ES2534936T3 - Método para producir y purificar una sialiltransferasa soluble activa - Google Patents
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Abstract
Un método para producir un polipéptido de sialiltransferasa, que comprende las etapas de: a) expresar un polipéptido de sialiltransferasa en células CHO; recoger el medio de cultivo celular que contiene el polipéptido de sialiltransferasa expresado; y b) purificar el polipéptido de sialiltransferasa del medio de cultivo celular sometiendo el medio de cultivo celular a (i) dos etapas de cromatografía de afinidad o una etapa de cromatografía de afinidad y una etapa de cromatografía de modo mixto, (ii) una etapa de cromatografía de intercambio aniónico, y (iii) una etapa de cromatografía de intercambio catiónico, en el que la sialiltransferasa es ST6GalNAcI.
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IV. Etapa de cromatografía de intercambio catiónico
Según la presente invención, el proceso de purificación del polipéptido de la sialiltransferasa ST6GalNAcI incluye una etapa de cromatografía de intercambio catiónico (CEC).
La CEC se basa en las interacciones entre las cargas de las proteínas en la muestra y las cargas inmovilizadas sobre la resina. En la cromatografía de intercambio catiónico, los iones de unión de las proteínas son positivos y el grupo funcional inmovilizado es negativo. Las resinas de intercambio catiónico que se emplean habitualmente son la resina S, derivados de sulfato, y resinas CM (carboximetilo), con iones derivados carboxilados.
Sin embargo, en general, la etapa de cromatografía de intercambio catiónico puede realizarse con todas las membranas o resinas de intercambio catiónico disponibles en el mercado habituales. Las resinas de intercambio catiónico pueden utilizarse en forma de membranas o columnas precargadas sobre las cuales se fija el grupo funcional, por ejemplo, ácido sulfónico. Como alternativa, las columnas pueden prepararse personalmente. No existen limitaciones específicas con respecto a la capacidad y a la geometría de las columnas distintas de las habituales. Los expertos en la técnica saben que la cantidad de resina de intercambio catiónico utilizada depende del contenido global en proteínas del fluido del cultivo celular o cualquiera otro fluido, por ejemplo, el eluato de una etapa de cromatografía previa.
Están disponibles diferentes tipos de materiales de intercambio catiónico bajo diferentes nombres y de una multitud de suministradores, tales como Bio-Rex® (por ejemplo, tipo 70), Chelex® (por ejemplo, tipo 100), Macro-Prep® (por ejemplo, tipo CM, High S, 25 S), AG® (por ejemplo, tipo 50W, MP) (todas disponibles en BioRad Laboratories); WCX 2 (disponible en Ciphergen), Dowex® MAC-3 (disponible en Dow Chemical Company), Mustang C y Mustang S (disponibles en Pall Corporation), Cellulose CM (por ejemplo, tipo 23, 52), Hyper-D, Partisphere (disponible en Whatman plc.), Amberlite® IRC (por ejemplo, tipo 76, 747, 748), Amberlite® GT 73, Toyopearl® (por ejemplo, tipo SP, CM, 650M) (todas disponibles en Tosoh Bioscience GmbH), CM 1500 y CM 3000 (disponibles en BioChrom Labs), SP-Sepharose™, CM-Sepharose™ (disponibles en GE Healthcare), resinas porosas (disponibles en PerSeptive Biosystems), Asahipak ES (por ejemplo, tipo 502C), CXpak P, IEC CM (por ejemplo, tipo 825, 2825, 5025, LG), IEC SP (por ejemplo, tipo 420N, 825), IEC QA (por ejemplo, tipo LG, 825) (disponibles en Shoko America Inc.), resina de intercambio catiónico 50W (disponible en Eichrom Technologies Inc.). Preferiblemente, el material de intercambio catiónico es un material de intercambio catiónico fuerte, tal como Macro-Prep® High S o 25S, MacroCap SP, Toyopearl® SP 650M, Source S, SP Sepharose, o POLYCAT A.
En una realización preferida de la presente invención, la etapa de intercambio catiónico se realiza con una resina que contiene un material de intercambio catiónico de sulfopropilo o una resina que tenga características similares. En una realización muy preferida de la presente invención, la cromatografía de intercambio catiónico se realiza con una resina SP-Sepharose High Performance disponible en el mercado.
La etapa de la cromatografía de intercambio catiónico se realiza preferiblemente empleando un tampón que tenga un pH ligeramente ácido. Los tampones adecuados incluyen, por ejemplo, ácido maleico, ácido malónico, ácido cítrico, ácido láctico, ácido fórmico, ácido butanandioico, ácido acético, fosfato, HEPES y BICINE. Se prefiere el uso de un tampón fosfato. La elución de la resina de intercambio catiónico habitualmente se logra aumentado la conductividad de la fase móvil mediante la adición de una sal, preferiblemente cloruro de sodio. Preferiblemente, la cromatografía de intercambio catiónico se realiza empleando un tampón de NaCl/fosfato de potasio a un pH en el intervalo entre 6,0 y 7,0 como eluyente.
V. Otras etapas de purificación
Además, el método puede comprender etapas de filtración. Los procesos de filtración son muy conocidos por los expertos en la técnica y pueden emplearse todos los métodos conocidos. El método puede comprender uno o más procesos de ultrafiltración en diversas etapas del método. El método puede comprender nanofiltración, por ejemplo, para la eliminación final de los virus.
La ultrafiltración es una forma de filtración con membrana en la que la presión hidrostática empuja a un líquido contra una membrana semipermeable. Los sólidos suspendidos y los solutos de alto peso molecular son retenidos, mientras que el agua y los solutos de bajo peso molecular pasan a través de la membrana. La ultrafiltración es un método de separación que se emplea habitualmente para purificar y concentrar disoluciones macromoleculares, en especial disoluciones de proteínas. La ultrafiltración es similar a la nanofiltración, pero se diferencia en términos del tamaño de las moléculas que retiene. En el marco de la presente invención, se prefiere un límite de exclusión de peso molecular de 10 kDa (10 kDa UF). Las membranas UF también pueden emplearse para la diafiltración para eliminar sales y otras microespecies de la disolución mediante una dilución y concentración repetidas o continuas.
Preferiblemente, el proceso de purificación comprende una o más etapas de ultrafiltración/diafiltración. Estas etapas de filtración pueden realizarse antes, entre y/o después de las etapas de cromatografía. Preferiblemente, se realiza una etapa de diafiltración entre las etapas de cromatografía, por ejemplo, entre la etapa de cromatografía de modo mixto y la etapa de cromatografía de intercambio catiónico, y se realiza una etapa de ultrafiltración/diafiltración después de las etapas de cromatografía. Estas etapas de filtración pueden realizarse empleando dispositivos de
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filtración disponibles en el mercado, por ejemplo, disponibles en GE Healthcare o Sartorius. La ultrafiltración se realiza preferiblemente empleando los módulos Sartocon y los módulos Sartocon Slice suministrados por Sartorius.
E. Polipéptido de sialiltransferasa producido
En otro aspecto, la presente descripción proporciona polipéptidos de sialiltransferasa producidos mediante cualquiera de los métodos según la invención.
En una realización, el polipéptido de sialiltransferasa es un polipéptido de sialiltransferasa truncado que carece del dominio de señal de la sialiltransferasa completo, o de una porción de este, del dominio transmembrana de la sialiltransferasa completo, o de una porción de este, y/o del dominio troncal de la sialiltransferasa completo, o de una porción de este. En una realización preferida de la presente invención, el polipéptido de sialiltransferasa solo comprende el dominio activo de la sialiltransferasa, y dicho polipéptido es soluble. La sialiltransferasa es ST6GalNAcI, preferiblemente de pollo, lo más preferiblemente la sialiltransferasa es la proteína según SEQ ID NO:4
o SEQ ID NO:6.
Los polipéptidos de la sialiltransferasa ST6GalNAcI producidos según los métodos de la presente invención tienen varias ventajas frente a los polipéptidos de sialiltransferasa de la técnica anterior. Los métodos de producción nuevos y mejorados de la presente invención proporcionan polipéptidos de la sialiltransferasa ST6GalNAcI que son muy activos, están purificados hasta una calidad farmacéutica, y pueden producirse a gran escala.
El término “puro” se refiere a un polipéptido de la sialiltransferasa ST6GalNAcI que está sustancial o fundamentalmente exento de los componentes que normalmente acompañan al material en la mezcla empleada para preparar el polipéptido, por ejemplo, ADN o proteínas de la célula hospedante. Generalmente, el polipéptido de la sialiltransferasa ST6GalNAcI producido mediante el método de la presente invención es al menos 98% puro, preferiblemente al menos 99% puro. La pureza se determina mediante cualquier método de análisis reconocido en la técnica (por ejemplo, la intensidad de las bandas en un gel teñido con plata, una electroforesis en gel de poliacrilamida, HPLC, RP-HPLC, ELISA o un medio similar).
El término “activo” se refiere a la actividad específica de un polipéptido de la sialiltransferasa ST6GalNAcI producido mediante el método de la presente invención, lo cual significa la actividad catalítica de la sialiltransferasa, que consiste en transferir un resto ácido siálico desde una molécula donante a una molécula aceptora.
La actividad catalítica de ST6GalNAcI se refiere a la transferencia de un resto ácido siálico desde CMP-ácido siálico con un enlace 2,6 hasta un resto N-acetilgalacosamina (GalNAc) O-enlazado al aminoácido treonina/serina de una glicoproteína. La actividad específica puede expresarse en unidades de actividad. Tal como se emplea en la presente, una unidad de actividad cataliza la formación de 1 mol de producto por minuto a un valor de pH, temperatura y aceptor-sustrato concretos. En la presente invención, la actividad específica de ST6GalNAcI está en un intervalo entre 5 U/mg y 10 U/mg, preferiblemente de 6 U/mg a 9 U/mg, lo más preferiblemente de 7 U/mg a 8 U/mg.
La actividad sialiltransferasa puede determinarse mediante métodos conocidos. Estos métodos incluyen un ensayo de fluorescencia, ensayos basados en RP-HPLC y estrategias radiactivas (Spiegel et al., 1992, J Chromatogr., 573(1):23-7; Gross et al., 1990, Anal Biochem., 186(1):127-34; Skretas et al., 2009, Microbial cell factories, 8:50).
F. Uso de las sialiltransferasas
En otro aspecto, la presente descripción incluye el uso de ST6GalNAcI producida mediante el método según la invención para la glicosilacón de proteínas terapéuticas, en particular para la glico-PEGilación de G-CSF, eritropoyetina, IFN, hGH, FSH o insulina humanas o anticuerpos.
La glicosiltransferasa ST6GalNAcI es un reactivo fundamental para la glicosilación de proteínas terapéuticas. Además, la ST6GalNAcI es un importante reactivo para la investigación y el desarrollo de glicopéptidos importantes desde el punto de vista terapéutico y productos terapéuticos de oligosacáridos.
Las enzimas sialiltransferasas ST6GalNAcI modificadas son útiles para la preparación in vivo e in vitro de péptidos glicosilados, así como para la producción de oligosacáridos que contienen los restos glicosilo específicos que pueden ser transferidos por las enzimas glicosiltransferasas modificadas. Las formas modificadas de los polipéptidos de la ST6GalNAcI pueden poseer actividades biológicas comparables, y en algunos casos mayores, a la de sus polipéptidos homólogos de longitud completa.
El término “glicosilación”, tal como se emplea en la presente, se refiere a una conjugación enzimáticamente mediada de una especie de azúcar modificado con un resto aminoácido o glicosilo de un polipéptido, por ejemplo, un péptido de eritropoyetina, por la sialiltransferasa preparada mediante el método de la presente invención. Los subgéneros de la glicosilación son la “glicoconjugación” y la “glico-PEGilación”, en los que el grupo modificador del azúcar modificado es polietilenglicol, o uno de sus derivados de alquilo (por ejemplo, m-PEG) o de sus derivados reactivos (por ejemplo, H2N-PEG, HOOC-PEG).
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El proceso de purificación de ST6GalNAcI comenzó con la etapa de cromatografía de captura empleando una columna de intercambio aniónico. Las posteriores etapas de purificación incluyen una cromatografía de afinidad, una cromatografía de modo mixto, una ultra-/diafiltración, una cromatografía de intercambio catiónico y una nanofiltración final a través de una membrana Planova de 15 nm. Las etapas cromatográficas se realizaron empleando sistemas de cromatografía en gradiente y se realizaron de modo automático. Se registró la absorción de UV, la conductividad, el pH, el caudal y la contrapresión en cada etapa cromatográfica con un software adecuado.
En la tabla 1 se presentan los tipos de columna y las resinas utilizadas.
- Etapa
- Tipo de columna Tipo de resina Dimensiones del gel (D x A) [mm]
- Cromatografía de intercambio aniónico
- Columna de vidrio de borosilicato BPG Q-Sepharose Fast Flow 200 x 205
- Cromatografía de afinidad
- Columna de vidrio de borosilicato BPG Blue Sepharose 6-Fast Flow 140 x 110
- Cromatografía de modo mixto
- Columna de vidrio de borosilicato BPG Hidroxiapatito de tipo I 40 m 100 x 250
- Cromatografía de intercambio catiónico
- Columna de vidrio de borosilicato BPG SP-Sepharose High Performance 100 x 150
1ª columna: Cromatografía de intercambio aniónico (Q-Sepharose FF)
10 Se empleó una cromatografía de intercambio aniónico con la resina Q-Sepharose Fast Flow como la primera etapa cromatográfica para capturar la ST6GalNAcI en la recolección y para la reducción del volumen.
La ST6GalNAcI se eluyó aplicando una etapa salina de NaCl 800 nM en Tris HCl 20 mM, pH 7,6. El eluato se recogió basándose en el perfil de absorción de UV.
En la tabla 2 se resumen las condiciones cromatográficas.
- Parámetro
- Condiciones
- Resina
- Q-Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences/GE-Healthcare)
- Diámetro de la columna
- 200 mm
- Altura del lecho
- 205 mm +/-15 mm
- Placas teóricas
- > 2.200 N/m
- Factor de asimetría
- 0,8-1,5
- Tampón de equilibrio
- Tris 20 mM, pH 7,6
- Tampón de elución
- NaCl 800 mM en Tris HCl 20 mM, pH 7,6
- Criterio de reunión
- Inicio: DO 280 > 0,04 AU; Final: 0,6 CV después del inicio
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2ª columna: Cromatografía de afinidad (Blue Sepharose 6 FF)
Blue Sepharose 6FF es una resina de agarosa unida covalentemente al tinte Cibacron Blue y se emplea para unir preferentemente la ST6GalNAcI en presencia de los contaminantes contenidos en el eluato de Q-Sepharose. La ST6GalNAcI eluye con clorhidrato de L-arginina 500 mM en tampón fosfato de potasio 25 mM, pH 7,5. El eluato se
20 recogió basándose en el perfil de absorción de UV.
En la tabla 3 se resumen las condiciones cromatrográficas.
- Parámetro
- Condiciones
- Resina
- Blue Sepharose FF (Amersham Biosciences/GE-Healthcare)
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- Parámetro
- Condiciones
- Factor de asimetría
- 0,8-1,5
- Tampón de equilibrio
- tampón fosfato de potasio 25 mM, pH 6,0
- Tampón de elución
- cloruro de sodio 250 mM, fosfato de potasio 25 mM, pH 6,0
- Criterio de reunión
- Inicio: DO > 0,050 AU; Final: OD < 0,200 AU + 0,6 CV
Ultrafiltración/diafiltración y formulación
El eluato de SP-Sepharose se diafiltró en un módulo de corte Sartocon con un MWCO de 30 kDa. La filtración de flujo tangencial se realizó para desalar y concentrar el producto, y para intercambiar el tampón a BisTris 50 mM, pH 6,5, NaCl 100 mM, sorbitol al 5%.
Después de completar la diafiltración se añadió Tween 80 hasta una concentración final de 0,003%.
Purificación -Ejemplo 2
1ª columna: Cromatografía de intercambio aniónico (Q-Sepharose FF)
Esta etapa del proceso se empleó para capturar el cST6 mediante una cromatografía de intercambio aniónico a partir de la recolección del biorreactor aclarada y esterilizada mediante filtración. Se diluyeron 1000 ml del sobrenadante del biorreactor 1:3 en el tampón A (Tris 20 mM, pH 7,6) y se cargaron sobre una columna Omni 25/150 Q Sepharose FF. El cST6 seluyó con un gradiente lineal de NaCl (0-1 M, 20 CV).
2ª columna: Cromatografía de afinidad (matriz de afinidad CDP)
Esta etapa del proceso de una cromatografía de afinidad es una etapa intermedia que es importante para aumentar la pureza de cST6. La reunión de las fracciones 9-11 de la etapa de captura de Q Sepharose se diluyó 1:3 en tampón A (MES 10 mM, pH 6,8, glicerol al 25%) y se cargó sobre una columna de afinidad XK 10/55 CDP. Para evitar sobrecargar la columna CDP, la carga se aplicó en dos ensayos CDP idénticos. El cST6 eluyó mediante un gradiente lineal de NaCl (0-1 M, 10 CV).
3ª columna: Cromatografía de intercambio aniónico (Mono Q Sepharose)
Esta cromatografía de intercambio aniónico se empleó como etapa de acabado final. La reunión de las fracciones de cST6 de la etapa intermedia de CDP se diluyó 1:10 en tampón A (Tris 20 mM, pH 7,6) y se cargó sobre una columna Mono Q HR 10/10. El cST6 eluyó con un gradiente lineal de NaCl (0-0,6 M, 5 CV).
Purificación -Ejemplo 3
1ª columna: Cromatografía de intercambio aniónico (Q-Sepharose FF)
Se empleó una cromatografía de intercambio aniónico con la resina Q-Sepharose Fast Flow como la primera etapa cromatográfica para capturar la ST6GalNAcI en la recolección y para la reducción del volumen. Se purificaron 300 ml del sobrenadante filtrado, aclarado y estéril del biorreactor de cultivo de alimentación discontinua.
Las condiciones cromatográficas se resumen en la tabla 6.
- Columna
- Omnifit 25, altura del lecho = 15 cm, CV = 73,6 ml
- Tampón de equilibrio A
- Tris 20 mM, pH 7,6
- Tampón de elución B
- Tris 20 mM, pH 7,6, NaCl 1 M
- Factor de dilución para la carga
- Dilución de la muestra 1:3 en tampón de equilibrio A
- Gradiente
- Etapas: Tampón de elución B al 4% (4 CV), al 20% (4 CV) y al 100% (2 CV)
2ª columna: Cromatografía de afinidad intermedia (Blue Sepharose FF)
Esta etapa del proceso de cromatografía de afinidad es una etapa intermedia que es importante para aumentar la pureza de cST6. El eluato de la etapa de cromatografía de captura (29 ml) se diluyó y se purificó con una etapa de cromatografía con Blue Sepharose.
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Las condiciones cromatográficas se resumen en la tabla 7.
- Columna
- Omnifit 10, altura del lecho = 7,0 cm, CV = 5,5 ml
- Tampón de equilibrio A
- fosfato de potasio 25 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM
- Tampón de elución B
- fosfato de potasio 25 mM, pH 7,5, arginina-HCl 1 M
- Factor de dilución para la carga
- Dilución de la muestra 1:3 en tampón de equilibrio A
- Gradiente
- Etapas: B al 10%, B al 75%, B al 100% (cada etapa 5 CV)
3ª columna: Cromatografía de afinidad de acabado (Prosep PB)
El medio ProSep-PB está compuesto de un ligando de m-aminofenilo sintético inmovilizado sobre esferas de vidrio de tamaño de poro controlado.
Esta cromatografía de afinidad se empleó como etapa de acabado final. Se purificaron 15 ml del eluato intermedio en esta etapa de cromatrografía.
Las condiciones cromatográficas se resumen en la tabla 8.
- Columna
- Omnifit 10, altura del lecho = 5,8 cm, CV = 4,55 ml
- Tampón de equilibrio A12
- fosfato de potasio 25 mM, pH 6,5, NaCl 0,5 M
- Tampón de equilibrio A11
- BisTris 50 mM, pH 6,5, NaCl 0,5 M
- Tampón de elución B
- BisTris 50 mM, pH 6,5, NaCl 0,5 M, sorbitol 1,37 M
- Factor de dilución para la carga de la muestra
- Dilución 1:5 en tampón de equilibrio A12
- Gradiente
- Etapas: B al 100% a lo largo de 5 CV
- Tampón de dilución
- BisTris 50 mM, pH 6,5, Tween80 al 0,015%
- Tampón de formulación
- BisTris 50 mM, pH 6,5, NaCl 0,1 M, sorbitol al 5%, Tween80 al 0,003%
10 6. Pureza de ST6GalNAcI, actividad específica y rendimiento de la producción
Ejemplo 1
Se midió la pureza de ST6GalNAcI purificada según el ejemplo 1 mediante SDS-PAGE teñida con Coomassie (véase la figura 3), RP-HPLC, ELISA, y ensayo del umbral en tres lotes. La actividad específica de ST6GalNAcI se midió mediante RP-HPLC.
15 La pureza y las actividades específicas se muestran en la tabla 9.
- Ensayo
- Método Lote n.º 1 Lote n.º 2 Lote n.º 3
- Identidad
- SDS-PAGE Banda principal a aprox. 66 kDa Banda principal a aprox. 66 kDa Banda principal a aprox. 66 kDa
- Pureza
- RP-HPLC 100,0% 100,0% 99,5%
- Proteínas residuales de las células hospedantes CHO (ensayo genérico)
- ELISA 35 ng/mg (ppm) 35 ng/mg (ppm) 37 ng/mg (ppm)
- ADN residual de la célula hospedante
- ensayo del umbral 784 pg/mg 833 pg/mg 755 pg/mg
- Actividad específica
- RP-HPLC 5,6 U/mg 7,8 U/mg 7,7 U/mg
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El rendimiento de la producción de la ST6GalNAcI purificada se encuentra en un intervalo de 65 mg/l a 75 mg/l.
Se realizó un estudio comparativo para comparar la expresión de ST6GalNAcI en células CHO con la expresión de ST6GalNAcI en células de insecto. La ST6GalNAcI derivada de células de insecto mostró una actividad específica 5 de 2,5 U/mg, y la ST6GalNAcI derivada de CHO mostró una actividad específica mayor de 7,8 U/mg.
Ejemplo 2
Las fracciones de cST6 purificadas según el ejemplo 2 se reunieron y se analizaron para la pureza mediante SDS-PAGE teñida con Coomassie (véase la figura 4). Las muestras reunidas de cST6 que proceden de tres clones diferentes C1, C2 y C3 se cargaron sin diluir, diluidas 1:5 y diluidas 1:10.
10 La tabla 10 muestra la preparación de las muestras y la carga.
- Pocillo
- Muestra Volumen de la muestra (l) Tampón de la muestra (l) Volumen de carga (l) Condiciones
- 1
- Reunión de C1 después de la 3ª columna (Mono Q) 10 10 20 ebullición/reducción
- 2
- Reunión de C2 después de la 3ª columna (Mono Q) 10
- 3
- Reunión de C3 después de la 3ª columna (Mono Q) 10
- 4
- - - 10 10
- 5
- Reunión de C1 después de la 3ª columna (Mono Q) 2+8 H20 10 20
- 6
- Reunión de C2 después de la 3ª columna (Mono Q) 2+8 H20
- 7
- Reunión de C3 después de la 3ª columna (Mono Q) 2+8 H20
- 8
- - - 10 10
- 9
- Reunión de C1 después de la 3ª columna (Mono Q) 1+9 H20 10 20
- 10
- Reunión de C2 después de la 3ª columna (Mono Q) 1+9 H20
- 11
- Reunión de C3 después de la 3ª columna (Mono Q) 1+9 H20
- 12
- Marcador de bajo peso molecular 10
Tal como se muestra en la figura 4, las reuniones no diluidas muestran una pequeña contaminación por debajo de 20 kDa. La señal de las reuniones diluidas 1:10 es más fuerte que la señal de las impurezas en las muestras no diluidas. Por tanto, puede calcularse que la pureza es > 90%.
15 Ejemplo 3
Se midió la pureza de la ST6GalNAcI purificada según el ejemplo 3 mediante SDS-PAGE teñida con Coomassie, RP-HPLC, ELISA, y ensayo del umbral en tres lotes. La actividad específica de ST6GalNAcI se midió mediante RP-HPLC.
Leyendas de las figuras
20 Figura 1: Proceso de fabricación de la sialiltransferasa: cultivo celular y recolección.
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