ES2525143T3 - Cápsides de AAVrh.64 modificado, composiciones que las contienen y usos de las mismas - Google Patents

Abstract

Un vector de virus adeno-asociado (AAV) que tiene una cápside de AAVrh.64 que tiene la secuencia SEQ ID Núm. 43 modificada para contener un triptófano en la posición 697 de residuo de aminoácido, que es de forma nativa una arginina.

Description

Cápsides de AAVrh.64 modificado, composiciones que las contienen y usos de las mismas.

Antecedentes de la invención

Un virus adeno-asociado (AAV), un miembro de la familia Parvovirus, es un pequeño virus icosaédrico, sin envoltura, con genomas de ADN lineal de cadena simple de 4,7 kilobases (kb) a 6 kb. El virus se asigna al género, Dependovirus, debido a que el virus fue descubierto como contaminante en poblaciones de adenovirus purificados. El ciclo de vida del AAV incluye una fase latente en la que los genomas de AAV, tras la infección, son el sitio específicamente integrado en cromosomas anfitrión, y una fase infecciosa en la que, a continuación de la infección ya sea por adenovirus o ya sea por virus de herpes simplex, los genomas integrados son posteriormente rescatados, replicados y empaquetados en virus infecciosos. Las propiedades de no patogenicidad, amplia gama de infectividad de anfitrión, incluyendo las células que no se dividen, y la integración cromosómica potencial específica del sitio, hacen que el AAV sea una herramienta atractiva para transferencia de gen.

Los vectores de AAV han sido descritos para su uso como vehículos de suministro tanto para moléculas terapéuticas como inmunogénicas. Hasta la fecha, se han aislado varios AAVs diferentes bien caracterizados a partir de primates humanos o no humanos (NHP).

Recientemente, los investigadores han descrito un gran número de AAVs de diferentes secuencias [G. Gao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(10): 6081-6086 (13 de Mayo de 2003); US-2003-0138772-A1 (24 de Julio de 2003)], y han caracterizado esos AAVs en diferentes serotipos y clados [G. Gao, et al., J. Virol., 78(12): 6381-6388 (Junio de 2004); publicación de Patente Internacional núm. WO 2005/033321]. Se ha informado que diferentes AAVs presentan eficacias de transfección diferentes, y también presentan tropismo para diferentes células o tejidos.

Lo que resulta deseable son construcciones a base de AAV para el suministro de moléculas heterólogas a diferentes tipos de células.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona, en un aspecto, un vector de virus adeno-asociado (AAV) que comprende una cápside de AAVrh32/33 que tiene la secuencia de aminoácido SEQ ID Núm. 2, en la que el vector viral porta un transgén que codifica un producto de gen bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen expresión del producto en una célula anfitrión.

El producto de gen puede ser, por ejemplo, un inmunógeno o un antígeno. En realizaciones particulares, el producto de gen se deriva de un inmunógeno o un antígeno viral.

El vector puede ser para uso en el suministro de un producto de gen a una célula anfitrión.

La invención se extiende también a una composición que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y un vector de AAV según se describe.

La invención se extiende además a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cápside de AAVrh32/33, que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 2.

Otros aspectos y ventajas de la invención resultarán fácilmente evidentes a partir de la descripción detallada que sigue de la invención.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un gráfico que ilustra transducción 293 in vitro de vectores de AAV corregidos en singletón. Las correcciones de singletón están indicadas detrás del nombre del vector con, si está presente, un número para indicar el número de mutaciones realizadas.

Las Figuras 2A-2C son gráficos lineales que ilustran la titulación de vectores de AAV sobre células 293 en multiplicidades de rango de infección desde 101 a 104, con una comparación entre rh.8 parental y rh.8 corregido en singletón (rh.8R) en la Figura 2A, rh.37 parental y rh.37 modificado (Figura 2B), y AAV2 y AAV8 en la Figura 2C. Como control, está presente una titulación similar de AAV2 y AAV2/8 eGFP que expresa el vector. El porcentaje (%) de células positivas de eGFP se presenta en el eje Y, y fue ensayado mediante citometría de flujo.

La Figura 3 es un árbol filogenético de secuencias de AAV, que indica su relación filogenética y clados.

Las Figuras 4A-4K son un alineamiento de las secuencias de ácido nucleico de la proteína de cápside (vp1) de AAV2 [SEQ ID Núm. 7], cy-5 [SEQ ID Núm. 8], rh.10 [SEQ ID Núm. 9], rh.13 [SEQ ID Núm. 10], AAV1 [SEQ ID Núm. 11], AAV3 [SEQ ID Núm. 12], AAV6 [SEQ ID Núm. 13], AAV7 [SEQ ID Núm. 14], AAV8 [SEQ ID Núm. 15], hu.13

[SEQ ID Núm. 16], hu.26 [SEQ ID Núm. 17], hu.37 [SEQ ID Núm. 18], hu.53 [SEQ ID Núm. 19], hu.39 [SEQ ID Núm. 20], rh.43 [SEQ ID Núm. 21], y rh.46 [SEQ ID Núm. 22].

Las Figuras 5A-5D son un alineamiento de las secuencias de aminoácido de la proteína de cápside (vp1) de AAV2 [SEQ ID Núm. 23], cy.5 [SEQ ID Núm. 24], rh.10 [SEQ ID Núm. 25], rh.13 [SEQ ID Núm. 26], AAV1 [SEQ ID Núm. 27], AAV3 [SEQ ID Núm. 28], AAV6 [SEQ ID Núm. 29], AAV7 [SEQ ID Núm. 30], AAV8 [SEQ ID Núm. 31], hu.13 [SEQ ID Núm. 32], hu.26 [SEQ ID Núm. 33], hu.37 [SEQ ID Núm. 34], hu.53 [SEQ ID Núm. 35], rh.39 [SEQ ID Núm. 36], rh.43 [SEQ ID Núm. 37] y rh.46 [SEQ ID Núm. 38].

Las Figuras 6A-6B son un alineamiento de las secuencias de aminoácido de la proteína de cápside (vp1) de rh.13 [SEQ ID Núm. 26], rh.2 [SEQ ID Núm. 39], rh.8 [SEQ ID Núm. 41], hu.29 [SEQ ID Núm. 42] y rh.64 [SEQ ID Núm. 43].

Descripción detallada de la invención

La presente invención fue concebida usando el “método de singletón” de la solicitante, el cual tiene como objetivo mejorar la producción de empaquetamiento, eficacia de transducción, y/o eficacia de transferencia de gen de un vector de AAV que tiene una cápside de un AAV que contiene uno o más singletones. Este método se describe con mayor detalle en lo que sigue y constituye también el objeto de la solicitud de Patente Europea núm. 06749685.1 (de la que deriva la presente solicitud por división).

Según se utiliza a través de la presente descripción y de las reivindicaciones, los términos “comprendiendo” e “incluyendo” son inclusives de otros componentes, elementos, integradores, etapas y similares. A la inversa, el término "“consistiendo” y sus variantes son excluyentes de otros componentes, elementos, integradores, etapas y similares.

Método de singletón

Según se utiliza en la presente memoria, el término “singletón” se refiere a un aminoácido variable en una posición dada en una secuencia de cápside de AAV seleccionada (es decir, parental). La secuencia de un aminoácido variable se determina mediante alineamiento de la secuencia de la cápside de AAV parental con una librería de secuencias de cápside de AAV funcionales. Las secuencias son analizadas después para determinar la presencia de cualesquiera secuencias de aminoácido variables en la cápside de AAV parental donde las secuencias del AAV en la librería de AAVs funcionales tienen conservación completa. La secuencia de AAV parental es alterada a continuación para cambiar el singletón en el aminoácido conservado identificado en esa posición en las secuencias de cápside de AAV funcionales. Una secuencia de AAV parental puede tener 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, o 2 singletones. Una secuencia de AAV parental puede tener más de 6 singletones.

Una vez modificada, la cápside de AAV modificada puede ser usada para construir un vector de AAV que tenga la cápside modificada. Este vector puede ser construido usando técnicas conocidas por los expertos en la materia.

El AAV seleccionado para modificación según el método, es uno para el que resulta deseable incrementar una cualquiera o más de las tres propiedades funcionales siguientes de AAV, a saber, empaquetamiento en la partícula viral que tiene la cápside de la secuencia de AAV seleccionada, incremento de la eficacia de transducción, o incremento de la eficacia de transferencia de gen en comparación con el AAV parental. Por ejemplo, el AAV parental puede estar caracterizado por tener una eficacia de empaquetamiento más baja que otro AAV relacionado cercanamente. En otro ejemplo, el AAV parental puede tener una eficacia de transducción más baja en comparación con AAVs relacionados cercanamente. En otro ejemplo, el AAV parental puede tener una eficacia de transferencia de gen más baja (es decir, una capacidad más baja para suministrar una molécula objetivo in vivo) en comparación con AAVs relacionados cercanamente. En otros ejemplos, el AAV parental está caracterizado por una función adecuada en cada una de esas categorías, pero una o más áreas de función incrementada si se desea.

De ese modo, el método proporciona una librería de AAVs funcionales, cuyas secuencias van a ser comparadas con el AAV (parental) seleccionado. Adecuadamente, la librería contiene AAVs que tienen una función deseada que es el objetivo a mejorar en el AAV parental seleccionado. En otras palabras, cada una de las secuencias de la librería de AAVs funcionales se caracteriza por un nivel deseado de capacidad de empaquetamiento, un nivel deseado de eficacia de transducción in vitro, o un nivel deseado de eficacia de transferencia de gen in vivo (es decir, la capacidad para el suministro a un tejido o célula objetivo seleccionada en un sujeto). Los AAVs funcionales que componen la librería pueden tener individualmente una, dos o todas esas características funcionales. Otras funciones deseadas para la librería pueden ser determinadas fácilmente por un experto en la materia.

En un ejemplo, un AAV funcional se caracteriza por la capacidad para producir partículas virales con eficacia de empaquetamiento y transducción mayor o equivalente a la de uno cualquiera de AAV1, AAV2, AAV7, AAV8 o AAV9. La función puede ser evaluada en un escenario de seudotipado con ITRs de AAV2 rep y de AAV2. De ese modo, se puede construir un AAV parental alterado usando técnicas convencionales y el vector de AAV se considera funcional si el virus se produce a partir del AAV parental en títulos de al menos el 50% en comparación con la producción de AAV2. Además, la capacidad del AAV para transducir células puede ser determinada fácilmente por un experto en la

materia. Por ejemplo, se puede construir un AAV parental de tal modo que contenga un gen marcador que permita una detección fácil del virus. Por ejemplo, el AAV contiene eGFP u otro gen que permita detección fluorescente. Donde el AAV contiene CMV-eGFP, cuando el virus producido a partir de la cápside de AAV parental alterada es transducido en células 293 en una multiplicidad de infección de 104, se demuestra la función donde la eficacia de transducción es mayor del 5% de fluorescencia GFP del total de las células en un contexto en que las células fueron pretratadas con adenovirus tipo 5 humano de tipo natural en una multiplicidad de infección de 20 durante 2 horas.

Adecuadamente, una librería se compone de al menos tres o al menos cuatro secuencias de cápside de AAV funcionales que representan al menos dos clados diferentes. Con preferencia, al menos dos secuencias de cada uno de los clados representados están incluidas en la librería. En algunos ejemplos, están representados tres, cuatro, cinco, seis o más clados.

Un “clado” es un grupo de AAVs que están relacionados filogenéticamente entre sí según se determina usando un algoritmo Neighbor-Joining mediante un valor de rutina de carga de al menos el 75% (de al menos 1000 repeticiones) y una medición de distancia de corrección de Poisson de no más de 0,05, en base a alineamiento de la secuencia de aminoácido de vp1 de AAV.

El algoritmo Neighbor-Joining ha sido descrito extensamente en la literatura. Véase, por ejemplo, M. Nei y S. Kumar, Evolución Molecular y Filogenética (Oxford University Press, New York (2000)). Hay disponibles programas de ordenador que pueden ser usados para implementar este algoritmo. Por ejemplo, el programa MEGA v2.1 implementa el método Nei-Gojobori modificado. Usando estas técnicas y programas de ordenador, y la secuencia de una proteína de cápside de vp1 de AAV, un experto en la materia puede determinar fácilmente si un AAV seleccionado está contenido en uno de los clados identificados en la presente memoria, en otro clado, o en otro caso, si está fuera de esos clados.

Mientras que los clados de AAV están basados principalmente en cápsides de vp1 de AAV que ocurren de forma natural, los clados no se limitan a los AAVs que ocurren de forma natural. Los clados pueden abarcar AAV que se produzca de forma no natural incluyendo, aunque sin limitación, AAVs recombinantes, modificados o alterados, quiméricos, híbridos, sintéticos, artificiales, etc., que estén relacionados filogenéticamente según se determina usando un algoritmo Neighbor-Joining al menos al 75% (de al menos 1000 repeticiones) y una medición de corrección de distancia de Poisson de no más de 0,05, en base a alineamiento de la secuencia de aminoácido de vp1 de AAV.

Los clados de AAV que han sido descritos incluyen el Clado A (representado por AAV1 y AAV6), Clado B (representado por AAV2) y Clado C (representado por el híbrido AAV2-AAV3), Clado D (representado por AAV7), Clado E (representado por AAV8), y Clado F (representado por AAV9 humano). Estos clados están representados por un miembro del clado que es un serotipo de AAV descrito con anterioridad. El AAV1 y el AAV6 descritos con anterioridad son miembros de un solo clado (Clado A) en el que se recuperaron 4 aislados procedentes de 3 humanos. Los serotipos de AAV3 y AAV5 descritos con anterioridad son claramente distintos entre sí, pero no fueron detectados en el escenario descrito en la presente memoria y no han sido incluidos en ninguno de esos clados.

Una discusión adicional de clados de AAV se proporciona en G. Gao, et al., J. Virol., 78(12): 6381-6388 (Junio de 2004) y las publicaciones de Patentes Internacionales núm. WO 2004/028817 y WO 2005/033321. El último documento proporciona también nuevas secuencias de AAV humano.

En un ejemplo, las librerías usadas en el método de la invención excluyen el AAV5. En otro ejemplo, las librerías usadas en el método excluyen el AAV4. Sin embargo, en algunos ejemplos, como donde el AAV parental es similar a AAV5, puede resultar deseable incluir esa secuencia en el alineamiento.

Aunque se puede construir una librería que contenga el número mínimo de secuencias, la eficacia de identificación de singletones puede ser optimizada utilizando una librería que contenga un número más grande de secuencias. Adecuadamente, la librería contiene un mínimo de cuatro secuencias, estando representados al menos dos clados. Con preferencia, la librería contiene al menos dos secuencias de cada uno de los clados representados. En un ejemplo, la librería contiene más de 100 secuencias de AAV. En otro ejemplo, la librería contiene al menos tres a 100 secuencias de AAV. En otro ejemplo más la librería contiene al menos seis a 50 secuencias de AAV.

Los AAVs adecuados para su uso en las librerías funcionales incluyen, por ejemplo, AAV1, AAV2, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 y otras secuencias que han sido descritas [G. Gao, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 100(10): 6081-6086 (13 de Mayo de 2003); publicación de Patentes Internacionales núm. WO 2004/042397 y WO 2005/033321]. Un experto en la materia puede seleccionar fácilmente otros AAVs, por ejemplo los aislados usando los métodos descritos en la publicación de Patente Internacional núm. WO 03/093460 A1 (13 de Noviembre de 2003) y en la publicación de solicitud de Patente US núm. 2003-0138772 A1 (24 de Julio de 2003).

Las al menos tres secuencias de dentro de la librería son al menos un 85% idénticas a través de la longitud completa de sus secuencias de cápside alineadas.

El término “porcentaje (%) de identidad” puede ser determinado fácilmente para secuencias de aminoácido, a través

de la longitud completa de una proteína, o de un fragmento de la misma. Adecuadamente, un fragmento tiene al menos aproximadamente una longitud de 8 aminoácidos, y puede llegar hasta 700 aminoácidos. En general, cuando se hace referencia a “identidad”, “homología” o “similitud” entre dos virus adeno-asociados diferentes, la “identidad”, “homología” o “similitud” se determina con referencia a secuencias “alineadas”. Secuencias “alineadas” o “alineamientos” se refieren a múltiples secuencias de ácido nucleico o secuencias de proteína (aminoácidos) que con frecuencia contienen correcciones en cuanto a bases o aminoácidos faltantes o adicionales cuando se comparan con una secuencia de referencia.

Los alineamientos se llevan a cabo usando cualquiera de una diversidad de Programas de Alineamiento de Secuencia Múltiple disponibles públicamente o comercialmente. Los programas de alineamiento de secuencia están disponibles para secuencias de aminoácido, por ejemplo, los programas “Clustal X”, “MAP”, “PIMA”, “MSA”, “BLOCKMKER”, “MEME” y “Match-Box”. En general, cualquiera de los programas mencionados se usa en configuraciones por defecto, aunque un experto en la materia puede alterar esas configuraciones según sea necesario. Alternativamente, un experto en la materia puede utilizar otro algoritmo o programa de ordenador que proporcione al menos un nivel de identidad o de alineamiento como el proporcionado por los algoritmos y programas de referencia. Véase, por ejemplo, J.D. Thomson et al., Nucl. Ácidos. Res., “Una comparación integral de múltiples alineamientos de secuencia”, 27(13): 2682-2690 (1999).

Los programas de alineamiento múltiple de secuencia están también disponibles para secuencias de ácido nucleico. Ejemplos de tales programas incluyen “Clustal W”, “Ensamblaje de Secuencia CAP”, “MAP” y “MEME”, los cuales son accesibles a través de Servidores Web por Internet. Los expertos en la materia conocen otras fuentes para tales programas. Alternativamente, también se usan utilidades NTI de Vector. Existe también un número de algoritmos conocidos en el estado de la técnica que pueden ser usados para medir identidad de secuencia de nucleótido, que incluyen los contenidos en los programas descritos en lo que antecede. Según otro ejemplo, se pueden comparar secuencias de polinucleótido usando Fasta™, un programa en GCG, Versión 6.1. Fasta proporciona alineamientos y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones de mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de ácido nucleico puede ser determinado usando Fasta con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuación) según se proporciona en GCG Versión 6.1, incorporado en la presente memoria por referencia.

Las secuencias de la cápside de AAV objetivo o parental, sospechosas de contener un singletón, se comparan con las secuencias de las cápsides de AAV del interior de la librería. Esta comparación se realiza usando un alineamiento de proteína vp1 de longitud completa de la cápside de AAV.

Un singletón se identifica donde, para una posición de aminoácido seleccionada cuando las secuencias de AAV están alineadas, todos los AAVs de la librería tienen el mismo residuo de aminoácido (es decir, están conservadas completamente), pero el AAV parental tiene un residuo de aminoácido diferente.

Típicamente, cuando se prepara un alineamiento basado en la proteína vp1 de cápside de AAV, el alineamiento contiene inserciones y supresiones que son identificadas por tanto con respecto a una secuencia de AAV de referencia (por ejemplo, el AAV2) y la numeración de los residuos de aminoácido están basados en una escala de referencia para el alineamiento. Sin embargo, cualquier secuencia de AAV dada puede tener menos residuos de aminoácido que la escala de referencia. En la presente descripción, cuando se discute el AAV parental y las secuencias de la librería de referencia, el término “la misma posición” o la “posición correspondiente” se refieren al aminoácido situado en el mismo número de residuo en cada una de las secuencias, con respecto a la escala de referencia para las secuencias alineadas. Sin embargo, cuando se toman fuera del alineamiento, cada una de las proteínas vp1 de AAV puede tener esos aminoácidos situados en números de residuo diferentes.

Opcionalmente, el método puede ser llevado a cabo usando un alineamiento de ácido nucleico e identificando como singletón un codón que codifica un aminoácido diferente (es decir, un codón no sinónimo). Cuando las secuencias de ácido nucleico de un codón dado no son idénticas en el AAV parental en comparación con las secuencias de ese codón en la librería, pero codifican el mismo aminoácido, se considera que son sinónimas y no son un singletón.

De acuerdo con el método, un AAV parental que contiene un singletón es alterado de tal modo que el residuo de singletón se sustituye por el residuo de aminoácido conservado de los AAVs en la librería.

A la inversa, esta sustitución puede ser realizada usando técnicas de mutagénesis convencionales dirigidas al sitio sobre el codón para el aminoácido variable. Típicamente, la mutagénesis dirigida al sitio se realiza usando tan pocas etapas como se requiera para obtener el codón deseado para el residuo de aminoácido conservado. Tales métodos son bien conocidos por los expertos en la materia y pueden ser llevados a cabo usando métodos publicados y/o kits disponibles comercialmente [por ejemplo, disponibles en Stratagene y Promega]. La mutagénesis dirigida al sitio puede ser llevada a cabo sobre la secuencia genómica de AAV. La secuencia de AAV puede ser portada por un vector (por ejemplo, una estructura de plásmido) por conveniencia. Alternativamente, un experto en la materia puede alterar el AAV parental usando otras técnicas conocidas por los expertos en la materia.

Un AAV parental puede tener más de un singletón, por ejemplo dos, tres, cuatro, cinco, seis o más. Sin embargo, se

puede observar una mejora en la función tras la corrección de un singletón. En el ejemplo en que un AAV parental porta múltiples singletones, cada singletón puede ser alterado en un instante, seguido de evaluación del AAV modificado para potenciación de la función deseada. Alternativamente, se pueden alterar múltiples singletones con anterioridad a la evaluación en cuanto a potenciación de la función deseada.

Incluso cuando un AAV parental contiene múltiples singletones y se observa una mejora funcional alterada de un primer singletón, puede ser deseable optimizar la función alterando el (los) singletón(es) restante(s).

Típicamente, un AAV parental que ha tenido uno o más singletones alterados conforme al método, es evaluado en cuanto a función mediante empaquetamiento del AAV en una partícula de AAV. Estos métodos son bien conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, G. Gao et al., Proc. Natl. Acad. Sci., citado anteriormente; Sambrook et al., Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY.

Estos AAVs alterados tienen nuevas cápsides producidas conforme al método de singletón y son evaluados en cuanto a función. Los métodos adecuados para la evaluación de función de AAV han sido descritos en la presente memoria e incluyen, por ejemplo, la capacidad de producir partículas protegidas de DNAsa, eficacia de transducción celular in vitro, y/o transferencia de gen in vivo. Adecuadamente, los AAVs alterados tienen un número suficiente de singletones alterados para incrementar la función en una o en todas esas características, en comparación con la función del AAV parental.

II. Nuevo AAV

Es posible predecir si un nuevo AAV será funcional usando el método de singletón e identificando la ausencia de un singletón en la secuencia del AAV seleccionado, es decir, un AAV que carezca de singletón.

De ese modo, en un ejemplo, el método permite la selección de un AAV para su uso en la producción de un vector. Este método incluye seleccionar una secuencia de cápside de AAV parental para análisis, e identificar la ausencia de cualquier singletón en la cápside de AAV parental en un alineamiento que comprende la secuencia de cápside de AAV parental y una librería de secuencias de cápside de AAV funcional. Una vez que se ha determinado la ausencia de un singletón en una cápside de AAV seleccionada, el AAV puede ser usado para generar un vector de acuerdo con técnicas conocidas.

El término “homología sustancial” o “similitud sustancial”, cuando se refiere a ácido nucleico o a un fragmento del mismo, indica que cuando se alinean óptimamente inserciones o supresiones de un nucleótido apropiado con otro ácido nucleico (o con su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótido en al menos un 95 a 99% de las secuencias alineadas. Con preferencia, la homología es sobre la longitud completa, o sobre una estructura de lectura abierta de la misma, u otro fragmento adecuado que sea al menos de 15 nucleótidos de longitud. En la presente memoria se describen ejemplos de fragmentos adecuados.

Los términos “identidad de secuencia”, “porcentaje de identidad de secuencia” o “porcentaje idéntico” en el contexto de las secuencias de ácido nucleico, se refieren a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para su máxima correspondencia. La longitud de la comparación de identidad de secuencia puede ser sobre la longitud completa del genoma, la longitud completa de una secuencia de codificación de gen, o sobre un fragmento de al menos alrededor de 500 a 5000 nucleótidos, según se desee. Sin embargo, se puede desear también identidad entre fragmentos más pequeños, por ejemplo de al menos alrededor de nueve nucleótidos, normalmente al menos de alrededor de 20 a 24 nucleótidos, al menos alrededor de 28 a 32 nucleótidos, al menos alrededor de 36 o más nucleótidos.

El término “homología sustancial” o “similitud sustancial”, cuando se refiere a aminoácidos o a fragmentos de los mismos, indica que, cuando se alinean óptimamente con inserciones o supresiones de aminoácido apropiadas con otro aminoácido (o con su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de aminoácido en al menos alrededor de un 90% a alrededor de un 99% de las secuencias alineadas, y en algunas realizaciones, alrededor del 97% de las secuencias alineadas. Con preferencia, la homología es sobre la secuencia de longitud completa o sobre una proteína de la misma, por ejemplo una proteína cap, una proteína rep, o un fragmento de la misma que sea al menos de 8 aminoácidos, o de forma más deseable, de al menos 15 aminoácidos de longitud. Ejemplos de fragmentos adecuados se describen en la presente memoria.

El término “altamente conservado” significa al menos una identidad del 80%, con preferencia una identidad de al menos el 90%, y más preferiblemente, una identidad de alrededor del 97%. Un experto en la materia determina fácilmente la identidad recurriendo a algoritmos y programas de ordenador conocidos por los expertos en la materia.

El término “serotipo” es una distinción con respecto a un AAV que tiene una cápside que es serológicamente distinta de otros serotipos de AAV. La distintividad serológica se determina en base a la falta de reactividad cruzada entre anticuerpos con el AAV en comparación con otro AAV. La reactividad cruzada se mide típicamente en un ensayo de anticuerpo neutralizante. Para este ensayo, se genera suero policlonal frente a un AAV específico en un conejo y en otro modelo de animal adecuado usando los virus adeno-asociados. En este ensayo, el suero generado frente a un AAV específico se prueba a continuación en cuanto a su capacidad para neutralizar el mismo AAV (homólogo) o

bien un AAV heterólogo. La dilución que alcanza una neutralización del 50% se considera el título de anticuerpo neutralizante. Si para dos AAVs, el cociente del título heterólogo dividido por el título homólogo es inferior a 16 de una manera recíproca, esos dos vectores se consideran como el mismo serotipo. A la inversa, si la relación del título heterólogo sobre el título homólogo es de 16 o superior de una manera recíproca, los dos AAVs se consideran serotipos distintos.

En un ejemplo adicional, el método puede ser usado para proporcionar un AAV que tenga nuevas cápsides, incluyendo rh.20, rh23/33, rh.39, rh.46, rh.73 y rh.74. Las secuencias de rh.20 tienen la misma secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 1 o una secuencia de 95 a 99% idéntica sobre la longitud completa de SEQ ID Núm. 1. La cápside de rh.32/33 tiene una secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 2 o secuencias de 95% a 99% idénticas con la misma sobre la longitud completa de SEQ ID Núm. 2. Esta cápside de rh.39 tiene una secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 3, o secuencias de 95% a 99% idénticas con la misma sobre la longitud completa de SEQ ID Núm. 3. La cápside de rh.46 tiene una secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 4, o secuencias de 95% a 99% idénticas con la misma sobre la longitud completa de SEQ ID Núm. 4. La cápside de rh.73 tiene una secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 5, o secuencias de 95% a 99% idénticas con la misma sobre la longitud completa de SEQ ID Núm. 5. La cápside de rh.74 tiene una secuencia de aminoácido de SEQ ID Núm. 6, o secuencias de 95% a 99% idénticas con la misma sobre la longitud completa de SEQ ID Núm. 6. Con preferencia, la identidad de secuencia de estas nuevas cápsides de AAV es tal que carecen de cualquier singletón. Las secuencias del nuevo AAV se proporcionan en el Listado de Secuencias.

En otro ejemplo más, las nuevas secuencias de AAV incluyen las proteínas de cápside de AAV corregidas en singletón y las secuencias que codifican esas proteínas de cápside. Ejemplos de secuencias de AAV adecuadas corregidas en singletón incluyen las AAV6.1, AAV6.2, AAV6.1.2, rh.8R, rh.48.1, rh.48.2, rh.48.1.2, hu.44R1, hu.44R2, hu.44R3, hu.29R, ch.5R1, rh.67, rh.54, hu.48R1, hu.48R2, y hu.48R3. Por ejemplo, la AAV6 corregida en singletón, incluyendo las AAV6.1, AAV6.2 y AAV6.1.2., han mostrado una mejora funcional significativa sobre la secuencia de AAV6 parental.

Las proteínas particularmente deseables incluyen las proteínas de cápside de AAV, las cuales son codificadas por las secuencias de nucleótido identificadas con anterioridad. La cápside de AAV está compuesta por tres proteínas, las vp1, vp2 y vp3, las cuales son variantes de empalme alternativas. Otros fragmentos deseables de la proteína de cápside incluyen las regiones constante y variable, situadas entre regiones hipervariables (HVR). Otros fragmentos deseables de la proteína de cápside incluyen las propias HVR.

Un algoritmo desarrollado para determinar áreas de la divergencia de secuencia en AAV2 ha producido 12 regiones hipervariables (HVR) de las que 5 se superponen o son parte de las cuatro regiones variables descritas con anterioridad. [Chiorini et al., J. Virol. 73: 1309-19 (1999); Rutledge et al., J. Virol, 72: 309-319]. Usando este algoritmo y/o las técnicas de alineamiento descritas en la presente memoria, se determina la HVR de los nuevos serotipos de AAV. Por ejemplo, las HVR se localizan como sigue: HVR1, aa 146-152; HVR2, aa 182-186; HVR3, aa 262-264; HVR4, aa 381-383; HVR5, aa 450-474; HVR6, aa 490-495; HVR7, aa-500-504; HVR8, aa 514-522; HVR9, aa 534-555; HVR10, aa 581-594; HVR11, aa 658-667; y HVR12, aa 705-719 [el sistema de numeración se basa en un alineamiento que usa la vp1 de AAV2 como punto de referencia]. Usando el alineamiento proporcionado en la presente memoria, llevado a cabo usando el programa Clustal X en configuraciones por defecto, o usando otros programas de alineamiento disponibles comercialmente o públicamente en configuraciones por defecto tales como las descritas en la presente memoria, un experto en la materia puede determinar fácilmente fragmentos correspondientes de las nuevas cápsides de AAV de la invención.

Adecuadamente, los fragmentos son de al menos 8 aminoácidos de longitud. Sin embargo, se pueden utilizar fácilmente fragmentos de otras longitudes deseadas. Tales fragmentos pueden ser producidos recombinantemente o mediante otros medios adecuados, por ejemplo mediante síntesis química.

El método de singletón puede ser usado también para proporcionar otras secuencias de AAV que se identifican usando la información de secuencia proporcionada en la presente memoria. Por ejemplo, dadas las secuencias proporcionadas en la presente memoria, la infecciosa puede ser aislada usando tecnología de genoma caminante (Siebert, et al., 1995, Nucleic Acid Research, 23: 1087-1088, Friezner-Degen et al., 1986, J. Biol. Chem. 261: 69726985, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA). El genoma caminante es particularmente adecuado para identificar y aislar las secuencias adyacentes a las nuevas secuencias identificadas conforme al método. Esta técnica es también útil para aislar repeticiones terminales invertidas (ITRs) del nuevo AAV, en base a la nueva cápside y a secuencias rep de AAV proporcionadas en la presente memoria.

Las nuevas secuencias de aminoácido de AAV, péptidos y proteínas pueden ser expresados a partir de las secuencias de ácido nucleico de AAV de la invención. Adicionalmente, estas secuencias de aminoácido, péptidos y proteínas pueden ser generados mediante otros métodos conocidos en el estado de la técnica, incluyendo por ejemplo síntesis química, mediante otras técnicas sintéticas, o mediante otros métodos. Las secuencias de cualquiera de las cápsides de AAV que se proporcionan en la presente memoria pueden ser generadas fácilmente usando una diversidad de técnicas.

Las técnicas de producción adecuadas son bien conocidas por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo,

Sambrook et al., Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY). Alternativamente, los péptidos pueden ser también sintetizados mediante métodos bien conocidos de síntesis de péptidos de fase sólida (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc., 85: 2149 (1962); Stewart and Young, Síntesis de Péptido de Fase Sólida (Freeman, San Francisco, 1969), pp. 27-62). Estos y otros métodos adecuados de producción caen dentro del conocimiento de los expertos en la materia y no constituyen una limitación de la presente invención.

Las secuencias y proteínas de la invención pueden ser producidas con cualesquiera medios adecuados, incluyendo producción recombinante, síntesis química, u otros medios sintéticos. Tales métodos de producción están dentro del conocimiento de los expertos en la materia y no constituyen una limitación de la presente invención.

III. Producción de rAAV con nuevas cápsides de AAV

La invención abarca nuevas secuencias de cápside de AAV generadas por mutación a consecuencia del uso del método de singletón descrito en la presente memoria.

En otro aspecto, la presente invención proporciona moléculas que utilizan las nuevas secuencias de AAV de la invención para la producción de vectores virales útiles para el suministro de un gen heterólogo o de secuencias de ácido nucleico a una célula objetivo.

Las moléculas de la invención que contienen secuencias de AAV incluyen cualquier elemento (vector) genético que pueda ser suministrado a una célula anfitrión, por ejemplo ADN desnudo, un plásmido, fago, transposón, cósmido, episoma, una proteína en un vehículo de suministro no viral (por ejemplo, un portador a base de lípido), virus, etc., que transfiera las secuencias portadas por el mismo.

El vector seleccionado puede ser suministrado mediante cualquier método adecuado, incluyendo transfeccion, electroporación, suministro de liposoma, técnicas de fusión de membrana, gránulos recubiertos de ADN de alta velocidad, infección viral y fusión de protoplasto. Los métodos usados para construir cualquier realización de la presente invención son conocidos por los expertos en manipulación de ácido nucleico e incluyen ingeniería genética, ingeniería recombinante, y técnicas sintéticas. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY.

En una realización, los vectores de la invención contienen, inter alia, secuencias que codifican una cápside de AAV de la invención. En otra realización, los vectores de la invención contienen, como mínimo, secuencias que codifican una proteína rep de AAV o un fragmento de la misma. Opcionalmente, los vectores de la invención pueden contener ambas proteínas rep y cap de AAV. En vectores en los que se proporcionan ambas rep y cap de AAV, las secuencias rep de AAV y cap de AAV pueden originarse a partir de un AAV del mismo clado. Alternativamente, la presente invención proporciona vectores en los que las secuencias rep proceden de una fuente de AAV que difiere de la que está proporcionando las secuencias cap. En una realización, las secuencias rep y cap son expresadas a partir de fuentes separadas (por ejemplo, vectores separados, o una célula anfitrión y un vector). En otra realización, estas secuencias rep se fusionan en un marco con secuencias cap de una fuente de AAV diferente para formar un vector de AAV quimérico. Opcionalmente, los vectores de la invención son vectores empaquetados en una cápside de AAV de la invención. Estos y otros vectores descritos en la presente memoria pueden contener un minigén que comprenda un transgén seleccionado que esté flanqueado por la ITR 5’ de AAV y por la ITR 3’ de AAV.

Los vectores descritos en la presente memoria, por ejemplo un plásmido, son útiles para una diversidad de propósitos, pero son particularmente adecuados para su uso en la producción de un rAAV que contiene una cápside que comprende secuencias de AAV o un fragmento de las mismas. Estos vectores, incluyendo el rAAV, sus elementos, su construcción y sus usos, se describen con detalle en la presente memoria.

La invención permite la generación de un virus adeno-asociado recombinante (rAAV) que tiene una nueva cápside de AAV según la invención. Dicho método incluye cultivar una célula anfitrión que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica una nueva proteína de cápside de AAV de la invención; un gen rep funcional; un minigén compuesto, como mínimo, por repeticiones terminales invertidas (ITRs) de AAV y un transgén; y, suficientes funciones auxiliares para permitir el empaquetamiento del minigén en la proteína de cápside de AAV.

Los componentes que requieren ser cultivados en la célula anfitrión para empaquetar un minigén de AAV en una cápside de AAV pueden ser proporcionados a la célula anfitrión en trans. Alternativamente, uno o más de los componentes requeridos (por ejemplo, minigén, secuencias rep, secuencias cap y/o funciones auxiliares) pueden ser proporcionadas por una célula anfitrión estable que haya sido diseñada de modo que contenga uno o más de los componentes requeridos usando métodos conocidos por los expertos en la materia. De manera más adecuada, una célula anfitrión estable de ese tipo contendrá el (los) componente(s) requerido(s) bajo el control de un promotor inducible. Sin embargo, el (los) componente(s) requerido(s) puede(n) estar bajo el control de un promotor constitutivo. Ejemplos de promotores inducibles y constitutivos adecuados se proporcionan en la presente memoria, en la discusión de elementos reguladores adecuados para su uso con el transgén. En otra alternativa más, una célula anfitrión estable seleccionada puede contener un(os) componente(s) seleccionado(s) bajo el control de un promotor constitutivo y otro(s) componente(s) seleccionado(s) bajo el control de uno o más promotores inducibles.

Por ejemplo, se puede generar una célula anfitrión estable que derive de células 293 (que contenga funciones auxiliares E1 bajo el control de un promotor constitutivo), pero que contiene las proteínas rep y/o cap bajo el control de promotores inducibles. Incluso otras células anfitrión más pueden ser generadas por un experto en la materia. El minigén, las secuencias rep, las secuencias cap, y las funciones auxiliares requeridas para producir el rAAV de la invención pueden ser suministrados a la célula anfitrión de empaquetamiento en forma de cualquier elemento genético que transfiera las secuencias portadas por el mismo. El elemento genético seleccionado puede ser suministrado mediante cualquier método adecuado, incluyendo los descritos en la presente memoria. Los métodos usados para construir cualquier realización de la invención son conocidos por los expertos en manipulación de ácido nucleico e incluyen ingeniería genética, ingeniería recombinante y técnicas sintéticas. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY. De forma similar, los métodos de generación de viriones de rAAV son bien conocidos y la selección de un método adecuado no constituye ninguna limitación de la presente invención. Véase, por ejemplo, K. Fisher et al., J. Virol., 70: 520-532 (1993) y la Patente US núm. 5.478.745.

A menos que se especifique otra cosa, las ITRs de AAV y otros componentes de AAV seleccionados descritos en la presente memoria, pueden ser seleccionados fácilmente a partir de cualquier AAV, incluyendo sin limitación los AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV9 y una de las nuevas secuencias de AAV de la invención. Estas ITRs u otros componentes de AAV pueden ser aislados fácilmente usando técnicas disponibles para los expertos en la materia, a partir de una secuencia de AAV. Tal AAV puede ser aislado u obtenido a partir de fuentes académicas, comerciales o públicas (por ejemplo, la American Type Culture Collection, Manassas, VA). Alternativamente, las secuencias de AAV pueden ser obtenidas a través de medios sintéticos o de otros medios adecuados en referencia a secuencias publicadas tal como las que están disponibles en la literatura o en bases de datos tales como, por ejemplo, GenBank®, PubMed®, o similar.

A. El minigén

El minigén está compuesto, como mínimo, por un transgén y sus secuencias reguladoras, y por repeticiones terminales invertidas (ITRs) 5’ y 3’ de AAV. En una realización deseable, se utilizan las ITRs del serotipo 2 de AAV. Sin embargo, pueden seleccionarse ITRs de otras fuentes adecuadas. Este minigén se empaqueta en una proteína de cápside y se suministra a una célula anfitriona seleccionada.

1. El transgén

El transgén es una secuencia de ácido nucleico, heteróloga respecto a las secuencias de vector que flanquean el transgén, que codifica un polipéptido, una proteína, u otro producto de interés. La secuencia de codificación de ácido nucleico está operativamente enlazada a componentes reguladores de una manera tal que permite la transcripción, traducción y/o expresión de transgén en una célula anfitrión.

La composición de la secuencia de transgén dependerá del uso que deba darse al vector resultante. Por ejemplo, un tipo de secuencia de transgén incluye una secuencia informadora que con su expresión produce una señal detectable. Tales secuencias informadoras incluyen, sin limitación, secuencias de ADN que codifican β-lactamasa, βgalactosidasa (LacZ), fosfatasa alcalina, timidina quinasa, proteína fluorescente verde (GFP), GFP potenciada (EGFP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), luciferasa, proteínas enlazadas por membrana incluyendo, por ejemplo, CD2, CD4, CD8, la proteína de hemaglutinina de influenza, y otras bien conocidas en el estado de la técnica, respecto a las que pueden existir o ser producidos anticuerpos de alta afinidad dirigidos a las mismas con medios convencionales, y proteínas de fusión que comprenden una proteína enlazada por membrana fusionada apropiadamente con un dominio de etiqueta de antígeno procedente, entre otros, de hemaglutinina o de Myc.

Estas secuencias de codificación, cuando están asociadas a elementos reguladores que activan su expresión, proporcionan señales detectables con medios convencionales, incluyendo ensayos enzimáticos, radiográficos, colorimétricos, de fluorescencia u otros ensayos espectrográficos, ensayos de clasificación de célula de activación de fluorescencia y ensayos inmunológicos, incluyendo el ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA), el radioinmunoensayo (RIA) y la inmunohistoquímica. Por ejemplo, cuando la secuencia marcadora es el gen LacZ, la presencia del vector portador de la señal se detecta mediante ensayos respecto a actividad de beta-galactosidasa. Cuando el transgén es proteína fluorescente verde o luciferasa, el vector portador de la señal puede ser medido visualmente mediante producción de color o de luz en un luminómetro.

Sin embargo, deseablemente, el transgén es una secuencia no marcadora que codifica un producto que es útil en biología y medicina, tal como proteínas, péptidos, ARN, enzimas, mutantes negativos dominantes, o ARNs catalíticos. Las moléculas de ARN deseables incluyen tARN, dsARN, ARN ribosómico, ARNs catalíticos, siARN, ARN de horquilla pequeña, ARN de empalme trans, y ARNs antisentido. Un ejemplo de una secuencia de ARN útil es una secuencia que inhibe o extingue la presencia de una secuencia de ácido nucleico objetivada en el animal tratado. Típicamente, las secuencias objetivo adecuadas incluyen objetivos oncológicos y enfermedades virales. Véase, como ejemplo de tales objetivos, los objetivos oncológicos y los virus identificados en lo que sigue en la sección relativa a inmunógenos.

El transgén puede ser usado para corregir o mejorar deficiencias de gen, las cuales pueden incluir deficiencias en

las que los genes normales son expresados a niveles menores que los normales o deficiencias en las que el producto de gen funcional no está expresado. Alternativamente, el transgén puede proporcionar un producto a una célula que no sea expresado de forma natural en el tipo de célula o en el anfitrión. Un tipo preferido de secuencia de transgén codifica una proteína terapéutica o un polipéptido que se expresa en una célula anfitrión. La invención incluye además el uso de múltiples transgenes. En algunas situaciones, se puede usar un transgén diferente para codificar cada subunidad de una proteína, o para codificar diferentes péptidos o proteínas. Esto es deseable cuando el tamaño del ADN que codifica la subunidad de proteína es grande, por ejemplo para una inmunoglobulina, para el factor de crecimiento derivado de plaqueta, o para una proteína de distrofina. Con el fin de que la célula produzca la proteína multi-subunidad, se infecta una célula con el virus recombinante que contiene cada una de las diferentes subunidades. Alternativamente, las diferentes subunidades de una proteína pueden ser codificadas mediante el mismo transgén. En este caso, un transgén simple incluye el ADN que codifica cada una de las subunidades, estando el ADN para cada unidad separado por un sitio de entrada de ribozima interna (IRES). Esto es deseable cuando el tamaño del ADN que codifica cada una de las subunidades es pequeño, por ejemplo el tamaño total del ADN que codifica las subunidades y los IRES es menor de cinco kilobases. Como alternativa a un IRES, el ADN puede estar separado por secuencias que codifican un péptido 2A, el cual se autoescinde en un evento posttraslacional. Véase, por ejemplo, M.L. Donnelly, et al., J. Gen. Virol., 78(Pt 1): 13-21 (Enero 1997); Furler, S., et al., Gene Ther., 8(11): 864-873 (Junio 2001); Klump H., et al., Gene Ther., 8(10): 811-817 (Mayo 2001). Este péptido 2A es significativamente más pequeño que un IRES, lo que hace que sea muy adecuado para su uso cuando el espacio es un factor limitativo. Con más frecuencia, cuando el transgén es grande, consiste en múltiples subunidades, o se co-suministran dos transgenes, portando el RAAV el (los) transgén(es) deseado(s) o se co-administran las subunidades para permitirles concatamerizar in vivo para formar un genoma de vector simple. En una realización de ese tipo, un primer AAV puede portar una casete de expresión que exprese un transgén simple y un segundo AAV puede portar una casete de expresión que exprese un transgén diferente para su co-expresión en la célula anfitrión. Sin embargo, el transgén seleccionad puede codificar cualquier producto biológicamente activo u otro producto, por ejemplo, un producto deseable para su estudio.

Los transgenes adecuados pueden ser seleccionados fácilmente por un experto en la materia. La selección del transgén no se considera una limitación de la presente invención.

2. Elementos reguladores

Adicionalmente a los elementos principales identificados anteriormente para el minigén, el vector incluye también elementos de control convencionales que están operativamente enlazados al transgén de una manera que permiten su transcripción, traducción y/o expresión en una célula transfectada con el vector de plásmido o infectada con el virus producido por la invención. Según se utiliza en la presente memoria, secuencias “operativamente enlazadas” incluyen tanto secuencias de control de expresión que son contiguas con el gen de interés como secuencias de control de expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés.

Las secuencias de control de expresión incluyen secuencias de transcripción, iniciación, promotoras y potenciadoras apropiadas; señales de procesamiento eficiente de ARN tal como señales de empalme y poliadenilación (poliA); secuencias que estabilizan mARN citoplásmico; secuencias que potencian la eficiencia de traducción (es decir, secuencias de consenso de Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de la proteína; y cuando se desee, secuencias que aumentan la secreción del producto codificado. Un gran número de secuencias de control de expresión, incluyendo las promotoras que son naturales, constitutivas, inducibles y/o específicas del tejido, son conocidas en el estado de la técnica y pueden ser utilizadas.

Ejemplos de promotores constitutivos incluyen, sin limitación, el promotor LTR del virus del sarcoma retroviral de Rous (RSV) (opcionalmente con el potenciador de RSV), el promotor de citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el potenciador de CMV) [véase, por ejemplo, Boshart et al., Célula, 41: 521-530 (1985)], el promotor SV40, el promotor de dihidrofolato reductasa, el promotor de β-actina, el promotor de fosfoglicerol quinasa (PGK), y el promotor de EF1 [Invitrogen]. Los promotores inducibles permiten la regulación de expresión de gen y pueden ser regulados mediante compuestos suministrados exógenamente, mediante factores ambientales tales como la temperatura, o por la presencia de un estado fisiológico específico como por ejemplo, fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula, o en células replicantes solamente. Los promotores inducibles y los sistemas inducibles están disponibles a partir de una diversidad de fuentes comerciales, incluyendo, sin limitación, Invitrogen, Clontech y Ariad. Se han descrito muchos otros sistemas y pueden ser fácilmente seleccionados por un experto en la materia. Ejemplos de promotores inducibles regulados por compuestos suministrados exógenamente incluyen el promotor de metalotionina (MT) de oveja inducible por zinc, el promotor del virus de tumor de mama de ratón (MMTV) inducible por dexametasona (Dex), el sistema promotor de polimerasa T7 [publicación de Patente Internacional núm. WO 98/10088]; el promotor de insecto de ecdisoma [No et al., Proc . Natl. Acad. Sci. USA, 93: 3346-3351 (1996)], el sistema reprimible por tetraciclina [Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551 (1992)], el sistema inducible por tetraciclina [Gossen et al., Ciencia, 268: 1766-1769 (1995), véase también Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2: 512-518 (1998)], el sistema inducible por RU486 [Wang et al., Nat. Biotech., 15: 239243 (1997) y Wang et al., Gene Ther., 4: 432-441 (1997)] y el sistema inducible por rapamicina [Magari et al., J. Clin. Invest., 100: 2865-2872 (1997)]. Otros tipos de promotores inducibles que pueden ser útiles en este contexto son aquellos que se regulan mediante un estado fisiológico específico, por ejemplo la temperatura, una fase aguda, un

estado de diferenciación particular de la célula, o en células replicantes solamente.

En otra realización, se utilizará el promotor natural para el transgén. El promotor natural puede ser el preferido cuando se desea que la expresión del transgén mimetice la expresión natural. El promotor natural puede ser usado cuando la expresión del transgén debe ser regulada temporalmente o durante el desarrollo, o de una manera específica del tejido, o en respuesta a estímulos transcripcionales específicos. En una realización adicional, se pueden usar también otros elementos naturales de control de expresión, tal como elementos potenciadores, sitios de poliadenilación o secuencias de consenso de Kozak, para mimetizar la expresión natural.

Otra realización del transgén incluye un gen operativamente enlazado a un promotor específico del tejido. Por ejemplo, si se desea expresión en el músculo esquelético, se deberá usar un promotor activo en el músculo. Esto incluye los promotores procedentes de genes que codifican la β-actina esquelética, la cadena ligera 2A de miosina, la creatina quinasa de músculo, así como promotores de músculo sintéticos con actividades más altas que los promotores que se producen de forma natural (véase Li et al., Nat. Biotech. 17: 241-245 (1999)). Ejemplos de promotores que son específicos del tejido son conocidos para el hígado (albúmina, Miyatake et al., J. Virol., 71: 5124-32 (1997); promotor de núcleo del virus de la hepatitis B, Sandig et al., Gene Ther., 3: 1002-9 (1996); alfafetoproteína (AFP), Arbunthnot et al., Hum. Gene Ther., 7: 1503-14 (1996)), osteocalcina ósea (Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24: 185-96 (1997)); sialloproteína ósea (Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11: 654-64 (1996)), linfocitos (CD2, Hansal et al., J. Immunol., 161: 1063-8 (1998); cadena pesada de inmunoglobulina; cadena receptora de célula T), promotor neuronal tal como promotor de enolasa específica de neurona (NSE) (Andersen et al., Cell Mol. Neurobiol.,

13: 503-15 (1993)), gen de cadena ligera de neurofilamento (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 5611-5 (1991)), y el gen vgf específico de neurona (Piccioli et al., Neuron, 15: 373-84 (1995)), entre otros.

Opcionalmente, los plásmidos portadores de transgenes terapéuticamente útiles pueden incluir también genes marcadores o informadores seleccionables (situados preferentemente fuera del genoma viral que va a ser rescatado mediante el método de la invención) pueden ser usados para indicar la presencia de los plásmidos en las células bacterianas, tal como por resistencia a la ampicilina. Otros componentes del plásmido pueden incluir un origen de replicación. La selección de estos y otros promotores y elementos de vector, se hace de manera convencional y muchas de esas secuencias están disponibles [véase, por ejemplo, Sambrook et al., y las referencias citadas en la misma].

La recombinación de transgén, de promotor/potenciador, y de las ITRs 3’ y 5’ de AAV, se menciona como “minigén” por facilidad de referencia en la presente memoria. Siempre según las enseñanzas de esta invención, el diseño de tal minigén puede hacerse recurriendo a técnicas convencionales.

3. Suministro del minigén a una célula anfitrión de empaquetamiento

El minigén puede ser portado sobre cualquier vector adecuado, por ejemplo un plásmido, que se suministre a una célula anfitrión. Los plásmidos útiles en la presente invención pueden estar diseñados de tal modo que sean adecuados para replicación y, opcionalmente, para integración en células procarióticas, en células de mamíferos, o en ambas. Estos plásmidos (u otros vectores portadores de la ITR 5’ de AAV – molécula heteróloga – ITR 3’ de AAV) contienen secuencias que permiten la replicación del minigén en marcadores eucariotas y/o procariotas y de selección para esos sistemas. Los genes marcadores o informadores seleccionables pueden incluir secuencias que codifican la resistencia a la geneticina, a la higromicina o a la purimicina, entre otras. Los plásmidos pueden contener también ciertos genes informadores o marcadores seleccionables que pueden ser usados para indicar la presencia del vector en células bacterianas, tal como por resistencia a ampicilina. Otros componentes del plásmido pueden incluir un origen de replicación y un amplicón, tal como el sistema de amplicón que emplea el antígeno nuclear del virus de Epstein Barr. Este sistema de amplicón, u otros componentes de amplicón similares, permiten una replicación episómica de alta copia en las células. Con preferencia, la molécula que porta el minigén es transfectada en la célula, donde puede existir transitoriamente. Alternativamente, el minigén (que porta la ITR 5’ de AAV – molécula heteróloga – ITR 3’ de AAV), puede estar integrado de forma estable en el genoma de la célula anfitrión, ya sea cromosómicamente o ya sea como episoma. En algunas realizaciones, el minigén puede estar presente en múltiples copias, opcionalmente en concatámeros de cabeza con cabeza, cabeza con cola, o cola con cola. Las técnicas de transfección adecuadas son conocidas y pueden ser fácilmente utilizadas para suministrar el minigén a la célula anfitrión.

En general, cuando se suministra el vector que comprende el minigén mediante transfección, el vector es suministrado en una cantidad que va desde aproximadamente 5 µg a aproximadamente 100 µg de ADN, aproximadamente 10 µg a aproximadamente 50 µg de ADN, en aproximadamente 1 x 104 células a aproximadamente 1 x 1013 células, o en aproximadamente 1 x 105 células. Sin embargo, las cantidades relativas de ADN de vector en células anfitrión pueden ser ajustadas por un experto en la materia, quién puede tener en cuenta factores tales como el vector seleccionado, el método de suministro y las células anfitrión seleccionadas.

B. Secuencias rep y cap

Adicionalmente al minigén, la célula anfitrión contiene las secuencias que activan expresión de una nueva proteína de cápside de AAV de la invención (o una proteína de cápside que comprende un fragmento de las mismas) en la

célula anfitrión y secuencias rep de la misma fuente que la fuente de las ITRs de AAV encontradas en el minigén, o de una fuente de complementación cruzada. Las secuencias cap y rep de AAV pueden ser obtenidas, de forma independiente, a partir de una fuente de AAV según se ha descrito en lo que antecede, y pueden ser introducidas en la célula anfitrión de cualquier manera conocida por los expertos en la materia, según se ha descrito con anterioridad. Adicionalmente, cuando se seudotipa un vector de AAV, las secuencias que codifican cada una de las proteínas rep esenciales pueden ser suministradas mediante diferentes fuentes de AAV 8por ejemplo, los AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9). Por ejemplo, las secuencias rep78/68 pueden proceder del AAV2, mientras que las secuencias rep52/40 pueden proceder del AAV8.

En una realización, la célula anfitrión contiene de forma estable la proteína de cápside bajo el control de un promotor adecuado, tal como los que se han descrito con anterioridad. Más deseablemente, en esta realización, la proteína de cápside se expresa bajo el control de un promotor inducible. En otra realización, la proteína de cápside se suministra a la célula anfitr8ión en trans. Cuando se suministra a la célula anfitrión en trans, la proteína de cápside puede ser suministrada por medio de un plásmido que contiene las secuencias necesarias para dirigir la expresión de la proteína de cápside seleccionada en la célula anfitrión. Más deseablemente, cuando se suministra a la célula anfitrión en trans, el plásmido que porta la proteína de cápside porta también otras secuencias requeridas para empaquetar el rAAV, por ejemplo las secuencias rep.

En otra realización, la célula anfitrión contiene de forma estable las secuencias rep bajo el control de un promotor adecuado, tal como los que se han descrito en lo que antecede. Más deseablemente, en esta realización, las proteínas rep esenciales son expresadas bajo el control de un promotor inducible. En otra realización, las proteínas rep son suministradas a la célula anfitrión en trans. Cuando se suministran a la célula anfitrión en trans, las proteínas rep pueden ser suministradas por medio de un plásmido que contiene las secuencias necesarias para dirigir la expresión de las proteínas rep seleccionadas en la célula anfitrión. Más deseablemente, cuando se suministra a la célula anfitrión en trans, el plásmido que porta la proteína de cápside porta también otras secuencias requeridas para empaquetar el rAAV, por ejemplo, las secuencias rep y cap.

Así, en una realización, las secuencias rep y cap pueden ser transfectadas en la célula anfitrión sobre una molécula simple de ácido nucleico y existir establemente en las células a modo de episoma. En otra realización, las secuencias rep y cap están integradas establemente en el cromosoma de la célula. Otra realización tiene las secuencias rep y cap expresadas transitoriamente en la célula anfitrión. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico útil para tal transfección comprende, desde 5’ hasta 3’, un promotor, un espaciador opcional intercalado entre el promotor y el sitio de inicio de la secuencia de gen rep, una secuencia de gen rep de AAV, y una secuencia de gen cap de AAV.

Opcionalmente, las secuencias rep y/o cap pueden ser suministradas sobre un vector que contiene otras secuencias de ADN que han de ser introducidas en las células anfitrión. Por ejemplo, el vector puede contener la construcción de rAAV que comprende el minigén. El vector puede comprender uno o más de los genes que codifican las funciones auxiliares, por ejemplo las proteínas adenovirales E1, E2a, y E4 ORF6, y el gen para VAI ARN.

Con preferencia, el promotor utilizado en esta construcción puede ser cualquiera de entre los promotores constitutivos, inducibles o naturales conocidos por los expertos en la materia o según se ha discutido en lo que antecede. En una realización, se emplea una secuencia de promotor P5 de AAV. La selección del AAV para proporcionar cualquiera de esas secuencias no constituye una limitación de la invención.

En otra realización preferida, el promotor para la rep es un promotor inducible, tal como los que se han discutido anteriormente en relación con los elementos reguladores de transgén. Un promotor preferido para expresión rep es el promotor T7. El vector qu3e comprende el gen rep regulado por el promotor T7 y el gen cap, es transfectado o transformado en una célula que expresa, ya sea constitutivamente o ya sea induciblemente, la polimerasa de T7. Véase la publicación de P<atente Internacional núm. WP 98/10099, publicada el 12 de Marzo de 1998.

El espaciador es un elemento opcional en el diseño del vector. El espaciador es una secuencia de ADN intercalada entre el promotor y el sitio de inicio ATG de gen rep. El espaciador puede tener cualquier diseño deseado; es decir, puede ser una secuencia aleatoria de nucleótidos, o alternativamente, puede codificar un producto de gen, tal como un gen marcador. El espaciador puede contener genes que incorporen típicamente sitios de inicio/detención y poliA. El espaciador puede ser una secuencia de ADN no codificadora, procedente de una procariota o eucariota, una secuencia no codificadora repetitiva, una secuencia de codificación sin controles transcripcionales, o una secuencia de codificación con controles transcripcionales. Dos ejemplos de fuentes de secuencias espaciadoras son las secuencias escalera de fago o las secuencias escalera de levadura, las cuales están disponibles comercialmente, por ejemplo en Gibco o Invitrogen, entre otros. El espaciador puede ser un tamaño cualquiera suficiente para reducir la expresión de los productos de gen rep78 y rep68, dejando los productos de gen rep52, rep40 y cap expresados a niveles normales. La longitud del espaciador puede estar comprendida, por lo tanto, entre alred3edor de 10 bp y alrededor de 10,0 kbp, con preferencia en la gama de alrededor de 100 bp a alrededor de 8,0 kbp. Para reducir la posibilidad de recombinación, el espaciador es preferentemente de una longitud menor de 2 kbp; sin embargo, la invención no está limitada por ello.

Aunque la(s) molécula(s) que proporciona(n) rep y cap pueden existir en la célula anfitrión transitoriamente (es decir,

mediante transfección), se prefiere que tanto las proteínas rep y cap como el (los) promotor(es) que controla(n) su expresión esté(n) expresado(s) de forma estable en la célula anfitrión, por ejemplo como episoma o mediante integración en el cromosoma de la célula anfitrión. Los métodos empleados para construir las realizaciones de esta invención son técnicas convencionales de ingeniería genética o de ingeniería recombinante tales como las descritas en las referencias que anteceden. Mientras esta descripción proporciona ejemplos ilustrativos de construcciones específicas, usando la información proporcionada en la presente memoria, un experto en la materia puede seleccionar y diseñar otras construcciones adecuadas, usando una opción de espaciadores, promotores P5 y otros elementos, incluyendo al menos una señal de inicio y detención traslacional, y la adición opcional de sitios de poliadenilación.

En otra realización de la presente invención, la proteína rep o cap puede ser proporciona de forma estable por una célula anfitrión.

C. Las funciones auxiliares

La célula anfitrión de empaquetamiento necesita también funciones auxiliares a efectos de empaquetar el rAAV de la invención. Opcionalmente, esas funciones pueden ser suministradas por un herpesvirus. Más deseablemente, las funciones auxiliares necesarias son proporcionadas, cada una de ellas, a partir de una fuente de adenovirus de primate humano o no humano, tal como las que se han descrito con anterioridad y/o están disponibles a partir de una diversidad de fuentes, incluyendo la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA (US). En una realización normalmente preferida, la célula anfitrión se ha dotado de, y/o contiene, un producto de gen E1a, un producto de gen E1b, un 0producto de gen E2a, y/o un producto de gen E4 ORF6. La célula anfitrión puede contener otros genes adenovirales tal como VAI ARN, pero esos genes no se necesitan. En una realización preferida, no hay ningún otro gen de adenovirus o funciones de gen presentes en la célula anfitrión.

Mediante “ADN adenoviral que expresa el producto de gen E1a”, se entiende cualquier secuencia de adenovirus que codifique E1a o cualquier porción de E1a funcional. El ADN adenoviral que expresa el producto de gen E2a y el ADN adenoviral que expresa los productos de gen E4 ORF6 se definen de forma similar. También están incluidos cualesquiera alelos u otras modificaciones del gen adenoviral o de la porción función del mismo. Tales modificaciones pueden ser introducidas deliberadamente recurriendo a técnicas convencionales mutagénicas o de ingeniería genética para potenciar la función adenoviral de alguna manera, así como las variantes alélicas de las mismas que ocurren de forma natural. Tales modificaciones y métodos para manipular ADN para conseguir esas funciones de gen de adenovirus son conocidos por los expertos en la materia.

Los productos de gen E1a, E1b, E2a y/o E4ORF6, así como cualesquiera otras funciones auxiliares deseadas, pueden ser proporcionados usando cualesquiera medios que permitan su expresión en una célula. Cada una de las secuencias que codifican esos productos puede estar en un vector separado, o uno o más genes pueden estar en el mismo vector. El vector puede ser cualquier vector conocido en el estado de la técnica o descrito en lo que antecede, incluyendo los plásmidos, cósmidos y virus. La introducción en la célula anfitrión del vector puede ser lograda con cualquier medio conocido en el estado de la técnica o descrito en lo que antecede, incluyendo transfección, infección, electroporación, suministro de liposoma, técnicas de fusión de membrana, gránulos recubiertos de ADN de alta velocidad, infección viral y fusión de protoplasto, entre otros. Uno o más de los genes adenovirales pueden estar integrados de forma estable en el genoma de la célula anfitrión, expresados de forma estable como episomas, o expresados transitoriamente. Los productos de gen pueden estar todos expresados transitoriamente, sobre un episoma o integrados de forma estable, o algunos de los productos de gen pueden estar expresados de forma estable mientras otros están expresados de forma transitoria. Además, el promotor para cada uno de los genes adenovirales puede ser seleccionado independientemente a partir de un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor adenoviral natural. Los promotores pueden estar regulados por un estado fisiológico específico del organismo o de la célula (es decir, por el estado de diferenciación o en células replicantes o quiescentes) o por otros medios, por ejemplo mediante factores añadidos exógenamente.

D. Células anfitrión y líneas de células de empaquetamiento

La célula anfitrión, en sí misma, puede ser seleccionada a partir de cualquier organismo biológico, incluyendo las células procarióticas (por ejemplo, bacterianas) y células eucarióticas, incluyendo células de insecto, células de levadura y células de mamífero. Las células anfitrión particularmente deseables se eligen entre especies cualesquiera de mamífero, incluyendo sin limitación células tales como A549, WEHI, 3T3, 10T1/2, BHK, MDCK, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, WI38, HeLa, células 293 (las cuales expresan E1 adenoviral funcional), Saos, C2C12, células L, HT1080, HepG2, y fibroblasto primario, hepatocito y células de mioblasto derivadas de mamíferos incluyendo el ser humano, el mono, el ratón, la rata, el conejo y el hámster. La selección de las especies de mamífero que proporcionan las células no es una limitación de la presente invención, ni lo es el tipo de célula de mamífero, es decir, fibroblasto, hepatocito, célula de tumor, etc. Los requisitos para la célula son que no porte ningún gen de adenovirus distinto de E1, E2a y/o E4 ORF6; no contenga cualquier otro gen de virus que pudiera dar como resultado la recombinación homóloga de un virus contaminante durante la producción de rAAV; y, que sea capaz de infección o transfección de ADN y de expresión del ADN transfectado. En una realización preferida, la célula anfitrión es una que tiene rep y cap transfectadas establemente en la célula.

Una célula anfitrión útil en la presente invención es una célula anfitrión transformada establemente con secuencias que codifican rep y cap, y que está transfectada con el ADN de E1, E2a, E4 ORF6 de adenovirus y una construcción portadora del minigén según se ha descrito con anterioridad. Las líneas de células de expresión de rep y/o cap estables, tal como la B-50 (publicación de solicitud de Patente Internacional núm. WO 99/15685), o las descritas en la Patente US núm. 5.658.785, pueden ser empleadas también de forma similar. Otra célula anfitrión deseable contiene el mínimo ADN adenoviral que sea suficiente para expresar E4 ORF6. Incluso pueden ser construidas otras líneas de célula usando las nuevas secuencias cap de AAV corregido en singletón de la invención.

La preparación de una célula anfitrión útil en la presente invención incluye técnicas tales como el ensamblaje de secuencias de ADN seleccionadas. Este ensamblaje puede ser llevado a cabo utilizando técnicas convencionales. Tales técnicas incluyen clonación genómica y de cADN, las cuales son bien conocidas y han sido descritas en Sambrook et al., mencionado anteriormente, el uso de secuencias solapantes de oligonucleótido de los genomas de adenovirus y de AAV, combinado con reacción de cadena de polimerasa, métodos sintéticos, y cualesquiera otros métodos adecuados que proporcionen la secuencia de nucleótido deseada.

La introducción de las moléculas (como plásmidos o virus) en la célula anfitrión puede ser también llevada a cabo usando técnicas conocidas por los expertos en la materia y discutidas a través de la descripción. En la realización preferida, se usan técnicas de transfección estándar, por ejemplo transfección o electroporación de CaPO4, y/o infección por vectores híbridos de adenovirus/AAV en líneas de células tal como la línea celular de riñón embriónico humano HEK 293 (una línea de células de riñón humano que contiene genes E1 de adenovirus funcional, que proporciona proteínas E1 que actúan en trans).

Un experto en la materia comprenderá fácilmente que las nuevas secuencias de AAV de la invención pueden ser adaptadas fácilmente para su uso en estos y otros sistemas de vector viral para suministro de gen in vitro, ex vivo o in vivo. De forma similar, un experto en la materia podrá seleccionar otros fragmentos del genoma de AAV de la invención para su uso en una diversidad de sistemas de vector rAAV y no rAAV. Tales sistemas de vector pueden incluir, por ejemplo, lentivirus, retrovirus, poxivirus, virus vaccinia, y sistemas adenovirales, entre otros. La selección de estos sistemas de vector no es una limitación de la presente invención.

Así, la invención proporciona además vectores generados usando las secuencias de ácido nucleico y de aminoácido del nuevo AAV de la invención. Tales vectores son útiles para una diversidad de propósitos, incluyendo el suministro de moléculas terapéuticas y el uso en regímenes de vacuna. Particularmente deseables para el suministro de moléculas terapéuticas son los AAV recombinantes que contienen cápsides del nuevo AAV de la invención. Estas u otras construcciones de vector, que contienen nuevas secuencias de AAV según la invención, pueden ser usadas en regímenes de vacuna, por ejemplo para el suministro de una citoquina o para el suministro de un inmunógeno en sí mismo.

IV. Virus recombinantes y usos de los mismos

Usando las técnicas descritas en la presente memoria, un experto en la materia puede generar un rAAV que tenga una cápside de un AAV según la invención, o que tenga una cápside que contenga uno o más fragmentos de un AVV según la invención. En una realización, se puede utilizar una cápside de longitud completa a partir de un AAV corregido en singletón.

A. Suministro de virus

Los vectores conforme a la presente invención proporcionan un método para el suministro de un gen a un anfitrión que incluye transfectar o infectar una célula anfitrión seleccionada con un vector viral recombinante generado con el AAV corregido en singletón (o un fragmento funcional del mismo) de la invención. Los métodos de suministro son bien conocidos por los expertos en la materia y no constituyen una limitación de la presente invención.

En una realización deseable, la invención habilita un método para el suministro mediado por AAV de un transgén a un anfitrión. Este método incluye transfectar o infectar una célula anfitrión seleccionada con un vector viral recombinante que contiene un transgén seleccionado bajo el control de secuencias que dirigen la expresión del mismo y las proteínas de cápside modificadas de las cápsides.

Opcionalmente, una muestra del anfitrión puede ser en primer lugar sometida a ensayo en cuanto a la presencia de anticuerpos respecto a una fuente de AAV seleccionada (por ejemplo, un serotipo). Una diversidad de formatos de ensayo para detectar anticuerpos neutralizantes son bien conocidos por los expertos en la materia. La selección de un ensayo de ese tipo no es una limitación de la presente invención. Véase, por ejemplo, Fisher et al., Nature Med., 3(3): 306-312 (marzo de 1997), y W.C. Manning et al., Terapia de Gen Humano, 9: 477-485 (1 de Marzo de 1998). Los resultados del ensayo pueden ser usados para determinar qué vector de AAV que contiene proteínas de cápside de una fuente particular, es el preferido para el suministro, por ejemplo mediante la ausencia de anticuerpos neutralizantes específicos para esa fuente de cápside.

En otro aspecto de este método, el suministro de vector con proteínas de cápside de AAV de la invención puede preceder o seguir al suministro de un gen por medio de un vector con una proteína de cápside de AAV diferente. Así,

el suministro de gen a través de vectores de AAV puede ser usado repetir el suministro de gen a una célula anfitrión seleccionada. Deseablemente, los vectores de rAAV suministrados posteriormente portan el mismo transgén que el primer vector de rAAV, pero los vectores administrados posteriormente contienen proteínas de cápside de fuentes (y con preferencia, serotipos diferentes) que difieren del primer vector. Por ejemplo, si un primer vector tiene proteínas de una cápside corregida en singletón, los vectores administrados posteriormente pueden tener proteínas de cápside seleccionadas entre el otro AAV, opcionalmente, procedente de otro serotipo o procedente de otro clado.

Opcionalmente, se pueden usar múltiples vectores de rAAV para suministrar transgenes grandes o múltiples transgenes mediante co-administración de vectores de rAAV concatamerizados in vivo para formar un genoma de vector simple. En una realización de ese tipo, un primer AAV puede portar una casete de expresión que exprese un transgén simple (o una subunidad del mismo) y un segundo AAV puede portar una casete de expresión que exprese un segundo transgén (o una subunidad diferente) para su co-expresión en la célula anfitrión. Un primer AAV puede portar una casete de expresión que es una primera pieza de una construcción policistrónica (por ejemplo, un promotor y transgén, o una subunidad) y un segundo AAV puede portar una casete de expresión que es una segunda pieza de una construcción policistrónica (por ejemplo, un transgén o subunidad y una secuencia de poliA). Estas dos piezas de una construcción policistrónica concatamerizan in vivo para formar un genoma de vector simple que co-expresa los transgenes suministrados por el primer y el segundo AAVs. En tales realizaciones, el vector de rAAV que porta la primera casete de expresión y el vector de rAAV que porta la segunda casete de expresión pueden ser proporcionados en una sola composición farmacéutica. En otras realizaciones, los dos o más vectores de rAAV son suministrados como composiciones farmacéuticas separadas que pueden ser administradas sustancialmente de forma simultánea, o una o poco antes o un poco después que la otra.

Los vectores recombinantes descritos en lo que antecede pueden ser suministrados a células anfitrión de acuerdo con métodos publicados. El rAAV, suspendido con preferencia en un portador fisiológicamente compatible, puede ser administrado a un paciente mamífero humano o no humano. Los portadores adecuados pueden ser seleccionados fácilmente por un experto en la materia en vista de la indicación para la que el virus de transferencia sea dirigido. Por ejemplo, un portador adecuado incluye solución salina, la cual puede ser formulada con una diversidad de soluciones tampón (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato). Otros portadores ejemplares incluyen solución salina estéril, lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, gelatina, dextrano, agar, pectina, aceite de cacahuete, aceite de sésamo y agua. La selección del portador no es una limitación de la presente invención.

Opcionalmente, las composiciones de la invención pueden contener, adicionalmente al rAAV y al (a lo) portador(es), otros ingredientes farmacéuticos convencionales, tal como conservantes o esterilizadores químicos. Ejemplos adecuados de conservantes incluyen el clorobutanol, sorbato de potasio, ácido sórbico, dióxido de azufre, propil galato, parabenos, etil vanilina, glicerina, fenol, y paraclorofenol. Los estabilizadores químicos adecuados incluyen gelatina y albúmina.

Los vectores son administrados en cantidades suficientes para transfectar las células y para proporcionar niveles suficientes de transferencia y expresión de gen para proporcionar un beneficio terapéutico sin efectos adversos indebidos, o con efectos fisiológicos médicamente aceptables, los cuales pueden ser determinados por los expertos en las artes médicas. Las vías de administración convencionales y farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque sin limitación, suministro directo a un órgano (por ejemplo, el hígado (opcionalmente a través de la arteria hepática)

o el pulmón), oral, inhalación, intratraqueal, intraocular, intravenoso, intramuscular, subcutáneo, intradérmico, y otras rutas de administración parentales. Las rutas de administración pueden ser combinadas, si se desea.

Las dosificaciones de vector viral dependerán principalmente de factores tales como la condición que va a ser tratada, el peso y el estado de salud del paciente, y por lo tanto pueden variar entre pacientes. Por ejemplo, una dosificación humana terapéuticamente eficaz del vector viral está por lo general comprendida en la gama de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 100 ml, de solución que contiene concentraciones de 1 x 109 a 1 x 1016 genomas de vector viral. Una dosis humana preferida para su suministro a un órgano grande (por ejemplo, el hígado, el músculo, el corazón o el pulmón), puede ser de aproximadamente 5 x 1010 a 5 x 1013 genomas de AAV por 1 kg, a un volumen de aproximadamente 1 a 100 ml. Una dosis preferida para su suministro al ojo es de aproximadamente 5 x 109 a 5 x 1012 copias de genoma, a un volumen de aproximadamente 0,1 ml a 1 ml. Las dosis podrán ser ajustadas para equilibrar el beneficio terapéutico frente a cualquier efecto colateral, y tales dosis pueden variar dependiendo de la aplicación terapéutica para la que se emplee el vector recombinante. Los niveles de expresión del transgén pueden ser monitorizados para determinar la frecuencia de dosificación resultante en vectores virales, con preferencia vectores de AAV que contienen el minigén. Opcionalmente, se pueden utilizar regímenes de dosificación similares a los descritos con fines terapéuticos, para inmunización, usando las composiciones de la invención.

Ejemplos de productos terapéuticos y de productos inmunogénicos para su suministro mediante vectores de la invención que contienen AAV, se proporcionan en lo que sigue. Estos vectores pueden ser usados para una diversidad de regímenes terapéuticos y de vacuna, según se describe en la presente memoria. Adicionalmente, esos vectores pueden ser suministrados en combinación con uno o más de otros vectores o ingredientes activos en un régimen terapéutico y/o de vacuna deseado.

B. Transgenes terapéuticos

Los productos terapéuticos útiles codificados por el transgén incluyen hormonas y factores de crecimiento y de diferenciación incluyendo, aunque sin limitación, insulina, glucagón, hormona del crecimiento (GH), hormona paratiroidea (PTH), factor de liberación de hormona de crecimiento (GRF), hormona de estimulación de folículo (FSH), hormona leutinizante (LH), gonadotropina coriónica humana (hCG), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), angiopoyetina, angiostatina, factor de estimulación de colonia de granulocito (GCSF), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF), factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), factor de crecimiento de fibroblasto acídico (aFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF), factores I y II de crecimiento de insulina (IGF-I e IGF.II), uno cualquiera de una familia de factor de crecimiento de transformación, incluyendo la TGFα, activinas, inhibinas, o cualquiera de las proteínas morfogénicas óseas (BMP) BMPs 1-15, uno cualquiera de la familia de factores de crecimiento de herogluína/neurogluína/neu factor de crecimiento (NDF), factor de crecimiento nérveo (NGF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofinas NT-3 y NT-4/5, factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico derivado de línea celular glial (GDNF), neurturina, agrina, uno cualquiera de la familia de semaforinas/colapsinas, netri-1 y netrin-2, factor de crecimiento de hepatocito (HGF), efrinas, noggin, erizo sónico y tirosina hidroxilasa.

Otros productos de transgén útiles incluyen proteínas que regulan el sistema inmune incluyendo, sin limitación, citoquinas y linfoquinas tal como la trombopoyetina (TPO), interleuquinas (IL) IL-1 a IL-25 (incluyendo, por ejemplo, IL-2, IL-4, IL-12 e IL-18), proteína quimioatrayente de monocito, factor inhibidor de leucemia, factor de estimulación de colonia de granulocito-macrófago, ligando Fas, factores α y β de necrosis tumoral, interferonas α, β y γ, factor de células madre, ligando flk-2/flt3. Los productos de gen producidos por el sistema inmune son también útiles en la invención. Éstos incluyen, sin limitación, inmunoglobulinas IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE, inmunoglobulinas quiméricas, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena simple, receptores de célula T, receptores de célula T quiméricos, receptores de célula T de cadena simple, moléculas MHC de clase I y de clase II, así como inmunoglobulinas de diseño y moléculas de MHC. Los productos de gen útiles incluyen también proteínas reguladoras de complemento tal como proteínas reguladoras de complemento, proteína de cofactor de membrana (MCP), factor de aceleración de pudrición (DAF), CR1, CF2 y CD59.

Otros productos de gen útiles adicionales incluyen uno cualquiera de los receptores para hormonas, factores de crecimiento, citoquinas, linfoquinas, proteínas reguladoras y proteínas de sistema inmune. La invención abarca receptores para regulación del colesterol y/o modulación de lípido, incluyendo el receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL), el receptor de lipoproteína de alta densidad (HDL), el receptor de lipoproteína de muy baja densidad (VLDL), y receptores scavengers. La invención abarca vectores que incorporan productos de gen tales como miembros de la superfamilia del receptor de hormona esteroide incluyendo los receptores de glucocorticoide y los receptores de estrógeno, la Vitamina D y otros receptores nucleares. Adicionalmente, los productos de gen útiles incluyen factores de transcripción tales como jun, fos, máx, mad, factor de respuesta de suero (SRF), AP-1, AP2, myb, MyoD y miogenina, proteínas que contienen ETS-box, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, AF5, NFAT, CREB, HNF-4, c/EBP, SP1, proteínas de enlace de CCAAT-box, por ejemplo GATA-3, y la familia forkhead de proteínas de hélice alada.

Otros productos de gen útiles incluyen carbamoil sintetasa I, ornitina transcarbamilasa, arginosuccinato sintetasa, arginosuccinato liasa, arginasa, fumarilacetato hidrolasa, fenilalanina hidroxilasa, alfa-1 antitripsina, glucosa-6fosfatasa, fosfobilinógeno desaminasa, cistationa beta-sintasa, acetoácido descarboxilasa de cadena ramificada, albúmina, isovaleril-coA deshidrogenasa, pripionil CoA carboxilasa, metil malonil CoA mutasa, glutaril CoA deshidrogenasa, insulina, beta-glucosidasa, piruvirato carboxilato, fosforilasa hepática, fosforilasa quinasa, glicina descarboxilasa, proteína H, proteína T, una secuencia reguladora de transmembrana de fibrosis cística (CFTR), y un producto de gen de distrofina [por ejemplo, una mini-o micro-distrofina]. Incluso otros productos de gen adicionales incluyen enzimas tales que puedan ser útiles en terapia de sustitución de enzima, la cual es útil en una diversidad de condiciones que resultan de una actividad deficiente de la enzima. Por ejemplo, las enzimas que contienen manosa6-fosfato pueden ser utilizadas en terapias para enfermedades de almacenamiento lisosómico (por ejemplo, un gen adecuado incluye el que codifica la β-glucoronidasa (GUSB)).

Incluso otros productos de gen útiles incluyen los usados para el tratamiento de la hemofilia, incluyendo la hemofilia B (incluyendo Factor IX) y la hemofilia A (incluyendo Factor VIII y sus variantes, tal como la cadena ligera y la cadena pesada del heterodímero y el dominio suprimido en B; Patente US núm. 6.200.560 y Patente US núm. 6.221.349). El gen de Factor VIII codifica 2351 aminoácidos y la proteína tiene seis dominios, designados desde el amino hasta el término carboxi terminal como A1-A2-B-A3.C1-C2 [Wood et al., Nature, 312: 330 (1984); Vehar et al., Nature 312: 337 (1984); y Toole et al., Nature, 342: 337 (1984)]. El Factor VIII humano se procesa en el interior de la célula para producir un heterodímero que comprende principalmente una cadena pesada que contiene los dominios A1, A2 y B y una cadena ligera que contiene los dominios A3, C1 y C2. Tanto el polipéptido de cadena simple como el heterodímero, circulan en el plasma como precursores inactivos, hasta ser activados por escisión de trombina entre los dominios A2 y B, lo que libera el dominio B y da como resultado una cadena pesada que consiste en los dominios A1 y A2. El dominio B se suprime en forma de precoagulante activado de la proteína. Adicionalmente, en la proteína natural, dos cadenas de polipéptido (“a” y “b”), que flanquean el dominio B, están enlazadas a un catión de calcio divalente.

En algunas realizaciones, el minigén comprende los primeros 57 pares de bases de la cadena pesada del Factor VIII, que codifican la secuencia 10 de señal de aminoácido, así como la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento humano (hGH). En realizaciones alternativas, el minigén comprende además los dominios A1 y A2, así como 5 aminoácidos a partir del término N del dominio B, y/o 85 aminoácidos del término C del dominio B, así como los dominios A3, C1 y C2. En otras realizaciones adicionales, los ácidos nucleicos que codifican la cadena pesada y la cadena ligera de Factor VIII se proporcionan en un solo minigén separado por 42 ácidos nucleicos que codifican 14 aminoácidos del dominio B [Patente US núm. 6.200.560].

Según se utiliza en la presente memoria, una cantidad terapéuticamente efecti8va es una cantidad del vector de AAV que produce cantidades suficientes de Factor VIII para reducir el tiempo que se necesita para que la sangre del sujeto coagule. En general, los hemofílicos severos que tienen menos de un 1% de niveles normales de Factor VIII tienen un tiempo total de coagulación sanguínea mayor de 60 minutos en comparación con los aproximadamente 10 minutos de un no hemofílico.

La presente invención no se limita a ninguna secuencia específica de Factor VIII. Se han aislado y generado muchas formas naturales y recombinantes de Factor VIII. Ejemplos de formas que ocurren de manera natural y recombinantes de Factor VII pueden ser encontradas en la literatura científica y de patentes incluyendo las Patentes US núms. 5.563.045; 5.451.521, 5.422.260; 5.004.803; 4.757.006; 5.661.008; 5.789.203; 5.681.746; 5.045.455; 5.668.108; 5.633.150; 5.693.499; 5.587.310; 5.171.844; 5.149.637; 5.112.950; 4.886.876; publicación de Patentes Internacionales núms. WO 92/16557, WO 91/09122, WO 97/03195, WO 96/21035 y WO 91/07490; solicitudes de Patentes Europeas núms. EP 0 672 138, EP 0 270 618, EP 0 182 448, EP 0 162 067, EP 0 786 474, EP 0 506 757, EP 0 874 057, EP 0 795 021, EP 0 670 332, EP 0 500 734, EP 0 232 112 y EP 0 160 457; Sanberg et al., XX Congreso Int. de la Fed Mundial de Hemofilia (1992), y Lind et al., Eur. J. Biochem., 232: 19 (1995).

Las secuencias de ácido nucleico que codifican el Factor VIII anteriormente descrito pueden ser obtenidas usando métodos recombinantes o derivando la secuencia de un vector que se sepa que la incluye. Además, la secuencia deseada puede ser aislada directamente de células y tejidos que la contienen, usando técnicas estándar, tal como extracción de fenol y PCR de cADN o ADN genómico [Véase, por ejemplo, Sambrook et al.]. Las secuencias de nucleótido pueden ser también producidas sintéticamente, en vez de clonadas. La secuencia completa puede ser ensamblada mediante solapamiento de nucleótidos preparados con métodos estándar y ensamblados en una secuencia de codificación completa [Véase, por ejemplo, Edge, Nature 292: 757 (1981); Nambari, et al., Science, 223… 1299 (1984); y, Jay et al., J. Biol. Chem. 259: 6311 (1984).

Además, la invención no se limita al Factor VIII humano. De hecho, se pretende que la presente invención abarque vectores que incorporan el Factor VIII procedentes de animales distintos de los humanos, incluyendo aunque sin limitación los animales de compañía (por ejemplo, caninos, felinos y equinos), el ganado (por ejemplo, los bovinos, caprinos y ovinos), animales de laboratorio, mamíferos marinos, grandes gatos, etc.

Los vectores de AAV pueden contener un ácido nucleico que codifica fragmentos de Factor VIII que en sí mismo no sea biológicamente activo, que incluso cuando se administra al sujeto mejora o restablece el tiempo de coagulación sanguínea. Por ejemplo, según se ha discutido con anterioridad, la proteína de Factor VIII comprende dos cadenas de polipéptido: una cadena pesada y una cadena ligera, separadas por un dominio B que es escindido durante el procesamiento. Según se ha demostrado mediante la presente invención, la co-transducción de células receptoras con la cadena pesada y la cadena ligera de Factor VIII conduce a la expresión del Factor VIII biológicamente activo. Puesto que la mayor parte de los hemofílicos contienen una mutación o supresión en una sola de las cadenas (por ejemplo, la cadena pesada o la ligera), puede ser posible administrar solamente la cadena defectuosa al paciente para suministrar la otra cadena.

Otros productos de gen útiles incluyen los polipéptidos que ocurren de forma no natural, tal como los polipéptidos quiméricos o híbridos que tienen una secuencia de aminoácido que se produce de forma no natural que contiene inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácido. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de diseño de cadena simple, podrían ser útiles en determinados pacientes inmunocomprometidos. Otros tipos de secuencia de gen que ocurre de forma no natural, incluyen moléculas antisentido y ácidos nucleicos catalíticos, tal como ribozimas, que podrían ser usadas para reducir la sobreexpresión de un objetivo.

La reducción y/o la modulación de la expresión de un gen es particularmente deseable para el tratamiento de condiciones hiperproliferativas caracterizadas por células hiperproliferantes, como son los cánceres y la psoriasis. Los polipéptidos objetivo incluyen los polipéptidos que se producen exclusivamente, o a niveles más altos, en células hiperproliferantes en comparación con células normales. Los antígenos objetivo incluyen polipéptidos codificados por oncogenes tales como myb, myc, fyn, y el gen de translocación bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk y EGRF. Adicionalmente a los productos de oncogén, los polipéptidos objetivo para tratamientos anti-cáncer y regímenes protectores incluyen regiones variables de anticuerpos formados por linfomas de célula B y regiones variables de receptores de célula T de linfomas de célula T que, en algunas realizaciones, se usan también como antígenos objetivo para enfermedad autoinmune. Otros polipéptidos asociados a tumor pueden ser usados como polipéptidos objetivo tal como los polipéptidos que se encuentran a niveles más altos en células de tumor incluyendo el polipéptido reconocido por el anticuerpo monoclonal 17-1A y los polipéptidos de enlace de folato.

Otros polipéptidos terapéuticos adecuados y proteínas incluyen los que pueden ser útiles para el tratamiento de individuos que sufren enfermedades y desórdenes autoinmunes, que confieren una respuesta inmune protectora de base amplia frente a objetivos que asociados a autoinmunidad incluyendo los receptores celulares y las células que producen anticuerpos dirigidos a la “corteza”. Las enfermedades autoinmunes mediadas por células T incluyen la artritis reumatoide (RA), esclerosis múltiples (MS), síndrome de Sjögren, sarcoidosis, diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM), tiroiditis autoinmune, artritis reactiva, espondilitis anquilosante, escleroderma, polimiositis, dermatomiositis, psoriasis, vasculitis, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Crohn y colitis ulcerante. Cada una de esas enfermedades se caracteriza por receptores de célula T (TCRs) que enlazan con antígenos endógenos y que inician la casca inflamatoria asociada a enfermedades autoinmunes.

C. Transgenes inmunogénicos

Adecuadamente, los vectores de AAV de la invención evitan la generación de respuestas inmunes a las secuencias de AAV contenidas dentro del vector. Sin embargo, estos vectores pueden no obstante ser formulados de una manera que permite la expresión de un transgén portado por los vectores para inducir una respuesta inmune a un antígeno seleccionado. Por ejemplo, con el fin de promover una respuesta inmune, el transgén puede ser expresado a partir de un promotor constitutivo, el vector puede ser potenciado según se describe en la presente memoria, y/o el vector puede ser dispuesto en tejido degenerativo.

Ejemplos de transgenes inmunogénicos adecuados incluyen los seleccionados a partir de una diversidad de familias virales. Ejemplos de familias virales deseables frente a las que podría ser deseable una respuesta inmune, incluyen la familia picomavirus, la cual incluye los géneros rinovirus, los cuales son responsables de alrededor de un 50% de los casos de resfriado común; los géneros enterovirus, los cuales incluyen los poliovirus, coxsackievirus, ecovirus, y enterovirus humanos tal como el virus de la hepatitis A; y los géneros aftovirus, los cuales son responsables de las enfermedades de los pies y la boca, principalmente en animales no humanos. Dentro de la familia de virus de los picomavirus, los antígenos objetivo incluyen los VP1, VP2, VP3, VP4 y VPG. Otras familias virales incluyen la familia de los astrovirus y los calcivirus. La familia calcivirus abarca el grupo de virus de Norwalk, los cuales son un importante agente causante de gastroenteritis epidémica. Otra familia ´deseable más para su uso en antígenos de objetivación para inducir respuestas inmunes en animales humanos y no humanos, es la familia togavirus, la cual incluye los géneros alfavirus, los cuales incluyen el virus de Sindbis, el virus de RossRiver, y la encefalitis equina Venezuelan, Eastern & Western, y los rubivirus, incluyendo el virus Rubella. La familia flaviviridae incluye el dengue, la fiebre amarilla, la encefalitis japonesa, la encefalitis de St. Louis, y los virus de la encefalitis transmitida por garrapatas. Otros antígenos objetivo pueden ser generados a partir de la hepatitis C o de la familia coronavirus, la cual incluye un número de virus no humanos tal como el virus de la bronquitis infecciosa (aves de corral), el virus gastroentérico transmisible porcino (cerdo), el virus de la encefalomielitis de hemaglutinatina porcina (cerdo), el virus de la peritonitis infecciosa felina (gato), el coronavirus entérico felino (gato), el coronavirus canino (perro), y los coronavirus respiratorios humanos, los cuales pueden causar el resfriado común y/o la hepatitis no A, B o C, y los cuales incluyen la causa putativa del síndrome respiratorio repentino agudo (SARS). Dentro de la familia de coronavirus, los antígenos objetivo incluyen el E1 (también denominado M o proteína matriz), E2 (también denominado S o proteína de Spike), E3 (también denominado HE o hemaglutina-elterosa), glicoproteína (no presente en todos los coronavirus), o N (nucleocápside). Incluso otros antígenos pueden estar objetivados contra la familia arterivirus y la familia rabdovirus. La familia rabdovirus incluye los géneros vesiculovirus (por ejemplo, el virus de la estomatitis vesicular), y los géneros lisavirus (por ejemplo, rabias). Dentro de la familia rabdovirus se pueden derivar antígenos adecuados a partir de la proteína G o de la proteína N. La familia filoviridae, la cual incluye virus de fiebre hemorrágica tal como los virus de Marburg y de Ébola, pueden ser una fuente adecuada de antígenos. La familia paramixovirus incluye el virus de parainflueza tipo 1, virus de parainflueza tipo 3, virus de parainfluenza bovina tipo 3, rubulavirus (virus de las paperas, virus de parainfluenza tipo 2, virus de la enfermedad de Newcastle (pollos), peste bovina, morbilivirus, el cual incluye el sarampión y el moquillo canino, y neumovirus, el cual incluye el virus sincitial respiratorio. El virus de la influenza se clasifica dentro de la familia ortomixovirus y es una fuente adecuada de antígeno (por ejemplo, la proteína HA, la proteína N1). La familia bunyavirus incluye los géneros bunyavirus (encefalitis de California, La Crosse), flebovirus (fiebre del Valle del Rift), hantavirus (el puremala es un virus de la fiebre hemahagin), nairovirus (enfermedad de la oveja de Nairobi), y varios bungavirus no asignados. La familia arenavirus proporciona una fuente de antígenos frente a LCM y al virus de la fiebre de Lassa. Otra fuente de antígenos es la familia bornavirus. La familia reovirus incluye los géneros reovirus, rotavirus (el cual causa gastroenteritis aguda en niños), orbivirus, y cultivirus (fiebre de la garrapata de Colorado, Lebombo (humanos), encefalitis equina, lengua azul). La familia etrovirus incluye la subfamilia oncovirinal que abarca enfermedades humanas y veterinarias tales como el virus de la leucemia felina, HTLVI y HTLVII, lentivirinal (que incluye el VIH, el virus de la inmunodeficiencia del simio, el virus de la inmunodeficiencia felina, el virus de la anemia infecciosa equina, y espumavirinal).

Con respecto a al VIH y al VIS, se han descrito muchos antígenos adecuados y pueden ser fácilmente seleccionados. Ejemplos de antígenos de VIH y de VIS adecuados incluyen, sin limitación, las proteínas gag, pol, Vif, Vpx, VPR, Env, Tat y Rev, así como varios fragmentos de las misma. Por ejemplo, fragmentos adecuados de la proteína envolvente (env) incluyen, por ejemplo, gp41, gp140 y gp 120. Adicionalmente, se ha descrito una diversidad de modificaciones en esos y otros antígenos de VIH y VIS. Antígenos adecuados para ese propósito son bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, se puede seleccionar una secuencia que codifique las

gag, pol, Vif y Vpr, Env, Tat y Tev, entre otras proteínas. Véase, por ejemplo, la proteína gag modificada que se ha descrito en la Patente US núm. 5.972.596. Véase también las proteínas de VIH y de VIS descritas en D.H. Barouch et al., J. Virol., 75(5): 2462-2467 (Marzo de 2001), y R.R. Amara, et al., Science, 292: 69-74 (6 de Abril de 2001). Estas proteínas o subunidades de las mismas pueden ser suministradas por si solas, o en combinación por medio de vectores separados o desde un vector simple.

La familia papovavirus incluye la subfamilia poliomavirus virus BKU y JCU) y la subfamilia papilomavirus (asociados a cánceres o progresión maligna de papiloma). La familia adenovirus incluye virus (EX, AD7, ARD, O.B.) que causan enfermedad respiratoria y/o enteritis. La familia parvovirus incluye el parvovirus felino (enteritis felina), panleucopeniavirus felino, parvovirus canino, y parvovirus porcino. La familia herpesvirus incluye la subfamilia alfaherpesvirinae, la cual abarca los géneros simplexvirus (HSVI, HSVII), varicellovirus (pseudo-rabias, varicela zóster) y la subfamilia betaherpesvirinae, la cual incluye los géneros citomegalovirus (HCMV, muromegalovirus) y la subfamilia gammaherpesvirinae, la cual incluye los géneros linfocriptovirus, EBV (linfoma de Burkitss), herpesvirus humano 6A, 6B y 7, herpesvirus asociado a sarcoma de Kaposi y herpesvirus cercopitecino (virus B), rinotraqueitis infecciosa, virus de la enfermedad de Marek, y radinovirus. La familia poxvirus incluye la subfamilia cordopoxvirinae, la cual abarca los géneros ortopoxvirus (Viruela mayor (Viruela) y Vaccinia (Viruela vacuna)), parapoxvirus, avipoxvirus, capripoxvirus, leporipoxvirus, suipoxvirus, y la subfamilia entomopoxvirinae. La familia hepadnavirus incluye el virus de la hepatitis B. Un virus no clasificado que puede ser una fuente adecuada de antígeno es el virus de la hepatitis delta, el virus de la hepatitis E, y los priones. Otro virus que es una fuente de antígeno es el virus Nipan. Otras fuentes virales más pueden incluir el virus de la enfermedad bursal infecciosa aviar y el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino. La familia alfavirus incluye el virus de arteritis equina y varios virus de encefalitis.

La presente invención puede abarcar también vectores que incorporan inmunógenos que son útiles para inmunizar un animal humano o no humano frente a otros patógenos que incluyen bacterias, hongos, microorganismos parásitos o parásitos multicelulares que infectan vertebrados humanos y no humanos, o procedentes de células cancerígenas o de células tumorales. Ejemplos de patógenos bacterianos incluyen los cocos patogénicos grampositivos incluyendo los neumococos; estafilococos (y las toxinas producidas por los mismos, por ejemplo, la enterotoxina B); y, estreptococos. Los cocos patogénicos gram-negativos incluyen los meningococos; gonococos; Los bacilos entéricos patogénicos gram-negativos incluyen los enterobacteriáceos; las seudomonas, acinetobacterias y eikenella; melioidosis; salmonella; shigella; hemófilos; moraxella; H. ducreyi (que causa el cancroide); especies de brucella (brucelosis); Frasicisella tularensis (que causa la tularemia); Yersinia pestis (plaga), y otra yersinia (pasteurella); estreptobacilo monoliformis y spirilum; bacilos gram-positivos que incluyen listeria monocitogenes; erysipelothrix rhusiopathiae; Corynebacterium diphteria (difteria); cólera; B. anthracis (ántrax); donovanosis (granuloma inguinal); y, bartonelosis. Las enfermedades causadas por bacterias anaerobias patogénicas incluyen el tétanos; botulismo (Clostridium botulimum y su toxina); Clostridium perfringens y su toxina épsilon; otras clostridias; tuberculosis; lepra, y otras micobacterias. Las enfermedades espiroquetales patogénicas incluyen la sífilis; trepanomatosos; sífilis pian, pinta y endémica; y, leptoespirosis. Otras infecciones causadas por bacterias patógenas mayores y por hongos patogénicos incluyen muermo (Burkolderia mallei); actinomicosis; nocardiosis; criptococosis, blastomicosis, histoplasmosis y coccidiyodomicosis; candidiasis, aspergilosis, y mucomicosis; esporotricosis; paracoccidiyodomicosis, petriellidiosis, torulopsosis, micetoma y cromomicosis; y dermatofitosis. Las infecciones rickettsianas incluyen la fiebre del tifus, la fiebre maculosa de las Montañas Rocosas, la fiebre Q (Coxiella burnetti), y Rickettsialpox. Ejemplos de micoplasma e infecciones clamidiales incluyen: infecciones por mycoplasma pneumoniae; linfogranuloma venéreo; psitacosis; perinatal chlamydial. Las eucariotas patogénicas abarcan protozoos patogénicos y helmintos y las infecciones producidas por los mismos incluyen: amebiasis; malaria; leishmaniasis; tripanosomiasis; toxoplasmosis; Pneumocystis carinii; Trichans; Toxoplasma gondii; babesiosis; giardasis; triquinosis; filariasis; esquistomatosis; nematodos, trematodos o fasciolas; e infecciones de cestodos (tenia).

Muchos de esos organismos y/o de las toxinas producidas por los mismos han sido identificados por los Centros para Control de Enfermedades [(CDC), Departamento de Salud y de Servicios Humanos, USA], como agentes que tienen potencial para su uso en ataques biológicos. Por ejemplo, algunos de esos agentes biológicos incluyen el Bacillus anthracis (ántrax), el Clostridium botulinum y su toxina (botulismo), el Yersinia pestis (plaga), la variola major (viruela), la Francisella tularensis (tularemia), y las fiebres hemorrágicas virales [filovirus, por ejemplo Ébola, Marburg y arenavirus [por ejemplo, Lassa, Machupo]], todos los cuales están actualmente clasificados como Agentes de Categoría A; Coxiella burnetti (fiebre Q); especies de bruxella (brucelosis), Burkolderia mallit (muermo), Burkliolderia pseudomallei (meloidosis), Ricinus communis y su toxina (toxina ricina), Clostridium perfringens y su toxina (toxina épsilon), especies de estafilococos y sus toxinas (enterotoxina B), Chlamydia psittaci (psitacosis), ataques a la seguridad del agua (por ejemplo, Vibrio cholerae, Cryptosporidium parvum), fiebre del tifus (Richettsia powazekii)y encefalitis viral (alfavirus, por ejemplo, encefalitis equina Venezuelan; encefalitis equina Eastern; encefalitis equina Western), todos los cuales están actualmente clasificados como agentes de Categoría B; y virus Nipan y hantavirus, los cuales están actualmente clasificados como agentes de Categoría C. Adicionalmente, otros organismos, que están clasificados de ese modo o clasificados de forma diferente, pueden ser identificados y/o usados para tal propósito en el futuro. Se comprenderá fácilmente que los vectores virales y otras construcciones descritas en la presente memoria son útiles para el suministro de antígenos a partir de esos organismos, virus, sus toxinas u otros subproductos, los cuales impedirán y/o tratarán la infección u otras reacciones adversas con esos agentes

biológicos.

La administración de los vectores de la invención para suministrar inmunógenos frente a la región variable de las células T provoca una respuesta inmune que incluye CTLs para eliminar esas células T. En artritis reumatoide (RA), han sido caracterizadas varias regiones variables específicas de TCRs que están involucradas en la enfermedad. Estas TCRs incluyen V-3, V-14, V-17 y V-17. De ese modo, el suministro de una secuencia de ácido nucleico que codifique al menos uno de esos polipéptidos proporcionará una respuesta inmune que objetivará células T involucradas en RA. En esclerosis múltiple (MS), varias regiones variables específicas de TCRs que están involucradas en la enfermedad han sido caracterizadas. Estas TCRs incluyen V-7 y V-10. Así, el suministro de una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos uno de esos polipéptidos proporcionará una respuesta inmune que objetivará células T involucras en MS. En escleroderma, varias regiones variables específicas de TCRs que están involucradas en la enfermedad han sido caracterizadas. Estas TCRs incluyen V-6, V-8, V-14 y V-16, V-3C, V7, V-14, V-15, V-16, V-28 y V-12. De ese modo, el suministro de una molécula de ácido nucleico que codifica al menos uno de esos polipéptidos proporcionará una respuesta inmune que objetivará células T involucradas en escleroderma.

Así, el vector viral recombinante derivado de rAAV de la invención proporciona un vehículo eficaz de transferencia de gen que puede suministrar un transgén seleccionado a una célula anfitrión seleccionada in vivo o ex vivo incluso cuando el organismo posee anticuerpos neutralizantes respecto a una o más fuentes de AAV. En una realización, el rAAV y las células se mezclan ex vivo; las células infectadas son cultivadas usando metodologías convencionales; y las células transducidas son re-infundidas en el paciente.

Estas composiciones son particularmente adecuadas para suministro de gen a efectos terapéuticos y para inmunización, incluyendo la inducción de inmunidad protectora. El AAV de la invención y las composiciones que contienen al mismo pueden ser usadas también en regímenes de inmunización tal como los descritos en el documento de propiedad compartida de solicitud de Patente US núm. 60/565.936, depositada el 28 de Abril de 2004, por “Adenovirus Secuencial y Suministro Mediado por AAV de Moléculas Inmunogénicas”.

Además, las composiciones de la invención pueden ser usadas también para la producción de un producto de gen deseado in vitro. Para la producción in vitro, un producto deseado (por ejemplo, una proteína) puede ser obtenido a partir de un cultivo deseado a continuación de la transfección de células anfitrión con un rAAV que contiene la molécula que codifica el producto deseado y cultivando el cultivo celular bajo condiciones que permitan la expresión. El producto expresado puede ser a continuación purificado y aislado, según se desee. Técnicas adecuadas para transfección, cultivo celular, purificación y aislamiento, son bien conocidas por los expertos en la materia.

Los ejemplos que siguen ilustran varios aspectos y realizaciones de la invención y del método de singletón en general.

Ejemplo 1

De acuerdo con el método descrito con anterioridad, las secuencias de AAV han sido identificadas como dotadas de singletones, cuando se disponen en alineamiento con una librería de secuencias que contienen representantes de cada uno de los clados A, B, C, D, E y F (representados por AAV9). La tabla que sigue ilustra las secuencias de cápside y el singletón que va a ser alterado hasta una secuencia conservada. Para ciertas mutaciones, el singletón va seguido de un * y a continuación el residuo de aminoácido que lo sustituye. Para otras mutaciones, el singletón va seguido por su posición de aminoácido y el residuo que lo sustituye.

La numeración de aminoácido está basada en las secuencias publicadas para cada uno de esas cápsides de AAV. Véase, por ejemplo, G. Gao, et al., J. Virol. 78(12): 6381-6388 (Junio de 2004) y publicación de Patente Internacional núm. WO 2204/042397 [todas las secuencias citadas en la misma están depositadas en GenBank], y la publicación de Patente Internacional núm. WO 2005/033321, depositada el 30 de Septiembre de 2004.

Por ejemplo, con referencia a la tabla que sigue, la nomenclatura debe ser leída como sigue. Cy5R1 se refiere a la secuencia de aminoácido de SEQ ID núm. 24, la cual ha sido modificada ara que contenga ácido aspártico (D) en la posición 13 de residuo de aminoácido; cy5 tiene una glicina en su secuencia de aminoácido natural en el residuo número 13. Cy5R2 se refiere a la secuencia de aminoácido de SEQ ID núm. 24, la cual ha sido modificada para contener un ácido aspártico en la posición 13 de aminoácido (glicina en la secuencia natural) y una asparagina en la posición 403 de residuo de aminoácido (ácido aspártico en la secuencia natural). Cy5R3 tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID núm. 24, la cual ha sido modificada para tener las mismas modificaciones que la Cy5R2 y, adicionalmente, una lisina en la posición 158 (de forma natural, una asparagina) y una glutamina en la posición 161 (de forma natural, una prolina). Dada esta información, un experto en la material podría estar fácilmente capacitado para determinar las otras modificaciones de singletón que se citan en la tabla que sigue.

Nombre

SEQ ID No. (AAV Parental) Sitios Mutados Clado

cy5

24

Cy5R1

G13D D

Cy5R2

G13D D403N D

Cy5R3

G13D D403N R51K D

Cy5R4

G13D D403N R51K N158K + P161Q D

rh.13

26 D

Rh.13R

E538K D

Rh37

40 D

Rh37R2

E634K T207M D

Rh.2

39 E

rh.2R

V6511 E

rh.8

41

rh.8R

D531E

Rh.48

44

Rh.48.1

K217E B

Rh.48.2

S304N B

Rh.48.1.2

K217E S304N B

Hu.44

45 A

Hu.44R1

E137K A

Hu.44R2

E137K P446L A

Hu.44R3

E137K P446L G609D A

Rh32/33

2

Hu.29

42 B

Hu.29R

G396E B

Ch.5

46

Ch.5R1

T611I

rh.67

47 D

rh.58

48 S653N E

Rh.64

43 E

Rh64R1

R697W E

Rh64R2

R697W V686E E

AAV6

29 A

AAV6.2

F129L A

AAV6.1

K531E A

AAV6.12

F129L K531E A

rh.54

49 V404M D

hu.48

50 A

hu.48R1

G277S A

hu.48R2

G277S E322K A

hu.48R3

G277S E322K S552N A

Ejemplo 2

En un estudio preliminar fueron seleccionados los clones para probar el método de singletón de la invención. La tabla que sigue proporciona la descripción de fenotipo de los 5 clones. El número de singletones pronosticados se proporciona con el clado y la clasificación de serotipo.

El fenotipo de empaquetamiento se considera insuficiente cuando su título es inferior a 1 x 1011 GC, bajo cuando es

inferior a 1 x 1012 GC, bueno cuando es inferior a 1 x 1013, excelente cuando es más alto.

Los fenotipos de transferencia de gen fueron establecidos mediante expresión de gen CB.A1AT e indicados como sigue: “+++” cuando son mejores que el candidato principal para el tejido objetivo, “++”, “+” y “-“ cuando son respectivamente mejores que el 50%, entre el 10-60% o inferiores al 10% de los niveles de suero de AIAT de los candidatos principales (músculo: AAV1; hígado: AAV8; pulmón: AAV9). “n/a” indicaba que el vector no podía ser producido a niveles suficientes para estudios de transferencia de gen in vivo.

La clonación de las conexiones de singletón fue como sigue. A partir el plásmido de empaquetamiento original, se llevó a cabo mutagénesis dirigida al sitio. A continuación de eso, se ensayó la integridad de esqueleto de vector mediante digestión Pstl y se confirmó la corrección del singletón mediante secuenciación. A continuación fue producido el vector de expresión de EGFP por triplicado sobre un formato de 12 pocillos lado con lado, con el vector que contiene el singletón parental, control positivo de AAV2 y AAV2/8 y una producción sin presencia de plásmido de empaquetamiento como control negativo. Un volumen igual de lisato cultivado después de congelación 3x fue incubado sobre células 293. Se monitorizó la expresión de eGFP mediante citometría de flujo 72 h posttransducción.

Se llevó a cabo mutagénesis dirigida al sitio de los residuos de singletón en clones rh.37, rh.2, ch.5, rh.13 y rh.8. Estas secuencias particulares fueron seleccionadas para representar una diversidad de fenotipos que estaban documentos previamente.

Clon

Empaquetamiento Fenotipo de transferencia de gen # Singletón Clado (serotipo)

Fenotipo

Pulmón Hígado Músculo

rh.37

Insuficiente n/a n/a n/a 2 D (AAV7)

rh.2

Bajo ++ + +++ 1 E (AAV8)

ch.5

Bueno - . - 1 Ch.5

rh.13

Excelente + + + 1 D (AAV7)

rh.8

Bueno - + ++ 1 Rh.8

Se apreció un incremento de la expresión de vector para 4 de los 5 clones. El incremento fue más drástico para el rh.37 y el rh.2, vectores que habían mostrado previamente una producción baja de empaquetamiento. Para estos vectores se produjeron partículas productoras a niveles suficientes para su detección. Los vectores rh.8 y rh.13 mostraron un incremento de la transducción.

Con el fin de distinguir los efectos de la mutación del singletón sobre la transducción frente al empaquetamiento y al ensamblaje, se realizaron preparaciones de vector a pequeña escala y se titularon en cuanto a partículas resistentes de Dnasa mediante PCR cuantitativo. Para el rh.37, se obtuvo un incremento dos log en la producción de vector. El rh.8 mostró un moderado incremento de 5 veces en la titulación mientras que el rh.13 se comportó igualmente. Totas las titulaciones de clones corregidos en singletón estuvieron dentro de una gama aceptable en comparación con la producción de AAV2 y AAV8 y cuando se extrapolaron a preparaciones a gran escala, no se ensayó el rh.2 para su titulación.

Posteriormente, se monitorizó el efecto del cambio de singletón in vitro en una disposición de transducción con igual número de partículas por célula. Se llevó a cabo una titulación sobre células 293 para el rh.8 y el rh.13. Se describieron incrementos moderados en cuanto a eficacia de transducción en todos los MOIs.

A partir del subconjunto inicial de 5 clones, fueron transducidas 3 células productivamente. Dos clones fueron inhábiles para producir cualquier expresión de eGFP en esta disposición. Lo más probable es que esto se deba a un defecto en el empaquetamiento del vector que no pudo ser pronosticado por la aproximación de singletón.

El método fue utilizado para corregir cuatro posiciones de singletón pronosticadas en el clon hu.46 de AAV, P156S R362C S393F A676. Sin embargo, esas modificaciones no dieron como resultado un AAV que pudiera ser rescatado, indicando otro tipo de error fatal en la secuencia de hu.46.

Ejemplo 3 – Análisis in vitro de vectores virales con cápsides alteradas

Usando los métodos descritos con anterioridad, las proteínas de cápside de rh.64 y hu.29 fueron alteradas y usadas después para construir vectores virales con las cápsides alteradas usando seudotipado según ha sido descrito en el ejemplo 2 y en G. Gao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 11854-9 (3 Septiembre 2002).

De forma resumida, se usaron vectores que expresan proteína fluorescente verde potenciada (EGFP) para examinar in vitro la eficacia de transducción de los vectores en células endoteliales humanas (células 293). Estas células 293 fueron incubadas en presencia de partículas AAVCMVeGFP seudotipadas a razón de 104 GC/célula después de un corto período de incubación con wtAd5. El número de células positivas de eGFP para un total de 10.000 células fue

medido mediante análisis FACS con un límite de detección de 5 células/10K.

La modificación de la cápside de Rh.64 conforme a la invención proporcionó partículas modificadas de rh.64 que fueron 100 veces más eficientes después de un cambio R697W. Una mutación V686E posterior produjo un incremento de 2 veces la capacidad de empaquetamiento.

La modificación de la cápside de Hu.29 produjo viriones de rh.64 modificados que fueron rescatados en cuanto a una capacidad de empaquetamiento deficiente cambiando G396E. Se observó un incremento de producción superior a 1000 veces.

Muchos de los más de 20 viriones de AAV modificados que mostraron una mejora de expresión incluyen los AAV6.1, hu.48R1, hu.48R2, hu.44R2, hu.44R3, rh.48.2, rh.48.2, rh.48.2.1.

Ejemplo 4 – Efecto de singletón en aplicaciones de transferencia de gen in vivo

Se estudiaron los efectos de los mutantes de singletón en una disposición in vivo. Se han iniciado estudios de transferencia de gen en ratones C75B/6 sobre un número de vectores modificados según el método de la invención.

Los estudios dirigidos al músculo y dirigidos al hígado fueron iniciados referenciados respecto a los candidatos principales actuales para la aplicación particular.

La α-antitripsina (A1AT) humana fue seleccionada como un gen informador sensible y cuantitativo en los vectores y expresada bajo el control de promotor de β-actina de pollo potenciado en CMV. El empleo del promotor CB permite que se alcancen altos niveles de transferencia de gen no específico del tejido y de A1AT constitutivo, y también permite el uso de la misma preparación de vector para estudios de transferencia de gen en cualquier tejido de interés.

Se eligió el músculo como un primer tejido objetivo. 40 nuevos vectores diferentes (basados en 24 clones diferentes, cada uno de ellos con su(s) respectivo(s) mutante(s) de singletón), fueron inyectados intramuscularmente en una extremidad posterior de los ratones C57B/6. Todos los experimentos fueron realizados con 1 x 1011 GC/animal con una casete de transgén CB.A1AT. Cada uno de los vectores fue cada vez dividido en alícuotas de igual volumen (50 µl) por ratón y grupo por clado. Cada estudio individual comprendía uno o dos clados con grupos de control que incluyen el serotipo representativo, AAV2/8 y AAV2/1 que sirvió como punto de referencia para transferencia de gen objetivada en el musculo. La expresión de transgén fue detectada en los días 7, 14, 28 y 63 post inyección, y evaluada mediante un ELISA de hA1AT específico.

Para diversas versiones corregidas de aislados y singletón, se generaron datos sobre su comportamiento tras la infusión intraportal dirigida al hígado. Los resultados preliminares muestran que la mayoría de los clones corregidos se comportan igual o mejor que el aislado original.

Para un clon particular, especialmente el cy.5, la corrección de singletón parce tener un efecto beneficioso sobre transducción de músculo. El clon cy.5R4 portador de correcciones de singletón mejoró la eficacia de transferencia de gen sobre un tropismo de músculo ya digno mostrado por el aislado original. El comportamiento del cy.5R4 es igual

o ligeramente mejor de lo que el referente controla a AAV2/1 y AAV2/7.

Un aislado que anteriormente produjo titulaciones muy bajas respecto a una evaluación adicional, el rh.64, se comportó excepcionalmente bien en el músculo tras la corrección de un singletón. El Rh.64R1 se comportó mejor que el rh64.2 y proporcionó niveles de hA1AT más altos que los conseguidos mediante su serotipo relativo más próximo AAV2/8, peo también que el AAV2/7.

En otros estudios, se inyectaron ratones con vector por grupos en base a los clados. Se dosificaron 1 x 1011 GC/ratón con expresión de vector CB.hA1AT. Se midieron los niveles de suero de hA1AT mediante ELISA de hA1AT específico.

Los efectos de singletón sobre transferencia de in vivo parecen ser dependientes del tejido aislado y objetivo. Se realizaron varias observaciones interesantes.

Para ciertos clones de singletón, los efectos son cuantitativamente similares en el músculo y en el hígado (por ejemplo, rh.2, rh.13 o cy.5). Los aislados hu.48 y rh.48 muestran una expresión incrementada en el músculo con un número incrementado de singletones revertidos.

Otros clones como rh.64 y AAV6 muestran un perfil de expresión particular. El aislado hu.48R2, por ejemplo, empaqueta de una manera alrededor de 10 veces menos eficiente si se compara con el hu.48R3, pero este último transduce el músculo de forma alrededor de 5 veces menos eficiente. El AAV6 contiene dos singletones. Ambos tienen efectos moderados sobre el empaquetamiento y cuando se combinan llevan el empaquetamiento de AAV6 hasta el nivel del índice de referencia. In vitro, la pequeña diferencia es despreciable entre el clon parental y los

diferentes clones. In vivo, en el músculo, el AAV6.1 y el AAV6.1.2 muestran transferencia de gen disminuida mientras que el AAV6.2 muestra un incremento moderado.

Ejemplo 5 -Evaluación de AAV corregido en singletón en el pulmón y en el hígado

Todos los vectores AAV optimizados en cuanto a empaquetamiento y eficacia de transferencia de gen mediante la reversión de residuos de singletón, fueron evaluados adicionalmente en el pulmón y en el hígado. Los datos se presentan tanto para los vectores que fueron identificados como no contenedores de singletón como para los que el residuo de singletón fue convertido en el aminoácido conservado.

A. Evaluación de transferencia de gen de CB.A1AT AAV al pulmón tras inyección intratraqueal mediante pi2, rh32.33, AAV2/9, AAV2/5, rh.2R, ch5R

Se comparan varias cápsides de AAV en cuanto a su capacidad para objetivar el pulmón. Se midieron los niveles de hA1AT en el suero. Los AAVs evaluados están ya sea libres en singletón (pi2, rh32.33, AAV2/9, AAV2/5, rh.2R, ch5R) o bien contienen un residuo de singletón (rh.2, rh.8). Los AAV2/5 y AAV2/9 se presentan como índices de referencia.

Los estudios de transferencia de gen fueron realizados en ratones C57B/6 (machos, 5 por grupo) usando los vectores portadores de ya sea la casete de expresión CB.A1AT (es decir, la ITR 5’ de AAV2, el promotor de β-actina de pollo (CB), la α1-antitripsina (A1AT) humana, la ITR 3’ de AAV2), o ya sea la casete de expresión CB.nLacZ (es decir, la ITR 5’ de AAV2, la β-galactosidasa localizada nuclear (nLacZ), la ITR 3’ de AAV2) en las cápsides descritas con anterioridad. De forma resumida, 50 µl de esos vectores corregidos en singletón o libres de singletón fueron coinstilados (1 x 1011 copias de genoma (GC)) intratraquealmente con vectores portadores de la A1AT y con vectores portadores de la nLacZ (1 x 1011 GC).

En los días 12 y 20, se tomaron 20 sangrías y se midieron los niveles de suero de A1AT (ng de AAT/ml de suero). Los datos mostraron un drástico incremento de expresión de la α1-antitripsina humana en el pulmón para los rh.2 a rh.2R tras la inyección intratraqueal (IT) de 1 x 10 11 GC. Adicionalmente, se evaluó una diversidad de vectores de AAV que estaban libres de residuos de singletón. Todos los vectores mostraron niveles aceptables de expresión en el pulmón.

B. Evaluación de vectores de singletón de AAV6 en comparación con AAV2/5 y AAV2/9

Se evaluaron clones corregidos en singletón de AAV6. El AAV6 modificado (AAV6.2) fue preparado usando el método de corrección de singletón de la invención, y las técnicas de seudotipado que se describen en la presente memoria. Las partículas de AAV6.2 portadoras de casetes de expresión LacZ y A1AT, preparadas según se ha descrito en el Ejemplo 5, fueron co-inyectadas intranasalmente (1 x 1011 GC) e intratraquealmente. Se evaluó la expresión de AAT mediante ELISA en suero y en líquido alveolar bronquial (BAL). Nos niveles de expresión estuvieron normalizados para la proteína total. Se midió la expresión LacZ mediante ELISA para la β-galactosidasa a partir de homogenato pulmonar. La necropsia se llevó a cabo en el día 21.

Estos vectores fueron comparados con AAV2/6, un candidato clínico actual para transferencia de gen de pulmón, AAV2/5 y AAV2/9 en un estudio que incluía ratones C57 B1/6 (machos, n = 8/grupo).

El AAV6.2 presentó una mejora estadísticamente significativa frente al AAV6 en excreción de A1AT de suero. El AAV6.2 también mostró niveles más altos de A1AT en comparación con los otros vectores, incluyendo el AAV2/9 y el AAV2/5. Se observó una leve mejoría en BAL como lo fue en expresión LacZ en homogenato de pulmón. Sin embargo, debido a grandes variaciones de animal en animal, no se pudieron extraer conclusiones de la cuantificación de LacZ.

Cuando se evaluó la localización de expresión de gen de AAV, se observó un tintado superior para la LacZ localizada nuclear en el grupo de AAV2/6.2, en comparación con el AAV2/6. Existió una mejora importante sobre el AAV2/6 y el AAV2/5 en el epitelio de las vías respiratorias pulmonares, el principal objetivo para las enfermedades como la fibrosis quística.

C. Inyección intraportal (iv) de AAV.CB.A1AT (1 x 1011 GC) en ratones C57B/6 con miembros de AAV de clado B y de clado C

Todos los vectores usados carecen de residuos de singletón ya sea a partir del aislamiento (AAV2/8, AAV2, hu.13, hu.51, hu.11, hu.53) o ya sea por mutación (hu.29R). Todos los vectores se comparan con el AAV2/8 (clado E) tomado como índice de referencia.

D. Inyección intravenosa de miembros de AAV de clado E. Los rh.64R1, rh.64R2, rh.2R están optimizados en singletón. Todos los otros vectores están libres de singletón

La expresión a partir de miembros de clado B y C de AAV fue encontrada similar a la equivalente para todos los miembros que incluyen el hu.29R, un clon optimizado en singletón. Este clon particular fue reconstituido en cuanto a

5 10

capacidad de empaquetamiento a partir de un hu.29 ahora presenta una funcionalidad de transferencia de gen similar a la de otros miembros de la familia de virus. Para los vectores de clado E evaluados, todos los vectores que están ya sea libres de singletón de forma natural o ya sea corregidos en cuanto a residuos de singletón, se comportan en un rango similar como el mejor ejecutante actual para transferencia de gen dirigida al hígado, el AAV2/8. En particular, son de interés los rh64R1 y rh.64R2 de AAV. El rh.64, que se encontró que era defectuoso en cuanto a empaquetamiento, se comporta ahora igualmente bien en la transferencia de gen dirigida al hígado tras la conversión de uno (rh.64R1) o dos (rh.64R2) singletones. Para rh.2, la corrección de singletón corresponde a un drástico incremento de más de 10 veces en el suministro de gen. Mientras que la invención ha sido descrita con referencia a realizaciones particularmente preferidas, se apreciará que se pueden realizar modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

15

20

25

30

35

Listado de secuencias

<110> Los Fideicomisarios de la Universidad de Pennsylvania vandenberghe, Luk Gao, Guangping Wilson, James

M. 5 <120> Método de incremento de la función de un vector AAV

<130> UPN-R3895PCT

<150> US 60/669.083

<151> 07.04.2005

<150> US 60/733.497 10 <151> 04.11.2005

<160> 50

<170> Patentin versión 3.3

<210> 1

<211> 738 15 <212> PRT

<213> virus adeno-asociado de Rhesus, rh.20

<400> 1

5

<210> <211> <212> <213> 2 733 PRT Clon 32/33 de virus adeno-asociado de Rhesus

<400>

2

5

<210> <211> <212> <213> 3 738 PRT Cápside de clon 39 de virus adeno-asociado de Rhesus

<400>

3

5

<210> <211> <212> <213> 4 738 PRT Proteína de cápside de clon 46 de virus adeno-asociado de Rhesus

<400>

4

5

<210> <211> <212> <213> 5 738 PRT Cápside de clon 73 de virus adeno-asociado de Rhesus

<400>

5

5

<210> <211> <212> <213> 6 736 PRT Cápside de clon 74 de virus adeno-asociado de Rhesus

<400>

6

5

<210> <211> <212> <213> 7 2208 ADN Serotipo 2 de virus adeno-asociado

<400>

7

5

<210> <211> <212> <213> 8 2187 ADN Ácido nucleico de cy.5

<400>

8

5

<210> <211> <212> <213> 9 2217 ADN Virus adeno-asociado de Rhesus, rh.10

<400>

9

5

<210> <211> <212> <213> 10 2187 ADN Virus adeno-asociado de Rhesus, rh.13

<400>

10

5

<210> <211> <212> <213> 11 2211 ADN Serotipo 1 de virus adeno-asociado

<400>

11

5

<210> <211> <212> <213> 12 2211 ADN Serotipo 3 de virus adeno-asociado

<400>

12

5

<210> <211> <212> <213> 13 2208 ADN Serotipo 6 de virus adeno-asociado

<400>

13

5

<210> <211> <212> <213> 14 2214 ADN Serotipo 7 de virus adeno-asociado

<400>

14

<210> <211> <212> <213>

15 2217 ADN Serotipo 8 de virus adeno-asociado

5

<400> 15

5

<210> <211> <212> <213> 16 2208 ADN Virus adeno-asociado, hu.13

<400>

16

5

<210> <211> <212> <213> 17 2208 ADN Virus adeno-asociado, hu.26

<400>

17

5

<210> <211> <212> <213> 18 2217 ADN Virus adeno-asociado, hu.37

<400>

18

5

<210> <211> <212> <213> 19 2205 ADN Virus adeno-asociado, hu.53

<400>

19

5

<210> <211> <212> <213> 20 2217 ADN Virus adeno-asociado de Rhesus, rh.39

<400>

20

5

<210> <211> <212> <213> 21 2211 ADN Virus adeno-asociado de Rhesus, rh.43

<400>

21

<210> <211> <212> <213>

22 2217 ADN Virus adeno-asociado de Rhesus, rh.46

5

<400> 22

5

<210> <211> <212> <213> 23 735 PRT Proteína de cápside de serotipo 2 de virus adeno-asociado

<400>

23

5

<210> <211> <212> <213> 24 728 PRT Proteína de cápside de cy.5

<400>

24

5

<210> <211> <212> <213> 25 738 PRT Proteína de cápside de virus adeno-asociado de Rhesus, rh.10

<400>

25

5

<210> <211> <212> <213> 26 728 PRT Proteína de cápside de virus adeno-asociado de Rhesus, rh.13

<400>

26

5

<210> <211> <212> <213> 27 736 PRT Proteína de cápside de serotipo 1 de virus adeno-asociado

<400>

27

5

<210> <211> <212> <213> 28 736 PRT Proteína de cápside de serotipo 3 de virus adeno-asociado

<400>

28

5

<210> <211> <212> <213> 29 736 PRT Proteína de cápside de serotipo 6 de virus adeno-asociado

<400>

29

5

<210> <211> <212> <213> 30 737 PRT Proteína de cápside de serotipo 7 de virus adeno-asociado

<400>

30

5

<210> <211> <212> <213> 31 738 PRT Proteína de cápside de serotipo 8 de virus adeno-asociado

<400>

31

5

<210> <211> <212> <213> 32 735 PRT Proteína de cápside de virus adeno-asociado, hu.13

<400>

32

5

<210> <211> <212> <213> 33 735 PRT Proteína de cápside de virus adeno-asociado, hu.26

<400>

33

5

<210> <211> <212> <213> 34 738 PRT Proteína de cápside de virus adeno-asociado, hu.37

<400>

34

<210>

35

<211>

734

<212>

PRT

5

<213> Proteína de cápside de virus adeno-asociado, hu.53

<400>

35

<400>

50

<210>

36

<211>

738

104

<212>

PRT

<213>

Proteína de cápside de virus adeno-asociado de Rhesus. Rh.39

<400>

36

5

<210> <211> <212> <213> 37 736 PRT Proteína de cápside de virus adeno-asociado de Rhesus, rh.43

<400>

37

5

<210> <211> <212> <213> 38 738 PRT Proteína de cápside de virus adeno-asociado de Rhesus, rh.46

<400>

38

5

<210> <211> <212> <213> 39 738 PRT Proteína de cápside de virus adeno-asociado de Rhesus, rh.2

<400>

39

5

<210> <211> <212> <213> 40 729 PRT Proteína de cápside de virus adeno-asociado de Rhesus, rh.37

<400>

40

5

<210> <211> <212> <213> 41 736 PRT Proteína de cápside de virus adeno-asociado de Rhesus, rh.8

<400>

41

5

<210> <211> <212> <213> 42 735 PRT Proteína de cápside de virus adeno-asociado, hu.29

<400>

42

5

<210> <211> <212> <213> 43 738 PRT Proteína de cápside de virus adeno-asociado de Rhesus, rh.64

<400>

43

5

<210> <211> <212> <213> 44 737 PRT Proteína de cápside de virus adeno-asociado de Rhesus, rh.48

<400>

44

5

<210> <211> <212> <213> 45 736 PRT Proteína de cápside de virus adeno-asociado, hu.44

<400>

45

5

<210> <211> <212> <213> 46 735 PRT Proteína de cápside de ch.5

<400>

46

5

<210> <211> <212> <213> 47 737 PRT Proteína de cápside de virus adeno-asociado de Rhesus, rh.67

<400>

47

5

<210> <211> <212> <213> 48 738 PRT Proteína de cápside de virus adeno-asociado de Rhesus, rh.58

<400>

48

5

<210> <211> <212> <213> 49 737 PRT Proteína de cápside de virus adeno-asociado de Rhesus, rh.54

<400>

49

<210>

50

<211>

736

<212>

PRT

5

<213> Proteína de cápside de virus adeno-asociado, hu.48

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1.-Un vector de virus adeno-asociado (AAV) que tiene una cápside de AAVrh.64 que tiene la secuencia SEQ ID Núm. 43 modificada para contener un triptófano en la posición 697 de residuo de aminoácido, que es de forma nativa una arginina.
2. 2.-El vector viral de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho vector viral porta un transgén que codifica un producto de gen bajo el control de secuencias reguladoras que dirigen expresión del producto en una célula anfitrión.
3. 3.-Una composición que comprende un vector de AAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 y un portador fisiológicamente compatible.
4. 4.-Un vector de AAV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 o una composición de acuerdo con la reivindicación 3, para su uso en el suministro de un producto de gen a un sujeto.
5. 5.-Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cápside de AAVrh.64 modificada que tiene la secuencia SEQ ID Núm. 43 modificada para contener un triptófano en la posición 697 de residuo de aminoácido, que es de forma nativa una arginina.
6. 6.-La molécula de +acido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5, la cual es un plásmido.