral significativamente más fuerte en el cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, tumor cerebral, cáncer de estómago, cáncer de útero, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de esófago, leucemia, linfoma, cáncer de hígado, cáncer de vesícula biliar, sarcoma, melanoma, cáncer de la corteza suprarrenal, tumor de Ewing, linfoma de Hodgkin, mesotelioma, mieloma múltiple, cáncer de testículo, cáncer de tiroides o cáncer de cabeza y cuello que el de los anticuerpos comparativos.
Por otra parte, los anticuerpos humanizados N.° 0 a N.° 10 y el anticuerpo quimérico de ser humano-conejo mostraron una actividad antitumoral significativamente más fuerte contra el cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, tumor cerebral, cáncer de estómago, cáncer de útero, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de esófago, leucemia, linfoma, cáncer de hígado, cáncer de vesícula biliar, sarcoma, melanoma, cáncer de la corteza suprarrenal, tumor de Ewing, linfoma de Hodgkin, mesotelioma, mieloma múltiple, cáncer de testículo, cáncer de tiroides, cáncer de cabeza y cuello como se ha descrito anteriormente que el de todos los anticuerpos contra CAPRINA-1 en los Ejemplos de los documentos WO2010/016526, WO2011/096517, WO2011/096528, WO2011/096519, WO2011/096533, WO2011/096534, WO2011/096535, WO2013/018886, WO2013/018894, WO2013/018892, WO2013/018891, WO2013/018889, WO2013/018883, WO2013/125636, WO2013/125654, WO2013/125630, WO2013/125640, WO2013/147169 y WO2013/147176.
El efecto antitumoral se mostró como actividad citotóxica contra las líneas celulares de cáncer que se determinó mezclando cada anticuerpo contra CAPRINA-1, las células efectoras y las células diana incorporadas al cromo 51, cultivando las células durante 4 horas y midiendo la cantidad de cromo 51 liberado en el medio después del cultivo, seguido del cálculo de acuerdo con la siguiente fórmula:
*Fórmula: Actividad citotóxica ( %) = (Cantidad de cromo 51 liberado de las células diana cuando se añaden el anticuerpo contra CAPRINA-1 y las células efectoras - Cantidad de cromo 51 liberado de forma natural desde las células diana)/(Cantidad de cromo 51 liberado desde la diana células a las que se añade ácido clorhídrico 1 N -Cantidad de cromo 51 liberado de forma natural desde las células diana) * 100.
Ejemplo 6-1: Preparación de anticuerpos monoclonales anti-CAPRINA-1 humanizados en los que se sustituyó el aminoácido en la región constante de la cadena pesada
Los anticuerpos anti-CAPRINA-1 que tienen una región constante de la cadena pesada descrita en la SEQ ID NO:33 en la que una porción de aminoácidos en la región constante de la cadena pesada de los anticuerpos humanizados N.° 0, N.° 2, N.° 3, N.° 4, N.° 5, N.° 6, N.° 7, N.° 8, N.° 9, o N.° 10 obtenidos en el Ejemplo 3 se sustituyó (en lo sucesivo, denominados anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo I diseñados por ingeniería). Se sintetizó un a Dn que codifica la secuencia de aminoácidos de una cadena pesada que tiene la región constante de la cadena pesada mencionada anteriormente y una región variable de la cadena pesada representada por la SEQ ID NO:7, y se insertó en un vector para la expresión en células de mamífero de acuerdo con una procedimiento rutinario. Adicionalmente, un ADN que codifica los aminoácidos de una región variable de la cadena ligera representada por la SEQ ID NO:11 se insertó en un vector para la expresión en células de mamífero que tienen un inserto de un gen que codifica la región constante de la cadena ligera de IgG1 humana para preparar un vector de expresión recombinante. Los dos vectores de expresión recombinantes preparados se transfirieron a células de mamífero de acuerdo con un procedimiento de rutina y se obtuvo un sobrenadante de cultivo del anticuerpo anti-CAPRINA-1 de tipo I diseñado por ingeniería genética N.° 0 del anticuerpo humanizado N.° 0. Los sobrenadantes de cultivo que contienen anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo 1 diseñados por ingeniería genética N.° 1, N.° 2, N.° 3, N.° 4, N.° 5, N.° 6, N.° 7, N.° 8, N.° 9 y N.° 10 descritos en el Ejemplo 3 se obtuvieron además de la misma manera que antes con respecto a los anticuerpos humanizados N.° 1, N.° 2, N.° 3, N.° 4, N.° 5, N.° 6, N.° 7, N.° 8, n.° 9 y n.° 10, respectivamente. Los sobrenadantes de cultivo obtenidos que contenían los anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo I diseñados por ingeniería genética N.° 0 a N.° 10 se purificaron cada uno de acuerdo con un procedimiento de rutina utilizando Hitrap Protein A Sepharose FF (fabricado por GE Healthcare Japan Corp.). El tampón se reemplazó con PBS(-) y la resultante se filtró a través de un filtro de 0,22 pm (fabricado por Merck Millipore Corp.) para preparar los anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo I diseñados por ingeniería.
A continuación, los anticuerpos anti-CAPRINA-1 que tienen una región constante de cadena pesada descrita en la SEQ ID NO:34, en la que una porción de aminoácidos en la región constante de la cadena pesada del anticuerpo humanizado N.° 0, N.° 1, N.° 2, N.° 3, N.° 4, N.° 5, N.° 6, N.° 7, N.° 8, N.° 9, o N.° 10 obtenidos en el Ejemplo 3 se sustituyó (en lo sucesivo, denominados anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo II diseñados por ingeniería). Se sintetizó un ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de una cadena pesada que tiene la región constante de la cadena pesada mencionada anteriormente y una región variable de la cadena pesada representada por la SEQ ID NO:7, y se insertó en un vector para la expresión en células de mamífero de acuerdo con una procedimiento rutinario. Además, como se ha preparado anteriormente, un ADN que codifica los aminoácidos de una región variable de la cadena ligera representada por la SEQ ID NO:11 se insertó en un vector para la expresión en células de mamífero que tienen un inserto de un gen que codifica la región constante de la cadena ligera de IgG1 humana para preparar un vector de expresión recombinante. Estos dos vectores de expresión recombinantes se transfirieron a células de mamífero de acuerdo con un procedimiento de rutina y se obtuvo un sobrenadante de cultivo del anticuerpo n.° 0 anti-CAPRINA-1 de tipo II diseñado por ingeniería genética. Los sobrenadantes de cultivo que contienen anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo II N.° 1, N.° 2, N.° 3, N.° 4, N.° 5, N.° 6, N.° 7, N.° 8, N.° 9 y N.° 10 descritos en el Ejemplo 3, se obtuvieron además de la misma manera que antes para los anticuerpos humanizados N.° 1, N.° 2, N.° 3, N.° 4, N.° 5, N.° 6, N.° 7, N.° 8, n.° 9 y n.° 10, respectivamente. Los sobrenadantes de cultivo obtenidos que contenían los anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo II diseñados por ingeniería genética N.° 0 a N.° 10 se purificaron cada uno de acuerdo con un procedimiento de rutina utilizando Hitrap Protein A Sepharose FF (fabricado por GE Healthcare Japan Corp.). El tampón se reemplazó con PBS(-) y la resultante se filtró a través de un filtro de 0,22 pm (fabricado por Merck Millipore Corp.) para preparar los anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo II diseñados por ingeniería genética.
Ejemplo 6-2: Preparación de anticuerpos anti-CAPRINA-1 que tienen una cadena de azúcar sin adición de fucosa a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar entre todas las cadenas de azúcar unidas a N-glucósidos unidas a la región constante de la cadena pesada
A continuación, los anticuerpos anti-CAPRINA-1 que tienen una cadena de azúcar sin fucosa añadida a N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar entre todas las cadenas de azúcar unidas a N-glucósido unidas a la región constante de la cadena pesada del anticuerpo humanizado N.° 0, N.° 1, N.° 2, N.° 3, N.° 4, N.° 5, N.° 6, N.° 7, N.° 8, N.° 9 o N.° 10 obtenidos en el Ejemplo 3 (en lo sucesivo, denominados anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo II diseñados por ingeniería) se obtuvieron mediante el procedimiento siguiente: un vector de expresión de células de mamífero que contienen el gen de resistencia a la neomicina que alberga un gen de la GDP-6-desoxinosina-D-lixo-4-hexulosa reductasa (RMD), que es una enzima que no cataliza la reacción de conversión de GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa en GDP-L-fucosa, se transfirió a la línea celular de mamífero de células CHO de acuerdo con un procedimiento de rutina usando un reactivo de transfección FreeStyle(TM) MAX Reagent (Life Technologies Corp.). Las células CHO transfectadas se cultivaron en un medio que contenía G-418 para preparar un conjunto estable de células CHO que expresan RMD. De este conjunto estable, se clonaron 7 células CHO que expresaban constitutivamente RMD mediante el procedimiento de dilución límite. El nivel de expresión del gen RMD en cada una de las 7 células RMD-CHO clonadas se evaluó tres veces cada dos semanas mediante PCR cuantitativa para seleccionar las células CHO que expresaban de forma constitutiva y estable el gen RMD (células RMD-CHO). De la misma manera que en el Ejemplo 3, el gen que codificaba la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada representada por la SEQ ID NO:7 y el gen que codificaba los aminoácidos de la región variable de la cadena ligera representada por la SEQ ID NO:11 se transfirieron respectivamente a través de un vector para la expresión en células de mamífero que tenían un inserto génico de la región constante de la cadena pesada de la IgG1 humana y un vector para la expresión en células de mamífero que tenían un inserto génico de la región constante de la cadena ligera de la IgG1 humana a las células RMD-CHO que expresaban constitutivamente RMD de acuerdo con un procedimiento de rutina, y se obtuvo un sobrenadante de cultivo que contenía anticuerpo anti-CAPRINA-1 de tipo III diseñado por ingeniería genética N.° 0. Los sobrenadantes de cultivo que contienen anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo III diseñados por ingeniería genética N.° 1, N.° 2, N.° 3, N.° 4, N.° 5, N.° 6, N.° 7, N.° 8, N.° 9 y N.° 10 descritos en el Ejemplo 3, se obtuvieron además de la misma manera que antes para los anticuerpos humanizados N.° 1, N.° 2, N. ° 3, N.° 4, N.° 5, N.° 6, N.° 7, N.° 8, n.° 9 y n.° 10, respectivamente. Los sobrenadantes de cultivo obtenidos que contenían los anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo III diseñados mediante ingeniería genética N.° 0 a N.° 10 se purificaron cada uno de acuerdo con un procedimiento de rutina utilizando Hitrap Protein A Sepharose FF (fabricado por GE Healthcare Japan Corp.). El tampón se reemplazó con PBS (-) y la resultante se filtró a través de un filtro de O, 22 pm (fabricado por Merck Millipore Corp.) para preparar una composición de anticuerpo que contenía el anticuerpo anti-CAPRINA-1 de tipo III diseñado por ingeniería genética n.° 0. De manera similar, se obtuvieron productos purificados de anticuerpos que contenían anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo III modificados por ingeniería genérica N.° 1 a N.° 10. La proporción del anticuerpo anti-CAPRINA-1 que tenía una cadena de azúcar sin fucosa añadida a N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar entre todas las cadenas de azúcar unidas a N-glucósidos unidas a la región constante de la cadena pesada, contenida en cada una de estas composiciones de anticuerpos purificadas se evaluó utilizando LabChip® GXII (PerkinElmer, Inc.) y, en consecuencia, fue del 80 % o superior en todos los casos.
De la misma manera que en el Ejemplo 3, el gen que codifica la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada representada por la SEQ ID NO:7 y el gen que codifica los aminoácidos de la región variable de la cadena ligera representada por la SEQ ID NO:11 se transfirieron, respectivamente, a través de un vector que contenía el gen de resistencia a higromicina para la expresión en células de mamífero que tienen un inserto genético de la región constante de la cadena pesada de la IgG1 humana y un vector que contiene el gen de resistencia a la higromicina para la expresión en células de mamíferos que tienen un inserto genético de la región constante de la cadena ligera de la IgG1 humana a las células RMD-CHO de acuerdo con un procedimiento de rutina, y las células resultantes se cultivaron en un medio que contenía higromicina B para preparar un grupo estable que expresaba el anticuerpo anti-CAPRINA-1 de tipo III diseñado por ingeniería genética N.° 0. De este conjunto estable, las células que expresan de forma constitutiva y estable el anticuerpo anti-CAPRINA-1 de tipo III N.° 0 diseñado por ingeniería genética se prepararon mediante el procedimiento de dilución límite. La proporción del anticuerpo anti-CAPRINA-1 que tenía una cadena de azúcar sin fucosa añadida a N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar entre todas las cadenas de azúcar unidas a N-glucósidos unidas a la región constante de la cadena pesada, contenidas en cada una de las composiciones de anticuerpos purificados que comprenden los anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo III diseñados por ingeniería genética N.° 0 a N.° 10 producidos por las células respectivas se evaluaron usando LabChip® GXII (PerkinElmer, Inc.) y, en consecuencia, fue del 80 % o superior en todos los casos.
Ejemplo 6-3: Preparación de anticuerpos anti-CAPRINA-1 que tienen sustitución de aminoácidos en la región constante de la cadena pesada y que tienen una cadena de azúcar sin adición de fucosa a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar entre todas las cadenas de azúcar unidas a N-glucósido unidas a la región constante de la cadena pesada
A continuación, se prepararon anticuerpos anti-CAPRINA-1 que tienen una región constante de la cadena pesada descrita en la SEQ Id NO:34 en la que una porción de aminoácidos en la región constante de la cadena pesada del anticuerpo humanizado N.° 0, N.° 1, N.° 2, N.° 3, N.° 4, N.° 5, N.° 6, N.° 7, N.° 8, n.° 9 o N.° 10 descritos en el ejemplo 3 se sustituyó y que tienen una cadena de azúcar sin fucosa añadida a N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar entre todas las cadenas de azúcar unidas a N-glucósido unidas a la región constante de la cadena pesada del anticuerpo (en lo sucesivo denominados anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo IV diseñados por ingeniería genética). Un ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de una cadena pesada que tiene la región constante variante de la cadena pesada preparada en el Ejemplo 6-1 y la región variable de la cadena pesada de la IgG1 humana representada por la SEQ ID NO:7 se sintetizó y se insertó en un vector para la expresión en células de mamífero según un procedimiento de rutina, mientras que un ADN que codifica los aminoácidos de una región variable de la cadena ligera representada por la SEQ ID NO:11 se sintetizó e insertó en un vector para la expresión en células de mamíferos que tienen un inserto génico que codifica los aminoácidos de la región constante de la cadena ligera de IgG1 de ser humano y los vectores resultantes se transfirieron a las células RMD-CHO que expresan de manera constitutiva GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa reductasa (RMD) preparada en el Ejemplo 6-2. Se obtuvo un sobrenadante de cultivo del anticuerpo anti-CAPRINA-1 de tipo IV diseñado por ingeniería genética N.° 0 del anticuerpo humanizado N.° 0. Los sobrenadantes de cultivo que contienen anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo IV diseñados por ingeniería N.° 1, N.° 2, N.° 3, N.° 4, N.° 5, N.° 6, N.° 7, N.° 8, N.° 9, y N.° 10 se obtuvieron además de la misma manera que antes con respecto a los anticuerpos humanizados N.° 1, N.° 2, N.° 3, N.° 4, N.° 5, N.° 6, N.° 7, N.° 8, n.° 9 y n.° 10, respectivamente, descritos en el Ejemplo 3. Los sobrenadantes de cultivo obtenidos que contenían los anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo IV de ingeniería N.° 0 a N.° 10 se purificaron cada uno de acuerdo con un procedimiento de rutina utilizando Hitrap Protein A Sepharose FF (fabricado por GE Healthcare Japan Corp.). El tampón se reemplazó con PBS (-), y la resultante se filtró a través de un filtro de 0,22 pm (fabricado por Merck Millipore Corp.) para preparar una composición de anticuerpo que contiene el anticuerpo anti-CAPRINA-1 de tipo IV N.° 0 diseñado por ingeniería genética. De manera similar, Se obtuvieron productos purificados de anticuerpos que contenían anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo IV N.° 1 a N.° 10. La proporción del anticuerpo anti-CAPRINA-1 que tenía una cadena de azúcar sin fucosa añadida a N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar entre todas las cadenas de azúcar unidas a N-glucósidos unidas a la región constante de la cadena pesada, contenida en cada una de estas composiciones de anticuerpos purificadas se evaluó utilizando LabChip® GXII (PerkinElmer, Inc.) y, en consecuencia, fue del 80 % o superior en todos los casos.
Un ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de una cadena pesada que tiene la región constante de la cadena pesada modificada preparada en el Ejemplo 6-1 y la región variable de la cadena pesada de la IgG1 humana representada por la SeQ ID NO:7 se sintetizó e insertó en un vector que contiene el gen de resistencia a la higromicina para la expresión en células de mamíferos de acuerdo con un procedimiento de rutina, mientras que un ADN que codifica los aminoácidos de una región variable de la cadena ligera representada por la SEQ ID NO:11 se sintetizó e insertó en un vector que contiene el gen de resistencia a la higromicina para la expresión en células de mamíferos que tienen un inserto de un gen que codifica los aminoácidos de la región constante de cadena ligera de la IgG1 humana y los vectores resultantes se transfirieron a las células. Las células se cultivaron en un medio que contenía higromicina B para preparar un grupo estable que expresaba el anticuerpo anti-CAPRINA-1 de tipo IV modificado por ingeniería genética N.° 0. De este conjunto estable, las células que expresan de forma constitutiva y estable el anticuerpo anti-CAPRINA-1 de tipo IV n.° 0 diseñado por ingeniería genética se prepararon mediante el procedimiento de dilución límite. Las células que expresan de manera constitutiva y estable los anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo IV diseñados mediante ingeniería N.° 1, N.° 2, N.° 3, N.° 4, N.° 5, N.° 6, N.° 7, N.° 8, n,° 9, y N.° 10 se prepararon adicionalmente de la misma manera que antes con respecto a los anticuerpos humanizados N.° 1, N.° 2, N.° 3, N.° 4, N.° 5, N.° 6, N.° 7, N.° 8, N.° 9 y N.° 10 descritos en el Ejemplo 3, respectivamente. La proporción del anticuerpo anti-CAPRINA-1 que tenía una cadena de azúcar sin fucosa añadida a N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar entre todas las cadenas de azúcar unidas a N-glucósidos unidas a la región constante de la cadena pesada, contenidas en cada una de las composiciones de anticuerpos purificados que contienen los anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo IV modificados por ingeniería genética N.° 0 a N.° 10 producidos por las células respectivas se evaluaron usando LabChip® GXII (PerkinElmer, Inc.) y, en consecuencia, fue del 80 % o superior en todos los casos.
Ejemplo 7: Especificidad antigénica de los anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo m odificado y su reactividad con células cancerosas
La reactividad específica de los anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo I diseñados por ingeniería genética N.° 0 a N.° 10, los anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo II diseñados por ingeniería genética N.° 0 a N.° 10, las respectivas composiciones de anticuerpos que contienen los anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo III diseñados por ingeniería genética N.° 0 a N.° 10, y las respectivas composiciones de anticuerpos que contienen los anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo IV diseñados por ingeniería genética N.° 0 a N.° 10 (en lo sucesivo, denominados anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo diseñado por ingeniería genética) preparados en los Ejemplos 6-1 a 6-3 con la proteína CAPRINA-1 se confirmaron de la misma manera que en el Ejemplo 4. Como resultado, el valor de absorbancia del pocillo al que se agregó un anticuerpo IgG humano que se confirmó que no reaccionaba con la proteína CAPRINA-1, utilizado como control negativo, fue tan baja como la del pocillo al que no se agregó anticuerpo, mientras que todos los pocillos, respectivamente, a los que se añadieron anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo diseñados por ingeniería genética exhibieron valores de absorbancia equivalentemente altos. Todos los anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo diseñados por ingeniería genética en los pocillos en los que no se inmovilizó la proteína CAPRINA-1 simplemente mostraron un valor de absorbancia equivalente al del control negativo. A partir de estos resultados, se confirmó que todos los anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo diseñados por ingeniería genética reaccionan específicamente con la proteína CAPRINA-1.
A continuación, la reactividad de cada anticuerpo anti-CAPRINA-1 de tipo diseñados por ingeniería genética con varias células cancerosas humanas se confirmó de la misma manera que en el Ejemplo 4. Las células de cáncer de mama (BT-474 y MDA-MB-361), células de cáncer colorrectal (HT-29), células de cáncer de pulmón (QG56), células de cáncer de estómago (NCI-N87), células de cáncer de útero (HEC-1-A), células de cáncer de próstata (22Rv1), células de cáncer de páncreas (Panc10.5), células de cáncer de hígado (Hep3B), células de cáncer de ovario (SKOV3), células de cáncer de riñón (Caki-2), células de tumor cerebral (U-87MG), células cáncer de vejiga (T24 y HT-1376), células de cáncer de esófago (OE33), células de leucemia (OCI-AML5), células de linfoma (Ramos), células de cáncer de vesícula biliar (TGBC14TKB), células de fibrosarcoma (HT-1080), células de melanoma (G-361), células de cáncer de la corteza suprarrenal (A-673), células de tumor de Ewing (RD-ES), células de linfoma de Hodgkin (RPMI1666), células de mesotelioma (NCI-H2452), células de mieloma múltiple (IM-9), células de cáncer de testículo (NT/D1), células de cáncer de tiroides (TT) y células de cáncer de cabeza y cuello (FaDu) se usaron en esa evaluación. Como resultado, la intensidad de fluorescencia de cada anticuerpo anti-CAPRINA-1 de tipo diseñados por ingeniería genética fue más fuerte en todas las células cancerosas utilizadas en la evaluación que en el caso de usar el control negativo. A partir de estos resultados, se confirmó que todos los anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo diseñados por ingeniería genética reaccionan específicamente con la proteína CAPRINA-1 presente en la superficie de la membrana de las células cancerosas humanas.
Ejemplo 8: Actividad antitumoral del anticuerpo anti-CAPRINA-1 de tipo diseñado por ingeniería genética dirig ido contra varias células cancerosas humanas
Los anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo diseñado por ingeniería genética (los anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo I diseñado por ingeniería genética N.° 0 a N.° 10, los anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo II diseñados por ingeniería genética N.° 0 a N.° 10, las respectivas composiciones de anticuerpos que contienen los anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo III diseñados por ingeniería genética N.° 0 a N.° 10, y las respectivas composiciones de anticuerpos que contienen los anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo IV diseñados por ingeniería genética N.° 0 a N.° 10 (en lo sucesivo, denominados anticuerpos anti-CAPRINA-1 de tipo diseñado por ingeniería genética) preparados en los Ejemplos 6-1 a 6-3 se evaluaron para determinar sus efectos antitumorales sobre varias células de cáncer humano sobre la base de la actividad ADCC de la misma manera que en el Ejemplo 5. Como controles negativos se prepararon un pocillo al que se añadió un anticuerpo de control de isotipo, un pozo al que no se añadió anticuerpo y un pocillo al que se añadió un anticuerpo que reacciona con la proteína CAPRINA-1 pero que no muestra reactividad con la superficie de las células cancerosas humanas sobre las que se expresó CAPRINA-1. Los anticuerpos humanizados N.° 0 a N.° 10, que eran los correspondientes anticuerpos anti-CAPRINA-1 no diseñados por ingeniería genética, se utilizaron como anticuerpos comparativos. Cada anticuerpo se añadió a 0,01 a 1 pg/ml (concentración final) a las placas de 96 pocillos con fondo en V.
Las células de cáncer de mama (BT-474 y MDA-MB-361), células de cáncer colorrectal (HT-29), células de cáncer de pulmón (QG56), células de cáncer de estómago (NCI-N87), células de cáncer de útero (HEC-1-A), células de cáncer de próstata (22Rv1), células de cáncer de páncreas (Panc10.5), células de cáncer de hígado (Hep3B), células de cáncer de ovario (SKOV3), células de cáncer de riñón (Caki-2), células de tumor cerebral (U-87MG), células cáncer de vejiga (T24 y HT-1376), células de cáncer de esófago (OE33), células de leucemia (OCI-AML5), células de linfoma (Ramos), células de cáncer de vesícula biliar (TGBC14TKB), células de fibrosarcoma (HT-1080), células de melanoma (G-361), células de cáncer de la corteza suprarrenal (A-673), células de tumor de Ewing (RD-ES), Las células de linfoma de Hodgkin (RPMI1666), células de mesotelioma (NCI-H2452), células de mieloma múltiple (IM-9), células de cáncer de testículo (NT/D1), células de cáncer de tiroides (TT) y células de cáncer de cabeza y cuello (FaDu) se usaron como células diana. Se recogieron 106 células de cada línea celular de cáncer humano mencionada anteriormente en

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo que comprende
una región variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 1, 2 y 3 y
una región variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 4, 5 y 6, y
tiene reactividad inmunológica con una proteína CAPRINA-1, o un fragmento de la misma.
2. El anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1,
en los que:
(i) la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8, y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:15; o
(ii) la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10, y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:15; o
(iii) la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7, y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:15; o
(iv) la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8, y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:13; o
(vi) la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7, y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:12;
(vi) la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8, y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:12; o
(vii) la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7, y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:13; o
(viii) la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:10, y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:14; o
(ix) la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8, y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:11; o
(x) la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7, y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:11; o
(xi) la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9, y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:15; o
(xii) la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:20, y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:21.
3. El anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monocatenario o un anticuerpo multiespecífico.
4. El anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo están conjugados con un agente antitumoral.
5. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el anticuerpo comprende la sustitución de uno o más aminoácidos en la región constante de la cadena pesada del mismo.
6. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el anticuerpo es un anticuerpo que carece de fucosa añadida a N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar de una cadena de azúcar unida a N-glucósido unida a la región constante de la cadena pesada.
7. Una composición de anticuerpo que comprende un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 6 y un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que tiene fucosa añadida a N-acetilglucosamina en el extremo reductor de una cadena de azúcar de una cadena de azúcar unida a N-glucósido unida a la región constante de la cadena pesada.
8. Una célula que produce un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 6 o una composición de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7.
9. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un anticuerpo según las reivindicaciones 5 o 6, o una composición de anticuerpo según la reivindicación 7 como principio activo.
10. Un producto farmacéutico de combinación que comprende una composición farmacéutica según la reivindicación 9 y una composición farmacéutica que comprende un agente antitumoral.
11. Un ADN que codifica un anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
12. El anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 6, una composición de anticuerpo según la reivindicación 7, una composición farmacéutica según la reivindicación 9, o una combinación de producto farmacéutico según la reivindicación 10, para su uso en un procedimiento de tratamiento y/o prevención del cáncer.
13. El anticuerpo, el fragmento, la composición de anticuerpo, la composición farmacéutica o el producto farmacéuticos de combinación para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el cáncer es cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, tumor cerebral, cáncer de estómago, cáncer de útero, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de esófago, leucemia, linfoma, cáncer de hígado, cáncer de vesícula biliar, sarcoma, mastocitoma, melanoma, cáncer de la corteza suprarrenal, tumor de Ewing, linfoma de Hodgkin, mesotelioma, mieloma múltiple, cáncer de testículo, cáncer de tiroides o cáncer de cabeza y cuello.
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