RS50960B - Postupak za prečišćavanje eritropoetina - Google Patents

Abstract

Postupak za obogaćivanje eritropoetina dobijenog kultivisanjem eukariotskih ćelija domaćina u medij umu za kulture u proteinskoj smeši, pri čemu se sledeći stupnjevi a-)-c) izvode navedenim redosledom:a) prva anjonska jonoizmenjivačka hromatografija,b) afinitetna hromatografija, hidrofobna interaktivna hromatografija i hidroksiapatitna hromatografija, navedenim redosledom, ic) druga anjonska jonoizmenjivačka hromatografija.Prijava sadrži još 17 patentnih zahteva.

Description

Predmetni pronalazak se odnosi na postupak proizvodnje rekombinantnog eritropoetina čiji je stepen čistoće posebno visok (^98%). Postupak obuhvata najmanje 5 hromatografskih stupnjeva prečišćavanja, i to najmanje dve anjonske jonoizmenjivačke hromatografije, najmanje jednu hidrofobnu interaktivnu hromatografiju, najmanje jednu afinitetnu hromatografiju i najmanje jednu hidroksiapatitnu hromatografiju. U poželjnim oblicima izvodjenja u postupku se odustaje od ekskluzione hromatografije i od svih vrsta hromatografije sa reverznom faznom. Pronalazak se posebno odnosi na postupak koji obuhvata sledeće hromatografske faze prečišćavanja, i to sledećim redosledom: i) prvu anjonsku jonoizmenjivačku hromatografiju, ii) afinitetnu hromatografiju, prvenstveno afinitetnu hromatografiju sa bojom kao matriksom, Hi) hidrofobnu interaktivnu hromatografiju iv} hidroksiapatitnu hromatografiju i v) drugu anjonsku jonoizmenjivačku hromatografiju.

Eritropoetin, skraćeno EPO, je glikoprotein koji stimuliše proizvodnju eritrocita u koštanoj srži. EPO se prvenstveno proizvodi u bubrezima i odatle preko krvotoka dospeva na ciljano mesto. Kod insuficijencije bubrega oštećeni bubrezi proizvode isuviše malo eritropoetina, ili ga uopšte ne proizvode, što ima za posledicu, da se iz matičnih ćelija koštane srži dobija isuviše malo eritrocita. Ta renalna anemija može se lečiti davanjem EPO u fiziološkim količinama koje stimulišu proizvodnju eritrocita u koštanoj srži. EPO koji se koristi u terapiji može se dobiti ili iz ljudskog urina ili se može proizvesti genetsko tehnološkim metodama. Pošto ljudsko telo sadrži samo slabe tragove eritropoetina, praktično nije moguće izolovati EPO za terapeutske svrhe iz prirodnog izvora. Zbog toga genetsko tehnološke metode pružaju jedinu ekonomsku mogućnost da se ta supstanca proizvede u većim količinama.

Rekombinantna proizvodnja eritropoetina postala je moguća od kada su 1984. godine identifikovani humani geni eritropoetina. Od početka 90ih godina razvijeni su razni lekovi koji sadrže humani eritropoetin, koji je proizveden na genetsko tehnološki način iz eukariotskih ćelija, pre svega iz CHO-ćelija (Chinese Hamster Ovary -ovarijum kineskog hrčka)). Proizvodnja rekombinantnog eritropoetina opisana je, na primer, u EP-A-0 148 605 i EP-A-205 564.

Rekombinantna proizvodnja eritropoetina obično se vrši u CHO-ćelijama domaćinima. Dok su one ranije kultivisane u medijumu za kulture, kome je dodavan fetalni teleći serum, a ponekad i govedji insulin, danas se kultivisanje redovno vrši u medij umu bez seruma i proteina. Na taj način se već pri kultivisanju smanjuje rizik od zagadjenja govedjim proteinima, govedjim virusima, govedjim DNK ili drugim neželjenim supstancama koje potiču od ranije korišćenih dodataka. Medijume bez seruma i proteina pogodne za kultivisanje eukariotskih ćelija nude razni snabdevači, na primer, Medium MAM-PF2 prodaje izmedju ostalog Bioconcept, Allschwil, Švajcarska, dok medijume DMEM i DMEM/F1.2 nudi, na primer, Invitrogen/Gibco, Eggenstein, Nemačka.

Razni hromatografski postupci prečišćavanja eritropoetina takodje su već poznati u stanju tehnike. EP-A-0 228 452 opisuje postupak filtracije biološki aktivnog eritropoetina iz tečnosti, koji obuhvata anjonsku jonoizmenjivačku hromatografiju i hromatografiju sa reverznom fazom.

U EP-A-0 267 678 opisuje se prečišćavanje eritropoetina proizvedenog u kulturi bez seruma, pri čemu se jedna za drugom vrše dijaliza, jonoizmenjivačka hromatografija, preparativna HPLC sa reverznom faznom i gel filtracija. Pri tome se stupanj gel filtracije može zameniti jonoizmenjivačkom hromatografijom. Takodje se predlaže da se pre (prve) jonoizmenjivačke hromatografije izvrši afinitetna hromatografija na koloni sa Tris Blue matriksom.

U EP-A-0 830 376 opisan je postupak prečišćavanja eritropoetina u kome se EPO suspenzije ostatka kulture u prvom stupnju hromatografskog prečišćavanja podvrgava afinitetnoj hromatografiji sa bojom kao matriksom. U drugom koraku sledi hromatografija na hidrofobnom matriksu na koju se nadovezuje hidroksiapatitna hromatografija. Posle toga sledi HPLC sa reverznom faznom i posle nje anjonska jonoizmenjivačka hromatografija kao poslednji stupanj hromatografij e.

EP-A-1 127 063 opisuje postupak prečišćavanja eritropoetina koji obuhvata sledeće stupnjeve: diferencijalnu precipitaciju, hidrofobnu interaktivnu hromatografiju, dijafiltraciju, anjonsku jonoizmenjivačku hromatografiju, katjonsku jonoizmenjivačku hromatografiju i ekskluzionu hromatografiju. Pojedinačni stupnjevi prečišćavanja su uEP-A-1 127 063 opisani navedenim redosledom. U jednoj varijanti postupak prečišćavanja obuhvata sledeće stupnjeve: diferencijalnu precipitaciju, hidrofobnu interaktivnu hromatografiju, dijafiltraciju, anjonsku jonoizmenjivačku hromatografiju, katjonsku jonoizmenjivačku hromatografiju, još jednu dijafiltraciju i ekskluzionu hromatografiju. U svakom slučaju, postupak u prvom stupnju predvidja precipitaciju i u nastavku centrifugiranje. Takodje, na kraju hromatografskog prečišćavanja obavezno je predvidjena gel filtracija.

Medjunarodna prijava WO-A-03/045996 opisuje postupak prečišćavanja EPO koji obuhvata anjonsku jonoizmenjivačku hromatografiju, posle nje hromatografiju sa reverznom fazom i još jednu anjonsku jonoizmenjivačku hromatografiju. Na drugu anjonsku jonozmenjivačku hromatografiju nastavlja se ekskluziona hromatografija u kojoj se koristi medijum za gel filtraciju.

Prečišćavanje eritropoetina je predmet i EP-A-0 428 267. Tu se hromatografija vrši na koloni sefaroze Q, a posle nje delimično slede hromatografija sa reverznom faznom i gel filtracija.

Predmetnim pronalaskom rešava se problem izvođenja postupaka prečišćavanja eritropoetina u kome se po mogućstvu ne koriste ni skupi stupnjevi hromatografije niti skupe metode u kojima pored toga može biti neophodna i upotreba neželjenih reagenasa. Eritropoetin dobijen postupkom prečišćavanja prema pronalasku treba da odgovara kriterijumima čistoće koje su definisali organi za izdavanje dozvola odn. Evropska farmakopeja. Naročito sadržaj proteina iz ćelije domaćina treba da bude ispod 100 ppm. Sadržaj DNK iz ćelije domaćina treba takodje da iznosi manje od 100 pg/mg eritropoetina. i konačno, eritropoetin dobijen prečišćavanjem u pogledu sastava izo-oblika treba da odgovara standardu definisanom od strane Evropske farmakopeje (Ph.Eur.; 01/2002:1316).

Takodje treba da se omogući da postupak funkcioniše bez hromatografije sa reverznom faznom, kao na primer RP-HPLC. Kod te vrste hromatografije obično se koriste reagensi kao što je acetonitril koji se kasnije teško uklanjaju sa proteina i koji bi mogli biti štetni za ljude. Drugi nedostatak RP-HPLC je što se često koriste skupi organski rastvarači koji povećavaju troškove prečišćavanja. Organski rastarači su pored toga ekološki sumijivi, a i rukovanje njima je teško i opasno. Sve u svemu, sredstva koja se koriste za hromatografiju sa reverznom fazom često su nepoželjna.

Očito je da se pred proizvod eritropoetina dobijen prečišćavanjem postavljaju visoki kriterijumi u pogledu čistoće i glikolizacije. Tako visoke zahteve može da ispuni samo postupak prečišćavanja prilagodjen specijalno eritropoetinu, koji je rezultat obimnih studija i analiza.

Ovaj problem kao i drugi problemi rešavaju se postupkom prečišćavanja navedenim u zahtevu 1. Poželjni primeri izvodjenja opisani su u zavisnim patentnim zahtevima.

Postupak se, prema tome, odnosi na postupak prečišćavanja eritropoetina iz jednog rastvora, posebno iz suspenzije ostatka kulture, u kome se sledeći stupnjevi a) do c) sprovode navedenim redosledom: u stupnju a) prva anjonska jonoizmenjivačka hromatografija, u stupnju b) afinitetna hromatografija, hidrofobna interaktivna hromatografija i hidroksiapatitna hromatografija, navedenim redosledom, i u koraku c) druga anjonska jonoizmenjivačka hromatografija.

0 postupku prečišćavanja prema pronalasku koriste se najmanje četiri različite hromatografske metode odvajanja, 1 to (i) metoda izmene jona na osnovu kompetitivne interakcije naelektrisanih jona, (ii) hidrofobna interakcija, koja se odlikuje time što se nepolarne površine proteina pri velikoj koncentraciji soli adsorbuju na malo hidrofobnim ligandima stacionarne faze, (iii) afinitet koji se zasniva na specifičnoj i reverzibilnoj adsorpciji jednog molekula na individualni partner za vezivanje koji je vezan za matriks, i (iv) hidroksiapatitna hromatografija zasnovana na korišćenju anorganskih kristala hidroksiapatita.

Ove navedene principe hromatografije na odgovarajući način razlikuju i stručni krugovi (vidi na pr. Bioanalytik, F. Lottspeich, H. Zorbas (izdavač), Heidelberg, Berlin, Spektrum Akađ,Verlag 1998). Ipak treba naglasiti da se kod afinitetne hromatografije obavezno predvidjene u stupnju b) ne radi o hidroksiapatitnoj hromatograf i ji. šta više, stupanj b) obuhvata i afinitetnu hromatografiju i hidroksiapatitnu hromatografiju.

U jednom poželjnom primeru izvodjenja postupak za prečišćavanje EPO obuhvata prvu anjonsku jonoizmenjivačku hromatografiju, afinitetnu hromatografiju, hidrofobnu interaktivnu hromatografiju, hidroksiapatitnu hromatografiju i drugu anjonsku jonoizmenjivačku hromatografiju, navedenim redosledom.

Poželjno je da afinitetna hromatografija bude afinitetna hromatografija sa bojom kao matriksom.

U jednom poželjnom primeru izvodjenja druga anjonska jonoizmenjivačka hromatografija se vrši uz jedan stupanj kiselog ispiranja kojim se bazni izo-oblici eritropoetina eluiraju značajnim sniženjem pH-vrednosti, čime se odvajaju od krajnjeg proizvoda. "Kiselo ispiranje' pri tome znači da se pH-vrednost pufera za ispiranje jasno kreće u kiselom području, poželjno izmedju 2,0 i 5,5, posebno povoljno izmedju 3,0 i 4,5, a najpoželjnije oko 4,0. Kao pufer posebno je pogodan natrijumacetatni pufer. Prema tome, ovaj stupanj hromatografije posebno je važan u pogledu glikolizacije krajnjeg proizvoda EPO.

Kultivisanje ćelija-domaćina koje proizvode eritropoetin vrši se u medij umu za kulture bez proteina i bez ćelijskih komponenti.

U poželjnim primerima izvodjenja ni u jednom stupnju prečišćavanja EPO ne izvodi se hromatografija sa reverznom fazom. I gel filtracija se, po mogućstvu, izbegava. Utvrdjeno je da eritropoetin dobijen postupkom prema pronalasku ima sadržaj proteina ćelija domaćina od < 100 ppm i sadržaj DNK ćelija domaćina od < 100 pg/mk. U stanju tehnike je posebno nedovoljno smanjenje koncentracije proteina ćelija domaćina predstavljalo Čest problem kod postupaka prečišćavanja. Postupak prema pronalasku tu nudi posebne prednosti, jer se postiže pouzdano smanjenje koncentracije ispod 100 ppm.

Eritropoetin dobijen postupkom prema pronalasku ima čistoću od najmanje 95%, poželjno 98%, a posebno poželjno od najmanje 99%, pri čemu se čistoća odredjuje analitičkom RP-HPLC metodom. Ali, RP-HPLC metoda služi samo za analizu, dok se u okviru prečišćavanja po mogućstvu ne primenjuje RP-HPLC metoda.

Aktivnost proteina bi trebalo da iznosi najmanje 100.000 IE/mg, poželjno najmanje 110.000 lE/mg, a posebno poželjno najmanje 120.000 IE/mg (Videti i Evropsku farmakopeju 01/2002:1316).

Pronalazak opisuje i farmaceutske preparate koji sadrže eritropoetin prečišćen prema pronalasku. EPO se uobičajeno formuliše u tečnom stanju i kao takav se daje intravenozno ili subkutano. Pogodni adjuvansi u tečnim formulacijama eritropoetina su, na primer, puferi, kao na primer fosfatni pufer, soli kao, na primer, natrijumhlorid, stabilizatori za EPO kao, na primer, aminokiseline, šećer i šećerni alkoholi, kao i tenzidi, kao, na primer, polisorbat 20/80. Primeri formulacija opisani su u EP-A-0 306 824, EP-A-0 607 156 i EP-A-0 909 564, videti i proizvode NeoRecormon<®>, Erypo<®>u CRVENOM SPISKU 2004.

Eritropoetin prečišćen prema pronalasku prvenstveno je rekombinantni humani eritropoetin proizveden u eukariotskim ćelijama. Poželjno je da se rekombinantni eritropoetin proizvodi u ćelijama sisara, a posebno poželjno u CHO-ćelijama, kao što je opisano, na primer, u EP-A-0 205 564 i EP-A-0 148 605. Fermentacija se vrši prema uobičajenim protokolima u medijumima za kulture koji se mogu nabaviti na tržištu.

Pod 'eritropoetinom' se u predmetnom pronalasku podrazumeva svaki protein koji je sposoban da stimuliše proizvodnju eritrocita u koštanoj srži i koji prema testu opisanom u Evropskoj farmakopeji (Ph.Eur.; 01/2002:1316) jasno može da se identifikuje kao eritropoetin (Odredjivanje aktivnosti kod miševa sa policitemijom ili normocitemijom) . Eritropoetin može biti prirodni humani eritropoetin ili jedna varijanta prirodnog humanog eritropoetina sa jednom ili više supstitucija, delecija ili ađicija amino kiselina. Eritropoetin sadržan u formulaciji prema pronalasku takodje može biti takozvani PEGilovani eritropoetin, konjugat u kome se protein nalazi, na primer, u konjugovanom obliku sa polimerima, kao na primer polialkilenglikolima.

Pod 'prečišćavanjem eritropetina' ili 'obogaćivanjem eritropoetina' se u predmetnom pronalasku podrazumeva da se protein eritropoetin đobija iz smeše u vrlo čistom obliku, tj. eritropoetin sadržan u smeši se obogaćuje sve dok osim eritropoetina u smeši nema više drugih proteina. Hromatografski principi korišćeni u postupku prema pronalasku poznati su stručnjacima, u svakom slučaju su opširno opisani u postojećim godišnjacima ili protokolima snabdevača hromatografskim matriksima. Pogodni matriksi i informacije kao i uputsva za izvodjenje različitih hromatografija mogu se naći, na primer, u katalogu proizvoda i informacijama o proizvodima firme Amersham Biosciences (videti i www. amershambiosciences. com) ili u katalogu proizvoda firme Bio-Rad (videti i www. bio-rad. com).

Anjonske jonoizmenjivačke hromatografije mogu se izvoditi sa uobičajenim jonoizmenjivačkim smolama ili membranama koje se mogu nabaviti na tržištu. Tipične jonoizmenjivačke smole, koje se mogu koristiti, obuhvataju funkcionalne grupe kao dietilaminoetil (DEAE), ovde treba pomenuti DEAE-sefarozu (Amersham Biosciences), Macroprep DEAE (Bio-Rad), Fractorgel EMD DEAE (Merck); kvarternerni aminoetil (QAE), tu treba navesti Tovopearl OAE (Toyo Biosep); kvarternerni amonijum, tu treba pomenuti Q sefarozu XL (Amersham Biosciences), Q sefarozu FF (Amersham Biosciences), Resource Q (Amersham Biosciences), Source 30 Q (Amersham Biosciences), Macro Prep High Q (Bio-Rad), Tovopearl SuperQ(Toyo Biosep); dimetilaminoetil (DMAE), tu treba pomenuti Fractogel EMD DMAE (Merck; trimetilaminoetil (TMAE), tu treba pomenuti Fractogel EMD TMAE (Merck); Sartobind membranski adsorber (MA) Q100 (Sartorius).

Poželjni anjonski izmenjivači su smole sa kvarternernim ili tercijarnim amonijum ligandima. Tako se, na primer, u jednom poželjnom primeru izvodjenja postupka prema pronalasku u prvoj i drugoj anjonskoj jonoizmenjivačkoj hromatografiji koriste Q Sepharose XL ili Source 30 Q (oba se mogu nabaviti od firme Amersham Biosciences). Posebno je poželjno da se u prvoj anjonskoj jonoizmenjivačkoj hromatografiji koristi Q Sepharose XL, a u drugoj anjonskoj jonoizmenjivačkoj hromatografiji Source 30 Q.

Afinitetna hromatografija takodje može da se izvodi sa uobičajenim smolama koje se mogu nabaviti na tržištu. Ovde kao primere treba navesti Dye Sepharose, Heparin Sepharose, HiTrap Blue HP-kolone (Cibacron Blue F3G-A), Blue Sepharose

(Cibacron Blue F3G-A), peptid/ligand afinitetne smole, afinitetne smole sa antitelima, lectin afinitetne smole, afinitetnu hromatografiju na imobilisanoj DNK, odnosno na imobilisanim nukleotiđima i na grupnospecifičnim adsorpcionim sredstvima kao na primer na želatinu vezanom za agarozu.

Poželjno je da to bude afinitetna hromatograf i ja sa bojom, posebno da se koristi Blue Sepharose (na pr. Blue Sepharose 6 Fast Flow firme Amersham Biosciences). Ali, pogodni su i drugi afinitetni matriksi sa bojom, kao na primer proizvod DyeMatrex firme Millipore.

I hidrofobna interaktivna hromatografija se može izvoditi sa uobičajenim matriksima. Pogodni su matriksi kao butil, fenil, propil ili oktil sefaroza (Amersham Biosciences), Macro-Prep Methyl ili t-Butyl (Bio-Rad) i Fractogel EMD sa propil ili fenil ligandima (Merck). Poželjno je da se koristi butil sefaroza (na pr. Butyl Sepharose 4 Fast Flow firme Amersham Biosciences).

Za hidroksiapatitnu hromatografiju se mogu koristiti uobičajeni hidroksiapatitni materijali. Hiđroksiapatit je jedan oblik kalcijumfosfata. Poželjno je da se koristi CHT keramički hiđroksiapatit (Bio-Rad), a posebno poželjno CHT keramički hiđroksiapatit tip I (Bio-Rad).

Izo-oblici krajnjeg proizvoda EPO dobijeni postupkom prema pronalasku, a sigurno posle druge anjonske jonoizmenjivačke hromatografije, mogu se porediti sa BRP-EPO standardom (videti Evropsku farmakopeju 01/2002:1316).

Sledeći primeri treba da objasne pronalazak, a da ga pri tome ne ograniče.

Primeri:

EPO se proizvodi u CHO-ćelijama. Fermentacija se vrši prema standardizovanim postupcima kao što su opisani u patentnoj i naučnoj literaturi za eukariotske, a posebno CHO ćelije. Kultivisanje se vrši u medijumu za kulture u kome nema proteina niti životinjskih komponenti (na pr. MAM-PF2, koji se može nabaviti od firme Bioconcept, Allschwill, Švajcarska, i to po preporuci snabdevača). Sakupljanje se vrši posle faze proizvodnje koja traje maksimalno sedam dana. Pri tome se ćelije odvajaju pomoću dubinskog filtera a zatim i 0,2 um filtracijom. Alternativno ćelije se mogu ukloniti centrifugiranjem. Filtrat bez ćelija se zatim pomoću ultrafiltracije koneentriše za faktor 10 i đijafiltrira naspram fosfatnog pufera. Dijafiltracija služi za smanjenje provodijivosti ispod 5 mS/cm da bi se proteinski rastvor pripremio za prvi hromatografski stupanj, takozvani stupanj hvatanja(Capture).

Pregled postupaka prečišćavanja

1. stupanj hromatografije (hvatanje, IEX 1)

Kao stupanj hvatanja izvodi se jonoizmenjivačka hromatografija (IEX) na Q Sepharose XL. U tom prvom stupnju prečišćavanja koneentriše se aktivna materija eritropoetin. Ovaj stupanj pored toga služi i za prevodjenje aktivne materije u stabilniji oblik za skladištenje.

Ispiranje se obavlja sa 20 mM natrijumsulfatom, pH 7,5, eluiranje sa 0,3 M natrijumhloridom na pH 7,5. 0 nastavku anjonske jonoizmenjivačke hromatografije može da se izvrši 0,2 pm filtracija.

2. stupanj hromatografije (afinitetna}

U sledećem stupnju izvodi se afinitetna hromatografija na Blue Sepharose 6FF (nabavljene od Amersham Biosciences). Posle promene pufera na koloni i dodatnog ispiranja vrši se eluiriranje u 1 M natrijumhloridu. Eluat se za sleđeći stupanj, hidrofobnu interaktivnu hromatografiju, meša sa puferisanim rastvorom soli i izopropanolom.

3. stupanj hromatografije (HIG)

U sledećem stupnju se eluat pomešan sa puferisanim rastvorom soli i izopropanolom nanosi na kolonu za hidrofobnu interaktivnu hromatografiju (HIC; Butyl Sepharose 4 FF, nabavljeni od Amersham Biosciences). Posle ispiranja (2 M natrijumhlorid u 10% izopropanolu) obavlja se eluiranje aktivne materije sa 0,75 M natrijumhloridom u 23% izopropanolu (v(v).

4. stupanj hromatografije (hiđroksiapatit)

Zatim se eluat iz hidrofobne interaktivne hromatografije podvrgava hidroksiapatitnoj hromatografiji (CHT-I Ceramic Hydroxyapatite, nabavljen od firme Bio-Rad). Prethodno se može razblažiti. Poželjno je da se razblaživanje vrši tako što se eluat HIC-kolone unosi direktno u Tris-pufer (20 mM tris/HCI, 5 mM CaCl2, pH 6,9). Poželjno je da konačna koncentracija izopropanola posle razblaživanja iznosi 9%. Zatim se taj rastvor nanosi direktno na kolonu hiđroksiapatita.

Nakon ispiranja sa 10 mM kalijumfosfatnim puferom obavlja se eluiranje eritropoetina. pH vrednost eluata podešava se pomoću HC1 na pH 7,4.

5. stupanj hromatografije (IEX 2)

Za sledeći i poželjno poslednji stupanj hromatografije rastvor, koji sadrži EPO, se nanosi na jonoizmenjivački matriks (Source 30Q od Amersham Biosciences). Ovaj stupanj hromatografije obuhvata kiselo ispiranje sa natrijumacetatom (pH 4,0) da bi se smanjili alkalni izo-oblici aktivne materije. Nakon podešavanja pH vrednosti drugim ispiranjem na pH 7,4 obavlja se eluiranje eritropoetina sa 200 mM natrijumhloridom.

Posle toga se ponovo može obaviti 0,2 um filtracija u okviru filtracije virusa. Rastvor aktivne materije naziva se glavna masa ('bulk') i on se pomoću tečnog azota može liofilizirati i zatim skladištiti na -80° C.

Dobijeni eritropoetin se može formulisati u oblik tečne formulacije zajedno sa uobičajenim farmaceutski prihvatij ivim ađjuvantima.

Detalji pojedinačnih hromatogrfskih stupnjeva

1. Prva anjonska jonoizmenjivačka hromatografija (stupanj hvatanja)

Ekvilibracija Q Sepharose XL-matriksa (0,6 L ± 0,05 L) izvodi se sa 20 mM natrijumfosfatom, pH 7,5 (sve dok posle kolone pH-vređnost ne iznosi 7,5 ± 0,3, a provodijivost < 5 mS/cra). Zatim se nanose uzorci. Posle toga se kolona ispira puferom za ekvilibrisanje, tj. 20 mM natrijumfosfatom, pH 7,5. Za eluiranje, koje sledi nakon toga, koriste se 20 mM natrijumfosfat, 300 mM NaCl, pH 7,5.

U okviru stupnja hvatanja se po pravilu izbegava kiselo ispiranje.

Čistoća eluiranog eritropoetina je > 65%, mereno sa RP-HPLC.

U nastavku stupnja hvatanja može se obaviti 0,2 um filtracija. Poželjno je da se eluat tokom eluiranja sa natrijumhloridom pumpa direktno kroz jedan 0,2 pm filter.

2. Blue Sepharose - afinitetna hromatografija

Ekvilibracija kolone izvodi se sa 20 mM natrijumfosfatom, 0,1 M NaCl, pH 7,5. Zatim se uzorak dobijen u stupnju hvatanja nanosi na kolonu, pri čemu ona, radi pripreme za afinitetnu hromatografiju, prethodno može da se razblaži sa 20 mM natrijumfosfatom, pH 7,5.

Posle toga se vrši jedno ispiranje sa 20 mM Tris-HCI, 0,1 M NaCl, pH 7,5. Drugo ispiranje vrši se sa 20 mM Tris/HCI, 5 mM Tris/HCI, 5mM CaCl2, 1 M NaCl, pH 7,5.

Blue Sepharose - afinitetna hromatografija izmedju ostalog služi za smanjivanje koncentracije proteina ćelija domaćina. Sadržaj proteina ćelija domaćina obično se odredjuje pomoću ELISA. Te i druge strategije za analizu proteina ćelija domaćina opisane su na primer u Hoffman K.

(2000) Biopharm, Vol.13, br. 6, str.38-45.

Prinos eritropoetina, izmeren pomoću RP-HPLC, posle Blue Sepharose- afinitetne hromatografije iznosi najmanje 65%, poželjno najmanje 70%. Čistoća, takodje izmerena pomoću RP-HPLC, iznosi najmanje 90%, poželjno najmanje 95%.

3. Hidrofobna interaktivna hromatografija (HIC)

Hidrofobna interaktivna hromatografija se izvodi sa Butyl Sepharose 4 FF kao matriksom. Taj matriks je fizički stabilan i dozvoljava velike brzine protoka.

Koncentracija soli (2 M NaCl) potrebna za vezivanje EPO podešava se mešanjem eluata Blue Sepharose 6 FF sa puferom koji sadrži 4 M NaCl. Uzorak se dodatno podešava na 10% izopropanola (v/v).

Provodijivost uzorka predvidjenog za punjenje HIC kolone po mogućstvu treba da iznosi izmedju 95 i 110 mS/cm. Provodljivost pufera za ekvilibraeiju bi takodje trebalo da se kreće u tom opsegu.

HIC kolona se ekvilibrira sa 20 mM Tris/HCI, 2 M NaCl, 10 % izopropanola, pH 7,5. Nakon nanošenja uzorka vrši se ispiranje puferom za ekvilibraeiju. Eluiranje se izvodi sa sledećim puferom za eluiranje: 20 mM Tris/HCI, 5mM CaCl2, 0,75 NaCl, 23% (v/v) izopropanol, pH 6,9. Eluaciona zapremina iznosi 1 zapreminu kolone.

Pokazalo se da u okviru postupka prečišćavanja, koji je ovde detaljno opisan, koncentracija izopropanola od 23%

(v/v) u puferu za eluiranje dovodi do optimalnog eluiranja eritropoetina uz istovremeno minimizirane gubitke.

Da bi se izbegla precipitacija eritropoetina usled dugog delovanja izopropanola (23%, v/v), eluat se tokom eluiranja unosi direktno u Tris-pufer. Koncentracija izopropanola konačno iznosi 9%(v/v).

Prinos eritropoetina posle ovog stupnja hromatografije iznosi najmanje 65%, poželjno najmanje 70%, a naročito poželjno najmanje 80%. Čistoća iznosi najmanje 92%, poželjno najmanje 95%.

4. Hidroksiapatitna hromatografija

Eluat posle hromatograf i je na Butyl Sepharose 4 FF se bez daljeg kondicioniranja može naneti na hidroksiapatitnu kolonu (HAP). Zbog elucionih uslova hidrofobne interaktivne hromatografije za ekvilibraeiju kolone je potreban Tris-pufer za ekvilibraeiju koji sadrži izopropanol. Posle punjenja kolone izopropanol se uklanja ispiranjem.

Puferi, koji se koriste za stupanj hidroksiapatitne hromatografije su sledeći:

Pufer za ekvilibraeiju: 20 mM Tris/HCI, 5mM NaCl2,

0,25 M NaCl, 9% izopropanol, pH 6,9.

Prvo ispiranje se izvodi sa puferom za ekvilibraeiju, drugo ispiranje sa: 10 mM Tris/HCI, 5mM CaCl2, pH 6,8. Pufer za eluciju je kako sledi: lOmM Tris/HCI, 0,5 mM CaCl2, 10 mM K2HP04, pH 6,8

Prinos stupnja hidroksiapatitne hromatografije iznosi najmanje 65%, poželjno najmanje 70%. Čistoća dobijenog EPO iznosi najmanje 97%, poželjno 98%.

Sve u svemu, hromatografija pomoću hidroksiapatita služi za uklanjanje izopropanola iz stupnja hidrofobne interaktivne hromatografije. Eluiranje EPO iz hidroksiapatitne kolone najbolje se može izvesti gradijentnom elucijom (od 0 do 10 mM kalijumfosfata). Ali, može se koristiti i linearni gradijent (na pr. od 0 do 40 mM kalujumfosfata).

U jednom poželjnom primeru izvodjenja postupka prema pronalsku u nastavku hidroksiapatitne hromatografije se vrši filtracija virusa. Ta filtracija virusa može se izvesti, na primer, sa Planova 15N-filterom Asahi Kasei grupe. Membrana filtera ima pore veličine 15 nm i ona obezbedjuje i smanjenje koncentracije poliovirusa i parvovirusa.

5. Druga jonoizmenjivačka hromatografija

Kao poslednji stupanj prečišćavanja izvodi se jonoizmenjivačka hromatografija pomoću Source 30 Q. Za ovaj stupanj karakteristično je pre svega jedno kiselo ispiranje, kojim se alkalni izo-oblici eritropoetina eluiraju snižavanjem pH vrednosti i tako odvajaju od krajnjeg proizvoda. Prema tome, ovaj stupanj hromatografije je posebno značajan u pogledu glikolizacije krajnjeg proizvoda EPO.

Kao puferski sistem za drugi jonoizmenjivački stupanj prečišćavanja eritropoetina koristi se fosfatni pufer. Posle nanošenja uzorka i prvog ispiranja vrši se 'kiselo' ispiranje. U tim uslovima eluiraju alkani izo-oblici eritropetina.

Ekvilibracija i prvo ispiranje izvode se sa 10 mM natrijumfosfata, pH 7,4. Kiselo ispiranje vrši se sa puferom za ispiranje koji sadrži 20 mM natrijumacetata i ima pH-vrednost od 4,0. Zapremina ispiranja kiselog ispiranja iznosi 2 zapremine kolone.

Po pravilu se zatim ponovo vrši ispiranje fosfatnim puferom, čime se pH-vređnost povećava na 7,4. Elucija se izvodi sukcesivno, sa gradijentom od 0 do 0,2 M NaCl. Pogodan je, medjutim, i linerani gradijent, na primer od 0 do 0,5 M NaCl.

Pufer za eluciju ima sledeći sastav: 20 mM natrijumfosfat, 0,2 M NaCl, pH 7,4. Elucija se izvodi na 1,5 zapremine kolone.

Prinos iznosi najmanje 65%, poželjno najmanje 70%, a posebno poželjno najmanje 75%. Čistoća iznosi najmanje 98%, poželjno najmanje 99%.

Konačno dobijeni EPO-proizvod ima biološku aktivnost od Ž100.000 IU/mg u bio-testu, sadržaj DNK od £ 98%, sadržaj ćelija domaćina (HCP, host cell protein) od < 100 ppm i izo-oblik (u CZE) koji ispunjava zahteva Evropske farmakopeje.

Uostalom, sve hromatografije na koloni se vrše u skladu sa preporukama i protokolima snabdevača matriksa, odnosno kolona (na pr. u pogledu brzine protoka, zapremine kolone koja se koristi za ispiranje, odnosno elucije, prečnika kolone i visine sloja u koloni, itd.).

Claims (18)

1. Postupak za obogaćivanje eritropoetina dobijenog kultivisanjem eukariotskih ćelija domaćina u medijumu za kulture u proteinskoj smeši, pri čemu se sledeći stupnjevi a)-c) izvode navedenim redosledom: a) prva anjonska jonoizmenjivačka hromatografija, b) afinitetna hromatografija, hidrofobna interaktivna hromatografija i hidroksiapatitna hromatografija, navedenim redosledom, i c) druga anjonska jonoizmenjivačka hromatografija.

2. Postupak prema zahtevu 1, u kome je afinitetna hromatografija izvedena kao afinitetna hromatografija sa bojom.

3. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, u kome druga anjonska jonoizmenjivačka hromatografija obuhvata stupanj kiselog ispiranja.

4. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, koji dodatno obuhvata najmanje jednan stupanj filtracije.

5. Postupak prema zahtevu 4, u kome se filtracija izvodi posle poslednjeg hromatografskog prečišćavanja u stupnju b).

6. Postupak prema zahtevu 4 ili 5, u kome se jedna filtracija izvodi posle druge anjonske jonoizmenjivačke hromatografije.

7. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, u kome je proteinska smeša filtrat medijuma za kulture, koji ne sadrži ćelije domaćina, i koji se pre prve anjonske jonoizmenjivačke hromatografije podvrgava dijafiltraciji.

8. Postupak prema zahtevu 7, u kome ,se filtrat, koji ne sadrži ćelije domaćina, pre dijafiltracije podvrgava ultrafiltracij i.

9. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, u kome medij um za kulture ne sadrži proteine niti životinjske komponente.

10. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu postupak ne obuhvata hromatografiju sa reverznom faznom.

11. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu postupak ne obuhvata gel filtracionu hromatografiju.

12. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu postupak ne obuhvata precipitaciju proteina.

13. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu postupak ne obuhvata nikakve druge hromatografske stupnjeve prečišćavanja.

14. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, u kome obogaćeni eritropoetin posle druge anjonske jonoizmenjivačke hromatografije ima sadržaj proteina ćelije domaćina < od 100 ppm.

15. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, u kome obogaćeni eritropoetin posle druge anjonske jonoizmenjivačke hromatografije ima sadržaj DNK ćelije domaćina < od 100 pg/mg.

16. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, u kome obogaćeni eritropoetin posle druge anjonske jonoizmenjivačke hromatografije ima čistoću £ 98%, izmerenu sa RP-HPLC.

17. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, u kome obogaćeni eritropoetin posle druge anjonske jonoizmenjivačke hromatografije ima aktivnost ^ 100.0001.E./mg.

18. Postupak za proizvodnju tečne formulacije eritropetina, koji obuhvata sledeće stupnjeve: i) obogaćivanje eritropoetina proizvedenog kultivisanjem eukariotskih ćelija domaćina u medij umu za kulture, u smeši proteina, u kome se sledeći stupnjevi izvode navedenim redosledom: a) prva anjonska jonoizmenjivačka hromatografija, b) afinitetna hromatografija, hidrofobna interaktivna hromatografija i hidroksiapatitna hromatografija, navedenim redosledom, i c) druga anjonska jonoizmenjivačka hromatografij a, i (ii) formulisanje eritropoetina obogaćenog u stupnju i) sa farmaceutski prihvatljivim adjuvantirna, kao što su puferi, soli i stabilizatori, u tečnu formulaciju.