PL204449B1 - DNA kodujący glikoproteinę VI - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest DNA kodujący glikoproteinę VI (GPVI). Niniejszym opisano również sposób izolowania, oczyszczania oraz metody rekombinacyjnego otrzymywania GPVI. GPVI jest użyteczna w leczeniu zaburzeń oraz stanów patologicznych bezpośrednio i pośrednio związanych z zaburzeniami krzepnięcia krwi, takimi jak choroby zakrzepowe oraz sercowo-naczyniowe. Pozakomórkowe rekombinowane białko może być także stosowane do prowadzania testów przesiewowych, w celu wyodrębnienia potencjalnych inhibitorów GPIV związanych z błoną do hamowania oddziaływań między płytkami krwi a kolagenem. GPVI na powierzchni płytek krwi ulega zmianom w trakcie trwania życia płytki in vivo, dzięki czemu może być ona stosowana jako marker profilu wiekowego płytek krwi.

Glikoproteina VI jest glikoproteiną błonową płytek krwi o masie 62/65 kDa (odpowiednio niezredukowana/zredukowana), która tworzy kompleks z typową podjednostką Fcy. Podjednostka GPVI zawiera miejsce wiążące kolagen, a podjednostka Fcy odpowiedzialna jest za sygnalizację. Kompleks ten tworzy jeden z głównych receptorów kolagenu na powierzchni płytek krwi, który ma podstawowe znaczenie dla aktywacji płytek krwi w odpowiedzi na kolagen. Sekwencja rozpoznająca na kolagenie obejmuje sekwencje (GlyProHyp)n. W Japonii opisano przypadki pacjentów, u których stwierdzono genetyczny niedobór GPVI. Występują u nich drobne problemy z krwawieniem, a ich płytki jedynie w niewielkim stopniu wykazują odpowiedź na kolagen, prawdopodobnie poprzez inne receptory. Wiele już wiadomo o kaskadzie sygnalizacyjnej, która rozpoczyna się na GPVI. Przypomina ona kaskadę powstającą w receptorach immunologicznych, w tym receptorach komórek T, receptorach komórek B oraz receptorach komórek naturalnych zabójców (NK) (ang. natural killer cell). Kaskady te obejmują kinazy tyrozynowe z rodziny src, takie jak Fyn, Lyn oraz p72^SYK, oraz wiele innych kinaz tyrozynowych, fosfataz i białek adaptorowych, takich jak LAT. Głównym celem tych kaskad jest aktywacja fosfolipazy Cy2, która rozszczepia fosfolipidy, z wytworzeniem wtórnych przekaźników: diacyloglicerolu i IP3. Uważa się, że GPVI jest zaangażowana w aktywację integryny płytek krwi α2β1, która odgrywa główną rolę w procesach adhezji płytek krwi do uszkodzonych ścian naczyniowych. Myszy ze znokautowaną podjednostką Fcy mają płytki krwi, które w dalszym ciągu wykazują odpowiedź na kolagen, co sugeruje, że w stanie niepobudzonym α2β1 może także podlegać regulacji przez kompleks GPVI/Fcy. Receptor kolagenu płytek krwi GPVI jest blisko spokrewniony z aktywującymi receptorami komórek naturalnych zabójców z rodziny p58KAR oraz z FcaR.

Adhezja oraz aktywacja niepobudzonych płytek krwi w układzie krążenia w miejscu uszkodzenia naczynia krwionośnego jest pierwszym etapem w procesie, który prowadzi do tworzenia skrzepu, ulegającego transformacji do czopu hemostatycznego. Kolagen jest jednym z głównych składników ścian naczyniowych, odpowiedzialnych za aktywację płytek krwi. Znanych jest wiele typów kolagenu. Siedem z nich występuje w warstwach podśródbłonkowych. Na płytkach krwi zidentyfikowano kilka różnych typów receptorów kolagenu. Jednak obecnie uważa się, że podstawowymi są integrynowe α2β1 oraz nieintegrynowa GPVI. Receptor α2β1 jest dobrze opisany, a obie jego podjednostki zostały kilka lat temu sklonowane i zsekwencjonowane. Chociaż opisano niektóre cechy GPVI, jej struktura pozostaje wciąż niedookreślona. Około dwadzieścia lat temu ustalono, że GPVI jest główną glikoproteiną płytek krwi o masie cząsteczkowej w zakresie 60 - 65 kDa oraz kwaśnym pI. Jej funkcja jako przypuszczalnego receptora kolagenowego została ustalona po opisaniu w Japonii przypadku pacjenta z drobnymi zaburzeniami krwawienia, u którego płytki wykazywały specyficzny defekt odpowiedzi na kolagen oraz były pozbawione tego receptora. U pacjenta tego rozwinęło się auto-przeciwciało wobec brakującego receptora, które wykorzystano do identyfikacji tej cząsteczki. Ostatnio ustalono, że GPVI związana jest niekowalencyjnie z typową podjednostką Fcy, która funkcjonuje jako część sygnalizacyjna kompleksu. Wykazano także, że sekwencję rozpoznającą GPVI na kolagenie stanowi powtarzający się triplet Gly-Pro-Hyp w potrójnej helikalnej strukturze kolagenu oraz, że syntetyczne peptydy pochodne względem takiej struktury mogą być stosowane jako agoniści swoiście skierowani wobec GPVI. Wykazano, że kompleks GPVI/Fcy sygnalizuje do wewnątrz płytki krwi poprzez mechanizm podobny do mechanizmu receptora immunologicznego, który obejmuje aktywację p72^SYK i prowadzi do aktywacji PLCy2 przez kaskadę oddziaływań kinaza/fosfataza/białko adaptorowe, a zatem do uwolnienia ziarnistości oraz agregacji płytek krwi. Następnym krokiem do scharakteryzowania tej cząsteczki było wykazanie, że lektyna węża typu C, konwulksyna, z tropikalnego grzechotnika Crotalus durissus terrificus wykazuje zdolność aktywacji płytek poprzez grupowanie GPVI na skutek oddziaływań multimerowych. Wykazano, że konwulksyna specyficznie wiąże się z GPVI dostarczając metody oczyszczania tego receptora w połączeniu z ustalonymi technikami. Zatem ze znanego stanu techniki jasno wynika, że GPVI jest bardzo intePL 204 449 B1 resującym związkiem możliwym do zastosowania w wielu dziedzinach terapeutycznych, ale przede wszystkim w tych, które są bezpośrednio lub pośrednio związane z procesami krzepnięcia krwi zależnymi od oddziaływania kolagen-płytki krwi.

Niniejszym opisano otrzymywanie rekombinowanej postaci GPVI oraz wykazano jej efektywność jako bezpośredniego celu terapeutycznego lub jako narzędzia stosowanego w badaniach przesiewowych do wykrywania małych związków, szczególnie syntetyzowanych związków chemicznych lub możliwych do otrzymania w syntezie chemicznej związków, które wykazują zdolność hamowania lub blokowania naturalnych oddziaływań płytek krwi z kolagenem.

Niniejszym ujawnione zostały części lub fragmenty białka GPVI, które zachowują swoją aktywność biologiczną polegającą na wiązaniu się z kolagenem.

Prowadzone badania umożliwiły oczyszczenie wystarczającej ilości GPVI do wstępnej identyfikacji oraz sekwencjonowania peptydu. Oznaczone sekwencje wykorzystano do zaprojektowania starterów PCR w celu zidentyfikowania pozytywnej sekwencji w bibliotece DNA. Ta sekwencja DNA została następnie wykorzystana jako sonda pozwalająca na identyfikację w bibliotece prawie kompletnej sekwencji cDNA, a brakującą sekwencję 5' otrzymano z biblioteki cDNA płytek, stosując metodę RACE.

Badania wykazały także, że możliwe jest zastosowanie rekombinowanej GPVI jako związku do zastosowania terapeutycznego, który jest zdolny do wiązania kolagenu, kiedy jest podawany pacjentowi, np. z uszkodzonymi naczyniami krwionośnymi. Dzięki temu zapobiega się wiązaniu kolagenu przez płytki krwi niosące związane z błoną GPVI. Rekombinowana rozpuszczalna zewnątrzkomórkowa domena GPVI zawiera miejsce wiązania kolagenu i może zapobiegać aktywacji płytek krwi przez kolagen. Stąd może być ona stosowana w leczeniu schorzeń, w których występuje zwiększona aktywacja płytek krwi pod wpływem kolagenu, przykładowo pęknięcie płytki miażdżycowej w chorobach, takich jak niestabilna dusznica lub podczas zabiegu chirurgicznego, takiego jak przezskórna transluminalna angioplastyka wieńcowa (PTCA), podczas którego tętnice rozszerza się przez nadmuchiwanie balonowego cewnika, co powoduje znaczne zniszczenie ściany naczynia oraz poważną aktywację płytek krwi, skutkując często ponownym zamknięciem naczynia. W porównaniu do obecnych metod leczenia zaletą rekombinowanych fragmentów GPVI jest fakt, że działają one na wcześniejszym etapie, zapobiegając aktywacji lub obniżając ją a nie przez tłumienie procesów przebiegających po aktywacji płytek, takich jak agregacja pod wpływem antagonistów GPIIb-IIIa. Stąd też uwalniane są mniejsze ilości ziarnistości płytek krwi, w tym czynników wzrostu oraz chemokin, które zaangażowane są nie tylko w naprawianie rany, ale także w procesy remodelowania ściany naczynia przez migrację mięśnia gładkiego oraz przyciąganie komórek fagocytów, takich jak monocyty, które jak wiadomo uczestniczą w rozwoju miażdżycy tętnic. Fragment Fab humanizowanego monoklonalnego mysiego przeciwciała przeciwko GPVI może być stosowany z podobnym skutkiem do blokowania GPVI na powierzchni płytek krwi.

Rekombinowana GPVI może być także stosowana w teście wiązania kolagenu w badaniach przesiewowych małych cząsteczek (np. bibliotek kombinatorycznych), które wykazują zdolność hamowania tego oddziaływania oraz mogą być wykorzystane do opracowania związków terapeutycznych, które są inhibitorami oddziaływań kolagen-płytka krwi. Poprzez odpowiednią derywatyzację związki te mogą być dostępne przez podawanie doustnie. Istotne jest otrzymywanie związków, które obniżają oddziaływania GPVI-kolagen, a zatem aktywację płytek krwi w warunkach, kiedy płytki wchodzą w kontakt z kolagenem. Technologia badań przesiewowych jest dobrze znana w stanie techniki. Przez takie badania przesiewowe możliwe jest otrzymywanie oraz opracowywanie nowych czynników docelowych, które jako antagoniści kolagenu mogą hamować naturalną GPVI związaną z błoną na powierzchni płytki krwi. Takie docelowe czynniki, którymi mogą być małe cząsteczki chemiczne, stanowić mogą następnie podstawę do dalszych badań.

Innym głównym zastosowaniem GPVI oraz reagentów, które rozpoznają specyficzne domeny GPVI, jest zastosowanie jako markerów wieku płytek oraz ich czynności. Ogólnie uważa się, że młode płytki są bardziej aktywne oraz działają lepiej niż starsze. Młode płytki wiążą się oraz są aktywowane przez lektynę typu C jadu, konwulksynę, która jest swoista wobec GPVI. Wraz z wiekiem zarówno zdolność wiązania jak i stopień aktywacji ulegają zmniejszeniu. Efekt ten może być wynikiem zmian proteolitycznych lub konformacyjnych w GPVI, bądź też asocjacją z Fcy w wyniku aktywacji płytek krwi lub ich uszkodzenia w układzie krążenia. Może to być wykorzystane jako parametr do określania wieku oraz profilu czynności płytek krwi u pacjentów oraz u ludzi bez zmian chorobowych w trakcie kontroli medycznych. Zmiany profilu wiekowego płytek krwi występują w przypadku wielu chorób oddziaływujących na szpik kostny lub układ odpornościowy. Może on zatem stanowić istotne kryterium diagnosty4

PL 204 449 B1 czne pod warunkiem, że lepsze metody jego określania staną się dostępne. Na przykład u pacjentów z chorobami, które charakteryzuje zwię kszona przemiana płytek wykrywana będzie większa liczba młodych płytek, podczas gdy pacjentów poddawanych chemoterapii lub radioterapii cechuje starzejąca się populacja płytek krwi. Tak więc taki profil wiekowy może być wykorzystywany do precyzyjnego monitorowania leczenia. W przypadku prawidłowej zdrowej populacji bardzo mało wiadomo o dystrybucji profilu wiekowego oraz jego roli do prognozowania zmiany stanu zdrowia. Nie wiadomo, czy zmiany GPVI są wynikiem częściowego zaangażowania płytek w procesach hemostatycznych oraz czy zmiany mogą się bardziej uwidaczniać u pacjentów z poważnymi schorzeniami sercowo-naczyniowymi. Obecnie do wykrywania młodych siateczkowych płytek krwi, zawierających mRNA stosuje się oranż tiazolowy. mRNA w płytkach szybko zanika, co ogranicza zastosowanie tej metody jedynie do najmłodszych płytek. Reagenty, które wykorzystać można w tego typu oznaczeniach mogłyby zawierać białka jadu węża, takie jak konwulksyna, swoiste wobec GPVI, albo monoklonalne lub poliklonalne przeciwciała rozpoznające N-końcowy region GPVI lub monoklonalne przeciwciała rozpoznające nowe miejsca lub konformacje eksponowane w wyniku proteolizy domeny N-końcowej lub specyficzne konformacje obecne w nienaruszonej cząsteczce, a nieobecne w zestarzałej lub też odwrotnie, lub też małe jednostki chemiczne wyselekcjonowane ze względu na zdolność specyficznego rozpoznawania całej nienaruszonej GPVI lub też jej zmodyfikowanej postaci. Reagenty te byłyby znakowane markerem fluorescencyjnym lub też razem z fluorescencyjnie znakowanym drugim przeciwciałem lub reagentem powinowactwa byłyby stosowane w cytometrii przepływowej, aby zmierzyć profil wiązania płytek. Alternatywnie na późniejszym etapie mogłyby być zaadaptowane techniki pomiaru oparte na automatycznym pomiarze profilu płytek, które wymagają mniejszego nakładu pracy. Zastosowanie metod sortowania komórek wraz z metodą cytometrii przepływowej lub magnetycznymi perełkami powinno umożliwić rozdzielanie młodych i starych płytek krwi, aby określić czynniki, które biorą udział w usuwaniu starych płytek z krwioobiegu. Kluczem do takich badań byłyby odczynniki rozpoznające specyficzne postaci GPVI.

Przedmiotem wynalazku jest DNA kodujący glikoproteinę VI zawierającą sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 1a i 1b. Korzystnie DNA według wynalazku ma sekwencję przedstawioną na fig. 2.

Niniejszym opisano również kompozycję farmaceutyczną zawierającą rekombinowaną GPVI razem z farmaceutycznie dopuszczalnymi rozcieńczalnikami, nośnikami lub zaróbkami, oraz jej zastosowanie do wytwarzania leków użytecznych w dziedzinie terapeutycznej procesów zakrzepowych lub sercowo-naczyniowych oraz schorzeń związanych z oddziaływaniami płytka-kolagen.

Rekombinowana GPVI może być stosowana jako narzędzie do badań przesiewowych do wykrywania specyficznych inhibitorów oddziaływań płytka-kolagen. GPVI może też być stosowany jako marker wieku płytki oraz jej ekspozycji na schorzenia sercowo-naczyniowe.

Możliwymi wskazaniami medycznymi i zastosowaniami są odpowiednio np. niestabilna dusznica, PTCA, zastosowanie stentów, operacje naczyń wieńcowych, ogólne operacje naczyń krwionośnych, operacje, które mogą uszkodzić większe naczynia krwionośne, takie jak operacje stawów biodrowych. Ponadto uwzględniono wszystkie wskazania, które wiążą się ze zdarzeniami zakrzepowymi z zatorami wywoływanymi zaburzeniami w oddziaływaniach między ścianą naczynia a układem koagulacyjnym o wysokim ryzyku tworzenia zakrzepu oraz zablokowania naczynia.

Jak stwierdzono powyżej białko GPVI oraz jego fragmenty mogą być stosowane jako farmaceutycznie skuteczne związki w kompozycjach farmaceutycznych oraz ich kombinacjach.

Preparat farmaceutyczny może ewentualnie zawierać dodatkowe składniki czynne, takie jak środki przeciwkrzepliwe, przykładowo hirudyna lub heparyna, albo środki rozpuszczające skrzeplinę, przykładowo aktywator plazminogenu lub hementyna, albo antagoniści innych receptorów płytek, przykładowo antagoniści GPIIb-IIIa, tacy jak abciksimab lub eptyfibatyd lub antagoniści receptora ADP, tacy jak klopidogrel.

Białko GPVI oraz odpowiednio jego biologicznie aktywne fragmenty mogą tworzyć farmaceutycznie dopuszczalne sole z dowolnym nietoksycznym organicznym lub nieorganicznym kwasem. Nieorganicznymi kwasami są np. kwas chlorowodorowy, bromowodorowy, siarkowy lub fosforowy, a kwaśnymi solami metalu są monowodoroortofosforan sodu i wodorosiarczan potasu. Przykładami kwasów organicznych są kwasy mono-, di- oraz trikarboksylowe, takie jak kwas octowy, glikolowy, mlekowy, pirogronowy, malonowy, bursztynowy, glutarowy, fumarowy, jabłkowy, winowy, cytrynowy, askorbinowy, maleinowy, hydroksymaleinowy, benzoesowy, hydroksybenzoesowy, fenylooctowy, cynamonowy, salicylowy oraz kwasy sulfonowe, takie jak metanosulfonowy. Sole końcowej grupy karboksylowej ugrupowania aminokwasowego obejmują nietoksyczne sole kwasów karboksylowych utworzone z dowolną

PL 204 449 B1 odpowiednią zasadą nieorganiczną lub organiczną. Sole te obejmują np. metale alkaliczne, takie jak sód lub potas, metale ziem alkalicznych, takie jak wapń lub magnez, metale lekkie grupy IIIA, w tym glin, oraz organiczne aminy pierwszorzędowe, drugorzędowe lub trzeciorzędowe, takie jak trialkiloaminy, w tym trietyloamina, prokaina, dibenzyloamina, 1-etenoamina, N,N'-dibenzyloetylenodiamina, dihydroabietyloamina oraz N-alkilopiperydyna.

W znaczeniu tu użytym termin „farmaceutycznie dopuszczalny nośnik” oznacza nietoksyczny stały lub ciekły wypełniacz, rozcieńczalnik lub materiał do wytwarzania kapsułek, który nie reaguje niekorzystnie ze związkiem aktywnym lub organizmem pacjenta. Odpowiednie korzystne ciekłe nośniki, takie jak sterylna woda, roztwór soli, wodny roztwór dekstrozy, roztwory cukru, etanol, glikole oraz oleje, w tym oleje naftowe, zwierzęce, roś linne oraz syntetyczne np. olej z orzeszków ziemnych, olej sojowy i olej mineralny, są dobrze znane w stanie techniki.

Preparaty mogą być podawane w postaci jednostkowych dawek zawierających konwencjonalne nietoksyczne farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, rozcieńczalniki, adiuwanty oraz zaróbki, które są typowe do podawania pozajelitowego.

Termin „pozajelitowy” obejmuje iniekcje podskórne, dożylne, dostawowe, dotchawicze oraz techniki infuzyjne. Odpowiednie są również inne sposoby podawania, takie jak podawanie doustne i miejscowe. Kompozycje oraz kombinacje pozajelitowe są najkorzystniej podawane dożylnie albo w postaci jednej dawki albo stałego wlewu zgodnie ze znanymi procedurami. Tabletki i kapsułki do podawania doustnego zawierają standardowe zaróbki, takie jak środki wiążące, wypełniacze, rozcieńczalniki, środki tabletkujące, środki smarujące, środki rozsadzające i środki zwilżające. Tabletki mogą być powlekane zgodnie z metodami znanymi ze stanu techniki.

Ciekłe preparaty doustne mogą mieć postać wodnych lub olejowych zawiesin, roztworów, emulsji, syropów lub eliksirów, ale także w postaci suchego produktu przeznaczonego do rekonstytucji przed użyciem wodą lub inną zaróbką. Takie ciekłe preparaty zawierać mogą typowe dodatki, takie jak środki do sporządzania zawiesin, emulgatory, zaróbki niewodne oraz konserwanty. Preparaty do stosowania miejscowego mogą występować w postaci wodnych lub olejowych zawiesin, roztworów, emulsji, żeli lub korzystnie maści emulsyjnych.

Jednostkowe dawki mogą zawierać dzienną wymaganą ilość białka lub jej podwielokrotności składające się na pożądaną dawkę. Optymalna terapeutycznie dopuszczalna dawka oraz częstość dawkowania w przypadku indywidualnych pacjentów (ssaków, w tym ludzi) zależy od różnych czynników, takich jak aktywności konkretnie stosowanego związku, od wieku, wagi ciała, ogólnego stanu zdrowia, płci, diety, czasu i sposobu podania, szybkości usuwania, przedmiotu leczenia, tj. terapii lub profilaktyki oraz charakteru schorzenia zakrzepowego, które ma być poddawane leczeniu, aktywności przeciwpłytkowej lub przeciwzakrzepowym.

Tak więc w przypadku kompozycji i kombinacji użytecznych jako czynniki przeciwzakrzepowe u leczonych pacjentów (in vivo), farmaceutycznie skuteczna dzienna dawka peptydu zawiera się pomiędzy około 0,01 a 100 mg/kg wagi ciała, korzystnie 0,1 a 10 mg/kg wagi ciała. Zależnie od drogi podawania jedna pojedyncza dawka zawierać może między 0,5 a 10 mg inhibitora kolagenu. Aby osiągnąć efekt przeciwzakrzepowy we krwi pozaustrojowej farmaceutycznie skuteczna ilość peptydu zawiera się pomiędzy 0,2 a 150 mg/l, korzystnie między 1 mg a 20 mg/l krwi pozaustrojowej.

Krótki opis figur

Fig. 1: Sekwencja białkowa GPVI (kod jednoliterowy)

Fig. 1a: Sekwencja liderowa

Fig. 1b: Białko dojrzałe

Otwarta ramka odczytu: 339 aminokwasów

Gwiazdka: miejsce glikozylacji

Podwójne podkreślenie: domena transbłonowa

Podkreślenie: sekwencjonowane peptydy

Fig. 2: Sekwencja nukleotydów GPVI obejmująca ramkę odczytu 1017 par zasad (bp) plus regiony 3' oraz 5', w całości 1249 bp

Szczegółowy opis wynalazku

Dwie sekwencje 7 aminokwasów wykazujące najmniejszy stopień degeneracji w kodzie genetycznym były wybrane do syntezy starterów DNA, aby amplifikować metodą PCR części cDNA GPVI.

Ponieważ położenie obu peptydów w białku było zupełnie nieznane (dla obu z nich) zsyntezowano dwa zdegenerowane startery, jeden sensowy a drugi antysensowy. Startery te użyto do amplifikacji ludzkiej biblioteki szpiku kostnego. Kombinacja starterów sensownego 5' TYA THC CNG CNA TGA

PL 204 449 B1

ARMG 3', kodującego sekwencję PAMKRSL, i antysensownego 5' TTR TAN ARN GCR AAY TGR TC 3', odpowiadającego DQFALYK, amplifikuje fragment DNA o rozmiarze 221 bp. DNA otrzymane w wyniku amplifikacji poza wybranymi peptydami koduje peptyd LysC/AspN DQLELVATGVFAKPSLSAQPGPAVSS, wyraźnie łącząc tę sekwencję z cDNA GPVI.

Badanie przesiewowe 600000 pfu (jednostek tworzących łysinki) z biblioteki szpiku kostnego za pomocą wymienionego fragmentu DNA o rozmiarze 221 bp doprowadziło do czterech pozytywnych pfu. Trzy z nich posiadały insercje 1350 bp bez względu na fakt, czy były cięte enzymem restrykcyjnym Sal I czy EcoR I i należały do nadrodziny IgG. Czwarta trawiona Sal I posiadała insercje 4,6 kb, a poddana działaniu EcoR I dawała dwa fragmenty 2300 bp oraz 1300 bp odpowiednio. Jej DNA kodowało sekwencję 10 peptydów pochodzących z sekwencjonowania aminokwasów GPVI, lecz nieoczekiwanie ulegało zakończeniu przez końcem aminowym. Początkowa metionina lub sekwencja liderowa również nie była zanleziona. Obecne było natomiast ponad 2000 bp poprzednio zsekwencjonowanego DNA poza ramką odczytu, kończącą się na sekwencji Alu. Badanie RACE końca 5' przeprowadzono na poli A RNA płytek ze starterami ulokowanymi w części sekwencji GPVI, która została potwierdzona sekwencją peptydu. Przed wykorzystaniem ustalonej sekwencji GPVI, stwierdzono obecność fragmentu 348 bp, w tym 278 bp na sekwencji czwartego klonu oraz 70 bp nowej postaci z 1987 bp odpowiadającej 14 aminokwasom łącznie z pierwszą metioniną. Zatem możliwe było zsekwencjonowanie cDNA zawierającego w sumie 1249 bp, 25 bp sekwencji 5' w kierunku powyżej (ang. upstream) kodonu startowego, otwartą ramkę odczytu o rozmiarze 1017 bp, kodującą białko, w tym sekwencję liderową z 339 aminokwasami, oraz region 3' o rozmiarze 207 bp, obejmujący kodon stop.

W celu dostarczenia brakującej sekwencji 5', cDNA kodujące GPVI płytek krwi klonowano i sekwencjonowano z biblioteki cDNA ludzkiego szpiku kości z zastosowaniem RACE z mRNA płytek krwi. Otwarta ramka odczytu o rozmiarze 1017 bp koduje 339 aminokwasów oraz nieulegający translacji region 3'. Analiza hydrofobowości sekwencji aminokwasowej ujawniła obecność dwóch domniemanych domen transbłonowych, domniemanej 20 aminokwasowej sekwencji sygnałowej oraz 19 aminokwasowej domeny między resztami 247 i 265 dojrzałego białka. Sekwencja ta oraz jej translacja aminokwasowa zostały przedstawione na fig. 2 i fig. 1. Porównanie z sekwencją aminokwasową najbardziej podobnej cząsteczki znalezionej w bazie GenBank ujawnia wyraźnie, że należy ona do nadrodziny immunoglobulin, a zewnątrzkomórkowa domena zawiera dwie pętle domeny Ig C2 utworzone przez dwa mostki disiarczkowe. Jest to cząsteczka klasy pierwszej białek przechodzących przez błonę z częścią N-końcową znajdującą się na zewnątrz, która przechodzi przez błonę tylko raz. Najbardziej zbliżone cząsteczki należą do klasy receptorów limfocytów NK, która obejmuje zarówno typy o właściwościach hamujących jak i aktywujących. GPVI należy niewątpliwie do podklasy aktywatorów nie tylko ze względu na jej funkcję, lecz także ponieważ w odróżnieniu od klasy inhibitorowej nie zawiera w swojej domenie cytoplazmatycznej sekwencji ITIM. Nie zawiera także żadnych reszt tyrozynowych, które mogą być zaangażowane w fosforylację. W domenie tej występuje pewna liczba reszt treoninowych oraz serynowych, lecz nie spełniają one żadnych kryteriów zgodności z sekwencjami kinazy. Podobnie jak aktywatorowa klasa receptorów NK GPVI zawiera resztę argininową jako trzeci aminokwas domeny przechodzącej przez błonę. Jest ona zaangażowana w tworzenie kompleksu z podjednostką Fcy. Domena cytoplazmatyczna zawiera 51 aminokwasów i wykazuje jedynie niewielkie podobieństwo (w regionie tuż poniżej błony) do domeny cytoplazmatycznej innych przedstawicieli tej klasy. Sugeruje to, że GPVI może łączyć się z różnymi innymi cząsteczkami cytoplazmatycznymi niż inni przedstawiciele tej klasy. GPVI zawiera jedynie pojedyncze przypuszczalne miejsce N-glikozylacji przy Asn69. Domena tuż powyżej błony w miejscu po zakończeniu struktur beta kartek domeny Ig jest jednak bogata w reszty treoniny i seryny, które mogą dostarczać miejsc O-glikozylacji, takich jak obecne w GPIba oraz GPV. Podstawową funkcją miejsca O-glikozylacji wydaje się być prezentacja struktur receptorowych, które znacznie wystają poza powierzchnię płytek krwi, aby umożliwić oddziaływania z ligandami o dużych rozmiarach. Ponieważ ustalono wcześniej, że GPVI jest sjaloglikoproteiną różnica w masie cząsteczkowej między teoretyczną masą aminokwasu (37 kDa) oraz masą wyznaczoną metodą elektroforezy (65 kDa zredukowana) musi wynikać z glikozylacji.

Struktura receptorów NK typu dwudomenowego ustalona została metodą rentgenowskich badań krystalograficznych. Wykazano, że dwie domeny Ig tworzą kąt ostry z miejscem receptorowym dla niosących peptyd antygenów HLA, znajdującym się na zewnątrz zagięcia. Bezpośrednie porównanie struktury miejsca wiązania peptydu HLA ze strukturą kolagenu natychmiast sugeruje dlaczego receptory te pochodzą z jednego źródła. Wielokrotna alfa helikalna struktura miejsca wiążącego HLA oraz peptyd, który zawiera ściśle przypominają potrójną helikalną strukturę kolagenu. Postuluje się, że recePL 204 449 B1 ptory NK działają przez mechanizm dimeryzacji z dwoma receptorami rozpoznającymi dwa oddzielne miejsca HLA na komórce testowanej przez komórki NK. Być może dimeryzacja, w zależności od klasy receptora, jest częścią mechanizmu aktywacji lub deaktywacji. W przypadku GPVI może także istnieć możliwość łączenia się dwóch cząsteczek GPVI z jedną Fcy, ponieważ każdy monomer Fcy posiada sekwencję rozpoznawania. Jednakże stechiometria nie jest jednak jeszcze znana. Opierając się na strukturze kolagenów, peptydów kolagenopodobnych, które oddziaływają przez GPVI oraz konwulksyny, wydaje się, że siła sygnału jest związana z liczbą kompleksów GPVI/Fcy, które są skupione razem. Innymi receptorami płytek krwi należącymi do tej klasy Ig są ICAM-2 (CD102) oraz PECAM (CD31).

Wszystkie mikroorganizmy, linie komórkowe, gospodarze ekspresji, plazmidy, promotory, markery oporności, źródła replikacji, miejsca restrykcyjne lub inne fragmenty lub części wektorów, które wymienione zostały w niniejszym opisie w kontekstach, które nie łączą się bezpośrednio z zastrzeżeniami niniejszego zgłoszenia, pochodzą ze źródeł handlowych lub też są w inny sposób ogólnie dostępne. W przypadku gdy nie wskazano inaczej, były one stosowane jedynie jako przykłady, nie są one istotne w aspekcie niniejszego wynalazku i mogą być zastąpione odpowiednio innymi instrumentami oraz materiałami biologicznymi.

Techniki, które mają dla wynalazku podstawowe znaczenie, opisane zostały szczegółowo w niniejszym opisie. Inne techniki, które nie zostały szczegółowo opisane, odpowiadają znanym typowym metodom, które są dobrze znane specjaliście w dziedzinie lub też bliższe szczegóły znaleźć można w cytowanych odnośnikach, zgłoszeniach patentowych oraz w literaturze (np. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor; Harlow, Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor).

Przykłady

P r z y k ł a d 1

Materiały

Układ białko A-Sepharose, skoniugowane z peroksydazą, kozie przeciwciała, anty-mysie oraz anty-królicze, albumina surowicy bydlęcej, jad Crotalus durissus terrificus, aglutynina kiełków pszenicy (WGA), usieciowane 4% złoże agarowe aktywowane chloromrówczanem N-hydroksysukcynoimidylu oraz Triton X-114 pochodziły z firmy Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), oktanoilo-N-metyloglukamid (ONMG) oraz nonanoilo-N-metyloglukamid (NNMG) pochodziły z firmy Oxyl Chemie (Bobingen, Niemcy).

P r z y k ł a d 2

Izolowanie GPVI z płytek

Glikoproteiny błonowe izoluje się z płytek krwi, jak opisano poprzednio. Pokrótce, płytki krwi (z 40 górnych jaśniejszych warstw żwirowanej krwi) przemywa się i poddaje lizie w 2% Tritonie X-114 w obecności inhibitorów proteazy. Triton X-114 i fazy wodne oddziela się, a warstwę detergentową nanosi się na kolumnę wypełnioną aglutyniną kiełków pszenicy sprzężoną z Sepharose 4B. Glikoproteiny płytek wymywa się 10 mM Tris HCl, pH 7,4, 30 mM NaCl, 0,2% oktanoilo-N-metyloglukamidem (ONMG) oraz 2% N-acetyloglukozoaminą. Po dializie i zatężeniu roztwór glikoprotein nanosi się na kolumnę konwulksyny związanej z usieciowanym 4% złożem agarozowym (1 mg/ml) aktywowanym chloromrówczanem N-hydroksysukcynimidylo-p-nitrofenylu. Kolumnę przemywa się 4 objętościami 10 mM Tris HCI, pH 7,4, 30 mM NaCl, 0,2% nonanoilo-N-metyloglukamidem (NNMG), a następnie 4 objętościami 10 mM Tris HCI, pH 7,4, 30 mM NaCl oraz 2% NNMG. GPVI wymywa się 0,08% SDS w 10 mM Tris/-HCI, pH 7,4. Roztwór zatęża się i nanosi się na 8,5% preparatywny żel poliakryloamidowy z zastosowaniem aparatu Prep Cell Model 491 (BioRad, CA). Preparatywną elektroforezę prowadzi się w warunkach nieredukujących zgodnie z instrukcją producenta. GPVI wymywa się w postaci pojedynczego prążka przy 65 kDa. Frakcje łączy się, zatęża z zastosowaniem Centricon-30 (Amicon, Beverly, MA) oraz ponownie zawiesza w 10 mM Tris/HCI, pH 7,4 oraz 0,1% ONMG.

P r z y k ł a d 3

Analiza aminokwasów GPVI

GPVI trawi się endoproteinazami LysC 15 oraz AspN (Boehringer Mannheim, Niemcy). Wytworzone 10 peptydów rozdziela się metodą HPLC w odwróconym układzie faz oraz sekwencjonuje się stosując sekwenator białek Applied Biosystem model 477A z fazą ciekłą poddaną pulsowaniu z fenyltiohydantoinowym analizatorem aminokwasów online model 120A.

P r z y k ł a d 4

Amplifikacja fragmentu o rozmiarze 221 bp, kodującego część GPVI z biblioteki cDNA Ygt11

Próbkę (10¹⁰ pfu) (jednostek tworzących łysinki) z ludzkiej biblioteki szpiku kostnego (Clonetech,

Paolo Alto, CA) amplifikuje się, stosując 2 kombinacje 4 zdegenerowanych starterów. Końcowe stęże8

PL 204 449 B1 nie starterów wynosi 2 μΜ. Stężenie dNTP wynosi 200 μΜ. Stosuje się 2 U/100 μΐ mieszaniny reakcyjnej AmpliTaq Gold (Perkin Elmer, Rotkreuz, Szwajcaria). Reakcję PCR prowadzi się w następujących warunkach: 5 cykli w 37°C, następnie 30 cykli w 44°C. 19 merowy sensowy 5'TYATHCCNGCNATGAARMG 3' oraz 20 merowy antysensowy 5'TTRTANARNGCRAAYTGRTC 3' amplifikują fragment o rozmiarze 221 bp, który subklonuje się w Bluescript KS+ (Stratagene, La Jolla, CA) oraz sekwencjonuje się z zastosowaniem zestawu do sekwencjonowania T7 Sequenase (Amersham, Szwajcaria).

P r z y k ł a d 5

Badanie przesiewowe biblioteki cDNA Ygt11 sondą GPVI o rozmiarze 221 bp

Fragment o rozmiarze 221 bp wycina się z plazmidu, oczyszcza i znakuje α P-ATP (20 MBq/50 gi, Hartmann Analytik, Braunschweig, Niemcy) używając zestawu do znakowania High Prime Labelling (Boehringer Mannheim, Szwajcaria). Ludzką bibliotekę szpiku kostnego przesiewa się według instrukcji producenta. Pozytywne fagi poddaje się hodowli, ich DNA izoluje się i subklonuje w BlueSchpt, stosując miejsca EcoRI albo Sal I oraz sekwencjonuje. Sekwencjonowanie przeprowadza się stosując układ ABS RACE. Poli A RNA płytek krwi przygotowuje się jak opisano uprzednio (Power et al, Cytokine 7, 479-482,1995). Odwrotną transkrypcję (30 gl) przeprowadza się stosując 5 gg poli A RNA ze starterem 5'TGAATGAGACGGTCAGTTCAGC 3' (20 μΜ), dNTP (1 mM), RNAsin (40 U), bufor 1X AMV oraz 20 U odwrotnej transkryptazy AMV przez 20 minut w temperaturze 45°C, a następnie przez 20 minut w temperaturze 52°C. Mieszaninę reakcyjną poddaje się działaniu 2 μl 6N NaOH w temperaturze 65°C przez 30 minut, zobojętnia 2 μl 6N kwasu octowego oraz zatęża stosując Centricon 30 (Amicon). Do pierwszej nici DNA przyłącza się przez ligację kotwicę według procedury Aptesa i Sieberta (BioTechniques 15: 890-893, 1993). Wewnętrzną PCR (ang. nested PCR) prowadzi się stosując starter komplementarny do kotwicy oraz starter 5TTGTACAGAGCAAATTGGTC 3' (35 cykli, 55°C), a następnie starter 5'GACCAGAGGCTTCCGTTCTG 3' (30 cykli, 53°C). Najwyższe pasmo (350 bp) oddziela się od niższych metodą elektroforezy na agarozie, subklonuje się do BlueScript oraz sekwencjonuje się.

P r z y k ł a d 6

Przygotowanie Fab oraz F(ab')2 anty-GPVI

Poliklonalne surowice odpornościowe przeciwko ludzkiemu GPVI generuje się u królika. IgG z surowicy odpornościowej anty-GPVI królika oczyszcza się jak opisano. Trawienie IgG unieruchomioną papainą (Pierce) w celu otrzymania fragmentów Fab prowadzi się zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta. Fragment Fab oddziela się od niestrawionej IgG oraz fragmentów Fc stosując kolumnę z unieruchomionym białkiem A (Sigma). Wypływające frakcje przenosi się do probówek do dializy, zatęża, stosując stały glikol polietylenowy 20000, starannie dializuje wobec 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, 4 mM KCI, pH 7,4, a następnie przechowuje aż do momentu użycia w temperaturze 4°C. Fragmenty F(ab')2 przygotowywuje się przez trawienie IgG pepsyną przy proporcji enzymu do substratu 1:50 (w/w), w 0,5 M buforze octanowym, pH 4,0 w temperaturze 37°C przez 18 godzin. Wartość pH koryguje się rozcieńczonym NaOH do 7,4, a próbkę poddaje dializie wobec 20 mM fosforanu, pH 7,4. Fragmenty F(ab')2 oddziela się od niestrawionych IgG oraz fragmentów Fc stosując chromatografię z białkiem A. Wypływające frakcje przenosi się do probówek do dializy, zatęża stosując stały glikol polietylenowy 20000, intensywnie dializuje wobec 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, 4 mM KCI, pH 7,4, i przechowuje się w temperaturze -20°C w postaci podzielonych próbek. Przemyte płytki poddaje się lizie w Tritonie X-114, rozdział faz prowadzi się na rozpuszczalnym materiale, a następnie izoluje się glikoproteiny błonowe związane z fazą Triton X-114 przez chromatografię powinowactwa w układzie aglutynina kiełków pszenicy - Sepharose 4B jak uprzednio opisano. Ponieważ GPVI reprezentuje jedynie bardzo niewielką część puli glikoprotein błonowych na powierzchni płytek krwi, do izolacji tego receptora wykorzystano swoistość lektyny typu C węża - konwulksyny. Chromatografia powinowactwa na konwulksynie związanej z Sepharose 4B jako główny produkt daje białko o masie 65 kDa. Otrzymuje się jednak także niescharakteryzowany materiał zarówno o wyższym jak i niższym ciężarze, który jest wymywany jednocześnie z GPVI i nie może zostać usunięty podczas intensywnego przemywania kolumny. Preparatywna elektroforeza żelowa na 8,5% poliakryloamidzie jest ostatnim etapem oczyszczania. Łączy się frakcje zawierające GPVI, które podczas ponownej analizy dają jedno pasmo. Oczyszczoną GPVI poddaje się badaniu pod kątem jej zdolności do blokowania agregacji płytek pod wpływem kolagenu. Przy dodawaniu próbek roztworu GPVI do zawiesiny płytek obserwuje się niewielkie działanie hamujące. Jednakże hamowanie agregacji może być zależne od dawki, przez wstępne inkubowanie GPVI z kolagenem przed dodaniem mieszaniny do zawiesiny płytek. Płytki te wciąż ulegają agregacji pod wpływem dodawanych porcji świeżego kolagenu. W warunkach nieredukujących izolowane białko posiada ciężar cząsteczkowy 62 kDa. W warunkach redukujących obserwuje się przesuPL 204 449 B1 nięcie w kierunku nieco wyższych wartości ciężaru cząsteczkowego (65 kDa). Ponieważ stwierdzono, że część aminokońcowa GPVI jest zablokowana, białko trawiono enzymami LysC oraz LysC/AspN z wytworzeniem odpowiednio 4 i 6 peptydów, których sekwencję ustalono. Peptydy rozdziela się metodą HPLC w układzie odwróconych faz na kolumnie C4 i sekwencjonuje metodą Edmana. Sekwencje aminokwasowe tych peptydów zostały podkreślone w sekwencji otrzymanej przez translację cDNA (fig. 1).

LISTA SEKWENCJI <I10> Merck Patent GmćH <120> Rekombinowana glikoproteina VI - receptor kolagenu płytek krw jej zastosowanie farmaceutyczne <130> Glikoproteina VI - Merck <140>

<141>

<160> 1 <170> patent Iz wersja 2. i <210 1 <211> 1249 <2125 ONA <213> Homo sapiens <220?

<221> CDS ' <222> (26),. 1851 <223> Sekwencja wiodącą <220>

<221> COS <222> (86)..(1042) <223> dojrzałe białko GPVI <400> 1

35	gagctcagga cagggctgag gaacc	atg tct cca tcc ccg acc gcc ctc ttc	52
Met 1	Ser Pro Ser Pro 5	Thr	Ala	Leu Phe
	tgt ctt ggg ctg tgt ctg ggg	cgt	gtg cca gcg cag	agt	gga	ccg ctc	100
	Cys Leu Gly Leu Cys Leu Gly	Arg	Val Pro Ala Gin	Ser	Gly	Pro Leu
	10 15		20			25
‘nł	ccc aag ccc tcc ctc cag gct	ctg	ccc agc tcc ctg	gtg	ccc	ctg gag	143
	Pro Lys Pro Ser Leu Gin Ala	Leu	Pro Ser Ser Leu	Val	Pro	Leu Glu
	30		35			40
45	aag cca gtg acc ctc cgg tgc	cag	gga cct ccg ggc	gtg	gac	ctg tac	196
	Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys	Gin	Gly Pro Pro Gly	Val	Asp	Leu Tyr
	45		50		55
	cgc ctg gag aag ctg agt tcc	agc	agg tac cag gat	cag	gca	gtc ctc	244
50	Arg Leu Głu Lys Leu Ser Ser	Ser	Arg Tyr Gin Asp	Gin	Ala	Val Leu
	60	65		70
	ttc atc ccg gcc atg aag aga	agt	ctg gct gga cgc	tac	cgc	tgc tcc	292
	Phe Ile Pro Ala Met Lys Arg	Ser	Leu Ala Gly Arg	Tyr	Arg	Cys Ser
55	35 80		85
	tac cag aac gga agc ctc tgg	tcc	ctg ccc agc gac	cag	ctg	gag ctc	340
	Tyr Gin Asn Gly Ser Leu Trp	Ser	Leu Pro Ser Asp	Gin	Leu	Glu Leu
	90 95		100			105

PL 204 449 B1 gtt gcc acg gga gtt ttt gcc aaa ccc tcg ctc tca gcc cag ccc ggc 388

Val Ala Thr Gly Val Phe Ala Lys Pro Ser Leu Ser Ala Gin Pro Gly

110 115 120 ccg gcg gtg tcg tca gga ggg gac gta acc eta cag tgt cag act cgg 436

Pro Ala Val Ser Ser Gly Gly Asp Val Thr Leu Gin Cys Gin Thr Arg

125 130 135 tat ggc ttt gac caa ttt get ctg tac aag gaa ggg gac cct gcg ccc 484

Tyr Gly Phe Asp Gin Phe Ala Leu Tyr Lys Glu Gly Asp Pro Ala Pro

140 145 150 tac aag aat ccc gag aga tgg tac cgg get agt ttc ccc atc atc acg 532

Tyr Lys Asn Pro Glu Arg Trp Tyr Arg Ala Ser Phe Pro Ile Ile Thr

155 160 165 gtg acc gcc gcc cac age gga acc tac ega tgc tac age ttc tcc age 580

Val Thr Ala Ala His Ser Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Ser Phe Ser Ser

170 175 180 185 agg gac cca tac ctg tgg tcg gcc ccc age gac ccc ctg gag ctt gtg 628

Arg Asp Pro Tyr Leu Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val

190 195 200 gtc aca gga acc tet gtg acc ccc age cgg tta cca aca gaa cca cct 676

Val Thr Gly Thr Ser Val Thr Pro Ser Arg Leu Pro Thr Glu Pro Pro

205 210 215 tcc tcg gta gca gaa ttc tca gaa gcc acc get gaa ctg acc gtc tca 724

Ser Ser Val Ala Glu Phe Ser Glu Ala Thr Ala Glu Leu Thr Val Ser

220 225 230 ttc aca aac aaa gtc ttc aca act gag act tet agg agt atc acc acc 772

Phe Thr Asn Lys Val Phe Thr Thr Glu Thr Ser Arg Ser Ile Thr Thr

235 240 245 agt cca aag gag tca gac tet cca get ggt cct gcc ege cag tac tac 820

Ser Pro Lys Glu Ser Asp Ser Pro Ala Gly Pro Ala Arg Gin Tyr Tyr

250 255 260 265 acc aag ggc aac ctg gtc cgg ata tgc ctc ggg get gtg atc eta ata 868

Thr Lys Gly Asn Leu Val Arg Ile Cys Leu Gly Ala Val Ile Leu Ile

270 275 280 atc ctg gcg ggg ttt ctg gca gag gac tgg cac age cgg agg aag ege 916

Ile Leu Ala Glv Phe Leu Ala Glu Asp Trp His Ser Arg Arg Lys Arg

285 290 295 ctg cgg cac agg ggc agg get gtg cag agg ccg ctt ccg ccc ctg ccg 964

Leu Arg His Arg Gly Arg Ala Val Gin Arg Pro Leu Pro Pro Leu Pro

300 305 310 ccc ctc ccg cag acc cgg aaa tca cac ggg ggt cag gat gga ggc ega 1012

Pro Leu Pro Gin Thr Arg Lys Ser His Gly Gly Gin Asp Gly Gly Arg

315 320 325 cag gat gtt cac age ege ggg tta tgt tca tgaccgctga accccaggca 1062 Gin Asp Val His Ser Arg Gly Leu Cys Ser

330 ’ 335

PL 204 449 B1 cggtcgtatc caagggaggg atcatggcat gggaggcgac tcaaagactg gcgtgtgtgg 1122 agcgtggaag caggagggca gaggctacag ctgtggaaac gaggccatgc tgcctcctcc 1132 i tggcgttcca tcagggagcc gttcggccag tgtctgtctg tctgtctgcc tctctgtctg 1242 agggcac 1249 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <40Q> 2

Met Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

Ala

Leu

Phe

Cys

Leu

Gly

Leu

Cys

Leu

Gly

1

5

10

15

Arg Val

Pro

Ala

20

<210> 3

20

<211> 319

25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3 Gin Ser

Gly

Pro

leu

Pro

Lys

Pro

Ser

Leu

Gin

Ala

Leu

Pro

Ser

Ser

30

1

5

10

15

Leu Val

Pro

leu

Glu

Lys

Pro

Val

Thr

Leu

Arg

Cys

Gin

Gly

Pro

Pro

20

25

30

35

Gly Val

Asp

Leu

Tyr

Arg

Leu

Glu

Lys

Leu

Ser

Ser

Ser

Arg

Tyr

Gin

35

40

45

Asp Gin

Ala

Val

Leu

Phe

Ile

Pro

Ala

Mec

Lys

Arg

Ser

Leu

Ala

Gly

50

55

60

40

Arg Tyr

Arg

Cys

Ser

Tyr

Gin

Asn

Gly

Ser

Leu

Trp

Ser

Leu

Pro

Ser

65

70

75

80

Asp Gin

Leu

Glu

Leu

Val

Ala

Thr

Gly

Vai

Phe

Lys

Pro

Ser

Leu

45

Θ5

90

95

Ser Ala

Gin

Pro

Gly

Pro

Ala

val

Ser

Ser

Gly

Gly

Asp

Val

Thr

Leu

100

105

110

5Q

Gin Cys

Gin

Thr

Arg

Tyr

Gly

Phe

Asp

Gin

Phe

Ala

Leu

Tyr

Lys

Glu

115

120

125

Gly Asp

Pro

Ala

Pro

Tyr

Lys

Asn

Pro

Glu

Arg

Trp

Tyr

Arg

Ala

Ser

130

135

140

55

Phe Pro

Ile

Ile

Thr

Val

Thr

Ala

Ala

His

Ser

Gly

Thr

Tyr

Arg

Cys

145

150

155

160

Tyr Ser

Phe

Ser

Ser

Arg

Asp

Pro

Tyr

Leu

Trp

Ser

Ala

Pro

Ser

Asp

60

165

170

175

PL 204 449 B1

Pro

Leu

Glu

Leu 180

Val

Val

Thr

Gly

Thr 185

Ser

Val

Thr

Pro

Ser 190

Arg

Leu

5

Pro

Thr

Glu 195

Pro

Pro

Ser

Ser

Val 200

Ala

Glu

Phe

Ser

Glu 205

Ala

Thr

Ala

Glu

Leu 210

Thr

Val

Ser

Phe

Thr 215

Asn

Lys

Val

Phe

Thr 220

Thr

Glu

Thr

Ser

10

Arg 225

Ser

Ile

Thr

Thr

Ser 230

Pro

Lys

Glu

Ser

Asp 235

Ser

Pro

Ala

Gly

Pro 240

15

Ala

Arg

Gin

Tyr

Tyr 245

Thr

Lys

Gly

Asn

Leu 250

Val

Arg

Ile

Cys

Leu 255

Gly

Ala

Val

Ile

Leu 260

Ile

Ile

Leu

Ala

Gly 265

Phe

Leu

Ala

Glu

Asp 270

Trp

His

20

Ser

Arg

Arg 275

Lys

Arg

Leu

Arg

His 280

Arg

Gly

Arg

Ala

Val 285

Gin

Arg

Pro

Leu

Pro 290

Pro

Leu

Pro

Pro

Leu 295

Pro

Gin

Thr

Arg

Lys 300

Ser

His

Gly

Gly

25

Gin 305

Asp

Gly

Gly

Arg

Gin 310

Asp

Val

His

Ser

Arg 315

Gly

Leu

Cys

Ser

<160> 3 30

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. DNA kodujący glikoproteinę VI zawierającą sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 1a i 1b.
2. 2. DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że ma sekwencję przedstawioną na fig. 2.

   PL 204 449 B1

   Rysunki

   FiSkl (la)

   1 20

   MSPSPTALFC LGLCLGRVPA (lb)

   QSGPLPKPSL QALPSSLVPL EKPVTLRCQG PPGVDLYRLS KLSSSRYQDQ {50}

   AVLFIPAMKR SŁAGRYRCSY QN*GSLWSLPS DQLELVATGV FAKPSLSAQP (100!

   GPAVSSGGDV TLQCQTRYGF DQFALYKEGD PAPYKNPERW YRASFPIITV (150) TAAHSGTYRC YSFSSRDPYL WSAPSDPLEL WTGTSVTPS RLPTEPPSSV (200) AEFSEATAEL TVSFTNKVFT TETSRSITTS PKESD5PAGP ARQYYTKGNL (250) VRICLGAVIL SHGGQDGGRQ IILAGFLAED DVHSRGLCS WHSRRKRLRH {319} RGRAVQRPLP PLPPLPQTRK (300)

   PL 204 449 B1

   Fiq,2 GAGCTCAGGA CAGGGCTGAG GAACCATGTC TCCATCCCCG ACCGCCCTCT (50) TCTGTCTTGG GCTGTGTCTG GGGCGTGTGC CAGCGCAGAG TGGACCGCTC (100) CCCAAGCCCT CCCTCCAGGC TCTGCCCAGC TCCCTGGTGC CCCTGGAGAA GCCAGTGACC CTCCGGTGCC AGGGACCTCC GGGCGTGGAC CTGTACCGCC (200)

   TGGAGAAGCT GAGTTCCAGC AGGTACCAGG ATCAGGCAGT CCTCTTCATC

   CCGGCCATGA AGAGAAGTCT GGCTGGACGC TACCGCTGCT CCTACCAGAA (300)

   CGGAAGCCTC TGGTCCCTGC CCAGCGACCA GCTGGAGCTC GTTGCCACGG

   GAGTTTTTGC CAAACCCTCG CTCTCAGCCC AGCCCGGCCC GGCGGTGTCG (400)

   TCAGGAGGGG ACGTAACCCT ACAGTGTCAG ACTCGGTATG GCTTTGACCA

   ATTTGCTCTG TACAAGGAAG GGGACCCTGC GCCCTACAAG AATCCCGAGA (500)

   GATGGTACCG GGCTAGTTTC CCCATCATCA CGGTGACCGC CGCCCACAGC

   GGAACCTACC GATGCTACAG CTTCTCCAGC AGGGACCCAT ACCTGTGGTC (600)

   GGCCCCCAGC GACCCCCTGG AGCTTGTGGT CACAGGAACC TCTGTGACCC

   CCAGCCGGTT ACCAACAGAA CCACCTTCCT CCGTAGCAGA ATTCTCAGAA (700)

   GCCACCGCTG AACTGACCGT CTCATTCACA AACAAAGTCT TCACAACTGA

   GACTTCTAGG AGTATCACCA CCAGTCCAAA GGAGTCAGAC TCTCCAGCTG (800)

   GTCCTGCCCG CCAGTACTAC ACCAAGGGCA ACCTGGTCCG GATATGCCTC

   GGGGCTGTGA TCCTAATAAT CCTGGCGGGG TTTCTGGCAG AGGACTGGCA (900)

   CAGCCGGAGG AAGCGCCTGC GGCACAGGGG CAGGGCTGTG CAGAGGCCGC

   TTCCGCCCCT GCCGCCCCTC CCGCAGACCC GGAAATCACA CGGGGGTCAG (1000)

   GATGGAGGCC GACAGGATGT TCACAGCCGC GGGTTATGTT CATGACCGCT

   GAACCCCAGG CACGGTCGTA TCCAAGGGAG GGATCATGGC ATGGGAGGCG (1100)

   ACTCAAAGAC TGGCGTGTGT GGAGCGTGGA AGCAGGAGGG CAGAGGCTAC

   AGCTGTGGAA ACGAGGCCAT GCTGCCTCCT CCTGGTGTTC CATCAGGGAG (1200)

   CCGTTCGGCC AGTGTCTGTC TGTCTGTCTG CCTCTCTGTC TGAGGGCAC (1249)