ES2525704T3 - Proteínas de unión a antígenos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo terapéutico que comprende un dominio VH que tiene la secuencia definida en la SEC ID Nº: 65 y un dominio VL que tiene la secuencia definida en la SEC ID Nº: 71.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

E08860577

09-12-2014

conjunto de CDR de cadena ligera, tal como las SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 5 y SEC ID Nº: 6 (ensambladas de forma que imiten la región variable de la cadena ligera madura y completamente reordenada) es suficiente para definir una región variable de la cadena ligera de la invención.

En una realización particular de la invención, la estructura de la cadena pesada receptora humana se deriva de

5 IGHV1-24 y del minigen JH4 y la estructura de la cadena ligera receptora humana se deriva de IGKV2-28 y del minigen JK-1 que opcionalmente contiene una o más sustituciones de restos aminoacídicos basándose en los restos correspondientes que se encuentran en el dominio VH del donante que tiene la secuencia: SEC ID Nº: 19 y el dominio VL que tiene la secuencia: SEC ID Nº: 21 que mantiene toda o sustancialmente toda la afinidad de unión del anticuerpo donante por el péptido β-amiloide. Por ‘sustancialmente toda la afinidad de unión’ se quiere decir que el

10 anticuerpo terapéutico presenta como máximo cinco veces, de forma más particular dos veces, una reducción en la afinidad de unión comparada con la del anticuerpo donante.

En una realización más particular de la invención la estructura de la cadena pesada receptora humana derivada de IGHV1-24 y JH4 tiene una o más, tal como de una a quince, de forma más particular de dos a quince, sustituciones de restos aminoacídicos que se seleccionan a partir de los siguientes restos (o sustituciones conservadoras de los

15 mismos):

Numeración Kabat del resto

Resto en la estructura humana (IGHV1-24 donante) Resto correspondiente en 6F6 murino

1

Q E

5

V Q

13

K E

24

V G

27

Y F

28

T N

29

L I

30

T K

37

V L

40

A L

41

P T

48

M I

66

R K

67

V A

69

M L

71

E V

75

T S

76

D N

93

A V

94

T S

En una realización más particular la estructura de la cadena pesada receptora humana que se deriva de IGHV1-24 y JH4 comprende los siguientes restos (o un sustituto conservador de los mismos):

8

E08860577

09-12-2014

Numeración Kabat del resto

Resto en la estructura humana (IGHV1-24 donante) Sustitución del resto

13

K E

24

V G

27

Y F

28

T N

29

L I

30

T K

37

V L

40

A L

48

M I

66

R K

67

V A

69

M L

71

E V

93

A V

94

T S

En una realización más particular de la invención la estructura de la cadena ligera receptora humana que se deriva de IGKV2-28 y JK-1 tiene una o más, tal como de una a cuatro, de forma más particular dos, sustituciones de restos aminoacídicos que se seleccionan a partir de los siguientes restos (o sustituciones conservadoras de los mismos):

Numeración Kabat del resto

Resto en la estructura humana (IGHV1-24 donante) Sustitución del resto

8

P A

11

L N

43

S P

63

S T

64

G S

100

Q (JK-1) G

104

V (JK-1) L

En una realización más particular de la invención la estructura de la cadena ligera receptora humana que se deriva de IGKV2-28 y JK-1 comprende los siguientes restos (o un sustituto conservador de los mismos):

Numeración Kabat del resto

Resto en la estructura humana (IGHV1-24 donante) Sustitución del resto

11

L N

64

G S

9

imagen7

imagen8

imagen9

imagen10

imagen11

imagen12

imagen13

imagen14

imagen15

imagen16

imagen17

imagen18

imagen19

imagen20

imagen21

imagen22

imagen23

imagen24

imagen25

imagen26

imagen27

imagen28

imagen29

imagen30

imagen31

imagen32

5

10

15

20

25

30

35

40

45

E08860577

09-12-2014

burro contra sc-2099 de ratón). Los controles negativos estaban constituidos por anticuerpo del mismo isotipo pero sin relación o se omitía el anticuerpo primario. Los núcleos se tiñeron posteriormente con 0,5 ml de 4',6-diamidino-2fenilindol (1 l de solución madre de DAPI a 5 ml de PBS 0,1 M; Sigma-Aldrich) durante 1 minuto. Después los cortes se lavaron varias veces con PBS 0,1 M seguido de cuatro lavados en solución salina de tampón Tris (a pH 7,4) y finalmente se montaron cubres de vidrio en VECTASHIELD (Vector Laboratories).

Los cortes se observaron y las imágenes se capturaron o bien en un microscopio confocal de barrido por láser (Leica SP2; Leitz) a 8 bites/canal y 1024x1024 píxeles, o un microscopio de campo brillante para Epi-fluorescencia (Olympus BX50F4, Olympus, Japón), donde los datos se capturaron en forma de imágenes a color de 24 bites a una resolución de 3840x3072 px usando una cámara Nikon DXM1200 (Nikon, Tokio, Japón).

Anticuerpos primarios disponibles comercialmente

Se usó C3 (anticuerpo de cabra contra ratón conjugado con FITC, dilución 1:100; ICN Biomedicals) para teñir los cortes de retina a las diluciones que se indica.

Anticuerpos contra β-amiloide que se usaron en este trabajo:

(1)

Ab policlonal de conejo específico para amiloide beta de roedor Covance SIG-39153, recomendado para usar en cortes embebidos en parafina IHC a una dilución de 1/250,

(2)

Ab monoclonal de ratón, (IgG2b), Calbiochem NE1002 (4G8) que reconoce tanto amiloide beta humano como de ratón, recomendado para usar cortes embebidos en parafina IHC a una dilución de 1/100 – 1/1000, (es necesario el pretratamiento con ácido fórmico),

(3)

Ab policlonal de conejo Abcam ab2539 que reconoce tanto amiloide beta humano como de ratón , recomendado para usar en cortes embebidos en parafina IHC a una dilución de 1/100, (requiere recuperar el antígeno por medios térmicos antes del procedimiento de tinción IHC),

Anticuerpos secundarios disponibles comercialmente

Tabla 5: Anticuerpos secundarios disponibles comercialmente que se usaron en este trabajo

Ab de burro contra IgG de ratón con FITC

Santa Cruz Biotech inc. sc-2099 1:300

Ab de burro contra IgG de conejo con FITC

Santa Cruz Biotech inc. sc-2090 1:300

Fragmento de Ab de cabra contra IgG de ratón Alexa Fluor 488

Invitrogen A11017 1:2000

Detección de depósitos drusenoides en ratones cfh-/-.

Los depósitos autofluorescentes pueden detectarse en la retina de ratones cfh-/-viejos. El lípido fluorescente, los depósitos de tipo drusenoide pueden detectarse primeramente aproximadamente a las 14 semanas de edad en los ratones cfh-/-y su presencia aumenta con la edad y está localizada en el espacio subretiniano (lado apical de RPE). Estos depósitos también están presentes en los ratones de tipo silvestre, pero con un grado significativamente menor. Por ejemplo, una imagen por cSLO de la retina de un ratón cfh-/-de 6 meses de edad identifica algunos puntos blancos autofluorescentes en un fondo gris y estos pueden observarse en un frotis de retina in vitro para IHC con aumentos de 10x y 40x, como depósitos autofluorescentes fácilmente identificables en el canal verde (FITC). Hay grandes variaciones en los espectros de emisión de fluorescencia entre los depósitos autofluorescentse, (no se muestran datos).

Cuando los cortes de la retina de los ratones cfh -/-se examinan mediante autofluorescencia IHC, pueden observarse depósitos de tipo drusenoide asociados a los sitios de deposición de complemento C3 en el espacio subretiniano de la parte apical de las células de RPE. Esto puede observarse en los ratones cfh-/-de 12 meses de edad (no se muestran datos).

Análisis de ojos de ratones cfh -/-con Ab contra amiloide beta disponibles comercialmente.

Se usaron cortes disponibles comercialmente de cerebros de Alzheimer humano cuya tinción para Aβ dio positivo (Abcam ab4582), para comprobar la reactividad cruzada de tres Ab contra amiloide beta disponibles comercialmente que se muestran en la Tabla 6.

El procedimiento que se usó para ello era:

Para cortes de cerebro en parafina:

1. Xileno -10 minutos

36

imagen33

imagen34

imagen35

imagen36

imagen37

imagen38

imagen39

imagen40

imagen41

E08860577

09-12-2014

Se identificaron los clones con las secuencias de VH y VL correctamente clonadas y se prepararon los plásmidos para la expresión en células CHO. El anticuerpo 6F6c expresado se purificó del sobrenadante del cultivo celular mediante cromatografía con proteína A en un sistema de FPLC, y después se analizó para determinar su unión a Aβ mediante ELISA y SPR usando tecnología BiacoreTM. Los resultados indicaban que se habían clonado y expresado

5 las regiones V de ratón de 6F6 correctas produciendo un anticuerpo funcional con características similares al anticuerpo murino progenitor 6F6.

Estrategia de humanización de la cadena pesada

Para la secuencia de la cadena pesada variable de ratón de 6F6 se seleccionó una estructura receptora de línea germinal humana (IGHV1-24, SEC. ID. Nº: 13) que tenía un 58 % de identidad (incluyendo las CDR) con la

10 secuencia variable de la cadena pesada de 6F6 de ratón (SEC ID Nº: 19) junto con el minigen JH4 (Kabat: YFDYWGQGTLVTVSS (SEC ID Nº: 15)). Los primeros cuatro restos de los restos del minigen JH4 entran en la región CDR3 que se sustituye por la CDR entrante del anticuerpo donante.

Se generó un conjunto de 34 variantes de cadena pesada variable humanizadas basándose en la comparación de las secuencias y en el posible impacto sobre la función del anticuerpo. Las CDR de la cadena pesada de 6F6 murino

15 (usando la definición de Kabat) (SEC. ID. Nº: 1, 2 y 3) se injertaron en la estructura receptora humana seleccionada anteriormente. Se diseñó un número de variantes de cadena pesada variable que comprendían las sustituciones a dos a quince posiciones elegidas de entre las posiciones 1, 5, 13, 24, 27, 28, 29, 30, 37, 40, 41, 48, 66, 67, 69, 71, 75, 76, 93 y 94 (numeración según Kabat) (Tabla 7). Las posiciones 93 y 94 inmediatamente adyacentes a la definición de Kabat de la CDRH3 se incluyeron en todas las variantes estudiadas.

20 Tabla 7 Lista de contramutaciones de VH investigadas

Numeración Kabat del resto

Resto en la estructura humana (IGHV1-24 donante) Resto correspondiente en 6F6 murino

1

Q E

5

V Q

13

K E

24

V G

27

Y F

28

T N

29

L I

30

T K

37

V L

40

A L

41

P T

48

M I

66

R K

67

V A

69

M L

71

E V

75

T S

76

D N

93

A V

94

T S

46

imagen42

imagen43

imagen44

imagen45

5

10

15

20

25

30

35

E08860577

09-12-2014

sucesivamente un resto del extremo C del péptido 18-mero empezando a partir del resto 40.

Todos los péptidos se generaron en el siguiente formato; Biotina-enlazador de SGSG-PÉPTIDO-amida, el enlazador se alargaba cuando era necesario para asegurar que todos los péptidos eran 22-meros.

Se lavó una placa biosensora recubierta con estreptavidina (SRU Biosytems ) con PBS y se centrifugó boca abajo para eliminar el tampón y después se lavó con PBS, 0,1 % de tween20 y 0,4 % de acetonitrilo y se centrifugó boca abajo para eliminar el tampón residual. Los pocillos se volvieron a suspender en 100 µl de PBS, 0,1 % de tween20 y 0,4 % de acetonitrilo y se leyeron en el lector de placas SRU para establecer los valores iniciales. Después se eliminaron 50 ul del tampón y se añadieron 50 ul de péptido diluido y se dejó que se unieran. La placa después se lavó con PBS dos veces y después se volvió a suspender en 100 ul de PBS y se volvieron a medir los valores iniciales. Una vez se hubieron establecido los valores iniciales, se eliminaron 50 ul de tampón y se añadió H11L9 y un anticuerpo de control a una concentración final de 30 ug/ml. Se controló la unión de los anticuerpos. Las placas se lavaron dos veces con PBS y se volvieron a suspender en 100 ul de PBS, y las placas se volvieron a medir y se referenciaron de nuevo a la adición de anticuerpo para buscar moléculas con enlace débil que pudieran eliminarse mediante la etapa de lavado. Se tomaron los niveles de unión de la placa lavada y se analizaron para determinar la unión de los anticuerpos al conjunto de diversos péptidos.

La deleción en el extremo N de la región no mostró efectos sobre la unión cuando se eliminaron los restos D23 a N27 de forma secuencial. La deleción de K28 provocó una reducción de la unión en más del 50 % pero la deleción de los restos G29 a A30 no redujo más la unión. La deleción del resto 131 y más allá suprimió totalmente la unión. Esto definió la frontera del extremo N que requería K28 para la unión completa. La deleción en el extremo C de la región no mostró efectos sobre la unión cuando se eliminaron los restos V40 a L34 de uno en uno. Sin embargo, la unión se suprimió completamente al eliminar la posición G33 y más allá. Esto definió la frontera del extremo C que requería al menos el resto G33 para la unión. Por lo tanto, los datos de la deleción en los extremos N y C tomados junto mapearon de forma detallada H11L9 al epítopo mínimo KGAIIG, restos 28-33, en el péptido β-amiloide. Esto confirma el mapeo de péptidos superpuestos anterior de los epítopos con anticuerpo monoclonal 6F6 pero la eliminación del resto M35 pareció provocar un descenso en la señal de unión con 6F6.

El barrido de sustitución con alanina de los restos N27 a G37 mostró que la sustitución de los aminoácidos I32 y en particular G33 con alanina tenía el mayor impacto sobre la unión. Estos datos también confirmaron los datos de deleción del extremo C anteriores en los que G33 parecía ser crucial para la unión de este anticuerpo. Los resultados se resumen en la Tabla 14 en forma esquemática.

Tabla 14 Resumen esquemático del mapeo detallado de los epítopos para H11L9

Nº de residuo en beta amiloide

23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

Aminoácido

D V G S N K G A I I G L M V G G V V

Barrido con alaninas

Truncado en el extremo N >

Truncado en el extremo C >

imagen46

Desinmunización del anticuerpo humanizado H11L9

Se realizó una evaluación in vitro de los potenciales epítopos en células Th y se sustituyeron restos seleccionados de la secuencia de aminoácidos de los los dominios de la cadena pesada variable y de la cadena ligera variable (SEC ID Nº: 24 y SEC ID Nº: 26 respectivamente) por restos alternativos para destruir estos epítopos a la vez que se mantenía la funcionalidad. Las posiciones 23, 30, 31, 38, 42, 61 y 95 para Vh y los restos 11, 30, 52 y 53 para VL se sustituyeron con los aminoácidos alternativos que se muestran en las Tablas 15 y 16 para cada posición.

51

E08860577

09-12-2014

Tabla 15 Sustituciones de aminoácidos seleccionadas en H11 de Vh humanizada

Variante humanizada de Vh

Numeración según Kabat 23 30 31 38 42 61 95

H11

K K V R G P S

H36

T - - - - - -

H37

- H - - - - -

H38

- - T - - - -

H39

- - - Q - - -

H40

- - - - E - -

H41

- - - - - Q -

H42

- - - - - - R

H43

T H T Q E Q R

H44

T H T Q E Q -

H45

- H T - - - -

H46

T H - - - - -

H47

T - - - E - -

H48

- H - - E - -

H49

- - T - E - -

H50

T H - E - -

H51

- H T - E - -

Tabla 16 Sustituciones de aminoácidos seleccionadas en L9 de VL humanizada

Variante de VL humanizada

Numeración según Kabat 11 30 52 53

L9

N I S N

L15

- K - -

L16

- - D -

L17

- - - H

L18

L K D H

L19

- K D H

L20

- - D H

L21

- K D -

L22

- K - H

52

E08860577

09-12-2014

Las regiones V se sintetizaron mediante construcción con oligos superpuestos y amplificación por PCR tal como se describe anteriormente o mediante mutagénesis dirigida al sitio usando las variantes H11 y L9 de cadena pesada y ligera como plantillas. Se incluyeron los sitios de restricción para la clonación en los vectores de expresión de mamífero RLD-bshe y RLN-bshe y una secuencia de señal murina (Kabat y col. "Sequences of Immunological 5 Interest", NIH, 1991, Quinta edición, p3.0 95VNP'CL). Los productos que que codificaban las regiones V modificadas se clonaron después en los vectores de expresión de mamífero: se clonaron variantes de cadena pesada en RLDbshe con el promotor pEF para generar ADN que codificaba cadenas pesadas mutadas de Fc de IgG1 humana de longitud completa; se clonaron variantes de cadena ligera en marco en el ADN que contenía RLN-bshe con el promotor pEF que codificaba la región constante kappa humana generando ADN que codificaba cadenas ligeras

10 kappa humanas de longitud completa.

Inicialmente, se expresaron variantes nuevas de Vh H36-H44 y se evaluaron combinadas con la cadena ligera L9 y se expresaron y evaluaron nuevas variantes de VL L15-L18 combinadas con la cadena pesada H11. Los anticuerpos expresados se analizaron para determinar su unión a beta amiloide 1-40 sintético usando el sobrenadante de cultivo de expresión y análisis por ELISA y Biacore. Después de esta evaluación, se combinaron los cambios únicos que 15 mejor mantenían la potencia de unión generando construcciones de cadenas pesada y ligera H45-H51 y L19-L22. Estas nuevas variantes de las cadenas se expresaron de nuevo combinadas con las cadenas emparejadas H11 y L9 tal como se describe anteriormente. Para este segundo conjunto de variantes, se combinaron las mejores cadenas pesadas (H48-H51) o ligeras (L19–L21) entre sí para generar un tercer conjunto que de nuevo se expresó e investigó mediante Biacore para determinar la cinética de la unión a beta amiloide 1-40. La Tabla 17 muestra esas

20 combinaciones y la cinética de unión

Tabla 17: Conjunto seleccionado de construcciones desinmunizadas humanizadas y cinética de unión(Biacore)

Construcciones

ka kd KD (nM)

H48L19

1,474E+5 4,643E-4 3,15

H49L19

1,549E+5 4,780E-4 3,09

H50L19

1,333E+5 3,682E-4 2,76

H51L19

1,405E+5 3,717E-4 2,65

H48L20

1,024E+5 2,065E-4 2,02

H49L20

9,967E+4 2,223E-4 2,23

H50L20

8,486E+4 2,122E-4 2,50

H51L20

9,646E+4 2,149E-4 2,23

H48L21

1,453E+5 2,922E-4 2,01

H49L21

1,405E+5 3,621E-4 2,58

H50L21

1,232E+5 2,671E-4 2,17

H51L21

1,383E+5 2,840E-4 2,05

H11L9 (sup)

1,019E+5 2,517E-4 2,47

H11L9 (pur)

1,013E+5 2,490E-4 2,46

Quimera 6F6 (pur)

1,815E+5 1,809E-4 1,00

Procedimiento Biacore que se usó para determinar la cinética de unión

25 El anticuerpo contra IgG humana (Biacore BR-1008-39) se acopló sobre un chip biosensor CM5 mediante acoplamiento de amina primaria. Los anticuerpos contra beta amiloide se capturaron sobre esta superficie. Después se hizo pasar beta amiloide (1-40) a 256, 64, 16, 4 y 1 nM, usando 0 nM (es decir, se hizo pasar tampón solo sobre la superficie del anticuerpo capturado) como referencia doble. Entre cada inyección de amiloide, la superficie se regeneró usando MgCl2 3 M, esto eliminó el anticuerpo capturado pero no afectó significativamente a la capacidad

30 de la superficie contra la proteína humana de capturar anticuerpos en análisis posteriores. Los datos se analizaron

53

imagen47

imagen48

imagen49

imagen50

Claims (1)

1. imagen1