ES2525045T3 - Agrupación de genes de saxitoxina de cianobacterias y detección de organismos cianotóxicos - Google Patents

Agrupación de genes de saxitoxina de cianobacterias y detección de organismos cianotóxicos Download PDF

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Abstract

Un método para detectar un organismo cianotóxico que comprende las etapas de obtener una muestra para usarse en el método y analizar la muestra para la presencia de una agrupación de genes SXT presente sólo en organismos productores de saxitoxina, en el que dicho análisis comprende detectar: (i) un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, y SEQ ID NO: 36; (ii) un polinucleótido variante que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con un polinucleótido de (i); (iii) un ácido ribonucleico o ADN complementario codificado por una secuencia según (i); (iv) un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, y SEQ ID NO: 37; o, (v) un polipéptido variante que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con un polipéptido de (iv), y en el que dicha presencia es indicativa de organismos cianotóxicos en la muestra.

Description

Agrupación de genes de saxitoxina de cianobacterias y detección de organismos cianotóxicos
Campo Técnico
La presente invención se refiere a métodos para la detección de cianobacterias, dinoflagelados, y en particular, a métodos para la detección de organismos cianotóxicos. Se proporcionan kits para la detección de cianobacterias, dinoflagelados, y organismos cianotóxicos. La invención se refiere además a métodos para cribar para compuestos que modulan la actividad de polinucleótidos y/o polipéptidos de las rutas biosintéticas de la saxitoxina y cilindrospermopsina.
Antecedentes
Las cianobacterias, también conocidas como algas verdeazuladas, son bacterias fotosintéticas distribuidas ampliamente en entornos marinos y de agua dulce. Las cianobacterias que producen compuestos tóxicos son particularmente significativas para la calidad del agua y la salud humana y animal. En condiciones eutróficas, las cianobacterias tienden a formar grandes floraciones que promueven drásticamente concentraciones elevadas de toxinas. Las floraciones de cianobacterias pueden crecer mucho y expandirse en aguas costeras, arroyos, lagos y agua potable y reservorios recreacionales. Las toxinas que producen pueden plantear un riesgo de salud grave para los seres humanos y animales y este problema es relevante internacionalmente ya que las cianobacterias más tóxicas tienen una distribución global.
Es muy conocido un diverso rango de géneros de cianobacterias por la formación de floraciones de algas verdeazuladas tóxicas en superficies acuáticas. La saxitoxina (SXT) y sus análogos causan el síndrome de intoxicación paralizante por moluscos (PSP), que aflige a la salud humana e impacta en las economías costeras de moluscos en todo el mundo. Las toxinas PSP son alcaloides únicos, que son producidas tanto por procariotas como eucariotas. Las toxinas PSP están entre las toxinas de algas más potentes y ubicuas y se consideran un riesgo toxicológico grave para la salud que puede afectar a los seres humanos, animales y ecosistemas en todo el mundo. Estas toxinas bloquean los canales de sodio y calcio regulados por voltaje y prolongan la apertura de los canales de potasio evitando la transducción de señales neuronales. Se ha estimado que cada año se producen globalmente más de 2.000 casos humanos de PSP. Además, las floraciones costeras de microorganismos productores resulta en millones de dólares de daño económico debidos a la contaminación por la toxina PSP de marisco y el requerimiento continuo de programas cotosos de monitorización de biotoxinas. Los sistemas de alerta temprana para anticipar las floraciones de algas productoras de la toxina paralizante de moluscos (PST), tales como PCR y cribado basado en ELISA, todavía no están disponibles debido a la ausencia de datos sobre la base genética de la producción de PST.
SXT es un alcaloide de perhidropurina tricíclica que puede estar sustituida en varias posiciones dando lugar a más de 30 análogos de SXT naturales. Aunque la biosíntesis de SXT parece compleja y única, los organismos de dos reinos, incluyendo determinadas especies de dinoflagelados marinos y cianobacterias de agua dulce, son capaces de producir estas toxinas, aparentemente por la misma ruta biosintética. A pesar de esfuerzos considerables, no se ha identificado previamente ninguna de las enzimas o genes implicados en la biosíntesis y modificación de SXT.
La aparición del género de cianobacterias Cylindrospermopsis se ha documentado en todos los continentes y por lo tanto plantea una amenaza significativa para la salud pública a escala global. La toxina principal producida por Cylindrospermopsis es cilindrospermopsina (CYR). Además de plantear una amenaza para la salud humana, la cilindrospermopsina también causa pérdidas económicas significativas para granjeros debido a la intoxicación del ganado con agua potable contaminada por cilindrospermopsina. La cilindrospermopsina tiene efectos hepatotóxicos, citotóxicos y neurotóxicos generales y es un carcinógeno potencial. Su toxicidad se debe a la inhibición de la síntesis de glutatión y proteínas así como a la inhibición del citocromo P450. Hasta ahora se han identificado seis especies de cianobacterias que producen cilindrospermopsina; Cylindrospermopsis raciborskii, Aphanizomenon ovalisporum, Aphanizomerzon flos-aquae, Umezakia natans, Rhaphdiopsis curvata y Anabaena bergii. Los incidentes de intoxicación humana con cilindrospermopsina sólo se han reportado en Australia subtropical hasta la fecha, sin embargo C. raciborskiiand A. flos-aquae se han detectado recientemente en áreas con climas más templados. La tendencia de C. raciborskii para formar floraciones densas y la capacidad de invasión de los organismos productores da lugar a preocupaciones globales respecto a la calidad del agua potable y necesita la monitorización de las reservas de agua potable para detectar la presencia de productores de cilindrospermopsina.
Existe una necesidad de métodos rápidos y exactos que detecten cianobacterias, y en particular aquellas cepas que son capaces de producir cianotoxinas tales como saxitoxina y cilindrospermopsina. Se necesitan métodos rápidos y exactos para detectar organismos cianotóxicos para evaluar el peligro potencial para la salud de floraciones de cianobacterias y para la implementación de estrategias de gestión del agua eficaces para minimizar los efectos de brotes de floraciones tóxicas.
Resumen
En un primer aspecto, se proporciona un polinucléotido aislado que comprende una secuencia según SEQ ID NO: 1
o una variante que comparte al menos 80% de identidad con SEQ ID NO: 1 o fragmento de ésta, en la que el
fragmento comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68.
En un segundo aspecto, se proporciona un ácido ribonucleico aislado o un ADN complementario aislado codificado por una secuencia según el primer aspecto.
En un tercer aspecto, se proporciona un polipéptido aislado de la ruta biosintética de la saxitoxina codificado por el fragmento del primer aspecto y que comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 80% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 69.
En una realización, se proporciona una sonda o cebador que hibrida específicamente con uno o más de: un polinucleótido según el primer aspecto, un ácido ribonucleico o ADN complementario según el segundo aspecto, o un polipéptido según el tercer aspecto.
Se describe un vector que comprende un polinucleótido según el primer aspecto, o un ácido ribonucleico o ADN complementario según el segundo aspecto. El vector puede ser un vector de expresión.
Se describe una célula huésped que comprende el vector.
En otra realización, se proporciona un anticuerpo aislado capaz de unirse específicamente a un polipéptido según el tercer aspecto.
En un cuarto aspecto, se proporciona un método para detectar un organismo cianotóxico que comprende las etapas de obtener una muestra para usarse en el método y analizar la muestra para la presencia de una agrupación de genes SXT presente sólo en organismos productores de saxitoxina, en el que dicho análisis comprende detectar:
(i)
un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, y SEQ ID NO: 36;
(ii)
un polinucleótido variante que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con un polinucleótido de (i);
(iii) un ácido ribonucleico o ADN complementario codificado por una secuencia según (i);
(iv)
un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, y SEQ ID NO: 37; o,
(v)
un polipéptido variante que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con un polipéptido de (iv),
y en el que dicha presencia es indicativa de organismos cianotóxicos en la muestra.
En una realización del cuarto aspecto, el organismo cianotóxico es una cianobacteria o un dinoflagelado.
En una realización del cuarto aspecto, el análisis de la muestra comprende la amplificación del ADN de la muestra por la reacción en cadena de la polimerasa y la detección de las secuencias amplificadas. La reacción en cadena de la polimerasa puede utilizar uno o más cebadores que comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias de polinucleótido.
En otra realización del cuarto aspecto, el método comprende analizar adicionalmente la muestra para la presencia de una o más de:
(i) un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias de polinucleótido,
(ii) un ácido ribonucleico o ADN complementario codificado por una secuencia según (i),
(iii) un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, y SEQ ID NO: 110 y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias de polipéptido.
El análisis adicional de la muestra puede comprender la amplificación del ADN de la muestra por la reacción en cadena de la polimerasa. La reacción en cadena de la polimerasa puede utilizar uno o más cebadores que comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, o variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias de polinucleótido.
Se describe un método para la detección de dinoflagelados, comprendiendo el método las etapas de obtener una muestra para usarse en el método y analizar la muestra para la presencia de uno o más de:
(i)
un polinucleótido que comprende una secuencia según el primer aspecto,
(ii)
un ácido ribonucleico o ADN complementario según el segundo aspecto,
(iii) un polipéptido que comprende una secuencia según el tercer aspecto,
en el que dicha presencia es indicativa de dinoflagelados en la muestra.
El análisis de la muestra puede comprender la amplificación del ADN de la muestra por la reacción en cadena de la polimerasa y la detección de las secuencias amplificadas.
En una realización del cuarto aspecto, la detección comprende una o ambas de electroforesis en gel y secuenciación de ácido nucleico. La muestra puede comprender uno o más organismos aislados o cultivados. La muestra puede ser una muestra medioambiental. La muestra medioambiental puede obtenerse de agua salada, agua dulce o una floración de algas verdeazuladas.
En un quinto aspecto, se proporciona un kit para la detección de organismos cianotóxicos, comprendiendo el kit al menos un agente para detectar la presencia de una agrupación de genes SXT presente sólo en organismos productores de saxitoxina, en el que bien:
(i)
dicho agente puede detectar un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 36, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias de polinucleótido y dicho agente es un cebador o una sonda;
(ii)
dicho agente puede detectar un ácido ribonucleico o ADN complementario codificado por una secuencia según (i) y dicho agente es un cebador o una sonda; o
(iii) dicho agente puede detectar un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 37, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias de polipéptido, y dicho agente es un anticuerpo capaz de unirse específicamente al polipéptido.
El cebador o sonda puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134 y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias de polipéptido.
En otra realización del quinto aspecto, el kit comprende además al menos un agente adicional para detectar la presencia de uno o más de:
(i)
un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias de polinucleótido,
(ii)
un ácido ribonucleico o ADN complementario codificado por una secuencia según (i),
(iii) un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, y SEQ ID NO: 110, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias de polipéptido.
El al menos un agente adicional puede ser un cebador, anticuerpo o sonda. El cebador o sonda puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias de polipéptido.
Se describe un kit para la detección de dinoflagelados, comprendiendo el kit al menos un agente para detectar la presencia de uno o más de:
(i)
un polinucleótido que comprende una secuencia según el primer aspecto,
(ii)
un ácido ribonucleico o ADN complementario según el segundo aspecto,
(iii) un polipéptido que comprende una secuencia según el tercer aspecto,
en el que dicha presencia es indicativa de dinoflagelados en la muestra.
Se describe además un método para cribar para un compuesto que modula la expresión o actividad de uno o más polipéptidos según el tercer aspecto, comprendiendo el método poner en contacto el polipéptido con un compuesto candidato en condiciones adecuadas para permitir la interacción del compuesto candidato y el polipéptido, y ensayar para actividad del polipéptido.
La modulación de la expresión o actividad de uno o más polipéptidos puede comprender inhibir la expresión o actividad de dicho polipéptido.
La modulación de la expresión o actividad de uno o más polipéptidos puede comprender aumentar la expresión o actividad de dicho polipéptido.
Definiciones
Tal y como se usa en esta solicitud, la forma singular "un", "una" y "el" incluyen las referencias plurales a no ser que el contexto dicte claramente otra cosa. Por ejemplo, el término "una célula madre" también incluye una pluralidad de células madre.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "que comprende" significa "que incluye." Las variaciones de la palabra "que comprende", tales como "comprenden" y "comprende," tienen correspondientemente significados variados. Así, por ejemplo, un polinucleótido "que comprende" una secuencia que codifica una proteína puede consistir exclusivamente en esa secuencia o puede incluir una o más secuencias adicionales.
Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "anticuerpo" y "anticuerpos" incluyen IgG (incluyendo IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4), IgA (incluyendo IgA1 e IgA2), IgD, IgE, o IgM, e IgY, anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos completos de cadena única, y fragmentos de unión a antígeno de éstos. Los fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno incluyen, pero no están limitados a, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fvs de cadena única (scFv), anticuerpos de cadena única, Fvs unidos por disulfuro (sdFv) y fragmentos que comprenden bien un dominio VL o VH. Los anticuerpos pueden ser de cualquier origen animal. Los fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno, incluyendo anticuerpos de cadena única, pueden comprender la o las regiones variables solas o en combinación con el total o parcial de lo siguiente: región bisagra, dominios CH1, CH2, y CH3. También se incluyen cualesquiera combinaciones de región o regiones variables y región bisagra, dominios CH1, CH2, y CH3. Los anticuerpos pueden ser monoclonales, policlonales, quiméricos, multiespecíficos, humanizados y anticuerpos humanos monoclonales y policlonales que se unen específicamente a la molécula biológica.
Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente y se considera que tienen el mismo significado.
Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "secuencia de nucleótidos" y "secuencia de polinucleótidos" se usan indistintamente y se considera que tienen el mismo significado.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "kit" se refiere a cualquier sistema de administración para administrar materiales. En el contexto de los ensayos de detección descritos en la presente memoria, dichos sistemas de administración incluyen sistemas que permiten el almacenamiento, transporte, o administración de reactivos de reacción (por ejemplo, etiquetas, muestras de referencia, material de soporte, etc. en los contenedores apropiados) y/o materiales de soporte (por ejemplo, tampones, instrucciones escritas para realizar el ensayo etc.) de una localización a otra. Por ejemplo, los kits incluyen uno o más cubículos, tales como cajas, que contienen los reactivos de reacción y/o materiales de soporte relevantes.
Cualquier discusión de documentos, actos, materiales, dispositivos, artículos o semejantes que se ha incluido en la presente especificación es solamente para el propósito de proporcionar un contexto para la presente invención. No debe considerarse como una admisión de que ninguna o todas estas materias forman parte de la base de la técnica anterior o formaban parte del conocimiento general común en el campo relevante a la presente invención antes de la fecha de prioridad de esta solicitud.
Descripción breve de los dibujos
Se describirá ahora una realización preferida de la presente invención, sólo como ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos en los que:
La Figura 1A es una tabla que muestra la distribución de los genes sxt en cianobacterias tóxicas y no tóxicas. PSP, saxitoxina; CYLN, cilindrospermopsina; +, fragmento génico amplificado; - no se detectó ningún gen.
La Figura 1B es una tabla que muestra secuencias de cebador usadas para amplificar varios genes SXT.
La Figura 2 es una tabla que muestra los genes sxt de la agrupación de genes de la saxitoxina de C. raciborskii T3, su longitud posible, su concordancia de similitud por BLAST con secuencias de proteínas similares de otros organismos, y su función predicha.
La Figura 3 es un diagrama que muestra la organización estructural de la agrupación de genes sxt de C. raciborskii T3. Las abreviaturas usadas son: IS4, secuencia de inserción 4; at, aminotransferasa; dmt, transportador de metabolito de fármaco; ompR, regulador transcripcional de la familia ompR; penP, unión a penicilina; smf, gen que se predice que está implicado en la captación de ADN. La escala indica la longitud de la agrupación de genes en pares de bases.
La Figura 4 es un diagrama de flujo que muestra la ruta para la biosíntesis de SXT y las funciones posibles de los genes sxt.
La Figura 5 muestra los espectros MS/MS de iones seleccionados de extractos celulares de Cylindrospermopsis raciborskii T3. Se indica la fragmentación predicha de iones y los valores m/z correspondientes. Figura 5A, arginina (m/z 175); Figura 5B, saxitoxina (m/z 300); Figura 5C, intermedio A' (m/z 187); Figura 5D, intermedio C' (m/z 211); Figura 5E, intermedio E' (m/z 225).
La Figura 6 es una tabla que muestra los genes cyr de la agrupación de genes de la cilindrospermopsina de C. raciborskii AWT205, su longitud posible, su concordancia de similitud por BLAST con secuencias de proteínas similares de otros organismos, y su función predicha.
La Figura 7 es una tabla que muestra la distribución del gen sulfotransferasa (cyrJ) en cianobacterias tóxicas y no tóxicas. La amplificación del gen de ARNt 16S se muestra como un control positivo. CYLN, cilindrospermopsina; SXT, saxitoxina; N.D., no detectado; +, fragmento génico amplificado; -, no se detectó ningún gen. NA, no disponible; AWQC, Australian Water Quality Center.
La Figura 8 es un diagrama de flujo que muestra la ruta biosintética de la biosíntesis de cilindrospermopsina.
La Figura 9 es un diagrama que muestra la organización estructural de la agrupación de genes de cilindrospermopsina de C. raciborskii AWT205. La escala indica la longitud de la agrupación de genes en pares de bases.
Descripción
Los inventores han identificado una agrupación de genes responsable de la biosíntesis de saxitoxina (la agrupación de genes SXT) y una agrupación de genes responsable de la biosíntesis de cilindrospermopsina (la agrupación de genes CYR). Se ha determinado la secuencia completa de cada agrupación de genes y se han identificado en ellas las actividades funcionales asignadas a cada uno de los genes. Tomando como base esta información, los inventores han elucidado las rutas biosintéticas completas de la saxitoxina y cilindrospermopsina.
De acuerdo con esto, la invención proporciona secuencias de polinucleótido y polipéptido derivadas de cada una de las agrupaciones de genes SXT y CYR y en particular, las secuencias relacionadas con los genes específicos en cada ruta. Se proporcionan métodos y kits para la detección de cepas de cianobacterias en una muestra tomando como base la presencia (o ausencia) en la muestra de una o más de las secuencias de la invención. Los inventores han determinado que determinados marcos de lectura abierta presentes en la agrupación de genes SXT de microorganismos productores de saxitoxina están ausentes en la agrupación de genes SXT de microorganismos que no producen saxitoxina. De manera similar, se ha descubierto que un marco de lectura abierto presente en la agrupación de genes CYR de microorganismos productores de cilindrospermopsina está ausente en microorganismos que no son productores de cilindrospermopsina. De acuerdo con esto, la invención proporciona métodos y kits para la detección de microorganismos productores de toxina.
También se proporcionan por la invención métodos de cribado para la identificación de compuestos capaces de modular la expresión o actividad de proteínas en las rutas biosintéticas de la saxitoxina y/o cilindrospermopsina.
Polinucleótidos y polipéptidos
Los inventores han determinado la secuencia de polinucleótido completa de la agrupación de genes de la saxitoxina (SXT) y la agrupación de genes de la cilindrospermopsina (CYR).
Según aspectos y realizaciones de la invención, la agrupación de genes SXT puede tener, pero no está limitado a, la secuencia de polinucleótido como se muestra en SEQ ID NO: 1 (número de registro GenBank DQ787200), o presentar una identidad de secuencia suficiente con ésta para hibridar con la secuencia de SEQ ID NO: 1.
La agrupación de genes SXT comprende 31 genes y 30 regiones intergénicas.
El Gen 1 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 759 pares de bases (pb) mostrada en SEQ ID NO: 4. La secuencia de nucleótidos del Gen 1 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 1625 hasta el nucleótido en la posición 2383 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 1 (SXTD) se muestra en SEQ ID NO: 5.
El Gen 2 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 396 pb mostrada en SEQ ID NO: 6. La secuencia de nucleótidos del Gen 2 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 2621 hasta el nucleótido en la posición 3016 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 2 (ORF3) se muestra en SEQ ID NO: 7.
El Gen 3 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 360 pb mostrada en SEQ ID NO: 8. La secuencia de nucleótidos del Gen 3 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 2955 hasta el nucleótido en la posición 3314 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 3 (ORF4) se muestra en SEQ ID NO: 9.
El Gen 4 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 354 pb mostrada en SEQ ID NO: 10. La secuencia de nucleótidos del Gen 4 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 3647 hasta el nucleótido en la posición 4000 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 4 (SXTC) se muestra en SEQ ID NO: 11.
El Gen 5 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 957 pb mostrada en SEQ ID NO: 12. La secuencia de nucleótidos del Gen 5 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 4030 hasta el nucleótido en la posición 4986 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 5 (SXTB) se muestra en SEQ ID NO: 13.
El Gen 6 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 3738 pb mostrada en SEQ ID NO: 14. La secuencia de nucleótidos del Gen 6 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 5047 hasta el nucleótido en la posición 8784 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 6 (SXTA) se muestra en SEQ ID NO: 15.
El Gen 7 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 387 pb mostrada en SEQ ID NO: 16. La secuencia de nucleótidos del Gen 7 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 9140 hasta el nucleótido en la posición 9526 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 7 (SXTE) se muestra en SEQ ID NO: 17.
El Gen 8 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 1416 pb mostrada en SEQ ID NO: 18. La secuencia de nucleótidos del Gen 8 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 9686 hasta el nucleótido en la posición 11101 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 8 (SXTF) se muestra en SEQ ID NO: 19.
El Gen 9 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 1134 pb mostrada en SEQ ID NO: 20. La secuencia de nucleótidos del Gen 9 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 11112 hasta el nucleótido en la posición 12245 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 9 de SXT (SXTG) se muestra en SEQ ID NO: 21.
El Gen 10 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 1005 pb mostrada en SEQ ID NO:
22. La secuencia de nucleótidos del Gen 10 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 12314 hasta el nucleótido en la posición 13318 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 10 (SXTH) se muestra en SEQ ID NO: 23.
El Gen 11 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 1839 pb mostrada en SEQ ID NO:
24. La secuencia de nucleótidos del Gen 11 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 13476 hasta el nucleótido en la posición 15314 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 11 (SXTI) se muestra en SEQ ID NO: 25.
El Gen 12 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 444 pb mostrada en SEQ ID NO: 26. La secuencia de nucleótidos del Gen 12 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 15318 hasta el nucleótido en la posición 15761 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 12 (SXTJ) se muestra en SEQ ID NO: 27.
El Gen 13 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 165 pb mostrada en SEQ ID NO: 28. La secuencia de nucleótidos del Gen 13 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 15761 hasta el nucleótido en la posición 15925 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 13 (SXTK) se muestra en SEQ ID NO: 29.
El Gen 14 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 1299 pb mostrada en SEQ ID NO:
30. La secuencia de nucleótidos del Gen 14 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 15937 hasta el nucleótido en la posición 17235 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 14 (SXTL) se muestra en SEQ ID NO: 31.
El Gen 15 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 1449 pb mostrada en SEQ ID NO:
32. La secuencia de nucleótidos del Gen 15 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 17323 hasta el nucleótido en la posición 18771 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 16 (SXTM) se muestra en SEQ ID NO: 33.
El Gen 16 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 831 pb mostrada en SEQ ID NO: 34. La secuencia de nucleótidos del Gen 16 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 19119 hasta el nucleótido en la posición 19949 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 16 (SXTN) se muestra en SEQ ID NO: 35.
El Gen 17 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 774 pb mostrada en SEQ ID NO: 36. La secuencia de nucleótidos del Gen 17 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 20238 hasta el nucleótido en la posición 21011 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 17 (SXTX) se muestra en SEQ ID NO: 37.
El Gen 18 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 327 pb mostrada en SEQ ID NO: 38. La secuencia de nucleótidos del Gen 18 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 21175 hasta el nucleótido en la posición 21501 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 18 (SXTW) se muestra en SEQ ID NO: 39.
El Gen 19 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 1653 pb mostrada en SEQ ID NO:
40. La secuencia de nucleótidos del Gen 219 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 21542 hasta el nucleótido en la posición 23194 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 19 (SXTV) se muestra en SEQ ID NO: 41.
El Gen 20 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 750 pb mostrada en SEQ ID NO: 42. La secuencia de nucleótidos del Gen 20 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 23199 hasta el nucleótido en la posición 23948 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 20 (SXTU) se muestra en SEQ ID NO: 43.
El Gen 21 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 1005 pb mostrada en SEQ ID NO:
44. La secuencia de nucleótidos del Gen 21 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 24091 hasta el nucleótido en la posición 25095 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 21 (SXTT) se muestra en SEQ ID NO: 45.
El Gen 22 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 726 pb mostrada en SEQ ID NO: 46. La secuencia de nucleótidos del Gen 22 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 25173 hasta el nucleótido en la posición 25898 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 22 (SXTS) se muestra en SEQ ID NO: 47.
El Gen 23 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 576 pb mostrada en SEQ ID NO: 48. La secuencia de nucleótidos del Gen 23 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 25974 hasta el nucleótido en la posición 26549 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 23 (ORF24) se muestra en SEQ ID NO: 49.
El Gen 24 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 777 pb mostrada en SEQ ID NO: 50. La secuencia de nucleótidos del Gen 24 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 26605 hasta el nucleótido en la posición 27381 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 24 (SXTR) se muestra en SEQ ID NO: 51.
El Gen 25 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 777 pb mostrada en SEQ ID NO: 52. La secuencia de nucleótidos del Gen 25 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 27392 hasta el nucleótido
en la posición 28168 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 25 (SXTQ) se muestra en SEQ ID NO: 53.
El Gen 26 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 1227 pb mostrada en SEQ ID NO:
54. La secuencia de nucleótidos del Gen 26 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 28281 hasta el nucleótido en la posición 29507 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 26 (SXTP) se muestra en SEQ ID NO: 55.
El Gen 27 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 603 pb mostrada en SEQ ID NO: 56. La secuencia de nucleótidos del Gen 27 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 29667 hasta el nucleótido en la posición 30269 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 27 (SXTO) se muestra en SEQ ID NO: 57.
El Gen 28 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 1350 pb mostrada en SEQ ID NO:
58. La secuencia de nucleótidos del Gen 28 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 30612 hasta el nucleótido en la posición 31961 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 28 (ORF29) se muestra en SEQ ID NO: 59.
El Gen 29 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 666 pb mostrada en SEQ ID NO: 60. La secuencia de nucleótidos del Gen 29 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 32612 hasta el nucleótido en la posición 33277 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 29 (SXTY) se muestra en SEQ ID NO: 61.
El Gen 30 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 1353 pb mostrada en SEQ ID NO:
62. La secuencia de nucleótidos del Gen 30 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 33325 hasta el nucleótido en la posición 34677 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 30 (SXTZ) se muestra en SEQ ID NO: 63.
El Gen 31 de la agrupación de genes SXT es una secuencia de nucleótidos de 819 pb mostrada en SEQ ID NO: 64. La secuencia de nucleótidos del Gen 31 de SXT abarca desde el nucleótido en la posición 35029 hasta el nucleótido en la posición 35847 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 31 (OMPR) se muestra en SEQ ID NO: 65.
La región del extremo 5' de la agrupación de genes SXT comprende un gen de 1320 pb (orf1), cuya secuencia se muestra en SEQ ID NO: 2. La secuencia de nucleótidos de orf1 abarca desde el nucleótido en la posición 1 hasta el nucleótido en la posición 1320 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por orf1 se muestra en SEQ ID NO: 3.
La región del extremo 3' de la agrupación de genes SXT comprende un gen de 774 pb (hisA), cuya secuencia se muestra en SEQ ID NO: 66. La secuencia de nucleótidos de hisA abarca desde el nucleótido en la posición 35972 hasta el nucleótido en la posición 36745 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por hisA se muestra en SEQ ID NO: 67.
La región del extremo 3' de la agrupación de genes SXT también comprende un gen de 396 pb (orfA), cuya secuencia se muestra en SEQ ID NO: 68. La secuencia de nucleótidos de orfA abarca desde el nucleótido en la posición 37060 hasta el nucleótido en la posición 37455 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido codificada por orfA se muestra en SEQ ID NO: 69.
Según otros aspectos y realizaciones de la invención, la agrupación de genes CYR puede tener, pero no está limitado a, la secuencia de nucleótidos como se muestra en SEQ ID NO: 80 (número de registro GenBank EU140798), o presentar una identidad de secuencia suficiente con ésta para hibridar con la secuencia de SEQ ID NO: 80.
La agrupación de genes CYR comprende 15 genes y 14 regiones intergénicas.
El Gen 1 de la agrupación de genes CYR es una secuencia de nucleótidos de 5631 pb mostrada en SEQ ID NO: 81. La secuencia de nucleótidos del Gen 1 de CYR abarca desde el nucleótido en la posición 444 hasta el nucleótido en la posición 6074 de SEQ ID NO: 80. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 1 (CYRD) se muestra en SEQ ID NO: 82.
El Gen 2 de la agrupación de genes CYR es una secuencia de nucleótidos de 4074 pb mostrada en SEQ ID NO: 83. La secuencia de nucleótidos del Gen 2 de CYR abarca desde el nucleótido en la posición 6130 hasta el nucleótido en la posición 10203 de SEQ ID NO: 80. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 2 (CYRF) se muestra en SEQ ID NO: 84.
El Gen 3 de la agrupación de genes CYR es una secuencia de nucleótidos de 1437 pb mostrada en SEQ ID NO: 85. La secuencia de nucleótidos del Gen 3 de CYR abarca desde el nucleótido en la posición 10251 hasta el nucleótido
en la posición 11687 de SEQ ID NO: 80. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 3 (CYRG) se muestra en SEQ ID NO: 86.
El Gen 4 de la agrupación de genes CYR es una secuencia de nucleótidos de 831 pb mostrada en SEQ ID NO: 87. La secuencia de nucleótidos del Gen 4 de CYR abarca desde el nucleótido en la posición 11741 hasta el nucleótido en la posición 12571 de SEQ ID NO: 80. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 4 (CYRI) se muestra en SEQ ID NO: 88.
El Gen 5 de la agrupación de genes CYR es una secuencia de nucleótidos de 1398 pb mostrada en SEQ ID NO: 89. La secuencia de nucleótidos del Gen 5 de CYR abarca desde el nucleótido en la posición 12568 hasta el nucleótido en la posición 13965 de SEQ ID NO: 80. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 5 (CYRK) se muestra en SEQ ID NO: 90.
El Gen 6 de la agrupación de genes CYR es una secuencia de nucleótidos de 750 pb mostrada en SEQ ID NO: 91. La secuencia de nucleótidos del Gen 6 de CYR abarca desde el nucleótido en la posición 14037 hasta el nucleótido en la posición 14786 de SEQ ID NO: 80. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 6 (CYRL) se muestra en SEQ ID NO: 92.
El Gen 7 de la agrupación de genes CYR es una secuencia de nucleótidos de 1431 pb mostrada en SEQ ID NO: 93. La secuencia de nucleótidos del Gen 7 de CYR abarca desde el nucleótido en la posición 14886 hasta el nucleótido en la posición 16316 de SEQ ID NO: 80. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 7 (CYRH) se muestra en SEQ ID NO: 94.
El Gen 8 de la agrupación de genes CYR es una secuencia de nucleótidos de 780 pb mostrada en SEQ ID NO: 95. La secuencia de nucleótidos del Gen 8 de CYR abarca desde el nucleótido en la posición 16893 hasta el nucleótido en la posición 17672 de SEQ ID NO: 80. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 8 (CYRJ) se muestra en SEQ ID NO: 96.
El Gen 9 de la agrupación de genes CYR es una secuencia de nucleótidos de 1176 pb mostrada en SEQ ID NO: 97. La secuencia de nucleótidos del Gen 9 de CYR abarca desde el nucleótido en la posición 18113 hasta el nucleótido en la posición 19288 de SEQ ID NO: 80. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 9 (CYRA) se muestra en SEQ ID NO: 98.
El Gen 10 de la agrupación de genes CYR es una secuencia de nucleótidos de 8754 pb mostrada en SEQ ID NO:
99. La secuencia de nucleótidos del Gen 10 de CYR abarca desde el nucleótido en la posición 19303 hasta el nucleótido en la posición 28056 de SEQ ID NO: 80. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 10 (CYRB) se muestra en SEQ ID NO: 100.
El Gen 11 de la agrupación de genes CYR es una secuencia de nucleótidos de 5667 pb mostrada en SEQ ID NO:
101. La secuencia de nucleótidos del Gen 11 de CYR abarca desde el nucleótido en la posición 28061 hasta el nucleótido en la posición 33727 de SEQ ID NO: 80. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 11 (CYRE) se muestra en SEQ ID NO: 102.
El Gen 12 de la agrupación de genes CYR es una secuencia de nucleótidos de 5004 pb mostrada en SEQ ID NO:
103. La secuencia de nucleótidos del Gen 12 de CYR abarca desde el nucleótido en la posición 34299 hasta el nucleótido en la posición 39302 de SEQ ID NO: 80. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 12 (CYRC) se muestra en SEQ ID NO: 104.
El Gen 13 de la agrupación de genes CYR es una secuencia de nucleótidos de 318 pb mostrada en SEQ ID NO:
105. La secuencia de nucleótidos del Gen 13 de CYR abarca desde el nucleótido en la posición 39366 hasta el nucleótido en la posición 39683 de SEQ ID NO: 80. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 13 (CYRM) se muestra en SEQ ID NO: 106.
El Gen 14 de la agrupación de genes CYR es una secuencia de nucleótidos de 600 pb mostrada en SEQ ID NO:
107. La secuencia de nucleótidos del Gen 14 de CYR abarca desde el nucleótido en la posición 39793 hasta el nucleótido en la posición 40392 de SEQ ID NO: 80. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 14 (CYRN) se muestra en SEQ ID NO: 108.
El Gen 15 de la agrupación de genes CYR es una secuencia de nucleótidos de 1548 pb mostrada en SEQ ID NO:
109. La secuencia de nucleótidos del Gen 15 de CYR abarca desde el nucleótido en la posición 40501 hasta el nucleótido en la posición 42048 de SEQ ID NO: 80. La secuencia de polipéptido codificada por el Gen 15 (CYRO) se muestra en SEQ ID NO: 110.
En general, los ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención están en una forma aislada o purificada.
Los polinucleótidos SXT y CYR descritos en la presente memoria pueden ser ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos ribonucleicos (ARN) o ácidos desoxirribonucleicos complementarios (ADNc).
El ARN puede derivar de la transcripción catalizada por una ARN polimerasa de una secuencia de ADN. El ARN puede ser un transcrito primario derivado de la transcripción de una secuencia de ADN correspondiente. El ARN también puede experimentar procesamiento posterior a la transcripción. Por ejemplo, un transcrito de ARN primario puede experimentar procesamiento posterior a la transcripción para formar un ARN maduro. ARN mensajero (ARNm) se refiere a ARN derivado de un marco de lectura abierto correspondiente que puede traducirse en proteína por la célula. ADNc se refiere a un ADN bicatenario que es complementario a y deriva de ARNm. ARN con sentido se refiere a transcrito de ARN que incluye el ARNm y así puede traducirse en proteína por la célula. ARN antisentido se refiere a un transcrito de ARN que es complementario a todo o parte de un transcrito primario diana o ARNm y puede usarse para bloquear la expresión de un gen diana.
El experto en la técnica reconocerá qué secuencias de ARN o ADNc codificadas por las secuencias de ADN de SXT y CYR descritas en la presente memoria pueden derivarse usando el código genético. Una secuencia de ARN puede derivar de una secuencia de ADN dada generando una secuencia que es complementaria a la secuencia de ADN particular. La secuencia complementaria puede generarse convirtiendo cada base citosina ('C') en la secuencia de ADN en una base guanina ('G'), cada base guanina ('G') en la secuencia de ADN en una base citosina ('C'), cada base timidina ('T') en la secuencia de ADN en una base adenina ('A'), y cada base adenina ('A') en la secuencia de ADN en una base uracilo ('U').
Una secuencia de ADN complementario (ADNc) puede derivar de una secuencia de ADN obteniendo una secuencia de ARN de la secuencia de ADN como anteriormente, y convirtiendo la secuencia de ARN en una secuencia de ADNc. Una secuencia de ARN puede convertirse en una secuencia de ADNc convirtiendo cada base citosina ('C') en la secuencia de ARN en una base guanina ('G'), cada base guanina ('G') en la secuencia de ARN en una base citosina ('C'), cada base uracilo ('U') en la secuencia de ARN en una base adenina ('A'), y cada base adenina ('A') en la secuencia de ARN en una base timidina ('T').
El término "variante" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a una secuencia sustancialmente similar. En general, dos secuencias son "sustancialmente similares" si las dos secuencias tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son los mismos (porcentaje de "identidad de secuencia"), sobre una región especificada o, cuando no se especifica, sobre la secuencia completa. De acuerdo con esto, una "variante" de una secuencia de polinucleótido y polipéptido descrita en la presente memoria puede compartir al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 83% 85%, 88%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia.
En general, las variantes de secuencias de polipéptido poseen una actividad biológica cualitativa en común. Las variantes de secuencias de polinucleótidos codifican generalmente polipéptidos que poseen generalmente una actividad biológica cualitativa en común. También se incluyen en el significado del término "variante" los homólogos de polinucleótidos y polipéptidos de la invención. Un homólogo de polinucleótido es típicamente de una especie bacteriana diferente pero comparte sustancialmente la misma función o actividad biológica que el polinucleótido correspondiente descrito en la presente memoria. Un homólogo de polipéptido es típicamente de una especie bacteriana diferente pero comparte sustancialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido correspondiente descrito en la presente memoria. Por ejemplo, los homólogos de los polinucleótidos y polipéptidos descritos en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, aquellos de diferentes especies de cianobacterias.
Además, el término "variante" también incluye análogos de los polipéptidos de la invención. Un "análogo" de polipéptido es un polipéptido que es un derivado de un polipéptido de la invención, derivado que comprende la adición, deleción, sustitución de uno o más aminoácidos, de manera que el polipéptido retiene sustancialmente la misma función. El término "sustitución de aminoácidos conservativa" se refiere a una sustitución o reemplazo de un aminoácido por otro aminoácido con propiedades similares en una cadena de polipéptido (secuencia primaria de una proteína). Por ejemplo, la sustitución del aminoácido cargado ácido glutámico (Glu) por el aminoácido cargado similarmente ácido aspártico (Asp) sería una sustitución de aminoácidos conservativa.
En general, el porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias puede determinarse comparando dos secuencias alineadas de forma óptima sobre una ventana de comparación. La parte de la secuencia en la ventana de comparación puede comprender, por ejemplo, deleciones o adiciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido o polipéptido descrita en la presente memoria), que no comprende deleciones o adiciones, con el fin de alinear las dos secuencias de forma óptima. Un porcentaje de identidad de secuencia puede calcularse entonces determinando el número de posiciones en las que aparecen bases de ácidos nucleicos o residuos de aminoácidos idénticos en ambas secuencias para rendir el número de posiciones concordantes, dividiendo el número de posiciones concordantes por el número total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando el resultado por 100 para rendir el porcentaje de identidad de secuencia.
En el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o polipéptido, el porcentaje de identidad de secuencia se refiere al porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales sobre la región especificada , (o, cuando no se especifica, sobre la secuencia completa), cuando se comparan y alinean para correspondencia máxima sobre una ventana de comparación, o región designada según se mide usando uno de los algoritmos de comparación de secuencias siguientes o por alineamiento manual e inspección visual.
Para comparaciones de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introdujeron en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencia. Pueden usarse los parámetros del programa por defecto, o pueden designarse parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias de ensayo respecto a la secuencia de referencia, tomando como base los parámetros del programa. Los métodos para el alineamiento de secuencias para comparación son muy conocidos en la técnica. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede determinarse convencionalmente usando programas informáticos conocidos, incluyendo, pero no limitado a: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible en Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Software GCG Wisconsin Genetics, Versión 10 (disponible en Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, EEUU).
El programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711) usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias (Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)). Cuando se usa BESTFIT o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar el grado de homología entre secuencias, los parámetros pueden ajustarse de manera que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de referencia y se permiten los huecos en homología de hasta 5% del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia.
GAP usa el algoritmo descrito en Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453, para encontrar el alineamiento de dos secuencias completas que maximiza el número de concordancias y minimiza el número de huecos. GAP considera todos los alineamientos y posiciones de hueco posibles y crea el alineamiento con el mayor número de bases concordantes y la menor cantidad de huecos. Permite el suministro de una penalización por creación de hueco y una penalización por extensión de hueco en unidades de bases concordantes. GAP presenta un miembro de la familia de los mejores alineamientos.
Otro método para determinar la mejor concordancia global entre una secuencia consultada y una secuencia sujeto, también referido como un alineamiento de secuencias global, puede determinarse usando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)). En un alineamiento de secuencias, las secuencias consultadas y sujeto son ambas secuencias de ADN. Una secuencia de ARN puede compararse convirtiendo los U en T. El resultado de dicho alineamiento de secuencias global es un porcentaje de identidad.
Los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, pueden usarse para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia. Éstos están descritos en Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, y Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. El software para llevar a cabo los análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo implica en primer lugar identificar parejas de secuencias con alta puntuación (HSP) mediante la identificación de palabras cortas con longitud W en la secuencia consultada, que o bien concuerdan o satisfacen una puntuación de umbral con valor positivo T cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se refiere como el umbral de puntuación de la palabra vecina (Altschul et al, supra). Estos logros de palabra vecina iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largas que las contienen. Los aciertos de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta que pueda incrementarse la puntuación acumulativa de alineamiento. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para una pareja de residuos concordantes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para residuos no concordantes; siempre < 0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se para cuando: la puntuación acumulativa de alineamiento cae por la cantidad X desde su máximo valor conseguido; la puntuación acumulativa va a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos con puntuación negativa; o se alcance el final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como defecto una longitud de palabra de 3, y expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl, Acad. Sci USA 89:10915) alineamientos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas cadenas. [0028] El algoritmo BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad menor de suma (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual ocurriría al azar una concordancia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad menor de suma en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0,2, más preferiblemente menor de aproximadamente 0,01, y lo más preferiblemente menor de aproximadamente 0,001.
La invención también contempla fragmentos de los polipéptidos descritos en la presente memoria. Un "fragmento" de polipéptido es una molécula de polipéptido que codifica un constituyente o es un constituyente de un polipéptido de la invención o variante de éste. Típicamente, el fragmento posee una actividad biológica cualitativa en común con el polipéptido del que es un constituyente. El fragmento de péptido puede tener una longitud entre aproximadamente 5 a aproximadamente 3.000 aminoácidos, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 2.750 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 2.500 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 2.250 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 2.000 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 1.750 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 1.500 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 1.250 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 1.000 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 900 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 800 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 700 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 600 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 500 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 450 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 400 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 350 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 300 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 250 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 200 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 175 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 150 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 125 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 75 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 40 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 30 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 5 a aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, y entre aproximadamente 5 a aproximadamente 15 aminoácidos de longitud. Alternativamente, el fragmento de péptido puede tener una longitud entre aproximadamente 5 a aproximadamente 10 aminoácidos.
También se contemplan fragmentos de los polinucleótidos descritos en la presente memoria. Un "fragmento" de polinucleótido es una molécula de polinucleótido que codifica un constituyente o es un constituyente de un polinucleótido de la invención o variante de éste. Los fragmentos de un polinucleótido no necesitan necesariamente codificar polipéptidos que retienen la actividad biológica. El fragmento, puede ser, por ejemplo, útil como una sonda de hibridación o cebador de PCR. El fragmento puede derivar de un polinucleótido de la invención o alternativamente puede sintetizarse por algún otro medio, por ejemplo por síntesis química.
Determinadas realizaciones de la invención se refieren a fragmentos de SEQ ID NO: 1. Un fragmento de SEQ ID NO: 1 puede comprender, por ejemplo, un constituyente de SEQ ID NO: 1 en el que el gen orf1 de la región del extremo 5' del gen está ausente. Alternativamente, un fragmento de SEQ ID NO: 1 puede comprender, por ejemplo, un constituyente de SEQ ID NO: 1 en el que el gen hisA de la región del extremo 3' del gen está ausente. Alternativamente, un fragmento de SEQ ID NO: 1 puede comprender, por ejemplo, un constituyente de SEQ ID NO: 1 en el que el gen orfA de la región del extremo 3' del gen está ausente. Alternativamente, un fragmento de SEQ ID NO: 1 puede comprender, por ejemplo, un constituyente de SEQ ID NO: 1 en el que el gen orf1 de la región del extremo 5' del gen está ausente y el gen orfA de la región del extremo 3' del gen está ausente. Alternativamente, un fragmento de SEQ ID NO: 1 puede comprender, por ejemplo, un constituyente de SEQ ID NO: 1 en el que el gen orf1 de la región del extremo 5' del gen está ausente y los genes hisA y/o orfA de la región del extremo 3' están ausentes.
En otras realizaciones, un fragmento de SEQ ID NO: 1 puede comprender uno o más marcos de lectura abiertos SXT. El marco de lectura abierto SXT puede seleccionarse del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, y variantes de éstos.
Las realizaciones adicionales de la invención se refieren a fragmentos de SEQ ID NO: 80. El fragmento de SEQ ID NO: 80 puede comprender uno o más marcos de lectura abiertos CYR. El marco de lectura abierto CYR puede seleccionarse del grupo que consiste en SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO: 109, y variantes de éstos.
En realizaciones particulares, los polinucleótidos de la invención pueden clonarse en un vector. El vector puede comprender, por ejemplo, una secuencia de ADN, ARN o ADN complementario (ADNc). El vector puede ser un vector plasmídico, un vector viral, o cualquier otro vehículo adecuado adaptado para la inserción de secuencias extrañas, su introducción en células y la expresión de las secuencias introducidas. Típicamente, el vector es un vector de expresión y puede incluir secuencias de control de la expresión y procesamiento tales como un promotor, un potenciador, sitios de unión a ribosomas, señales de poliadenilación y secuencias de terminación de la transcripción. La invención también contempla células huésped transformadas por dichos vectores. Por ejemplo, los
polinucleótidos de la invención pueden clonarse en un vector que se transforma en una célula huésped bacteriana, por ejemplo, E. coli. Los métodos para la construcción de vectores y su transformación en células huésped son conocidos generalmente en la técnica y se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York, y, Ausubel F. M. et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology (2007), John Wiley and Sons, Inc.
Sondas de nucleótidos, cebadores y anticuerpos
La invención contempla nucleótidos y fragmentos basados en las secuencias de los polinucleótidos descritos en la presente memoria para uso como cebadores y sondas para la identificación de secuencias homólogas.
Los nucleótidos y fragmentos pueden estar en la forma de oligonucleótidos. Los oligonucleótidos son cadenas cortas de residuos de nucleótidos adecuados para uso en reacciones de amplificación de ácidos nucleicos tales como PCR, teniendo típicamente una longitud de al menos aproximadamente 5 nucleótidos a aproximadamente 80 nucleótidos, más típicamente aproximadamente 10 nucleótidos de longitud a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, e incluso más típicamente aproximadamente 15 nucleótidos de longitud a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud.
Las sondas son secuencias de nucleótidos con una longitud variable, por ejemplo entre aproximadamente 10 nucleótidos y varios miles de nucleótidos, para uso en la detección de secuencias homólogas, típicamente por hibridación. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN, u otros oligonucleótidos.
Los métodos para el diseño y/o producción de sondas de nucleótidos y/o cebadores son generalmente conocidos en la técnica, y se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York; Itakura K. et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Innis et al., (Eds) (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nueva York); Innis y Gelfand, (Eds) (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York); e Innis y Gelfand, (Eds) (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York). Los cebadores y sondas de nucleótidos pueden prepararse, por ejemplo, por técnicas de síntesis química, por ejemplo, los métodos de fosfodiéster y fosfotriéster (véase, por ejemplo, Narang S.
A. et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown, E. L. (1979) et al. Meth. Enzymol. 68:109; y la Patente U.S. No. 4356270), el método de dietilfósforamidita (véase Beaucage S.L et al. (1981) Tetrahedron Letters, 22:1859-1862). Un método para sintetizar oligonucleótidos en un soporte sólido modificado se describe en la Patente U.S. No. 4458066.
Los ácidos nucleicos de la invención, incluyendo las sondas y cebadores mencionados anteriormente, pueden marcarse por la incorporación de un marcador para facilitar su detección. Las técnicas para marcar y detectar ácidos nucleicos se describen, por ejemplo, en Ausubel F. M. et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology (2007), John Wiley and Sons, Inc. Los ejemplos de marcadores adecuados incluyen moléculas fluorescentes (por ejemplo, acetilaminofluoreno, 5-bromodesoxiuridina, digoxigenina, fluoresceína) e isótopos radiactivos (por ejemplo, 32P, 35S, 3H, 33P). La detección del marcador puede conseguirse, por ejemplo, por técnicas químicas, fotoquímicas, inmunoquímicas, bioquímicas, o espectroscópicas.
Las sondas y cebadores de la invención pueden usarse, por ejemplo, para detectar o aislar cianobacterias y/o dinoflagelados en una muestra de interés. Adicionalmente o alternativamente, las sondas y cebadores de la invención pueden usarse para detectar o aislar un organismo cianotóxico y/o un organismo productor de cilindrospermopisna en una muestra de interés. Adicionalmente o alternativamente, las sondas o cebadores de la invención pueden usarse para aislar secuencias correspondientes en otros organismos incluyendo, por ejemplo, otras especies bacterianas. Los métodos tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), hibridación, y semejantes pueden usarse para identificar dichas secuencias tomando como base su homología de secuencia con las secuencias mostradas en la presente memoria. Las secuencias que se seleccionan tomando como base su identidad de secuencia con las secuencias completas mostradas en la presente memoria o con fragmentos de éstas están englobadas por las realizaciones. Dichas secuencias incluyen secuencias que son ortólogos de las secuencias descritas. El término "ortólogos" se refiere a genes derivados de un gen ancestral común y que se encuentran en diferentes especies como resultado de la especiación. Los genes encontrados en diferentes especies se consideran ortólogos cuando sus secuencias de nucleótidos y/o sus secuencias de proteína codificadas comparten una identidad sustancial como se define en otro lugar de la presente memoria. Las funciones de los ortólogos están frecuentemente altamente conservadas entre las especies.
En técnicas de hibridación, toda o parte de una secuencia de nucleótidos conocida se usa para generar una sonda que hibrida selectivamente con otras secuencias de ácido nucleico correspondientes presentes en una muestra dada. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN, u otros oligonucleótidos, y pueden marcarse con un marcador detectable. Así, por ejemplo, las sondas para hibridación pueden prepararse marcando oligonucleótidos sintéticos basados en las secuencias de la invención.
El nivel de homología (identidad de secuencia) entre la sonda y la secuencia diana se determinará principalmente por la astringencia de las condiciones de hibridación. En particular, la secuencia de nucleótidos usada como una
sonda puede hibridar con un homólogo u otra variante de un polinucleótido descrito en la presente memoria en condiciones de astringencia baja, astringencia media o astringencia alta. Existen numerosas condiciones y factores, muy conocidos para los expertos en la técnica, que pueden emplearse para alterar la astringencia de la hibridación. Por ejemplo, la longitud y naturaleza (ADN, ARN, composición de bases) del ácido nucleico que va a hibridar con un ácido nucleico especificado; la concentración de sales y otros componentes, tales como la presencia o ausencia de formamida, sulfato de dextrano, polietilen glicol etc; y alterar la temperatura de las etapas de hibridación y/o lavado.
Típicamente, las condiciones de hibridación astringentes serán aquellas en las que la concentración de sal es menor de aproximadamente 1,5 M ión Na, típicamente aproximadamente 0,01 a 1,0 M concentración de ión Na (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, mayores de 50 nucleótidos). Las condiciones astringentes también pueden conseguirse con la adición de agentes desestabilizadores tales como formamida. Las condiciones de astringencia baja ejemplares incluyen hibridación con una disolución tampón de 30% a 35% formamida, 1 M NaCl, 1% SDS (dodecil sulfato de sodio) a 37°C, y un lavado en 1X a 2X SSC (20X SSC = 3,0 M NaCl/0,3 M citrato de trisodio) a 50°C a 55°C. Las condiciones de astringencia moderadas ejemplares incluyen hibridación en 40% a 45% formamida, 1,0 M NaCl, 1% SDS a 37°C, y un lavado en 0,5X a 1X SSC a 55°C a 60°C. Las condiciones de astringencia alta ejemplares incluyen hibridación en 50% formamida, 1 M NaCl, 1% SDS a 37°C, y un lavado final en 0,1X SSC a 60°C a 65°C durante al menos aproximadamente 20 minutos. Opcionalmente, los tampones de lavado pueden comprender aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1% SDS. La duración de la hibridación es generalmente menor de aproximadamente 24 horas, habitualmente aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas.
En una estrategia de PCR, los cebadores de oligonucleótidos pueden diseñarse para usarse en reacciones de PCR para amplificar secuencias de ADN correspondientes a partir de ADNc o ADN genómico extraído de cualquier organismo de interés. Los métodos para diseñar cebadores de PCR y clonación por PCR se conocen generalmente en la técnica y se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York); Ausubel F. M. et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology (2007), John Wiley and Sons, Inc; Maniatis et al. Molecular Cloning (1982), 280-281; Innis et al. (Eds) (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nueva York); Innis y Gelfand, (Eds) (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York); e Innis y Gelfand, (Eds) (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York). Los métodos de PCR conocidos incluyen, pero no están limitados a, métodos usando cebadores emparejados, cebadores anidados, cebadores únicos específicos, cebadores degenerados, cebadores específicos de gen, cebadores específicos de vector, cebadores emparejados erróneamente parcialmente, y semejantes.
El experto en la técnica reconocerá que los cebadores descritos en la presente memoria para uso en PCR o RT-PCR también pueden usarse como sondas para la detección de secuencias SXT o CYR.
También se contemplan por la invención anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a los polipéptidos de la invención. Los anticuerpos pueden usarse para detectar y analizar cualitativamente o cuantitativamente uno o más polipéptidos SXT o CYR en una muestra dada. Por "unirse específicamente" se entenderá que el anticuerpo es capaz de unirse al polipéptido diana o fragmento de éste con una afinidad mayor de la que se une a una proteína no relacionada. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse al polipéptido o fragmento de éste con una constante de unión en el intervalo de al menos aproximadamente 10-4M a aproximadamente 10-10M. Preferiblemente, la constante de unión es al menos aproximadamente 10-5M, o al menos aproximadamente 10-6M, más preferiblemente la constante de unión del anticuerpo para el polipéptido SXT o CYR o fragmento de éste es al menos aproximadamente 10-7M, al menos aproximadamente 10-8M, o al menos aproximadamente 10-9M o más.
Los anticuerpos de la invención pueden existir en una variedad de formas, incluyendo por ejemplo como un anticuerpo completo, o como un fragmento de anticuerpo, u otro fragmento inmunológicamente activo de éste, tal como regiones determinantes de la complementariedad. De forma similar, el anticuerpo puede existir como un fragmento de anticuerpo que tiene dominios de unión a antígeno funcionales, esto es, dominios variables de cadena pesada y ligera. También, el fragmento de anticuerpo puede existir en una forma seleccionada del grupo que consiste en, pero no está limitada a: Fv, Fab, F(ab)2, scFv (Fv de cadena única), dAb (anticuerpo de dominio único), anticuerpos quiméricos, anticuerpos bi-específicos, fragmentos divalentes y trivalentes.
Un 'fragmento' de anticuerpo puede producirse por modificación de un anticuerpo completo o por síntesis del fragmento de anticuerpo deseado. Los métodos para generar anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpo, son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, síntesis por tecnología de ADN recombinante. El experto en la técnica tendrá conocimiento de los métodos para sintetizar anticuerpos, tales como los descritos, por ejemplo, en la Patente US No. 5296348 y Ausubel F. M. et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology (2007), John Wiley and Sons, Inc.
Preferiblemente, los anticuerpos se preparan a partir de regiones o fragmentos discretos del polipéptido SXT o CYR de interés. Una parte antigénica de un polipéptido de interés puede tener cualquier longitud apropiada, tal como de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 aminoácidos. Preferiblemente, una parte antigénica contiene al menos aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ó 14 residuos de aminoácidos.
En el contexto de esta especificación, la referencia a un anticuerpo específico para un polipéptido SXT o CYR de la invención incluye un anticuerpo que es específico para un fragmento del polipéptido de interés.
Los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido de la invención pueden prepararse, por ejemplo, usando los polipéptidos SXT o CYR purificados o sus secuencias de ácido nucleico usando cualesquiera métodos adecuados conocidos en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, que contiene típicamente partes Fab, puede prepararse usando tecnología de hibridoma descrita en Harlow y Lane (Eds) Antibodies - A Laboratory Manual, (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y; Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (1986) 2a ed; y Kohler y Milstein, (1975) Nature 256: 495-497. Dichas técnicas incluyen, pero no están limitadas a, la preparación de anticuerpos por la selección de anticuerpos de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares, así como la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales mediante la inmunización de conejos o ratones (véase, por ejemplo, Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; Ward et al. (1989) Nature 341: 544-546).
También se entenderá que los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y anticuerpos totalmente humanos. Un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo bi-específico, que tiene especificidad de unión para más de un antígeno o epítopo. Por ejemplo, el anticuerpo puede tener especificidad para uno o más polipéptidos SXT o CYR o fragmentos de éstos, y además tiene especificidad de unión para otro antígeno. Los métodos para la preparación de anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos totalmente humanos, y anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, los descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 6995243 presentada en 7 de febrero, 2006 de Garabedian, et al. y titulada "Antibodies that recognize and bind phosphorylated human glucocorticoid receptor and methods of using same".
Generalmente, una muestra que comprende potencialmente polipéptidos SXT o CYR puede ponerse en contacto con un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido SXT o CYR o fragmento de éste. Opcionalmente, el anticuerpo puede fijarse a un soporte sólido para facilitar el lavado y aislamiento posterior del complejo, antes de poner en contacto el anticuerpo con una muestra. Los ejemplos de soportes sólidos incluyen, por ejemplo, placas de microtitulación, lechos, tics, o microlechos. Los anticuerpos también pueden unirse a una matriz ProteinChip o un sustrato sonda como se ha descrito anteriormente.
Los marcadores detectables para la identificación de anticuerpos unidos a los polipéptidos SXT o CYR de la invención incluyen, pero no están limitados a fluorocromos, agentes de tinción fluorescentes, radiomarcadores, enzimas tales como peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina y otros usados comúnmente en la técnica, y marcadores colorimétricos incluyendo oro coloidal o lechos de vidrio o plástico coloreados. Alternativamente, el marcador en la muestra puede detectarse usando un ensayo indirecto, en el que, por ejemplo, se usa un segundo anticuerpo marcado para detectar el anticuerpo unido específico del marcador.
Los métodos para detectar la presencia de o medir la cantidad de, un complejo anticuerpo-marcador incluyen, por ejemplo, la detección de fluorescencia, quimioluminiscencia, luminiscencia, absorbancia, birefringencia, transmitancia, reflectancia, o índice de refracción tal como resonancia de plasmón superficial, elipsometría, un método de espejo resonante, un método de guía de onda con acoplador de rejilla o interferometría. Los métodos de radio frecuencia incluyen espectroscopía de resonancia multipolar. Los métodos electroquímicos incluyen métodos de amperometría y voltametría. Los métodos ópticos incluyen métodos de formación de imágenes y métodos sin formación de imágenes y microscopía.
Los ensayos útiles para detectar la presencia de o medir la cantidad de, un complejo anticuerpo-marcador incluyen, por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), un ensayo radioinmune (RIA), o un ensayo de transferencia Western. Dichos métodos se describen, por ejemplo, en Clinical Immunology (Stites & Terr, eds., 7a ed. 1991); Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volumen 37 (Asai, ed. 1993); y Harlow y Lane, supra.
Métodos y kits para la detección
La invención proporciona métodos y kits para la detección y/o aislamiento de ácidos nucleicos y polipéptidos SXT. También se proporcionan métodos y kits para la detección y/o aislamiento de ácidos nucleicos y polipéptidos CYR.
En un aspecto, la invención proporciona un método para la detección de cianobacterias. El experto en la técnica entenderá que la detección de "cianobacterias" engloba la detección de una o más cianobacterias. El método comprende obtener una muestra para usarse en el método, y detectar la presencia de uno o más polinucleótidos o polipéptidos SXT como se describe en la presente memoria, o una variante o fragmento de éstos. La presencia de polinucleótidos, polipéptidos SXT, o variantes o fragmentos de éstos, es indicativa de cianobacterias en la muestra.
El polinucleótido SXT puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, ' SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ
ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, y variantes y fragmentos de éstas.
Alternativamente, el polinucleótido SXT puede ser un ARN o ADNc codificado por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, y variantes y fragmentos de éstas y/o polipéptidos como se describe en la presente memoria, o una variante o fragmento de éstos.
El polipéptido SXT puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID, NO: 37, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 69, y variantes y fragmentos de éstas.
Los inventores han determinado que varios genes de la agrupación de genes SXT existen en organismos productores de saxitoxina y que están ausentes en los organismos con la agrupación de genes SXT que no producen saxitoxina. Específicamente, los inventores han identificado que el gen 6 (sxtA) (SEQ ID NO: 14), gen 9 (sxtG) (SEQ ID NO: 20), gen 10 (sxtH) (SEQ ID NO: 22), gen 11 (sxtI) (SEQ ID NO: 24) y gen 17 (sxtX) (SEQ ID NO: 36) de la agrupación de genes SXT están presentes sólo en organismos que producen saxitoxina.
De acuerdo con esto, en otro aspecto, la invención proporciona un método para detectar un organismo cianotóxico. El método comprende obtener una muestra para usarse en el método, y detectar un organismo cianotóxico tomando como base la detección de uno o más polinucleótidos SXT que comprenden una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 14 (sxtA, gen 6), SEQ ID NO: 20 (sxtG, gen 9), SEQ ID NO: 22 (sxtH, gen 10), SEQ ID NO: 24 (sxtI, gen 11), SEQ ID NO: 36 (sxtX, gen 17), o variantes o fragmentos de éstos. Adicionalmente o alternativamente, un organismo cianotóxico puede detectarse tomando como base la detección de un ARN o ADNc que comprende una secuencia codificada por SEQ ID NO: 14 (sxtA, gen 6), SEQ ID NO: 20 (sxtG, gen 9), SEQ ID NO: 22 (sxtH, gen 10), SEQ ID NO: 24 (sxtI, gen 11), SEQ ID NO: 36 (sxtX, gen 17), o variantes o fragmentos de éstos. Adicionalmente o alternativamente, un organismo cianotóxico puede detectarse tomando como base la detección de uno o más polipéptidos que comprenden una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 15 (SXTA), SEQ ID NO: 21 (SXTG), SEQ ID NO: 23 (SXTH), SEQ ID NO: 25 (SXTI), SEQ ID NO: 37 (SXTX), o variantes o fragmentos de éstas, en una muestra que se sospecha que comprende uno o más organismos cianotóxicos. El organismo cianotóxico puede ser cualquier organismo capaz de producir saxitoxina. En una realización preferida de la invención, el organismo cianotóxico es una cianobacteria o un dinoflagelado.
En determinadas realizaciones de la invención, los métodos para detectar cianobacterias o los métodos para detectar organismos cianotóxicos pueden comprender además la detección de uno o más polinucleótidos CYR o polipéptidos CYR como se describe en la presente memoria, o una variante o fragmento de éstos. El polinucleótido CYR puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, y variantes o fragmentos de éstas.
Alternativamente, el polinucleótido CYR puede ser un ARN o ADNc codificado por una secuencia de polinucleótido seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, y variantes o fragmentos de éstas.
El polipéptido CYR puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, y SEQ ID NO: 110, y variantes o fragmentos de éstas.
Los inventores han determinado que el gen 8 (cyrJ) (SEQ ID NO: 95) de la agrupación de genes CYR existe en organismos productores de cilindrospermopsina, y está ausente en organismos con la agrupación de genes CYR que no producen cilindrospermopsina. De acuerdo con esto, los métodos para detectar cianobacterias o los métodos para detectar organismos cianotóxicos pueden comprender además la detección de un organismo productor de cilindrospermopsina tomando como base la detección de un polinucleótido CYR que comprende una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 95, o una variante o fragmento de éste. Adicionalmente o alternativamente, , los métodos para detectar cianobacterias o los métodos para detectar organismos cianotóxicos pueden comprender además la detección de un organismo productor de cilindrospermopsina tomando como base la detección de un ARN o ADNc que comprende una secuencia codificada por SEQ ID NO: 95, o una variante o fragmento de éste. Adicionalmente o
alternativamente, los métodos para detectar cianobacterias o los métodos para detectar organismos cianotóxicos pueden comprender además la detección de un organismo productor de cilindrospermopsina tomando como base la detección de un polipéptido CYR que comprende una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 96, o una variante o fragmento de éste.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para la detección de cianobacterias. El experto en la técnica entenderá que la detección de "cianobacterias" engloba la detección de una o más cianobacterias. El método comprende obtener una muestra para usarse en el método, y detectar la presencia de uno o más polinucleótidos o polipéptidos CYR como se describe en la presente memoria, o una variante o fragmento de éstos. La presencia de polinucleótidos, polipéptidos CYR, o variantes o fragmentos de éstos, es indicativa de cianobacterias en la muestra.
El polinucleótido CYR puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, y variantes y fragmentos de éstas.
Alternativamente, el polinucleótido CYR puede ser un ARN o ADNc codificado por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO: 109, y variantes y fragmentos de éstas.
El polipéptido CYR puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, y SEQ ID NO: 110, y variantes o fragmentos de éstas.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para detectar un organismo productor de cilindrospermopsina tomando como base la detección del gen 8 de CYR (cyrJ). El método comprende obtener una muestra para usarse en el método, y detectar la presencia de un polinucleótido CYR que comprende una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 95, o una variante o fragmento de éste. Adicionalmente o alternativamente, el método para detectar un organismo productor de cilindrospermopsina tomando como base la detección del gen 8 de CYR (cyrJ) puede comprender la detección de un ARN o ADNc que comprende una secuencia codificada por SEQ ID NO: 95, o una variante o fragmento de éste. Adicionalmente o alternativamente, el método para detectar un organismo productor de cilindrospermopsina tomando como base la detección del gen 8 de CYR (cyrJ) puede comprender la detección de un polipéptido CYR que comprende una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 96, o una variante o fragmento de éste.
En determinadas realizaciones de la invención, los métodos para detectar cianobacterias que comprenden la detección de secuencias CYR o variantes o fragmentos de éstas comprende además la detección de uno o más polinucleótidos SXT o polipéptidos SXT como se describe en la presente memoria, o una variante o fragmento de éstos.
El polinucleótido SXT puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, y variantes y fragmentos de éstas.
Alternativamente, el polinucleótido SXT puede ser un ARN o ADNc codificado por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, y variantes y fragmentos de éstas y/o polipéptidos como se describe en la presente memoria, o una variante o fragmento de éstos.
El polipéptido SXT puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 69, y variantes y fragmentos de éstas.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para la detección de dinoflagelados. El experto en la técnica entenderá que la detección de "dinoflagelados" engloba la detección de uno o más dinoflagelados. El método
comprende obtener una muestra para usarse en el método, y detectar la presencia de uno o más polinucleótidos o polipéptidos SXT como se describe en la presente memoria, o una variante o fragmento de éstos. La presencia de polinucleótidos, polipéptidos SXT, o variantes o fragmentos de éstos, es indicativa de dinoflagelados en la muestra.
El polinucleótido SXT puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, y variantes y fragmentos de éstas.
Alternativamente, el polinucleótido SXT puede ser un ARN o ADNc codificado por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, y variantes y fragmentos de éstas y/o polipéptidos como se describe en la presente memoria, o una variante o fragmento de éstos.
El polipéptido SXT puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 69, y variantes y fragmentos de éstas.
Se puede sospechar que una muestra para usarse según los métodos descritos en la presente memoria comprende uno o más organismos cianotóxicos. Los organismos cianotóxicos pueden ser una o más cianobacterias y/o uno o más dinoflagelados. Adicionalmente o alternativamente, puede sospecharse que una muestra para usarse según los métodos descritos en la presente memoria comprende una o más cianobacterias y/o uno o más dinoflagelados. Una muestra para usarse según los métodos descritos en la presente memoria puede ser una muestra comparativa o control, por ejemplo, una muestra que comprende una concentración o densidad conocida de cianobacterias y/o dinoflagelados, o una muestra que comprende una o más especies o cepas conocidas de cianobacterias y/o dinoflagelados.
Una muestra para usarse según los métodos descritos en la presente memoria puede derivar de cualquier fuente. Por ejemplo, una muestra puede ser una muestra medioambiental. La muestra medioambiental puede derivar, por ejemplo, de agua salada, agua dulce o una floración de algas verdeazuladas. Alternativamente, la muestra puede derivar de una fuente de laboratorio, tal como un cultivo, o una fuente comercial.
Los expertos en la técnica apreciarán que los métodos y kits descritos en la presente memoria son adecuados generalmente para detectar cualesquiera organismos en los que están presentes las agrupaciones de genes SXT y/o CYR. Las cianobacterias adecuadas a las que se pueden aplicar los métodos de la invención pueden seleccionarse de los órdenes Oscillatoriales, Chroococcales, Nostocales y Stigonematales. Por ejemplo, las cianobacterias pueden seleccionarse de los géneros Anabaena, Nostoc, Microcystis, Planktothrix, Oscillatoria, Phormidium, y Nodularia. Por ejemplo, las cianobacterias pueden seleccionarse de las especies Cylindrospermopsis raciborskii T3, Cylindrospermopsis raciborskii AWT205, Aphanizomenon ovalisporum, Aphanizomenon flos-aquae, Aphanizomenon sp., Umezakia natans, Raphidiopsis curvata, Anabaena bergii, Lyngbya wollei, y Anabaena circinalis. Los ejemplos de dinoflagelados adecuados a los que se pueden aplicar los métodos y kits de la invención pueden seleccionarse de los géneros Alexandrium, Pyrodinium y Gymnodinium. Los métodos y kits de la invención también pueden emplearse para el descubrimiento de nuevas especies o géneros hepatotóxicos en colecciones de cultivos o de muestras medioambientales. Los métodos y kits de la invención también pueden emplearse para detectar cianotoxinas que se acumulan en otros animales, por ejemplo, peces y moluscos.
La detección de polinucleótidos y polipéptidos SXT y CYR descritos en la presente memoria puede llevarse a cabo usando cualquier método adecuado. Por ejemplo, los métodos para la detección de polinucleótidos y/o polipéptidos SXT y CYR descritos en la presente memoria pueden implicar el uso de un cebador, sonda o anticuerpo específico para uno o más polinucleótidos y polipéptidos SXT y CYR. Las técnicas y ensayos adecuados en los que el experto en la técnica puede utilizar un cebador, sonda o anticuerpo específico para uno o más polinucleótidos y polipéptidos SXT y CYR incluyen, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (y variaciones relacionadas de esta técnica), ensayos basados en anticuerpos tales como ELISA y citometría de flujo, y microscopía fluorescente. Los métodos por los que pueden identificarse los polipéptidos SXT y CYR descritos en la presente memoria se conocen generalmente en la técnica, y se describen por ejemplo en Coligan J. E. et al. (Eds) Current Protocols in Protein Science (2007), John Wiley and Sons, Inc; Walker, J. M., (Ed) (1988) New Protein Techniques: Methods in Molecular Biology, Humana Press, Clifton, N.J; y Scopes, R. K. (1987) Protein Purification: Principles and Practice, 3a. Ed.,
Springer-Verlag, Nueva York, N.Y. Por ejemplo, los polipéptidos SXT y CYR descritos en la presente memoria pueden detectarse por transferencia western o análisis espectrofotométrico. Otros ejemplos de métodos adecuados para la detección de polipéptidos SXT y CYR se describen, por ejemplo, en la Patente US No. 4683195, Patente US No. 6228578, Patente US No. 7282355, Patente US No. 7348147 y publicación PCT No. WO/2007/056723.
En una realización preferida de la invención, la detección de los polinucleótidos y polipéptidos SXT y CYR se consigue por la amplificación de ADN de la muestra de interés por la reacción en cadena de la polimerasa, usando cebadores que hibridan específicamente con la secuencia SXT y/o CYR, o una variante o fragmento de éstas, y detectando la secuencia amplificada.
Los ácidos nucleicos y polipéptidos para análisis usando los métodos y kits descritos en la presente memoria pueden extraerse de organismos bien en cultivo mixto o como especies individuales o aislados de género. De acuerdo con esto, los organismos pueden cultivarse antes del aislamiento del ácido nucleico y/o polipéptido o alternativamente el ácido nucleico y/o polipéptidos pueden extraerse directamente de muestras medioambientales, tales como muestras de agua o floraciones de algas verdeazuladas.
Los métodos adecuados para la extracción y purificación de ácidos nucleicos para análisis usando los métodos y kits de la invención se conocen generalmente en la técnica y se describen, por ejemplo, en Ausubel F. M. et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology (2007), John Wiley and Sons, Inc; Neilan (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61:2286-2291; y Neilan et al. (2002) Astrobiol. 2:271-280. El experto en la técnica apreciará fácilmente que la invención no está limitada a los métodos específicos para el aislamiento de ácidos nucleicos descritos en esas publicaciones y que otros métodos adecuados están englobados por la invención. La invención puede llevarse a cabo sin el aislamiento del ácido nucleico antes del análisis del ácido nucleico.
Los métodos adecuados para la extracción y purificación de polipéptidos para los propósitos de la invención se conocen generalmente en la técnica y se describen, por ejemplo, en Coligan J. E. et al. (Eds) Current Protocols in Protein Science (2007), John Wiley and Sons, Inc; Walker, J. M., (Ed) (1988) New Protein Techniques: Methods in Molecular Biology, Humana Press, Clifton, N.J; y Scopes, R. k. (1987) Protein Purification: Principles and Practice, 3a. Ed., Springer-Verlag, Nueva York, N.Y. Los ejemplos de técnicas adecuadas para la extracción de proteínas incluyen, pero no están limitadas a diálisis, ultrafiltración y precipitación. Las técnicas de purificación de proteínas adecuadas para usarse incluyen, pero no están limitadas a, cromatografía en fase reversa, cromatografía de interacción hidrofóbica, centrifugación, filtración en gel, precipitación con sulfato de amonio e intercambio iónico.
Según los métodos y kits de la invención, los polinucleótidos SXT y CYR o variantes o fragmentos de éstos pueden detectarse por cualquier medio adecuado conocido en la técnica. En una realización preferida de la invención, los polinucleótidos SXT y CYR se detectan por amplificación por PCR. En la estrategia de PCR, pueden diseñarse cebadores de oligonucleótidos para uso en las reacciones de PCR para amplificar los polinucleótidos SXT y CYR de la invención. También está englobada en la invención la amplificación por PCR de ADN complementario (ADNc) amplificado a partir de ARN mensajero (ARNm) derivado de la transcripción inversa de secuencias SXT y CYR (RT-PCR). Los métodos de PCR conocidos incluyen, pero no están limitados a, métodos usando cebadores emparejados, cebadores anidados, cebadores únicos específicos, cebadores degenerados, cebadores específicos de gen, cebadores específicos de vector, cebadores emparejados erróneamente parcialmente, y semejantes. Los métodos para diseñar cebadores de PCR y RT-PCR se conocen generalmente en la técnica y se describen, por ejemplo, en Ausubel F. M. et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology (2007), John Wiley and Sons, Inc; Maniatis et al. Molecular Cloning (1982), 280-281; Innis et al. (Eds) (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nueva York); Innis y Gelfand, (Eds) (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York); Innis y Gelfand, (Eds) (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York); y Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York.
El experto en la técnica apreciará fácilmente que pueden alterarse diferentes parámetros de los procedimientos de PCR y RT-PCR sin afectar la capacidad para conseguir el producto deseado. Por ejemplo, puede variarse la concentración de sal o puede variarse el tiempo y/o temperatura de una o más de las etapas de desnaturalización, hibridación y extensión. De forma similar, la cantidad de molde de ADN, ADNc o ARN también puede variarse dependiendo de la cantidad de ácido nucleico disponible o la cantidad óptima de molde requerida para una amplificación eficaz. Los cebadores para uso en los métodos y kits de la presente invención son típicamente oligonucleótidos, teniendo típicamente una longitud de al menos aproximadamente 5 nucleótidos a aproximadamente 80 nucleótidos, más típicamente aproximadamente 10 nucleótidos de longitud a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud e incluso más típicamente aproximadamente 15 nucleótidos de longitud a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. El experto en la técnica reconocerá que los cebadores descritos en la presente memoria pueden ser útiles para varias aplicaciones diferentes, incluyendo pero no limitado a PCR, RT-PCR, y uso de sondas para la detección de secuencias SXT o CYR.
Dichos cebadores pueden prepararse por cualquier método adecuado, incluyendo, por ejemplo, síntesis química directa o clonación y restricción de las secuencias apropiadas. No todas las bases en el cebador necesitan reflejar la secuencia de la molécula de molde con la que hibridará el cebador, el cebador sólo necesita contener suficientes bases complementarias para permitir que el cebador hibride con el molde. Un cebador también puede incluir bases con emparejamiento erróneo en una o más posiciones, siendo bases que no son complementarias a las bases en el
molde, sino que se diseñan para incorporar cambios en el ADN después de la extensión o amplificación de las bases. Un cebador puede incluir bases adicionales, por ejemplo, en la forma de una secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción en el extremo 5', para facilitar la clonación del ADN amplificado.
La invención proporciona un método para detectar un organismo cianotóxico tomando como base la detección de uno o más de SXT gen 6 (sxtA), SXT gen 9 (sxtG), SXT gen 10 (sxtH), SXT gen 11 (sxtI) y SXT gen 17 (sxtX) (SEQ ID NOS: 14, 20, 22, 24, y 36 respectivamente), o fragmentos o variantes de éstos. Adicionalmente o alternativamente, un organismo cianotóxico puede detectarse tomando como base la detección de uno o más de los siguientes polipéptidos SXT: SXTA (SEQ ID NO: 15), SXTG (SEQ ID NO: 21), SXTH (SEQ ID NO: 23), SXTI (SEQ ID NO: 25), SXTX (SEQ ID NO: 37), o fragmentos o variantes de éstos.
El experto en la técnica reconocerá que cualesquiera cebadores capaces de amplificar las secuencias SXT y/o CYR indicadas, o variantes o fragmentos de éstas, son adecuados para uso en los métodos de la invención. Por ejemplo, las parejas de cebador de oligonucleótido adecuadas para la amplificación por PCR de SXT gen 6 (sxtA) puede comprender un primer cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 70 y un segundo cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 71, un primer cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 72 y un segundo cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 73, un primer cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 74 y un segundo cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 75, un primer cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 76 y un segundo cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 77, un primer cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 78 y un segundo cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 79, un primer cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 113 y un segundo cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 114, o un primer cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 115 o SEQ ID NO: 116 y un segundo cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 117.
Las parejas de cebador de oligonucleótido adecuadas para la amplificación de SXT gen 9 (sxtG) pueden comprender un primer cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 118 y un segundo cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 119, o un primer cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 120 y un segundo cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 121.
Las parejas de cebador de oligonucleótido adecuadas para la amplificación de SXT gen 10 (sxtH) pueden comprender un primer cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 122 y un segundo cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 123.
Las parejas de cebador de oligonucleótido adecuadas para la amplificación de SXT gen 11 (sxtI) pueden comprender un primer cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 124 o SEQ ID NO: 125 y un segundo cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 126, o un primer cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 127 y un segundo cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 128.
Las parejas de cebador de oligonucleótido adecuadas para la amplificación de SXT gen 17 (sxtX) pueden comprender un primer cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 129 y un segundo cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 130, o un primer cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 131 y un segundo cebador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 132.
El experto en la técnica reconocerá qué fragmentos y variantes de las parejas de cebador mencionadas anteriormente también pueden amplificar eficazmente las secuencias de SXT gen 6 (sxtA), SXT gen 9 (sxtG), SXT gen 10 (sxtH), SXT gen 11 (sxtI) o SXT gen 17 (sxtX).
En determinadas realizaciones de la invención, se detectan secuencias de polinucleótidos derivadas del gen de CYR tomando como base la detección de CYR gen 8 (cyrJ) (SEQ ID NO: 95). Las parejas de cebador de oligonucleótido adecuadas para la amplificación por PCR de CYR gen 8 (cyrJ) pueden comprender un primer cebador que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 111 o un fragmento o variante de éste y un segundo cebador que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 112 o un fragmento de éste.
También están incluidas en el alcance de la presente invención variantes y fragmentos de los cebadores de oligonucleótido ejemplificados. El experto en la técnica también reconocerá que la invención no está limitada al uso de los cebadores específicos ejemplificados, y que también pueden usarse secuencias cebadoras alternativas, siempre que los cebadores se diseñen apropiadamente de manera que se permita la amplificación de secuencias SXT y/o CYR. Las secuencias de cebador adecuadas pueden determinarse por los expertos en la técnica usando procedimientos rutinarios sin experimentación excesiva. La localización de cebadores adecuados para la amplificación de secuencias SXT y/o CYR puede determinarse por factores tales como el contenido G+C y la capacidad de una secuencia de formar estructuras secundarias no deseadas.
Los métodos adecuados de análisis de los ácidos nucleicos amplificados son muy conocidos para los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York); Ausubel F. M. et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology (2007), John Wiley and Sons, Inc; y Maniatis et al. Molecular Cloning (1982), 280-281. Los métodos adecuados de análisis de los ácidos nucleicos amplificados incluyen, por ejemplo, electroforesis en gel que puede estar precedida o no de digestión con enzimas de restricción, y/o secuenciación de ácidos nucleicos. La
electroforesis en gel puede comprender electroforesis en gel de agarosa o electroforesis en gel de poliacrilamida, técnicas usadas comúnmente por los expertos en la técnica para la separación de fragmentos de ADN tomando como base el tamaño. La concentración de agarosa o poliacrilamida en el gel determina en gran medida la capacidad de resolución del gel y la concentración apropiada de agarosa o poliacrilamida dependerá por lo tanto del tamaño de los fragmentos de ADN que se quieren distinguir.
En otras realizaciones de la invención, los polinucleótidos SXT y CYR y variantes o fragmentos de éstos pueden detectarse por el uso de sondas adecuadas. Las sondas de la invención se basan en las secuencias de los polinucleótidos SXT y/o CYR descritas en la presente memoria. Las sondas son secuencias de nucleótidos con una longitud variable, por ejemplo entre aproximadamente 10 nucleótidos y varios miles de nucleótidos, para uso en la detección de secuencias homólogas, típicamente por hibridación. Las sondas de hibridación de la invención pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN, u otros oligonucleótidos.
Los métodos para el diseño y/o producción de sondas de nucleótidos se conocen generalmente en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Robinson P. J.. et al. (Eds) Current Protocols in Cytometry (2007), John Wiley and Sons, Inc; Ausubel F. M. et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology (2007), John Wiley and Sons, Inc; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York; y Maniatis et al. Molecular Cloning (1982), 280-281. Las sondas de nucleótidos pueden prepararse, por ejemplo, por técnicas de síntesis química, por ejemplo, los métodos de fosfodiéster y fosfotriéster (véase, por ejemplo, Narang S. A. et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown, E. L. (1979) et al. Meth. Enzymol. 68:109; y la Patente U.S. No. 4356270), el método de dietilfósforamidita (véase Beaucage S.L et al. (1981) Tetrahedron Letters, 22:1859-1862). Un método para sintetizar oligonucleótidos en un soporte sólido modificado se describe en la Patente
U.S. No. 4458066.
Las sondas de la invención pueden marcarse por la incorporación de un marcador para facilitar su detección. Las técnicas para marcar y detectar ácidos nucleicos se describen, por ejemplo, en Ausubel F. M. et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology (2007), John Wiley and Sons, Inc. Los ejemplos de marcadores adecuados incluyen moléculas fluorescentes (por ejemplo, acetilaminofluoreno, 5-bromodesoxiuridina, digoxigenina, fluoresceína) e isótopos radiactivos (por ejemplo, 32P, 35S, 3H, 33P). La detección del marcador puede conseguirse, por ejemplo, por técnicas químicas, fotoquímicas, inmunoquímicas, bioquímicas, o espectroscópicas.
Los métodos y kits de la invención también engloban el uso de anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a los polipéptidos de la invención. Los anticuerpos pueden usarse para detectar y analizar cualitativamente o cuantitativamente uno o más polipéptidos SXT o CYR en una muestra dada. Los métodos para la generación y uso de anticuerpos son conocidos generalmente en la técnica y se describen, por ejemplo, en Harlow y Lane (Eds) Antibodies - A Laboratory Manual, (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y: Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (1986) 2a ed; y Kohler y Milstein, (1975) Nature 256: 495-497. Los anticuerpos pueden conjugarse con un fluorocromo que permite la detección, por ejemplo, por citometría de flujo, inmunohistoquímica u otros medios conocidos en la técnica. Alternativamente, el anticuerpo puede unirse a un sustrato que permite la detección colorimétrica o quimioluminiscente. La invención también contempla el uso de anticuerpos secundarios capaces de unirse a uno o más anticuerpos capaces de unirse específicamente a los polipéptidos de la invención.
La invención también proporciona kits para la detección de organismos cianotóxicos y/o cianobacterias, y/o dinoflagelados. En general, los kits de la invención comprenden al menos un agente para detectar la presencia de uno más polinucleótidos o polipéptidos SXT y/o CYR descritos en la presente memoria, o una variante o fragmento de éstos. En el kit puede incluirse cualquier agente adecuado capaz de detectar secuencias SXT y/o CYR de la invención. Los ejemplos no limitativos incluyen cebadores, sondas y anticuerpos.
En un aspecto, la invención proporciona un kit para la detección de cianobacterias, comprendiendo el kit al menos un agente para detectar la presencia de uno o más polinucleótidos o polipéptidos SXT como se describe en la presente memoria, o una variante o fragmento de éstos.
El polinucleótido SXT puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, y variantes y fragmentos de éstas.
Alternativamente, el polinucleótido SXT puede ser un ARN o ADNc codificado por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, y
variantes y fragmentos de éstas y/o polipéptidos como se describe en la presente memoria, o una variante o fragmento de éstos.
El polipéptido SXT puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 69, y variantes y fragmentos de éstas.
También se proporciona un kit para la detección de organismos cianotóxicos. El kit comprende al menos un agente para detectar la presencia de uno o más polinucleótidos o polipéptidos SXT como se describe en la presente memoria, o una variante o fragmento de éstos.
El polinucleótido SXT puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 36, y variantes y fragmentos de éstas.
Alternativamente, el polinucleótido SXT puede ser un ARN o ADNc codificado por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 36, y variantes y fragmentos de éstas.
El polipéptido SXT puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 37, y variantes y fragmentos de éstas.
El al menos un agente puede ser cualquier reactivo adecuado para la detección de polinucleótidos y/o polipéptidos SXT descritos en la presente memoria. Por ejemplo, el agente puede ser un cebador, un anticuerpo o una sonda. Sólo como ejemplificación, los cebadores o sondas pueden comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, y variantes y fragmentos de éstas.
En determinadas realizaciones de la invención, los kits para la detección de cianobacterias u organismos cianotóxicos pueden comprender además al menos un agente adicional capaz de detectar una o más secuencias de polinucleótido CYR y/o polipéptido CYR como se describe en la presente memoria, o una variante o fragmento de éstas.
El polinucleótido CYR puede comprender un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, y variantes y fragmentos de éstas.
Alternativamente, el polinucleótido CYR puede comprender un ácido ribonucleico o ADN complementario codificado por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, y variantes y fragmentos de éstas.
El polipéptido CYR puede comprender un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, y SEQ ID NO: 110, y variantes y fragmentos de éstas.
El al menos un agente adicional puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en cebadores, anticuerpos y sondas. Un cebador o sonda adecuado puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, y variantes y fragmentos de éstas.
En otro aspecto, la invención proporciona un kit para la detección de cianobacterias, comprendiendo el kit al menos un agente para detectar la presencia de uno o más polinucleótidos o polipéptidos CYR como se describe en la presente memoria, o una variante o fragmento de éstos.
El polinucleótido CYR puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, y variantes y fragmentos de éstas.
Alternativamente, el polinucleótido CYR puede ser un ARN o ADNc codificado por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, y variantes y fragmentos de éstas.
El polipéptido CYR puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, y SEQ ID NO: 110, y variantes o fragmentos de éstas.
En determinadas realizaciones de la invención, los kits para detectar cianobacterias que comprenden uno o más agentes para la detección de secuencias CYR o variantes o fragmentos de éstas, pueden comprender además al menos un agente adicional capaz de detectar uno o más de los polinucleótidos SXT y/o polipéptidos SXT descritos en la presente memoria, o variantes o fragmentos de éstos.
El polinucleótido SXT puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, y variantes y fragmentos de éstas.
Alternativamente, el polinucleótido SXT puede ser un ARN o ADNc codificado por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ m NO: 66, SEQ ID NO: 68, y variantes y fragmentos de éstas y/o polipéptidos como se describe en la presente memoria, o una variante o fragmento de éstos.
El al menos un agente puede ser cualquier reactivo adecuado para la detección de polinucleótidos y/o polipéptidos CYR descritos en la presente memoria. Por ejemplo, el agente puede ser un cebador, un anticuerpo o una sonda. Sólo como ejemplificación, los cebadores o sondas pueden comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, y variantes y fragmentos de éstas.
También se proporciona un kit para la detección de dinoflagelados, comprendiendo el kit al menos un agente para detectar la presencia de uno o más polinucleótidos o polipéptidos SXT como se describe en la presente memoria, o una variante o fragmento de éstos.
El polinucleótido SXT puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, y variantes y fragmentos de éstas.
Alternativamente, el polinucleótido SXT puede ser un ARN o ADNc codificado por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, y variantes y fragmentos de éstas y/o polipéptidos como se describe en la presente memoria, o una variante o fragmento de éstos.
El polipéptido SXT puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 69, y variantes y fragmentos de éstas.
En general, los kits de la invención pueden comprender cualquier número de componentes adicionales. Como ejemplos no limitativos, los componentes adicionales pueden incluir, reactivos para cultivo celular, muestras de referencia, tampones, marcadores, e instrucciones escritas para llevar a cabo el ensayo de detección.
Métodos de cribado
Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención, y fragmentos y análogos de éstos son útiles para el cribado e identificación de compuestos y agentes que interaccionan con estas moléculas. En particular, los compuestos deseables son aquellos que modulan la actividad de estos polipéptidos y polinucleótidos. Dichos compuestos pueden ejercer un efecto modulador mediante la activación, estimulación, incremento, inhibición o prevención de la expresión o actividad de los polipéptidos y/o polinucleótidos. Los compuestos adecuados pueden ejercer su efecto mediante una interacción directa (por ejemplo, unión) o indirecta.
Los compuestos que se unen, o interaccionan de otra manera, con los polipéptidos y polinucleótidos de la invención, y específicamente los compuestos que modulan su actividad, pueden identificarse mediante una variedad de métodos adecuados. Los métodos no limitativos incluyen el método de dos híbridos, co-inmunoprecipitación, purificación por afinidad, espectroscopía de masas, purificación por afinidad en tándem, exposición en fago, transferencia de marcaje, micromatrices de ADN/coexpresión génica y micromatrices de proteínas.
Por ejemplo, un ensayo de dos híbridos puede usarse para determinar si un agente candidato o una pluralidad de agentes candidatos interacciona o se une a un polipéptido de la invención o una variante o fragmento de éste. El sistema de ensayo de dos híbridos en levaduras es un ensayo genético basado en levaduras usado típicamente para detectar interacciones proteína-proteína (Fields y Song., Nature 340: 245-246 (1989)). El ensayo usa la naturaleza multi-dominio de activadores transcripcionales. Por ejemplo, el dominio de unión a ADN de un activador transcripcional conocido puede fusionarse con un polipéptido de la invención o una variante o fragmento de éste, y el dominio de activación del activador transcripcional fusionarse con el agente candidato. La interacción entre el agente candidato y el polipéptido de la invención o una variante o fragmento de éste, acercará mucho los dominios de unión a ADN y de activación del activador transcripcional. La transcripción posterior de un gen informador específico activada por el activador transcripcional permite la detección de una interacción.
En una modificación de la técnica anterior, puede construirse una proteína de fusión fusionando el polipéptido de la invención o una variante o fragmento de éste a una etiqueta detectable, por ejemplo fosfatasa alcalina, y usar una forma modificada de inmunoprecipitación como describen Flanagan y Leder (Flanagan y Leder, Cell 63:185-194 (1990))
Alternativamente, puede usarse co-inmunoprecipitación para determinar si un agente candidato o una pluralidad de agentes candidatos interacciona o se une a un polipéptido de la invención o una variante o fragmento de éste. Usando esta técnica, los organismos cianotóxicos, cianobacterias y/o dinoflagelados pueden lisarse en condiciones no desnaturalizantes adecuadas para la conservación de las interacciones proteína-proteína. La disolución resultante puede incubarse con un anticuerpo específico para un polipéptido de la invención o una variante o fragmento de éste e inmunoprecipitarse de la disolución en bruto, por ejemplo por captura con una proteína de unión a anticuerpo unida a un soporte sólido. La inmunoprecipitación del polipéptido de la invención o una variante o fragmento de éste por este método facilita la co-inmunoprecipitación de un agente asociado con esa proteína. La identificación de un agente asociado puede establecerse usando varios métodos conocidos en la técnica, incluyendo pero no limitado a SDS-PAGE, transferencia western y espectrometría de masas.
Alternativamente, puede usarse el método de exposición en fago para determinar si un agente candidato o una pluralidad de agentes candidatos interacciona o se une a un polipéptido de la invención o una variante o fragmento de éste. La exposición en fago es un ensayo para cribar interacciones proteicas mediante la integración de múltiples genes de un banco de genes en fagos. Con este método, se usan técnicas de ADN recombinante para expresar numerosos genes como fusiones con la proteína de cubierta de un bacteriófago de manera que el producto de péptido o proteína de cada gen se expone en la superficie de la partícula viral. De esta manera puede producirse una biblioteca completa de péptidos o productos proteicos de interés expuestos en fagos. Las bibliotecas resultantes de péptidos o productos proteicos expuestos en fagos puede cribarse para la capacidad de unirse a un polipéptido de la invención o una variante o fragmento de éste. El ADN extraído de fagos que interaccionan contiene las secuencias de las proteínas que interaccionan.
Alternativamente, puede usarse cromatografía de afinidad para determinar si un agente candidato o una pluralidad de agentes candidatos interacciona o se une a un polipéptido de la invención o una variante o fragmento de éste. Por ejemplo, un polipéptido de la invención o una variante o fragmento de éste, puede inmovilizarse en un soporte (tal como sefarosa) y pasar lisados celulares sobre la columna. Las proteínas que se unen al polipéptido inmovilizado de la invención o una variante o fragmento de éste pueden eluirse de la columna e identificarse, por ejemplo por secuenciación de aminoácidos N-terminal.
Los moduladores potenciales de la actividad de los polipéptidos de la invención pueden generarse por cribado por los métodos anteriores mediante varias técnicas conocidas para los expertos en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse métodos tales como cristalografía con rayos X y espectroscopía de resonancia magnética nuclear para modelar la estructura de polipéptido de la invención o una variante o fragmento de éste, facilitando así el diseño de agentes moduladores potenciales usando modelado basado en ordenador. También pueden usarse varias formas de química combinatona para generar posibles moduladores.
Los polipéptidos de la invención y las variantes o fragmentos de éstos apropiados, pueden usarse en cribados de alto rendimiento para ensayar compuestos candidatos para la capacidad de unirse a, o interaccionar de otra manera, con ellos. Estos compuestos candidatos pueden cribarse además frente a polipéptidos funcionales para determinar el efecto del compuesto sobre la actividad del polipéptido.
La presente invención también contempla compuestos que pueden ejercer su efecto modulador en polipéptidos de la invención alterando la expresión del polipéptido. En este caso, dichos compuestos pueden identificarse comparando el nivel de expresión del polipéptido en presencia de un compuesto candidato con el nivel de expresión en ausencia del compuesto candidato.
Se apreciará que los métodos descritos anteriormente son meramente ejemplos de los tipos de métodos que pueden utilizarse para identificar agentes capaces de interaccionar con, o modular la actividad de polipéptidos de la invención o variantes o fragmentos de éstos. Otros métodos adecuados serán conocidos para los expertos en la técnica y están en el alcance de esta invención.
Usando los métodos descritos anteriormente, puede identificarse que un agente es un agonista de un polipéptido de la invención o una variante o fragmento de éste. Los agentes que son agonistas aumentan una o más de las actividades biológicas del polipéptido. Alternativamente, los métodos descritos anteriormente pueden identificar un agente que es un antagonista de un polipéptido de la invención o una variante o fragmento de éste. Los agentes que son antagonistas retardan una o más de las actividades biológicas del polipéptido.
Los anticuerpos pueden actuar como agonistas o antagonistas de un polipéptido de la invención o una variante o fragmento de éste. Preferiblemente, los anticuerpos adecuados se preparan a partir de regiones o fragmentos discretos de los polipéptidos de la invención o variantes o fragmentos de éstos. Una parte antigénica de un polinucleótido de interés puede tener cualquier longitud apropiada, tal como aproximadamente 5 a aproximadamente 15 aminoácidos. Preferiblemente, una parte antigénica contiene al menos aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ó 14 residuos de aminoácidos.
Los métodos para la generación de anticuerpos adecuados serán apreciados fácilmente por los expertos en la técnica. Por ejemplo, puede prepararse un anticuerpo monoclonal específico para un polipéptido de la invención o una variante o fragmento de éste que contiene típicamente partes Fab, usando tecnología de hibridoma descrita en Antibodies-A Laboratory Manual, Harlow y Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1988).
En esencia, en la preparación de anticuerpos monoclonales dirigidos frente a un polipéptido de la invención o una variante o fragmento de éste, puede usarse cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Éstas incluyen la técnica de hibridoma desarrollada originalmente por Kohler et al., Nature, 256:495-497 (1975), así como la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., Immunology Today, 4:72 (1983)), y la técnica de hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77- 96, Alan R. Liss, Inc., (1985)). Pueden crearse líneas celulares inmortales que producen anticuerpo por técnicas distintas de la fusión, tal como transformación directa de linfocitos B con ADN oncogénico, o transfección con el virus de Epstein-Barr. Véase, por ejemplo, M. Schreier et al., "Hybridoma Techniques" Cold Spring Harbor Laboratory, (1980); Hammerling et al., "Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas" Elsevier/North-Holland Biochemical Press, Amsterdam (1981); y Kennett et al., "Monoclonal Antibodies", Plenum Press (1980).
Brevemente, un medio para producir un hibridoma a partir del cual se produce el anticuerpo monoclonal, un mieloma u otra línea celular que se perpetúe por sí misma se fusiona con linfocitos obtenidos del bazo de un mamífero hiperinmunizado con una parte de unión a un factor de reconocimiento de éste, o factor de reconocimiento, o una parte de unión a ADN específica de origen de éste. Los hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal útil en la práctica de esta invención se identifican por su capacidad de inmunoreaccionar con los presentes factores de reconocimiento y su capacidad para inhibir actividad transcripcional especificada en células diana.
Un anticuerpo monoclonal útil en la práctica de la invención puede producirse iniciando un cultivo de hibridoma monoclonal que comprende un medio nutritivo que contiene un hibridoma que secreta moléculas de anticuerpo con la especificidad de antígeno apropiada. El cultivo se mantiene en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para que el hibridoma secrete las moléculas de anticuerpo en el medio. El medio que contiene el anticuerpo se recoge. Las moléculas de anticuerpo pueden aislarse adicionalmente por técnicas muy conocidas.
De manera similar, existen varios procedimientos conocidos en la técnica que pueden usarse para la producción de anticuerpos policlonales. Para la producción de anticuerpos policlonales frente a un polipéptido de la invención o una variante o fragmento de éste, pueden inmunizarse varios animales huésped por inyección con un polipéptido de la invención, o una variante o fragmento de éste, incluyendo pero no limitado a conejos, pollos, ratones, ratas, ovejas, cabras, etc. Además, la variante de polipéptido o fragmento de éste puede conjugarse con un vehículo inmunogénico (por ejemplo, albúmina de suero bovino (BSA) o hemocianina de lapa (KLH)). También, pueden usarse varios adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica, incluyendo pero no limitado a adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como risolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianinas de lapa,
dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.
El cribado para el anticuerpo deseado también puede conseguirse por una variedad de técnicas conocidas en la técnica. Los ensayos para unión inmunoespecífica de anticuerpos pueden incluir, ero no están limitados a, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), inmunoensayos en sandwich, ensayos inmunoradiométricos, reacciones de precipitación por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ, transferencias Western, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A, y ensayos de inmunoelectroforesis, y semejantes (véase, por ejemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York (1994)). La unión de anticuerpo puede detectarse mediante un marcador detectable en el anticuerpo primario. Alternativamente, el anticuerpo puede detectarse mediante su unión con un anticuerpo secundario o reactivo que está marcado apropiadamente. En la técnica se conoce una variedad de métodos para detectar la unión en un inmunoensayo y se incluyen en el alcance de la presente invención.
El anticuerpo (o fragmento de éste) producido frente a un polipéptido de la invención o una variante o fragmento de éste, tiene afinidad de unión para esa proteína. Preferiblemente, el anticuerpo (o fragmento de éste) tiene afinidad de unión o avidez mayor de aproximadamente 105M-1, más preferiblemente mayor de aproximadamente 106M-1, más preferiblemente aún mayor de aproximadamente 107M-1 y lo más preferiblemente mayor de aproximadamente
108M-1 .
En términos de obtener una cantidad adecuada de un anticuerpo según la presente invención, se puede fabricar el o los anticuerpos usando fermentación discontinua con medio sin suero. Después de fermentar el anticuerpo puede purificarse mediante un procedimiento con múltiples etapas que incorpora etapas de cromatografía e inactivación/eliminación viral. Por ejemplo, el anticuerpo puede separarse en primer lugar por cromatografía por afinidad de Proteína A y tratarse con disolvente/detergente para inactivar cualesquiera virus con cubierta lipídica. Puede usarse purificación adicional, típicamente por cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, para eliminar proteínas residuales, disolventes/detergentes y ácidos nucleicos. El anticuerpo purificado puede purificarse además y formularse en disolución salina al 0,9% usando columnas de filtración en gel. La preparación bruta formulada puede esterilizarse y filtrarse para virus y dispensarse.
Las realizaciones de la invención pueden utilizar tecnología antisentido para inhibir la expresión de un ácido nucleico de la invención o un fragmento o variante de éste mediante el bloqueo de la traducción del polipéptido codificado. La tecnología antisentido se aprovecha del hecho de que los ácidos nucleicos se emparejan con secuencias complementarias. Las moléculas antisentido adecuadas pueden fabricarse por síntesis química o, en el caso de ARN antisentido, por transcripción in vitro o in vivo cuando se une a un promotor, por métodos conocidos para los expertos en la técnica.
Por ejemplo, pueden generarse oligonucleótidos antisentido, típicamente con una longitud de 18-30 nucleótidos, que son al menos sustancialmente complementarios a lo largo de su longitud con una región de la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de interés. La unión del oligonucleótido antisentido a sus secuencias de nucleótidos celulares complementarias puede interferir con la transcripción, procesamiento del ARN, transporte, traducción y/o estabilidad del ARNm. Pueden prepararse oligonucleótidos antisentido adecuados por métodos muy conocidos para los expertos en la técnica y pueden diseñarse para tomar como diana y unirse a regiones reguladoras de la secuencia de nucleótidos o a secuencias codificadoras (gen) o no codificadoras (región intergénica). Típicamente, los oligonucleótidos antisentido se sintetizarán en sintetizadores automáticos. Los oligonucleótidos antisentido adecuados pueden incluir modificaciones diseñadas para mejorar su administración a células, su estabilidad una vez dentro de una célula, y/o su unión a la diana apropiada. Por ejemplo, el oligonucleótidos antisentido puede modificarse por la adición de una o más uniones fósforotioato, o la inclusión de uno o anillos morfolina en el núcleo (denominados oligonucleótidos 'morfolino').
Puede usarse una tecnología antisentido alternativa, conocida como ARN de interferencia (ARNi), según métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo WO 99/49029 y WO 01/70949), para inhibir la expresión de un polinucleótido. ARNi se refiere a un medio de silenciamiento génico selectivo posterior a la transcripción por la destrucción de ARNm específicos por moléculas pequeñas de ARN de interferencia (ARNsi). El ARNsi se genera por la escisión de ARN bicatenario, en el que una cadena es idéntica al mensaje que se quiere inactivar. Pueden sintetizarse moléculas de ARN bicatenario en las que una cadena es idéntica a una región específica del transcrito de ARNm de p53 e introducirse directamente. Alternativamente, puede emplearse el ADNds correspondiente, que, una vez presentado intracelularmente se convierte en ARNds. Los métodos para la síntesis de moléculas adecuadas para uso en ARNi y para conseguir el silenciamiento génico posterior a la trascripción son conocidos para los expertos en la técnica.
Un medio adicional para inhibir la expresión puede conseguirse introduciendo construcciones de ácido nucleico antisentido catalítico, tales como ribozimas, que son capaces de escindir los transcritos de ARNm y evitar, de esta manera, la producción de proteína de tipo salvaje. Las ribozimas están dirigidas a e hibridan con una secuencia particular debido a dos regiones de complementariedad de secuencia con la diana que flanquea el sitio catalítico de la ribozima. Después de la unión, la ribozima escinde la diana de una manera específica de sitio. El diseño y ensayo
de ribozimas que reconocen y escinden específicamente secuencias de interés puede conseguirse por técnicas muy conocidas para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Lieber y Strauss, 1995, Molecular and Cellular Biology, 15:540-551.
La invención se describirá ahora con referencia a ejemplos específicos, que no debe considerarse que limitan de ninguna manera el alcance de la invención.
Ejemplos
La invención se describirá ahora con referencia a ejemplos específicos, que no debe considerarse que limitan de ninguna manera el alcance de la invención.
Ejemplo 1: Cultivos de cianobacterias y caracterización de la agrupación de genes SXT.
Las cepas de cianobacterias usadas en el presente estudio (Figura 1) se crecieron en medio Jaworski en cultivo discontinuo estático a 26°C bajo iluminación continua (10 µmoles m-2 s-1). El ADN genómico total se extrajo se las células cianobacterianas por lisis con lisozima/SDS/proteinasa K seguido de extracción con fenol-cloroformo como se describe en Neilan, B. A. 1995.. Appl Environ Microbiol 61:2286-2291. El ADN en el sobrenadante se precipitó en 2 volúmenes de etanol a - 20°C, se lavó con etanol al 70%, se disolvió en tampón TE (10:1), y se almacenó a - 20°C. Las secuencias de cebadores de PCR usadas para la amplificación de ORF de sxt se muestran en la Figura 1B).
Los amplicones de PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa en tampón TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA, pH 7,8), y se visualizaron por transiluminación UV después de teñir con bromuro de etidio (0,5 µg/ml). La secuenciación de regiones desconocidas de ADN se realizó por PCR mediada por adaptador como se describe en Moffitt et al. (2004) Appl. Environ. Microbiol. 70:6353-6362. La secuenciación automatizada del ADN se realizó usando el sistema de secuenciación PRISM Big Dye cycle y un secuenciador modelo 373 (Applied Biosystems). Los datos de secuencia se analizaron usando software ABI Prism-Autoassembler, y se determinó el porcentaje de similitud e identidad con otras secuencias traducidas usando BLAST conjuntamente con National Center for Biotechnology Information (NIH), Fugue blast (http://www-cryst.bioc.cam.ac.uk/fugue/) se usó para identificar homólogos distantes mediante comparaciones secuencia-estructura. Las agrupaciones de genes sxt se ensamblaron usando el software Phred, Phrap, y Consed (http://www.phrap.org/phredphrapconsed.html), y los marcos de lectura abiertos se identificaron manualmente. El número de registro GenBank para la agrupación de genes sxt de C. raciborskii T3 es DQ787200.
Ejemplo 2: Análisis espectrométrico de intermedios SXT.
Los extractos bacterianos y estándares SXT se analizaron por HPLC (Thermo Finnigan Surveyor HPLC y automuestreador) acoplada con un espectrómetro de masa con trampa de iones (Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus) ajustado con una fuente de electropulverización. La separación de los analitos se obtuvo en una columna 2,1 mm x 150 mm Phenomenex Luna 3 micrómetros C18 a 100 mL/min. El análisis se realizó usando un gradiente empezando en 5% acetonitrilo en 10 mM ácido heptafluorobutírico (HFBA). Éste se mantuvo durante 10 min, y se subió hasta 100% acetonitrilo, durante 30 min. Las condiciones se mantuvieron a 100% acetonitrilo durante 10 min para lavar la columna y se volvió a 5% acetonitrilo en 10 mM HFBA y de nuevo se mantuvo durante 10 min para equilibrar la columna para la siguiente muestra. Esto resultó en un tiempo de corrida de 60 min por muestra. Se inyectaron volúmenes de muestra de 10-100 mL para cada análisis. El eluato de HPLC se introdujo directamente en la fuente de electropulverización, que se programó como sigue: voltaje de electropulverización 5 kV, caudal de gas protector 30 unidades arbitrarias, caudal del gas auxiliar 5 unidades arbitrarias. La temperatura capilar fue 200°C y tenía un voltaje de 47 V. Las ópticas iónicas se optimizaron para una sensibilidad máxima antes del análisis de la muestra usando la función autoajuste del instrumento con una disolución de toxina estándar. Los espectros de masas se adquirieron en el modo centroide sobre el rango m/z 145-650. El ajuste del rango de masa fue 'normal', con 200 ms de tiempo de inyección máximo de ión y control de ganancia automático (AGC) encendido. Se obtuvieron espectros de masa en tándem sobre un rango m/z relevante para el ión precursor. La energía de colisión fue típicamente 20-30 unidades arbitrarias ThermoFinnigan, y se optimizó para información máxima usando estándares cuando estaban disponibles.
Ejemplo 3: Identificación y secuenciación de la agrupación de genes SXT en Cylindrospermopsis raciborskii T3
La O-carbamoiltransferasa se detectó inicialmente en C. raciborskii T3 mediante PCR degenerada, y posteriormente se denominó sxtI. La investigación adicional mostró que los homólogos de sxtI estaban presentes exclusivamente en cepas productoras de toxina SXT de cuatro géneros de cianobacterias (Tabla 1), representando así un buen gen candidato en la biosíntesis de toxina SXT. La secuencia de la agrupación de genes biosintéticos de SXT (sxt) posible se obtuvo por paseo genómico en de sxtI en C. raciborskii T3 (Figura 3). En C. raciborskii T3, esta agrupación de genes sxt abarca aproximadamente 35000 pb, que codifican 31 marcos de lectura abiertos (Figura 2). La agrupación también incluía otros genes que codifican enzimas de la biosíntesis de SXT, incluyendo una metiltransferasa (sxtA1), una aminotransferasa a clase II (sxtA4), una amidinotransferasa (sxtG), dioxigenasas (sxtH), además de la Ocarbamoiltransferasa (sxtI). El cribado por PCR de marcos de lectura abiertos de sxt seleccionados en cepas de cianobacterias tóxicas y no tóxicas mostró que estaban presentes exclusivamente en aislados productores de toxina SXT (Figura 1A), indicando la asociación de estos genes con el fenotipo tóxico. En los pasajes siguientes
describimos los marcos de lectura abiertos en la agrupación de genes stx posible y sus funciones predichas, tomando como base análisis bioinformáticos, datos de LCMS/MS sobre intermedios biosintéticos y biosíntesis in vitro, cuando es aplicable.
Ejemplo 4: Predicción funcional de los genes biosintéticos de la molécula parental SXT
El análisis bioinformático de la agrupación de genes sxt reveló que contiene un ejemplo no descrito previamente de una estructura semejante a poliquétido sintasa (PKS), denominado sxtA. SxtA posee cuatro dominios catalíticos, SxtA1 a SxtA4. Una búsqueda iterada en PSI-blast reveló una baja homología de secuencia de SxtA1 con metiltransferasas dependientes de S-adenosilmetionina (SAM). Los análisis adicionales revelaron la presencia de tres restos de secuencia conservados en SxtA1 (278-ITDMGCGDG- 286, 359-DPENILHI-366, y 424-VVNKHGLMIL433) que son específicos para las metiltransferasas dependientes de SAM. SxtA2 está relacionado con N-acetil transferasas relacionadas con GCN5 (GNAT). GNAT catalizan la transferencia de acetato de acetil-CoA a varios heteroátomos, y se ha indicado en asociación con otras PKS no convencionales, tales como PedI, en las que cargan la proteína transportadora de acilo (ACP) con acetato. SxtA3 está relacionado con una ACP, y proporciona un sitio de unión a fosfopanteteinilo. SxtA4 es homólogo a aminotransferasas de clase II y fue lo más similar a 8-amino-7oxononanoato sintasa (AONS). Las aminotransferasas de clase II son un grupo monofilético de enzimas dependientes de piridoxal fosfato (PLP), y son las únicas enzimas que se sabe que realizan condensaciones de Claisen de aminoácidos. Por lo tanto, razonamos que sxtA realiza la primara etapa en la biosíntesis de SXT, que implica una condensación de Claisen.
La secuencia de reacción predicha de SxtA, tomando como base su estructura primaria, es la carga de la ACP (SxtA3) con acetato de acetil-CoA, seguido de la metilación catalizada por SxtA1 de acetil-ACP, convirtiéndola en propionil-ACP. El dominio de aminotransferasa de clase II, SxtA4, realizaría entonces una condensación de Claisen entre propionil-ACP y arginina (Figura 4). El producto posible de SxtA es así 4-amino-3-oxoguanidinoheptano que se designa aquí como Compuesto A', (Figura 4). Para verificar esta ruta para la biosíntesis de SXT tomando como base análisis comparativos de secuencias génicas, se cribaron extractos celulares de C. raciborskii T3 por LC-MS/MS para la presencia del compuesto A' (Figura 5) así como arginina y SXT como controles. Se detectaron fácilmente arginina y SXT (Figura 5) y produjeron los iones de fragmento esperados. Por otra parte, los datos de LC-MS/MS obtenidos de m/z 187 fueron consistentes con la presencia de la estructura A de C. raciborskii T3 (Figura 5). Los espectros de MS/MS mostraron el ión fragmento esperado (m/z 170, m/z 128) después de la pérdida de amoniaco y guanidina de A'. Los datos de LC-MS/MS apoyaron fuertemente la función predicha de SxtA y así una reacción de iniciación revisada en la ruta de biosíntesis de SXT.
sxtG codifica una amidinotransferasa posible, que tenía la mayor similitud de secuencia de aminoácidos con Larginina:lisina amidinotransferasas. Se propone que el producto de SxtA es el sustrato para la amidinotransferasa SxtG, que transfiere un grupo amidino de arginina al grupo a-amino A' (Figura 4), produciendo así 4,7-diguanidino-3oxoheptano designado compuesto B' (Figura 3). Esta secuencia de reacciones hipotética también fue apoyada por la detección de C' por LC-MS/MS (Figura 4). Los extractos celulares de C. raciborskii T3, sin embargo, no contenían niveles mensurables de B' (4,7-diguanidino-3- oxoheptano). Una explicación posible para la falta de detección del intermedio B' es su ciclación rápida para formar C' a través de la acción de SxtB.
La agrupación de genes sxt codifica una enzima, sxtB, similar a las enzimas semejantes a citidina desaminasa de gproteobacterias. El mecanismo catalítico de la citidina desaminasa es una escisión retro-aldol de amoniaco de citidina, que es el mismo mecanismo de reacción en la dirección inversa que la formación del primer heterociclo en la conversión de B' a C' (Figura 4). Por lo tanto, se sugiere que SxtB cataliza esta condensación semejante a retroaldol (etapa 4, Figura 4).
Se estudió la incorporación de metil metionina en SXT, y su hidroxilación. Sólo se retiene un hidrógeno derivado de metil metionina en SXT, y se observó un desplazamiento 1,2-H entre C-5 y C-6 derivados de acetato de SXT. La hidroxilación de la cadena lateral metilo del precursor de SXT se produce mediante la epoxidación de un doble enlace entre el grupo metilo derivado de SAM y el C-6 derivado de acetato. Este patrón de incorporación puede resultar de un ataque electrofílico de metil metionina en el doble enlace entre C-5 y C-6, que se habría formado durante la ciclación precedente. Posteriormente, la nueva cadena lateral metileno se epoxidaría, seguido de la apertura a un aldehído, y posterior reducción a un hidroxilo. La retención de un único hidrógeno derivado de metil metionina, el desplazamiento 1,2-H entre C-5 y C-6, y la ausencia de desplazamiento 1,2-H entre C-1 y C-5 es completamente consistente con los resultados de este estudio, en el que la introducción de metil metionina precede a la formación de los tres heterociclos.
sxtD codifica una enzima con similitud de secuencia con esterol desaturasa y es la única desaturasa candidata presente en la agrupación de genes sxt, se predice que SxtD introduce un doble enlace entre C-1 y C-5 de C', y causa un desplazamiento 1,2-H entre C-5 y C-6 (compuesto D', Figura 3). El producto génico de sxtS tiene homología de secuencia con dioxigenasas dependientes de 2-oxoglutarato (2OG) con hierro no hemo. Éstas son enzimas multifuncionales que pueden realizar reacciones de hidroxilación, epoxidación, desaturación, ciclación, y expansión. Se ha indicado que las 2OG dioxigenasas catalizan la formación oxidativa de heterociclos. SxtS podría, por lo tanto, realizar la epoxidación consecutiva del nuevo doble enlace, y apertura del peróxido a un aldehído con biciclación simultánea. Esto explica la retención de un único hidrógeno derivado de metil metionina, y la ausencia de
un desplazamiento 1,2-H entre C-1 y C-5 de SXT (etapas 5 a 7, Figura 4). SxtU tiene similitud de secuencia con deshidrogenasas de alchol de cadena corta. La enzima más similar con una función conocida es clavaldehído deshidrogenasa (AAF86624), que reduce el aldehído terminal de clavulanato-9-aldehído a un alcohol. Se predice, por lo tanto, que SxtU reduce el grupo aldehído terminal del precursor SXT en la etapa 8 (Figura 4), formando el compuesto E'.
La acción concertada de SxtD, SxtS y SxtU es, por lo tanto, la hidroxilación y biciclado del compuesto C' a E' (Figura 4). Apoyando esta ruta propuesta de la biosíntesis de SXT, LC-MS/MS obtenido de m/z 211 y m/z 225 permitieron la detección de los compuestos C' y E' de C. raciborskii T3 (Figura 5). Por otra parte, no se pudo encontrar evidencia por LC-MS/MS de los intermedios B (m/z 216), y C (m/z 198). Los espectros de MS/MS mostraron los iones fragmento esperados después de la pérdida de amoniaco y guanidina de C', así como la pérdida de agua en el caso de E'.
La detección de E' indicó que las reacciones finales que dan lugar a la molécula SXT completa son la Ocarbamoilación de su grupo hidroxilo libre y una oxidación de C-12. La secuencia real de estas reacciones finales permanece, sin embargo, sin resolver. El producto génico de sxtI es lo más similar a una Ocarbamoiltransferasa predicha de Trichodesmium erythraeum (registro ABG50968) y otras O-carbamoiltransferasas predichas de cianobacterias. Las O-carbamoiltransferasas transfieren invariablemente un grupo carbamoilo de carbamoilfosfato a un grupo hidroxilo libre. Nuestros datos indican que SxtI puede catalizar la transferencia de un grupo carbamoilo de carbamoilfosfato al grupo hidroxilo libre de E'. No se encontraron homólogos de sxtJ y sxtK con una función conocida en las bases de datos, sin embargo, se indicó que los homólogos sxtJ y sxtK estaban codificados frecuentemente adyacentes a genes de O-carbamoiltransferasa.
La agrupación de genes sxt contiene dos genes, sxtH y sxtT, cada uno codificando una subunidad de oxigenasa terminal de fenil-propionato bacteriano y dioxigenasas hidroxilantes de anillo relacionadas. El homólogo más cercano con una función predicha era capreomicidina hidroxilasa de Streptomyces vinaceus, que hidroliza un carbono del anillo (C-6) de capreomicidina. SxtH y SxtT pueden realizar, por lo tanto, una función similar en la biosíntesis de SXT, esto es, la oxidación o hidroxilación y oxidación de C-12, convirtiendo F' en SXT.
Los miembros que pertenecen a fenilpropionato bacteriano y dioxigenasas hidroxilantes de anillo relacionadas son enzimas multi-componente, ya que requieren una oxigenasa reductasa para su regeneración después de cada ciclo catalítico. La agrupación de genes sxt proporciona un sistema de transporte de electrones posible, que cumpliría con esta función. sxtV codifica una ferredoxina 4Fe-4S con alta homología de secuencia con una ferredoxina de Nostoc punctiforme. sxtW era lo más similar a las enzimas semejantes a fumarato reductasa/succinato deshidrogenasea de
A. variabilis y Nostoc punctiforme, seguido de AsfA de Pseudomonas putida. AsfA y AsfB son enzimas implicadas en el transporte de electrones que resultan del catabolismo de aril sulfonatos. SxtV podría extraer posiblemente un par de electrones de succinato, convirtiéndolo en fumarato, y transferir los electrones a través de ferredoxina (SxtW) a SxtH y SxtT.
Ejemplo 5: Análisis comparativo de secuencia y asignación funcional de genes adaptados a SXT
Después de la síntesis de la molécula SXT parental, las enzimas de modificación introducen varios grupos funcionales. Además de SXT, C. raciborskii T3 produce toxinas N-1 hidroxiladas (neoSXT), descarbamoiladas (dcSXT), y N-sulfuriladas (GTX-5), mientras A. circinalis AWQC131C produce toxinas descarbamoiladas (dcSXT), Osulfuriladas (GTX-3/2, dcGTX-3/2), así como tanto O- como N-sulfuriladas (C- 1/2), pero no toxinas N-1 hidroxiladas.
sxtX codifica una enzima con homología con cefalosporina hidroxilasa. sxtX sólo se detectó en C. raciborskii T3, A. flos-aquae NH- 5, y Lyngbya wollei, que producen análogos N-1 hidroxilados de SXT, tal como neoSXT. Este componente de la agrupación de genes no estaba presente en ninguna cepa de A.circinalis, y, por lo tanto, es probablemente la razón por la que esta especie no produce toxinas N-1 hidroxiladas PSP (Figura 1A). La función predicha de SxtX es, por lo tanto, la N-1 hidroxilación de SXT.
A. circinalis AWQC131C y C. raciborskii T3 también producen análogos N-y O-sulfatados de SXT (GTX-5, C-2/3, (dc)GTX- 3/4). Se ha descrito la actividad de dos sulfotransferasas dependientes de 3'-fosfato 5'-fosfosulfato (PAPS), que eran específicas para N- 21 de SXT y GTX-3/2, y O-22 de 11- hidroxi SXT, respectivamente, en el dinoflagelado productor de toxina SXT Gymnodinium catenatum. La agrupación de genes sxt de C. raciborskii T3 codifica una posible sulfotransferasa, SxtN. Una búsqueda PSI-BLAST con SxtN identificó sólo 25 proteínas hipotéticas de función desconocida con un valor E por encima del umbral (0,005). Una búsqueda de biblioteca de perfiles, sin embargo, reveló una relación estructural significativa de SxtN con estrógeno sulfotransferasa (1AQU) (puntuación Z=24,02) y otras sulfotransferasas. SxtN tiene una región N-terminal conservada, que corresponde a la región de unión de adenosina 3'-fosfato5'-fosfosulfato (PAPS) en 1AQU. No se sabe, sin embargo, si SxtN transfiere un grupo sulfato a N-21 o O-22. De forma interesante, la agrupación de genes sxt codifica una adenililsulfato quinasa (APSK), SxtO, cuyos homólogos están implicados en la formación de PAPS (Figura 2). APKS fosforila el producto de ATPsulfurilasa, adenililsulfato, convirtiéndolo en PAPS. Otras agrupaciones de genes biosintéticas que resultan en metabolitos secundarios sulfatados también contienen genes requeridos para la producción de PAPS.
Podrían producirse análogos descarbamoilados de SXT a través de uno de dos hipotéticos escenarios. Se propone que las enzimas que actúan aguas abajo de la carbamoiltransferasa, SxtI, en la biosíntesis de toxinas PSP tienen una amplia especificidad de sustrato, procesando precursores tanto carbamoilados como descarbamoilados de SXT. Alternativamente, puede producirse la escisión hidrolítica del resto carbamoilo de SXT o sus precursores. SxtL está relacionado con GDSL-lipasas, que son enzimas multifuncionales con actividades tioesterasa, arilesterasa, proteasa y lisofosfolipasa. La función de SxtL podría incluir, por lo tanto, la escisión hidrolítica del grupo carbamoilo de análogos de SXT.
Ejemplo 6: Genes SXT asociados en agrupaciones implicados en el transporte de metabolitos
sxtF y sxtM codificaban dos proteínas con alta similitud de secuencia con proteínas de extrusión multifármaco y de compuestos tóxicos (MATE) dirigidas por sodio de la familia NorM. Los miembros de la familia NorM de proteínas MATE son antiportadores dirigidos por sodio bacterianos, que exportan sustancias catiónicas. Todas las toxinas PSP son sustancias catiónicas, excepto las toxinas C que son zwiteriónicas. Por lo tanto, es probable que SxtF y SxtM también estén implicados en la exportación de toxinas PSP. Un estudio mutacional de NorM de V. parahaematolyticus identificó tres residuos cargados negativamente conservados (D32, E251, y D367) que confieren especificidad de sustrato, sin embargo, el mecanismo del reconocimiento del sustrato permanece desconocido. En SxtF, el residuo que corresponde a E251 de NorM está conservado, mientras los correspondientes a D32 y D367 están reemplazados por los aminoácidos neutros asparagina y tirosina, respectivamente. Los residuos correspondientes a D32 y E251 están conservados en SxtM, pero D367 está reemplazado por histidina. Los cambios en los residuos de unión a sustrato pueden reflejar las diferencias en los sustratos de la toxina PSP transportados por estas proteínas.
Ejemplo 7: Reguladores transcripcionales posibles de saxitoxina sintasa
Se ha indicado que los factores medioambientales, tales como disponibilidad de nitrógeno y fosfato regulan la producción de toxinas PSP en dinoflagelados y cianobacterias. Se identificaron dos factores transcripcionales, sxtY y sxtZ, relacionados con PhoU y OmpR, respectivamente, así como un regulador de dos componentes histidina quinasa próximos al extremo 3' de la agrupación de genes sxt en C. raciborskii T3. Las proteínas relacionadas con PhoU son reguladores negativos de la captación de fosfato mientras las proteínas semejantes a OmpR están implicadas en la regulación de una variedad de metabolismos, incluyendo nitrógeno y equilibrio osmótico. Por lo tanto, es probable que la producción de toxina PSP en C. raciborskii T3 esté regulada a nivel transcripcional en respuesta a la disponibilidad de fosfato, así como, otros factores medioambientales.
Ejemplo 8: Orígenes filogenéticos de los genes SXT
La agrupación de genes sxt de C. raciborskii T3 tiene una estructura de mosaico verdadera. Aproximadamente la mitad de los genes sxt de C. raciborskii T3 eran lo más similares a equivalentes de otras cianobacterias, sin embargo, los genes restantes tenían sus concordancias más cercanas con homólogos de proteobacterias, actinomicetes, esfingobacterias, y firmicutes. Existe un número de evidencias creciente de que la transferencia horizontal de genes (HGT) es una fuerza directriz principal detrás de la evolución de genomas procariotas, y se sabe que los genomas de cianobacterias están muy afectados por HGT, implicando frecuentemente transposasas y fagos. El hecho de que la mayoría de los genes sxt esté lo más relacionado con homólogos de otras cianobacterias, sugiere que la biosíntesis de SXT puede haber evolucionado en una cianobacteria ancestral que adquirió sucesivamente los genes restantes de otras bacterias a través de HGT. La organización estructural de la agrupación de genes sxt investigada, así como la presencia de varias transposasas relacionadas con la familia IS4, sugiere que casetes pequeños de genes sxt son móviles.
Ejemplo 9: Cultivos de cianobacterias y caracterización de la agrupación de genes CYR.
Las cepas de cianobacterias se crecieron en medio Jaworski como se describe en el Ejemplo 1 anterior. El ADN genómico total se extrajo de las células de cianobacterias por lisis con lisozima/SDS/proteinasa K seguido de extracción con fenol-cloroformo como se ha descrito previamente Neilan B. A. 1995.. Appl Environ Microbiol 61:2286-2291. El ADN en el sobrenadante se precipitó en 2 volúmenes de etanol a -20°C, se lavó con etanol al 70%, se disolvió en tampón TE (10:1), y se almacenó a -20°C.
La caracterización de regiones desconocidas de ADN que flanquean los genes posibles de biosíntesis de cilindrospermopsina se realizó usando una PCR mediada por adaptador como se describe en Moffitt et al. (2004) Appl. Environ. Microbiol. 70:6353-6362. Las PCR se realizaron en volúmenes de reacción de 20 µl que contenían 1 x tampón de Taq polimerasa 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM desoxinucleótidos trifosfato, 10 pmoles cada uno de los cebadores directo e inverso, entre 10 y 100 ng de ADN genómico y 0,2 U de Taq polimerasa (Fischer Biotech, Australia). El ciclado térmico se realizó en un ciclador térmico GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer Corporation, Norwalk, CT). El ciclado empezó con una etapa de desnaturalización a 94°C durante 3 min seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 10 s, hibridación de cebador entre 55° y 65°C durante 20 s y una extensión de la cadena de ADN a 72°C durante 1-3 min. La amplificación se completó por una etapa final de extensión a 72°C durante 7 min. El ADN amplificado se separó por electroforesis en gel de agarosa en tampón TAE
(40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA, pH 7,8), y se visualizó por transiluminación UV después de teñir con bromuro de propidio (0,5 µg/ml).
La secuenciación automatizada del ADN se realizó usando el sistema de secuenciación PRISM Big Dye cycle y un secuenciador modelo 373 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los datos de secuencia se analizaron usando software ABI Prism-Autoassembler, mientras los valores de identidad/similitud con otras secuencias traducidas se determinaron usando BLAST conjuntamente con el National Center for Biotechnology Information (NIH, Bethesda, MD). Se usó Fugue blast (http://www-cryst.bioc.cam.ac.uk/fugue/) para identificar homólogos distantes a través de comparaciones secuencia-estructura. Las agrupaciones de genes se ensamblaron usando el software Phred, Phrap, y Consed (http://www.phrap.org/phredphrapconsed.html), y los marcos de lectura abiertos se identificaron manualmente. Los dominios poliquétido sintasa y péptido sintetasa no-ribosomal se determinaron usando las bases de datos especializadas en estructuras cristalinas (http://www-ab.informatik.unituebingen.de/software/NRPSpredictor; http://www.tigr.org/jravel/nrps/, http://www.nii.res.in/nrps-pks.html).
Ejemplo 10: Cribado genético de cepas de cianobacterias productoras y no productoras de Cilindrospermopsina
Las cepas de cianobacterias productoras y no productoras de Cilindrospermopsina se cribaron para la presencia del gen de sulfotransferasa cyrJ usando el conjunto de cebadores cynsulfF (5' ACTTCTCTCCTTTCCCTATC 3') (SEQ ID NO: 111) y cylnamR (5' GAGTGAAAATGCGTAGAACTTG 3') (SEQ ID NO: 112). El ADN genómico se ensayó para amplificación positiva usando los cebadores del gen de 16S ARNr 27F y 809 como se describe en Neilan et al. (1997) Int. J. Syst. Bacteriol. 47:693-697. Los amplicones se secuenciaron, como se describe en el Ejemplo 9 anterior, para verificar la identidad del fragmento génico.
La biosíntesis de cilindrospermopsina implica una amidinotransferasa, un NRPS, y un PKS (AoaA, AoaB y AoaC, respectivamente). Con el fin de obtener la secuencia completa de la agrupación de genes de la biosíntesis de cilindrospermopsina, usamos tecnología de 'paseo genético' mediada por adaptador, iniciando el proceso a partir de una secuencia parcial del gen de amidinotransferasa de C. raciborskii AWT205. Se diseñaron cebadores externos sucesivos y se secuenció la agrupación de genes completa que abarca 43 kb, junto con 3,5 kb más a cada lado de la agrupación de genes de la toxina.
Estas regiones flanqueantes codifican genes auxiliares posibles (genes hyp), que incluyen chaperonas moleculares implicadas en la maduración de hidrogenasas. Debido al hecho de que estos genes están flanqueando la agrupación de genes de la cilindrospermopsina en ambos extremos, postulamos que la agrupación de genes de la toxina estaba insertada en esta área del genoma interrumpiendo así la agrupación de genes HYP. Esta reorganización genética está apoyada mecanísticamente por la presencia de secuencias semejantes a transposasa en la agrupación de cilindrospermopsina.
Se realizó el análisis informático de la agrupación de genes de la toxina y tomando como base la inferencia de la función génica usando alineamientos de secuencias (NCBI BLAST), homólogos estructurales predichos (Fugue Blast), y análisis de dominios PKS y NRPS usando servidores blast especializados basados en estructuras cristalinas. La agrupación de genes de la biosíntesis de cilindrospermopsina contiene 15 ORF, que codifican todas las funciones requeridas para la biosíntesis, regulación y exportación de la toxina cilindrospermopsina (Figura 6).
Ejemplo 11: Formación del esqueleto de carbono de CYR
La primera etapa en la formación del esqueleto de carbono de cilindrospermopsina implica la síntesis de guanidinoacetato a través de la transamidinación de glicina. CyrA, el homólogo AoaA, que codifica una amidinotransferasa similar a la arginina:glicina amidinotransferasa GATM humana, transfiere un grupo guanidino de una molécula donante, lo más probablemente arginina, a una molécula aceptora de glicina formando así guanidinoacetato (Figura 8, etapa 1).
La siguiente etapa (Figura 8, etapa 2) en la biosíntesis se realiza por CyrB (homólogo de AoaB), un NRPS-PKS mixto. CyrB abarca 8,7 kb y codifica los dominios siguientes; dominio de adenilación (dominio A) y una proteína transportadora de peptidilo (PCP) de un NRPS seguido de un dominio β̃
quetosintasa (KS), dominio aciltransferasa (AT), dominio deshidratasa (DH), dominio metiltransferasa (MT), dominio quetoreductasa (KR), y una proteína transportadora de acilo (ACP) de origen PKS. CyrB por lo tanto debe catalizar la segunda reacción ya que es el único gen que contiene un dominio A que podría reclutar una unidad de inicio para extensiones PKS posteriores. El aminoácido específico activado por el dominio CyrB A no puede predecirse ya que sus residuos que confieren especificidad de sustrato no concuerdan con ninguna de las bases de datos disponibles (http://wwwab.informatik.uni-tuebingen.de/software/NRPSpredictor; http://www.tigr.org/jravel/nrps/, http://www.nii.res.in/nrpspks.html). Hasta ahora, no se ha descrito ningún otro NRPS que utilice guanidinoacetato como sustrato. Se piensa que el dominio A activa el guanidinoacetato, que entonces se transfiere a través de un brazo oscilante de la proteína transportadora de peptidilo (PCP) al dominio KS. El dominio AT activa malonil-CoA y la une al ACP. Esto es seguido de una reacción de condensación entre el guanidinoacetato activado y malonil-CoA en el dominio KS. CyrB contiene dos moléculas reductoras, KR y DH. Su reacción concertada reduce el grupo ceto a un hidroxilo seguido de la eliminación de H2O, lo que resulta en un enlace doble entre C13 y C14. El dominio metil transferasa (MT) identificado en CyrB a través de bases de datos NRPS/PKS (Ejemplo 9 anterior), es homólogo a MT dependiente de
S-adenosilmetionina (SAM). Por lo tanto, se sugiere que MT metila C13. Se propone que se produce un ataque nucleofílico del grupo amidino en N19 al nuevo enlace doble formado entre C13 y C14 a través de una 'adición de Michael'. La ciclación sigue las reglas de Baldwin para el cierre del anillo (Baldwin et al. (1997) J. Org. Chem 42;3846-3852), lo que resulta en la formación del primer anillo en cilindrospermopsina. Esta reacción podría ser espontánea y puede no requerir catálisis enzimática, ya que es energéticamente favorable. Ésta es la primera de tres formaciones de anillo.
La tercera etapa (Figura 8, etapa 3) en la biosíntesis implica CyrC (homólogo de AoaC), que codifica un PKS con dominios KS, AT, KR, y ACP. La acción de estos dominios resulta en la elongación de la cadena creciente por un acetato a través de la activación de malonil-CoA por el dominio AT, su transferencia a ACP y condensación en el dominio KS con el producto de CyrB. La cadena elongada se une al ACP de CyrC y el dominio KR reduce el grupo ceto a un grupo hidroxilo en C12. El módulo PKS que realiza esta etapa contiene un dominio KR y no contiene un dominio DH, esto sólo corresponde a CyrC.
Después de la catálisis de la enzima CyrC está CyrD (Figura 8, etapa 4), un PKS con cinco módulos; KS, AT, DH, KR, y un ACP. La acción de este módulo PKS en el producto de CyrC resulta en la adición de un acetato y la reducción del grupo ceto en C10 a un hidroxilo y deshidratación a un doble enlace entre C9 y C10. Este doble enlace es el sitio de un ataque nucleofílico por el grupo amidino N19 a través de otra adición de Michael que de nuevo sigue las reglas de Baldwin de cierre del anillo, lo que resulta en la formación del segundo anillo, el primer anillo de 6 miembros preparado en la cilindrospermopsina.
El producto de CyrD es el sustrato para CyrE (etapa 5 en la Figura 8), un PKS que contiene dominios KS, AT, DH, KR y un ACP. Como esta secuencia de dominios es idéntica a la de CyrD, no es posible en este estadio discernir qué PKS actúa en primer lugar, pero como se propone que su acción es idéntica es irrelevante en este punto. CyrE cataliza la adición de un acetato y la formación de un doble enlace entre C7 y C8. Este doble enlace es atacado por N18 a través de una adición de Michael y se produce la tercera ciclación, lo que resulta en el segundo anillo de 6 miembros.
CyrF es el módulo PKS final (etapa 6 de la Figura 8) y es un PKS mínimo que contiene sólo KS, AT, y ACP. CyrF actúa en el producto de CyrE y elonga la cadena por un acetato, dejando C4 y C6 sin reducir.
La etapa 7 en la ruta (Figura 8) implica la formación del anillo uracilo, una reacción que se requiere para la toxicidad del compuesto cilindrospermopsina final. La agrupación de genes de la cilindrospermopsina codifica dos enzimas con alta similitud de secuencia (87%) que se han denominado CyrG y CyrH. Una búsqueda Psi-blast (NCBI) seguida de una búsqueda en la biblioteca de perfiles Fugue (véase materiales y métodos) reveló que CyrG y CyrH son lo más similares a la familia de enzimas de amidohidrolasas/ureasas/dihidroorotasas, cuyos miembros catalizan la formación y escisión de enlaces N-C. Se propone que estas enzimas transfieren un segundo grupo guanidino de una molécula donante, tal como arginina o urea, a C6 y C4 de cilindrospermopsina lo que resulta en la formación del anillo uracilo. Estas enzimas realizan dos o tres reacciones dependiendo del donante de guanidino. La primera reacción consiste en la formación de un enlace covalente entre el N del donante de guanidino y C6 de cilindrospermopsina seguido de una eliminación de H2O formando un doble enlace entre C5 y C6. La segunda reacción cataliza la formación de un enlace entre el segundo N en el donante de guanidino y C4 de cilindrospermopsina, simultáneamente con la rotura del enlace tioéster entre la proteína transportadora de acilo de CyrE y cilindrospermopsina, causando la liberación de la molécula del complejo enzimático. Los experimentos de siembra con acetato marcado han mostrado que el oxígeno en C4 tiene origen acetato y no se pierde durante la biosíntesis, por lo tanto requiere la formación de novo del anillo uracilo. La tercera reacción - si se requiere catalizaría la escisión del grupo guanidino de una molécula donante distinta de urea. La acción de CyrG y CyrH en la formación del anillo uracilo en cilindrospermopsina describe una ruta de biosíntesis nueva de una pirimidina.
Una teoría sugiere un poliquétido lineal que asume fácilmente una conformación favorable para la formación de los anillos. La ciclación puede ser así espontánea y no está bajo control enzimático. Estos análisis muestran que esto puede ocurrir por etapas, con la formación sucesiva de anillos del intermedio apropiado al sintetizarse. Este mecanismo también explica la ausencia de un dominio tioesterasa o de ciclación, que están asociados habitualmente con módulos NRPS/PKS y catalizan la liberación y ciclación del producto final del complejo enzimático.
Ejemplo 12: Reacciones adaptadas a CYR
La biosíntesis de cilindrospermopsina requiere la acción de enzimas adaptadas con el fin de completar la biosíntesis, catalizando la sulfatación en C12 e hidroxilación en C7. El análisis de la agrupación de genes de cilindrospermopsina reveló tres enzimas candidatas para las reacciones adaptadas implicadas en la biosíntesis de cilindrospermopsina, concretamente CyrI, CyrJ, y CyrN. La sulfatación de cilindrospermopsina en C12 se realiza probablemente por la acción de una sulfotransferasa. CyrJ codifica una proteína que es lo más similar a sulfotransferasas dependientes de 3'-fosfoadenilil sulfato (PAPS) humanas. La agrupación de genes de cilindrospermopsina también codifica una adenilsulfato quinasa (ASK), concretamente CyrN. Las ASK son enzimas que catalizan la formación de PAPS, que es el donante de sulfato para las sulfotransferasas. Se propone que CyrJ sulfata la cilindrospermopsina en C12 mientras CyrN crea el conjunto de PAPS requerido para esta reacción. El
cribado de cepas productoras y no productoras de cilindrospermopsina reveló que los genes de sulfotransferasa sólo estaban presentes en las cepas productoras de cilindrospermopsina, afirmando adicionalmente la implicación de esta agrupación completa en la biosíntesis de cilindrospermopsina (Figura 7). El gen cyrJ podría ser por lo tanto un buen candidato para una sonda de toxina, ya que es más único que los genes NRPS y PKS y presumiblemente tendría menos reactividad cruzada con otras agrupaciones de genes que contienen estos genes, que son comunes en cianobacterias. La reacción de adaptación final es realizada por CyrI. Una búsqueda Fugue y un Psi-Blast iterado revelaron que CyrI es similar a una hidroxilasa que pertenece a la superfamilia de oxigenasas dependientes de 2oxoglutarato y Fe(II), que incluye la subunidad alfa de Prolil 4-hidroxilasa de mamíferos que cataliza la hidroxilación del colágeno. Se propone que CyrI cataliza la hidroxilación de C7, un residuo que, junto con el anillo de uracilo, parece conferir mucha de la toxicidad de cilindrospermopsina. La hidroxilación en C7 por CyrI es probablemente la etapa final en la biosíntesis de cilindrospermopsina.
Ejemplo 13: Transporte de la toxina CYR
Parece que la cilindrospermopsina y otras toxinas cianobacterianas se exportan fuera de las células productoras. La agrupación de genes de cilindrospermopsina contiene un ORF denominado CyrK, cuyo producto es lo más similar a proteínas de extrusión multi-fármaco y de compuestos tóxicos (MATE) dirigidas por el ión sodio de la familia NorM. Se postula que CyrK es un transportador para cilindrospermopsina, tomando como base esta homología y su localización central en la agrupación. La expresión heteróloga y caracterización de la proteína se están realizando actualmente para verificar su posible papel en la exportación de cilindrospermopsina.
Ejemplo 14: Regulación transcripcional de la agrupación de genes de la toxina
Se ha mostrado que la producción de cilindrospermopsina es mayor cuando se elimina el nitrógeno fijado del medio de crecimiento (Saker et al. (1999) J. Phycol 35:599-606). Flanqueando la agrupación de genes de cilindrospermopsina están homólogos del gen "hyp" implicados en la maduración de hidrogenasas. En la cianobacteria Nostoc PCC73102 están bajo la regulación del regulador de nitrógeno global NtcA, que activa la transcripción de genes de asimilación del nitrógeno. Es plausible que la agrupación de genes de cilindrospermopsina esté bajo la misma regulación, ya que está localizada completamente en la agrupación de genes "hyp" en C. raciborskii AWT205, y no pudo identificarse ninguna región promotora obvia en la agrupación de genes de cilindrospermopsina.
Finalmente, la agrupación de genes de cilindrospermopsina también incluye un ORF en su extremo 3' designado CyrO. Por homología, codifica una proteína hipotética que parece poseer un casete de unión a ATP, y es similar a proteínas con repetición WD, que tienen diversos papeles reguladores y de transducción de la señal. CyrO también puede tener un papel en la regulación transcripcional y unión a ADN. También muestra homología con las proteínas de la familia AAA que realizan frecuentemente funciones semejantes a chaperona y asisten en el ensamblaje, operación, o desensamblaje de complejos proteicos. La comprensión más profunda del papel de CyrO está dificultada debido a la baja homología de secuencia con otras proteínas en las bases de datos.
LISTADO DE SECUENCIAS
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<213> Cylindrospermopsis raciborskii AWT205
<400> 94 5 <210> 95
<211> 780
<212> ADN
<213> Cylindrospermopsis raciborskii AWT205
10 <400> 95 <210> 96
<211> 259
<212> PRT
<213> Cylindrospermopsis raciborskii AWT205
<400> 96
<210> 97 15 <211> 1176
<212> ADN
<213> Cylindrospermopsis raciborskii AWT205
<400> 97 20
<210> 98
<211> 391
<212> PRT
<213> Cylindrospermopsis raciborskii AWT205
<400> 98 <210> 99
<211> 8754
<212> ADN
<213> Cylindrospermopsis raciborskii AWT205
<400> 99
<210> 100
<211> 2917
<212> PRT
<213> Cylindrospermopsis raciborskii AWT205
<400> 100
<210> 101
<211> 5667
<212> ADN
<213> Cylindrospermopsis raciborskii AWT205
<400> 101
<210> 102
<211> 1888
<212> PRT
<213> Cylindrospermopsis raciborskii AWT205
<400> 102
<210> 103 <211> 5004
<212> ADN
<213> Cylindrospermopsis raciborskii AWT205
<400> 103 <210> 104
<211> 1667
<212> PRT .
<213> Cylindrospermopsis raciborskii AWT205
<400> 104
<210> 105
<211> 318
<212> ADN
<213> Cylindrospermopsis raciborskii AWT205
<400> 105
<210> 106
<211> 105
<212>
PRT 15 <213> Cylindrospermopsis raciborskii AWT205
<400> 106
<210> 107
<211> 600
<212> ADN
<213> Cylindrospermopsis raciborskii AWT205
<400> 107
<210> 108
<211> 199
<212>
PRT 15 <213> Cylindrospermopsis raciborskii AWT205
<400> 108
<210> 109
<211> 1548 25 <212> ADN
<213> Cylindrospermopsis raciborskii AWT205
<400> 109
5 <210> 110
<211> 515
<212> PRT
<213> Cylindrospermopsis raciborskii AWT205
10 <400> 110 <210> 111
<211> 20 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii AWT205 10
<400> 111
acttctctcc tttccctatc 20
15 <210> 112
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
20 <220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii AWT205
<400> 112
gagtgaaaat gcgtagaact tg 22
<210> 113
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 113
cccaatatct ccctgtaaaa ct 22
<210> 114
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 114
tggcaattgt ctctccgtat 20
<210> 115
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 115
ctcgccgatg aaagtcctct 20
<210> 116
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 116
gcgtgtcgag aaaaaggtgt 20
<210> 117
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 117
ctcgacacgc aagaataacg 20
<210> 118
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 118 atgcttctgc tttggcatgg c 21
<210> 119
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 119 taactcgacg aactttgacc c 21
<210> 120
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 120 gccgccaatc ctcgcgatg 19
<210> 121
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 121 gaacgtctaa tgttgcacag tg 22
<210> 122
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 122 ctggtacgta gtcgcaaagg tgg 23
<210> 123
<211> 26
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 123
ctgacggtac atgtatttcc tgtgac 26
<210> 124
<211> 30
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 124
cgtctcatat gcagatctta ggaatttcag 30
<210> 125
<211> 25
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 125
gcttactacc acgatagtgc tgccg 25
<210> 126
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 126
tctatgttta gcaggtggtg tc 22
<210> 127
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 127
ttctgcaaga cgagccataa 20
<210> 128
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 128
ggttcgccgc ggacattaaa 20
<210> 129
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 129 atgctaatgc ggtgggagta 20
<210> 130
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 130 aaagcagttc cgacgacatt 20
<210> 131
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 131 cctatttcga ttattgtttt cgg 23
<210> 132
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 132 gataccgatc ataaactacg 20
<210> 133
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3 sequence
<400> 133 gcaaattttg caggagtaat g 21
<210> 134
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 134
gcaaattttg caggagtaat g 21
<210> 135
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 135
ttttgggtaa actttatagc cat 23
<210> 136
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 136
tgggtctgga cagttgtaga ta 22
<210> 137
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 137
aaggggaaaa caaaattatc aat 23
<210> 138
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 138
ggcgatcgcc tgctaaaaat 20
<210> 139
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 139
cctcattttc atttctagac gtt 23
<210> 140
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 140 ccacttcaac taaaacagca 20
<210> 141
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 141 aaaaattttg gaggggtagc 20
<210> 142
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 142 atccaagatg cgacaacact 20
<210> 143
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 143 ggtccttgcg cagatagagt g 21
<210> 144
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 144 cactctatct gcgcaaggac c 21
<210> 145
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 145
tgactgcatt cgctgtataa a 21
<210> 146
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 146
ttcataagac ggctgttgaa tc 22
<210> 147
<211> 30
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 147
ctcgagttaa aaaagagtgt aaatgaaagg 30
<210> 148
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 148
ttctataact gctgccaaat ttt 23
<210> 149
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 149
aattttggag tgactggtta tgg 23
<210> 150
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 150
ccataaccag tcactccaaa att 23
<210> 151
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 151 ttttagttgt tacttttggc g 21
<210> 152
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 152 acagcagatg agagaaagta 20
<210> 153
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 153 gggttgtctt gctgattttc 20
<210> 154
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 154 cattaaaata agtccggaca gg 22
<210> 155
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 155 ttaaacagaa tgaggagcaa 20
<210> 156
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 156 aaacaacaca cccatctaag 20
<210> 157
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 157
ttaataaggc atccccaaga 20
<210> 158
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 158
gaaatggctg tgtaaaaact 20
<210> 159
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 159
tctgccatat ccccaaccta 20
<210> 160
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 160
gatcgcccga caggaagact 20
<210> 161
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 161
tccggcttga cctgctggac 20
<210> 162
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 162 tgcgatgatt ttgcctctgt 20
<210> 163
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 163 aaaatttgca cacccacacg 20
<210> 164
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 164 ttggattgaa cgtgtaattg aaaaagc 27
<210> 165
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 165 gctttttcaa ttacacgttc aatccaa 27
<210> 166
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 166 aaatggcgta tcgactaac 19
<210> 167
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 167
atataggagc gcataaagtg c 21
<210> 168
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 168
cttggtataa gtcttgtgat 20
<210> 169
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 169
aacactcatt agattcatct 20
<210> 170
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 170
tccactaaat cctttgaatt g 21
<210> 171
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 171
tgtttgtctg gatgcgatcc t 21
<210> 172
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 172
gcagttcagg tccatgaaac 20
<210> 173
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 173 agcccagtca caaccttcgt 20
<210> 174
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 174 tctggaagta cttgcactgt c 21
<210> 175
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 175 tgtaactccg tcaggacata aa 22
<210> 176
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 176 tgcaaatttt agtagcaata acg 23
<210> 177
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 177 ctttactaat tatagcgggg atattat 27
<210> 178
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 178 cagtggggaa atagatggat 20
<210> 179
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 179
tggtcataaa agcgggattc 20
<210> 180
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 180
ggatcttggc gcaattta 18
<210> 181
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 181
gttagagact tggaacgtat tgg 23
<210> 182
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 182
ccaaacccag aagaaatcc 19
<210> 183
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 183
aatctatagc caaaacccct aa 22
<210> 184
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 184 actgtgtgaa caattcccc 19
<210> 185
<211> 29
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 185 gcaacaagac tacatttagt agatttaga 29
<210> 186
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Basado en la secuencia de Cylindrospermopsis raciborskii T3
<400> 186 gctttttcaa ttacacgttc aatccaa 27

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un método para detectar un organismo cianotóxico que comprende las etapas de obtener una muestra para usarse en el método y analizar la muestra para la presencia de una agrupación de genes SXT presente sólo en organismos productores de saxitoxina, en el que dicho análisis comprende detectar:
    (i)
    un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, y SEQ ID NO: 36;
    (ii)
    un polinucleótido variante que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con un polinucleótido de (i);
    (iii) un ácido ribonucleico o ADN complementario codificado por una secuencia según (i);
    (iv)
    un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, y SEQ ID NO: 37; o,
    (v)
    un polipéptido variante que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con un polipéptido de (iv),
    y en el que dicha presencia es indicativa de organismos cianotóxicos en la muestra.
  2. 2.
    El método según la reivindicación 1, en el que dicho organismo cianotóxico es una cianobacteria o un dinoflagelado.
  3. 3.
    El método según la reivindicación 1, en el que dicho análisis comprende la amplificación de ADN de la muestra por la reacción en cadena de la polimerasa utilizando uno o más cebadores que comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias de cebador.
  4. 4.
    El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además analizar la muestra para la presencia de uno o más de:
    (i)
    un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias de polinucleótido,
    (ii)
    un ácido ribonucleico o ADN complementario codificado por una secuencia según (i),
    (iii) un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, y SEQ ID NO: 110, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias de polipéptido.
  5. 5.
    El método según la reivindicación 4, en el que dicho análisis comprende la amplificación de ADN de la muestra por la reacción en cadena de la polimerasa utilizando uno o más cebadores que comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias.
  6. 6.
    Un kit para la detección de organismos cianotóxicos, comprendiendo el kit al menos un agente para detectar la presencia de una agrupación de genes SXT presente sólo en organismos productores de saxitoxina, en el que bien:
    (i)
    dicho agente puede detectar un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 36, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias de polinucleótido y dicho agente es un cebador o una sonda;
    (ii)
    dicho agente puede detectar un ácido ribonucleico o ADN complementario codificado por una secuencia según (i) y dicho agente es un cebador o una sonda; o
    (iii) dicho agente puede detectar un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 37, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencia de polipéptido, y dicho agente es un anticuerpo capaz de unirse específicamente al polipéptido.
  7. 7.
    El kit según la reivindicación 6, en el que dicho al menos un agente es un cebador o sonda que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias de nucleótidos.
  8. 8.
    El kit según la reivindicación 6 o reivindicación 7, que comprende además al menos un agente adicional para detectar la presencia de uno o más de:
    (i)
    un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias de polinucleótido,
    (ii)
    un ácido ribonucleico o ADN complementario codificado por una secuencia según (i), o,
    (iii) un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, y SEQ ID NO: 110, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias de polipéptido.
  9. 9.
    El kit según la reivindicación 8, en el que dicho al menos un agente adicional es un anticuerpo, cebador o sonda, en el que dicho cebador o sonda comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias.
  10. 10.
    Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que comparte al menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos que comparte al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, y SEQ ID NO: 68.
  11. 11.
    Un ácido ribonucleico aislado o un ADN complementario aislado codificado por una secuencia según la reivindicación 10.
  12. 12.
    Un polipéptido aislado de la ruta biosintética de la saxitoxina codificado por un fragmento según la reivindicación 10 y que comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, y SEQ ID NO: 69.
  13. 13.
    Una sonda o cebador que hibrida específicamente con uno o más de:
    (i)
    un polinucleótido según la reivindicación 10, o
    (ii)
    un ácido ribonucleico o ADN complementario según la reivindicación 11,
    en el que dicho cebador o sonda comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias de polinucleótido.
  14. 14. Un anticuerpo aislado capaz de unirse específicamente a un polipéptido según la reivindicación 12.
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