ES2538100T3 - Procedimiento para la realización y evaluación de ensayos de mezclado y medición para la medición de cinéticas de reacción así como de concentraciones y afinidades de analitos en formato múltiplex - Google Patents

Procedimiento para la realización y evaluación de ensayos de mezclado y medición para la medición de cinéticas de reacción así como de concentraciones y afinidades de analitos en formato múltiplex Download PDF

Info

Publication number
ES2538100T3
ES2538100T3 ES08761034.1T ES08761034T ES2538100T3 ES 2538100 T3 ES2538100 T3 ES 2538100T3 ES 08761034 T ES08761034 T ES 08761034T ES 2538100 T3 ES2538100 T3 ES 2538100T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
fluorescence
microparticles
carrier
populations
different
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES08761034.1T
Other languages
English (en)
Inventor
Werner Lehmann
Alexander BÖHM
Kai Grossmann
Rico Hiemann
Jörg NITSCHKE
Stefan RÖDIGER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Attomol Molekulare Diagnostika GmbH
Original Assignee
Attomol Molekulare Diagnostika GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE102007031137A external-priority patent/DE102007031137A1/de
Application filed by Attomol Molekulare Diagnostika GmbH filed Critical Attomol Molekulare Diagnostika GmbH
Application granted granted Critical
Publication of ES2538100T3 publication Critical patent/ES2538100T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Procedimiento para el análisis múltiplex de varios analitos que comprende las etapas de: a) Utilizar un portador, sobre el que están inmovilizadas al menos dos poblaciones de micropartículas diferentes, diferenciándose las diferentes poblaciones de micropartículas en su codificación de fluorescencia y conteniendo al menos dos de las poblaciones de micropartículas con codificación de fluorescencia diferentes en cada caso micropartículas, que están ocupadas con una determinada población de moléculas aceptoras específica, diferenciándose entre sí las poblaciones de moléculas aceptoras de las al menos dos poblaciones de micropartículas con codificación de fluorescencia diferentes. b) Medir la fluorescencia del portador de la etapa a) con una resolución óptica 1 antes de poner en contacto el portador con la muestra que va a analizarse o antes del inicio de la reacción, permitiendo la resolución 1: - una diferenciación de singletes, dupletes, tripletes, multipletes y monocapas de micropartículas, y - la determinación de la situación local de las micropartículas inmovilizadas individuales de las respectivas al menos dos poblaciones de micropartículas diferentes sobre el portador teniendo en cuenta la codificación de fluorescencia en cada caso diferente de las al menos dos poblaciones de micropartículas diferentes. c) Poner en contacto el portador de la etapa a) con la muestra que va a analizarse, provocando la interacción del respectivo analito con la molécula aceptora específica para el mismo sobre la micropartícula inmovilizada correspondiente una variación de la fluorescencia. d) Realizar al menos una medición adicional de la fluorescencia del portador durante o después de la puesta en contacto o del inicio de la reacción según la etapa c) con una resolución 2. e) Asociar los valores de fluorescencia medidos con la resolución 2 con los singletes, dupletes, tripletes, multipletes y monocapas de micropartículas individuales identificados localmente sobre el portador según la etapa b) y asociados a una determinada población de moléculas aceptoras. f) Determinar la variación de la fluorescencia mediante la puesta en contacto según la etapa c) para cada singlete de micropartículas identificado localmente y cada micropartícula en un duplete, triplete, multiplete y monocapa sobre el portador.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
5
15
25
35
45
55
E08761034
28-05-2015
electrónica). El núcleo de microcápsulas puede encontrarse en forma sólida, líquida o gaseosa (esferas huecas). En el caso de las partículas de matriz se conocen sistemas de fase homogénea y heterogénea. Según la invención se tienen en cuenta todas las micropartículas que posibilitan una inmovilización. Los corpúsculos de partícula están compuestos preferiblemente por un material polimérico. Se prefieren los siguientes materiales poliméricos, que comprenden, pero no se limitan a: poliestireno, poli(ácido acrílico), poliacrilonitrilo, poliamida, poliacrilamida, poliacroleína, polibutadieno, policaprolactona, policarbonato, poliéster, polietileno, poli(tereftalato de etileno), polidimetilsiloxano, poliisopreno, poliuretano, poli(acetato de vinilo), poli(cloruro de vinilo), polivinilpiridina, poli(cloruro de vinilbencilo), poliviniltolueno, poli(cloruro de vinilideno), polidivinilbenceno, poli(metacrilato de metilo), polilactida, poliglicolida, poli(lactida-co-glicolida], polianhídrido, poliortoéster, polisulfona o combinaciones de los mismos. Otros materiales poliméricos, tales como por ejemplo hidratos de carbono, tales como carboximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, agar, gel, un polímero de tipo proteico, polipéptidos, células eucariotas y procariotas, lípidos, metal, resinas, látex, caucho, silicona, tal como por ejemplo polidimetildifenilsiloxano, vidrio, melamina, cerámica, carbón vegetal, caolinita, bentonita y similares pueden usarse de la misma manera. A estos polímeros pueden incorporarse también un imán o un óxido metálico que responde magnéticamente seleccionado del grupo compuesto por óxido metálico superparamagnético, paramagnético o ferromagnético. Las partículas pueden contener grupos funcionales adicionales en la superficie, tales como por ejemplo carboxilatos, ésteres, alcoholes, carbamidas, aldehídos, aminas, óxidos de azufre, grupos mercapto, óxidos de nitrógeno o halogenuros, que pueden facilitar una unión de reactantes analíticos y/o una unión de corpúsculos a corpúsculos.
Se han descrito en gran número procedimientos para la producción de micropartículas por medio de procesos de formación de partículas reactivos y no reactivos. En la formación de partículas reactiva tiene lugar la formación de la pared o de la matriz en paralelo a un proceso de polimerización, policondensación o poliadición. En los procedimientos no reactivos se utilizan directamente polímeros formadores de película, que se llevan de manera termodinámica a la separación de fases y a la formación de partículas. En procedimientos para la encapsulación de materiales de núcleo sólidos o líquidos se utilizan por ejemplo resinas de melamina-formaldehído. En particular pueden utilizarse de manera variada y sin problemas resinas de melamina-formaldehído, y pueden aplicarse para la formación de partículas a partir de la fase acuosa. El tamaño de microcápsula puede ajustarse en función de las condiciones de reacción, por ejemplo adición de emulsionante o método de dispersión, y para el uso según la invención se encuentra entre 0,5 y 30 m. Una posibilidad adicional es la reticulación hidrotérmica de hidroximetilmelamina.
El experto conoce micropartículas con codificación de fluorescencia y se describen por ejemplo en los documentos DE 699 07 630 T2 y DE 10054382.0. Los colorantes, cuando se usa más de un colorante para teñir más de una población de partículas, se seleccionan de tal manera que presentan espectros de emisión esencialmente diferentes, preferiblemente con máximos de emisión que están separados por más de 10 nm, más preferiblemente con máximos de emisión que están separados por más de 25 nm, que están separados aún más preferiblemente por más de 50 nm. Los colorantes pueden seleccionarse para presentar bandas de emisión que son apropiadas para filtros que pueden obtenerse en el mercado, o para detectar fluoróforos múltiples con diferentes bandas de excitación y emisión.
Insertar aquí una lista de las clases de colorantes de fluorescencia.
Colorantes fluorescentes, que sirven para el marcaje de las micropartículas, son todas las sustancias que pueden emitir señales de luminiscencia detectables. Sin embargo, también pueden utilizarse colorantes que emiten radiación de rayos X o presentan fosforescencia. Colorantes fluorescentes en el sentido de la invención son todos los compuestos inorgánicos y/u orgánicos gaseosos, líquidos o sólidos, que se caracterizan porque tras la excitación vuelven a emitir la energía absorbida en forma de radiación de una longitud de onda igual, más larga o más corta. Es decir, también pueden usarse pigmentos inorgánicos u orgánicos con capacidad luminiscente o “puntos cuánticos” (quantum dots) como colorantes fluorescentes en el sentido de la invención. Sin embargo, también puede estar previsto que las micropartículas tengan una constitución tal que presenten fluorescencia propia, o tanto fluorescencia propia como un marcaje fluorescente no propio. Una fluorescencia propia de las micropartículas puede generarse por ejemplo porque las micropartículas contienen el mineral fluorita. Como colorantes fluorescentes no propios pueden utilizarse por ejemplo: cloruro de dansilo, isotiocianato de fluoresceína, 7-cloro-4-nitrobenzoxadiazol, anhídrido del ácido pirenbutirilacético, N-yodoacetil-N’-(ácido 5-sulfónico-1-naftil)-etilendiamina, 8-sulfonato de 1anilinonaftaleno, 6-sulfonato de 2-toluidinonaftaleno, 7-(p-metoxibencilamino)4-nitro-benz-2-oxa-1,3-diazol, formicina, 2-aminopurinorribonucleósido, etenoadenosina, benzoadenosina, ácido -y -parinárico y/o ácido 9,11,13,15octadecatetraenoico, cristales de selenito de cadmio de un solo tamaño o de tamaños diferentes, y otros. Como colorantes fluorescentes pueden utilizarse igualmente por ejemplo complejos de metales de transición, que contienen las siguientes sustancias: rutenio (II), renio (I) u osmio e iridio como átomo central y ligandos de diimina; porfirinas fosforescentes con platino, paladio, lutecio o estaño como átomo central; complejos fosforescentes de las tierras raras tales como europio, disprosio o terbio; cristales fosforescentes tales como rubí, Cr-YAG, alejandrita u óxidos mixtos fosforescentes tales como fluorogermanato de magnesio o cristales de selenito de cadmio, fluoresceína, aminofluoresceína, aminometilcumarina, rodamina, rodamina 6G, rodamina B, tetrametilrodamina, bromuro de etidio y/o naranja de acridina.
Como colorantes fluorescentes pueden utilizarse por ejemplo las siguientes sustancias en combinación:
5
10
15
20
25
30
35
40
E08761034
28-05-2015
(tris-4,7-difenil-1,10-fenantrolina)rutenio (II)/HPTS (tris-4,7-difenil-1,10-fenantrolina)rutenio (II)/fluoresceína (tris-4,7-difenil-1,10-fenantrolina)rutenio (II)/rodamina B (tris-4,7-difenil-1,10-fenantrolina)rutenio (II)/rodamina B-éster octadecílico (tris-4,7-difenil-1,10-fenantrolina)rutenio (II)/hexadecilo-naranja de acridina (tris-teonil-trifluorometilacetonato)europio (III)/hidroximetilcumarina tetrafenilporfirina platino (II)/rodamina B-éster octadecílico tetrafenilporfirina platino (II)/rodamina B tetrafenilporfirina platino (II)/naftofluoresceína tetrafenilporfirina platino (II)/sulforrodamina 101 octaetilporfirina platino (II)/eosina octaetilporfirina platino (II)/tionina octaetilcetoporfirina platino (II)/azul Nilo Cr(III)-YAG/azul Nilo y Cr(III)-YAG/naftofluoresceína aminocumarina/aminofluoresceína aminocumarina/rodamina 6G aminocumarina/tetrametilrodamina aminocumarina/naranja de acridina aminofluoresceína/rodamina 6G aminocumarina/azul Nilo aminofluoresceína/tetrametilrodamina aminofluoresceína/bromuro de etidio y DAPI/rodamina. Sin embargo, también pueden utilizarse combinaciones con 3 colorantes para la codificación de las partículas, como
por ejemplo: aminocumarina, rodamina, azul Nilo o aminocumarina, fluoresceína, rodamina. Son posibles combinaciones adicionales. Como fluorescencia superficial puede denominarse o bien la fluorescencia de la capa más externa de las
micropartículas o bien, cuando las moléculas aceptoras están marcadas con fluorescencia sobre la propia superficie
de la partícula, la fluorescencia de estas moléculas aceptoras.
Como fluorescencia de ligando se denomina la fluorescencia que o bien procede de analitos marcados con un
colorante correspondiente o bien, cuando se utiliza un ligando de competencia marcado correspondientemente, la
fluorescencia de este ligando marcado o bien cuando una molécula de detección fluorescente se une a los ligandos
unidos a las moléculas aceptoras.
En una variante preferida se introducen mediante polimerización para la codificación de partículas uno o varios colorantes de las clases de las cumarinas, rodaminas o derivados de azul Nilo en las partículas y un derivado de fluoresceína como fluorescencia superficial o para el marcaje de ligandos.
Si se codifica con cumarina, fluoresceína y rodamina, pueden utilizarse preferiblemente Cy5 y colorantes fluorescentes con una longitud de onda de emisión mayor para la fluorescencia superficial o para la fluorescencia de ligando. Sin embargo, también es posible implementar la fluorescencia superficial o fluorescencia de ligando a través
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E08761034
28-05-2015
de un par de FRET, como por ejemplo fluoresceína y rodamina. Entonces están disponibles para la codificación colorantes de cumarina y cian, etc. Las posibilidades de codificación aumentan enormemente porque un mismo colorante puede utilizarse en varias capas de las micropartículas a diferentes concentraciones. De este modo resulta para cada capa y entre diferentes capas un gran número de posibilidades de formación de razones, que pueden aprovecharse para la decodificación de las poblaciones de partículas.
Una posibilidad adicional para la formación de estructura dentro de micropartículas consiste en la introducción mediante polimerización por capas de micropartículas fluorescentes o con codificación de fluorescencia adicionales. De este modo pueden generarse de manera dirigida en las micropartículas patrones, como por ejemplo de grano grueso o fino, o el número de los gránulos por capa, que pueden aprovecharse para la codificación de numerosas poblaciones de micropartículas.
Según la invención se utilizan preferiblemente micropartículas de melamina, sílice, polisulfona y poliéter, polimetacrilato, muy preferiblemente de polimetacrilato. Por regla general tienen un diámetro de 0,5 -60 m. El tamaño de partícula preferido asciende a 5-15 m. A este respecto, la forma de las partículas puede ser esférica, elíptica, cilíndrica, irregular o cuboidal.
Las micropartículas usadas preferiblemente se caracterizan porque están compuestas preferiblemente por 2 capas y un núcleo, que se diferencian desde el punto de vista de la fluorescencia óptica y siendo al menos la capa externa resistente a la temperatura y estando compuesta por ejemplo por melamina. La capa central e interna están compuestas preferiblemente también por un polímero resistente a la temperatura, siempre que las pruebas utilizadas transcurran a temperaturas más elevadas. Las partículas pueden contener en una o varias capas partículas magnéticas, con cuya ayuda se garantiza una inmovilización segura de las partículas durante la medición.
Las diferentes capas pueden contener uno o varios colorantes fluorescentes, que se aprovechan para la codificación, así como colorantes fluorescentes, que se acoplaron directamente o facilitado a través de biomoléculas a la superficie de la partícula. Los colorantes fluorescentes, que se unieron a través de biomoléculas a la superficie, pueden tener por consiguiente la función de codificación así como la función de indicación de la cinética de unión o de reacción.
Alternativamente a las partículas con codificación de fluorescencia pueden utilizarse también células en forma de suspensiones, monocapa o cortes histológicos, pudiendo diferenciarse entre sí diferentes poblaciones celulares a través de su estructura fina o dado el caso a través de su codificación de fluorescencia.
Los polímeros en la superficie de la partícula pueden encontrarse en forma no modificada o en forma modificada. Posibles funcionalizaciones son grupos carboxilo, sulfhidrilo, epoxilo, amino, hidroxilo, ácido sulfónico, pegililo, acrilo, fosfato.
Inmovilización de micropartículas
Preferiblemente se usa un dispositivo, que como puntos de medición contiene micropartículas con codificación de fluorescencia que portan las moléculas aceptoras y están inmovilizadas por gravedad, fuerzas magnéticas o mecánicas, por la unión química o física al fondo del recipiente de manera permanente o durante la duración de la operación de medición. A este respecto, las micropartículas pueden acoplarse directamente al portador o facilitado a través de moléculas ligadoras. Como moléculas ligadoras actúan también las moléculas aceptoras inmovilizadas que representan preferiblemente biomoléculas. Las partículas inmovilizadas de las diferentes poblaciones de partículas se distribuyen aleatoriamente por todo el área prevista del portador y pueden encontrarse como singletes, dupletes, tripletes, multipletes, como disposiciones complejas e incluso como monocapa. La función más importante de la inmovilización de partículas es la ventaja de que sólo es necesario que la decodificación de las fluorescencias de partícula tenga lugar una vez y después sólo tiene que registrarse la fluorescencia superficial o de ligando para el registro de puntos de medición adicionales. Si las partículas no se inmovilizan de manera permanente, el registro de las fluorescencias de partícula también debe tener lugar durante el registro de los puntos de medición adicionales.
Las partículas no tienen que inmovilizarse de manera firme en una superficie sólida, sino retenerse de manera estable en un plano de enfoque, lo que también puede garantizarse mediante un gradiente de densidad. En caso de usar partículas de densidades diferentes, puede conseguirse por consiguiente una codificación adicional de poblaciones de partículas. Pueden utilizarse por ejemplo diferentes densidades mediante el uso de polímeros diferentes en la producción de partículas y capas de partículas. La creación del gradiente se garantiza por ejemplo mediante el pipeteo simultáneo de muestra y gradientes de densidad, pudiendo la dilución de la muestra ser igual o variar a lo largo del gradiente. En caso de variación de la dilución de la muestra es posible realizar en una mezcla básica de reacción por ejemplo una titulación del analito. El gradiente de densidad puede encontrarse como gradiente homogéneo o como gradiente escalonado. Las partículas pueden sedimentarse por gravedad en el límite de fase deseado. Si se trata de un gradiente de carga que se obtiene preferiblemente mediante anfolitos, las partículas también pueden migrar de manera correspondiente a su carga a través de un campo aplicado a su punto isoeléctrico. Mediante la combinación de gradientes de carga y de densidad homogéneos pueden crearse múltiples capas de perlas en el recipiente de reacción.
Resulta ventajoso que los límites de fase entre diferentes densidades, en el caso de fondos no planos del entorno de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E08761034
28-05-2015
reacción (los fondos de las microplacas de prueba nunca son por ejemplo idealmente planos) también consigan a pesar de ello un plano de enfoque plano. De este modo se ahorra esfuerzo de enfoque y por consiguiente tiempo. También es posible encerrar las partículas con la disolución de reacción entre un líquido apolar menos denso y uno apolar más denso, para limitar de este modo el espacio de reacción. De este modo también es posible minimizar la fluorescencia de fondo. Las fluorescencias de fondo también pueden minimizarse añadiendo a la disolución de reacción por ejemplo un colorante extintor o nanopartículas que absorben luz, que no perjudican la reacción pero aumentan el contraste y por consiguiente la sensibilidad. Preferiblemente se añaden aquellas sustancias para aumentar el contraste, que corresponden a la luz de la longitud de onda de excitación y/o de la longitud de onda de emisión de la o de las fluorescencias de ligando.
Moléculas aceptoras
Como moléculas aceptoras, que son preferiblemente biomoléculas, se utilizan aquellas sustancias, que se unen específicamente a los analitos de la muestra o de la muestra de referencia con alta sensibilidad y especificidad, o que compiten con el analito por la unión a un análogo. La molécula aceptora y el análogo o ligando pueden portar un marcaje de fluorescencia y/o un extintor (quencher). Las biomoléculas inmovilizadas pueden ser péptidos o proteínas y en este caso preferiblemente anticuerpos, antígenos, enzimas, lectinas, aptámeros. Sin embargo, también pueden ser polisacáridos, lípidos o ácidos nucleicos. En el caso de ácidos nucleicos se utilizan en la mayoría de los casos oligonucleótidos de ADN o ARN sintéticos. Sin embargo, también pueden emplearse análogos de ácido nucleico no naturales.
El acoplamiento de las moléculas aceptoras a las micropartículas tiene lugar de manera covalente y/o de manera no covalente.
Variación de la fluorescencia
Las reacciones necesarias para la detección son interacciones intermoleculares, que transcurren en la superficie límite entre la fase sólida de la superficie de la partícula y la fase líquida de la disolución de reacción. A este respecto, en función del principio de prueba se provoca una variación de la fluorescencia de la fluorescencia superficial o de ligando que se hace perceptible mediante un aumento o disminución de la intensidad, polarización, duración de la fluorescencia superficial o de ligando en la superficie de la partícula y en la evolución temporal se registra con al menos dos puntos de medición. Una reducción de la intensidad de la fluorescencia puede producirse al degradarse, tal como ya se expuso anteriormente, biomoléculas marcadas con fluorescencia inmovilizadas sobre la superficie de la partícula en la reacción.
Alternativamente puede producirse un aumento de la señal de fluorescencia, cuando un extintor se desplaza mediante la reacción fuera de la proximidad espacial hacia el fluoróforo extinguido, empezando el fluoróforo a fluorescer como por ejemplo en el caso de balizas moleculares, Scorpions, cebadores Amplifluor. La extinción del fluoróforo también puede neutralizarse durante la reacción mediante la degradación de una songa TaqMan inmovilizada, permaneciendo y fluoresciendo el fluoróforo tras la degradación de la sonda en la superficie de la partícula. Igualmente es posible que se generen pares de FRET mediante la unión espacialmente adyacente de sondas marcadas con moléculas de colorante fluorescente a las moléculas de analito, que a su vez se inmovilizaron durante la reacción sobre la superficie de las partículas por ejemplo mediante PCR. También está previsto que un aumento de las señales de fluorescencia de la fluorescencia de ligando sobre la superficie de la partícula pueda generarse porque se unan moléculas de detección marcadas con fluorescencia como por ejemplo anticuerpos específicos anti-grupos fosfato. Mediante esta unión a péptidos fosforilados durante la reacción e inmovilizados sobre la superficie de la partícula se aumenta de manera mediable la concentración de grupos fluorescentes, sin que sean necesarios la extinción y sistemas FRET.
La variación de la fluorescencia que va a medirse puede preferiblemente:
-consistir en una disminución de la fluorescencia superficial, por ejemplo mediante degradación.
-consistir en un aumento de la fluorescencia superficial, por ejemplo mediante el desplazamiento de un
ligando de competición marcado con un extintor de la molécula aceptora marcada con un colorante
correspondiente mediante uno o varios analitos.
-consistir en una disminución de la fluorescencia de ligando, por ejemplo mediante la unión específica de un
analito marcado con un colorante correspondiente a un aceptor marcado con un extintor sobre la superficie
de la partícula.
-consistir en un aumento de la fluorescencia de ligando, por ejemplo mediante la unión específica de un
analito marcado con un colorante correspondiente a una molécula aceptora correspondiente sobre la
superficie de la micropartícula.
-consistir en una variación de la fluorescencia total, por ejemplo mediante la acción conjunta de un par de FRET entre molécula aceptora y analito.
imagen6
imagen7
imagen8
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
E08761034
28-05-2015
-Un procedimiento según la invención, caracterizado porque las micropartículas presentan funcionalizaciones superficiales, que pueden aprovecharse para el acoplamiento covalente o no covalente de moléculas aceptoras y la inmovilización de las partículas al/en el portador.
-Un procedimiento según la invención, caracterizado porque las micropartículas están compuestas preferiblemente por poliestireno, polimetacrilato, polisulfona, poliéter, sílice o resina de melamina.
-Un procedimiento según la invención, caracterizado porque las micropartículas con codificación de fluorescencia están inmovilizadas por gravedad, fuerzas magnéticas, eléctricas o mediante una unión química o física, o la inclusión parcial en un polímero en el fondo del recipiente o en un gradiente de densidad y/o de carga de manera permanente o durante la duración de la operación de medición.
-Un procedimiento según la invención, caracterizado porque las micropartículas con codificación de fluorescencia están inmovilizadas de manera facilitada a través de moléculas ligadoras o aceptoras en el portador.
-Un procedimiento según la invención, caracterizado porque las moléculas aceptoras se unen al o a los analitos específicos de la muestra o de la muestra de referencia con una elevada sensibilidad y especificidad o porque las moléculas aceptoras compiten con el analito por la unión de un análogo.
-Un procedimiento según la invención, caracterizado porque las moléculas aceptoras pueden ser biomoléculas y preferiblemente péptidos, proteínas, anticuerpos, antígenos, enzimas, lectinas, aptámeros, polisacáridos, lípidos, glicolípidos, hormonas, ácidos nucleicos o análogos de ácido nucleico.
-Un procedimiento según la invención, caracterizado porque la interacción entre moléculas aceptoras y analitos o análogo conduce a una variación de la fluorescencia en el sentido de una reducción o un aumento de una fluorescencia.
-Un procedimiento según la invención, caracterizado porque se usa un aparato de medición, en el que el termociclador está combinado con un electroimán o un imán permanente para la inmovilización de las micropartículas.
-Un procedimiento según la invención, caracterizado porque de manera especialmente preferible se registran 1-10 píxeles por partícula preseleccionada.
-Un procedimiento según la invención, caracterizado porque al menos un píxel registra la partícula preseleccionada.
-Un procedimiento según la invención, caracterizado porque exclusivamente se tienen en cuenta como singletes, dupletes, tripletes y/o como distribuciones de orden superior incluyendo monocapas, partículas distribuidas.
-Un procedimiento según la invención, caracterizado porque los puntos de medición adicionales tienen lugar tras la puesta en contacto según la etapa c) de manera correspondiente a periodos de tiempo predefinidos o tras alcanzar temperaturas de reacción definidas.
-Un procedimiento según la invención, caracterizado porque los valores de medición registrados en la evolución de tiempo o en diferentes ciclos de reacción de los puntos de medición adicionales de una serie de medición de un mismo lugar de medición toman como referencia uno o varios valores de medición de la misma serie de medición, del mismo lugar de medición o también de otros lugares de medición.
-Un procedimiento según la invención, caracterizado porque los valores de medición se corrigen considerando evoluciones de tiempo de blanqueamiento determinadas previamente.
-El uso de un procedimiento según la invención para determinar la cinética de reacción para al menos un analito en la muestra que va a analizarse.
Ventajas:
-Establecimiento como referencia de sólo el punto de medición 1 y dado el caso una muestra comparativa.
De este modo la medición se vuelve más exacta y pueden utilizarse o medirse menos partículas por
población.
-Sólo son necesarias una determinación de lugar y decodificación únicas. De este modo puede ahorrarse tiempo y conseguirse una reducción de datos.
-La resolución 2 menor contribuye a que pueda registrarse un área grande y por tanto se detecten más partículas por operación de registro, lo que ahorra tiempo.
-Un ensayo de mezclado y medición es sencillo de manejar, de modo que resultan pocas posibilidades de error. Además es posible registrar cinéticas de reacción, con lo que se amplía la calidad del análisis.
-La reducción del número de partículas por población necesarias para la evaluación posibilita no sólo un
imagen9
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
E08761034
28-05-2015
Cociente 3
población de partículas 1: 0,5
población de partículas 2: 1
Todos los demás cocientes y todos los demás diámetros y grosores de capa de las partículas no se diferencian.
El punto de medición 1 se registra a la resolución 1 con un objetivo con un aumento de 4 veces. Los puntos de medición adicionales para determinar el desarrollo de la fluorescencia de ligando se registran igualmente a la resolución 1 usando un objetivo con un aumento de 4 veces. Para la correcta recuperación de las partículas se utilizan las coordenadas espaciales relativas de las partículas del punto de medición 1, para poder compensar imprecisiones al desplazarse múltiples veces por los campos de medición. Por tanto, también se incluyen de manera especialmente preferible como singletes partículas inmovilizadas en la evaluación, dado que éstos se identifican, decodifican y recuperan de una manera más sencilla y segura. Los efectos de blanqueamiento cuantificados previamente de los colorantes fluorescentes usados deben corregirse, antes de que se deduzcan los valores de fluorescencia de ligando a partir de los datos. El aumento así como la velocidad del aumento de la fluorescencia de ligando a través de diferentes puntos de medición son proporcionales a la actividad cinasa en la muestra (véase también el ejemplo 2).
Figura 3: Representación esquemática de un sistema de aparato (A) y un entorno de reacción (B) para la amplificación de secuencias diana y detección de los amplificados combinadas en la matriz de micropartículas
(A) El aparato controlado por ordenador de manera completamente automática representa mediante sus parámetros de rendimiento una combinación de microscopio de fluorescencia directa y termociclador.
En un bastidor 6 con accionamiento z motorizado se encuentran los componentes ópticos compuestos al menos por un sistema óptico de larga distancia 5 para la detección de fluorescencia equipado con un objetivo 20X y elementos para la conducción de la radiación y para la formación de la imagen. La excitación tiene lugar a través de al menos una lámpara de xenón o al menos dos LED 3 o láseres 4 diferentes preferiblemente en las regiones del espectro de 350-400 nm; 450-500 nm; 550-600 nm. Los longitudes de onda concretas de la luz de excitación dependen de los colorantes fluorescentes usados y se ajustan de manera fina en caso necesario mediante filtros 2 apropiados. La luz emitida por los colorantes fluorescentes se separa de la luz de excitación mediante filtros de emisión 1 correspondientes y se registra mediante una cámara sensibilizada 3. La platina presenta un accionamiento x/y que presenta una exactitud de menos de 0,1 mm y aloja el termociclador con soporte para muestras (en este caso para 96 recipientes de reacción con una capacidad de 0,2 ml). Bajo los recipientes de reacción, que presentan un fondo plano, está ubicado opcionalmente un imán 11 (imán permanente o un electroimán), de modo que las micropartículas paramagnéticas se inmovilizan bien durante la operación de medición.
Un control por ordenador automático comprende el programa de PCR y con ello el perfil de temperatura de la reacción de PCR, los cambiadores de filtro, la cámara, la adquisición de imágenes y el procesamiento de imágenes, el accionamiento x/y/z y el control de la luz de excitación, así como la superficie de usuario, de modo que durante, por ejemplo, la reacción de PCR puede garantizarse la emisión de las fluorescencias de amplificado para las diferentes poblaciones de partículas.
Alternativamente al microscopio de fluorescencia directa, el aparato puede estar realizado también como microscopio de fluorescencia inversa.
(B)
Como recipientes de reacción se usan por ejemplo NucleoSorb de 8 tiras 12, que se cierran con un cubreobjetos de vidrio.
(C)
La mezcla maestra de PCR se pipetea junto con el ADN de muestra 16 en el recipiente de reacción y se recubre con aceite. Después se cierra opcionalmente el recipiente de reacción con un cubreobjetos y se inicia la operación de PCR/medición. Mientras transcurren los ciclos de PCR tiene lugar la medición de las fluorescencias preferiblemente en la fase de hibridación (adición del cebador) en condiciones isotérmicas. Alternativamente tiene lugar el registro de una curva de fusión al final de la PCR. Las micropartículas están inmovilizadas durante la PCR preferiblemente de manera constante mediante acoplamiento covalente, sedimentación o atracción magnética. En caso de usar electroimanes, las partículas pueden encontrarse durante la PCR inmovilizadas o flotando libremente y se inmovilizan de nuevo para cada medición.
1-Filtro de emisión
2-Filtro para luz de excitación
3-Cámara (CCD o CMOS)
4-LED o láser para excitación
5-Sistema óptico de larga distancia
imagen10
imagen11
E08761034
28-05-2015
Se usan las siguientes partículas de manera correspondiente a la figura 2:
Partícula 1:
El núcleo contiene por ejemplo 100 partes de aminocumarina y por ejemplo 100 partes de azul Nilo (100/100). La capa central contiene por ejemplo 100 partes de fluoresceína y la capa externa contiene por ejemplo 50 partes de 5 aminocumarina y por ejemplo 100 partes de azul Nilo.
Partícula 2:
El núcleo contiene por ejemplo 100 partes de aminocumarina y por ejemplo 100 partes de azul Nilo (100/100). La capa central contiene por ejemplo 100 partes de fluoresceína y la capa externa contiene por ejemplo 100 partes de aminocumarina y por ejemplo 100 partes de azul Nilo.
10 La partícula 1 porta un péptido que puede fosforilarse mediante ERK1 y la partícula 2 con fines de referencia un péptido similar, pero que no puede fosforilarse. En caso de usar poblaciones de micropartículas adicionales pueden integrarse péptidos que pueden fosforilarse adicionales en la prueba, lo que aumenta el grado de múltiplex del análisis.
Tras registrarse la fluorescencia de partícula para aminocumarina y para azul Nilo usando un objetivo con un
15 aumento de 20 veces y localizarse e identificarse las partículas de las poblaciones de partículas 1 y 2, se pipetea la mezcla de reacción en los recipientes de reacción recubiertos con partículas y se cierran. El desarrollo de la fluorescencia de ligando de rodamina como consecuencia de la reacción de cinasa se registra en función de la velocidad de reacción en diferentes puntos de tiempo usando un objetivo con un aumento de 4 veces en el caso de densidades de partículas reducidas y con un aumento de 10 veces en el caso de densidades de partículas elevadas
20 hasta que se detectó una señal clara.
Alternativamente, según el principio expuesto en el presente documento pueden establecerse muchas otras aplicaciones para la detección de antígenos y anticuerpos, con pero también sin una reacción enzimática que transcurra simultáneamente.
Leyenda de las figuras
Cebador
imagen12
Sonda de captación con fluoróforo 1
Fluoróforo 1
Hebras de ácido nucleico hibridadas
Diana (amplificado [figura 1], péptidos [figura 2])
Taq polimerasa
Capa de partículas media con partículas magnéticas y 100 partes de fluoróforo, por ejemplo fluoresceína
Partícula

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
ES08761034.1T 2007-06-13 2008-06-13 Procedimiento para la realización y evaluación de ensayos de mezclado y medición para la medición de cinéticas de reacción así como de concentraciones y afinidades de analitos en formato múltiplex Active ES2538100T3 (es)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102007027779 2007-06-13
DE102007027779 2007-06-13
DE102007031137A DE102007031137A1 (de) 2007-06-13 2007-06-29 Verfahren und Sonden/Primärsystem zum "real time" Nachweis eines Nukleinsäuretargets
DE102007031137 2007-06-29
DE102008008485 2008-02-08
DE102008008485 2008-02-08
PCT/EP2008/057515 WO2008152145A1 (de) 2007-06-13 2008-06-13 Verfahren zur durchführung und auswertung von mix & measure assays für die messung von reaktionskinetiken sowie von konzentrationen und affinitäten von analyten im multiplexformat

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2538100T3 true ES2538100T3 (es) 2015-06-17

Family

ID=40129269

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES08761034.1T Active ES2538100T3 (es) 2007-06-13 2008-06-13 Procedimiento para la realización y evaluación de ensayos de mezclado y medición para la medición de cinéticas de reacción así como de concentraciones y afinidades de analitos en formato múltiplex

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20100203572A1 (es)
EP (2) EP2167964B1 (es)
ES (1) ES2538100T3 (es)
WO (2) WO2008152144A1 (es)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2449104B1 (en) 2009-06-29 2014-06-04 Luminex Corporation Chimeric primers with hairpin conformations and methods of using same
WO2011037802A2 (en) * 2009-09-28 2011-03-31 Igor Kutyavin Methods and compositions for detection of nucleic acids based on stabilized oligonucleotide probe complexes
SI23321A (sl) * 2010-03-03 2011-09-30 Inštitut za fizikalno biologijo d.o.o. Izboljĺ ano zbiranje fluorescentne svetlobe iz vzorca med pomnoĺ˝evanjem v rt-pcr
GB201007867D0 (en) * 2010-05-11 2010-06-23 Enigma Diagnostics Ltd Signalling system
US20120034703A1 (en) * 2010-08-06 2012-02-09 Affymetrix, Inc. Devices, Systems and Methods for Processing of Magnetic Particles
US9329127B2 (en) * 2011-04-28 2016-05-03 Bio-Rad Laboratories, Inc. Fluorescence scanning head with multiband detection
CN104039978A (zh) 2011-09-29 2014-09-10 露美内克丝公司 水解探针
EP3329279B1 (en) * 2015-10-05 2021-07-07 The University of North Carolina at Chapel Hill Decoding methods for multiplexing assays and associated fluidic devices, kits, and solid supports
CN113376146A (zh) * 2020-02-25 2021-09-10 上海交通大学 适于生物分子多重检测的检测颗粒及其制备方法与应用
CN113984722B (zh) * 2020-05-26 2025-09-26 深圳市液芯科技有限公司 液相芯片检测系统、分析一种或多种待分析物的方法
DE102023101477A1 (de) * 2023-01-20 2024-07-25 Testo bioAnalytics GmbH Verfahren und Aufnahmeraum zur optischen Aufzeichnung von Mikropartikeln und Verwendung einer Bewegungskomponente zur Entfernung eines Abdeckelements vor einer Aufzeichnung
DE102023131381A1 (de) 2023-11-10 2025-05-15 Attomol Gmbh Molekulare Diagnostika Kompakter Präzisions-ThermoCycler mit Wärmespeicher und Verfahren zur schnellen Temperierung von Proben

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2082256T3 (es) * 1992-03-23 1996-03-16 Hoffmann La Roche Metodo de deteccion del adn.
EP0892808B1 (en) * 1996-04-12 2008-05-14 PHRI Properties, Inc. Detection probes, kits and assays
EP1033411B1 (en) * 1996-06-04 2006-02-22 University of Utah Research Foundation Fluorescent donor-acceptor pair
US6327410B1 (en) * 1997-03-14 2001-12-04 The Trustees Of Tufts College Target analyte sensors utilizing Microspheres
GB9812768D0 (en) * 1998-06-13 1998-08-12 Zeneca Ltd Methods
US6514750B2 (en) * 2001-07-03 2003-02-04 Pe Corporation (Ny) PCR sample handling device
AUPS076802A0 (en) * 2002-02-26 2002-03-21 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Selective nucleic acid amplification
EP1509624A2 (en) * 2002-05-31 2005-03-02 Secretary, Department Of Atomic Energy Met/fret based method of target nucleic acid detection whereby the donor/acceptor moieties are on complementary strands
AU2003267583A1 (en) * 2002-09-19 2004-04-08 The Chancellor, Master And Scholars Of The University Of Oxford Molecular arrays and single molecule detection
WO2004061127A2 (en) * 2003-01-02 2004-07-22 University Of Rochester Hybridization-based biosensor containing hairpin probes and use thereof
CA2545252A1 (en) * 2003-11-06 2005-05-26 University Of Nevada, Reno Improved methods for detecting and measuring specific nucleic acid sequences
US20070020656A1 (en) * 2005-05-11 2007-01-25 Stratagene California Snapback oligonucleotide probe

Also Published As

Publication number Publication date
EP2167685A1 (de) 2010-03-31
US20100203572A1 (en) 2010-08-12
EP2167964B1 (de) 2015-03-11
EP2167685B1 (de) 2014-12-17
EP2167964A1 (de) 2010-03-31
WO2008152144A1 (de) 2008-12-18
WO2008152145A1 (de) 2008-12-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2538100T3 (es) Procedimiento para la realización y evaluación de ensayos de mezclado y medición para la medición de cinéticas de reacción así como de concentraciones y afinidades de analitos en formato múltiplex
ES2668960T3 (es) Sensor de autocodificación con microesferas
JP4500455B2 (ja) マイクロキャリアのコード化
US7869011B2 (en) Apparatus and methods for analysis and sorting of particles such as polymer beads
Braeckmans et al. Encoding microcarriers: present and future technologies
JP4583923B2 (ja) 生体分子基板ならびにそれを利用した検査および診断の方法および装置
EP1388587A1 (en) Biomolecular substrate and method and apparatus for examination and diagnosis using the same
US20220317100A1 (en) Flow cell with one or more barrier features
US20090227043A1 (en) Fluorescence Resonance Energy Transfer Assay Based on Modified Solid Surface
EP1021718A1 (en) Self-encoding fiber optic sensor
AU2008331824A1 (en) Alternate labeling strategies for single molecule sequencing
WO2005016515A2 (en) Colorable microspheres for dna and protein microarray
CN113640512A (zh) 用于多路测定的解码方法及相关流体设备、试剂盒和固体支持物
ES2266297T3 (es) Procedimiento y equipo de analisis para la deteccion de analitos en una muestra.
ES2284833T3 (es) Procedimiento y aparato bioquimicos para detectar caracteristicas geneticas.
WO2000058735A2 (en) High throughput screening apparatus and methods for arraying microparticles
ES2284832T3 (es) Procedimiento y aparato bioquimicos para la deteccion de caracteristicas de proteinas.
JPWO2004068144A1 (ja) 液体試料の分析方法及び分析装置
WO2007115815A1 (en) Method and apparatus for labelling, reading and sorting of microcarriers
CN121488151A (zh) 使用激光粒的光谱可区分微珠
US20080032311A1 (en) Low volume mixing of sample