ES2536639T3 - Células recombinantes productoras de ácidos omega-aminocarboxílicos, ésteres de ácidos omega-aminocarboxílicos o sus lactamas - Google Patents
Células recombinantes productoras de ácidos omega-aminocarboxílicos, ésteres de ácidos omega-aminocarboxílicos o sus lactamas Download PDFInfo
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Abstract
Una célula que ha sido modificada mediante tecnología genética con respecto a su tipo salvaje de modo que, en comparación con su tipo salvaje, es capaz de producir más ácidos ω-aminocarboxílicos, ésteres de ácidos ω- aminocarboxílicos o más lactamas derivadas de ácidos ω-aminocarboxílicos a partir de ácidos carboxílicos o ésteres de ácidos carboxílicos, presentando la célula una actividad, incrementada en comparación con su tipo salvaje, de las enzimas EI y EIII o de las enzimas EI, EII y EIII: i) de una enzima EI que cataliza la reacción de ácidos carboxílicos o ésteres de ácidos carboxílicos para dar los correspondientes ácidos ω-hidroxicarboxílicos o ésteres de ácidos ω- hidroxicarboxílicos, elegida del grupo consistente en las alcano monooxigenasas: alcano monooxigenasa codificada por alkBGT de Pseudomonas putida GPo1 y citocromo-P450- monooxigenasas de Candida tropicalis; ii) de una enzima EII que cataliza la reacción de ácidos &omegaa,-hidroxicarboxílicos o ésteres de ácidos ω- hidroxicarboxílicos para dar los correspondientes ácidos ω-oxocarboxílicos o ésteres de ácidos ω- oxocarboxílicos, elegida del grupo consistente en las alcoholdeshidrogenasas codificadas por el gen alkJ; iii) de una enzima EIII que cataliza la reacción de ácidos ω-oxocarboxílicos o ésteres de ácidos ω- oxocarboxílicos para dar los correspondientes ácidos ω-aminocarboxílicos o ésteres de ácidos ω- aminocarboxílicos, elegida del grupo de las ω-transaminasas.
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En la etapa I) del procedimiento de acuerdo con la invención, las células se ponen en contacto primeramente con un medio de cultivo que contiene un ácido carboxílico o un éster de ácido carboxílico, o con un medio de cultivo contiguo a una fase orgánica que contiene un ácido carboxílico o un éster de ácido carboxílico, en donde esta puesta en contacto tiene lugar bajo condiciones que posibilitan a la célula formar a partir del ácido carboxílico o a partir de los ésteres del ácido carboxílico, ácidos ω-aminocarboxílicos, ésteres de ácidos ω-aminocarboxílicos o lactamas derivadas de ácidos ω-aminocarboxílicos.
Las células modificadas por tecnología genética, de acuerdo con la invención, pueden ponerse en contacto con el medio nutricio y, por consiguiente, cultivarse, de forma continua o discontinua, en el procedimiento batch (procedimiento continuo o discontinuo) o en el procedimiento fed-batch (procedimiento alimentado discontinuo) o en el procedimiento repeated-fed-batch (procedimiento alimentado discontinuo repetitivo) con el fin de la producción de ácidos ω-aminocarboxílicos o de lactamas derivadas de ácidos ω-aminocarboxílicos. Es imaginable también un procedimiento semi-continuo tal como se describe en el documento GB-A-1009370. Una recopilación sobre métodos de cultivo conocidos se describe en el libro de texto de von Chmiel ("Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik" (editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1991)) o en elibro de texto de Storhas ("Bioreaktoren und periphere Einrichtungen", editorial Vieweg, Braunschweig/Wiesbaden, 1994).
El medio de cultivo a utilizar debe satisfacer de manera adecuada los requisitos de las cepas respectivas. Descripciones de medios de cultivos de diferentes organismos están contenidos en el manual “Manual of Methods for General Bacteriology” de American Society for Bacteriology (Washington, D. C., EE.UU, 1981).
Como fuente de carbono pueden utilizarse, junto a los ácidos carboxílicos o ésteres de ácidos carboxílicos, hidratos de carbono tales como, p. ej., glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, almidón y celulosa, aceites y grasas tales como, p. ej., aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y grasa de coco, ácidos grasos tales como, p. ej., ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes tales como, p. ej., glicerol y metanol, hidrocarburos tales como metano, aminoácidos tales como L-glutamina o L-valina o ácidos orgánicos tales como p. ej., ácido acético. Estas sustancias pueden utilizarse individualmente o en forma de mezcla. Particularmente preferido es el empleo de hidratos de carbono, en particular de monosacáridos, oligosacáridos o polisacáridos tal como se describe en el documento US 6.01.494 y US 6.136.576, de azúcares C5 o de glicerol.
Como fuente de nitrógeno pueden utilizarse compuestos nitrogenados orgánicos tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, agua de fuente del maíz, harina de soja y urea, o compuestos inorgánicos tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno pueden utilizarse individualmente o en forma de mezcla.
Como fuente de fósforo pueden utilizarse ácido fosfórico, dihidrógeno-fosfato de potasio o hidrógeno-fosfato dipotásico o las correspondientes sales con contenido en sodio. El medio de cultivo debe contener, además, sales de metales tales como, p. ej., sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente, pueden emplearse, adicionalmente a las sustancias arriba mencionadas, sustancias de crecimiento esenciales tales como aminoácidos y vitaminas. Al medio de cultivo pueden añadirse, además, precursores adecuados. Las sustancias de partida mencionadas pueden agregarse al cultivo en forma de una tanda única o pueden alimentarse de manera adecuada durante el cultivo.
Para el control del pH del cultivo se emplean de manera adecuada compuestos de carácter básico tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o bien agua amoniacal, o compuestos de carácter ácido tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Para el control de la formación de espuma pueden emplearse agentes antiespumantes tales como, p. ej., ésteres poliglicólicos de ácidos grasos. Para mantener la estabilidad de plásmidos pueden agregarse al medio sustancias de acción selectiva adecuadas tales como, p. ej., antibióticos. Con el fin de mantener las condiciones aerobias, se incorporan en el cultivo oxígeno o mezclas gaseosas con contenido en oxígeno tal como, p. ej., aire. La temperatura del cultivo se encuentra normalmente en 20ºC a 45ºC, y preferiblemente en 25ºC hasta 40ºC.
De acuerdo con una forma de realización particularmente preferida del procedimiento de acuerdo con la invención para la preparación de ácidos ω-aminocarboxílicos, de ésteres de ácidos ω-aminocarboxílicos o de lactamas derivadas de ácidos ω-aminocarboxílicos, en el que como célula de acuerdo con la invención se emplea una célula recombinante que se deriva de una célula de E. coli, se emplea como medio nutricio un medio de sales minerales suplementado con ampicilina, cloranfenicol y canamicina según Riesenberg et. al., "High cell density fermentation of recombinant Escherichia coli expressing human interferon alpha 1", Appl Microbiol and Biotechnology, Vol. 34 (1), páginas 77-82 (1990)).
La puesta en contacto de las células de acuerdo con la invención con el medio de cultivo en la etapa I) del procedimiento tiene lugar preferiblemente bajo condiciones que posibilitan a la célula a formar, a partir del ácido
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En la etapa (β2) del procedimiento de acuerdo con la invención para la preparación de poliamidas basadas en lactamas, las lactamas obtenidas en la etapa (β1) del procedimiento, en particular la laurin-lactama obtenida en la etapa (β1) del procedimiento, se hacen reaccionar, en una polimerización con apertura del anillo o mediante policondensación, para formar una poliamida, pudiendo emplearse eventualmente también mezclas de diferentes lactamas, por ejemplo mezclas de laurin-lactama y ε-caprolactama, de las que al menos una de las lactamas, pero eventualmente también todas las lactamas fueron preparadas mediante el procedimiento de acuerdo con la invención para la preparación de lactamas derivadas de ácidos ω-aminocarboxílicos.
La preparación de las poliamidas a partir de las lactamas puede tener lugar mediante procedimientos en sí conocidos tal como se describen, por ejemplo, en los documentos DE-A-14 95 198, DE-A-25 58 480, EP-A-0 129 196, o bien en “Polymerization Processes”, Interscience, Nueva York, 1977, páginas 424-467, particularmente en las páginas 444-446.
La invención se explica ahora con mayor detalle con ayuda de Figuras y Ejemplos no limitantes.
La Figura 1 muestra la representación esquemática de un plásmido recombinante para la integración cromosómica de los genes alk en Escherichia coli (tnp: gen transposasa; bla: gen de resistencia a ampicilina, oriT RP4: región de movilización; I y O marcan las “repeticiones invertidas” del mini-transposón Tn5).
La Figura 2 muestra la representación esquemática de un plásmido recombinante para la expresión de la transaminasa y de la alanina-deshidrogenasa bajo el control de un promotor inducible por arabinosa (bla: gen de resistencia a ampicilina; CV2025: gen para ω-transaminasa de Chromobacterium violaceum, ald: gen para alaninadeshidrogenasa de B. subtilis, araC: regulador de la transcripción).
La Figura 3 muestra la representación esquemática de un plásmido recombinante para la expresión de LipA en E. coli y la preparación de la enzima sobre la superficie de la célula (colE1, ColE1: origen de la replicación; estA*, estA: gen con intercambio de aminoácidos alanina por serina (codón nº 38), cat: gen de resistencia a cloranfenicol; phoA: segmento de gen que codifica la secuencia conductora de la fosfatasa alcalina).
La Figura 4 muestra la determinación de la actividad de transaminasa de C. violaceum a partir del ensayo con enzimas. La determinación de la actividad se llevó a cabo en determinación doble (activo 1, activo 2) en el fotómetro. Como controles negativos se utilizó una tanda sin el co-sustrato L-alanina (o.Cos), una tanda con enzima activada por calor (inactiva) y una tanda del cultivo de expresión de E. coli con vector vacío (vector vacío), purificada análogamente a omega-TA.
La Figura 5 muestra los cromatogramas del sustrato éster metílico del ácido 12-aminoláurico al comienzo de la medición de referencia (arriba) y después de 2 h de incubación con la transaminasa purificada (abajo).
La Figura 6 muestra los cromatogramas del sustrato éster metílico del ácido 12-aminoláurico después de 24 h (arriba) del ensayo con enzimas y después de la ampliación del sustrato (control, abajo).
La Figura 7 muestra 6 cromatogramas del sustrato éster metílico del ácido 12-aminoláurico después de activación por calor de la enzima (arriba) y después de 0 h (abajo).
La Figura 8 muestra el plásmido de partida pGEc47 que se empleó como molde para la amplificación de alkBGTS.
La Figura 9 muestra los cebadores empleados y los productos de la PCR resultante de ello alkBFG y alkT.
La Figura 10 muestra el vector recombinante pBT10 que se empleó para la síntesis de éster metílico del ácido hidroxiláurico y éster metílico del ácido oxoláurico.
La Figura 11 muestra un cromatograma por CG del patrón éster metílico del ácido 12-oxo-láurico.
La Figura 12 muestra un cromatograma por CG del patrón de éster metílico del ácido 12-hidroxi-láurico.
La Figura 13 muestra un cromatograma de la fase orgánica de una biotransformación de célula en reposo en un bioreactor de éster metílico de ácido láurico, instante 0 min.
La Figura 14 muestra un cromatograma de la fase orgánica de una biotransformación de célula en reposo en un bioreactor de éster metílico de ácido láurico, instante 150 min.
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Para simplificar la clonación de alkB y alkG, el gen alkF situado entremedias se amplifica y clona conjuntamente con alkB y alkG. AlkF carece de importancia para la reacción a catalizar. Los genes alkBFG y alkJ se amplifican en dos tandas de PCR separadas y se fusionan entre sí a través de SOE-PCR (Horton et al., Gene, Vol. 77, páginas 61-68 (1989)). Como ADN diana sirve el plásmido OCT de Pseudomonas putida GPo1.
A.2 Estrategia de clonación:
Amplificación por PCR del fragmento alkST = 4077 pb (SEQ.-ID-NO 06 (alkS) y SEQ.-ID-NO 07 (alkT)) en el lugar de corte NotI aguas arriba de alkT: Cebador
alkT-directo-NotI (SEQ.-ID-NO 08) 5' ACGTAGCGGCCGCCTAATCAGGTAATTTTATAC alkS-inverso (SEQ.-ID-NO 09) 5' GAGCGAGCTATCTGGT El fragmento de PCR es clonado en el vector pUT-Km portador del transposón. Para ello, el vector se corta
dentro de Tn5 con NotI y se liga mediante ligamiento en los extremos romos con el fragmento alkST. El plásmido recombinante tiene la denominación pUT-Km-alkST.
A3. Síntesis de la construcción alkBFGJ con la técnica SOE-PCR: Síntesis del fragmento 1: alkBFG + promotor aguas arriba de alkB y lugar de corte NotI en el extremo 5’ (tamaño de producto: 1409 pb):
Cebador alkBFG-directo-NotI (SEQ.-ID.-NO 10) 5' TCGTAGCGGCCGCCCAGCAGACGACGGAGCAA alkBFG-inverso-SOE (SEQ.-ID-NO 11) 5' ATTTTATCTTCTCGAGGCTTTTCCTCGTAGAGCACAT Síntesis del fragmento 3, alkJ con extremo complementario a alkG en el extremo 5’ y lugar de corte NotI en
el extremo 3’ (tamaño de producto: 1723 pb): Cebador alkJ-directo-SOE (SEQ.-ID-NO 12) 5' TGCTCTAACGAGGAAAAGCCTCGAGAAGATAAAATGTA alkJ-inverso-NotI (SEQ.-ID-NO 13) 5' ATTGACGCGGCCGCTTACATGCAGACAGCTATCA Los dos fragmentos individuales se fusionan entre sí a través de SOE-PCR. (Se requieren 3 reacciones PCR separadas). El plásmido pUT-Km-alkST recombinante y la construcción alkBFGJ se cortan con NotI y se ligan. El nuevo plásmido pUT-Km-alkBGIST recombinante (véase la Figura 1) se transforma en E coli HB101 y se transfiere a través de transferencia de plásmido conjugativa a E. coli JM101.
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A.7 Purificación de proteína expresada de forma heteróloga a través de la etiqueta 6xHis
Después de la transformación del vector (paCYCDuet-1::omega transaminasa) en E. coli XL1blue, la cepa transformada se cultivó medio YT doble (dYT) con el antibiótico ampicilina (100 μg/ml) a 28ºC hasta una densidad de DO600 nm = 0,3-0,4. La expresión tiene lugar bajo el control del promotor Plac y es inducida con IPTG (concentración final 1 mM). Lisis del cultivo de expresión en bacterias: 50 ml de cultivo se separaron por centrifugación a 2360 x g, y a continuación se resuspendieron en 5 ml de tampón fosfato de Na (pH 8) con EDTA 5 mM, NaCl 300 mM y 1 mg/ml de lisozima y se incubaron durante 1 h a TA. El lisado se centrifugó a 2360 x g durante 10 min y el sobrenadante se purificó a través de una columna empaquetada Protino Ni-TED 2000 (de acuerdo con los datos del fabricante; Macherey-Nagel, Düren). La concentración de proteínas se determinó mediante Bradford.
A8. Detección de la actividad enzimática a través de un ensayo acoplado
La actividad se determinó en un ensayo acoplado, en el que como producto secundario se continúa haciendo reaccionar en una segunda etapa el piruvato que resulta de la reacción de transaminasa, oxidándose NADH en NAD+. La disminución de la concentración en NADH (principio: medición de la disminución de la extinción) se mide en el fotómetro a 340 nm y sirve como medida de la actividad.
A9. Detección de la proteína expresada de forma heteróloga a través de HPLC
Después de incubación durante 4 h a TA, la reacción se detuvo con 1 vol. de MeOH. Para la analítica por HPLC, la tanda se derivatizó con o-ftaldialdehído (oPA) y de ello se analizaron 250 μl. Como eluyente A se utilizó NaAC 50 mM pH 4: acetonitrilo 4:1 (v:v). El eluyente B era acetonitrilo con 5% de NaAC 50 mM pH 4. El gradiente discurría de 30% de B a 60% de B en 4 min, de 60% de B a 100% de B en 2 min. El caudal ascendió a 1,2 ml/min. La separación tuvo lugar a través de una columna Agilent Zorbax RP18 (Agilent Technologies, EE.UU.), la temperatura de la columna ascendió a 40ºC.
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Las Figuras 5 y 6 muestran el patrón, así como la disminución del éster metílico del ácido 12-oxoláurico. Como control negativo sirve enzima inactivada por calor (Figura 7).
A.6 Disociación del éster
Para la disociación del éster metílico del ácido ω-aminoláurico en ácido ω-aminoláurico se emplea la lipasa LipA (Q76D26) de Pseudomonas fluorescens (Kojima y Shimizu, J. of Bioscience and Bioengin., Vol. 96 (3), páginas 219-226 (2003)). El gen se amplifica con los cebadores LipA-SfiI-up y LipA-SfiI-down con ADN cromosómico de Pseudomonas fluorescens y se clona en el vector pEST100 a través de los lugares de corte SfiI. El plásmido recombinante se denomina pEST-lipA (véase la Figura 3).
Mediante la clonación, lipA (SEQ.-ID-NO 18) se fusiona a la secuencia señal de la fosfatasa alcalina phoA y los dominios autotransportadores de EstA, una esterasa de P. aeruginosa, de modo que la lipasa es transferida a través de la membrana del citoplasma y se representa sobre la superficie celular de E. coli. Para el modo de proceder, véase Becker et al, "A generic system for the Escherichia coli cell-surface display of lipolytic enzymes", FEBS Letters Vol. 579, páginas 1177-1182 (2005). La expresión tiene lugar a través del control del promotor Plac y es inducida con IPTG (concentración final 1 mM) (tamaño del producto: 1894 pb).
Cebador
Cebador lipA-Sfi-up (SEQ.-ID-NO 19)
5' AACAA.AAGGGCCGCAATGGCCATGGGTGTGTATGACTAC
Cebador lipA-Sfi-down (SEQ.-ID-NO 20)
5' TACAGGGGCCACCACGGCCTCAGGCGATCACAATTCC
B. Sintesis de éster metílico del ácido 12-hidroxiláurico y éster metílico del ácido 12-oxoláurico partiendo de éster metílico del ácido láurico con el sistema de alcanohidroxilasa alkBGT de Pseudomonas putida GPo1
B1. Construcción de los vectores de expresión alkBGT
Partiendo de pCOM
Partiendo de los sistemas pCOM (Smits et al., 2001 Plasmid 64: 16-24) se preparó la construcción pBT10 (Figura 10, SEQ.-ID-NO 31) que contiene los tres componentes necesarios para la oxidación en aldehído, alcano-hidroxilasa (AlkB), rubredoxina (AlkG) y rubredoxina-reductasa (AlkT) de Pseudomonas putida. Para la expresión de los tres genes, la secuencia génica alkBFG se puso bajo el control del promotor alkB y el gen alkT bajo la del promotor alkS.
B2. Estrategia de clonación:
Para simplificar la clonación de alkB y alkG, el gen alkF situado entremedias se amplificó conjuntamente con alkB y alkG y se clonó. AlkF carece de importancia para la reacción a catalizar.
Amplificación por PCR del fragmento alkBFG = 2524 pb (véase SEQ.-ID-NO 03 (alkB) y SEQ.-ID-NO 04 (alkG)) con el lugar de corte NdeI aguas arriba de alkB y el lugar de corte SalI aguas abajo de alkG:
Cebador: alkBFG directo (SEQ.-ID-NO 32)
AAGGGAATTCCATATGCTTGAGAAACACAGAGTTC
Cebador: alkBFG inverso (SEQ.-ID-NO 33)
AAAATTCGCGTCGACAAGCGCTGAATGGGTATCGG
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- C
- Reacción de éster metílico del ácido 12-oxoláurico para dar éster metílico del ácido 12-aminoláurico
- C1.
- Aislamiento y expresión de una aminotransferasa de Arabidopsis thaliana
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- Se analizó una aminotransferasa conocida de Arabidopsis thaliana. En este caso, sorprendentemente, la 4aminobutirato-transaminasa (at3g22200, SEQ.-ID-NO 38) mostraba una actividad de aproximadamente 14 U/mg de proteína expresada de forma heteróloga frente al éster metílico del ácido 12-oxododecanoico. El producto éster metílico del ácido 12-aminododecanoico se confirmó mediante HPLC.
- Si no se indica otra cosa, todos los métodos se realizaron según los protocolos en Sambrook, J., Fritsch, E. F., y Maniatis, T (1989). Molecular cloning, 2ª ed. Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
- Aislamiento de la 4-aminobutirotransaminasa de A. thaliana (at3g22200)
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- El ARN se aisló con el mini kit RNeasy a partir de una planta entera en flor de la especie A. thaliana según los datos del fabricante: QIAGEN GmbH, Hilden. A continuación, se llevó a cabo la síntesis de ADNc con el kit RT Skript (USB Europe GmbH, Staufen) según los datos del fabricante. La determinación de la calidad/cantidad de ARN se determinó mediante Nanodrop según los datos del fabricante (Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham EE.UU.).
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- PCR de ADNc de A. thaliana para la introducción de lugares de corte
- Con los cebadores siguientes, el ADN que codifica la 4-aminobutirotransaminasa con la SEQ.-ID-NO 39 se clonó en el vector digerido con NaeI, BamHI
- El cebador directo introduce al lugar de corte de proteasa GCCGGCGAGAACCTGTACTTTCAGATGGCAAGTAAGTATGCCACTTG
- y NaeI, SEQ.-ID-NO 36
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- El cebador inverso GGATCCTCACTTCTTGTGCTGAGCCTTG introduce BamHI, SEQ.-ID-NO 37
- La PCR se llevó a cabo según el siguiente protocolo:
El producto de la PCR resultante se purificó con el kit NucleoSpin® Extract II (Macherey Nagel, Alemania, 25 según los datos del fabricante).
Expresión de la proteína heteróloga
Utilizando el producto de la PCR arriba descrito se preparó, mediante métodos de biología molecular estándares, el vector pGJ3130 (Figura 15, SEQ.-ID-NO 43) y se transformó en E. coli XL1blue. La cepa de
E. coli transformada se cultivó en medio doble YT (dYt) con los antibióticos ampicilina (100 μg/ml) y la 30 adición de IPTG 0,5 mM a 28 ºC hasta una densidad de DO600 nm = 0,3-0,4.
Purificación de proteína expresada de forma heteróloga a través etiqueta 6xHis
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Lisis del cultivo de expresión en bacterias: 50 ml de cultivo se separaron por centrifugación a 2360 x g, y a continuación se resuspendieron en 5 ml de tampón fosfato de Na (pH 8) con EDTA 5 mM, NaCl 300 mM y 1 mg/ml de lisozima y se incubaron durante 1 h a TA. El lisado se centrifugó a 2360 x g durante 10 min y el sobrenadante se purificó a través de una columna empaquetada Protino Ni-TED 2000 (de acuerdo con
5 los datos del fabricante; Macherey-Nagel, Düren). La concentración de proteínas se determinó mediante Bradford.
Detección de la actividad enzimática a través de un ensayo acoplado
La actividad se determinó en un ensayo acoplado, en el que como producto secundario se continúa haciendo reaccionar en una segunda etapa el piruvato que resulta de la reacción de transaminasa, 10 oxidándose NADH en NAD+. La disminución de la concentración en NADH (principio: medición de la disminución de la extinción) se mide en el fotómetro a 340 nm y sirve como medida de la actividad.
- Tanda
-
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- 50 mM
- Fosfato de Na pH 7,5
- 50 mM
- L-alanina
- 100 µM
- Fosfato de piridoxal
- 250 µg
- Éster metílico del ácido 12-oxododecanoico
- 1,25 mM
- NADH
- 10 U
- Lactato deshidrogenasa
- 10 µg
- Proteína expresada de forma heteróloga
- con H2Obidest
- completar hasta 1 ml
El ensayo se inició mediante la adición de 5 μl de 12-ODME (50 mg/ml). La medición tiene lugar de forma continua cada minuto a 340 nm a TA hasta como máx. 20 minutos. Para el control se utilizó proteína inactivada y una tanda sin sustrato de Co. En la Figura 16 pudo vigilarse fotométricamente la variación de la extinción.
Detección de la proteína expresada de forma heteróloga a través de HPLC
- Tanda
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- 50 mM
- Fosfato de Na pH 7,5
- 50 mM
- L-alanina
- 100 µM
- Fosfato de piridoxal
- 250 µg
- Éster metílico del ácido 12-oxododecanoico
- 50 µg
- Proteína expresada de forma heteróloga
- con H2Obidest
- completar hasta 500 µl
- Después de incubación durante 4 h a TA, la reacción se detuvo con 1 vol. de MeOH. Para la analítica por
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- HPLC, la tanda se derivatizó con o-ftaldialdehído (oPA) y de ello se analizaron 250 μl. Como eluyente A se
- utilizó NaAC 50 mM pH 4: acetonitrilo 4:1 (v:v).
- El eluyente B era acetonitrilo con 5% de NaAC 50 mM pH 4. El gradiente discurría de 30% de B a 60% de B
- en 4 min, de 60% de B a 100% de B en 2 min. El caudal ascendió a 1,2 ml/min.
- La separación tuvo lugar a través de una columna Agilent Zorbax RP18 (Agilent Technologies, EE.UU.), la
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- temperatura de la columna ascendió a 40ºC.
- La Figura 17 (arriba) muestra la formación de éster metílico del ácido 12-aminoláurico. La muestra de
- referencia está representada abajo en la Figura 17.
- D
- Aminación de éster metílico del ácido12-oxoláurico con PPTA5 y PSTA de Pseudomonas
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D1. Clonación de PPTA5 y PSTA
Para la aminación de éster metílico del ácido 12-oxoláurico se emplearon las cepas E. coli BL21(DE3)/PPTA5 y E. coli BL21(DE3)/PSTA. Estas cepas se construyeron como sigue. Para la clonación de los dos genes transaminasa se eligió el vector de expresión pET-21a(+) (Novagen). Para el gen ppta5, SEQ.-ID-NO 40 se construyeron cebadores que deberían añadir al gen los lugares de corte por restricción NdeI y XhoI en los extremos; cebador PPTA5_NdeI: GGAATTCCATATGAGCGTCAACAACCCGCAAACCCG (SEQ.-ID-NO 44) y cebador PPTA5_XhoI: CCGCTCGAGTTATCGAATCGCCTCAAGGGTCAGGTCC (SEQ.-ID-NO 45). Para el gen psta, SEQ.-ID-NO 41, cebador con NdeI y BamHI en los extremos; cebador PSTA_NdeI: GGAATTCCATATGAGCGATTCGCAAACCCTGCACTGGC (SEQ.-ID-NO 46) y cebador PSTA_BamHI: CGCGGATCCTCAGCCCAGCACATCCTTGGCTGTCG (SEQ.-ID-NO 47)
Estos cebadores se emplearon en PCRs. Los productos de la PCR purificados, así como el vector pET21a(+) se sometieron a continuación a una restricción con las enzimas de restricción NdeI y XhoI o bien NdeI y BamHI. El vector cortado se desfosforiló con fosfatasa alcalina de camarones. El vector cortado con NdeI y XhoI y el gen ppta5, así como el vector cortado con NdeI y BamHI y el gen psta se transformaron después del ligamiento con T4 ADN ligasa con la cepa de expresión competente E. coli XL1-blue. Después del cultivo de algunos clones tuvo lugar el aislamiento de los plásmidos con la subsiguiente restricción y análisis efectroforético en gel. Las secuencias de transaminasa de los clones obtenidos (pPPTA5 o bien pPSTA) se confirmaron mediante análisis de la secuencia. La Figura 18 muestra los mapas de plásmidos de los vectores de expresión.
D2. Expresión de PPTA5 y PSTA
Para la expresión, los vectores pPPTA5 y pPSTA se transformaron en células BL21(DE3) de E. coli competentes. En cada caso, una colonia individual se sobre-inoculó en 5 ml de medio LB-Amp (concentración de ampicilina 100 μg/ml) y se agitó durante una noche a 37 ºC. A continuación, se sobreinoculó al 1% en 200 ml de medio LB-Amp, se agitó a 37 ºC y, después de alcanzar una DO600 de 0,5, se indujo la expresión del gen con IPTG 0,5 mM. Después de agitar durante 20 horas a 30ºC, se recolectaron las células y se almacenaron a -20ºC.
Para la disgregación de las cepas E. coli BL21(DE3)/pPPTA5 y E. coli BL21(DE3)/pPSTA, se elaboraron en cada caso 0,4 g de células con tampón Tris-HCl 100 mM pH 7,2 para formar suspensiones de células al 25% que fueron tratadas dos veces durante 90 s con ultrasonidos (Bandelin Sonoplus HD2070, sonda MS73; 50% de intensidad). Después de la centrifugación se retiraron los sobrenadantes. Los extractos brutos, así obtenidos, se emplearon en reacciones de éster metílico del ácido 12-oxoláurico. Las tandas de 400 μl contenían éster metílico del ácido 12-oxoláurico 5 mM disuelto en N,N-dimetilformamida, DL-alanina 500 mM, piridoxal-5’-fosfato 1 mM y 80 μl de extracto bruto en tampón Kpi 10 mM pH 7,0. Se agitó a 25ºC. Después de tiempos determinados se recogieron muestras de en cada caso 20 μl, una parte con 1 μl de disolución de NaOH al 1% se llevó al intervalo de pH alcalino y se separó por agitación con 100 μl de éster etílico del ácido acético. Las fases orgánicas se examinaron mediante cromatografía de gases (cromatógrafo razón social Perkin Elmer, Clarus 500 con detector de ionización de llama). Para ello se utilizó una columna Optima 5 (0,25 μm, 30 m, 0,25 mm, Macherey Nagel), con el programa:
80ºC 25ºC/min 180ºC 5ºC/min 215ºC 20ºC/min 280ºC
Los tiempos de retención de éster metílico del ácido 12-oxo-y 12-amino-láurico se encuentran en 7,2 o bien 7,7 min.
Los resultados de las reacciones están representados en las Figuras 20 y 21. Para la evaluación se sumaron las superficies pico de éster metílico del ácido 12-oxo-y 12-amino-láurico a partir de los cromatogramas obtenidos de la extracción neutra y ácida y se calculó la porción porcentual de precursor o bien producto.
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