ES2536252T3 - ADN polimerasas con diferenciación de desapareamientos 3' aumentada - Google Patents

Abstract

Un ADN polimerasa que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la SEC ID Nº: 1 y que tiene actividad de diferenciación de desapareamientos 3' aumentada en comparación con un ADN polimerasa de control, en la que la ADN polimerasa comprende un motivo en el dominio de polimerasa que comprende A-G-H-P-F-N-L-N-S-R-D-Q-L-E-R-V-L-X13-D-E-L, en el que: X13 es A, G, S, T, Y, D o K (SEC ID Nº: 11), y en el que la ADN polimerasa de control tiene la misma secuencia de aminoácidos que la ADN polimerasa excepto que el aminoácido X13 de la ADN polimerasa de control es F.

Description

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naturales, aminoácidos modificados (por ejemplo, que tienen cadenas laterales y/o cadenas principales modificadas), y análogos de aminoácidos. Véase, por ejemplo, Zhang et al. (2004) “Selective incorporation of 5hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells,” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(24): 8882-8887, Anderson et al. (2004) “An expanded genetic code with a functional quadruplet codon” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(20): 7566-7571, Ikeda et al. (2003) “Synthesis of a novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo,” Protein Eng. Des. Sel. 16(9): 699-706, Chin et al. (2003) “An Expanded Eukaryotic Genetic Code”, Science 301(5635): 964-967, James et al. (2001) “Kinetic characterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues”, Protein Eng. Des. Sel. 14(12): 983-991, Kohrer et al. (2001) “Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells: A general approach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins”, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(25): 14310-14315, Bacher et al. (2001) “Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise Toxic Tryptophan Analogue”, J. Bacteriol. 183(18): 5414-5425, Hamano-Takaku et al. (2000) “A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine”, J. Biol. Chem. 275(51): 40324-40328, y Budisa et al. (2001) “Proteins with {beta}-(thienopyrrolyl)alanines as alternative chromophores and pharmaceutically active amino acids”, Protein Sci. 10(7): 1281-1292.

Para ilustrar adicionalmente, un aminoácido es típicamente un ácido orgánico que incluye un grupo amino sustituido

o no sustituido, un grupo carboxi sustituido o no sustituido, y una o más cadenas o grupos laterales, o análogos de cualquiera de estos grupos. Las cadenas laterales ejemplares incluyen, por ejemplo, tiol, seleno, sulfonilo, alquilo, arilo, acilo, ceto, azido, hidroxilo, hidracina, ciano, halo, hidracida, alquenilo, alquinilo, éter, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, enona, imina, aldehído, éster, tioácido, hidroxilamina o cualquier combinación de estos grupos. Otros aminoácidos representativos incluyen, pero sin limitación, aminoácidos que comprenden agentes de reticulación fotoactivables, aminoácidos de unión a metales, aminoácidos con marcaje de espín, aminoácidos fluorescentes, aminoácidos que contienen metales, aminoácidos con grupos funcionales nuevos, aminoácidos que interaccionan covalente o no covalentemente con otros moléculas, aminoácidos fotomarcados y/o fotoisomerizables, aminoácidos radiactivos, aminoácidos que comprenden biotina o un análogo de biotina, aminoácidos glucosilados, otros aminoácidos con carbohidratos modificados, aminoácidos que comprenden polietilenglicol o poliéter, aminoácidos sustituidos con átomos pesados, aminoácidos químicamente escindibles y/o fotoescindibles, aminoácidos que contienen azúcares con enlaces de carbono, aminoácidos redox activos, aminoácidos que contienen amino tioácido y aminoácidos que comprenden uno o más restos tóxicos.

El término “aptámero” se refiere a un ADN monocatenario que reconoce y se une con ADN polimerasa, e inhibe eficazmente la actividad polimerasa como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.693.502.

El término “mutante”, en el contexto de ADN polimerasas de la presente invención, significa un polipéptido, típicamente recombinante, que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en relación con una ADN polimerasa correspondiente, de origen natural o no modificada.

La expresión “forma no modificada”, en el contexto de una polimerasa mutante, es una expresión usada en el presente documento para el fin de definir una ADN polimerasa mutante de la presente invención: la expresión “forma no modificada” se refiere a una ADN polimerasa funcional que tiene la secuencia de aminoácidos de la polimerasa mutante excepto en una o más posiciones de aminoácidos especificadas como características de la polimerasa mutante. Por lo tanto, la referencia a una ADN polimerasa mutante con respecto a (a) su forma no modificada y (b) una o más sustituciones de aminoácidos específicas significa que, con la excepción de la sustitución o las sustituciones de aminoácidos específicas, la polimerasa mutante tiene de otro modo una secuencia de aminoácidos idéntica a la forma no modificada en el motivo específico. La “polimerasa no modificada” (y por lo tanto también la forma modificada que tiene diferenciación de desapareamientos 3’ aumentada) puede contener mutaciones adicionales para proporcionar funcionalidad deseada, por ejemplo, incorporación mejorada de didesoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, análogos de ribonucleótidos, nucleótidos marcados con colorante, modulación de la actividad 5’ nucleasa, modulación de la actividad 3’ nucleasa (o corrección), o similares. En consecuencia, al llevar a cabo la presente invención como se describe en el presente documento, se predetermina la forma no modificada de una ADN polimerasa. La forma no modificada de una ADN polimerasa puede ser, por ejemplo, una ADN polimerasa de origen natural y/o de tipo silvestre, o una ADN polimerasa que ya se ha modificado intencionadamente. Una forma no modificada de la polimerasa es preferentemente una ADN polimerasa termoestable, tal como ADN polimerasas de diversas bacterias termófilas, así como variantes funcionales de las mismas que tienen identidad de secuencia sustancial con una polimerasa termoestable de origen natural o de tipo silvestre. Dichas variantes pueden incluir, por ejemplo, ADN polimerasas quiméricas tales como, por ejemplo, las ADN polimerasas quiméricas descritas en la Patente de Estados Unidos Nº 6.228.628 y Publicación de Solicitud de Estados Unidos Nº 2004/0005599. En ciertas realizaciones, la forma no modificada de una polimerasa tiene actividad transcriptasa inversa (RT).

La expresión “polimerasa termoestable”, se refiere a una enzima que es estable frente al calor, es resistente al calor y conserva suficiente actividad para efectuar reacciones de extensión de polinucleótidos posteriores y no se desnaturaliza (se inactiva) irreversiblemente cuando se somete a las temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de ácidos nucleicos bicatenarios. Las condiciones de calentamiento necesarias para desnaturalización de ácidos nucleicos se conocen bien en la técnica y se ejemplifican, por ejemplo,

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en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.683.202, 4.683.195 y 4.965.188. Como se usa en el presente documento una polimerasa termoestable es adecuada para su uso en una reacción de ciclación de temperatura tal como la reacción en cadena de la polimerasa (“PCR”). La desnaturalización irreversible para fines del presente documento se refiere a pérdida permanente y completa de la actividad enzimática. Para una polimerasa termoestable, la actividad enzimática se refiere a la catálisis de la combinación de los nucleótidos de la manera apropiada para formar productos de extensión polinucleotídicos que son complementarios de una cadena de ácido nucleico molde. Las ADN polimerasas termoestables de bacterias termófilas incluyen, por ejemplo, ADN polimerasas de Thermotoga maritima, Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus flavus, Thermus filiformis, especie de Thermus Sps17, especie de Thermus Z05, Thermus caldophilus, Bacillus caldotenax, Thermotoga neopolitana y Thermosipho africanus.

El término “termoactivo” se refiere a una enzima que mantiene propiedades catalíticas a temperaturas habitualmente usadas para transcripción inversa o etapas de hibridación/extensión en reacciones de RT-PCR y/o PCR (es decir, 45-80 ºC). Son enzimas termoestables las que no se inactivan o se desnaturalizan de forma irreversible cuando se someten a temperaturas elevadas necesarias para la desnaturalización de ácidos nucleicos. Las enzimas termoactivas pueden ser o no termoestables. Las ADN polimerasas termoactivas pueden ser ADN o ARN dependiente de especie termófila o de especie mesófila incluyendo, pero sin limitación, Escherichia coli, virus de la leucemia murina de Moloney y virus de la mioblastosis Aviar.

Como se usa en el presente documento, una proteína “quimérica” se refiere a una proteína cuya secuencia de aminoácidos representa un producto de fusión de subsecuencias de las secuencias de aminoácidos de al menos dos proteínas distintas. Una proteína quimérica típicamente no se produce por manipulación directa de secuencias de aminoácidos, sino que, más bien, se expresa a partir de un gen “quimérico” que codifica la secuencia de aminoácidos quimérica. En ciertas realizaciones, por ejemplo, una forma no modificada de una ADN polimerasa mutante de la presente invención es un proteína quimérica que consiste en una región amino terminal (N-terminal) derivada de una ADN polimerasa de especie de Thermus y una región carboxilo terminal (C terminal) derivada de ADN polimerasa Tma. La región N terminal se refiere a una región que se extiende desde el extremo N terminal (posición de aminoácido 1) a un aminoácido interno. De forma similar, la región C terminal se refiere a una región que se extiende desde un aminoácido interno al extremo C terminal.

En el contexto de las ADN polimerasas, la “correspondencia” con otra secuencia (por ejemplo, regiones, fragmentos, posiciones de nucleótidos o aminoácidos, o similares) se basa en la convención de numeración de acuerdo con el número de posición de nucleótido o aminoácido y alineando después las secuencias de manera que se maximice el porcentaje de identidad de secuencia. Debido a que no todas las posiciones dentro de una “región correspondiente” dada tienen que ser idénticas, las posiciones no coincidentes dentro de una región correspondiente pueden considerarse “posiciones correspondientes”. En consecuencia, como se usa en el presente documento, la referencia a una “posición de aminoácido correspondiente a una posición de aminoácido [X]” de una ADN polimerasa específica se refiere a posiciones equivalentes, basándose en el alineamiento, en otras ADN polimerasas y homólogos estructurales y familias. En algunas realizaciones de la presente invención, la “correspondencia” de posiciones de aminoácidos se determina con respecto a una región de la polimerasa que comprende uno o más motivos de SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 36, 37, 38, 39, 40 o 41. Cuando una secuencia polipeptídica de polimerasa difiere de SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 36, 37, 38, 39, 40 o 41 (por ejemplo, por cambios en aminoácidos o adición o deleción de aminoácidos), puede ser que una mutación particular asociada con actividad mejorada como se analiza en el presente documento no esté en el mismo número de posición que en la SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 36, 37, 38, 39, 40 o 41. Esto se ilustra, por ejemplo, en la Tabla 1.

“Recombinante”, como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de aminoácidos o a una secuencia de nucleótidos que se ha modificado intencionadamente por métodos recombinantes. Por la expresión “ácido nucleico recombinante” en el presente documento se entiende un ácido nucleico, originalmente formado in vitro, en general, por la manipulación de un ácido nucleico por endonucleasas, en una forma que no se encuentra normalmente en la naturaleza. Por lo tanto un ácido nucleico de ADN polimerasa mutante, aislado, en una forma lineal, o un vector de expresión formado in vitro ligando moléculas de ADN que no se unen normalmente, se consideran ambos recombinantes para los fines de la presente invención. Se entiende que una vez que se realiza un ácido nucleico recombinante y se reintroduce en una célula hospedadora, se replicará de forma no recombinante, es decir, usando la maquinaria celular in vivo de la célula hospedadora en lugar de manipulaciones in vitro; sin embargo, dichos ácidos nucleicos, una vez producidos de forma recombinante, aunque se replican posteriormente de forma no recombinante, aún se consideran recombinantes para los fines de la invención. Una “proteína recombinante” es una proteína realizada usando técnicas recombinantes, es decir, mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante como se ha representado anteriormente.

Un ácido nucleico está “unido operativamente” cuando se sitúa en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador está unido operativamente con una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está unido operativamente con una secuencia codificante si se sitúa de modo que facilite la traducción.

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Escherichia coli, Bacillus caldotenax, Bacillus stearothermophilus, Deinococcus radiodurans, Thermosipho africanus, Thermotoga maritima, Thermotoga neopolitana, Thermus aquaticus, Thermus caldophilus, Thermus filiformus, Thermus flavus, Thermus sp. Sps17, Thermus sp. Z05, y Thermus thermophilus. Como se muestra, el motivo de SEC ID Nº: 8 (excepto cuando X13 es F) está presente en cada una de estas polimerasas, lo que indica una función conservada para esta región de la polimerasa. La Figura 2 proporciona identidades de secuencias entres estas ADN polimerasas.

En consecuencia, en algunas realizaciones, se desvela una polimerasa que comprende SEC ID Nº: 8, 9, 10 u 11 (por ejemplo, cuando se selecciona X3, según sea apropiado en la secuencia consenso, de G, A, V, L, I, M, W, P, S, T, C, N, Q, D, E, K, R, H o Y), que tienen la actividad y/o las características mejoradas descritas en el presente documento, y en la que la ADN polimerasa es de otro modo una ADN polimerasa de tipo silvestre o una de origen natural, tal como, por ejemplo, una polimerasa de cualquiera de las especies de bacterias termófilas enumeradas anteriormente, o es sustancialmente idéntica a dicha ADN polimerasa de tipo silvestre o de origen natural. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la polimerasa como se desvela comprende SEC ID Nº: 8, 9, 10 o 11 y es al menos 80 %, 85 %, 90 % o 95 % idéntica a SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 36, 37, 38, 39, 40 o 41. En una variación, la forma no modificada de la polimerasa es de una especie del género Thermus. También se desvela que la polimerasa no modificada es de una especie termófila distinta de Thermus, por ejemplo, Thermotoga. Están disponibles las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos completas para numerosas ADN polimerasas termoestables. Las secuencias de cada una de las polimerasas de Thermus aquaticus (Taq) (SEC ID Nº: 2), Thermus thermophilus (Tth) (SEC ID Nº: 6), especie de Thermus Z05 (SEC ID Nº: 1), especie de Thermus Sps17 (SEC ID Nº: 5), Thermotoga maritima (Tma) (SEC ID Nº: 38) y Thermosipho africanus (Taf) (SEC ID Nº: 37) se han publicado en la Publicación de Patente Internacional de PCT Nº WO 92/06200. La secuencia para la ADN polimerasa de Thermus flavus (SEC ID Nº: 4) se ha publicado en Akhmetzjanov y Vakhitov (Nucleic Acids Research

20: 5839, 1992). La secuencia de la ADN polimerasa termoestable de Thermus caldophilus (SEC ID Nº: 7) se encuentra en EMBL/GenBank Nº de Referencia U62584. La secuencia de la ADN polimerasa termoestable de Thermus filiformis puede recuperarse de la ATCC Nº de Depósito 42380 usando, por ejemplo, los métodos proporcionados en la Patente de Estados Unidos Nº 4.889.818, así como la información de secuencia proporcionada en la Tabla 1. La secuencia de la ADN polimerasa de Thermotoga neapolitana (SEC ID Nº: 39) es de la Base de Datos de Patentes GeneSeq Nº de Referencia R98144 y el documento PCT WO 97/09451. La secuencia de la ADN polimerasa termoestable de Bacillus caldotenax (SEC ID Nº: 41) se describe, por ejemplo, en Uemori et al. (J Biochem (Tokio) 113(3): 401-410, 1993; véase también, base de datos Swiss-Prot Nº de Referencia Q04957 y GenBank Nº de Referencia D12982 y BAA02361). También se describen ejemplos de formas no modificadas de ADN polimerasas que pueden modificarse como se describe en el presente documento en, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 6.228.628; 6.346.379; 7.030.220; 6.881.559; 6.794.177; 6.468.775; y Solicitudes de Patente de Estados Unidos Nº 20040005599; 20020012970; 20060078928; 20040115639. También se proporcionan en la lista de secuencias secuencias de polimerasa de longitud completa representativas.

En algunas realizaciones, la polimerasa de la invención, además de tener un dominio de polimerasa que comprende SEC ID Nº: 8, 9, 10 u 11, también comprende un dominio de nucleasa (por ejemplo, correspondiente a las posiciones 1 a 291 de Z05).

También se desvela una polimerasa que es una polimerasa quimérica, es decir, que comprende regiones polipeptídicas de dos o más enzimas. Se describen ejemplos de dichas ADN polimerasas quiméricas, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 6.228.628. Son particularmente adecuadas las ADN polimerasas de la familia CS quiméricas, que incluyen las polimerasas CS5 (SEC ID Nº: 29) y CS6 (SEC ID Nº: 30) y variantes de las mismas que tienen identidad o similitud de secuencia sustancial con la SEC ID Nº: 29 o SEC ID Nº: 30 (típicamente al menos 80 % de identidad de secuencia y más típicamente al menos 90 %, más típicamente al menos 95 % de identidad de secuencia) y pueden por lo tanto modificarse para contener SEC ID Nº: 8. Las ADN polimerasas CS5 y CS6 son enzimas quiméricas derivadas de ADN polimerasas Z05 de Thermus sp. y Thermotoga maritima (Tma). Comprenden el dominio nucleasa 5’ N terminal de la enzima de Thermus y la exonucleasa 3’-5’ C terminal y los dominios de polimerasa de la enzima Tma. Estas enzimas tienen actividad transcriptasa inversa eficaz, pueden extender cebadores que contienen análogos de nucleótidos, y pueden utilizar alfa-fosforotioato dNTP, dUTP, dITP y también dNTP marcados con familias de colorantes de fluoresceína y cianina. Las polimerasas CS5 y CS6 también son enzimas de PCR activadas por Mg2+ eficaces. Las polimerasas quiméricas CS5 y CS6 se describen adicionalmente, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 2004/0005599.

En algunas realizaciones, la polimerasa de la invención comprende la SEC ID Nº: 8, 9, 10 u 11 y comprende además uno o más cambios de aminoácidos adicionales (por ejemplo, por sustitución, adición o deleción de aminoácidos) en comparación con una polimerasa nativa. En algunas realizaciones, dichas polimerasas conservan el motivo de aminoácidos de SEC ID Nº: 8 (o un motivo de SEC ID Nº: 9, 10 u 11), y comprenden además el motivo de aminoácido de SEC ID Nº: 27 (correspondiente a la mutación D580X de Z05 (SEC ID Nº: 1)) de la siguiente manera:

T-G-R-L-S-S-X7-X8-P-N-L-Q-N; en el que

X7 es Ser (S) o Thr (T); y X8 es cualquier aminoácido distinto de D o E (SEC ID Nº: 27)

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La mutación caracterizada por SEC ID Nº: 27 se analiza en más detalle, por ejemplo, en la Publicación de Patente de Estados Unidos Nº 2009/0148891. En algunas realizaciones, dichas polimerasas variantes funcionales típicamente tendrán identidad o similitud de secuencia sustancial con la polimerasa de tipo silvestre o de origen natural (por ejemplo, SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 39, 40, 41, 42, 43 o 44), típicamente al menos 80 % de identidad de secuencia y más típicamente al menos 90 %, más típicamente al menos 95 % de identidad de secuencia.

En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición X13 se sustituye con un aminoácido como se expone en SEC ID Nº: 8, 9, 10 u 11, y el aminoácido en la posición X8 se sustituye con un aminoácido como se expone en SEC ID Nº: 27. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el aminoácido en la posición X13 es cualquier aminoácido distinto de Phe (F) y el aminoácido en la posición X8 es cualquier aminoácido distinto de Asp (D) o Glu (E). En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos incluyen Leucina (L), Glicina (G), Treonina (T), Glutamina (Q), Alanina (A), Serina (S), Asparagina (N), Arginina (R) y Lisina (K) en la posición X8 de SEC ID Nº: 27. En ciertas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos incluyen de forma independiente Alanina (A), Glicina (G), Serina (S),Treonina (T), Tirosina (Y), Ácido Aspártico (D) o Lisina (K) en la posición X13, y Glicina (G) en la posición X8. Otra sustitución u otras sustituciones de aminoácidos adecuadas en uno o más de los sitios identificados pueden determinarse usando, por ejemplo, métodos conocidos de mutagénesis dirigida y determinación del rendimiento de extensión de polinucleótidos en ensayos descritos adicionalmente en el presente documento o conocidos de otro modo por expertos en la materia.

Debido a que la longitud precisa de ADN polimerasas varía, las posiciones de aminoácidos precisas correspondientes a cada una de X13 y X8 pueden variar dependiendo de la polimerasa particular usada. Están disponibles fácilmente programas de alineamiento de secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos (véase, por ejemplo, los indicados anteriormente) y, dados los motivos particulares identificados en el presente documento, sirven para ayudar en la identificación de los aminoácidos exactos (y codones correspondientes) para la modificación de acuerdo con la presente invención. Las posiciones correspondientes a cada una de X13 y X8 se muestran en la Tabla 1 para ADN polimerasas termoestables quiméricas representativas y ADN polimerasas termoestables de especies termófilas ejemplares.

Tabla 1. Posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones de motivo X6, X10, X13 (por ejemplo, de SEC ID Nº: 8, 9, 10 y 11) y X8 (de SEC ID Nº: 27) en polimerasas ejemplares.

Organismo o Secuencia Quimérica

Posición de Aminoácido

Consenso (SEC ID Nº:)

X6 X10 X13 X8 (de SEC ID Nº: 27)

T. thermophilus (6)

488 493 497 580

T. caldophilus (7)

488 493 497 580

T. sp. Z05 (1)

488 493 497 580

T. aquaticus (2)

486 491 495 578

T. flavus (4)

485 490 494 577

T. filiformis (3)

484 489 493 576

T. sp. Sps17 (5)

484 489 493 576

T. maritima (38)

548 553 557 640

T. neapolitana (39)

548 553 557 640

T. africanus (37)

548 553 557 639

B. caldotenax (41)

530 535 539 621

B. stearothermophilus (40)

530 535 539 620

CS5 (29)

548 553 557 640

CS6 (30)

548 553 557 640

En algunas realizaciones, la ADN polimerasa de la presente invención deriva de ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. (SEC ID Nº: 1) o una variante de la misma (por ejemplo, que porta la mutación D580G o similares). Como se ha indicado anteriormente, en la ADN polimerasa Z05 de Thermus sp., la posición X6 corresponde a Serina (S) en la posición 488; la posición X10 corresponde a Ácido glutámico (E) en la posición 493; y la posición X13 corresponde a Fenilalanina (F) en la posición 497; la posición X8 corresponde Aspartato (D) en la posición 580. Por lo tanto, en ciertas variaciones de la invención, la polimerasa mutante comprende al menos una sustitución de un aminoácido,

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Enzima

100 copias de plásmido mutante 10.000 copias de plásmido mutante 10.000 copias de ADNg humano Óptimo de KCl Eficacia de PCR Delta Cp de Altas Copias (ADNg-plásmido)

Z05 F497Y

31,0 24,3 26,6 100 98,1 2,4

Z05 D580G*

31,2 24,3 26,3 115 96,3 2,0

Z05 D580G F497D

37,0 28,9 40,8 25 76,9 12,0

Z05 D580G F497K

35,9 27,9 40,7 55 76,9 12,8

Z05 D580G F497S

34,3 26,8 34,7 55 84,1 7,9

* Promedio de 4 experimentos

Este ejemplo demuestra que las enzimas mutantes F497A, F497G, F497S, F497T, F497Y, F497D, F497K tienen una detección de alelos poco habituales mejorada en relación con las enzimas parentales de control Z05 y Z05 D580G.

5 Ejemplo 2: identificación de polimerasas mutantes adicionales con diferenciación de desapareamientos 3’ aumentada

Este ejemplo demuestra que diversas sustituciones en la posición E493 de la ADN polimerasa Z05 dan como

10 resultado diferenciación de desapareamientos 3’ aumentada. Estas sustituciones se crearon como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se compararon los mutantes de Z05 E493 G (Glicina), K (Lisina) y R (Arginina); y los mutantes de Z05 D580G A (Alanina), G (Glicina), K (Lisina) y R (Arginina) con su enzima parental respectiva en un ensayo de PCR específica de alelo.

15 Las enzimas de control y condiciones de reacción fueron como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1. La tabla 6 muestra que varias sustituciones de aminoácidos en la posición E493 de la ADN polimerasa Z05 dan como resultado diferenciación mejorada de desapareamientos de cebadores en PCR selectiva de alelos cuando se comparan con las enzimas parentales, Z05 y Z05 D580G.

20 Tabla 6. Cp de amplificación de plásmido mutante BRAF V600K frente a ADN genómico humano usando enzimas Z05 mutantes E493

Enzima

100 copias de plásmido mutante 10.000 copias de plásmido mutante 10.000 copias de ADNg KCl Óptimo Eficacia de PCR Delta Cp de Altas Copias (ADNgplásmido)

Z05

31,3 24,5 26,8 100 96,1 2,3

Z05 E493G

31,1 24,5 27,7 85 100,8 3,2

Z05 E493K

33,4 26,3 30,3 100 90,9 4,0

Z05 E493R

31,7 24,7 29,2 85 94,1 4,5

Z05 D580G*

31,2 24,3 26,3 115 96,3 2,0

Z05 D580G E493A

31,0 24,1 26,2 115 93,3 2,1

Z05 D580G E493G

30,9 24,2 27,1 115 98,5 2,9

Z05 D580G E493K

31,6 24,9 31,5 100 99,1 6,6

Z05 D580G E493R

31,0 24,2 27,9 115 97,6 3,7

* Promedio de 4 experimentos

28

Claims (1)

1. imagen1