ES2531983T3 - Composición y método de tratamiento de deficiencias cognitivas en individuos con síndrome de Down - Google Patents

Abstract

Un compuesto que tiene selectividad funcional de agonista inverso para receptores GABAA que contienen la subunidad α5 para utilización como medicamento para el tratamiento o alivio de la gravedad de deficiencias cognitivas en individuos que padecen síndrome de Down, en donde el compuesto tiene una de las estructuras siguientes:**Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable o un éster escindible in vivo o un conjugado de glucósido enzimáticamente lábil o uno de sus ésteres de aminoácido.

Description

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metabolito o uno de sus residuos, según se describe de otra manera en la presente memoria . Los derivados farmacéuticamente aceptables comprenden por lo tanto, entre otros, profármacos.

Como se emplea en esta memoria, un profármaco es un compuesto que, tras la administración in vivo, se metaboliza o dicho de otra manera se convierte en la forma biológica, farmacéutica o terapéuticamente activa del compuesto. En otras palabras, un profármaco es un derivado de un compuesto, normalmente con actividad farmacológica considerablemente reducida, que contiene un grupo adicional que es susceptible de eliminación in vivo proporcionando la molécula original en forma de especie farmacológicamente activa. Para producir un profármaco, el compuesto farmacéuticamente activo se modifica de tal manera que el compuesto activo se regenerará por procesos metabólicos. El profármaco puede diseñarse para alterar la estabilidad metabólica o el transporte característicos de un fármaco, para enmascarar efectos secundarios o toxicidad, para mejorar el sabor de un fármaco o para alterar otras características o propiedades de un fármaco. En virtud del conocimiento de los procesos farmacodinámicos y del metabolismo de los fármacos in vivo, una vez un compuesto farmacéuticamente activo está identificado, los especialistas en la técnica farmacéutica generalmente pueden diseñar profármacos del compuesto [véase, es., Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, Nueva York, páginas 388-392].

Un ejemplo de un profármaco es un éster que se escinde in vivo para dar un compuesto de interés. Dichos ésteres pueden formarse por esterificación, por ejemplo, de cualesquiera de los grupos de ácido carboxílico (-C(=O)OH) en el compuesto original, con protección previa, cuando proceda, de cualesquiera otros grupos reactivos presentes en el compuesto original, seguido de desprotección si se necesita.

Ejemplos de dichos ésteres metabólicamente lábiles comprenden los de la fórmula -C(=O)OR en donde R es: alquilo C1-7 (p. ej., Me, Et, -nPr, -iPr, -nBu, -sBu, -iBu, tBu); aminoalquilo C1-7 (p. ej., aminoetilo; 2-(N,N-dietilamino)etilo; 2-(4-morfolino)etilo); y aciloxi-alquil C1-7 (p. ej., aciloximetilo; aciloxietilo; pivaloiloximetilo; acetoximetilo; 1acetoxietilo; 1-(1-metoxi-1-metil)etil-carboniloxietilo; 1-(benzoiloxi)etilo; isopropoxi-carboniloximetilo; 1-isopropoxicarboniloxietilo; ciclohexil-carboniloximetilo; 1-ciclohexil-carboniloxietilo; ciclohexiloxi-carboniloximetilo; 1ciclohexiloxi-carboniloxietilo; (4-tetrahidropiraniloxi)carboniloximetilo; 1-(4-tetrahidropiraniloxi)carboniloxietilo; (4tetrahidropiranil)carboniloximetilo y 1-(4-tetrahidropiranil)carboniloxietilo).

Además, algunos profármacos se activan mediante enzimas para dar el compuesto activo, o un compuesto que, tras otra reacción química, da el compuesto activo (por ejemplo, como en ADEPT, GDEPT, LIDEPT, etc.). Por ejemplo, el profármaco puede ser un derivado de azúcar u otro conjugado de glucósido, o puede ser un derivado de éster de aminoácido.

Se conocen profármacos de una variedad de compuestos y materiales y métodos para modificar los compuestos originales para crear los profármacos, y pueden adaptarse a la presente invención.

Otros derivados comprenden parejas de acoplamiento de los compuestos en las que los compuestos están unidos a una pareja de acoplamiento, p. ej. al estar químicamente acoplado al compuesto o físicamente asociado a él. Ejemplos de parejas de acoplamiento comprenden un marcador o molécula indicadora, un sustrato de soporte, un vehículo o molécula transportadora, un efector, un fármaco, un anticuerpo o un inhibidor. Las parejas de acoplamiento pueden estar unidas por enlaces covalentes a compuestos de la invención mediante un grupo funcional apropiado en el compuesto tal como un grupo hidroxilo, un grupo carboxilo o un grupo amino. Otros derivados comprenden la formulación de los compuestos con liposomas.

Algunas composiciones farmacéuticas ilustrativas y derivados farmacéuticamente aceptables se expondrán con más detalle en la presente memoria a continuación.

Descripción detallada de algunas realizaciones preferidas de la invención

Los receptores GABAA son canales iónicos para la entrada de ligandos que son los principales moduladores del tono inhibidor en todo el sistema nervioso central (SNC). Son el lugar de acción de numerosos fármacos clínicamente importantes, como por ejemplo benzodiazepinas (BZ), barbitúricos y anestésicos. Los receptores GABAA existen en forma de numerosos subtipos formados por el ensamblaje conjunto de polipéptidos de la subunidad de la familia de genes, la mayoría de los cuales contienen subunidades α, β y γ. Cada subtipo de receptor tiene un modelo distinto de expresión dentro del cerebro del mamífero, lo que sugiere una función fisiológica definida.

La fijación de GABA a su receptor puede modularse por la fijación simultánea de compuestos químicos a zonas alostéricas en el complejo del canal iónico, la más estudiada de las cuales es la zona de fijación a BZ. En base a sus efectos moduladores sobre la activación del receptor GABAA inducida por GABA, los ligandos de la zona a BZ se clasifican en agonistas (moduladores alostéricos positivos), agonistas inversos (moduladores alostéricos negativos)

o antagonistas.

Los agonistas BZ ejercen su efecto al aumentar la frecuencia de abertura del canal en presencia de GABA produciendo un aumento en el flujo de cloruro a través del canal iónico para dar una hiperpolarización neta de las neuronas y una menor excitabilidad. En cambio, los agonistas inversos BZ disminuyen la frecuencia de abertura del

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3. Composiciones farmacéuticas

En otro aspecto, se proporcionan composiciones farmacéuticamente aceptables, en donde estas composiciones comprenden cualesquiera de los compuestos descritos en la presente memoria, y opcionalmente comprenden un excipiente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, estas composiciones

5 opcionalmente comprenden además uno o más agentes terapéuticos adicionales.

Por lo tanto, se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen, como principio activo, uno o más de los compuestos descritos en la presente memoria junto con al menos un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas son útiles para tratar o aliviar la gravedad de deficiencias cognitivas relacionadas con el síndrome de Down, o para potenciar la función cognitiva en individuos

10 que padecen síndrome de Down.

En algunas realizaciones, el principio activo farmacéutico comprende al menos un compuesto que tiene selectividad funcional de agonista inverso por receptores GABAA que contienen la subunidad α5. En algunas realizaciones ilustrativas, al menos un agonista inverso funcionalmente selectivo por subtipos α5 del receptor GABAA presenta una de las estructuras siguientes:

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o una de sus sales o profármacos farmacéuticamente aceptables.

* fuera del alcance de la invención

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En algunas realizaciones preferidas, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un compuesto que tiene selectividad funcional de agonista inverso por receptores GABAA que contienen la subunidad α5, o una de sus sales o profármacos farmacéuticamente aceptables, en combinación con un tensioactivo (agente activo de superficie o agente tensio-activo), por ejemplo aceite de ricino polietoxilado, como excipiente y 5 sulfóxido de dimetilo como disolvente. En algunas realizaciones, la composición es útil para el tratamiento o el alivio de la gravedad de deficiencias cognitivas en individuos que padecen síndrome de Down. En algunas realizaciones, la composición puede estar en forma de una cápsula, solución líquida o suspensión gelatinosa. En algunas realizaciones, la composición puede ser un preparado parenteral. En algunas realizaciones, el preparado parenteral puede ser para inyección intravenosa. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz del compuesto puede ser eficaz 10 para producir un efecto potenciador de la memoria, un efecto potenciador del aprendizaje o ambos. En algunas realizaciones, la composición puede comprender además un agente terapéutico adicional utilizado para tratar enfermedades o trastornos relacionadas con el síndrome de Down. La cantidad eficaz puede extrapolarse de las curvas clásicas de respuesta a la dosis, que permiten la determinación de CE50 para un determinado compuesto ensayado (la concentración de un fármaco que provoca una respuesta a medio camino entre la inicial y la máxima

15 después de algún tiempo de exposición especificado). La CE50 de una curva de respuesta a la dosis escalonada representa por consiguiente la concentración de un compuesto donde se observa el 50% de su efecto máximo. Se utiliza frecuentemente como una medida de la potencia y toxicidad del fármaco. Por ejemplo, una cantidad eficaz para el compuesto α5IA puede estar comprendida entre 3 y 10 mg por vía oral, por ejemplo aproximadamente 4 mg por vía oral en personas.

20 En algunas realizaciones ilustrativas, la composición comprende al menos un compuesto que presenta una de las estructuras siguientes:

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25 o una de sus sales o profármacos farmacéuticamente aceptables.

* fuera del alcance de la invención

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En algunas realizaciones ilustrativas, la composición comprende al menos un compuesto que presenta una de las estructuras siguientes:

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o una de sus sales o profármacos farmacéuticamente aceptables.

* fuera del alcance de la invención En algunas realizaciones preferidas, la composición comprende al menos un compuesto que la estructura siguiente:

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o una de sus sales o profármacos farmacéuticamente aceptables.

En algunas realizaciones ilustrativas, el tensioactivo es aceite de ricino polietoxilado. En algunas realizaciones

10 ilustrativas, el aceite de ricino polietoxilado es Cremophor EL-H20®. Cremophor EL es la marca comercial registrada de BASF Corporation para su versión de aceite de ricino polietoxilado. Se prepara haciendo reaccionar 35 moles de óxido de etileno con cada mol de aceite de ricino. El producto resultante es una mezcla (CAS número 61791-12-6): el componente principal es el material en el que los grupos hidroxilo del triglicérido del aceite de ricino se han etoxilado con óxido de etileno para formar éteres de polietilenglicol. Los componentes minoritarios son los éteres de

15 polietilenglicol del ácido ricinoleico, polietilenglicoles y éteres polietilenglicólicos de glicerol. En algunas realizaciones, pueden utilizarse otros tensioactivos tal como solutol HS15 en lugar de aceite de ricino polietoxilado o además del mismo.

En algunas realizaciones, se utiliza DMSO como codisolvente con agua.

En algunas realizaciones, la composición se formula utilizando una mezcla de DMSO/aceite de ricino

20 polietoxilado/agua donde el aceite de ricino polietoxilado representa entre el 10 y el 20%, preferiblemente entre el 11 y el 19%, preferiblemente entre el 12 y el 18%, preferiblemente entre el 13 y el 17%, preferiblemente entre el 14 y el 15%, preferiblemente alrededor del 15% en volumen de la mezcla DMSO/aceite de ricino polietoxilado/agua. En algunas realizaciones, la composición se formula utilizando una mezcla de DMSO/aceite de ricino polietoxilado/agua donde el DMSO representa entre el 5 y el 15%, preferiblemente entre el 6 y el 14%, preferiblemente entre el 7 y el

25 13%, preferiblemente entre el 8 y el 12%, preferiblemente entre el 9 y el 11%, preferiblemente alrededor del 10% en volumen de la mezcla DMSO/aceite de ricino polietoxilado/agua. En algunas realizaciones ilustrativas, la

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farmacéuticamente aceptables. Éstas pueden prepararse según métodos conocidos por los expertos en la técnica. La forma de la mezcla resultante depende de numerosos factores, como por ejemplo el modo de administración deseado y la solubilidad del compuesto en el excipiente o vehículo seleccionado. La concentración eficaz es suficiente para mejorar los síntomas de la enfermedad, trastorno o afección tratado y puede determinarse empíricamente.

Los excipientes o vehículos farmacéuticos adecuados para la administración de los compuestos proporcionados en la presente memoria comprenden cualesquiera de dichos excipientes conocidos por los expertos en la técnica por ser adecuados para el modo específico de administración. Además, los materiales activos pueden mezclarse también con otros materiales activos que no afectan la acción deseada, o con materiales que complementan la acción deseada o tienen otra acción. Los compuestos pueden formularse en forma de un solo principio farmacéuticamente activo en la composición o pueden combinarse con otros principios activos.

Un excipiente sólido puede ser una o más sustancias, que pueden actuar también como diluyentes, agentes potenciadores de sabor, disolventes, lubricantes, agentes de suspensión, aglutinantes o agentes disgregadores de comprimidos; puede ser también un material de encapsulación.

En polvo, el excipiente es un sólido finamente dividido, que está en una mezcla con el componente activo finamente dividido. En comprimidos, el componente activo se mezcla con el excipiente que tiene las propiedades de fijación necesarias en proporciones adecuadas y se compacta en la forma y tamaño deseados.

Para preparar composiciones para supositorios, se derrite en primer lugar una cera de bajo punto de fusión tal como una mezcla de glicéridos de ácidos grasos y manteca de cacao y el principio activo se dispersa en ésta por agitación, por ejemplo. La mezcla homogénea fundida se vierte a continuación en moldes de tamaño conveniente y se deja enfriar y solidificar.

los excipientes adecuados comprenden carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, lactosa, azúcar, pectina, dextrina, almidón, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, una cera de bajo punto de fusión, manteca de cacao y similares.

La composición farmacéutica puede estar en forma recubierta. Ejemplos de materiales de recubrimiento adecuados comprenden, pero no se limitan a, polímeros de celulosa tales como acetato ftalato de celulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropil-metilcelulosa, ftalato de hidroxipropil-metilcelulosa y acetato succinato de hidroxipropilmetilcelulosa; acetato ftalato de polivinilo, polímeros y copolímeros de ácido acrílico y resinas metacrílicas que están disponibles en el mercado bajo la denominación comercial Eudragit® (Roth Pharma, Westerstadt, Alemania), zeína, goma laca y polisacáridos.

Además, el material de recubrimiento puede contener excipientes convencionales tales como plastificantes, pigmentos, colorantes, fluidificantes, agentes de estabilización, formadores de poros y tensioactivos.

Si se desea administración oral, el compuesto puede suministrarse en una composición que le protege del medio ácido del estómago. Por ejemplo, la composición puede formularse en un recubrimiento entérico que mantiene su integridad en el estómago y libera el compuesto activo en el intestino. La composición puede formularse también en combinación con un antiácido u otro de dichos ingredientes.

Los excipientes opcionales farmacéuticamente aceptables presentes en los comprimidos, bolitas, gránulos o partículas que contienen fármacos comprenden, pero no se limitan a, diluyentes, aglutinantes, lubricantes, disgregadores, colorantes, estabilizantes y tensioactivos.

Los diluyentes, denominados también "cargas" son por lo general necesarios para aumentar la mayor parte de una forma farmacéutica sólida de manera que se proporciona un tamaño práctico se proporciona para la compresión de comprimidos o la formación de bolitas y gránulos. Los diluyentes adecuados comprenden, pero no se limitan a, fosfato dicálcico dihidratado, sulfato cálcico, lactosa, sacarosa, manitol, sorbitol, celulosa, celulosa microcristalina, caolín, cloruro de sodio, almidón anhidro, almidones hidrolizados, almidón pregelatinizado, dióxido de silicio, óxido de titanio, silicato de magnesio y aluminio y azúcar en polvo.

Se utilizan aglutinantes para comunicar cualidades cohesivas a una formulación en dosis sólida, y garantizar de este modo que un comprimido, bolita o gránulo permanece intacto después de la formación de las formas farmacéuticas. Los materiales aglutinantes adecuados comprenden, pero no se limitan a, almidón, almidón pregelatinizado, gelatina, azúcares (como por ejemplo sacarosa, glucosa, dextrosa, lactosa y sorbitol), polietilenglicol, ceras, gomas naturales y sintéticas tales como goma arábiga, tragacanto, alginato sódico, celulosa, como por ejemplo hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, etilcelulosa, y Veegum, y polímeros sintéticos tales como copolímeros de ácido acrílico y ácido metacrílico, copolímeros de ácido metacrílico, copolímeros de metacrilato de metilo, copolímeros de metacrilato de aminoalquilo, ácido poliacrílico/ácido polimetacrílico y polividona.

Se utilizan lubricantes para facilitar la preparación de comprimidos. Ejemplos de lubricantes adecuados comprenden, pero no se limitan a, estearato de magnesio, estearato de calcio, ácido esteárico, behenato de glicerol, polietilenglicol, talco y aceite mineral.

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La cantidad de agente terapéutico adicional presente en las composiciones de esta invención no debe ser superior a la cantidad que normalmente se administraría en una composición que comprende este agente terapéutico como el único agente activo. Preferiblemente la cantidad de agente terapéutico adicional presente en las composiciones descritas actualmente oscilarán desde aproximadamente 50% a 100% de la cantidad normalmente presente en una composición que comprende este agente como el único agente terapéuticamente activo.

Los problemas médicos asociados por lo general al síndrome de Down comprenden los defectos congénitos de corazón (p. ej., defectos del tabique auriculoventricular, el defecto del tabique ventricular (VSD), el defecto del tabique auricular, o el conducto arterioso persistente, otra cardiopatía compleja tal como la Tetralogía de Fallot y el síndrome del corazón izquierdo hipoplásico), la hipertensión pulmonar, problemas del oído (p. ej., acumulación de líquido en el oído interno, infección del oído o problemas estructurales del propio oído) y de la visión (p. ej., cataratas congénitas (pérdida de transparencia del cristalino del ojo), glaucoma (aumento de la presión dentro del ojo), estrabismo (bizco) y errores refractarios principales (hipermétrope o miope), ambliopía (ojo perezoso)), anomalías intestinales, trastornos convulsivos, problemas respiratorios, obesidad, un aumento de sensibilidad a las infecciones, leucemia (la leucemia se produce en uno de cada 150 niños con síndrome de Down. Esto es 20 veces más elevada que en la población general), anomalías gastrointestinales (2 por ciento a 5 por ciento de los niños tienen obstrucción completa del intestino delgado conocida como atresia duodenal. Otro 2 por ciento tiene escasas de capacidades de movimiento del colon y/o recto conocida como enfermedad de Hirschsprung) y trastornos del tiroides.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, el método de la invención puede incluir la administración conjunta (simultánea o sucesivamente) de un compuesto o composición farmacéutica de la invención junto con un agente terapéutico adicional apropiado para tratar enfermedades o afecciones asociadas al síndrome de Down, tales como las mencionadas anteriormente.

Los ejemplos representativos siguientes están pensados para ayudar a ilustrar la invención, y no están pensados para, ni debería considerarse que, limitan el alcance de la invención. De hecho, varias modificaciones de la invención y muchas más de sus realizaciones, además de las mostradas y descritas en la presente memoria, se harán patentes para los expertos en la materia a partir de los contenidos completos de este documento, entre otros los ejemplos que siguen y las referencias a la bibliografía científica y de patentes citada en la presente memoria.

Los siguientes ejemplos contienen importante información, ejemplificación y orientaciones adicionales que pueden adaptarse a la puesta en práctica de esta invención en sus varias realizaciones y sus equivalentes.

Ejemplos

Compendio

El tratamiento con antagonistas de GABAA puede restablecer funciones cognitivas de ratones Ts65Dn, un modelo genético para el síndrome de Down. Ya que estos fármacos son también convulsionantes, los inventores evaluaron las estrategias terapéuticas más seguras utilizando un agonista inverso (α5IA) selectivo para los receptores GABAAbenzodiazepina que contienen el subtipo α5 que inhibe la transmisión GABAérgica sin presentar actividades convulsionantes. Los inventores demuestran que α5IA alivia las deficiencias del aprendizaje y la memoria en ratones Ts65Dn al potenciar productos génicos iniciales inmediatos producidos por el comportamiento en el cerebro.

El síndrome de Down es la causa genética más frecuente de retraso mental (1/800 nacimientos), y está caracterizado por grados variables de deficiencias cognitivas [ref. 17]. Datos recientes sugieren que los cambios asociados al aprendizaje y la disfunción de la memoria en el SD podrían proceder, en parte, del aumento de inhibición GABAérgica en el cerebro, abriendo nuevas vías para la intervención terapéutica [ref. 2, 18]. La utilización de antagonistas de GABAA no competitivos puede restablecer de hecho fenotipos alterados en ratones con SD [ref. 3, 19]. Sin embargo, estos fármacos son convulsionantes a altas dosis, evitando su empleo, sobre todo en pacientes con SD que pueden ser más propensos a las convulsiones [ref. 9].

El objetivo del presente trabajo era evaluar el potencial terapéutico de un agonista inverso selectivo para α5, la 3-(5metilisoxazol-3-il)-6-[(1-metil-1,2,3-triazol-4-il)metiloxi]-1,2,4-triazolo[3,4-a]ftalazina [ref. 8] activa por vía oral, denominada en la presente memoria compuesto α5IA, en ratones Ts65Dn con deficiencia cognitiva que modelan el SD [ref. 1].

Los inventores en primer lugar comprobaron que el nivel de expresión del gen Gabra5 codifica la subunidad α5 GABAA era comparable en ratones Ts65Dn y euploides (Fig. 2). Los inventores sintetizaron α5IA según Sternfeld [ref. 8] (Fig. 1) y seleccionaron la dosis de 5 mg/kg i.p. para estimular efectos promnésicos claros en ratones (Fig. 5) con actividad convulsionante/proconvulsionante no asociada (véase el ejemplo 3 y la tabla 1) ni ansiógena y efectos locomotores (Figs. 6 y 7). El examen histopatológico no puso de manifiesto alteraciones tisulares tras el tratamiento prolongado con α5IA (Fig. 8 y comentarios en la figura 8). Dada la ausencia de efectos secundarios de α5IA, los inventores evaluaron su potencial terapéutico para recuperar el conocimiento alterado en ratones Ts65Dn.

La memoria espacial se evaluó en la tarea del laberinto acuático de Morris (LAM), en el que los ratones nadan en su medio para encontrar una plataforma oculta (Fig. 11A). Se administró i.p. α5IA o placebo 30 min antes de cada

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sesión de adiestramiento. Aunque muestran capacidades visuales normales (Fig. 9), los ratones Ts65Dn bajo placebo se alteraron profundamente en comparación con los ratones euploides (p<0,0025), y presentaron un retardo para mejorar su eficacia de aciertos a través de las sesiones (p<0,025) (Figs. 11B y C). El tratamiento con α5IA disminuyó la utilización de estrategias de búsqueda ineficientes por ratones Ts65Dn (véanse Comentarios en las figuras 9 y 10, y Fig. 10) y sobre todo permitiéndoles recuperar la eficacia de aprendizaje normal (Fig. 11B y C). Se evaluó la retención durante una prueba con una sola sonda (sin plataforma disponible). La memoria para el objetivo se demostró en ratones euploides (p<0,05) pero no en ratones Ts65Dn, incluso después del tratamiento con α5IA (p>0,38) (Fig. 11D).

La memoria no espacial se evaluó en la tares de reconocimiento de nuevos objetos (RNO) (Fig. 12A). Se proporcionaron tratamientos 30 min antes de la obtención. Los ratones Ts65Dn bajo placebo presentaron una deficiencia de la memoria cuando se comparaban con ratones euploides (p<0,05). Después del tratamiento con α5-IA, la memoria de reconocimiento se potenció en gran medida tanto en grupos Ts65Dn como euploides (p<0,001) que presentaron eficacia de alta retención similar (falta de efecto de genotipo: p>0,99).

En paralelo los inventores realizaron un análisis de la cartografía cerebral del producto génico inicial inmediato fos noventa minutos tras la obtención de la tarea de RNO (Figs. 12B y 13). Se observó aumento de inmunorreactividad de fos en ratones euploides y Ts65Dn tratados con α5IA en comparación con los ratones bajo placebo. Especialmente, se observó el aumento de inmunorreactividad de fos provocado por α5IA en diferentes áreas cerebrales involucradas en la memoria de reconocimiento (p. ej. corteza perirrinal) pero no en el giro dentado, que contiene solamente bajos niveles de expresión de los receptores GABAA que contienen la subunidad α5 [ref. 21].

En este estudio los inventores demostraron que los ratones Ts65Dn que reciben una sola administración de α5IA aumentaron su eficacia cognitiva en la tarea del RNO. Además, el tratamiento repetido con α5IA en todas las sesiones de adiestramiento en la tarea del LAM permitió a los ratones Ts65Dn disminuir sus comportamientos anómalos en la búsqueda, y aprender un lugar objetivo fijado con la misma eficiencia que los ratones euploides. α5IA, debido a su falta de efectos convulsionantes o ansiógenos, tiene unas características terapéuticas más favorables que otros fármacos GABAérgicos (antagonistas de GABAA) y de hecho ya ha sido aprobado para estudios en personas [ref. 10].

Materiales y Métodos

a. Animales

Se produjeron ratones en el centro de recursos Intragene (TAAM, CNRS UPS44 Orleans, Francia) y se reprodujeron en un fondo genético mixto (B6C3<B>(l)) que lleva un alelo funcional de Pd6b similar al que se describe en Costa et al. [ref. 24], evitando de este modo la degeneración retiniana y el fenotipo de la ceguera en los ratones modificados genéticamente. Para cada experimento, se utilizaron diferentes cohortes de ratones sin experimentación previa para evitar confundir los efectos de pruebas repetidas. Cuando se transfirieron de un centro de animales al otro, los ratones se aclimataron a su nuevo medio durante al menos 2 semanas antes de iniciar experimentos de comportamiento. La salud general de los ratones se comprobó regularmente y los pesos corporales se evaluaron semanalmente en todos los periodos experimentales.

Todos los experimentos se realizaron según las normas éticas de los reglamentos francés y europeo (Directiva del Consejo para las Comunidades Europeas de 24 de noviembre de 1986). El supervisor de los estudios in vivo (B. Delatour) recibió autorización oficial del ministro francés de Agricultura para llevar a cabo investigación y experimentos en animales (autorización nº 91-282).

b. RCP cuantitativa en tiempo real de Gabra-5

La expresión del gen Gabra-5 se estudió utilizando RCP cuantitativa en tiempo real (qRCP) en 9 ratones euploides y 7 Ts65Dn. Se extrajeron ARN completos de los hipocampos disecados y se trataron con DNasa utilizando el kit Nucleospin RNA II (Macherey-Nagel, Francia). De cada hipocampo, se transcribieron a la inversa individualmente 500 ng de ARN completo en ADNc durante la noche a 37°C utilizando el kit Verso cDNA (ThermoFisher Scientific, Waltham, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Los ADNc se diluyeron 1:20 a continuación para la ampliación por qRCP en tiempo real de los genes Gabra-5 y pPib (ciclofilina B) como gen de referencia (los cebadores y sondas se diseñaron mediante el programa informático ProbeFinder, http://www.universalprobelibrary.com)

Los ensayos por qRCP se realizaron en un Lightcycler® 480 System (Roche), en presencia de 200 nM de cada cebador, 100 nM de sonda específica para hidrólisis y 1X Lightcycler® 480

Sondas Master mix (Roche, Francia). Cada reacción se llevó a cabo por triplicado según las instrucciones del fabricante. Se calcularon valores de la expresión normalizada de Gabra-5 utilizando el programa informático Lightcycler® 480 SW 1.5 .

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c. Análisis Estadístico

Los datos de comportamiento y morfológicos se analizaron utilizando estadísticas paramétricas, dependiendo de las variables estudiadas. En la mayoría de los casos, los datos se analizaron utilizando un análisis de la variancia (ANOVA) con dos factores: genotipo (euploide frente a Ts65Dn) y tratamiento (placebo frente a α5IA). La

5 significación estadística se fijó para un valor p <0,05. Todos los análisis se realizaron utilizando los paquetes informáticos Statistica v6 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, EE.UU.) o GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE.UU.) .

Obsérvese que para facilitar la presentación de los resultados, las estadísticas de ANOVA se han presentado utilizando solamente los valores p.

10 Cuando no están explícitamente expresadas en las legendas de las figuras, las variables dependientes se han representado en cada grupo como media ± error típico para la media (SEM).

Ejemplo 1: Síntesis del compuesto α5IA (714A3)

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "temperatura ambiente" se refiera a una temperatura comprendida entre 20°C y 25°C.

15 El compuesto α5IA (714A3) se obtuvo en 4 etapas partiendo del 714A0 con un rendimiento global del 35,3%. Estas 4 etapas se detallan a continuación.

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Etapa 1: Síntesis del compuesto 714A1

El compuesto 714A0 (1 eq., 9,96 g, 50,1 mmol) se introdujo en un matraz de fondo redondo de 250 ml. Se añadieron

20 con agitación magnética 106,4 ml de alcohol etílico (36 eq., 1,80 mol), a continuación 4,8 ml de hidróxido amónico al 20% (0,5 eq., 0,03 mol). La mezcla se calentó a 60°C. Se añadió gota a gota a continuación durante 5 minutos hidrazina monohidratada (3,6 eq., 0,18 mol, 9,0 g). La mezcla resultante se calentó a reflujo durante 10 minutos (mezcla espesa, la agitación fue difícil). La mezcla se dejó enfriar a continuación por debajo de la temperatura ambiente. La mezcla se filtró, el matraz se enjuagó con una cantidad mínima de alcohol etílico. El filtro se lavó con

25 agua, alcohol etílico y éter. Después del secado, se obtuvieron 8,32 g de compuesto 714A1 en forma de un sólido blanquecino. El rendimiento fue del 86%.

Etapa 2: Síntesis del compuesto 714A1'

Se introdujeron bajo argon en un reactor de 2 l con agitación mecánica CH2Cl2 (1051,6 ml, 383 eq., 16,34 mol), el compuesto 714C0 (5,4 g, 1 eq., 0,04 mol), a continuación trietilamina (11,8 ml, 2 eq., 0,09 mol). La mezcla resultante

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se enfrió por debajo de 0°C con agitación, a continuación se añadió cloruro de bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfónico (BOP-C1, 10,9 g, 1 eq., 0,04 mol). Después de agitar a esta temperatura durante 45 minutos, se introdujo el compuesto 714A1 (8,3 g, 1 eq., 42,7 mmol). La mezcla se dejó en agitación a 0°C durante 2 horas, a continuación a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se evaporó, se puso en suspensión en agua y se filtró. El sólido resultante se lavó dos veces con agua, a continuación se secó en evaporador rotativo con alcohol etílico. El sólido se puso en suspensión y se lavó con pentano para proporcionar el compuesto 714A1' en forma de un sólido amarillo (m=12,4 g). Rendimiento: 96%.

Etapa 3:Síntesis del compuesto 714A2

Se introdujeron en un matraz de 1 l de fondo redondo de tres bocas con agitación magnética clorhidrato de trietilamina (2,5 g, 0,4 eq., 0,02 mol), xileno (601,2 ml, 119 eq., 4,87 mol), a continuación el compuesto 714A1' (12,4 g, 1 eq., 40,9 mmol). La mezcla resultante se dejó a reflujo durante 3 horas, a continuación se dejó en agitación a temperatura ambiente durante la noche. Se añadió DCM (CH2Cl2) a la suspensión resultante para obtener una mezcla homogénea. La fase orgánica se lavó con agua, se secó sobre MgSO4, se filtró y el disolvente se evaporó. El residuo se puso en suspensión en pentano para proporcionar 8,39 g de un sólido amarillo. El sólido se puso en suspensión para una extracción con DCM/H2O. Después del tratamiento habitual, se obtuvo el compuesto 714A2 en forma de un sólido amarillo (7,1 g). Rendimiento: 61%.

Etapa 4: Síntesis del compuesto α5IA (714A3)

a) Síntesis del reactivo 714B3

El compuesto 714A3 se obtuvo en 3 etapas partiendo del 714B0 con un rendimiento global del 17,6%. Estas 3 etapas se detallan a continuación.

-Síntesis del compuesto 714B1:

El compuesto 714B0 (24,9 ml, 1 eq., 0,298 mol) y (CH3)3SiN3 se introdujeron en un autoclave de 1 l con agitación magnética. La mezcla resultante se calentó a 105°C durante 90 horas. La mezcla se enfrió por debajo de 0°C, a continuación se añadieron gota a gota 36 ml de metanol. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 45 minutos, a continuación se añadieron 20 ml de éter. El sólido se filtró, se lavó con éter, con pentano, a continuación se secó a proporcionar un sólido blanquecino (37,36 g). El sólido se puso en suspensión en 80 ml de metanol. La mezcla resultante se calentó a reflujo (disolución), a continuación se añadió éter hasta enturbiar la solución. La mezcla se dejó sin agitar y sin calentar durante 2 horas. La suspensión resultante se filtró, se lavó con éter para proporcionar el compuesto 714B1 en forma de un sólido blanco (28 g + 9 g para el 2º lote). Rendimiento: 98%.

-Síntesis del compuesto 714B2:

El compuesto 714B1 (27 g, 1 eq., 0,213 mol) y a continuación DMF (434,8 ml, 26,3 eq., 5,59 mol) se introdujeron en un reactor de 500 ml en agitación mecánica. La mezcla resultante se enfrió por debajo de 0°C. Se añadió en porciones K2CO3 (35,21 g, 1,2 eq., 0,255 mol), a continuación se añadió gota a gota CH3I (31,7 g, 1,05 eq., 0,223 mol). La mezcla se agitó a 0°C durante 1 hora, a continuación a temperatura ambiente durante la noche. Se evaporó el disolvente; el residuo se puso en suspensión en agua y se extrajo con CH2Cl2. Después de secar y evaporar, el sólido se puso en suspensión en CH2Cl2. La fase orgánica se lavó con agua y las fases acuosas se volvieron a extraer con CH2Cl2. Las fases orgánicas se recogieron, se secaron sobre MgSO4, se filtraron, a continuación se evaporó el disolvente. El aceite resultante se puso en suspensión en éter y el sólido resultante se filtró y se lavó con éter para proporcionar 6,98 g de compuesto 714B2 en forma de un sólido blanco. Rendimiento: 23%.

-Síntesis del compuesto 714B3:

El compuesto 714B2 (6,98 g, 1 eq., 49,5 mmol) y THF (tetrahidrofurano,81,1 ml, 20 eq., 0,99 mol) se introdujeron en un reactor de 250 ml en agitación mecánica. La mezcla resultante se enfrió por debajo de 0°C. Se añadió en porciones LAH (hidruro de litio y aluminio o LiAlH4, 1,9 g, 1 eq., 0,05 mol) . La mezcla se agitó a 0°C durante 30 minutos, a continuación a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla se enfrió por debajo de 0°C, a continuación se hidrolizó con 2 ml de agua, 2 ml de NaOH al 15%, a continuación 6 ml de agua. Después de agitar a temperatura ambiente durante 1 hora, se filtró la mezcla, se lavaron las sales con THF, a continuación se evaporó el disolvente. Se puso en suspensión el residuo en CH2Cl2, se secó sobre MgSO4, se filtró, a continuación se evaporó el disolvente para proporcionar 4,34 g de compuesto 714B3 en forma de un aceite que cristaliza. Rendimiento: 78%.

b) Reacción entre el compuesto 714A2 y el reactivo 714B3

El reactivo 714B3 (2,8 g, 1 eq., 0,02 mol) y a continuación DMF (dimetilformamida,665,2 ml, 344 eq., 8,55 mol) se introdujeron en un reactor de 2 ml en agitación mecánica. La mezcla resultante se enfrió por debajo de -10°C. Se añadió gota a gota LiHMDS (hexametildisilazida de litio en tetrahidrofurano 1,06 M, 26,9 ml, 1,1 eq., 0,03 mol) durante 10 minutos . La mezcla se agitó a -10°C durante 50 minutos. El compuesto 714A2 (7,1 g, 1 eq., 24,9 mmol) en solución en 90,9 ml de DMF (47 eq., 1,17 mol) se añadió rápidamente gota a gota a la mezcla. La mezcla se dejó en agitación a temperatura ambiente durante la noche, a continuación se hidrolizó con agua (450 ml, reacción

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Para determinar la dosis óptima de α5IA, se llevó a cabo un estudio de respuesta a la dosis en ratones euploides adiestrados en la tarea de emparejamiento demorado con la muestra (DMTP), un paradigma clásico de aprendizaje y memoria utilizado para evaluar los efectos promnesiantes de fármacos, y en particular de agonistas inversos de GABAA α5 [ref. 8, 9, 11].

Se llevaron a cabo experimentos en un laberinto acuático de Morris (LAM). El laberinto era un depósito de 150 cm de diámetro lleno con agua opacificada mantenida a 19°C y equipada con una plataforma de 9 cm de diámetro sumergida 1 cm bajo la superficie del agua. Se utilizaron un total de 27 ratones. Los animales se distribuyeron al azar y equitativamente en 3 grupos (placebo, 1mg/kg de α5IA, 5mg/kg de α5IA). El adiestramiento se llevó a cabo durante 7 días. Se proporcionó a los animales cuatro pruebas por sesión, y la posición de la plataforma oculta se alteró cada día como se describe en la Fig. 5-a, pero permanecía constante en cada sesión. Se inyectó a los ratones placebo o α5IA 30 min antes del comienzo de la prueba de comportamiento. Cada uno de los ratones de la prueba se liberaron en el depósito desde un punto de partida aleatorio, y se les dejó nadar hasta que alcanzaban la plataforma. La duración máxima de la prueba fue de 90 s, tras lo cual los ratones fueron guiados manualmente a la plataforma. Una vez en la plataforma, a los animales se les dio un descanso de 30 s antes de volver a colocarlos en su propia jaula. Al final de un intervalo de 30 s entre las pruebas,los ratones se introdujeron de nuevo en el depósito para la siguiente prueba utilizando una nuevo punto de partida. Este procedimiento se repitió hasta que se habían completado cuatro pruebas. La evaluación de la memoria se determinó comparando a distancia para alcanzar la plataforma en la primer prueba (prueba de obtención) y la distancia media recorrida en pruebas posteriores (pruebas de retención).

Ejemplo 5: Actividad locomotriz

Se evaluó la actividad locomotriz en un total de 33 ratones 30 min. después de las inyecciones i.p. (placebo: 8 ratones euploides y 7 Ts65Dn; α5IA (5 mg/kg): 10 ratones euploides y 8 Ts65Dn; Se midió la locomoción en un área cuadrada (50 cm×50 cm al descubierto; luminosidad: 30 lux) con paredes negras de 30 cm de altura. En resumen, cada animal se colocó en el centro del plano y dejó explorar libremente durante 10 min. La actividad horizontal se controló utilizando el programa informático Any-Maze. Se registró el tiempo transcurrido en la zona periférica de 10 cm de ancho y en la zona central complementaria de 30 cm×30 cm para evaluar la ansiedad.

Ejemplo 6: Pruebas de comportamiento relacionadas con la ansiedad

La modulación de comportamientos por α5IA relacionados con la ansiedad se evaluó con más precisión utilizando el laberinto en cruz elevado, en un total de 42 ratones, 30 min después de las inyecciones i.p. (placebo: 11 ratones euploides y 7 Ts65Dn; α5IA (15 mg/kg): 14 ratones euploides y 10 Ts65Dn; El laberinto se construyó de perspex negro (longitud, 28 cm; anchura, 5 cm; altura desde el suelo, 40 cm; luminosidad total en los brazos abiertos: 70 lx) con dos brazos abiertos opuestos, y dos brazos cerrados equipados con tres paredes de 16 cm de altura. Los ratones se colocaron en la zona central del laberinto y se registró el comportamiento durante un periodo de 5 min utilizando el programa informático Any-Maze que calcula automáticamente el tiempo transcurrido en las diferentes partes del laberinto (p. ej., brazos abiertos y cerrados).

Para explorar la potencial adversidad de las inyecciones prolongadas de α5IA (5 mg/kg), se trató otro grupo de ratones euploides durante dos semanas (5 inyecciones/semana; 5 ratones tratados con α5IA; 5 ratones tratados con placebo). Después del tratamiento repetido, estos ratones se evaluaron en el laberinto en cruz elevado como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 7: Anatomopatología después de tratamiento prolongado con α5IA

ratones tratados durante 2 semanas con α5IA y probados en el laberinto en cruz elevado se trataron más durante otras 3 semanas. El último día de tratamiento, se recogieron muestras de orina 2 horas después de la administración de α5IA o placebo i.p.. La orina se guardó a -20°C antes de su análisis. Al día siguiente, se inyectó i.p. a los ratones una sobredosis de pentobarbital sódico. Los ratones fuertemente anestesiados recibieron un enjuague con PBS mediante una perfusión intracardíaca. Para el examen anatomopatológico, se sacrificaron además 3 ratones euploides adicionales no inyectados. El hígado, el riñón, el cerebro y el bazo se disecaron y se fijaron en una solución de formalina al 10%. Los tejidos se empaparon en parafina a continuación y se cortaron utilizando un microtomo (secciones de 5 µm de espesor) antes de que se procesen para su evaluación histopatológica de rutina (hematina-eosina y ácido peryódico-tinciones de Schiff).

Ejemplo 8: Laberinto acuático de Morris (LAM)

Se evaluó la memoria de referencia espacial utilizando la tarea típica del laberinto acuático de Morris. El laberinto era similar al descrito anteriormente (efectos de respuesta a la dosis de α5IA). La plataforma se sumergió 1 cm por debajo de la superficie del agua en el centro de uno de los cuadrantes del depósito. Durante el adiestramiento espacial alocéntrico la plataforma oculta permaneció en una posición constante de principio a fin de las pruebas con numerosos índices visuales externos disponibles para facilitar la formación de cartografías espaciales cognitivas.

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fijaron en formalina al 10% durante una semana. Tras la crioprotección, se seccionaron los cerebros en un microtomo por congelación (secciones frontales en serie de 40 µm).

Una serie de secciones se procesó para inmunodetección de fos. Las secciones flotantes libres se incubaron con un anticuerpo anti-fos primario (policlonal AB-5, Calbiochem-VWR, Francia; dilución 1:10.000) durante 48 horas a 8°C. Las etapas posteriores fueron 1) incubación con anticuerpo secundario anti-conejo en cabra biotinilado (Sigma, Francia, 1:200), 2) reacción con avidina-biotina-peroxidasa (ABC Vectastain standard kit, Vector Laboratories, Burlingame, EE.UU., 1:400), 3) reacción con diaminobenzidina potenciada con níquel (Ni-DAB) que forma precipitados gris oscuro. El tiempo de incubación en Ni-DAB fue el mismo para todos los ratones.

El análisis por la imagen se llevó a cabo de la manera siguiente: se fotografiaron regiones de interés (RDI) utilizando un microscopio Olympus BX61 (objectivo x10) e inmunotiñendo fos se cuantificó utilizando un programa informático especializado de tratamiento de imagen que calculaba automáticamente la proporción de tejido teñido con fos (p= área teñida/área total), que proporciona una medición estereológica objetiva de la inmunorreactividad a fos. Se analizaron cuatro RDI: corteza del cuerpo calloso posterior, corteza perirrinal, giro dentado y campo CA1 del hipocampo. Se tomaron muestras de cada RDI en varias secciones en serie y los resultados se promediaron a continuación para dar una evaluación cuantitativa fiable de inmunotinción local de fos.

Ejemplo 10: Preparación de membranas y ensayo de fijación

La afinidad de compuestos a subtipos del receptor GABAA puede medirse por competición para [3H]flumazenil (85 Ci/mmol; Roche) fijación a células HEK293 que expresan receptores de rata (transfectados de manera estable) o humanos (transfectados temporalmente) de composición . α1β3γ2, α2β3γ2, α3β3γ2 y α5βγ2.

Los sedimentos celulares se pusieron en suspensión en tampón Krebs-tris (KCl 4,8 mM, CaCl2 1,2 mM, MgCl2 1,2 mM, NaCl 120 mM, Tris 15 mM; pH 7,5; tampón de ensayo de fijación), se homogeneizaron mediante Polytron durante aprox. 20 s en hielo y se centrifugaron durante 60 min a 4°C (50.000 g; Sorvall, rotor: SM24=20.000 rpm). Los sedimentos celulares se volvieron a poner en suspensión en tampón Krebs-tris y se homogeneizaron mediante Polytron durante aprox. 15 s en hielo. Se mide la proteína (método Bradford, Bio-Rad) y se preparan alícuotas de 1 ml y se almacenan a -80°C.

Se llevan a cabo ensayos de fijación de radioligandos en un volumen de 200 µl (placas de 96 pocillos) que contienen 100 µl de membranas celulares, [3H]flumazenil a una concentración de 1 nM para las subunidades α1, α2, α3 y 0,5 nM para las subunidades α5 y el compuesto de ensayo en el intervalo de 10-10-3x10-6 M. La fijación inespecífica puede definirse por diazepam 10-5 M y puede representar por lo general menos del 5% de la fijación total. Los análisis se incuban hasta el equilibrio durante 1 hora a 4°C y se recogen sobre uni-filtros GF/C (Packard) por filtración utilizando un recogedor Packard y lavando con tampón de lavado enfriado con hielo (Tris 50 mM; pH 7,5). Después del secado, la radioactividad retenida en el filtro puede detectarse por recuento de centelleo líquido. Los valores Ki pueden calcularse utilizando Excel-Fit (Microsoft) y son los promedios de dos determinaciones.

Comentarios a la figura 8: Solubilidad y toxicidad renal de α5IA

Los estudios previos determinaron que α5IA se metaboliza exclusivamente en el metabolito hidroximetil-isoxazol M1 principalmente en la orina y en las heces [ref. 25]. M1 es poco soluble en agua y orina a temperatura ambiente, pero su solubilidad aumenta en la orina a 37°C. La dosis promnesiante eficaz de α5IA en ratas en la prueba LAM es de 3 mg/kg (3-5). Esta dosis corresponde al 80% de ocupación del receptor después de 2 h y 60% después de 8 h [ref. 25]. El estudio que publicó poca solubilidad del compuesto M1 se llevó a cabo después de tratar las ratas con una dosis casi 100 veces superior (240 mg/kg) durante 5 semanas [ref. 26]. La inducción de pielitis y papilitis renales relacionadas con la formación de cristales en las ratas tratadas se publicó en este estudio. Sin embargo después del tratamiento prolongado con α5IA a una dosis farmacológica (5 mg/kg), los inventores no observaron ninguna anomalía histológica en diferentes órganos de los ratones tratados ni formación de anormales cristales en la orina (véase la Fig. 8). Además, se llevó a cabo la determinación de la zona de concentración a saturación de M1 en la orina añadiendo M1 sólido (3 mg) en la orina [ref. 25, 26]. Este método no permite sin embargo estudiar la solubilidad de α5IA y de su metabolito M1 en la orina tras la administración periférica (p. ej. absorción oral). Dada la poca solubilidad de M1, la probabilidad de disolución en la orina es despreciable.

Aunque presenta poca solubilidad a muy altas dosis, α5IA parece ser bien tolerado en pacientes jóvenes y ancianos [ref. 25]. Se ha proporcionado anteriormente la información sobre la dosis que podría administrarse en estudios clínicos y sobre la duración del tratamiento con α5IA [ref. 26]. El estudio clínico sobre el síndrome alcohólico llevado a cabo por Nutt et al. [ref. 10] utilizó una sola administración de 4 mg por vía oral.

Para investigaciones clínicas del síndrome de Down que utilizan α5IA, podría ser aplicable el mismo tipo de protocolo. Alternativamente, moléculas recién desarrolladas que presentan características de agonista inverso en los receptores α5-GABAA serían también adecuadas en el contexto de la presente invención, especialmente tan pronto como han demostrado su inocuidad en seres humanos.

Comentarios a las figuras 9 y 10: Espectro de acción de α5IA sobre aprendizaje y memoria en ratones euploides y Ts65Dn.

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La recuperación de insuficiencias de aprendizaje en ratones Ts65Dn por α5IA parecía ser específica. Por lo tanto, los defectos cognitivos α5IA contrarresta cuando no es debido a funciones sensitivas alteradas en la prueba LAM (Fig. 9) o a una motivación disminuida para explorar objetos en la tarea RNO ya que los niveles globales de exploración de objetos eran comparables en los dos genotipos durante la obtención de RNO y las fases de la prueba (ps>0,36). Esto acentúa que α5IA actúa principalmente como un potenciador cognitivo en los ratones tratados. En la versión señalada de la LAM que exige poco conocimiento, los inventores no hallaron ningún efecto de α5IA (Fig. 8; p>0,16), reforzando de este modo la hipótesis de que α5IA se dirige únicamente a funciones cognitivas complejas.

En la prueba LAM, los inventores observaron un fuerte efecto de α5IA sobre el tiempo transcurrido en el anillo más periférico de 10 cm de ancho del depósito. Este comportamiento tigmotáctico irrelevante disminuyó fuertemente después del tratamiento con α5IA (Fig. 10). El efecto fue significativo en ratones Ts65Dn (p<0,001) pero solo no pudo alcanzar significación estadística en ratones euploides (p=0,06), debido probablemente al hecho de que los ratones Ts65Dn presentaban un nivel basal global aumentado de tigmotaxia en comparación con los ratones euploides (p<0,0001). α5IA puede potenciar directamente aptitudes de aprendizaje y por consiguiente disminuyen la utilización de estrategias inadecuadas de resolución de problemas (p. ej., tigmotaxia). Alternativamente, su acción puede basarse en primer lugar en el alivio de comportamientos extraños irrelevantes con un efecto positivo indirecto en eficacias de obtención.

Además sus efectos terapéuticos en ratones Ts65Dn, α5IA también presentó una acción promnesiante en ratones euploides. La eficacia de ratones euploides fue considerablemente potenciada en la prueba RNO tras el tratamiento con α5IA.

Al contrario que la prueba DMTP, la tarea LAM requiere el animal para memorizar gradualmente, a lo largo de las pruebas y días, un lugar objetivo invariante. En este paradigma específico de memoria de referencia espacial, los inventores observaron que α5IA facilitaba claramente la eficacia de ratones Ts65Dn, pero los inventores no observaron un efecto promnesiante significativo de α5IA sobre la eficacia de aprendizaje ratones euploides de de referencia. Esto podría sugerir que las propiedades promnesiantes de α5-IA dependen tanto de la tarea como del genotipo. Sin embargo, esto no está conforme con los datos de otros estudios, que indicaban que la liberación de la inhibición GABAérgica utilizando otro inverso agonista α5 GABAA menos selectivo (L-655,708) o un antagonista GABAA no selectivo (pentilentetrazol) puede facilitar la obtención en la prueba del laberinto acuático de memoria de referencia, incluso en roedores salvajes con conocimiento normal.

Por último, los inventores evaluaron los efectos de α5IA sobre la recuperación de memorias espaciales a largo plazo (24 horas) durante la prueba con sonda de la tarea de navegación. Los resultados de los inventores indican que α5IA no aumentaron significativamente la eficacia de retención en ratones euploides o Ts65Dn, permaneciendo los últimos animales igualmente deficientes después de placebo o tratamiento con fármacos. Los ratones Ts65Dn tratados con α5IA, aunque aumentando gradualmente su aprovechamiento del aprendizaje a través de las sesiones hasta alcanzar la eficacia normal, no demostraron una representación adecuada del lugar objetivo según se evalúa por su poca eficacia de retención durante la prueba con sonda. Los datos de los inventores podrían indicar que α5IA principalmente ejerce su acción noótropa durante la obtención de información pero es menos potente en estimular la recuperación exacta de las memorias previamente formadas. Alternativamente, los agonistas inversos α5 GABAA pudieron, en algunas circunstancias, mejorar tanto la obtención como la recuperación de memorias espaciales. Sin embargo, estas conclusiones se obtuvieron en paradigmas de memoria basados en intervalos breves de retención (15-180 min) que no permitían completamente evaluar los recuerdos a largo plazo (al menos 24 horas) como normalmente se llevó a cabo durante las pruebas con sonda. A partir de los datos de los inventores, puede concluirse que los agonistas inversos α5 GABAA estimulan las eficacias de aprendizaje y pueden incluso aliviar deficiencias de aprendizaje en ratones Ts65Dn, pero esta acción suya en la recuperación de memorias a largo plazo es más disputable y/o podría ser dependiente de la tarea.

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[Ref. 35] Documento US 2006/0084642

[Ref. 36] Documento WO 96/25948

Claims (1)

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