ES2535457T3

ES2535457T3 - Péptidos antimicrobianos novedosos

Info

Publication number: ES2535457T3
Application number: ES09731331.6T
Authority: ES
Inventors: Klaus Brandenburg
Original assignee: Forschungsinstitut Borstel Institut fuer Experimentelle Biologie und Medizin
Current assignee: Forschungszentrum Borstel Leibniz Lungenzentrum FZB
Priority date: 2008-04-09
Filing date: 2009-04-07
Publication date: 2015-05-11
Anticipated expiration: 2029-04-07
Also published as: US20110105416A1; WO2009124721A1; EP2108372A1; JP5550634B2; EP2271356B1; US8633164B2; EP2271356A1; JP2011520422A

Abstract

Un péptido de estructura lineal, no cíclica que consiste en o comprende de 17 a 23 aminoácidos, en donde los aminoácidos en posiciones 1 a 23, contados desde el extremo N, son como sigue (1) G, S o falta; (2) C o falta; (3) K o R; (4) K o R; (5) Y, W o F; (6) K o R; (7) K o R; (8) F, W o L; (9) K o R; (10) K o L o falta; (11) W, L o F; (12) K o R; (13) F, Y o C; (14) K o R; (15) G o Q; (16) K o R; (17) F, L o W; (18) F o W; (19) F, L o W; (20) W o F; (21) C o falta; (22) F o G o falta (23) G o falta.

Description

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El experto en la materia apreciará fácilmente que más de un ácido nucleico puede codificar el péptido de la presente invención debido a la degeneración del código genético. La degeneración se produce porque un código de bases en triplete compuesto de cuatro bases designa cada uno de los 20 aminoácidos proteinogénicos y un codón de terminación. Las posibles 43 posibilidades para bases en tripletes dan 64 posibles codones, lo que significa que debe existir alguna degeneración. Como resultado, algunos aminoácidos están codificados por más de un triplete, es decir, por hasta seis. La degeneración principalmente surge de alteraciones en la tercera posición en un triplete. Esto significa que moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia diferente, pero que aún codifican el mismo polipéptido están dentro del ámbito de la presente invención.

Además, la invención se refiere a un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la invención.

Preferiblemente, el vector es un plásmido, cósmido, virus, bacteriófago u otro vector usado convencionalmente, por ejemplo, en ingeniería genética.

La molécula de ácido nucleico de la presente invención se puede insertar en varios vectores comercialmente disponibles. Los ejemplos no limitantes incluyen vectores plásmidos procariotas, tal como la serie pUC, pBluescript (Stratagene), la serie pET de vectores de expresión (Novagen) o pCRTOPO (Invitrogen), lambda gt11, pJOE, la serie pBBR1-MCS, pJB861, pBSMuL, pBC2, pUCPKS, pTACT1 y vectores compatibles con expresión en células de mamífero como pREP (Invitrogen), pCEP4 (Invitrogen), pMC1neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2neo, pBPV-1, pdBPVMMTneo, pRSVgpt, pRSVneo, pSV2-dhfr, pIZD35, el vector de expresión de ADNc de Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogene), pSPORT1 (GIBCO BRL), pGEMHE (Promega), pLXIN, pSIR (Clontech), pIRES-EGFP (Clontech), pEAK-10 (Edge Biosystems) pTriEx-Hygro (Novagen) y pClNeo (Promega). Los ejemplos para vectores plásmidos adecuados para Pichia pastoris comprenden, por ejemplo, los plásmidos pAO815, pPIC9K y pPIC3.5K (todos de Invitrogen).

La molécula de ácido nucleico de la presente invención referida anteriormente también se puede insertar en vectores de modo que se genere una fusión traduccional con otra molécula de ácido nucleico. Las otras moléculas de ácido nucleico pueden codificar una proteína que puede, por ejemplo, aumentar la solubilidad y/o facilitar la purificación de la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico de la invención. Los ejemplos no limitantes incluyen pET32, pET41, pET43. Además, la otra molécula de ácido nucleico puede codificar un péptido o proteína que permita la compensación de las propiedades tóxicas de los péptidos antimicrobianos de la invención que de otra manera dañarían o destruirían la célula huésped (véase posteriormente).

Los vectores también pueden contener un polinucleótido expresable que codifica una o más chaperonas para facilitar el correcto plegamiento de la proteína. Los huéspedes de expresión bacterianos adecuados comprenden, por ejemplo, cepas derivadas de BL21 (tal como BL21(DE3), BL21(DE3)PlysS, BL21(DE3)RIL, BL21(DE3)PRARE) o Rosetta®.

Para técnicas de modificación de vectores, véase Sambrook y Russel (2001). Generalmente, los vectores pueden contener uno o más orígenes de replicación (ori) y sistemas de herencia para clonación o expresión, uno o más marcadores para la selección en el huésped, por ejemplo, resistencia a antibióticos, y uno o más casetes de expresión. Los orígenes de replicación adecuados incluyen, por ejemplo, los orígenes de replicación Col E1, el vírico SV40 y el M13.

Las secuencias codificantes insertadas en el vector se pueden, por ejemplo, sintetizar por métodos estándar, o aislar de fuentes naturales. La ligación de las secuencias codificantes a los elementos reguladores transcripcionales y/o otras secuencias que codifican aminoácidos se puede llevar a cabo usando métodos establecidos. Los expertos en la materia conocen bien los elementos reguladores transcripcionales (partes de un casete de expresión) que aseguran la expresión en células procariotas o eucariotas. Estos elementos comprenden secuencias reguladoras que aseguran el inicio de la transcripción (por ejemplo, codón de iniciación de la traducción, promotores, potenciadores y/o aisladores), sitios internos de entrada a los ribosomas (IRES) (Owens et al., 2001) y opcionalmente señales de poli-A que aseguran la terminación de la transcripción y estabilización del transcrito. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores transcripcionales así como traduccionales, y/o regiones de promotor asociadas naturalmente o heterólogas. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico de la invención está operativamente unida a tales secuencias de control de la expresión lo que permite la expresión en células procariotas o eucariotas. El vector puede comprender además secuencias de nucleótidos que codifican péptidos señal como elementos reguladores adicionales. Tales secuencias las conoce el experto en la materia. Además, dependiendo del sistema de expresión usado, se pueden añadir secuencias líder capaces de dirigir el polipéptido expresado a un compartimento celular a la secuencia codificante de la molécula de ácido nucleico de la invención. Tales secuencias líder se conocen bien en la técnica. Vectores específicamente diseñados permiten el traslado de ADN entre diferentes huéspedes, tal como bacterias-células fúngicas o bacterias-células animales.

El vector es un vector de expresión.

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proteína recombinante de la invención se puede expresar en líneas celulares estables que contienen la construcción génica integrada en un cromosoma.

Los medios y condiciones de cultivo apropiados para las células huéspedes descritas anteriormente se conocen en la técnica.

Alternativamente, la célula huésped es una célula aislada. Tal célula se ha aislado de un tejido de un organismo multicelular o forma un protozoo. En el caso de células eucariotas, la célula huésped de la presente invención se ha separado del tejido donde normalmente se encuentra. Las células encontradas en cultivo celular, preferiblemente en cultivo celular líquido, son células aisladas según la presente invención.

Como se ha mencionado anteriormente, los vectores de la presente invención presentes o expresados en una célula huésped preferiblemente comprenden la molécula de ácido nucleico que codifica el péptido de la presente invención fusionado a una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido o polipéptido capaz de compensar el efecto potencialmente tóxico del péptido de la invención para la célula huésped si el péptido solo fuera tóxico para la célula.

En una forma de realización adicional, la invención se refiere a un método de producir el péptido de la invención que comprende cultivar la célula huésped de la invención y recoger el péptido producido.

Existe un gran número de métodos adecuados en la técnica para producir péptidos en huéspedes apropiados. Si el huésped es un organismo unicelular tal como un procariota o una célula de mamífero o insecto, el experto en la materia puede volver a una variedad de condiciones de cultivo. Convenientemente, la proteína producida se recoge del medio de cultivo, lisados de las células cultivadas o de membranas (biológicas) aisladas por técnicas establecidas. Un método preferido implica la síntesis de secuencias de ácido nucleico por PCR y su inserción en un vector de expresión. Posteriormente una célula huésped adecuada se puede transfectar o transformar, etc., con el vector de expresión. Después de ello, la célula huésped se cultiva para producir el péptido deseado, que se aísla y purifica.

Los medios y condiciones de cultivo apropiadas para las células huéspedes descritas anteriormente se conocen en la técnica. Por ejemplo, las condiciones adecuadas para cultivar bacterias son hacerlas crecer con aireación en medio Luria Bertani (LB). Para aumentar el rendimiento y la solubilidad del producto de expresión, el medio puede estar tamponado o suplementado con aditivos adecuados que se sabe aumentan o facilitan ambos. E. coli se puede cultivar desde 4 hasta aproximadamente 37ºC, la temperatura exacta o secuencia de temperaturas depende de la molécula que se va a sobreexpresar. En general, el experto en la materia también sabe que estas condiciones se pueden tener que adaptar a las necesidades del huésped y los requisitos del péptido o proteína expresados. En el caso de un promotor inducible que controla el ácido nucleico de la invención en el vector presente en la célula huésped, la expresión del polipéptido se puede inducir por adición de un agente inductor apropiado. El experto en la materia conoce protocolos y estrategias de expresión adecuados.

Dependiendo del tipo celular y sus requisitos específicos, el cultivo de células de mamífero, por ejemplo, se puede llevar a cabo en medio RPMI o DMEM que contiene SFT al 10% (v/v), L-glutamina 2 mM y penicilina/estreptomicina 100 U/ml. Las células se pueden mantener a 37ºC en una atmósfera de CO2 al 5%, saturada con agua.

Los medios adecuados para el cultivo de células de insecto son, por ejemplo, TNM + SFT al 10% o medio SF900. Las células de insecto habitualmente se hacen crecer a 27ºC como cultivo de adhesión o en suspensión.

El experto en la materia conoce bien protocolos de expresión adecuados para células eucariotas y se pueden recuperar, por ejemplo, de Sambrook, 2001.

Como se ha descrito anteriormente, cuando se produce el péptido de la invención en una célula huésped, el vector de expresión preferiblemente codifica un péptido de fusión o polipéptido de fusión si el péptido producido ejerce actividad tóxica hacia la célula huésped seleccionada. Esto también es cierto en particular para bacterias que producen LPS.

El péptido de fusión o polipéptido de fusión expresado se tiene que procesar para cortar el péptido o polipéptido compensador pero no deseado fusionado al péptido de la invención. Esto puede tener lugar en cualquier fase del proceso de purificación después de cultivar la célula huésped. Los métodos adecuados para cortar la parte indeseada son bien métodos químicos que usan, por ejemplo, bromuro de cianógeno que corta en residuos de metionina o N-clorosuccinimida que corta en residuos de triptófano. Alternativamente, se pueden usar métodos enzimáticos que en general son más moderados que los métodos químicos. Las proteasa ejemplares adecuadas para el corte son específicas para una cierta secuencia de aminoácidos e incluyen factor Xa o proteasa TEV.

Un método alternativo para producir el péptido de la invención es la traducción in vitro de ARNm. Los sistemas de expresión sin células adecuados para su uso según la presente invención incluyen lisado de reticulocitos de conejo, extracto de germen de trigo, membranas microsómicas pancreáticas caninas, extracto S30 de E. coli, y sistemas acoplados de transcripción/traducción tal como el sistema TNT (Promega). Estos sistemas permiten la expresión de

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péptidos o proteínas recombinantes tras la adición de vectores de clonación, fragmentos de ADN, o secuencias de ARN que contienen regiones codificantes y elementos promotores apropiados.

Los métodos de aislamiento del péptido producido se conocen bien en la técnica y comprenden, sin limitación, pasos de método tal como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel (cromatografía de exclusión molecular), cromatografía de afinidad, cromatografía líquida de alta presión (HPLC), HPLC de fase reversa, electroforesis en gel en disco o inmunoprecipitación (véase, por ejemplo, Sambrook, 2001).

Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el péptido o el péptido fusionado (es decir, el péptido de la invención fusionado a otro péptido o un polipéptido) de la invención, la molécula de ácido nucleico de la invención, el vector de expresión de la invención o la célula huésped de la invención.

Según la presente invención, el término “composición farmacéutica” se refiere a una composición para la administración a un paciente, preferiblemente un paciente humano. La composición farmacéutica de la invención preferiblemente comprende el péptido de la invención. Opcionalmente, puede comprender moléculas adicionales capaces de alterar las características del péptido de la invención mediante las mismas, por ejemplo, estabilizando, modulando y/o activando su función. La composición puede estar forma sólida, líquida o gaseosa y puede estar, entre otras, en forma de (un) polvo(s), (un) comprimido(s), (una) solución(es), o (un) aerosol(es). La composición farmacéutica de la presente invención puede, opcional y adicionalmente, comprender un soporte farmacéuticamente aceptable. Mediante “soporte farmacéuticamente aceptable” se quiere decir un relleno, diluyente, material encapsulante o formulación auxiliar de cualquier tipo no tóxica sólida, semisólida o líquida. Los ejemplos de soportes farmacéuticamente aceptables se conocen bien en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tal como emulsiones aceite/agua, varios tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, solventes orgánicos incluyendo DMSO, etc. Las composiciones que comprenden tales soportes se pueden formular por métodos convencionales bien conocidos. Estas composiciones farmacéuticas se pueden administrar al sujeto a una dosis adecuada. La pauta de dosis la determinará el médico y los factores clínicos. Como se sabe bien en las artes médicas, las dosis para cualquier paciente depende de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, área de superficie corporal, edad, el compuesto particular que se administra, sexo, tiempo y vía de administración, salud general y otros fármacos que se administran al mismo tiempo. La cantidad terapéuticamente eficaz para una situación determinada se determinará fácilmente por experimentación rutinaria y está dentro de las capacidades y juicio del clínico o médico habitual. Generalmente, la pauta como una administración regular de la composición farmacéutica debe estar en el intervalo de 1 μg a 5 g unidades por día. Sin embargo, un dosis más preferida podría estar en el intervalo de 0,01 mg a 100 mg, incluso más preferiblemente de 0,01 mg a 50 mg y lo más preferiblemente de 0,01 mg a 10 mg por día.

La composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar, por ejemplo, por vía sistémica, tópica o parenteral. El término “parenteral” como se usa en el presente documento se refiere a modos de administración que incluyen inyección intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal, subcutánea e intrarticular e infusión.

En una forma de realización adicional, la invención se refiere al péptido o péptido fusionado de la invención, la molécula de ácido nucleico, el vector de expresión o la célula huésped de la invención, para tratar enfermedades infecciosas, cáncer o psoriasis.

Una enfermedad infecciosa es una enfermedad clínicamente manifiesta resultante de la presencia de agentes microbianos patógenos, incluyendo virus, bacterias, hongos, protozoos, parásitos multicelulares y proteínas anormales conocidas como priones. Estos patógenos son capaces de producir enfermedad en animales y/o plantas.

Las patologías infecciosas habitualmente se califican como enfermedades contagiosas (también denominadas enfermedades comunicables) debido a potencialidad de transmisión de una persona o especie a otra. La transmisión de una enfermedad infecciosa se puede producir a través de una o más de diversas rutas incluyendo contacto físico con individuos infectados. Estos agentes infecciosos también se pueden transmitir a través de líquidos, alimentos, líquidos corporales, objetos contaminados, inhalación por aire, o a través de propagación por vectores.

Entre las casi infinitas variedades de microorganismos, relativamente pocos causan enfermedad en individuos de otra manera sanos. La enfermedad infecciosa resulta de la interacción entre esos pocos patógenos y las defensas de los huéspedes de infectan. La aparición y gravedad de la enfermedad resultante de cualquier patógeno depende de la capacidad de ese patógeno de dañar el huésped así como de la capacidad del huésped de resistir el patógeno. Los microorganismos, o microbios, infecciosos, por tanto, se clasifican bien como patógenos primarios o como patógenos oportunistas según el estado de las defensas del huésped.

Los patógenos primarios causan enfermedad como resultado de su presencia o actividad en el huésped normal, sano, y su virulencia intrínseca (la gravedad de la enfermedad que causan) es, parte, una consecuencia necesaria de su necesidad de reproducirse y propagarse. Muchos de los patógenos primarios más comunes de seres humanos solo infectan seres humanos, sin embargo, muchas enfermedades graves están causadas por organismos adquiridos del medio ambiente o que infectan huéspedes no humanos.

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Figura 1: Comparación de los péptidos lineales Pep12, 17-1 y 19-1 para inhibir la expresión de citoquinas inducida por LPS en células mononucleares humanas. El IPep19-1 inhibe lo más fuertemente la producción de citoquinas inducida por LPS.

Figura 2: La comparación de péptidos cíclicos y lineales muestra diferentes estructuras secundarias, obtenidas a través de evaluación de la banda I de amida del péptido.

Figura 3: Unión de IPep19-2 a LPS medida por calorimetría de titulación isotérmica.

Figura 4: Transición de fase cristalina gel a líquida de las cadenas hidrocarbonadas de LPS en presencia de IPep19-2 (figura 4 A), e IPep17-1 (figura 4 B) de experimentos de FTIR.

Figura 5: Patrones de dispersión de rayos X a ángulo bajo (SAXS) de mezclas LPS Ra:Pep19-2 a 20 y 50ºC.

Figura 6: Experimentos de FRET de liposomas de PS marcados que muestran la intercalación del péptido y péptido+LPS en los liposomas.

Figura 7: Acción de algunos péptidos contra células tumorales (PC3 = células de carcinoma de próstata) como la salida de LDH (lactodeshidrogenasa).

Figura 8: Acción anti-VIH de los PAM Pep19-2, -4, 6, y 8 a concentraciones de péptido de 1, 5, 10 y 20 μg/ml. El % de inhibición de la replicación del virus en una línea de células T se representa frente a la concentración de péptido que muestra una inhibición del 99% para los péptidos Pep19-5 y 19-8 a 20 μg/ml.

Los ejemplos ilustran la invención:

Ejemplo 1: Síntesis de péptidos

Se sintetizaron péptidos lineales con las secuencias descritas anteriormente con un extremo C amidado mediante la técnica de síntesis de péptidos en fase sólida en un sintetizador de péptidos automático en la resina Fmoc-amida estándar según el protocolo de síntesis fastmoc del fabricante. El grupo Fmoc N-terminal se eliminó del péptidoresina y el péptido se desprotegió y cortó con ácido trifluoroacético (TFA) al 90%, anisol al 5%, tioanisol al 2%, ditiotreitol al 3% durante 3 horas a temperatura ambiente. Después del corte la suspensión se filtró y los péptidos solubles se precipitaron con éter dietílico helado seguido por centrifugación y lavado extenso con éter. Los péptidos se purificaron por RP-HPLC usando una columna Aqua C18 (Phenomenex). La elución se hizo usando un gradiente del 0-70% de acetonitrilo en (TFA) al 0,1%. Los péptidos se purificaron de nuevo por HPLC de fase reversa a purezas por encima del 95%. La pureza se determinó por espectrometría de masas de desorción laser asistida por matriz tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS, Bruker).

Ejemplo 2: Secreción de citoquinas de células mononucleares humanas

Células mononucleares humanas (CMN): se mezcló sangre heparinizada (20 UI/ml) obtenida de donantes sanos con un volumen igual de solución equilibrada de Hank, se colocó sobre Ficoll, y se centrifugó durante 40 minutos (21ºC, 500 g). La interfase de CMN se recogió y lavó dos veces en medio de Hank y después se resuspendió en RPMI 1640 suplementado con L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 μg/ml. Las CMN (200 μl/pocillo; 5x106 células/ml) se transfirieron a placas de cultivo de 96 pocillos. Se añadieron veinte microlitros de una mezcla que contenía LPS (100 ng/ml o 10 ng/ml) y Gra-pep (10:1, exceso de % en peso) a cada pocillo. Los sobrenadantes se recogieron después de 4 horas de incubación a 37ºC en CO2 al 5%, y se midió la producción de TNFα en un ELISA sándwich. TNFα se determinó en duplicado a dos diluciones diferentes y se hizo la media de los valores de dos experimentos independientes.

Ejemplo 3: Espectroscopía de infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR)

Para las medidas de espectroscopía de infrarrojos, las muestras de lípidos se colocaron en una cubeta de CaF2 con un espaciador de teflón 12,5 μM. Se realizaron barridos de temperatura automáticamente entre 10 y 70ºC con una velocidad de calentamiento de 0,6ºC/min. Cada 3ºC, se acumularon 50 inferogramas, se apodizaron, se hizo la transformada de Fourier, y se convirtieron a espectros de absorbancia. Para bandas de absorción fuertes, los parámetros de banda (posición del pico, ancho de la banda e intensidad) se evaluaron a partir de los espectros

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originales, o después de restar las bandas de agua fuertes si era necesario. La banda vibracional principal usada para el análisis es la vibración de tensión simétrica de los grupos metileno vs(CH2) localizada aproximadamente a 2850 cm-1, una medida de orden de las cadenas de lípido A. Para la determinación de las estructuras secundarias de los péptidos, se usó la banda vibracional de amida I en el intervalo de 1700 a 1600 cm-1 .

Ejemplo 4: Calorimetría de titulación isotérmica (CTI)

Se realizaron medidas micocalorimétricas de la unión de péptidos a las endotoxinas en un calorímetro de titulación isotérmico MCS a 37ºC. Brevemente, después de desgasificación completa de las suspensiones por ultrasonicación, se dispensaron 1,5 ml de muestras de endotoxina (0,05 mM) en la célula microcalorimétrica, y 100 μl de soluciones de péptidos (2 mM) se cargaron en el compartimento de jeringa. Después de equilibrar la temperatura, los péptidos (3 μl) se titularon cada 5 minutos en la célula que contenía lípido con agitación constante. El calor de interacción medido por el instrumento de CTI después de cada inyección se representó frente al tiempo. Las curvas de titulación se repitieron tres veces.

Ejemplo 5: Difracción de rayos X a ángulo bajo

Las medidas de difracción de rayos X se realizaron en la dependencia del Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL) en la instalación de radiación del sincrotrón de Hamburgo HASYLAB usando la cámara de SAXS X33. Se registraron patrones de difracción en el intervalo de vector de dispersión 0,1 < s < 1,0 nm-1 (s = 2 sin θ/λ, ángulo de dispersión 2θ y λ la longitud de onda = 0,15 nm) a 40ºC con tiempos de exposición de 1 minuto usando un detector de placa de imágenes con lectura en línea (MAR345, MarResearch, Nosderstedt/Alemania). El eje s se calibró con behenato de Ag, que tiene una periodicidad de 58,4 nm. Los patrones de difracción se pueden evaluar asignando las razones de espaciamiento del máximo de dispersión principal a estructuras dimensionales definidas. Las estructuras lamelar y cúbica son las más relevantes aquí. Se caracterizan por las siguientes características:

(1): Lamelar: Las reflexiones se agrupan en razones equidistantes, es decir, 1, 1/2, 1/3, 1/4, etc., de la distancia de repetición lamelar dl;

(2): Cúbica: Los diferentes grupos de espacio de estas estructuras tridimensionales no lamelares se diferencian en la razón de sus espaciamientos. La relación entre el espaciamiento recíproco shkl = 1/dhkl y la constante de red a es shkl = [(h2 + k2+ I2)/a]1/2 (hkl = índices de Miller del correspondiente conjunto de plano).

La figura 5 representa los patrones de dispersión de rayos X a ángulo bajo (SAXS) de mezclas LPS Ra:Pep19-2 a 20 y 50ºC. Los patrones de dispersión de rayos X a ángulo bajo obtenidos son característicos para la existencia de estructuras de agregados multilamelares de LPS, que se ve de la aparición de reflexiones que están a razones equidistantes. Por tanto, a 20ºC se produce una periodicidad a 9,71 con la reflexión de segundo orden a 4,88 nm, otra periodicidad a 7,63 con la reflexión de segundo orden a 3,84 nm y la periodicidad principal a 5,84 nm con dos reflexiones de orden superior a 2,94 y 1,96 nm. La primera periodicidad corresponde a una periodicidad casi sin afectar de LPS R60 puro, mientras que las dos periodicidades adicionales con valores menores son indicativas de pilas lamelares fuertemente comprimidas, de las que la bioactividad fuertemente reducida de LPS se hace inteligible.

A 50ºC, la periodicidad del LPS sin perturbar desaparece, y solo permanecen las dos pilas multilamelares con lamelas comprimidas.

Ejemplo 6: Espectroscopía de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET)

La intercalación de los péptidos y de LPS Re en liposomas se determinó por espectroscopía FRET aplicada como un ensayo de dilución de sonda. Los liposomas se marcaron con el colorante donante NBD-fosfatidiletanolamina (NBD-PE) y el colorante aceptor rodamina-PE. A continuación, se añadieron los lípidos seguidos por los péptidos (o viceversa) a liposomas a una concentración final de 1 μM. La intercalación se siguió como el aumento de la razón de intensidad de donante ID a 531 nm respecto a esa de la intensidad del aceptor IA a 593 nm (señal FRET) de una manera dependiente del tiempo.

Ejemplo 7: Actividad antibacteriana de los péptidos

La actividad antibacteriana de los péptidos se determino por ensayos de susceptibilidad de microdilución realizados en caldo de Mueller-Hinton. El ensayo de susceptibilidad se realizó según las recomendaciones del Clinical Standards Institute (CLSI, anteriormente NCCLS) [Standards, 2000]. Los péptidos (2 mg/ml en HEPES 4 mM, pH 7,2) se diluyeron dos veces en caldo de Mueller-Hinton en placas de microtitulación de 96 pocillos para obtener concentraciones de 512 a 0,25 μg/ml en un volumen de 100 μl. Las bacterias se cultivaron en placas de agar Mueller-Hinton durante de 1 a 3 días dependiendo de la velocidad de crecimiento de las bacterias, se resuspendieron en 2 ml de solución salina al 0,9% y se ajustaron a 108 UFC/ml. La suspensión bacteriana se diluyó 100 veces en caldo de Mueller-Hinton, y se añadieron 0,1 ml de esta nueva dilución (105 UFC) a las diluciones de los péptidos. Las placas de microtitulación se incubaron a 37ºC durante 24 horas. La concentración inhibitoria mínima

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