ES2524559T3

ES2524559T3 - Composiciones de acondicionamiento de la piel que contienen compuestos para reproducir el efecto del ácido retinoico sobre la piel

Info

Publication number: ES2524559T3
Application number: ES01957886.3T
Authority: ES
Inventors: Stewart Paton Granger; Ian Richard Scott; Susanne Teklits Iobst; Lisa Licameli; Robert Mark Donovan
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 2000-06-30
Filing date: 2001-06-25
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2021-06-25
Also published as: EP1333800B1; US20080234342A1; EP1333800A2; KR20030011937A; MXPA02012865A; US20110206626A1; US20120258061A1; US8409550B2; WO2002002074A2; ZA200210288B; CN1662216A; AU7968701A; US8226933B2; CZ20024220A3; WO2002002074A3; US20140050676A1; JP2004501952A; BR0112142A; US7959913B2; CA2412788A1

Abstract

Una composición para el cuidado de la piel, que comprende: a. de 0,001 % a 10 % en peso de la composición de un retinoide; b. una combinación de al menos 4 refuerzos retinoides pertenecientes a las clases de inhibidores de LRAT / ARAT (B1), agonistas de la retinol deshidrogenasa (B2), inhibidores de la retinal reductasa (B3), agonistas de CRABP-2 (B4) e inhibidores de la oxidación de ácidos retinoicos del citocromo (B5) en una cantidad de 0,0001 % a 50 % en peso de la composición, en la que las proporciones de cada uno de los refuerzos entre sí está en el intervalo de 1: 1000 a 1000: 1; c. un vehículo farmacéuticamente aceptable. en la que el inhibidor de LRAT / ARAT (B1) es seleccionado entre el grupo que consiste en crocetina, esfingosina acetilo, cocamidopropil betaína, coco hidroxietil-imidazolina, cocoamida-mea, glicerol-pca-oleato, hexanoamida, esfingosina hexanoílo, lauroil sarcosina, lidocaína, linoleamidedea, linoleamida-mea, dimetilamina linoleamidopropil, melinamida, miristoilsarcosina, oleil betaína, palmitamida-mea, estearilhidroxiamida, naringenina, alilo alfa-ionona, alfa-damascona, alfa-ionona, alfa-metil ionona, alfa-terpineol, beta-damascona, brahmanol, damascenona, delta damascona, dihidro alfa-ionona, safranato etílico, alcohol fenquilo, gamma-metil ionona, isobutil ionona, isociclogeraniol, isodamascona liral, santalona, santanol, timberol, tonalid, traseolida, cloruro de trimetilamonio de coco, ácido ursólico, citral, citronelol, farnesol, geraniol, geranil geraniol, linalol, nonadieneal, pseudoionona, dioctilfosfatidil etanolamina, dimetil imidazolidinona e imidazolidinil urea; en la que el agonista de retinol deshidrogenasa (B2) es seleccionado entre el grupo que consiste en fosfatidilcolina y esfingomielina; en el que el inhibidor de la reductasa retinaldehído (B3) es seleccionado del grupo que consiste en la vainillina, ácido araquídico, ácido araquidónico, ácido linoleico, ácido linolénico, ácido mirístico, amsacrina, carbenoxolona, ácido glicirretínico y fosfatidiletanolamina; en el que el antagonista de CRABP-2 (B4) es seleccionado entre el grupo que consiste en ácido elaídico, ácido hexadecanodioico, ácido 12-hidroxiesteárico, ácido isoesteárico y aceite de linaza; y en el que el inhibidor de la oxidación de ácidos retinoicos (B5) es seleccionado del grupo que consiste en bifonazol, climbazol, clotrimazol, econazol, ketoconazol, miconazol, lauril hidroxietilimidazolina, oleil hidroxietilimidazolina, quercetina, cumarina y metirapona.

Description

Composiciones de acondicionamiento de la piel que contienen compuestos para reproducir el efecto del ácido retinoico sobre la piel

La presente invención se refiere a composiciones cosméticas de acondicionamiento de la piel que contienen ciertos compuestos que reproducen el efecto del ácido retinoico sobre la piel

El retinol (vitamina A) es un compuesto endógeno que aparece de forma natural en el cuerpo humano y es esencial para la diferenciación de las células epiteliales normales. Se han usado ampliamente derivados naturales y sintéticos de la vitamina A para el tratamiento de una variedad de trastornos de la piel y se han usado como agentes de reparación o renovación de la piel. El ácido retinoico se ha empleado para tratar una variedad de estados de la piel, por ejemplo, acné, arrugas, psoriasis, manchas de edad y decoloración. Véase, por ejemplo, Vahlquist, A. et al., J. Invest. Dermatol., Vol. 94, Holland D.B. y Cunliffe, W.J. (1990), pág. 496-498; Ellis, C.N. et al., "Pharmacology of Retinols in Skin", Vasel, Karger, Vol. 3, (1989), pág. 249-252; Lowe, N.J. et al., "Pharmacology of Retinols in Skin", Vol. 3, (1989), pág. 240-248; Solicitud de patente PCT Nº WO 93/19743.

Se cree que los ésteres de retinol y el retinol se convierten metabólicamente en la piel en ácido retinoico según el siguiente mecanismo:

Metabolismo del retinol en la superficie: nombres de las enzimas

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que ciertos compuestos potencian la conversión de los ésteres de retinilo y el retinol en ácido retinoico. Los compuestos se denominan colectivamente "refuerzos" y se codifican como grupos B1 a B5 de acuerdo con el mecanismo de refuerzo del compuesto particular. El mecanismo de los grupos de refuerzo es el siguiente: inhibición ARAT / LRAT (AcilCoenzima A (CoA): retinol acil transferasa/lecitina: retinol acil transferasa) (B1), potenciando la actividad la retinol deshidrogenasa (B2), inhibiendo la actividad de la retinal reductasa (B3), antagonizando CRABP-II (proteína de unión al ácido retinoico celular II) la unión del ácido retinoico (B4) e inhibiendo el citocromo P450 dependiente de la oxidación de ácidos retinoico (B5).

Los refuerzos, solos o en combinación unos con otros, potencian la acción de los retinoides mediante el aumento de la conversión de los retinoides en ácido retinoico y la prevención de la degradación del ácido retinoico. Los refuerzos actúan junto con un retinoide (por ejemplo, retinol, ésteres de retinilo, retinal, ácido retinoico), estando este último presente de forma endógena en la piel. Las composiciones incluyen un retinoide en la composición, presentes junto con un refuerzo o una combinación de refuerzos, para optimizar el rendimiento.

Varias patentes de Granger et al. describen el uso de reforzadores de retinoide en las composiciones cosméticas para mejorar la eficacia de del retinol y ésteres de retinilo (números de patente de Estados Unidos: 5759556, 5756109, 5747051, 5716627, 5811110; 5536740, 5747051, 5599548, 5955092, 5885595, 5759556, 5693330). Los refuerzos descritos en estas patentes están restringidos a las clases B1 y B5. Además Johnson & Johnson tienen una serie de patentes que describen el uso de moléculas que entran en moléculas de clase 5 de refuerzo (documentos US 5.028.628, US 5.037.829, US 5.151.421, US 476.852, US 5.500.435, US 5.583.136, US 5.612.354).

Las moléculas que actúan como refuerzos de retinoides son ingredientes comunes en los productos cosméticos. Existe una considerable técnica anterior que describe su uso en composiciones cosméticas. Hay técnica anterior sustancial que describe el uso de dos o más de estas moléculas en la misma composición. Algunos de los ejemplos de la técnica anterior son como en los documentos US 5.665.367, US 5.747.049, US 5.853.705, US 5.766.575 y US

5.849.310.

Sin embargo, la técnica anterior no describe la sinergia derivada de combinaciones de moléculas de refuerzo. . Esta observación de un refuerzo sinérgico de la actividad retinoide partir de combinaciones de moléculas de refuerzo fue un hallazgo inesperado. La técnica anterior no describe las concentraciones o proporciones de moléculas de

5 refuerzo o proporciones de moléculas de refuerzo con las de los retinoides. Por lo tanto, la presente invención es novedosa en que mediante la combinación de retinoides cosméticos con moléculas de refuerzo, a las concentraciones o proporciones más adecuadas, se obtiene una mejora sustancial en la eficacia de los retinoides.

Las clases de propulsores adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a ellos, los refuerzos enumerados en las Tablas B1 a B5.

10 Mejores Grupos de refuerzos

Compuestos B1

1. Amidas de ácidos grasos: Estas están fácilmente disponibles comercialmente y tienen la ventaja añadida de ser agentes tensioactivos y, por lo tanto, ayudan a generar emulsiones adecuadas para preparaciones cosméticas.

2. Ceramidas: Estas, además, pueden actuar como precursores de las ceramidas de barrera en el estrato córneo

3. Carotenoides: Estos pueden ofrecer cierta protección UV y actuar como colorantes naturales.

4. Flavanoides: Antioxidantes naturales.

5. Fragancias cíclicas: Estas están fácilmente disponibles comercialmente y, además, se pueden utilizar para dar fragancia al producto.

6. Fragancias no cíclicas: Estas se pueden utilizar para dar fragancia al producto.

7. Análogos de fosfolípidos: Estos pueden usarlos las células de la piel para alimentar la generación de componentes de la barrera.

8. Ureas: Estas están fácilmente disponibles comercialmente y también pueden actuar como conservantes para el producto.

Compuestos B2

1. Fosfatidilcolina: Los más preferidos como activadores más activos de la retinol deshidrogenasa

2. Esfingomielina

15 Compuestos B3

Ácido araquidónico Ácido linoleico Ácido linolénico Ácido mirístico: Ácidos grasos que pueden ser útiles en el mantenimiento de la barrera del estrato córneo

Ácido linoleico Ácido linolénico: Ácidos grasos esenciales

Ácido araquidónico Ácido mirístico: Ácidos grasos no esenciales

ácido glicirretínico: Ácido carboxílico policíclico triterpeno que se obtiene fácilmente a partir de fuentes vegetales.

Fosfatidiletanolamina: Se pueden incorporar en las membranas celulares.

Compuestos B4

Ácido hexadecanodioico Ácido 12-hidroxiesteárico Ácido isoesteárico: Ácidos grasos saturados.

Aceite de linaza Ácido elaídico: Ácidos grasos insaturados

Ácido elaídico Ácido isoesteárico Ácido hexadecanodioico: Sólidos a temperatura ambiente

Aceite de linaza Ácido 12-hidroxiesteárico: Líquidos a temperatura ambiente.

Compuestos B5

Bifonazol Climbazol Clotrimazol Econazol Ketoconazol Miconazol: Antimicóticos

Climbazol: Fácilmente disponibles comercialmente

Laurilhidroxietilimidazolina: Compuestos que están fácilmente disponibles comercialmente y tienen la ventaja añadida de ser agentes tensioactivos y, por lo tanto, ayudan a generar emulsiones adecuadas para preparaciones cosméticas.

Quercetin: Flavanoide de origen natural que tiene propiedades antioxidantes

Cumarina: Colorante natural

Quinolinas Isoquinolinas

Metirapona

5 La presente invención incluye, en parte, una composición de acondicionamiento de la piel que contiene de aproximadamente 0,0001 % a aproximadamente 50 %, preferentemente de 0,001 % a 10 %, más preferentemente de 0,001 % a 5 % en peso de la composición de un refuerzo o una combinación de refuerzos y un vehículo cosméticamente aceptable.

Los refuerzos o combinaciones de los mismos incluidos en las composiciones de la invención se seleccionan del 10 grupo que consiste en:

(a) un refuerzo seleccionado de entre el grupo que consiste en B2; B3; B4;

(b) combinaciones binarias de refuerzos seleccionados del grupo que consiste en: B1/B2; B1/B3; B1/B4; B1/B5; B2/B3, B2/B4; B2/B5, B3/B4; B3/B5; B4/B5 15 (c) combinaciones ternarias de refuerzos seleccionados del grupo que consiste en:

B1/B2/B3; B1/B2/B4; B1/B2/B5; B1/B3/B4; B1/B3/B5; B1/B4/B5; B2/B3/B4; B2/B3/B5; B2/B4/B5; B3/B4/B5

(d) combinaciones cuaternarias de refuerzos seleccionados del grupo que consiste en: B1/B2/B3/B4; B1/B2/B3/B5; B1/B2/B4/B5;

20 B1/B3/B4/B5; B2/B3/B4/B5; y

(e) una combinación de cinco grupos de refuerzos:

B1/B2/B3/B4/B5.

Las composiciones preferidas incluyen de aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 10 %, en peso de la composición de un retinoide.

Los compuestos incluidos en la presente invención como refuerzos se seleccionan basados en la capacidad de estos compuestos para pasar, a una cierta concentración indicada en la Tabla A, ensayos in vitro por enzimas específicas como se describe a continuación en las secciones 2.1 a 2.7.

El término "acondicionamiento" según se usa en la presente invención se refiere a la prevención y al tratamiento de una o más de los siguientes estados: piel seca, piel fotodañada, aparición de arrugas, manchas de edad, piel envejecida. Las composiciones también son útiles para aumentar la flexibilidad del estrato córneo, para aclarar el color de la piel, para controlar la excreción de sebo y para aumentar, en general, la calidad de la piel. . La composición se puede usar para mejorar la descamación de la piel y la diferenciación epidérmica.

La presencia de los compuestos seleccionados en la composición de la invención mejora sustancialmente el comportamiento de un retinoide.

Las composiciones de la invención contienen un retinoide que se selecciona de ésteres de retinilo, retinol, retinal y ácido retinoico, preferentemente retinol o el éster de retinilo. El término "retinol" incluye los siguientes isómeros de retinol: todo-trans-retinol, 13-cis-retinol, 11-cis-retinol, 9-cis-retinol, 3,4-dideshidro-retinol, 3,4-didehidro-13-cis-retinol; 3,4-didehidro-11-cis-retinol; 3,4-didehidro-9-cis-retinol. Los isómeros preferidos son todo-trans-retinol, 13-cis-retinol, 3,4-dideshidroretinol, 9-cis-retinol. El más preferido es todo-trans-retinol, debido a su amplia disponibilidad comercial.

El éster de retinilo es un éster de retinol. El término "retinol" se ha definido anteriormente. Los ésteres de retinilo adecuados para uso en la presente invención son los ésteres C1-C30 de retinol, preferentemente ésteres C2-C20, y lo más preferentemente los ésteres C2, C3 y C16 debido a que se encuentran más comúnmente disponibles. ejemplos de ésteres de retinilo incluyen, pero no se limitan a: palmitato de retinilo, formiato de retinilo, acetato de retinilo, propionato de retinilo, butirato de retinilo, valerato de retinilo, isovalerato de retinilo, hexanoato de retinilo, heptanoato de retinilo, octanoato de retinilo, nonanoato de retinilo, decanoato de retinilo, undecanoato de retinilo, laurato de retinilo, tridecanoato de retinilo, miristato de retinilo, pentadecanoato de retinilo, heptadecanoato de retinilo, estearato de retinilo, isoestearato de retinilo, nonadecanoato de retinilo, araquidonato de retinilo, behenato de retinilo, linoleato de retinilo y oleato de retinilo.

El éster preferido para uso en la presente invención se selecciona de palmitato de retinilo, acetato de retinilo y propionato de retinilo, debido a que son los que tienen mayor disponibilidad en el mercado y, por tanto, los más baratos. El linoleato de retinilo y el oleato de retinilo también se prefieren debido a su eficacia.

El retinol y/o el éster de retinilo se emplean en la composición de la invención en una cantidad de aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 10 %, preferentemente en una cantidad de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 1 %, lo más preferentemente en una cantidad de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 0,5 %.

El ingrediente esencial de las composiciones de la invención es un compuesto que supere los Ensayos descritos más adelante en las secciones 2.1 a 2.7. Un compuesto adecuado para uso en la presente invención inhibe o potencia con una concentración de 100 mM indicado en la Tabla A una enzima hasta al menos un amplio % enumerado en la Tabla A.

TABLA A

Sección A: Identificación del refuerzo:

Concentraciones de ensayo del refuerzo y % de inhibición/incremento Ensayo ARAT / LRAT (para identificar los refuerzos B1)

Invención: Concentración del compuesto % de inhibición

Ancho: 100 µM > 10 %

Preferido: 100 µM > 25 %

Lo más preferido: 100 µM > 40 %

Óptimo: 100 µM > 50 %

(continuación)

Invención: Concentración del compuesto % de inhibición

Ensayo de retinol deshidrogenasa (para identificar los refuerzos B2)

Invención: Concentración del compuesto % de incremento

Ancho: 100 µM > 10 %

Preferido: 100 µM > 15 %

Lo más preferido: 100 µM > 20 %

Óptimo: 100 µM > 25 %

Ensayo de retinal reductasa (para identificar los refuerzos B3)

Invención: Concentración del compuesto % de inhibición

Ancho: 100 µM > 5 %

Preferido: 100 µM > 10 %

Lo más preferido: 100 µM > 20 %

Óptimo: 100 µM > 35 %

Ensayo de antagonista de CRABPII (para identificar los refuerzos B4)

Invención: Compuesto: proporción de ácido retinoico % de inhibición

Ancho: 7000 : 1 > 25 %

Preferido: 7000 : 1 > 50 %

Lo más preferido: 70 : 1 > 25 %

Óptimo: 70 : 1 > 50 %

Ensayo de oxidación de ácido retinoico (para identificar los refuerzos B5)

Invención: Concentración del compuesto % de inhibición

Ancho: 100 µM > 25 %

Preferido: 100 µM > 45 %

Lo más preferido: 100 µM > 70 %

Óptimo: 100 µM > 80 %

Los ensayos microsomales in vitro usados para determinar la idoneidad de la inclusión del compuesto en las composiciones de la invención son los siguientes:

5 1. Materiales

Todo-trans-retinol, ácido todo-trans-retinoico ácido, palmitoil-CoA, dilauroilfosfatidilcolina, NAD y NADPH se adquirieron de Sigma Chemical Company. Las soluciones madre de los retinoides para los ensayos microsomales se prepararon en acetonitrilo de calidad HPLC. Todas las soluciones madre de patrón de retinoides para el análisis de HPLC se prepararon en etanol, se almacenaron en atmósfera de N2 a -70 ºC y se mantuvieron en hielo bajo una

10 luz ámbar cuando estaban fuera del almacenamiento. Otros productos químicos y los inhibidores estaban disponibles comercialmente en proveedores de materiales cosméticos o empresas químicas tales como Aldrich o International Flavours and Fragrances.

2. Procedimientos

2.1 Aislamiento de los microsomas de RPE (modificado de (1))

Se obtuvieron 50 globos oculares bovinos hemiseccionados congelados, de los que se había extraído la retina y el humor acuoso en WL Lawson Co., Lincoln, NE, EE.UU. Los ojos se descongelaron durante la noche y se extrajo la membrana iridiscente coloreada mediante extracción con fórceps. Cada ocular se lavó con 0,5 ml de tampón enfriado 2x Cada globo ocular se lavó con 2x 0,5 ml de tampón frío (PO4 0,1M / DTT 1 mM / sacarosa 0,25 M, pH 7) mediante frotado de las células de pigmentación oscura con pincel de pintor o una espátula de goma. La suspensión celular se añadió a las membranas iridiscentes y la suspensión se agitó durante varios minutos en un vaso de precipitados con una barra de agitación de teflón. La suspensión se filtró a través de un filtro grueso (Spectra/Por tamaño de poro 925 μ en malla de polietileno) para eliminar las partículas grandes, y la suspensión de color oscuro resultante se homogeneizó usando una Glas-Col con un homogeneizador de teflón accionado por motor.

El homogeneizado de células se centrifugó durante 30 minutos a 20.000 g (centrífuga modelo Sorvaal RC-5B con un rotor SS34 en Tubos 2.5x10cm a 14.000 rpm). El sobrenadante resultante se sometió a una centrifugación adicional durante 60 minutos a 150.000 g (Ultracentrífuga Beckman modelo L80 con un rotor SW50.1 en Tubos de 13 x51mm a 40.000 rpm). Los sedimentos resultantes se dispersaron en ~ 5 ml de PO4 0,1M/ DTT 5 mM, tampón de pH 7 utilizando un Heat Systems Ultrasonics, Inc. modelo W185D Sonifier Celular Disruptor, y la dispersión microsomal resultante se alicuotó en tubos pequeños y se almacenó a -70 ºC. Las concentraciones de proteínas de los microsomas se determinaron usando el ensayo de unión del colorante BioRad, utilizando BSA como patrón.

2.2 Aislamiento de los microsomas de hígado de rata (4)

Aproximadamente 6 gramos de hígado de rata congelado (obtenido de ratas Harlan Sprague Dawley de Accurate Chemical y Scientific Corp.) se homogeneizaron en 3 volúmenes de tampón Tris 0,1 M /KCl 0,1 M / EDTA 1 mM / sacarosa 0,25 M, pH 7,4 usando un Brinkmann Polytron. La suspensión de tejido resultante se homogeneizó adicionalmente, en el homogeneizador de teflón accionado por motor descrito anteriormente. El homogeneizado resultante se centrifugó sucesivamente durante 30 minutos a 10.000 g, 30 minutos a 20.000 g, y 15 minutos a

30.000 g y el sobrenadante resultante se ultracentrifugó durante 80 minutos a 105.000 g. El sedimento se sometió a ultrasonidos en ~ 5 ml de tampón PO4 0,1 M / EDTA0,1 mM / MgCl2 5 mM a pH 7,4 como se describió anteriormente y se almacenó como alícuotas a -70 ºC. Las concentraciones de proteína se determinaron como se ha descrito anteriormente.

2.3 Ensayo para la actividad ARAT y LRAT (para identificar B1)

El procedimiento siguiente fue una modificación de un procedimiento descrito en la literatura (2). El siguiente tampón se preparó y se almacenó a 4 ºC: PO4 0,1 M / ditiotreitol 5 mM, pH 7,0 (PO4/DTT). El día del ensayo, se añadieron 2 mg de BSA por ml de tampón para dar un tampón de trabajo PO4 / DTT / BSA. El sustrato retinol 1mM se preparó en acetonitrilo y se almacenó en botellas de color ámbar con gas nitrógeno a -20 ºC. Las soluciones de Palmitoil-CoA 4 mM en tampón de trabajo (almacenadas en alícuotas) y de dilauroil fosfatidilcolina 4 mM en etanol se prepararon y se almacenaron a -20 ºC. Los inhibidores se prepararon como soluciones madre de 10 mM en H2O, etanol, acetonitrilo o DMSO. La solución de inactivación se preparó usando etanol puro que contiene 50 μg /ml de hidroxitolueno butilado (BHT), y una solución de hexano que contenía 50 μg / ml de BHT se utilizó para las extracciones.

A un vial de vidrio de 2 dram, se añadió lo siguiente en orden: tampón PO4 / DTT / BSA para dar un volumen total de 500 μl, 5μl de donante de acilo (palmitoil-CoA 4 mM y / o dilauroil fosfatidilcolina), 5 μl del inhibidor o blanco de disolvente (dilución madre 10 mM o más), seguido de aproximadamente 15 μg de proteína microsomal RPE (aproximadamente 15 μl de un alícuota de proteínas microsomales ~1 mg/ml). La mezcla se incubó durante 5 minutos a 37 ºC para equilibrar la temperatura de reacción y después se añadieron 5 μl de retinol.1mM. Los viales se taparon, se agitaron en vórtex durante 5 segundos y se incubaron durante 30-90 minutos a 37 ºC. La reacción se inactivó mediante la adición de 0,5 ml de etanol / BHT. Los retinoides se extrajeron mediante la adición de 3 ml de hexano / BHT, agitando en vórtex durante varios segundos varias veces y centrifugando los tubos a baja velocidad durante 5 minutos para separar rápidamente las capas. La capa superior de hexano se retiró en un vial limpio, y la capa acuosa se volvió a extraer con otra 3 ml de hexano / BHT, como se describió anteriormente. Las capas de hexano se combinaron, se evaporaron en hexano por secado a 37 ºC en una corriente de gas nitrógeno en un bloque de aluminio calentado. El residuo seco se almacenó a -20 ºC hasta el análisis HPLC. La cantidad de palmitato de retinilo y laurato de retinilo se cuantificó para determinar la actividad de ARAT y LRAT, respectivamente, por la integración de la señal de HPLC como se describe a continuación.

Obsérvese que la solución de incubación contiene donante de acilo 40µM, 100μM o menos inhibidor, retinol 10μM, aproximadamente 30 μg / ml de proteína microsomal, y casi PO4 0,1 M/ pH 7 / DTT 5 mM / 2 mg / ml de BSA. Todos los pasos posteriores a la adición de retinol se realizaron en oscuridad o con luz ámbar.

2.4 Ensayo de actividad de retinol deshidrogenasa (para identificar B2)

Se prepararon las siguientes soluciones madre:

KH2PO4 50mM, tampón a pH 7,4 esterilizado por filtración

Todo-trans retinol 10mM (Sigma R7632) en DMSO.

Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato 200 mM, sal de sodio (NADP) (Sigma N0505) en agua estéril.

Compuesto de ensayo 40 mM en un disolvente adecuado (agua, tampón, etanol, cloroformo o DMSO).

Dilución 1:10 de microsomas de hígado de rata en KH2PO4 50 mM, tampón pH 7,4 (4 μg /µl).

A un vial de vidrio de 2 dram con tapón de rosca, se añadieron los siguientes en orden:

Tampón para dar un volumen final de 400 μl 25 µl de microsomas diluidos (final = 100 µg) -Los microsomas llevados a ebullición se usaron para los controles y los microsomas regulares para las muestras de ensayo. 4μl de NADP 200 mM (final = 2 mM) 1µl de compuesto de ensayo 40 mM (final = 100μM) 8μl de retinol 10 mM (final = 200 µM)

Los viales se incubaron en un baño de agua con agitación 37 ºC durante 45 minutos. Se añadieron 500 μl de etanol enfriado con hielo a cada vial para inactivar la reacción. Los retinoides se extrajeron dos veces con hexano helado (2,7 ml por extracción). A cada vial se añadió acetato de retinilo (5μl de reserva 900 μM) durante la primera extracción como un medio de control de la eficacia de la extracción en cada muestra. Las muestras se agitaron con vórtex durante diez segundos antes de centrifugar suavemente durante cinco minutos a 1.000 rpm, 5 ºC en una centrífuga Beckman GS-6R. La capa superior de hexano que contiene los retinoides se separó de la capa acuosa después de cada extracción a un vial limpio de dos dram. El hexano se evaporó bajo una corriente suave de nitrógeno gaseoso. El residuo seco se almacenó a -20 ºC hasta el análisis HPLC.

2.5 Ensayo de actividad de retinal reductasa (para identificar B3)

Todas las soluciones madre se prepararon como anteriormente con las siguientes sustituciones:

Todo-trans retinaldehído 10mM (Sigma R2500) en DMSO, en lugar de retinol. 200 mM, fosfato de nicotinamida adenina dinucleótido, forma reducida, sal tetrasódica (NADPH) (Sigma N7505) en agua estéril -en lugar de NADP.

Tampón para dar un volumen final de 400μl 25 µl de microsomas diluidos (final = 100 µg) – uso de microsomas llevados a ebullición como controles y microsomas regulares para las muestras de ensayo. 4μl de NADPH 200 mM (final = 2 mM) 1µl de compuesto de ensayo 40 mM (final = 100μM) 3 μl de retinaldehído 10 mM (final = 75 µM)

Siga el mismo procedimiento de incubación y extracción que se ha detallado anteriormente.

2.6 Ensayo para antagonistas de CRABPII (para identificar B4)

2.6.1. Síntesis de CRABPII

a. Sistema de expresión

El gen CRABPII se clonó en el plásmido pET 29a-c (+) (Novagen). El gen clonado estaba bajo control de las fuertes señales de transcripción y traducción del bacteriófago T7. La fuente de polimerasa de T7 fue proporcionada por la célula huésped de E. coli BLR(DE3)pLysS (Novagen). Este último tiene una copia cromosómica de la polimerasa T7 bajo el control de lacUV5, inducida por la presencia de IPTG.

El plásmido se transfirió a células E. coli BLR (DE3) pLysS mediante transformación de acuerdo con el protocolo del fabricante (Novagen).

b. Inducción

Un cultivo durante la noche de las células transformadas se diluyó a 1:100 en 2xYT que contiene 50 µg/ml de kanamicina y 25 μg / ml de cloranfenicol. Las células crecieron con agitación a 37 ºC hasta que la DO a 600 nm alcanzó 0,6-0,8. El IPTG se añadió a una concentración final de 1mM y el cultivo se incubó durante dos horas adicionales. Las células se recogieron por centrifugación a 5.000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. El sedimento se almacenó a -20 ºC.

2.6.2. Purificación

La purificación se realizó de acuerdo con el procedimiento descrito en Norris y Li, 1997.

a. Lisis

El sedimento congelado se descongeló a temperatura ambiente en 1-2 volúmenes de pastillas de tampón de lisis recién preparado (Tris-HCl 50 mM, pH 8, 10 % (p / v) de sacarosa, EDTA 1 mM, 0,05 % (p / v) de azida sódica, DTT 0,5 mM, MnCl2 10 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 2,5 mM, benzamidina 2,5 mM, 6μg / ml de DNasa). El lisado se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Más lisis se consiguió mediante tratamiento con ultrasonidos (seis ráfagas de 30 segundos a 68,9 MPa alternadas con cinco retrasos de 30 segundos en hielo). La fracción insoluble del lisado se eliminó por centrifugación a 15.000 rpm 1 hora a 4 ºC y el .sobrenadante se almacenó a 20ºC.

b. Filtración en gel en Sephacryl S300

El sobrenadante de la etapa a se cargó en una columna de 2,5x100 cm de Sephacryl S-300 (Pharmacia) a temperatura ambiente. El tampón de elución era Tris-HCl 20 mM, pH 8, DTT 0,5 mM, 0,05 % de azida de sodio (tampón A). El caudal fue de 2 ml / min. Las fracciones de 2 ml recogidas se revisaron para determinar la absorbancia ultravioleta a 280 nm. Las fracciones que representan los picos se examinaron por SDS-PAGE para determinar la presencia de CRABPII.

c. Cromatografía de intercambio aniónico

2 ml de fracciones de filtración en gel que contienen CRABPII se cargaron en una columna de amina cuaternaria de intercambio de aniones FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) de tipo monoQ (Pharmacia). CRABPII se eluyó usando un tampón de gradiente desde 100 % de tampón A a 30 % de tampón B (100 % de tampón B = tampón A + NaCl 250 mM) durante un período de 20 minutos a temperatura ambiente. Se recogieron fracciones de 1 ml cada minuto. Una vez más, la presencia de CRABPII se comprobó mediante SDS PAGE. CRABPII se almacenó a 4 ºC antes de la liofilización utilizando una plataforma Micromodulyo 1.5K con vial Edwards High Vacuum International). Las muestras desecadas se almacenaron a temperatura ambiente hasta su uso en el ensayo de unión.

d. Detección de la presencia de CRABPII

La expresión y purificación de CRABPII se validó utilizando electroforesis en gel desnaturalizante SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) en un gel de poliacrilamida al 7-15 % (Biorad). Muestras de 10 µl se mezclaron con 10 µl de 2X tampón de carga (Tris-HCl 100 mM, pH 6,8, SDS al 4 %, 0,2 % BPB, 20 % de glicerol, DTT 1mM) y se desnaturalizó por calentamiento (2 minutos a 80 ºC). Las muestras se cargaron en el gel que se sumergió en un tampón 1X Tris-glicina (Biorad) y una corriente constante (25 mA) se aplicó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de tinción con azul de Coomassie, la proteína se identificó de acuerdo con su peso molecular tal como se determina con la escalera de proteínas de pretinción Benchmark (Gibco BRL).

Una transferencia de tipo Western se utilizó para confirmar la presencia de CRABPII. Las proteínas separadas en SDS-PAGE se transfirieron a una membrana de transferencia Immobilon-P (Millipore) con un casete Biorad. La transferencia se produjo en tampón 1X Tris-glicina tampón (Biorad) + 10 % de metanol. Se aplicó una corriente eléctrica (60 mA) durante 3 horas para permitir que la proteína migre a través de la membrana. Posteriormente, la membrana se bloqueó con leche en polvo al 5 % en TBS 1X durante una hora a temperatura ambiente y se sondeó con anticuerpos primarios frente a CRABPII (dilución 1/1000 de 5-CRA-B3 monoclonal de ratón) en el mismo tampón a 4 ºC durante la noche. El día siguiente, la membrana se lavó con PBS (3 x 5 minutos) y después se incubó con la dilución 1: 2000 del anticuerpo secundario, anticuerpo anti-ratón conjugado con peroxidasa (ECLTM, Amersham), durante 1 hora a temperatura ambiente. La membrana se lavó con 1 x PBS (3 x 5 minutos) y la proteína se detectó utilizando el kit de detección ECL de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham).

La concentración de CRABPII purificado se determinó usando el kit de BSA (Pierce).

2.6.3. Ensayo de unión radiactivo

220 pmol de CRABPII se incubaron en tampón Tris-HCl 20 mM a pH 7,4 con 15 pmol de ácido todo-trans retinoico (NEN) radiactiva en un volumen total de 70 μl. Para el ensayo competitivo, otro ligando en exceso (6670: 1, 670: 1 o

70: 1) se añadió a la mezcla. La reacción se produjo durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. Con el fin de separar el ácido todo-trans-retinoico no unido a partir del ácido trans-retinoico unido, se utilizó una columna minicromatografía de corte de 6 kD (BioRad). El tampón de almacenamiento se descartó usando un colector Microplex de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pharmacia). Las muestras se cargaron en la columna y la separación se produjo por gravedad durante un período de 30 minutos. El ácido retinoico ("RA") unido a CRABPII apareció en el filtrado, mientras el RA libre se quedó en la columna. La radiactividad del filtrado se midió por contador de centelleo.

2.7 Ensayo para la oxidación de NADPH dependiente de ácido retinoico (Para identificar B5)

El procedimiento siguiente es una modificación de un procedimiento descrito en la literatura (4). El siguiente tampón de ensayo se preparó y se almacenó a 4 ºC: PO4 0,1M / EDTA 0,1mM /MgCl2 5mM, pH 7,4. El día del ensayo, se preparó una solución de NADPH 60 mM en tampón. Las reservas de inhibidor, solución de inactivación acidificada en etanol / BHT y hexano / BHT se prepararon como se ha descrito anteriormente. Una solución de trabajo de ácido retinoico 1mM se preparó por dilución de una reserva de 15 mM (en DMSO) con etanol.

A un vial de 2 dram, se añadió lo siguiente en orden: tampón de ensayo para dar un volumen final de 500 μl, 20μl de NADPH 60 mM, 5μ de inhibidor o blanco de disolvente, seguido de aproximadamente 2 mg de proteína microsomal de hígado de rata.

La mezcla se incubó durante 5 minutos. a 37 ºC, se añadieron 5 µl de solución de trabajo de ácido retinoico 1mM. La incubación se continuó durante 60 minutos. a 37 ºC -los viales no se taparon, ya que el proceso de oxidación requiere O2 molecular además de NADPH. La inactivación llevó a cabo con etanol / BHT acidificado y la extracción se llevó a cabo con hexano / BHT como se describe anteriormente. La cuantificación de los metabolitos del ácido retinoico polares que eluyen rápidamente (que se supone que son ácido 4-oxo-retinoico) se llevó a cabo mediante la integración de la señal de HPLC como se describe a continuación.

Todas las etapas posteriores a la adición de ácido retinoico se realizaron en oscuridad o con luz ámbar. La solución final de incubación contenía NADPH 2,4 mm, 100 μM o menos de inhibidor, ácido retinoico 10 μM, aproximadamente 4 mg / ml de proteína microsomal de hígado de rata y casi PO4 0,1 M / EDTA 0,1 mM / MgCl2 5 mM.

Análisis por HPLC de los retinoides individuales

Las muestras para cuantificación del retinoide por HPLC se prepararon disolviendo el residuo en cada vial con 100 µl de metanol. La solución se transfirió a un tubo cónico de vidrio con 150 μl dentro de un vial de almacenamiento de 1 ml, se tapó herméticamente y se colocó dentro de un tomamuestras automático Waters 715. Se inyectaron alícuotas de 60 μl inmediatamente y se analizó el contenido de retinoides.

La instrumentación de cromatografía consistía en un gradiente de controlador / bomba Waters 600, un detector de matriz de fotodiodos Waters 996 y un detector de barrido de fluorescencia Waters 474. Dos protocolos de HPLC se utilizaron para el análisis retinoide. Para el ensayo de ARAT y LRAT, la separación de los ésteres de retinol y retinol se realizó con una columna analítica de fase inversa C18 Novapak de 3.9x300mm y una columna de seguridad Waters Sentry NovaPak C18 con una fase móvil isocrática de 80/20 (v / v) de metanol / THF ajustada a un caudal de 1 ml / minuto durante 10 minutos En el eluato se monitorizó la absorbancia a 325 nm y la fluorescencia a 325ex / 480em.

Una columna analítica de fase inversa C18 Novapak de 3,9x150mm de y una columna de seguridad Waters Sentry NovaPak C18 se usaron para separar los ácidos retinoides y los alcoholes para los ensayos de oxidación de retinol y ácido retinoico de usando una modificación de un sistema de gradiente descrito por Barua (5). Este sistema consistía en 20 minuto de. gradiente lineal de 68:32 (v / v) de metanol / agua que contiene acetato amónico 10 mM a

4: 1 (v / v) de metanol: diclorometano seguido de retención de 5 minutos a un caudal de 1 ml / minutos. El eluido de la columna se controló de 300 nm a 400 nm.

Estos protocolos se seleccionaron basándose en su capacidad para resolver claramente los ácidos retinoicos retinoides, alcoholes, aldehídos y / o ésteres pertinentes para cada ensayo y la rapidez relativa de separación. La identificación de los retinoides individuales por HPLC se basó en una coincidencia exacta del tiempo de retención de los picos desconocidos con la de los patrones de retinoide auténticos disponibles y el análisis de espectros UV (300400) de los picos desconocidos frente a retinoides auténticos disponibles.

Referencias

1 J. C. Saari & D. L. Bredberg, "CoA and Non-CoA Dependent Retinol Esterification in Retinal Pigment Epithelium", J. Bill. Chem. 263, 8084-8090 (1988). 2 J. C. Saari & D. L. Bredberg, "ARAT & LRAT Activities of Bovine Retinal Pigment Epithelial Microsomes", Methods Enzymol. 190, 156-163 (1990). 3 J. L. Napoli & K. R. Race, "The Biosynthesis of Retinoic Acid from Retinol by Rat Tissues in vitro", Archives Biochem. Biophys. 255, 95-101 (1987). 4 R. Martini & M. Murray, "Participation of P450 3A Enzymes in Rat Hepatic Microsomal Retinoic Acid 4- Hydroxylation", Archives Biochem. Biophys. 303, 57-66 (1993). 5 A. B. Barua, "Analysis of Water-Soluble Compounds: Glucuronides", Methods Enzymol. 189, 136-145 (1990).

Los refuerzos adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a ellos, los refuerzos enumerados en las Tablas B 1 a B5 a continuación. La siguiente tabla proporciona la clase de refuerzo (B 1 -B 5), el nombre químico del compuesto, y los resultados de los ensayos apropiados utilizados para identificar el refuerzo (es decir ARAT / LRAT para B1, retinol deshidrogenasa para B2, inhibición de retinaldehído para B3, CRABP es la unión para B4 y la inhibición de la oxidación del ácido retinoico para B5.

Activadores de la retinol deshidrogenasa (B2) Clase Compuesto % Incremento de la retinol deshidrogenasa

Fosfolípido Fosfatidilcolina 21 % de incremento Fosfolípido Esfingomielina 26 % de incremento

Inhibidores de la retinaldehído reductasa (B3) Clase Compuesto TG global (CI50) % de inhibición de la retinal reductasa

Aldehído Vanillina 9,70E-03 6 % Ácido graso Ácido araquídico 20 % Ácido graso Ácido araquidónico 49 % Ácido graso Ácido linoleico 1,63E-04 62 %+/-2 Ácido graso Ácido linolénico 1, 34E-04 54 %+/-16 Ácido graso Ácido mirístico 1,72E-05 26 % Otros Amsacrina 6,26E-06 22 %+/-8 Otros Carbenoxolona 3,61E-07 26 %+/-2 Otros ácido glicirretínico 8,64E-06 38 %+/-1 Fosfolípido Fosfatidiletanolamina 37 %

Antagonistas de CRABPII (B4) Clase Compuesto TG global (CI50) % de inhibición CRABPII

Ácido graso Ácido elaídico 6,50E-05 >50 % Ácido graso Ácido hexadecanodioico 1,30E-04 >50 % Ácido graso Ácido 12-hidroxiesteárico 2,91E-05 >50 % Ácido graso Ácido isoesteárico 6,88E-05 >50 % Ácidos grasos Aceite de linaza >50 %

Inhibidores de la oxidación del ácido retinoico (B5)

Clase Compuesto TG global % Inhibición % Inhibición (CI50) ácido retinoico ácido retinoico (10μM) (100 μM)

Imidazol: Bifonazol 89 % 100 %

Imidazol: Climbazol 9,47E-06 80 % 92 %

Imidazol: Clotrimazol 76 % 85 %

Imidazol: Econazol 88 % 100 %

Imidazol: Ketoconazol 1,85E-07 84 % 84 %

Imidazol: Miconazol 2,78E-07 74 % 86 %

Amidas de ácidos grasos y otros tensioactivos: Laurilhidroxietilimidazolina 4,67E-07

Amidas de ácidos grasos y otros tensioactivos: oleilhidroxietilimidazolina 3,02E-05 54 % 80 %

Flavanoides: Quercetin 6,29E-05 40 % 74 %

Cumarina
Cumarina

Quinolina: (7H-Benzimidazo[2,1a]Benz[de]-isoquinolin-7-ona 8,59E-07

Quinolina: Hidroxiquinolina (Carboestirilo) 3,64E-04

Quinolina: Metilrapona (2-Metil-1,2-di-3-Piridil-1-Propano) 47 %

Sección b. Efectos de las combinaciones de refuerzos

Con el fin de evaluar el efecto de combinaciones de moléculas de refuerzo se requiere un ensayo que abarque el efecto de cada una de las cinco clases de refuerzos. Un único ensayo de la enzima no es adecuado para este propósito, ya que será específico sólo para una clase de molécula de refuerzo. Un ensayo que refleja la concentración de retinoide en los queratinocitos es necesario para relacionar los efectos de las moléculas de

refuerzo individuales con combinación de moléculas de refuerzo. Por esta razón, se utilizó un ensayo de transglutaminasa (TGasa). Las TGasas son enzimas dependientes de calcio que catalizan la formación de reticulaciones covalentes en las proteínas. Varias enzimas TGasa están unidas a la membrana en los queratinocitos, lo que es importante para la maduración de las células epidérmicas. Esta enzima es inhibida por el ácido retinoico. Cuanto mayor sea la concentración de ácido retinoico, mayor es la inhibición de la expresión de TGasa. Por lo tanto TGasa es un buen marcador de la diferenciación de queratinocitos y del efecto retinoide en los queratinocitos.

Transglutaminasa como un marcador de diferenciación de la piel.

Durante el procedimiento de diferenciación terminar en la epidermis, se forma una capa de 15 nm de espesor de proteína, conocida como la cubierta cornificada (CC) sobre la superficie interior de la periferia celular. La CC está compuesta por numerosas proteínas distintas que se han entrecruzado entre sí mediante la formación de enlaces isodipeptídicos NΣ-(γ-glutamil) lisina catalizados por la acción de al menos dos transglutaminasas (TGasas) diferentes expresadas en la epidermis. La transglutaminasa I (TGasa) se expresa en abundancia en las capas diferenciadas de la epidermis, especialmente en la capa granular, pero no está presente en la epidermis basal no diferenciada. Así pues, la TGasa I constituye un marcador útil para la diferenciación de los queratinocitos, indicando los elevados niveles de TGasa I un estado más diferenciado. Se usó un ensayo de la TGasa I basado en un ELISA, usando un anticuerpo de la TGasa I, para evaluar el estado de diferenciación de los queratinocitos cultivados en los ejemplos siguientes.

Se cultivaron queratinocitos (cultivados como se ha descrito anteriormente) en placas de 96 pocillos con una densidad de 4.000-5.000 células por pocillo en 200 µl de medio. Tras incubar durante dos o tres días, o hasta que las células alcanzaron un -50 % de confluencia, se cambió el medio por un medio que contenía los compuestos de ensayo (seis réplicas por prueba). Las células se cultivaron durante 96 horas adicionales, tiempo tras el que el medio se aspiró y las placas se almacenaron a -70ºC. Las placas se retiraron del congelador, y las células se lavaron dos veces con 200 µl 1xPBS. Las células se incubaron durante una hora a temperatura ambiente (TA) con TBS / BSA al 5 % (tampón de lavado, albúmina de suero bovino). Después se añadió el anticuerpo primario TGasa: 50 µl de anticuerpos monoclonales anti-Tgasa diluidos a 1:2.000 en tampón de lavado. El anticuerpo primario se incubó durante 2 horas a 37 ºC y después se aclaró 6x con tampón de lavado. Las células se incubaron después con 50µl de anticuerpo secundario (fragmento Fab, conjugado con peroxidasa anti-IgG de ratón de de Amersham) diluido a 1:

4.000 en tampón de lavado durante dos horas a 37 ºC, a continuación se enjuagaron tres veces con tampón de lavado. Tras el aclarado con tampón de lavado, las células se lavaron 3 veces con PBS. Para el desarrollo colorimétrico, las células se incubaron con una solución de 100 µl de sustrato (4 mg o-fenilendiamina y 3,3 l 30 % H2O2 en 10 ml de tampón citrato 0,1M a pH 5,0) durante exactamente cinco minutos a TA en la oscuridad (bajo papel de aluminio). La reacción se detuvo mediante la adición de 50 µl de H2SO4 4N. La absorbancia de las muestras se leyó a 492 nm en el espectrofotómetro de UV de placas de 96 pocillos. De las seis réplicas, cuatro se trataron con ambos anticuerpos, y el quinto se usó como TGasa de fondo control. Los niveles de TGasa se determinaron restando y se expresaron como el porcentaje de control.

Detalles del ensayo de TGasa:

Antes de iniciar los experimentos, para determinar los efectos de las combinaciones de moléculas de refuerzo se investigaron las condiciones de ensayo estándar TGasa. Un ensayo de TGasa plenamente validados se estableció

de la siguiente manera:

A. Reactivos

Células: Queratinocitos humanos(P2 en matraces T75; P3 en placas de ensayo de 96 pocillos) Anticuerpo principal: TGm monoclonal específico Ab B.C1 Ac secundario: F(ab) 2:de la Ig anti-ratón marcada con peroxidasa Solución de sustrato: Para 10 ml de tampón citrato fosfato 4,0 mg de o-fenilendiamina 3,3 µl de 30 % de H202: Prepucio humano Neonatal Biogenesis (Nº Cat 5560 6006) Amersham (Cat # NA9310) Sigma P-7288 Sigma H-1909 -

B. Medios/Tampones Medio de crecimiento de queratinocitos (KGM) Solución salina tamponada con fosfato; Dulbecco sin Ca / MgCl2) Solución salina tamponada con Tris Tampón de bloqueo (1xTBS + 5 % de leche en polvo) Tampón de lavado (leche en polvo al 1 % en TBS + 0,05 % de Tween 20) tampón fosfato citrato: Mezcla 1: 1 de 0,2 M dibásico fosfato de sodio y ácido cítrico 0,1 M H2SO4 4 N: Clonetics (Nº Cat 3111) Life Technology (Cat # 14200-075) BioRad (Cat #170-6404) Sigma (Cat # P-7949) Sigma (Cat # S-9763) Sigma (Cat # C-1909)

C. Accesorios para cultivo Placa de microtitulación de polipropileno de 96 pocillos Placa de polipropileno de 96 pocillos con fondo en U T75-tapa de ventilación: Costar (Cat # 3595) Costar (Cat # 3794) Costar (Cat # 3376)

D: Instrumentación/Equipo Lector de microplacas Biotek Modelo EL 340 Multiprobe II: Bio-tek Instuments Inc. Packard

E: Procedimiento de cultivo celular

Siembra de los queratinocitos en placas de 96 pocillos

1.: Una suspensión de queratinocitos se preparó a una concentración de 3.000 células / 200 µl/ / pocillo en medio KGM (Usado 3x105células / 12 ml de medio en cada placa de microtitulación)

2.: 200 μl de la suspensión de queratinocitos se transfirió únicamente a cada uno de los 60 pocillos internos.

3.: 200 μl de medios KGM se pipetearon en los pocillos exteriores (para mantener el equilibrio térmico).

4.: Cada placa se incubó a 37 ºC y 5 % de CO2 durante 3 días o hasta que las células son ~ 50 % de confluencia.

Tratamiento de queratinocitos con muestras

5.: Las soluciones madre de las muestras se prepararon en DMSO.

6.: Las muestras se diluyeron a la concentración deseada con la concentración de ensayo final de DMSO de 0,1 %.

7.: 20 µl de la muestra se transfirió a los pocillos y 180µl de medio KGM se añadieron para dar un volumen de ensayo final de 200 µl.

8.: Las placas se incubaron a 37 ºC y 5 % de CO 2 durante 72 horas.

9.: Los medios se retiraron completamente de cada pocillo

10.: Los pocillos se lavaron 2 veces con 200 µl de 1xPBS.

11.: Finalmente, se congelaron durante al menos 1,5 horas a -70 ºC

F: Ensayo de la transglutaminasa

1.: Bloqueo: Incubar las placas a temperatura ambiente con 200 µl / pocillo de tampón de bloqueo durante 1 hora.

2.: Anticuerpo principal: Aspirar el tampón de bloqueo. . Incubación con 100 µl/ pocillo de -anticuerpo monoclonal específico B.C1 TGm (diluido 1: 2000 en tampón de lavado) a 37 ºC durante al menos 2 horas. El anticuerpo primario no se añadió en los pocillos de control de fondo.

3.: Aclarado de los pocillos 6x con tampón de lavado.

4.: Anticuerpo secundario: Incubación con 100 µl/ pocillo de fragmento F(ab)2 de Ig marcado con peroxidasa anti-ratón (diluido 1: 4000 en tampón de lavado) a 37 ºC durante 2 horas.

5.: Aclarado de los pocillos 6x con tampón de lavado (200 μl añadido) y aspiración después de cada lavado.

6.: Aclarado de los pocillos 3x con PBS sin Tween.

7.: Incubación con 100 µl/ pocillo de solución de sustrato a temperatura ambiente durante exactamente 5 minutos.

8.: Detención de la reacción con 50 µl/ / pocillo H2SO4 4N.

9. Leer absorbancia a 492 nm en el lector de placas de Bio-tek

I. Estudios de optimización

a. Curso de tiempo de la producción de transglutaminasa

Un experimento de transcurso de tiempo se llevó a cabo para determinar el tiempo de incubación óptimo para la producción de transglutaminasa en queratinocitos cultivados en placas de 96 pocillos (4000 células / pocillo). Este tiempo de estudio se llevó a cabo con múltiples variables incluyendo análisis de respuesta a la dosis de ácido retinoico y retinol así como de incubación en presencia de CaCl2 1,2 mM. Aunque la producción de transglutaminasa en las células control (DMSO al 0,1 %) no se alteró, tanto el ácido retinoico como el retinol exhibieron una inhibición dependiente de la dosis de la producción de transglutaminasa durante el período de incubación de cinco días. El efecto retinoide más pronunciado se observó los días 2 y 3. La inhibición máxima se observó el día 2, inhibiéndose la producción de transglutaminasa el día 2 en un 85 % y 55 % en presencia de la concentración más alta (1 µM) de ácido retinoico y retinol respectivamente. El mismo experimento se realizó también con diferentes densidad de células (3000 células / pocillo y 5000 células / pocillo) y se observaron resultados comparables.

B: Sensibilidad a DMSO

Diversas concentraciones de DMSO que van desde 0-2 % se analizaron para determinar el efecto sobre la producción de transglutaminasa en queratinocitos. El ensayo era sensible a la concentración de DMSO con una inhibición significativa de la actividad, por encima de 0,5 % de DMSO. Por lo tanto, se seleccionó una concentración de ensayo final de 0,1 % para los estudios posteriores de la concentración de la muestra.

C: Curvas dosis-respuesta: ácido retinoico y retinol

Basándose en los datos, día 3 se seleccionó como el tiempo óptimo y 0,1 % de DMSO se seleccionó como la concentración a utilizar para la prueba adicional. Un experimento de respuesta a la dosis adicional se llevó a cabo con ácido retinoico y retinol en presencia de 0,1 % de DMSO, con la producción de transglutaminasa analizada el día 3. Se observó una buena respuesta a la dosis para la inhibición de TGasa por el ácido retinoico y retinol. Retinol 10-7M dio una inhibición de la TGasa en el intervalo lineal de la concentración. . Por lo tanto, esta concentración de retinol se eligió para evaluar las combinaciones de refuerzos.

D: Condiciones finales utilizados para refuerzos de ensayo o combinación de refuerzos

Días de incubación de queratinocitos con

Retinol y refuerzos: -3 días

Concentración final de DMSO: -menos de 0,1 %

concentración de retinol: -10-7M (0,1µM)

Concentraciones del refuerzo: -10 mM a 0,1 nM

Usando las condiciones anteriores se analizó la respuesta a la dosis para todos los diferentes refuerzos (B1-B5) para identificar la mejor concentración del refuerzo para probar en las combinaciones.

Los niveles de transglutaminasa se determinaron y se expresaron en la Tablas B1 a B5, ya sea como

(i): % (inhibición de refuerzo + retinol / inhibición de control) -% (inhibición de ROH / inhibición de control), que mide el efecto del refuerzo añadido + el inducido por retinol en la inhibición de TGasa sobre retinol solo, o

(ii): como un valor de CI50 cuando se examinó el efecto inhibitorio de concentraciones múltiples de refuerzo esto proporciona la concentración de refuerzo que, en combinación con una concentración de retinol constante de 10 -7 M, inhibe la TGasa en un 50 %.

Combinaciones de refuerzos y proporciones de refuerzos

Se ha descubierto sorprendentemente que ciertos compuestos de aumentar los niveles endógenos de la formación de ácido retinoico a partir de retinol o de ésteres de retinilo por diferentes mecanismos. Estos compuestos se denominan colectivamente "refuerzos" retinoides. Estos incluyen: inhibidores de la ARAT / LRAT (refuerzos B1), inhibidores de la retinaldehído reductasa de (refuerzos B3), inhibidores de la unión de ácido retinoico a CRABP-2 (refuerzos B4) e inhibidores de la oxidación de ácido retinoico catalizada por las enzimas del citocromo P450 (refuerzos B5), o ciertos otros compuestos que potencian o activan la retinol deshidrogenasa (refuerzos B2). Estos refuerzos se codifican como grupos B1 hasta B5, como se ve en el gráfico 1 en el presente documento anteriormente.

Los refuerzos, solos o en combinación unos con otros, potencian la acción de de un retinoide mediante el aumento de la cantidad de retinol disponible para la conversión en ácido retinoico y la inhibición de la degradación del ácido retinoico. Los refuerzos actúan junto con un retinoide (por ejemplo, retinol, ésteres de retinilo, retinal, ácido retinoico), estando este último presente de forma endógena en la piel. No obstante, las composiciones incluyen un retinoide en la composición, presentes junto con un refuerzo para optimizar el rendimiento.

La presente invención incluye, en parte, una segunda composición de acondicionamiento de la piel que contiene de aproximadamente 0,0001 % a aproximadamente 50 %, preferentemente de 0,001 % a 10 %, más preferentemente de 0,001 % a 5 % en peso de la composición de un refuerzo o al menos una combinación de combinaciones de refuerzos cuaternarios o 5. La concentración combinada de las combinaciones de refuerzo de 0,001 % a 5 % en las proporciones especificadas como se muestra a continuación, inhiben la transglutaminasa en un ensayo in vitro de la transglutaminasa en a más de 50 %, y un vehículo cosméticamente aceptable.

Los refuerzos incluidos en las composiciones de la invención se seleccionan del grupo que consiste en:

d.: Combinaciones cuaternarias de refuerzos seleccionados entre el grupo que consiste en B1/B2/B3/B4; B1/B2/B3/B5;B1/B2/B4/B5; B1/B3/B4/B5; B2/B3/B4/B5; y

e.: Una combinación de cinco grupos de refuerzos B1 / B2 / B3 / B4 / B5

Proporciones entre refuerzos:

Los refuerzos de diferentes clases (B1 a B5) en combinaciones como se muestra anteriormente tienen una concentración óptima de entre 0,001 % a 5 % en un producto cosmético en proporciones específicas como se muestra a continuación para la inhibición de la actividad TGasa a por lo menos por debajo de 50 %:

Invención: Proporciones entre refuerzos Concentraciones

Ancho: 1: 10,000 a 10,000:1 100 mM a 1 nM

Preferido: 1: 1000 a 1000:1 10 mM a 10 nM

Lo más preferido: 1:100 a 100:1 1 mM a 100 nM

Óptimo: 1:10 a 10:1 0.1 mM a 1 µM

Proporciones entre retinoide y refuerzos:

La composición preferida incluye un retinoide (por ejemplo, retinol, éster de retinilo, y retinaldehído) en la composición, presente cooperación con un refuerzo o una combinación de los refuerzos, para optimizar el rendimiento.

Para un rendimiento óptimo, la concentración de retinoide y el refuerzo debe estar presente en la composición en proporciones como se indica a continuación:

Invención Proporciones entre Concentraciones refuerzos y retinoides

Ancho 10,000:1 a 1:10,000 100 mM-1 nM de refuerzo; 0.001-10 % de retinoides

Preferido 1000:1 a 1:1000 10 mM-10 nM de refuerzo; 0.001-10 % de retinoide

Lo más preferido 100:1 a 1:100 1 mM-100 nM de refuerzo; 0,01-1 % de retinoide

Concentraciones de refuerzos individuales utilizadas en los ejemplos

Dado que el objetivo es establecer inhibición sinérgica de la expresión de la transglutaminasa por combinaciones de los compuestos activos con retinol, era esencial determinar los perfiles de respuesta a la dosis (valores de CI50) de los compuestos activos, cuando se analizan individualmente en presencia de retinol. La respuesta a la dosis detallada de los refuerzos que pertenecen a B2-B4 se da en las tablas siguientes a la tabla de CI50 e CI20 siguiente. Estos datos se utilizaron para identificar una concentración inhibidora submáxima apropiada de cada compuesto activo, para hacer eventualmente posible identificar efectos sinérgicos putativos de las mezclas de los compuestos activos en la presencia de retinol. Los datos de la tabla siguiente representan los valores de CI50 y CI20 (80 % del control) y las concentraciones utilizadas cuando se prueban las sinergias con combinaciones de refuerzos.

A fin de demostrar la sinergia de dos compuestos, es esencial seleccionar concentraciones para analizar que sean como máximo CI20, en otras palabras, una concentración de compuesto que aumenta de forma individual la inhibición por retinol de la expresión de TGasa en un 20 %. Dos de tales compuestos deben tener una inhibición aditiva de 40 %. Utilizando esta estrategia para determinar las concentraciones deja una ventana de 40-100 % de inhibición adicional para la detección de la sinergia de los dos compuestos bajo examen.

Un criterio de concentración más difícil sería la selección de las concentraciones de compuestos que por sí sola no mostró ningún efecto de inhibición, pero en combinación mostró inhibición. En este estudio, sin embargo, se optó por un criterio aún más desafiante. Se seleccionaron concentraciones de los compuestos que fueron de 10 a 1000 veces menor que la concentración mínimamente eficaz inhibidora de TGasa. Identificación de combinaciones sinérgicas

5 que usan tales concentraciones muy bajas significaría que se identificaron las combinaciones sinérgicas más eficaces.

Clase de refuerzo: Nombre del compuesto CI50 CI20 Conc. usada para la sinergia (binario, terciario, cuaternario)

B1: Linoleoilmonoetanolamida (LAMEA) 1,61E-05 1,4BE-05 1E-05 a 1E-09

Palmitamida monoetanolamida: ND ND 1E-06 a 1E-10

oleil betaína: 2,80E-05 1,08E-05 1E-05 a 1E-8

Naringenina: ND ND 1E-05 a 1E-09

Equinácea: ND ND 1E-05 a 1E-09

Dimetilmidazolidinona: ND ND 1E-05 a 1E-09

Melinamida: ND ND 1E-05 a 1E-09

Geranil geraniol: ND ND 1E-05 a 1E-09

Farnesol: 9,35E-05 7,82E-05 1E-06 a 1E-09

Geraniol: 7,83E-03 4,72E-03 1E-03 a 1E-07

α-Damascona: 3,35E-04 1,69E-04 1E-04 a 1E-08

α-Ionona: 9,27E-04 1,42E-04 1E-04 a 1E-08

Éster metílico de ácido de aceite de ricino (MEA): 3,25E-05 9,38-E06 1E-06 a 1E-09

Ácido ursólico: 1,46E-06 5,94-E07 1E-06 a 1E-09

Utrecht-2: 3,47-E06 3,30-E06 1E-06 a 1E-09

Cocoil hidroxietilimidazolina: 2,84E-07 9,21E-08 1E-08 a 1E-11

Acetil esfingosina (ceramida C2): 6,78E-06 5,15E-06 1E-06 a 1E-09

Hexanoil esfingosina (ceramida C6): 9,99E-05 6,94E-05 1E-05 a 1E-09

Crocetin: 3,75E-05 2,52E-05 1E-05 a 1E-09

Lyrial: 1,27E-04 4,00E-05 1E-05 a 1E-09

N-hidroxietil-2-hidroxidodecilamida: 3,29E-05 2,40E-05 1E-05 a 1E-09

B2: Fosfatidilcolina ND ND 1E-05 a 1E-09

Esfingomielina: ND ND 1E-05 a 1E-09

TCC: 9,64E-07 6,18-E07 1E-07 a 1E-10

1,2-dioctanoilo-sn-glicero-3fosfoetanolamida: ND ND 1E-05 a 1E-09

B3: Amsacrina-HCl 6,26E-06 3,30E-06 1E-06 a 1E-09

Carbenoxolona: 3,61E-07 2,00E-07 1E-07 a 1E-10

ácido glicirretínico: 8,64E-06 5,96E-06 1E-06to 1E-09

Ácido linoleico: 1,63E-04 8,95E-05 1E-05 a 1E-09

Ácido linolénico: 1,34E-04 1,21E-04 1E-05 a 1E-09

ácido araquidónico (sal de Na+): ND ND 1E-05 a 1E-09

Ácido mirístico: 1,72E-05 1,05E-05 1E-05 a 1E-09

Vanillina: 9,70E-03 8,47E-03 1E-03 a 1E-06

(continuación)

B4: Ácido hexadecanodioico 1,30E-04 8,40E-05 1E-05 a 1E-09

Ácido 12-hidroxiesteárico: 2,91E-05 1,45E-05 1E-05 a 1E-09

Ácido elaídico: 6,50E-05 5,88E-05 1E-05 a 1E-09

Aceite de linaza: ND ND 1E-05 a 1E-09

Ácido isoesteárico: 6,88E-05 6,23E-05 1E-05 a 1E-09

Ácido 2-hidroxiesteárico: ND ND 1E-05 a 1E-09

B5: Climbazol 4,47E-06 2,45E-07 1E-07 a 1E-10

Clotrimazol: ND ND 1E-05 a 1E-09

Miconazol: 2,78E-07 8,42E-08 1E-08 a 1E-11

Cumarina: ND ND 1E-05 a 1E-09

Ketoconazol: 1,85E-07 5,52E-08 1E-08 a 1E-11

3,4, dihidro-2 (1H) quinolinona (Hidrocarbostirilo): ND ND 1E-05 a 1E-09

2-Hidroxiquinolina (Carboestirilo): 3,64E-04 1,70E-04 1E-04 a 1E-08

Amino Benzotriazol: ND ND 1E-05 a 1E-09

Laurilhidroxietilimidazolina: 4,67E-07 2,69E-07 1E-07 a 1E-10

Quercetin: 6,29E-05 5,11E-05 1E-05 a 1E-09

oleilhidroxietilmidazolina: 3,02E-05 5,65E-06 1E-06 a 1E-09

(7H-Benzimidazo[2,1-a]Benz[de]isoquinolin-7-ona: 8,59E-07 4,69E-07 1E-07 a 1E-09

ND: No determinado o no se observó una respuesta clara a la dosis. Para sinergias, se analizó una amplia gama de concentración (4 órdenes de magnitud 10-5 un 10-9M),

Respuesta a la dosis para la los refuerzos de clase B2 a B4

Las siguientes tablas incluyen los datos de la respuesta a la dosis de refuerzos pertenecientes a las clases B2 a B4. 5 La concentración de los refuerzos se expresan en molar; nivel medio de la TGasa y la desviación estándar de 4 repeticiones se expresa como % de control (0,1 % de DMSO y 10-7M retinol). Los números más altos (cerca de 100

o por encima de 100) indican que no hay inhibición de la TGasa. Cuanto menor sea el número, más potente es el inhibidor a esa concentración. Los valores de CI50 y CI20 se calcularon a partir de esta tabla de dosis-respuesta y se expresan en la tabla anterior.

10 Refuerzos de la clase B2:

Fosfatidilcolina (B2)

Concentración: Niveles de TGasa (media) Tgasa (SD)

4,4E-05: 90,9 0,01

1,47E-05: 120,3 10,6

4,89E-06: 70,1 11,4

1,63E-06: 98,8 0,00

5,43E-07: 86,7 6,19

1,8E-07: 75,9 20,5

6,0E-08: 87,8 3,9

1,2E-08: 159 42,3

2,4E-09: 85,5 0,39

Esfingomielina (B2)

TCC (B2)

Concentración: Niveles de TGasa (media) Tgasa (SD)

3,0E-05: 45 3,21

1,0E-05: 77,8 25,5

3,33E-06: 76,4 7,55

1,1E-06: 98,8 0,00

3,73E-07: 91,6 14,9

1,23E-07: 70,0 3,63

4,10E-08: 74,6 4,19

8,2E-08: 115,2 1,02

1,65E-09: 68,4 2,03

3,29E-10: 69,2 2,1

Concentración: Niveles de TGasa (media) Tgasa (SD)

1,14E-03: 36,3 4,6

3,8E-04: 3,8 0,96

3,31,23E-04: -3,2 0,91

4,22E-05: -11,2 0

1,41E-06: -,3 4,88

4,69E-07: 15,9 3,52

6,26E-08: 18,9 3,12

1,25E-08: 100,2 23,3

6,9E-09: 77,6 21,2

1,0E-09: 54,4 11,23

1,2-dioctanoilo-sn-glicero-3-fosfoetanolamida (B2)

Concentración: Niveles de TGasa (media) Tgasa (SD)

1,6E-04: 58,1 2,08

5,33E-05: 95,4 21,3

1,78E-05: 104 4,01

5,93E-06: 129 0,0

1,98E-06: 110 8,74

6,58E-07: 92,8 15,78

2,19E-09: 88,6 12,3

4,39E-08: 127,3 3,39

8,78E-09: 119 21,1

1,79E-9: 82 15,6

Refuerzos de la clase B3: Amsacrina B3

Carbenoxolona (B3)

Concentración: Niveles de TGasa (media) Tgasa (SD)

3,0E-05: -10 3,29

1,0E-05: 1,8 7,45

3,33E-06: 64 4,2

1,1E-06: 84 0

3,73E-07: 109 6,2

1,23E-07: 65 15,8

4,10E-08: 110 10,5

8,2E-08: 131 27

1,65E-09: 113 18

3,29E-10: 92 8,9

Ácido glicirrético (B3)

Concentración: Niveles de TGasa (media) Tgasa (SD)

3,0E-06: -7,1 0

1,0E-06: 27,3 1,15

3,33E-07: 51,7 0

1,1E-07: 158 0

3,73E-08: 126 4,67

1,23E-08: 81 29

4,10E-09: 135 6,88

8,2E-10: 112 32

1,65E-10: 77,8 10,6

3,29E-11: 64 49

Concentración: Niveles de TGasa (media) Tgasa (SD)

3,0E-04: -0,3 3,9

1,0E-05: 0,7 3,55

3,33E-05: 2,5 2,1

1,1E-06: 96,4 0,00

3,73E-06: 120 33,2

1,23E-07: 112 38

4,10E-07: 93 11

8,2E-08: 225 108

1,65E-08: 103 11

3,29E-9: 100 6,2

Ácido linoleico (B3)

Ácido linolenico (B3)

Concentración: Niveles de TGasa (media) Tgasa (SD)

9,0E-03: -6 3,06

3,0E-03: 0,1 2,01

1E-03: -16,40 16,3

1,1E-04: 4,4 0

3,73E-04,: 79,2 0

1,23E-05: 62,6 6,2

4,10E-05: 76,8 3,69

8,2E-06: 146 44,2

1,65E-07: 106 20,2

3,29E-07: 60,2 2,3

Concentración: Niveles de TGasa (media) Tgasa (SD)

9,0E-03: -11 8,7

3,0E-03: -5,7 0,74

1E-03: -7,5 7,8

1,1E-04: -23 0

3,73E-04,: 68 0,57

1,23E-05: 94,9 17,2

4,10E-05: 65,9 0,03

8,2E-06: 119 1,6

1,65E-07: 77 8,5

3,29E-07: 98 7,0

Ácido mirístico (B3)

Concentración: Niveles de TGasa (media) Tgasa (SD)

1E-03: -2 4,1

1,1E-04: -8 2,3

3,73E-04: -6 1,16

1,23E-05

4,10E-05: 75,1 1,06

8,2E-06: 74,2 10,0

1,65E-07: 88,9 8,4

3,29E-07: 101 4,47

5,0E-08

1,1E-08

Vanillina (B3)

Concentración: Niveles de TGasa (media) Tgasa (SD)

1,4E-02: 21,5 24,2

4,8E-03: 93,8 1,7

1E-03: 124 15,6

1,1E-04

3,73E-04: 101 14,3

1,23E-05: 82 14,6

4,10E-05: 98 2,4

8,2E-06: 109 22

1,65E-07: 80 4

3,29E-07: 93 41

Refuerzos de la clase B4: Ácido hexadecanodioico (B4)

Concentración: Niveles de TGasa (media) Tgasa (SD)

1E-03

1,1E-04: 14,2 2,7

3,73E-04: 43,4 8,4

1,23E-05: 130 0

4,10E-05: 105 14

8,2E-06: 114 12

1,65E-07: 95 1,9

3,29E-07

5,0E-08: 74 6,7

1,1E-08: 70 10,4

Ácido 12-hidroxiestérico (B4)

Concentración: Niveles de TGasa (media) Tgasa (SD)

3,73E-04

1,23E-05: -5,2 2,3

4,10E-05: 32,4 5,3

8,2E-06: 97,6 0

1,65E-07: 90,2 11

3,29E-07: 82 28

5,0E-08: 81 3,8

1,1E-08: 98 24

2,0E-08: 118 28

4,3E-09: 71 2,3

Ácido elaídico (B4)

Aceite de linaza (B4)

Ácido isostérico (B4)

Concentración: Niveles de TGasa (media) Tgasa (SD)

1E-03: 12,8 12,1

1,1E-04: 8 0,45

3,73E-04: 13,8 1,92

1,23E-05: 80,9 0

4,10E-05: 58,2 8,8

8,2E-06

1,65E-07: 58 0,13

3,29E-07: 69 44

5,0E-08: 50,5 3,8

1,1E-08

Concentración: Niveles de TGasa (media) Tgasa (SD)

1E-04: 138 15

3,73E-05: 145 2,5

1,23E-05: 88 12

4,10E-06: 113 0

8,2E-06: 113 13

1,65E-07: 96 18

3,29E-07: 106 10

5,0E-08: 134 22

1,1E-09: 83 13

9,9E-10: 73 15

Concentración: Niveles de TGasa (media) Tgasa (SD)

1E-03: -8,6 3,4

1,1E-04: 1,2 3,0

3,73E-04: -5,3 1,1

1,23E-05: 80 00

4,10E-05: 67 7,9

8,2E-06: 103 12,3

1,65E-07: 95 5,5

3,29E-07: 123 0,5

5,0E-08: 78 12,2

1,1E-08: 78 29

Ácido 2-hidroxiestérico (B4)

Concentración: Niveles de TGasa (media) Tgasa (SD)

9,1E-04: 46,6 6,2

3,73E-04: 69,3 8,3

1,23E-04: 51 8,8

3,10E-05: 96,0 0,0

1,2E-05: 105 30

3,65E-06: 63 8,0

1,29E-06: 80 4,7

2,0E-07: 142 34

5,1E-08: 64 20

1,0E-08: 58 17

Sinergia de inhibición de la TGasa con combinaciones binarias de refuerzos

Para investigar la inhibición sinérgica de la expresión de TGasa por combinaciones de 2 clases diferentes de

5 refuerzos con retinol, las combinaciones seleccionadas de los compuestos se analizaron a las concentraciones dadas en la tabla anterior. Las concentraciones analizadas fueron de un orden log de magnitud menor que la concentración requerida para la inhibición mínima de actividad TGasa (es decir, CI20). Los compuestos se analizaron solos y en combinación, y el % de inhibición de la TGasa se da para cada compuesto y la combinación.

Los siguientes ejemplos dan las combinaciones sinérgicas en todas las posibles combinaciones binarias (B1 / B2; B1

10 / B3, B1 / B4; B1 / B5; B2 / B3, B2 / B4; B2 / B5; B3 / B4, B3 / B5; B4 / B5). Cuando el%de inhibición de la combinación es más que la inhibición de cada compuesto añadido juntos, indica sinergia (es decir, la inhibición por la combinación es mayor que la inhibición por el compuesto 1 + compuesto 2). Todos los ejemplos de combinación binarias dadas en la siguiente tabla sinérgicamente inhibieron TGasa.

Combinaciones binarias: Compuesto 1 Compuesto 2 TG como % C Comp. 1 TG como % C Comp. 2 Combinación TG % c

B1/B2: Dimetilmidazolidinona Fosfatidilcolina 99 97 84

B1/B2: Alfa-demascona Fosfatidilcolina 95 97 86

B1/B2: hexanoilesfingosina Fosfatidilcolina 109 97 86

B1/B2: Alfa-Ionona Esfingomielina 101 98 76

B1/B2: 1,2-dioctanoilo-sn-glicero-3fosfoetanolamida Fosfatidilcolina 106 98 78

B1/B2: Alfa-demascona Esfingomielina 95 84 67

B1/B3: 1,2-dioctanoilo-sn-glicero-3fosfoetanolamida Amsacrina 123 134 75

B1/B3: 1,2-dioctanoilo-sn-glicero-3fosfoetanolamida Carbenoxelona 123 164 96

B1/B3: Aceite de ricino MEA Carbenoxelona 96 164 67

B1/B3: Utrecht-2 Amsacrina 102 98 86

B1/B3: Utrecht-2 Carbenoxelona 102 164 91

(continuación)

B1/B3: hexanoilesfingosina Carbenoxelona 122 164 78

B1/B3: Lyral Carbenoxelona 120 164 82

B1/B3: Aceite de ricino MEA Carbenoxelona 110 164 78

B1/B3: hexanoilesfingosina Amsacrina 122 134 92

B1/B3: hexanoilesfingosina Ácido eliádico 122 144 85

B1/B3: Alfa ionona Amsacrina 101 134 78

B1/B3: 1,2-dioctanoilo-snglicero-3fosfoetanolamida Ácido cliciretínico 95 92 69

B1/B4: Naringenina Ácido 2-hidroxiestérico 95 112 78

B1/B4: hexanoilesfingosina Ácido 2-hidroxiestérico 99.3 112 77

B1/B4: Lyral Ácido hexadecanoico 120 95 69

B1/B4: Aceite de ricino MEA Ácido hexadecanoico 110 125 82

B1/B4: hexanoilesfingosina Ácido isoesteárico 122 146 93

B1/B4: Oleoilbetaína Ácido hexadecanodioico 99.5 125 80

B1/B5: hexanoilesfingosina Cocoil hidroxietilimidazolina 99 102 68

B1/B5: Farnesol Ketokonazol 98 111 84

B1/B5: hexanoilesfingosina Miconazol 99 101 56

B1/B5: hexanoilesfingosina Ketoconazol 99 99 65

B1/B5: hexanoilesfingosina Laurilhidroxietilimidazolina 99 98 51

B1/B5: Utrecht-2 Amino Benzotriazol 122 105 83

B1/B5: hexanoilesfingosina 3,4-dihidro-2 quinolinona 122 102 89

B1/B5: hexanoilesfingosina Amino benzotriazol 122 126 85

B1/B5: Aceite de ricino MEA Laurilhidroxietilimidazolina 110 98 56

B1/B5: hexanoilesfingosina Climbazol 122 98 83

B1/B5: hexanoilesfingosina Miconazol 122 99 78

B1/B5: hexanoilesfingosina Ketoconazol 122 110 90

B1/B5: Oleoilbetaína ketoconazol 96 116 81

B1/B5: Utrecht-2 Laurilhidroxietilimidazolina 122 98 57

B1/B5: Alfa-demascona Oleilhidroxietilmidazolina 112 73 76

(continuación)

B1/B5: Alfa-ionona Laurilhidroxietilimidazolina 101 98 49

B1/B5: Alfa-Ionona Oleilhidroxietilmidazolina 101 73 75

B2/B3: Fosfatidilcolina ácido glicirretínico 98 92 73

B2/B4: Fosfatidilcolina Ácido 2-hidroxiestérico 98 82 70

B2/B5: Fosfatidilcolina Climbazol 98 102 82

B2/B5: Fosfatidilcolina Miconazol 98 111 92

B2/B5: Fosfatidilcolina Ketoconazol 98 101 89

B2/B5: Fosfatidilcolina Laurilhidroxiimidazolina 98 106 82

B3/B4: Amsacrina Ácido 2-hidroxiestérico 102 82 75

B3/B4: Ácido mirístico Ácido 2-hidroxiestérico 110 82 78

B3/B5: Amsacrina Aminobenzotriazol 102 98 84

B3/B5: Amsacrina Dimetilimidazolina 102 112 94

B3/B5: Ácido mirístico Climbazol 110 102 82

B4/B5: Aceite de linaza Laurilhidroxietil imidazolina 98 73 57

B4/B5: Ácido 2hidroxiestérico Ketaconazol 92 109 77

B4/B5: Aceite de linaza Oleoil hidroxietilimidazolina 98 92 75

B4/B5: Ácido 2hidroxiestérico Cumarina 92 96 70

Sinergia de la inhibición de TGasa con combinaciones terciarias de refuerzos

Para investigar la inhibición sinérgica de la expresión de TGasa por combinaciones de 3 clases diferentes de refuerzos con retinol, se analizaron combinaciones seleccionadas de compuestos. Las concentraciones ensayadas 5 fueron de un orden log de magnitud menor que la concentración requerida para la inhibición mínima de actividad TGasa (es decir, CI20). Los compuestos se analizaron solos y en combinación, y el % de inhibición de la TGasa se da para cada compuesto y la combinación. Los siguientes ejemplos dan las combinaciones sinérgicas en todas las posibles combinaciones terciarias (B1 / B2 / B3; B1 / B2 / B4; B1 / B2 / B5; B1 / B3 / B4; B1 / B3 / B5; B1 / B4 / B5; B2 / B3 / B4; B2 / B3 / B5; B2 / B4 / B5; B3 / B4 / B5). El % de inhibición de la combinación es más que la inhibición

10 de cada compuesto se suman, lo que indica sinergia (es decir, la inhibición por la combinación es mayor que la inhibición por el compuesto 1 + 2 + compuesto 3). Todos los ejemplos de combinaciones terciarias de refuerzos indicados en la siguiente tabla sinérgicamente inhibieron TGasa en presencia de 10-7M retinol.

Sinergia de la inhibición de TGasa con combinaciones cuaternarias de refuerzos

Para investigar la inhibición sinérgica de la expresión de TGasa por combinaciones de 4 clases diferentes de refuerzos con retinol, se analizaron combinaciones seleccionadas de compuestos. Las concentraciones ensayadas fueron de un orden log de magnitud menor que la concentración requerida para la inhibición mínima de actividad

5 TGasa (es decir, CI20).

Los compuestos se analizaron solos y en combinación, y el % de inhibición de la TGasa se da para cada compuesto y la combinación. Los siguientes ejemplos dan las combinaciones sinérgicas en todas las combinaciones posibles cuaternario (B1 / B2 / B3 / B4; B1 / B2 / B3 / B5; B1 / B2 / B4 / B5; B1 / B3 / B4 / B5; B2 / B3 / B4 / B5;). Sinergia se confirmó si la diferencia en % de inhibición de la combinación (de 4 refuerzos) es más de 30 % de la de la inhibición

10 por 3 combinaciones de refuerzo (es decir, 4 % de inhibición de refuerzo combinado es igual o mayor que el % de inhibición de combo 3 de refuerzo + 30 %). Todas las combinaciones cuaternarias de refuerzos que se muestran en la tabla que figura a continuación mostraron sinergia.

Vehículo cosméticamente aceptable

La composición según la invención también comprende un vehículo cosméticamente aceptable que actúa como diluyente, dispersante o portador para los ingredientes activos de la composición, de tal forma que facilite su distribución cuando la composición se aplica a la piel.

Los vehículos aparte del o además del agua pueden incluir emolientes líquidos o sólidos, disolventes, humectantes, espesantes y polvos. Un vehículo no acuoso especialmente preferido es un polidimetilsiloxano y/o un polidimetilfenilsiloxano. Las siliconas de esta invención pueden ser aquellas tengan viscosidades comprendidas entre 10 y 10.000.000 mm2/s (centiestoquios) a 25ºC. Son especialmente deseables las mezclas de siliconas de baja y alta viscosidad. General Electric Company suministra estas siliconas con las marcas comerciales Vicasil, SE y SF y Dow Corning Company las suministra como las series 200 y 550. Las cantidades de silicona que se pueden utilizar en las composiciones de esta invención están comprendidas entre 5 % y 95 %, preferentemente entre 25 % y 90 % en peso de la composición.

Materiales beneficiosos para la piel y adjuntos cosméticos opcionales

Puede haber presente un aceite o un material aceitoso, junto con un emulsionante para proporcionar una emulsión de agua en aceite o una emulsión de aceite en agua, dependiendo en gran medida del equilibrio hidrófilo-lipófilo medio (EHL) del emulsionante empleado.

Varios tipos de ingredientes activos pueden estar presentes en las composiciones cosméticas de la presente invención. Varios tipos de ingredientes activos pueden estar presentes en las composiciones cosméticas de la presente invención. Activos se definen como la piel o los agentes beneficiosos para el cabello distintos de emolientes y distintos de ingredientes. que simplemente mejoran las características físicas de la composición. Aunque no se limita a esta categoría, los ejemplos generales incluyen protectores solares, agentes para aclarar la piel, y agentes de bronceado.

Los protectores solares incluyen aquellos materiales empleados habitualmente para bloquear la luz ultravioleta. Los compuestos ilustrativos son los derivados de PABA, cinamato y salicilato. Por ejemplo, metoxicinamato de octilo y benzofenona 2-hidroxi-4-metoxi (también conocida como oxibenzona) pueden ser utilizados. El metoxicinamato de octilo y benzofenona 2-hidroxi-4-metoxi están disponibles comercialmente bajo las marcas comerciales, Parsol MCX y benzofenona-3, respectivamente.

La cantidad exacta de protector solar empleada en las emulsiones puede variar dependiendo del grado de protección deseado de la radiación UV del sol.

Otro ingrediente opcional preferido se selecciona de ácidos grasos esenciales (EFA), es decir, aquellos ácidos grasos que son esenciales para la formación de la membrana plasmática de todas las células, en queratinocitos la deficiencia de EFA hace que las células hiperproliferativas. La suplementación de la EPT corrige esto. EPT 's también mejorar la biosíntesis de lípidos de la epidermis y proporcionan lípidos para la formación de la barrera de la epidermis. Los ácidos grasos esenciales se eligen preferentemente de ácido linoleico, ácido γ-linolénico, ácido homo-γ-linolénico, ácido columbínico, eicosa-(n-β, 9, 13) -trienoico, ácido araquidónico, ácido γ-linolénico, timnodónico ácido, ácido hexaenoico y mezclas de los mismos.

A menudo se incorporan emolientes en las composiciones cosméticas de la presente invención. Los niveles de tales emolientes pueden variar desde aproximadamente 0,5 % a aproximadamente 50 %, preferentemente entre aproximadamente 5 % y 30 % en peso de la composición total. Los emolientes pueden clasificarse en categorías químicas generales como ésteres, ácidos grasos y alcoholes, polioles e hidrocarburos.

Los ésteres pueden ser mono-o di-ésteres. Los ejemplos aceptables de diésteres grasos incluyen adipato de dibutilo, sebacato de dietilo, dimerato de diisopropilo, y succinato de dioctilo. Ésteres grasos de cadena ramificada aceptables incluyen miristato de 2-etil-hexilo, estearato de isopropilo y palmitato de isoestearilo. Ésteres de ácidos tribásicos aceptables incluyen trilinoleato de triisopropilo y citrato de trilaurilo. Ésteres grasos de cadena lineal aceptables incluyen palmitato de laurilo, lactato de miristilo, eurcato de oleílo y oleato de estearilo. Los ésteres preferidos incluyen coco-caprilato / caprato (una mezcla de coco-caprilato y coco-caprato), propileno glicol, acetato de éter de miristilo, adipato de diisopropilo y octanoato de cetilo.

Alcoholes y ácidos grasos adecuados incluyen aquellos compuestos que tienen de 10 a 20 átomos de carbono. Especialmente preferidos son los compuestos tales como los de cetilo, miristilo, palmítico y estearilo alcoholes y ácidos.

Entre los polioles que pueden servir como emolientes son compuestos alquil polihidroxílicos de cadena lineal y ramificada. Por ejemplo, se prefieren propilenglicol, sorbitol y glicerina. También pueden ser útiles los polioles poliméricos tales como polipropilenglicol y polietilenglicol. Butileno y propilenglicol son también especialmente preferidos como mejoradores de la penetración.

Hidrocarburos ejemplares que pueden servir como emolientes son aquellos que tienen cadenas hidrocarbonadas de 12 a 30 átomos de carbono. Los ejemplos específicos incluyen aceite mineral, vaselina, escualeno e isoparafinas.

Otra categoría de ingredientes funcionales dentro de las composiciones cosméticas de la presente invención son los espesantes. Un espesante estará presente habitualmente en cantidades en cualquier lugar de 0,1 a 20 % en peso, preferentemente de aproximadamente 0,5 % a 10 % en peso de la composición. Ejemplos de espesantes son materiales de poliacrilato reticulados disponibles bajo la marca comercial Carbopol de la BF Goodrich Company. Se pueden emplear gomas tales como xantano, carragenina, gelatina, karaya, pectina y goma de algarrofín. Bajo ciertas circunstancias, la función espesante puede conseguirse mediante un material que también sirva como silicona o emoliente. Por ejemplo, las gomas de silicona de más de 10 centistoquios y los ésteres tales como estearato de glicerol tienen funcionalidad dual.

Los polvos se pueden incorporar en la composición cosmética de la invención. Estos polvos incluyen creta, talco, tierra de Fullers, caolín, almidón, arcillas de esmectita, silicato de aluminio modificado químicamente de magnesio, arcilla de montmorillonita orgánicamente modificada, silicato de aluminio hidratado, sílice de pirólisis, succinato de octenilo de almidón de aluminio y mezclas de los mismos.

Otros componentes minoritarios coadyuvantes también se pueden incorporar en las composiciones cosméticas. Estos ingredientes pueden incluir agentes colorantes, opacificantes y perfumes. Las cantidades de estos materiales pueden variar desde 0,001 % hasta 20 % en peso de la composición.

Uso de la composición

La composición según la invención está concebida principalmente como un producto para aplicación tópica a la piel humana, especialmente como un agente para acondicionar y suavizar la piel, y prevenir o reducir la aparición de piel arrugada o envejecida.

En uso, una pequeña cantidad de la composición, por ejemplo de 1 a 5 ml, se aplica a las áreas expuestas de la piel, desde un recipiente o aplicador adecuado y, si es necesario, después se extiende y / o se frota en la piel usando la mano o los dedos o un dispositivo adecuado.

Forma del producto y envasado

La composición de tratamiento tópico de la piel de la invención se puede formular como una loción, una crema fluida, una crema o un gel. La composición se puede envasar en un recipiente adecuado para adaptarse a su viscosidad y al uso pretendido por el consumidor. Por ejemplo, una loción o crema fluida se puede envasar en una botella o un aplicador de bola, o una cápsula, o un dispositivo de aerosol impulsado por un propelente o un recipiente equipado con una bomba adecuada para accionar con el dedo. Cuando la composición es una crema, se puede almacenar simplemente en una botella o recipiente para apretar no deformable, tal como un tubo o un tarro con tapa.

En consecuencia, la invención también proporciona un recipiente cerrado que contiene una composición cosméticamente aceptable como se define en el presente documento.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición para el cuidado de la piel, que comprende:

a.

de 0,001 % a 10 % en peso de la composición de un retinoide;

b.

una combinación de al menos 4 refuerzos retinoides pertenecientes a las clases de inhibidores de LRAT / ARAT (B1), agonistas de la retinol deshidrogenasa (B2), inhibidores de la retinal reductasa (B3), agonistas de CRABP-2 (B4) e inhibidores de la oxidación de ácidos retinoicos del citocromo (B5) en una cantidad de 0,0001 % a 50 % en peso de la composición, en la que las proporciones de cada uno de los refuerzos entre sí está en el intervalo de 1: 1000 a 1000: 1;

c.

un vehículo farmacéuticamente aceptable.

en la que el inhibidor de LRAT / ARAT (B1) es seleccionado entre el grupo que consiste en crocetina, esfingosina acetilo, cocamidopropil betaína, coco hidroxietil-imidazolina, cocoamida-mea, glicerol-pca-oleato, hexanoamida, esfingosina hexanoílo, lauroil sarcosina, lidocaína, linoleamidedea, linoleamida-mea, dimetilamina linoleamidopropil, melinamida, miristoilsarcosina, oleil betaína, palmitamida-mea, estearilhidroxiamida, naringenina, alilo alfa-ionona, alfa-damascona, alfa-ionona, alfa-metil ionona, alfa-terpineol, beta-damascona, brahmanol, damascenona, deltadamascona, dihidro alfa-ionona, safranato etílico, alcohol fenquilo, gamma-metil ionona, isobutil ionona, isociclogeraniol, isodamascona liral, santalona, santanol, timberol, tonalid, traseolida, cloruro de trimetilamonio de coco, ácido ursólico, citral, citronelol, farnesol, geraniol, geranil geraniol, linalol, nonadieneal, pseudoionona, dioctilfosfatidil etanolamina, dimetil imidazolidinona e imidazolidinil urea;

en la que el agonista de retinol deshidrogenasa (B2) es seleccionado entre el grupo que consiste en fosfatidilcolina y esfingomielina;

en el que el inhibidor de la reductasa retinaldehído (B3) es seleccionado del grupo que consiste en la vainillina, ácido araquídico, ácido araquidónico, ácido linoleico, ácido linolénico, ácido mirístico, amsacrina, carbenoxolona, ácido glicirretínico y fosfatidiletanolamina;

en el que el antagonista de CRABP-2 (B4) es seleccionado entre el grupo que consiste en ácido elaídico, ácido hexadecanodioico, ácido 12-hidroxiesteárico, ácido isoesteárico y aceite de linaza;

y en el que el inhibidor de la oxidación de ácidos retinoicos (B5) es seleccionado del grupo que consiste en bifonazol, climbazol, clotrimazol, econazol, ketoconazol, miconazol, lauril hidroxietilimidazolina, oleil hidroxietilimidazolina, quercetina, cumarina y metirapona.
2.

La composición para el cuidado de la piel de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la combinación de los refuerzos comprende las 5 clases de refuerzos pertenecientes a las clases B1 a B5.
3.

Un procedimiento cosmético de acondicionamiento de la piel, comprendiendo el procedimiento aplicar por vía tópica a la piel el producto de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
4.

Un procedimiento cosmético de reproducir el efecto sobre la piel del ácido retinoico, comprendiendo el procedimiento aplicar a la piel el producto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2.