ES2504521T3 - Incorporación específica del sitio de aminoácidos en moléculas - Google Patents

Incorporación específica del sitio de aminoácidos en moléculas Download PDF

Info

Publication number
ES2504521T3
ES2504521T3 ES07752295.1T ES07752295T ES2504521T3 ES 2504521 T3 ES2504521 T3 ES 2504521T3 ES 07752295 T ES07752295 T ES 07752295T ES 2504521 T3 ES2504521 T3 ES 2504521T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
amino acid
trna
modified
protein
amino acids
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES07752295.1T
Other languages
English (en)
Inventor
Pin Wang
Inchan Kwon
Soojin Son
Yi Tang
David A. Tirrell
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
California Institute of Technology
Original Assignee
California Institute of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by California Institute of Technology filed Critical California Institute of Technology
Application granted granted Critical
Publication of ES2504521T3 publication Critical patent/ES2504521T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Una composición, que comprende un primer vector que contiene un polinucleótido que codifica una fenilalanina ARNt sintetasa (PheRS) de levadura modificada, en donde dicho polinucleótido está mutado en los codones que codifican el aminoácido en las posiciones de la secuencia seleccionadas del grupo que consiste en los números de posición de la secuencia de aminoácidos (i) 412 y 415; (ii) 415 y 418; (iii) 415 y 437; (iv) 412, 415 y 437; (v) 415, 418 y 437; (vi) 412, 415 y 418; y (vii) 412, 415, 418 y 437 del polipéptido codificado por SEQ ID NO: 3, y en donde dicha sintetasa modificada es capaz de cargar una molécula de ARNt con un aminoácido no natu

Description

Incorporación específica del sitio de aminoácidos en moléculas
Declaración de interés del gobierno
Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno federal bajo el número de concesión GM62523, otorgado por el NIH. El gobierno de Estados Unidos tiene ciertos derechos sobre la invención.
Antecedentes de la invención
La ingeniería de proteínas es una potente herramienta para la modificación de las propiedades catalíticas estructurales y de unión de proteínas naturales y para el diseño de novo de proteínas artificiales. La ingeniería de proteínas se basa en un mecanismo de reconocimiento eficiente para la incorporación de aminoácidos mutantes en las secuencias de proteínas deseadas. Aunque este proceso ha sido muy útil para el diseño de nuevas macromoléculas con un control preciso de la composición y la arquitectura, una limitación importante es que la mutagénesis está restringida a los 20 aminoácidos que se producen de forma natural. Sin embargo, cada vez es más evidente que la incorporación de aminoácidos no naturales puede ampliar el alcance y el impacto de los métodos de ingeniería de proteínas.
Los aminoácidos no naturales que portan una amplia diversidad de nuevos grupos funcionales han sido reemplazados globalmente para el reemplazo o la incorporación específica para el residuo en proteínas recombinantes. La asimilación biosintética de aminoácidos no canónicos en proteínas se ha logrado en gran medida explotando la capacidad del aparato de síntesis de tipo salvaje de utilizar análogos de aminoácidos de origen natural (Budisa 1995, Eur. J. Biochem 230: 788-796; Deming 1997, J. Macromol. Sci. Pure Appl. Chem A34; 2143-2150; Duewel 1997, Biochemistry 36: 3404-3416; van Hest y Tirrell 1998, FEBS Lett 428(1-2): 68-70; Sharma et al, 2000, FEBS Lett 467(1): 37-40.). Sin embargo, hay situaciones en las que se requiere la sustitución o incorporación en un solo sitio de aminoácidos no naturales. Una metodología de este tipo permitiría la adaptación en una proteína (el tamaño, la acidez, nucleofilicidad, enlaces hidrógeno o propiedades hidrófobas, etc. de aminoácidos) para cumplir una propiedad estructural o funcional específica de interés. La capacidad de incorporar de modo específico para el sitio tales análogos de aminoácidos en proteínas ampliaría en gran medida nuestra capacidad de manipular de forma racional y sistemática las estructuras de proteínas, tanto para investigar la función de proteínas como para crear proteínas con nuevas propiedades. Por ejemplo, la capacidad de sintetizar grandes cantidades de proteínas que contienen átomos pesados facilitaría la determinación de la estructura de las proteínas, y la capacidad de sustituir de modo específico para el sitio fluoróforos o grupos foto-escindibles en proteínas en células vivas proporcionaría potentes herramientas para el estudio de las funciones de proteínas in vivo.
En los últimos años, varios laboratorios han llevado a cabo una expansión en el número de aminoácidos codificados genéticamente, utilizando un supresor sin sentido o un ARNt supresor del desplazamiento del marco para incorporar aminoácidos no canónicos en proteínas en respuesta a codones ámbar o de cuatro bases , respectivamente (Bain et al., J. Am. Chem. Soc. 111: 8013, 1989; Noren et al., Science 244: 182, 1989; Furter, Protein Sci. 7: 419, 1998; Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100: 56, 2003; Hohsaka et al., FEBS Lett. 344:
171: 1994; Kowal y Oliver, Nucleic Acids Res. 25: 4685, 1997). Tales métodos insertan aminoácidos no canónicos en posiciones del codón que normalmente terminarán la síntesis de péptidos de tipo salvaje (p. ej., un codón de terminación o una mutación de desplazamiento del marco). Estos métodos han funcionado bien para la inserción en un solo sitio de nuevos aminoácidos. Sin embargo, su utilidad en la sustitución o incorporación específica para la posición en múltiples sitios (frente a específica para residuos) está limitada por modestas eficacias de supresión (20-60%) (Anderson et al., J. Am. Chem. Soc. 124: 9674, 2002; Bain et al., Nature 356: 537, 1992; Hohsaka et al., Nucleic Acids Res. 29: 3646, 2001). Esto es así, en parte debido a que una eficacia de supresión demasiado alta del codón de terminación interferirá con la terminación normal de la traducción de algunas proteínas no fijadas como objetivo en el organismo. Por otra parte, una baja eficacia de supresión será probablemente insuficiente para suprimir más de un sitio sin sentido o de mutación de desplazamiento del marco en la proteína diana, de tal manera que se hace más y más difícil o poco práctico sintetizar una proteína diana de longitud completa incorporando más y más aminoácidos no canónicos.
Una incorporación eficaz en múltiples sitios se ha logrado mediante la sustitución de aminoácidos naturales en cepas auxotróficas de Escherichia coli, por ejemplo utilizando aminoacil-ARNt sintetasas con especificidad relajada para el sustrato o actividad de edición alterada (Wilson y Hatfield, Biochim. Biophys. Acta 781: 205, 1984; Kast y Hennecke, J. Mol. Biol. 222: 99, 1991; lbba et al., Biochemistry 33:. 7107, 1994; Sharma et al., FEBS Lett. 467: 37, 2000; Tang y Tirrell, Biochemistry 41: 10635, 2002; Datta et al., J. Am. Chem. Soc. 124: 5652, 2002; Doring et al., Science 292: 501, 2001). Aunque este método proporciona una incorporación eficaz de análogos en múltiples
sitios, adolece de la limitación de que los nuevos aminoácidos deben "compartir" codones con uno de los aminoácidos naturales. Así, para cualquier posición del codón dada en la que se puedan insertar aminoácidos tanto naturales como nuevos, con excepción de una probabilidad de incorporación, hay relativamente poco control sobre qué aminoácido terminará siendo insertado. Esto puede ser indeseable, ya que para una enzima o proteína modificada, la incorporación no canónica de aminoácidos en un sitio no pretendido puede comprometer de forma inesperada la función de la proteína, mientras que omitir la incorporación del aminoácido no canónico en el sitio diseñado fracasará en lograr el objetivo de diseño.
En general, métodos de sustitución en múltiples sitios son relativamente simples de llevar a cabo, pero están reemplazados todos los sitios correspondientes a un aminoácido natural particular a lo largo de la proteína. El grado de incorporación del aminoácido natural y no natural también puede variar. Además de ello, la incorporación de múltiples sitios de análogos resulta, a menudo, en toxicidad cuando se utilizan células, lo que hace difícil estudiar la proteína mutante en células vivas. La presente invención supera estos obstáculos al permitir una mutación específica para el sitio de aminoácidos en proteínas.
Determinadas realizaciones descritas en esta memoria proporcionan una nueva técnica para la incorporación de aminoácidos de sustitución, incluidos aminoácidos de origen natural o aminoácidos no estándares o no canónicos, en proteínas que se basa en romper la degeneración del código genético. Específicamente, determinadas realizaciones en esta memoria permiten una sustitución específica para la posición de alta fidelidad o la incorporación de aminoácidos no naturales en proteínas.
El documento US2004/0053390 Datta et al.) describe métodos, reactivos y herramientas computacionales para diseñar análogos de sustrato no naturales para enzimas, especialmente para diseñar análogos de aminoácidos no naturales para aminoacil-ARNt sintetasas tal como la Phe-ARNt sintetasa.
Breve sumario de la invención
Determinadas realizaciones descritas en esta memoria proporcionan composiciones de componentes utilizados en la maquinaria biosintética de proteínas, que incluyen moléculas de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS – siglas en inglés) mutantes externas, opcionalmente emparejadas con moléculas de aminoacil-ARNt mutantes externas.
También se proporcionan métodos para la generación y selección de ARNts mutantes externos, aminoacil-ARNt sintetasas mutantes externas, y pares de los mismos, que son capaces de incorporar aminoácidos, incluidos aminoácidos no naturales, en polipéptidos o proteínas. Determinadas composiciones de formas de realización específicas incluyen nuevos pares de ARNt mutante externo o aminoacil-ARNt mutante externo. Las nuevas moléculas de ARNt, moléculas de AARS mutantes externas, o pares de AARS-ARNt mutantes externos se pueden utilizar para incorporar un aminoácido no natural en un polipéptido in vitro e in vivo. Otras realizaciones de la invención incluyen la selección de pares de mutantes externos.
Composiciones de la presente invención incluyen una aminoacil-ARNt sintetasa mutante externa, en que la ARNt sintetasa mutante externa aminoacila preferiblemente un ARNt mutante externo con un aminoácido no natural, opcionalmente in vivo. En una forma de realización, se proporciona un ácido nucleico o polinucleótido que codifica una sintetasa mutante externa, o una secuencia de ácidos nucleicos complementaria de la misma.
Por lo tanto, determinadas formas de realización incluyen una composición que comprende un primer vector que contiene un polinucleótido que codifica una aminoacil fenilalanil ARNt sintetasa (PheRS) de levadura modificada, en donde dicho polinucleótido está mutado en codones que codifican el aminoácido en las posiciones de secuencia seleccionadas del grupo que consiste en los números de posición de la secuencia de aminoácidos (i) 412 y 415; (ii) 415 y 418; (iii) 415 y 437; (iv) 412, 415 y 437; (v) 415, 418 y 437; (vi) 412, 415 y 418; y (vii) 412, 415, 418 y 437 del polipéptido codificado por SEQ ID NO: 3, y en donde dicha sintetasa modificada es capaz de cargar una molécula de ARNt con un aminoácido no natural.
Al menos una forma de realización comprende, además, un segundo vector que contiene un polinucleótido que codifica una molécula de ARNt. En al menos una forma de realización, dichos primer y segundo vectores son el mismo vector. En otras formas de realización, dichos primer y segundo vectores son vectores diferentes.
En al menos una forma de realización, el ARNt es endógeno, y en al menos una forma de realización, el ARNt está modificado. En al menos una forma de realización, el ARNt está modificado de modo que contiene un anticodón mutado que se empareja en bases con un correspondiente codón degenerado de bamboleo con una afinidad mayor que la afinidad del ARNt natural. En algunas formas de realización, los AARS y el ARNt son del mismo o de diferentes organismos. En al menos una forma de realización, el aminoácido no natural se selecciona del grupo que consiste en: azidonorleucina, 3-(1-naftil)alanina, 3-(2-naftil)alanina, p-etinil-fenilalanina, p-propargil-oxi
fenilalanina, m-etinil-fenilalanina, 6-etinil-triptófano, 5-etinil-triptófano, ácido (R)-2-amino-3-(4-etinil-1H-pirol-3il)propanoico, p-bromofenilalanina, p-yodofenilalanina, p-azidofenilalanina, 3-(6 cloroindolil)alanina, 3-(6bromoindolil)alanina, 3-(5-bromoindolil)alanina, azidohomoalanina y p-clorofenilalanina.
Otra forma de realización comprende un polipéptido que comprende una fenilalanil ARNt sintetasa (PheRS) de levadura modificada, en donde dicha sintetasa modificada está mutada en las posiciones de la secuencia de aminoácidos en codones que codifican el aminoácido en las posiciones de secuencia seleccionadas del grupo que consiste en los números de posición de la secuencia de aminoácidos (i) 412 y 415; (ii) 415 y 418; (iii) 415 y 437;
(iv) 412, 415 y 437; (v) 415, 418 y 437; (vi) 412, 415 y 418; y (vii) 412, 415, 418 y 437 del polipéptido codificado por SEQ ID NO: 3.
Determinadas realizaciones incluyen un sistema de traducción que comprende un polinucleótido que codifica una fenilalanil ARNt sintetasa de levadura modificada, en donde dicho polinucleótido de sintetasa modificada está mutado en uno o más codones que codifican el aminoácido en las posiciones de secuencia seleccionadas del grupo que consiste en los números de posición de la secuencia de aminoácidos (i) 412 y 415; (ii) 415 y 418; (iii) 415 y 437; (iv) 412, 415 y 437; (v) 415, 418 y 437; (vi) 412, 415 y 418; y (vii) 412, 415, 418 y 437 del polipéptido codificado por SEQ ID NO: 3, y en donde dicha sintetasa modificada es capaz de cargar una molécula de ARNt con un aminoácido no natural. En al menos una forma de realización, el sistema comprende una célula huésped. En al menos una forma de realización, la aminoacil ARNt sintetasa modificada se deriva de un organismo diferente de la célula huésped. En otra forma de realización, el sistema de traducción comprende, además, un polinucleótido que codifica una molécula de ARNt modificado. En determinadas formas de realización, la molécula de ARNt modificado se deriva de un organismo diferente de la célula huésped. En determinadas formas de realización, la molécula de ARNt modificado se deriva de una célula eucariota y la célula huésped es una célula procariota. En aún otras formas de realización, la célula es una auxótrofo.
En algunas formas de realización, el sistema de traducción comprende, además, un medio de cultivo que contiene uno o más aminoácidos no naturales. En todavía otras formas de realización, dichos uno o más aminoácidos no naturales se seleccionan del grupo que consiste en: azidonorleucina, 3-(1-naftil)alanina, 3-(2-naftil)alanina, p-etinilfenilalanina, p-propargil-oxi-fenilalanina, m-etinil-fenilalanina, 6-etinil-triptófano, 5-etinil-triptófano, ácido (R)-2amino-3-(4-etinil-1H-pirol-3-il)propanoico, p-bromofenilalanina, p-yodofenilalanina, p-azidofenilalanina, 3-(6 cloroindolil)alanina, 3-(6-bromoindolil)alanina, 3-(5-bromoindolil)alanina, azidohomoalanina y p-clorofenilalanina.
Otras formas de realización se refieren a un método para incorporar un aminoácido no natural en un polipéptido diana en una o más posiciones especificadas, comprendiendo el método las etapas de: proporcionar un sistema de traducción que contiene al menos un aminoácido no natural; proporcionar al sistema de traducción una o más una fenilalanil ARNt sintetasas de levadura modificadas según se define arriba, proporcionar al sistema de traducción un polinucleótido que codifica un polipéptido diana de interés, y permitir la traducción del polipéptido diana de interés, incorporando con ello al menos un aminoácido no natural en el polipéptido diana, en donde las etapas se efectúan en cualquier orden.
En determinadas formas de realización, dicho sistema de traducción comprende una célula. En algunas formas de realización, se proporciona el aminoácido no natural poniendo en contacto dicho sistema de traducción con una disolución que contiene el aminoácido no natural. En al menos una forma de realización, la constante de especificidad (kcat / KM) para la activación de dicho aminoácido no natural por parte de dicha AARS modificada es al menos 5 veces mayor que la de dicho aminoácido natural. En determinadas formas de realización, la AARS modificada carga erróneamente un ARNt a una velocidad de no más de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7% u 8%. En aún otras formas de realización, el ARNt es un ARNt modificado. En determinadas formas de realización, dicho primer polinucleótido o dicho segundo polinucleótido comprende una secuencia de promotor constitutivamente activa o inducible que controla la expresión del ARNt o de la PheRS. En al menos una forma de realización, el método comprende, además, la etapa de rastreo de células que contienen una PheRS modificada. En otra forma de realización, el método comprende, además, la etapa de verificar la incorporación del aminoácido no natural. Aún otras formas de realización comprenden un polipéptido hecho por el método descrito.
Determinadas formas de realización descritas en esta memoria incluyen un método para la incorporación de al menos un aminoácido no natural en un polipéptido diana en una o más ubicaciones especificadas, comprendiendo el método proporcionar un sistema de traducción que contiene al menos un aminoácido no natural; proporcionar al sistema de traducción una o más PheRS modificadas; proporcionar al sistema de traducción un polinucleótido que codifica un polipéptido diana de interés; y permitir la traducción de interés, incorporando con ello al menos un aminoácido no natural en el polipéptido diana. Determinadas formas de realización incluyen un polipéptido hecho por este método.
Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos
La Figura 1 muestra una alineación de secuencia de variantes PheRS a partir de secuencias conservadas de Thermus thermophilus, Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae. La Figura 2 muestra varios aminoácidos ilustrativos (que se producen de forma natural o no natural) utilizados para algunas realizaciones descritas en esta memoria. La Figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos de un polipéptido ilustrativo utilizado para algunas formas de realización descritas en esta memoria, dihidrofolato reductasa (DHFR). Se utilizaron cuatro fragmentos de péptidos proteolíticos (marcados Péptido A, Péptido B, Péptido C y Péptido D) para MALDI y análisis de cromatografía líquida-Espectro de Masas/Espectro de masas (LC-MS/MS) tal como se destaca. La Figura 4 muestra una MALDI-MS de fragmentos de péptidos proteolíticos derivados de mDHFR expresada en medios suplementados con (a) aminoácido 1 (3 mM); (B) aminoácidos 7 (3 mM) y 1 (0,03 mM); (c) aminoácidos 2 (3 mM) y 1 (0,03); (d) aminoácidos 2 (3 mM) y 1 (0,03 mm). No se suplementa nada de triptófano durante la inducción, excepto que 1 mM de triptófano se suplementa en medios en (c). Péptido B, que contiene un codón Phe, es el control. Péptido A contiene un codón ámbar (Z), el aminoácido para el que se asigna basado en las unidades de masa para el péptido A a diferentes condiciones de expresión. Debido a la incorporación de lisina con Péptido A (c), la lisina C-terminal se escinde para producir un péptido A más corto (NGDLPWPPLRNEK) (SEQ ID NO: 4). Figura 5 Espectro de masas tándem de Péptido A (NGDLPWPPLRNEZK) (SEQ ID NO: 5) derivado de DHFR expresada en medios suplementados con aminoácido 7 (3 mM) y aminoácido 1 (0,03 mM). La secuencia parcial de PWPPLRNE (SEQ ID NO: 6) y del residuo Z (correspondiente al aminoácido 7) del Péptido A puede ser asignada a la serie de iones y y b anotadas, respectivamente. La Figura 6 muestra una MALDI-MS de fragmentos de péptidos proteolíticos derivados de mDHFR expresada en medios suplementados con (a) aminoácido 2 (3 mM) y aminoácido 6 (3 mM) y aminoácido 1 (0,03 mM) y aminoácido 13 (0,2 mM); (b) aminoácido 2 (3 mM) y aminoácido 6 (0,01 mM) y aminoácido 1 (0,03 mM) y aminoácido 13 (0,2 mM); (c) aminoácido 3 (3 mM) y aminoácido 6 (0,01 mM) y aminoácido 1 (0,03 mM) y aminoácido 13 (0,01 mM). Péptido C, con un codón Phe, es el control. La Figura 7 muestra los resultados de MALDI-MS de fragmentos de péptidos proteolíticos derivados de mDHFR expresada en medios suplementados con (a) aminoácido 9 (3 mM) y aminoácido 6 (0,03 mM) y aminoácido 1 (0,01 mM); (b) aminoácido 10 (3 mM) y aminoácido 6 (0,03 mM) y aminoácido 1 (0,03 mM); (c) aminoácido 11 (3 mM) y aminoácido 6 (0,01 mM) y aminoácido 1 (0,03 mM). Péptido D era el control. La Figura 8 muestra la aminoacilación de ARNtPheCUA de levadura (cuadrados) y ARNtPheCUA_UG (círculo) con lisina mediante eLysS. La Figura 9 muestra cromatogramas de LC-MS de digestiones trípticas de los polipéptidos mDHFR. La figura 10 muestra las tasas de intercambio ATP-IPP para fenilalanina, triptófano y p-bromofenilalanina por parte de PheRS de levadura de tipo salvaje y PheRS de levadura T415G mutante externa o PheRS de levadura T415A mutante externa. La figura 11 muestra la aminoacilación de fenilalanina y triptófano por parte de aminoacil ARNt sintetasa de tipo salvaje o ARNt sintetasa mutante externa (T415G o T415A). La figura 12 muestra la incorporación de lisina (cuadrado en blanco), triptófano (rayado) o p-bromofenilalanina (tablero de ajedrez). La Figura 13 muestra los espectros de masas de p-etinilfenilalanina incorporada en un polipéptido utilizando una ARNt sintetasa modificada (T415G) y ARNtPhe con un supresor ámbar en una célula huésped. La Figura 14 muestra un FACS de proteína fluorescente verde (GFP) la incorporación de aminoácidos utilizando el codón de supresión ámbar en una proteína de ensayo. La Figura 15 ilustra una representación en mapa ilustrativa de un plásmido de una aminoacil ARNt sintetasa mutante (T415G). La Figura 16 ilustra mutaciones ilustrativas realizadas en una fenilalanina ARNt sintetasa de levadura.
Descripción detallada de la invención
Las proteínas se encuentran en la encrucijada de prácticamente cada uno de los procesos biológicos, desde la fotosíntesis y la visión a la transducción de señales y la respuesta inmune. La modificación de proteínas o polipéptidos para incluir aminoácidos no naturales tiene un gran potencial para su uso en productos terapéuticos humanos, la agricultura, los biocombustibles y otras áreas.
Aminoacil-ARNt sintetasas catalizan la reacción de aminoacilación para la incorporación de aminoácidos en proteínas a través de las moléculas de ARN de transferencia correspondientes. La manipulación precisa de la actividad sintetasa puede alterar la especificidad de aminoacilación para fijar de manera estable aminoácidos no canónicos en el ARNt pretendido. Entonces, a través de la interacción codón-anticodón entre el ARN mensajero (ARNm) y el ARNt, los análogos de aminoácidos pueden ser suministrados a una cadena polipeptídica en crecimiento. Por lo tanto, la incorporación de aminoácidos no naturales en proteínas se basa en la manipulación de especificidad de aminoácidos de aminoacil ARNt sintetasas (AARS).
Las aminoacil-ARNt sintetasas actúan para transformar las secuencias del código genético en proteínas biológicamente funcionales a través de una reacción de aminoacilación de dos etapas. Como una etapa inicial, el aminoácido cognato es activado por parte de AARS en presencia de ATP para formar el aminoácido-adenilato; posteriormente, la AARS cataliza la reacción de esterificación para unir el aminoácido a 2’-o 3'-OH del ribonucleótido terminal de su ARNt cognato. Una vez que se produce la reacción de aminoacilación, el aminoácido se dirige a la cadena polipeptídica en crecimiento mediante el ARNt cargado.
Determinadas formas de realización descritas en esta memoria se refieren a moléculas de PheRS mutantes o modificadas que han sido mutadas o modificadas de tal manera que las enzimas son capaces de cargar una molécula de ARNt con un aminoácido de sustitución, preferiblemente un aminoácido no natural debido a una interrupción entre la sintetasa y el aminoácido natural correspondiente.
Por ejemplo, la interrupción puede ser debida a interferir con el apareamiento de bases de Watson-Crick, interfiriendo con el apareamiento de bases de bamboleo, o a la creación de un nuevo bamboleo u otro apareamiento de bases.
Algunas formas de realización se refieren a un polinucleótido que codifica un ARNt mutante o modificado de un ARNt para un aminoácido natural, en donde el aminoácido natural es codificado por uno o más codones de bamboleo degenerados, el ARNt modificado comprende una secuencia de anticodon modificada que forma un apareamiento de bases de Watson-Crick con uno de los codones de bamboleo degenerados. Preferiblemente, el ARNt modificado no se carga o sólo lo hace ineficazmente mediante una aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) endógena para el aminoácido natural. En una forma de realización, pueden utilizarse múltiples moléculas de PheRS modificadas con una o más moléculas de ARNt. En una forma de realización, se pueden utilizar una o más moléculas de PheRS modificadas o mutadas con uno o más moléculas de ARNt nativas, mientras que en otra forma de realización se puede utilizar una PheRS modificada o mutada con una molécula de ARNt modificada o mutada. En determinadas formas de realización se pueden utilizar uno o más pares de moléculas de PheRS/ARNt modificadas. En determinadas formas de realización se pueden utilizar pares heterólogos. En determinadas formas de realización, uno o más PheRS y/o ARNt modificado o mutado puede derivarse del mismo o de un organismo diferente.
En algunas formas de realización ilustrativas, una PheRS particular puede utilizar varios métodos para la incorporación de un aminoácido de sustitución (incluido un aminoácido no natural) en un polipéptido o proteína. Por ejemplo, una sola PheRS puede utilizar un codón sin sentido (tal como un codón de terminación ámbar) para la incorporación de un aminoácido de sustitución (tal como un aminoácido no natural) en una localización particular en el polipéptido. Además o en lugar de esto, se podría utilizar un codón de bamboleo (tal como UUU) para la incorporación del aminoácido de sustitución en el sitio del codón de bamboleo.
En otras formas de realización ilustrativas, múltiples aminoácidos de sustitución (tales como dos aminoácidos no naturales diferentes) se pueden incorporar en un polipéptido o proteína a través de la utilización de diversos métodos. Por ejemplo, un aminoácido no natural se puede incorporar en un sitio de bamboleo, mientras que un aminoácido no natural diferente puede ser incorporado en un codón de terminación ámbar. En algunas formas de realización ilustrativas, la incorporación de múltiples aminoácidos de sustitución (incluidos aminoácidos no naturales) incluye la utilización de una PheRS modificada para incorporar múltiples análogos de fenilalanina diferentes tales como bromofenilalanina y/o p-yodofenilalanina, en el mismo polipéptido o proteína.
Una estrategia similar implica el uso de una sintetasa heteróloga y un ARNt iniciador mutante del mismo organismo o de un organismo relacionado como una molécula de ARNt. (Véase, por ejemplo, Kowal, et al., PNAS, 98, 2268 (2001)).
En determinadas formas de realización, la RS modificada o mutada interactúa con la sustitución de aminoácidos deseada (ya sea aminoácido que se produce de forma natural o no natural) con una especificidad alterada de unión y/o un evento catalítico alterado de la enzima hacia la sustitución de aminoácidos cuando se compara con la enzima RS de tipo salvaje o del correspondiente aminoácido de tipo salvaje.
En la cinética enzimática, kcat es una constante de velocidad de primer orden que corresponde a la etapa o etapas más lentas en la vía catalítica global. La kcat representa el número máximo de moléculas de sustrato que se puede convertir en producto por cada una de las moléculas de enzima por unidad de tiempo (lo cual se produce si la enzima está "saturada" con el sustrato) y, por lo tanto, se refiere a menudo como el número de cambio. La Km es una constante de disociación aparente y se refiere a la afinidad de la enzima por el sustrato; es el producto de todas las constantes de disociación y de equilibrio antes de la primera etapa irreversible de la vía. A menudo, es una medida cercana a la constante de disociación enzima-sustrato. La kcat/Km es una constante de velocidad de
segundo orden que se refiere a la enzima libre (no al complejo enzima-sustrato) y es también una medida de la eficacia global de la catálisis de la enzima y a la que también se alude como la constante de especificidad.
En determinadas formas de realización, la sintetasa mutante externa tiene propiedades enzimáticas mejoradas o potenciadas, p. ej., la Km es mayor o menor, la kcat es mayor o menor, el valor de kcat/Km es mayor o menor, o similar, para el aminoácido no natural en comparación con un aminoácido que se produce de forma natural, p. ej., uno de los 20 aminoácidos conocidos. La Km de la AARS mutante o modificada es preferiblemente igual o menor para el aminoácido no natural que para el aminoácido natural de tipo salvaje correspondiente.
En determinadas formas de realización, los valores kcat/Km de la variante RS puede variar de 3 veces, 5 veces, 10 veces, 25 veces, 50 veces, 100 veces, 150 veces, 200 veces, 250 veces, 300 veces, 350 veces, 385 veces, 400 veces más que para el aminoácido que se produce de forma natural.
En determinadas formas de realización, el ARNt modificado interactúa con el codón de bamboleo degenerado con una afinidad a 37ºC de al menos aproximadamente 1,0 kcal/mol, 1,5 kcal/mol, 2,0 kcal/mol, 2,5 kcal/mol, 3,0 kcal/mol, 3,5 kcal/mol, 4,0 kcal/mol, 4,5 kcal/mol, 5,0 kcal/mol o mayor (o cualquier valor intermedio) de manera más favorable que la interacción entre su versión sin modificar y el codón de bamboleo degenerado.
Por ejemplo, fenilalanina (Phe) es codificada por dos codones, UUC y UUU. Ambos codones son leídos por un único ARNt, que está equipado con la secuencia de anticodón GAA. Por lo tanto, el codón UUC es reconocido a través de un apareamiento de bases de Watson-Crick estándar entre codón y anticodón; UUU es leído a través de un par de bases de bamboleo G-U en la primera posición del anticodón (Crick, J. Mol. Biol. 19: 548, 1966; Soll y Rajbhandary, J. Mol. Biol. 29: 113, 1967). La desnaturalización térmica de los dúplex de ARN ha proporcionado estimaciones de las energías libres de Gibbs de fusión de pares de bases G-U, G-C, A-U y A-C como 4,1, 6,5, 6,3 y 2,6 kcal/mol, respectivamente, a 37ºC. Así, el par de bases de bamboleo, G-U, es menos estable que el par de bases de Watson-Crick, A-U. Un ARNtPhe modificado equipado con el anticodón (tRNAPhe AAA) fue diseñado para leer el codón UUU, y fue predicho para leer tales codones de una forma más rápida que el ARNtPhe GAA de tipo salvaje.
En algunas formas de realización, el bolsillo de unión de la RS se modifica de tal manera que la RS modificada exhibe una preferencia por el aminoácido no natural frente al aminoácido que se produce de forma natural correspondiente. En formas de realización preferidas, la RS se modifica en uno o más codones necesarios para el contacto estructural entre la RS y el aminoácido que está siendo cargado al ARNt. En determinadas formas de realización, el uno o más codones seleccionados para la mutación o modificación se seleccionan por medio de modelado por ordenador. Mientras que cualquier RS puede ser modificada, la presente invención se refiere a fenilalanil-ARNt sintetasa (PheRS). La RS modificada es de Saccharomyces cerevisiae, u otra célula de levadura. En determinadas formas de realización, en las que la RS es una PheRS, la enzima tiene una o más mutaciones puntuales según se define antes, en particular una mutación puntual (N412G), (T415G), (T415A), (S418C) o (S437F) en la subunidad alfa de la enzima. Las mutaciones puntuales (por ejemplo, la mutación T a G o A en la posición 415, o la mutación S a C en la posición 418, o la mutación N a G en la posición 412, o la mutación S a F en la posición 437) se encuentran en la región del bolsillo de unión de la aminoacil-ARNt sintetasa (RS).
En algunas formas de realización ilustrativas, los valores típicos Km para diferentes análogos con AARS pueden oscilar desde aproximadamente 15 microM, 20 microM, 30 microM, 50 microM, 75 microM, 100 microM, 150 microM, 200 microM, 300 microM, 400 microM, 440 microM, 500 microM, 1000 microM, 1500 microM, 2000 microM, 3000 microM, 4000 microM, 5000 microM, 6000 microM, o mayor, o cualquier valor intermedio.
Asimismo, los valores de kcat de la PheRS mutante son preferiblemente iguales o más altos para el análogo de aminoácido que para el aminoácido natural. Por ejemplo, los valores kcat para diferentes análogos con el PheRS correspondiente puede oscilar entre aproximadamente 0,002 s-1, 0,0018 s-1, 0,0015 s-1, 0,014 s-1, 0,1 s-1, 0,3 s-1, 1 s-1, 3 s-1, 5 s-1, 8 s-1, 10 s-1, 13,3 s-1, 15 s-1, o mayor.
Por lo tanto, la kcat/Km del mutante PheRS es óptimamente igual a o mayor que para el análogo de aminoácido que para el aminoácido de tipo salvaje natural. Valores de kcat/Km típicos pueden variar de aproximadamente 0,0001 M1 s-1, 0,0003 M-1 s-1, 0,005 M-1 s-1, 0,05 M-1 s-1, 0,5 M-1 s-1, 0,547 M-1 s-1, 1 M-1 s-1, 5 M-1 s-1, 10 M-1 s-1, 20 M-1 s-1, 30
M-1 -1
s-1, 32 M-1 s-1, 500 M-1 s-1, 600 M-1 s-1, 1000 M-1 s-1, 5000 M-1 s-1, 11000 M-1 s. En determinadas formas de realización, las mutaciones puntuales PheRS se pueden alterar para cualquier aminoácido, dependiendo de las características del aminoácido no natural deseado para su incorporación en la proteína/el polipéptido de ensayo. En determinadas formas de realización, un aminoácido en el bolsillo de unión de la PheRS puede ser mutado a un codón para un aminoácido con una cadena lateral pequeña, un aminoácido con una cadena lateral alifática, un aminoácido cíclico, un aminoácido con cadenas laterales que contienen hidroxilo o azufre, un aminoácido aromático, un aminoácido de carácter básico, un aminoácido (o amida) de carácter ácido.
La selección del aminoácido para mutar la PheRS en un punto particular es de rutina, dependiendo del resultado deseado y del aminoácido no natural deseado a ser incorporado en el polipéptido/proteína diana o de ensayo. Por ejemplo, si el objetivo es agrandar el bolsillo de unión de la molécula de PheRS, entonces podría elegirse un aminoácido con una cadena lateral alifática, o una pequeña cadena lateral para mutar la PheRS. En otros casos, si se desea un bolsillo de unión que albergue un bolsillo cargado, entonces puede seleccionarse un aminoácido de carácter básico o ácido para la mutación puntual de la PheRS. En algunas realizaciones, la RS modificada puede utilizarse en un sistema de traducción, incluida una célula huésped auxótrofa o célula huésped prototrópica junto con un ARNt supresor con el fin de permitir la asignación de un codón de terminación (tal como un codón ámbar, ocre u ópalo sin sentido, un codón de terminación que no está presente en un organismo particular, cualquier codón sin sentido, un codón de cuatro o cinco pares de bases, u otro aminoácido natural que no esté presente en niveles significativos en la proteína, tal como metionina) para incorporar otra amino ácido, incluido un análogo de aminoácido. Por lo tanto, las enzimas RS pueden ser "reprogramadas" para una especificidad promiscua para el sustrato con el fin de facilitar la incorporación de un aminoácido no natural en un polipéptido de una manera específica para el sitio. En formas de realización particulares, se puede utilizar cualquier aminoácido no natural aromático con la PheRS modificada. Esta reprogramación permite una incorporación de alta fidelidad de un aminoácido, incluidos aminoácidos no naturales, en polipéptidos o proteínas con o sin el uso de células huésped auxotróficas.
La reprogramación de una enzima AARS puede implicar el análisis estructural o bioquímico, incluido el modelado por ordenador o la alineación de secuencias. Dado que no hay información de la secuencia disponible para muchas moléculas de AARS, por ejemplo en GenBank, la comparación de alineaciones de secuencias es un proceso rutinario una vez que se determina la secuencia de la región particular de interés.
El uso de células huésped auxotróficas puede aumentar el nivel de incorporación del aminoácido no natural, o puede disminuir el nivel de incorporación errónea de otro aminoácido en lugar del aminoácido no natural deseado. Por ejemplo, después de potenciar la reactividad de aminoacilación celular mediante la expresión de PheRS de tipo salvaje en el huésped, los autores de la invención encontraron, sorprendentemente, que algunos de los lentos análogos de aminoácidos también podrían ser introducidos en las proteínas, incluso en ausencia de una célula huésped auxotrófica.
En determinadas formas de realización, la expresión de una o más moléculas de PheRS modificadas o mutantes, una o más moléculas de ARNt mutantes o modificadas, o ambos, puede ser regulada por un promotor constitutivo
o inducible u otro sistema de expresión inducible.
Determinadas formas de realización descritas en esta memoria se refieren a permitir la inserción selectiva para el sitio de uno o más aminoácidos no naturales en cualquier posición deseada de cualquier proteína, (ii) es aplicable a células tanto procariotas como eucariotas, y permite estudios in vivo de proteínas mutantes, además de la generación de grandes cantidades de proteínas mutantes purificadas. Además, determinadas formas de realización se refieren a la adaptación para incorporar cualquiera de una gran diversidad de aminoácidos no naturales, en proteínas in vivo. Así, en una secuencia de polipéptido específica es posible un cierto número de diferentes inserciones selectivas del sitio de aminoácidos no naturales. Tales inserciones son opcionalmente todas del mismo tipo (p. ej., múltiples ejemplos de un tipo de aminoácido no natural insertado en múltiples puntos en un polipéptido) o son, opcionalmente, de diversos tipos (p. ej., diferentes tipos de aminoácidos no naturales se insertan en múltiples puntos en un polipéptido).
Un resultado sorprendente descrito en esta memoria muestra que el re-diseño del sitio sintético de una enzima PheRS puede ampliar la capacidad de introducir aminoácidos de sustitución (incluidos aminoácidos no naturales) en polipéptidos o proteínas. En algunas realizaciones, las composiciones y los métodos de modificar o mutar PheRS pueden incluir, opcionalmente, alterar la función de edición de la PheRS modificada o mutante. En algunas formas de realización, la capacidad de edición o corrección de la PheRS modificada o mutante es aproximadamente igual a la de la PheRS de tipo salvaje (inalterada). En otras formas de realización, se reduce la capacidad de editar o corregir la PheRS modificada o mutantes. En aún otras formas de realización, se elimina la capacidad de edición o corrección de la PheRS modificada o mutante. En algunas determinadas formas de realización, la alteración de la función de edición o de corrección de la PheRS es inherente a la modificación de la PheRS con el fin de alojar a un aminoácido de sustitución (por ejemplo, modificación del bolsillo de unión de la PheRS). En otras formas de realización, la alteración de la función de edición o corrección se puede realizar, además de la modificación de la PheRS, con el fin de acomodar a un aminoácido de sustitución. En aún otras formas de realización, la función de edición o corrección de la PheRS está inalterada. Así, además de la modificación o alteración del bolsillo de unión de una PheRS, también puede ser alterado el dominio de corrección
o edición de la PheRS modificada con el fin de permitir una especificidad incrementada de aminoacilar el aminoácido de sustitución (incluidos aminoácidos no naturales) a un ARNt (ya sea ARNt endógeno o mutante externo), al tiempo de hidrolizar opcionalmente el o los aminoácidos-adenilato de tipo salvaje que se pueden
formar y que resultan en una mayor fidelidad o especificidad de incorporación del aminoácido de sustitución (incluido un aminoácido no natural) en el polipéptido o proteína.
En algunas formas de realización, las tasas de incorporación de un aminoácido no natural eran aproximadamente 65% o mayor, 70% o mayor, 75% o mayor, 80% o mayor, 85% o mayor, 90% o mayor, 91% o mayor , 92% o mayor, 93% o mayor, 94% o mayor, 95% o mayor, 96% o mayor, 97% o mayor, 98% o mayor o 99% o mayor utilizando una RS modificada.
Tal como se describe en esta memoria, entre otros puede utilizarse la estructura cristalina de la RS exacta a ser modificada, o la estructura cristalina de una RS homóloga para el modelado molecular de la interacción enzima aminoácido con el fin de determinar los puntos de contacto entre la RS y el aminoácido de origen natural correspondiente, y/o los puntos de contacto entre la RS y el aminoácido no natural seleccionado deseado para ser incorporado en un polipéptido. Por ejemplo, en determinadas formas de realización de esta memoria, se utilizó la estructura cristalina de la PheRS de Thermus thermophilus complejada con fenilalanina para el diseño de modelado molecular de un PheRS de Saccharomyces cerevisiae, debido a la identidad de la secuencia de aproximadamente un 40% en la región del sitio activo de las sintetasas. La mutación de la treonina en la posición 415 a glicina o alanina (T415G o T415A, respectivamente) amplió el sitio activo y permitió el acomodamiento de análogos de fenilalanina mayores. Mutaciones como ésta que interrumpen el apareamiento de bases de Watson-Crick con el aminoácido que se produce de forma natural designadas para una RS particular permiten una especificidad incrementada para la incorporación de un aminoácido no natural y una incorporación errónea disminuida de otro aminoácido. Tal como se expone en los Ejemplos y Figuras, la (T415A) fenilalanina aminoacil ARNt sintetasa de levadura (PheRS) reveló una preferencia quíntuple por bromofenilalanina que por fenilalanina que se produce de forma natural. Por lo tanto, es posible alterar una molécula de aminoacil ARNt sintetasa (RS) para incorporar preferentemente un aminoácido deseado en 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces , 9 veces, 10 veces o más, dependiendo de las propiedades de la RS particular y del aminoácido deseado (incluido un aminoácido no natural).
En una forma de realización particular, se encontró que el espacio alrededor de la posición para del anillo de arilo de Phe unida podría reducirse ligeramente para excluir otros aminoácidos aromáticos, tales como Trp, al tiempo que sigue acomodando a un aminoácido no natural, tal como pBrF. Por lo tanto, una forma de realización describe la incorporación de un grupo funcional bromuro de arilo en un polipéptido en una posición programada, proporcionando un ligamiento quimioselectivo a través de un acoplamiento cruzado catalizado por paladio con participantes en la reacción de etino o acetileno. Aunque tales RSs reprogramadas o modificadas pueden utilizarse en cualquier número de células huésped, incluidas células huésped auxotróficas, el alto nivel de eficacia de incorporación del aminoácido (o análogo) deseado de las RSs modificadas de determinadas formas de realización, así como los altos rendimientos de producción de proteínas, hacen innecesario el uso de células huésped auxotróficas.
Dado que se conoce o se deduce fácilmente la región del sitio activo para casi todas las aminoácidos sintetasas, una técnica ilustrativa de este tipo se puede aplicar a otras AARSs en un esfuerzo para reprogramar la especificidad para el aminoácido de un aminoácido que se produce de forma natural a un aminoácido no natural con una expectativa de éxito y sin experimentación excesiva.
Como un ejemplo ilustrativo, la treonina en la posición 415 en PheRS de levadura es el equivalente a treonina 251 en PheRS de E. coli. Por lo tanto, la mutación de la PheRS de levadura (T415G) permitió la activación de una diversidad de análogos de Phe. (Véanse los Ejemplos en esta memoria). Mutaciones puntuales adicionales y/o el uso de una célula huésped auxotrófica permitió una incorporación errónea disminuida en la variante de PheRS de levadura T415G.
En otra forma de realización particular descrita en esta memoria, un ARN de transferencia de levadura mutante (yARNtPheCUA) del cual se interrumpió un apareamiento de bases de Watson-Crick entre la posición de aminoácido 30 y la posición de aminoácido 40, se cargó con p-bromo-fenilalanina (pBrF) mediante una fenilalanina de levadura co-expresada. En determinadas formas de realización, el bolsillo de unión de aminoácidos de la AARS constituye aproximadamente 200, aproximadamente 100, aproximadamente 75, aproximadamente 50, aproximadamente 25, aproximadamente 10, aproximadamente 5 o más o menos aminoácidos. En algunas formas de realización, los aminoácidos a mutar en el sitio activo o de unión son tramos contiguos de aminoácidos. En otras formas de realización, los aminoácidos a mutar están situados en estrecha proximidad entre sí, pero no son contiguos.
En determinadas formas de realización, el aminoácido natural es codificada por dos o más códigos genéticos (por lo tanto, es codificado por códigos genéticos degenerados). En la mayoría, si no todos los casos, esto incluye 18 de los 20 aminoácidos naturales, excepto Met y Trp. En estas circunstancias, para reconocer todos los códigos genéticos degenerados para el aminoácido natural, el bucle de anticodón del o de los ARNts de tipo salvaje se
basa tanto en un apareamiento de bases de bamboleo como de un apareamiento de bases de Watson-Crick puro. El presente ARNt modificado contiene al menos una modificación en su bucle de anticodón, de tal manera que el bucle de anticodón modificado forma ahora un apareamiento de bases de Watson-Crick a uno de los códigos genéticos degenerados, al que el ARNt se une previamente sólo a través de apareamiento de bases por bamboleo.
Ya que el apareamiento de bases de Watson-Crick es invariablemente más fuerte y más estable que el apareamiento de bases por bamboleo, el presente ARNt modificado se unirán preferiblemente a un código genético previo de apareamiento de bases por bamboleo (ahora a través de un apareamiento de bases de Watson-Crick), a lo largo de un apareamiento de bases de Watson-Crick previo (ahora a través de apareamiento de bases por bamboleo). Por lo tanto un análogo puede ser incorporado en el presente codón, si el ARNt modificado se carga con un análogo de un aminoácido natural, que puede o puede no ser el mismo que el aminoácido natural codificada por el codón en cuestión.
Así, en determinadas formas de realización, si es deseable incorporar determinados análogos de aminoácidos en los codones para Met o Trp, un ARNt para un aminoácido natural (p. ej., un ARNt Met, un ARNt Trp, o incluso un ARNt Phe, etc.) puede ser modificado para reconocer el codón Met o Trp. Bajo este tipo de situación única, tanto el ARNt modificado como el ARNt natural compiten por unirse al mismo código genético (único) a través de un apareamiento de bases de Watson-Crick. Algunos, pero no todos estos codones aceptarán sus aminoácidos naturales, mientras que otros pueden aceptar análogos de aminoácidos portados por el ARNt modificado. Otros factores, tales como la abundancia del aminoácido natural frente a la del análogo, pueden afectar al resultado final. (Véanse los Ejemplos descritos en esta memoria).
En determinadas formas de realización preferidas, el ARNt modificado no está cargado o sólo lo está ineficazmente por una aminoacil-ARNt sintetasa endógena (AARS) para cualquier aminoácido natural, de manera que el ARNt modificado en gran medida (si no exclusivamente) porta un análogo de aminoácido, pero no un aminoácido natural. Aunque un ARNt modificado objeto todavía puede ser útil si se puede cargar por parte de las AARS endógenas con un aminoácido natural.
En determinadas formas de realización, el ARNt modificado cargado con un análogo de aminoácido tiene tal forma y tamaño general que el ARNt análogo es un complejo ribosómicamente aceptable, es decir, el complejo ARNtanálogo puede ser aceptado por los ribosomas procariotas o eucariotas en un sistema de traducción in vivo o in vitro.
Preferiblemente, la PheRS modificada carga de forma específica o preferible el análogo al ARNt modificado en cualquier aminoácido natural. En una realización preferida, la constante de especificidad para la activación del análogo por parte de la AARS modificada (definida como kcat/KM) es igual o mayor que al menos aproximadamente 2 veces mayor que para el aminoácido natural, de preferencia aproximadamente 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces mayor o más que el aminoácido natural.
En determinadas formas de realización, el ARNt modificado comprende, además, una mutación en el cuarto sitio de anticodón extendido, para aumentar la eficacia de la traducción.
El uso de codones extendidos se basa en la supresión del marco de lectura de traducción. Cuatro codones base tienen el potencial para la inserción de múltiples aminoácidos no naturales en la misma proteína. Por ejemplo, el cuadruplete UAGA puede ser descodificado por un ARNtLeu con un anticodón UCUA con una eficacia de 13 a 26%. (Véase, por ejemplo, Moore, et al., J. Mol Biol., 298: 195 (2000)). El uso de codones extendidos solos tiene problemas potenciales, de modo que la lectura en marco de las tres primeras bases como un triplete en el codón extendido compite con la supresión global del marco de lectura. En algunos casos, los codones extendidos basados en codones raros o codones sin sentido pueden reducir la lectura sin sentido y la supresión del marco de lectura en otros sitios no deseados. Estos problemas pueden ser superados, sin embargo, con el uso de un codón/anticodón extendido y una AARS y/o ARNt modificado como se indica en algunas formas de realización descritas en esta memoria.
Por lo tanto, para resumir, los codones específicos están reservados para uso en los métodos descritos en esta memoria por la PheRS mutantes o modificada y/o por el ARNt modificado o mutante para la incorporación de un aminoácido de sustitución (incluido un aminoácido que se produce de forma natural o no natural). Tales métodos pueden incluir el uso de una decodificación ámbar (ocre, ámbar u otro ARNt supresor) que lee codones de terminación (TAG), sesgo de descodificación que explota ARNts no utilizados responsables del sesgo de codones, descodificación por bamboleo que crea nuevos ARNts que leen codones de bamboleo y codones extendidos (4-5 bases o más) que utilizan ARNts "supresores" mutantes que utilizan anticodones de 4 bases o 5 bases (o más).
Al menos una otra forma de realización proporciona un método para incorporar un análogo de aminoácido en una
proteína diana en una o más posiciones especificadas, comprendiendo el método: (1) proporcionar a un entorno un primer polinucleótido objeto para un ARNt modificado, o un ARNt modificado objeto; (2) proporcionar al entorno un segundo polinucleótido objeto que codifica una PheRS modificada, en donde la PheRS modificada es capaz de cargar el ARNt modificado con el análogo; (3) proporcionar al entorno el análogo; (4) proporcionar un polinucleótido molde que codifica la proteína diana, en donde el codón en el polinucleótido molde para la posición especificada sólo forma un apareamiento de bases de Watson-Crick con el ARNt modificado; y (5) permitir la traducción del polinucleótido molde para proceder, incorporando así el análogo en la proteína diana en la posición especificada, en donde las etapas (1) -(4) se efectúan en cualquier orden.
En determinadas formas de realización, el método comprende, además, verificar la incorporación del análogo, por ejemplo, mediante espectrometría de masas, secuenciación de proteínas, marcaje de aminoácidos tal como mediante fluorescencia, radiactividad, etc., ELISA, u otro rastreo de anticuerpos, ensayos o rastreos funcionales, u otros métodos.
En determinadas formas de realización, el método incorpora el análogo en la posición con una eficacia de al menos aproximadamente 50%, o 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o casi el 100%.
Definiciones
Antes de describir determinadas formas de realización en detalle, debe entenderse que esta invención no se limita a composiciones o sistemas biológicos particulares, que pueden, por supuesto, variar. Ha de entenderse también que la terminología utilizada en esta memoria es con el fin de describir solamente realizaciones ilustrativas particulares, y no se pretende que sea limitante. Tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y "el", “la” incluyen referentes en plural, a menos que el contenido dicte claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una molécula" incluye opcionalmente una combinación de dos o más de tales moléculas, y similares.
A menos que se defina específicamente a continuación, los términos y expresiones utilizados en esta memoria descriptiva tienen generalmente sus significados ordinarios en la técnica, dentro del contexto general de esta invención y en el contexto específico donde se utiliza cada uno de los términos y expresiones. Determinados términos y expresiones se discuten más adelante o en otra parte en la memoria descriptiva, para proporcionar una orientación adicional al practicante en la descripción de las composiciones y métodos de la invención y cómo hacer y utilizar los mismos. El alcance y el significado de cualquier uso de un término o expresión resultarán evidentes a partir del contexto específico en el que se utiliza el término o expresión.
"Alrededor de" y "aproximadamente" deben dar a entender, en general, un grado aceptable de error para la cantidad medida dada la naturaleza o la precisión de las mediciones. Grados de error típicos ilustrativos están dentro del 20 por ciento (%), preferentemente dentro del 10%, y más preferiblemente dentro del 5% de un valor o intervalo de valores dado. Alternativamente, y en particular en los sistemas biológicos, las expresiones “alrededor de" y "aproximadamente" pueden significar valores que están dentro de un orden de magnitud, preferentemente dentro de 5 veces y más preferiblemente dentro de 2 veces de un valor dado. Cantidades numéricas dadas en esta memoria son aproximadas, a menos que se indique otra cosa, lo que significa que el término "alrededor de" o "aproximadamente" se puede inferir cuando no se indique expresamente.
"Análogo de aminoácido", "aminoácido no canónico" o "aminoácido no estándar", "aminoácido no natural", "aminoácido antinatural" y similares se pueden utilizar de manera indistinta, y pretende incluir todos los compuestos de tipo aminoácido que son similares en estructura y/o forma general a uno o más de los veinte Laminoácidos que se encuentran comúnmente en proteínas que se producen de forma natural (Ala o A, Cys o C, Asp o D, Glu o E, Phe o F, Gly o G, His o H, Ile o I, Lys o K, Leu o L, Met o M, Asn o N, Pro o P, Gln o Q, Arg o R, Ser o S, Thr o T, Val o V, Trp o W, Tyr o Y, según se definen y listan en la Norma ST.25 de la OMPI (1998), Apéndice 2, Tabla 3). Análogo de aminoácido también pueden ser aminoácidos naturales con cadenas laterales o cadenas principales modificadas. Los aminoácidos también pueden ser aminoácidos que se producen de forma natural en forma D más que en forma L. Preferiblemente, estos análogos normalmente no son "sustratos" para las aminoacil ARNt sintetasas (AARSs), debido a la normalmente alta especificidad de las AARSs. Aunque ocasionalmente, determinados análogos con estructuras o formas suficientemente cercanas a las de los aminoácidos naturales se pueden incorporar en las proteínas erróneamente mediante AARSs, especialmente AARSs modificadas con especificidad de sustrato relajado. En una forma de realización preferida, los análogos comparten estructuras de cadena principal, y/o incluso la mayoría de estructuras de cadena lateral de uno o más aminoácidos naturales, siendo la o las únicas diferencias el que contienen uno o más grupos modificados en la molécula. Una modificación de este tipo puede incluir, sin limitación, la sustitución de un átomo (tal como N) por un átomo relacionado (tal como S), la adición de un grupo (tal como metilo, o un grupo hidroxilo, etc.) o un átomo (tal como Cl o Br, etc.), la supresión de un grupo (supra), la sustitución de un enlace covalente (enlace sencillo por
un doble enlace, etc.), o combinaciones de los mismos. Análogos de aminoácidos pueden incluir α-hidroxiácidos y β-aminoácidos, a los que también se puede aludir como "aminoácidos modificados" o "sustratos de AARS antinaturales”. Los análogos de aminoácidos se pueden producir de forma natural o no natural (por ejemplo, sintetizados). Como se apreciará por los expertos en la técnica, cualquier estructura para la cual se conoce o se puede generar un conjunto de rotámeros se puede utilizar como un análogo de aminoácido. Las cadenas laterales pueden estar en la configuración (R) o la configuración (S) (o la configuración D o L). En una forma de realización preferida, los aminoácidos están en la configuración el (S) o L.
Preferiblemente, la forma y el tamaño globales de los análogos de aminoácidos son tales que, al ser cargados a ARNts (naturales o modiificados o re-diseñados) mediante AARS (naturales o re-diseñados), el análogo-ARNt es un complejo aceptado por los ribosomas, es decir, el complejo ARNt-análogo puede ser aceptado por los ribosomas procariotas o eucariotas en un sistema de traducción in vivo o in vitro.
"Residuos de anclaje" son las posiciones de residuos en AARS que mantienen interacciones críticas entre la AARS y la cadena principal del aminoácido natural.
"Cadena principal", o "molde" incluye los átomos de la cadena principal y cualesquiera cadenas laterales fijadas (tales como las cadenas laterales de los residuos de anclaje) de la proteína (p. ej., AARS). A efectos de cálculo, la cadena principal de un análogo se trata como parte de la cadena principal de la AARS.
"Estructura de la cadena principal de la proteína" o equivalentes gramaticales en esta memoria quieren dar a entender las coordenadas tridimensionales que definen la estructura tridimensional de una proteína particular. Las estructuras que comprenden una estructura de la cadena principal de la proteína (de una proteína que se produce de forma natural) son el nitrógeno, el carbono del carbonilo, el carbono α y el oxígeno del carbonilo, junto con la dirección del vector del carbono α al carbono β.
La estructura de la cadena principal de la proteína que se introduce en un ordenador para la predicción estructural
o la interacción molecular por ordenador, puede incluir las coordenadas tanto para la cadena principal como para las cadenas laterales de aminoácidos, o simplemente la cadena principal, es decir, con las coordenadas de las cadenas laterales de los aminoácidos eliminadas. En el primer caso, los átomos de la cadena lateral de cada uno de los aminoácidos de la estructura de proteína puede ser "despojado" o retirado de la estructura de una proteína, tal como se conoce en la técnica, dejando sólo las coordenadas para los átomos de la "cadena principal" (el nitrógeno, el carbono y el oxígeno del carbonilo, y el carbono α, y los átomos de hidrógeno unidos al nitrógeno y el carbono α).
Opcionalmente, la estructura de la cadena principal de la proteína puede ser alterada antes del análisis que se esboza más adelante. En esta forma de realización, la representación de la estructura de la cadena principal de la proteína de partida se reduce a una descripción de la disposición espacial de sus elementos estructurales secundarios. Las posiciones relativas de los elementos estructurales secundarios están definidas por un conjunto de parámetros denominados parámetros de la estructura supersecundaria. A estos parámetros se asignan valores que se pueden variar de forma sistemática o aleatoria para alterar la disposición de los elementos de estructura secundaria para introducir una flexibilidad de la cadena principal explícita. Las coordenadas atómicas de la cadena principal son entonces cambiadas para reflejar los parámetros estructurales supersecundarios alterados, y estas nuevas coordenadas se introducen en el sistema para su uso en la subsiguiente automatización de diseño de proteínas. Para más detalles, véase la patente de EE.UU. Nº 6.269.312, cuyo contenido completo queda incorporado aquí como referencia.
"Energía conformacional" se refiere generalmente a la energía asociada con una "conformación" particular, o estructura tridimensional, de una macromolécula, tal como la energía asociada con la conformación de una proteína particular. Interacciones que tienden a estabilizar una proteína tienen energías que están representadas como valores de energía negativa, mientras que las interacciones que desestabilizan una proteína tienen valores de energía positiva. Así, la energía conformacional para cualquier proteína estable está cuantitativamente representada por un valor de energía conformacional negativo. Generalmente, la energía conformacional para una proteína particular se relacionará con la estabilidad de esa proteína. En particular, las moléculas que tienen una energía conformacional menor (es decir, más negativa) son típicamente más estables, p. ej., a temperaturas más altas (es decir, tienen una mayor "estabilidad térmica"). Por consiguiente, a la energía conformacional de una proteína también se puede aludir como la "energía de estabilización.
Típicamente, la energía conformacional se calcula utilizando una energía del "campo de fuerza" que calcula o estima la contribución de energía a partir de diversas interacciones que dependen de la conformación de una molécula. El campo de fuerza está constituido por términos que incluyen la energía conformacional de la cadena principal del carbono alfa, interacciones cadena lateral -cadena principal, e interacciones cadena lateral -cadena
lateral. Típicamente, las interacciones con la cadena principal o la cadena lateral incluyen términos para la rotación del enlace, torsión del enlace y longitud del enlace. Las interacciones cadena principal -cadena lateral y cadena lateral -cadena lateral incluyen interacciones de van der Waals, enlaces hidrógeno, electrostática y términos de solvatación. Interacciones electrostáticas pueden incluir interacciones de Coulomb, interacciones dipolo e interacciones cuadrupolo). También se pueden incluir otros términos similares. Campos de fuerza que pueden utilizarse para determinar la energía conformacional para un polímero son bien conocidos en la técnica e incluyen los campos de fuerza CHARMM (veáse, Brooks et al., J. Comp.Chem. 1983,4: 187-217; MacKerell et al., en The Encyclopedia of Computational Chemistry, vol. 1: 271-277, John Wiley & Sons, Chichester, 1998), AMBER (véase, Cornell et al., J. Amer. Chem. Soc. 1995, 117: 5179; Woods, et al., J. Phys. Chem. 1995, 99: 3832-3846; Weiner et al., J. Comp. Chem. 1986, 7: 230; y Weiner et al., J. Amer.Chem.Soc. 1984, 106:765) y DREIDING (Mayo et al., J. Phys.Chem. 1990, 94-: 8897), por nombrar sólo unos pocos.En una implementación preferida, las expresiones enlace de hidrógeno y electrostática son como se describe en Dahiyat y Mayo, (Science 1997 278: 82).El campo de fuerza también puede ser descrito para incluir términos atómicos conformacionales (ángulos de enlace, longitudes de enlace, torsiones), como en otras referencias.Véase, p. ej., Nielsen, et al., Prot. Eng., 12: 657-662 (1999); Stikoff, et al., Biophys. J., 67: 2251-2260 (1994); Hendsch, et al., Prot. Sci., 3: 211-226 (1994); Schneider, et al., J. Am. Chem. Soc., 119: 5742-5743 (1997); Sidelar, et al., Prot Sci. 7: 1898-1914 (1998). También podrían incluirse términos y expresiones de solvatación. Véase, p. ej., Jackson, et al., Biochemistry, 32: 11259 -11269 (1993); Eisenberg, et al., Nature, 319: 199-203 (1986); Street A G y Mayo S L, Folding & Design, 3: 253-258 (1998); Eisenberg y Wesson, Prot Sci., 1: 227-235 (1992); Gordon & Mayo, supra."Residuos acoplados" son los residuos en una molécula que interactúan a través de cualquier mecanismo.Por lo tanto, a la interacción entre los dos residuos se la alude como una "interacción de acoplamiento”. Residuos acoplados generalmente contribuyen a la aptitud de polímero a través de la interacción de acoplamiento. Típicamente, la interacción de acoplamiento es una interacción física o química tal como una interacción electrostática, una interacción de van der Waals, una interacción de enlaces de hidrógeno, o una combinación de las mismas. Como resultado de la interacción de acoplamiento, cambiar la identidad de cualquier residuo afectará a la "aptitud" de la molécula, en particular si el cambio altera la interacción de acoplamiento entre los dos residuos. La interacción de acoplamiento también se puede describir por un parámetro de distancia entre los residuos en una molécula. Si los residuos se encuentran a una determinada distancia de corte, se consideran que interactúan.
La "aptitud" se utiliza para denotar el nivel o grado en el que se optimiza una propiedad particular o una combinación particular de propiedades de una molécula, p. ej. una proteína. En determinadas formas de realización de la invención, la aptitud de una proteína se determina preferiblemente por las propiedades que un usuario desea mejorar. Así, por ejemplo, la aptitud de una proteína puede referirse a la estabilidad térmica de la proteína, la actividad catalítica, la afinidad de unión, la solubilidad (p. ej., en un disolvente acuoso u orgánico), y similares. Otros ejemplos de propiedades de aptitud incluyen la enantioselectividad, la actividad hacia sustratos antinaturales, y mecanismos catalíticos alternativos. Las interacciones de acoplamiento se pueden modelar como una forma de evaluar o predecir la aptitud (estabilidad). La aptitud puede determinarse o evaluarse experimental o teóricamente, p. ej., por ordenador.
Preferiblemente, la aptitud se cuantifica de manera que cada una de las moléculas, p. ej., cada uno de los aminoácidos tendrá un "valor de aptitud" particular. Por ejemplo, la aptitud de una proteína puede ser la velocidad a la que la proteína cataliza una reacción química particular, o la afinidad de unión de la proteína por un ligando. En una forma de realización particularmente preferida, la aptitud de una proteína se refiere a la energía conformacional del polímero y se calcula, p. ej., utilizando cualquier método conocido en la técnica. Véase, p. ej., Brooks, et al., J. Comp. Chem., 4: 187-217 (1983); Mayo, et al., J. Phys. Chem., 94: 8897-8909 (1990); . Pabo, et al., Biochemistry, 25: 5987-5991 (1986), Lazar, et al., Prot. Sci., 6: 1167-1178 (1997); Lee, et al., Nature, 352: 448451 (1991); Colombo, et al., J. Am. Chem. Soc., 121: 6895-6903 (1999); Weiner, et al., J. Am. Chem. Soc., 106: 765-784 (1984). Generalmente, la aptitud de una proteína se cuantifica de modo que el valor de la aptitud aumente a medida que se optimiza la propiedad o combinación de propiedades. Por ejemplo, en realizaciones en las que la estabilidad térmica de una proteína se ha de optimizar (la energía conformacional disminuye preferiblemente), el valor de aptitud puede ser la energía conformacional negativa, es decir, F = -E.
La "contribución a la aptitud" de un residuo de proteína se refiere al nivel o grado f(ia) al que el residuo ia, que tiene una identidad, contribuye a la aptitud total de la proteína. Así, por ejemplo, si se cambia o muta un residuo de aminoácido particular, se reducirá en gran medida la aptitud de la proteína, se dice que ese residuo tiene una alta contribución a la aptitud para el polímero. Por el contrario, típicamente algunos residuos ia en una proteína pueden tener una diversidad de posibles identidades sin afectar a la aptitud de la proteína. Tales residuos, por lo tanto, tienen una baja contribución a la aptitud de la proteína. La "Eliminación sin salida" (DEE) es un algoritmo de búsqueda determinista que busca eliminar sistemáticamente malos rotámeros y combinaciones de rotámeros hasta que quede una única solución. Por ejemplo, los residuos de aminoácidos se pueden modelar como rotámeros que interactúan con una cadena principal fija. La base teórica para DEE establece que, si la búsqueda de DEE converge, la solución es la conformación de energía mínima
global (GMEC) sin incertidumbre (Desmet et al., 1992).
La eliminación sin salida se basa en el siguiente concepto. Consideremos dos rotámeros, ir e it en el residuo i, el conjunto de todas las demás configuraciones de rotámeros {S} en todos los residuos, excluido i (de los cuales el rotámero js es un miembro). Si la energía por parejas contribuida entre ir y js es superior a la energía por parejas entre it y js para todos los {S}, entonces el rotámero ir no puede existir en la conformación global de energía mínima, y puede ser eliminado. Esta noción se expresa matemáticamente por la desigualdad.
Si esta expresión es verdadera, el único rotámero ir puede ser eliminado (Desmet et al., 1992)
En esta forma, la Ecuación A no es computacionalmente tratables porque, para realizar una eliminación, se requiere que se enumere todo el espacio de la secuencia (rotámero). Para simplificar el problema, se pueden
Utilizando un argumento análogo, la Ecuación B se puede extender a la eliminación de pares de rotámeros incompatibles con la GMEC. Esto se realiza mediante la determinación de que un par de rotámeros ir en el residuo i y js en el residuo j, siempre contribuyen a energías más altas que los rotámeros iu y jv con todas las combinaciones posibles de rotámeros {L}. De manera similar a la Ecuación B, el estricto límite de esta afirmación
en que ε es las energías combinadas para pares de rotámeros
(Ecuación D) y
(Ecuación E)
Esto conduce a la eliminación de dobles del par de rotámeros ir y js, pero no elimina los rotámeros individuales por completo, ya que cualquiera de ellos podría existir independientemente en la GMEC. La etapa de eliminación de dobles reduce el número de posibles pares (reduce S) que necesitan ser evaluados en el lado de la derecha de la Ecuación 6, permitiendo que sean eliminados individualmente más rotámeros.
Los criterios sencillos y dobles presentados por Desmet et al. dejan por descubrir condiciones especiales que conducen a la determinación de más rotámeros sin salida. Por ejemplo, es posible que la contribución energética de rotámero it sea siempre menor que ir sin estar el máximo de ir por debajo del mínimo de ir. Para abordar este problema, Goldstein 1994 presentó una modificación de los criterios que determina si se cruzan los perfiles de energía de dos rotámeros. Si no lo hacen, se puede determinar que el rotámero de mayor energía es sin salida. El cálculo de dobles utiliza significativamente más tiempo computacional que el cálculo de los sencillos. Para acelerar el proceso, se han desarrollado otros métodos computacionales para predecir los cálculos de dobles que serán los más productivos (Gordon y Mayo, 1998). Este tipo de modificaciones, denominados colectivamente dobles rápidos, mejoraron significativamente la velocidad y la eficacia de la DEE.
Varias otras modificaciones también potencian el DEE. Rotámeros de múltiples residuos se pueden combinar formando los llamados super-rotámeros para solicitar más eliminaciones (Desmet et al., 1994; Goldstein, 1994). Esto tiene la ventaja de eliminar múltiples rotámeros en una sola etapa. Además, se ha demostrado que la "división" del espacio conformacional entre rotámeros mejora la eficacia del DEE (Pierce et al., 2000). La división maneja el siguiente caso especial. Consideremos el rotámero ir. Si un rotámero it1 contribuye en una energía más baja que ir para una porción del espacio conformacional, y un rotámero it2 tiene una energía más baja que ir para la fracción restante, entonces se puede eliminar ir. Este caso no sería detectado por los criterios de Desmet o Goldstein menos sensibles. En las implementaciones preferidas, como se describe en esta memoria, se utilizaron
todas las mejoras descritas para DEE.
Para más información sobre estos métodos, véase, Goldstein, Biophysical Journal 66, 1335-1340 (1994); Desmet, et al., Nature 356, 539-542 (1992).; Desmet, et al., The Protein Folding Problem and Tertiary Structure Prediction (Jr., K.M. y Grand, S.L., comps.), págs. 307-337 (Birkhauser, Boston, 1994); De Maeyer, et al., Folding & Design 2, 53-66 (1997), Gordon y Mayo, J. Comp. Chem. 19, 1505-1514 (1998); Pierce, et al., J. Comp. Chem. 21, 999-1009 (2000).
Se puede utilizar otro cálculo, apodado SCREAM (siglas inglesas de Método de Análisis de la Energía de Rotámeros de la Cadena Lateral). El SCREAM permite el examen del mecanismo de discriminación frente a aminoácidos no afines, mediante el cálculo de las energías relativas de unión de los 20 aminoácidos naturales a un AARS particular. (Véase, por ejemplo, McClendon, et al., Prot. Eng. Design & Select. 19: 195-203 (2006)).
Como una primera etapa, se calcula el espectro de energía del rotámero para un solo aminoácido en una cadena principal vacía, sin otras cadenas laterales movibles. A continuación, a partir de los rotámeros más bajos de la cadena principal vacía, llenar las cadenas laterales, pero eliminar los enfrentamientos. Por ejemplo, colocar las cadenas laterales en cada sitio, estimar las energías de las excitaciones bajas del espectro de la cadena principal vacía y calcular las interacciones por parejas, eliminando configuraciones que tengan enfrentamientos. Por lo tanto, Etot (A,B) = Eself (A) + Eself (B) + Eint. (A,B) = Eself (A,B) y Etot (A,B,C) = Eself (A) + Eself (B) + Eself (C) + Eint. (A,B) + Eint. (A,C) + Eint. (B,C)= Eself (A,B) + Eself (C) + Eint. (A,C) + Eint. (B,C) = Eself (A,B) + Eself (C) + Eint. (AB,C) establece la relación recursiva. A continuación, todas las excitaciones bajas del espectro de la cadena lateral deben ser analizadas hasta que deje de aumentar la distribución de energía de las energías de rotámeros en la cadena principal vacía. En síntesis, se evalúa la energía del estado fundamental para todos los residuos, seguido de un conjunto de rotámeros con la energía suma lineal más baja y, finalmente, la siguiente energía suma lineal más baja, y así sucesivamente. Además de ello, las interacciones electrostáticas deben ser abordadas a medida que las cargas polarizan el entorno para proteger las cargas y reducir la interacción de aminoácidos deseada. Dado que los métodos de modelado de dinámica molecular no representan, por lo general, la polarización, el sesgo es a favor de puentes de sal. Con el fin de superar esto, los residuos se neutralizan y los parámetros se evalúan de nuevo de acuerdo con la parametrización DREIDING.
Para la parametrización DREIDING, las interacciones cargado-cargado y cargado-dipolo se compensan mediante la introducción del término enlaces de hidrógeno. Esto puede hacerse en unión con otros programas, incluidos CHARMM, según se describe en esta memoria. Por lo tanto, utilizando una estructura cristalográfica a partir de una AARS particular, o una AARS homóloga de otro organismo, se puede utilizar un programa tal como SCREAM y HierDock, u otros, para predecir la conformación de unión y la energía de enlace de cada uno de los 20 aminoácidos naturales en el sitio de unión en el modo mejor de unión y el modo de activación, al ordenar los cálculos según los cuales los aminoácidos compiten por la unión a un AARS particular.
En particular, primero se realiza la unión selectiva, que proporciona el aminoácido y la molécula de ATP para unirse al sitio activo de la AARS. A veces, esto conduce a un cambio conformacional. Seguidamente, la activación selectiva de la AARS para catalizar la formación de un enlace covalente entre el aminoácido y el ATP, forma un aminoacil adenilato complejado con el AARS y elimina pirofosfato inorgánico. En tercer lugar, si se produce una activación errónea de un aminoácido no afín, la AARS puede escindir hidrolíticamente el complejo aminoacil adenilato (como corrector de pre-transferencia). Finalmente, si ha sobrevivido un aminoacil adenilato no afin, la AARS puede escindir hidrolíticamente el complejo aminoacil-ARNt (corrección post-transferencia).
Por lo tanto, un programa computacional de este tipo permite una predicción fiable de la probabilidad de que los aminoácidos naturales compitan por unirse y la aminoacilación mediante enzimas AARS de tipo salvaje o mutantes. Utilizando programas múltiples (tales como SCREAM y HierDock juntos) se reduce la tasa de incorporación errónea y permite una mayor previsibilidad en la selección de localizaciones de aminoácidos que se unen específicamente al aminoácido.
Todavía, otros programas de modelado por ordenador incluyen SCAP (siglas inglesas de Programa de Predicción del Aminoácido de la Cadena lateral) (Xiang y Honig, J. Mol. Biol. 311, 421-430 (2001)), y SCWRL (siglas inglesas de Reemplazo de la Cadena Lateral con un Banco de Rotámeros), que es útil para la adición de cadenas laterales a una cadena principal de la proteína basado en el banco de rotámeros dependiente de la cadena principal. El banco SCWRL ofrece listas de valores chi1-chi2-chi3-chi4 y sus probabilidades relativas de residuos en valores phi-psi dados, y explora estas conformaciones para minimizar enfrentamientos cadena lateral-cadena principal y enfrentamientos cadena lateral-cadena lateral. (Véase, por ejemplo. Bower, et al., J. Mol. Biol., 267, 1268-1282 (1997)).
La previsibilidad computacional se debe, en gran parte, a utilizar secuencias de ácidos nucleicos y/o de
aminoácidos conocidas de las enzimas AARS. Por ejemplo, el dominio catalítico se conserva a lo largo de todos los miembros de una clase particular de enzima AARS. (O'Donoghue y Luthey-Schulten, Microbiol. And MoI. Biol. Rev : 550-573 (2003); Díaz-Lazcoz, et al., Mol. Biol Evol. 15 (11): 1548-1561 (1998); Wang, et al., Chem. Commun. 1-11 (2002)).
"Sistema de expresión" significa una célula huésped, o componentes celulares y vector compatible bajo condiciones adecuadas, p. ej., para la expresión de una proteína codificada por ADN extraño transportado por el vector e introducido en la célula huésped. Los sistemas de expresión comunes incluyen células huésped de E. coli y vectores de plásmido, células huésped de insectos tales como células Sf9, Hi5 o S2 y vectores de Baculovirus, células de Drosophila (células de Schneider) y sistemas de expresión, y células huésped y vectores de mamíferos.
"Célula huésped" significa cualquier célula de cualquier organismo que ha sido seleccionada, modificada, transformada, cultivada o utilizada o manipulada de alguna forma para la producción de una sustancia por parte de la célula. Una célula huésped puede ser auxotrófica, que es incapaz de sintetizar al menos un compuesto orgánico particular requerido para su mantenimiento o crecimiento y debe obtener el compuesto de otra fuente tal como su entorno o medio de cultivo. Además, una célula huésped auxotrófica puede tener niveles de auxotrofia sencillo, doble, triple, cuádruple o mayor, de manera que es incapaz de sintetizar uno, dos, tres, cuatro o más compuestos orgánicos necesarios para su crecimiento o mantenimiento, respectivamente. Por ejemplo, una célula huésped puede ser una que es manipulada para expresar un gen particular, una secuencia de ADN o ARN, una proteína o una enzima. Las células huésped pueden cultivarse in vitro o una o más células en un animal no humano (p. ej., un animal transgénico o un animal transfectado transitoriamente).
Determinadas formas de realización descritas en esta memoria expresamente sólo utilizan un sistema de expresión
o traducción exento de células y no una célula huésped. Determinadas otras formas de realización utilizan expresamente sólo una célula huésped auxotrófica. Todavía otras determinadas formas de realización utilizan expresamente sólo una célula huésped no auxotrófica, o una célula huésped prototrófica.
La similitud de secuencia puede ser relevante para determinadas formas de realización, ya que éstas pueden incluir etapas de comparación de secuencias entre sí, incluida la secuencia de tipo salvaje, con uno o más mutantes. Tales comparaciones comprenden típicamente alineaciones de secuencias de polímeros, p. ej., utilizando programas y/o algoritmos de alineación de secuencias que son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, BLAST, FASTA y MEGALIGN, por nombrar unos pocos). El experto en la técnica puede apreciar fácilmente que, en tales alineaciones, en que una mutación contiene una inserción o deleción de residuos, la alineación de la secuencia introducirá un "hueco" (por lo general representado por un guión, "-", o "Δ") en la secuencia de polímero que no contiene el residuo insertado o suprimido.
"Homóloga", en todas sus formas gramaticales y variaciones ortográficas, se refiere a la relación entre dos moléculas (p. ej., proteínas, ARNts, ácidos nucleicos) que poseen un "origen evolutivo común", incluidas proteínas de superfamilias en la misma especie de organismo, así como proteínas homólogas de diferentes especies de organismos. Tales proteínas (y sus ácidos nucleicos codificantes) tienen una homología de la secuencia y/o estructural, tal como se refleja por su similitud de secuencia, ya sea en términos de porcentaje de identidad o por la presencia de residuos o motivos específicos y posiciones conservadas. Moléculas homólogas también comparten, con frecuencia, funciones similares o incluso idénticas.
En algunos aspectos, homóloga puede incluir una secuencia que es al menos 50% homóloga, pero que presenta una estructura homóloga en tres dimensiones, es decir, incluye una carga de superficie sustancialmente similar o una presentación de grupos hidrófobos. Dado que los enlaces hidrógeno, fuerzas de van der Waals e interacciones hidrófobas pueden funcionar para unir un aminoácido al bolsillo de unión de una AARS, la manipulación de una estructura de la AARS también puede alterar una o más de estas fuerzas.
Por lo tanto, tal como se utiliza en esta memoria, proteínas y/o secuencias de proteínas son "homólogas" cuando se derivan, natural o artificialmente, de una proteína o secuencia de proteína ancestral común. De manera similar, ácidos nucleicos y/o secuencias de ácidos nucleicos son homólogos cuando se derivan, natural o artificialmente, de un ácido nucleico o secuencia de ácido nucleico ancestral común. Por ejemplo, cualquier ácido nucleico que se produzca de forma natural se puede modificar por cualquier método de mutagénesis disponible para incluir uno o más codones selectores. Cuando se expresa, este ácido nucleico mutagenizado codifica un polipéptido que comprende uno o más aminoácidos antinaturales. El proceso de mutación puede, por supuesto, alterar adicionalmente uno o más codones estándares, cambiando de este modo asimismo uno o más aminoácidos estándares en la proteína mutante resultante. La homología generalmente se infiere de la similitud de secuencias entre dos o más ácidos nucleicos o proteínas (o secuencias de los mismos). El porcentaje preciso de similitud entre secuencias, que es útil para establecer la homología, varía con el ácido nucleico y la proteína en cuestión, pero un valor tan bajo como 25% de similitud de la secuencia se utiliza rutinariamente para establecer la
homología. Niveles más altos de similitud de la secuencia, por ejemplo 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% o mayores también se pueden utilizar para establecer la homología. En esta memoria se describen y están generalmente disponibles métodos para determinar los porcentajes de similitud de secuencias (p. ej., BLASTP BLASTN y utilizando los parámetros por defecto).
La expresión "similitud de secuencias", en todas sus formas gramaticales, se refiere al grado de identidad o correspondencia entre secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos que pueden o no compartir un origen evolutivo común (véase, Reeck et al., supra). Sin embargo, en el uso común y en la presente solicitud, el término "homólogo", cuando se modifica con un adverbio tal como "altamente", puede referirse a la similitud de secuencias y puede o no puede estar relacionado con un origen evolutivo común.
Una molécula de ácido nucleico es "hibridable" a otra molécula de ácido nucleico, tal como un ADNc, ADN genómico, o ARN, cuando una forma de cadena sencilla de la molécula de ácido nucleico puede asociarse con la otra molécula de ácido nucleico en las condiciones apropiadas de temperatura y fuerza iónica en solución (véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan la "rigurosidad" de la hibridación. Para el rastreo preliminar de ácidos nucleicos homólogos, se pueden utilizar condiciones de hibridación de rigurosidad baja, correspondientes a una Tm (temperatura de fusión) de 55ºC, por ejemplo, 5xSSC, SDS al 0,1%, leche al 0,25% y sin formamida; o formamida al 30%, 5xSSC, SDS al 0,5%). Condiciones de hibridación de rigurosidad moderada corresponden a una Tm superior, p. ej. formamida al 40%, con 5x o 6xSSC. Condiciones de hibridación de alta rigurosidad corresponden a la Tm más alta, por ejemplo, formamida al 50%, 5x
o 6xSSC. SSC es NaCl 0,15 M, citrato de Na 0,015 M. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan tramos complementarios de secuencias genéticas o de aminoácidos, aunque dependiendo de la rigurosidad de la hibridación, son posibles uniones erróneas entre bases.
La rigurosidad apropiada para hibridar ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementariedad, variables bien conocidas en la técnica. Cuanto mayor sea el grado de similitud u homología entre dos secuencias de nucleótidos, más alto será el valor de Tm para los híbridos de ácidos nucleicos que tienen esas secuencias. La estabilidad relativa (correspondiente a la Tm alta) de hibridaciones de ácidos nucleicos disminuye en el siguiente orden: ARN:ARN, ADN:ARN, ADN:ADN. Para híbridos de más de 100 nucleótidos de longitud, se han derivado ecuaciones para calcular la Tm (véase Sambrook et al., supra, 9.50-9.51). Para la hibridación con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos, la posición de los errores de apareamiento se vuelve más importante, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook et al., supra, 11.7-11.8). Una longitud mínima para un ácido nucleico hibridable es de al menos aproximadamente 10 nucleótidos; preferiblemente de al menos aproximadamente 15 nucleótidos; y más preferiblemente la longitud es de al menos aproximadamente 20 nucleótidos.
Salvo que se especifique, la expresión "condiciones de hibridación estándares" se refiere a una Tm de aproximadamente 55ºC, y utiliza las condiciones como se estableció anteriormente. En una forma de realización preferida, la Tm es 60ºC; en una realización más preferida, la Tm es 65ºC. En una realización específica, "alta rigurosidad" se refiere a las condiciones de hibridación y/o lavado a 68ºC en 0,2xSSC, a 42ºC en formamida al 50%, 4xSSC, o bajo condiciones que ofrezcan niveles de hibridación equivalentes a los observados bajo cualquiera de estas dos condiciones.
Condiciones de hibridación adecuadas para oligonucleótidos (p. ej. para sondas o cebadores de oligonucleótidos) son típicamente algo diferentes que para los ácidos nucleicos de longitud completa (p. ej., ADNc de longitud completa), debido a la menor temperatura de fusión de los oligonucleótidos. Debido a que la temperatura de fusión de los oligonucleótidos dependerá de la longitud de las secuencias de oligonucleótidos implicadas, temperaturas de hibridación adecuadas variarán dependiendo de las moléculas de oligonucleótidos utilizadas. Temperaturas ilustrativas pueden ser 37ºC (para oligonucleótidos de 14 bases), 48ºC (para oligonucleótidos de 17 bases), 55ºC (para oligonucleótidos 20 bases) y 60ºC (para oligonucleótidos de 23 bases). Condiciones de hibridación adecuadas ilustrativas para oligonucleótidos incluyen el lavado en 6xSSC/pirofosfato sódico al 0,05%, u otras condiciones que aportan niveles equivalentes de hibridación. "Polipéptido", "péptido" o "proteína" se utilizan indistintamente para describir una cadena de aminoácidos que están unidos entre sí por enlaces químicos denominados "enlaces peptídicos”. Una proteína o polipéptido, incluida una enzima, puede ser “nativo” o de “tipo salvaje", lo que significa que se produce en la naturaleza; o puede ser un "mutante", "variante"o "modificado", lo que significa que se ha hecho, alterado, derivado, o de alguna manera es diferente o se ha cambiado de una proteína nativa o de otro mutante.
"Rotámeros" se define como un conjunto de posibles confórmeros para cada una de las cadenas laterales de aminoácidos o análogos. Véase Ponder, et al., Acad. Press Inc. (London) Ltd. págs. 775-791 (1987); Dunbrack, et al., Struc. Biol. 1(5): 334-340 (1994); Desmet, et al., Nature 356: 539-542 (1992). Un "banco de rotámeros" es una
colección de un conjunto de conformaciones rotaméticas posibles/permitidas para un conjunto dado de aminoácidos o análogos. Existen dos tipos generales de bancos de rotámeros: "dependiente de la cadena principal" e "independiente de la cadena principal”. Un banco de rotámeros dependiente de la cadena principal permite diferentes rotámeros dependiendo de la posición del residuo en la cadena principal; así, por ejemplo, se permiten determinados rotámeros de leucina si la posición está dentro de una hélice α, y se permiten diferentes rotámeros de leucina si la posición no está en una hélice α. Un banco de rotámeros independiente de la cadena principal utiliza todos los rotámeros de un aminoácido en cada una de las posiciones. En general, se prefiere un banco independiente de la cadena principal considerando residuos del núcleo, puesto que la flexibilidad en el núcleo es importante. Sin embargo, bancos independientes de la cadena principal son computacionalmente más caros y, por lo tanto, para posiciones en la superficie y los límites, se prefiere un banco dependiente de la cadena principal. Sin embargo, se puede utilizar cualquier tipo de banco en cualquier posición.
"Posición del residuo variable" en esta memoria quiera dar a entender una posición de aminoácido de la proteína a diseñar que no se fija en el método de diseño como un residuo o rotámero específico, generalmente el residuo o rotámero de tipo salvaje. Cabe señalar que incluso si una posición se elige como una posición variable, es posible que determinados métodos descritos en esta memoria optimicen la secuencia de tal manera como para seleccionar el residuo de tipo salvaje en la posición variable. En general, esto ocurre con mayor frecuencia para los residuos del núcleo, y con menos regularidad para residuos en la superficie. Además, asimismo es posible fijar residuos como aminoácidos de tipo no salvaje.
"Posición de residuo fija" significa que el residuo identificado en la estructura tridimensional se encuentra en una conformación establecida. En algunas formas de realización, una posición fija se deja en su conformación original (que puede o puede no correlacionarse con un rotámero específico del banco de rotámeros que se esté utilizando). Alternativamente, los residuos se pueden fijar como un residuo de tipo no salvaje en función de las necesidades de diseño; por ejemplo, cuando las técnicas de mutagénesis dirigida al sitio conocidas han demostrado que es deseable un residuo particular (por ejemplo, para eliminar un sitio proteolítico o alterar la especificidad del sustrato para una AARS), el residuo puede fijarse como un aminoácido particular. Los residuos que pueden fijarse incluyen, pero no se limitan a residuos estructural o biológicamente funcionales, por ejemplo los residuos de anclaje.
En determinadas formas de realización, una posición fija puede ser "flotando"; el aminoácido o análogo en esa posición es fijo, pero se someten a ensayo diferentes rotámeros de ese aminoácido o análogo. En esta forma de realización, los residuos variables pueden ser al menos uno, o en cualquier lugar de 0,1% a 99,9% del número total de residuos. Así, por ejemplo, puede ser posible cambiar sólo unos pocos residuos (o uno) de la mayoría de los residuos, con todas las posibilidades entremedias.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "mutante externa" se refiere a una molécula modificada (p. ej., un ARNt mutante externo y/o una aminoacil ARNt sintetasa mutante externa) que exhibe una eficacia reducida (en comparación con la de tipo salvaje o endógena) para la aminoacilación con el correspondiente aminoácido de tipo salvaje. "Mutante externa" se refiere a la incapacidad o eficacia reducida, p. ej., menos de 20% de eficacia, menos de 10% de eficacia, menos de 5% de eficacia o, por ejemplo, menos de 1% de eficacia, de un ARNt y/o una RS de actuar con el correspondiente aminoácido que se produce de forma natural en el sistema de traducción de interés. Por ejemplo, un mutante RS externos en un sistema de traducción de interés aminoacila cualquier ARNt endógeno de un sistema de traducción de interés con el aminoácido de tipo salvaje a una eficacia reducida o incluso cero, en comparación con la aminoacilación de un ARNt endógeno por parte de una RS endógena.
Cabe señalar, sin embargo, que una RS mutante externa aminoacila un ARNt endógeno con un aminoácido de sustitución (tanto si se produce de forma natural como no natural) con una eficacia incrementada en comparación con la capacidad de la RS endógena de aminoacilar un ARNt endógeno con un aminoácido de sustitución. De igual manera, un ARNt mutante externo funciona con una mayor eficacia hacia el aminoácido de sustitución (ya sea un aminoácido no natural u otro aminoácido que se produzca de forma natural) que hacia el correspondiente aminoácidos de tipo salvaje.
"Codón degenerado por bamboleo" se refiere a un codón que codifica un aminoácido natural, codón que, cuando está presente en ARNm, es reconocido por un anticodón de ARNt natural, a través de al menos un apareamiento de bases no de Watson-Crick, o por bamboleo (p. ej. apareamiento de bases A-C o G-U). El apareamiento de bases de Watson-Crick se refiere al apareamiento de bases G-C o A-U (ARN o híbrido de ADN/ARN) o A-T (ADN). Cuando se utiliza en el contexto de apareamiento de bases codón de ARNm – anticodón de ARNt, el apareamiento de bases de Watson-Crick significa que todos los apareamientos de bases codón-anticodón están mediados a través de cualquier apareamiento G-C o A-U.
La expresión "preferiblemente aminoacila" se refiere a una eficacia, p. ej., de aproximadamente el 20%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%,
aproximadamente el 70%, aproximadamente el 75%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 99% o eficacia mayor. La eficacia se puede medir mediante la cual una aminoacil ARNt sintetasa modificada o mutante externa aminoacila un ARNt con un aminoácido de sustitución, ya sea un aminoácido antinatural u otro aminoácido que se produce de forma natural cuando se compara con el correspondiente aminoácido natural asignado al ARNt particular, a la AARS, o a ambos. La expresión "preferiblemente aminoacila" puede referirse, además, a la eficacia de la aminoacil ARNt sintetasa modificada o mutante externa a aminoacilar o cargar un ARNt con cualquier aminoácido que no sea el correspondiente aminoácido natural asignado al ARNt particular, la AARS, o ambos. La expresión "preferiblemente aminoacila" puede referirse, además, a la eficacia de la aminoacil ARNt sintetasa modificada o mutante externa a aminoacilar un ARNt con un aminoácido no natural en comparación con la AARS no modificada o que se produce de forma natural.
Cabe señalar que la eficacia de aminoacilación del ARNt por parte de la AARS puede ser correlacionada con la eficacia de la especificidad, o la fidelidad de incorporación del aminoácido no natural en el polipéptido o proteína diana. Esto es debido a la función de la maquinaria de síntesis de proteínas en que, una vez que un ARNt se aminoacila con un aminoácido (ya sea el aminoácido de tipo salvaje, o un aminoácido no natural), el ARNt cargado se libera de la enzima AARS y el aminoácido se incorpora en el polipéptido diana. Cuando se altera la capacidad de corrección de la AARS, la enzima permitirá que el aminoácido de sustitución cargue el ARNt y sea liberado para su incorporación en la proteína diana. Por lo tanto, la eficacia de aminoacilación por parte del AARS se correlaciona directamente con la fidelidad o especificidad de incorporación del aminoácido no natural en el polipéptido diana.
El aminoácido de sustitución (ya sea no natural o que se produzca de forma natural) se incorpora a continuación en una cadena polipeptídica en crecimiento con alta fidelidad, p. ej. una eficacia mayor que aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80 %, 90%, 95%, o mayor que aproximadamente 99% para un codón particular.
El término "complementario" se refiere a componentes de un par mutante externo, el ARNt mutante externo y la sintetasa mutante externa que pueden funcionar juntos, p. ej. la sintetasa mutante externa aminoacila el ARNt mutante externo.
La expresión "derivado de" se refiere a un componente que se aísla de un organismo, o se aísla y modifica, o se genera, p. ej., se sintetiza químicamente, utilizando información del componente del organismo.
La expresión "sistema de traducción" se refiere a los componentes necesarios para incorporar un aminoácido que se produce de forma natural o antinatural en una cadena polipeptídica en crecimiento (proteína). Por ejemplo, los componentes pueden incluir ribosomas, ARNt(s), sintetasa(s), ARNm y similares. Los componentes descritos en esta memoria pueden añadirse a un sistema de traducción, in vivo o in vitro. Un sistema de traducción in vivo puede ser una célula (célula eucariota o procariota). Un sistema de traducción in vitro puede ser un sistema exento de células tal como uno reconstituido con componentes de diferentes organismos (purificados o producidos de forma recombinante). En determinadas formas de realización, el sistema de traducción no comprende una célula. En determinadas formas de realización, el sistema de traducción no comprende una célula auxotrófica. Si el sistema de traducción no comprende una célula auxotrófica, puede comprender otra célula o componentes celulares.
La expresión "RS inactiva" se refiere a un sintetasa que ha sido mutada, de manera que ya no puede aminoacilar su ARNt afín con cualquier aminoácido, ya sea que se produce de forma natural o no natural. La expresión "RS modificada" se refiere a un sintetasa que ha sido mutada de manera que ya no puede aminoacilar su ARNt afín con el correspondiente aminoácido que se produce de forma natural, pero puede ser capaz de aminoacilar su ARNt afín con otro aminoácido, preferiblemente un aminoácido no natural.
La expresión "agente de selección" se refiere a un agente que, cuando está presente, permite una selección de determinados componentes de una población, p. ej., un antibiótico, longitud de onda de la luz, un anticuerpo, un nutriente o similares. El agente de selección se puede variar, p. ej., tal como concentración, intensidad, etc.
La expresión "marcador de selección positiva" se refiere a un marcador que cuando está presente, p. ej., expresado, activado o similares, da como resultado la identificación de un organismo con el marcador de selección positivo de los que no tienen el marcador de selección positivo.
La expresión "marcador de selección negativo" se refiere a un marcador que cuando está presente, p. ej., expresado, activado o similares, permite la identificación de un organismo que no posee la propiedad deseada (p. ej., en comparación con un organismo que sí posee la propiedad deseada).
El término "informador" se refiere a un componente que se puede utilizar para seleccionar los componentes descritos en la descripción. Por ejemplo, un informador puede incluir una proteína verde fluorescente, una proteína de luciferasa de luciérnaga, o genes tales como β-gal/lacZ (β-galactosidasa), Adh (alcohol deshidrogenasa) o similares.
La expresión "no reconocido de manera eficiente" se refiere a una eficacia, p. ej., menor que aproximadamente 10%, menor que aproximadamente 5% o menor que aproximadamente 1%, a la que una RS de un organismo aminoacila un ARNt mutante externo. En determinadas formas de realización, la RS puede ser del mismo o de un organismo diferente que el ARNt mutante externo. En algunas realizaciones, la RS ha sido modificada para
10 aminoacilar un ARNt con un aminoácido particular, preferiblemente un aminoácido no natural.
El término "eucariota" se refiere a organismos que pertenecen al dominio filogenético Eucarya, tales como animales (p. ej., mamíferos, insectos, reptiles, aves, etc.), ciliados, plantas, hongos (p. ej., levaduras, etc.), flagelados, microsporidios, protistas, etc. Adicionalmente, el término "procariota" se refiere a organismos no
15 eucariotas pertenecientes a los dominios filogenéticos Eubacteria (p. ej., Escherichia coli, Thermus thermophilus, etc.) y Archaea (p. ej., Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium tales como Haloferax volcanii y especies de Halobacterium NRC-1, A. fulgidus, P. firiosus, P. horikoshii, A. pernix, etc.).
El Código Genético, Células Huésped y los Codones Degenerados
El código genético estándar que utiliza la mayoría de las células se lista a continuación.
El Medio del Código Genético
Primero
U C A G Último
Phe
Ser Tyr Cys U
Phe
Ser Tyr Cys C
U
Leu Ser Terminación
(Ocre)
Terminación
(Ámbar)
A
Leu
Ser Terminación
(Ámbar)
Trp G
Leu
Pro His Arg U
Leu
Pro His Arg C
C
Leu Pro Gin Arg A
Leu
Pro Gin Arg G
Ile
Thr Asn Ser U
A
Ile Thr Asn Ser C
Ile
Thr Lys Arg A
Met
Thr Lys Arg G
Val
Ala Asp Gly U
G
Val Ala Asp Gly C
Val
Ala Glu Gly A
Val
Ala Glu Gly G
25 El código genético es degenerado, debido a que la maquinaria biosintética de proteínas utiliza 61 codones sentido ARNm para dirigir la polimerización con molde de los 20 monómeros de aminoácidos naturales. (Crick et al., Nature 192: 1227, 1961). Sólo dos aminoácidos, es decir, metionina y triptófano, son codificados por tripletes de ARNm únicos.
30 El código genético estándar se aplica a la mayoría, pero no a todos los casos. Se han encontrado excepciones en el ADN mitocondrial de muchos organismos y en el ADN nuclear de unos pocos organismos inferiores. Algunos ejemplos se dan en la siguiente tabla.
35 Ejemplos de códigos genéticos no estándares
Mitocondrias
Vertebrados UGC→Trp; AGA, AGG→TERMINACIÓN
Invertebrados
UGA→Trp; AGA, AGG→Ser
Levaduras
UGC→Trp; CUN→Thr
Protistas
UGA→Trp;
Núcleo
Bacterias GUG, UUG, AUU, CUG→Iniciación
Levaduras
CUG→Ser
Ciliados
UAA, UGA→Gln
* Las células vegetales utilizan el código genético estándar tanto en mitocondrias como en el núcleo.
El NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica) mantiene una lista detallada del código genético estándar, y los códigos genéticos utilizados en diversos organismos, incluido el código mitocondrial de vertebrados; el código mitocondrial de levaduras; el código genético de hongos, protozoos y celentéreos y el código de micoplasma / espiroplasma; el código mitocondrial de invertebrados; el código nuclear de ciliados, dasycladaceae y hexamita; el código mitocondrial de equinodermos y platelmintos; el código nuclear de euplótida; el código bacteriano y vegetal de plastidio; el código nuclear de la levadura alternativa; el código mitocondrial de la ascidia; el código mitocondrial alternativo de platelmintos; el código nuclear de blepharisma; el código mitocondrial de clorofíceas; el código mitocondrial de trematodos; el código mitocondrial de scenedesmus obliquus; el código mitocondrial de thraustochytrium (todos ellos incorporados en esta memoria como referencia). Estas se basan principalmente en las revisiones de Osawa et al., Microbiol. Rev. 56: 229-264, 1992, y Jukes y Osawa, Comp. Biochem. Physiol. 106B: 489-494, 1993.
Células Huésped
Algunos métodos descritos en esta memoria pueden ponerse en práctica dentro de una célula, lo que permite hacer niveles de producción de proteínas para fines prácticos. En realizaciones preferidas, las células utilizadas son células cultivables (es decir, células que pueden ser cultivadas en condiciones de laboratorio). Células adecuadas incluyen células de mamíferos (mamíferos humanos o no humanos), células bacterianas y células de insectos, etc.
Un ejemplo incluye la tecnología PFENEX™, que es una línea celular que utiliza una línea celular basada en Pseudomonas fluorescens que aumenta la expresión celular, al tiempo que mantiene determinadas características de solubilidad y actividad debido a su uso de diferentes vías en el metabolismo de determinados azúcares en comparación con E. coli.
Además, otras líneas de células huésped auxotróficas la cepa Phe auxotrófica basada en K10 (AF), las cepas auxotróficas dobles Phe/Trp (AFW), las cepas auxotróficas triples de Phe/Trp/Lys (AFWK), un auxótrofo Met (M 15MA sobre fondo M15), así como la cepa AF basada en DH10B.
Células que se pueden utilizar para practicar determinadas formas de realización descritas en esta memoria incluyen células huésped auxotróficas (ya sean procariotas o eucariotas). Células auxotróficas pueden exhibir niveles de auxotrofia sencillos, dobles, triples, cuádruples o mayores (indicando cada uno de los niveles de auxotrofia un compuesto orgánico particular de que el organismo es incapaz de sintetizar y deben ser suministrados a la célula). Determinadas formas de realización descritas en esta memoria expresamente no utilizan una célula huésped auxotrófica. En la medida en que no se utilice una célula huésped auxotrófica, se puede seguir utilizando otra célula o componentes celulares para poner en práctica determinadas formas de realización descritas en esta memoria. Otras formas de realización pueden utilizar uno, dos, tres o más células huésped auxotróficas diferentes que pueden ser de la misma o de diferentes cepas u organismos.
Las células huésped se modifican genéticamente (p. ej., se transforman, transducen o transfectan) con los vectores de esta descripción, que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una bacteria, un virus, un polinucleótido desnudo o un polinucleótido conjugado. Los vectores se introducen en células y/o microorganismos por métodos estándares, incluidos electroporación (From et al., PNAS USA 82, 5824 (1985)), Infección por vectores virales, penetración balística de alta velocidad por partículas pequeñas con el ácido nucleico ya sea dentro de la matriz de pequeñas perlas o partículas, o sobre la superficie (Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987)). Berger, Sambrook y Ausubel proporcionan una diversidad de métodos de transformación apropiados.
Las células huésped modificadas pueden cultivarse en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para actividades tales como, por ejemplo, etapas de rastreo, activación de promotores o selección de transformantes. Estas células pueden opcionalmente cultivarse en organismos transgénicos.
Determinadas formas de realización descritas en esta memoria incluyen, además, métodos de rastreo de AARSs modificadas y/o ARNts modificados. Por ejemplo, en una forma de realización, un banco de PheRS de levaduras se somete a rastreo por doble tamiz para detectar altos niveles de incorporación de un aminoácido no natural o la
incorporación errónea de aminoácidos naturales distintos de Phe dará lugar a un serio plegamiento erróneo o a un despliegue de GFP. Las células del banco de PheRS de levaduras son así sometidas a un rastreo de alto rendimiento basado en el análisis por citometría de flujo (FACS). En primer lugar, las células del banco de PheRS de levadura se expresan en presencia de células 2NaI y de baja fluorescencia, indicando una mayor incorporación de cualquiera de 2NaI u otros aminoácidos naturales son recogidos por FACS. A continuación, las células del banco de PheRS de levaduras se expresan sin 2NaI. Las células brillantes se recogen a fin de eliminar variantes de PheRS de levaduras que puedan incorporar erróneamente otros aminoácidos naturales. En una forma de realización ilustrativa, dos ciclos de cribado produjeron una PheRS de levadura mutante con mutaciones en N412G, S418C, T415G y S437F, que tenían una baja fluorescencia en presencia de 2NaI y una alta fluorescencia en ausencia de 2NaI. Esta técnica permite la incorporación de 2NaI en el codón UUU, aumentando hasta alrededor de 90%.
Otras referencias útiles, p. ej., para el aislamiento y cultivo de células (p. ej., para el subsiguiente aislamiento de ácidos nucleicos) incluyen Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edición, Wiley-Liss, Nueva York y las referencias citadas en la misma; Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. Nueva York, N.Y.; Gamborg y Phillips (comps.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg Nueva York) y Atlas y Parks (comps.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FIa.
Están disponibles varios métodos bien conocidos para introducir ácidos nucleicos diana en células bacterianas, cualquiera de los cuales puede ser utilizado en determinadas formas de realización descritas en esta memoria.Éstos incluyen: la fusión de las células receptoras con protoplastos bacterianos que contienen el ADN, electroporación, bombardeo de proyectiles y la infección con vectores virales, etc. Las células bacterianas se pueden utilizar para amplificar el número de plásmidos que contienen construcciones de ADN de determinadas formas de realización descritas en esta memoria. Las bacterias se cultivan hasta la fase logarítmica y los plásmidos dentro de las bacterias se pueden aislar por una diversidad de métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook). Además, está comercialmente disponible una plétora de kits para la purificación de plásmidos a partir de bacterias, (véase, p. ej., EASYPREP™, FLEXIPREP™, ambos de Pharmacia Biotech; STRATACLEAN™, de Stratagene; y, QIAPREP™ de Qiagen). Los plásmidos aislados y purificados se manipulan luego adicionalmente para producir otros plásmidos, utilizados para transfectar células o se incorporan en vectores relacionados para infectar organismos.
Vectores típicos contienen terminadores de la transcripción y traducción, secuencias de iniciación de la transcripción y traducción, y promotores útiles para la regulación de la expresión del ácido nucleico diana particular. Los vectores comprenden, opcionalmente, casetes de expresión genéricas que contienen al menos una secuencia de terminador independiente, secuencias que permiten la replicación de la casete en eucariotas o procariotas, o en ambos, (p. ej., vectores lanzadera) y marcadores de selección tanto para sistemas procariotas como eucariotas. Los vectores son adecuados para la replicación e integración en procariotas, eucariotas o preferiblemente en ambos. Véase Giliman y Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al., Nature, 328: 731 (1987); Schneider, B., et al., Protein Expr. Purif. 6435:10 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (todos supra). Se proporciona un catálogo de Bacterias y Bacteriófagos útiles para la clonación, p. ej., por la ATCC, p. ej., The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna et al. (comps.) publicado por la ATCC. Procedimientos básicos adicionales para la secuenciación, la clonación y otros aspectos de la biología molecular y consideraciones teóricas subyacentes también se encuentran en Watson et al. (1992) Recombinant DNA 2ª Edición Scientific American Books, NY.
Selección de Codones Degenerados
Tal como se describió anteriormente, todos los aminoácidos, con la excepción de metionina y triptófano, son codificados por más de un codón. De acuerdo con algunos métodos descritos en esta memoria, un codón en el genoma que se utiliza normalmente para codificar un aminoácido natural se reprograma, en parte por la maquinaria transcripcional o de traducción en lugar de codificar un análogo de aminoácido. Un análogo de aminoácido puede ser un análogo de aminoácido que se produce de forma natural o canónico. En una forma de realización preferida, el análogo de aminoácido no es un aminoácido codificado canónicamente.
La estabilidad termodinámica de un par codón-anticodón se puede predecir o determinar experimentalmente. De acuerdo con algunas realizaciones, es preferible que el ARNt mutante externo interactúe con el codón degenerado con una afinidad (a 37ºC) de al menos aproximadamente 1,0 kcal/mol más intensamente, incluso más preferiblemente 1,5 kcal/mol más intensamente, e incluso más preferiblemente más de 2,0 kcal/mol más intensamente que un ARNt natural en la célula que reconocería la misma secuencia. Estos valores son conocidos para un experto en la técnica y se pueden determinar mediante experimentos de desnaturalización térmica (véase,
p. ej., Meroueh y Chow, Nucleic Acids Res. 27: 1118, 1999).
La siguiente Tabla lista algunas de las secuencias anti-codón conocidos para E. coli. En general, para cualquier organismo, la secuencia de anticodón de ARNt se puede determinar de forma rutinaria utilizando tecnologías reconocidas en la técnica. Por ejemplo, cualquier gen ARNt puede ser amplificado, por ejemplo, mediante PCR. La
5 secuenciación se puede realizar para determinar las secuencias exactas del bucle anti-codón. Alternativamente, el ensayo de unión bioquímico se puede utilizar para determinar la afinidad de unión de un ARNt purificado a uno de los 2-6 posibles codones. El codón que se une al ARNt con la mayor especificidad / afinidad tiene, presumiblemente, un apareamiento de Watson-Crick puro en las tres posiciones del codón, determinando así la secuencia del bucle anti-codón.
En general, la base de bamboleo en el bucle de anti-codón tiende a ser G o U (en lugar de A o C).
Los Codones Degenerados para E. coli
Cuando un ARNt sencillo reconoce un codón a través de una interacción complementaria perfecta entre el
anticodón del ARNt y un codón, se denomina apareamiento de bases de Watson-Crick. Cuando un ARNt sencillo
reconoce un segundo codón degenerado, se denomina un apareamiento de base por bamboleo u otro
5 apareamiento de bases no estándar. En determinadas formas de realización descritas en esta memoria, un nuevo
ARNt puede ser construido con una secuencia de anticodón que sea perfectamente complementaria a un codón
degenerado o a un codón para un aminoácido no natural, utilizando así el apareamiento de bases por bamboleo o
de Watson-Crick. Del mismo modo, se puede construir una nueva AARS que utiliza un aminoácido de sustitución
(que no sea de tipo salvaje -puede ser otro aminoácido que se produzca de forma natural o un aminoácido no 10 natural) para aminoacilar el ARNt correspondiente. Esto puede ser además de o en lugar de modificar una
molécula de ARNt para la incorporación de un aminoácido de sustitución.
La AARS modificada se puede alterar de manera que la eficacia de unión al aminoácido no natural, u otro
aminoácido que se produce de forma natural seleccionado, es mayor que la eficacia de unión de la AARS 15 modificada para el aminoácido que se produce de forma natural correspondiente. De esta manera, una AARS
modificada puede unirse preferiblemente a un aminoácido no natural con el fin de cargar un ARNt, incluso en
presencia del aminoácido que se produce de forma natural que corresponde a la AARS en su estado no
modificado. Esta "reprogramación" de una aminoacil ARNt sintetasa permite la incorporación de un aminoácido no
natural en un polipéptido con niveles más bajos de incorporación errónea de otros aminoácidos en el sitio deseado. 20
La "reprogramación" adicional puede permitir el uso de la sintetasa modificada o mutante externa con altos niveles de incorporación en células huésped estándares, sin la necesidad de células huésped auxotróficas, y con o sin agotar los medios del aminoácido que se produce de forma natural correspondiente. Por lo tanto, mientras que determinadas formas de realización descritas en esta memoria pueden ponerse en práctica utilizando una célula huésped auxotrófica, determinadas otras formas de realización pueden ponerse en práctica sin utilizar una célula huésped auxotrófica. En el caso de no utilizar una célula huésped auxotrófica para poner en práctica determinadas formas de realización, se puede utilizar otra célula huésped, se pueden utilizar componentes, o se puede utilizar un sistema totalmente exento de células.
Cuando la célula tiene múltiples moléculas de ARNt para un aminoácido particular, y un ARNt tiene una secuencia de anticodón que es perfectamente complementaria a la del codón degenerado seleccionado, el gen que codifica el ARNt puede ser desactivado a través de cualquier medio disponible para un experto en la técnica, que incluye, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o deleción del gen o de la secuencia promotora del gen. La expresión del gen también se puede desactivar a través de cualesquiera técnicas de interferencia antisentido o de ARN.
Aminoácidos Antinaturales o No naturales
La primera etapa en el proceso de ingeniería de proteínas es habitualmente seleccionar un conjunto de aminoácidos antinaturales o no naturales que tienen las propiedades químicas deseadas. La selección de los aminoácidos no naturales depende de las propiedades químicas predeterminadas que a uno le gustaría tener, y las modificaciones que a uno le gustaría hacer en la proteína diana. Los aminoácidos antinaturales, una vez seleccionados, se pueden adquirir de vendedores, o se pueden sintetizar químicamente.
En los métodos descritos en esta memoria se puede utilizar una amplia diversidad de aminoácidos antinaturales o no naturales. El aminoácido antinatural se puede seleccionar en base a las características deseadas del aminoácido antinatural, p. ej., la función del aminoácido antinatural tal como modificar las propiedades biológicas de la proteína tales como toxicidad, biodistribución, inmunogenicidad, o semi-vida, propiedades estructurales, propiedades espectroscópicas, propiedades químicas y/o fotoquímicas, propiedades catalíticas, capacidad para reaccionar con otras moléculas (ya sea de forma covalente o no covalente), o similares.
Tal como se utiliza en esta memoria, un "aminoácido antinatural" se refiere a cualquier aminoácido, aminoácido modificado o análogo de aminoácido diferente de selenocisteína y los siguientes veinte alfa-aminoácidos genéticamente codificados: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina,
Fórmula I
Un aminoácido antinatural es típicamente cualquier estructura que tenga la Fórmula I, en donde el grupo R es cualquier sustituyente distinto del utilizado en los veinte aminoácidos naturales. Véase, p. ej., cualquier texto de bioquímica tal como Biochemistry por L. Stryer, 3ª ed. 1988, Freeman and Company, Nueva York, para las estructuras de los veinte aminoácidos naturales. Obsérvese que los aminoácidos antinaturales descritos en esta memoria pueden ser compuestos que se producen de forma natural distintos de los veinte alfa-aminoácidos anteriores. Debido a que los aminoácidos antinaturales descritos en esta memoria difieren típicamente de los aminoácidos naturales solamente en la cadena lateral, los aminoácidos antinaturales forman enlaces amida con otros aminoácidos, p. ej., naturales o antinaturales, de la misma manera en que se forman en proteínas que se producen de forma natural. Sin embargo, los aminoácidos antinaturales tienen grupos de cadena lateral que los distinguen de los aminoácidos naturales. Por ejemplo, R en la Fórmula I comprende opcionalmente un, grupo alquilo, arilo, haluro de arilo, haluro de vinilo, haluro de alquilo, acetilo, cetona, aziridina, nitrilo, nitro, haluro, acilo, ceto, azido, hidroxilo, hidrazina , ciano, halo, hidrazida, alquenilo, alquinilo, éter, tioéter, epóxido, sulfona, ácido borónico, éster boronato, borano, ácido fenilborónico, tiol, seleno, sulfonilo, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, piridilo, naftilo, benzofenona, un anillo restringido tal como una ciclo-octina, tioéster, enona, imina, aldehído, éster, tioácido, hidroxilamina, amino, ácido carboxílico, ácido alfa-cetocarboxílico, ácidos alfa o beta-insaturados y amidas, glioxil-amida, o grupo organosilano, o similares, o cualquier combinación de los mismos.
Sustituciones arilo pueden aparecer en diversas posiciones, p. ej., orto, meta, para, y con uno o más grupos funcionales colocados en el anillo de arilo. Otros aminoácidos antinaturales de interés incluyen, pero no se limitan a aminoácidos que comprenden un reticulante fotoactivable, aminoácidos spin-marcados, aminoácidos marcados con colorante, aminoácidos fluorescentes, aminoácidos de unión a metales, aminoácidos que contienen metales, aminoácidos radiactivos, aminoácidos con nuevos grupos funcionales, aminoácidos con hidrofilicidad, hidrofobocidad, polaridad o capacidad de enlace de hidrógeno alterada, aminoácidos que interactúan de forma covalente o no covalente con otras moléculas, aminoácidos foto-enjaulados o fotoisomerizables, aminoácidos que comprenden biotina o un análogo de biotina, aminoácidos glicosilados tales como una serina sustituida con azúcar, otros aminoácidos modificados con hidratos de carbono, aminoácidos que contienen ceto, aminoácidos que comprenden polietilenglicol o un poliéter, un polialcohol o un polisacárido, aminoácidos que puede sufrir metátesis, aminoácidos que pueden sufrir cicloadiciones, aminoácidos sustituidos con átomos pesados, aminoácidos químicamente escindibles y/o fotoescindibles, aminoácidos con cadenas laterales alargadas en comparación con aminoácidos naturales, p. ej., poliéteres o hidrocarburos de cadena larga, p. ej., más de aproximadamente 5 o más de aproximadamente 10 átomos de carbono, aminoácidos que contienen azúcar enlazado a carbono, aminoácidos con actividad redox, aminoácidos que contienen aminotioácido, aminoácidos que contienen un resto de fármaco y aminoácidos que comprenden uno o más restos tóxicos.
Además de aminoácidos antinaturales que contienen nuevas cadenas laterales, los aminoácidos antinaturales también comprenden opcionalmente estructuras de cadena principal modificadas, p. ej., como se ilustra por las estructuras de las Fórmulas II y III:
Fórmula II Fórmula III
en donde Z comprende típicamente OH, NH2, SH, NH2O-, NH-R’, R’NH-, R’S-o S-R'-; X e Y, que pueden ser iguales o diferentes, comprenden típicamente S, N u O, y R y R’, que son opcionalmente iguales o diferentes, se seleccionan típicamente de la misma lista de constituyentes para el grupo R descrito anteriormente para los aminoácidos antinaturales que tienen la Fórmula I así como hidrógeno o (CH2)x o las cadenas laterales de aminoácidos naturales. Por ejemplo, los aminoácidos antinaturales descritos en esta memoria comprenden opcionalmente sustituciones en el grupo amino o carboxilo tal como se ilustra por las Fórmulas II y III. Aminoácidos antinaturales de este tipo incluyen, pero no se limitan a α-hidroxiácidos, α-aminotiocarboxilatos de αtioácidos, o aminoácidos α-α-disustituidos, con cadenas laterales correspondientes, p. ej., a los veinte aminoácidos naturales o a cadenas laterales antinaturales. También incluyen pero no se limitan a β-aminoácidos o γaminoácidos, tales como β-alanina sustituida y ácido γ-aminobutírico. Además, sustituciones o modificaciones en el carbono α incluyen, opcionalmente, L o D isómeros tales como D-glutamato, D-alanina, D-metil-O-tirosina, ácido aminobutírico, y similares. Otras alternativas estructurales incluyen aminoácidos cíclicos tales como análogos de prolina, así como análogos de prolina de anillos de 3, 4, 6, 7, 8 y 9 miembros. Algunos aminoácidos no naturales tales como haluros de arilo (p-bromo-fenilalanina, p-yodofenilalanina) proporcionan reacciones de acoplamiento cruzado catalizadas por paladio versátil con reacciones de etino o acetileno que permiten la formación de enlaces carbono-carbono, carbono-nitrógeno y carbono-oxígeno entre haluros de arilo y una amplia diversidad de participantes en el acoplamiento.
Por ejemplo, muchos aminoácidos antinaturales se basan en aminoácidos naturales, tales como tirosina, glutamina, fenilalanina y similares. Análogos de tirosina incluyen tirosinas para-sustituidas, tirosinas ortosustituidas y tirosinas meta-sustituidas, en donde la tirosina sustituida comprende un grupo acetilo, un grupo benzoílo, un grupo amino, una hidrazina, una hidroxiamina, un grupo tiol, un grupo carboxi, un grupo isopropilo, un grupo metilo, un hidrocarburo C6-C20 de cadena lineal o ramificado o, un hidrocarburo saturado o insaturado, un grupo O-metilo, un grupo poliéter, un grupo nitro, o similares. Además, también se contemplan anillos de arilo polisustituidos. Análogos de glutamina incluyen, pero no se limitan a, derivados α-hidroxi, derivados β-sustituidos, derivados cíclicos y derivados de glutamina sustituidos con amida. Análogos de fenilalanina ilustrativos incluyen, pero no se limitan a fenilalaninas meta-sustituidas, en donde el sustituyente comprende un grupo hidroxi, un grupo metoxi, un grupo metilo, un grupo alilo, un grupo acetilo, o similares.
Ejemplos específicos de aminoácidos antinaturales incluyen, pero no se limitan a formas o, m y/o p de aminoácidos o análogos de aminoácidos (aminoácidos no naturales), incluidos homoalilglicina, cis-o transcrotilglicina, ácido 6,6,6-trifluoro-2-aminohexanoico, ácido 2-aminoheptanoico, norvalina, norleucina, O-metil-L
tirosina, o-, m-o p-metil-fenilalanina, 4-O-alil-L-tirosina, una 4-propil-L-tirosina, una tri-O-acetil-GlcNAcβ-serina, una L-Dopa, una fenilalanina fluorada, una isopropil-L-fenilalanina, una p-azidofenilalanina, una p-acil-Lfenilalanina, una p-benzoil-L-fenilalanina, una L-fosfoserina, una fosfonoserina, una fosfonotiirosina, una p-yodofenilalanina, o-, m-o p-bromofenilalanina, 2-, 3-ó 4-piridilalanina, p-yodofenilalanina, ácido diaminobutírico, ácido aminobutírico, benzofuranilalanina, 3-bromo-tirosina, 3-(6-cloroindolil)alanina, 3-(6-bromoindolil)alanina, 3-(5bromonindolil)alanina, p-clorofenilalanina, p-etinil-fenilalanina, p-propargil-oxi-fenilalanina, m-etinil-fenilalanina, 6etinil-triptófano, 5-etinil-triptófano, ácido (R)-2-amino-3-(4-etinil-1H-pirol-3-il)propanoico, azidonorleucina, azidohomoalanina, p-acetilfenilalanina, p-amino-L-fenilalanina, homopropargilglicina, p-etil-fenilalanina, p-etinilfenilalanina, p-propargil-oxi-fenilalanina, isopropil-L-fenilalanina, una 3-(2-naftil)alanina, 3-(1-naftil)alanina, 3-idiotirosina, O-propargil-tirosina, homoglutamina, una O-4-alil-L-tirosina, una 4-propil-L-tirosina, una 3-nitro-L-tirosina, una tri-O-acetil-GlcNAcβ-serina, una L-Dopa, una fenilalanina fluorada, una isopropil-L-fenilalanina, una p-azido-Lfenilalanina, una p-acil-L-fenilalanina, una p-acetil-L-fenilalanina, una m-acetil-L-fenilalanina, selenometionina, telurometionina, selenocisteína, una alquino-fenilalanina, una O-alil-L-tirosina, una O-(2-propinil)-L-tirosina, una petiltiocarbonil-L-fenilalanina, una p-(3-oxobutanoil)-L-fenilalanina, una p-benzoil-L-fenilalanina, una L-fosfoserina, una fosfonoserina, una fosfonotirosina, homopropargilglicina, azidohomoalanina, una p-yodo-fenilalanina, una pbromo-L-fenilalanina, dihidroxi-fenilalanina, dihidroxil-L-fenilalanina, una p-nitro-L-fenilalanina, una m-metoxi-Lfenilalanina, una p-yodo-fenilalanina, una p-bromofenilalanina, una p-amino-L-fenilalanina y una isopropil-Lfenilalanina, trifluoroleucina, norleucina, 4-, 5-ó 6-fluoro triptófano, 4-aminotriptófano, 5-hidroxitriptófano, biocitina, ácido amino-oxiacético, m-hidroxifenilalanina, m-alilfenilalanina, grupo m-metoxifenilalanina, β-GlcNAc-serina, αGalNAc-treonina, p-acetoacetilfenilalanina, para-halo-fenilalanina, seleno-metionina, etionina, S-nitrosohomocisteína, tia-prolina, 3-tienil-alanina, homo-alil-glicina, trifluoroisoleucina, ácido trans-y cis-2-amino-4hexenoico, 2-butinil-glicina, alil-glicina, para-azido-fenilalanina, para-ciano-fenilalanina, para-etinil-fenilalanina, hexafluoroleucina, 1,2,4-triazol-3-alanina, 2-fluoro-histidina, L-metil-histidina, 3-metil-L-histidina, β-2-tienil-Lalanina, β-(2-tiazolil)-DL-alanina, homopropargilglicina (HPG) y azidohomoalanina (AHA) y similares. Las estructuras de una diversidad de aminoácidos antinaturales no limitantes se proporcionan en las figuras, p. ej., las FIGs. 29, 30 y 31 del documento US 2003/0108885 A1, cuyo contenido completo se incorpora aquí como referencia.
Análogos de tirosina incluyen tirosinas para-sustituidas, tirosinas orto-sustituidas y tirosinas meta-sustituidas, en donde la tirosina sustituida comprende un grupo acetilo, un grupo benzoilo, un grupo amino, una hidrazina, una hidroxiamina, un grupo tiol, un grupo carboxi, un grupo isopropilo, un grupo metilo, un hidrocarburo C6-C20 de cadena lineal o ramificado, un hidrocarburo saturado o insaturado, un grupo O-metilo, un grupo poliéter, un grupo nitro, o similares. Además, también se contemplan anillos arilo polisustituidos. Análogos de glutamina de la invención incluyen, pero no se limitan a derivados α-hidroxi, derivados β-sustituidos, derivados cíclicos y derivados de glutamina sustituidos con amida. Análogos de fenilalanina ilustrativos incluyen, pero no se limitan a fenilalaninas meta-sustituidas, en donde el sustituyente comprende un grupo hidroxi, un grupo metoxi, un grupo metilo, un grupo alilo, un grupo acetilo, o similares.
Adicionalmente, otros ejemplos incluyen opcionalmente (pero no se limitan a) un análogo antinatural de un aminoácido tirosina; un análogo antinatural de un aminoácido glutamina; un análogo antinatural de un aminoácido fenilalanina; un análogo antinatural de un aminoácido serina; un análogo antinatural de un aminoácido treonina; un aminoácido sustituido con alquilo, arilo, acilo, azido, ciano, halo, hidrazina, hidrazida, hidroxilo, alquenilo, alquinilo, éter, tiol, sulfonilo, seleno, éster, tioácido, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterociclo, enona, imina, aldehído, hidroxilamina, ceto o amino, o cualquier combinación de los mismos; un aminoácido con un reticulante fotoactivable; un aminoácido spin-marcado; un aminoácido fluorescente; un aminoácido con un nuevo grupo funcional; un aminoácido que interactúa de forma covalente o no covalente con otra molécula; un aminoácido de unión a metales; un aminoácido que contiene metales; un aminoácido radiactivo; un aminoácido foto-enjaulado; un aminoácido fotoisomerizable; un aminoácido que contiene biotina o un análogo de biotina; un aminoácido glicosilado o modificado con hidratos de carbono; un aminoácido que contiene ceto; un aminoácido que comprende polietilenglicol; un aminoácido que comprende poliéter; un aminoácido sustituido con átomos pesados; un aminoácido químicamente escindible o fotoescindible; un aminoácido con una cadena lateral alargada; un aminoácido que contiene un grupo tóxico; un aminoácido sustituido con azúcar, p. ej., una serina sustituida con azúcar o similares; un aminoácido que contiene azúcar enlazado a carbono; un aminoácido redoxactivo; un ácido que contiene α-hidroxi; un aminoácido que contiene un amino-tio-ácido; un aminoácido α,αdisustituido; un β-aminoácido; y un aminoácido cíclico.
Típicamente, los aminoácidos antinaturales utilizados en esta memoria para determinadas formas de realización se pueden seleccionar o diseñar para proporcionar características adicionales no disponibles en los veinte aminoácidos naturales. Por ejemplo, los aminoácidos antinaturales están opcionalmente diseñados o se seleccionan para modificar las propiedades biológicas de una proteína, p. ej., en la que están incorporados. Por ejemplo, las siguientes propiedades se modifican opcionalmente mediante la inclusión de un aminoácido antinatural en una proteína: toxicidad, biodistribución, solubilidad, estabilidad, p. ej., térmica, hidrolítica, oxidativa,
resistencia a la degradación enzimática, y similares, facilidad de purificación y tratamiento, propiedades estructurales, propiedades espectroscópicas, propiedades químicas y/o fotoquímicas, actividad catalítica, potencial redox, semi-vida, capacidad de reaccionar con otras moléculas, p. ej., de forma covalente o no covalente, y similares.
Otros ejemplos de análogos de aminoácidos incluyen opcionalmente (pero no se limitan a) un análogo antinatural de un aminoácido tirosina; un análogo antinatural de un aminoácido glutamina; un análogo antinatural de un aminoácido fenilalanina; un análogo antinatural de un aminoácido serina; un análogo antinatural de un aminoácido treonina; un grupo alquilo, arilo, acilo, azido, ciano, halo, hidrazina, hidrazida, hidroxilo, alquenilo, alquinilo, éter, tiol, sulfonilo, seleno, éster, tioácido, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, enona, imina, aldehído, hidroxilamina, ceto o aminoácido amino-sustituido, o cualquier combinación de los mismos; un aminoácido con un reticulante fotoactivable; un aminoácido spin-marcado; un aminoácido fluorescente; un aminoácido con un nuevo grupo funcional; un aminoácido que interactúa de forma covalente o no covalente con otra molécula; un aminoácido de unión a metales; un aminoácido que contiene metales; un aminoácido radiactivo; un aminoácido foto-enjaulado; un aminoácido fotoisomerizable; un aminoácido que contiene biotina o un análogo de biotina; un aminoácido glicosilado o modificado con hidratos de carbono; un aminoácido que contiene ceto; un aminoácido que comprende polietilenglicol; un aminoácido que comprende poliéter; un aminoácido sustituido con átomos pesados; un aminoácido químicamente escindible o fotoescindible; un aminoácido con una cadena lateral alargada; un aminoácido que contiene un grupo tóxico; un aminoácido sustituido con azúcar, p. ej., una serina sustituida con azúcar o similares; un aminoácido que contiene azúcar enlazado a carbono; un aminoácido redoxactivo; un ácido que contiene α-hidroxi; un aminoácido que contiene un amino-tio-ácido; un aminoácido α,αdisustituido; un β-aminoácido; y un aminoácido cíclico.
Aminoacil-ARNt sintetasas
La aminoacil-ARNt sintetasa (se utiliza de forma indistinta en este documento con AARS, RS o "sintetasa") utilizada en determinados métodos descritos en esta memoria puede ser una sintetasa que se produce de forma natural derivada de un organismo, ya sea la misma (homóloga) o diferente (heteróloga), una sintetasa mutada o modificada, o una sintetasa diseñada.
La sintetasa utilizada puede reconocer el análogo de aminoácido (antinatural) deseado selectivamente de aminoácidos disponibles relacionados. Por ejemplo, cuando el análogo de aminoácido a utilizar está estructuralmente relacionado con un aminoácido que se produce de forma natural, la sintetasa debería cargar la molécula de ARNt mutante externa con el análogo de aminoácido deseado con una eficacia al menos sustancialmente equivalente a la de, y más preferiblemente al menos aproximadamente dos veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o más que la del aminoácido que se produce de forma natural. Sin embargo, en los casos en los que no es necesario un producto de proteína bien definido, la sintetasa puede tener una especificidad relajada para cargar los aminoácidos. En una forma de realización de este tipo, se podría producir una mezcla de ARNts mutantes externos, con diversos aminoácidos o análogos.
En determinadas formas de realización, es preferible que la sintetasa tenga actividad tanto para el análogo de aminoácido como para el aminoácido que es codificado por el codón correspondiente de la molécula de ARNt.
Una sintetasa se puede conseguir por una diversidad de técnicas conocidas para un experto en la técnica, incluidas combinaciones de técnicas tales como, por ejemplo, métodos computacionales, métodos de selección y la incorporación de sintetasas de otros organismos (véase más adelante).
En determinadas formas de realización, sintetasas se pueden utilizar o desarrollar para que carguen eficazmente moléculas de ARNt que no están cargadas por sintetasas de la célula huésped. Por ejemplo, generalmente pares adecuados se pueden desarrollar a través de la modificación de sintetasas a partir de organismos distintos de la célula huésped. En determinadas formas de realización, la sintetasa puede ser desarrollada por procesos de selección. En determinadas formas de realización, la sintetasa puede ser diseñado utilizando técnicas computacionales tales como las descritas en Datta et al., J. Am. Chem. Soc. 124: 5652-5653, 2002, y en la Patente de EE.UU. Nº 7.139.665, incorporada aquí como referencia.
Diseño Computacional de AARS
Específicamente, en una forma de realización, el presente método depende, en parte, del diseño y la ingeniería de AARS naturales para una forma modificada que tiene especificidad de sustrato relajado, de manera que puede absorber análogos de aminoácidos no canónicos como sustrato, y cargar un ARNt modificado (con su anticodón cambiado) con un aminoácido no canónico de este tipo. Las siguientes secciones describen brevemente un método para la generación de tales AARS modificadas, método que se describe con mayor detalle en la Patente de
EE.UU. Nº 7.139.665, cuyos contenidos completos se incorporan aquí como referencia.
Brevemente, los métodos de algunas formas de realización descritos en ese documento se refieren a herramientas computacionales para modificar la especificidad de sustrato de una aminoacil ARNt sintetasa (AARSs) a través de la mutación para permitir que la enzima utilice de manera más eficaz un análogo o análogos de aminoácidos en los sistemas de traducción de proteínas, ya sea in vitro, en células enteras, o en otros sistemas de traducción. Una característica de algunas formas de realización incluye rediseñar sistemáticamente el sitio de unión al sustrato de una enzima AARS para facilitar el uso de sustratos antinaturales en la reacción de traducción de péptidos o proteínas que cataliza la enzima.
De acuerdo con un método, se construye un banco de rotámeros para el aminoácido artificial variando sus ángulos de torsión para crear rotámeros que encajarían en el bolsillo de unión para el sustrato natural. La orientación geométrica de la cadena principal del análogo de aminoácido se especifica por la orientación cristalográfica de la cadena principal del sustrato natural en la estructura cristalina. Se puede utilizar la estructura cristalográfica de la aminoácido sintetasa específica para el organismo, o se puede utilizar una estructura homóloga de otro organismo, dependiendo de la semejanza estructural. A los aminoácidos en el bolsillo de unión de la sintetasa que interactúan con la cadena lateral en el análogo se les permite variar en la identidad y la conformación de rotámeros en los subsiguientes cálculos de diseño de proteínas.
Uno de estos protocolos también emplea un método computacional para potenciar las interacciones entre el sustrato y las posiciones de las proteínas. Esto se hace mediante la ampliación de las energías por pares entre el sustrato y los aminoácidos permitidos en las posiciones de diseño a la proteína en los cálculos de energía. En un cálculo de optimización en que se amplían las interacciones proteína-sustrato en comparación con las interacciones entre proteínas, la secuencia de selección se desvía hacia la selección de aquellos aminoácidos que tienen una interacción favorable con el sustrato.
El método descrito ayudó a construir una nueva forma modificada de la fenilalanil-ARNt sintetasa de E. coli, basado en la estructura conocida de la PheRS de Thermus thermophilus relacionada (tPheRS). La nueva forma modificada de la fenilalanil-ARNt sintetasa de E. coli (ePheRS) permite una incorporación eficaz in vivo de la funcionalidad reactiva de aril-cetona en proteínas recombinantes. Además, una triptofanil-ARNt sintetasa modificada se modificó de una manera similar y ha demostrado tener la capacidad de incorporar análogos de aminoácidos no naturales en polipéptidos en lugar de triptófano que se produce de forma natural. Los resultados descritos en ese documento también demuestran el poder general del diseño de proteínas computacional en el desarrollo de aminoacil-ARNt sintetasas para la activación y carga de aminoácidos no naturales.
A. Secuencia e Información Estructural Disponibles para ARNt sintetasas
La traducción de proteínas a partir de un molde de ARNm se lleva a cabo por parte de los ribosomas. Durante el proceso de traducción; cada uno de los ARNt se empareja con su aminoácido mucho antes de que llegue al ribosoma. El emparejamiento se realiza mediante una colección de enzimas conocidas como las aminoacil-ARNt sintetasas (AARS). Estas enzimas cargan cada uno de los ARNt con el aminoácido apropiado, permitiendo así que cada uno de los ARNt haga la traducción apropiada del código genético de ADN (y el ARNm transcrito a partir del ADN) en el código de aminoácidos de las proteínas.
La mayoría de las células producen veinte aminoacil-ARNt sintetasas diferentes, una para cada uno de los tipos de aminoácido. Estos veinte enzimas están optimizadas en cada caso para funcionar con su propio aminoácido particular y el conjunto de moléculas de ARNt apropiadas para ese aminoácido. Las aminoacil-ARNt sintetasas deben realizar sus tareas con una alta precisión. Muchas de estas enzimas reconocen sus moléculas de ARNt utilizando el anticodón. Estas enzimas producen alrededor de un error en 10.000. Para la mayoría de los aminoácidos, este nivel de precisión no es demasiado difícil de conseguir, ya que la mayoría de los aminoácidos son bastante diferentes uno de otro.
En el presente método, una descripción precisa del bolsillo de unión de AARS para ARNt es importante para la estrategia de diseño computacional, ya que depende de la estructura cristalina para las descripciones de la cadena principal de la proteína, aunque en muchos casos es perfectamente aceptable utilizar la estructura cristalina de un proteína homóloga (por ejemplo, un homólogo de una especie relacionada) o incluso un dominio conservado para sustituir la descripción de la estructura cristalográfica del bolsillo de unión. La estructura cristalina también define la orientación del sustrato de aminoácido natural en el bolsillo de unión de un sintetasa, así como la posición relativa del sustrato de aminoácido a los residuos sintetasa, especialmente aquellos residuos en y alrededor del bolsillo de unión. Para diseñar el bolsillo de unión para los análogos, se prefiere que estos análogos se unan a la sintetasa en la misma orientación que el sustrato de aminoácido natural, ya que esta orientación puede ser importante para la etapa de adenilación.
Las AARSs pueden ser de cualquier organismo, incluyendo procariotas y eucariotas, siendo posibles las enzimas de bacterias, hongos, extremeófilos tales como las arqueobacterias, gusanos, insectos, peces, anfibios, aves, animales (particularmente mamíferos y especialmente seres humanos) y plantas.
Tal como se describió anteriormente, la mayoría de las células producen veinte diferentes aminoacil-ARNt sintetasas, una para cada uno de los tipos de aminoácido. Algunos sintetasas adecuadas son conocidas, incluidas: la fenilalanil-ARNt sintetasa de levadura (Kwon et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 7.512-7513, 2003); la tirosil-ARNt sintetasa de Methonococcus jannaschii (Wang et al., Science 292, 498-500, 2001); y la tirosil-ARNt-sintetasa de levadura (Ohno et al., J. Biochem. 130, 417-423, 2001). De hecho, las estructuras cristalinas de casi todos las 20 diferentes enzimas AARS están actualmente disponibles en el Brookhaven Protein Data Bank (PDB, véase Bernstein et al., J. Mol. Biol. 112: 535-542, 1977). Una lista de todas las AARSs con estructuras cristalinas está disponible a partir de abril de 2001 en la página web de PDB. Por ejemplo, la estructura cristalina de la fenilalanil-ARNt sintetasa de Thermus Aquaticus complejada con fenilalanina tiene una resolución de 2,7 A, y su PDB ID es 1B70.
La base de datos de estructura o la base de datos Molecular Modeling DataBase (MMDB) contiene datos experimentales de determinaciones de la estructura cristalográficas y de RMN. Los datos para MMDB se obtienen del banco de datos Protein Data Bank (PDB). El NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica) ha cruzado datos estructurales con la información bibliográfica, a las bases de datos de secuencias, y para la taxonomía de NCBI. Cn3D, el visor de estructura 3D de NCBI, se puede utilizar para una visualización interactiva fácil de las estructuras moleculares de Entrez.
La base de datos Entrez Dominios 3D contiene dominios de la proteína a partir de la base de datos de dominio conservado (CDD) de NCBI. Los biólogos computacionales definen dominios conservados sobre la base de patrones o motivos de secuencias recurrentes. La CDD contiene actualmente dominios derivados de dos colecciones populares, Smart y Pfam, además de las contribuciones de colegas en la NCBI, tal como COG. Las bases de datos fuente también proporcionan descripciones y enlaces a las citas. Dado que los dominios conservados corresponden a compactar unidades estructurales, CDs contienen enlaces a la estructura 3D a través Cn3D siempre que sea posible.
Para identificar dominios conservados en una secuencia de proteínas, el servicio CD-Search emplea el algoritmo BLAST específico para la posición inversa. La secuencia de consulta se compara con una matriz de puntuación específica para la posición, preparada a partir de la alineación subyacente del dominio conservado. Las solicitudes pueden mostrarse como una alineación por pares de la secuencia de consultas con una secuencia de dominio representativa o como una alineación múltiple. CD-Search se ejecuta ahora por defecto en paralelo con las búsquedas BLAST de proteínas. Mientras que el usuario espera la cola de BLAST para procesar aún más la petición, la arquitectura del dominio de la consulta ya puede ser estudiada. Además, CDART, la herramienta de recuperación de la arquitectura del dominio conservado, permite al usuario buscar proteínas con arquitecturas de dominio similares. CDART utiliza los resultados de búsqueda de CD-precomputados para identificar rápidamente proteínas con un conjunto de dominios similares a los de la consulta. Para más detalles, véase Marchler-Bauer et al., Nucleic Acids Research 31: 383-387, 2003; y Marchler-Bauer et al., Nucleic Acids Research 30: 281-283, 2002.
Además, una base de datos de aminoacil-ARNt sintetasas conocida ha sido publicada por Maciej Szymanski, Marzanna A. Deniziak y Jan Barciszewski, en Nucleic Acids Res. 29: 288-290, 2001 (titulado "Base de datos de las aminoacil-ARNt sintetasas"). Un sitio web correspondiente (rose.man.poznan.pl/aars/seq_main.html) proporciona detalles acerca de todas las AARSs conocidas de diferentes especies. Por ejemplo, de acuerdo con la base de datos, la isoleucil-ARNt sintetasa para la bacteria Deinococcus radiodurans radiorresistente (Nº de Acceso AAF10907) tiene 1078 aminoácidos, y fue publicada por White et al., en Science 286: 1571-1577 (1999); la Valil-ARNt sintetasa para ratón (Mus musculus) tiene 1263 aminoácidos (Nº. de Acceso AAD26531), y fue publicada por Snoek M. y van Vugt H: en lmmunogenetics 49: 468-470 (1999); y están también disponibles las secuencias de fenilalanil-ARNt sintetasa para seres humanos, Drosophila, S. pombe, S. cerevisiae, Candida albicans, E. coli y otras numerosas bacterias, incluida Thermus aquaticus ssp. thermophilus. La base de datos fue actualizada por última vez en noviembre de 2006. Información similar para otras AARSs recientemente identificadas se puede obtener, por ejemplo, realizando una búsqueda BLAST utilizando cualquiera de las secuencias conocidas en la base de datos de AARS como consulta frente a las bases de datos públicas disponibles (tales como la base de datos no redundante en el NCBI, o "nr" ) o de propiedad privada.
Alternativamente, en determinadas formas de realización, si no se conoce la estructura cristalina exacta de una AARS particular, pero su secuencia de proteínas es similar u homóloga a una secuencia de AARS conocida con una estructura cristalina conocida. En tales casos, se espera que la conformación de las AARS en cuestión sea similar a la estructura cristalina conocida de las AARS homólogas. La estructura conocida puede, por lo tanto, ser
utilizada como la estructura para las AARS de interés o, más preferiblemente, se puede utilizar para predecir la estructura de las AARS de interés (es decir, en "modelado por homología" o "modelado molecular"). Como un ejemplo particular, la base de datos de modelado molecular (MMDB) descrita anteriormente (véase, Wang et al., Nucl. Acids Res. 2000, 28: 243-245; Marchler-Bauer et al., Nucl. Acids Res. 1999,27: 240-243) proporciona motores de búsqueda que se pueden utilizar para identificar proteínas y/o ácidos nucleicos que son similares u homólogos a una secuencia de proteínas (a la que se alude como secuencias “vecinas" en la MMDB), incluyendo secuencias vecinas, cuyas estructuras tridimensionales son conocidas. La base de datos proporciona, además, enlaces a las estructuras conocidas junto con herramientas de alineación y visualización, tales como Cn3D (desarrollado por NCBI), RasMol, etc., por lo que las secuencias homólogas y las parentales pueden ser comparadas y se puede obtener una estructura para la secuencia parental basada en tales alineaciones de secuencias y estructuras conocidas.
La secuencia de AARS homóloga con estructura 3D conocida es preferiblemente al menos aproximadamente 60%,
o al menos aproximadamente 70%, o al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95% idéntica, o al menos aproximadamente 98% idéntica a las AARS de interés en la región del sitio activo o la región de bolsillo para la unión al sustrato de aminoácido. Un sitio activo o sitio en el bolsillo de este tipo puede no ser continuo en la secuencia primaria de aminoácidos de las AARS, ya que aminoácidos distantes pueden reunirse en la estructura 3D. En este caso, la homología o identidad de la secuencia se puede calcular utilizando, por ejemplo, el programa BLASTp estándar de la NCBI para la proteína utilizando condiciones por defecto, en regiones alineadas juntas (sin inserciones ni deleciones en cualquiera de las dos secuencias que se comparan) e incluyen residuos que se sabe están implicados en la unión de aminoácidos sustrato. Por ejemplo, la subunidad (alfa) catalítica de la fenilalanil-ARNt sintetasa de Thermus Aquaticus parece tener una región de "inserto" desde los residuos 156 a 165 en comparación con sus homólogos de otras especies. Esta región puede no tenerse en cuenta en el cálculo de identidad de la secuencia. Alternativamente, la AARS homóloga es preferiblemente aproximadamente 35%, o 40%, o 45%, o 50%, o 55% idéntica en general a las AARS de interés. La subunidad alfa de la fenilalanil-ARNt sintetasa de E. coli es aproximadamente 45% idéntica en general, y aproximadamente 80% idéntica en la región del sitio activo a la fenilalanil-ARNt sintetasa de Thermus Aquaticus. Las subunidades alfa de fenilalanil-ARNt sintetasa humana son aproximadamente 62%, 60%, 54%, 50% idénticas en general con sus homólogos de Drosophila, gusano (C. elegans), planta (Arabidopsis thaliana), levadura (S. cerevisiae) respectivamente.
En los pocos casos en los que la estructura para una secuencia de AARS particular no puede ser conocida o ni estar disponible, es posible determinar la estructura utilizando técnicas experimentales rutinarias (por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear (RMN)) y sin una experimentación excesiva. Véase, p. ej., NMR of Macromolecules: A Practical Approach, G.C.K. Roberts, Ed., Oxford University Press Inc., Nueva York (1993); lshima y Torchia, Nat. Struct. Biol. 7: 740-743, 2000; Gardner y Kay, Annu. Rev. Bioph. Biom. 27: 357-406, 1998; Kay, Biochem. Cell. Biol. 75: 1-15, 1997; Dayie et al., Annu. Rev. Phys. Chem. 47: 243-282, 1996; Wuthrich, Acta Cyrstallogr. D 51: 249-270, 1995; Kahn et al., J. Synchrotron Radiat. 7: 131-138, 2000; Oakley y Wilce, Clin. Exp. Pharmacol. P. 27: 145-151, 2000; Fourme et al., J. Synchrotron Radiat. 6: 834-844, 1999.
Alternativamente, la estructura tridimensional de una secuencia de AARS puede calcularse a partir de la propia secuencia y utilizando desde el principio técnicas de modelado molecular ya conocidas en la técnica. Véase, p. ej., Smith et al., J. Comput. Biol. 4: 217-225, 1997; Eisenhaber et al., Proteins 24: 169-179, 1996; Bohm, Biophys Chem. 59: 1-32, 1996; Fetrow y Bryant, BioTechnol. 11: 479-484, 1993; Swindells y Thorton, Curr. Opin. Biotech. 2: 512-519, 1991; Levitt et al., Annu. Rev. Biochem. 66: 549-579, 1997; Eisenhaber et al., Crit. Rev. Biochem. Mol. 30: 1-94, 1995; Xia et al., J. Mol. Biol. 300: 171-185, 2000; Jones, Curr. Opin. Struc. Biol. 10: 371-379, 2000. Estructuras tridimensionales obtenidas a partir de modelado desde el principio son típicamente menos fiables que las estructuras obtenidas utilizando técnicas empíricas (p. ej., espectroscopía de RMN o cristalografía de rayos X)
o semi-empíricas (p. ej., modelado de homología). Sin embargo, tales estructuras serán generalmente de suficiente calidad, aunque menos preferidas para su uso en algunos de los métodos descritos en esta memoria.
B.
Métodos para Predecir la Estructura 3D basados en la Homología de la Secuencia
Para las proteínas AARS que no han sido cristalizadas o que han sido el foco de otras determinaciones estructurales, un modelo molecular generado por ordenador de las AARS y su sitio de unión, se puede generar, sin embargo, utilizando cualquiera de un cierto número de técnicas disponibles en la técnica. Por ejemplo, las posiciones del carbono Cα de la secuencia AARS diana se pueden representar en mapa en un determinado patrón de coordenadas de una enzima AARS ("AARS conocida") que tiene una secuencia similar y una estructura deducida utilizando técnicas de modelado de homología, y la estructura de la proteína diana y las velocidades de cada uno de los átomos calculada a una temperatura de simulación (To) a la que se ha de determinar una simulación de acoplamiento con un análogo de aminoácido. Típicamente, un protocolo de este tipo implica principalmente la predicción de las conformaciones de cadena lateral en la proteína AARS diana modelada, al
tiempo que suponiendo una traza de la cadena principal tomada de una estructura terciaria, tal como se proporciona por la proteína AARS conocida. Los programas de ordenador para llevar a cabo rutinas de minimización de la energía se utilizan comúnmente para generar modelos moleculares. Por ejemplo, tanto el algoritmo CHARMM (Brooks et al. (1983) J Comput Chem 4: 187-217) como AMBER (Weiner et al. (1981) J. Comput. Chem. 106: 765) manejan toda la configuración del sistema molecular, el cálculo del campo de fuerza y el análisis (véase también, Eisenfield et al. (1991) Am J Physiol 261: C376-386; Lybrand (1991) J Pharm Belg 46: 4954; Froimowitz (1990) Biotechniques 8: 640-644; Burbarn et al. (1990) Proteins 7: 99-111; Pedersen (1985) Environ Health Perspect. 61: 185-190; y Kini et al. (1991) J Biomol Struct Dyn 9: 475-488). En el corazón de estos programas se encuentra un conjunto de subrutinas que, dada la posición de cada uno de los átomos en el modelo, calculan la energía potencial total del sistema y la fuerza en cada átomo. Estos programas pueden utilizar un conjunto de partida de las coordenadas atómicas, los parámetros para los diversos términos de la función de energía potencial, y una descripción de la topología molecular (la estructura covalente). Características comunes de este tipo de métodos de modelado molecular incluyen: provisiones para la manipulación de enlaces hidrógeno y otras fuerzas de restricción; el uso de condiciones de contorno periódicas; y provisiones para ajustar ocasionalmente las posiciones, velocidades, u otros parámetros con el fin de mantener o cambiar la temperatura, la presión, el volumen, las fuerzas de restricción, u otras condiciones controladas externamente.
La mayoría de los métodos de minimización de energía convencionales utilizan los datos de coordenadas entrada y el hecho de que la función de energía potencial es una función explícita, diferenciable de coordenadas cartesianas, para calcular la energía potencial y su gradiente (que da la fuerza sobre cada uno de los átomos) para cualquier conjunto de posiciones atómicas. Esta información se puede utilizar para generar un nuevo conjunto de coordenadas en un esfuerzo por reducir la energía potencial total y, mediante la repetición de este proceso una y otra vez, para optimizar la estructura molecular bajo un conjunto dado de condiciones externas. Estos métodos de minimización de la energía se aplican rutinariamente a moléculas similares a las proteínas AARS objeto.
En general, los métodos de minimización de la energía pueden llevarse a cabo para una temperatura dada, Ti, que puede ser diferente de la temperatura de simulación de acoplamiento, To. Tras la minimización de la energía de la molécula en Ti, se computan las coordenadas y velocidades de todos los átomos en el sistema. Adicionalmente, se calculan los modos normales del sistema. Se apreciará por los expertos en la técnica que cada uno de los modos normales es un movimiento periódico colectivo, con todas las partes del sistema en movimiento en fase entre sí, y que el movimiento de la molécula es la superposición de todos los modos normales. Para una temperatura dada, la amplitud media cuadrada de movimiento en un modo particular es inversamente proporcional a la constante de fuerza efectiva para ese modo. A este respecto, las vibraciones de baja frecuencia dominarán a menudo el movimiento de la molécula.
Después de que el modelo molecular ha sido minimizado en energía en Ti, el sistema se "calienta" o "enfría" a la temperatura de simulación, To, llevando a cabo una operación de equilibrio, en que las velocidades de los átomos aumentan de una manera escalonada hasta alcanzar la temperatura deseada, To. El sistema se equilibra aún más durante un período de tiempo especificado hasta que permanecen constantes determinadas propiedades del sistema tales como la energía cinética media. Las coordenadas y velocidades de cada uno de los átomos se obtienen entonces a partir del sistema equilibrado.
También pueden llevarse a cabo rutinas de minimización de la energía adicionales. Por ejemplo, una segunda clase de métodos implica calcular soluciones aproximadas a la EOM restringida para la proteína. Estos métodos utilizan una estrategia iterativa para resolver los multiplicadores de Lagrange y, típicamente, sólo necesitan unas pocas iteraciones si las correcciones necesarias son pequeñas. El método más popular de este tipo, SHAKE (Ryckaert et al. (1977) J. Comput. Phys. 23: 327; y Van Gunsteren et al. (1977) Mol. Phys. 34: 1311), es fácil de implementar y aumenta como O(N) a medida que se incrementa el número de restricciones. Por lo tanto, el método es aplicable a macromoléculas tales como proteínas AARS. Un método alternativo, RATTLE (Anderson (1983) J. Comput. Phys. 52:24) se basa en la versión de velocidad del algoritmo de Verlet. Al igual que SHAKE, RATTLE es un algoritmo iterativo y se puede utilizar para minimizar en energía el modelo de una proteína AARS objeto.
C. Métodos Alternativos
En otras realizaciones, en lugar de mantener la identidad del análogo de aminoácido constante y variando la estructura de AARS (modelando varias estructuras mutantes diferentes), el presente método se lleva a cabo utilizando el o los modelos moleculares para una AARS modificada sencilla (p. ej., en el que se cambian uno más residuos de aminoácidos de no anclaje) y el muestreo de una diversidad de diferentes análogos de aminoácidos o fragmentos potenciales de los mismos, para identificar análogos que son propensos a interactuar con, y ser sustratos para la enzima AARS modificada. Esta estrategia puede hacer uso de coordinar bancos para análogos de aminoácidos (incluidas variantes de rotámeros) o bancos de los grupos funcionales y espaciadores que se
pueden unir para formar la cadena lateral de un análogo de aminoácido.
Al utilizar tales estrategias según se describe anteriormente, p. ej., el modelado de homología, se puede derivar un conjunto de coordenadas para el sitio de unión para las AARS modificadas.
Existe una diversidad de métodos computacionales que se pueden adaptar fácilmente para identificar la estructura de análogos de aminoácidos que tendrían propiedades estéricas y electrónicas apropiadas para interactuar con el sitio de unión al sustrato de una AARS modificada. Véase, por ejemplo, Cohen et al. (1990) J. Med. Cam. 33: 883894; Kuntz et al. (1982) J. Mol. Biol 161: 269-288; DesJarlais (1988) J. Med. Cam. 31: 722-729; Bartlett et al. (1989) (Spec. Publ., Roy. Soc. Chem.) 78: 182-196; Goodford et al. (1985) J. Med. Cam. 29: 849-857; DesJarlais et al. J. Med. Cam. 29: 2149-2153). Métodos dirigidos generalmente se dividen en dos categorías: (1) el diseño por analogía, en el que las estructuras 3-D de las moléculas conocidas (tales como las de una base de datos cristalográfica) se acoplan a la estructura del sitio de unión AARS y se puntúan en cuanto a la bondad del ajuste; y
(2) diseño de novo, en el que el modelo análogo de aminoácido se construye por piezas en el sitio de unión de AARS. El último enfoque, en particular, puede facilitar el desarrollo de nuevas moléculas, de diseño único, para unirse al sitio de unión de AARS modificada objeto.
En una forma de realización ilustrativa, el diseño de análogos de aminoácidos potenciales que pueden funcionar con una AARS modificada particular comienza desde la perspectiva general de la complementariedad de forma para el sitio de unión al sustrato de la enzima, y se emplea un algoritmo de búsqueda que es capaz de rastrear una base de datos de pequeñas moléculas de conocida estructura tridimensional para los candidatos que se ajustan geométricamente en el sitio de unión al sustrato. Tales bancos pueden ser bancos de pequeñas moléculas generales, o pueden ser bancos dirigidos a análogos de aminoácidos o moléculas pequeñas que pueden utilizarse para crear análogos de aminoácidos. No se espera que las moléculas que se encuentran en la búsqueda de forma sean necesariamente conductoras por sí mismas, ya que no se ha de hacer necesariamente una evaluación de la interacción química durante la búsqueda inicial. Más bien, se prevé que tales candidatos puedan actuar como el marco para un diseño adicional, proporcionando esqueletos moleculares a los cuales se pueden sustituciones atómicas apropiadas. Por supuesto, se puede evaluar la complementariedad química de estas moléculas, pero se espera que cambiarán los tipos de átomos para maximizar la electrostática, los enlaces hidrógeno y las interacciones hidrofóbicas con el sitio de unión al sustrato. La mayoría de los algoritmos de este tipo proporcionan un método para encontrar una amplia variedad de estructuras químicas que pueden ser complementarias a la forma del sitio de unión al sustrato de AARS.
Por ejemplo, cada uno de un conjunto de pequeñas moléculas de una base de datos particular, tal como el banco de datos Cambridge Crystallographic Data Bank (CCDB) (Allen et al. (1973) J. Chem. Doc. 13: 119), está acoplado de forma individual al sitio de unión de las AARS modificadas en un cierto número de orientaciones geométricamente permisibles con el uso de un algoritmo de acoplamiento. En una realización preferida, se puede utilizar un conjunto de algoritmos de ordenador denominado DOCK para caracterizar la forma de invaginaciones y ranuras que forman el sitio de unión. Véase, por ejemplo, Kuntz et al. (1982) J. Mol. Biol 161: 269-288. El programa también puede buscar una base de datos de pequeñas moléculas para los moldes, cuyas formas son complementarias a un sitio de unión particular, de las AARS modificadas. Algoritmos ilustrativos que se pueden adaptar para este propósito se describen, por ejemplo, en DesJarlais et al. (1988) J. Med. Chem. 31: 722-729.
Las orientaciones son evaluadas en cuanto a la bondad de ajuste y las mejores se mantienen para un examen ulterior utilizando programas de mecánica molecular tal como AMBER o CHARMM. Tales algoritmos han demostrado previamente tener éxito en encontrar una diversidad de moléculas que son complementarias en forma a un determinado sitio de unión de un receptor o enzima, y han demostrado tener varias características atractivas. En primer lugar, este tipo de algoritmos puede recuperar una notable diversidad de arquitecturas moleculares. En segundo lugar, las mejores estructuras han demostrado, en aplicaciones previas a otras proteínas, una impresionante complementariedad de la forma con una superficie específica extendida. En tercer lugar, la estrategia general parece ser bastante más robusta con respecto a las pequeñas incertidumbres en el posicionamiento de los átomos candidatos.
En determinadas formas de realización, el presente método puede utilizar un algoritmo descrito por Goodford (1985, J. Med. Chem. 28:849-857) y Boobbyer et al. (1989, J. Med. Chem. 32: 1083-1094). Estos artículos describen un programa de ordenador (GRID), que busca determinar las regiones de alta afinidad por diferentes grupos químicos (denominados sondas) en la superficie molecular del sitio de unión. Por lo tanto, GRID proporciona una herramienta para sugerir modificaciones a ligandos conocidos que pudieran potenciar la unión. Se puede anticipar que algunos de los sitios discernidos por GRID como regiones de alta afinidad corresponden a "patrones farmacofóricos" determinado por inferencia a partir de una serie de ligandos conocidos. Tal como se utiliza en esta memoria, un patrón farmacofórico es una disposición geométrica de características del análogo de aminoácido anticipado que se cree que es importante para la unión. Goodsell y Olson (1990, Proteins: Struct.
Funct. Genet. 8: 195-202) han utilizado el algoritmo Metropolis (reasociación simulada) para acoplar un solo ligando conocido en una proteína diana, y su estrategia se puede adaptar para la identificación de análogos de aminoácidos adecuados para el acoplamiento con el sitio de unión de AARS. Este algoritmo puede permitir la flexibilidad a la torsión en la cadena lateral de aminoácidos y el uso de mapas de energía de interacción GRID como tablas de búsqueda rápida para computar energías de interacción aproximadas.
Sin embargo, una forma de realización adicional utiliza un algoritmo de ordenador tal como CLIX que busca en las bases de datos tales como CCDB pequeñas moléculas que puedan ser orientadas en el sitio de unión al sustrato de la AARS de una manera que sea tanto estéricamente aceptable como que tenga una alta probabilidad de lograr interacciones químicas favorables entre la molécula candidata y los residuos de aminoácidos que la rodean. El método se basa en la caracterización del sitio de unión al sustrato en términos de un conjunto de posiciones de unión favorables para diferentes grupos químicos y luego la búsqueda de orientaciones de las moléculas candidatas que provocan una máxima coincidencia espacial de grupos químicos candidatos individuales con los miembros del conjunto. La disponibilidad actual de energía de ordenador dicta que una búsqueda basada en ordenador para nuevos ligandos siga una estrategia “de lo ancho”. Una estrategia “de lo ancho” tiene como objetivo reducir progresivamente el tamaño del espacio de búsqueda potencial candidato por la aplicación de criterios cada vez más estrictos, en contraposición a una estrategia de profundidad en el que se lleva a cabo un análisis máximamente detallado de un candidato antes de proceder a la siguiente. CLIX se ajusta a esta estrategia en que su análisis de unión es rudimentario -busca satisfacer las condiciones necesarias de ajuste estérico y de tener grupos individuales en lugares "correctos" para la unión, sin imponer la condición suficiente de que interacciones de unión favorables ocurran en realidad. Se produce una "lista restringida" clasificada de moléculas, en sus orientaciones favorecidas, que puede ser examinada sobre una base de molécula por molécula, usando gráficos por ordenador y técnicas de modelado molecular más sofisticadas. CLIX también es capaz de sugerir cambios en los grupos químicos sustituyentes de las moléculas candidatas que pudieran potenciar la unión. De nuevo, el banco de partida puede ser de análogos de aminoácidos o de moléculas que pueden ser utilizadas para generar la cadena lateral de un análogo de aminoácido.
Los detalles algorítmicos de CLIX se describen en Lawerence et al., (1992) Proteins 12: 31-41, y el algoritmo CLIX pueden resumirse como sigue. El programa GRID se utiliza para determinar posiciones discretas favorables de interacción (denominadas sitios diana) en el sitio de unión de la proteína AARS para una amplia diversidad de grupos químicos representativos. Para cada uno de los ligandos candidatos en el CCDB se hace un intento exhaustivo para hacer coincidir, en un sentido espacial en el sitio de unión de la proteína, un par de grupos químicos sustituyentes del candidato con un par de sitios de interacción favorables correspondientes propuestos por GRID. Durante este proceso se consideran todas las posibles combinaciones de pares de grupos de ligandos con pares de sitios GRID. Tras localizar tal coincidencia, el programa hace girar el ligando candidato alrededor de los dos pares de grupos y verifica el impedimento estérico y la coincidencia de otros grupos atómicos candidatos con sitios diana apropiados. Se conservan combinaciones candidato / orientación particulares que son buenos ajustes geométricos en el sitio de unión y muestran una coincidencia suficiente de grupos atómicos con sitios GRID.
En consonancia con la estrategia “de lo ancho”, este enfoque implica simplificar suposiciones. La proteína rígida y la geometría de moléculas pequeñas se mantienen a lo largo del mismo. Como primera aproximación la geometría rígida es aceptable como las coordenadas minimizadas en energía del sitio de unión de las AARS modificadas, describen un mínimo de energía para la molécula, aunque uno local.
Otro supuesto implícito en CLIX es que el ligando potencial, cuando se introduce en el sitio de unión al sustrato de las AARS modificadas, no induce cambios en la estereoquímica o la distribución de la carga parcial de la proteína y, así, altera la base sobre la cual se computaron los mapas de energía de interacción GRID. También hay que destacar que los sitios de interacción predichos por GRID se utilizan en un sentido posicional y del tipo solamente, es decir, cuando un grupo atómico candidato se coloca en un sitio predicho tan favorable por GRID, no se hace verificación alguna para asegurarse de que la geometría de unión, el estado de protonación o la distribución de carga parcial favorece una fuerte interacción entre la proteína y ese grupo. Tal análisis detallado debe formar parte de más de un modelado avanzado de candidatos identificados en la lista restringida CLIX.
Todavía otra forma de realización de un método de diseño molecular asistido por ordenador para la identificación de análogos de aminoácidos que pueden ser utilizados por una AARS predeterminada modificada comprende la síntesis de novo de inhibidores potenciales por la conexión algorítmica de pequeños fragmentos moleculares que exhibirá la complementariedad estructural y electrostática deseada con el sitio de unión al sustrato de la enzima. La metodología emplea a un gran conjunto de moldes de pequeñas moléculas que es iterativamente reconstruido en un modelo del sitio de unión al sustrato de la AARS’. Cada una de las etapas de crecimiento del ligando se evalúa de acuerdo con una función de la energía basada en la mecánica molecular, que considera interacciones de van der Waals y de Coulomb, la energía de deformación interna del ligando de alargamiento y la desolvatación
tanto del ligando como de la enzima. El espacio de búsqueda puede ser gestionado mediante el uso de un árbol de datos que se mantiene bajo control mediante la poda de acuerdo con los criterios de unión.
Aún en otra forma de realización, análogos de aminoácidos potenciales pueden determinarse utilizando un método basado en un algoritmo de dinámica molecular restringida a la minimización de energía para la determinación de posiciones energéticamente favorables de grupos funcionales en el sitio de unión al sustrato de una enzima AARS modificada. El método puede ayudar al diseño de moléculas que incorporan tales grupos funcionales mediante modificación de aminoácidos y análogos de aminoácidos conocidos o mediante la síntesis de novo.
Por ejemplo, el método de búsqueda simultánea de múltiples copias (MCSS) descrito por Miranker et al. (1991) Proteins 11: 29-34 se puede adaptar para su uso en el método objeto. Para determinar y caracterizar mínimos locales de un grupo funcional en el campo de fuerza de la proteína, múltiples copias de grupos funcionales seleccionados se distribuyen primero en un sitio de unión de interés en la proteína AARS. La minimización de la energía de estas copias mediante mecánica molecular o dinámicas restringidas proporciona los mínimos locales distintos. La vecindad de estos mínimos puede ser explorada por una búsqueda grid o por la minimización restringida. En una forma de realización, el método MCSS utiliza la aproximación de Hartree dependiente del tiempo (TDH) clásica para minimizar simultáneamente o apagar muchos grupos idénticos en el campo de fuerza de la proteína.
La implementación del algoritmo MCSS requiere una elección de grupos funcionales y un modelo de mecánica molecular para cada uno de ellos. Los grupos deben ser lo suficientemente simples como para ser caracterizados y manipulados (3-6 átomos, pocos o ningún grados de libertad de diedros) con facilidad, pero lo suficientemente complejos como para aproximarse a las interacciones estéricas y electrostáticas que el grupo funcional tendría en la unión del sustrato al sitio de la proteína AARS. Un conjunto preferido es, por ejemplo, uno en el que la mayoría de las moléculas orgánicas pueden ser descritas como una colección de tales grupos (Patal’s Guide to the Chemistry of Functional Groups, ed. S. Patai (Nueva York: John Wiley and Sons, (1989)). Esto incluye fragmentos tales como acetonitrilo, metanol, acetato, metil-amonio, dimetil-éter, metano y acetaldehído.
La determinación de los mínimos de energía local en el sitio de unión requiere que se tomen muestras de muchas posiciones de partida. Esto se puede lograr mediante la distribución de, por ejemplo, 1.000-5.000 grupos al azar dentro de una esfera centrada en el sitio de unión; sólo el espacio no ocupado por la proteína necesita ser considerado. Si la energía de interacción de un grupo particular en un lugar determinado con la proteína es más positivo que un punto de corte dado (p. ej., 5,0 kcal/mol), el grupo se descarta de ese sitio. Teniendo en cuenta el conjunto de las posiciones de partida, todos los fragmentos se minimizan al mismo tiempo mediante el uso de la aproximación TDH (Elber et al. (1990) J. Am. Chem. Soc. 112: 9161-9175). En este método, las fuerzas sobre cada uno de los fragmentos consiste en sus fuerzas internas y las debidas a la proteína. El elemento esencial de este método es que se omiten las interacciones entre los fragmentos y las fuerzas sobre la proteína se normalizan a las debidas a un solo fragmento. De esta manera, se puede realizar la minimización simultánea o dinámica de cualquier número de grupos funcionales en el campo de una sola proteína
La minimización se realiza sucesivamente en subconjuntos de, p. ej., 100, de los grupos colocadas al azar. Después de un cierto número de intervalos de paso, tales como 1.000 intervalos, los resultados pueden ser examinados para eliminar los grupos que converjan hacia el mismo mínimo. Este proceso se repite hasta que se haya completado la minimización (p. ej., gradiente de RMS de 0,01 kcal/mol/A). Así, el conjunto de moléculas minimizado en energía resultante comprende lo que equivale a un conjunto de fragmentos inconexos en tres dimensiones que representan posibles cadenas laterales para análogos de aminoácidos.
La siguiente etapa es, entonces, conectar las piezas con espaciadores montados a partir de pequeñas entidades químicas (átomos, cadenas o restos de anillo) para formar análogos de aminoácidos, p. ej., cada uno de los desconectados puede ser vinculado en el espacio para generar una sola molécula utilizando programas de ordenador tales como, por ejemplo, NEWLEAD (Tschinke et al. (1993) J. Med. Chem. 36: 3863,3870). El procedimiento adoptado por NEWLEAD ejecuta la siguiente secuencia de comandos (1) conectar dos restos aislados, (2) mantener las soluciones intermedias para su posterior procesamiento, (3) repetir las etapas anteriores para cada una de las soluciones intermedias hasta que no se encuentren unidades desconectadas, y (4) salida de las soluciones finales, cada uno de los cuales es una molécula sencilla. Dicho programa puede utilizar, por ejemplo, tres tipos de separadores: separadores de bancos, espaciadores de un solo átomo y separadores de anillo condensado. Los espaciadores de bancos son estructuras optimizadas de moléculas pequeñas tales como etileno, benceno y metilamida. La salida producida por programas tales como NEWLEAD consiste en un conjunto de moléculas que contienen los fragmentos originales ahora conectados por espaciadores. Los átomos que pertenecen a los fragmentos de entrada mantienen sus orientaciones originales en el espacio. Las moléculas son químicamente plausibles porque el simple maquillaje de los espaciadores y grupos funcionales, y energéticamente aceptables debido al rechazo de soluciones con violaciones de radios de van-der Waals.
Además, el orden en que se realizan las etapas de este método es puramente ilustrativo por naturaleza. De hecho, las etapas se pueden realizar en cualquier orden o en paralelo, a menos que se indique lo contrario por la presente descripción.
Además de ello, los métodos descritos en esta memoria se pueden realizar en cualquier hardware, software, o cualquier combinación de los mismos, ya que estos términos son conocidos actualmente en la técnica. En particular, el presente método puede llevarse a cabo mediante software, firmware o microcódigo que opera en un ordenador u ordenadores de cualquier tipo. Adicionalmente, el software puede comprender instrucciones de ordenador de cualquier forma (p. ej., código fuente, código objeto, código interpretado, etc.) almacenados en cualquier medio legible por ordenador (p. ej., ROM, RAM, medios magnéticos, cinta o tarjeta perforada, disco compacto (CD) en cualquier forma, DVD, etc.). Además, un software de este tipo también puede ser en forma de una señal de datos de ordenador incorporada en una onda portadora, tal como la que se encuentra dentro de las páginas Web conocidas transferidas entre dispositivos conectados a Internet. En consecuencia, determinadas formas de realización no se limitan a cualquier plataforma en particular, salvo que se indique específicamente lo contrario en la presente descripción.
Medios de hardware informático ilustrativos, adecuados para llevar a cabo determinadas formas de realización puede ser un servidor de Silicon Graphics Power Challenge con 10 R10000 procesadores funcionando en paralelo. Un entorno de desarrollo de software adecuado incluye CERIUS2 de Biosym/Molecular Simulations (San Diego, CA), u otros equivalentes.
El método computacional descrito anteriormente se ha utilizado eficazmente en la modificación de enzimas de la maquinaria de síntesis de proteínas (p. ej., AARS) para permitir la incorporación de aminoácidos antinaturales. El mismo conjunto de herramientas computacionales también se puede aprovechar para diseñar los productos finales
(p. ej., anticuerpos monoclonales u otros agentes terapéuticos) en que los aminoácidos antinaturales se incorporarían a fin de potenciar o modificar sus propiedades estructurales o funcionales.
Aunque se han mostrado y descrito realizaciones particulares en esta memoria, resultará evidente para los expertos en la técnica que pueden hacerse cambios y modificaciones sin apartarse del aspecto más amplio y, por lo tanto, las reivindicaciones adjuntas deben abarcar dentro de su alcance todos esos cambios y modificaciones que caigan dentro del verdadero espíritu de esta invención.
Adopción de AARS de diferentes organismos
Una segunda estrategia para generar un ARNt mutante externo, una RS modificada o mutante externa, o un par ARNt/RS modificado implica importar un ARNt y/o sintetasa de otro organismo en el sistema de traducción de interés tal como Escherichia coli. En este ejemplo particular, las propiedades del candidato sintetasa heteróloga incluyen, p. ej., que no carga ARNt de Escherichia coli razonablemente bien (preferiblemente no en todos), y las propiedades del candidato de ARNt heterólogo incluyen, p. ej., que no sea acilado por sintetasa de Escherichia coli en una medida razonable (preferiblemente no en todas).
Schimmel et al. informó que GInRS de Escherichia coli (EcGInRS) no acila ARNtGIn de Saccharomyces cerevisiae (EcGInRS carece de un dominio de unión a ARN N-terminal que posee GlnRS de Saccharomyces cerevisiae (ScGInRS)). Véase, E. F. Whelihan y P. Schimmel, EMBO J., 16:2968 (1997). Por ejemplo, se analizó el ARNtGIn supresor de ámbar de Saccharomyces cerevisiae (ScARNtGInCUA) para determinar si también no es un sustrato para EcGInRS. Ensayos de aminoacilación in vitro demostraron ser este el caso; y estudios de supresión in vitro demuestran que el ScARNtGInCUA es competente en la traducción. Véase, p. ej., Liu y Schultz, PNAS. U S A , 96:4780 (1999). Se demostró, además, que ScGInRS no acila cualquier ARNt de Escherichia coli, sólo el ScARNtGInCUA in vitro. El grado al que es capaz ScGInRS de aminoacilar el ScARNtGInCUA en Escherichia coli también se evaluó utilizando un ensayo de complementación in vivo. Una mutación sin sentido ámbar se introdujo en un sitio permisivo en el gen β-lactamasa. La supresión de la mutación por parte de un ARNt supresor ámbar debería producir β-lactamasa de longitud completa y conferir resistencia a la ampicilina a la célula. Cuando sólo se expresa ScARNtGInCUA, las células presentan una CI50 de 20 µg/mL de ampicilina, lo que indica virtualmente ninguna acilación por parte de sintetasas endógenas de Escherichia coli; cuando se coexpresa ScARNtGInCUA con ScGInRS, las células adquieren una CI50 de aproximadamente 500 µg/mL de ampicilina, demostrando que ScGInRS acila ScARNtGInCUA eficazmente en Escherichia coli. Véase, Liu y Schultz, PNAS, U S A, 96: 4780 (1999).
Como otro ejemplo, se sabe que ARNtAsp de Saccharomyces cerevisiae es un mutante externo a sintetasas de Escherichia coli. Véase, p, ej., Doctor y Mudd, J. Biol. Chem., 238:3677 (1963); y Kwok y Wong, Can. J. Biochem.,
58: 213 (1980). Se demostró que un ARNt supresor ámbar derivado del mismo (ScARNtAspCUA) es también un
mutante externo en Escherichia coli utilizando el ensayo de β-lactamasa in vivo descrito anteriormente. Sin embargo, el anticodón de ARNtAsp es un elemento de reconocimiento crítico de AspRS, véase, p. ej., Giege, et al., Biochimie, 78: 605 (1996), y la mutación del anticodón a CUA resulta en una pérdida de afinidad del supresor para AspRS. Un mutante de Escherichia coli AspRS E93K ha demostrado reconocer ARNtAspCUA supresor ámbar de Escherichia coli aproximadamente un orden de magnitud mejor que AspRS de tipo salvaje (wt). Véase, p. ej. Martin, 'Thesis', Universidad Louis Pasteur de Estrasburgo, Francia, 1995. Se especuló que la introducción de la mutación relacionada en AspRS(E188K) de Saccharomyces cerevisiae podría restaurar su afinidad por SeARNtAspCUA. Se determinó que el mutante AspRS(E188K) de Saccharomyces cerevisiae no acila ARNts de Escherichia coli, pero carga ScARNtAspCUA con una eficacia moderada tal como se muestra por los experimentos de aminoacilación in vitro. Véase, p. ej., Pastrnak, et al., Helv. Chim. Acta, 83: 2277 (2000).
Una estrategia similar implica el uso de una sintetasa heteróloga como la sintetasa mutante externa y un ARNt iniciador mutante del mismo organismo o de un organismo relacionado como el ARNt modificado. RajBhandary y colaboradores encontraron que un mutante ámbar de ARNttMet iniciador humano es acilado por GInRS de Escherichia coli y actúa como un supresor ámbar en células de levadura sólo cuando EcGInRS se co-expresa. Véase, Kowal, et al., PNAS U S A, 98:2268 (2001). Así, este par representa un par mutante externo para su uso en levaduras. Además, se encontró que un ARNtfMet iniciador de Escherichia coli mutante ámbar es inactivo hacia cualquier sintetasa de Escherichia coli. Se seleccionó un TyrRS de levadura mutante que carga este ARNt mutante, resultando en un par mutante externo en Escherichia coli.
Utilizando los métodos descritos en esta memoria, se desarrollan los pares y componentes de pares deseados arriba para generar ARNt y/o RS mutante externo que poseen características deseadas, p. ej., que preferiblemente pueden aminoacilar un O-ARNt con un aminoácido antinatural.
En determinadas formas de realización, el ARNt modificado y la RS modificada pueden derivarse por mutación de un ARNt que se produce de forma natural y RS a partir de una diversidad de organismos. En una forma de realización, el ARNt modificado y/o la RS modificada se derivan de al menos un organismo, en que el organismo es un organismo procariótico, p. ej., Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thennoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, T. thermophilus, o similares. Opcionalmente, el organismo es un organismo eucariota, p. ej. plantas (p. ej., plantas complejas tales como monocotiledóneas o dicotiledóneas,), algas, hongos (p. ej. levaduras, etc.), animales (p. ej., mamíferos, insectos, artrópodos, etc.), insectos, protistas, o similares. Opcionalmente, el ARNt modificado se deriva por mutación de un ARNt que se produce de forma natural a partir de un primer organismo y la RS modificada se deriva por mutación de una RS que se produce de forma natural origen natural de un segundo organismo. En una forma de realización, el ARNt modificado y la RS modificada se pueden derivar de un ARNt mutado y una RS mutada. En determinadas formas de realización, la RS modificada y/o el ARNt modificado de un primer organismo se proporciona a un sistema de traducción de un segundo organismo, que opcionalmente tiene una RS y/o un ARNt endógeno no funcional con respecto a los codones reconocidos por el ARNt modificado o la RS modificada.
El ARNt mutante externo y/o la ARNt sintetasa mutante externa también pueden aislarse, opcionalmente, a partir de una diversidad de organismos. En una forma de realización, el ARNt mutante externo y/o la sintetasa mutante externa se aíslan a partir de al menos un organismo, en que el organismo es un organismo procariótico, p. ej., Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. Pemix, T. thermophilus, o similares. Opcionalmente, el organismo es un organismo eucariota, p. ej., plantas (por ejemplo, plantas complejas tales como monocotiledóneas o dicotiledóneas,), algas, hongos (p. ej., levaduras, etc.), animales (p. ej., mamíferos, insectos, artrópodos, etc.), insectos, protistas, o similares. Opcionalmente, el ARNt externo se aísla a partir de un ARNt que se produce de forma natural a partir de un primer organismo y la sintetasa mutante externa se aísla a partir de una RS que se produce de forma natural a partir de un segundo organismo. En una forma de realización, el ARNt mutante externo y/o la ARNt sintetasa mutante externa se pueden aislar a partir de uno o más bancos (que comprende opcionalmente uno o más ARNt y/o RS de uno o más organismos (incluidos los que comprenden procariotas y/o eucariotas).
También se describen en esta memoria métodos para la selección de un par ARNt mutante externo y/o una ARNt sintetasa para su uso en cualquier sistema de traducción. Los métodos incluyen: introducir un gen marcador, un ARNt y/o una aminoacil-ARNt sintetasa (RS) aislados o derivados de un primer organismo en un primer conjunto de células del segundo organismo; introducir el gen marcador y el ARNt o la RS en un conjunto de células duplicadas procedente del segundo organismo; y seleccionar para que sobrevivan las células en el primer conjunto que no sobreviven en el conjunto de células por duplicado, en que el primer conjunto y el conjunto de células por duplicado se hacen crecer en presencia de un agente de selección, y en que las células supervivientes comprenden el ARNt mutante externo y/o la RS para uso en el sistema de traducción. En una forma de realización, comparar y seleccionar incluye un ensayo de complementación in vivo. En otra forma de realización, se varía la concentración del agente de selección. El mismo ensayo puede realizarse también en un sistema in vitro o in vivo basado en el
segundo organismo.
Generación de AARS por mutagénesis y Selección / Rastreo
La mutación o modificación de una AARS a utilizar para la incorporación de un aminoácido no natural en un polipéptido o una proteína diana se puede realizar mediante el uso de mutagénesis dirigida una vez que se han identificado los residuos de aminoácidos de contacto deseados. La identificación de los aminoácidos de contacto se puede realizar utilizando cualquier método que permita el análisis de la estructura de la AARS, incluyendo el análisis cristalográfico, el modelado por ordenador, la resonancia magnética nuclear (RMN), el rastreo de bancos,
o una combinación de cualquiera de estos u otros métodos.
Se ha secuenciado un cierto número de moléculas de AARS, y proporcionan una orientación en cuanto a qué aminoácidos son importantes para la unión del aminoácido con el que cargar el ARNt correspondiente. Véanse, por ejemplo, SEQ ID Nos. 48-103.
En determinadas formas de realización, las AARS capaz de cargar un ARNt mutante externo particular con un aminoácido antinatural particular, se pueden obtener por mutagénesis de la AARS para generar un banco de candidatos, seguido por el rastreo y/o la selección de las AARSs candidatas capaces de su deseada función. AARSs mutantes externas y ARNts mutantes externos de este tipo se pueden usar para la producción in vitro / in vivo de las proteínas deseadas con aminoácidos antinaturales modificados.
Así, se proporcionan en determinadas formas de realización descritas en esta memoria métodos para la generación de componentes de la maquinaria biosintética de proteínas tales como las RSs mutantes externas, ARNts mutante externos y/o pares de ARNt/RS mutantes externos que se pueden utilizar para incorporar un aminoácido antinatural.
En una forma de realización, métodos para producir al menos una aminoacil-ARNt sintetasa mutante externa recombinante comprenden: (a) generar un banco de RSs (opcionalmente mutantes) derivado de al menos una aminoacil-ARNt sintetasa (RS) procedente de un primer organismo, p. ej., un organismo eucariota (tal como una levadura), o un organismo procariota tal como Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thennoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, T. thermophilus, o similares; (b) seleccionar (y/o rastrear) el banco de RSs (opcionalmente RSs mutantes) para miembros que aminoacilan un ARNt mutante externo en presencia de un aminoácido antinatural y un aminoácido natural, proporcionando de ese modo una agrupación de RSs activas (opcionalmente mutantes); y/o, (c) seleccionar (opcionalmente a través de selección negativa) la agrupación para RSs activas (p. ej. RSs mutantes) que preferiblemente aminoacilan el O-ARNt en ausencia del aminoácido antinatural, proporcionando con ello la al menos una sintetasa mutante externa recombinante, en donde la al menos una sintetasa mutante externa recombinante aminoacila preferiblemente el ARNt mutante externo con el aminoácido antinatural. Sintetasas mutantes externas recombinantes, producidas por los métodos también se incluyen en determinadas formas de realización descritas en esta memoria.
En una forma de realización, la RS es una RS inactiva, que puede haber sido generada a partir de la mutación de una RS activa. Por ejemplo, la RS inactiva se puede generar mutando al menos aproximadamente 1, al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 6, o al menos aproximadamente 10 o más aminoácidos a diferentes aminoácidos, p. ej., alanina.
Bancos de RSs mutantes pueden generarse utilizando diversas técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica. Por ejemplo, Las RSs mutantes se pueden generar por mutaciones específicas del sitio, mutaciones aleatorias, mutaciones de recombinación generadoras de diversidad, construcciones quiméricas, y por otros métodos descritos en esta memoria o conocidos en la técnica.
En una forma de realización, seleccionar (y/o rastrear) el banco de RSs (opcionalmente RSs mutantes) para los miembros que son activos, p. ej., que aminoacilan un ARNt mutante externo en presencia de un aminoácido antinatural y un aminoácido natural, incluye: introducir un marcador de selección o rastreo positivo, p. ej., un gen de resistencia a antibióticos, o similares, y el banco de RSs (opcionalmente mutantes) en una pluralidad de células, en donde el marcador de selección y/o rastreo positivo comprende al menos un codón, cuya traducción (opcionalmente de forma condicional) depende de la capacidad de RSs candidatas de cargar el ARNt mutante externo (con un aminoácido natural y/o antinatural); hacer crecer la pluralidad de células en presencia de un agente de selección; identificar las células que sobreviven (o que muestran una respuesta específica) en presencia del agente de selección y/o rastreo mediante la traducción con éxito del codón en el marcador de selección o rastreo positivo, proporcionando de este modo un subconjunto de células seleccionadas positivamente que contiene la agrupación de RSs activas (opcionalmente mutantes). Opcionalmente, se puede variar la concentración del agente
de selección y/o rastreo. En determinadas formas de realización, las células no contienen un ARNt, RS o par RS-ARNt endógeno funcional que pueda ayudar a traducir el codón. El par ARNt/RS endógeno puede ser desactivado por deleción de genes y/o inhibidores de la RS.
Dado que muchos genes esenciales de la célula probablemente contengan también un codón que depende de la capacidad de la sintetasa mutante externa de cargar el ARNt modificado en ausencia del par RS/ARNt funcional endógeno, en una forma de realización no se necesitan marcadores de selección positivos extras para el proceso de selección positiva -la supervivencia de la célula se puede utilizar como una lectura del proceso de selección positiva.
En un aspecto, el marcador de selección positiva es un gen cloroanfenicol acetiltransferasa (CAT). Opcionalmente, el marcador de selección positiva es un gen β-lactamasa. En otro aspecto, el marcador de rastreo positivo comprende un marcador de rastreo fluorescente o luminiscente o un marcador de rastreo basado en afinidad (p. ej., un marcador de superficie celular).
En una forma de realización similar, se puede utilizar un sistema in vitro exento de células para someter a ensayo la capacidad de la sintetasa mutante externa de cargar el ARNt modificado en un rastreo positivo. Por ejemplo, la capacidad del sistema in vitro para traducir un gen de rastreo positivo tal como un gen marcador fluorescente, puede depender de la capacidad de la sintetasa mutante externa de cargar ARNt modificado para leer a través de un codón del gen marcador.
En una forma de realización, la selección o el rastreo negativo de la agrupación para RSs activas (opcionalmente mutantes) que preferiblemente aminoacilan el ARNt mutante en ausencia del aminoácido no natural incluye: introducir un marcador de selección o rastreo negativo con la agrupación de RSs activas (opcionalmente mutantes) procedentes de la selección o rastreo positivo en una pluralidad de sistema de traducción, en donde el marcador de selección o rastreo negativo comprende al menos un codón (p. ej., un codón para un gen marcador tóxico, p. ej., un gen de la ribonucleasa barnasa), cuya traducción depende de la capacidad de una RS candidata de cargar el ARNt mutante externo (con un aminoácido natural); e identificar el sistema de traducción que muestra una respuesta de rastreo específica en un primer medio suplementado con el aminoácido antinatural y un agente de rastreo o selección, pero fracasa en mostrar la respuesta específica en un segundo medio suplementado con el aminoácido natural y el agente de selección o rastreo, proporcionando con ello células supervivientes o células rastreadas con la al menos una RS recombinante.
En un aspecto, se varía la concentración del agente de selección (y/o rastreo). En algunos aspectos los primer y segundo organismos son diferentes. Así, el primer y/o segundo organismo comprende opcionalmente: un procariota, un eucariota, un mamífero, una Escherichia coli, un hongo, una levadura, una arqueobacteria, un Eubacterium, una planta, un insecto, un protista, etc. En otras formas de realización, el marcador de rastreo comprende un marcador de rastreo fluorescente o luminiscente (tal como la proteína verde fluorescente) o un marcador de rastreo basado en afinidad.
Además, algunos aspectos incluyen el que el marcador de selección negativa comprende un gen ribonucleasa barnasa (que comprende al menos uno de dichos codones). Otros aspectos incluyen que el marcador de rastreo comprende opcionalmente un marcador de rastreo fluorescente o luminiscente o un marcador de rastreo basado en afinidad. En las realizaciones de esta memoria, los rastreos y/o selecciones incluyen opcionalmente una variación de la rigurosidad de rastreo y/o selección.
En un aspecto, el segundo conjunto de RS mutadas se deriva de al menos una RS recombinante que puede ser generada por mutagénesis, p. ej., mutagénesis aleatoria, mutagénesis específica del sitio, recombinación o una combinación de las mismas.
Los métodos incorporados en esta memoria comprenden opcionalmente el que el aminoácido antinatural se selección, p. ej., de una O-metil-L-tirosina, una L-3-(2-naftil)alanina, una 3-metil-fenilalanina, una O-4-alil-Ltirosina, una 4-propil-L-tirosina, una tri-O-acetil-GlcNAcβ-serina, una L-Dopa, una fenilalanina fluorada, una isopropil-L-fenilalanina, una p-azido L-fenilalanina, una p-acil-L-fenilalanina, una p-benzoil-L-fenilalanina, una Lfosfoserina, una fosfonoserina, un fosfonotirosina, una p-yodo-fenilalanina, una p-bromofenilalanina, una p-aminoL-fenilalanina y una isopropil-L-fenilalanina. Una RS recombinante producida por los métodos de esta memoria también se incluye en las realizaciones descritas en esta memoria.
En un aspecto relacionado, métodos para producir un ARNt mutante externo recombinante incluyen: (a) generar un banco de ARNts mutantes derivados de al menos un ARNt, a partir de un primer organismo; (b) seleccionar (p. ej., seleccionar negativamente) o rastrear el banco de ARNts (opcionalmente mutantes) que se aminoacilan mediante una aminoacil-ARNt sintetasa (RS) procedente de un segundo organismo en ausencia de una RS procedente del
primer organismo, proporcionando de ese modo una agrupación de ARNts (opcionalmente mutantes); y, (c) seleccionar o rastrear la agrupación de ARNts (opcionalmente mutantes) en cuanto a miembros que se aminoacilan por una RS mutante externa introducida, proporcionando de este modo al menos un ARNt recombinante; en donde el al menos un ARNt recombinante reconoce un codón de aminoácido no natural y no es reconocido por la eficacia de la RS procedente del segundo organismo y se aminoacila preferiblemente por la RS mutante externa.
Los diversos métodos descritos en esta memoria comprenden opcionalmente, en donde la selección o el rastreo comprende uno o más selecciones o rastreos positivos o negativos, p. ej., un cambio en la permeabilidad de aminoácidos, un cambio en la eficacia de la traducción, y un cambio en la fidelidad de la traducción. Adicionalmente, el uno o más cambios se basan opcionalmente en una mutación en uno o más genes en un organismo en el que se utiliza un par ARNt-ARNt sintetasa mutante externo para producir tales proteínas. La selección y/o el rastreo de esta memoria comprende opcionalmente en el que se utilizan al menos 2 codones dentro de uno o más gen de selección o dentro de uno o más genes de rastreo. Tales múltiples codones se encuentran opcionalmente dentro del mismo gen o dentro de diferentes genes de rastre/selección. Adicionalmente, los múltiples codones opcionales son opcionalmente codones diferentes o comprenden el mismo tipo de codones.
Kits son una característica adicional de determinadas formas de realización descritas en esta memoria. Por ejemplo, los kits pueden incluir uno o más sistema de traducción como se señaló anteriormente (p. ej., una célula), uno o más ARNt (incluido ARNt modificado o mutado), uno o más AARS (incluida AARS modificada o mutada), uno o más aminoácidos antinaturales, p. ej., con el material de envasado apropiado, recipientes para contener los componentes del kit, materiales de instrucciones para poner en práctica de los métodos de esta memoria y/o similares. Si se proporcionan uno o más AARS y/o uno o más ARNt en un kit, éstos se pueden suministrar como ácidos nucleicos o proteínas, y pueden ser parte de un único vector o pueden estar contenidos en vectores separados. De manera similar, los productos de los sistemas de traducción (p. ej., proteínas tales como análogos de EPO que comprenden aminoácidos antinaturales) pueden proporcionarse en forma de kit, p. ej., con recipientes para contener los componentes del kit, materiales de instrucciones para poner en práctica los métodos de esta memoria y/o similares.
Usos Ilustrativos
Según se ha reseñado, bastantes más de 100 aminoácidos no codificados (todos ribosómicamente aceptables) se han introducido proteínas utilizando otros métodos (véase, p. ej., Schultz et al., J. Am. Chem. Soc., 103: 15631567, 1981; Hinsberg et al., J. Am. Chem. Soc., 104: 766-773, 1982; Pollack et al, Science, 242: 1038-1040, 1988; Nowak et al., Science, 268: 439-442, 1995) todos estos análogos pueden utilizarse en los presentes métodos para una incorporación eficaz de estos análogos en productos de proteínas.
En otra forma de realización preferida, dos o más análogos se pueden utilizar en el mismo sistema de traducción in vitro o in vivo, cada uno con su ARNt mutante externo o pares de sintetasa mutantes externos. Esto se logra más fácilmente cuando un aminoácido natural es codificado por cuatro o más codones (tales como seis para Leu y Arg). Sin embargo, para los aminoácidos codificados por sólo dos codones, se puede reservar para el aminoácido natural, mientras que el otro era "compartido" por uno o más análogos de aminoácido. Estos análogos pueden asemejarse a los de un solo aminoácido natural (por ejemplo, diferentes análogos de Phe), o pueden asemejarse a diferentes aminoácidos (por ejemplo, análogos de Phe y Tyr).
En determinadas formas de realización, un primer ácido nucleico que codifica una molécula de ARNt mutante externa/modificada que no se carga de manera eficaz por una aminoacil-ARNt sintetasa endógena en la célulal / sistema de traducción in vitro (IVT), o el propio ARNt mutante externo / modificado. De acuerdo con algunas formas de realización, un segundo ácido nucleico que codifica una aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) mutante externa / modificada también se introduce en la célula / IVT. La AARS mutante externa / modificada es capaz de cargar el ARNt mutante externo / modificado con un análogo de aminoácido elegido. El análogo de aminoácido puede entonces ser proporcionado a la célula de modo que se puede incorporar en una o más proteínas dentro de la célula o IVT.
En otras formas de realización, el entorno es una célula. Una diversidad de células (o lisados de las mismas adecuados para IVT) se puede utilizar en determinados métodos, que incluyen, por ejemplo, una célula bacteriana, una célula fúngica, una célula de insecto y una célula de mamífero (p. ej., una célula humana o una célula de mamífero no humano). En una realización, la célula es una célula de E. coli, en otra realización, la célula es una célula de Pseudomonas.
En determinadas formas de realización, el análogo de aminoácido puede ser proporcionado por contacto directo de la célula o IVT con el análogo, por ejemplo mediante la aplicación de una disolución del análogo a la célula en
cultivo, o mediante la adición directa del análogo al IVT. El análogo también se puede proporcionar introduciendo una o más construcciones adicionales de ácidos nucleicos en la célula / IVT, en donde la o las construcciones de ácido nucleico adicionales codifica una o más proteínas de síntesis de análogo de aminoácidos que son necesarias para la síntesis del análogo deseado.
Determinadas formas de realización implican, además, la introducción de una construcción de ácido nucleico molde en la célula / IVT, codificando el molde una proteína, en el que la construcción de ácido nucleico contiene al menos una secuencia de codón degenerado. Los ácidos nucleicos introducida en la célula / IVT se pueden introducir como una construcción o como una pluralidad de construcciones. En determinadas formas de realización, los diversos ácidos nucleicos se incluyen en la misma construcción. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden introducirse en cualesquiera vectores adecuados capaces de expresar el ARNt y / o las proteínas codificadas en la célula / IVT. En una forma de realización, las primera y segunda secuencias de ácidos nucleicos se proporcionan en uno o más plásmidos. En otra forma de realización, el vector o los vectores utilizados son vectores virales, que incluyen, por ejemplo, vectores adenovirales y lentivirales. Las secuencias se pueden introducir con una secuencia promotora apropiada para la célula / IVT, o múltiples secuencias que pueden ser inducibles para controlar la expresión de las secuencias.
Para su uso in vitro, una o más sintetasas mutante externas se pueden producir de forma recombinante y suministrar a cualquiera de los sistemas disponibles de traducción in vitro (tal como PROTEINscript-PRO™ basado en lisado de germen de trigo disponible comercialmente, el sistema de E. coli de Ambion® para la transcripción/traducción in vitro acoplada; o el kit Retic Lysate IVT™ basado en lisado de reticulocitos de conejo de Ambion®). Opcionalmente, el sistema de traducción in vitro se puede agotar selectivamente de uno o más AARSs naturales (por ejemplo, mediante inmuno-agotamiento utilizando anticuerpos inmovilizados contra AARS natural) y/o aminoácidos naturales, de manera que se puede lograr la incorporación mejorada del análogo. Alternativamente, los ácidos nucleicos que codifican las sintetasas mutantes externas rediseñadas pueden ser suministrados en lugar de las AARSs producidas de forma recombinante. El sistema de traducción in vitro también se suministra con los análogos a incorporar en productos proteicos maduros.
Aunque la síntesis in vitro de proteínas no puede llevarse a cabo, por lo general, a la misma escala que la síntesis in vivo, métodos in vitro pueden producir cientos de microgramos de proteína purificada que contienen análogos de aminoácidos. Tales proteínas han sido producidas en cantidades suficientes para su caracterización utilizando el dicroísmo circular (CD), espectrometría de resonancia magnética nuclear (RMN) y cristalografía de rayos X. Esta metodología también se puede utilizar para investigar el papel de hidrofobicidad, envasado, entropía de la cadena lateral y enlaces hidrógeno en la determinación de la estabilidad de proteínas y el plegamiento. También se puede utilizar para sondear un mecanismo catalítico, transducción de señales y la transferencia de electrones en proteínas. Además, las propiedades de las proteínas se pueden modificar utilizando esta metodología. Por ejemplo, se pueden generar proteínas foto-enjauladas que pueden ser activadas por fotólisis, y se han introducido nuevas manijas químicas en proteínas para la incorporación específica de sitio de sondas espectroscópicas ópticas y otras.
El desarrollo de una estrategia general para la incorporación de análogos de aminoácidos en proteínas in vivo, directamente desde los medios de crecimiento, mejoraría en gran medida el poder de mutagénesis de aminoácido antinaturales. Por ejemplo, la capacidad de sintetizar grandes cantidades de proteínas que contienen átomos pesados facilitaría la determinación de la estructura de la proteína, y la capacidad de sustituir de una manera específica del sitio fluoróforos o grupos fotoescindibles en proteínas en células vivas proporcionaría herramientas poderosas para el estudio de la función de proteínas in vivo. Alternativamente, se podrían mejorar las propiedades de las proteínas, proporcionando bloques de construcción con nuevos grupos funcionales tales como un aminoácido que contiene ceto.
Para el uso in vivo, una o más AARS se pueden suministrar a una célula huésped (procariota o eucariota) en forma de materiales genéticos tales como secuencias codificadoras en plásmidos o vectores virales, que opcionalmente pueden integrarse en el genoma del huésped y expresar de forma constitutiva o inducible las AARSs re-diseñadas. Una proteína heteróloga o endógena de interés se puede expresar en células huésped de este tipo, en presencia de análogos de aminoácidos suministrados. Los productos de proteína se pueden purificar después utilizando cualquier técnica de purificación de proteínas reconocida en la técnica, o técnicas especialmente diseñadas para la proteína de interés.
Estos son unos pocos medios posibles para generar un transcrito que codifica un polipéptido. En general, cualquier medio conocido en la técnica para la generación de transcritos se puede emplear para sintetizar proteínas con análogos de aminoácidos. Por ejemplo, cualquier sistema de transcripción in vitro o sistemas de transcripción / traducción acopladas se pueden utilizar para generar un transcrito de interés, que luego sirve como molde para la síntesis de proteínas. Alternativamente, para generar una transcripción se puede utilizar cualquier célula, célula /
línea celular modificada o componentes funcionales (lisados, fracciones de membrana, etc.) que sean capaces de expresar proteínas a partir de materiales genéticos. Estos medios para generar un transcrito incluirán típicamente componentes tales como la ARN polimerasa (T7, SP6, etc.) y co-factores, nucleótidos (ATP, CTP, GTP, UTP), factores de transcripción necesarios, y las condiciones tampón apropiadas, así como al menos un molde de ADN adecuado, pero también se pueden añadir otros componentes para condiciones de reacción optimizadas. Un experto en la técnica podría fácilmente imaginar otras formas de realización similares a las descritas en esta memoria.
Restos químicos
En determinadas formas de realización, el o los aminoácidos antinaturales y/o la molécula terapéutica comprenden un resto químicamente reactivo. El resto puede ser fuertemente electrofílico o nucleofílico y por lo tanto estará disponible para reaccionar directamente con la molécula terapéutica o el anticuerpo o fragmento del mismo. Alternativamente, el resto puede ser un electrófilo o nucleófilo más débil y, por lo tanto, requiere la activación antes de la conjugación con la molécula terapéutica o el anticuerpo o fragmento del mismo. Esta alternativa sería deseable cuando fuese necesario retrasar la activación del resto químicamente reactivo hasta que se añade un agente a la molécula con el fin de prevenir la reacción del agente con el resto. En cualquier escenario, el resto es químicamente reactivo, los escenarios difieren (en la reacción con el escenario de anticuerpo) por si después de la adición de un agente, el resto se hace reaccionar directamente con un anticuerpo o fragmento del mismo o se hace reaccionar primero con uno o más productos químicos para hacer que el resto sea capaz de reaccionar con un anticuerpo o fragmento del mismo. En determinadas formas de realización, el resto químicamente reactivo incluye un grupo amino, un grupo sulfhidrilo, un grupo hidroxilo, un grupo que contiene carbonilo, o un grupo lábil alquilo.
Determinadas formas de realización pueden emplear la química click, que incluye, pero no se limita a, la cicloadición 1,3-dipolar de Huisgen, en particular la variante escalonada catalizada por Cu(I), la reacción de Diels-Alder, sustitución nucleófila, especialmente a los pequeños anillos tensados tales como compuestos epoxi y aziridina, formación de ureas y amidas similar a la química del carbonilo, reacciones de adición a dobles enlaces carbono-carbono tal como epoxidación y dihidroxilación.
Por lo tanto, además de o en lugar de la glicosilación de polipéptidos de las formas de realización descritas en esta memoria, se pueden añadir otros restos químicos (incluyendo poli(etilen)glicol), enlazado, unido o conjugado o incorporado de otra manera a los polipéptidos modificados. La PEGilación es un proceso para fijar covalentemente oligosacáridos y polímeros sintéticos tales como polietilenglicol (PEG) de forma específica del sitio a moléculas de proteínas terapéuticas. La PEGilación puede mejorar significativamente la semi-vida de las proteínas mediante el blindaje del polipéptido frente a las enzimas proteolíticas y aumentar el tamaño aparente de la proteína, reduciendo así las tasas de aclaramiento. Además, conjugados de PEG pueden mejorar la solubilidad de la proteína y tienen efectos beneficiosos sobre la biodistribución. Las propiedades físicas y farmacológicas de proteínas PEGiladas se ven afectadas por el número y el tamaño de las cadenas de PEG fijadas al polipéptido, la ubicación de los sitios de PEG y la química utilizada para la PEGilación.
Ejemplos de conjugación de PEG a proteínas incluyen reacciones de PEGs derivatizados con éster de Nhidroxisuccinimidilo con lisina, reacciones de 1,4-adición de maleimida y PEGs derivatizados con vinilsulfona con cisteína, y condensación de hidrazida que contiene PEGs con aldehídos generados por la oxidación de las glicoproteínas. Cuando está presente más de un sitio reactivo en una proteína (p. ej., múltiples grupos amino o tiol)
o se utilizan electrófilos reactivos, puede producirse la fijación no selectiva de una o múltiples moléculas de PEG, lo cual conduce a la generación de una mezcla heterogénea que es difícil de separar. La falta de selectividad y de un control posicional en la fijación de cadenas de PEG puede conducir a pérdidas significativas en la actividad biológica y posiblemente a una inmunogenicidad potenciada de la proteína conjugada. De hecho, históricamente, la pérdida de actividad biológica y la heterogeneidad del producto han sido los dos problemas más comunes con los que se topa en el desarrollo de productos farmacéuticos de proteínas de acción prolongada utilizando técnicas estándares de PEGilación. La modificación de proteínas con PEGs reactivos con aminas resulta típicamente en una pérdida drástica de la actividad biológica debido a la modificación de los residuos lisina localizados en regiones de la proteína importantes para la actividad biológica. En determinadas situaciones, la bioactividad de hormonas de crecimiento se puede reducir 400 veces o más. Por ejemplo, la bioactividad de GCSF se reduce
1.000 veces cuando las proteínas se modifican utilizando tecnologías convencionales de PEGilación de aminas (Clark et al., J. Biol. Chem. 271: 21969, 1996; Bowen et al., Exp. Hematol. 27, 425, 1999). Así, existe la necesidad de un método que permite la fijación completamente específica del sitio e irreversible de cadenas de PEG a proteínas.
Sería ventajoso utilizar tecnologías avanzadas de ingeniería de proteínas para crear productos farmacéuticos de proteínas humanas, de acción prolongada, "agradables para el paciente", por ejemplo incorporando de aminoácidos antinaturales en una proteína de fármacos, de manera que la proteína de fármacos modificada
pueden lograr una semi-vida y/o una actividad biológica más larga y/o sostenida. En aras de este fin, pueden utilizarse determinadas formas de realización descritas en esta memoria para superar problemas tales como la heterogeneidad y la pérdida de la actividad inherente a las técnicas estándares de PEGilación con aminas. La incorporación de aminoácidos antinaturales proporcionará sitios únicos, predeterminados lejos de la unión o el sitio catalítico de la proteína diana, en que las moléculas de PEG pueden ser conjugadas de una forma específica del sitio. Además, las moléculas de PEG pueden fijarse a aminoácidos antinaturales a través de técnicas distintas a la PEGilación con aminas, evitando así los grupos amina primarios de lisinas una PEGilación indeseable. Estas técnicas se pueden utilizar para potenciar la semi-vida, la eficacia y/o la seguridad de los productos biofarmacéuticos en todos los ámbitos, incluyendo el campo específico de cáncer, endocrinología, enfermedades infecciosas, y la inflamación, etc.
Como un ejemplo ilustrativo, la Química Click o la cicloadición puede utilizarse para formar un enlace triazol. Un ejemplo particular de cicloadición es una [3 + 2] cicloadición de Huisgen mediada por cobre (Tornoe et al., J. Org. Chem. 67: 3057, 2002; Rostovtsev et al., Angew. Chem., Ed. Int. 41: 596, 2002; y Wang et al., J. Am. Chem. Soc.
125: 3192, 2003) de una azida y un alquino es mutante externo para todos los grupos funcionales encontrados en las proteínas, y forma un enlace triazol estable, esta reacción se puede utilizar para la PEGilación selectiva de proteínas. Por ejemplo, Deiters et al. (Bioorg. Med. Chem. Lett. 14(23): 5743-5745, 2004) informan de una metodología de PEGilación de aplicación general basada en la incorporación específica del sitio de paraazidofenilalanina en proteínas en levaduras. El grupo azido se utilizó en una reacción de [3 + 2] cicloadición suave con un reactivo de PEG derivatizado con alquino para proporcionar selectivamente proteína PEGilada. Esta estrategia debería ser útil para la generación de proteínas PEGiladas selectivamente para aplicaciones terapéuticas.
En determinadas formas de realización, el polipéptido es una proteína terapéutica, de diagnóstico, u otra proteína seleccionada de: Alfa-1-antitripsina, angiostatina, Factor antihemolítico, anticuerpos (incluido un anticuerpo o un fragmento funcional o derivado del mismo seleccionado de: Fab, Fab', F(ab)2, Fd, Fv, scFv, diacuerpo, tricuerpo, tetracuerpo, dímero, trímero o minicuerpo), moléculas angiogénicas, moléculas angiostáticas, apolipoproteína, apoproteína, factor natriurético auricular, polipéptido natriurético auricular, asparaginasa, adenosina desaminasa, hirudina, factor neurotrófico ciliar, factor morfogénico óseo (cualquiera y todas las BMPs), péptidos atriales, C-X-C quimioquinas (p. ej., T39765, NAP-2 , ENA-78, Gro-a, Gro-b, Groc, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG), calcitonina, quimioquinas CC (por ejemplo, proteína-1 quimioatractiva de monocitos, proteína-2 quimioatractiva de monocitos, proteína-3 quimioatractiva de monocitos, proteína-1 alfa inflamatoria de monocitos, proteína-1 beta inflamatoria de monocitos, RANTES, I309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262), ligando CD40, calcitonina, ligando C-kit, colágeno, factor estimulante de colonias (CSF), péptido natriurético tipo C (CNP), factor del complemento 5a, inhibidor del complemento, receptor 1 del complemento, citoquinas, (p. ej. péptido-78 activador de neutrófilos epitelial, GROα/MGSA, GROβ, GROγ, MIP-1α, MIP-1δ, MCP-1), ácidos desoxirribonucleicos, Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF), eritropoyetina, toxinas exfoliantes A y B, Factor IX, Factor VII, Factor VIlI, Factor X, Factor de Crecimiento de Fibroblastos (FGF), fibrinógeno, fibronectina, el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), folitropina, glucocerebrosidasa, gonadotropina, glucagón, GLP-1, factores de crecimiento, proteínas Hedgehog (p. ej., Sonic, India, Desert), hormona del crecimiento humano, hemoglobina, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), virus de la hepatitis, hirudina, albúmina de suero humano, insulina, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), interferones (p. ej., IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IFN-ε, IFN-ζ, IFN-η, IFN-κ, IFN-λ, IFN-τ, IFN-ϛ, IFN-ω), interleucinas (p. ej., IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, etc.), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), lactoferrina, factor inhibidor de la leucemia, luciferasa, hormona luteinizante, neurturina, factor inhibidor de neutrófilos (NIF), oncostatina M, proteína osteogénica, hormona paratiroidea, PD-ECSF, PDGF, hormonas peptídicas (p. ej., hormona de crecimiento humana), pleyotropina, proteína A, proteína G, fenilalanina hidroxilasa, parathormona (PTH), prolactina, exotoxinas pirogénicas A, B y C, relaxina, renina, ácidos ribonucleicos, SCF, receptor del complemento soluble I, Soluble I-CAM 1, receptores solubles de interleucina (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL14, IL-15), receptor de TNF soluble, somatomedina, somatostatina, somatotropina, estreptoquinasa, superantígenos, es decir, las enterotoxinas estafilocócicas (SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE), superóxido dismutasa (SOD), toxina del síndrome de choque tóxico (TSST-1), timosina alfa 1, activador tisular del plasminógeno, factor de necrosis tumoral beta (TNF beta), receptor de factor de necrosis tumoral (TNFR), factor de necrosis tumoral-alfa (TNF alfa), factor de necrosis tumoral relacionada con ligando inductor de apoptosis (TRAIL), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGEF), uroquinasa; un modulador de la transcripción que modula el crecimiento celular, la diferenciación o la regulación, en donde el modulador transcripcional es de procariotas, virus
o eucariotas, incluidos hongos, plantas, levaduras, insectos y animales, incluidos mamíferos; activador de la expresión seleccionado de citoquinas, moléculas inflamatorias, factores de crecimiento, sus receptores, productos de oncogenes, interleucinas (p. ej. IL-1, IL-2, IL-8, etc.), interferones, FGF, IGF-I, IGF-II, FGF , PDGF, TNF, TGFα, TGF-β, EGF, KGF, SCF/c-Kit, CD40L/CD40, VLA-4/VCAM-1, ICAM-1/LFA-1 y hialurina/CD44; moléculas de transducción de señales y los correspondientes productos de oncogenes, p. ej., Mos, Ras, Raf y Met; activadores y
supresores de la transcripción, p. ej., p53, Tat, Fos, Myc, Jun, Myb, ReI; receptores de hormonas esteroides seleccionados de receptores para el estrógeno, progesterona, testosterona, aldosterona, LDL, o corticosterona; o una enzima seleccionada de: amidasas, aminoácido racemasas, acilasas, deshalogenasas, dioxigenasas, diarilpropano peroxidasas, epimerasas, epóxido hidrolasas, esterasas, isomerasas, quinasas, glucosa isomerasas, glicosidasas, glicosil transferasas, haloperoxidasas, monooxigenasas (p. ej., P450s), lipasas , lignina peroxidasas, nitrilo hidratasas, nitrilasas, proteasas, fosfatasas, subtilisinas, transaminasas o nucleasas.
En el caso de que la proteína o molécula de interés a ser modificada sea un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, el o los residuos de aminoácidos no naturales se pueden colocar en cualquier lugar o posición en la estructura del anticuerpo, dependiendo del objetivo deseado. Por ejemplo, el residuo de aminoácido no natural se puede colocar en la región variable de Fab, la región Fc, o en otra ubicación que interactúa con la región Fc del anticuerpo. En otras formas de realización, el residuo de aminoácido no natural se puede colocar en la interfaz de unión del anticuerpo, o de la región VH. En determinadas formas de realización, el anticuerpo modificado exhibe un aumento
o disminución en su capacidad para exterminar a una o más dianas. En particular, puede ser deseable un anticuerpo con una mayor capacidad de exterminar una o más dianas, o con efectos secundarios reducidos.
En otras formas de realización, el o los aminoácidos no naturales confieren una afinidad de unión mejorada a un receptor de Fc y/o a C1q del sistema del complemento. En particular, un anticuerpo modificado puede tener una afinidad alterada (p. ej., potenciada) y/o una especificidad para un antígeno o un participante en la unión de proteínas (p. ej., C1q del complemento y/o el receptor de Fc en macrófagos, etc.). Por ejemplo, la modificación de una molécula puede aumentar o disminuir su función de citotoxicidad mediada por células dependiente del anticuerpo (ADCC), o complementar la actividad de fijación. En otros ejemplos, la modificación de una molécula particular puede aumentar o disminuir su capacidad de unirse a otra molécula de la estructura antagonista natural (tal como un anticuerpo).
Glicosilación a través de Aminoácidos Antinaturales
La modificación post-traduccional de proteínas mediante glicosilación puede afectar el plegamiento y la estabilidad de proteínas, modificar la actividad intrínseca de las proteínas y modular sus interacciones con otras biomoléculas. Véase, p. ej., Varki, Glycobiology 3: 97-130, 1993. Glicoproteínas naturales están a menudo presentes como una población de muchas glicoformas diferentes, lo que dificulta el análisis de la estructura de glicano y el estudio de los efectos de glicosilación sobre la estructura y función de proteínas. Por lo tanto, se necesitan métodos para la síntesis de proteínas glicosiladas homogéneamente naturales y antinaturales para la comprensión sistemática de la función de glicano, y para el desarrollo de terapias mejoradas con glicoproteínas.
Una estrategia previamente conocida para la fabricación de proteínas que tienen patrones de glicosilación deseados hace uso de glicosidasas para convertir una glicoproteína natural heterogénea a un simple núcleo homogéneo, sobre la que se pueden injertar sacáridos secuencialmente con glicosil transferasas. Véase, p. ej., Witte et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 2114-2118, 1997. Una limitación de esta estrategia es que los sitios de glicosilación primarios están predeterminados por la línea celular en la que se expresa la proteína. Alternativamente, un glicopéptido que contiene la estructura de glicano deseada se puede sintetizar mediante síntesis de péptidos en fase sólida. Este glicopéptido puede acoplarse a otros péptidos o fragmentos de proteínas recombinantes para producir una glicoproteína grande por ligamiento químico nativo (véase, p. ej., Shin et al., J. Am. Chem. Soc. 121: 11684-11689, 1999), el ligamiento de la proteína expresada (véase, p. ej., Tolbert y Wong, J. Am Chem. Soc. 122: 5421-5428, 2000), o con proteasas modificadas por ingeniería (véase, p. ej., Witte et al., J. Am Chem. Soc. 120: 1979-1989, 1998). Tanto el ligamiento químico nativo como el ligamiento de proteínas expresado son lo más eficaces con proteínas pequeñas, y requieren un residuo cisteína en el extremo N del glicopéptido.
Cuando se utiliza una proteasa para ligar péptidos juntos, el sitio de ligamiento se debe colocar alejado del sitio de glicosilación para los buenos rendimientos de acoplamiento. Véase, p. ej., Witte et al., J. Am. Chem. Soc. 120: 1979-1989, 1998. Una tercera estrategia consiste en modificar proteínas con sacáridos directamente utilizando métodos químicos. Se puede conseguir una buena selectividad con derivados de sacáridos de haloacetamida, que están acoplados al grupo tiol de la cisteína (véase, p. ej., Davis y Flitsch, Tetrahedron Lett. 32: 6793-6796, 1991, y Macmillan et al., Org. Lett. 4: 1467-1470, 2002). Sin embargo, este método puede ser problemático con proteínas que tienen más de un residuo cisteína.
Determinadas formas de realización proporcionadas en esta memoria describen métodos para la síntesis de glicoproteínas. Estos métodos implican, en algunas formas de realización, la incorporación en una proteína de un aminoácido antinatural que comprende un primer grupo reactivo; y poner en contacto la proteína con un resto de sacárido que comprende un segundo grupo reactivo, en donde el primer grupo reactivo reacciona con el segundo grupo reactivo, formando de este modo un enlace covalente que fija el resto de sacárido al aminoácido antinatural
de la proteína. Las glicoproteínas producidas por estos métodos también se incluyen en determinadas formas de realización.
El primer grupo reactivo es, en algunas formas de realización, un resto electrófilo (p. ej., un resto ceto, un resto aldehído, y/o similares), y el segundo grupo reactivo es un resto nucleófilo. En algunas formas de realización, el primer grupo reactivo es un resto nucleófilo y el segundo grupo reactivo es un resto electrófilo (p. ej., un resto ceto, un resto aldehído, y/o similares). Por ejemplo, un resto electrófilo está fijado al resto sacárido y el resto nucleófilo está fijado al aminoácido antinatural. El resto sacárido puede incluir un único resto carbohidrato, o el resto de sacárido puede incluir dos o más restos carbohidrato.
En algunas formas de realización, los métodos implican, además, poner en contacto el resto sacárido con una glicosil-transferasa, un resto donante de azúcar, y otros reaccionantes requeridos para la actividad glicosiltransferasa durante un tiempo suficiente y bajo condiciones apropiadas para transferir un azúcar desde el resto donante de azúcar al resto sacárido. El producto de esta reacción puede, si se desea, ser contactado por al menos una segunda glicosil-transferasa, junto con el resto donante de azúcar apropiado.
En determinadas formas de realización, el método comprende, además, poner en contacto e resto sacárido con una o más de una β1-4N-acetilglucosaminil transferasa, una α1,3-fucosil transferasa, una α1,2-fucosil transferasa, una α 4fucosil transferasa, una β1,4-galactosil transferasa, una sialil transferasa, y/o similares, para formar una estructura de oligosacárido biantenario o triantenario. En una forma de realización, el resto sacárido comprende un GlcNAc terminal, el resto donante de azúcar es UDP-Gal y la glicosil transferasa es una β1,4-galactosil transferasa.
En una realización, el resto sacárido comprende un GlcNAc terminal, el resto donante de azúcar es UDP-GlcNAc y la glicosiltransferasa es una β1,4-acetilglucosaminil transferasa.
Opcionalmente, las algunos métodos comprenden, además, poner en contacto el producto de la reacción de Nacetilglucosaminil transferasa con un β1,4-manosil transferasa y GDP-manosa para formar un resto sacárido que comprende Manβ1-4GlcNAcβ1-4GIcNAc. Opcionalmente, el método comprende, además, poner en contacto el resto Manβ1-4GlcNAcβ1-4GIcNAc con una α1,3-manosil transferasa y GDP-manosa para formar un resto sacárido que comprende Manα1-3Manβ1-4GlcNAcβ1-4GIcNAc. Opcionalmente, el método comprende, además, poner en contacto el resto Manα1-3Manβ1-4GlcNAcβ1-4GIcNAc con una α1-6 manosiltransferasa y GDP-manosa para formar un resto sacárido que comprende Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GIcNAc. Opcionalmente, el método comprende, además, poner en contacto el resto Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GIcNAc con una β1-2N-acetilglucosaminil transferasa y UDP-GlcNAc para formar un resto sacárido que comprende Manα16(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GIcNAc. Opcionalmente, el método comprende, además, poner en contacto el resto Manα1-6(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GIcNAc con una β1-2N-acetilglucosaminil transferasa y UDP-GlcNAc para formar un resto sacárido que comprende GlcNAcβ1-2Manα1-6(GlcNAcβ12Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GIcNAc.
La etapa de incorporar en una proteína un aminoácido antinatural que comprende un primer grupo reactivo, en algunas formas de realización, comprende utilizar un ARNt mutante externo, una RS mutante externa o un par ARNt/RS mutante externa. En tales casos, el ARNt mutante externo reconoce preferiblemente un codón degenerado para el ARNt de tipo salvaje, e incorpora el aminoácido antinatural en la proteína en respuesta al codón degenerado, y en donde la sintetasa mutante externa aminoacila preferiblemente el ARNt mutante externo con el aminoácido antinatural. En algunas formas de realización, el aminoácido no natural se incorpora en el polipéptido in vivo.
Se conoce una amplia diversidad de grupos reactivos adecuados por los expertos en la técnica. Tales grupos reactivos adecuados pueden incluir, por ejemplo, amino, hidroxilo, carboxilo, carboxilato, carbonilo, alquenilo, alquinilo, aldehído, éster, éter (p. ej., tio-éter), amida, amina, nitrilo, vinilo, sulfuro, sulfonilo, fosforilo, o grupos químicamente reactivos de manera similar. Grupos reactivos adecuados adicionales incluyen, pero no se limitan a, maleimida, N-hidroxisuccinimida, sulfo-N-hidroxisuccinimida, ácido nitrilotriacético, hidroxilo activado, haloacetilo
(p. ej., bromoacetilo, yodoacetilo), carboxilo activado, hidrazida, epoxi, aziridina, cloruro de sulfonilo, trifluorometildiaziridina, disulfuro de piridilo, N-acil-imidazol, carbamato de imidazol, vinilsulfona, carbonato de succinimidilo, arilazida, anhídrido, diazoacetato, benzofenona, isotiocianato, isocianato, imidoéster, fluorobenceno, biotina y avidina.
En algunas formas de realización, uno de los grupos reactivos es un resto electrófilo y el segundo grupo reactivo es un resto nucleófilo. El resto nucleófilo o el resto electrófilo se pueden fijar a la cadena lateral del aminoácido no natural; el grupo correspondiente se fija luego al resto sacárido.
Restos electrófilos adecuados que reaccionan con restos nucleófilos para formar un enlace covalente son conocidos por los expertos en la técnica. En determinadas formas de realización, tales restos electrófilos incluyen, pero no se limitan a, p. ej., un grupo carbonilo, un grupo sulfonilo, un grupo aldehído, un grupo cetona, un grupo éster estéricamente impedido, un grupo tioéster, un grupo imina estable, un grupo epóxido , un grupo aziridina, etc.
Restos nucleófilos adecuados que pueden reaccionar con un resto electrófilo son conocidos por los expertos en la técnica. En determinadas formas de realización, tales nucleófilos incluyen, por ejemplo, aminas alifáticas o aromáticas, tales como etilendiamina. En determinadas formas de realización, los restos nucleófilos incluyen, pero no se limitan a, p. ej., -NR1-NH2 (hidrazida), -NR1(C=O)NR2NH2 (semicarbazida), -NR1(C=S)NR2NH2 (tiosemicarbazida), -(C=O)NR1NH2 (carbonilhidrazida), -(C=S)NR1NH2 (tiocarbonilhidrazida), -(SO2)NR1NH2 (sulfonilhidrazida), -NR1NR2(C=O)NR3NH2 (carbazida), NR1NR2(C=S)NR3NH2 (tiocarbazida), -O-NH2 (hidroxilamina), y similares, en donde cada uno de R1, R2 y R3 es independientemente H, o alquilo que tiene 1-6 carbonos, preferiblemente H. En determinadas formas de realización, el grupo reactivo es una hidrazida, hidroxilamina, semicarbazida, carbohidrazida, una sulfonilhidrazida, o similares.
El producto de la reacción entre el nucleófilo y el resto electrófilo incorpora típicamente los átomos presentes originalmente en el resto nucleófilo. Enlaces típicos obtenidos por reacción de los aldehídos o cetonas con los restos nucleófilos incluyen productos de reacción tales como una oxima, una amida, una hidrazona, una hidrazona reducida, una carbohidrazona, una tiocarbohidrazona, un sufonilhidrazona, una semicarbazona, una tiosemicarbazona, o una funcionalidad similar, dependiendo del resto nucleófilo utilizado y el resto electrófilo (p. ej., aldehído, cetona, y/o similares) que se hace reaccionar con el resto nucleófilo. A enlaces con ácidos carboxílicos se les alude típicamente como carbohidrazidas o ácidos hidroxámicos. A enlaces con ácidos sulfónicos se les alude típicamente como sulfonilhidrazidas o N-sulfonilhidroxilaminas. El enlace resultante puede ser posteriormente estabilizado por reducción química.
Estos métodos pueden implicar, además, poner en contacto el resto sacárido con una glicosil transferasa, un resto donante de azúcar, y otros reaccionantes requeridos para la actividad glicosil transferasa durante un tiempo suficiente y bajo condiciones apropiadas para transferir un azúcar desde el resto donante de azúcar al resto sacárido. En determinadas formas de realización, el método comprende, además, poner en contacto el producto de la reacción de glicosil transferasa con al menos una segunda glicosiltransferasa y un segundo resto donante de azúcar. En otras palabras, determinadas formas de realización descritas en esta memoria proporcionan métodos en los que un resto sacárido enlazado a aminoácido o un aminoácido antinatural que incluye un resto sacárido se glicosila adicionalmente. Estas etapas de glicosilación se llevan a cabo preferiblemente (aunque no necesariamente) enzimáticamente utilizando, por ejemplo, una glicosiltransferasa, glicosidasa, u otra enzima conocida para los expertos en la técnica. En algunas formas de realización, se llevan a cabo una pluralidad de etapas enzimáticas en una única mezcla de reacción que contiene dos o más glicosil transferasas diferentes. Por ejemplo, se puede llevar a cabo una etapa de galactosilación y una etapa de sialilación simultáneamente incluyendo tanto sialil transferasa como galactosil transferasa en la mezcla de reacción.
Para síntesis enzimáticas de sacáridos que implican reacciones de glicosil transferasa, las células recombinantes contienen opcionalmente al menos un gen heterólogo que codifica una glicosil transferasa. Se conocen muchas glicosil transferasas, como lo son sus secuencias de polinucleótidos. Véase, p. ej., "The WWW Guide To Cloned Glycosyl transferases," (disponible en la World Wide Web). Secuencias de aminoácidos glicosil transferasa y secuencias de nucleótidos que codifican glicosil transferasas de las que pueden deducirse las secuencias de aminoácidos también se encuentran en diversas bases de datos disponibles públicamente, incluidas GenBank, Swiss-Prot, EMBL, y otras.
En determinadas formas de realización, una glicosil transferasa incluye, pero no se limita a, p. ej., una galactosil transferasa, una fucosil transferasa, una glucosil transferasa, una N-acetilgalactosaminil transferasa, una Nacetilglucosaminil transferasa, una glucuronil transferasa, una sialil transferasa, una manosil transferasa, una transferasa de ácido glucurónico, una transferasa de ácido galacturónico, una oligosacaril transferasa, y similares. Glicosil transferasas adecuadas incluyen las obtenidas de eucariotas o procariotas.
Un aceptor para las glicosil transferasas estará presente en la glicoproteína que ha de ser modificada por los métodos descritos en esta memoria. Aceptores adecuados incluyen, por ejemplo, aceptores de galactosilo tales como Galβ1,4GaINAc-; Galβ1,3GaINAc-; lacto-N-tetraosa-; Gal β1,3GIcNAc-; Gal β1,4GIcNAc-; Gal β1,3Ara-; Gal β1,6GIcNAc-; y Gal β1,4Glc-(lactosa). Otros aceptores conocidos por los expertos en la técnica (véase, p. ej., Paulson et al., J. Biol. Chem. 253: 5617-5624, 1978). Típicamente, los aceptores forman parte de un resto sacárido que está fijado a la glicoproteína.
En una forma de realización, el resto sacárido comprende un GIcNAc terminal, el resto donante de azúcar es UDP-GlcNAc y la glicosil transferasa es una β1-4N-acetilglucosaminil transferasa. En otra realización, el resto sacárido
comprende un GlcNAc terminal, el resto donante de azúcar es UDP-Gal y la glicosil transferasa es una β1-4galactosil transferasa. Asimismo se pueden añadir azúcares adicionales.
Las reacciones de glicosilación incluyen, además de la glicosil transferasa adecuada y aceptor, un azúcar nucleótido activado que actúa como un donante de azúcar para la glicosil transferasa. Las reacciones también pueden incluir otros ingredientes que facilitan la actividad glicosil transferasa. Estos ingredientes pueden incluir un catión divalente (p. ej., Mg2+ o Mn2+), materiales necesarios para la regeneración de ATP, iones fosfato, y disolventes orgánicos. Las concentraciones o cantidades de los diversos reaccionantes utilizados en los procedimientos dependen de numerosos factores que incluyen condiciones de reacción tales como la temperatura y el valor del pH, y la elección y cantidad de sacáridos aceptores a ser glicosilados. El medio de reacción también puede comprender detergentes solubilizantes (p. ej. Triton o SDS) y disolventes orgánicos tales como metanol o etanol, si es necesario.
También proporcionadas por parte de determinadas formas de realización para la modificación de una glicoproteína son composiciones que incluyen un sistema de traducción que puede o puede no incluir una célula huésped, un ARNt mutante externo, una RS mutante externa, o cualquiera o la totalidad de estos.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "resto sacárido" se refiere a restos de azúcares naturales y antinaturales (es decir, un resto de azúcar que se produce de forma no natural, p. ej., un resto azúcar que es modificado, p. ej., en una o más posiciones de hidroxilo o amino, p. ej., deshidroxilado, desaminado, esterificado, etc., p. ej., 2-desoxiGal es un ejemplo de un resto azúcar antinatural).
El término "carbohidrato" tiene la fórmula general (CH2O)n, e incluye, pero no se limita a, p. ej., monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. Los oligosacáridos son cadenas compuestas de unidades sacárido, que se conocen alternativamente como azúcares. Unidades sacárido se pueden organizar en cualquier orden y el enlace entre dos unidades sacárido puede producirse en cualquiera de aproximadamente diez maneras diferentes. Las siguientes abreviaturas se utilizan en esta memoria: Ara = arabinosilo; Fru = fructosilo; Fuc = fucosilo; Gal = galactosilo; GalNAc = N-acetilgalactosaminilo; Glc = glucosilo; GlcNAc = N-acetilgucosaminilo; Man = manosilo; y NeuAc = sialilo (típicamente N-acetilneuraminilo).
Se considera que los oligosacáridos tienen un extremo reductor y un extremo no reductor, sea o no el sacárido en el extremo reductor, de hecho, un azúcar reductor. De acuerdo con la nomenclatura aceptada, los oligosacáridos se representan en esta memoria con el extremo no reductor a la izquierda y el extremo reductor a la derecha. Todos los oligosacáridos descritos en esta memoria se describen con el nombre o abreviatura para el sacárido no reductor (p, ej., GaI), seguido por la configuración del enlace glicosídico (α o β), el enlace del anillo, la posición del anillo del sacárido reductor implicado en el enlace, y luego el nombre o la abreviatura del sacárido reductor (p. ej. GlcNAc). El enlace entre dos azúcares puede expresarse, por ejemplo, como 2,3; 2→3; 2-3; o (2,3). Enlaces naturales y no naturales (p. ej., 1-2; 1-3; 1-4; 1-6; 2-3; 2-4; 2-6; etc.) entre dos azúcares están incluidos en determinadas realizaciones. Cada uno de los sacáridos es una piranosa
La expresión "ácido siálico" (abreviado "Sia") se refiere a cualquier miembro de una familia de azúcares carboxilados de nueve carbonos. El miembro más común de la familia del ácido siálico es ácido N-acetilneuramínico (ácido 2-ceto-5-acetaminido-3,5-didesoxi-D-glicero-D-galactononulopiranos-1-ónico) (a menudo abreviado como Neu5Ac, NeuAc o NANA). Un segundo miembro de la familia es ácido N-glicolil-neuramínico (Neu5Gc o NeuGc), en el que el grupo N-acetilo de NeuAc está hidroxilado. Un tercer miembro de la familia del ácido siálico es el ácido 2-ceto-3-desoxi-nonulosónico (KDN) (Nadano et al., J. Biol. Chem. 261: 11550-11557, 1986; Kanamori et al., J. Biol. Chem. 265: 21811-21819, 1990). También se incluyen ácidos siálicos 9-sustituidos tales como 9-O-acilo C1-C6-Neu5Ac tal como 9-O-lactil-Neu5Ac o 9-O-acetil-Neu5Ac, 9-desoxi-9-fluoro-Neu5Ac y 9-azido-9-desoxi-Neu5Ac. Para una revisión de la familia del ácido siálico, véase, p. ej., Varki, Glycobiology 2: 2540, 1992; Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, comp. (editorial Springer, Nueva York (1992). La síntesis y el uso de compuestos de ácido siálico en un proceso de sialilación se describen, por ejemplo, en la solicitud internacional WO 92/16640 (cuyo contenido completo se incorpora en esta memoria como referencia).
Sustratos donantes para glicosil transferasas son azúcares nucleótidos activados. Tales azúcares activados consisten generalmente en uridina y guanosina difosfato, y citidina monofosfato, los derivados de los azúcares en los que el nucleósido difosfato o monofosfato sirve como un grupo lábil. Sistemas bacterianos, vegetales y de hongos a veces pueden utilizar otros azúcares nucleótidos activados.
La incorporación de un aminoácido no natural, p. ej., un aminoácido no natural que comprende un resto en el que puede estar fijado un resto sacárido, o un aminoácido antinatural que incluye un resto sacárido, se puede hacer para, p. ej., adaptar los cambios en la estructura y/o función de proteínas, p. ej. para cambiar el tamaño, acidez,
nucleofilia, enlaces hidrógeno, hidrofobia, accesibilidad de sitios diana de proteasa, acceso diana a un resto de proteína, etc. Las proteínas que incluyen un ácido amino antinatural, p. ej., un aminoácido no natural que comprende un resto en que se puede fijar un resto sacárido, o un aminoácido antinatural que incluye un resto sacárido, pueden tener propiedades catalíticas o físicas mejoradas o incluso totalmente nuevas.
Por ejemplo, las siguientes propiedades se modifican opcionalmente por la inclusión de un aminoácido antinatural,
p. ej., un aminoácido antinatural que comprende un resto amino, en que se puede fijar un resto sacárido, o un aminoácido antinatural que incluye un resto sacárido en una proteína: la toxicidad, biodistribución, propiedades estructurales, propiedades espectroscópicas, propiedades químicas y/o fotoquímicas, la capacidad catalítica, la semi-vida (p. ej., la semi-vida en suero), la capacidad de reaccionar con otras moléculas, p. ej. de forma covalente
o no covalente, y similares. Las composiciones que incluyen proteínas que incluyen al menos un aminoácido antinatural, p. ej., un aminoácido antinatural que comprende un resto al que puede fijarse un resto sacárido, o un aminoácido no natural que incluye un resto sacárido son útiles, p. ej., para nuevos productos terapéuticos, de diagnóstico, enzimas catalíticas, enzimas industriales, proteínas de unión (p. ej., anticuerpos) y, p. ej., el estudio de la estructura y función de proteínas. Véase, p. ej., Dougherty, Curr. Opin. en Chem. Biol., 4: 645-652 (2000).
En un aspecto, una composición incluye al menos una proteína con al menos uno, p. ej., al menos aproximadamente dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o al menos aproximadamente diez o más aminoácidos antinaturales, p. ej., un aminoácido no natural que comprende un resto al que se puede fijar un resto sacárido, o un aminoácido antinatural que incluye un resto sacárido, y/o que incluyen otro aminoácido antinatural. Los aminoácidos antinaturales pueden ser iguales o diferentes, p. ej., puede haber 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 o más sitios diferentes en la proteína que comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 o más aminoácidos antinaturales diferentes. En otro aspecto, una composición incluye una proteína con al menos uno, pero menos que todos, de un aminoácido particular presente en la proteína sustituida con el aminoácido antinatural, p. ej. un aminoácido antinatural que comprende un resto al que se puede fijar un resto sacárido, o un aminoácido antinatural que incluye un resto sacárido. Para una proteína dada con más de un aminoácido antinatural, los aminoácidos no naturales pueden ser idénticos o diferentes (p. ej., la proteína puede incluir dos o más tipos diferentes de aminoácidos antinaturales, o puede incluir dos de los mismos aminoácidos antinaturales). Para una proteína dada con más de dos aminoácidos antinaturales, los aminoácidos antinaturales pueden ser el mismo, diferente, o una combinación de múltiples aminoácidos antinaturales del mismo tipo con al menos un aminoácido antinatural diferente.
Esencialmente, cualquier proteína (o parte de la misma) que incluya un aminoácido antinatural, p. ej., un aminoácido antinatural que comprende un resto al que se fija un resto sacárido, tal como un aminoácido aldehído
o ceto-derivatizado, o un aminoácido antinatural que incluye un resto sacárido (y cualquier ácido nucleico codificante correspondiente, p. ej., que incluye uno o más codones selectores) se puede producir utilizando las composiciones y los métodos de esta memoria. No se intenta identificar los cientos de miles de proteínas conocidas, cualquiera de las cuales se puede modificar para incluir uno o más aminoácidos antinaturales, p. ej., adaptando cualquier método de mutación disponible para que incluya uno o más codones degenerados apropiados en un sistema de traducción relevante. Repositorios de secuencias comunes de proteínas conocidas incluyen GenBank EMBL, DDBJ y el NCBI. Otros repositorios pueden ser fácilmente identificados por búsquedas en internet.
Típicamente, las proteínas son, por ejemplo, al menos aproximadamente 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, o al menos aproximadamente 99% o más idénticas a cualquier proteína disponible (p. ej., una proteína terapéutica, una proteína de diagnóstico, una enzima industrial, o parte de la misma, y similares), y comprenden uno o más aminoácidos antinaturales.
Además de modificar uno o más residuos aminoácidos de la proteína, se puede modificar la composición de carbohidratos de la proteína, es decir, a través de la glicosilación. La modificación post-traducción de las proteínas por glicosilación puede afectar al plegamiento y la estabilidad de proteínas, modificar la actividad intrínseca de las proteínas y modular sus interacciones con otras biomoléculas. Véase, p. ej., Varki, Glycobiology 3: 97-130, 1993, se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Glicoproteínas naturales están a menudo presentes como una población de muchas glicoformas diferentes, lo que dificulta el análisis de la estructura de glicano y el estudio de los efectos de glicosilación sobre la estructura y función de proteínas. Por lo tanto, se necesitan métodos para la síntesis de proteínas glicosiladas homogéneamente naturales y antinaturales para la comprensión sistemática de la función de glicano, y para el desarrollo de productos terapéuticos de glicoproteína mejorados.
Una clase de proteínas que se pueden hacer utilizando determinadas composiciones y métodos descritos en esta memoria incluyen moduladores de la transcripción, enzimas, o una porción del mismo. Moduladores transcripcionales ilustrativos incluyen genes y proteínas moduladoras de la transcripción que modulan el crecimiento celular, la diferenciación, la regulación, o similares. Moduladores de la transcripción se encuentran en
procariotas, virus y eucariotas, incluidos hongos, plantas, levaduras, insectos y animales, incluidos mamíferos, proporcionando una amplia gama de dianas terapéuticas. Se apreciará que activadores de la expresión y la transcripción regulan la transcripción mediante muchos mecanismos, p. ej., mediante la unión a receptores, estimulando una cascada de transducción de señales, regulando la expresión de factores de transcripción, uniéndose a promotores y potenciadores, uniéndose a proteínas que se unen a promotores y potenciadores, desenrollando ADN, cortando y empalmando pre-ARNm, poliadenilando ARN y degradando ARN. Algunos ejemplos de enzimas incluyen, pero no se limitan a, p. ej., amidasas, aminoácido racemasas, acilasas, deshalogenasas, dioxigenasas, diarilpropano peroxidasas, epimerasas, epóxido hidrolasas, esterasas, isomerasas, quinasas, glucosa isomerasas, glicosidasas, glicosil transferasas, haloperoxidasas, monooxigenasas (p. ej., p450s), lipasas, lignina peroxidasas, nitrilo hidratasas, nitrilasas, proteasas, fosfatasas, subtilisinas, transaminasas y nucleasas.
Algunos de los polipéptidos que pueden ser modificados de acuerdo con determinadas formas de realización descritas en esta memoria están comercialmente disponibles (véase, p. ej., el catálogo de Sigma BioSciences y la lista de precios), y las correspondientes secuencias de proteínas y genes y, típicamente, muchas variantes de los mismos, son bien conocidos (véase, p. ej. GenBank).
Ejemplos de propiedades terapéuticamente relevantes que pueden ser manipuladas o modificadas por cualquiera de las realizaciones descritas en esta memoria (incluyendo la glicosilación y/o pegilación, y/o la incorporación de aminoácidos no naturales) incluyen la semi-vida sérica, la semi-vida útil, estabilidad, inmunogenicidad, actividad terapéutica, detectabilidad (p. ej., mediante la inclusión de grupos informadores (p. ej., etiquetas o sitios de unión de etiquetas) en los aminoácidos no naturales, la especificidad, la reducción de la DL50 u otros efectos secundarios, la capacidad de penetrar en el cuerpo a través del tracto gástrico (p. ej., disponibilidad oral) o similares. Ejemplos de propiedades de diagnóstico relevantes incluyen semi-vida útil, estabilidad, actividad diagnóstica, detectabilidad, especificidad, o similares. Ejemplos de propiedades enzimáticas relevantes incluyen semi-vida útil, estabilidad, especificidad, actividad enzimática, capacidad de producción, o similares.
Una diversidad de otras proteínas también se puede modificar para incluir uno o más aminoácidos antinaturales de acuerdo con determinadas formas de realización descritas en esta memoria. Por ejemplo, las proteínas procedentes de hongos infecciosos, p. ej., Aspergillus, especies de Candida; bacterias, particularmente E. coli, que sirve de modelo para bacterias patógenas, así como bacterias médicamente importantes tales como Staphylococci
(p.
ej., aureus), o Streptococci (p. ej., pneumoniae); protozoos tales como sporozoa (p. ej., Plasmodia), rizópodos
(p.
ej., Entamoeba) y flagelados (Trypanosoma, Leishmania, Trichomonas, Giardia, etc.); virus tales como virus de (+)ARN (ejemplos incluyen Poxvirus, p. ej., vaccinia; picornavirus, p. ej., polio; Togavirus, p. ej., rubéola; Flavivirus,
p.
ej., VHC, y Coronavirus), virus de (-)ARN (p. ej., Rhabdovirus, p. ej., VSV; Paramyxovirus, p. ej., RSV; Orthomyxovirus, p. ej., influenza; Bunyavirus; y Arenavirus), virus ADNds (Reovirus, por ejemplo), virus de ARN a ADN, es decir, Retrovirus, p. ej., VIH y HTLV, y determinados virus de ADN a ARN tales como hepatitis B.
Proteínas relacionadas con la agricultura tales como las proteínas de resistencia a los insectos (p. ej., las proteínas Cry), enzimas productoras de almidón y de lípidos, toxinas de plantas e insectos, proteínas de resistencia a la toxina, proteínas de desintoxicación de micotoxinas, enzimas de crecimiento de las plantas (p. ej., ribulosa 1,5bisfosfato carboxilasa/oxigenasa, "RUBISCO"), lipoxigenasa (LOX) y fosfoenolpiruvato (PEP) carboxilasa son también dianas adecuadas para la modificación por parte de determinadas formas de realización descritas en esta memoria.
En determinadas formas de realización, la proteína o polipéptido de interés (o parte del mismo) en los métodos y/o composiciones descritos en esta memoria es codificado por un ácido nucleico. Típicamente, el ácido nucleico comprende al menos un codón degenerado, al menos aproximadamente dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o al menos aproximadamente diez o más codones degenerados.
Así, los polipéptidos y polinucleótidos artificiales descritos anteriormente (p. ej., hecho por el hombre y que no se produce de forma natural) son también características de determinadas formas de realización descritas en esta memoria. Un polinucleótido artificial puede incluir, p. ej., (a) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido artificial; (b) un polinucleótido que es complementario a o que codifica una secuencia de polinucleótidos de (a); (c) un ácido nucleico que se hibrida a un polinucleótido de (a) o (b) bajo condiciones rigurosas, sustancialmente a lo largo de toda la longitud del ácido nucleico; (d) un polinucleótido que es al menos aproximadamente 95%, preferiblemente al menos aproximadamente 98% idéntico a un polinucleótido de (a), (b) o (c); y (e) un polinucleótido que comprende una variación conservativa de (a), (b), (c) o (d).
Aminoácidos antinaturales se describen generalmente arriba. De particular interés para la producción de glicoproteínas como se describe en esta memoria son aminoácidos antinaturales en que R en la Fórmula I incluye un resto que puede reaccionar con un grupo reactivo que está unido a un resto sacárido, para enlazar el resto
sacárido a una proteína que incluye el aminoácido antinatural. Grupos R adecuados incluyen, por ejemplo, ceto-, azido-, hidroxil-, hidrazina, ciano-, halo-, aminooxi-, alquenilo, alquinilo, carbonilo, éter, tiol, seleno-, sulfonil-, borato, boronato, fosfo , fosfono, fosfina, heterocíclico, enona, imina, (aldehído, éster, tioácido, tioéster, éster estéricamente impedido, hidroxilamina, amina, y similares, o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, los aminoácidos antinaturales tienen un reticulante fotoactivable.
Además de aminoácidos antinaturales que contienen nuevas cadenas laterales, los aminoácidos antinaturales también comprenden opcionalmente estructuras de cadena principal modificada, p. ej., como se ilustra por las estructuras de las Fórmulas II y III:
Fórmula II Fórmula III en donde Z comprende típicamente OH, NH2, SH, NH-R’ o S-R'-; X e Y, que pueden ser iguales o diferentes, comprenden típicamente S u O, y R y R’, que son opcionalmente iguales o diferentes, se seleccionan típicamente de la misma lista de constituyentes para el grupo R descrito anteriormente para los aminoácidos antinaturales que tienen la Fórmula I así como hidrógeno. Por ejemplo, los aminoácidos antinaturales descritos en esta memoria comprenden opcionalmente sustituciones en el grupo amino o carboxilo tal como se ilustra por las Fórmulas II y III. Aminoácidos antinaturales de este tipo incluyen, pero no se limitan a α-hidroxiácidos, α-aminotiocarboxilatos de αtioácidos, p. ej., con cadenas laterales correspondientes a los veinte aminoácidos naturales comunes o a cadenas laterales antinaturales. Además, sustituciones en el carbono α incluyen, opcionalmente, L o D o aminoácidos α,αdisustituidos tales como D-glutamato, D-alanina, D-metil-O-tirosina, ácido aminobutírico, y similares. Otras alternativas estructurales incluyen aminoácidos cíclicos tales como análogos de prolina, así como análogos de prolina de anillos de 3, 4, 6, 7, 8 y 9 miembros, β-y γ-aminoácidos tales como β-alanina sustituida y ácido γaminobutírico.
Por ejemplo, muchos aminoácidos antinaturales se basan en aminoácidos naturales tales como tirosina, glutamina, fenilalanina y similares. Análogos de tirosina incluyen tirosinas para-sustituidas, tirosinas ortosustituidas y meta-sustituidas, en donde la tirosina sustituida comprende un grupo acetilo, un grupo benzoilo, un grupo amino, una hidrazina, una hidroxiamina, un grupo tiol, un grupo carboxi, un grupo isopropilo, un grupo metilo, un hidrocarburo C6-C20 de cadena lineal o ramificada, un hidrocarburo saturado o insaturado, un grupo Ometilo, un grupo poliéter, un grupo nitro, o similares. Además, también se contemplan anillos de arilo polisustituidos. Análogos de glutamina incluyen, pero no se limitan a derivados α-hidroxi, derivados γ-sustituidos, derivados cíclicos, y derivados de glutamina amida-sustituidos. Análogos de fenilalanina ilustrativos incluyen, pero no se limitan a fenilalaninas meta-sustituidas, orto-sustituidas y/o para-sustituidas, en donde el sustituyente comprende un grupo hidroxi, un grupo metoxi, un grupo metilo, un grupo alilo, un aldehído o grupo ceto, o similares.
Ejemplos específicos de aminoácidos antinaturales incluyen, pero no se limitan a, p-acetil-L-fenilalanina, O-metil-Ltirosina, una L-3-(2-naftil)alanina, una 3-metil-fenilalanina, una O-4-alil-L-tirosina, una 4-propil-L-tirosina, una tri-Oacetil-GlcNAcβ-serina, β-O-GlcNAc-L-serina, una tri-O-acetil-GlcNAc-α-treonina, una α-GalNAc-L-treonina, una L-Dopa, una fenilalanina fluorada, una isopropil-L-fenilalanina, una p-azido L-fenilalanina, una p-acil-L-fenilalanina, una p-benzoil-L-fenilalanina, una L-fosfoserina, una fosfonoserina, un fosfonotirosina, una p-yodo-fenilalanina, una p-bromofenilalanina, una p-amino-L-fenilalanina, una isopropil-L-fenilalanina, las listadas más adelante o en otra parte en esta memoria, y similares.
Aminoácidos antinaturales adecuados para su uso en algunos de los métodos descritos en esta memoria también incluyen los que tienen un resto sacárido fijado a la cadena lateral del aminoácido. En una forma de realización, un aminoácido antinatural con un resto sacárido incluye un aminoácido serina o treonina con un resto Man, GalNAc, GIC, Fuc o Gal. Ejemplos de aminoácidos antinaturales que incluyen un resto sacárido incluyen, pero no se limitan a, p. ej., una tri-O-acetil-GlcNAcβ-serina, una β-O-GlcNAc-L-serina, una tri O-acetil-GalNAc-α-treonina, una αGalNAc-L-treonina, una O-Man-L-serina, una tetra-acetil-O-Man-L-serina, una O-GalNAc-L-serina, una tri-O-acetilGalNAc-L-serina, una Glc-L-serina, una tetraacetil-Glc-L-serina, una fuc-L-serina, una tri-acetil-fuc-L-serina, una OGal-L-serina, una tetra-acetil-O-Gal-L-serina, una beta-O-GlcNAc-L-treonina, un tri-acetil-beta-GlcNAc-L-treonina, una O-Man-L-treonina, una tetra-acetil-O-Man-L-treonina, una O-GalNAc-L-treonina, una tri-acetil-O-GalNAc-Ltreonina, una Glc-L-treonina, una tetraacetil-Glc-L-treonina, una fuc-L-treonina, una tri-acetil-fuc-L-treonina, una OGal-L-treonina, una tetra-acetil-O-Gal-L-serina, y similares. Determinadas formas de realización también incluyen
formas de lo anterior no protegidas y acetiladas.
En algunas formas de realización, el diseño de aminoácidos antinaturales es desviado por información conocida sobre los sitios activos de sintetasas, p. ej., ARNt sintetasas mutantes externas utilizados para aminoacilar un ARNt mutante externo. Por ejemplo, se proporcionan tres clases de análogos de glutamina, incluidos derivados sustituidos en el nitrógeno de la amida (1), un grupo metilo en la posición γ (2), y un derivado N-Cγ cíclico (3). En base a la estructura cristalina de rayos x de GInRS de E. coll, en el que los residuos del sitio de unión clave son homólogas a GInRS de levadura, los análogos fueron diseñados para complementar una disposición de mutaciones de la cadena lateral de residuos dentro de un intervalo de 10 Å de la cadena lateral de glutamina, p. ej. una mutación del sitio activo Phe233 a un pequeño aminoácido hidrófobo puede ser complementado por el aumento de volumen estérico en la posición de Cγ de Gln.
Por ejemplo, 1,5-anhídrido N-ftaloil-L-glutámico (compuesto número 4 en la FIG. 23 del documento WO 02/085923) se utiliza opcionalmente para sintetizar análogos de glutamina con sustituyentes en el nitrógeno de la amida. Véase, p. ej., King y Kidd, J. Chem. Soc., 3315-3319, 1949; Friedman y Chatterrji, J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752, 1959; Craig et al., J. Org. Chem. 53, 1167-1170, 1988; y Azoulay et al., Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5, 1991. El anhídrido se prepara típicamente a partir de ácido glutámico, primero mediante protección de la amina como la ftalimida, seguido por calentamiento a reflujo en ácido acético. El anhídrido se abre luego con un cierto número de aminas, resultando en una gama de sustituyentes en la amida. La desprotección del grupo ftaloilo con hidrazina proporciona un aminoácido libre tal como se muestra en la FIG. 23 del documento WO 2002/085923.
La sustitución en la posición γ se consigue típicamente a través de alquilación de ácido glutámico. Véase, p. ej., Koskinen y Rapoport, J. Org. Chem. 54, 1859-1866, 1989. Un aminoácido protegido, p. ej. tal como se ilustra por el número de compuesto 5 en la FIG. 24 del documento WO 02/085923 se prepara opcionalmente primero por alquilación del resto amino con 9-bromo-9-fenilfluoreno (PhfIBr) (véase, p. ej. Christie y Rapoport, J. Org. Chem. 1989, 1859-1866, 1985) y, a continuación, esterificación del resto ácido utilizando O-terc-butil-N,N'diisopropilisourea. La adición de KN(Si(CH3)3)2 desprotona de forma regioselectiva en la posición β del éster metílico para formar el enolato, que luego se alquila opcionalmente con una gama de yoduros de alquilo. La hidrólisis del éster t-butílico y el grupo Phfl dio el análogo de γ-metil-glutamina deseado (Compuesto número 2 en la FIG. 24 del documento WO 02/085923).
Determinadas otras formas de realización incluyen un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo (o su fragmento funcional) específico para una diana (p. ej., una célula diana), el anticuerpo (o fragmento o equivalente funcional del mismo) conjugado, en posiciones específicas predeterminadas, con dos o moléculas terapéuticas, en el que cada una de las posiciones comprenden un aminoácido antinatural. En determinadas formas de realización, los fragmentos de anticuerpo son fragmentos F(ab')2, Fab', Fab o Fv.
En determinadas formas de realización, las dos o más moléculas terapéuticas son las mismas. En determinadas formas de realización, las dos o más moléculas terapéuticas son diferentes. En determinadas formas de realización, las moléculas terapéuticas están conjugadas con los mismos aminoácidos antinaturales. En determinadas formas de realización, las moléculas terapéuticas se conjugan con diferentes aminoácidos antinaturales.
En determinadas formas de realización, la naturaleza o química del aminoácido antinatural/enlace de molécula terapéutica permite la escisión del enlace bajo determinadas condiciones tales como condiciones de carácter ácido suaves o débiles (p. ej., aproximadamente pH 4-6, de preferencia aproximadamente pH 5), entorno reductor (p. ej., la presencia de un agente reductor), o cationes divalentes, y está opcionalmente acelerada por el calor.
En determinadas formas de realización, la molécula terapéutica está conjugada a un anticuerpo a través de un enlazador / espaciador (p. ej., una o más repeticiones de metileno (-CH2-), metilenoxi (-CH2-O-), metilencarbonilo (-CH2-CO-), aminoácidos, o combinaciones de los mismos).
Complejos multiproteicos
Los aminoácidos antinaturales se pueden también utilizar para unir dos o más proteínas o sub-unidades de proteínas con funcionalidades únicas. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se pueden generar mediante el enlace de dos anticuerpos (o partes funcionales de los mismos o sus derivados, tales como fragmentos Fab, Fab', Fd, Fv, scFv, etc.) a través de aminoácidos antinaturales incorporados en el mismo.
Así, determinadas formas de realización en esta memoria proporcionan métodos para la síntesis de conjugados de multiproteicos. Estos métodos implican, en algunas formas de realización, la incorporación en una primera proteína (p. ej., un primer anticuerpo) un primer aminoácido no natural que comprende un primer grupo reactivo; y
poner en contacto la primera proteína con una segunda proteína (p. ej., un segundo anticuerpo) que comprende un segundo aminoácido antinatural que comprende un segundo grupo reactivo, en donde el primer grupo reactivo reacciona con el segundo grupo reactivo, formando de este modo un enlace covalente que fija la segunda proteína a la primera proteína.
El primer grupo reactivo es, en algunas realizaciones, un resto electrófilo (p. ej., un resto ceto, un resto aldehído, y/o similares), y el segundo grupo reactivo es un resto nucleófilo. En algunas formas de realización, el primer grupo reactivo es un resto nucleófilo y el segundo grupo reactivo es un resto electrófilo (p. ej., un resto ceto, un resto aldehído, y/o similares). Por ejemplo, un resto electrófilo está fijado al aminoácido antinatural del primer anticuerpo y el resto nucleófilo está fijado al aminoácido antinatural del segundo anticuerpo.
Diferentes dominios funcionales de proteínas diferentes pueden estar unidos entre sí de manera similar para crear nuevas proteínas con nuevas funciones (p. ej., nuevos factores de transcripción con una combinación única de unión a ADN y dominios de activación de la transcripción; nuevas enzimas con nuevos dominios reguladores, etc.).
Unión sensible al pH
Muchas interacciones de proteínas son sensibles al pH, en el sentido de que la afinidad de unión de una proteína a su participante en la unión habitual puede cambiar a medida que cambia el pH del entorno. Por ejemplo, muchos ligandos (tales como insulina, interferones, hormona de crecimiento, etc.) se unen a sus respectivos receptores de la superficie celular para provocar la transducción de señales. El complejo ligando-receptor será entonces internalizado por endocitosis mediada por receptor, y pasa por una serie sucesiva de endosomas más y más ácidos. Finalmente, la interacción ligando-receptor se debilita a un cierto pH de carácter ácido (p. ej., aproximadamente pH 5,0), y el ligando se disocia del receptor. Algunos receptores (y quizás algunos ligandos) pueden ser reciclados de nuevo a la superficie celular. Allí, pueden ser capaces de unirse a sus respectivos participantes en la unión normales.
Si la unión sensible al pH puede ser modulada de tal manera que el complejo ligando-receptor puede disociarse a un pH relativamente más alto, entonces determinados ligandos pueden ser disociados antes de sus receptores, y son reciclados preferentemente a la superficie celular en lugar de ser degradados. Esto resultará en una semi-vida incrementada in vivo de tales ligandos, lo que podría ser deseable, ya que puede ser necesaria menos insulina para una eficacia igual (o mejor) en pacientes de diabetes. En otras situaciones, puede ser deseable modular la unión sensible al pH, favoreciendo la unión a un pH más bajo.
Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales son generalmente muy específicos para sus dianas. Sin embargo, en muchas aplicaciones, tales como en la terapia del cáncer, tienden a provocar determinados efectos secundarios, por ejemplo, uniéndose a tejidos no tumorales. Una razón podría ser que las dianas de tumores contra los que se dirigen anticuerpos monoclonales no se expresan específicamente en células tumorales, sino que también se expresan (aunque puede ser en menor número) en algunas células sanas. Estos efectos secundarios son generalmente indeseables, y hay una necesidad de anticuerpos con una especificidad mejorada.
El pH de la sangre humana está altamente regulado y se mantiene en el intervalo de aproximadamente 7,6-7,8. Por otra parte, las células tumorales tienen un pH extracelular de 6,3-6,5, debido a la acumulación de ácidos metabólicos que se borran de manera ineficaz debido a la vascularización deficiente del tumor. Si la interacción entre un antígeno tumoral y su anticuerpo terapéutico puede ser modulada de tal forma que a pH bajo, se ve favorecida la unión, el tumor-anticuerpo puede tener una especificidad / afinidad / selectividad añadida para esos antígenos tumorales, a pesar de que los mismos antígenos tumorales también se encuentran, en ocasiones, en los tejidos normales.
De hecho, dichos anticuerpos modificados pueden ser deseables no sólo para la terapia del cáncer, sino también deseables para cualquier unión antígeno-anticuerpo que pueda producirse a un nivel inferior al normal de pH.
Técnicas generales
La práctica de las formas de realización descritas en esta memoria empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, biología celular, cultivo celular, microbiología y ADN recombinante, que están dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., comp. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volúmenes I y Il (D.N. Glover comp., 1985.); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait comp., 1984.); Mullis et al.; patente de EE.UU. Nº: 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B.D. Harnes y S.J. Higgins comps. 1984); Transcription And Translation (B.D. Harnes y S.J. Higgins comps. 1984); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); el tratado, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.,
N.Y.); Methods in Enzymology, Vols. 154 y 155 (Wu et al. comps.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, comps., Academic Press, Londres, 1987).
Además de ello, los textos generales que describen la clonación, la mutación, el cultivo de células en general y similares, incluyen Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology vol. 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger); Sambrook et al, Molecular Cloning -A Laboratory Manual (3ª Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 2000 ("Sambrook") y Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., comps., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (suplementado a lo largo de 2002) ("Ausubel")) están todos incorporados como referencia en su totalidad. Estos textos describen mutagénesis, el uso de vectores, promotores y muchos otros temas relevantes relacionados, p. ej., con la generación de ARNt mutante externo, sintetasas mutantes externas, y pares de los mismos.
Diversos tipos de mutagénesis se utilizan en determinadas formas de realización, p. ej., para producir nuevas sintetasas o ARNts. Estos incluyen, pero no se limitan a dirigido al sitio (tal como a través del uso del codón Ámbar, Ocre, Ocre Oscuro u otro codón de terminación), a través de mutagénesis de codones por bamboleo, mutagénesis puntual aleatoria, recombinación homóloga (barajeo de ADN), mutagénesis utilizando moldes que contienen uracilo, mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, mutagénesis de ADN modificada con fosforotioato, mutagénesis utilizando ADN dúplex con huecos, o similares. Métodos adecuados adicionales incluyen la reparación del punto de emparejamiento erróneo, la mutagénesis utilizando cepas huéspedes deficientes en la reparación, restricción-selección y restricción-purificación, mutagénesis por deleción, mutagénesis por síntesis génica total, reparación de rotura de doble hebra, y similares. La mutagénesis, p. ej., que implica construcciones quiméricas, también se incluyen en determinadas formas de realización. En una forma de realización, la mutagénesis puede ser guiada por la información conocida de la molécula que se produce de forma natural o la molécula que se produce de forma natural alterada o mutada, p. ej., la secuencia, la comparación de secuencias, las propiedades físicas, estructura cristalina o similares.
Los textos y ejemplos anteriores que se encuentran en esta memoria describen estos procesos, así como las siguientes publicaciones y referencias citadas en los mismos: Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19: 456-460 (2001); Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal. Biochem. 254 (2): 157-178 (1997); Date et al., Methods Mol. Biol. 57: 369-374 (1996); I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995); W. P .C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); Arnold, Curr. Opin. in Biotech. 4:450-455 (1993); Bass et al., Science 242: 240-245 (1988);. Fritz et al., Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988); Kramer et al., Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988); Sakamar y Khorana, Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988); Sayers et al., Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988); Sayers et al., Nucl. Acids Res. 16: 803-814 (1988); Carter, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987); Kramer y Fritz Methods in Enzymol. 154:350-367 (1987); Kunkel, Nucleic Acids & Mol. Biol. (Eckstein, F.y Lilley, D.
M. J. comps., Springer Verlag, Berlín)) (1987); Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987); Zoller y Smith, Methods in Enzymol. 154:329-350 (1987); Carter, Biochem. J. 237:1-7 (1986); Eghtedarzadeh y Henikoff, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986); Mandecki, PNAS, USA, 83:7177-7181 (1986); Nakamaye y Eckstein, Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986); Wells et al., Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986); Botstein y Shortle, Science 229:1193-1201(1985); Carter et al., Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985); Grundström et al., Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985); Kunkel, PNAS, USA 82:488-492 (1985); Smith, Ann. Rev. Genet. 19:423-462(1985); Taylor et al., Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985); Taylor et al., Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Wells et al., Gene 34:315-323 (1985); Kramer et al., Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984); Kramer et al., Cell 38:879-887 (1984); Nambiar et al., Science 223: 1299-1301 (1984); Zoller y Smith, Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983); y Zoller y Smith, Nucl Acids Res. 10:6487-6500 (1982). Detalles adicionales sobre muchos de los métodos anteriores se pueden encontrar en Methods in Enzymology Volumen 154, que también describe controles útiles para los problemas de resolución de problemas con diversos métodos de mutagénesis.
Los oligonucleótidos, p. ej., para uso en mutagénesis en determinadas formas de realización, p. ej., mutando bancos de sintetasas, o alterando ARNts, se sintetizan típicamente por vía química de acuerdo con el método del triéster de fosforoamidita en fase sólida descrito por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Letts. 22 (20): 1859-1862, (1981), p. ej., utilizando un sintetizador automatizado, según se describe en Needham-VanDevanter et al., Nucl Acids Res., 12: 6159-6168 (1984).
Además, esencialmente cualquier ácido nucleico puede ser ordenado de forma personalizada o estandarizada de cualquiera de una diversidad de fuentes comerciales, como The Midland Certified Reagent Company, The Great American Gene Company, ExpressGen Inc., Operon Technologies Inc. (Alameda, Calif.) y muchas otras.
Todas las formas de realización descritas en esta memoria están destinadas a ser capaces de ser combinadas con una o más otras formas de realización, incluso para las que se describen en diferentes secciones de la descripción.
Todas las anteriores patentes de EE.UU., publicaciones de solicitudes de patente de EE.UU., solicitudes de patente de EE.UU., las patentes extranjeras, solicitudes de patente extranjeras y publicaciones no patente a las que se alude en esta memoria y/o se listan en la Hoja de Datos de Solicitud, se incorporan a esta memoria como referencia en su totalidad.
EJEMPLOS
Estos ejemplos ilustran la incorporación de un análogo de aminoácido en proteínas en las posiciones codificadas por codones que normalmente codifican específicamente fenilalanina (Phe) o codifican específicamente triptófano (Trp). Un diagrama esquemático se muestra en la Figura 1. Se pueden utilizar estrategias similares para cualesquiera otros análogos.
Phe es codificada por dos codones, UUC y UUU. Ambos codones son leídos por un único ARNt que está equipado con la secuencia de anticodón GAA. Por lo tanto, el codón CUU es reconocido a través del apareamiento de bases estándar de Watson-Crick entre codón y anticodón; UUU se lee a través de un par de bases de bamboleo G-U en la primera posición del anticodón (Crick, J. Mol. Biol. 19: 548, 1966; Soll y Rajbhandary, J. Mol. Biol. 29: 113, 1967). La desnaturalización térmica de los dúplex de ARN ha proporcionado estimaciones de las energías libres de Gibbs de fusión de pares de bases G-U, G-C, A-U, y A-C como 4,1, 6,5, 6,3 y 2,6 kcal/mol, respectivamente, a 37ºC. Así, el par de bases de bamboleo, G-U es menos estable que el par de bases de Watson-Crick, A-U. Un ARNtPhe modificado, equipado con el anticodón AAA (ARNTPhe AAA) fue diseñado para leer el codón UUU, y se predijo que leía tales codones de una manera más rápida que el ARNtPheGAA de tipo salvaje.
La dihidrofolato reductasa murina (mDHFR), que contiene nueve residuos Phe, fue elegida como la proteína de ensayo. El plásmido de expresión pQE16 codifica mDHFR bajo el control de un promotor de bacteriófago T5; la proteína está equipada con una etiqueta hexahistidina C-terminal (HIS6) para facilitar la purificación a través de cromatografía de afinidad con metal inmovilizada.
Los PheRS de levadura modificada (mu-yPheRS) se preparó mediante la introducción de una mutación Thr415Gly
o Thr415AIa en la subunidad α de la sintetasa (Datta et al., J. Am. Chem. Soc., 124: 5652, 2002). La cinética de activación de NaI y Phe por parte de mu-yPheRS se analizaron in vitro a través del ensayo de intercambio de adenosina trifosfato-pirofosfato. Se encontró que la constante de especificidad (kcat/KM) para la activación de NaI por parte de mu-yPheRS era 1,55 * 10-3 (s-1 M-1), 8 veces mayor que la de Phe. Por lo tanto, cuando la relación de NaI a Phe en el medio de cultivo es alta, yARNtPheAAA debería ser cargado predominantemente con NaI. Además, el mutante T415G fue generado por mutagénesis de cuatro cebadores.
Tanto la sintetasa de E. coli como de levaduras son α2β2 hetero-tetrámeros y los pesos moleculares para cada una de las subunidades son bastante diferentes α(ePheRS) = 37 kDa; α(yPheRS) = 57 kDa; β(ePheRS) = 87 kDa; y β(yPheRS) = 67,5, todos aproximadamente.
Por lo tanto, los siguientes ejemplos se proporcionan como modo de ilustración y no a modo de limitación.
EJEMPLO 1
Con el fin de alterar la capacidad de una aminoacil ARNt sintetasa de levadura, el gen yPheRS se amplificó a partir del plásmido molde pUC-ASab2 que codifica subunidades alfa y beta del gen PheRS. La amplificación se llevó a cabo con una secuencia intergénica de 14 pares de bases que contiene un sitio de reiniciación de la traducción aguas arriba del código de inicio ATG del gen de la subunidad beta.
Se utilizaron los siguientes oligo-cebadores para la PCR: 5'-CGA TTT TCA CAC AGG ATC CAG ACC ATG ATT CTA G-3' (SEQ ID NO: 7) (cebador 1 con el sitio de restricción BamHI) y 5'-GAC GGC CAG TGA ATT CGA GCT CGG TAC-3' (SEQ ID NO: 8) (cebador 2 con el sitio de restricción KpnI). El producto de ADN resultante se introdujo en los sitios BamHI y KpnI de pQE32 para dar pQE32-yFRS. El polinucleótido yPheRS mutante fue generado mediante el uso de mutagénesis del cebador mediante técnicas estándares.
En síntesis, se sintetizaron dos oligonucleótidos complementarios: 5'-CTA CCT ACA ATC CTT ACG GCG AGC CAT CAA TGG AAA TC-3’ (SEQ ID NO: 9) (cebador 3) y 5'-GAT TTC CAT TGA TGG CTC GCC GTA AGG ATT GTA GGT AG-3' (SEQ ID NO: 10) (cebador 4) para llevar la mutación específica en la posición 415 de la subunidad alfa del polinucleótido yPheRS.
EJEMPLO 2
El plásmido pQE32-yFRS, y pQE32-T415G, pQE32-T415A fueron cada uno de ellos transformados en la cepa de células huésped BLR de E. coli (de NOVAGEN®) para formar las cepas de expresión BLR(pQE32-yFRS_ y BLR (pQE32-T415G). Las células se cultivaron en medio LB, a una concentración de 0,6 a una DO 600. Entonces la expresión se indujo con IPTG 1 mM durante 4 horas. Se recogieron las células y los polipéptidos se purificaron por medio de una columna de afinidad de níquel-ácido nitrilotriacético bajo condiciones nativas de acuerdo con el protocolo del fabricante (QIAGEN®). El imidazol en el tampón de elución se separó mediante columna de desalación, y los polipéptidos se eluyeron en un tampón que contiene Tris-HCl 50 mM (pH = 7,5), DTT 1 mM. Partes alícuotas de polipéptidos se almacenaron a -8OºC con glicerol al 50%.
EJEMPLO 3
Se utilizó la reacción de intercambio ATP-PPi dependiente del aminoácido para evaluar la activación de aminoácidos no naturales por parte de yPheRS. El ensayo se realizó en 200 mincrolitros de tampón de reacción que contiene HEPES 50 mM (pH = 7,6), MgCl2 20 mM, DTT 1 mM, ATP 2 mM y [32P] –PPi 2 mM, con una actividad específica de 0,2 -0,5 TBq/mol. Dependiendo de la actividad de los diversos aminoácidos no naturales con la sintetasa, la concentración de aminoácidos varió de 10 microM a 5 mM, y la concentración de enzimas varió de 10 nM a 100 nM. Partes alícuotas de 20 microlitros fueron retiradas de la disolución de reacción en diversos instantes y fueron inactivadas en 500 microlitros de disolución tampón que contiene NaPPi 200 mM, HCIO4 al 7% p/v y carbón vegetal activado al 3% p/v. El carbón vegetal se centrifugó y se lavó dos veces con 500 microlitros de NaPPi 10 mM y disolución de HCIO4 al 0,5%. El ATP radiomarcado absorbido por el carbón vegetal se cuantificó a través de métodos de centelleo líquido. Las constantes de especificidad se calcularon por ajuste de regresión no lineal de los datos a un modelo de Michaelis Menten. Los parámetros cinéticos para el intercambio ATP-PPi de aminoácidos por las yPheRS (T415G), yPheRS de tipo salvaje y variante yPheRS_naph se muestran en la siguiente Tabla.
Aminoácido
Enzima Km (µm) Kcat (s-1) Kcat/Km (s-1 M-1) Kcat/Km (relativa)
Phe
T415G 55 ± 14 0,202 ± 0,11 3512 ± 1134 1a
Trp
T415G 2,83 ± 1,6 0,153 ± 0,003 63190 ± 34590 18a
2NaI
T415G 7,03 ± 0,14 0,208 ± 0,04 29535 ± 5848 8,4a
Phe
tipo salvaje 3,85 ± 0,99 0,181 ± 0,011 50994 ± 22655 15a
Phe
naf 11010 ± 2688 0,0095 ± 0,0021 0,855 ± 0,007 1b
Trp
naf 1424 ± 597 0,0035 ± 0,0009 2,52 ± 0,44 2,9b
2NaI
naf 2030 ± 691 0,030 ± 0,018 14,54 ± 4,22 17b
EJEMPLO 4
El plásmido de expresión, pQE16 (QIAGEN®) se utilizó con dihidrofolato reductasa murina (mDHFR) de polipéptido marcador con un gen de la etiqueta de hexa-histidina C-terminal bajo el control de un promotor del bacteriófago T5 y el terminador t0.
Un codon Ámbar (TAG) se colocó en la 38ª posición de mDHFR utilizando un kit de mutagénesis QUICK-CHANGE®. Se utlizaron dos oligo-cebadores complementarios (5'-CCG CTC AGG AAC GAG TAG AAG TAC TTC CAA AGA ATG-3’ (SEQ ID NO: 11) y 5'-CAT TCT TTG GAA GTA CTT CTC CTA GTT CCT GAG CGG-3' (SEQ ID NO: 12)) para producir pQE16am. El gen yPheRS mutante T415G se amplificó a partir pQE32-T415G y un promotor tac constitutivo con un sitio de unión al represor lac abolido se añadió aguas arriba del codón de inicio del gen.
Toda la casete de expresión de T415G se insertó en el sitio PvuII de pQE16 para producir pQE16am-T415G. El ARNt supresor de levadura mutante (mutARNtPhe(CUA)) se expresó constitutivamente bajo el control del promotor lpp. La casete de expresión de mutARNtPhe(CUA) se insertó en el plásmido represor pREP4 para formar pREP4-ARNt utilizando métodos conocidos.
Una cepa bacteriana auxotrófica de fenilalanina (Phe); AF (K10, Hfr(Cavalli) pheS93rel-1 tonA22 thi T2R pheA18) se utilizó como una cepa huésped. Una doble cepa doble auxotrófica Phe/Trp AFW (K10, Hfr (Cavalli) pheS13rel1tonA22 thi T2R pheA18, trpB114) y una cepa triple auxotrófica Phe/Trp/Lys AFWK (K10, Hfr (Cavalli) pheS13rel-1 tonA22 thi T2R pheA18, trpB114, lysA) se prepararon mediante transducción mediada por el fago P1 con los transposones trpB::Tn10 y lysA::Tn10.
EJEMPLO 5
Las cepas de células huésped auxotróficas AF, AFW y AFWK se transforman cada una de ellas con el plásmido pQE16am-T415G y pREP4-ARNt para proporcionar las cepas de expresión AF[pQE16am-T415G/pREP4-ARNt] y AWF[pQE16am-T415G/pREP4-ARNt], respectivamente . Las células se cultivaron en medio mínimo M9 suplementado con glucosa, tiamina, MgSO4, CaCl2, 20 aminoácidos (20 mg/L), antibióticos (kanamicina y ampicilina). Cuando las células alcanzaron una lectura a una DO600 de 1,0, se sedimentaron por centrifugación, se lavaron dos veces con NaCl frío al 0,9% y se cambiaron a medio M9 suplementado que contenía 17 aminoácidos (20 mg/L), aminoácido 3 mM no natural de interés, y las concentraciones indicadas de Phe, Trp y Lys. La expresión de proteínas se indujo mediante la adición de IPTG (1 mM). Después de 4 horas, las células se sedimentaron y la proteína se purificó por medio de una etiqueta de hexa-histidina C-terminal y una columna de centrifugación Nickel-NTA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (QIAGEN®).
EJEMPLO 6
mDHFR mutante se purificó en condiciones desnaturalizantes y se eluyó con tampón estándar (urea 8 M, NaH2PO4 100 mM, Tris 10 mM, pH 4,5). Los polipéptidos fueron digeridos con tripsina con 10 microlitros de la disolución diluida en 90 microlitros de (NH4)2CO3 75 mM y el pH se ajustó a 8. Se añadieron dos microlitros de tripsina modificada (0,2 microgramos/microlitro) y la muestra se incubó a temperatura ambiente durante la noche. Los polipéptidos se digirieron con endoproteinasa con Lys-C, 10 microlitros de disolución diluida en 90 microlitros de Tris-HCl 25 mM, pH 8 y EDTA 1 mM. A continuación, se añadieron 2 microlitros de Lys-C (0,2 microgramos/microlitro; CALBIOCHEM®) y la reacción se incubó a 37º durante 10 horas. La reacción de digestión se detuvo mediante la adición de 2 microlitros de ácido trifluoroacético (TFA). La disolución se purificó por medio de ZIPTIPC18® (MILLIPORE®) y los péptidos digeridos se eluyeron con 3 microlitros de CH3CN al 50%, TFA al 0,1%. Se utilizó un microlitro para el análisis por espectrometría de masas desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-MS) con ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico y ácido 2,5-dihidroxibenzoico como matriz. El análisis se realizó utilizando un espectrómetro de masas Voyager DE PRO MALDI-TOF de PERSEPTIVE BIOSYSTEMS® en modo lineal y de iones positivos.
Se realizó un análisis LC-MS/MS de péptidos digerido con proteasa en espectrometría de masas con trampa de iones FINNIGAN® LCQ con bomba de HPLC y sonda ESI. La secuenciación de masas en tándem se llevó a cabo mediante fragmentación del ion precursor con m/z correspondiente a fragmento digerido con proteasa que incluye el residuo en la posición 38 de mDHFR mutante.
EJEMPLO 7
Los plásmidos se construyeron para yPheRS de tipo salvaje e yPheRS (T415G) según se describe en el Ejemplo 1 en esta memoria. Además, el gen lysS de E. coli se amplificó mediante PCR a partir del plásmido molde pXLLysKS1, utilizando los siguientes cebadores: 5'-GCA CTG ACC ATG GCT GAA CAA CAC GCA CAG-3' (SEQ ID NO: 13) (con el sitio de restricción NcoI) y 5'-GGA CTT CGG ATC CTT TCT GTG GGC GCA TCG C-3' (SEQ ID NO: 14) (con el sitio de restricción BamHI). El ADN resultante se introdujo en los sitios NcoIy BamHI de pQE60 para producir pQE60-eLysS. Las enzimas clonadas contienen etiquetas hexaHistidina N-terminal o C-terminal para facilitar la purificación de proteínas.
En las dos primeras reacciones, (cebador 1 y cebador 4) y (cebador 2 y cebador 3) se añadieron en tubos individuales y se generaron dos fragmentos de ADN a partir de estas dos reacciones PCR. Con la mezcla de dos productos de reacción y cebadores externos adicionales, se obtuvo un fragmento de ADN de 3400 pb. El fragmento se purificó por métodos estándares y se digirió con BamHI y KpnI y se insertó en pQE32 para producir pQE32-T415G. Las enzimas PheRS clonadas contenían una etiqueta de la secuencia hexa-histidina N-terminal conocida para la purificación. El gen yPheRS completo se secuenció en ADN para su verificación.
EJEMPLO 8
El plásmido pQE32-T415A y pQE60-eLysS se co-transformaron individualmente con un plásmido represor pREP4 en una cepa BLR de E. coli para formar cepas de expresión BLR (pQE32-yFRS), BLR (pQE32-T415G), BLR (pQE32-T415A) y BLR (pQE60-eLysS). La sobre-expresión se llevó a cabo en medios 2x YT con 100 microgramos/mL de ampicilina y 35 microgramos/mL de kanamicina. A una DO 600 = 0,6, la expresión de variantes yPheRS y la lisil-ARNt sintetasa de E. coli codificada por el gen lysS (eLysS) se indujeron con IPTG 1 mM. Después de expresión durante 4 horas, se recogieron las células y las proteínas se purificaron sobre una columna de afinidad de níquel-ácido nitrilotriacético bajo condiciones nativas de acuerdo con el protocolo del fabricante (QIAGEN®). El imidazol en el tampón de elución se separó mediante columna de desalación y los polipéptidos se eluyeron en un tampón que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), DTT 1 mM. Partes alícuotas de los polipéptidos se almacenaron a -80ºC con glicerol al 50%. Las concentraciones de variantes de yPheRS y eLysS se determinaron por absorbancia UV a 280 nm.
EJEMPLO 9
El péptido 38 (residuos 26-39; codónK NGDLPWPPLRNEámbar) (SEQ ID NO: 15) contiene el codón ámbar en la posición número 38. Los péptidos (K38S, K38L), el péptido W38 y el péptido pBrF (Z)38 fueron separados y detectados por MS. Los polipéptidos se sintetizaron en células huésped auxótrofas triples con (a) ARNtPheCUA e yPheRS (T415G); (b) ARNtPheCUA_UG e yPheRS (T415G); (c) ARNtPheCUA e yPheRS (T415A); (d) ARNtPheCUA_UG e yPheRS (T415A) o (e) en una sola cepa auxotrófica con ARNtPheCUA_UG e yPheRS (T415A). Los medios mínimos de expresión se suplementaron con pBrF 6,0 mM, Trp 0,01 mM, Lys 1,0 mM, Phe 0,03 mM (a y b) o Phe 0,01 mM (c, d y e) y 25 mg/L de 17 aminoácidos, los resultados se muestran en la Figura 9.
EJEMPLO 10
Se utilizó la reacción de intercambio de ATP-PPi dependiente de aminoácidos para evaluar la activación de análogos de aminoácidos mediante yPheRS según se describe en los Ejemplos anteriores. En síntesis, una parte alícuota de 200 microlitros de tampón de reacción contiene HEPES 50 mM (pH 7,6), MgCl2 20 nM, DTT 1 mM, ATP 2 mM y 32P-pirofosfato (PPi) 2 mM con actividad específica de 10-50 Ci/mol. Dependiendo de la actividad de análogos por parte de la sintetasa, la concentración de aminoácidos varió de 10 microM a 2,5 mM y la concentración de enzimas varió de 10nM a 100 nM. Partes alícuotas de 20 microlitros fueron retiradas de la disolución de reacción en diversos instantes y se inactivaron en 500 microlitros de solución tampón que contiene NaPPi 200 mN, HCIO4 al 7% p/v y carbón vegetal activado al 3% p/v. El carbón vegetal se centrifugó y se lavó dos veces con 500 microlitros de NaPPi 10 mM y disolución de HCIO4 al 0,5%. El ATP radiomarcado absorbido por el carbón vegetal se cuantificó a través de métodos de centelleo líquido. Las constantes de especificidad se calcularon por ajuste de regresión no lineal de los datos a un modelo de Michaelis Menten.
Los resultados de los parámetros cinéticos se muestran en la Tabla I. Las sustituciones en el anillo de indol (especialmente en la posición 6ª) eran muy favorables para algunos análogos (8-10).
Tabla I: Parámetros cinéticos para el intercambio ATP-PPi de aminoácidos ilustrativos (1-11) por parte de PheRS de levadura mutante externa
Aminoácido
Enzima Km (µm) kcat (s-1) Kcat/Km (s-1 M-1) Kcat/Km (relativa)*
1
T415G 264 ± 42 0,05 ± 0,002 184 ± 30
1
2
T415G 22 ± 3 0,03 ± 0,001 1,538 ± 228 8
3
T415G 12 ± 2 0,05 ± 0,001 4,365 ± 797 24
4
T415G 11 ± 3 0,05 ± 0,002 4,558 ± 1,186 25
5
T415G 757± 149 0,4 ± 0,003 48 ± 10 1\4
6
T415G 20± 5 0,30 ± 0,006 15,000 ± 4,063 82
7
T415G 27 ± 2 0,04 ± 0,001 1,550 ± 125 8
8
T415G 20±8 0,20 ± 0,018 10,256 ± 4,562 56
9
T415G 8±4 0,55 ± 0,097 70,876 ± 34,843 385
10
T415G 31±18 0,06 ± 0,005 1,939 ± 1,149
10
11
T415G 94±50 0,05 ± 0,006 533 ± 293 3
1
T415G 68±20 0,52 ± 0,093 7,627 ± 2,664 41
En que los aminoácidos se indican como en la Figura 2.
EJEMPLO 11
El ARNt supresor ámbar de levadura mutante (yARNtPheCUA) fue constitutivamente expresado bajo el control del promotor lpp. La casete de expresión de yARNtPheCUA se insertó en el plásmido represor pREP4 para formar pREP4-yARNt como se describe anteriormente en los Ejemplos en esta memoria. El supresor yARNtPheCUA_30U40G de levadura mutante (yARNtPheCUA_UG) se construyó a partir de yARNtPheCUA mediante el uso de un kit de mutagénesis QUICK-CHANGE®. Dos oligonucleótidos complementarios, designados como cebador UG-f (5'-GAA CAC AGG ACC TCC ACA TTT AGA GTA TGG CGC TCT CCC-3') (SEQ ID NO: 16) para el cebador directo y el cebador UG-r (5'-GGG AGA GCG CCA TAC AAA TGT TCT GGA GGT CCT GTG TTC-3') (SEQ ID NO: 17) para el cebador inverso se sintetizaron para portar la mutación específica, ya sea en la posición 30 o la posición 40 del ARNt supresor de levadura mutante. El plásmido resultante que porta el gen que codifica yARNtPheCUA_UG se designa pREP4-yARNt_UG. Con el fin de construir los plásmidos para la transcripción in vitro de yARNtPhe, los genes yARNtPheCUA e yARNtPheCUA_UG se amplificaron a partir del plásmido molde pREP4-yARNt y pREP4-yARNt_UG, respectivamente. Al final de la secuencia de ARNt, se insertó un sitio BstNI para producir el
transcrito exacto de yARNtPhe. Se añadió una secuencia promotora T7 para la transcripción in vitro de yARNtPhe por parte de una T7 ARN polimerasa. Para la PCR se utilizaron los siguientes cebadores: 5'-CTG GGT AAG CTT CGC TAA GGA TCT GTG CTG GCC CGA ACT CTG-3' (SEQ ID NO: 18) (con sitios de restricción HindIII y BstNI) y 5'-GAT TAC GGA TTC CTA ATA CGA CTC ACT ATA GCG GAC TTA GCT C-3' (SEQ ID NO: 19) (con el sitio de restricción EcoRI y una secuencia de promotor T7). El ADN resultante se introdujo en los sitios HindIII y EcoRI de pUC18 para proporcionar pUC18-yARNtPheCUA y pUC18-yARNtPheCUA_UG.
Con el fin de facilitar la manipulación del ADN, se eliminó un sitio de escisión BstNI cerca de la secuencia del promotor T7 de pUC18-yARNtPheCUA para aumentar el tamaño del fragmento de ADN que contiene el gen yARNtPheCUA de 180 pb a 500 pb después de la digestión con BstNI. Dos oligonucleótidos complementarios, 5'-CGG AAG CAG AAA GTG TAA AGA GCG GGG TGC CTA ATG AGT G-3’ (SEQ ID NO: 20) para el cebador directo y 5'-CAC TCA TTA GGC ACC CCG CTC TTT ACA CTT TCC GCT TAT G-3' (SEQ ID NO: 21) para el cebador inverso, se sintetizaron para portar la mutación específica.
EJEMPLO 12
El ADN linearizado se preparó mediante digestión con BstNI de pUC18-yARNtPheCUA y pUC18-yARNtPheCUA_UG como se ha descrito previamente (Véase Sampson, Uhlenbeck, PNAS USA 85: 1033-1037 (1988)). La transcripción in vitro de moldes de ADN linearizado y la purificación de transcritos se realizaron como se ha descrito previamente (Véase Nowak, et al., Ion Channels pt. B 293: 504-529 (1998). La transcripción in vitro del ADN linearizado para producir transcritos de ARNt 76rnero se realizó con el kit T7-MEGASHORTSCRIPT® de AMBION®. Los transcritos se aislaron con una extracción 25:24:1 fenol:CHCl3:alcohol isoamílico (PCI). La capa orgánica se volvió a extraer con agua y se realizó una extracción 24:1 CHCl3:alcohol isoamílico (CI) en las capas acuosas. A continuación, la capa acuosa se mezcló con un volumen igual de isopropanol, se precipitó durante la noche a -20ºC, se sedimentó, se secó y se volvió a disolver en agua. Los nucleótidos que no habían reaccionado en la disolución de ARNt fueron eliminados utilizando CHROMA SPIN-30® DEPC-H2O (BD Bioscience®). Las concentraciones de los transcritos se determinaron mediante absorbancia UV a 260 nm. La aminoacilación de yARNtPheGAA de tipo salvaje con Phe y Trp mediante variantes de yPheRS se realizó como se ha descrito previamente (Véase Sampson, Uhlenbeck, PNAS USA 85: 1033-1037 (1988)). Se llevaron a cabo reacciones de aminoacilación en el tampón que contiene HEPES 30 mM (pH 7,45), MgCl2 15 mM, DTT 4 mM, KCl 25 mM KCl y ATP 2 mM a 30ºC, en volúmenes de reacción de 100 microlitros. En el ensayo se utilizó ARNt total de levadura purificado a una concentración final de 4 mg/mL (concentración de yARNtPheGAA aproximadamente 2,24 microM). Para la aminoacilación de Phe, se utilizaron [3H]-Phe 13,3 microM (5,3 Ci/mmol) y variantes de yPheRS 80 nM; para la aminoacilación de Trp, se utilizaron [3H]-Trp 3,3 microM (30,0 Ci/mmol) y variantes de yPheRS 160 nM. La aminoacilación de transcritos de yARNtPhe se realizó en volúmenes de reacción de 100 microlitros en tampón que contenía potasio-HEPES 100 mM (pH 7,4), MgCl2 10 mM, DTT 1 mM, EDTA 0,2 mM, ATP 2 mM, y 4 unidades/mL de pirofosfatasa inorgánica de levadura a 37ºC para eLysS. Para la aminoacilación de Lys, se utilizaron 4 microM de transcrito de yARNtPhe, [3H] Lys 1,1microM (91 Ci/mmol) y eLysS 80 nM. Los ARNts fueron asociados antes de su uso por calentamiento hasta 85ºC durante 4 minutos en el tampón de reasociación (Tris 60 mM, pH 7,8, MgCl2 2 mM) seguido de enfriamiento lento a temperatura ambiente. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de la enzima y se inactivaron partes alícuotas de 10 microlitros mediante la detección en discos de filtro Whatman empapados con TCA al 5%. Los filtros se lavaron durante tres períodos de 10 minutos en TCA al 5% enfriado con hielo, se lavaron en etanol al 95% enfriado con hielo, y se contaron mediante métodos de centelleo líquido.
EJEMPLO 13
La construcción del plásmido para la incorporación in vivo de un aminoácido no natural se realizó en una cepa doble auxotrófica Phe/Trp, AFW, y una cepa triple auxotrófica Phe/Trp/Lys, AFWK. Las cepas auxotróficas se construyeron a partir de una cepa auxotrófica Phe, AF (K10, Hfr(Cavalli) pheS13rel-1 tonA22 thi T2R pheA18, trpB114) (Véase Furter, Prot. Sci., 7: 419-426 (1998)) mediante transducción del trasposón mediada por el fago P1. Un vector pQE16 (QIAGEN®) se eligió como el plásmido de expresión, que codifica una proteína marcadora dihidrofolato reductasa murina (mDHFR) con el gen de la etiqueta hexa-histidina C-terminal bajo el control de un promotor de bacteriófago T5 y un terminador t0. Se utilizó un kit de mutagénesis Quick-change para colocar un codón ámbar (TAG) en la 38ª posición de mDHFR con dos oligonucleótidos complementarios (5'-CCG CTC GAG AGG AAC TAG AAG TAC TTC CAA AGA ATG-3’ (SEQ ID NO: 11); 5'-CAT TCT TTG GAA GTA CTT CTC CTA GTT CCT GAG CGG-3') (SEQ ID NO: 12) para producir pQE16am. Los genes de yPheRS mutantes T415G y T415A se amplificaron a partir de pQE32-T415G y pQE32-T415A y se añadió un promotor tac constitutivo con un sitio de unión al represor lac abolido aguas arriba del codón de inicio del gen. Toda la casete de expresión de T415G y T415A se insertó en el sitio PvuII de pQE16am-T415G y pQE16am-T415A.
EJEMPLO 14
Las cepas bacterianas auxotróficas AF, AFW y AFWK se transformaron con el plásmido pQE16am que contiene variantes de yPheRS y vectores pREP4-yARNt que contienen variantes de yARNt para investigar incorporación de pBrF. Las cepas de expresión de E. coli se cultivaron en medio mínimo M9 suplementado con glucosa, tiamina, MgSO4, CaCl2, 20 aminoácidos (a 25 mg/L) antibióticos (35 microgramos/mL de kanamicina y 100 microgramos/mL de ampicilina). Cuando las células alcanzaron una DO600 de 0,8-1,0, se sedimentaron por centrifugación, se lavaron dos veces con NaCl al 0,9% frío y se desplazaron a medios de expresión suplementados con 17 aminoácidos (a 20 mg/L), 6 mM de pBrF (p-bromo-fenilalanina) o plodoF (p-yodo-fenilalanina), y las concentraciones indicadas de fenilalanina, triptófano y lisina. La expresión de proteínas fue inducida por la adición de IPTG 1 mM. Después de cuatro horas de expresión, las células se sedimentaron por centrifugación, y la proteína se purificó en virtud de la etiqueta de hexa-histidina C-terminal a través de una columna de centrifugación de nickel-NTA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (QIAGEN®). Después de la purificación, los niveles de expresión de mDHFR se determinaron mediante absorbancia UV a 280 nm
EJEMPLO 15
Se realizó un análisis LC-MS/MS de digestos trípticos de mDHFR en una espectrometría de masas con trampa de iones Finnigan LCQ con bomba de HPLC y sonda ESI. La mDHFR mutante purificada en condiciones desnaturalizantes se encontraba en tampón de elución (urea 8 M, NaH2PO4 100 mM, Tris 10 mM, pH 4,5). Para la digestión de tripsina, 10 microL de la disolución se diluyeron en 90 microL de (NH4)2CO3 75 mM. Se añadió un microlitro de tripsina modificada (0,2 microgramos/microlitro). La muestra se incubó a 37º C durante 2 a 6 horas. La reacción de digestión se detuvo mediante la adición de 12 microL de disolución de TFA al 5%. La disolución de péptido digerido se sometió a desalación con una columna C18 Vydac Microspin (el grupo Nest) y se eluyó con 50 microL de 80% de acetonitrilo y 20% de ácido fórmico al 0,1% p/v. Se secó la disolución de péptido digerido eluida a partir de la columna Microspin, se redisolvió en 10% de acetonitrilo y 90% de disolución de TFA 0,1%, y se inyectó en una bomba de HPLC. Se separaron los péptidos mediante la columna Magic C18 (Michrom, 300 Å, 0,3 x 150 mm) y se eluyó a un caudal de 30 microL/min utilizando un gradiente de 10-95% de disolvente A (90% de acetonitrilo y 10% de disolución de ácido acético 0,1 M) y disolvente B (2% de acetonitrilo y 98% de disolución de ácido acético 0,1 M) durante 30 minutos. Se detectó el flujo de eluyente de la columna a la fuente de electroproyección y cada una de las señales de digesto tríptico. La secuenciación de masas en tándem se llevó a cabo de forma simultánea mediante la fragmentación del ion precursor con m/z correspondiente a fragmento digerido por proteasa que incluye el residuo en la posición 38 de mDHFR mutante. Por lo tanto, los polipéptidos de DHFR fueron sintetizados en una célula huésped auxotrófica triple con (a), (b) ARNtPheCUA de levadura PheRS de levadura (T415G); (c) ARNtPheCUA_UG de levadura y PheRS de levadura (T415G); (d) ARNtPheCUA de levadura y PheRS levadura (T415A); (e) ARNtPheCUA_UG de levadura y PheRS de levadura (T415A) o (f) en una sola cepa auxotrófica con ARNtPheCUA_UG de levadura y PheRS de levadura (T415A), cuyos resultados se muestran en la Figura 12.
EJEMPLO 17
Se rastreó un banco de PheRS de levadura (utilizando la proteína fluorescente verde o GFP) para identificar mutaciones de PheRS que permiten la incorporación de Nal. Posiciones de las secuencias de aminoácidos específicas que estaban mutadas incluyen los números de residuos 412, 415, 418 y 437, que están situadas en el sitio de unión y contactan con el aminoácido. Tal como se indica en la Figura 13, p-etinil-fenilalanina se incorporó en una proteína de ensayo utilizando la PheRS de levadura modificada.
En síntesis, GFP se ligó en un vector que contenía el gen T415G mutante o PheRS de levadura de tipo salvaje de acuerdo con procesos estándares. El ARNt supresor ámbar de levadura mutante (ytRNAPheAAA) se expresó de forma constitutiva bajo el control del promotor lpp y se transformó en una cepa auxotrófica doble de Phe/Trp AFW de E.coli. Las células se cultivaron en medio mínimo M9 suplementado con glucosa, tiamina, MgSO4, CaCl2, 20 aminoácidos (a 25 mg/L), antibióticos (35 µg/mL de kanamicina y 100 µg/mL de ampicilina). Cuando las células alcanzaron una DO600 de 0,8-1,0, las células se sedimentaron y lavaron dos veces con NaCl al 0,9% enfriada con hielo y se cambiaron a medio de expresión suplementado con 18 aminoácidos (a 20 mg/L) y diversas concentraciones de fenilalanina, triptófano y 2Nal. La expresión de proteínas se indujo mediante IPTG.
EJEMPLO 18
Se realizaron mutagénesis de los cuatro residuos aminoácidos seleccionados (N412, T145, S418 y S437) mediante mutación por PCR en dos etapas. En síntesis, se realiza una serie de mutagénesis por PCR en el gen GFPUV en un plásmido pQE9_GFPUV (STRATAGENE®), utilizando cuatro pares complementarios de cebadores (F64LS65T_f: 5’-CTT GTC ACT ACT CTG ACC TAT GGT GTT CAA TGC TTC TCC CGT-3’ (SEQ ID NO: 22); F64LS65T_r: 5’-ACG GGA GAA GCA TTG AAC ACC ATA GGT CAG AGT AGT GAC AAG-3’ (SEQ ID NO: 23); S99F_f: 5’-GTA CAG GAA CGC ACT ATA TTC TTC AAA GAT GAC GGG AAC-3’ (SEQ ID NO: 24); S99F_r : 5’-GTT CCC GTC
ATC TTT GAA GAA TAT AGT GCG TTC CTG TAC-3’ (SEQ ID NO: 25); T153M_f: 5’-CAC AAT GTA TAC ATC ATG GCA GAC AAA CAA AAG AAT GGA-3’ (SEQ ID NO: 26); T153M_r: 5’-TCC ATT CTT TTG TTT GTC TGC CAT GAT GTA TAC ATT GTG -3’ (SEQ ID NO: 27)).
Los mutantes de GFP se generaron según se describe en esta memoria. En síntesis, una GFP3 tiene 12 residuos Phe, de los cuales cinco son codificados por los codones de bamboleo de Phe (UUU). Se prepararon una GFP5 y una variante de GFP6 reemplazando los codones UUC por UUU, utilizando reacciones PCR de dos etapas, seguido de ligamiento. Se preparó una GFP5 reemplazando cuatro codones UUC y un codón Leu en los residuos F8, L64, F84, F99 y F165 por codones UUU utilizando doce cebadores (1: 5’-GTG CCA CCT GAC GTC TAA GAA ACC ATT ATT ATC ATG ACA TTA ACC-3’ (SEQ ID NO: 28) 2: 5’-GAG TAA AGG AGA AGA ACT TTT TAC TGG AGT TGT CCC AAT TC-3’ (SEQ ID NO: 29) 3: 5’-GAA TTG GGA CAA CTC CAG TAA AAA GTT CTT CTC CTT TAC TC-3’ (SEQ ID NO: 30) 4: 5’-GGC CAA CAC TTG TCA CTA CTT TTA CCT ATG GTG TTC AAT GCT T-3’ (SEQ ID NO: 31) 5: 5’-AAG CAT TGA ACA CCA TAG GTA AAA GTA GTG ACA AGT GTT GGC C-3’ (SEQ ID NO: 32) 6:5’-CAT ATG AAA CGG CAT GAC TTT TTT AAG AGT GCC ATG CCC GAA G-3’ (SEQ ID NO:33) 7: 5’-CTT CGG GCA TGG CAC TCT TAA AAA AGT CAT GCC GTT TCA TAT G (SEQ ID NO: 34) 8: 5’-GTT ATG TAC AGG AAC GCA CTA TAT TTT TCA AAG ATG ACG GGA ACT ACA A-3’ (SEQ ID NO: 35) 9:5’-TTG TAG TTC CCG TCA TCT TTG AAA AAT ATA GTG CGT TCC TGT ACA TAA C-3’ (SEQ ID NO: 36) 10: 5’-ACA AAA GAA TGG AAT CAA AGC TAA CTT TAA AAT TCG CCA CAA CAT TGA AGA TG-3’ (SEQ ID NO: 37) 11: 5’-CAT CTT CAA TGT TGT GGC GAA TTT TAA AGT TAG CTT TGA TTC CAT TCT TTT GT-3’ (SEQ ID NO: 38); 12: 5’-CGC CAA GCT AGC TTG GAT TCT CAC CAA TAA AAA ACG CCC-3’ (SEQ ID NO: 39). Se obtuvieron cinco fragmentos de solapamiento parcialmente solapantes de casetes de expresión GFP3 mediante cinco reacciones PCR con cinco conjuntos decebadores (1 y 3; 2 y 5; 4 y 7; 6 y 9; 8 y 10).
Estos productos de la PCR se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa, seguido de extracción de gel. Se preparó una GFP6, de la cual todos los residuos Phe son codificados por UUU reemplazando dos codones Phe (F71 y F99) de GFP5 por codones UUU utilizando seis cebadores. (1 y 12 son los mismos de arriba; 13: 5’-TAC CTA TGG TGT TCA ATG CTT TTC CCG TTA TCC GGA TCA TAT G-3’ (SEQ ID NO: 40); 14: 5’-CAT ATG ATC CGG ATA ACG GGA AAA GCA TTG AAC ACC ATA GGT A-3’ (SEQ ID NO: 41); 15: 5’-GTT ATG TAC AGG AAC GCA CTA TAT TTT TTA AAG ATG ACG GGA ACT ACA AG-3’ (SEQ ID NO: 42); 16: 5’-CTT GTA GTT CCC GTC ATC TTT AAA AAA TAT AGT GCG TTC CTG TAC ATA AC-3’ (SEQ ID NO: 43)).
EJEMPLO 19
Se realiza también una construcción de banco en dos etapas. En síntesis, la mutagénesis por saturación en cuatro residuos (N412, T415, S418 y S437) se consiguió con mutagénesis por PCR en dos etapas. Primero, se introdujeron codones degenerados en S437 mediante mutagénesis por PCR con dos cebadores complementarios (437_f: 5’-GTC GAA ATC GGT AAC NNK GGT ATG TTC AGA CCA GAA ATG CTC G-3’ (SEQ ID NO: 44); 437_r: 5’-C GAG CAT TTC TGG TCT GAA CAT ACC MNN GTT AC C GAT TTC GAC-3’ (SEQ ID NO: 45)). Después de digestión durante 1 h del producto de la PCR con DpnI, se transformó el producto de la PCR en el huésped de clonación XL-1 blue. Los plásmidos de la 437ª posición se saturaron y aislaron y se utilizaron como un molde para la 2ª mutagénesis por PCR para introducir una mutación en los residuos N412, T415 y S418. La 2ª mutagénesis por PCR se realizó con otro par de cebadores complementarios (412_418_f: 5’-C AAG CCT ACC TAC NNK CCT TAC NNK GAG CCA NNK ATG GAA ATC TTT T-3’ (SEQ ID NO: 46); 412_418_r: 5’-A AAA GAT TTC CAT MNN TGG CTC MNN GTA AGG MNN GTA GG T AGG CTT G-3’ (SEQ ID NO: 47)). Después de la PCR, los productos se digirieron con DpnI durante 1 h, se limpió y se concentró mediante columna de centrifugación. El producto eluido se electroporó en una célula electrocompetente ElectroTen-Blue (Stratagene) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se obtuvieron ocho millones de transformantes. El plásmido del banco se expandió en cultivo y se digirió con NsiI y Bg/ll. Después de la purificación de estos insertos, éstos se ligaron con fragmentos grandes de pQE9_GFP6_yPheRS (T415G) y pQE9_GFP9_yPheRS (T415G) obtenidos mediante digestión con NsiI y BglII.
El banco se transformó en células de E. coli AFW y DHF químicamente competentes. Estas células se inocularon luego en medio 2x YT con kanamicina y se cultivaron durante la noche. Cuando las células alcanzaron una DO600 de 0,8, las células se sedimentaron y se resuspendieron en agua destilada. Los stocks de glicerol del banco se expresaron como es costumbre en el técnica.
después de la expresión de GFP durante 3 horas, 1 mL de células (basado en una DO600 de 1,0) se lavó con PBS y se diluyó en agua destilada, luego se sometió a análisis por citometría de flujo (aparato MoFlo cell sorter®, DakoCytomation, Fort Collins, CO), utilizando una longitud de onda de excitación de 488 nm, emisión de 525 nm y un filtro de corte 495 nm. En cada una de las mediciones se recogieron al menos 20.000 eventos. Los datos se analizaron con el software Summit (DakoCytomation). El rastreo de bancos se hizo tanto de forma positive como negative, es decir, las variantes de yPheRS que permiten una elevada incorporación de 2Nal o cualesquiera otros aminoácidos naturales, excepto Phe, en los codones UUU desplegarán GFP y son menos brillantes y, de esta
forma, se recogen células de baja fluorescencia. Las variantes de yPheRS que no permiten la incorporación de cualesquiera otros aminoácidos natural, excepto Phe, en los codones UUU no afectarán al plegamiento de GFP y son brillantes. Por lo tanto, se recogen células brillantes. La Figura 14 ilustra histogramas del rastreo de bancos de yPheRS de GFP.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> California Institute of Technology Wang, Pin Kwon, Inchan Son, Soojin Tang, Yi Tirrel, David A.
<120> INCORPORACIÓN ESPECÍFICA DEL SITIO DE AMINOÁCIDOS EN MOLÉCULAS
<130> 110197 412 PC
<140> PCT
<141>
<150> US 60/779.375
<151>
<150> US 60/779.376
<151>
<160> 104
<170> FastSEQ para Windows versión 4.0
<210> 1
<211> 7790
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Gen dihidrofolato reductasa de ratón modificado y gen MetRS de E. coli
<400> 1
<210> 2
<211> 8294
<212> ADN
<213> gen fenilalanina aminoacilsintetasa de levadura
<400> 2
<210> 3
<211> 1512
<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> subunidad alfa del gen fenilalanina aminoacilsintetasa de levadura
10 <220>
<221> característica misc.
<222> 1234, 1235, 1236, 1243, 1244, 1245, 1252, 1253, 1254, 1309, 1310, 1311
<223> n = A, T, C ó G 15
<400> 3
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Derivado artificial de hidrofolato reductasa
<400> 4
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Derivado artificial de hidrofolato reductasa
<220>
<221> VARIANTE
<222> 13
<223> Xaa = aminoácido supresor
<400> 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Derivado artificial de hidrofolato reductasa
<400> 6
<210> 7
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 7 cgattttcac acaggatcca gaccatgatt ctag 34
<210> 8
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<210> 9
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<210> 10
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 10
<210> 11
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 11
<210> 12
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 12
<210> 13
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 13
<210> 14
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 14
<210> 15
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> subunidad alfa del gen fenilalanina aminoacilsintetasa de levadura
<220>
<221> VARIANTE
<222> 13
<223> Xaa = aminoácido supresor
<400> 15
<210> 16
<211> 39
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 16
<210> 17
<211> 39
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 17
<210> 18
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 18
<210> 19
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 19
<210> 20
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 20
<210> 21
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<210> 22
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 22
<210> 23
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 23
<210> 24
<211> 39
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 24
<210> 25
<211> 39
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 25
<210> 26
<211> 39
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 26
<210> 27
<211> 39
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<210> 28
<211> 45
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 28 <210> 29
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 29
<210> 30
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 30
<210> 31
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 31
<210> 32
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 32
<210> 33
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 33
<210> 34
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 34
<210> 35
<211> 49
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 35
<210> 36
<211> 49
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 36
<210> 37
<211> 53
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 37
<210> 38
<211> 53
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<210> 39
<211> 39
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 39 <210> 40
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<210> 41
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 41
<210> 42
<211> 50
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<210> 43
<211> 50
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<400> 43
<210> 44
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<220>
<221> característica misc
<222> 16, 17
<223> n = A, T, C o G
<400> 44 <210> 45
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<220>
<221> característica misc
<222> 27, 28
<223> n = A, T, C o G
<400> 45
<210> 46
<211> 47
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<220>
<221> característica misc
<222> 14, 15, 23, 24, 32, 33
<223> n = A, T, C o G
<400> 46
<210> 47
<211> 47
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador de oligonucleótidos
<220>
<221> característica misc
<222> 15, 16, 24, 25, 33, 34
<223> n = A, T, C o G
<400> 47
<210> 48
<211> 432
<212> PRT
<213> Thermus thermophilus
<400> 48

Claims (22)

  1. REIVINDICACIONES
    1.-Una composición, que comprende un primer vector que contiene un polinucleótido que codifica una fenilalanina ARNt sintetasa (PheRS) de levadura modificada, en donde dicho polinucleótido está mutado en los codones que codifican el aminoácido en las posiciones de la secuencia seleccionadas del grupo que consiste en los números de posición de la secuencia de aminoácidos (i) 412 y 415; (ii) 415 y 418; (iii) 415 y 437; (iv) 412, 415 y 437; (v) 415, 418 y 437; (vi) 412, 415 y 418; y (vii) 412, 415, 418 y 437 del polipéptido codificado por SEQ ID NO: 3, y en donde dicha sintetasa modificada es capaz de cargar una molécula de ARNt con un aminoácido no natural.
  2. 2.-La composición de la reivindicación 1, que comprende, además, un segundo vector que contiene un polinucleótido que codifica una molécula de ARNt modificada.
  3. 3.-La composición de la reivindicación 2, en donde dichos primer y segundo vectores son el mismo vector.
  4. 4.-La composición de la reivindicación 2, en donde dichos primer y segundo vectores son vectores diferentes.
  5. 5.-La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde dicho ARNt está modificado de manera que contiene un anticodón mutado que forma pares de bases con un correspondiente codón degenerado por bamboleo con una afinidad mayor que la afinidad del ARNt natural.
  6. 6.-Un polipéptido que comprende una fenilalanina ARNt sintetasa (PheRS) de levadura modificada, en donde dicha sintetasa modificada está mutada en las posiciones de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en los números de posición de la secuencia de aminoácidos (i) 412 y 415; (ii) 415 y 418; (iii) 415 y 437; (iv) 412, 415 y 437; (v) 415, 418 y 437; (vi) 412, 415 y 418; y (vii) 412, 415, 418 y 437 del polipéptido codificado por SEQ ID NO: 3, y en donde dicha sintetasa modificada es capaz de cargar una molécula de ARNt con un aminoácido no natural.
  7. 7.-Un sistema de traducción que comprende un polinucleótido que codifica una fenilalanina ARNt sintetasa (PheRS) de levadura modificada, en donde dicho polinucleótido de sintetasa modificada está mutado en uno o más codones que codifican el aminoácido en las posiciones de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en los números de posición de la secuencia de aminoácidos (i) 412 y 415; (ii) 415 y 418; (iii) 415 y 437; (iv) 412, 415 y 437; (v) 415, 418 y 437; (vi) 412, 415 y 418; y (vii) 412, 415, 418 y 437 del polipéptido codificado por SEQ ID NO: 3, y en donde dicha sintetasa modificada es capaz de cargar una molécula de ARNt con un aminoácido no natural.
  8. 8.-El sistema de traducción de la reivindicación 7, en donde dicho sistema comprende una célula huésped.
  9. 9.-El sistema de traducción de la reivindicación 7 o la reivindicación 8, que comprende, además, un polinucleótido que codifica una molécula de ARNt modificada.
  10. 10.-El sistema de traducción de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde dicho ARNt está modificado de manera que contiene un anticodón mutado que forma pares de bases con un correspondiente codón degenerado por bamboleo con una afinidad mayor que la afinidad del ARNt natural.
  11. 11.-El sistema de traducción de la reivindicación 10, en donde el ARNt modificado es ARNtPhe equipado con el anticodón AAA.
  12. 12.-El sistema de traducción de la reivindicación 8, en donde dicha PheRS modificada y/o dicha molécula de ARNt modificada se deriva de un organismo diferente de la célula huésped.
  13. 13.-El sistema de traducción de la reivindicación 12, en donde dicha molécula de ARNt modificada se deriva de una célula eucariótica, y la célula huésped es una célula procariótica.
  14. 14.-El sistema de traducción de la reivindicación 8, en donde la célula huésped es un auxótrofo.
  15. 15.-El sistema de traducción de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14, que comprende un medio de cultivo que contiene uno o más aminoácidos no naturales.
  16. 16.-Un método para incorporar al menos un aminoácido no natural en un polipéptido diana en una o más ubicaciones especificadas, compendiendo el método proporcionar un sistema de traducción que contiene al menos un aminoácido no natural; proporcionar al sistema de traducción una o más fenilalanina ARNt sintetasa (PheRS) de levadura modificada, en donde dicha sintetasa modificada está mutada en las posiciones de la secuencia de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en los números de posición de la secuencia de aminoácidos (i) 412 y 415; (ii) 415 y 418; (iii) 415 y 437; (iv) 412, 415 y 437; (v) 415, 418 y 437; (vi) 412, 415 y 418; y (vii) 412, 415, 418 y 437 del polipéptido codificado por SEQ ID NO: 3, y en donde dicha sintetasa modificada es capaz de cargar una molécula de ARNt con un aminoácido no natural, proporcionar al sistema de traducción un polinucleótido que codifica un polipéptido diana de interés y permitir la traducción del polipéptido diana de interés, incorporando con ello al menos un aminoácido no natural en el polipéptido diana.
  17. 17.-Un método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que dicha molécula de ARNt se modifica de manera que contiene un anticodón mutado que forma pares de bases con un correspondiente codón degenerado por bamboleo con una afinidad mayor que la afinidad del ARNt natural.
  18. 18.-Un método de acuerdo con la reivindicación 16 o la reivindicación 17, en el que el sistema de traducción comprende una célula huésped, la molécula de ARNt se modifica, y en el que dicha PheRS modificada y/o dicha molécula de ARNt modificada se deriva de un organismo diferente a la célula huésped.
  19. 19.-Una composición, polipéptido, sistema de traducción o método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde la sintetasa modificada está mutada de manera que los codones que codifican los aminoácidos en las posiciones 412, 415 y 437 están mutados.
  20. 20.-Una composición, polipéptido, sistema de traducción o método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde la sintetasa modificada está mutada de manera que los codones que codifican los aminoácidos en las posiciones 415, 418 y 437 están mutados.
  21. 21.-Una composición, polipéptido, sistema de traducción o método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde la sintetasa modificada está mutada de manera que los codones que codifican los aminoácidos en las posiciones 412, 415, 418 y 437 están mutados.
  22. 22.-Una composición, polipéptido, sistema de traducción o método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 6, 7 ó 16, en donde dicha PheRS modificada utiliza un codón de terminación ámbar para la incorporación de un aminoácido no natural en una ubicación particular en el polipéptido.
    153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172
ES07752295.1T 2006-03-03 2007-03-05 Incorporación específica del sitio de aminoácidos en moléculas Active ES2504521T3 (es)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US77937606P 2006-03-03 2006-03-03
US77937506P 2006-03-03 2006-03-03
US779375P 2006-03-03
US779376P 2006-03-03
PCT/US2007/005581 WO2007103307A2 (en) 2006-03-03 2007-03-05 Site-specific incorporation of amino acids into molecules

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2504521T3 true ES2504521T3 (es) 2014-10-08

Family

ID=38462077

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES07752295.1T Active ES2504521T3 (es) 2006-03-03 2007-03-05 Incorporación específica del sitio de aminoácidos en moléculas

Country Status (11)

Country Link
US (2) US8518666B2 (es)
EP (1) EP1999259B1 (es)
JP (2) JP5808882B2 (es)
AU (2) AU2007224019A1 (es)
CA (1) CA2644474A1 (es)
DK (1) DK1999259T3 (es)
ES (1) ES2504521T3 (es)
PL (1) PL1999259T3 (es)
PT (1) PT1999259E (es)
SI (1) SI1999259T1 (es)
WO (1) WO2007103307A2 (es)

Families Citing this family (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050287639A1 (en) 2004-05-17 2005-12-29 California Institute Of Technology Methods of incorporating amino acid analogs into proteins
JP5313129B2 (ja) * 2006-05-02 2013-10-09 アロザイン， インコーポレイテッド 非天然アミノ酸置換ポリペプチド
US20080096819A1 (en) * 2006-05-02 2008-04-24 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
CA2707840A1 (en) 2007-08-20 2009-02-26 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
WO2009059056A2 (en) * 2007-11-02 2009-05-07 The Scripps Research Institute A genetically encoded boronate amino acid
JP5798489B2 (ja) 2009-01-12 2015-10-21 ストロ バイオファーマ， インコーポレイテッド インビトロタンパク質合成システムを用いて非天然アミノ酸をタンパク質に選択的に導入するためのモノチャージシステム
EP2403864B1 (en) 2009-02-27 2015-08-12 Atyr Pharma, Inc. Polypeptide structural motifs associated with cell signaling activity
AU2010327949A1 (en) * 2009-12-11 2012-06-28 Case Western Reserve University Insulin analogues with chlorinated amino acids
CA2797093C (en) 2010-04-26 2019-10-29 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of cysteinyl-trna synthetase
AU2011248521B2 (en) 2010-04-27 2017-03-16 Pangu Biopharma Limited Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of threonyl tRNA synthetases
EP2563381B1 (en) 2010-04-27 2017-08-09 aTyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of isoleucyl trna synthetases
CN103097524B (zh) 2010-04-28 2016-08-03 Atyr医药公司 与丙氨酰-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现
EP2563383B1 (en) 2010-04-29 2017-03-01 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of valyl trna synthetases
CA2797374C (en) 2010-04-29 2021-02-16 Pangu Biopharma Limited Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of asparaginyl trna synthetases
EP2566516B1 (en) 2010-05-03 2019-07-03 aTyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of seryl-trna synthetases
ES2668207T3 (es) 2010-05-03 2018-05-17 Atyr Pharma, Inc. Descubrimiento innovador de composiciones terapéuticas, de diagnóstico y de anticuerpos relacionadas con fragmentos de proteínas de metionil-ARNt sintetasas
CN103096925A (zh) 2010-05-03 2013-05-08 Atyr医药公司 与精氨酰-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现
AU2011248227B2 (en) 2010-05-03 2016-12-01 Pangu Biopharma Limited Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of phenylalanyl-alpha-tRNA synthetases
JP6008844B2 (ja) 2010-05-04 2016-10-19 エータイアー ファーマ， インコーポレイテッド ｐ３８ＭＵＬＴＩ−ｔＲＮＡ合成酵素複合体のタンパク質フラグメントに関連した治療用、診断用および抗体組成物の革新的発見
CN103096909A (zh) 2010-05-04 2013-05-08 Atyr医药公司 与谷氨酰-脯氨酰-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现
EP2568996B1 (en) 2010-05-14 2017-10-04 aTyr Pharma, Inc. Therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of phenylalanyl-beta-trna synthetases
US9034598B2 (en) 2010-05-17 2015-05-19 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of leucyl-tRNA synthetases
CN103096913B (zh) 2010-05-27 2017-07-18 Atyr 医药公司 与谷氨酰胺酰‑tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现
CA2800281C (en) 2010-06-01 2021-01-12 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of lysyl-trna synthetases
AU2011289831C1 (en) 2010-07-12 2017-06-15 Pangu Biopharma Limited Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glycyl-tRNA synthetases
KR20130102534A (ko) 2010-07-12 2013-09-17 에이티와이알 파마, 인코포레이티드 히스티딜­trna 합성효소의 단백질 단편에 관련된 치료적, 진단적, 및 항체 조성물의 혁신적 발견
US8999321B2 (en) 2010-07-12 2015-04-07 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glycyl-tRNA synthetases
KR20180059575A (ko) 2010-07-12 2018-06-04 에이티와이알 파마, 인코포레이티드 아스파르틸­trna 합성효소의 단백질 단편에 관련된 치료적, 진단적, 및 항체 조성물의 혁신적 발견
CN103108650A (zh) 2010-08-25 2013-05-15 Atyr医药公司 与酪氨酰-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现
MX349622B (es) 2010-09-08 2017-08-07 Halozyme Inc Metodos para evaluar e identificar o evolucionar proteinas terapeuticas condicionalmente activas.
CN103118696B (zh) 2010-10-06 2020-02-14 Atyr 医药公司 与色氨酰-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物
US20140140962A1 (en) * 2011-04-29 2014-05-22 The Research Foundation Of State University Of New York Viruses modified with unnatural moieties and methods of use thereof
US9714419B2 (en) 2011-08-09 2017-07-25 Atyr Pharma, Inc. PEGylated tyrosyl-tRNA synthetase polypeptides
BR112014010666A2 (pt) * 2011-11-03 2018-08-07 Yeda Res & Dev plantas transgênicas resistentes a aminoácidos não proteicos
WO2013086228A1 (en) 2011-12-06 2013-06-13 Atyr Pharma, Inc. Pegylated aspartyl-trna synthetase polypeptides
WO2013086216A1 (en) 2011-12-06 2013-06-13 Atyr Pharma, Inc. Improved aspartyl-trna synthetases
TW202446781A (zh) 2011-12-28 2024-12-01 日商中外製藥股份有限公司 胜肽化合物之製造方法
CA2858613A1 (en) 2011-12-29 2013-08-08 Atyr Pharma, Inc. Aspartyl-trna synthetase-fc conjugates
WO2013188635A2 (en) * 2012-06-14 2013-12-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel methods of identifying proteins via n-terminal tagging and selective pull-down
ES2708565T3 (es) 2013-03-15 2019-04-10 Atyr Pharma Inc Conjugados de Fc-histidil-ARNt sintetasa
EP2979168A4 (en) * 2013-03-29 2016-11-23 Univ Washington Ct Commerciali SYSTEMS, ALGORITHMS AND SOFTWARE FOR THE DESIGN OF A MOLECULAR INVERSION PROBE (MIP)
EP2876165A1 (en) 2013-11-22 2015-05-27 ACIB GmbH Improved method for producing modifed target polypeptides
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
EP4166664A1 (en) 2015-03-13 2023-04-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified aminoacyl-trna synthetase and use thereof
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
GB201600512D0 (en) * 2016-01-12 2016-02-24 Univ York Recombinant protein production
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
JP7187323B2 (ja) 2017-01-31 2022-12-12 中外製薬株式会社 無細胞翻訳系におけるペプチドの合成方法
PE20191716A1 (es) 2017-02-08 2019-12-05 Bristol Myers Squibb Co Polipeptidos de relaxina modificada que comprenden un mejorador farmacocinetico y sus usos
JP6917050B2 (ja) * 2017-03-06 2021-08-11 学校法人早稲田大学 最適特性を有する非天然型タンパク質の製造方法
CA3060514A1 (en) 2017-04-20 2018-10-25 Atyr Pharma, Inc. Compositions and methods for treating lung inflammation
KR20250007021A (ko) 2017-06-09 2025-01-13 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 N-치환 아미노산을 포함하는 펩타이드의 합성 방법
US11442067B2 (en) * 2017-07-25 2022-09-13 Biocon Limited Peptide mapping method for sequence identification of insulin and insulin analogues
WO2019117274A1 (ja) 2017-12-15 2019-06-20 中外製薬株式会社 ペプチドの製造方法、及び塩基の処理方法
CN108588040B (zh) * 2018-06-08 2021-06-15 中国医学科学院病原生物学研究所 重组MtMetRS、其晶体及它们在制备抗结核药物中的应用
CA3111576A1 (en) 2018-09-11 2020-03-19 Ambrx, Inc. Interleukin-2 polypeptide conjugates and their uses
EP3878836B1 (en) 2018-11-07 2025-07-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha O-substituted serine derivative production method
WO2020111238A1 (ja) 2018-11-30 2020-06-04 中外製薬株式会社 ペプチド化合物、またはアミド化合物の脱保護法および固相反応における脱樹脂方法、並びにペプチド化合物の製造方法
EP3904568A4 (en) 2018-12-26 2024-03-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Mutated trna for codon expansion
EP3938046A1 (en) * 2019-03-13 2022-01-19 St. Jude Children's Research Hospital Vaccine compositions and methods for reducing transmission of streptococcus pneumoniae
EP3939962A4 (en) 2019-03-15 2022-12-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha PROCESS FOR PREPARING AN AROMATIC AMINO ACID DERIVATIVE
BR112022007535A2 (pt) 2019-11-07 2022-07-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composto peptídico cíclico tendo ação inibitória de kras
CN114641569A (zh) 2019-12-26 2022-06-17 中外制药株式会社 翻译用组合物及肽的制备方法
GB2610490A (en) 2020-03-31 2023-03-08 Protomer Tech Inc Conjugates for selective responsiveness to vicinal diols
AR122020A1 (es) 2020-05-05 2022-08-03 Genentech Inc Sistemas y métodos para la conjugación específica de sitio de proteínas mediada por tirosinasa
JPWO2021261577A1 (es) 2020-06-25 2021-12-30
PE20231309A1 (es) * 2020-10-17 2023-08-24 Sun Pharmaceutical Ind Ltd Agonistas duales glp-1/gip
IL302775A (en) 2020-11-19 2023-07-01 Protomer Tech Inc Aromatic boron-containing compounds and insulin analogs
US20240384267A1 (en) 2021-09-20 2024-11-21 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for multiplex decoding of quadruplet codons
IL317049A (en) 2022-05-18 2025-01-01 Protomer Tech Inc Aromatic boron-containing compounds and related insulin analogs
WO2023250446A2 (en) * 2022-06-22 2023-12-28 The University Of Chicago ENGINEERED tRNA AND METHODS OF USE
CN116376851A (zh) * 2022-08-25 2023-07-04 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 氨酰tRNA合酶突变体及其应用

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0576592B1 (en) 1991-03-18 2000-05-31 The Scripps Research Institute Oligosaccharide enzyme substrates and inhibitors: methods and compositions
DK0974111T3 (da) 1997-04-11 2003-04-22 California Inst Of Techn Apparat og metode til automatiseret design af proteiner
US7449443B2 (en) 2000-03-23 2008-11-11 California Institute Of Technology Method for stabilization of proteins using non-natural amino acids
WO2002085923A2 (en) 2001-04-19 2002-10-31 The Scripps Research Institute In vivo incorporation of unnatural amino acids
WO2003073238A2 (en) * 2002-02-27 2003-09-04 California Institute Of Technology Computational method for designing enzymes for incorporation of amino acid analogs into proteins
MXPA05003978A (es) 2002-10-16 2005-06-22 Scripps Research Inst Sintesis de glicoproteinas.
BRPI0507169A (pt) 2004-02-02 2007-06-26 Ambrx Inc polipeptìdeos do hormÈnio de crescimento humano modificados e seu usos
US20050260711A1 (en) 2004-03-30 2005-11-24 Deepshikha Datta Modulating pH-sensitive binding using non-natural amino acids
US20050287639A1 (en) 2004-05-17 2005-12-29 California Institute Of Technology Methods of incorporating amino acid analogs into proteins
WO2006091231A2 (en) 2004-07-21 2006-08-31 Ambrx, Inc. Biosynthetic polypeptides utilizing non-naturally encoded amino acids
US20090181858A1 (en) 2004-09-21 2009-07-16 The Scripps Research Institute Adding photoregulated amino acids to the genetic code
JP2008516637A (ja) 2004-10-20 2008-05-22 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート 真正細菌へのｎ−アセチルガラクトサミンアミノ酸のインビボ部位特異的組込み
EP2399893B1 (en) 2004-12-22 2018-08-15 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides
EP1836298B1 (en) 2004-12-22 2012-01-18 Ambrx, Inc. COMPOSITIONS OF AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE AND USES THEREOF
EP1891092A4 (en) 2005-06-03 2011-12-21 Ambrx Inc INSTALLATION OF NATURALLY CODED AMINO ACIDS IN PROTEINS
AU2005335491B2 (en) 2005-08-18 2010-11-25 Ambrx, Inc. Compositions of tRNA and uses thereof
WO2007070659A2 (en) 2005-12-14 2007-06-21 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides
AU2007215566A1 (en) 2006-01-19 2007-08-23 Ambrx, Inc. Non-natural amino acid polypeptides having modulated immunogenicity

Also Published As

Publication number Publication date
AU2007224019A1 (en) 2007-09-13
PT1999259E (pt) 2014-09-24
EP1999259A2 (en) 2008-12-10
US8518666B2 (en) 2013-08-27
CA2644474A1 (en) 2007-09-13
JP5808882B2 (ja) 2015-11-10
WO2007103307A3 (en) 2008-03-13
SI1999259T1 (sl) 2014-11-28
US8980581B2 (en) 2015-03-17
JP2013146274A (ja) 2013-08-01
US20140045261A1 (en) 2014-02-13
JP2009528824A (ja) 2009-08-13
WO2007103307B1 (en) 2008-05-02
EP1999259B1 (en) 2014-06-25
US20080044854A1 (en) 2008-02-21
PL1999259T3 (pl) 2015-01-30
DK1999259T3 (da) 2014-10-06
AU2014202733A1 (en) 2014-06-12
WO2007103307A2 (en) 2007-09-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2504521T3 (es) Incorporación específica del sitio de aminoácidos en moléculas
US9133457B2 (en) Methods of incorporating amino acid analogs into proteins
EP2581450B1 (en) Non-natural amino acid substituted polypeptides
US8568706B2 (en) Modified human interferon-beta polypeptides
US7829659B2 (en) Methods of modifying polypeptides comprising non-natural amino acids
US20250327074A1 (en) The rare codon recoding platform for noncanonical amino acids incorporation in mammalian cells
US20100273978A1 (en) Modified polypeptides suitable for acceptace of amino acid substited molecules
AU2013203486A1 (en) Non-natural amino acid substituted polypeptides
Umehara et al. Synthetase Activity in Escherichia coli
HK1164939A (en) Amino acid substituted molecules