ES2534652T3 - Anticuerpos contra la glicoproteína VI para el receptor de colágeno de plaquetas recombinante - Google Patents

Abstract

Antisuero anti-GPVI policlonal, Fab anti-GPVI obtenible a partir de dicho antisuero anti-GPVI, o F(ab')2 anti-GPVI obtenible a partir de dicho antisuero anti-GPVI, en el que GPVI tiene la secuencia de SEC ID NO:3.

Description

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DESCRIPCIÓN

Anticuerpos contra la glicoproteína VI para el receptor de colágeno de plaquetas recombinante

La invención se refiere a la glicoproteína VI (GPVI), a su aislamiento, purificación, y a métodos para la producción recombinante. Especialmente, la invención se refiere al uso de GPVI, preferiblemente GPVI recombinante, en el

5 tratamiento de trastornos y sucesos patológicos correlacionados directa o indirectamente con trastornos de la coagulación sanguínea, tales como enfermedades trombóticas y cardiovasculares. La proteína recombinante extracelular también se puede usar para establecer ensayos de cribado para encontrar inhibidores potenciales de la GPVI unida a la membrana con el fin de inhibir la interacción de los trombocitos y el colágeno.

La glicoproteína VI es una glicoproteína de la membrana plaquetaria de 62/65 kDa (no reducida/reducida

10 respectivamente), que forma un complejo junto con la subunidad común Fc. La subunidad GPVI contiene el sitio de unión con el colágeno, y la subunidad Fc es responsable de la señalización. El complejo forma uno de los principales receptores de colágeno en la superficie de las plaquetas, crítico para la activación plaquetaria en respuesta al colágeno. La secuencia de reconocimiento en el colágeno consiste en secuencias de (GlyProHyp)n’. Se conocen pacientes de Japón que tienen una deficiencia genética de GPVI. Tienen leves problemas de hemorragia, y

15 sus plaquetas responden sólo débilmente al colágeno, presumiblemente mediante otros receptores. Se ha aprendido mucho acerca de las cascadas de señalización que se originan en la GPVI, las cuales se parecen mucho a las de receptores inmunitarios, incluyendo receptores de linfocitos T, receptores de células B y receptores de células asesinas naturales. Estas cascadas implican la familia src de tirosina cinasas tales como Fyn y Lyn, así como p72SYK y muchas otras tirosina cinasas y fosfatasas, y proteínas adaptadoras tales como LAT. Una diana principal de estas

20 cascadas es la activación de la fosfolipasa Cy2 que desdobla fosfolípidos para dar los segundos mensajeros diacilglicerol e IP3. Se piensa que la GPVI está implicada en la activación de la integrina plaquetaria 2B1, que tiene un papel principal en la adhesión de las plaquetas a la pared de los vasos dañados. Los ratones con la subunidad Fcy “eliminada genéticamente” tienen plaquetas que aún muestran respuestas al colágeno, implicando que el estado de reposo de 2B1 también puede ser regulado por el complejo GPVI/Fcy.

25 La GPVI del receptor de colágeno plaquetario está estrechamente relacionada con los receptores activadores asesinos naturales de la familia p58KAR.

La adhesión y activación de plaquetas en reposo, circulantes, en un sitio de lesión vascular es la primera etapa en un proceso que conduce a la formación de un trombo, que se convierte en un tapón hemostático. El colágeno es uno de los componentes principales de la pared de los vasos, responsable de la activación de las plaquetas. Existen 30 muchos tipos de colágeno, y siete de éstos se encuentran en las capas subendoteliales. Se han identificado en las plaquetas varios receptores diferentes para el colágeno, pero se considera ahora que los principales son la integrina 2B1 y la GPVI no integrina. Aunque la 2B1 está bien caracterizada y ambas subunidades se clonaron y secuenciaron hace varios años, la estructura de la GPVI ha permanecido difícil de averiguar, aunque se han identificado varios rasgos. Se determinó, hace aproximadamente veinte años, que la GPVI es una glicoproteína 35 plaquetaria importante con una masa molecular en el intervalo de 60-65 kDa y un pl ácido. Su papel como receptor de colágeno putativo fue establecido después de la identificación de un paciente en Japón con un trastorno de hemorragia leve cuyas plaquetas mostraban un defecto específico de respuesta al colágeno y carecían de este receptor. Este paciente había desarrollado también autoanticuerpos para el receptor deficiente, y se usaron éstos para caracterizar la molécula adicionalmente. Más recientemente, se estableció que la GPVI está asociada de 40 manera no covalente con la subunidad común Fcy, la cual actúa como la parte señalizadora del complejo. También se demostró que la secuencia de reconocimiento en el colágeno para la GPVI es un triplete Gly-Pro-Hyp repetido dentro de la estructura helicoidal triple del colágeno, y que se podrían usar péptidos sintéticos basados en esta estructura como agonistas específicos dirigidos a la GPVI. Se mostró que el complejo GPVI/Fcy señaliza hacia el interior de las plaquetas mediante un mecanismo similar a un receptor inmunitario, que implica la activación de 45 p72SYK y que conduce mediante una cascada de interacciones cinasa/fosfatasa/proteína adaptadora a la activación de PLCy2 y por tanto a la liberación de gránulos y agregación plaquetaria. Una etapa adicional en la caracterización de esta molécula fue la demostración de que la lectina de tipo C de serpiente, convulxina, de la Serpiente de Cascabel Tropical, Crotalus durissus terrificus, fue capaz de activar plaquetas agrupando GPVI mediante una interacción multimérica. Se mostró que la convulxina se une de manera específica a la GPVI, proporcionando un

50 método para la purificación de este receptor junto con los enfoques establecidos.

Sugiyama et al. (Blood 69 (1987) 1712-1720) describen un nuevo factor agregador de plaquetas. Este factor se ha encontrado en un paciente con trombocitopenia autoinmunitaria. El factor es el IgG del paciente o sus fragmentos Fab o F(ab)2. Los fragmentos F(ab)2 indujeron agregación irreversible en plasma normal rico en plaquetas. Además, los fragmentos Fab inhibieron específicamente la agregación inducida por colágeno y por el IgG del paciente. El

55 componente principal de un inmunoprecipitado obtenido con el IgG del paciente a partir de proteínas de membrana radiomarcadas de extracto plaquetario normal tuvo un peso molecular de 62 kDa.

Sugiyama et al. (International Journal of Hematology 58 (1993) 99-104) examinaron el papel funcional de P62, el antígeno reconocido por el fragmento Fab de IgG aislado del paciente con trombocitopenia autoinmunitaria. Se describe que la plaqueta del paciente mostró adherencia normal a colágeno, y que el fragmento Fab inhibió la

60 adhesión plaquetaria normal a colágeno de una manera dependiente de la dosis.

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Ichinohe et al. (The Journal of Biological Chemistry 270 (1995) 28029-28036) examinaron el papel de la proteína GPVI usando los fragmentos F(ab)2 del IgG del paciente con trombocitopenia autoinmunitaria. El acoplamiento de GPVI se acopla a la activación de c-Src y Syk, insensible a cAMP, acompañado de fosforilación de tirosina de numerosos sustratos, incluyendo fosfolipasa C-2, de una manera similar a la estimulación de colágeno.

5 Gibbins et al. (FEBS Letters 413 (1997) 255-259) describen que GPVI es el receptor de colágeno en plaquetas que acopla la estimulación de plaquetas por colágeno a la fosforilación tirosínica de la cadena  del receptor de Fc. Los autores usan fragmentos F(ab)2 anti-GPVI del IgG del paciente con trombocitopenia autoinmunitaria.

Jandrot-Perrus et al. (The Journal of Biological Chemistry 272 (1997) 27035-27041) describen la adhesión y activación de plaquetas humanas inducidas por convulxina. La adhesión y activación implica GPVI e integrina

10 alfa2beta1. La exocitosis y agregación plaquetarias inducidas por convulxina se inhibieron por los fragmentos Fab del IgG del paciente con trombocitopenia autoinmunitaria.

Ezumi et al. (The Journal of Experimental Medicine 188 (1998) 267-276) investigaron la implicación de la familia de Src en las señales proximales a través del complejo GPVI-FcR usando convulxina y fragmentos F(ab)2 anti-GPVI del IgG del paciente con trombocitopenia autoinmunitaria. Los resultados indicaron que la familia de Src desempeña

15 un papel crítico en la activación plaquetaria vía el complejo del receptor de colágeno GPVI-FcRy.

Heemskerk et al. (Thrombosis and Haemostasis, Schattauer GmbH 81 (1999) 782-792) describen la función de GPVI e integrina alfa2beta1 en la respuesta procoagulante de plaquetas adherentes a colágeno individuales. Los autores usan IgG anti-GPVI y los fragmentos Fab correspondientes del IgG del paciente con trombocitopenia autoinmunitaria.

20 Ishibashi et al. (International Journal of Hematoloy 62 (1995) 107-115) identificaron la molécula 2 de adhesión intercelular (ICAM-2) usando el anticuerpo del paciente con trombocitopenia autoinmunitaria en una técnica de inmunoprecipitación mejorada. La molécula ICAM-2 tiene un peso molecular de alrededor de 62 kDa.

El documento EP 0.896.002 se refiere a proteínas quiméricas que consisten en una integrina y una inmunoglobulina, a sus complejos heterodímeros, a un procedimiento de producción de las mismas y a sus aplicaciones como 25 fármacos y reactivos. Además, el documento EP 0.896.002 se refiere a la aplicación médica de la proteína quimérica integrina-inmunoglobulina como sustituto de las plaquetas. Las integrinas son moléculas que pertenecen a la superfamilia de integrinas. Las cadenas alfa incluyen 15 cadenas alfa, entre otras, alfa1. Las cadenas beta incluyen ocho cadenas beta, entre otras, beta1. Se encontró que un complejo heterodímero de proteína quimérica integrina alfa2beta1-inmunoglobulina tiene capacidad de unión a la matriz extracelular. Por lo tanto, se puede usar como

30 agente terapéutico o preventivo frente a la tendencia hemorrágica congénita y adquirida debido a anormalidad plaquetaria, y también ampliamente como sustituto de transfusión de plaquetas. Además, el complejo heterodímero de proteína quimérica integrina alfa2beta1-inmunoglobulina puede ser un agente terapéutico o preventivo para condiciones de enfermedades en las que el trastorno de células endoteliales vasculares es un problema.

Por tanto, está claro a partir de la técnica anterior que la GPVI parece ser un compuesto muy interesante en muchos 35 campos terapéuticos, sobre todo concernientes a aplicaciones que están relacionadas, hablando en general, directa

o indirectamente, con sucesos de coagulación sanguínea que dependen de la interacción colágeno -plaqueta. Fue, por tanto, una meta de la presente invención proporcionar GPVI en una forma recombinante y mostrar su eficacia como diana terapéutica directa o como herramienta para el cribado de compuestos cortos, especialmente compuestos sintetizados o sintetizables químicamente que tienen la capacidad de inhibir o bloquear la interacción

40 natural plaqueta-colágeno.

Fue otra meta de la presente invención proporcionar anticuerpos anti-GPVI.

En vista de esto, la presente invención se refiere a un antisuero anti-GPVI policlonal, a un Fab anti-GPVI obtenible a partir de dicho antisuero anti-GPVI, o a un F(ab’)2 anti-GPVI obtenible a partir de dicho antisuero anti-GPVI, en el que GPVI tiene la secuencia de SEC ID NO:3.

45 La presente invención también se refiere a un antisuero anti-GPVI policlonal, a un Fab anti-GPVI obtenible a partir de dicho antisuero anti-GPVI, o a un F(ab’)2 anti-GPVI obtenible a partir de dicho antisuero anti-GPVI como se describe anteriormente, en el que GPVI se puede obtener a partir de plaquetas usando aglutinina de germen de trigo y convulxina y aplicando electroforesis en gel sobre poliacrilamida de alrededor de 8,5%.

La presente invención se refiere además a un antisuero anti-GPVI policlonal, a un Fab anti-GPVI obtenible a partir

50 de dicho antisuero anti-GPVI, o a un F(ab’)2 anti-GPVI obtenible a partir de dicho antisuero anti-GPVI como se describe anteriormente, en el que el antisuero anti-GPVI policlonal se genera en conejos.

Además, la presente invención se refiere a un fragmento Fab anti-GPVI de anticuerpos monoclonales de ratón humanizados frente a GPVI, en el que GPVI tiene la secuencia de SEC ID NO: 3.

La presente invención también se refiere a anticuerpos monoclonales o policlonales que reconocen la región N55 terminal de GPVI, en el que GPVI tiene la secuencia de SEC ID NO: 3.

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La invención describe porciones o fragmentos de la proteína GPVI que han mantenido su actividad biológica, la cual es la unión al colágeno.

La invención tuvo éxito en la purificación de cantidades adecuadas de GPVI para su caracterización preliminar y para la secuenciación peptídica. Las secuencias se usaron para diseñar cebadores para PCR para identificar una

5 secuencia positiva en una librería de ADN. Esta secuencia de ADN se usó después como sonda para aislar una secuencia de ADNc casi completa de la librería y se obtuvo la secuencia 5’ faltante usando un método RACE a partir de una librería de ADNc de plaquetas.

La invención también tuvo éxito en mostrar el uso de GPVI recombinante como compuesto terapéuticamente aplicable que es capaz, cuando se administra a un paciente con, por ejemplo, vasos sanguíneos dañados, de unirse 10 al colágeno, impidiendo así que los trombocitos que llevan GPVI unida a la membrana se unan a dicho colágeno. El dominio extracelular soluble recombinante de la GPVI contiene el sitio de unión con el colágeno y puede impedir la activación de las plaquetas por el colágeno. Podría, por lo tanto, ser aplicable al tratamiento de estados de enfermedad que impliquen una activación incrementada de las plaquetas con el colágeno, tal como la rotura de la placa aterosclerótica, en enfermedades tales como angina inestable o durante tratamiento quirúrgico, tal como la 15 Angioplastia Coronaria Transluminal Percutánea (PTCA), en la que las arterias son reabiertas por el inflado de un catéter de globo causando un daño considerable a la pared vascular y mucha activación plaquetaria, y dando como resultado a menudo el cierre nuevamente del vaso posteriormente. La ventaja de los fragmentos de GPVI recombinante en comparación con los métodos de tratamiento actuales es que actúan en una etapa más temprana impidiendo o reduciendo la activación plaquetaria en vez de suprimir los sucesos después de la activación 20 plaquetaria, tales como la agregación mediante antagonistas de GPIIb-IIIa. Así, se liberan cantidades más pequeñas de los contenidos de los gránulos plaquetarios, incluyendo factores de crecimiento y quimiocinas, que están implicados no sólo en la reparación de heridas sino en la remodelación de la pared vascular por migración del músculo liso y en la atracción de células fagocíticas tales como monocitos, que se sabe que contribuyen a la aterosclerosis. Se podría usar el fragmento Fab de anticuerpos monoclonales de ratón humanizados contra la GPVI

25 con un efecto similar para bloquear la GPVI en la superficie de las plaquetas con similares aplicaciones que las anteriores.

La GPVI recombinante como se describe aquí también se puede usar en un ensayo de unión al colágeno para cribar moléculas pequeñas (en librerías combinatorias por ejemplo) capaces de inhibir esta interacción y que se pueden usar para desarrollar compuestos terapéuticos que son inhibidores de la interacción colágeno-plaqueta. Mediante 30 una derivatización adecuada, estos compuestos se hacen disponibles por vía oral. De nuevo, el principal objetivo es preparar compuestos que reduzcan las interacciones GPVI-colágeno y por tanto la activación de las plaquetas en situaciones donde las plaquetas entran en contacto con el colágeno. La tecnología de cribado como tal usada en esta invención está bien establecida en la técnica anterior. Mediante tales ensayos de cribado, la invención permite encontrar y desarrollar nuevas dianas que pueden inhibir la GPVI natural unida a la membrana en la superficie de los

35 trombocitos como antagonista del colágeno. Tales dianas, las cuales pueden ser moléculas químicas cortas, pueden ser entonces la base para invenciones posteriores.

Otra aplicación principal de la GPVI y reactivos que reconocen dominios específicos de la GPVI es como marcadores de la edad y funcionalidad de las plaquetas. Se piensa generalmente que las plaquetas jóvenes son más activas y funcionales que las más viejas. Las plaquetas jóvenes se unen a y son activadas por la lectina de tipo 40 C de veneno de serpiente convulxina, que es específica para la GPVI, y según envejecen disminuyen tanto la unión como el grado de activación. Esto puede ser debido a cambios bien proteolíticos o bien conformacionales en la GPVI

o su asociación con Fcy debido a la activación de las plaquetas o un daño en la circulación. Este puede ser un parámetro útil para medir el perfil de edad y función de las plaquetas en pacientes, así como en personas normales, durante controles médicos. El perfil de edad de las plaquetas cambia en muchas enfermedades que afectan a la 45 médula ósea o al sistema inmunitario, y podría ser un criterio de diagnóstico importante si estuvieran disponibles métodos mejores para su determinación. Por ejemplo, los pacientes con enfermedades que implican un recambio de plaquetas incrementado mostrarán más plaquetas jóvenes, mientras que los pacientes en tratamiento de quimioterapia o radiación mostrarán una población que envejece continuamente. De este modo, se puede usar tal perfil de edad para una monitorización precisa del tratamiento. En una población sana normal se sabe muy poco 50 acerca de la distribución del perfil de edad y su papel como pronosticador de cambios en la salud. En la actualidad se usa el naranja de tiazol para detectar plaquetas reticuladas jóvenes que contienen ARNm. Este ARNm se descompone pronto, restringiendo el método solamente a las plaquetas más jóvenes. Los reactivos que se podrían usar en tal ensayo incluirían proteínas de veneno de serpiente específicas para la GPVI, tales como convulxina, o anticuerpos monoclonales o policlonales que reconozcen la región N-terminal de la GPVI, o anticuerpos 55 monoclonales que reconozcen nuevos sitios o conformaciones expuestas por proteolisis del dominio N-terminal o conformaciones específicas presentes bien en la molécula intacta y no en la envejecida o bien viceversa. Estos reactivos serían marcados con un marcador fluorescente, o junto con un segundo anticuerpo o reactivo de afinidad marcado fluorescente, y se usarían en citometría de flujo para medir el perfil de unión de las plaquetas. En una fase más tardía alternativa, se podrían adoptar técnicas de medición menos laboriosas basadas en una medición

60 automatizada de perfiles plaquetarios. Usar métodos de clasificación celular con citometría de flujo o perlas magnéticas, debe ser posible aislar plaquetas jóvenes y viejas para examinar los factores implicados en la eliminación de las plaquetas viejas de la circulación.

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La presente invención describe un ADN que codifica la Glicoproteína VI o ss fragmentos biológicamente activos, especialmente la secuencia de la Fig. 2.

La presente invención describe además un ADN que codifica la Glicoproteína VI que comprende la secuencia de aminoácidos de la Fig. 1.

5 La presente invención describe una composición farmacéutica que comprende GPVI recombinante junto con un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable para ella, y su uso para la fabricación de un medicamento en el campo terapéutico de sucesos y trastornos trombóticos y cardiovasculares relacionados con interacciones plaqueta-colágeno.

La presente invención describe el uso de GPVI recombinante en una herramienta de cribado para detectar

10 inhibidores específicos de las interacciones plaqueta-colágeno. Las posibles indicaciones y aplicaciones médicas, respectivamente, son, por ejemplo, la angina de pecho inestable, la PTCA, el uso de endoprótesis vasculares en este campo, las operaciones en vasos coronarios, las operaciones generales en vasos sanguíneos, las operaciones que pueden dañar vasos sanguíneos más grandes, tales como operaciones de la articulación de la cadera. Además, están incluidas todas las indicaciones que se refieran a sucesos tromboembólicos causados por trastornos de la

15 interacción entre la pared del vaso y el sistema de coagulación con un alto riesgo de formación de trombos y bloqueo de vasos.

Como se indicó anteriormente, la proteína GPVI y los fragmentos de la misma son adecuados como compuestos farmacéuticamente eficaces en composiciones y combinaciones farmacéuticas.

Las formulaciones farmacéuticas pueden comprender opcionalmente ingredientes activos adicionales, como

20 anticoagulantes tales como hirudina o heparina, o agentes trombolíticos tales como activador del plasminógeno o hementina.

La nueva proteína, y sus fragmentos activos biológicos, respectivamente, pueden formar sales farmacéuticamente aceptables con cualquier ácido orgánico o inorgánico no tóxico. Los ácidos inorgánicos son, por ejemplo, el ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico o fosfórico y sales ácidas de metales, tales como monohidrogenoortofosfato de 25 sodio e hidrogenosulfato de potasio. Los ejemplos para ácidos orgánicos son los ácidos mono-, di-y tricarboxílicos tales como acético, glicólico, láctico, pirúvico, malónico, succínico, glutárico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, maleico, hidroximaleico, benzoico, hidroxibenzoico, fenilacético, cinámico, salicílico, y ácidos sulfónicos tales como el ácido metanosulfónico. Las sales del resto de aminoácido carboxiterminal incluyen las sales no tóxicas de ácidos carboxílicos formadas con cualesquiera bases inorgánicas u orgánicas adecuadas. Estas sales incluyen, 30 por ejemplo, metales alcalinos tales como sodio y potasio, metales alcalino-térreos tales como calcio y magnesio, metales ligeros del Grupo IIIA, incluyendo aluminio, y aminas orgánicas primarias, secundarias y terciarias tales como trialquilaminas, incluyendo trietilamina, procaína, dibencilamina, 1-etenamina, N,N’-dibenciletilendiamina, dihidroabietilamina y N-alquilpiperidina. Como se usa aquí, la expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable” significa un material de carga, diluyente o material encapsulante sólido o líquido, no tóxico, inerte, que no reacciona

35 de manera adversa con el compuesto activo o con el paciente. Se conocen bien en la técnica vehículos adecuados, preferiblemente líquidos, tales como agua estéril, disolución salina, dextrosa acuosa, disoluciones de azúcar, etanol, glicoles y aceites, incluyendo los de origen del petróleo, animal, vegetal o sintético, por ejemplo aceite de cacahuete, aceite de soja y aceite mineral.

Las formulaciones se pueden administrar como dosis unitarias que contienen los excipientes, diluyentes, adyuvantes

40 y vehículos farmacéuticamente aceptables, no tóxicos, convencionales, que son típicos para la administración parenteral.

El término “parenteral” incluye en la presente memoria técnicas de inyección e infusión subcutánea, intravenosa, intraarticular y intratraqueal. También son adecuadas otras administraciones, tales como administración oral y aplicación tópica. Las composiciones y combinaciones parenterales se administran de manera más preferible por vía

45 intravenosa, bien en una forma de bolo o bien como una fusión constante, según procedimientos conocidos. Los comprimidos y cápsulas para la administración oral contienen excipientes convencionales tales como agentes aglutinantes, cargas, diluyentes, agentes formadores de comprimidos, lubricantes, disgregrantes, y agentes humectantes. Los comprimidos se pueden revestir según métodos bien conocidos en la técnica.

Las preparaciones líquidas orales pueden estar en forma de suspensiones acuosas u oleosas, disoluciones,

50 emulsiones, jarabes o elixires, o se pueden presentar como un producto seco para su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes del uso. Tales preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales, como agentes suspensores, agentes emulsionantes, vehículos no acuosos y conservantes.

Las aplicaciones tópicas pueden estar en la forma de suspensiones acuosas u oleosas, disoluciones, emulsiones, jaleas o preferiblemente pomadas en emulsión.

55 Las dosis unitarias pueden contener las cantidades requeridas diariamente de la proteína según la invención, o submúltiplos de las mismas para componer la dosis deseada. La dosis óptima terapéuticamente aceptable y la frecuencia de la dosis para un paciente dado (mamíferos, incluyendo seres humanos) dependen de una variedad de factores, tales como la actividad del material activo específico empleado, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo y vía de administración, velocidad de aclaramiento, el objeto del tratamiento, es decir, terapia o profilaxis, y la naturaleza de la enfermedad trombótica a tratar, la actividad antiplaquetaria o anticoagulante.

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Por lo tanto, en composiciones y combinaciones útiles como anticoagulantes en un paciente tratado (in vivo), una

5 dosis diaria farmacéuticamente eficaz de los péptidos de esta invención está entre alrededor de 0,01 y 100 mg/kg de peso corporal, preferiblemente entre 0,1 y 10 mg/kg de peso corporal. Según la forma de aplicación, una dosis única puede contener entre 0,5 y 10 mg del inhibidor de trombina. Para conseguir un efecto anticoagulante en sangre extracorpórea, una cantidad farmacéuticamente eficaz de los péptidos inventivos está entre 0,2 y 150 mg/l, preferiblemente entre 1 mg y 20 mg/l de sangre extracorpórea.

10 Descripción detallada de la invención

Se eligieron dos secuencias de 7 aminoácidos que mostraban la degeneración mínima en el código genético para la síntesis de cebadores de ADN, con el fin de amplificar parte del ADNc de la GPVI por PCR. Como la ubicación de ambos péptidos en la proteína era totalmente desconocida, para cada uno de ellos, se prepararon dos cebadores degenerados, uno sentido y uno antisentido. Estos cebadores se usaron para amplificar una librería de médula ósea

15 humana. La combinación del cebador 5’TYA THC CNG CNA TGA ARMG 3’ sentido que codifica la secuencia PAMKRSL con el antisentido 5’TTR TAN ARN GCR AAY TGR TC 3’ que corresponde a DQFALYK amplificó un fragmento de ADN de 221 pb. Además de los péptidos seleccionados, el ADN amplificado codificó el péptido LysC/AspN DQLELVATGVFAKPSLSAQPGPAVSS, que enlaza claramente la secuencia al ADNc para la GPVI.

El cribado de 600.000 pfu de una librería de médula ósea con este fragmento de ADN de 221 pb produjo 4 pfu

20 positivas. Tres tenían insertos de 1350 pb ya fueran cortados por la enzima de restricción Sal I o por EcoR I y pertenecían a la superfamilia de IgG. El cuarto tenía un inserto de 4,6 kb por digestión con Sal I y dio dos fragmentos de 2300 pb y 1300 pb respectivamente cuando se trataron por EcoR I. Su ADN contuvo la secuencia para los 10 péptidos derivados de la secuenciación de aminoácidos de la GPVI pero se detuvo cerca del terminal amino. No se pudo encontrar metionina de partida o secuencia líder, pero estaban presentes más de 2000 pb de ADN no del

25 marco de lectura secuenciado previamente que terminaba en una secuencia Alu. El experimento RACE del extremo 5’ se completó en ARN poli A de plaqueta con cebadores ubicados en una parte de la secuencia de la GPVI que había sido corroborada por la de los péptidos. Un fragmento de 318 pb que incluye 70 bp nuevos y x pb en la secuencia de la cuarta pfu en pb 1987 correspondientes a 14 aminoácidos que incluyen la primera metionina se encontró antes de caer en la secuencia de GPVI establecida. De este modo, se pudo secuenciar un ADNC que

30 contenía un total de 1249 pb y que codifica una proteína con un marco de lectura abierto que incluye la secuencia líder con 339 aminoácidos.

Un ADNc que codifica GPVI de plaquetas se clonó y secuenció a partir de una librería de ADNc de médula ósea humana usando RACE con ARNm de plaquetas para suministrar la secuencia 5’ faltante. El marco de lectura abierto de 1017 pb codifica 339 aminoácidos y una región 3’ no traducida. El análisis de hidrofobicidad de la secuencia de 35 aminoácidos reveló la presencia de dos dominios transmembrana putativos, una secuencia señal de 23 aminoácidos putativa, y un dominio de 19 aminoácidos entre los restos 247 y 265 de la proteína madura. La secuencia y su traducción de aminoácidos se muestran en la Fig. 2 y la Fig. 1. Una comparación con la secuencia de aminoácidos de las moléculas más similares encontradas en una búsqueda de GenBank revela claramente que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas, y el dominio extracelular contiene dos bucles de dominio C2 de Ig formados 40 por dos puentes de disulfuro. Es una molécula proteica que cruza la membrana de clase uno, con el término N en el exterior y atraviesa la membrana una vez. Las moléculas más estrechamente relacionadas pertenecen a la clase de los receptores asesinos naturales, que contiene tanto tipos inhibidores como activadores. La GPVI pertenece claramente a la subclase activadora, no sólo a través de su función sino también porque, a diferencia de la clase inhibidora, no contiene secuencias ITIM en su dominio citoplásmico. Tampoco contiene ningún resto de tirosina que 45 pudiera estar implicado en la fosforilación. Hay algunos restos de treonina y serina en este dominio, pero no concuerdan con ningún criterio para secuencias de consenso de cinasas. Al igual que la clase activadora de receptores NK, la GPVI contiene un resto de arginina como tercer aminoácido del dominio que cruza la membrana, que está implicado en la formación del complejo con la subunidad Fcy. El dominio citoplásmico contiene 51 aminoácidos, mostrando solamente una pequeña similitud (en la región justo por debajo de la membrana) a los 50 dominios citoplásmicos de otros miembros de esta familia. Esto sugiere que este dominio en la GPVI puede asociarse con diferentes tipos de molécula citoplásmica que los otros miembros de la familia. La GPVI contiene solamente un único sitio de N-glicosilación putativo en Asn69. El dominio justo por encima de la membrana antes de que comiencen las láminas beta del dominio Ig, sin embargo, es rico en restos de treonina y serina, los cuales podrían proporcionar sitios de O-glicosilación tales como los que se encuentran en la GPIb y GPV. La función

55 principal de esta O-glicosilación parece ser presentar las estructuras del receptor bien extendidas desde la superficie de las plaquetas para facilitar las interacciones con sus ligandos voluminosos. Dado que GPVI fue establecida anteriormente como una sialoglicoproteína, la diferencia en masa molecular entre la masa de aminoácidos teórica (37 kDa) y la masa determinada por electroforesis en gel (65 kDa reducida) debe ser debida a esta glicosilación.

La estructura de los receptores asesinos naturales de los dos tipos de dominio ha sido establecida por estudios

60 cristalográficos de rayos X, y se mostró que los dos dominios de Ig forman un ángulo agudo, encontrándose el sitio del receptor para los antígenos HLA que llevan péptidos en el exterior del codo. Una comparación directa de la

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estructura del sitio de unión a los péptidos HLA con la del colágeno sugiere inmediatamente que estos receptores tienen un origen común, debido a que las estructuras alfa-helicoidales múltiples del sitio de unión a HLA y el péptido que contiene se asemejan mucho a la estructura de triple hélice del colágeno. Además, GPVI contiene múltiples secuencias de PGX, que podrían imitar una hebra de colágeno adicional en la interacción con una fibra de colágeno. 5 Se ha postulado que los receptores asesinos naturales funcionan por un mecanismo de dimerización con dos receptores que reconocen dos sitios de HLA independientes en la célula que está investigando la célula asesina natural. Posiblemente, esta dimerización es parte del mecanismo de activación o desactivación, dependiendo de la clase de receptor. En el caso de GPVI, puede haber también la posibilidad de que dos moléculas de GPVI se asocien con un Fcy, dado que cada monómero del dímero Fcy tiene una secuencia de reconocimiento. Sin embargo,

10 la estequiometría no es aún conocida, y en base a la estructura de colágenos, péptidos similares al colágeno que actúan mediante GPVI y convulxina, parece probable que la fuerza de la señal esté relacionada con el número de complejos GPVI/Fcy que están agrupados entre sí. Otros receptores plaquetarios que pertenecen a esa familia de Ig incluyen ICAM-2 (CD) y PECAM (CD31).

Todos los microorganismos, líneas celulares, sistemas de expresión, huéspedes de expresión, plásmidos,

15 promotores, marcadores de resistencia, orígenes de replicación, sitios de restricción u otros fragmentos o partes de vectores que se mencionan en la descripción no directamente relacionados con la invención reivindicada están generalmente disponibles comercialmente o de otro modo. A no ser que se den otras alusiones, se usan solamente como ejemplos y no son esenciales con respecto a la invención, y pueden ser sustituidos por otras herramientas adecuadas y materiales biológicos, respectivamente.

20 Las técnicas que son esenciales de acuerdo con la invención se describen en detalle a continuación y anteriormente. Otras técnicas que no se describen en detalle corresponden a métodos estándar conocidos que son bien conocidos por un experto en la técnica, o se describen con más detalle en las referencias y solicitudes de patente citadas y en la bibliografía estándar (por ejemplo Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor; Harlow, Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor).

25 EJEMPLOS

Ejemplo 1: Materiales – La Proteína A-Sepharose, los anticuerpos de cabra antirratón y anticonejo conjugados con peroxidasa, la albúmina de suero bovino, el veneno de Crotalus durissus terrificus, la aglutinina de germen de trigo (WGA), la agarosa en perlas al 4% reticulada activada con cloroformiato de N-hidroxilsuccinamidilo, y Triton X-114 fueron de Sigma Chemical Co. (St Louis, MO), octanoil-N-metil-glucamida (ONMG) y nonanoil-N-metil-glucamida

30 (NNMG) fueron de Oxyl Chemie (Bobingen, Alemania).

Ejemplo 2: Aislamiento de GPVI de las plaquetas -Las glicoproteínas de la membrana se aislaron de las plaquetas como se describe anteriormente. Brevemente, se lavaron plaquetas (de 40 capas leucoplaquetarias) y se lisaron en Triton X-114 al 2% en presencia de inhibidores de proteasa. El Triton X-114 y las fases acuosas se separaron, y la fase detergente se cargó en una columna de aglutinina de germen de trigo acoplada a Sepharose 4B. Las 35 glicoproteínas plaquetarias se eluyeron con Tris HCl 10 mM, pH 7,4, NaCl 30 mM, octanoil-N-metilglucamida al 0,2% (ONMG) y N-acetilglucosamina al 2%. Después de diálisis y concentración, la disolución de glicoproteínas se cargó en una columna de convulxina unida a agarosa en perlas al 4% reticulada activada con cloroformiato de Nhidroxilsuccinamidil-p-nitrofenilo (1 mg/ml). La columna se lavó con 4 volúmenes de Tris HCl 10 mM, pH 7,4, NaCl 30 mM, nonanoil-N-metilglucamida (NNMG) al 0,2%, y después con 4 volúmenes de Tris HCl 10 mM, pH 7,4, NaCl 30

40 mM y NNMG al 2%. La GPVI se eluyó con SDS al 0,08% en Tris/HCl 10 mM, pH 7,4. Se concentró la disolución y se cargó en un gel preparativo de 8,5% de poliacrilamida usando el Model 491 Prep Cell (BioRad, CA). La electroforesis preparativa se realizó en condiciones no reducidas siguiendo las instrucciones del fabricante. La GPVI eluyó como una única banda a 65 kDa. Se reunieron las fracciones, se concentraron en Centricon-30 (Amicon, Beverly, MA) y se resuspendieron en Tris/HCl 10 mM, pH 7,4 y ONMG al 0,1%.

45 Ejemplo 3: Análisis de aminoácidos de GPVI -Se digirió GPVI con las endoproteinasas LysC y AspN (Boehringer Mannheim, Alemania). Los 10 péptidos generados se separaron por HPLC de fase inversa y se secuenciaron en un secuenciador de proteínas de fase líquida pulsada Applied Biosystem modelo 477A con un analizador de aminoácidos de feniltiohidantoína en línea modelo 120A.

Ejemplo 4: Amplificación de un fragmento de 221 pb que codifica parte de GPVI a partir de una librería de ADNc gt 50 77-

Se amplificó una muestra (1010 pfu) (unidades formadoras de placa) a partir de una librería de médula ósea humana (Clonetech, Palo Alto, CA) usando 2 combinaciones de 4 cebadores degenerados. Las concentraciones finales de cebador fueron 2 M, la concentración de dNTP fue 200 M, y se usaron 2 U/100 l de AmpliTaq Gold (Perkin Elmer, Rotkreuz, Suiza) de reacción. Las condiciones de la PCR fueron 5 ciclos a 37ºC seguido de 30 ciclos a 44ºC.

55 El 19mer sentido 5’ TYATHCCNGCNATGAARMG 3’ y el 20mer antisentido 5’ TTRTANARNGCRAAYTGRTC 3’ amplificaron un fragmento de 221 pb que se subclonó en Bluescript KS+ (Stratagene, La Jolla, CA) y se secuenció usando el kit T7 Sequenase (Amersham, Suiza).

Claims (5)

1. imagen1

   REIVINDICACIONES

   1.

   Antisuero anti-GPVI policlonal, Fab anti-GPVI obtenible a partir de dicho antisuero anti-GPVI, o F(ab’)2 anti-GPVI obtenible a partir de dicho antisuero anti-GPVI, en el que GPVI tiene la secuencia de SEC ID NO:3.

2. 2.

   Antisuero anti-GPVI policlonal, Fab anti-GPVI obtenible a partir de dicho antisuero anti-GPVI, o F(ab’)2 anti-GPVI

   5 obtenible a partir de dicho antisuero anti-GPVI según la reivindicación 1, en el que GPVI se puede obtener a partir de plaquetas usando aglutinina de germen de trigo y convulxina y aplicando electroforesis en gel sobre poliacrilamida de alrededor de 8,5%.
3. 3. Antisuero anti-GPVI policlonal, Fab anti-GPVI obtenible a partir de dicho antisuero anti-GPVI, o F(ab’)2 obtenible a

   partir de dicho antisuero anti-GPVI según la reivindicación 1 ó 2, en el que el antisuero anti-GPVI policlonal se 10 genera en conejos.

4. 4.

   Fragmento Fab anti-GPVI de anticuerpos monoclonales de ratón humanizados frente a GPVI, en el que GPVI tiene la secuencia de SEC ID NO: 3.

5. 5.

   Anticuerpos monoclonales o policlonales que reconocen la región N-terminal de GPVI, en el que GPVI tiene la secuencia de SEC ID NO: 3.

   15

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