JP6020706B2

JP6020706B2 - ジペプチド合成酵素（バリアント）をコードするｄｎａ、エシェリヒア属に属する細菌、およびそれらを用いるジペププドの生産方法

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Publication number: JP6020706B2
Application number: JP2015501974A
Authority: JP
Inventors: ヴァシリエヴィッチスミルノフ，セルゲイ; ミハイロヴィッチソコロフ，パーヴェル; 崇敬伊藤
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2012-07-11
Filing date: 2013-07-11
Publication date: 2016-11-02
Anticipated expiration: 2033-07-11
Also published as: WO2014010755A1; US9428783B2; US20150197782A1; RU2012129311A; CN104603264A; JP2015525561A; EP2872624A1

Description

本発明は、生物工学産業、具体的には、新規ジペプチド合成酵素、およびジペプチド、特に、酸性Ｌ−アミノ酸残基をＮ末端に有するジペプチドの生産方法に関する。

ジペプチドは、医薬・食品分野、および種々の他分野で用いられる。例えば、ジペプチドＡｓｐ−Ｇｌｕは、利尿およびナトリウム利尿性医薬組成物の調製に用いられている（特許文献１）。ＮＭＤＡ受容体のＮＲ１／ＮＲ２ＡおよびＮＲ１／ＮＲ２Ｂサブタイプに対するアゴニスト効果を有するジペプチドを含む医薬組成物が知られている（特許文献２）。多数のジペプチドの味覚特性が研究されている。例えば、ジペプチドＡｓｐ−Ｖａｌは、酸味を有する（非特許文献１）。Ｇｌｕ−Ａｌａ、Ｇｌｕ−Ａｓｐ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−Ｉｌｅ、Ａｓｐ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ｇｌｕ、Ｔｒｐ−Ｇｌｕ等のグルタミン酸含有ジペプチドを用いることにより得られる優れた塩味強化剤が知られている（特許文献３）。

タンパク質加水分解物からの抽出、保護および／または活性化アミノ酸からの化学合成、ならびにペプチダーゼおよび保護アミノ酸を用いる酵素合成を含む、種々のジペプチド生産方法が知られている（非特許文献２、３）。反復アミノ酸配列（Ａｓｐ−Ｐｈｅ）ｎを含むペプチドをコードするクローニング媒体がジペプチドＡｓｐ−Ｐｈｅのベンジル化およびメチル化誘導体の生産に有用であることが報告されている（特許文献４）。

化学および／または化学−酵素アプローチを用いるジペプチド合成は、連結されるアミノ酸の官能基に対する保護基の導入および脱離、ならびにラセミ混合物からの所望の生成物の単離を必要とする。したがって、このプロセスは、費用、効率、および有機溶媒、塩等の付随化学品の廃棄の必要性などの観点から不利であると考えられる。

ジペプチドおよびその誘導体の酵素合成のための幾つかのアプローチが報告されている。このようなものとして、Ｌ−アミノ酸エステルおよびＬ−アミノ酸からペプチドを生産する能力を有するプロリンイミノペプチダーゼの逆反応を用いる方法（特許文献５）、非リボソームペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）を用いる方法（特許文献６、７、非特許文献４、５）、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを用いる方法（特許文献８〜１０）、ならびにペプチド合成活性を有する変異タンパク質を用いる方法（特許文献１１）が挙げられる。

ＡＴＰ依存性カルボキシレート−アミン／チオールαリガーゼスーパーファミリーに属する酵素が、２つのＬ−アミノ酸間にαペプチド結合を有するジペプチドの生産のため広く用いられている。例えば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８のゲノムＤＮＡのデータベースであるＳｕｂｔｉＬｉｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｌｉｓｔ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ＳｕｂｔｉＬｉｓｔ／）の相同性検索機能、およびバチルス・サブチリス１６８由来のＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａリガーゼ遺伝子のアミノ酸配列を用いることにより、特にＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｙ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、およびＬ−Ｔｈｒ等のＬ−アミノ酸をＮ末端に有するジペプチドを合成し得る酵素をコードするｙｗｆＥ遺伝子が見出された（特許文献１２、１３、非特許文献６）。ＹｗｆＥタンパク質（バチリシン（ｂａｃｉｌｙｓｉｎ）シンテターゼ、酵素分類番号（ＥＣ）６．３．２．２８）は非常に広範な基質特異性を有するにもかかわらず、この酵素は、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｇｌｕ、およびＬ−Ａｓｐ等の高度に荷電したアミノ酸、ならびにＬ−Ｐｒｏ等の二級アミンを許容しない（非特許文献６）。また、リゾクチシン（ｒｈｉｚｏｃｔｉｃｉｎ）シンテターゼ遺伝子によりコードされ、Ｌ−アミノ酸Ｇｌｙおよびβ−Ａｌａを基質として利用する、ジペプチド合成活性を有するタンパク質が記載されている（特許文献１４）。遊離リン酸（Ｐｉ）、ならびにＴＯＦＭＳおよびＮＭＲ解析により確認されるように、この酵素は、ジペプチドのＮ末端にＬ−ＡｒｇおよびＬ−Ｌｙｓを配置する。隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）に基づくプロフィール解析により、リン酸の放出により証明されるように、種々のペプチジル化合物をＬ−アミノ酸から生成し得る、トレポネマ・デンチコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａ）ＡＴＣＣ３５４０５、フォトラビダス・ルミネッセンス亜種・ラウモンジー（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｓｕｂｓｐ．Ｌａｕｍｏｎｄｉｉ）ＴＴＯ１、ストレプトコッカス・ミュータンツ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｔｓ）ＵＡ１５９、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＴＩＧＲ４、およびアクチノバチルス・プレウロニューモニエ・セロバル１株（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｓｅｒｏｖａｒ１ｓｔｒ．）４０７４を由来とする５つのＬ−アミノ酸αリガーゼ（Ｌａｌ）が明らかにされた（非特許文献７）。如何なるジペプチド生成も、Ｌ−ＧｌｕまたはＬ−Ａｓｐの他のＬ−アミン酸との組合せでは確認されなかった。ペプチド合成活性を有する変異タンパク質が、標品試料を用いるＨＰＬＣにより、Ｌ−ＭｅｔをＮ末端に保持するジペプチドを生成することが確認された（特許文献１１）。ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴサービス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）の支援で行われた、バチルス・サブチリス由来のＬａｌ（ＢｓＬａｌ）のアミノ酸配列に基づくインシリコ・スクリーニングにより、リン酸の放出により確認されたように、ジペプチド結合を生成し得る、ラルストニア・ソラナセアラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）由来のタンパク質ＲＳｐ１４８６ａが明らかとなった（特許文献１５、非特許文献８）。ＮＭＲを用いた構造解析により、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｌａ、およびＬ−ＣｙｓをＮ末端に有するジペプチドの生成が確認された。ＲＳｐ１４８６ａならびにＬ−ＡｓｐおよびＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｃｙｓ、またはＬ−Ａｌａ、あるいはＲＳｐ１４８６ａならびにＬ−ＧｌｕおよびＬ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｓｅｒ、またはＬ−Ａｌａを含む混合液において無機リン酸の放出が確認されたにもかかわらず、反応生成物の構造解析は行われなかった。バックグランドレベルを超える如何なる追加的なリン酸放出も、ＲＳｐ１４８６ａおよびＬ−ＡｓｐまたはＬ−Ｇｌｕを含む反応混合液において観察されなかった。新たに発見されたＬ−アミノ酸リガーゼである、バチルス・サブチリスＮＢＲＣ３１３４由来のＲｉｚＢは、２〜５個のアミノ酸残基からなる分岐鎖アミノ酸の種々のヘテロペプチドおよびホモオリゴマーを合成することが見出された（非特許文献９）。例えば、Ｌ−Ｖａｌの二量体、三量体、および四量体の生成が、ＲｉｚＢ、Ｌ−Ｖａｌ、およびＬ−ＧｌｕまたはＬ−Ａｓｐを含む混合液において、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ解析により証明された。如何なるヘテロペプチドも明らかにされていなかった。

仏国特許出願公開第２６６２３５９号明細書特開２００９−２０９１３１号国際公開２００９／１１３５６３号公報欧州特許出願第００３６２５８号露国特許第２２７９４４０号明細書米国特許第５，７９５，７３８号明細書米国特許第５，６５２，１１６号明細書特開昭５８−１４６５３９号（１９８３）特開昭５８−２０９９９２号（１９８３）特開昭５９−１０６２９８号（１９８４）露国特許出願第２００７１２７７１９号明細書米国特許第７，５１４，２４３号明細書米国特許第７，９３９，３０２号明細書米国特許第７，９３９，２９４号明細書欧州特許出願第１８７０４５４号明細書

ＳｏｇａｍｅＳ．およびＭａｔｓｕｓｈｉｔａＩ．，ＮｅｗＦｏｏｄＩｎｄ．，１９９６，３８（１２）：４４−４９（Ｊａｐａｎｅｓｅ）ＡｋａｂｏｒｉＳ．ら，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ，１９６１，３４：７３９ＭｏｎｔｅｒＢ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９１，１４（２）：１８３−１９１ＤｏｅｋｅｌＳ．およびＭａｒａｈｉｅｌＭ．Ａ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０００，７：３７３−３８４ＤｉｅｃｋｍａｎｎＲ．ら，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，２００１，４９８：４２−４５ＴａｂａｔａＫ．ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００５，１８７（１５）：５１９５−５２０２ＳｅｎｏｏＡ．ら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１０，７４（２）：４１５−４１８ＫｉｎｏＫ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００８，３７１：５３６−５４０ＫｉｎｏＫ．，ＹａｋｕｇａｋｕＺａｓｓｈｉ，２０１０，１３０（１１）：１４６３−１４６９

現在までに、Ｌ−アミノ酸αリガーゼ（Ｌａｌ）を用いて、Ｌ−ＧｌｕまたはＬ−Ａｓｐ残基等の酸性Ｌ−アミノ酸残基をＮ末端に有し、かつ任意の他のＬ−アミノ酸またはその誘導体をＣ末端に有するジペプチドの合成を実証する如何なるデータも報告されていない。

本発明の局面は、アデノシン５’−トリホスフェート（ＡＴＰ）またはその塩等の高エネルギー分子を含む反応混合液において、Ｌ−ＡｓｐまたはＬ−Ｇｌｕ等の酸性Ｌ−アミノ酸をＮ末端に有し、かつ任意の他のＬ−アミノ酸またはその誘導体をＣ末端に有するジペプチドを合成し得るＬ−アミノ酸αリガーゼ（Ｌａｌ）をコードするＤＮＡを提供することである。

本発明の別の局面は、本明細書中に記載される、ＬａｌをコードするＤＮＡを含むように改変されたエシェリヒア属、例えばエシェリヒア・コリ種に属する細菌を提供することである。

本発明の別の局面は、本明細書中に記載されるＬａｌ酵素、または本明細書中に記載される、Ｌａｌ酵素をコードするＤＮＡを含むように改変されたエシェリヒア属の細菌を用いて、アデノシン５’−トリホスフェート（ＡＴＰ）またはその塩等の高エネルギー分子を含む反応混合液における、Ｌ−ＡｓｐまたはＬ−Ｇｌｕ等の酸性Ｌ−アミノ酸をＮ末端に有し、かつ任意の他のＬ−アミノ酸またはその誘導体をＣ末端に有するジペプチドの生産方法を提供することである。

これらの目的は、Ｌ−ＡｓｐまたはＬ−Ｇｌｕ残基等の酸性Ｌ−アミノ酸残基をＮ末端に有するジペプチドの生成を触媒する、新規に見出された細菌性Ｌ−アミノ酸αリガーゼ（Ｌａｌ）により達成される。

本発明の局面は、ジペプチド合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを提供することであり、ここで、ＤＮＡは、以下からなる群より選ばれる：
（Ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５および１７の塩基配列を有するＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５および１７で示される配列に相補的な塩基配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ストリンジェント条件が、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳまたは０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの塩濃度を含む溶液中での６０℃または６５℃での１以上の洗浄を含む、ＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８のアミノ酸配列を有するが、１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含み、かつ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８のアミノ酸配列のジペプチド合成活性を有するバリアントタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８のアミノ酸配列に対する１２８以上、１４２以上、１６２以上、１７５以上、１８２以上、１９６以上、または２３３以上の｜Ｌｏｇ１０（Ｅ値）｜値、ならびに配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８のアミノ酸配列のジペプチド合成活性により規定される、相同性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

本発明の局面は、上記ＤＮＡを含む、上記ＤＮＡの発現用組換えＤＮＡを提供することである。

本発明の局面は、上記組換えＤＮＡを含むように改変された、エシェリヒア属に属するジペプチド生産細菌を提供することである。

本発明のさらなる局面は、エシェリヒア・コリ種に属する上記細菌を提供することである。

本発明のさらなる局面は、ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードする１以上の遺伝子が改変されて減弱または不活化されている上記細菌を提供することである。

本発明のさらなる局面は、ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、ｐｅｐＡ、ｐｅｐＢ、ｐｅｐＤ、ｐｅｐＥ、ｐｅｐＰ、ｐｅｐＱ、ｐｅｐＮ、ｐｅｐＴ、ｉａｄＡ、ｉａａＡ（ｙｂｉＫ）、およびｄａｐＥからなる群より選ばれる、上記細菌を提供することである。

本発明の局面は、ジペプチド合成活性を有するタンパク質を提供することである。ここで、タンパク質は、以下からなる群より選ばれる：
（Ｆ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（Ｇ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８のアミノ酸配列を有するが、１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含み、かつ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８のアミノ酸配列のジペプチド合成活性を有するバリアントタンパク質；
（Ｈ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８のアミノ酸配列に対する１２８以上、１４２以上、１６２以上、１７５以上、１８２以上、１９６以上、または２３３以上の｜Ｌｏｇ１０（Ｅ値）｜値、ならびに配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８のアミノ酸配列のジペプチド合成活性により規定される、相同性を有するタンパク質。

本発明の局面は、以下を含む、上記タンパク質の生産方法を提供することである：
（ａ）培養培地中で上記細菌を培養して、タンパク質を生産すること；
（ｂ）細菌または培養培地中、あるいはその双方にタンパク質を蓄積させること；および、必要に応じて
（ｃ）細菌または培養培地からタンパク質を回収すること。

本発明の局面は、以下の工程を含む、ジペプチドまたはその塩の生産方法を提供することである：
（ａ）上記タンパク質の存在下における適切な条件下でＬ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸誘導体、あるいはそれらの塩を反応させること；
（ｂ）適切な溶媒中にジペプチドまたはその塩を蓄積させること；および、必要に応じて
（ｃ）適切な溶媒からジペプチドまたはその塩を回収すること。

本発明の局面は、以下の工程を含む、ジペプチドまたはその塩の生産方法を提供することである：
（ａ）培養培地中で上記細菌を培養すること；
（ｂ）細菌または培養培地中、あるいはその双方にタンパク質を蓄積させること；および、必要に応じて
（ｃ）細菌または培養培地からタンパク質を回収すること。

本発明のさらなる局面は、Ｌ−アミノ酸またはその誘導体が、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、およびＬ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルである、上記方法を提供することである。

本発明のさらなる局面は、ジペプチドが、式：Ｒ１−Ｒ２により表され、
Ｒ１が、酸性Ｌ−アミノ酸残基、または酸性Ｌ−アミノ酸残基の誘導体であり、
Ｒ２が、Ｌ−アミノ酸残基、またはＬ−アミノ酸残基の誘導体であり、
Ｌ−アミノ酸残基が、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、およびＬ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルからなる群より選ばれる、上記方法を提供することである。

本発明のさらなる局面は、Ｒ１が、Ｌ−アスパラギン酸またはＬ−グルタミン酸残基であり、Ｒ２が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−バリン、またはＬ−フェニルアラニン残基の低級アルキルエステルである、上記方法を提供することである。

本発明のさらなる局面は、Ｒ１が、Ｌ−アスパラギン酸残基であり、Ｒ２が、Ｌ−フェニルアラニン、またはＬ−フェニルアラニン残基の低級アルキルエステルである、上記方法を提供することである。

本発明のさらなる局面は、Ｌ−フェニルアラニン残基の低級アルキルエステルが、Ｌ−フェニルアラニンのメチル、エチルまたはプロピルエステルである、上記方法を提供することである。

本発明は、以下に詳細に記載される。

図１は、Ｌ−アミノ酸リガーゼ（Ｌａｌ）により触媒される連結反応についてのスキームを示す。Ｒ_ＡおよびＲ_Ｂは、同種または異種であり得る側鎖基である。ＡＴＰはアデノシン５’−トリホスフェートを示し、ＡＤＰはアデノシン５’−ジホスフェートを示し、Ｐｉは無機ホスフェート、リン酸、またはそれらの塩を示す。図２は、同種の標準Ｌ−アミノ酸の連結におけるＢＢＲ４７＿５１９００の活性を示す。図３は、異なる２種の標準Ｌ−アミノ酸（ここで１種はＬ−Ｇｌｕである）の連結におけるＢＢＲ４７＿５１９００の活性を示す。Ｃｎｔ：コントロール（Ｌ−Ａｓｐ）。図４は、異なる２種の標準Ｌ−アミノ酸（ここで１種はＬ−Ａｓｐである）の連結におけるＢＢＲ４７＿５１９００の活性を示す。Ｃｎｔ：コントロール（Ｌ−Ａｓｐ）。図５は、異なる２種の標準Ｌ−アミノ酸（ここで１種はＬ−Ａｓｐである）の連結におけるＳｔａｕｒ＿４８５１の活性を示す。図６は、ＴＬＣ解析により決定された、Ｌ−ＡｓｐおよびＬ−Ｐｈｅの連結におけるＳｔａｕｒ＿４８５１の活性を示す。１−（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ９．０５０ｍＭ，ＭｇＣｌ_２１０ｍＭ，Ｌ−Ａｓｐ１０ｍＭ，Ｌ−Ｐｈｅ１０ｍＭ，ＡＴＰ１０ｍＭ，Ｓｔａｕｒ＿４８５１２μｇ）；２−（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０５０ｍＭ，ＭｇＣｌ_２１０ｍＭ，Ｌ−Ａｓｐ１０ｍＭ，Ｌ−Ｐｈｅ１０ｍＭ，ＡＴＰ１０ｍＭ，Ｓｔａｕｒ＿４８５１２μｇ）；３−（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０５０ｍＭ，ＭｇＣｌ_２１０ｍＭ，Ｌ−Ａｓｐ２０ｍＭ，Ｌ−Ｐｈｅ０ｍＭ，ＡＴＰ１０ｍＭ，Ｓｔａｕｒ＿４８５１２μｇ）；４−（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０５０ｍＭ，ＭｇＣｌ_２１０ｍＭ，Ｌ−Ａｓｐ０ｍＭ，Ｌ−Ｐｈｅ２０ｍＭ，ＡＴＰ１０ｍＭ，Ｓｔａｕｒ＿４８５１２μｇ）；５−（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０５０ｍＭ，ＭｇＣｌ_２１０ｍＭ，Ｌ−Ａｓｐ１０ｍＭ，Ｌ−Ｐｈｅ１０ｍＭ，ＡＴＰ０ｍＭ，Ｓｔａｕｒ＿４８５１２μｇ）；６−（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０５０ｍＭ，ＭｇＣｌ_２１０ｍＭ，Ｌ−Ａｓｐ１０ｍＭ，Ｌ−Ｐｈｅ１０ｍＭ，ＡＴＰ１０ｍＭ，Ｓｔａｕｒ＿４８５１０μｇ）。図７は、ＬＣ−ＱＴＯＦ／ＭＳ／ＭＳ解析により決定されたＬ−ＡｓｐおよびＬ−Ｐｈｅの連結におけるＢＢＲ４７＿５１９００の活性を示す。ＳＰ：サンプル；ＳＴ：標品（αＡｓｐ−ＰｈｅおよびβＡｓｐ−Ｐｈｅ）。図８は、ＬＣ−ＱＴＯＦ／ＭＳ／ＭＳ解析により決定されるＬ−ＡｓｐおよびＬ−Ｖａｌの連結におけるＢＢＲ４７＿５１９００の活性を示す図である。ＳＰ：サンプル；ＳＴ：標品（αＡｓｐ−Ｖａｌ）。図９は、ＬＣ−ＱＴＯＦ／ＭＳ／ＭＳ解析により決定されるＬ−ＧｌｕおよびＬ−Ｖａｌの連結におけるＢＢＲ４７＿５１９００の活性を示す図である。ＳＰ：サンプル；ＳＴ：標品（αＧｌｕ−ＶａｌおよびγＧｌｕ−Ｖａｌ）。図１０は、ＢＢＲ４７＿５１９００およびＳｔａｕｒ＿４８５１のアライメントを示す（ＣｌｕｓｔａｌＷ，ＰＩＲ形式で出力）。図１１−１は、ＢＢＲ４７＿５１９００およびＳｔａｕｒ＿４８５１のアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の４９ヒットを提示する）（その１）。図１１−２は、ＢＢＲ４７＿５１９００およびＳｔａｕｒ＿４８５１のアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の４９ヒットを提示する）（その２）。図１１−３は、ＢＢＲ４７＿５１９００およびＳｔａｕｒ＿４８５１のアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の４９ヒットを提示する）（その３）。図１２は、ＢＢＲ４７＿５１９００およびＳｔａｕｒ＿４８５１のアライメント（図１０を参照）を用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた｜Ｌｏｇ１０（Ｅ値）｜値の分布図を示す。以下のヒットに、実線の矢印を付す：１−ＢＢＲ４７＿５１９００，２−Ｓｔａｕｒ＿４８５１，３−ＤＥＳ，４−ＢＣＥ，５−ＢＭＹ，１３−ＢＴＨ，１７−ＢＵＲ，４７−ＡＭＥ，４９−ＳＦＬ。図１３は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳおよびＢＣＥのアライメントを示す（ＣｌｕｓｔａｌＷ，ＰＩＲ形式で出力）。図１４−１は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳおよびＢＣＥのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の６５ヒットを提示する）（その１）。図１４−２は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳおよびＢＣＥのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の６５ヒットを提示する）（その２）。図１４−３は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳおよびＢＣＥのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の６５ヒットを提示する）（その３）。図１４−４は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳおよびＢＣＥのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の６５ヒットを提示する）（その４）。図１５は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳおよびＢＣＥのアライメント（図１３を参照）を用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた｜Ｌｏｇ１０（Ｅ値）｜値の分布図を示す。以下のヒットに、実線の矢印を付す：１−ＢＢＲ４７＿５１９００，２−ＤＥＳ，３−ＢＣＥ，４−Ｓｔａｕｒ＿４８５１，５−ＢＭＹ，８−ＢＴＨ，１８−ＢＵＲ，３３−ＡＭＥ，６２−ＳＦＬ。図１６−１は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥおよびＢＭＹのアライメントにおける整列したＢＢＲ４７＿５１９００，Ｓｔａｕｒ＿４８５１およびＤＥＳを示す（ＣｌｕｓｔａｌＷ，ＰＩＲ形式で出力）。図１６−２は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥおよびＢＭＹのアライメントにおける整列したＢＣＥおよびＢＭＹを示す（ＣｌｕｓｔａｌＷ，ＰＩＲ形式で出力）。図１７−１は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥおよびＢＭＹのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の６５ヒットを提示する）（その１）。図１７−２は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥおよびＢＭＹのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の６５ヒットを提示する）（その２）。図１７−３は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥおよびＢＭＹのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の６５ヒットを提示する）（その３）。図１７−４は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥおよびＢＭＹのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の６５ヒットを提示する）（その４）。図１７−５は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥおよびＢＭＹのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の６５ヒットを提示する）（その５）。図１８−１は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹおよびＢＴＨのアライメントにおける整列したＳｔａｕｒ＿４８５１、ＢＢＲ４７＿５１９００およびＢＣＥを示す（ＣｌｕｓｔａｌＷ，ＰＩＲ形式で出力）。図１８−２は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹおよびＢＴＨのアライメントにおける整列したＤＥＳ、ＢＭＹおよびＢＴＨを示す（ＣｌｕｓｔａｌＷ，ＰＩＲ形式で出力）。図１９−１は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹおよびＢＴＨのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の７３ヒットを提示する）（その１）。図１９−２は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹおよびＢＴＨのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の７３ヒットを提示する）（その２）。図１９−３は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹおよびＢＴＨのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の７３ヒットを提示する）（その３）。図１９−４は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹおよびＢＴＨのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の７３ヒットを提示する）（その４）。図１９−５は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹおよびＢＴＨのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の７３ヒットを提示する）（その５）。図２０−１は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨおよびＢＵＲのアライメントにおける整列したＳｔａｕｒ＿４８５１およびＢＢＲ４７＿５１９００を示す（ＣｌｕｓｔａｌＷ，ＰＩＲ形式で出力）。図２０−２は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨおよびＢＵＲのアライメントにおける整列したＢＣＥおよびＤＥＳを示す（ＣｌｕｓｔａｌＷ，ＰＩＲ形式で出力）。図２０−３は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨおよびＢＵＲのアライメントにおける整列したＢＭＹおよびＢＴＨを示す（ＣｌｕｓｔａｌＷ，ＰＩＲ形式で出力）。図２０−４は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨおよびＢＵＲのアライメントにおける整列したＢＵＲを示す（ＣｌｕｓｔａｌＷ，ＰＩＲ形式で出力）。図２１−１は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨおよびＢＵＲのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の１０４ヒットを提示する）（その１）。図２１−２は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨおよびＢＵＲのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の１０４ヒットを提示する）（その２）。図２１−３は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨおよびＢＵＲのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の１０４ヒットを提示する）（その３）。図２１−４は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨおよびＢＵＲのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の１０４ヒットを提示する）（その４）。図２１−５は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨおよびＢＵＲのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の１０４ヒットを提示する）（その５）。図２１−６は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨおよびＢＵＲのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の１０４ヒットを提示する）（その６）。図２１−７は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨおよびＢＵＲのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の１０４ヒットを提示する）（その７）。図２２−１は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨ、ＢＵＲおよびＡＭＥのアライメントにおける整列したＳｔａｕｒ＿４８５１およびＢＢＲ４７＿５１９００を示す（ＣｌｕｓｔａｌＷ，ＰＩＲ形式で出力）。図２２−２は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨ、ＢＵＲおよびＡＭＥのアライメントにおける整列したＢＣＥおよびＤＥＳを示す（ＣｌｕｓｔａｌＷ，ＰＩＲ形式で出力）。図２２−３は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨ、ＢＵＲおよびＡＭＥのアライメントにおける整列したＢＭＹおよびＢＴＨを示す（ＣｌｕｓｔａｌＷ，ＰＩＲ形式で出力）。図２２−４は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨ、ＢＵＲおよびＡＭＥのアライメントにおける整列したＢＵＲおよびＡＭＥを示す（ＣｌｕｓｔａｌＷ，ＰＩＲ形式で出力）。図２３−１は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨ、ＢＵＲおよびＡＭＥのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の６５ヒットを提示する）（その１）。図２３−２は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨ、ＢＵＲおよびＡＭＥのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の６５ヒットを提示する）（その２）。図２３−３は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨ、ＢＵＲおよびＡＭＥのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の６５ヒットを提示する）（その３）。図２３−４は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨ、ＢＵＲおよびＡＭＥのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の６５ヒットを提示する）（その４）。図２４−１は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨ、ＢＵＲ、ＡＭＥおよびＳＦＬのアライメントにおける整列したＳｔａｕｒ＿４８５１およびＢＢＲ４７＿５１９００を示す（ＣｌｕｓｔａｌＷ，ＰＩＲ形式で出力）。図２４−２は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨ、ＢＵＲ、ＡＭＥおよびＳＦＬのアライメントにおける整列したＢＣＥおよびＤＥＳを示す（ＣｌｕｓｔａｌＷ，ＰＩＲ形式で出力）。図２４−３は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨ、ＢＵＲ、ＡＭＥおよびＳＦＬのアライメントにおける整列したＢＭＹおよびＢＴＨを示す（ＣｌｕｓｔａｌＷ，ＰＩＲ形式で出力）。図２４−４は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨ、ＢＵＲ、ＡＭＥおよびＳＦＬのアライメントにおける整列したＢＵＲおよびＡＭＥを示す（ＣｌｕｓｔａｌＷ，ＰＩＲ形式で出力）。図２４−５は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨ、ＢＵＲ、ＡＭＥおよびＳＦＬのアライメントにおける整列したＳＦＬを示す（ＣｌｕｓｔａｌＷ，ＰＩＲ形式で出力）。図２５−１は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨ、ＢＵＲ、ＡＭＥおよびＳＦＬのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の３８ヒットを提示する）（その１）。図２５−２は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨ、ＢＵＲ、ＡＭＥおよびＳＦＬのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の３８ヒットを提示する）（その２）。図２５−３は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨ、ＢＵＲ、ＡＭＥおよびＳＦＬのアライメントを用いたＨＭＭ検索プログラムにより得られた出力データを示す（最初の３８ヒットを提示する）（その３）。図２６は、ＨＭＭプロフィール（モデル１〜７）を用いた同機能Ｌａｌの解析を示す。＊Ｅ値＝０（図２１、２３、および２５）。ＢＢＲはＢＢＲ４７＿５１９００を示し、ＳＴＡはＳｔａｕｒ＿４８５１を示す。図２７は、Ｅ．ｃｏｌｉ４−５Δ株における特異的なアスパラギン酸ペプチド加水分解（ＤＰ３−加水分解）活性のＴＬＣ解析を示す。５−フルオロトリプトファン（標品）の溶液（１μＬ）を、検量のため用いた（１）３ｍＭ、（２）２ｍＭ、（３）１ｍＭ、および（４）０．５ｍＭ。Ｍｎ^２＋（５，６）またはＺｎ^２＋（７，８）を含む反応混合液１μＬを、ＴＬＣプレート上にロードした。略語：５ＦＴは５−フルオロトリプトファン、ＤＰ３はＬ−Ａｓｐ−Ｌ−５−フルオロトリプトファンジペプチド、ＡｓｐはＬ−アスパラギン酸。図２８は、Ｅ．ｃｏｌｉ１−５Δ株における特異的なアスパラギン酸ペプチド加水分解活性に起因するＤＰ３毒性の試験についての模式図である。Ｅ．ｃｏｌｉ株を、ＤＰ３ジペプチドの存在下で増殖させる。ペプチダーゼ＋株（Ｅ．ｃｏｌｉＰ^＋）により受容されると、ＤＰ３は加水分解されて、Ｌ−アスパラギン酸および５−フロオロトリプトファン（５ＦＴ）を生成する。５ＦＴは、細胞に対して有毒であり、増殖の停止をもたらす。ＤＰ３ジペプチドは安定であり、ペプチダーゼ欠損株において、または低いペプチダーゼ活性を有する株（Ｅ．ｃｏｌｉＰ⁻）において菌体の増殖に影響しない。

１．酵素
「酵素」という語句は、高エネルギー分子依存性様式でアミノ酸を連結して、アミノ酸残基間でペプチド結合を生成する活性を有するＬ−アミノ酸αリガーゼ（Ｌａｌ）を意味し得る。

本発明の酵素は、ＢＢＲ４７＿５１９００（機能未知タンパク質）、Ｓｔａｕｒ＿４８５１（アルギニノスクシネート・リアーゼ２様タンパク質）、ＤＥＳ（ピリドキサール−ホスフェート依存性酵素）、ＢＵＲ（推定リアーゼ）、ＢＣＥ（アルギニノスクシネート・リアーゼ・ドメイン・タンパク質）、ＢＴＨ（機能未知タンパク質ＹＢＴ０２０＿２５５７０）、ＡＭＥ（保存された機能未知タンパク質）、ＳＦＬ（機能未知ＤＵＦ２０１のタンパク質）、およびＢＭＹ（アルギニノスクシネート・リアーゼ・ドメイン・タンパク質）からなる群より選ばれるＬ−アミノ酸αリガーゼであり得るが、これは上述のタンパク質に限定されない。

ブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）ＮＢＲＣ１００５９９（ＮＣＢＩ分類ＩＤ：３５８６８１）由来の遺伝子（ＮＣＢＩ参照番号：ＹＰ＿００２７７４６７１．１；ヌクレオチドの位置：５４６４１６２〜５４６５４１８，相補体；遺伝子ＩＤ：７７２１０４０）の塩基配列、および本遺伝子によりコードされるＢＢＲ４７＿５１９００のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１および配列番号２に示される。
スチグマテラ・アウランチアカ（Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａａｕｒａｎｔｉａｃａ）ＤＷ４／３−１（ＮＣＢＩ分類ＩＤ：３７８８０６）由来の遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＡＤＯ７２６２９．１；ヌクレオチドの位置：５９７３９６３〜５９７５２１６，相補体；遺伝子ＩＤ：９８７８３４４）の塩基配列、および本遺伝子によりコードされるＳｔａｕｒ＿４８５１のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号３および配列番号４に示される。
デスモスポラ・エスピー（Ｄｅｓｍｏｓｐｏｒａｓｐ．）８４３７（ＮＣＢＩ分類ＩＤ：９９７３４６）由来の遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＧＫ０６８１０．１，ＧＩ：３３２９６７７０１）の塩基配列、および本遺伝子によりコードされるＤＥＳのアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号５および配列番号６に示される。
バークホルデリア・シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）３０５（ＮＣＢＩ分類ＩＤ：４２５０６７）由来の遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＢＡ５１２０８．１，ＧＩ：１３４２５１１２９）の塩基配列、および本遺伝子によりコードされるＢＵＲのアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号７および配列番号８に示される。
バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）ＡＨ６２１（ＮＣＢＩ分類ＩＤ：５２６９７２）由来の遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＥＫ７２１９０．１，ＧＩ：２２８６１５０９０）の塩基配列、および本遺伝子によりコードされるＢＣＥのアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号９および配列番号１０に示される。
バチルス・スリンギエンシス亜種・フィニチムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｓｕｂｓｐ．Ｆｉｎｉｔｉｍｕｓ）（株ＹＢＴ−０２０）（ＮＣＢＩ分類ＩＤ：９３０１７０）の遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＤＹ２４３４１．１，ＧＩ：３２４３２９０８１）の塩基配列、および本遺伝子によりコードされるＢＴＨのアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１１および配列番号１２に示される。
アルカリフィラス・メタリレヂゲンス（Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｉｇｅｎｓ）ＱＹＭＦ（ＮＣＢＩ分類ＩＤ：２９３８２６）由来の遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ４８２１６．１，ＧＩ：１４９９４９６８８）の塩基配列、および本遺伝子によりコードされるＡＭＥのアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１３および配列番号１４に示される。
ストレプトマイセス・フラボグリゼウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｆｌａｖｏｇｒｉｓｅｕｓ）ＡＴＣＣ３３３３１（ＮＣＢＩ分類ＩＤ：５９１１６７）由来の遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＤＷ０１９４２．１，ＧＩ：３２０００７０９２）の塩基配列、および本遺伝子によりコードされるＳＦＬのアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１５および配列番号１６に示される。
バチルス・ミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｙｃｏｉｄｅｓ）Ｒｏｃｋ３−１７（ＮＣＢＩ分類ＩＤ：５２６９９９）由来の遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＺＰ＿０４１６０５６４．１，ＧＩ：２２９００２４７５）の塩基配列、および本遺伝子によりコードされるＢＭＹのアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１７および配列番号１８に示される。

属、または当該属の種および株の間のＤＮＡ配列には幾らかの差異があり得るため、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＵＲ、ＢＣＥ、ＢＴＨ、ＡＭＥ、ＳＦＬおよびＢＭＹをコードする遺伝子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、または１７に示される遺伝子に限定されず、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、または１７のバリアント塩基配列、またはそれらのホモログであり、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＵＲ、ＢＣＥ、ＢＴＨ、ＡＭＥ、ＳＦＬおよびＢＭＹタンパク質のバリアントをコードする遺伝子が含まれていてもよい。さらに、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＵＲ、ＢＣＥ、ＢＴＨ、ＡＭＥ、ＳＦＬおよびＢＭＹをコードする遺伝子は、バリアント塩基配列であってもよい。

「バリアント塩基配列」という語句は、「バリアントタンパク質」をコードする塩基配列を意味し得る。
「バリアント塩基配列」という語句は、標準的な遺伝暗号表（例えば、ＬｅｗｉｎＢ．，「ＧｅｎｅｓＶＩＩＩ」，２００４，ＰｅａｒｓｏｎＥｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，ＵｐｐｅｒＳａｄｄｌｅＲｉｖｅｒ，ＮＪ０７４５８参照）による任意の同義アミノ酸コドンを用いて「バリアントタンパク質」をコードする塩基配列を意味し得る。

「バリアント塩基配列」という語句はまた、それが機能的Ｌ−アミノ酸αリガーゼをコードする限り、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、または１７に示される配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、またはストリンジェントな条件下でその塩基配列から作製することができるプローブを意味し得る。「ストリンジェントな条件」は、特異的ハイブリッド、例えば、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の類似性を有するハイブリッドが形成され、非特異的ハイブリッド、例えば、上記より低い相同性を有するハイブリッドが形成されない条件である。洗浄時間は、ブロッティングに用いられるメンブレンの種類に依存し、原則としてメーカーが推奨する時間であり得る。例えば、正に帯電したナイロンメンブレンであるＡｍｅｒｓｈａｍＨｙｂｏｎｄ（商標）−Ｎ＋（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）にストリンジェントな条件下で推奨される洗浄時間は１５分である。洗浄ステップは２〜３回行うことができる。プローブとして、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、または１７に示される配列に相補的な配列の一部を用いてもよい。そのようなプローブは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、または１７に示される配列に基づいて作製されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして、およびそのような塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型として用いるＰＣＲにより作製することができる。プローブの長さは５０ｂｐを超えることが推奨され、これはハイブリダイゼーション条件に基づいて好適に選択することができ、通常、１００ｂｐ〜１ｋｂｐである。

ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＵＲ、ＢＣＥ、ＢＴＨ、ＡＭＥ、ＳＦＬおよびＢＭＹタンパク質をコードする遺伝子は、既に明らかにされているので（上記参照）、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＵＲ、ＢＣＥ、ＢＴＨ、ＡＭＥ、ＳＦＬおよびＢＭＹタンパク質のバリアントタンパク質をコードするバリアント塩基配列は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＵＲ、ＢＣＥ、ＢＴＨ、ＡＭＥ、ＳＦＬおよびＢＭＹをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて調製されたプライマーを利用して、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応；ＷｈｉｔｅＴ．Ｊ．ら，ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．，１９８９，５：１８５−１８９を参照）により得ることができる。ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＵＲ、ＢＣＥ、ＢＴＨ、ＡＭＥ、ＳＦＬおよびＢＭＹタンパク質、または他の微生物のそれらのバリアントタンパク質をコードする遺伝子は、同様の様式で得ることができる。

「バリアントタンパク質」という語句は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、および１８と比較して、配列中に１または数個の変化（これらはアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および／または付加のいずれかである）を有するが、それぞれ、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＵＲ、ＢＣＥ、ＢＴＨ、ＡＭＥ、ＳＦＬおよびＢＭＹタンパク質の活性と同様の活性を依然として維持するか、またはＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＵＲ、ＢＣＥ、ＢＴＨ、ＡＭＥ、ＳＦＬおよびＢＭＹタンパク質の三次元構造が野生型もしくは非改変タンパク質と比べて顕著に変化していないタンパク質を意味し得る。バリアントタンパク質中の変化の数は、タンパク質の三次元構造中のアミノ酸残基の位置または種類に依存する。それは、厳密に限定されるものではないが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、および１８において、１〜４５個、または１〜３０個、または１〜１５個、または１〜１０個、または１〜５個であり得る。

１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加の例は、バリアントタンパク質の活性および特性が維持されており、かつそれらがＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＵＲ、ＢＣＥ、ＢＴＨ、ＡＭＥ、ＳＦＬおよびＢＭＹタンパク質のものと同様である保存的変異であり得る。代表的な保存的変異は保存的置換である。保存的置換は、置換部位が芳香族アミノ酸であれば、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒ間；置換部位が疎水性アミノ酸であれば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、およびＶａｌ間；置換部位が親水性アミノ酸であれば、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、およびＴｈｒ間；置換部位が極性アミノ酸であれば、ＧｌｎおよびＡｓｎ間；置換部位が塩基性アミノ酸であれば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓ間；置換部部位が酸性アミノ酸であれば、ＡｓｐおよびＧｌｕ間；置換部位がヒドロキシル基を有するアミノ酸であれば、ＳｅｒおよびＴｈｒ間、で相互に起こる置換であり得る。保存的置換の例としては、ＳｅｒまたはＴｈｒによるＡｌａの置換、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓによるＡｒｇの置換、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、またはＡｓｐによるＡｓｎの置換、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎによるＡｓｐの置換、ＳｅｒまたはＡｌａによるＣｙｓの置換、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、またはＡｒｇによるＧｌｎの置換、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、またはＡｓｐによるＧｌｕの置換、ＰｒｏによるＧｌｙの置換、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、またはＴｙｒによるＨｉｓの置換、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、またはＰｈｅによるＩｌｅの置換、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、またはＰｈｅによるＬｅｕの置換、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＡｒｇによるＬｙｓの置換、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＰｈｅによるＭｅｔの置換、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕによるＰｈｅの置換、ＴｈｒまたはＡｌａによるＳｅｒの置換、ＳｅｒまたはＡｌａによるＴｈｒの置換、ＰｈｅまたはＴｙｒによるＴｒｐの置換、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、またはＴｒｐによるＴｙｒの置換、およびＭｅｔ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕによるＶａｌの置換が含まれる。バリアントタンパク質中のこれらの変化は、タンパク質の機能に重要でないタンパク質領域中で生じ得る。これは、幾つかのアミノ酸は別のものと高い相同性を有する結果、三次元構造または活性がこのような変化により影響されないためである。したがって、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、または１７に示される遺伝子によりコードされるタンパク質バリアントは、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＵＲ、ＢＣＥ、ＢＴＨ、ＡＭＥ、ＳＦＬおよびＢＭＹタンパク質の機能が維持される限り、それぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、および１８に示されるアミノ酸配列全体に関して、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の類似性または同一性を有していてもよい。あるいは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、または１７に示される遺伝子によりコードされるタンパク質バリアントは、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＵＲ、ＢＣＥ、ＢＴＨ、ＡＭＥ、ＳＦＬおよびＢＭＹタンパク質の機能が維持される限り、それぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、および１８に示されるアミノ酸配列全体に関して、実施例６で以下に記載されるような、ＨＭＭ検索プログラムに基づく隠れマルコフモデルプロフィール（ＨＭＭプロフィール）を構築した場合にそのプログラムにより算出される｜Ｌｏｇ１０（Ｅ値）｜値（ＦｉｎｎＲ．Ｄ．ら，ＨＭＭＥＲｗｅｂｓｅｒｖｅｒ：ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｓｅａｒｃｈｉｎｇ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０１１，３９（ウェブサーバー発行）：Ｗ２９−３７）を用いて規定することができる１２８以上、１４２以上、１６２以上、１７５以上、１８２以上、１９６以上、または２３３以上の相同性を有していてもよい。

１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加の例はまた、アミノ酸配列の異なる位置における１以上の二次的変異によって変異が補償されることによりバリアントタンパク質の活性および特性が維持されており、かつそれらがＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＵＲ、ＢＣＥ、ＢＴＨ、ＡＭＥ、ＳＦＬおよびＢＭＹタンパク質のものと同様である非保存的変異であり得る。

タンパク質またはＤＮＡの相同性の程度を評価するために、ＢＬＡＳＴ検索、ＦＡＳＴＡ検索、およびＣｌｕｓｔａｌＷ法等の幾つかの計算方法を用いることができる。ＢＬＡＳＴ（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ，ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）検索は、プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｍｅｇａｂｌａｓｔ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘに採用されている発見的サーチアルゴリズムであり、これらのプログラムは、ＳａｍｕｅｌＫ．およびＡｌｔｓｃｈｕｌＳ．Ｆ．（「Ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒａｓｓｅｓｓｉｎｇｔｈｅｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｅｑｕｅｎｃｅｆｅａｔｕｒｅｓｂｙｕｓｉｎｇｇｅｎｅｒａｌｓｃｏｒｉｎｇｓｃｈｅｍｅｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０，８７：２２６４−２２６８；「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓａｎｄｓｔａｔｉｓｔｉｃｓｆｏｒｍｕｌｔｉｐｌｅｈｉｇｈ−ｓｃｏｒｉｎｇｓｅｇｍｅｎｔｓｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０：５８７３−５８７７）の統計学的方法を用いてそれらの発見に有意性を付与する。コンピュータープログラムＢＬＡＳＴは、スコア、同一性、および類似性の３つのパラメーターを計算する。ＦＡＳＴＡ検索法は、ＰｅａｒｓｏｎＷ．Ｒ．（「ＲａｐｉｄａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅｓｅｑｕｅｎｃｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｗｉｔｈＦＡＳＴＰａｎｄＦＡＳＴＡ」，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１９９０，１８３：６３−９８）に記載されている。ＣｌｕｓｔａｌＷ法はＴｈｏｍｐｓｏｎＪ．Ｄ．ら．（「ＣＬＵＳＴＡＬＷ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｍｕｌｔｉｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｔｈｒｏｕｇｈｓｅｑｕｅｎｃｅｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｇａｐｐｅｎａｌｔｉｅｓａｎｄｗｅｉｇｈｔｍａｔｒｉｘｃｈｏｉｃｅ」，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９４，２２：４６７３−４６８０）に記載されている。

「Ｌ−アミノ酸αリガーゼ（Ｌａｌ）の活性」という語句は、高エネルギー分子依存性様式でアミノ酸を連結して、アミノ酸残基間でペプチド結合を生成する反応を触媒する酵素の活性を意味し得る。ジペプチド、トリペプチド、または３つを超えるアミノ酸残基、もしくはその誘導体からなる線状もしくは分岐状のペプチドが、Ｌａｌにより触媒される反応の生成物であり得る。Ｌａｌ触媒反応についての反応スキームは、アミノ酸またはその誘導外の種類および以下の非限定的な実施例で用いられる反応条件に限定されず、図１に示されるように記載され得る。Ｌａｌの活性は、例えば、実施例３、またはＴａｂａｔａＫ．ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００５，１８７（１５）：５１９５−５２０２に記載されるアッセイにより測定することができる。「Ｌ−アミノ酸αリガーゼ（Ｌａｌ）の活性」という語句は、特に「ジペプチド合成活性」という語句と同義であり得る。

さらに、アミノ酸配列が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、および１８のアミノ酸配列における１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含む場合、それは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、および１８のアミノ酸配列を有するタンパク質の１０％以上、３０％以上、５０％以上、７０％以上、および９０％以上、Ｌ−アミノ酸αリガーゼの活性を保持し得る。

「同機能タンパク質」という語句は、上記したようなＬ−アミノ酸αリガーゼ（Ｌａｌ）の活性を有するタンパク質を意味し得る。例を示すと、同機能タンパク質は、Ｌ−ＧｌｕまたはＬ−Ａｓｐ等の酸性Ｌ−アミノ酸をＮ末端に有し、かつ任意の他のＬ−アミノ酸またはその誘導体をＣ末端に有するジペプチドを合成し得る。

２．細菌
「ジペプチド生産細菌」という語句は、その細菌が培地中で培養される場合に、培養培地においてジペプチドを生産し、その蓄積を引き起こす能力を有する、エシェリヒア属に属する細菌等の腸内細菌科の細菌を意味し得る。ジペプチド生産能は、細菌が培地中で培養される場合に培地または菌体からジペプチドを回収できる程度に、細菌が培地または菌体中にジペプチドを生産し、かつジペプチドの蓄積を引き起こす能力を意味し得る。

本細菌は、ジペプチド生産能を固有に有し得るか、または変異方法もしくはＤＮＡ組換え技術を用いることによりジペプチド生産能を有するように改変され得る。

腸内細菌科に属する細菌は、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、フォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）等の属に由来し得、ジペプチド生産能を有し得る。具体的には、ＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター）データベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｔａｘｏｎｏｍｙ／Ｂｒｏｗｓｅｒ／ｗｗｗｔａｘ．ｃｇｉ？ｉｄ＝５４３）で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されるものが用いられ得る。改変することができる腸内細菌科に由来する株の例としては、エシェリヒア属、エンテロバクター属、またはパントエア属の細菌が挙げられる。

本開示の主題に係るエシェリヒア細菌を得るために改変できるエシェリヒア細菌の株は特に限定されず、具体的には、ナイトハルトらの著書（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｂ．Ｊ．，ＤｅｒｉｖａｔｉｏｎｓａｎｄｇｅｎｏｔｙｐｅｓｏｆｓｏｍｅｍｕｔａｎｔｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓｏｆＥ．ｃｏｌｉＫ−１２，ｐ．２４６０−２４８８．ＩｎＦ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら（編），Ｅ．ｃｏｌｉａｎｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａ：ｃｅｌｌｕｌａｒａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ（第２版）ＡＳＭＰｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９６）に記載されているものが用いられ得る。Ｅ．ｃｏｌｉ種が好適な例である。Ｅ．ｃｏｌｉの具体例としては、プロトタイプの野生型株であるＫ−１２株に由来する、Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）、Ｅ．ｃｏｌｉＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ４７０７６）等が含まれる。これらの株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１５４９，マナサス，ＶＡ２０１０８，米国）から入手可能である。すなわち、各株に登録番号が付与されており、これらの登録番号を用いて株を注文することができる（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ参照）。株の登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに列挙されている。

エンテロバクター細菌の例としては、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等が挙げられる。パントエア細菌の例としては、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａａｎａｎａｔｉｓ）等が挙げられる。エンテロバクター・アグロメランスの幾つかの株が、近年、１６ＳｒＲＮＡの塩基配列分析等に基づいて、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、パントエア・アナナティス、又はパントエア・ステワルティイ（Ｐａｎｔｏｅａｓｔｅｗａｒｔｉｉ）に再分類された。エンテロバクター属又はパントエア属のいずれかに属する細菌は、腸内細菌科に分類される細菌である限り、用いられ得る。パントエア・アナナティス株を遺伝子工学技術により育種する場合、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭＢＰ−６６１４）、ＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭＢＰ−６６１５）、ＡＪ１３６０１株（ＦＥＲＭＢＰ−７２０７）、及びこれらの誘導体を用いることができる。これらの株は、それらが単離されたときにエンテロバクター・アグロメランスとして同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託された。しかし、上記のように、最近、１６ＳｒＲＮＡの塩基配列等に基づきパントエア・アナナティスに再分類された。

本明細書中で上記したようなジペプチド生産細菌は、ペプチダーゼ、すなわち、タンパク質分解活性を有する１種以上のタンパク質をコードする１以上の遺伝子が減弱または不活化され、その結果、ペプチダーゼの活性が減少するように改変され得る。例えば、ｐｅｐＡ（ＫＥＧＧ（京都遺伝子ゲノム百科事典），エントリー番号ｂ４２６０）、ｐｅｐＢ（ＫＥＧＧ，エントリー番号ｂ２５２３）、ｐｅｐＤ（ＫＥＧＧ，エントリー番号ｂ０２３７）、ｐｅｐＥ（ＫＥＧＧ，エントリー番号ｂ４０２１）、ｐｅｐＰ（ＫＥＧＧ，エントリー番号ｂ２９０８）、ｐｅｐＱ（ＫＥＧＧ，エントリー番号ｂ３８４７）、ｐｅｐＮ（ＫＥＧＧ，エントリー番号ｂ０９３２）、ｐｅｐＴ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ７４２１１）、ｉａｄＡ（ＫＥＧＧ，エントリー番号ｂ４３２８）、ｉａａＡ（ｙｂｉＫ）（ＫＥＧＧ，エントリー番号ｂ０８２８）、ｄａｐＥ（ＫＥＧＧ，エントリー番号ｂ２４７２）等の遺伝子をコードする１以上のプロテアーゼが、減弱および／または不活化され得る。

本明細書中で上記したようなジペプチド生産細菌はまた、ジペプチドパーミアーゼ（ｄｐｐ）活性を有する１種以上のタンパク質をコードする１以上の遺伝子が減弱または不活化され、その結果、ペプチドパーミアーゼの活性が減少するように改変され得る。例えば、ｄｐｐＡ（ＫＥＧＧ，エントリー番号ｂ３５４４）、ｄｐｐＢ（ＫＥＧＧ，エントリー番号ｂ３５４３）、ｄｐｐＣ（ＫＥＧＧ，エントリー番号ｂ３５４２）、ｄｐｐＤ（ＫＥＧＧ，エントリー番号ｂ３５４１）、ｄｐｐＦ（ＫＥＧＧ，エントリー番号ｂ３５４０）等の遺伝子をコードする１以上のジペプチドパーミアーゼが、減弱および／または不活化され得る。ｄｐｐ遺伝子オペロン全体（ｄｐｐＡ、ｄｐｐＢ、ｄｐｐＣ、ｄｐｐＤおよびｄｐｐＦ）の欠失もまた、ジペプチド生産細菌では好ましくあり得る。

本明細書中で上記したようなジペプチド生産細菌はまた、芳香族アミノ酸の生合成に関与する１種以上のタンパク質をコードする１以上の遺伝子が減弱または不活化され、その結果、タンパク質の活性が減少するように改変され得る。例えばｔｙｒＲ（ＫＥＧＧ，エントリー番号ｂ１３２３）、ｔｒｙＡ（ＫＥＧＧ，エントリー番号ｂ２６００）等の遺伝子をコードする１以上のタンパク質が、減弱および／または不活化され得る。

「ペプチダーゼをコードする減弱された遺伝子」または「タンパク質をコードする減弱された遺伝子」という語句は、それぞれ、「発現が減弱したペプチダーゼをコードする遺伝子」または「発現が減弱したタンパク質をコードする遺伝子」という語句と同義である。本明細書中以降、「ペプチダーゼ」という用語は、「タンパク質をコードする減弱された遺伝子」という語句の解釈のため、上記のように「タンパク質」（例、ジペプチドパーミアーゼ（ｄｐｐ）活性を有するタンパク質、または芳香族アミノ酸の生合成に関与するタンパク質）と交換され得る。したがって、このような交換された語句は、本発明を特定するための要件として記載され得る。

「発現が減弱した遺伝子をコードするペプチダーゼ」という語句は、改変細菌（ここで、ペプチダーゼをコードする遺伝子の発現が減弱されている）におけるペプチダーゼの量が非改変細菌、例えば、腸内細菌科、またはより具体的には、Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２株等のエシェリヒア属に属する細菌の野生型株と比較して減少しているものを意味し得る。

「発現が減弱したペプチダーゼをコードする遺伝子」という語句はまた、改変細菌が、野生型タンパク質と比較して減少した活性を有する変異タンパク質をコードする改変遺伝子を含むか、またはプロモーター、エンハンサー、アテニュエーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シャイン−ダルガノ（ＳＤ）配列等の遺伝子発現制御配列を含む、遺伝子に作動可能に連結される領域が改変されてペプチダーゼをコードする遺伝子の発現レベルが減少すること、および他の例（例えば、ＷＯ９５／３４６７２；ＣａｒｒｉｅｒＴ．Ａ．およびＫｅａｓｌｉｎｇＪ．Ｄ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１９９９，１５：５８−６４を参照）を意味し得る。

ペプチダーゼをコードする遺伝子の発現は、染色体ＤＮＡ上のプロモーター等の遺伝子発現制御配列をより弱いものと交換することにより減弱させることができる。プロモーターの強度は、ＲＮＡ合成の初期作用の頻度により規定される。プロモーター強度の評価方法および強いプロモーターの例は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｐｒｏｍｏｔｅｒｓｉｎｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．，１９９５，１：１０５−１２８）等に記載されている。さらに、国際公開公報ＷＯ００／１８９３５に開示されるように、標的遺伝子のプロモーター中の数個のヌクレオチドにヌクレオチド置換を導入し、それによりプロモーターが弱くなるように改変することもまた可能である。さらに、ＲＢＳ間のＳＤ配列と開始コドンとの間のスペーサー、特に、開始コドンの直ぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換が、ｍＲＮＡの翻訳効率に大きく影響することが知られている。ＲＢＳのこの改変は、ペプチダーゼをコードする遺伝子の転写の減少と組み合せられ得る。

ペプチダーゼをコードする遺伝子の発現もまた、遺伝子のコーディング領域中へのトランスポゾンもしくはＩＳ因子の挿入により（米国特許第５，１７５，１０７号）、または紫外線照射（ＵＢ）の照射もしくはニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）による変異誘発等の従来法により減弱させることができる。さらに、上記したような相同組換えを用いる遺伝子置換による部位特異的変異の導入もまた、宿主中で複製し得ないプラスミドで行うことができる。

「酵素活性が減少された」という語句は、ペプチダーゼの酵素活性が、非改変株、例えば、腸内細菌科、またはより具体的には、エシェリヒア属に属する細菌の野生型株におけるものよりも低いことを意味し得る。例えば、遺伝子をコードするペプチダーゼの酵素活性は、遺伝子不活化により消失させることができる。

「ペプチダーゼの活性が減少された」という語句はまた、ペプチド分解活性が、ｐｅｐＡ、ｐｅｐＢ、ｐｅｐＤ、ｐｅｐＥ、ｐｅｐＰ、ｐｅｐＱ、ｐｅｐＮ、ｐｅｐＴ、ｉａｄＡ、ｉａａＡ（ｙｂｉＫ）、ｄａｐＥ等の野生型遺伝子によりコードされる野生型ペプチダーゼと比較して減少することを意味し得る。

改変細菌において、ペプチダーゼの活性は、腸内細菌科、より具体的にはエシェリヒア属に属する非改変細菌における野生型遺伝子によりコードされるペプチダーゼと比較して、少なくとも１０％以上、少なくとも３０％以上、少なくとも５０％以上、少なくとも７０％以上、少なくとも９０％以上減少させることができる。

「ペプチダーゼ活性」または「タンパク質分解活性」という語句は、ペプチド結合の分子内消化の反応を触媒する酵素の活性を意味し得る（Ｒ．Ｂｅｙｎｏｎ（編）およびＪ．Ｓ．Ｂｏｎｄ（編），“ＰｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃＥｎｚｙｍｅｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ”，第２版，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，ＵＳＡ（２００１））。

微生物のペプチド分解活性は、基質としてのペプチドおよび微生物菌体を培地中に共存させ、次いで、既知の方法（例えば、ＨＰＬＣ解析）により、またはＫｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎＭ．Ｍ．，Ａｃｔｉｖｉｔｙｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓｕｓｉｎｇｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ（ＵＮＩＴＣ２．１）ｏｒＡｋｐｉｎａｒＯ．およびＰｅｎｎｅｒＭ．Ｈ．，Ｐｅｐｔｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙａｓｓａｙｓｕｓｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ（ＵＮＩＴＣ２．２）ｉｎＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＦｏｏｄＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＵＮＩＴＣ２，ＰｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃＥｎｚｙｍｅｓ），ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）に記載されるように、ペプチドの残存量を決定することにより測定することができる。

ペプチダーゼの酵素活性は、ペプチダーゼの細胞内活性が非改変株と比較して減少するように、染色体中に変異を導入することにより、減少させることができる。遺伝子、またはオペロン構造中の遺伝子上流に対するこのような変異は、遺伝子によりコードされるタンパク質においてアミノ酸置換を生じさせる１個以上の塩基の交換（ミスセンス変異）、停止コドンの導入（ナンセンス変異）、フレームシフトを引き起こす１または２個の塩基の欠失、薬物耐性遺伝子および／または転写終結シグナルの挿入、遺伝子の一部の欠失、あるいは遺伝子全体の欠失であり得る（ＱｉｕＺ．およびＧｏｏｄｍａｎＭ．Ｆ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２７２：８６１１−８６１７；ＫｗｏｎＤ．Ｈ．ら，Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，２０００，４６：７９３−７９６）。

「ペプチダーゼをコードする不活化された遺伝子」という語句は、改変遺伝子が完全に不活性である、または非機能的であるペプチダーゼをコードすることを意味し得る。改変ＤＮＡ領域が、遺伝子の一部または全体の欠失、遺伝子の読み枠の変更、ミスセンス／ナンセンス変異の導入、またはプロモーター、エンハンサー、アテニュエーター、リボソーム結合部位等を含む遺伝子隣接領域の改変に起因して、遺伝子を天然に発現し得ないこともまた可能である。遺伝子の不活化はまた、ＵＶ照射もしくはニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）、部位特異的変異誘発、相同組換えを用いる遺伝子破壊、または／および「Ｒｅｄ駆動性組込み」または「λＲｅｄ媒介組込み」とも呼ばれる挿入−欠失変異誘発（ＹｕＤ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，９７（１２）：５９７８−８３；ＤａｔｓｅｎｋｏＫ．Ａ．およびＷａｎｎｅｒＢ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，９７（１２）：６６４０−４５）を用いる変異誘発処理等の従来法により行うことができる。

「組換えＤＮＡを含むように改変された細菌」という語句は、例えば、形質転換、トランスフェクション、感染、結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、および接合伝達（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）等の従来法により、外因性ＤＮＡを含むように改変された細菌を意味し得る。タンパク質をコードするＤＮＡによる細菌の形質転換、トランスフェクション、感染、結合、または接合伝達は、ＤＮＡによりコードされるタンパク質の合成能を細菌に付与することができる。形質転換、トランスフェクション、感染、結合、および接合伝達の方法としては、報告されている任意の既知の方法が挙げられる。例えば、ＤＮＡに対するエシェリヒア・コリＫ−１２菌体の透過性を向上させるために受容細胞を塩化カルシウムで処理する方法が、効率的なＤＮＡ形質転換およびトランスフェクションのために報告されている（ＭａｎｄｅｌＭ．およびＨｉｇａＡ．，Ｃａｌｃｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＤＮＡｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９７０，５３：１５９−１６２）。特化および／または一般化した形質導入の方法が記載されている（ＭｏｒｓｅＭ．Ｌ．ら，ＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ−１２，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９５６，４１（１）：１４２−１５６；ＭｉｌｌｅｒＪ．Ｈ．，ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａ．Ｐｒｅｓｓ，１９７２）。例えば、「Ｍｕ駆動性組込み／増幅」（Ａｋｈｖｅｒｄｙａｎら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１１，９１：８５７−８７１）、「Ｒｅｄ／ＥＴ駆動性組込み」または「λＲｅｄ／ＥＴ媒介組込み」（ＤａｔｓｅｎｋｏＫ．Ａ．およびＷａｎｎｅｒＢ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２０００，９７（１２）：６６４０−４５；ＺｈａｎｇＹ．，ら，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．，１９９８，２０：１２３−１２８）といった、宿主ゲノム中へのＤＮＡの無作為および／または標的化組込みのための方法を適用することができる。さらに、Ｍｕ駆動性複製転移（Ａｋｈｖｅｒｄｙａｎら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１１，９１：８５７−８７１）および所望の遺伝子の増幅を生じるｒｅｃＡ依存組換えに基づく化学誘導染色体進化（ＴｙｏＫ．Ｅ．Ｊ．ら，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００９，２７：７６０−７６５）に加えて、所望の遺伝子を複数挿入するために、転移、部位特異的および／または相同Ｒｅｄ／ＥＴ媒介組換え、ならびに／あるいはＰ１媒介汎用形質導入の異なる組合せを利用する別の方法を用いることができる。（例えば、Ｍｉｎａｅｖａら，ＢＭＣＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，８：６３；ＫｏｍａＤ．ら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１２，９３（２）：８１５−８２９を参照）。

本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ（Ｌａｌ）をコードする遺伝子、またはフェニルアラニンの生合成に関与する１以上のタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルが向上する様式において、さらに改変することができる。このようなタンパク質の例としては、コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼ（ＣＭ−ＰＤ）、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロソン酸−７−リン酸シンテターゼ（ＤＡＨＰシンテターゼ）、およびシキミ酸キナーゼ（ＳＫ）をそれぞれコードするｐｈｅＡ、ａｒｏＧ４、およびａｒｏＬが挙げられる（例、日本特許第３２２５５９７号を参照）。本明細書中以降、「Ｌａｌ」という用語は、「フェニルアラニンの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子」等の解釈のために、フェニルアラニンの生合成に関与するタンパク質と交換され得る。したがって、このような交換された語句は、本発明を特定するための要件として記載され得る。

「Ｌａｌをコードする遺伝子の増強された発現」という語句は、野生型または親株等の非改変株と比較して、一細胞当たりの、Ｌａｌ−コーディング遺伝子によりコードされる分子数が、増加すること、またはこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質の一分子当たりの活性（比活性として参照され得る）が、改善することを、意味し得る。上記比較のための参照として供する非改変株の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ４７０７６）、Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）、パントエア・アナナティスＡＪ１３３３５株（ＦＥＲＭＢＰ−６６１４）等の腸内細菌科に属する微生物の野生型株が挙げられる。

「Ｌａｌをコードする遺伝子の増強された発現」という語句はまた、Ｌａｌコーディング遺伝子の発現レベルが、非改変株、例えば、野生型または親株におけるレベルよりも高いことを意味し得る。

Ｌａｌコーディング遺伝子の発現を増強させるために用いることができる方法としては、これらに制限されないが、当業者に既知である遺伝子工学的方法による、細菌ゲノム中（染色体中および／または自己複製プラスミド中）のＬａｌコーディング遺伝子コピー数の増加、ならびに／あるいはエシェリヒア属の細菌におけるＬａｌコーディング遺伝子のコピー数および／または発現レベルを増加させることができるベクター中へのＬａｌコーディング遺伝子の導入が挙げられる。

ベクターの例としては、これらに制限されないが、ｐＣＭ１１０、ｐＲＫ３１０、ｐＶＫ１０１、ｐＢＢＲ１２２、ｐＢＨＲ１等の広範な宿主範囲のベクターが挙げられる。複数コピーのＬａｌコーディング遺伝子もまた、例えば、相同組換え、Ｍｕ駆動性組込み等により、細菌の染色体ＤＮＡ中に導入することができる。相同組換えは、染色体ＤＮＡにおいて、配列の複数コピーを用いて行うことができる。染色体ＤＮＡにおける複数コピーを有する配列としては、これらに制限されないが、転位エレメントの末端に存在する反復ＤＮＡまたは反転ＤＮＡが挙げられる。また、Ｌａｌコーディング遺伝子をトランスポゾン中に組込み、それを転移させて、染色体ＤＮＡ中に複数コピーのＬａｌコーディング遺伝子を導入することもまた可能である。Ｍｕ駆動性組込みを用いることにより、３コピーを超える遺伝子を、単一動作の間に、染色体ＤＮＡ中に導入することができる（ＡｋｈｖｅｒｄｙａｎＶ．Ｚ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（ロシア），２００７，３：３−２０）。

Ｌａｌコーディング遺伝子発現の増強はまた、Ｌａｌコーディング遺伝子の隣接調節領域の改変、またはネイティブおよび／または改変外来性調節領域の導入により、Ｌａｌコーディング遺伝子の発現レベルを増加させることにより達成することができる。調節領域または配列としては、プロモーター、エンハンサー、アテニュエーター、および転写終結シグナル、抗終結シグナル、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）および他の発現制御エレメント（例、リプレッサーまたはインデューサーが結合する領域、および／または転写および翻訳調節タンパク質のための、例えば、転写されたｍＲＮＡ中の結合部位）を例示することができる。このような調節配列は、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋＪ．，ＦｒｉｔｓｃｈＥ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓＴ．，“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている。遺伝子発現を制御する領域の改変は、既知の方法（例えば、ＡｋｈｖｅｒｄｙａｎＶ．Ｚ．ら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１１，９１：８５７−８７１；ＴｙｏＫ．Ｅ．Ｊ．ら，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００９，２７：７６０−７６５を参照）を用いる、細菌ゲノム中の改変遺伝子のコピー数の増加と組み合わせることができる。

Ｌａｌコーディング遺伝子発現を増強させるプロモーターの例は、強力なプロモーターであり得る。例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰ_ＲまたはＰ_Ｌプロモーターは全て、強力なプロモーターであることが知られている。腸内細菌科に属する細菌において高レベルの遺伝子発現を提供する強力なプロモーターを用いることができる。あるいは、プロモーターの効果は、例えば、Ｌａｌコーディング遺伝子のプロモーター領域中に変異を導入して強力なプロモーター機能を実現し、それによりプロモーターの下流に位置するＬａｌコーディング遺伝子の転写レベルの増加を生じさせることにより、増強させることができる。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、特に開始コドンの直ぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳能に顕著に影響することが知られている。例えば、開始コドンの前にある３個のヌクレオチドの性質に依存して、発現レベルに２０倍の幅が見出された（ＧｏｌｄＬ．ら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８１：３５，３６５−４０３；ＨｕｉＡ．ら，ＥＭＢＯＪ．，１９８４：３，６２３−６２９）。

宿主微生物におけるＬａｌコーディング遺伝子の異種発現の増強は、希少および／または低使用頻度コドンを同義の中および／または高使用頻度コドンに置換することにより、達成することができ、ここで、コドン使用頻度は、生物の細胞における単位時間当たりに翻訳される回数（頻度）、または生物のシークエンスされたタンパク質コーディング読み枠の平均コドン頻度として定義することができる（ＺｈａｎｇＳ．Ｐ．ら，Ｇｅｎｅ，１９９１，１０５（１）：６１−７２）。生物におけるコドン使用頻度は、ＣＵＴＧ（ＣｏｄｏｎＵｓａｇｅＴａｂｕｌａｔｅｄｆｒｏｍＧｅｎＢａｎｋ）の拡張ウェブ版であるコドン使用頻度データベース（ＣｏｄｏｎＵｓａｇｅＤａｔａｂａｓｅ）において見出すことができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／；ＮａｋａｍｕｒａＹ．ら，ＣｏｄｏｎｕｓａｇｅｔａｂｕｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓｆｏｒｔｈｅｙｅａｒ２０００，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０００，２８（１）：２９２）。Ｅ．ｃｏｌｉでは、このような変異としては、制限されないが、希少ＡｒｇコドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＧ、ＣＧＡのＣＧＴまたはＣＧＣへの置換、希少ＩｌｅコドンＡＴＡのＡＴＣまたはＡＴＴへの置換、希少ＬｅｕコドンＣＴＡのＣＴＧ、ＣＴＣ、ＣＴＴ、ＴＴＡまたはＴＴＧへの置換、希少ＰｒｏコドンＣＣＣのＣＣＧまたはＣＣＡへの置換、希少ＳｅｒコドンＴＣＧのＴＣＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＡＧＣまたはＡＧＴへの置換、希少ＧｌｙコドンＧＧＡ、ＧＧＧのＧＧＴまたはＧＧＣへの置換などが挙げられる。低使用頻度コドンの同義の高使用頻度コドンへの置換が好ましい。希少および／または低使用頻度コドンの同義の中または高使用頻度コドンへの置換は、希少コドンを認識する希少ｔＲＮＡをコードする遺伝子の共発現と組み合わせてもよい。

遺伝子および／またはオペロン遺伝子のコピー数、存在または非存在は、例えば、染色体ＤＮＡの制限処理、続いて遺伝子配列に基づくプローブを用いるサザンブロッティング、蛍光インサイチュ・ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）等により、測定することができる。遺伝子および／またはオペロン遺伝子発現のレベルは、ノザンブロッティング、定量的ＲＴ−ＰＣＴ等を含む種々の既知の方法により、測定することができる。また、遺伝子発現のレベルは、ノザンブロッティング、定量的ＲＴ−ＰＣＲ等を含む種々の周知の方法を用いて、遺伝子から転写されるｍＲＮＡ量を測定することにより、決定することができる。遺伝子によりコードされるタンパク質の量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてイムノブロッティングアッセイ（ウエスタンブロッティング解析）、またはタンパク質試料の質量分光解析等を含む既知の方法により、測定することができる。

プラスミドＤＮＡの調製、消化、ＤＮＡの連結および形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等のための方法は、当業者に周知である通常の方法であり得る。これらの方法は、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋＪ．，ＦｒｉｔｓｃｈＥ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓＴ．，“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）、またはＧｒｅｅｎＭ．Ｒ．およびＳａｍｂｒｏｏｋＪ．Ｒ．，“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”，第４版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（２０１２）に記載されている。分子クローニングおよび異種遺伝子発現のための方法は、ＢｅｒｎａｒｄＲ．Ｇｌｉｃｋ，ＪａｃｋＪ．ＰａｓｔｅｒｎａｋおよびＣｈｅｒｙｌＬ．Ｐａｔｔｅｎ，“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ”，第４版，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ：ＡＳＭＰｒｅｓｓ（２００９）；ＥｖａｎｓＪｒ．，Ｔ．Ｃ．およびＸｕＭ．−Ｑ．，“ＨｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＥ．ｃｏｌｉ”，第１版，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ（２０１１）に記載されている。

「遺伝子に作動可能に連結された」という語句は、調節領域が、目的の核酸分子または遺伝子の塩基配列に、塩基配列の発現、好ましくは塩基配列にコードされる遺伝子産物の発現（例えば、増強された、上昇した、構成的な、基本的な、減弱した、低減された、または抑圧された発現）が可能であるように連結されていることを意味し得る。

本明細書中に記載の細菌は、ペプチドの生産能を固有に有する細菌に必要な特性を付与することにより、得ることができる。あるいは、細菌は、既に必要な特性を有する細菌に、ジペプチドの生産能を付与することにより、得ることができる。

細菌は、既に述べた特性に加えて、種々の栄養要求性、薬物耐性、薬物感受性、および薬物依存性等の他の特異的な特性を、本発明の範囲を逸脱することなく、有することができる。

３．ジペプチドの製造方法
本発明の方法は、酵素法および発酵法とそれぞれ呼ばれる、Ｌ−アミノ酸αリガーゼ（Ｌａｌ）、または当該Ｌａｌを含むように改変された腸内細菌科に属する細菌を用いる、ジペプチド、より具体的には、酸性Ｌ−アミノ酸をＮ末端に有するジペプチドの製造方法であり得る。

「アミノ酸」という語句は、当業者に既知の通常のアミノ酸、アミノ酸の誘導体、またはそれらの塩を意味し得る。アミノ酸の例は、アミノ基、カルボキシ基、および側鎖基が結合しているＣ^αまたはＣ^βキラル炭素原子をそれぞれ有するα−アミノ酸およびβ−アミノ酸であり得る。β−アミノ酸としては、βＡｌａを例示することができる。α−アミノ酸としては、タンパク質材料または非タンパク質材料のアミノ酸を例示することができる。タンパク質材料のアミノ酸としては、Ｃ^αキラル炭素原子を有する、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、グリシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、およびＬ−バリン等のＬ−アミノ酸、またはその塩を例示することができる。アミノ酸は、保護または未保護形態で用いることができる。保護形態のアミノ酸とは、未保護形態とは対照的に、アミノ基、カルボキシ基、および／または側鎖基に結合した１以上の置換基を有するアミノ酸を意味し得る。結合した置換基を有するアミノ酸は、アミノ酸誘導体と呼ぶことができる。アミノ酸誘導体としては、Ｌ−フェニルアラニン低級アルキルエステル等のアミノ酸低級アルキルエステルを例示することができる。低級アルキルエステルとしては、メチルエステル、エチルエステル、およびプロピルエステル等を挙げることができる。

「アミノ酸」という語句は、「Ｌａｌ触媒反応の基質」、または簡素化の理由のため「基質」という語句と同義であり得る。

「酸性Ｌ−アミノ酸」という語句は、Ｌ型のアスパラギン酸（Ａｓｐ）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ）、またはそれらの塩を意味し得る。

「ジペプチド」という語句は、ペプチド結合を介して連結した、２つのアミノ酸残基、もしくは２つのアミノ酸残基の誘導体、またはそれらの組合せからなる有機分子またはその塩を意味し得る。ジペプチドは、先に特定したアミノ酸またはその誘導体から構成され得る。例えば、「ジペプチド」という語句は、Ｌ−ＡｓｐまたはＬ−Ｇｌｕ等の酸性Ｌ−アミノ酸残基がジペプチドのＮ末端に位置し、かつ同種または異種の別のＬ−アミノ酸残基がジペプチドのＣ末端に位置する様式において、２つのタンパク質材料のＬ−アミノ酸残基により生成するジペプチドを意味し得る。アミノ酸の誘導体、例えば、Ｌ−Ｐｈｅメチルエステル等のＬ−アミノ酸低級アルキルエステルが、ジペプチドのＣ末端に位置し得ることもまた、許容される。

上記のようなジペプチドは、酸性アミノ酸残基をＮ末端に有するジペプチドに限定されない。ジペプチドは、式Ｒ１−Ｒ２により表すことができる。ここで、Ｒ１およびＲ２は、ジペプチドのＮおよびＣ末端にそれぞれ位置し、かつペプチド結合を介して連結されたアミノ酸残基またはその誘導体を意味し得る。Ｒ１およびＲ２としては、Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｔｙｒ、およびＬ−Ｖａｌ等のＬ−アミノ酸、もしくはＬ−ＰｈｅＯＭｅ等のその誘導体、またはそれらの塩を例示することができる。Ｒ１およびＲ２は、同種または異種のものであってもよい。

「ペプチド結合」という語句は、カルボキシ成分と呼ばれる、ある分子のカルボキシ部分が、アミノ成分と呼ばれる、別分子のアミノ部分と反応し、分子の放出を生じた場合に、２つの分子間で生成する共有化学結合−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−を意味し得る。例えば、アミノ酸は、水分子の放出と共に、ペプチド結合を生成することができる。

任意のカルボキシ成分が、アミン成分の形態における他の基質との縮合によりペプチドを生成し得る限り、使用されてもよい。カルボキシ成分の例としては、Ｌ−アミノ酸エステル、Ｄ−アミノ酸エステル、Ｌ−アミノ酸アミド、およびＤ−アミノ酸アミド、ならびに未保護のアミノ基を有しない有機酸エステルが挙げられる。また、アミノ酸エステルの例としては、天然に存在するアミノ酸に対応するアミノ酸エステルのみならず、天然に存在しないアミノ酸に対応するアミノ酸エステル、またはそれらの塩が挙げられる。また、アミノ酸エステルの例としては、α−アミノ酸エステル、ならびに異なるアミノ基結合部位を有するβ−、γ−およびω−アミノ酸エステル等が挙げられる。アミノ酸エステルの典型例としては、アミノ酸のメチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｉｓｏ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、ｉｓｏ−ブチルエステル、およびｔｅｒｔ−ブチルエステルが挙げられる。また、カルボキシ成分のカルボキシ部分としては、カルボキシル基ＣＯＯＨ、またはその誘導体ＣＯＲ（式中、Ｒは、置換フェニル基、またはクロロ基等のハロゲニル基を意味し得る）を例示することができる。

任意のアミン成分が、カルボキシ成分の形態における他の基質との縮合によりペプチドを生成し得る限り、使用されてもよい。アミン成分の例としては、Ｌ−アミノ酸、Ｃ−保護Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、Ｃ保護Ｄ−アミノ酸、およびアミンが挙げられる。また、アミンの例としては、天然に存在するアミンのみならず、非天然に存在するアミン、またはそれらの誘導体が挙げられる。また、アミノ酸の例としては、天然に存在するアミノ酸のみならず、非天然に存在するアミノ酸またはそれらの誘導体が挙げられる。これらとしては、α−アミノ酸、ならびに異なるカルボキシ基結合部位を有するβ−、γ−またはω−アミン酸等が挙げられる。

３．１．酵素法
酵素法は、上記のようなＬａｌの活性により反応生成物を得る適切な条件下で、Ｌ−アミノ酸αリガーゼまたはＬａｌ含有物を、同種または異種の１以上のアミノ酸、もしくはその誘導体、またはそれらの塩と接触させる工程を少なくとも含むことができる。

本発明で用いられるＬａｌまたはＬａｌ含有物をカルボキシ成分およびアミノ成分に作用させる方法は、ＬａｌまたはＬａｌ含有物、カルボキシ部分を有する分子、およびアミノ部分を有する分子を互いに混合することであってもよい。より具体的には、ＬａｌまたはＬａｌ含有物を、ジペプチドを生成するカルボキシおよびアミノ成分を含む溶液に加え、それらを反応させる方法を用いてもよい。あるいは、Ｌａｌ生産細菌を用いる場合には、Ｌａｌ生成細菌を培養し、細菌または培養培地中にＬａｌを生産および蓄積させ、次いで、カルボキシ成分を有する分子およびアミン成分を有する分子を培地に加える方法を用いてもよい。次いで、生産されたペプチドは、定法により回収し、必要に応じて精製することができる。

「Ｌａｌ含有物」という語句は、Ｌａｌを含有する任意の物質を意味し得、その具体的形態の例としては、当該Ｌａｌ生産細菌の培養物、当該培養物から分離された菌体、菌体処理物（「細菌の菌体処理物」とも呼ばれる）が挙げられる。細菌の培養物とは、細菌を培養して得られるもの、より具体的には、菌体、細菌の培養に用いた培地、および培養された細菌により生成された物質の混合物等を意味し得る。また、菌体は、洗浄し、洗浄菌体として用いてもよい。また、細菌の菌体処理物としては、細菌の菌体を破砕、溶菌、または凍結乾燥したものなどが挙げられ、また、細菌の菌体などを処理して回収される粗酵素、および粗酵素の精製により得られる精製酵素などが挙げられる。精製処理された酵素としては、各種精製法によって得られる部分精製酵素等を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、捕捉法等によって固定化した固定化酵素を使用してもよい。また、幾つかの細菌は、その菌によっては、培養中に部分的に溶菌するため、この場合には、培養液上清もまた、Ｌａｌ含有物として用いることができる。

また、野生株を、Ｌａｌを含む細菌として用いてもよく、またはＬａｌを発現する遺伝子組換え株を、上記として用いてもよい。細菌は、インタクトな菌体に限られず、アセトン処理菌体、凍結乾燥菌体等の菌体処理物を使用してもよい。共有結合法、吸着法、捕捉法等によって菌体または細菌の菌体処理物を固定化した固定化菌体、ならびに細菌の固定化菌体処理物を使用してもよい。

さらに、培養物、培養菌体、洗浄菌体、または菌体を破砕あるいは溶菌させることにより得られる細菌の菌体処理物を用いる場合、ペプチドの生成に関与せずに生成ペプチドを分解する酵素が存在することがしばしばある。この場合、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属プロテアーゼ阻害剤を添加するほうが好ましい場合がある。添加量は、０．１ｍＭ〜３００ｍＭの範囲内、好ましくは１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲内である。

本発明の酵素法の形態例は、本明細書中に記載される形質転換菌体を培地中で培養し、ペプチド精製酵素（Ｌａｌ）を培地および／または形質転換菌体中に蓄積させる方法である。形質転換体を用いることによりペプチド生成酵素を簡便に大量生産できるため、ジペプチドを、大量かつ迅速に製造することができる。

ＬａｌまたはＬａｌ含有物の量は、目的の効果を発揮する量（有効量）に十分であればよく、この有効量は、当業者であれば簡単な予備実験により容易に決定することができる。Ｌａｌを用いる場合、例えば、使用量は、約０．１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌであり得るが（例えば、実施例３を参照）、洗浄菌体を用いる場合、使用量は、菌体におけるＬａｌ量に応じて、より多くあり得る。

「適切な条件」という語句は、Ｌａｌ触媒反応が進行する（すなわち、反応生成物、例えば、ジペプチドを、カルボキシ成分およびアミノ成分から生成することができる）条件を意味し得る。「適切な条件」という語句は、制限されないが、「酵素」、「アミノ酸」、「基質」、「適切な溶媒」、「高エネルギー分子」、「適切な温度条件」等を含むことができる。

「高エネルギー分子」という語句は、Ｌａｌ触媒反応が適切な条件下で進行するために必要とされる任意の有機または無機分子を意味し得る。通常、高エネルギー分子として、補因子を例示し得る。より具体的には、高エネルギー分子としては、アデノシン５’−トリホスフェート（ＡＴＰ）またはその塩を例示することができる。ナトリウム、カリウム、アンモニウム塩等の任意の組合せを用いることができる。

「適切な溶媒」という語句は、Ｌａｌ触媒反応が進行できる、すなわち、反応生成物、例えば、ジペプチドを生成することができる任意の溶媒を意味し得る。有機および水性溶媒、または種々の割合のそれらの混合液が適切な溶媒であり得る。適切な溶媒は、本発明のＬａｌ酵素；ＡＴＰ等の補因子；ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウムイオン等の金属イオン；サルフェート、クロリド、ホスフェートイオン等のアニオン；Ｌ−アミノ酸αリガーゼの活性に必要とされる他の無機および／または有機分子を含有していてもよい。ＣａｒｍｏｄｙＷ．Ｒ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄｕｃ．，１９６１，３８（１１）：５５９−５６０に記載されるようなトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（トリシン）、またはＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）等を、緩衝剤として、反応混合液中に加えることができる。反応混合液の酸性度（ｐＨ）は、６．５〜１０．５の間、または７．０〜１０．０の間、あるいは７．５〜９．５の間、または８〜９の間に維持してもよい。適切な溶媒は、適切な温度条件に付されてもよい。

「適切な温度条件」という語句は、Ｌａｌ触媒反応が進行できる、すなわち、反応生成物、例えば、ジペプチドを生成できる温度条件を意味し得る。適切な温度条件は、０〜６０℃の間、または２０〜４０℃の間、あるいは２５〜３７℃の間、または２８〜３５℃の間であってもよい。

出発原料であるカルボキシ成分およびアミン成分の濃度は各々、１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは０．０５Ｍ〜２Ｍであるが、カルボキシ成分に対してアミン成分を等量以上添加したほうが好ましい場合がある。また、基質が高濃度だと反応を阻害するような場合には、反応中にこれらを阻害しない濃度にして逐次添加することができる。

ジペプチドが生産され、適切な溶媒中に必要量で蓄積した後、菌体、菌屑および変性タンパク質等の固体を、遠心分離または膜ろ過により培地から除去することができ、次いで、目的のジペプチドを、濃縮、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、晶出等の従来技術の任意の組合せにより、適切な溶媒から回収することができる。

酵素の回収および精製
Ｌ−アミノ酸αリガーゼは、エシェリヒア属、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ種に属する細菌から精製することができる。細菌からＬａｌを蓄積、回収および精製する方法は、当業者に既知の通常の方法であり得る。

細菌は、Ｌａｌを生産する本明細書中の以降に記載されるような培養培地中で増殖される。菌体抽出物は、超音波破砕等の物理法、または細胞壁溶解酵素を用いる酵素法を用いて菌体を破砕し、遠心分離により不溶性画分を除去すること等により、菌体から調製することができる。次いで、ペプチド生成酵素は、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーまたはゲル濾過クロマトグラフィー等の通常のタンパク質精製法を組み合わせることにより、上記様式で得られた菌体抽出溶液を分画することにより、精製することができる。

陰イオン交換クロマトグラフィーにおける使用のための担体の例は、Ｑ−セファロースＨＰまたはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）アガロース（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等であり得る。酵素は、酵素を含有する菌体抽出液を担体充填カラムを介して通過させる場合、７〜８等の中性ｐＨ条件下で、非吸着画分において回収することができる。種々の溶出液を、担体に応じて用いることができる。例えば、ＭｏｎｏＳＨＲ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて陽イオン交換クロマトグラフィーを行う場合、酵素を含有する菌体抽出液を、担体充填カラムを介して通過させる。酵素を溶出させるため、カラムを、高い塩濃度を有する緩衝溶液で洗浄することができる。そのとき、塩濃度を逐次増加させてもよいし、または濃度勾配を適用してもよい。生理食塩水溶液として、約０〜０．５ＭのＮａＣｌを適用することができる。必要な場合、酵素は、ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製することができる。ゲル濾過クロマトグラフィーにおける使用のための担体の例は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲまたはＳｅｐｈａｄｅｘ２００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）であり得る。

上述の精製法では、酵素含有画分は、以降に記載される実施例に示される方法により、各画分のＬａｌ活性をアッセイすることにより、検証することができる。

３．２．発酵法
本発明の方法はまた、本発明の細菌を培養培地中で培養して、ジペプチドを生産、分泌、培養培地中に蓄積せしめ、培養培地からジペプチドを回収することによる、ジペプチド、より具体的には、酸性Ｌ−アミノ酸をＮ末端に有するジペプチドの製造方法であり得る。
本発明の細菌の培養、培地からのジペプチドの回収および精製等は、微生物を用いてジペプチドまたはアミノ酸を生産する従来の発酵法と同様の様式で行われてもよい。ジペプチド生産用の培養培地は、炭素源、窒素源、無機イオン、および必要とされる他の有機成分を含有する典型的な培地であってもよい。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フルクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボース等の糖質、および澱粉の加水分解物；グリセロール、マンニトール、およびソルビトール等のアルコール；グルコン酸、フマル酸、クエン酸、リンゴ酸、およびコハク酸等の有機酸等を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、およびリン酸アンモニウム等のアンモニウム塩；大豆加水分解物のもの等の有機窒素；アンモニアガス；水性アンモニア等を用いることができる。ビタミンＢ１等のビタミン、必要物質、例えば、アデニンおよびＲＮＡ等の核酸等の有機栄養素、または酵母抽出物等が、たとえ微量であっても適切な量で存在していてもよい。これら以外に、少量のリン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等を、必要に応じて、加えてもよい。

本発明の細菌のジペプチド生産能を向上させるため、培養培地にさらに、アミノ酸またはアミノ酸誘導体、補因子、および他の（生物）化学品を補充することができる。例えば、細菌がＡｓｐ−Ｐｈｅジペプチドを生産する能力を向上させるため、培養培地に、さらなる量のＬ−ＰｈｅおよびＬ−Ａｓｐを補充してもよい。

培養は、好気性条件下で１６〜７２時間行うことができる。培養中の培養温度は、１５〜４５℃の範囲、または２８〜３７℃の範囲内で制御することができる。酸性度（ｐＨ）は、無機または有機の酸性またはアルカリ性物質、ならびにアンモニアガスを用いることにより、５〜６の間、または６．５〜７．２の間に調整することができる。

培養後、菌体および菌屑等の固体は、遠心分離または膜ろ過により、液体培地から除去することができ、次いで、目的のジペプチドを、濃縮、イオン交換クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、晶出等の従来技術の任意の組合せにより、発酵液から回収することができる。

下記の非限定的な実施例を参照しつつ、本発明をより詳細に以下に説明する。

実施例１．ブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）ＮＢＲＣ１００５９９由来のＢＢＲ４７＿５１９００およびスチグマテラ・アウランチアカ（Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａａｕｒａｎｔｉａｃａ）ＤＷ４／３−１由来のＳｔａｕｒ＿４８５１のクローニング
機能未知タンパク質ＢＢＲ４７＿５１９００およびＳｔａｕｒ＿４８５１をコードする遺伝子の一次構造を、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のために最適化した。ブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）ＮＢＲＣ１００５９９由来のＢＢＲ４７＿５１９００およびスチグマテラ・アウランチアカ（Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａａｕｒａｎｔｉａｃａ）ＤＷ４／３−１由来のＳｔａｕｒ＿４８５１をコードする遺伝子を、ＳｌｏｎｏＧｅｎｅ^ＴＭ遺伝子合成サービス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｌｏｎｉｎｇ．ｃｏｍ／）により合成し、最適化配列を有する標的遺伝子を含む合成ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを保持するｐＳｌｏ．Ｘプラスミドセットとして移入した。ＢＢＲ４７＿５１９００およびＳｔａｕｒ＿４８５１タンパク質をコードする最適化配列の遺伝子を保持するＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、それぞれ、配列番号１９および２０に示す。

ｐＥＴ−ＨＴ−ＢＢＲおよびｐＥＴ−ＨＴ−ＳＴＡプラスミドを構築するために、対応するｐＳｌｏ．ＸプラスミドのＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩでの消化により切り出し、次いで、同じ制限酵素により消化されたｐＥＴ１５（ｂ＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）に連結した。

実施例２．Ｈｉｓ６タグ付加ＢＢＲ４７＿５１９００およびＳｔａｕｒ＿４８５１の発現および精製
プラスミドｐＥＴ−ＨＴ−ＢＢＲおよびｐＥＴ−ＨＴ−ＳＴＡを、Ｃａ^２＋依存性形質転換により、ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）に導入して、ＢＬ２１（ＤＥ３）［ｐＥＴ−ＨＴ−ＢＢＲ］およびＢＬ２１（ＤＥ３）［ｐＥＴ−ＨＴ−ＳＴＡ］株を構築した。製造業者の使用説明書にしたがい、“Ｂｉｏ−Ｒａｄ”電気穿孔器（ＵＳＡ）（番号１６５−２０９８，バージョン２−８９）を用いて、電気形質転換を行った。ＢＬ２１（ＤＥ３）［ｐＥＴ−ＨＴ−ＢＢＲ］およびＢＬ２１（ＤＥ３）［ｐＥＴ−ＨＴ−ＳＴＡ］株の菌体を各々、３７℃および１５０ｒｐｍでＬＢブロス中でＯＤ_５４０約１まで増殖させた（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２００１）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第３版）．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓに記載される溶原性ブロスとも呼ばれる）中で増殖させた。イソプロビル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの終濃度で加え、細胞培養物を３７℃および１５０ｒｐｍで２時間インキュベートした。誘導された細胞を１Ｌの培養ブロスから採取し、６０〜８０ｍＬのＨＴ−１緩衝液（２０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４，０．５ＭＮａＣｌ，２０ｍＭイミダゾール，ｐＨ７．４，ＮａＯＨで調整）中に再懸濁し、フレンチ−プレス（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）を用いて２０００Ｐｓｉ（約１４０バール）下で破砕した。破砕屑を４℃および１３０００ｒｐｍで２回遠心分離し、続いて０．４５μｍフィルター（ＣＨＲＯＭＡＦＩＬＸｔｒａＣＡ−４５／２５，ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬＧｍｂＨ）を通じて濾過することにより除去した。粗タンパク質溶液を、総容量１ｍｌの固定金属アフィニティー・クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）に予め充填し、かつＨＴ−Ｉ緩衝液で平衡化したＨｉＴｒａｐキレートカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。製造業者の推奨にしたがい、ＩＭＡＣを行った。活性画分を回収し、合わせて、ＳＢ緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１２０ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭ β−メルカプトエタノール，１５％グリセロール，ｐＨ７．５）で平衡化したＰＤ１０カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて脱塩した。タンパク質調製物を一定分量（２００μＬ）に分け、−７０℃で保存した。ＢＩＯ−ＲＡＤタンパク質ＡＳＳＡＹ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，ＵＳＡ）を用いて、タンパク質濃度を決定した。

実施例３．ＢＢＲ４７＿５１９００およびＳｔａｕｒ＿４８５１の基質特異性の予備解析
ＢＢＲ４７＿５１９００およびＳｔａｕｒ＿４８５１の基質特異性を、酵素含有反応混合液、ならびにＬ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、グリシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、およびＬ−バリン等の標準Ｌ−アミノ酸、またはその塩（同種または異なる２種）において試験した。総容量５０μＬの反応混合液の組成は、他に指摘しない限り、以下のとおりであった。

ＢＢＲ４７＿５１９００またはＳｔａｕｒ＿４８５１４μｇ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０５０ｍＭ
第１Ｌ−アミノ酸１０ｍＭ
第２Ｌ−アミノ酸１０ｍＭ
アデノシン５’−トリホスフェート（ＡＴＰ）１０ｍＭ
ＭｇＳＯ_４ｘ７Ｈ_２Ｏ１０ｍＭ
Ｈ_２Ｏ５０μＬにする

反応を、３２℃で１５分間行った。反応混合液のうち１〜２μＬを、２−プロパノール：アセトン：２５０ｍＭアンモニア：Ｈ_２Ｏの１００：１００：１２：２８混合液を移動相として用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に供した。ニンヒドリンのアセトン溶液（０．３％，ｗ／ｖ）を可視化試薬として用いた。検出を５４０ｎｍで行った。反応混合液の展開後に、ＴＬＣプレート上の新たなスポットを検出した。これは、以下を含んでいた：
１）ＢＢＲ４７＿５１９００およびＬ−Ｇｌｕ／Ｌ−Ｇｌｕ、またはＬ−Ｇｌｕ／Ｌ−Ａｓｐ、またはＬ−Ｇｌｕ／Ｌ−Ｖａｌ、またはＬ−Ｇｌｕ／Ｌ−Ｉｌｅ、またはＬ−Ａｓｐ／Ｌ−Ｉｌｅ、またはＬ−Ａｓｐ／Ｌ−Ｖａｌ（図２−４）；
２）Ｓｔａｕｒ＿４８５１およびＬ−Ａｓｐ／Ｌ−Ｐｈｅ、またはＬ−Ａｓｐ／Ｌ−Ｔｒｐ、またはＬ−Ａｓｐ／Ｌ−Ｔｈｒ）（図５および６）。

得られた結果は、ＢＢＲ４７＿５１９００およびＳｔａｕｒ＿４８５１が、Ｌ−ＧｌｕおよびＬ−Ａｓｐ等の酸性アミノ酸の他のＬ−アミノ酸との連結を触媒できることを示す。

実施例４．ＢＢＲ４７＿５１９００およびＳｔａｕｒ＿４８５１により合成されたジペプチドのＨＰＬＣ解析による決定
ＢＢＲ４７＿５１９００およびＳｔａｕｒ＿４８５１により合成されたジペプチドを、総容量４００μＬの反応混合液のＨＰＬＣ解析を用いて決定した。反応混合液は、以下を含んでいた：
ＢＢＲ４７＿５１９００またはＳｔａｕｒ＿４８５１１６０μｇ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．０５０ｍＭ
Ｌ−ＡｓｐまたはＬ−Ｇｌｕ１０ｍＭ
Ｌ−ＰｈｅまたはＬ−ＰｈｅＯＭｅ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｔｒｐ１０ｍＭ
アデノシン５’−トリホスフェート（ＡＴＰ）１０ｍＭ
ＭｇＳＯ_４ｘ７Ｈ_２Ｏ１０ｍＭ
ここで、Ｍｅはメチル基を示す。

反応を、３２℃で１５分間行った。次いで、０．５ｍＬの反応混合液を、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−０．５ｍＬ，３Ｋ遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，＃ＵＦＣ５００３９６）を通じて濾過し、ＨＰＬＣ解析に供した。

条件は、以下のとおりであった：
装置：ＨＩＴＡＣＨＩＬ−２０００シリーズ
カラム：ＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ−３４．６ｘ２５０ｍｍ，５ｍｍ（ＧＬＳｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ．）
温度：４０℃
緩衝液：
Ａ（混合物Ｌ−Ａｓｐ／Ｌ−ＶａｌおよびＬ−Ｇｌｕ／Ｌ−Ｖａｌ）：０．１ＭＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ２．２）＋５ｍＭオクタンスルホネート，ナトリウム塩：ＣＨ_３ＣＮ＝４：１（ｖ／ｖ）
Ｂ（混合物Ｌ−Ａｓｐ／Ｌ−Ｐｈｅ）：０．１ＭＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ２．２）＋５ｍＭオクタンスルホネート，ナトリウム塩：ＣＨ_３ＣＮ＝７：３（ｖ／ｖ）
Ｃ（混合物Ｌ−Ａｓｐ／Ｌ−ＰｈｅＯＭｅ、Ｌ−Ａｓｐ／Ｌ−Ｔｒｐ、およびＬ−Ｖａｌ／Ｌ−Ｖａｌ）：０．１ＭＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ２．２）＋５ｍＭオクタンスルホネート，ナトリウム塩：ＣＨ_３ＣＮ＝３：２（ｖ／ｖ）
Ｄ（混合物Ｌ−Ｐｈｅ／Ｌ−Ｐｈｅ）：０．１ＭＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ２．２）＋５ｍＭオクタンスルホネート，ナトリウム塩：ＣＨ_３ＣＮ＝１：１（ｖ／ｖ）
勾配プロフィール：均一
流速：１．５ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１０μＬ
検出：ＵＶ２１０ｎｍ

ＨＰＬＣに用いた化学物質は、以下のとおりであった：
Ｌ−Ａｓｐ（Ｌ−アスパラギン酸，ナトリウム塩）：ナカライテスク株式会社＃０３５０４−７５
Ｌ−Ｐｈｅ（Ｌ−フェニルアラニン）：ナカライテスク株式会社＃２６９０１−３５
Ｌ−Ｖａｌ（Ｌ−バリン）：味の素株式会社＃３１７ＬＧ１３
Ｌ−Ｔｒｐ（Ｌ−トリプトファン）：味の素株式会社＃００００００２２０５
Ｌ−ＰｈｅＯＭｅ（Ｌ−フェニルアラニン，メチルエステル塩酸塩）：東京化成工業株式会社＃Ｐ１２７８
ＡＴＰ：オリエンタル酵母工業株式会社＃４５１４２０００
ＭｇＳＯ_４ｘ７Ｈ_２Ｏ：純正化学株式会社＃８３５８０−０３０１
αＡｓｐ−Ｐｈｅ（Ｈ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＯＨ）：ＢａｃｈｅｍＧ−１６２０
βＡｓｐ−Ｐｈｅ（Ｈ−Ａｓｐ（Ｐｈｅ−ＯＨ）−ＯＨ）：ＢａｃｈｅｍＧ−４７５０
αＡｓｐ−Ａｓｐ（Ｈ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−ＯＨ）：ＢａｃｈｅｍＧ−１５６５
Ｐｈｅ−Ａｓｐ（Ｈ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−ＯＨ）：ＢａｃｈｅｍＧ−２８７０
Ｐｈｅ−Ｐｈｅ（Ｈ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−ＯＨ）：ＢａｃｈｅｍＧ−２９２５
αＡｓｐ−Ｖａｌ（Ｈ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ＯＨ）：ＢａｃｈｅｍＧ−１６３５
Ｖａｌ−Ａｓｐ（Ｈ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＯＨ）：ＢａｃｈｅｍＧ−３５１０
Ｖａｌ−Ｖａｌ（Ｈ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＯＨ）：ＢａｃｈｅｍＧ−３５９５
αＧｌｕ−Ｖａｌ（Ｈ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＯＨ）：ＢａｃｈｅｍＧ−２０１０
γＧｌｕ−Ｖａｌ（Ｈ−Ｇｌｕ（Ｖａｌ−ＯＨ）−ＯＨ）：ＢａｃｈｅｍＧ−２０１５
Ｖａｌ−Ｇｌｕ（Ｈ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−ＯＨ）：ＢａｃｈｅｍＧ−３５２０
αＧｌｕ−Ｇｌｕ（Ｈ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−ＯＨ）：ＢａｃｈｅｍＧ−１９１５
αＡｓｐａｒｔａｍｅ（Ｈ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ）：ＢａｃｈｅｍＧ−１５４５
βＡｓｐａｒｔａｍｅ：（Ｈ−Ａｓｐ（Ｐｈｅ−ＯＭｅ）−ＯＨ）：ＢａｃｈｅｍＧ−３７２５
Ａｓｐ−Ｔｒｐ（Ｈ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−ＯＨ）：ＢａｃｈｅｍＧ−３７０５

αＧｌｕ−Ｖａｌ、γＧｌｕ−Ｖａｌ、αＡｓｐ−Ｖａｌ溶液（各々１０ｍＭ）、およびαＡｓｐ−Ｐｈｅ、βＡｓｐ−Ｐｈｅ溶液（各々５ｍＭ）を、ＨＰＬＣ解析のために調製した。生成したジペプチドの濃度を、対応する検量線を用いて決定した。標準試料の各溶液を、ＬＣ−ＱＴＯＦ／ＭＳ／ＭＳ解析のために５０倍または１００倍に希釈した（実施例５）。

反応混合液のＨＰＬＣ解析の結果を表１に示す。表１から分かるように、ＢＢＲ４７＿５１９００およびＳｔａｕｒ＿４８５１は、Ｌ−ＡｓｐおよびＬ−Ｇｌｕ等の酸性Ｌ−アミノ酸をＮ末端に有するジペプチドの生成を触媒する。

実施例５．ＢＢＲ４７＿５１９００により合成されたジペプチドについて、ＬＣ−ＱＴＯＦ／ＭＳ／ＭＳ解析による決定
実施例４に記載されるようにして得られた反応混合液および標準溶液の試料を、ＬＣ−ＱＴＯＦ／ＭＳ／ＭＳ解析に供した。

条件は、以下のとおりであった：
装置：ＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ１２００ＳＬ），ＭＳ（ＭｉｃｒｏｍａｓｓＱ−ＴＯＦＰｒｅｍｉｅｒ）
ＬＣ条件：
カラム：ＤｅｖｅｌｏｓｉｌＣ３０２．０ｘ２５０ｍｍ，３μｍ（野村化学）
温度：２０℃
緩衝液：
Ａ：Ｈ_２Ｏ（０．０２５％ギ酸）、
Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ（０．０２５％ギ酸）。
勾配プロフィール：
時間（分）Ｂ（％）
００
２０２．５
２０．１１００
２５１００
流速：０．３ｍＬ／分
注入量：２〜５μＬ

ＭＳ条件：
キャピラリー電圧：３．０ｋＶ
コーン電圧：２０Ｖ
衝突電圧：４Ｖ（ＭＳ／ＭＳ１２Ｖ）
ソース温度：８０℃
脱溶剤温度：１２０℃
コーンガス流速：５０Ｌ／時間
脱溶剤ガス流速：７００Ｌ／時間。

反応混合液のＬＣ−ＱＴＯＦ／ＭＳ／ＭＳ解析の結果を、図７〜９に示す。図７〜９から分かるように、ＢＢＲ４７＿５１９００は、αＡｓｐ−Ｐｈｅ、αＡｓｐ−Ｖａｌ、およびαＧｌｕ−Ｖａｌジペプチドの生成を触媒する。

実施例６．ＢＢＲ４７＿５１９００およびＳｔａｕｒ＿４８５１と同機能である酵素の検索
タンパク質配列のホモログについて配列データベース中で検索するため、およびタンパク質配列のアライメントのため、ＨＭＭＥＲ法を用いた。この方法は、隠れマルコフモデルプロフィール（ＨＭＭプロフィール）と呼ばれる確率モデルを使用する（ＦｉｎｎＲ．Ｄ．ら，ＨＭＭＥＲｗｅｂｓｅｒｖｅｒ：ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｓｅａｒｃｈｉｎｇ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０１１，３９（ウェブサーバー発行）：Ｗ２９−３７）。

より古いスコア付け方法論に基づくＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、および他の配列アライメントおよびデータベース検索ツールと比較して、ＨＭＭＥＲは、その根底にある数学的モデルの強みのため、同機能タンパク質等の遠縁ホモログをより優位な精度および信頼性で検出することを目指している。過去には、この強みは、高額なコンピュータ費用を伴ったが、新たなＨＭＭＥＲ３プロジェクトでは、ＨＭＭＥＲは、ＢＬＡＳＴと本質的に同等の速さになった（ＦｉｎｎＲ．Ｄ．ら，ＨＭＭＥＲｗｅｂｓｅｒｖｅｒ：ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｓｅａｒｃｈｉｎｇ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０１１，３９（ウェブサーバー発行）：Ｗ２９−３７）。

ＢＢＲ４７＿５１９００およびＳｔａｕｒ＿４８５１と同機能である酵素を検索するため、ＢＢＲ４７＿５１９００およびＳｔａｕｒ＿４８５１のアライメント（図１０）を、タンパク質配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｈｍｍｅｒ．ｊａｎｅｌｉａ．ｏｒｇ／）に対する１以上のプロフィールについて検索を可能にする、ＨＭＭＥＲ３ｓｕｉｔｅのＨＭＭ検索プログラムに供した。ＢＢＲ４７＿５１９００およびＳｔａｕｒ＿４８５１に対する配列アライメントに基づいて、相同性検索に用いられるＨＭＭプロフィールを構築した（モデル１）。見出された最も近い同機能タンパク質の一覧表（ヒット）を、図１１）に示す。｜Ｌｏｇ（Ｅ値）｜値の分布図の解析より、グループ間の値よりも低いグループのメンバー間で｜Ｌｏｇ（Ｅ値）｜値を共有するタンパク質の５つのグループが明らかとなった（図１２）。第１のグループはＢＢＲ４７＿５１９００およびＳｔａｕｒ＿４８５１を含み、第２のグループはＤＥＳおよびＢＣＥを含み、第３のグループはＢＭＹを含み、第４のグループはＢＴＨを含み、第５のグループはＢＵＲを含む。残りのタンパク質は、推測｜Ｌｏｇ（Ｅ値）｜値を有する未分類ホモログである。ＡＭＥおよびＳＦＬタンパク質を、ネガティブコントロールとして、このような未分類ホモログから選んだ。

第１（ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１）ならびに第２（ＤＥＳおよびＢＣＥ）グループのタンパク質が同機能であると仮定して、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳおよびＢＣＥのアライメント（図１３）に基づく新たなＨＭＭプロフィール（モデル２）を構築することができる。これは、上述したようにＨＭＭ検索プログラムを用いる同機能タンパク質検索に用いることができる。したがって、同機能タンパク質の新たな一覧表を作成することができる（図１４）。この一覧表は、｜Ｌｏｇ１０（Ｅ値）｜値の分布図により記載されており、最初の図とは異なる（図１５）。同機能タンパク質の新たな一覧表は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳおよびＢＣＥを含む第１のグループ；ＢＭＹおよびＢＴＨを含む第２のグループ；ならびにＢＵＲを含む第３のグループ等の３つのグループを含み得、ここで、ＡＭＥは、第１のグループにより近く（番号４７（図１２）から番号３３（図１５）への位置の変更）、ＳＦＬは、第１のグループよりも離れている（番号４９（図１２）から番号６２（図１５）への位置の変更）。

第１（ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳおよびＢＣＥ）ならびに第２（ＢＭＹ等）グループが同機能であると仮定して、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥおよびＢＭＹのアライメント（図１３）に基づく新たなＨＭＭプロフィール（モデル３）を構築することができる。これは、上述したようにＨＭＭ検索プログラムを用いる同機能タンパク質検索に用いることができる。したがって、同機能タンパク質の新たな一覧表を作成した（図１７）。同機能タンパク質の新たな一覧表は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥおよびＢＭＹを含む第１のグループ；ＢＴＨを含む第２のグループ；ならびにＢＵＲを含む第３のグループ等の３つのグループを含み得、ここで、ＡＭＥは番号３７の位置にあり、ＳＦＬは番号６５の位置にある（図１７）。

第１（ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥおよびＢＭＹ）ならびに第２（ＢＴＨ）グループが同機能であると仮定して、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹおよびＢＴＨのアライメント（図１８）に基づく新たなＨＭＭプロフィール（モデル４）を構築することができる。これは、上述したようにＨＭＭ検索プログラムを用いる同機能タンパク質検索に用いることができる。したがって、同機能タンパク質の新たな一覧表を作成した（図１９）。同機能タンパク質の新たな一覧表は、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹおよびＢＴＨを含む第１のグループ；ＢＵＲを含む第２のグループ；ＡＭＥを含む第３のグループ等の３つのグループを含み得、ここで、ＳＦＬは番号７３の位置にある（図１９）。

第１（ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹおよびＢＴＨ）ならびに第２（ＢＵＲ）グループが同機能であると仮定して、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨおよびＢＵＲのアライメント（図２０）に基づく新たなＨＭＭプロフィール（モデル５）を構築することができる。これは、上述したようにＨＭＭ検索プログラムを用いる同機能タンパク質検索に用いることができる。したがって、同機能タンパク質の新たな一覧表を作成した（図２１）。同機能タンパク質の新たな一覧表は、ＢＵＲを含む第１のグループ；ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹおよびＢＴＨを含む第２のグループ；ＡＭＥを含む第３のグループ等の３つのグループを含み得、ここで、ＳＦＬは番号１０４の位置にある（図２１）。

第１（ＢＵＲ）、第２（ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹおよびＢＴＨ）、ならびに第３（ＡＭＥ）グループが同機能であると仮定して、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨ、ＢＵＲおよびＡＭＥのアライメント（図２２）に基づく新たなＨＭＭプロフィール（モデル６）を構築することができる。これは、上述したようにＨＭＭ検索プログラムを用いる同機能タンパク質検索に用いることができる。したがって、同機能タンパク質の新たな一覧表を作成した（図２３）。同機能タンパク質の新たな一覧表は、ＢＵＲを含む第１のグループ；ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨおよびＡＭＥを含む第２のグループ等の２つのグループを含み得、ここでＳＦＬは番号６５の位置にある（図２３）。

第１（ＢＵＲ）、第２（ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨおよびＡＭＥ）グループ、ならびにＳＦＬタンパク質が同機能であると仮定して、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨ、ＢＵＲ、ＡＭＥおよびＳＦＬのアライメント（図２４）に基づく新たなＨＭＭプロフィール（モデル７）を構築することができる。これは、上述したようにＨＭＭ検索プログラムを用いる同機能タンパク質検索に用いることができる。したがって、同機能タンパク質の新たな一覧表を作成した（図２５）。同機能タンパク質の新たな一覧表は、ＢＵＲを含む第１のグループ；ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨおよびＡＭＥを含む第２のグループ；ならびに番号３８の位置にあるＳＦＬを含む第３のグループ等の３つのグループを含み得る（図２５）。

同様の様式において、Ｌ−ＡｓｐまたはＬ−Ｇｌｕ等の酸性Ｌ−アミノ酸をＮ末端に有し、かつ任意の他のＬ−アミノ酸またはその誘導体をＣ末端に有するジペプチドを合成し得る同機能Ｌ−アミノ酸αリガーゼの一覧表を作成することができる。ＢＢＲ４７＿５１９００およびＳｔａｕｒ＿４８５１タンパク質を用いてＨＭＭプロフィール（モデル１）を構築する場合、｜Ｌｏｇ１０（Ｅ値）｜≧２３３を、新たな同機能Ｌａｌｓ検索のために用いることができる；ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳおよびＢＣＥタンパク質を用いてＨＭＭプロフィール（モデル２）を構築する場合、｜Ｌｏｇ１０（Ｅ値）｜≧１９６を、新たな同機能Ｌａｌｓ検索のために用いることができる；ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥおよびＢＭＹタンパク質を用いてＨＭＭプロフィール（モデル３）を構築する場合、｜Ｌｏｇ１０（Ｅ値）｜≧１８２を、新たな同機能Ｌａｌｓ検索のために用いることができる；ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹおよびＢＴＨタンパク質を用いてＨＭＭプロフィール（モデル４）を構築する場合、｜Ｌｏｇ１０（Ｅ値）｜≧１７５を、新たな同機能Ｌａｌｓ検索のために用いることができる；ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨおよびＢＵＲタンパク質を用いてＨＭＭプロフィール（モデル５）を構築する場合、｜Ｌｏｇ１０（Ｅ値）｜≧１６２を、新たな同機能Ｌａｌｓ検索のために用いることができる；ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨ、ＢＵＲおよびＡＭＥタンパク質を用いてＨＭＭプロフィール（モデル６）を構築する場合、｜Ｌｏｇ１０（Ｅ値）｜≧１４２、新たな同機能Ｌａｌｓ検索のために用いることができる；ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＣＥ、ＢＭＹ、ＢＴＨ、ＢＵＲ、ＡＭＥおよびＳＦＬタンパク質を用いてＨＭＭプロフィール（モデル７）を構築する場合、｜Ｌｏｇ１０（Ｅ値）｜≧１２８を、新たな同機能Ｌａｌｓ検索のために用いることができる（図２６）。ここで、Ｅ値は、ＨＭＭ検索プログラムのパラメータである（ＦｉｎｎＲ．Ｄ．ら，ＨＭＭＥＲｗｅｂｓｅｒｖｅｒ：ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｓｅａｒｃｈｉｎｇ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０１１，３９（ウェブサーバー発行）：Ｗ２９−３７）。

実施例７．ＤＥＳ、ＢＵＲ、ＢＣＥ、ＢＴＨ、ＡＭＥ、ＳＦＬおよびＢＭＹ酵素のクローニング、発現および精製
ＤＥＳ、ＢＵＲ、ＢＣＥ、ＢＴＨ、ＡＭＥ、ＳＦＬおよびＢＭＹタンパク質をコードする遺伝子の一次構造を、遺伝子デザイナー・プログラムの「バック翻訳」機能（ＶｉｌｌａｌｏｂｏｓＡ．ら，ＧｅｎｅＤｅｓｉｇｎｅｒ：ａｓｙｎｔｈｅｔｉｃｂｉｏｌｏｇｙｔｏｏｌｆｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇａｒｔｉｆｉｃｉａｌＤＮＡｓｅｇｍｅｎｔｓ，ＢＭＣＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００６，７：２８５）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のために最適化した。全てのコンストラクトは、ＳｌｏｎｏＧｅｎｅ^ＴＭ遺伝子合成サービス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｌｏｎｉｎｇ．ｃｏｍ／）により合成し、最適化配列を有する標的遺伝子を含む合成ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを保持するｐＳｌｏ．Ｘのセットとして移入した。ＤＥＳ、ＢＵＲ、ＢＣＥ、ＢＴＨ、ＡＭＥ、ＳＦＬおよびＢＭＹをコードする最適化配列を有する遺伝子を保持するＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、それぞれ、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６および２７に示す。

ＤＥＳ、ＢＵＲ、ＢＣＥ、ＢＴＨ、ＡＭＥ、ＳＦＬおよびＢＭＹタンパク質をＥ．ｃｏｌｉで発現・精製することができ、そして実施例１−５においてＢＢＲ４７＿５１９００およびＳｔａｕｒ＿４８５１について記載したように、それらの活性を調べることができる。

実施例８．Ｅ．ｃｏｌｉペプチダーゼ欠損１−６Δ株の構築
８．１．Ｅ．ｃｏｌｉペプチダーゼ欠損１−５Δ株の構築
ΔｐｅｐＢ変異を有するＥ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３株（Ｅ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３株：Ｋｅｉｏコレクション，株番号ＭＥ９０６２）（ΔｐｅｐＢ変異を有するＥ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３株：Ｋｅｉｏコレクション，株番号ＪＷ２５０７；Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子保存センター，エール大学，ニュー・ヘヴン，米国，アクセッション番号ＣＧＳＣ９９９５）において、ｉａｄＡ遺伝子を欠失させた（Ｅ．ｃｏｌｉ１Δ株）。この目的のため、λａｔｔＬ−ｃａｔ−λａｔｔＲカセットを保持するＤＮＡフラグメントを、プライマーＰ１（配列番号２８）およびＰ２（配列番号２９）、ならびにｐＭＷ１１８−λａｔｔＲ−ｃａｔ−λａｔｔＬ（ＫａｔａｓｈｋｉｎａＺｈ．Ｉ．ら．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｍｏｓｋ．），２００５，３９（５）：８２３−８３１）を鋳型として用いて、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により増幅した。得られたＤＮＡフラグメントを、製造業者の使用説明書にしたがい、「Ｂｉｏ−Ｒａｄ」電気穿孔器（米国）（番号１６５−２０９８，バージョン２−８９）を用いる電気的形質転換により、Ｅ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３（ΔｐｅｐＢ）／ｐＫＤ４６株中に導入した。組換えプラスミドｐＫＤ４６（ＤａｔｓｅｎｋｏＫ．Ａ．およびＷａｎｎｅｒＢ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，９７：６６４０−６６４５）を温度感受性レプリコンとともに、λＲｅｄ媒介組換え系を担うλファージ由来遺伝子のドナーとして用いた。ｐＫＤ４６プラスミドを、上記の方法（ＤａｔｓｅｎｋｏＫ．Ａ．およびＷａｎｎｅｒＢ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，９７：６６４０−６６４５）により、Ｅ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３（ΔｐｅｐＢ）中に組み込んで、Ｅ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３（ΔｐｅｐＢ）／ｐＫＤ４６株を得ることができる。あるいは、組換えプラスミドｐＫＤ４６を含むＥ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３（ΔｐｅｐＢ）株を、Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子保存センター、エール大学，ニュー・ヘヴン，米国，アクセション番号ＣＧＳＣ７７３９から得ることができる。

Ｅ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３（ΔｐｅｐＢ，ｉａｄＡ：：λａｔｔＲ−ｃａｔ−λａｔｔＬ）形質転換体は、ｃａｔ遺伝子によりコードされるクロラムフェニコール（Ｃｍ）に耐性であり、かつｉａｄＡの代わりに「切出し可能」なクロラムフェニコール耐性マーカー（Ｃｍ^Ｒマーカー）を染色体中に保持する。Ｃｍ^Ｒマーカーを、（ＫａｔａｓｈｋｉｎａＺｈ．Ｉ．ら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｍｏｓｋ．），２００５，３９（５）：８２３−８３１）に記載されるように切り出して、Ｅ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３（ΔｐｅｐＢ，ｉａｄＡ：：λａｔｔＢ）株（Ｅ．ｃｏｌｉ２Δ株）株を構築した。

ｐｅｐＥ遺伝子を、ＢＷ２５１１３（ΔｐｅｐＢ，ｉａｄＡ：：λａｔｔＢ）株において欠失させた。λａｔｔＬ−ｃａｔ−λａｔｔＲカセットを保持するＤＮＡフラグメントを、プライマーＰ３（配列番号３０）およびＰ４（配列番号３１）、ならびにｐＭＷ１１８−λａｔｔＲ−ｃａｔ−λａｔｔＬプラスミドを鋳型として用いて、ＰＣＲにより増幅した。得られたＤＮＡフラグメントを、上記したような電気的形質転換により、Ｅ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３（ΔｐｅｐＢ，ｉａｄＡ：：λａｔｔＢ）／ｐＫＤ４６株中に導入した。Ｃｍ^Ｒマーカーを、Ｅ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３（ΔｐｅｐＢ，ｉａｄＡ：：λａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：λａｔｔＲ−ｃａｔ−λａｔｔＬ）形質転換体から切り出して、Ｅ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３（ΔｐｅｐＢ，ｉａｄＡ：：λａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：λａｔｔＢ）株（Ｅ．ｃｏｌｉ３Δ株）を構築した。

ｙｂｉＫ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３（ΔｐｅｐＢ，ｉａｄＡ：：λａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：λａｔｔＢ）株において欠失させた。λａｔｔＬ−ｃａｔ−λａｔｔＲカセットを保持するＤＮＡフラグメントを、プライマーＰ５（配列番号３２）およびＰ６（配列番号３３）、ならびにｐＭＷ１１８−λａｔｔＲ−ｃａｔ−λａｔｔＬを鋳型として用いて、ＰＣＲにより増幅した。得られたＤＮＡフラグメントを、上記したような電気的形質転換により、Ｅ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３（ΔｐｅｐＢ，ｉａｄＡ：：λａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：λａｔｔＢ）／ｐＫＤ４６株に導入した。Ｃｍ^Ｒマーカーを、Ｅ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３（ΔｐｅｐＢ，ｉａｄＡ：：λａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：λａｔｔＢ，ｙｂｉＫ：：λａｔｔＲ−ｃａｔ−λａｔｔＬ）形質転換体から切り出して、Ｅ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３（ΔｐｅｐＢ，ｉａｄＡ：：λａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：λａｔｔＢ，ｙｂｉＫ：：λａｔｔＢ）株（Ｅ．ｃｏｌｉ４Δ株）を構築した。

ｄａｐＥ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３（ΔｐｅｐＢ，ｉａｄＡ：：λａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：λａｔｔＢ，ｙｂｉＫ：：λａｔｔＢ）株において欠失させた。λａｔｔＬ−ｃａｔ−λａｔｔＲカセットを保持するＤＮＡフラグメントを、プライマーＰ７（配列番号３４）およびＰ８（配列番号３５）、ならびにｐＭＷ１１８−λａｔｔＲ−ｃａｔ−λａｔｔＬプラスミドを鋳型として用いて、ＰＣＲにより増幅した。得られたＤＮＡフラグメントを、上記したような電気的形質転換により、Ｅ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３（ΔｐｅｐＢ，ｉａｄＡ：：λａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：λａｔｔＢ，ｙｂｉＫ：：λａｔｔＢ）／ｐＫＤ４６株中に導入した。Ｃｍ^Ｒマーカーを、Ｅ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３（ΔｐｅｐＢ，ｉａｄＡ：：λａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：λａｔｔＢ，ｙｂｉＫ：：λａｔｔＢ，ｄａｐＥ：：λａｔｔＲ−ｃａｔ−λａｔｔＬ）形質転換体中に導入して、Ｅ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３（ΔｐｅｐＢ，ｉａｄＡ：：λａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：λａｔｔＢ，ｙｂｉＫ：：λａｔｔＢ，ｄａｐＥ：：λａｔｔＢ）株（Ｅ．ｃｏｌｉ５Δ株）を構築した。

このようにして、１〜５個の欠失したペプチダーゼをコードする遺伝子を有するＥ．ｃｏｌｉ株（Ｅ．ｃｏｌｉ１−５Δ株）を構築した。

８．２．Ｅ．ｃｏｌｉ５Δ株における特異的なアスパラギン酸ペプチド加水分解活性の解析
特異的なアスパラギン酸ペプチド加水分解活性を解析するため、人工ジペプチドＤＰ３（Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ−５−フルオロトリプトファン）を合成した（ロシア科学アカデミーの生物有機化学研究所部門（ＢＩＢＣｈ），プーシチノ，ロシア連邦）。ペプチド加水分解活性を、インビトロおよびインビボで試験した。

インビトロ研究については、Ｅ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３およびＥ．ｃｏｌｉ５Δの菌体を、ＯＤ_{５９５ｎｍ} 約１の菌体密度になるまで、ＬＢおよびＭ９塩＋グルコース（０．２％，ｗ／ｖ）培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２００１）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第３版）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）で３７℃にて増殖させた。増殖菌体を、遠心分離（４℃，１００００ｒｐｍ）により採取し、緩衝液Ｅ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０，２０ｍＭＮａＣｌ）中に再懸濁し、超音波処理により破砕し、続いて遠心分離（１４０００ｇ，４℃，２０分）して、細胞屑を除去した。粗タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標品として用いて、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（ＢｒａｄｆｏｒｄＭ．Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９７６，７２：２４８−２５４）を用いて決定することができる。得られた粗タンパク質調製物を用いて、ＤＰ３加水分解活性を試験した。

反応混合液は、以下を含んでいた：
５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０、
２０ｍＭＮａＣｌ、
５ｍＭＤＰ３ジペプチド、
１ｍＭＺｎＳＯ_４またはＭｎＣｌ_２、
２４μｇ粗タンパク質調製物、
Ｈ_２Ｏ総容量１０μＬまで。

反応混合液を、３７℃で異なる時間インキュベートした。ＤＰ３加水分解活性を、放出される５−フルオロトリプトファンの定量的ＴＬＣ解析により測定した（図２７，表４）。移動相として２−プロパノール：アセトン：Ｈ_２Ｏの２５：２５：４の混合液を用いた。ニンヒドリンのアセトン溶液（０．３％，ｗ／ｖ）を、可視化試薬として用いた。得られた結果は、アスパラギン酸ペプチド加水分解活性を５Δ株において測定できることを示す。このことは、Ｅ．ｃｏｌｉ５Δ株におけるＤＰ３加水分解活性を有する未知のペプチダーゼが存在することを示す。

インビボ研究については、構築したペプチダーゼ欠損Ｅ．ｃｏｌｉ５Δ株に対するＤＰ３ジペプチドの毒性を試験した（図２８）。Ｅ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３およびＥ．ｃｏｌｉ５Δ株の菌体を、ＯＤ_{５５５ｎｍ} 約２の菌体密度になるまで、Ｄ−グルコースまたはグリセロール（０．４％，ｗ／ｖ）を補充したＭ９塩培地で増殖させた。菌体バイオマスを希釈し、約１０６菌体を、Ｄ−グルコースまたはグリセロール（０．４％，ｗ／ｖ）、およびＤＰ３ジペプチドを補充したＭ９塩寒天上に撒いた。プレートを、３７℃で４８時間（Ｄ−グルコースに対する）または７２時間（グリセロールに対する）インキュベートした（表５）。可視化解析は、ｐｅｐＢ、ｉａｄＡ、ｐｅｐＥ、ｙｂｉＫおよびｄａｐＥ遺伝子によりコードされる５個の既知のアスパラギン酸ペプチド加水分解酵素の欠失が、Ｅ．ｃｏｌｉ５Δ株に対するＤＰ３毒性を減少させることを示した（Ｍ９塩＋Ｄ−グルコース培地で増殖した、ＢＷ２５１１３に対する６μＭから５Δ株に対する３０μＭまで）。５０μＭまでＤＰ３濃度を上昇させると、Ｅ．ｃｏｌｉ５Δ株の増殖が停止した。このことは、細胞内ＤＰ３ペプチダーゼ活性が残存していることを示唆する。

８．３．特異的なアスパラギン酸ペプチド加水分解活性を有するＥ．ｃｏｌｉ Δ５株における残存ペプチダーゼの同定
特異的なアスパラギン酸ペプチド加水分解活性を有する残存細胞内ペプチダーゼを同定するため、以下の手法を用いた。Ｅ．ｃｏｌｉ５Δ株の菌体を、Ｄ−グルコース（０．４％，ｗ／ｖ）を補充したＭ９塩培地４Ｌ中で３７℃で一晩増殖させた。増殖した菌体を、遠心分離（４℃，１００００ｒｐｍ）により採取し、１００ｍＬの緩衝液Ｆ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５，２０ｍＭＮａＣｌ）中に再懸濁した。

精製プロトコルは、以下のとおりであった：
工程１．フレンチ−プレス（ＴｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）を２回通し、続いて遠心分離（１４０００ｇ，４℃，２０分）により、菌体を破砕して菌体屑を除去した。得られた粗タンパク質調製物を、緩衝液Ｆ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５，２０ｍＭＮａＣｌ）で平衡化したＤＥＡＥＦＦ１６／１０カラム（２０ｍＬ）（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。緩衝液Ｆ（各々１０ｍＬ）において線形勾配のＮａＣｌ（２０カラム容量において２０〜６００ｍＭ）により流速１ｍＬ／分で溶出し、回収し、実施例８．２．に記載されるように解析した。活性画分１６〜２１が見出された。

工程２．回収画分１６〜２１からのタンパク質を、飽和（６０％）（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４により沈殿させ、２ｍＬの緩衝液Ｆ中に再懸濁させ、緩衝液Ｇ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７）で平衡化した標準ＳｕｐｅｒｄｅｘＨＲ１０／３０Ａカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。緩衝液Ｇを用い、均一な溶出を流速０．５ｍＬ／分で行った。０．５ｍｌ画分（各々０．５ｍＬ）を回収し、実施例８．２．に記載されるように解析した。活性画分（１２〜１３）を見出した。

工程３．回収画分１２〜１３（工程２）からのタンパク質を、緩衝液Ｇ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７）で平衡化した標準Ｓｏｕｒｓｅ１５Ｑカラム（１．６ｍＬ）（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。緩衝液Ｇにおいて線形勾配のＮａＣｌ（２０カラム容量において０〜４００ｍＭ）により、流速０．５ｍＬ／分で溶出した。画分（各々０．５ｍＬ）を回収し、実施例８．２．に記載されるように解析した。活性画分（１５〜１７）を見出した。精製データを表６に要約する。

工程４．特異的なアスパラギン酸ペプチド加水分解活性を有するペプチダーゼを同定するため、幾つかの画分（１５〜１７）からのタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＬａｅｍｍｌｉＵ．Ｋ．，ＣｌｅａｖａｇｅｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｄｕｒｉｎｇｔｈｅａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｔｈｅｈｅａｄｏｆｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＴ４，Ｎａｔｕｒｅ，１９７０，２２７：６８０−６８５）に供した。活性溶出のプロフィールを、タンパク質溶出のものと比較した。活性および溶出プロフィールが同一であるタンパク質が１種のみ見出された。

精製タンパク質を、ＳＤＳゲルから抽出し、トリプシンで消化した（ＧｏｖｏｒｕｎＶ．Ｍ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ．），２００３，６８（１）：４２−４９）。（ＧｏｖｏｒｕｎＶ．Ｍ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ．），２００３，６８（１）：４２−４９）に記載されるように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いて消化混合液を質量分析した。単離されたタンパク質で得られた質量スペクトルは、Ｅ．ｃｏｌｉのアミノペプチダーゼＡ／Ｉ（ＰｅｐＡ）について得られたものと一致した。したがって、第６のペプチダーゼが、Ｅ．ｃｏｌｉ５Δ株において見出された。

８．４．Ｅ．ｃｏｌｉペプチダーゼ欠損６Δ株の構築
ＰｅｐＡ遺伝子を、実施例８．１．に記載されるように、Ｅ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３（ΔｐｅｐＢ，ｉａｄＡ：：λａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：λａｔｔＢ，ｙｂｉＫ：：λａｔｔＢ，ｄａｐＥ：：λａｔｔＢ）株において欠失させた。λａｔｔＬ−ｃａｔ−λａｔｔＲカセットを保持するＤＮＡフラグメントを、プライマーＰ９（配列番号３６）およびＰ１０（配列番号３７）、ならびにｐＭＷ１１８−λａｔｔＲ−ｃａｔ−λａｔｔＬプラスミドを鋳型として用いて、ＰＣＲにより増幅した。得られたＤＮＡフラグメントを、上記したような電気的形質転換により、Ｅ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３（ΔｐｅｐＢ，ｉａｄＡ：：λａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：λａｔｔＢ，ｙｂｉＫ：：λａｔｔＢ，ｄａｐＥ：：λａｔｔＢ）／ｐＫＤ４６株中に導入して、Ｅ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３（ΔｐｅｐＢ，ｉａｄＡ：：λａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：λａｔｔＢ，ｙｂｉＫ：：λａｔｔＢ，ｄａｐＥ：：λａｔｔＢ，ｐｅｐＡ：：λａｔｔＬ−ｃａｔ−λａｔｔＲ）株（Ｅ．ｃｏｌｉ６Δ株）を構築した。

８．５．Ｅ．ｃｏｌｉ６Δ株における特異的なアスパラギン酸ペプチド加水分解活性の解析
特異的なアスパラギン酸ペプチド加水分解活性を、実施例８．２．で上記したように、インビトロで解析した。得られた結果（表４）は、４〜５Δ株と比較してより低いアスパラギン酸ペプチド加水分解活性が６Δ株において測定できることを示す。

実施例９．Ｌａｌ活性を有する改変Ｅ．ｃｏｌｉ５Δおよび６Δ株を用いる、Ｌ−ＡｓｐまたはＬ−Ｇｌｕ等の酸性Ｌ−アミノ酸をＮ末端に有するジペプチドの発酵生産
Ｌ−ＡｓｐまたはＬ−Ｇｌｕ等の酸性Ｌ−アミノ酸をＮ末端に有するジペプチドを、腸内細菌科の細菌、より具体的には、Ｅ．ｃｏｌｉ等のエシェリヒア属に属する、ジペプチド生産能を有する細菌を用いて、必要なアミノ酸（例であり、これに限定されない）を補充した、またはこれを欠く培地中で生産した。ジペプチド生産菌は、Ｌ−アミノ酸αリガーゼ活性を有するようにさらに改変された、ペプチダーゼ活性を欠損する上記Ｅ．ｃｏｌｉ５Δまたは６Δ株である。ジペプチド生産株は、さらにＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＵＲ、ＢＣＥ、ＢＴＨ、ＡＭＥ、ＳＦＬおよびＢＭＹからなる群より選ばれるＬａｌをコードする遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉの染色体に導入するか、またはＬａｌをコードする遺伝子を有するプラスミドにおいて、細菌の菌体中に導入する。Ｌａｌをコードする遺伝子を、プロモーター下に配置する。

Ｌａｌをコードする遺伝子を保持する改変Ｅ．ｃｏｌｉ５Δまたは６Δ株、およびコントロール５Δまたは６Δ株を各々、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２００１）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第３版）．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓに記載される溶原性ブロスとも呼ばれる）中で、２８〜３７℃で１８〜７２時間培養する。Ｌａｌをコードする遺伝子を保持するＥ．ｃｏｌｉ５Δまたは６Δ株を、２０×２００ｍｍ試験管における２ｍＬの発酵培地中に接種し、回転式振盪機において２５０ｒｐｍにて２８〜３７℃で１８〜７２時間培養する。

発酵培地の組成は、以下（ｇ／Ｌ）である：
グルコース５〜４０
ＮａＣｌ０．８
（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４２２
Ｋ_２ＨＰＯ_４２．０
ＭｇＳＯ_４ｘ７Ｈ_２Ｏ０．８
ＭｎＳＯ_４ｘ５Ｈ_２Ｏ０．０２
ＦｅＳＯ_４ｘ７Ｈ_２Ｏ０．０２
塩酸チアミン０．００２
酵母抽出物１．０〜２．０
ＣａＣＯ_３３０
Ｌ−Ｐｈｅ０〜１００（ｍＭ）
Ｌ−Ａｓｐ０〜１００（ｍＭ）

発酵培地を、１１６℃で３０分間滅菌する。但し、グルコースおよびＣａＣＯ_３は別々に以下のとおり滅菌する：グルコースは１１０℃で３０分間、ＣａＣＯ_３は１１６℃で３０分間。ｐＨを、ＫＯＨ溶液により５〜８に調整する。

培養後、蓄積したジペプチドを、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて測定する。ＴＬＣプレート（１０×２０ｃｍ）を、非蛍光指示薬を含むＳｏｒｂｆｉｌシリカゲル（Ｓｏｒｂｐｏｌｙｍｅｒ、クラスノダール，ロシア連邦）０．１１ｍｍ層で被覆する。ＴＬＣプレートを、１００：１００：１２：２８の２−プロパノール：アセトン：２５０ｍＭアンモニア：Ｈ_２Ｏからなる移動相で展開する。ニンヒドリンのアセトン溶液（０．３％，ｗ／ｖ）を、可視化試薬として用いる。検出を５４０ｎｍで行う。

参考例１
ＢＢＲ４７＿５１９００およびＳｔａｕｒ＿４８５１タンパク質の既知Ｌ−アミノ酸αリガーゼ（Ｌａｌ）との多重アライメントを表２（同一性）および表３（類似性）に示す。表２および３から分かるように、ＢＢＲ４７＿５１９００およびＳｔａｕｒ＿４８５１タンパク質は、既知のＬａｌと、２５％以下の同一性値（表２）、および４３％以下の類似性値（表３）を有する。

参考例２
ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＵＲ、ＢＣＥ、ＢＴＨ、ＡＭＥ、ＳＦＬおよびＢＭＹタンパク質についてのペア−ワイズ・アライメント・データを表７（同一性）および表８（類似性）に示す。表７および８から分かるように、ＢＢＲ４７＿５１９００、Ｓｔａｕｒ＿４８５１、ＤＥＳ、ＢＵＲ、ＢＣＥ、ＢＴＨ、ＡＭＥ、ＳＦＬおよびＢＭＹタンパク質は、２５％以下の同一性値（表７）、および４４％以下の類似性値（表８）を有する。

タンパク質の略語：
１−ＢＢＲ４７＿５１９００（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿００２７７４６７１．１）；
２−Ｓｔａｕｒ＿４８５１（ＮＣＢＩ参照配列：ＡＤＯ７２６２９．１）；
３−ＴＤＥ２２０９（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿９７２８０９．１）；
４−ＢＬ００２３５（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿０８１３１２．１）；
５−ｐｌｕ１２１８（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿９２８５３０．１）；
６−ＹｗｆＥ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ３９６４１．１）；
７−Ｒｓｐ１４８６（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿５２３０４５．１）；
８−ＮＰ＿９００４７６（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿９００４７６．１）；
９−Ａｐｌｅ０２０００８３５（ＮＣＢＩ参照配列：ＺＰ＿００１３４４６２．２）；
１０−ＳＭＵ１３２１ｃ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿７２１６９０．１）；
１１−ＹＰ＿８１６２６６（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿８１６２６６．１）；
１２−ＹＰ＿００１５４４７９４（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿００１５４４７９４．１）；
１３−ＹＰ＿０７７４８２（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿０７７４８２．１）；
１４−ＢＡＨ５６７２３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＨ５６７２３．１）；
１５−ＮＰ＿３５８５６３（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３５８５６３．１）；
１６−ＹＰ＿９１００６３（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿９１００６３．１）；
１７−ＢＡＧ７２１３４（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＧ７２１３４．１）；
１８−ｐｌｕ１４４０（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿９２８７３８．１）；
１９−ＡＡＺ３７７４１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＺ３７７４１．１）．

タンパク質の略語：
１−ＢＢＲ４７＿５１９００（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿００２７７４６７１．１）；
２−Ｓｔａｕｒ＿４８５１（ＮＣＢＩ参照配列：ＡＤＯ７２６２９．１）；
３−ＴＤＥ２２０９（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿９７２８０９．１）；
４−ＢＬ００２３５（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿０８１３１２．１）；
５−ｐｌｕ１２１８（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿９２８５３０．１）；
６−ＹｗｆＥ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ３９６４１．１）；
７−Ｒｓｐ１４８６（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿５２３０４５．１）；
８−ＮＰ＿９００４７６（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿９００４７６．１）；
９−Ａｐｌｅ０２０００８３５（ＮＣＢＩ参照配列：ＺＰ＿００１３４４６２．２）；
１０−ＳＭＵ１３２１ｃ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿７２１６９０．１）；
１１−ＹＰ＿８１６２６６（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿８１６２６６．１）；
１２−ＹＰ＿００１５４４７９４（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿００１５４４７９４．１）；
１３−ＹＰ＿０７７４８２（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿０７７４８２．１）；
１４−ＢＡＨ５６７２３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＨ５６７２３．１）；
１５−ＮＰ＿３５８５６３（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３５８５６３．１）；
１６−ＹＰ＿９１００６３（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿９１００６３．１）；
１７−ＢＡＧ７２１３４（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＧ７２１３４．１）；
１８−ｐｌｕ１４４０（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿９２８７３８．１）；
１９−ＡＡＺ３７７４１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＺ３７７４１．１）

略号：
ＷＴ−ＢＷ２５１１３；
４Δ−ＢＷ２５１１３（ΔｐｅｐＢ，ｉａｄＡ：：λａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：λａｔｔＢ，ｙｂｉＫ：：λａｔｔＢ）；
５Δ−ＢＷ２５１１３（ΔｐｅｐＢ，ｉａｄＡ：：λａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：λａｔｔＢ，ｙｂｉＫ：：λａｔｔＢ，ｄａｐＥ：：λａｔｔＢ；
６Δ−ＢＷ２５１１３（ΔｐｅｐＢ，ｉａｄＡ：：λａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：λａｔｔＢ，ｙｂｉＫ：：λａｔｔＢ，ｄａｐＥ：：λａｔｔＢ，ｐｅｐＡ：：λａｔｔＬ−ｃａｔ−λａｔｔＲ）．

実施例１０．ＡＴＰ再生系を用いる、ＢＢＲ４７＿５１９００およびＳｔａｕｒ＿４８５１によるＡｓｐ−Ｐｈｅの酵素生産
高度に濃縮されたＡＴＰが酵素反応を阻害することを防ぐため、Ａｓｐ−Ｐｈｅの生産収率を、ＡＴＰ再生のためのホスホエノールピルビン酸およびピルビン酸キナーゼを含むＢＢＲ４７＿５１９００およびＳｔａｕｒ＿４８５１の反応混合液において試験した。総容量１ｍｌの反応混合液の組成は、以下のとおりであった。

ＢＢＲ４７＿５１９００またはＳｔａｕｒ＿４８５１０．１５Ｕ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ９．０５０ｍＭ
Ｌ−ＡｓｐＮａ１００ｍＭ
Ｌ−Ｐｈｅ１００ｍＭ
ＡＴＰ１０ｍＭ
ホスホエノールピルビン酸１００ｍＭ
ＭｇＳＯ_４ｘ７Ｈ_２Ｏ１０ｍＭ
ピルビン酸キナーゼ２５Ｕ
Ｈ_２Ｏ総容量１ｍＬまで

反応を、３７℃で１〜４８時間行った。１ｍＬの反応混合液のうち１００μＬを、各反応時間でサンプリングした。反応を停止させるために１０μＬの１ＭＥＤＴＡ（ｐＨ９．０）が添加された各反応混合液を、ＨＰＬＣ解析に供した。条件は、実施例４に記載されるとおりであった。その結果、ＢＢＲ４７＿５１９００およびＳｔａｕｒ＿４８５１は、ＡＴＰ再生系においてＡｓｐ−Ｐｈｅを生産することができた（表９）。

実施例１１．Ｅ．ｃｏｌｉ７Δ株における特異的なＡｓｐ−Ｐｈｅ加水分解活性の解析
１１．１．Ｅ．ｃｏｌｉＡｓｐ−Ｐｈｅ加水分解ペプチダーゼ欠損７Δ株の構築
ｐｅｐＤ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９株において欠損させた。ΔａｔｔＬ−ｃａｔ−ΔａｔｔＲカセットを保持するＤＮＡフラグメントを、プライマーＰ１１（配列番号３８）およびＰ１２（配列番号３９）、ならびにｐＭＷ１１８−ΔａｔｔＬ−ｃａｔ−ΔａｔｔＲプラスミドを鋳型として用いて、ＰＣＲにより増幅した。得られたＤＮＡフラグメントを、上記したように、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＫＤ４６株中に導入した。Ｃｍ^Ｒマーカーを、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＲ−ｃａｔ−ΔａｔｔＬ）形質転換体から切り出して、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ）株を構築した。

ｐｅｐＥ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ）株において欠損させた。ΔａｔｔＬ−ｃａｔ−ΔａｔｔＲカセットを保持するＤＮＡフラグメントを、プライマーＰ１３（配列番号４０）およびＰ１４（配列番号４１）、ならびにｐＭＷ１１８−ΔａｔｔＬ−ｃａｔ−ΔａｔｔＲプラスミドを鋳型として用いて、ＰＣＲにより増幅した。得られたＤＮＡフラグメントを、上記したように、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＢ：：ΔａｔｔＢ）／ｐＫＤ４６株中に導入した。Ｃｍ^Ｒマーカーを、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＲ−ｃａｔ−ΔａｔｔＬ）形質転換体から切り出して、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ）株を構築した。

ｉａｄＡ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ）株において欠損させた。ΔａｔｔＬ−ｃａｔ−ΔａｔｔＲカセットを保持するＤＮＡフラグメントを、プライマーＰ１５（配列番号４２）およびＰ１６（配列番号４３）、ならびにｐＭＷ１１８−ΔａｔｔＬ−ｃａｔ−ΔａｔｔＲプラスミドを鋳型として用いて、ＰＣＲにより増幅した。得られたＤＮＡフラグメントを、上記したように、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ）／ｐＫＤ４６株中に導入した。Ｃｍ^Ｒマーカーを、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ，ｉａｄＡ：：ΔａｔｔＲ−ｃａｔ−ΔａｔｔＬ）形質転換体から切り出して、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ，ｉａｄＡ：：ΔａｔｔＢ）株を構築した。

ｐｅｐＡ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ，ｉａｄＡ：：ΔａｔｔＢ）株において欠損させた。ΔａｔｔＬ−ｃａｔ−ΔａｔｔＲカセットを保持するＤＮＡフラグメントを、プライマーＰ１７（配列番号４４）およびＰ１８（配列番号４５）、ならびにｐＭＷ１１８−ΔａｔｔＬ−ｃａｔ−ΔａｔｔＲプラスミドを鋳型として用いて、ＰＣＲにより増幅した。得られたＤＮＡフラグメントを、上記したように、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ，ｉａｄＡ：：ΔａｔｔＢ）／ｐＫＤ４６株中に導入した。Ｃｍ^Ｒマーカーを、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ，ｉａｄＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＡ：：ΔａｔｔＲ−ｃａｔ−ΔａｔｔＬ）形質転換体から切り出して、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ，ｉａｄＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＡ：：ΔａｔｔＢ）株を構築した。

ｐｅｐＢ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ，ｉａｄＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＡ：：ΔａｔｔＢ）株において欠損させた。ΔａｔｔＬ−ｃａｔ−ΔａｔｔＲカセットを保持するＤＮＡフラグメントを、プライマーＰ１９（配列番号４６）およびＰ２０（配列番号４７）、ならびにｐＭＷ１１８−ΔａｔｔＬ−ｃａｔ−ΔａｔｔＲプラスミドを鋳型として用いて、ＰＣＲにより増幅した。得られたＤＮＡフラグメントを、上記したように、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ，ｉａｄＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＡ：：ΔａｔｔＢ）／ｐＫＤ４６株中に導入した。Ｃｍ^Ｒマーカーを、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ，ｉａｄＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＢ：：ΔａｔｔＲ−ｃａｔ−ΔａｔｔＬ）形質転換体から切り出して、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ，ｉａｄＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＢ：：ΔａｔｔＢ）株を構築した。

ｉａａＡ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ，ｉａｄＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＢ：：ΔａｔｔＢ）株において欠損させた。ΔａｔｔＬ−ｃａｔ−ΔａｔｔＲカセットを保持するＤＮＡフラグメントを、プライマーＰ２１（配列番号４８）およびＰ２２（配列番号４９）、ならびにｐＭＷ１１８−ΔａｔｔＬ−ｃａｔ−ΔａｔｔＲプラスミドを鋳型として用いて、ＰＣＲにより増幅した。得られたＤＮＡフラグメントを、上記したように、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ，ｉａｄＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＢ：：ΔａｔｔＢ）／ｐＫＤ４６株中に導入した。Ｃｍ^Ｒマーカーを、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ，ｉａｄＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＢ：：ΔａｔｔＢ，ｉａａＡ：：ΔａｔｔＲ−ｃａｔ−ΔａｔｔＬ）形質転換体から切り出して、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ，ｉａｄＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＢ：：ΔａｔｔＢ，ｉａａＡ：：ΔａｔｔＢ）株を構築した。

ｄｐｐ遺伝子オペロン（ｄｐｐＡ，ｄｐｐＢ，ｄｐｐＣ，ｄｐｐＤ，ｄｐｐＦ）を、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ，ｉａｄＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＢ：：ΔａｔｔＢ，ｉａａＡ：：ΔａｔｔＢ）株において欠損させた。ΔａｔｔＬ−ｃａｔ−ΔａｔｔＲカセットを保持するＤＮＡフラグメントを、プライマーＰ２３（配列番号５０）およびＰ２４（配列番号５１）、ならびにｐＭＷ１１８−ΔａｔｔＬ−ｃａｔ−ΔａｔｔＲプラスミドを鋳型として用いて、ＰＣＲにより増幅した。得られたＤＮＡフラグメントを、上記したように、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ，ｉａｄＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＢ：：ΔａｔｔＢ，ｉａａＡ：：ΔａｔｔＢ）／ｐＫＤ４６株中に導入した。Ｃｍ^Ｒマーカーを、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ，ｉａｄＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＢ：：ΔａｔｔＢ，ｉａａＡ：：ΔａｔｔＢ，ｄｐｐ：：ΔａｔｔＲ−ｃａｔ−ΔａｔｔＬ）形質転換体から切り出して、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ，ｉａｄＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＢ：：ΔａｔｔＢ，ｉａａＡ：：ΔａｔｔＢ，ｄｐｐ：：ΔａｔｔＢ）株を構築した。

１１．２．Ｅ．ｃｏｌｉ７Δ株における特異的なＡｓｐ−Ｐｈｅ加水分解活性の解析
Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９およびＥ．ｃｏｌｉ７Δ株の菌体を、ＬＢ寒天培地上で、３７℃で１６時間増殖させた。増殖した菌体を、２０ｍＬのＭＳ培地中に接種し、ＯＤ_{６１０ｎｍ} 約２０の菌体密度になるまで３７℃で増殖させた。次いで、Ａｓｐ−Ｐｈｅの標準品を培養液に添加し（終濃度２ｍＭ）、さらに３２時間培養を行った。各培養時間で得られた培養液を遠心分離して、培養上清を得た。培養上清中の残存Ａｓｐ−Ｐｈｅを、ＨＰＬＣにより解析した。結果を表１０に示す。Ｅ．ｃｏｌｉ７Δ株の培地におけるＡｓｐ−Ｐｈｅ加水分解活性は、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９のものと比較して、はるかに低かった。

ＭＳ培地の組成は、以下（ｇ／Ｌ）である。
グルコース２０
（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４８
ＫＨ_２ＰＯ_４０．５
ＦｅＳＯ_４ｘ７Ｈ_２Ｏ０．００５
ＭｎＳＯ_４ｘ７Ｈ_２Ｏ０．００５
酵母抽出物１
Ｌ−Ｔｙｒ０．０５
ＭｇＳＯ_４ｘ７Ｈ_２Ｏ０．５
ＣａＣＯ_３３０

発酵培地を１２１℃で２０分間滅菌する。但し、グルコース、ＭｇＳＯ_４７Ｈ_２ＯおよびＣａＣＯ_３は別々に以下のとおり滅菌する：グルコースおよびＭｇＳＯ_４７Ｈ_２Ｏは１２１℃で２０分間、ＣａＣＯ_３は１８０℃で２時間。ｐＨを、ＫＯＨ溶液により７に調整する。その結果、特異的なＡｓｐ−Ｐｈｅ加水分解活性は、Ｅ．ｃｏｌｉ７Δ数では、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９におけるものと比較して、より低かった（表１０）。

実施例１２．Ｌａｌ遺伝子を過剰発現するＥ．ｃｏｌｉ７Δ株によるＡｓｐ−Ｐｈｅの生産性の評価
ＢＢＲ４７＿５１９００およびＳｔａｕｒ＿４８５１をコードする遺伝子の一次構造を、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のためにさらに最適化した。ブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）ＮＢＲＣ１００５９９由来のＢＢＲ４７＿５１９００およびスチグマテラ・アウランチアカ（Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａａｕｒａｎｔｉａｃａ）ＤＷ４／３−１由来のＳｔａｕｒ＿４８５１をコードする遺伝子を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより合成し、ｐＵＣ５７プラスミドのセット（ｐＵＣ５７−ｃＢＢＲおよびｐＵＣ５７−ｃＳＴＡ）として移入した。調製したｃＢＢＲおよびｃＳＴＡの塩基配列を、それぞれ、配列番号６８および６９に示す。

１２．１．ｐＳＦ１２−ｃＢＢＲおよびｐＳＦ１２−ｃＳＴＡの構築
ＢＢＲ４７＿５１９００を保持するＤＮＡフラグメントを、プライマーＰ２５（配列番号５２）およびＰ２６（配列番号５３）、ならびにｐＵＣ５７−ｃＢＢＲプラスミドを鋳型として用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲを、以下の工程プログラム：９８℃，３０秒；（９８℃，１５秒；５８℃，１０秒；７２℃，１分）×３０サイクル；７２℃，５分を用いて、０．０４μｇのプラスミドＤＮＡ、各０．２μｍｏｌ／Ｌのプライマー、１．０ユニットのＰｈｕｓｉｏｎＨｉｇｈ−ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＬａｂｓ）、１０μＬの５×ＰｈｕｓｉｏｎＨＦ緩衝液および各０．２ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰを含む５０μＬの反応混合液で行った。増幅したＤＮＡフラグメントを、ＭｉｎＥｌｕｔｅＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。

Ｓｔａｕｒ＿４８５１を保持するＤＮＡフラグメントを、プライマーＰ２７（配列番号５４）およびＰ２８（配列番号５５）、ならびにｐＵＣ５７−ｃＳＴＡプラスミドを鋳型として用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ条件および精製方法は、上述したとおりであった。

得られた溶液中の、増幅ＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩおよびＰｓｔＩで切断し、次いで、各１．３ｋｂフラグメントを、ＭｉｎＥｌｕｔｅＲｅａｃｔｉｏｎＣｌｅａｎｕｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。

ｐＳＦ１２−ｇｇｔベクターを、ｐＵＣ１８ベクターから構築した。これは、Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０株由来のｒｐｏＨプロモーターおよびγ−グルタミルトランスペプチダーゼをコードするｇｇｔ遺伝子を保持する（ＷＯ２０１３０５１６８５Ａ１）。ｐＳＦ１２−ｇｇｔベクターを、ＮｄｅＩおよびＰｓｔＩで切断した。ＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル電気泳動により分離し、３．０ｋｂＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により回収した。

ＢＢＲ４７＿５１９００またはＳｔａｕｒ＿４８５１を含む１．３ｋｂＤＮＡフラグメント、および上記で得られた３．０ｋｂＤＮＡフラグメントを、ＴａＫａＲａＬｉｇａｔｉｏｎキットＶｅｒ．２．１．（ＴａＫａＲａ）を用いる連結反応に１６℃で３０分間供した。Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９コンピテント細胞（ＴａＫａＲａ）を、連結反応混合液を用いて、熱ショック法により形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に塗布し、３０℃で一晩培養した。プラスミドを、既知の方法にしたがって、培地上で増殖した形質転換体のコロニーから抽出し、それによりｐＳＦ１２−ｃＢＢＲおよびｐＳＦ１２−ｃＳＴＡを得た。ベクターのＤＮＡ配列を、３１３０ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて確認した。

１２．２．Ｌａｌ活性を有する改変Ｅ．ｃｏｌｉ７Δ株を用いる、Ａｓｐ−Ｐｈｅの発酵生産
ジペプチド生産菌は、Ｌ−アミノ酸αリガーゼ活性を有するようにさらに改変された、ペプチダーゼおよびジペプチドパーミアーゼ活性を欠損する、上記Ｅ．ｃｏｌｉ７Δ株である。ジペプチド生産株は、プラスミド（それぞれｐＳＦ１２−ｃＢＢＲまたはｐＳＦ１２−ｃＳＴＡ）において、細菌の菌体中に導入されるＢＢＲ４７＿５１９００またはＳｔａｕｒ＿４８５１をコードする遺伝子を保持する。Ｌａｌをコードする各遺伝子を、ｒｐｏＨプロモーター下に配置する。Ｌａｌをコードする遺伝子を保持する改変Ｅ．ｃｏｌｉ７Δ株、およびコントロール７Δ株を各々、ＬＢ寒天培地（Ｌａｌをコードする遺伝子を保持する改変Ｅ．ｃｏｌｉ７Δ株のために、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）上で２５℃にて２４時間培養した。Ｌａｌをコードする遺伝子を保持するＥ．ｃｏｌｉ７Δ株、およびコントロール７Δ株を、５００ｍＬ坂口フラスコにおいて、１００ｍＭＬ−Ａｓｐおよび１００ｍＭＬ−Ｐｈｅを補充した２０ｍＬのＭＳ培地中に接種し、往復式振盪機において１２０ｒｐｍで２５℃にて３２時間培養した。得られた培養液を遠心分離して、培養上清を得た。培養上清中に蓄積したＡｓｐ−Ｐｈｅを、ＨＰＬＣにより解析した。結果を表１１に示す。

表１１から分かるように、Ａｓｐ−Ｐｈｅは、７Δ株の使用によっては生産されなかった一方で、Ａｓｐ−Ｐｈｅは、Ｌａｌをコードする遺伝子を保持する７Δ株の使用によって生産された。

実施例１３．Ｅ．ｃｏｌｉ９Δ／ｐＭＧＡＬ１／ｐＨＳＧ−ｃＬａｌによるＡｓｐ−Ｐｈｅ生産性の評価
１３．１．ｔｙｒＲおよびｔｙｒＡ欠損Ｅ．ｃｏｌｉ７Δ株の構築
先ず、芳香族アミノ酸の生合成に関与する酵素の合成を抑制するため、ｔｙｒＲ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ，ｉａｄＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＢ：：ΔａｔｔＢ，ｉａａＡ：：ΔａｔｔＢ，ｄｐｐ：：ΔａｔｔＢ）株において欠損させた。ΔａｔｔＬ−ｃａｔ−ΔａｔｔＲカセットを保持するＤＮＡフラグメントを、プライマーＰ２９（配列番号５６）およびＰ３０（配列番号５７）、ならびにｐＭＷ１１８−ΔａｔｔＬ−ｃａｔ−ΔａｔｔＲプラスミドを鋳型として用いて、ＰＣＲにより増幅した。得られたＤＮＡフラグメントを、実施例１１．１に記載したように、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ，ｉａｄＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＢ：：ΔａｔｔＢ，ｉａａＡ：：ΔａｔｔＢ，ｄｐｐ：：ΔａｔｔＢ）／ｐＫＤ４６株中に導入した。Ｃｍ^Ｒマーカーを、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ，ｉａｄＡ：：ΔｔｔＢ，ｐｅｐＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＢ：：ΔａｔｔＢ，ｉａａＡ：：ΔａｔｔＢ，ｄｐｐ：：ΔａｔｔＢ，ｔｙｒＲ：：ΔａｔｔＲ−ｃａｔ−ΔａｔｔＬ）形質転換体から切り出して、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ，ｉａｄＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＢ：：ΔａｔｔＢ，ｉａａＡ：：ΔａｔｔＢ，ｄｐｐ：：ΔａｔｔＢ，ｔｙｒＲ：：ΔａｔｔＢ）株を構築した。

次いで、ｔｙｒＡ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ，ｉａｄＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＢ：：ΔａｔｔＢ，ｉａａＡ：：ΔａｔｔＢ，ｄｐｐ：：ΔａｔｔＢ，ｔｙｒＲ：：ΔａｔｔＢ）株において欠損させて、ＰｈｅおよびＴｙｒの生合成における共通中間体であるプレフェン酸が、Ｔｙｒ生合成に利用されないようにした。ΔａｔｔＬ−ｃａｔ−ΔａｔｔＲカセットを保持するＤＮＡフラグメントを、プライマーＰ３１（配列番号５８）およびＰ３２（配列番号５９）、ならびにｐＭＷ１１８−ΔａｔｔＬ−ｃａｔ−ΔａｔｔＲプラスミドを鋳型として用いて、ＰＣＲにより増幅した。得られたＤＮＡフラグメントを、上記したように、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ，ｉａｄＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＢ：：ΔａｔｔＢ，ｉａａＡ：：ΔａｔｔＢ，ｄｐｐ：：ΔａｔｔＢ，ｔｙｒＲ：：ΔａｔｔＢ）／ｐＫＤ４６株中に導入した。Ｃｍ^Ｒマーカーを、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ，ｉａｄＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＢ：：ΔａｔｔＢ，ｉａａＡ：：ΔａｔｔＢ，ｄｐｐ：：ΔａｔｔＢ，ｔｙｒＲ：：ΔａｔｔＢ，ｔｙｒＡ：：ΔａｔｔＲ−ｃａｔ−ΔａｔｔＬ）形質転換体から切り出して、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐｅｐＤ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＥ：：ΔａｔｔＢ，ｉａｄＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＡ：：ΔａｔｔＢ，ｐｅｐＢ：：ΔａｔｔＢ，ｉａａＡ：：ΔａｔｔＢ，ｄｐｐ：：ΔａｔｔＢ，ｔｙｒＲ：：ΔａｔｔＢ，ｔｙｒＡ：：ΔａｔｔＢ）株を構築した。

１３．２．ｐＨＳＧ−ｃＢＢＲおよびｐＨＳＧ−ｃＳＴＡの構築
ｐＨＳＧ−ｃＢＢＲプラスミドを構築するために、ｐＳＦ１２−ｃＢＢＲプラスミドのｒｐｏＨプロモーターおよびＢＢＲ４７＿５１９００遺伝子を含む対応ＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩでの消化により切出し、次いで、同じ制限酵素により消化されたｐＨＳＧ３９６ベクター（ＴａＫａＲａ）に連結した。

ｐＨＳＧ−ｃＳＴＡを構築するため、ｒｐｏＨプロモーター下にあるＳｔａｕｒ＿４８５１を保持するＤＮＡフラグメントを、プライマーＰ３３（配列番号６０）およびＰ３４（配列番号６１）、ならびにｐＳＦ１２−ｃＳＴＡプラスミドを鋳型として用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは、以下の工程プログラム：９８℃，３０秒；（９８℃，１５秒；５８℃，１０秒；７２℃，１分）×３０サイクル；７２℃，５分を用いて、０．０４μｇのプラスミドＤＮＡ、各０．２μｍｏｌ／Ｌのプライマー、１．０ユニットのＰｈｕｓｉｏｎＨｉｇｈ−ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＬａｂｓ）、１０μＬの５×ＰｈｕｓｉｏｎＨＦ緩衝液および各０．２ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰを含む５０μＬの反応混合液で行った。次いで、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩにより消化された１．５ｋｂフラグメントを、同じ制限酵素で消化されたｐＨＳＧ３９６に連結した。

１３．３．ｐＭＧＡＬ１およびｐＨＳＧ−ｃＬａｌベクターによるＥ．ｃｏｌｉ９Δ株の形質転換
ｐＭＧＡＬ１ベクターを、ｐＭＷ１９（Ｗａｋｏ）から構築した。これは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰｈｅ生合成に関与する３つの遺伝子；コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼ（ＣＭ−ＰＤ）、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロソン酸−７−リン酸シンテターゼ（ＤＡＨＰシンテターゼ）、およびシキミ酸キナーゼ（ＳＫ）をそれぞれコードするｐｈｅＡ、ａｒｏＧ４、およびａｒｏＬを保持する（特許第３２２５５９７号）。ｐｈｅＡおよびａｒｏＧ４遺伝子の各々を、対応する元の遺伝子から変異させて、生合成されるＰｈｅによるネガティブ・フィードバックを回避した。

ｐＭＧＡＬ１およびｐＨＳＧ−ｃＬａｌベクターを、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地を用いて、電気穿孔法により、Ｅ．ｃｏｌｉ９Δ株中に同時に導入した。このようにして得られた株を、Ｅ．ｃｏｌｉ９Δ／ｐＭＧＡＬ１／ｐＨＳＧ−ｃＬａｌと名付けた。

１３．４．Ｅ．ｃｏｌｉ９Δ／ｐＭＧＡＬ１／ｐＨＳＧ−ｃＬａｌによるＡｓｐ−Ｐｈｅの発酵生産
改変Ｅ．ｃｏｌｉ９Δ／ｐＭＧＡＬ１／ｐＨＳＧ−ｃＬａｌおよびコントロール９Δ株／ｐＭＧＡＬ１の各々を、ＬＢ寒天培地（Ｅ．ｃｏｌｉ９Δ／ｐＭＧＡＬ１／ｐＨＳＧ−ｃＬａｌのために１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む）上で、２５℃で２４時間培養した。Ｅ．ｃｏｌｉ９Δ／ｐＭＧＡＬ１／ｐＨＳＧ−ｃＬａｌおよびコントロール９Δ／ｐＭＧＡＬ１株を、５００ｍＬ坂口フラスコにおいて１００ｍＭＬ−Ａｓｐを補充した２０ｍＬのＭＳ培地中に接種し、往復式振盪機において、１２０ｒｐｍで２５℃にて７２時間培養した。得られた培養液を遠心分離して、培養上清を得た。培養上清中に蓄積したＰｈｅおよびＡｓｐ−Ｐｈｅを、ＨＰＬＣにより解析した。結果を表１２に示す。

表１２から分かるように、Ａｓｐ−Ｐｈｅは、９Δ／ｐＭＧＡＬ１株の使用によって生産されなかった一方で、Ａｓｐ−Ｐｈｅは、Ｌａｌをコードする遺伝子を保持する９Δ／ｐＭＧＡＬ１株の使用によって生産された。

実施例１４．ＤＥＳの基質特異性の解析
１４．１．ｐＥＬＡＣ−ＭＢＰ−ＤＥＳ−ＨＴプラスミドの構築
１４．１．１．補助プラスミドｐＥＬＡＣの構築
＜ＰｌａｃＵＶ５＞ＤＮＡフラグメントを、オリゴプライマーＰ３５（配列番号６２）、Ｐ３６（配列番号６３）、およびｐＵＣ１８プラスミド（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｌ０８７５２．１）のＤＮＡを鋳型として用いて、ＰＣＲにより増幅した。

得られたＤＮＡフラグメントを、ＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩにより消化し、同じ制限酵素により消化されたｐＥＴ２２（ｂ＋）プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ，カタログ番号６９７４４−３）中にクローニングした。これにより、ｐＥＬＡＣプラスミドを構築した。

１４．１．２．補助プラスミドｐＥＬＡＣ−ＭＢＰ−ＨＴの構築
ｍａｌＥ遺伝子（シグナルペプチド配列無し）を、オリゴプライマーＰ３７（配列番号６４）、Ｐ３８（配列番号６５）、およびＥ．ｃｏｌｉＭＧ１６５５染色体を鋳型として用いて、ＰＣＲにより増幅した。得られたＤＮＡフラグメントを、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩにより消化し、ｐＥＬＡＣ−／ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩベクター中にクローニングした。これにより、ｐＥＬＡＣ−ＭＢＰ−ＨＴプラスミドを構築した。

１４．１．３．ｐＥＬＡＣ−ＭＢＰ−ＤＥＳ−ＨＴプラスミドの構築
ｐＥＬＡＣ−ＭＢＰ−ＤＥＳ−ＨＴプラスミドを構築するため、我々は、オリゴプライマーＰ３９（配列番号６６）、Ｐ４０（配列番号６７）、およびｐＵＣ５７−ＤＥＳ（ジペプチド特許出願に記載される）のＤＮＡを鋳型として用いることにより、ＤＥＳ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを増幅した。得られたＤＮＡフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、ｐＥＬＡＣ−ＭＢＰ−ＨＴ／ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩベクターに連結した。これにより、ｐＥＬＡＣ−ＭＢＰ−ＤＥＳ−ＨＴプラスミドを構築した。

１４．２．ＭＢＰ融合Ｈｉｓ６タグ付加ＤＥＳの発現および精製
ｐＥＬＡＣ−ＭＢＰ−ＤＥＳ−ＨＴを保持するＥ．ｃｏｌｉ７Δの菌体を、試験管において、１００μｇ／ｍＬアンピリシンを含むＬＢ培地中で、ＯＤ_{６１０ｎｍ}が約２になるまで、３７℃で増殖させた。得られた培養液２ｍＬを、５００ｍｌ坂口フラスコにおいて、ＩＰＴＧ（終濃度０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）を補充した１００ｍＬのＬＢ培地中に、３０℃で８時間接種した。誘導された菌体を、１．６Ｌの培養ブロスから採取し、２００〜２４０ｍＬのＨＴ−ＩＩ緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ，ｐＨ８．０，０．３ＭＮａＣｌ，１０ｍＭイミダゾール，１５％グリセロール）中に再懸濁し、ソニケーター（ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ２０１Ｍ，ＫＵＢＯＴＡ）を用いて超音波処理した。４℃および１４，０００ｒｐｍでの１５分間の遠心分離、続いて、０．４５ｍｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通じた濾過により、屑を除去した。粗タンパク質の溶液を、製造業者の推奨にしたがい、ＡＫＴＡａｖａｎｔ２５（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ＨｉｓＴＡＬＯＮＳｕｐｅｒｆｌｏｗカートリッジ，５ｍｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に充填した。ＭＢＰ融合Ｈｉｓ_６タグ付加ＤＥＳを含む画分を合わせ、ＳＣ緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，０．３ＭＮａＣｌ，１５％グリセロール）で平衡化したＰＤ−１０カラム（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて脱塩した。

１４．３．ＭＢＰ融合Ｈｉｓ_６タグ付加ＤＥＳのＡｓｐ−Ｐｈｅ加水分解活性の解析
ＭＢＰ融合Ｈｉｓ_６タグ付加ＤＥＳにより合成されたジペプチドを、総容量４００μＬの反応混合液のＨＰＬＣ解析を用いて決定した。反応混合液は、以下を含んだ：
ＤＥＳ１６０μｇ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．０５０ｍＭ
Ｌ−Ａｓｐ１００ｍＭ
Ｌ−Ｐｈｅ１００ｍＭ
アデノシン５’−トリホスフェート（ＡＴＰ）１０ｍＭ
ＭｇＳＯ_４ｘ７Ｈ_２Ｏ１０ｍＭ

反応を、３７℃で１５分間行った。次いで、酵素反応を停止するために１０μｌの１ＭＥＤＴＡ（ｐＨ９．０）が添加された反応混合液を、ＨＰＬＣ解析に供した。条件は、実施例４に記載されるとおりであった。その結果、ＤＥＳは、０．３０ｍＭＡｓｐ−Ｐｈｅの精製を触媒する。

本発明は、その好ましい実施形態を参照して詳細に記載されているものの、発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更が為され得ること、および均等物が採用され得ることは、当業者に明らかである。本明細書中の全ての引用文献は、参照により本願の一部として援用される。

（配列の記載）
配列番号１は、ＢＢＲ４７＿５１９００遺伝子を示す。
配列番号２は、ＢＢＲ４７＿５１９００タンパク質を示す。
配列番号３は、Ｓｔａｕｒ＿４８５１遺伝子を示す。
配列番号４は、Ｓｔａｕｒ＿４８５１タンパク質を示す。
配列番号５は、ＤＥＳ遺伝子を示す。
配列番号６は、ＤＥＳタンパク質を示す。
配列番号７は、ＢＵＲ遺伝子を示す。
配列番号８は、ＢＵＲタンパク質を示す。
配列番号９は、ＢＣＥ遺伝子を示す。
配列番号１０は、ＢＣＥタンパク質を示す。
配列番号１１は、ＢＴＨ遺伝子を示す。
配列番号１２は、ＢＴＨタンパク質を示す。
配列番号１３は、ＡＭＥ遺伝子を示す。
配列番号１４は、ＡＭＥタンパク質を示す。
配列番号１５は、ＳＦＬ遺伝子を示す。
配列番号１６は、ＳＦＬタンパク質を示す。
配列番号１７は、ＢＭＹ遺伝子を示す。
配列番号１８は、ＢＭＹタンパク質を示す。
配列番号１９は、ＢＢＲ４７＿５１９００を保持するＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを示す。
配列番号２０は、Ｓｔａｕｒ＿４８５１を保持するＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを示す。
配列番号２１は、ＤＥＳを保持するＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを示す。
配列番号２２は、ＢＵＲを保持するＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを示す。
配列番号２３は、ＢＣＥを保持するＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを示す。
配列番号２４は、ＢＴＨを保持するＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを示す。
配列番号２５は、ＡＭＥを保持するＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを示す。
配列番号２６は、ＳＦＬを保持するＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを示す。
配列番号２７は、ＢＭＹを保持するＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを示す。
配列番号２８は、プライマーＰ１を示す。
配列番号２９は、プライマーＰ２を示す。
配列番号３０は、プライマーＰ３を示す。
配列番号３１は、プライマーＰ４を示す。
配列番号３２は、プライマーＰ５を示す。
配列番号３３は、プライマーＰ６を示す。
配列番号３４は、プライマーＰ７を示す。
配列番号３５は、プライマーＰ８を示す。
配列番号３６は、プライマーＰ９を示す。
配列番号３７は、プライマーＰ１０を示す。
配列番号３８は、プライマーＰ１１を示す。
配列番号３９は、プライマーＰ１２を示す。
配列番号４０は、プライマーＰ１３を示す。
配列番号４１は、プライマーＰ１４を示す。
配列番号４２は、プライマーＰ１５を示す。
配列番号４３は、プライマーＰ１６を示す。
配列番号４４は、プライマーＰ１７を示す。
配列番号４５は、プライマーＰ１８を示す。
配列番号４６は、プライマーＰ１９を示す。
配列番号４７は、プライマーＰ２０を示す。
配列番号４８は、プライマーＰ２１を示す。
配列番号４９は、プライマーＰ２２を示す。
配列番号５０は、プライマーＰ２３を示す。
配列番号５１は、プライマーＰ２４を示す。
配列番号５２は、プライマーＰ２５を示す。
配列番号５３は、プライマーＰ２６を示す。
配列番号５４は、プライマーＰ２７を示す。
配列番号５５は、プライマーＰ２８を示す。
配列番号５６は、プライマーＰ２９を示す。
配列番号５７は、プライマーＰ３０を示す。
配列番号５８は、プライマーＰ３１を示す。
配列番号５９は、プライマーＰ３２を示す。
配列番号６０は、プライマーＰ３３を示す。
配列番号６１は、プライマーＰ３４を示す。
配列番号６２は、プライマーＰ３５を示す。
配列番号６３は、プライマーＰ３６を示す。
配列番号６４は、プライマーＰ３７を示す。
配列番号６５は、プライマーＰ３８を示す。
配列番号６６は、プライマーＰ３９を示す。
配列番号６７は、プライマーＰ４０を示す。
配列番号６８は、ブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）ＮＢＲＣ１００５９９のＢＢＲ４７＿５１９００をコードする最適化遺伝子を示す。
配列番号６９は、スチグマテラ・アウランチアカ（Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａａｕｒａｎｔｉａｃａ）のＳｔａｕｒ＿４８５１をコードする最適化遺伝子を示す。

Claims

エシェリヒア属に属するジペプチド生産細菌であって、
ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードする１以上の遺伝子の改変により、ペプチダーゼ活性が減弱または不活化されるように改変されており、
エシェリヒア属に属するジペプチド生産細菌におけるペプチダーゼ活性の減弱または不活化の比較基準が、エシェリヒア属に属する同じジペプチド生産細菌の野生型株におけるペプチダーゼ活性であり、かつ
以下（Ａ）〜（Ｅ）からなる群より選ばれるＤＮＡを含むように改変された、エシェリヒア属に属するジペプチド生産細菌：
（Ａ）配列番号１、３または５の塩基配列を有するＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号１、３または５で示される配列に相補的な塩基配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号２、４または６のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号２、４または６のアミノ酸配列に対して１〜３０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含み、かつジペプチド合成活性を有するバリアントタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｅ）配列番号２、４または６のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有し、かつジペプチド合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
前記細菌が、エシェリヒア・コリ種に属する、請求項１記載の細菌。
ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードする前記遺伝子が、ｐｅｐＡ、ｐｅｐＢ、ｐｅｐＤ、ｐｅｐＥ、ｐｅｐＰ、ｐｅｐＱ、ｐｅｐＮ、ｐｅｐＴ、ｉａｄＡ、ｉａａＡ（ｙｂｉＫ）、およびｄａｐＥからなる群より選ばれる、請求項１または２記載の細菌。
下記：
（Ｆ）配列番号２、４または６のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（Ｇ）配列番号２、４または６のアミノ酸配列に対して１〜３０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含み、かつジペプチド合成活性を有するバリアントタンパク質；
（Ｈ）配列番号２、４または６のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有し、かつジペプチド合成活性を有するタンパク質、
からなる群より選ばれるタンパク質の生産方法であって、
以下を含む、生産方法：
（ａ）培養培地中で請求項１〜３のいずれか一項記載の細菌を培養して、前記タンパク質を生産すること；
（ｂ）前記細菌または培養培地中、あるいはその双方に前記タンパク質を蓄積させること；および、必要に応じて
（ｃ）前記細菌または培養培地から前記タンパク質を回収すること。
以下の工程を含む、Ｎ末端側が酸性アミノ酸残基または酸性Ｌ−アミノ酸残基の誘導体であるジペプチドまたはその塩の生産方法：
（ａ）下記：
（Ｆ）配列番号２、４または６のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（Ｇ）配列番号２、４または６のアミノ酸配列に対して１〜３０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含み、かつジペプチド合成活性を有するバリアントタンパク質；
（Ｈ）配列番号２、４または６のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有し、かつジペプチド合成活性を有するタンパク質、
からなる群より選ばれるタンパク質の存在下における適切な条件下でＬ−アミノ酸またはその誘導体、あるいはそれらの塩を反応させること；
（ｂ）適切な溶媒中に前記ジペプチドまたはその塩を蓄積させること；および、必要に応じて
（ｃ）適切な溶媒から前記ジペプチドまたはその塩を回収すること
〔ただし、配列番号６のアミノ酸配列に関連するタンパク質が用いられる場合、生産されるジペプチドはＬ−Ａｓｐ−Ｌ−Ｐｈｅである〕。
Ｎ末端側が酸性アミノ酸残基または酸性Ｌ−アミノ酸残基の誘導体であるジペプチドまたはその塩の生産方法であって、以下の工程：
（ａ）培養培地中で細菌を培養すること；
（ｂ）前記細菌または培養培地中、あるいはその双方に前記ジペプチドを蓄積させること；および、必要に応じて
（ｃ）前記細菌または培養培地から前記ジペプチドを回収すること、
を含み、
前記細菌が、以下（Ａ）〜（Ｅ）からなる群より選ばれるＤＮＡを含むように改変された、エシェリヒア属に属するジペプチド生産細菌である、生産方法：
（Ａ）配列番号１、３または５の塩基配列を有するＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号１、３または５で示される配列に相補的な塩基配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号２、４または６のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号２、４または６のアミノ酸配列に対して１〜３０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含み、かつジペプチド合成活性を有するバリアントタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｅ）配列番号２、４または６のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有し、かつジペプチド合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
〔ただし、配列番号６のアミノ酸配列に関連するタンパク質が用いられる場合、生産されるジペプチドはＬ−Ａｓｐ−Ｌ−Ｐｈｅである〕。
前記Ｌ−アミノ酸またはその誘導体が、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、およびＬ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルからなる群より選ばれる、請求項５記載の方法。
前記ジペプチドが、式：Ｒ１−Ｒ２により表され、
Ｒ１が、酸性Ｌ−アミノ酸残基、または酸性Ｌ−アミノ酸残基の誘導体であり、
Ｒ２が、Ｌ−アミノ酸残基、またはＬ−アミノ酸残基の誘導体であり、
前記Ｌ−アミノ酸残基が、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、およびＬ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルからなる群より選ばれる、請求項５または６のいずれか記載の方法。
Ｒ１が、Ｌ−アスパラギン酸またはＬ−グルタミン酸残基であり、
Ｒ２が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−バリン、またはＬ−フェニルアラニン残基の低級アルキルエステルである、請求項８記載の方法。
Ｒ１が、Ｌ−アスパラギン酸残基であり、
Ｒ２が、Ｌ−フェニルアラニン、またはＬ−フェニルアラニン残基の低級アルキルエステルである、請求項８記載の方法。
前記Ｌ−フェニルアラニン残基の低級アルキルエステルが、Ｌ−フェニルアラニンのメチル、エチルまたはプロピルエステルである、請求項８記載の方法。