ES2531753T3 - Enzima de degradación de la pared celular fúngica - Google Patents

Enzima de degradación de la pared celular fúngica Download PDF

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Abstract

Polipéptido fúngico que tiene actividad de lisozima y pertenece a la familia GH25 seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos, que tiene al menos 80% de identidad con los aminoácidos 1 a 233 de SEC ID nº: 2; (b) un polipéptido que es codificado por una secuencia de nucleótidos que hibridiza bajo condiciones de astringencia altas con una sonda polinucleótida que está constituida por la cadena complementaria de los nucleótidos 84 a 782 de SEC ID nº: 1 o (c) un fragmento de (a) o de (b) que tiene actividad de lisozima; donde el polipéptido tiene un pH óptimo a pH5.

Description

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estándar, para identificar y aislar el gen correspondiente del mismo. Tales sondas pueden ser considerablemente más cortas que toda la secuencia, pero deberían tener al menos 15, preferiblemente al menos 25, de forma más preferible al menos 35 nucleótidos de longitud, tal como al menos 70 nucleótidos de longitud. No obstante, se prefiere que la sonda de polinucleótidos tenga al menos 100 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, la sonda polinucleótida puede tener al menos 200 nucleótidos de longitud, al menos 300 nucleótidos de longitud, al menos 400 nucleótidos de longitud o al menos 500 nucleótidos de longitud. Incluso se pueden utilizar sondas más largas, por ejemplo, sondas polinucleótidas que tengan al menos 600 nucleótidos de longitud, al menos 700 nucleótidos de longitud, al menos 800 nucleótidos de longitud, o al menos 900 nucleótidos de longitud. Se pueden usar tanto sondas de ADN como de ARN. Las sondas están típicamente marcadas para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina o avidina).
[0045] Así, un ADN genómico o genoteca de ADNc obtenido a partir de tales otros organismos se pueden seleccionar para ADN que hibridiza con las sondas descritas anteriormente y que codifica un polipéptido que tiene actividad de lisozima. ADN genómico u otro ADN de tales otros organismos se pueden separar por electrofóresis en gel de poliacrilamida o agarosa, u otras técnicas de separación. ADN de las bibliotecas o el ADN separado se pueden transferir, e inmovilizar, en la nitrocelulosa u otros materiales portadores adecuados. Para identificar un clon o ADN que sea homólogo de la SEC ID nº: 1 el material portador con el ADN inmovilizado se usa en una transferencia de Southern.
[0046] Para fines de la presente invención, la hibridación indica que la secuencia de nucleótidos hibridiza a una sonda de polinucleótidos marcada que hibridiza a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID nº: 1 bajo muy bajas a muy altas condiciones de astringencia. Moléculas a la que la sonda polinucleótida hibridiza bajo estas condiciones se pueden detectar usando una película radiográfica o por cualquier otro método conocido en la técnica. Siempre que se usa el término "sonda polinucleótida" en el presente contexto, deben entenderse que tal sonda contiene al menos 15 nucleótidos.
[0047] En una forma de realización interesante, la sonda polinucleótida es la cadena complementaria de nucleótidos 84 a 782 de SEC ID nº: 1.
[0048] En otra forma de realización interesante, la sonda polinucleótida es la cadena complementaria de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de SEC ID nº: 2. En otra forma de realización interesante, la sonda polinucleótida es la cadena complementaria de SEC ID nº: 1. En otra forma de realización interesante, la sonda polinucleótida es la cadena complementaria de la región de codificación de polipéptido maduro de SEC ID nº: 1.
[0049] Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, se definen condiciones de astringencia de muy bajas a altísimas tales como pre-hibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 1,0% de SDS, 5X solución de Denhardt, 100 µ g/ml ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, siguiendo procedimientos de transferencia de Southern de estándar. Preferiblemente, las sondas largas de al menos 100 nucleótidos no contienen más de 1.000 nucleótidos. Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, el material portador se lava finalmente tres veces cada uno durante 15 minutos usando 2 x SSC, 0,1% de SDS a 42°C (astringencia muy baja), se lava preferiblemente tres veces cada uno durante 15 minutos usando 0,5 x SSC, 0,1% de SDS a 42°C (astringencia baja), se lava de forma más preferible tres veces cada uno durante 15 minutos usando 0,2 x SSC, 0,1% de SDS a 42°C (astringencia media), se lava incluso de forma más preferible tres veces cada uno durante 15 minutos usando 0,2 x SSC, 0,1% de SDS a 55°C (astringencia media alta), se lava de la forma más preferible tres veces cada uno durante 15 minutos usando 0,1 x SSC, 0,1% de SDS a 60°C (astringencia alta), en particular se lava tres veces cada uno durante 15 minutos usando 0,1 x SSC, 0,1% de SDS a 68°C (astringencia muy alta).
[0050] Aunque no se prefiere particularmente, se contempla que sondas más cortas, por ejemplo sondas que sean de aproximadamente 15 a 99 nucleótidos de longitud, tal como de aproximadamente 15 a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, se pueden usar también. Para este tipo de sondas cortas, se definen condiciones de astringencia tales como prehibridación, hibridación y post-hibridación de lavado de 5°C a 10°C por debajo de la Tm usando el cálculo según Bolton y McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) en 0,9 M NaCl, 0,09 M de Tris-HCl pH 7,6, 6 mM de EDTA, 0,5% de NP-40, 1X solución de Denhardt, 1 mM de pirofosfato de sodio, 1 mM de fosfato monobásico de sodio, 0,1 mM de ATP y 0,2 mg de ARN de levadura por ml siguiendo procedimientos de transferencia de Southern estándar.
[0051] Para sondas cortas que son de aproximadamente 15 nucleótidos a 99 nucleótidos de longitud, el material portador se lava una vez en 6X SCC más 0,1% de SDS durante 15 minutos y dos veces cada una durante 15 minutos usando 6X SSC de 5°C a 10°C por debajo de la Tm calculada.
Actividad de lisozima
[0052] Se han descrito diferentes ensayos para la determinación de actividad de lisozima. Un ensayo descrito en J. Biochem. (H. Maeda, 1980, vol. 88 (4): 1185-1191) se basa en la polarización de fluorescencia o la intensidad de fluorescencia utilizando peptidoglicano marcado con fluoresceína como un sustrato, que se obtuvo de Micrococcus lysodeikticus.
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[0125] La composición puede comprender un polipéptido de la invención como el componente enzimático principal, por ejemplo, una composición monocomponente. Alternativamente, la composición puede comprender actividades enzimáticas múltiples, tales como una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, glicosiltransferasa de ciclodextrina, desoxiribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, betagalactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, haloperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peptidoglutaminasa, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa.
[0126] Las composiciones se pueden preparar conforme a métodos conocidos en la técnica y pueden ser en forma de un líquido o una composición seca. Por ejemplo, la composición de polipéptido puede ser en forma de un granulado o un microgranulado. El polipéptido que se va a incluir en la composición se puede estabilizar conforme a métodos conocidos en la técnica.
[0127] Más adelante se dan ejemplos de usos preferidos de las composiciones de polipéptido de la invención. La dosificación de la composición de polipéptido de la invención y otras condiciones bajo las que la composición se usa se pueden determinar basándose en métodos conocidos en la técnica.
Biopelículas
[0128] Los microorganismos que crecen en biopelículas son menos susceptibles a todos los tipos de agentes antimicrobianos que los mismos microorganismos cuando crecen en cultivos de suspensión convencionales.
[0129] Es bien conocido que las bacterias hambrientas pueden ser mucho menos susceptibles a una variedad de desafíos antimicrobianos. Por ejemplo, varios antibióticos tradicionales tales como la penicilina, tienen un mal rendimiento en bacterias de división lenta o que no se dividen. Debido a que la lisozima ataca y destruye la capa de peptidoglicano independientemente del estado de crecimiento de las bacterias, sigue siendo eficaz.
Control de biopelícula; ejemplo líneas de agua dentales:
[0130] La acumulación de biopelícula dentro de una línea de agua dental puede contener biopelículas que consisten en, Psuedomonas aeroginosa, Proteus mirabilis, Leigonella sp. por nombrar algunos. También existe la posibilidad de colonización de especies que generalmente se encuentran en la cavidad bucal como resultado del fallo de las válvulas anti-retracción en el sistema. El riesgo de infección cruzada se vuelve incluso más un riesgo potencial por supuesto cuando pacientes inmunocomprometidos están implicados y en la actualidad el número de pacientes dentro de esta categoría continúa aumentando de manera constante. Existe la necesidad de un control eficaz de la acumulación de biopelícula bacteriana en las líneas de agua dentales. Un reseña sobre biopelículas se puede encontrar en: Watnick P y Kolter R. (2000) Biofilm, city of microbes. J Bacteriol.;182(10):2675-9.
[0131] Un ejemplo típico de un producto de pastilla para la garganta comercial es Lysopaine producida por: BOEHRINGER INGELHEIM FRANCE
Ingredientes activos:
[0132]
Bacitracina 200 U.I.. (para 65 UI/mg) Papaína 2 mg para 30 NK/mg Clorhidrato de lisozima 5 mg para 26.000 U FIP / mg: unidades determinadas por medición cinética OD de lisis de bacterias suspendidas en el tampón. La determinación de la unidad fue medida por cambio inducido por lisis en turbiedad de un cultivo bacteriano suspendido en el tampón.
Ingredientes no activos:
[0133]
Excipiente sacarina
Excipiente estearato de magnesio
Aromatizante mentol
Excipiente sorbitol
[0134] Para tratamiento local de infecciones puntuales limitadas a las membranas bucales de la orofaringe. Precaución, si hay indicaciones clínicas de una infección bacteriana general evidentes, se recomienda terapia antibiótica.
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