ES2538499T3

ES2538499T3 - Composiciones inmunogénicas para PCV2 y métodos de producir composiciones de este tipo

Info

Publication number: ES2538499T3
Application number: ES05856068.1T
Authority: ES
Inventors: Marc Allan Eichmeyer; Greg Nitzel; Merrill Lynn Schaeffer
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc
Current assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Priority date: 2004-12-30
Filing date: 2005-12-29
Publication date: 2015-06-22
Anticipated expiration: 2025-12-29
Also published as: EP2460818A3; HUE046045T2; PT2460820T; EP2460819A3; ES2532861T3; HUE025537T2; EP2460818A2; HRP20150568T1; PH12014500696A1; CN103285387A; RU2011132502A; SI2281829T1; RU2620968C9; PT2460817T; DK2281829T3; EP2460819A2; EP2460821A3; DK1833992T3; ES2629679T3; CN102660578B

Abstract

Un método de recuperar proteína recombinante expresada por el marco de lectura abierto 2 de PCV2 en el sobrenadante, en el que dicho método incluye las etapas de: (i) infectar células en medio de crecimiento con un vector de baculovirus que contiene dicho marco de lectura abierto 2; (ii) provocar que dicho vector de baculovirus exprese dicha proteína de marco de lectura abierto 2; y (iii) recuperar dicha proteína de marco de lectura abierto 2 en el sobrenadante, en donde dicha recuperación se produce al menos 5 días después de la infección de las células con dicho vector de baculovirus.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones inmunogénicas para PCV2 y métodos de producir composiciones de este tipo.

LISTADO DE SECUENCIAS

Esta solicitud contiene un listado de secuencias en formato papel y en formato legible por ordenador.

Un aspecto de la presente divulgación se relaciona con la recuperación de una proteína expresada por el marco de 5 lectura abierto 2 (ORF2) del circovirus porcino tipo 2 (PCV2). Más particularmente, la proteína es una proteína re-combinante expresada por un virus transfectado que contiene secuencias de codificación recombinantes del circovi-rus porcino tipo 2, el marco de lectura abierto 2. Aún más particularmente, se deja que el virus transfectado infecte células en un medio de crecimiento y la proteína expresada por el marco de lectura abierto 2 se recupera en el so-brenadante, y no del interior de las células. Más particularmente aún, el método comprende los pasos de amplificar 10 el gen del marco de lectura abierto 2 del circovirus porcino tipo 2, clonar esta porción amplificada en un primer vec-tor, recortar la porción del marco de lectura abierto 2 de este primer vector y clonarla en un vector de transferencia, cotransfectar el vector de transferencia con un vector viral en células en un medio de crecimiento,lograr la infección de las células por el vector viral y de esa manera expresar el marco de lectura abierto 2 y recuperar la proteína re-combinante expresada codificada por el marco de lectura abierto 2 en el sobrenadante. 15

En otro aspecto, la presente divulgación se relaciona con una composición inmunogénica eficaz para inducir una respuesta inmune contra PCV2 y con métodos para producir dicha composiciones inmunogénicas. Más particular-mente, la presente divulgación se relaciona con una composición inmunológica eficaz para proveer una respuesta inmune que proteja a un animal que recibe la composición y reducir, o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con una infección por PCV2. Aún más particularmente, la presente divulgación se relaciona con una com-20 posición inmunológica basada en proteínas que confiera una protección eficaz contra una infección por PCV2. Aún más particularmente, la presente divulgación se relaciona con una composición inmunológica que comprende el ORF2 de PCV2, en donde la administración de PCV2-ORF2 da como resultado la protección contra una infección por PCV2. Más particularmente, la presente divulgación se relaciona con una composición inmunológica eficaz para conferir una inmunidad eficaz a porcinos que reciban la composición inmunológica y donde la composición com-25 prende la proteína expresada por el ORF2 de PCV2.

Divulgación de la Técnica Anterior

El circovirus porcino tipo 2 (PCV2) es un virus a ADN pequeño (17-22 nm de diámetro), icosahédrico, desnudo o sin envoltura, que contiene un genoma circular de cadena simple. Kim et al (J. Vet. Sci, 2002, 3(1): 19-23) caracterizan las proteínas recombinantes de aislado de campo de PCV2. Nawagitgul et al (J. Gen. Virol, 2000, 81: 2281-2287) in-30 forman que una proteína estructural principal de PCV2 es codificada por ORF2. El PCV2 comparte un 80% de iden-tidad de secuencia aproximadamente con el circovirus porcino de tipo 1 (PCV1). Sin embargo, a diferencia del PCV1, que en general no es virulento, los porcinos infectados con PCV2 presentan un síndrome conocido común-mente como síndrome de desmedro multisistémico post-destete (PMWS). El PMWS se caracteriza clínicamente por desmedro o debilidad, palidez de la piel, letargia, dificultad respiratoria, diarrea, ictericia e ictericia ligera. En algunos 35 cerdos afectados, se evidencia una combinación de todos los síntomas, en tanto otros cerdos solamente presentan uno o dos de estos síntomas. Durante la necropsia, también lesiones microscópicas y macroscópicas en diversos te-jidos y órganos, siendo los órganos linfoides el sitio más común de las lesiones. Se ha observado una fuerte correla-ción entre la cantidad de antígeno o ácido nucleico PCV2 y la gravedad de las lesiones linfoides microscópicas. Los índices de mortalidad en los cerdos infectados con PCV2 pueden acercarse a tanto como un 80%. Además del 40 PMWS, el PCV2 se ha asociado con otras diversas infecciones incluyendo seudorrabia, síndrome reproductor y res-piratorio de porcinos (PRRS), enfermedad de Glasser, meningitis estreptocócica, salmonelosis, colibacilosis de post-destete, hepatosis dietética y bronconeumonía supurante.

En el pasado, se ha utilizado la proteína del marco de lectura abierto 2 (ORF2) del PCV2, con un peso molecular aproximado de 30 kDa cuando se corre sobre un gel SDS-PAGE, como un componente antigénico en vacunas para 45 PCV2. Blanchard et al (Vaccine 21, 2003, 4565-4575) describen protocolos de de vacunación basados en ADN de 2 inyecciones de refuerzo utilizando un cultivo de 72 h en la producción de un lisado de proteína bruto. Los métodos típicos para obtener el ORF2 para su uso en dichas vacunas comprende en general amplificar el ADN que codifica el ORF2 del PCV2, transfectar un vector viral con el ADN del ORF2, infectar células con dicho vector viral que contiene el ADN del ORF2, permitir que el virus exprese la proteína ORF2 dentro de la célula y extraer la proteína ORF2 de la 50 célula mediante lisis celular. Estos procedimientos generalmente demoran hasta cuatro días después de la infección de las células por el vector viral. Sin embargo, estos procedimientos tienen la desventaja que los procedimientos de extracción son costosos y también demoran mucho tiempo. Además, no se recupera una gran cantidad de ORF2 de las células; en consecuencia, es necesario infectar una gran cantidad de células con una gran cantidad de vectores virales con el fin de obtener cantidades suficientes de la proteína expresada recombinante para su uso en vacunas y 55

semejantes.

Los enfoques actuales sobre inmunización contra PCV2 incluyen vacunas basadas en ADN, tales como las que se describen en la Patente de EEUU Nº 6.703.023. Sin embargo, dichas vacunas han resultado ineficaces para conferir una inmunidad protectora contra una infección por PCV2 y los signos clínicos asociados con la misma.

Por consiguiente, persiste en la técnica la necesidad de un método para obtener una proteína ORF2, que no requie-5 ra extracción de la proteína ORF2 desde el interior de las células infectadas. También se necesitan métodos de ob-tención de la proteína ORF2 recombinante en cantidades suficientes como para preparar eficazmente composicio-nes de vacunas. Se necesitan asimismo métodos para obtener la proteína ORF2 que no comprendan los complica-dos y trabajosos métodos requeridos por los protocolos actuales de extracción de la proteína ORF2. Finalmente, con respecto a las composiciones, en la técnica se necesita una composición inmunogénica que confiera una inmunidad 10 protectora contra una infección por PCV2 y que disminuya la severidad o permita prevenir los signos clínicos asocia-dos con la misma.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención supera los problemas inherentes de la técnica anterior y provee un avance distintivo en el es-tado de la técnica. 15

La presente invención proporciona:

[1] Un método de recuperar proteína recombinante expresada por el marco de lectura abierto 2 de PCV2 en el sobrenadante, en el que dicho método incluye las etapas de:

(i) infectar células en medio de crecimiento con un vector de baculovirus que contiene dicho marco de lectu-ra abierto 2; 20

(ii) provocar que dicho vector de baculovirus exprese dicha proteína de marco de lectura abierto 2; y

(iii) recuperar dicha proteína de marco de lectura abierto 2 en el sobrenadante,

en donde dicha recuperación se produce al menos 5 días después de la infección de las células con dicho vector de baculovirus.

[2] El método de [1], que comprende las etapas de 25

A) clonar dicho marco de lectura abierto 2 recombinante de PCV2 en un vector de transferencia;

B) introducir la parte de dicho vector de transferencia que contiene dicho marco de lectura abierto 2 recombi-nante en un baculovirus;

C) infectar células en medios con dicho baculovirus;

D) provocar que dicho baculovirus exprese la proteína de marco de lectura abierto 2 de dicho marco de lectura 30 abierto 2;

E) separar del sobrenadante células que contienen dicho vector de baculovirus; y

F) recuperar dicha proteína de marco de lectura abierto 2 en dicho sobrenadante al menos cinco días después de infectar las células con dicho baculovirus.

[3] El método de [1] o [2], en el que la proteína de marco de lectura abierto 2 recombinante expresada es se-35 cretada por las células en el medio de crecimiento circundante, y en el que la proteína de marco de lectura abierto 2 se recupera en el sobrenadante más que del interior de las células.

[4] El método de uno cualquiera de [1]-[3], en el que dicho método incluye, además, la etapa de amplificar di-cho marco de lectura abierto 2 de una cepa de PCV2 antes de clonar dicho marco de lectura abierto en dicho vector de transferencia. 40

[5] El método de uno cualquiera de [1]-[4], en el que dicho marco de lectura abierto 2 comprende, además, una secuencia seleccionada del grupo que consiste en una secuencia 5’ de Kozak, un sitio 3’ EcoRI y combinaciones de los mismos.

[6] El método de [5], en el que dicha secuencia 5’ de Kozak comprende la SEQ ID NO: 1.

[7] El método de [5], en el que dicho sitio 3’ EcoRI comprende la SEQ ID NO: 2. 45

[8] El método de uno cualquiera de [1] a [7], en el que dicho marco de lectura abierto de PCV2 comprende la SEQ ID NO: 4.

[9] El método de uno cualquiera de [1] a [7], en el que dicha proteína de marco de lectura abierto 2 comprende la SEQ ID NO: 6.

[10] El método de uno cualquiera de [1] a [8], en el que dichos medios comprenden medios de células de insecto libres de suero.

[11] El método de uno cualquiera de [2] a [10], que comprende, además, las etapas de:

i) antes de la etapa A, clonar dicho marco de lectura abierto 2 amplificado en un primer vector;

ii) escindir dicho marco de lectura abierto 2 de dicho primer vector; y 5

iii) utilizar dicho marco de lectura abierto 2 escindido en la etapa A.

[12] El método de uno cualquiera de [1] a [11], en el que dichas células comprenden células SF+.

[13] El método de uno cualquiera de [1] a [12], en el que la etapa de recuperación comprende la separación de desecho de células de la proteína de marco de lectura abierto 2 expresada en medios a través de una etapa de se-paración, en donde la etapa de separación incluye preferiblemente filtración. 10

[14] Un método de preparar una composición para invocar una respuesta inmune contra PCV2, comprendiendo dicho método las etapas de:

i) introducir una construcción en un baculovirus, comprendiendo dicha construcción ADN recombi-nante de un marco de lectura abierto 2 de PCV2;

ii) infectar células con dicho baculovirus, estando dichas células en un medio de crecimiento; 15

iii) provocar que dicho baculovirus exprese la proteína de marco de lectura abierto 2 recombinante a partir de dicho marco de lectura abierto 2;

iv) recuperar dicha proteína de marco de lectura abierto 2 expresada en el sobrenadante, en donde dicha proteína de marco de lectura abierto 2 se recupera al menos 5 días después de infectar di-chas células con dicho baculovirus; y 20

v) combinar dicha proteína de marco de lectura abierto 2 recuperada en el sobrenadante con un ad-yuvante adecuado u otro soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable.

[15] El método de [14], en el que la proteína de marco de lectura abierto 2 recombinante se secreta por las células en el medio de crecimiento circundante, y en donde la proteína de marco de lectura abierto 2 se recupera en el so-brenadante más que del interior de las células. 25

[16] El método de [14] o [15], en el que dicho método incluye, además, la etapa de obtener de un vector de transfe-rencia dicha construcción.

[17] El método de uno cualquiera de [14]-[16], en el que dicho método incluye, además, la etapa de amplificar dicho marco de lectura abierto 2 a partir de una cepa de PCV2 antes de clonar dicho marco de lectura abierto 2 en dicho vector de transferencia. 30

[18] El método de uno cualquiera de [14] a [17], en el que dicho marco de lectura abierto 2 recombinante com-prende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en una una secuencia 5’ de Kozak, un sitio 3’ EcoRI y combinaciones de los mismos.

[19] El método de [18], en el que dicha secuencia 5’ de Kozak comprende la SEQ ID NO: 1.

[20] El método de [18], en el que dicho sitio 3’ EcoRI comprende la SEQ ID NO: 2. 35

[21] El método de uno cualquiera de [14] a [20], comprendiendo dicho marco de lectura abierto 2 de PCV2 la SEQ ID NO: 4.

[22] El método de uno cualquiera de [14] a [21], comprendiendo dicha proteína de marco de lectura abierto 2 la SEQ ID NO: 6.

[23] El método de uno cualquiera de [14] a [22], en el que dichos medios comprenden medios de células de in-40 secto libres de suero.

[24] El método de uno cualquiera de [17] a [23], que comprende, además, las etapas de:

i) clonar dicho marco de lectura abierto 2 en un primer vector;

ii) escindir dicho marco de lectura abierto 2 de dicho primer vector; y

iii) utilizar dicho marco de lectura abierto 2 escindido en dicho vector de 45

transferencia.

[25] El método de uno cualquiera de [14] a [24], en el que dichas células comprende células SF+.

[26] El método de uno cualquiera de [14] a [25], en el que dicha etapa de recuperación comprende, además, la etapa

de separar dichos medios de dichas células y desechos de células.

[27] El método de [26], en el que dicha etapa de separación incluye la etapa de filtrar dichas células, desechos de células y medio de crecimiento a través de un filtro que tiene poros que oscilan en tamaño de aproximadamente 0,45 µm a aproximadamente 1,0 µm.

[28] El método de uno cualquiera de [14] a [27], en el que dicho método incluye, además, la etapa de inactivar dicho 5 baculovirus añadiendo etilenimina binaria (BEI) ciclada y, después de haberse completado la inactivación, se añade una disolución de tiosulfato de sodio, antes de combinar dicha proteína de marco de lectura abierto 2 con un adyu-vante adecuado.

[29] Una composiciòn de materia, obtenible por el método de uno cualquiera de [1]-[28].

[30] El uso de la composición de [29] para la preparación de un medicamento para la prevención de una infección 10 por PCV2.

[31] Composición de [29] para uso como un medicamento.

[32] Composición de [29] para uso como una vacuna para la prevención de una infección por PCV2.

[33] Composición de [29] para uso en un método de prevenir una infección por PCV2.

[34] Un método para producir un kit de diagnóstico para la detección de una infección por PCV2 en una muestra, que 15 comprende

i) producir una proteína de marco de lectura abierto 2 recombinante según se recoge en uno cual-quiera de [1]-[28];

ii) y envasar dicha proteína de marco de lectura abierto 2 recombinante en un recipiente adecuado.

[35] El método de [34], que comprende, además, la etapa de incluir un manual de instrucciones con el recipiente que 20 incluya la proteína de marco de lectura abierto 2 recombinante.

[36] Kit que incluye al menos un recipiente que comprende al menos una dosis de la composición de [29], en donde dicha composición es inmunogénica y una dosis comprende al menos 2 µg de proteína de marco de lectura abierto 2 de PCV2.

[37] Kit que comprende i) un recipiente que contiene al menos una dosis de la composición de [29] y ii) un recipiente 25 que contiene una composición inmunogénica que comprende antígeno de PRRS.

[38] Kit de [37], en donde el antígeno de PRRS es IngelVac PRRS MLV.

Se describen en esta memoria también:

Específicamente, un aspecto de la presente divulgación proporciona métodos mejorados de producción y/o recupe-ración de la proteína ORF2 PCV2 recombinante, que i) permiten infectar de células susceptibles en cultivo con un 30 vector viral recombinante que contiene secuencias de ADN codificantes de ORF2 PCV2, donde la proteína ORF2 es expresada por el vector viral recombinante, y ii) luego recuperar el ORF2 en el sobrenadante. Se ha descubierto inesperadamente que el ORF2 es liberado hacia el sobrenadante en grandes cantidades si se permite que la infec-ción y subsiguiente incubación de las células infectadas avancen más allá del típico proceso de recuperación de ORF2 PCV2, que extrae al ORF2 PCV2 desde el interior de las células. También se ha encontrado sorprendente-35 mente que la proteína ORF2 PCV es robusta frente a la degradación prototípica fuera de las células productoras. Ambos hallazgos juntos permiten recuperar grandes cantidades de proteína ORF2 del PCV2 del sobrenadante de cultivos celulares infectados con vectores virales recombinantes que contienen un ADN del ORF2 del PCV2 y expre-san la proteína ORF2 del PCV2. Las grandes cantidades de proteína ORF2 del PCV2 mencionadas significan más de aproximadamente 20 µg/ml de sobrenadante, preferentemente más de aproximadamente 25 µg/ml, con mayor 40 preferencia aún más de aproximadamente 30 µg/ml, con mayor preferencia aún más de aproximadamente 40 µg/ml, con mayor preferencia aún más de aproximadamente 50 µg/ml, con mayor preferencia aún más de aproximadamen-te 60 µg/ml, con mayor preferencia aún más de aproximadamente 80 µg/ml, con mayor preferencia aún más de aproximadamente 100 µg/ml, con mayor preferencia aún más de aproximadamente 150 µg/ml, más preferentemente más de 190 µg/ml aproximadamente. Dichos índices de expresión también se pueden lograr por ejemplo con los mé-45 todos descritos en los Ejemplos 1 a 3.

Cultivos celulares preferidos tienen una cuenta celular entre aproximadamente 0,3-2,0 x 106 células/mL, más prefe-rentemente entre aproximadamente 0,35-1,9 x 106 células/mL, más preferentemente aún entre aproximadamente

0,4-1,8 x 106 células/mL, aún más preferentemente entre aproximadamente 0,45-1,7 x 106 células/mL y con mayor preferencia entre aproximadamente 0,5-1,5 x 106 células/mL. Las células preferidas pueden ser determinadas por los especialistas en la técnica. Las células preferidas son aquellas que son susceptibles a una infección por un vec-tor viral recombinante apropiado, que contiene el ADN de ORF2 del PCV2 y que expresa a la proteína ORF2 del PCV2. Preferentemente las células son células de insecto y más preferentemente incluyen las células de insecto 5 comercializadas bajo el nombre comercial células de insecto Sf+ (Protein Sciences Corporation, Meriden, CT).

El medio de crecimiento apropiado también será determinado por los especialistas en la técnica, siendo un medio de crecimiento preferido un medio para células de insecto sin suero tal como Excell 420 (JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS) y semejantes. Vectores virales preferidos incluyen baculovirus, tal como BaculoGold (BD Biosciences Pharmin-gen, San Diego, CA), en particular si las células productoras son células de insecto. Aunque se prefiere el sistema 10 de expresión en baculovirus, los especialistas en la técnica comprenderán que existen otros sistemas de expresión que funcionarán a efectos de la presente divulgación, es decir, la expresión de ORF2 del PCV2 en el sobrenadante de un cultivo celular. Dichos otros sistemas de expresión pueden requerir el uso de una secuencia señal con el fin de lograr la expresión de ORF2 hacia el medio. Se ha descubierto sorprendentemente que cuando el ORF2 es produci-do por un sistema de expresión en baculovirus, no requiere de ninguna secuencia señal o modificación adicional pa-15 ra lograr la expresión de ORF2 hacia el medio. Se cree que esta proteína puede formar independientemente partícu-las de tipo virus (Journal of General Virology, Vol. 81, págs. 2281-2287 (2000) y ser secretada hacia el sobrenadante del cultivo. El vector viral recombinante que contiene las secuencias de ADN de ORF2 del PCV2 tiene una multiplici-dad de infección (MOI) preferida que comprende entre 0,03-1,5 aproximadamente, más preferentemente entre 0,05-1,3 aproximadamente, más preferentemente aún entre 0,09-1,1 aproximadamente y con mayor preferencia entre 20 0,1-1,0 aproximadamente, cuando se usa para la infección de células susceptibles. Preferentemente, los valores de MOI mencionados precedentemente están relacionados con un mL de líquido de cultivo celular. Preferentemente, el método descrito en la presente comprende la infección de 0,35-1,9 x 106 células/mL, más preferentemente aún de 0,4-1,8 x 106 células/mL aproximadamente, aún más preferentemente de 0,45-1,7 x 106 células/mL aproximadamen-te y con mayor preferencia de 0,5-1,5 x 106 células/mL aproximadamente con un vector viral recombinante que con-25 tiene el ADN de ORF2 del PCV2 y que expresa la proteína ORF del PCV2 con una MOI (multiplicidad de infección) de 0,03-1,5 aproximadamente, más preferentemente de 0,05-1,3 aproximadamente, más preferentemente aún de 0,09-1,1 aproximadamente y con mayor preferencia de 0,1-1,0 aproximadamente.

Las células infectadas se incuban luego a lo largo de un período de hasta diez días, más preferentemente entre aproximadamente dos días y aproximadamente diez días, más preferentemente aún entre aproximadamente cuatro 30 días y aproximadamente nueve días y con mayor preferencia entre aproximadamente cinco días y aproximadamente ocho días. Las condiciones de incubación preferidas incluyen una temperatura de 22-32°C aproximadamente, más preferentemente de 24-30°C aproximadamente, más preferentemente aún de 25-29°C aproximadamente, aún más preferentemente de 26-28°C aproximadamente y con mayor preferencia de 27°C aproximadamente. Preferentemen-te, las células Sf+ son observadas después de la inoculación por los cambios característicos inducidos por el bacu-35 lovirus. Dicha observación puede incluir el monitoreo de la tendencia de la densidad celular y la disminución de la viabilidad durante el período de post-infección. Se encontró que se observa un pico del título viral 3-5 días después de la infección y se obtiene una liberación pico de ORF2 de las células hacia el sobrenadante entre los días 5 y 8 y/o cuando la viabilidad celular disminuye a menos de un 10%.

Por lo tanto, un aspecto de la presente divulgación proporciona un método mejorado para producir y/o recuperar una 40 proteína ORF2 del PCV2 recombinante, preferentemente en las cantidades descritas precedentemente, que i) per-miten infectar numerosas células susceptibles (véase antes) en cultivo con un vector viral recombinante con la MOI definida precedentemente, ii) expresar la proteína ORF2 del PCV2 por el vector viral recombinante y iii) a continua-ción recuperar el ORF2 del PCV2 en el sobrenadante de las células obtenido entre los días 5 y 8 después de la in-fección y/o cuando la viabilidad celular disminuye a menos del 10%. Preferentemente, el vector viral recombinante es 45 un baculovirus recombinante que contiene secuencias de ADN codificantes de ORF2 del PCV2 y las células son cé-lulas Sf+. Además, se prefiere examinar periódicamente el cultivo por evidencia macroscópica y microscópica de contaminación o por cambios atípicos en la morfología celular durante el período de post-infección. Todo cultivo que exhiba alguna clase de contaminación debe ser descartado. Preferentemente, la proteína ORF2 recombinante ex-presada es secretada por las células hacia el medio de crecimiento circundante que mantiene la viabilidad celular. 50 La ORF2 es recuperada luego en el sobrenadante que rodea a las células en lugar de las propias células.

El proceso de recuperación comienza preferentemente con la separación de los desechos celulares de la ORF2 ex-presada en el medio mediante un paso de separación. Etapas de separación preferidas incluyen filtración, centrifu-gación a velocidades de hasta 20.000 xg aproximadamente, centrifugación de flujo continuo, separación cromatográ-fica usando métodos convencionales de intercambio iónico o filtración a través de gel e inmunoafinidad. Dichos mé-55 todos son conocidos por los especialistas en la técnica p.ej. según (Harris y Angel (eds.), Protein purification met-hods-a practical approach, IRL press Oxford 1995). Los métodos de separación más preferidos incluyen centrifuga-ción a velocidades de hasta 20.000 xg aproximadamente y filtración. Los métodos de filtración preferidos incluyen microfiltración frontal o de flujo perpendicular y filtración de flujo tangencial (o de flujo cruzado) incluyendo filtración con membranas de fibras huecas, microfiltración frontal. Entre los métodos mencionados, se prefiere la microfiltra-60 ción frontal. Los tamaños de poro preferidos para la microfiltración frontal son de 0,30-1,35 µm aproximadamente,

más preferentemente de 0,35-1,25 µm aproximadamente, más preferentemente aún de 0,40-1,10 µm aproximada-mente y con mayor preferencia de 0,45-1,0 µm aproximadamente. Se cree que cualquier membrana de filtración convencional funcionará a los efectos de la presente invención y se prefieren las membranas de poliétersulfona. Se elimina todo ácido nucleico de bajo peso durante la etapa de filtración.

Por lo tanto, un aspecto de la presente divulgación proporciona un método mejorado para producir y/o recuperar pro-5 teína ORF2 del PCV2 recombinante, preferentemente en las cantidades descritas precedentemente, que i) permiten infectar numerosas células susceptibles (véase antes) en cultivo con un vector viral recombinante con la MOI defini-da precedentemente, ii) expresar la proteína ORF2 del PCV por el vector viral recombinante, iii) recuperar la ORF2 del PCV2 en el sobrenadante de células obtenido entre los días 5 y 8 después de la infección y/o cuando la viabili-dad celular disminuye a menos del 10% y iv) separar los desechos celulares de la ORF2 del PCV2 expresado a tra-10 vés de una etapa de separación. Preferentemente, el vector viral recombinante es un baculovirus que contiene las secuencias de ADN codificantes de la ORF2 y las células son células Sf+. Las etapas de separación preferidas son las que se describieron precedentemente. Más preferida es la microfiltración frontal usando una membrana con un tamaño de poro de 0,30-1,35 µm aproximadamente, más preferentemente de 0,35-1,25 µm aproximadamente, más preferentemente aún de 0,40-1,10 µm aproximadamente y con mayor preferencia de 0,45-1,0 µm aproximadamente. 15

Para recuperar la ORF2 del PCV2 que se usará en una composición inmunogénica o inmunológica tal como una va-cuna, se prefiere incluir un paso de inactivación con el fin de inactivar el vector viral. Una “composición inmunogénica o inmunológica” se refiere a una composición de materia que comprende al menos un antígeno capaz de provocar una respuesta inmunológica en el huésped celular y/o una respuesta inmune mediada por un anticuerpo contra la composición o vacuna de interés. Habitualmente, una "respuesta inmunológica" incluye, a modo de ejemplo, uno o 20 más de los siguientes efectos: la producción o activación de anticuerpos, células B, células T auxiliares, células T supresoras y/o células T citotóxicas y/o células T γδ, dirigidos específicamente contra uno o más antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferentemente, el huésped expresará ya sea una respuesta inmunológica terapéutica o protectora de modo tal que mejora la resistencia a una nueva infección y/o se reduce la severidad clí-nica de la enfermedad. Dicha protección quedará demostrada ya sea por una reducción o falta de los síntomas nor-25 malmente expresados por un huésped infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o un menor título viral en el huésped infectado. Por lo tanto, la presente divulgación también se refiere a un método para producir y/o recupe-rar la proteína ORF2 del PCV2 recombinante, preferentemente en las cantidades descritas precedentemente, que i) permiten infectar numerosas células susceptibles (véase antes) en cultivo con un vector viral recombinante con la MOI definida precedentemente, ii) expresar la proteína ORF2 del PCV por el vector viral recombinante, iii) recuperar 30 la ORF2 del PCV2 en el sobrenadante de las células obtenidas entre los días 5 y 8 después de la infección y/o cuando la viabilidad celular disminuye a menos del 10%, iv) separar los desechos celulares de la ORF2 del PCV2 expresado a través de una etapa de separación y v) inactivar el vector viral recombinante.

Preferentemente, esta inactivación tiene lugar justo antes o justo después de la etapa de filtración, donde el momen-to de inactivación preferido es después de la etapa de filtración. Se puede usar cualquier método de inactivación 35 convencional a los efectos de la presente invención. Por consiguiente, la inactivación se puede efectuar mediante tratamientos químicos y/o físicos. En las formas preferidas, se determina el volumen de los líquidos de cosecha y la temperatura se lleva a un valor de 32-42°C aproximadamente, más preferentemente de 34-40°C aproximadamente y con mayor preferencia de 35-39°C aproximadamente. Los métodos de inactivación preferidos incluyen la adición de etilenimina binaria ciclada (BEI), preferentemente a una concentración entre aproximadamente 1 y aproximadamente 40 20 mM, preferentemente entre aproximadamente 2 y aproximadamente 10 mM, más preferentemente aún entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8 mM, más preferentemente aún entre aproximadamente 3 y aproximada-mente 7 mM, con mayor preferencia de aproximadamente 5 mM. Por ejemplo, la inactivación incluye la adición de una solución de bromhidrato de 2-bromoetilenamina, preferentemente a 0,4 M aproximadamente, que ha sido cicla-do a etilenimina binaria (BEI) 0,2 M en NaOH 0,3N, a los líquidos para obtener una concentración final de BEI de 5 45 mM aproximadamente. Preferentemente, los líquidos se agitan luego de forma continua durante 72-96 horas y los lí-quidos de cosecha inactivados se pueden guardar congelados a -40°C o menos o a 1-7°C aproximadamente. Una vez completada la inactivación se agrega una solución de tiosulfato de sodio, preferentemente a 1,0 M, para neutra-lizar toda la BEI residual. Preferentemente, el tiosulfato de sodio se agrega en una cantidad equivalente en compa-ración con la cantidad de BEI que se agregó antes para la inactivación. Por ejemplo, en el caso de agregar BEI a 50 una concentración final de 5 mM, se agrega una solución de tiosulfato de sodio 1,0 M para obtener una concentra-ción mínima final 5 mM para neutralizar todo BEI residual.

Por lo tanto, un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a un método para producir una proteína ORF2 del PCV2 recombinante, preferentemente en las cantidades descritas precedentemente, que i) permite infec-tar numerosas células susceptibles (véase antes) en cultivo con un vector viral recombinante con la MOI definida 55 precedentemente, ii) expresar la proteína ORF2 del PCV por el vector viral recombinante, iii) recuperar la ORF2 del PCV2 en el sobrenadante de células obtenido entre los días 5 y 8 después de la infección y/o cuando la viabilidad celular disminuye a menos del 10%, iv) separar los desechos celulares de la ORF2 del PCV2 expresado mediante una etapa de separación y v) inactivar el vector viral recombinante. Preferentemente, el vector viral recombinante es un baculovirus que contiene secuencias de ADN codificantes de la ORF2 y las células son células Sf+. Las etapas 60 de separación preferidas son las que se describieron precedentemente, siendo más preferida la etapa de filtración.

Las etapas de inactivación preferidas son las descritas precedentemente. Preferentemente, la inactivación se efec-túa entre 35-39 °C aproximadamente y en presencia de BEI 2 a 8 mM, con mayor preferencia aún en presencia de BEI 5 mM aproximadamente. Se ha encontrado, sorprendentemente, que concentraciones mayores de BEI afectan negativamente a la proteína ORF2 del PCV2.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente divulgación, el método descrito precedentemente también pue-5 de incluir una etapa de neutralización después de la etapa v). Esta etapa vi) comprende la adición de una cantidad equivalente de un agente capaz de neutralizar al agente de inactivación en la solución. Preferentemente, si el agente de inactivación es BEI, se prefiere la adición de una cantidad equivalente de tiosulfato de sodio. Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto adicional, la etapa vi) comprende la adición de una solución de tiosulfato de sodio hasta una concentración final entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 mM, preferentemente entre aproximadamente 10 2 y aproximadamente 10 mM, más preferentemente aún entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8 mM, más preferentemente aún entre aproximadamente 3 y aproximadamente 7 mM, con mayor preferencia de aproximada-mente 5 mM, cuando el agente de inactivación es BEI.

En formas preferidas y especialmente en formas que emplearán a la proteína ORF2 del PCV2 recombinante en una composición inmunogénica tal como una vacuna, se evaluará la inactivación de cada lote de ORF2 cosechado me-15 diante pasajes en las células Sf+ susceptibles a baculovirus, dependiente de anclaje. En una realización preferida de esta evaluación, se inocula 150 cm2 de una monocapa de cultivo celular apropiado con 1,0 mL de líquidos de PCV2 inactivados y se mantiene a 25-29°C durante 14 días con al menos dos pasajes. A final del período de mantenimien-to, se examinan las monocapas de células por los efectos citopatogénicos (CPE) típicos de baculovirus de ORF2 del PCV2. Preferentemente, también se utilizan controles virales positivos. Dichos controles pueden consistir en un culti-20 vo de células Sf+ inoculadas con un baculovirus de ORF2 del PCV2 no inactivado de referencia y un matraz de célu-las Sf+ sin ocular. Después de la incubación y el pasaje, la ausencia de células infectadas con virus para los líquidos virales tratados con BEI constituye una prueba de inactivación satisfactoria. Las células control inoculadas con el vi-rus de referencia deberían exhibir los CPE típicos del baculovirus de ORF2 del PCV2 y el matraz no inoculado no debería mostrar evidencia alguna de CPE de baculovirus de ORF2 del PCV2. Como alternativa, al final del período 25 de mantenimiento, se podrían recolectar muestras de sobrenadante e inocularlas sobre una placa de 96 cavidades Sf+, que fue cargada con células Sf+, y luego mantenerlas a 25-29°C por 5-6 días. A continuación, la placa se fija y se tiñe con anticuerpo anti-ORF2 del PCV2 conjugado con FITC. La ausencia de CPE y la expresión de ORF2, de-tectados por microscopía IFA, en los líquidos virales tratados con BEI constituye una prueba de inactivación satisfac-toria. Las células control inoculadas con el virus de referencia debería exhibir CPE y actividad IFA y el matraz no 30 inoculado no debería presentar evidencia alguna de los CPE de baculovirus de ORF2 del PCV2 ni actividad IFA.

Por lo tanto, un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a una prueba de inactivación para determinar la eficacia de la inactivación del vector viral recombinante, que comprende las etapas de: i) poner al menos una por-ción del líquido de cultivo que contiene al vector viral recombinante en contacto con un agente de inactivación, prefe-rentemente el descrito precedentemente, ii) agregar un agente de neutralización para neutralizar al agente de inacti-35 vación, preferentemente el descrito precedentemente y iii) determinar la infectividad residual con los ensayos descri-tos precedentemente.

Después de la inactivación, se puede determinar la cantidad relativa de proteína ORF2 del PCV2 recombinante en una muestra de numerosas maneras. Métodos de cuantificación preferidos incluyen densitometría por SDS-PAGE, ELISA y estudios de vacunación en animales que correlacionan cantidades conocidas de vacuna con los resultados 40 clínicos (serología, etc.). Cuando se utiliza SDS-PAGE para la cuantificación, el material de muestra que contiene una cantidad desconocida de proteína ORF2 del PCV2 recombinante se corre sobre un gel, junto con muestras que contienen diferentes cantidades conocidas de proteína ORF2 del PCV2 recombinante. Luego se puede trazar una curva estándar basado en las muestras conocidas y determinar la cantidad de ORF2 del PCV2 recombinante en la muestra desconocida por comparación con esta curva estándar. Dado que los ELISA son reconocidos en general 45 como el estándar de la industria para la cuantificación de antígeno, constituyen los métodos preferidos para la cuan-tificación.

Por lo tanto, la presente divulgación también se refiere a un ELISA para la cuantificación de la proteína ORF2 del PCV2 recombinante. El ELISA preferido provisto en la presente generalmente comienza con una dilución 1:6000 del anticuerpo de captura o una dilución de trabajo apropiada en solución amortiguadora de recubrimiento. El anticuerpo 50 de captura preferido es el anti-PAb Prot. G PCV2 de cerdo purificado y la solución amortiguadora de recubrimiento preferida es una solución amortiguadora de carbonato 0,05 M, que se puede elaborar combinando 2,93 g de NaHCO3 (Sigma, Nº Cat. S-6014 o su equivalente) y 1,59 g de NaCO3 (Sigma, Nº Cat. S-6139 o su equivalente). La mezcla se combina con agua destilada, o su equivalente, para obtener un litro a un pH de 9,6 ± 0,1. A continuación, el anticuerpo de captura se diluye 1:6000, o cualquier otra dilución de trabajo apropiada, en solución amortiguadora 55 de recubrimiento. Por ejemplo, para cuatro placas, se necesitarán 42 mL de solución amortiguadora de recubrimien-to y siete µL de anticuerpo de captura. Con el método de pipeteo inverso, se agregan 100 µL de anticuerpo de captu-ra diluido a todos los pocillos. Con el fin de obtener un recubrimiento homogéneo, se deben golpear suavemente los lados de cada placa. Las placas se sellan luego con selladores de placa, antes de apilar las placas y terminar la pila con una placa de 96 pocillos vacía. Las placas se incuban luego durante la noche (14-24 horas) a 35-39°C. Des-60

pués, cada placa se lava tres veces con solución amortiguadora de lavado usando el lavador de placas para microti-tulación UltraWash Plus definido en 250 µL/lavado con tres lavado y sin tiempo de remojo. Después del último lava-do, las placas se golpean suavemente sobre una toalla de papel. Nuevamente, usando la técnica de pipeteo inverso, se deberían agregar 250 µL de solución de bloqueo a todos los pocillos. Las placas de prueba se sellan y se incuban durante una hora aproximadamente (± cinco minutos) a 35-37°C. Preferentemente, las placas no se apilarán des-5 pués de esta etapa. Durante la etapa de bloqueo se deben extraer todas las muestras de prueba y descongelarlas a temperatura ambiente. A continuación, se deben preparar cuatro placas de dilución separadas por adición de 200 µL de solución de diluyente a todos los pocillos restantes, excepto la fila A y la fila H, columnas 1-3. A continuación, se rotularán seis tubos de ensayo de la siguiente manera, título bajo, título medio, título alto, inactivado/filtrado (1:240), inactivado/filtrado (1:480) y control interno. En los tubos indicados, se debe preparar la dilución apropiada para las 10 siguientes muestras de prueba. Las muestras de prueba descongeladas deben ser agitadas por vortexeo antes del uso. Para cuatro placas, se efectuarán las siguientes diluciones: A) el título bajo no será pre-diluido: 3,0 mL de título bajo; B) control negativo a una dilución 1:30 (células SF+): 3,77 mL de diluyente + 130 µL de control negativo; C) tí-tulo medio a una dilución 1:30 (8 µg/mL): 3,77 mL de diluyente + 130 µL de título medio; D) título alto a una dilución 1:90 (16 µg/mL): 2,967 mL de diluyente + 33 µL de título alto; E) inactivado/filtrado a una dilución 1:240: 2,39 mL de 15 diluyente + 10 µL de muestra inactivada/filtrada; F) inactivado/filtrado a una dilución 1:480: 1,0 mL de diluyente + 1,0 mL de inactivado/filtrado (1:240) preparada con una muestra de E anterior; G) control interno a una dilución 1:30: 3,77 mL de diluyente + 130 µL de control interno. A continuación, se agregan 300 µL de las muestras preparadas a los correspondientes pocillos vacíos en las placas de dilución para las placas 1 a 4. Luego se define el pipeteador automático de múltiples canales en 100 µL y el contenido de la fila A se mezcla mediante pipeteo hacia arriba y aba-20 jo al menos 5 veces y luego se transfieren 100 µL a la fila B usando la técnica de pipeteo inverso. Se deben cambiar las puntas y avanzar por la placa utilizando este mismo procedimiento hasta la fila G. Ahora las muestras en estas placas de dilución están listas para su transferencia a las placas de prueba una vez lavadas dichas placas de prueba 3 veces con solución amortiguadora de lavado usando el lavador de placas para microtitulación UltraWash Plus (ajustes en 250 µL/lavado, 3 lavados, sin tiempo de remojo). Después del último lavado, las placas se golpearán 25 suavemente sobre una toalla de papel. A continuación, se transfiere el contenido de la placa de dilución a la placa de prueba usando un procedimiento de transferencia simple. Más específicamente, comenzando por la fila H, se trans-fieren 100 µL/pocillo de la(s) placa(s) de dilución a los correspondientes pocillos de la(s) placa(s) de prueba usando la técnica de pipeteo inverso. Se deben cambiar las puntas de pipeta después de cada transferencia. De la fila G, se transfieren 100 µL/pocillo de la(s) placa(s) de dilución a los correspondientes pocillos de la(s) placa(s) de prueba 30 usando la técnica de pipeteo inverso. Se puede emplear el mismo juego de puntas de pipeta para las transferencias restantes. Para asegurar una solución homogénea para la transferencia, la solución debe pipetearse hacia arriba y abajo al menos 3 veces antes de la transferencia. A continuación, las(s) placa(s) de prueba se sella(n) y se incuba(n) durante 1,0 hora ± 5 minutos a 37 °C ± 2,0°C. Nuevamente, es preferible no apilar las placas. Las placas se lavan luego 3 veces con solución amortiguadora de lavado usando el lavador de placas para microtitulación UltraWash 35 Plus (ajustes en 250 µL/lavado, 3 lavados y sin tiempo de remojo). Después del último lavado, las placas se golpean suavemente sobre una toalla de papel. Con la técnica de pipeteo inverso, se agregan 100 µL de anticuerpo de de-tección diluido 1:300, o una dilución de trabajo apropiada, en solución diluyente a todas las cavidades de la(s) pla-ca(s) de prueba. Por ejemplo, para cuatro placas, se necesitarán 42 mL de solución diluyente con 140 µL de anti-cuerpo de captura. La(s) placa(s) de prueba se sella(n) y se incuba(n) durante 1,0 hora 5 minutos a 37°C 40 2,0°C. Nuevamente, las placas se lavan 3 veces con solución amortiguadora de lavado usando el lavador de pla-cas para microtitulación UltraWash Plus (ajustes en 250 µl/lavado, 3 lavados y sin tiempo de remojo). Después del último lavado, las placas se golpean suavemente sobre una toalla de papel. A continuación, se prepara el diluyente de conjugación por adición de suero de conejo normal 1% al diluyente. Por ejemplo, para cuatro placas, se agregan 420 µl de suero de conejo normal a 42 ml de diluyente. El anticuerpo conjugado es diluido a 1:10.000, o cualquier 45 otra dilución de trabajo apropiada, en una solución diluyente de conjugación recién preparada para todos los pocillos de la(s) placa(s) de prueba. Con la técnica de pipeteo inverso, se agregan 100 µL de este anticuerpo conjugado di-luido a todos los pocillos. La(s) placa(s) de prueba se sella(n) y se incuba(n) durante 45 ± 5 minutos a 37°C ± 2,0°C. Preferentemente, no se apilan las placas. Las placas se lavan luego 3 veces con solución amortiguadora de lavado usando el lavador de placas para microtitulación UltraWash Plus (ajustes en 250 µL/lavado, 3 lavados y sin tiempo 50 de remojo). Después del último lavado, las placas se golpean suavemente sobre una toalla de papel. A continuación, se mezclan volúmenes iguales de sustrato de peroxidasa TMB (reactivo A) con solución de peroxidasa B (reactivo B) inmediatamente antes del uso. La cantidad mezclada varía según la cantidad de placas, pero cada placa necesitará 10 mL/placa ± 2 mL. Por ello, para 4 placas, serán 21 mL de reactivo A + 21 mL de reactivo B. Con la técnica de pi-peteo inverso, se agregan 100 µL de sustrato a todas las cavidades de la(s) placa(s) de prueba. Las placas se incu-55 ban luego a temperatura ambiente durante 15 minutos ± 15 segundos. La reacción se detiene por la adición de 100 µL de solución de HCl 1 N a todas los pocillos usando la técnica de pipeteo inverso. Luego se enciende el lector de placas de ELISA y se deja que proceda por las fases de diagnóstico y evaluación de manera convencional.

Un aspecto adicional de la divulgación se refiere a un método para construir un vector viral recombinante que con-tiene ADN de ORF2 del PCV2 y expresar la proteína ORF2 del PCV2 en grandes cantidades, cuando infectan célu-60 las susceptibles. Se ha encontrado sorprendentemente que el vector viral recombinante provisto en la presente ex-presa grandes cantidades, definidas precedentemente, de ORF2 del PCV2 después de infectar células susceptibles. Por lo tanto, la presente divulgación también se refiere a un método mejorado para producir y/o recuperar la proteína ORF2 del PCV2, que preferentemente comprende la etapa de: construir un vector viral recombinante que contiene ADN de ORF2 del PCV2 y expresar la proteína ORF2 del PCV2. Preferentemente, el vector viral es un baculovirus 65

recombinante. A continuación se describirán los detalles del método para construir vectores virales recombinantes que contienen ADN de ORF2 del PCV2 y para expresar la proteína ORF2 del PCV2, provista en la presente: En rea-lizaciones preferidas, el vector viral recombinante que contiene ADN de ORF2 del PCV2 y expresa la proteína ORF2 del PCV2 usado para infectar las células es generado por transfección de un vector de transferencia, que contiene un gen ORF2 clonado en el mismo, en un vector viral. Preferentemente, solamente se transfecta al vector viral la 5 porción del vector de transferencia que contiene ADN de ORF2. La expresión “transfectado en un vector viral” signi-fica, y se usa como sinónimo de, “introducir” o “clonar“ un ADN heterólogo en un vector viral, tal como por ejemplo en un vector de baculovirus. En el contexto de la invención, el vector viral es un baculovirus.

Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto adicional de la presente divulgación, el vector viral recombinante puede ser generado por recombinación entre un vector de transferencia que contiene ADN heterólogo de ORF2 del PCV2 y un 10 vector viral, preferentemente un baculovirus, aún más preferentemente un baculovirus linearizado de replicación de-ficiente (tal como BaculoGold DNA). Un “vector de transferencia” se refiere a una molécula de ADN, que incluye al menos un origen de replicación, el gen heterólogo, en este caso la ORF2 del PCV2, y secuencias de ADN que per-miten la clonación de dicho gen heterólogo en el vector viral. Preferentemente, las secuencias que permiten clonar un gen heterólogo en el vector viral flanquean al gen heterólogo. Aún más preferentemente, dichas secuencias flan-15 queadoras son homólogas, al menos en parte, de secuencias del vector viral. La homología de secuencia permite entonces la recombinación de ambas moléculas, el vector viral y el vector de transferencia, para generar un vector viral recombinante que contiene al gen heterólogo. Un vector de transferencia preferido es el vector pVL1392 (BD Biosciences Pharmingen), diseñado para la cotransfección con el BaculoGold DNA en la línea de células Sf+ preferi-da. Preferentemente, dicho vector de transferencia comprende ADN de ORF2 del PCV2. La construcción cotransfec-20 tada es de 10.387 pares de bases aproximadamente de longitud.

En formas más preferidas, los métodos de la presnte invención comenzarán con el aislamiento de ADN de ORF2 del PCV2. Generalmente, este puede provenir de una cepa conocida o desconocida ya que el ADN de ORF2 parece es-tar altamente conservado, con al menos un 95% de identidad de secuencia aproximadamente entre las diferentes formas aisladas. Se puede utilizar cualquier gen ORF2 PCV2 conocido en la técnica a los efectos de la presente in-25 vención, ya que cada uno se expresará en el sobrenadante. El ADN de ORF2 del PCV se amplifica empleando pre-ferentemente métodos de PCR, con mayor preferencia aún junto con la introducción de la secuencia consenso de Kozak flanqueadora 5' (CCGCCAUG) (SEQ ID Nº: 1) y/o un sitio EcoR1 flanqueador 3' (GAATTC) (SEQ ID Nº: 2). Dicha introducción del consenso de Kozak 5' elimina preferentemente el codón de inicio natural AUG de ORF2 del PCV2. El sitio EcoR1 3' se introduce preferentemente 3’ con respecto al codón de terminación de ORF2 del PCV2. 30 Más preferentemente, se introduce 3’ con respecto a una secuencia de terminación de la transcripción poli A, donde dicha secuencia está ubicada 3’ con respecto al codón de terminación de ORF2 del PCV2. Se ha encontrado que el uso de la secuencia consenso de Kozak, en particular la que se describió precedentemente, incrementa el nivel de expresión de la subsiguiente proteína ORF2 del PCV2. El ADN de ORF2 del PCV2 amplificado, con estas secuen-cias adicionales, es clonado en un vector. Un vector preferido para este paso de clonación inicial es el vector pGEM-35 T-Easy (Promega, Madison, WI). El ADN de ORF2 del PCV2 que incluye algunas secuencias del vector pGEM (SEQ ID Nº: 7) se recorta preferentemente del vector en el sitio de restricción Not1. El ADN resultante se clona luego en el vector de transferencia.

Por lo tanto, en un aspecto de la presente divulgación se proporciona un método para construir un vector viral re-combinante que contiene al ADN del ORF2 PCV2. Este método comprende las etapas de: i) clonar un ORF2 PCV2 40 recombinante en un vector de transferencia; y ii) transfectar la porción del vector de transferencia que contiene a ORF2 del PCV2 recombinante en un vector viral, para generar el vector viral recombinante. Preferentemente, el vec-tor de transferencia es el que se describió precedentemente o se construye como se describió precedentemente o como se muestra a modo de ejemplo en la figura 1. Por consiguiente, de acuerdo con un aspecto adicional, el vector de transferencia, usado para la construcción del vector viral recombinante descrito en la presente, contiene la se-45 cuencia de la SEQ ID Nº: 7.

De acuerdo con un aspecto adicional, este método comprende además antes de la etapa i) la siguiente etapa: ampli-ficar el ADN de ORF2 del PCV2 in vitro, donde las secuencias flanqueadoras del ADN de ORF2 del PCV2 fueron modificadas como se describió precedentemente. Los métodos in vitro para amplificar el ADN de ORF2 del PCV2 y modificar las secuencias flanqueadoras, clonar in vitro el ADN de ORF2 del PCV2 amplificado en un vector de trans-50 ferencia y los vectores de transferencia adecuados se describieron precedentemente, se muestran a modo de ejem-plo en la figura 1, o son conocidos por los especialistas en la técnica. Por lo tanto, en un aspecto adicional, la pre-sente divulgación se refiere a un método para construir un vector viral recombinante que contiene ADN de ORF2 del PCV2 y expresar la proteína ORF2 del PCV2 que comprende las etapas de: i) amplificar ADN de ORF2 del PCV2 in vitro, donde las secuencias flanqueadoras de dicho ADN de ORF2 del PCV2 están modificadas, ii) clonar el ADN de 55 ORF2 del PCV2 amplificado en un vector de transferencia; y iii) transfectar el vector de transferencia, o una porción del mismo que contiene al ADN de ORF2 del PCV2 recombinante, en un vector viral para generar el vector viral re-combinante. Preferentemente, la modificación de las secuencias flanqueadoras del ADN de ORF2 del PCV2 se efec-túa como se describió precedentemente, por ejemplo introduciendo una secuencia Kozak 5’ y/o un sitio EcoR1, pre-ferentemente como se describió precedentemente. 60

De acuerdo con un aspecto adicional, se provee un método para producir y/o recuperar la proteína recombinante expresada por el marco de lectura abierto 2 del PCV2. El método comprende en general las etapas de: i) clonar un ORF2 del PCV2 recombinante en un vector de transferencia; ii) transfectar la porción del vector de transferencia que contiene al ORF2 del PCV2 recombinante en un virus; iii) infectar células en un medio con el virus transfectado; iv) lograr que el virus transfectado exprese la proteína recombinante de la ORF2 del PCV2; v) separar las células del 5 sobrenadante; y vi) recuperar la proteína ORF2 del PCV2 expresada del sobrenadante.

Los métodos de cómo clonar un ADN de ORF2 del PCV2 recombinante en un vector de transferencia fueron descri-tos precedentemente. Preferentemente, el vector de transferencia contiene a la secuencia de las SEQ ID Nº:3, SEQ ID Nº:4, SEQ ID Nº:7. Sin embargo, el vector de transferencia puede contener cualquier ADN de ORF2 del PCV2, modificado o no modificado, siempre que el ADN de ORF2 del PCV2, cuando es transfectado en un vector viral re-10 combinante, sea expresado en un cultivo celular. Preferentemente, el vector viral recombinante comprende la se-cuencia de la SEQ ID Nº:8. Más aún, los métodos para infectar linfocitos T, preferentemente para infectar linfocitos T de insecto con un número definido de baculovirus recombinantes que contienen ADN de ORF2 del PCV2 y para ex-presar la proteína ORF2 del PCV2 se describieron precedentemente con mayor detalle. Más aún, las etapas de se-paración de las células del sobrenadante así como las etapas de recuperación de la proteína ORF2 del PCV2 expre-15 sada también se describieron precedentemente con detalle. Todas estas etapas de proceso específicas, descritas en la presente, forman parte del método para producir y/o recuperar la proteína recombinante expresada por el mar-co de lectura abierto 2 de PCV2 según se describió precedentemente. Preferentemente, las células son células Sf+. Más preferentemente aún, los cultivos celulares presentan un recuento celular de 0,3-2,0 x 106 células/mL aproxi-madamente, más preferentemente de 0,35-1,9 x 106 células/mL aproximadamente, más preferentemente aún de 0,4-20 1,8 x 106 células/mL aproximadamente, aún más preferentemente de 0,45-1,7 x 106 células/mL aproximadamente y con mayor preferencia de 0,5-1,5 x 106 células/mL aproximadamente. Preferentemente, el vector viral recombinante que contiene al ADN de ORF2 del PCV2 tiene una multiplicidad de infección (MOI) preferida de 0,03-1,5 aproxima-damente, más preferentemente de 0,05-1,3 aproximadamente, más preferentemente aún 0,09-1,1 aproximadamen-te, más preferentemente aún de 0,1-1,0 aproximadamente y con mayor preferencia de 0,5 aproximadamente, cuan-25 do se usa para la infección de las células susceptibles. Preferentemente, la proteína ORF2 del PCV2 se recupera del sobrenadante celular obtenido entre los días 5 y 8 después de la infección y/o cuando la viabilidad celular disminuye a menos del 10%. Preferentemente, para producir la proteína ORF2 del PCV2, las células se cultivan a 25-29°C. Preferentemente, la etapa de separación es una etapa de centrifugación o de filtración.

Opcionalmente, este método puede incluir la etapa de amplificar el ADN de ORF2 del PCV2 a partir de una cepa de 30 PCV2 antes de clonar el ADN de ORF2 del PCV2 en el vector de transferencia. En realizaciones preferidas, también se puede agregar una secuencia de Kozak 5', un sitio EcoR1 3' y combinaciones de los mismos, a la secuencia am-plificada, preferentemente antes o durante la amplificación. La secuencia de Kozak 5’ preferida comprende la SEQ ID Nº: 1. El sitio EcoR1 3’ preferido comprende la SEQ ID Nº: 2. El ADN de ORF2 del PCV2 preferido comprende la secuencia de nucleótidos de Genbank, Nº Acceso AF086834 (SEQ ID Nº: 3) y SEQ ID Nº: 4. La proteína ORF2 del 35 PCV2 recombinante preferida comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 5, que es la proteína codifi-cada por la SEQ ID Nº: 3 (Genbank, Nº Acceso AF086834) y la SEQ ID Nº: 6, que es la proteína codificada por la SEQ ID Nº: 4. El medio preferido comprende medio para células de insecto sin suero, más preferentemente aún el medio Excell 420. Cuando se efectúa la etapa de amplificación opcional, se prefiere clonar primero el marco de lec-tura abierto 2 amplificado en un primer vector, recortar el marco de lectura abierto 2 de dicho primer vector y usar el 40 marco de lectura abierto recortado para su clonación en el vector de transferencia. La línea celular preferida para la cotransfección es la línea celular SF+. El virus preferido para la cotransfección es el baculovirus. En realizaciones preferidas de este método, la porción transfectada del vector de transferencia comprende la SEQ ID Nº: 8. Finalmen-te, para este método, se recupera la proteína del marco de lectura abierto 2 (ORF2) del PCV2 en el sobrenadante del cultivo celular al menos 5 días después de infectar las células con el virus. 45

Por lo tanto, un aspecto adicional de la divulgación se refiere a un método para producir y/o recuperar el marco de lectura abierto 2 del PCV2, que comprende las etapas de: i) amplificar el ADN de ORF2 del PCV2 in vitro, preferen-temente por adición de una secuencia Kozak 5’ y/o por adición de un sitio de restricción EcoR1 3’, ii) clonar la ORF2 del PCV2 amplificado en un vector de transferencia; iii) transfectar la porción del vector de transferencia que contie-ne ORF2 del PCV2 recombinante en un virus; iv) infectar células en un medio con el virus transfectado; v) lograr que 50 el virus transfectado exprese la proteína recombinante ORF2 del PCV2; vi) separar las células del sobrenadante; y vii) recuperar la proteína ORF2 del PCV2 expresada del sobrenadante.

Un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a un método para preparar una composición que com-prende la proteína ORF2 del PCV2 y un vector viral inactivado. Este método comprende las etapas de: i) clonar ORF2 del PCV2 amplificado en un vector de transferencia; ii) transfectar la porción del vector de transferencia que 55 contiene ORF2 del PCV2 recombinante en un virus; iii) infectar las células en el medio con el vector viral transfecta-do; iv) lograr que el vector viral transfectado exprese la proteína recombinante de ORF2 del PCV2; v) separar las cé-lulas del sobrenadante; vi) recuperar la proteína ORF2 del PCV2 expresada del sobrenadante; y vii) inactivar el vec-tor viral recombinante. Preferentemente, el vector viral recombinante es un baculovirus que contiene secuencias de ADN codificantes de ORF2 y las células son células Sf+. Las etapas de separación preferidas son las que se descri-60 bieron precedentemente, siendo más preferida la etapa de filtración. Las etapas de inactivación preferidas son las

que se describieron precedentemente. Preferentemente, la inactivación se realiza a 35-39 °C aproximadamente y en presencia de BEI 2 a 8 mM, aún más preferentemente en presencia de BEI 5 mM aproximadamente. Se ha encon-trado sorprendentemente que concentraciones más altas de BEI afectan negativamente la proteína ORF2 del PCV2 y que concentraciones más bajas no son eficaces para inactivar el vector viral dentro de las 24 a 72 horas de inacti-vación. Preferentemente, la inactivación se realiza durante al menos 24 horas, con mayor preferencia aún durante 5 24 a 72 horas.

De acuerdo con un aspecto adicional, el método para preparar una composición que comprende la proteína ORF2 del PCV2, y el vector viral inactivado, descrito precedentemente, también incluye una etapa de neutralización des-pués de la etapa vii). Esta etapa viii) comprende la adición de una cantidad equivalente de un agente que neutraliza al agente de inactivación a la solución. Preferentemente, si el agente de inactivación es BEI, se prefiere agregar una 10 cantidad equivalente de tiosulfato de sodio. Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto adicional, la etapa viii) com-prende la adición de una solución de tiosulfato de sodio a una concentración final entre aproximadamente 1 y apro-ximadamente 20 mM, preferentemente entre aproximadamente 2 y aproximadamente 10 mM, más preferentemente aún entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8 mM, más preferentemente aún entre aproximadamente 3 y aproximadamente 7 mM, con mayor preferencia de aproximadamente 5 mM, cuando el agente de inactivación es 15 BEI.

De acuerdo con un aspecto adicional, el método para preparar una composición que comprende la proteína ORF2 del PCV2 y el vector viral inactivado, descrito precedentemente, comprende antes de la etapa i) la siguiente etapa: amplificar el ADN de ORF2 del PCV2 in vitro, donde las secuencias flanqueadoras del ADN de ORF2 del PCV2 es-tán modificadas según se describió precedentemente. Los métodos in vitro para amplificar el ADN de ORF2 del 20 PCV2 y para modificar las secuencias flanqueadoras, clonar in vitro el ADN de ORF2 del PCV2 amplificado en un vector de transferencia y los vectores de transferencia adecuados fueron descritos precedentemente, se muestran a modo de ejemplo en la figura 1 o son conocidos por los especialistas en la técnica. Entonces, de acuerdo con un as-pecto adicional, este método comprende las etapas de: i) amplificar el ADN de ORF2 del PCV2 in vitro, donde las secuencias flanqueadoras de dicho ADN de ORF2 del PCV2 están modificadas, ii) clonar el ADN de ORF2 del PCV2 25 amplificado en un vector de transferencia; y iii) transfectar el vector de transferencia, o una porción del mismo que contiene al ADN de ORF2 del PCV2 recombinante, en un vector viral para generar el vector viral recombinante, iv) infectar células en un medio con el virus transfectado; v) lograr que el virus transfectado exprese la proteína recom-binante de ORF2 del PCV2; vi) separar las células del sobrenadante; vii) recuperar la proteína ORF2 del PCV2 ex-presada del sobrenadante; viii) inactivar el vector viral recombinante, preferentemente, en presencia de BEI entre 30 aproximadamente 1 y aproximadamente 20 mM, con mayor preferencia en presencia de BEI 5 mM aproximadamen-te; y ix) agregar una cantidad equivalente de un agente capaz de neutralizar el agente de inactivación en la solución, preferentemente, agregar una solución de tiosulfato de sodio a una concentración final entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 mM, preferentemente de aproximadamente 5 mM, cuando el agente de inactivación es BEI.

En otro aspecto de la presente divulgación se proporciona un método para preparar una composición, preferente-35 mente una composición antigénica, tal como, por ejemplo, una vacuna, para generar una respuesta inmune contra PCV2. En general, este método incluye las etapas de transfectar una construcción en un virus, donde dicha cons-trucción comprende i) ADN recombinante de ORF2 del PCV2, ii) infectar células en un medio de crecimiento con el virus transfectado, iii) lograr que el virus exprese la proteína recombinante ORF2 del PCV2, iv) recuperar la proteína ORF2 expresada del sobrenadante y v) preparar la composición combinando la proteína recuperada con un adyu-40 vante adecuado y/u otro vehículo aceptable para uso farmacéutico.

“Adyuvantes”, tal como se definen en la presente, pueden incluir hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, saponi-nas como por ejemplo, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge, MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuti-cals, Inc., Birmingham, AL), una emulsión de agua-en-aceite, una emulsión de aceite-en-agua, una emulsión de agua-en-aceite-en-agua. La emulsión se puede basar particularmente en aceite parafínico líquido liviano (tipo Far-45 macopea Europea); aceite de isoprenoides tal como escualano o escualeno; aceite obtenido por teoligomerización de alquenos, en particular de isobuteno o deceno; ésteres de ácidos o de alcoholes que contienen un grupo alquilo lineal, más particularmente aceites vegetales, oleato de etilo, di-(caprilato/caprato) de propilenglicol, tri-(caprilato/caprato) de glicerilo o dioleato de propilenglicol; ésteres de ácidos o alcoholes grasos ramificados, en par-ticular ésteres del ácido isoesteárico. El aceite se usa en combinación con emulsionantes para formar la emulsión. 50 Los emulsionantes son preferentemente agentes tensioactivos no iónicos, en particular ésteres de sorbitano, de ma-nida (por ejemplo, oleato de anhidromanitol), de glicol, de poliglicerol, de propilenglicol y de ácido oleico, isoesteári-co, ricinoleico o hidroxiesteárico, que están opcionalmente etoxilados, y bloques de copolímeros de polioxipropileno-polioxietileno, en particular los productos Pluronic, en especial L121. Véase Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull, D. E. S.). John Wiley and Sons, NY, págs. 51-94 (1995) y Todd et al., 55 Vaccine 15:564-570 (1997).

Por ejemplo, es posible usar la emulsión SPT descrita en la página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adju-vant Approach" editado por M. Powell y M. Newman, Plenum Press, 1995, y la emulsión MF59 descrita en la página 183 del mismo libro.

Un caso adicional de un adyuvante es un compuesto seleccionado entre polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros de anhídrido maleico y derivados alquenilo. Los compuestos adyuvantes ventajosos son los políme-ros de ácido acrílico o metacrílico entrecruzados, en especial con éteres de polialquenilo de azúcares o polialcoho-les. Estos compuestos se conocen con el término de carbómeros (Phameuropa Vol. 8, Nº 2, junio de 1996). Los es-pecialistas en la técnica también pueden consultar la Patente de EE.UU. Nº: 2.909.462 en la que se describen di-5 chos polímeros de acrílico entrecruzados con un compuesto polihidroxilado que contiene al menos 3 grupos hidroxi-lo, preferentemente no más que 8, donde los átomos de hidrógeno de al menos tres hidroxilos están sustituidos por radicales alifáticos insaturados de al menos 2 átomos de carbono. Los radicales preferidos son los que contienen en-tre 2 y 4 átomos de carbono, por ejemplo vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insa-turados pueden contener ellos mismos otros sustituyentes, tal como metilo. Los productos comercializados con el 10 nombre Carbopol (BF Goodrich, Ohio, EE.UU.) son particularmente apropiados. Están entrecruzados con una saca-rosa de alilo o con alilo pentaeritritol. Entre ellos, se puede mencionar Carbopol 974P, 934P y 971P. Más preferido es el uso de Carbopol 971P. Entre los copolímeros de anhídrido maleico y derivados alquenilo, los copolímeros EMA (Monsanto) que son copolímeros de anhídrido maleico y etileno. La disolución de estos polímeros en agua permite obtener una solución ácida que será neutralizada, preferentemente hasta un pH fisiológico, con el fin de obtener la 15 solución adyuvante en la cual se incorporará la propia composición inmunogénica, inmunológica o vacuna.

Otros adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan al sistema adyuvante RIBI (Ribi Inc.), copolímeros de blo-ques (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), monofosforil lípido A, adyuvante de avridina lípido-amina, enterotoxina lábil al calor de E. coli (recombinante u otro), toxina de cólera, IMS 1314 o dipéptido muramilo entre muchos otros. 20

Preferentemente, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 100 µg y aproximadamente 10 mg por dosis. Con mayor preferencia aún, la cantidad de adyuvante añadida comprende entre aproximadamente 100 µg y aproximadamente 10 mg por dosis. Con mayor preferencia aún, la cantidad de adyuvante añadida comprende en-tre aproximadamente 500 µg y aproximadamente 5 mg por dosis. Con mayor preferencia aún, la cantidad de adyu-vante añadida comprende entre aproximadamente 750 µg y aproximadamente 2,5 mg por dosis. Con mayor prefe-25 rencia, la cantidad de adyuvante añadida es de aproximadamente 1 mg por dosis.

Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto adicional, el método para preparar una composición antigénica, tal como por ejemplo una vacuna, para generar una respuesta inmune contra PCV2 comprende i) preparar y recuperar la proteína ORF2 del PCV2 y ii) mezclarla con un adyuvante adecuado. Preferentemente, el adyuvante es Carbopol 971P. Con mayor preferencia aún, se agrega una cantidad de Carbopol 971P que comprende entre aproximadamente 500 µg y 30 aproximadamente 5 mg por dosis, con mayor preferencia aún una cantidad que comprende entre aproximadamente 750 µg y aproximadamente 2,5 mg por dosis y con mayor preferencia una cantidad que comprende aproximadamen-te 1 mg por dosis. Preferentemente, el paso de proceso i) incluye las etapas de proceso descritas para la prepara-ción y recuperación de la ORF2 del PCV2. Por ejemplo, en realizaciones preferidas de este método, la construcción que comprende el ADN de la ORF2 del PCV2 se obtiene en un vector de transferencia. Los vectores de transferen-35 cia adecuados y los métodos para prepararlos fueron descritos precedentemente. Opcionalmente, el método puede incluir el paso de amplificar la ORF2 a partir de una cepa de PCV2 mediante PCR antes de clonar la ORF2 en el vector de transferencia. Las secuencias de marco de lectura abierto, secuencias de Kozak, secuencias del sitio EcoR1 3’, secuencias de proteínas recombinantes, secuencias de construcciones transfectadas, medios, células y virus preferidos son como se describieron para los métodos precedentes. Otra etapa opcional para este método in-40 cluye clonar el ADN de la ORF2 del PCV2 amplificado en un primer vector, recortar el ADN de la ORF2 de este pri-mer vector y usar este ADN de la ORF2 del PCV2 recortado para clonarlo en el vector de transferencia. Al igual que con los otros métodos, se prefiere esperar durante al menos 5 días después de la infección de las células por el ba-culovirus transfectado antes de recuperar la proteína ORF2 recombinante del sobrenadante. Preferentemente, la etapa de recuperación de este método también incluye la etapa de separar el medio de las células y de los desechos 45 celulares. Esto se puede realizar de diversas maneras, pero para mayor facilidad y conveniencia, se prefiere filtrar las células, los desechos celulares y el medio de crecimiento a través de un filtro cuyos poros varían en un intervalo de tamaños entre aproximadamente 0,45 µM y aproximadamente 1,0 µM. Finalmente, para este método, se prefiere incluir una etapa de inactivación del virus antes de combinar la proteína ORF2 del PCV2 recombinante recuperada en una composición. Esto se puede realizar de diversas maneras, pero para la práctica de la presente invención se 50 prefiere usar BEI.

Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto adicional, este método comprende las etapas de: i) amplificar el ADN de la ORF2 del PCV2 in vitro, donde las secuencias flanqueadoras de dicho ADN de la ORF2 del PCV2 están modifica-das, ii) clonar el ADN de la ORF2 del PCV2 amplificado en un vector de transferencia; y iii) transfectar el vector de transferencia, o una porción del mismo que contiene al ADN de la ORF2 del PCV2 recombinante, en un vector viral 55 para generar el vector viral recombinante, iv) infectar las células en un medio con el virus transfectado; v) lograr que el virus transfectado exprese la proteína recombinante de la ORF2 del PCV2; vi) separar las células del sobrenadan-te; vii) recuperar la proteína ORF2 del PCV2 expresada del sobrenadante; viii) inactivar el vector viral recombinante, preferentemente en presencia de BEI entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 mM, con mayor preferencia en presencia de BEI aproximadamente 5 mM; ix) agregar una cantidad equivalente de un agente capaz de neutrali-60 zar al agente de inactivación en la solución, preferentemente por adición de una solución de tiosulfato de sodio a una

concentración final entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 mM, preferentemente de aproximadamente 5 mM, cuando el agente de inactivación es BEI, y x) agregar una cantidad adecuada de un adyuvante, preferentemen-te agregar Carbopol, más preferentemente Carbopol 971P, con mayor preferencia aún en las cantidades descritas precedentemente (por ejemplo entre aproximadamente 500 µg y aproximadamente 5 mg por dosis, con mayor prefe-rencia aún una cantidad entre aproximadamente 750 µg y aproximadamente 2,5 mg por dosis y con mayor preferen-5 cia una cantidad de aproximadamente 1 mg por dosis).

Además, la composición puede incluir uno o más vehículos aceptables para uso farmacéutico. Tal como se utiliza en la presente, "un vehículo aceptable para uso farmacéutico" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dis-persión, recubrimientos, agentes estabilizantes, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes que demoran la absorción y semejantes. Con mayor preferencia, la composición provis-10 ta en la presente, contiene a la proteína ORF2 del PCV2 recuperada del sobrenadante de células cultivadas in vitro, donde dichas células fueron infectadas con un vector viral recombinante que contiene ADN de la ORF2 del PCV2 y expresan la proteína ORF2 del PCV2, y donde dicho cultivo celular fue tratado con BEI entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8 mM, preferentemente con BEI aproximadamente 5 mM para inactivar el vector viral, y una con-centración equivalente de un agente de neutralización, preferentemente una solución de tiosulfato de sodio a una 15 concentración final entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8 mM, preferentemente de aproximadamente 5 mM; Carbopol, más preferentemente Carbopol 971P, preferentemente en cantidades que comprenden entre aproxi-madamente 500 µg y aproximadamente 5 mg por dosis, con mayor preferencia aún una cantidad entre aproximada-mente 750 µg y aproximadamente 2,5 mg por dosis y con mayor preferencia una cantidad entre aproximadamente 1 mg por dosis; y salina fisiológica, preferentemente en una cantidad que comprende entre aproximadamente 50 y 20 aproximadamente 90% (v/v), más preferentemente entre aproximadamente 60 y 80% (v/v), más preferentemente aún de aproximadamente 70% (v/v).

Por lo tanto, un aspecto adicional se refiere a un método para preparar una composición antigénica, tal como por ejemplo una vacuna, para generar una respuesta inmune contra el PCV2 que comprende las etapas de: i) amplificar el ADN de la ORF2 del PCV2 in vitro, donde las secuencias flanqueadoras de dicho ADN de la ORF2 del PCV2 es-25 tán modificadas, ii) clonar el ADN de la ORF2 del PCV2 amplificado en un vector de transferencia; y iii) transfectar el vector de transferencia, o una porción del mismo que contiene al ADN de la ORF2 del PCV2 recombinante, en un vector viral para generar el vector viral recombinante, iv) infectar células en un medio con el virus transfectado; v) lo-grar que el virus transfectado exprese la proteína recombinante de la ORF2 del PCV2; vi) separar las células del so-brenadante; vii) recuperar la proteína ORF2 del PCV2 expresada del sobrenadante; viii) inactivar el vector viral re-30 combinante, preferentemente, en presencia de BEI entre aproximadamente 2 y aproximadamente 20 mM, con mayor preferencia en presencia de BEI aproximadamente 5 mM; ix) agregar una cantidad equivalente de un agente capaz de neutralizar al agente de inactivación en la solución, preferentemente, con la adición de una solución de tiosulfato de sodio a una concentración final entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 20 mM, preferentemente de aproximadamente 5 mM, cuando el agente de inactivación es BEI, x) agregar una cantidad adecuada de un adyu-35 vante, preferentemente agregar Carbopol, más preferentemente Carbopol 971P, con mayor preferencia en las canti-dades descritas precedentemente (por ejemplo, entre aproximadamente 500 µg y aproximadamente 5 mg por dosis, con mayor preferencia aún en cantidades entre aproximadamente 750 µg y aproximadamente 2,5 mg por dosis y con mayor preferencia en una cantidad de aproximadamente 1 mg por dosis); y xi) agregar salina fisiológica, prefe-rentemente una cantidad entre aproximadamente 50 y aproximadamente 90% (v/v), más preferentemente entre 40 aproximadamente 60 y 80% (v/v), más preferentemente aún de aproximadamente 70% (v/v). Opcionalmente, este método también puede incluir la adición de un protector. Un protector, tal como se utiliza en la presente, se refiere a un agente anti-microbiológico activo, tal como por ejemplo Gentamicina, Mertiolate y semejantes. En particular, se prefiere agregar un protector en la preparación de una composición de múltiples dosis. Dichos agentes anti-microbiológicos activos se agregan a concentraciones eficaces para prevenir toda contaminación microbiológica de 45 la composición de interés o para inhibidor todo crecimiento microbiológico en la composición de interés.

Más aún, este método también puede comprender la adición de un agente estabilizante, tal como p.ej. sacáridos, trehalosa, manitol, sacarosa y semejantes, para incrementar y/o mantener la vida en estante del producto.Sin em-bargo, se ha encontrado sorpresivamente que la formulación resultante es inmunológicamente eficaz sobre un pe-ríodo de al menos 24 meses, sin agregar ningún agente estabilizante adicional. 50

Un aspecto adicional de la presente divulgación se relaciona con los productos resultantes de los métodos descritos precedentemente. En particular, la presente divulgación se relaciona con una composición de materia que compren-de la proteína ORF2 del PCV2 expresada de forma recombinante. Más aún, la presente divulgación también se rela-ciona con una composición de materia que comprende la proteína ORF2 del PCV2 expresada de forma recombinan-te, recuperada del sobrenadante de un cultivo de células de insecto. Más aún, la presente divulgación también se re-55 laciona con una composición de materia que comprende la proteína ORF2 del PCV2 expresada de forma recombi-nante, recuperada del sobrenadante de un cultivo de células de insecto. Preferentemente, esta composición de ma-teria también comprende un agente adecuado para la inactivación de vectores virales. Preferentemente, dicho agen-te de inactivación es BEI. Más aún, la presente invención también se relaciona con una composición de materia que comprende la proteína ORF2 del PCV2 expresada de forma recombinante, recuperada del sobrenadante de un culti-60 vo de células de insecto y que comprende un agente adecuado para la inactivación de vectores virales, preferente-

mente BEI, y un agente de neutralización para neutralizar el agente de inactivación. Preferentemente, dicho agente de neutralización es tiosulfato de sodio, cuando se usa BEI como agente de inactivación.

Aún en otro aspecto de la presente divulgación se proporciona una composición inmunogénica que induce una res-puesta inmune y, más preferentemente, confiere inmunidad protectora contra los signos clínicos de una infección por PCV2. La composición comprende generalmente el polipéptido,o un fragmento del mismo,expresado por el marco 5 de lectura abierto 2 (ORF2) de PCV2, como componente antigénico de la composición.

El ADN y la proteína ORF2 del PCV2, tal como se utiliza en la presente para la preparación de las composiciones y también en los procesos provistos aquí comprende un dominio altamente conservado en las formas aisladas de PCV2 y por ello cualquier ORF2 del PCV2 sería eficaz como fuente del ADN y/o polipéptido de la ORF2 del PCV tal como se utiliza en la presente. Una proteína ORF2 del PCV2 preferida es la que se muestra en la SEQ ID Nº 11. El 10 polipéptido de la ORF2 del PCV preferido se provee aquí en la SEQ ID Nº 5, pero los especialistas en la técnica comprenderán que esta podría variar en tanto como un 6-10% en cuanto a homología de secuencia y aún retener las características antigénicas que los vuelve útiles en las composiciones inmunogénicas. Las características antigé-nicas de la composición inmunológica se pueden estimar, por ejemplo, mediante un experimento de exposición co-mo el que se provee en el ejemplo 4. Más aún, la característica antigénica del antígeno modificado es retenido, 15 cuando el antígeno modificado confiere al menos un 70%, preferentemente un 80%, más preferentemente un 90% de inmunidad protectora en comparación con la proteína ORF2 del PCV2, codificada por la secuencia de polinucleó-tidos de la SEQ ID Nº:3 o de la SEQ ID Nº:4. Una “composición inmunogénica”, tal como se utiliza en la presente, se refiere a una proteína ORF2 del PCV2 que genera una “respuesta inmunológica” en el huésped que comprende una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpos a la proteína ORF2 del PCV2. Preferentemente, esta compo-20 sición inmunogénica puede conferir inmunidad protectora contra una infección por PCV2 y los signos clínicos aso-ciados con la misma. En algunas realizaciones, se usan las porciones inmunogénicas de la proteína ORF2 del PCV2 como componente antigénico en la composición. El término “porción inmunogénica”, tal como se utiliza en la presen-te, se refiere a formas truncadas y/o sustituidas, o fragmentos de la proteína y/o del polinucleótido ORF2 del PCV2, respectivamente. Preferentemente, dichas formas truncadas y/o sustituidas, o fragmentos, comprenderán al menos 6 25 aminoácidos contiguos del polipéptido ORF2 de longitud completa. Más preferentemente, las formas truncadas o sustituidas, o fragmentos, comprenden al menos 10, más preferentemente al menos 15 y más preferentemente aún al menos 19 aminoácidos contiguos del polipéptido ORF2 de longitud completa. En la presente se proveen dos se-cuencias preferidas en este respecto como las SEQ ID Nº: 9 y 10. Se considera además que dichas secuencias pueden formar parte de fragmentos o formas truncadas más grandes. Otro polipéptido ORF2 del PCV2 preferido 30 provisto en la presente es codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº: 3 o de la SEQ ID Nº: 4. Pero los especialistas en la técnica comprenderán que esta secuencia podría variar en tanto como un 6-20% en cuanto a homología de secuencia y aún retener las características antigénicas que lo vuelven útil en las composiciones inmu-nogénicas. En algunas realizaciones, se usa una forma truncada o sustituida, o un fragmento, de la ORF2 como componente antigénico en la composición. Preferentemente, dichas formas truncadas o sustituidas, o fragmentos, 35 comprenderán al menos 18 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos ORF2 de longitud completa, por ejemplo de la SEQ ID Nº 3 o la SEQ ID Nº 4. Más preferentemente, las formas truncadas o sustituidas, o fragmen-tos, tendrán al menos 30, más preferentemente al menos 45 y más preferentemente aún al menos 57 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos de longitud completa del ORF2, por ejemplo la SEQ ID Nº 3 o la SEQ ID Nº 4. 40

La “identidad de secuencia”, tal como se conoce en la técnica, se refiere a la relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, es decir una secuencia de referencia y una secuencia dada que será comparada con la secuencia de referencia. La identidad de secuencia se determina por comparación de la secuencia dada con la secuencia de referencia después de alinear las secuencias de forma óptima con el objeto de obtener el mayor grado de similitud de secuencia, determinado por la coincidencia entre las cadenas de dichas se-45 cuencias. Dicha alineación permite establecer la identidad de secuencia sobre una base de posición-por-posición, por ejemplo, las secuencias son “idénticas” en una posición particular si en dicha posición los nucleótidos o residuos de aminoácidos son idénticos. La cantidad total de dichas identidades de posición se divide entonces por el número total de nucleótidos o residuos en la secuencia de referencia para obtener el % de identidad de secuencia. la identi-dad de secuencia puede calcularse fácilmente utilizando métodos conocidos, incluyendo en un sentido no limitativo, 50 los que se describen en Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, Nueva York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequences Analysis Pri-mer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nueva York (1991); y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. 55 Applied Math., 48: 1073 (1988). Los métodos preferidos para determinar la identidad de secuencia están diseñados para lograr la mayor coincidencia entre las secuencias evaluadas. Los métodos para determinar la identidad de se-cuencia están codificados en programas para computadora disponibles al público que determinan la identidad de se-cuencia entre las secuencias dadas. Los ejemplos de tales programas incluyen, a modo de ejemplo, el paquete de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN y FASTA (Al-60 tschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990). El programa BLASTX se encuentra disponible al público de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al.,

J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)). Estos programas alinean de forma óptima las secuencias usando los pesos de hueco predeterminados con el fin de obtener el mayor nivel de identidad de secuencia entre la secuencia dada y la secuencia de referencia. A modo ilustrativo, cuando se dice que un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos tie-ne al menos, por ejemplo, un 85%, preferentemente un 90%, aún más preferentemente un 95% de “identidad de se-cuencia” con la secuencia de nucleótidos de referencia, se considera que la secuencia de nucleótidos del polinucleó-5 tido dado es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de polinucleótidos dada puede incluir hasta 15, preferentemente hasta 10, aún más preferentemente hasta 5 mutaciones puntuales por cada 100 nucleóti-dos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, en un polinucleótido cuya secuencia de nucleó-tidos tiene al menos un 85%, preferentemente un 90%, aún más preferentemente un 95% de identidad con relación a la secuencia de nucleótidos de referencia, hasta un 15%, preferentemente un 10%, aún más preferentemente un 10 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia pueden ser suprimidos o sustituidos por otro nucleótido, o se puede insertar una cantidad de nucleótidos de hasta el 15%, preferentemente el 10%, aún más preferentemente el 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden tener lugar en las posiciones 5' o 3' terminales de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier ubicación entre dichas posiciones terminales, dispersas ya sea individualmente entre los nucleótidos de la secuencia de refe-15 rencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. De manera análoga, un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos dada tiene al menos, por ejemplo, un 85%, preferentemente un 90%, aún más pre-ferentemente un 95% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de referencia, significa que la secuencia de aminoácidos dada del polipéptido es idéntica a la secuencia de referencia excepto que dicha secuen-cia de polipéptidos dada puede incluir hasta 15, preferentemente hasta 10, aún más preferentemente hasta 5 altera-20 ciones de aminoácido por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia. En otras palabras, para obtener una secuencia de polipéptidos dada que tiene al menos un 85%, preferentemente un 90%, aún más preferentemente un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de referencia, se puede su-primir o sustituir hasta un 15%, preferentemente hasta un 10%, aún más preferentemente hasta un 5% de los resi-duos de aminoácidos en la secuencia de referencia por otro aminoácido, o se puede insertar un número de aminoá-25 cidos hasta un 15%, preferentemente hasta un 10%, aún más preferentemente hasta un 5% del número total de re-siduos de aminoácidos de la secuencia de referencia en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la se-cuencia de referencia pueden tener lugar en las posiciones amino o carboxilo terminales de la secuencia de aminoá-cidos de referencia o en cualquier ubicación entre dichas posiciones terminales, dispersas ya sea individualmente entre los residuos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de refe-30 rencia. Preferentemente, las posiciones de residuos que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservadoras. Sin embargo, las sustituciones conservadoras no se incluyen como una coincidencia al determinar la identidad de secuencia.

La “homología de secuencia”, tal como se utiliza en la presente, se refiere a un método para determinar la relación de dos secuencias. Para determinar la homología de secuencia, se alinean de forma óptima dos o más secuencias y 35 se introducen huecos si fuera necesario. Sin embargo, a diferencia de la “identidad de secuencia”, las sustituciones de aminoácidos conservadoras se cuentan como coincidencias al determinar la homología de secuencia. En otras palabras, para obtener un polipéptido o polinucleótido con un 95% de homología de secuencia con la secuencia de referencia, un 85%, preferentemente un 90%, aún más preferentemente un 95% de los residuos de aminoácidos o nucleótidos de la secuencia de referencia deben coincidir o comprender una sustitución conservadora con otro ami-40 noácido o nucleótido, o se puede insertar en la secuencia de referencia un número de aminoácidos o nucleótidos que comprende hasta un 15%, preferentemente hasta un 10%, aún más preferentemente hasta un 5% de los resi-duos de aminoácidos o nucleótidos totales, sin incluir las sustituciones conservadoras, en la secuencia de referencia. Preferentemente, la secuencia homóloga comprende al menos una extensión de 50, con mayor preferencia aún de 100, con mayor preferencia aún de 250, con mayor preferencia aún de 500 nucleótidos. 45

Una “sustitución conservadora” se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido o nucleótido por otro residuo de aminoácido o nucleótido de características o propiedades similares, incluyendo tamaño, hidrofobicidad, etc., de modo tal que la funcionalidad general no cambia significativamente.

El término “aislado” significa alterado “por la mano del hombre” con respecto a su estado natural, es decir, si tiene lugar en la naturaleza, ha sido cambiado o eliminado de su entorno original o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido 50 o polipéptido naturalmente presente en un organismo vivo no está “aislado”, pero el mismo polinucleótido o polipép-tido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está “aislado”, según el término se emplea en la presente.

Por lo tanto, un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a una composición inmunogénica eficaz para disminuir la severidad de los síntomas clínicos asociados con una infección por PCV2 que comprende a la proteína 55 ORF2 del PCV2. Preferentemente, la proteína ORF2 del PCV2 es cualquiera de las que se describieron preceden-temente. Preferentemente, dicha proteína ORF2 del PCV2 es

i) un polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID Nº: 5, SEQ ID Nº: 6, SEQ ID Nº: 9, SEQ ID Nº: 10 o SEQ ID Nº: 11;

ii) cualquier polipéptido que es al menos un 80% homólogo del polipéptido de i), 60

iii) cualquier porción inmunogénica de los polipéptidos de i) y/o ii)

iv) la porción inmunogénica de iii), que comprende al menos 10 aminoácidos contiguos incluidos en la secuencia de la SEQ ID Nº: 5, SEQ ID Nº: 6, SEQ ID Nº: 9, SEQ ID Nº: 10 o SEQ ID Nº: 11,

v) un polipéptido codificado por un ADN que comprende la secuencia de la SEQ ID Nº: 3 o SEQ ID Nº: 4,

vi) cualquier polipéptido codificado por un polinucleótido que es al menos un 80% homólogo del poli-5 nucleótido de v),

vii) cualquier porción inmunogénica de los polipéptidos codificados por el polinucleótido de v) y/o vi),

viii) la porción inmunogénica de vii), donde el polinucleótido que codifica dicha porción inmunogénica comprende al menos 30 nucleótidos contiguos incluidos en la secuencia de la SEQ ID Nº: 3, o SEQ ID Nº: 4. 10

Preferentemente cualquiera de dichas porciones inmunogénicas poseen las características inmunogénicas de la pro-teína ORF2 PCV2 codificada por la secuencia de la SEQ ID Nº: 3 o SEQ ID Nº: 4.

De acuerdo con un aspecto adicional, la proteína ORF2 del PCV2 se provee en la composición inmunológica a un nivel de inclusión de antígeno eficaz para inducir la respuesta inmune deseada, a saber, la reducción de la inciden-cia o disminución de la severidad de los signos clínicos resultantes de una infección por PCV2. Preferentemente, el 15 nivel de inclusión de la proteína ORF2 del PCV2 es de al menos 0,2 µg de antígeno/ml de la composición inmuno-génica final (µg/ml), más preferentemente entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 400 µg/ml, más preferen-temente aún entre aproximadamente 0,3 y aproximadamente 200 µg/ml, aún más preferentemente entre aproxima-damente 0,35 y aproximadamente 100 µg/ml, más preferentemente aún entre aproximadamente 0,4 y aproximada-mente 50 µg/ml, más preferentemente aún entre aproximadamente 0,45 y aproximadamente 30 µg/ml, más preferen-20 temente aún entre aproximadamente 0,6 y aproximadamente 15 µg /ml, aún más preferentemente entre aproxima-damente 0,75 y aproximadamente 8 µg/ml, aún más preferentemente entre aproximadamente 1,0 y aproximadamen-te 6 µg/ml, más preferentemente aún entre aproximadamente 1,3 y aproximadamente 3,0 µg/ml, aún más preferen-temente entre aproximadamente 1,4 y aproximadamente 2,5 µg/ml, aún más preferentemente entre aproximadamen-te 1,5 y aproximadamente 2,0 µg/ml y con mayor preferencia es de 1,6 µg/ml aproximadamente. 25

De acuerdo con un aspecto adicional, el nivel de inclusión de antígeno de la ORF2 es de al menos 0,2 µg de proteí-na ORF2 del PCV2 según se describió precedentemente por dosis de la composición antigénica final (µg/dosis), más preferentemente entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 400 µg/dosis, más preferentemente aún entre aproximadamente 0,3 y aproximadamente 200 µg/dosis, aún más preferentemente entre aproximadamente 0,35 y aproximadamente 100 µg/dosis, más preferentemente aún entre aproximadamente 0,4 y aproximadamente 50 30 µg/dosis, más preferentemente aún entre aproximadamente 0,45 y aproximadamente 30 µg/dosis, más preferente-mente aún entre aproximadamente 0,6 y aproximadamente 15 µg/dosis, aún más preferentemente entre aproxima-damente 0,75 y aproximadamente 8 µg/dosis, aún más preferentemente entre aproximadamente 1,0 y aproximada-mente 6 µg/dosis, más preferentemente aún entre aproximadamente 1,3 y aproximadamente 3,0 µg/dosis, aún más preferentemente entre aproximadamente 1,4 y aproximadamente 2,5 µg/dosis, aún más preferentemente entre apro-35 ximadamente 1,5 y aproximadamente 2,0 µg/dosis y con mayor preferencia es de 1,6 µg/dosis aproximadamente.

El polipéptido ORF2 del PCV2 usado en la composición inmunogénica acorde con la presente divulgación puede ser derivado de cualquier manera incluyendo aislamiento y purificación de la ORF2 del PCV2, síntesis estándar de pro-teínas y metodología recombinante. Los métodos preferidos para obtener el polipéptido ORF2 del PCV2 se descri-bieron ya en la presente y también se proveen en la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº: 11/034.797. Brevemente, se 40 infectan células susceptibles con un vector viral recombinante que contiene las secuencias de ADN codificantes de ORF2 del PCV2, el polipéptido ORF2 del PCV2 es expresado por el virus recombinante y el polipéptido ORF2 del PCV2 expresado se recupera del sobrenadante por filtración y es inactivado mediante cualquier método convencio-nal, preferentemente usando etilenimina binaria, que luego es neutralizado para detener el proceso de inactivación.

Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto adicional, la composición inmunogénica comprende i) cualesquiera de las 45 proteínas ORF2 del PCV2 descritas precedentemente, preferentemente a las concentraciones descritas preceden-temente, y ii) al menos una porción del vector viral que expresa dicha proteína ORF2 del PCV2, preferentemente de un baculovirus recombinante. Más aún, de acuerdo con un aspecto adicional, la composición inmunogénica com-prende i) cualquiera de las proteínas ORF2 del PCV2 descritas precedentemente, preferentemente a las concentra-ciones descritas precedentemente, ii) al menos una porción del vector viral que expresa dicha proteína ORF2 del 50 PCV2, preferentemente de un baculovirus recombinante, y iii) una porción del sobrenadante del cultivo celular.

De acuerdo con una realiazaicón especídfica del proceso de producción y recuperación para la proteína ORF2 del PCV2, el sobrenadante del cultivo celular puede ser filtrado a través de una membrana que tiene un tamaño de poro que comprende preferentemente entre aproximadamente 0,45 y 1 µm. Por consiguiente, un aspecto adicional se re-laciona con una composición inmunogénica que comprende i) cualquiera de las proteínas ORF2 del PCV2 descritas 55 precedentemente, preferentemente a las concentraciones descritas precedentemente, ii) al menos una porción del vector viral que expresa dicha proteína ORF2 del PCV2, preferentemente de un baculovirus recombinante, y iii) una porción del cultivo celular; donde aproximadamente un 90% de los componentes tiene un tamaño menor que 1 µm.

De acuerdo con un aspecto adicional, la presente divulgación se relaciona con una composición inmunogénica que comprende i) cualquiera de las proteínas ORF2 del PCV2 descritas precedentemente, preferentemente a las con-centraciones descritas precedentemente, ii) al menos una porción del vector viral que expresa dicha proteína ORF2 del PCV2, iii) una porción del cultivo celular y iv) un agente de inactivación para inactivar el vector viral recombinan-te que preferentemente es BEI, donde aproximadamente un 90% de los componentes i) a iii) son de un tamaño me-5 nor que 1 µm. Preferentemente, BEI está presente a concentraciones eficaces para inactivar el baculovirus. Las concentraciones eficaces se describieron precedentemente.

De acuerdo con un aspecto adicional, la presente divulgación se relaciona con una composición inmunogénica que comprende i) cualquiera de las proteínas ORF2 del PCV2 descritas precedentemente, preferentemente a las con-centraciones descritas precedentemente, ii) al menos una porción del vector viral que expresa dicha proteína ORF2 10 del PCV2, iii) una porción del cultivo celular, iv) un agente de inactivación para inactivar el vector viral recombinante que preferentemente es BEI y v) un agente de neutralización para detener la inactivación mediada por el agente de inactivación, donde aproximadamente un 90% de los componentes i) a iii) son de un tamaño menor que 1 µm. Prefe-rentemente, si el agente de inactivación es BEI, dicha composición comprende tiosulfato de sodio en cantidades equivalentes a BEI. 15

El polipéptido es incorporado en una composición que puede ser administrada a un animal susceptible a un infección por PCV2. En realizaciones preferidas, la composición también puede incluir componentes adicionales conocidos por los especialistas en la técnica (véase también Remington's Pharmaceutical Sciences, (1990), 18ª ed.Mack Publ., Easton). Además, la composición puede incluir uno o más vehículos aceptables para uso veterinario. Tal como se utiliza en la presente, un "vehículo aceptable para uso veterinario" incluye cualquiera y todos los solventes, medios 20 de dispersión, recubrimientos, adyuvantes, agentes estabilizantes, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes que demoran la absorción y semejantes.

En una realización preferida, la composición inmunogénica comprende la proteína ORF2 del PCV2 provista en la presente, preferentemente a las concentraciones descritas precedentemente, como un componente antigénico, mezclado con un adyuvante, preferentemente Carbopol,y salina fisiológica. 25

Los especialistas en la técnica comprenderán que la presente composición puede incorporar soluciones estériles in-yectables conocidas, aceptables para uso fisiológico. Para preparar una solución lista para usar como una inyección o infusión parenteral, hay soluciones isotónicas acuosas, tal como por ejemplo salina, o las correspondientes solu-ciones con proteínas plasmáticas. Además, las composiciones inmunogénicas y vacunas según se describen en es-ta memoria pueden incluir diluyentes, agentes isotónicos, estabilizantes o adyuvantes. Los diluyentes pueden incluir 30 agua, salina, dextrosa, etanol, glicerol y semejantes. Los agentes isotónicos pueden incluir cloruro de sodio, dextro-sa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Los estabilizantes incluyen albúmina y sales alcalinas del ácido etilendia-mintetracético, entre otros. Los adyuvantes adecuados son los que se describieron precedentemente. Más preferido es el uso de Carbopol, en particular el uso de Carbopol 971P, preferentemente en las cantidades descritas prece-dentemente (por ejemplo entre aproximadamente 500 µg y aproximadamente 5 mg por dosis, con mayor preferencia 35 aún entre aproximadamente 750 µg y aproximadamente 2,5 mg por dosis y más preferentemente en una cantidad de aproximadamente 1 mg por dosis).

Por lo tanto, la presente divulgación también se relaciona con una composición inmunogénica que comprende i) cualquiera de las proteínas ORF2 del PCV2 descritas precedentemente, preferentemente a las concentraciones descritas precedentemente, ii) al menos una porción del vector viral que expresa dicha proteína ORF2 del PCV2, iii) 40 una porción del cultivo celular, iv) un agente de inactivación para inactivar el vector viral recombinante, preferente-mente es BEI, y v) un agente de neutralización para detener la inactivación mediada por el agente de inactivación, preferentemente tiosulfato de sodio en cantidades equivalentes a BEI; y vi) un adyuvante adecuado, preferentemen-te Carbopol 971 en las cantidades descritas precedentemente; donde aproximadamente un 90% de los componen-tes i) a iii) tienen un tamaño menor que 1 µm. De acuerdo con un aspecto adicional, esta composición inmunogénica 45 comprende además una sal aceptable para uso farmacéutico, preferentemente una sal de fosfato a concentraciones aceptables para uso fisiológico. Preferentemente, el pH de dicha composición inmunogénica se ajusta a un pH fisio-lógico, o sea entre 6,5 y 7,5 aproximadamente.

Por lo tanto, la presente divulgación también se relaciona con una composición inmunogénica que comprende por cada ml i) al menos 1,6 µg de la proteína ORF2 del PCV2 descrita precedentemente, ii) al menos una porción de 50 baculovirus que expresa dicha proteína ORF2 del PCV2, iii) una porción del cultivo celular, iv) BEI entre 2 y 8 mM aproximadamente, v) tiosulfato de sodio en cantidades equivalentes a BEI; y vi) aproximadamente 1 mg de Carbopol 971, y vii) sal de fosfato a una concentración aceptable para uso fisiológico; donde aproximadamente un 90% de los componentes i) a iii) son de un tamaño menor que 1 µm y el pH de dicha composición inmunogénica se ajusta en 6,5 a 7,5 aproximadamente. 55

Las composiciones inmunogénicas pueden incluir además uno o más agentes inmunomoduladores adicionales tales como, por ejemplo, interleuquinas, interferones u otras citoquinas. Las composiciones inmunogénicas también pue-den incluir Gentamicina y Mertiolate. Aunque las cantidades y concentraciones de los adyuvantes y aditivos que son

de utilidad en el contexto de la presente invención pueden ser determinadas fácilmente por el especialista, la presen-te divulgación contempla composiciones que comprenden entre aproximadamente 50 µg y aproximadamente 2000 µg de adyuvante y preferentemente una dosis de 250 µg/ml aproximadamente de la composición de vacuna. La pre-sente divulgación contempla composiciones de vacuna que comprenden entre aproximadamente 1 µg/ml y aproxi-madamente 60 µg/ml de antibióticos, y más preferentemente menos que 30 µg/ml aproximadamente de antibióticos. 5

Por lo tanto, la presente divulgación también se relaciona con una composición inmunogénica que comprende i) cualquiera de las proteínas ORF2 del PCV2 descritas precedentemente, preferentemente a las concentraciones descritas precedentemente, ii) al menos una porción del vector viral que expresa dicha proteína ORF2 del PCV2, iii) una porción del cultivo celular, iv) un agente de inactivación para inactivar el vector viral recombinante, preferente-mente es BEI, y v) un agente de neutralización para detener la inactivación mediada por el agente de inactivación, 10 preferentemente es tiosulfato de sodio en cantidades equivalentes a BEI; vi) un adyuvante adecuado, preferente-mente es Carbopol 971 en las cantidades descritas precedentemente; vii) una concentración aceptable para uso farmacéutico de una solución amortiguadora salina, preferentemente de una sal de fosfato, y viii) un agente anti-microbiológico activo; donde aproximadamente un 90% de los componentes i) a iii) son de un tamaño menor que 1 µm. 15

Se ha encontrado sorprendentemente que la composición inmunogénica provista en la presente era muy estable so-bre un período de 24 meses. También se ha encontrado que las composiciones inmunogénicas provistas en la pre-sente, que comprenden la proteína ORF2 del PCV2 recombinante, expresada en el baculovirus, provista en la pre-sente son muy eficaces para reducir los síntomas clínicos asociados con las infecciones por PCV2. Se ha encontra-do sorpresivamente que las composiciones inmunogénicas que comprenden la proteína ORF2 del PCV2 recombi-20 nante expresada en el baculovirus provista en la presente, son más eficaces que una composición inmunogénica que comprende al virus PCV2 completo en una forma inactivada o un antígeno ORF2 del PCV2 viral aislado. En par-ticular, se ha encontrado sorpresivamente que la proteína ORF2 del PCV2 recombinante expresada en el baculovi-rus es eficaz a concentraciones muy bajas, lo que significa concentraciones de hasta 0,25 µg/dosis. Este potencial inmunogénico inesperadamente alto de la proteína ORF2 del PCV2 podría incrementarse con la adición de Car-25 bopol.

Un aspecto adicional se relaciona con un envase que comprende al menos una dosis de la composición inmunogé-nica de la proteína ORF2 del PCV2 provista en la presente, donde una dosis comprende al menos 2 µg de la proteí-na ORF2 del PCV2, preferentemente entre 2 y 16 µg de proteína ORF2 del PCV2. Dicho envase puede comprender entre 1 y 250 dosis de la composición inmunogénica, preferentemente contiene 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200 ó 250 30 dosis de la composición inmunogénica de la proteína ORF2 del PCV2. Preferentemente, cada uno de los envases que comprende más de una dosis de la composición inmunogénica de proteína ORF2 del PCV2 comprende además un agente anti-microbiológico activo. Dichos agentes son, p.ej., antibióticos incluyendo Gentamicina y Mertiolate y semejantes. Por lo tanto, un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a un envase que comprende en-tre 1 y 250 dosis de la composición inmunogénica de la proteína ORF2 del PCV2, donde una dosis comprende al 35 menos 2 µg de proteína ORF2 del PCV2, y Gentamicina y/o Mertiolate, preferentemente entre aproximadamente 1 µg/ml y aproximadamente 60 µg/ml de antibióticos y más preferentemente menos que 30 µg/ml aproximadamente.

Un aspecto adicional se relaciona con un kit que comprende cualquiera de los envases, descritos precedentemente, y un manual de instrucciones, incluyendo la información para la aplicación intramuscular de al menos una dosis de la composición inmunogénica de la proteína ORF2 del PCV2 a lechones para disminuir la gravedad de los síntomas 40 clínicos asociados con una infección por PCV2. Más aún, de acuerdo con un aspecto adicional, dicho manual de ins-trucciones comprende la información de una segunda o más administración(es) de al menos una dosis de la compo-sición inmunogénica de ORF2 del PCV2, donde dicha segunda administración o cualquiera administración adicional es al menos 14 días posterior a la administración inicial o anterior. Preferentemente, dicho manual de instrucciones también incluye la información para administrar un estimulante inmunológico. Preferentemente, dicho estimulante 45 inmunológico será administrado al menos dos veces. Preferentemente, hay al menos 3, más preferentemente al me-nos 5, aún más preferentemente al menos 7 días entre la primera y la segunda administración o cualquier adminis-tración adicional del estimulante inmunológico. Preferentemente, el estimulante inmunológico es administrado al me-nos 10 días, preferentemente 15, aún más preferentemente 20, aún más preferentemente al menos 22 días después de la administración inicial de la composición inmunogénica de la proteína ORF2 del PCV2. Un estimulante inmuno-50 lógico preferido es, por ejemplo, hemocianina de lapa (KLH), preferentemente emulsionada con adyuvante incomple-to de Freund (KLH/ICFA). Sin embargo, se debe tener en cuenta que también se puede usar cualquier otro estimu-lante inmunológico conocido por los especialistas en la técnica. Un “estimulante inmunológico”, tal como se lo utiliza en la presente, significa cualquier agente o composición que pueda desencadenar la respuesta inmune, preferente-mente sin iniciar o incrementar una respuesta inmune específica, p.ej. la respuesta inmune contra un patógeno es-55 pecífico. Se indica además administrar el estimulante inmunológico a una dosis adecuada. Más aún, el conjunto de elementos también puede comprender un envase, que incluye al menos una dosis del estimulante inmunológi-co,preferentemente una dosis de KLH o KLH/ICFA.

Más aún, también se ha encontrado sorprendentemente que el potencial inmunogénico de las composiciones inmu-nogénicas que comprenden la proteína ORF2 del PCV2 recombinante expresada en el baculovirus, preferentemente 60

en combinación con Carbopol, puede ser mejorado aún más mediante la administración de la vacuna IngelVac PRRS MLV (véase el Ejemplo 5). Los signos clínicos de PCV2 y las manifestaciones de enfermedad se magnifican cuando hay una infección por PRRS. Sin embargo, las composiciones inmunogénicas y las estrategias de vacuna-ción provistas en la presente disminuye este efecto en gran parte y más de los esperado. En otras palabras, se ob-servó un efecto sinérgico inesperado cuando los animales, preferentemente cerdos,son tratados con cualquiera de 5 las composiciones inmunogénicas con ORF2 PCV2, provistas en la presente, y la vacuna Ingelvac PRRS MLV (Boehringer Ingelheim).

Por lo tanto, un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a un kit descrito precedentemente, que com-prende la composición inmunogénica de ORF2 del PCV2 provista en la presente y el manual de instrucciones, don-de dicho manual de instrucciones incluye además la información para administrar la composición inmunogénica de 10 ORF2 del PCV2 junto con una composición inmunogénica que comprende un antígeno PRRS, preferentemente un antígeno PRRS con adyuvante. Preferentemente, el adyuvante para el antígeno PRRS es Carbopol. Preferentemen-te, el antígeno PRRS es IngelVac® PRRS MLV (Boehringer Ingelheim).

Un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere también a un kit que comprende i) un envase que contie-ne al menos una dosis de la composición inmunogénica de ORF2 del PCV2 provista en la presente, y ii) un envase 15 que contiene una composición inmunogénica que comprende un antígeno PRRS, preferentemente un antígeno PRRS con adyuvante. Preferentemente, el adyuvante para el antígeno PRRS es Carbopol. Preferentemente el antí-geno PRRS es IngelVac® PRRS MLV (Boehringer Ingelheim). Más preferentemente, el kit comprende además un manual de instrucciones, incluyendo la información para administrar ambas composiciones farmacéuticas. Preferen-temente, provee la información que la composición que contiene ORF2 del PCV2 es administrada temporalmente 20 antes que la composición que contiene PRRS.

Un aspecto adicional se relaciona con el uso de cualquiera de las composiciones provistas en la presente como un medicamento, preferentemente como un medicamento veterinario, con mayor preferencia aún como una vacuna. Más aún, la presente divulgación también se refiere al uso de cualquiera de las composiciones descritas en la pre-sente, para preparar un medicamento para disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con una infec-25 ción por PCV2. Preferentemente, el medicamento es para prevenir una infección por PCV2, aún más preferentemen-te en lechones.

Un aspecto adicional se refiere a un método para (i) prevenir una infección, o una reinfección, con PCV2 o (ii) redu-cir o eliminar los síntomas clínicos causados por PCV2 en un sujeto, que comprende administrar cualquiera de las composiciones inmunogénicas provistas en la presente a un sujeto que lo necesita. Preferentemente, el sujeto es un 30 cerdo. Preferentemente, la composición inmunogénica se administra por vía intramuscular. Preferentemente, se ad-ministra una dosis o dos dosis de la composición inmunogénica, donde una dosis comprende preferentemente al menos 2 µg de proteína ORF2 del PCV2 aproximadamente, aún más preferentemente entre aproximadamente 2 y aproximadamente 16 µg y al menos entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 5 mg de Carbopol, con prefe-rencia 1 mg de Carbopol aproximadamente. Un aspecto adicional se refiere a un método de tratamiento descrito 35 precedentemente, donde se administra una segunda aplicación de la composición inmunogénica. Preferentemente, la segunda administración es con la misma composición inmunogénica, que preferentemente contiene la misma can-tidad de proteína ORF2 del PCV2. Preferentemente, la segunda administración también es por vía intramuscular. Preferentemente, la segunda administración tiene lugar al menos 14 días después de la administración inicial, aún más preferentemente al menos 4 semanas después de la administración inicial. 40

De acuerdo con un aspecto adicional, el método de tratamiento también puede comprender la administración de un estimulante inmunológico. Preferentemente, dicho estimulante inmunológico es administrado al menos dos veces. Preferentemente, hay al menos 3, más preferentemente al menos 5 días, aún más preferentemente al menos 7 días entre la primera y la segunda administración del estimulante inmunológico. Preferentemente, el estimulante inmuno-lógico es administrado al menos 10 días, preferentemente 15, aún más preferentemente 20, aún más preferente-45 mente al menos 22 días después de la administración inicial de la composición inmunogénica ORF2 del PCV2. Un estimulante inmunológico preferido es, por ejemplo, hemocianina de lapa (KLH), preferentemente en una emulsión con adyuvante incompleto de Freund (KLH/ICFA). Sin embargo, se debe tener en cuanta que también se puede usar cualquier otro estimulante inmunológico conocido por los especialistas en la técnica. Es propio del conocimiento ge-neral de los especialistas en la técnica administrar el estimulante inmunológico a una dosis adecuada. 50

De acuerdo con un aspecto adicional, el método de tratamiento descrito precedentemente también comprende la administración del antígeno PRRS. Preferentemente, el antígeno PRRS se formula con el adyuvante Carbopol. Pre-ferentemente el antígeno PRRS es IngelVac® PRRS MLV (Boehringer Ingelheim). Preferentemente, dicho antígeno PRRS es administrado temporalmente después de administrar la composición inmunogénica de la proteína ORF2 PCV2. 55

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 es un diagrama de flujo esquemático de una construcción preferida del baculovirus recombinante de

ORF2 del PCV2; y

las figuras 2a y 2b son diagramas de flujo esquemáticos de cómo producir una composición para uso acorde con la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

En los siguientes ejemplos se describen materiales y procedimientos preferidos para uso de acuerdo con la presente 5 invención. Sin embargo, se comprenderá que estos ejemplos solamente se ofrecen a efectos ilustrativos y ningún contenido en los mismos debe considerarse como una limitación del alcance general de la invención que se define por las reivindicaciones.

EJEMPLO 1

Este ejemplo compara los rendimientos relativos de ORF2 usando los métodos según se describen en esta memoria 10 junto con métodos que son conocidos en la técnica anterior. Se sembraron cada uno de cuatro matrazs rotatorios de 1000 ml con aproximadamente 1,0 x 106 células Sf+/ml en 300 mL de medio de insecto libre de suero, Excell 420 (JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS). El cultivo celular maestro se identifica como solución madre de células maes-tras SF+ (Spodoptera frugiperda), pasaje 19, Lote Nº N112-095W. Las células usadas para generar la solución ma-dre de células maestras SF+ se obtuvieron de Protein Sciences Corporation, Inc., Meriden, CT. La línea celular SF+ 15 para este ejemplo se confinó entre los pasajes 19 y 59. Otros pasajes también funcionan bien a los efectos de la presente invención, pero con el fin de llevar el proceso a una escala de producción mayor, probablemente sean ne-cesarios al menos 19 pasajes y los pasajes posteriores a 59 pueden tener efectos sobre la expresión, aunque esto no se investigó. Con mayor detalle, los cultivos celulares iniciales de SF+ luego del almacenamiento en nitrógeno lí-quido se cultivaron en medio Excell 420 en suspensión en matrazs rotatorios estériles bajo agitación constante. Los 20 cultivos crecieron en matrazs rotatorios de 100 mL a 250 mL con 25 a 150 mL de medio Excell 420 sin suero. Cuan-do las células se habían multiplicado hasta una densidad celular de 1,0-8,0 x 106 células/mL, se repartieron en nue-vos recipientes con una densidad de siembra de 0,5-1,5 x 106 células/mL. Los subsiguientes cultivos de expansión se cultivaron en matrazs rotatorios cuyo tamaño era de hasta 36 litros o en biorreactores de acero inoxidable de has-ta 300 litros por un período de 2-7 días a 25-29°C. 25

Después de la siembra, los matrazs fueron incubados a 27°C por cuatro horas. A continuación, en cada matraz se sembró baculovirus recombinante que contiene el gen de la ORF2 del PCV2 (SEQ ID Nº: 4). El baculovirus recombi-nante que contiene el gen de la ORF2 del PCV2 fue generado de la siguiente manera: el gen de la ORF2 del PCV2 de una cepa de PCV2 de EE.UU. fue amplificado por PCR para contener una secuencia de Kozak 5’ (SEQ ID Nº: 1) y un sitio EcoR1 3’ (SEQ ID Nº: 2), clonado en el vector pGEM-T-Easy (Promega, Madison, WI). Después, se recortó 30 y subclonó en el vector de transferencia pVL1392 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). La porción subclo-nada está representada aquí en la SEQ ID Nº: 7. El plásmido pVL1392 que contiene al gen de ORF2 del PCV2 se denominó N47-064Y y luego se cotransfectó con el ADN del baculovirus BaculoGold® (BD Biosciences Pharmingen) en células de insecto Sf+ (Protein Sciences, Meriden, CT) para generar el baculovirus recombinante que contiene al gen de ORF2 del PCV2. La nueva construcción se provee aquí en la SEQ ID Nº: 8. El baculovirus recombinante que 35 contiene al gen de ORF2 del PCV2 se purificó en placa y se propagó un virus semilla maestro [Master Seed Virus] (MSV) sobre la línea celular SF+, se tomaron alícuotas y se guardaron a –70 ºC. El MSV se identificó positivamente como baculovirus ORF2 del PCV2 por PCR-RFLP usando cebadores específicos del baculovirus. Las células de in-secto infectadas con el baculovirus ORF2 del PCV2 para generar el MSV o virus semilla de trabajo [Working Seed Virus] expresan al antígeno ORF2 del PCV2 según se detectó con anticuerpos policlonales séricas o monoclonales 40 en un ensayo con anticuerpos fluorescentes indirecto. Además, la identidad del baculovirus ORF2 del PCV2 se con-firmó por secuenciación de los aminoácidos N-terminales. El baculovirus ORF2 del PCV2 MSV también fue evaluado por su pureza de acuerdo con 9 C.F.R. 113.27 (c), 113.28 y 113.55. Cada baculovirus recombinante sembrado en los matrazs rotatorios tenían multiplicidades de infección (MOI) variables. En el Matraz 1 se sembraron 7,52 mL de semilla 0,088 MOI; en el matraz 2 se sembraron 3,01 mL de semilla 0,36 MOI; en el matraz 3 se sembraron 1,5 mL 45 de semilla 0,18 MOI; y en el matraz 4 se sembraron 0,75 mL de semilla 0,09 MOI. En la figura 1 se provee un dia-grama de flujo esquemático que ilustra los pasos básicos usados para la construcción de un baculovirus ORF2 del PCV2 recombinante.

Después de sembrar los baculovirus, los matrazs se incubaron a 27 ± 2°C durante 7 días y también se agitaron a 100 rpm durante dicho tiempo. Los matrazs estaban equipados con tapas ventiladas para permitir el flujo de aire. Se 50 tomaron muestras de cada matraz cada 24 horas durante los 7 días siguientes. Después de la extracción, cada muestra se centrifugó, se separó el sedimento del sobrenadante y luego se microfiltró a través de una membrana cuyo tamaño de poro era de 0,45-1,0 µm.

A continuación, se determinó la cantidad de ORF2 presente en las muestras resultantes mediante un ensayo de ELISA. El ensayo de ELISA se realizó con el anticuerpo de captura anti-PCV2 Pab IgG Prot. G de porcinos purifica-55 do (diluido 1:250 en PBS) diluido a 1:6000 en solución tampón carbonato 0,05 M (pH 9,6). Luego se introdujeron 100 µL del anticuerpo en los pocillos de la placa de microtitulación, se sellaron las placas y se incubaron durante la no-

che a 37°C. La placa se lavó después tres veces con una solución de lavado que comprendía 0,5 mL de Tween 20 (Sigma, St. Louis, MO), 100 mL de D-PBS 10X (Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA) y 899,5 mL de agua destilada. A continuación, se agregaron 250 µL de una solución de bloqueo (5 g de leche en polvo descremada Carnation (Nestle, Glendale, CA) en 10 mL de D-PBS y cantidad necesario hasta llevar a 100 mL de agua destilada) a cada uno de los pocillos. La siguiente etapa comprendía lavar la placa de prueba y luego agregar el antígeno diluido pre-5 viamente. El antígeno pre-diluido se obtuvo por adición de 200 µL de solución diluyente (0,5 mL de Tween 20 en 999,5 mL de D-PBS) a cada uno de los pocillos sobre una placa de dilución. A continuación, la muestra se diluyó a una relación de 1:240 y a una relación de 1:480 y luego se agregaron 100 µL de cada una de estas muestras dilui-das a uno de los pocillos superiores de la placa de dilución (es decir, un pocillo superior recibió 100 µL de la dilución 1:240 y la otra recibió 100 µL de la dilución 1:480). Después se efectuaron diluciones en serie para el resto de la pla-10 ca retirando 100 µL de cada pocillo sucesivo y transfiriéndolos al siguiente pocillo de la placa. Se mezcló el conteni-do de cada pocillo antes de efectuar la transferencia siguiente. El lavado de la placa de prueba incluyó tres lavados de la placa con la solución tampón de lavado. La placa se selló luego y se incubó durante una hora a 37°C antes de lavarla otras tres veces con la solución tampón de lavado. El anticuerpo de detección usado era un anticuerpo mo-noclonal contra PCV ORF2. Se diluyó a 1:300 en solución diluyente y luego se agregaron 100 µL de anticuerpo de 15 detección diluido a los pocillos. A continuación, se selló la placa y se incubó durante una hora a 37°C antes de lavar-la tres veces con la solución tampón de lavado. Luego se preparó diluyente de conjugación por adición de suero de conejo normal (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) a la solución diluyente hasta una concentración del 1%. El anticuerpo conjugado anti-(H+l) de ratón de cabra-HRP (Jackson Immunoresearch) se diluyó en el diluyente de conjugación hasta 1:10.000. Después se agregaron 100 µL del anticuerpo conjugado diluido a cada uno de los poci-20 llos. La placa se selló y se incubó durante 45 minutos a 37°C antes de lavarla tres veces con la solución tampón de lavado. Se agregaron 100 µL de sustrato (sustrato de peroxidasa TMB, Kirkgaard y Perry Laboratories (KPL), Gai-thersberg, MD), mezclado con un volumen igual de sustrato de peroxidasa B (KPL) a cada uno de los pocillos. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación se agregaron 100 µL de solución de HCl 1 N a todos los pocillos para detener la reacción. La placa se pasó luego por un lector para ELISA. Los resulta-25 dos de este ensayo se muestran en la siguiente Tabla 1:

Tabla 1

Día: Matraz ORF2 en sedimento (µg) ORF2 en sobrenadante (µg)

3: 1 47,53 12

3: 2 57,46 22

3
3: 53,44 14

3: 4 58,64 12

4: 1 43,01 44

4: 2 65,61 62

4: 3 70,56 32

4
4: 64,97 24

5: 1 31,74 100

5: 2 34,93 142

5: 3 47,84 90

5: 4 55,14 86

6: 1 14,7 158

6: 2 18,13 182

6: 3 34,78 140

6: 4 36,88 146

7: 1 6,54 176

7: 2 12,09 190

7: 3 15,84 158

7: 4 15,19 152

Estos resultados indican que cuando se prolonga el tiempo de incubación, la expresión de ORF2 hacia el sobrena-dante de las células y medio centrifugados es mayor que la expresión en el sedimento de las células y medio centri-30 fugados. Por consiguiente, si se deja que la expresión de ORF2 avance durante al menos 5 días y se lo recupera en el sobrenadante en lugar de dejar que la expresión avance por menos de 5 días y recuperar el ORF2 de las células, provee un gran incremento en los rendimientos de ORF2 y una mejora significativa con respecto a los métodos ante-riores.

35

EJEMPLO 2

En este ejemplo se proveen datos sobre la eficacia de las vacunas descritas en esta memoria. En un matraz rotato-rio de 1000 mL se sembraron aproximadamente 1,0 x 106 células Sf+/ml en 300 mL de medio Excell 420. El matraz se incubó luego a 27°C y se agitó a 100 rpm. A continuación, en el matraz se sembraron 10 mL de virus semilla ORF2 PCV2/Bac p+6 (el baculovirus recombinante que contiene al gen de la ORF2 del PCV2 de 6 pasajes adiciona-40 les en las células de insecto Sf9) con 0,1 MOI después de 24 horas de incubación.

El matraz se incubó luego a 27°C durante un total de 6 días. Después de la incubación, el matraz se centrifugó y se cosecharon tres muestras del sobrenadante resultante y se inactivaron. El sobrenadante se inactivó llevando su temperatura a 37 ± 2°C. Para la primera muestra, se agregó una solución 0,4 M de bromhidrato de 2-bromoetilenamina que había sido ciclado en etilenimina binaria 0,2 M (BEI) en NaOH 0,3 N al sobrenadante para ob-5 tener una concentración final de BEI de 5 mM. Para la segunda muestra, se agregó BEI 10 mM al sobrenadante. Pa-ra la tercera muestra, no se agregó BEI al sobrenadante. Las muestras se agitaron luego de forma continua durante 48 h. Se agregó una solución 1,0 M de tiosulfato de sodio para obtener una concentración mínima final de 5 mM con el fin de neutralizar toda BEI residual. Después se determinó la cantidad de ORF2 en cada muestra usando el mismo procedimiento de ensayo ELISA que se describió en el ejemplo 1. Los resultados se pueden observar en la siguiente 10 Tabla 2:

Tabla 2

Muestra: ORF2 en sobrenadante (µg)

1: 78,71

2: 68,75

3: 83,33

Este ejemplo demuestra que la neutralización con BEI no elimina o degrada cantidades significativas de producto de proteína ORF2 del PCV2 recombinante. Esto queda evidenciado por el hecho que no hay una gran pérdida de ORF2 15 en el sobrenadante del BEI o temperaturas elevadas. Los especialistas en la técnica comprenderán que el ORF2 re-cuperados es un producto proteico estable.

EJEMPLO 3 Este ejemplo demuestra que el método descrito en esta memoria puede llevarse a escala desde una producción a pequeña escala de ORF2 del PCV2 recombinante a una producción a gran escala de ORF2 del PCV2 recombinante. 20 Se introdujeron 5,0 x 105 células/ml de células SF+/ml en 7000 mL de medio ExCell 420 en un Biorreactor Applikon de 20000 mL. El medio y las células se incubaron luego a 27°C y se agitaron a 100 RPM durante las siguientes 68 horas. A la hora 68, se agregaron 41,3 mL de ORF2 de PCV2 Baculovirus MSV+3 a 7000 mL de medio ExCell 420. La mezcla resultante se introdujo luego en el biorreactor. Durante los siguientes siete días, la mezcla se incubó a 27°C y se agitó a 100 RPM. Se extrajeron muestras del biorreactor cada 24 horas comenzando el día 4, después de 25 la infección, y se centrifugó cada muestra. Se conservó el sobrenadante de las muestras y se cuantificó la cantidad de ORF2 usando densitometría con SDS-PAGE. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 3:

Tabla 3

Día después de la infección:: ORF2 en sobrenadante (µg/ml)

4: 29,33

5: 41,33

6: 31,33

7: 60,67

30

EJEMPLO 4

En este ejemplo se evalúa la eficacia de siete candidatos de vacunas contra PCV2 y además se definen los paráme-tros de eficacia después de exposición a una cepa virulenta de PCV2. Se dividieron aleatoriamente ciento ocho (108) lechones, nacidos por cesárea, privados de calostro (CDCD), de 9-14 días de vida, en 9 grupos de igual tama-ño. En la Tabla 4 se muestra el diseño general del estudio para este ejemplo. 35

Tabla 4. Diseño general del estudio

Grupo: Nº de cerdos Tratamiento Día de trata-miento KLH/ICF A el día 21 y día 27 Expuestos a PCV2 virulen-to el día 24 Necropsia el día 49

1: 12 Vacuna PCV2 Nº 1-(vORF2 16 µg) 0 + + +

2: 12 Vacuna PCV2 Nº 2-(vORF2 8 µg) 0 + + +

3: 12 Vacuna PCV2 Nº 3-(vORF2 4 µg) 0 + + +

4: 12 Vacuna PCV2 Nº 4-(rORF2 16 µg) 0 + + +

5: 12 Vacuna PCV2 Nº 5-(rORF2 8 µg) 0 + + +

6: 12 Vacuna PCV2 Nº 6-(rORF2 4 µg) 0 + + +

7: 12 Vacuna PCV2 Nº 7-(Virus comple-tos muertos) 0 + + +

8: 12 Controles no ex-puestos N/D + + +

9: 12 Grupo control ne-gativo no estricto N/D + - +

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 de baculovirus recombinante expresado; virus completos muertos = vi-rus PCV2 cultivados en un cultivo celular adecuado

Siete de los grupos (Grupos 1-7) recibieron dosis del polipéptido ORF2 PCV2, uno de los grupos actuó como un con-trol de prueba y no recibió ORF2 PCV2 y otro grupo actuó como grupo control negativo estricto y tampoco recibió ORF2 PCV2. El día 0, los grupos 1 a 7 fueron tratados con las vacunas asignadas. Los lechones en el grupo 7 reci-5 bieron un tratamiento de refuerzo el día 14. Se observó la aparición de efectos adversos en los lechones, así como reacciones en el sitio de inyección después de la vacunación y el día 19 los lechones fueron trasladados al segundo sitio de estudio. En el segundo sitio de estudio, los grupos 1-8 fueron albergados en una instalación, en tanto el gru-po 9 fue albergado en una instalación separada. Todos los cerdos recibieron hemocianina de lapa (KLH)/adyuvante incompleto de Freund (ICFA) los días 21 y 27 y el día 24, los grupos 1-8 fueron expuestos a un PCV2 virulento. 10

Se recolectaron muestras de sangre antes y después de la exposición para determinar la serología de PCV2. Des-pués de la exposición, se recolectaron los datos de peso corporal para determinar la ganancia de peso diario pro-medio (ADWG), y los síntomas clínicos, así como muestras de hisopados nasales para determinar el exudado nasal de PCV2. El día 49, se realizó la necropsia de los 15 cerdos que sobrevivieron, se calificaron las lesiones de los pulmones y se conservaron algunos tejidos selectos en formalina para efectuar posteriormente las pruebas de inmu-15 nohistoquímica (IHC).

Materiales y métodos

Este era un estudio de viabilidad frente a una exposición a vacunación parcialmente ciego realizado con cerdos CDCD, de 9 a 14 días de vida el día 0. Para su inclusión en el estudio, los títulos de IFA PCV2 de cerdas eran = 1:1000. Además, el estado serológico de las cerdas era de una piara negativa para PRRS conocida. Se evaluó el es-20 tado serológico de PCV2 de veintiocho (28) cerdas. Catorce (14) cerdas tenía un título de PCV2 = 1000 y fueron transferidas al primer sitio de estudio. Ciento diez (110) lechones nacieron mediante cirugía cesárea y estaban dis-ponibles para este estudio el día -4. El día -3, se pesaron 108 cerdos CDCD en el primer sitio de estudio, se identifi-caron mediante rótulos de oreja, bloqueados por el por peso y luego fueron asignados aleatoriamente a 1 de 9 gru-pos, como se mostró anteriormente en la tabla 4. Si alguno de los animales de prueba que había cumplido con los 25 criterios de inclusión era enrolado en el estudio y posteriormente excluido del mismo por cualquier motivo, se notifi-caba al Investigador y Monitor con el fin de determinar el uso de los datos recolectados del animal en el análisis final. Se registró la fecha en que los lechones enrolados eran excluidos y la razón de dicha exclusión. Inicialmente, no se excluyó ninguna cerda. Un total de 108 de los 110 cerdos disponibles fueron asignados aleatoriamente a uno de los 9 grupos el día -3. Los dos cerdos más pequeños (Nº 17 y 19) no fueron asignados a ningún grupo y quedaron a 30 disposición en caso de necesitarlos. Durante el transcurso del estudio, se retiraron varios animales. Cada uno de los siguientes cerdos fueron encontrados muertos antes de la exposición: el cerdo 82 (grupo 9) el día -1,el cerdo Nº 56 (grupo 6) el día 3,el cerdo Nº 53 (grupo 9) el día 4,el cerdo Nº 28 (grupo 8) el día 8,el cerdo Nº 69 (grupo 8) el día 7 y el cerdo Nº 93 (grupo 4) el día 9. Estos seis cerdos no se incluyeron en los resultados finales del estudio. El cerdo no 17 (uno de los cerdos disponibles) fue asignado al Grupo 9. El cerdo disponible restante, Nº 19, se excluyó del estu-35 dio.

Las formulaciones administradas a cada uno los grupos fueron: el grupo 1 fue asignado para recibir 1 ml de ORF2 viral (vORF2) que contiene 16 µg de ORF2/ml. Esto se obtuvo mezclando 10,24 ml de ORF2 viral (256 µg/25 µg/ml = 10,24 ml vORF2) con 3,2 ml de Carbopol al 0,5% y 2,56 ml de solución tampón fosfato salina a un pH de 7,4. Esto permitió obtener 16 ml de formulación para el grupo 1. El grupo 2 fue asignado para recibir 1 ml de vORF2 que con-40 tiene 8 µg de vORF2/ml. Esto se obtuvo mezclando 5,12 ml de vORF2 (128 µg/25 µg/ml = 5,12 ml vORF2) con 3,2 ml de Carbopol al 0,5% y 7,68 ml de solución tampón fosfato salina a un pH de 7,4. Esto permitió obtener 16 ml de formulación para el grupo 2. El grupo 3 fue asignado para recibir 1 ml de vORF2 que contiene 4 µg de vORF2/ml. Esto se obtuvo mezclando 2,56 ml de vORF2 (64 µg/25 µg/ml = 2,56 ml vORF2) con 3,2 ml de Carbopol al 0,5% y 10,24 ml de solución tampón fosfato salina a un pH de 7,4. Esto permitió obtener 16 ml de formulación para el grupo 45 3. El grupo 4 fue asignado para recibir 1 ml de ORF2 recombinante (rORF2) que contiene 16 µg de rORF2/ml. Esto se obtuvo mezclando 2,23 ml de rORF2 (512 µg/230 µg/ml = 2,23 ml rORF2) con 6,4 ml de Carbopol al 0,5% y 23,37 ml de solución tampón fosfato salina a un pH de 7,4. Esto permitió obtener 32 ml de formulación para el grupo 4. El grupo 5 fue asignado para recibir 1 ml de rORF2 que contiene 8 µg de rORF2/ml. Esto se obtuvo mezclando 1,11 ml de rORF2 (256 µg/230 µg/ml = 1,11 ml rORF2) con 6,4 ml de Carbopol al 0,5% y 24,49 ml de solución tampón fosfa-50 to salina a un pH de 7,4. Esto permitió obtener 32 ml de formulación para el grupo 5. El grupo 6 fue asignado para recibir 1 ml de rORF2 que contiene 8 µg de rORF2/ml. Esto se obtuvo mezclando 0,56 ml de rORF2 (128 µg/230 µg/ml = 0,56 ml rORF2) con 6,4 ml de Carbopol al 0,5% y 25,04 ml de solución tampón fosfato salina a un pH de 7,4.

Esto permitió obtener 32 ml de formulación para el grupo 6. El grupo 7 fue asignado para recibir 2 ml de vacuna de células enteras muertas de PCV2 (PCV2 KV) que contiene al MAX PCV2 KV. Esto se obtuvo mezclando 56 ml de PCV2 KV con 14 ml de Carbopol al 0,5%. Esto permitió obtener 70 ml de formulación para el grupo 7. Finalmente, el grupo 8 fue asignado para recibir KLH a 0,5 µg/ml o 1,0 µg/ml por dosis de 2 ml. Esto se obtuvo mezclando 40,71 ml de KLH (7,0 µg proteína/ml a 0,5 µg/ml = 570 ml (7,0 µg/ml)(x) = (0,5)(570 ml)), 244,29 ml solución tampón fosfato 5 salina a un pH de 7,4 y 285 ml de adyuvante de Freund. En la tabla 5 se describen los tiempos para las principales actividades de este ejemplo.

Tabla 5. Actividades del estudio

Día del estudio: Actividad del estudio

-4, 0 a 49: Observaciones generales sobre el estado de salud general y síntomas clíni-cos

-3: Peso; asignación aleatoria en grupos; recolección de muestras de sangre de todos los cerdos

0: Examen de salud; administración de IVP Nº 1-7 a los grupos 1-7, respecti-vamente

0-7: Observación de los cerdos por reacciones en el sitio de inyección

14: Grupo 7 reforzado con la vacuna PCV2 Nº 7; recolección de muestras de sangre de todos los cerdos

14-21: Observación del grupo 7 por reacciones en el sitio de inyección

16-19: Tratamiento de todos los cerdos con antibióticos (faltan los datos)

19: Transporte de los cerdos desde el primer sitio de prueba al segundo sitio de prueba

21: Tratamiento de los grupos 1-9 con KLH/ICFA

24: Recolección de muestras de sangre y de hisopados nasales de todos los cerdos; peso de todos los cerdos; exposición de los grupos 1-8 con material de exposición de PCV2

25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47: Recolección de muestras de hisopados nasales de todos los cerdos

27: Tratamiento de los grupos 1-9 con KLH/ICFA

31: Recolección de muestras de sangre de todos los cerdos

49: Recolección de muestras de sangre y de hisopados nasales de todos los cerdos; peso de todos los cerdos; necropsia de todos los cerdos; registro de lesiones visibles con especial énfasis en ictericia y úlceras gástricas; eva-luación de lesiones en los pulmones; reserva de muestras de tejido fresco y fijado en formalina; fase en-vida del estudio completada

10

Una vez completada la fase en-vida del estudio, se examinaron los tejidos fijados en formalina mediante inmunohis-toquímica (IHC) para que el patólogo pudiera detectar el antígeno PCV2, se evaluaron las muestras de sangre por la serología de PCV2, se evaluaron las muestras de hisopados nasales por el exudado de PCV2 y se determinó la ga-nancia de peso diario promedio (ADWG) entre el día 24 y el día 49.

Los animales fueron albergados en el primer sitio de estudio en jaulas individuales en cinco habitaciones desde el 15 nacimiento y hasta los 11 días de vida aproximadamente (día 0 del estudio aproximadamente). Cada habitación era idéntica en cuanto a disposición y consistía de jaulas de acero inoxidable individuales apiladas con suministro de ai-re caliente y filtrado por separado para cada unidad de aislamiento. Cada habituación tenía calefacción y ventilación separadas, impidiendo de esa manera la contaminación cruzada de aire entre las habitaciones. Los animales fueron albergados en dos instalaciones diferentes en el segundo sitio de estudio. El grupo 9 (el grupo control negativo es-20 tricto) fue albergado por separado en un galpón de engorde convertido y los grupos 1-8 fueron albergados en un galpón de cría convertido. Cada grupo fue albergado en un corral separado (11-12 cerdos por corral) y cada corral proporcionaba aproximadamente 3,0 pies cuadrados por cerdo. Cada corral se encontraba sobre un suelo elevado con pisos de listones de plástico. Un pozo debajo de los corrales servía como tanque de retención para excrementos y desechos. Cada instalación tenía sus propios sistemas de calefacción y ventilación, con poca probabilidad de con-25 taminación cruzada de aire entre las instalaciones.

En el primer sitio de estudio, los lechones recibieron una ración de leche especialmente formulada desde el naci-miento y hasta aproximadamente las 3 semanas de vida. Todos los lechones consumían una ración sólida, mixta especial al día 19 (4 ½ semanas de vida aproximadamente). En el segundo sitio de estudio, todos los lechones reci-bieron una ración de una mezcla comercial especial sin medicación apropiada para su edad y peso, ad libitum. Tam-30 bién disponían de agua ad libitum en ambos sitios de estudio.

Todos los cerdos de prueba fueron tratados con vitamina E el día -2, con inyecciones de hierro el día -1 y con NAX-CEL® (1,0 mL, IM, en flancos alternantes) los días 16, 17, 18 y 19. Además, el cerdo Nº 52 (grupo 9) fue tratado con una inyección de hierro el día 3, el cerdo 45 (grupo 6) fue tratado con una inyección de hierro el día 11, el cerdo Nº 69 (grupo 8) fue tratado con NAXCEL® el día 6, el cerdo Nº 74 (grupo 3) fue tratado con dexametazona y penicilina 35

el día 14 y el cerdo Nº 51 (grupo 1) fue tratado con dexametazona y penicilina el día 13 y con NAXCEL® el día 14 por diferentes razones de salud.

Mientras permanecían en ambos sitios de estudio, los cerdos se encontraban bajo control veterinario. Los exámenes de salud de los animales se realizaron el día 0 y se registraron en el formulario de registro del examen de salud. To-dos los animales se encontraban en un buen estado de salud y nutrición antes de recibir las vacunas según las ob-5 servaciones efectuadas el día 0. Todos los animales de prueba se encontraban en un buen estado de salud y nutri-cional antes de la exposición. Las carcasas y los tejidos fueron eliminados por cremación. La disposición final de los animales de estudio fue registrada en el registro de baja de animales.

El día 0, los cerdos asignados a los grupos 1-6 recibieron 1,0 mL de las vacunas de PCV2 1-6, respectivamente, IM, en la región izquierda del cuello usando una jeringa tipo Luer estéril de 3,0 mL y una aguja de 20g x ½" estéril. Los 10 cerdos asignados al grupo 7 recibieron 2,0 ml de vacuna PCV2 Nº 7 IM, en la región izquierda del cuello usando una jeringa tipo Luer estéril de 3,0 mL y una aguja 20g x ½” estéril. El día 14, los cerdos asignados al grupo 7 recibieron 2,0 mL de vacuna PCV2 Nº 7 IM, en la región derecha del cuello usando una jeringa tipo Luer estéril de 3,0 mL y una aguja 20g x ½” estéril.

El día 21 todos los cerdos de prueba recibieron 2,0 mL de KLH/ICFA IM en la región del flanco derecho usando una 15 jeringa tipo Luer estéril de 3,0 mL y una aguja 20g x1” estéril. El día 27 todos los cerdos de prueba recibieron 2,0 mL de KLH/ICFA en la región del flanco izquierdo usando una jeringa tipo Luer estéril de 3,0 mL y una aguja 20g x 1” es-téril.

El día 24, los cerdos asignados a los grupos 1-8 recibieron 1,0 mL de material de exposición de prueba PCV2 ISU-VDL (5,11 log10 TCID50/mL), IM, en la región izquierda del cuello usando una jeringa tipo Luer estéril de 3,0 mL y 20 una aguja 20g x 1” estéril. Se administró 1,0 mL adicional del mismo material IN a cada cerdo (0,5 mL por fosa na-sal) usando una jeringa tipo Luer estéril de 3,0 mL y una cánula nasal.

Los cerdos de prueba fueron observados todos los días por su estado de salud general y los efectos adversos el día -4 y desde el día 0 hasta el día 19. Las observaciones fueron registradas en el registro de observación clínica. Todos los cerdos de prueba fueron observados entre el día 0 y el día 7 y el grupo 7 fue monitoreado además entre los días 25 14 y 21, para monitorear las reacciones en el sitio de inyección. La ganancia de peso diario promedio se determinó pesando cada cerdo sobre una balanza calibrada los días -3, 24 y 49, o el día en que el cerdo aparecía muerto des-pués de la exposición. Los pesos corporales fueron registrados en el formulario de peso corporal. Los pesos corpo-rales del día -3 se utilizaron para bloquear los cerdos antes de la asignación aleatoria. Los datos de los pesos del día 24 y del día 49 se utilizaron para determinar la ganancia de peso diario promedio (ADWG) para cada cerdo y para 30 los tiempos definidos. En el caso de los cerdos que murieron después de la exposición y antes del día 49, se ajustó la ADWG para que representara la ADWG desde el día 24 hasta el día de muerte.

Con el fin de determinar la serología de PCV2, se recolectó sangre venosa completa del seno venoso orbital de cada lechón los días -3 y 14. Para cada lechón, se recolectó sangre del seno venoso orbital insertando un tubo capilar es-téril en el canto medial de uno de los ojos y drenando aproximadamente 3,0 mL de sangre completa en un tubo se-35 parador de suero (SST) de 4,0 mL. Los días 24, 31 y 49, se recolectó sangre venosa completa de la vena cava ante-rior de cada cerdo usando una aguja Vacutainer 18g x 1 ½" estéril (Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, Nueva Jersey), un soporte de aguja Vacutainer y un SST de 13 mL. La recolección de sangre en cada tiempo se re-gistró en el registro de recolección de muestras. Se dejó que la sangre coagulara en cada SST, a continuación se centrifugó cada SST y se cosechó el suero. El suero cosechado se transfirió a un tubo Snap estéril y se guardó a –40 70 ± 10°C hasta su evaluación en una fecha posterior. Las muestras de suero fueron evaluadas por la presencia de anticuerpos contra PCV2 por el personal de BIVI-R&D.

Los cerdos fueron monitoreados una vez por día entre el día 20 y el día 49 por los síntomas clínicos y se registraron las observaciones clínicas en el registro de observación clínica.

Para evaluar el exudado nasal de PCV2, los días 24, 25 y luego cada día impar de por medio del estudio hasta el día 45 49 inclusive, se insertó un hisopo de Dacrón estéril por vía intranasal en cualquiera de las fosas nasales izquierda o derecha de cada cerdo (un hisopo por cerdo) tan asépticamente como fuera posible, se giró unos pocos segundos y luego se retiró. Cada hisopo se colocó luego en un tubo de tapa roscada estéril individual que contiene 1,0 mL de medio EMEM con IFBS 2%, 500 unidades/mL de penicilina, 500 µg/mL de estreptomicina y 2,5 µg/mL de Fungizone. Se partió el hisopo del tubo, y el tubo Snap se selló y se rotuló apropiadamente con el número de animal, número de 50 estudio, fecha de recolección, día del estudio e “hisopado nasal”. Los tubos Snap sellados se guardaron a -40 ± 10°C hasta transportarlos por la noche sobre hielo a BIVI-St. Joseph. Las recolecciones de hisopados nasales fue-ron registradas en el formulario de recolección de muestras por hisopado nasal. En BIVI-R&D se efectuaron las pruebas de aislamiento cuantitativo del virus (VI) para PCV2 con las muestras de hisopados nasales. Los resultados se expresaron en valores de log10. Un valor de 1,3 logs o menos era considerado negativo y cualquier valor superior 55 a 1,3 logs era considerado positivo.

Los cerdos que murieron (Nº 28, 52, 56, 69, 82 y 93) en el primer sitio de estudio fueron sometidos a necropsia hasta el nivel necesario como para determinar el diagnóstico. Se registraron las lesiones visibles y no se retuvieron tejidos de estos cerdos. En el segundo sitio de estudio, se efectuó necropsia de los cerdos que murieron antes del día 49 (Nº 45, 23, 58, 35), los cerdos que aparecieron muertos el día 49 antes de sacrificarlos (Nº 2, 43) y los cerdos sacri-ficados el día 49. Se registraron todas las lesiones visibles y también los porcentajes de lóbulos pulmonares con le-5 siones en el formulario de informe de necropsia.

De cada uno de los 103 cerdos a los que se les había efectuado necropsia en el segundo sitio de estudio, se tomó una muestra de tejido de amígdala, pulmón, corazón, hígado, nódulo linfático mesentérico, riñón y nódulo linfático inguinal que se colocó en un envase individual con formalina 10% amortiguada; y otra muestra de tejido de los mis-mos órganos mencionados se colocó en un Whirl-pak (M-Tech Diagnostics Ltd., Thelwall, Reino Unido) y cada Whirl-10 pak se colocó sobre hielo. Cada envase se rotuló apropiadamente. Las recolecciones de muestras se registraron en el formulario de informe de necropsia. Posteriormente, se enviaron las muestras de tejidos fijados en formalina y un formulario de solicitud de diagnóstico para las pruebas de IHC. Las pruebas de IHC se realizaron de acuerdo con los procedimientos de laboratorio ISU estándar para recibir muestras, preparar muestras y portaobjetos y usar las técni-cas de coloración. Los tejidos frescos en los Whirl-pak fueron enviados sobre hielo al Monitor del estudio para su al-15 macenamiento (-70° ± 10 °C) y posible uso futuro. Los tejidos fijados en formalina fueron examinados por un patólo-go para detectar el PCV2 por IHC y se calificaron de acuerdo con el siguiente sistema de puntaje: 0 = ninguno; 1 = escasa coloración positiva, pocos sitios; 2 = coloración positiva moderada, múltiples sitios; y 3 = coloración positiva abundante, difusa en todo el tejido. Debido al hecho que el patólogo no podía diferenciar positivamente el LN ingui-nal del LN mesentérico, los resultados para estos tejidos se rotularon simplemente como nódulo linfático y el puntaje 20 asignado era el puntaje más alto de cada uno de los dos tejidos por animal.

Resultados

Los resultados para este ejemplo se muestran más adelante. Cabe destacar que un cerdo del grupo 9 murió antes del día 0 y 5 cerdos más murieron después de la vacunación (1 cerdo del grupo 4; 1 cerdo del grupo 6; 2 cerdos del grupo 8; y 1 cerdo del grupo 9). Los exámenes de post-mortem indicaron que los seis animales murieron debido a in-25 fecciones subyacentes que no estaban asociados con la vacunación o con PMWS. Además, no se registraron efec-tos adversos o reacciones en el sitio de inyección en ninguno de los grupos.

Los resultados de la ganancia de peso diario promedio (ADWG) se muestran a continuación en la tabla 6.El grupo 9, el grupo control negativo estricto,tenía la ADWG más alta (1,06 ± 0,17 lbs/día),seguido del grupo 5 (0,94 ± 0,22 lbs/día), que recibieron una dosis de 8 µg de rORF2.El grupo 3, que recibió una dosis de 4 µg de vORF2,tenía la 30 ADWG más bajo (0,49 ± 0,21 lbs/día),seguido del grupo 7 (0,50 ± 0,15 lbs/día),que recibió 2 dosis de vacuna de cé-lulas muertas.

Tabla 6. Resumen de la ganancia de peso diario promedio (ADWG) de los grupos

Grupo: Tratamiento N ADWG-lbs/día (día 24 al día 49) o ajustado para los cerdos que murieron antes del día 29

1: vORF2-16 µg (1 dosis) 12 0,87 ± 0,29 lbs/día

2: vORF2-8 µg (1 dosis) 12 0,70 ± 0,32 lbs/día

3: vORF2-4 µg (1 dosis) 12 0,49 ± 0,21 lbs/día

4: rORF2-16 µg (1 dosis) 11 0,84 ± 0,30 lbs/día

5: rORF2-8 µg (1 dosis) 12 0,94 ± 0,22 lbs/día

6: rORF2-4 µg (1 dosis) 11 0,72 ± 0,25 lbs/día

7: KV (2 dosis) 12 0,50 ± 0,15 lbs/día

8: Controles de exposición 10 0,76 ± 0,19 lbs/día

9: Control negativo estricto 11 1,06 ± 0,17 lbs/día

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 de baculovirus recombinante expresado; virus completos muertos = vi-rus PCV2 cultivado en un cultivo celular adecuado 35

Los resultados de la serología de PCV2 se muestran en la siguiente tabla 7. Los nueve grupos eran seronegativos para PCV2 el día -3. El día 14, los grupos que recibieron vacunas vORF2 tenían los títulos más altos, que variaban en un rango entre 187,5 y 529,2. Los cerdos que recibieron la vacuna de virus muerto tenían los siguientes títulos más altos, seguido de los grupos que recibieron vacunas rORF2. Los grupos 8 y 9 permanecieron seronegativos en ese momento. El día 24 y el día 31, los cerdos que recibieron vacunas vORF2 continuaron mostrando una fuerte 40 respuesta serológica, seguido estrechamente por el grupo que recibió dos dosis de vacuna a virus muerto. Los cer-dos que recibieron vacunas rORF2 mostraron una respuesta serológica más lenta y los grupos 8 y 9 continuaron se-ronegativos. El día 49, los cerdos que recibieron la vacuna vORF2, 2 dosis de la vacuna de virus muerto y la menor dosis de rORF2 mostraron las respuestas serológicas más fuertes. Los cerdos que recibieron 16 µg y 8 µg de vacu-nas rORF2 tenían títulos IFA ligeramente más altos que los controles de prueba. El grupo 9 demostró el día 49 una 45 fuerte respuesta serológica.

Tabla 7. Resumen de los títulos de IFA PCV2 de los grupos

TÍTULO IFA PROMEDIO

Grupo: Tratamiento Día –3 Día 14 Día 24 Día 31** Día 49***

1: vORF2-16 µg (1 dosis) 50,0 529,2 4400,0 7866,7 11054,5

2: vORF2-8 µg (1 dosis) 50,0 500,0 3466,7 6800,0 10181,8

3: vORF2-4 µg (1 dosis) 50,0 187,5 1133,3 5733,3 9333,3

4: rORF2-16 µg (1 dosis) 50,0 95,5 1550,0 3090,9 8000,0

5: rORF2-8 µg (1 dosis) 50,0 75,0 887,5 2266,7 7416,7

6: rORF2-4 µg (1 dosis) 50,0 50,0 550,0 3118,2 10570,0

7: KV (2 dosis) 50,0 204,2 3087,5 4620,8 8680,0

8: Controles de prueba 50,0 55,0 50,0 50,0 5433,3

9: Control negativo estricto 50,0 59,1 59,1 54,5 6136,4

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 de baculovirus recombinante expresado; virus completos muertos = vi-rus de PCV2 cultivados en el cultivo celular adecuado

*A efectos de los cálculos, un título de IFA =100 se denominó título de “50"; un título IFA =6400 se denominó título 5 de “12.800".

**Día de la exposición

***Día de la necropsia

Los resultados de las observaciones clínicas después de la exposición se muestran en la siguiente tabla 8. Este re-sumen de los resultados incluye observaciones de conducta anormal, respiración anormal, tos y diarrea. La tabla 9 10 incluye los resultados del resumen de la incidencia general de síntomas clínicos de los grupos y la tabla 10 incluye los resultados del resumen de los índices de mortalidad de post-exposición de los grupos. El síntoma clínico más común observado en este estudio fue una conducta anormal, que se calificó como letargia leve a severa. Los cerdos que recibieron las 2 dosis inferiores de vORF2, los cerdos que recibieron 16 µg de rORF2 y los cerdos que recibie-ron 2 dosis de vacuna KV tenían índices de incidencia de = 27,3%. Los cerdos que recibieron 8 µg de rORF2 y el 15 grupo control negativo estricto no presentaron una conducta anormal. En este estudio ninguno de los cerdos mostró una respiración anormal. La tos era frecuente en los 15 grupos (0 a 25%), así como la diarrea (0-20%). Ninguno de los síntomas clínicos observados era patognómico para PMWS.

La incidencia general de síntomas clínicos variaba según los grupos. Los grupos que recibieron cualquiera de las vacunas vORF2, el grupo que recibió 16 µg de rORF2, el grupo que recibió 2 dosis de vacuna KV y el grupo de con-20 trol de prueba tenían la mayor incidencia de todos los síntomas clínicos (=36,4%). El grupo control negativo estricto, el grupo que recibió 8 µg de rORF2 y el grupo que recibió 4 µg de rORF2 tenían índices de incidencia general de síntomas clínicos del 0%, 8,3% y 9,1%, respectivamente.

Los índices de mortalidad generales también variaban según los grupos. El grupo que recibió 2 dosis de vacuna KV mostró el mayor índice de mortalidad (16,7%); en tanto los grupos que recibieron 4 µg de vORF2, 16 µg de rORF2 u 25 8 µg de rORF2 y el grupo control negativo estricto presentaban todos índices de mortalidad del 0%.

Tabla 8. Resumen de las observaciones de conducta anormal, respiración anormal, tos y diarrea en los gru-pos

Grupo: Tratamiento N Conducta anormal1 Conducta anormal2 Tos3 Diarrea4

1: vORF2-16 µg (1 do-sis) 12 2/12 (16,7%) 0/12 (0%) 3/12 (25%) 2/12 (16/7%)

2: vORF2-8 µg (1 dosis) 12 4/12 (33,3%) 0/12 (0%) 1/12 (8,3%) 1/12 (8,3%)

3: vORF2-4 µg (1 dosis) 12 8/12 (66,7%) 0/12 (0%) 2/12 (16,7%) 1/12 (8,3%)

4: rORF2-16 µg (1 dosis) 11 3/11 (27,3%) 0/11 (0%) 0/11 (0%) 2/11 (18,2%)

5: rORF2-8 µg (1 dosis) 12 0/12 (0%) 0/12 (0%) 1/12 (8,3%) 0/12 (0%)

6: rORF2-4 µg (1 dosis) 11 1/11 (9,1%) 0/11 (0%) 0/11 (0%) 0/12 (0%)

30

7: KV (2 dosis) 12 7/12 (58,3) 0/12 (0%) 0/12 (0%) 1/12 (8,3%)

8: Control de prueba 10 1/10 (10%) 0/10 (0%) 2/10 (20%) 2/10 (20%)

9: Control negativo es-tricto 11 0/11 (0%) 0/11 (0%) 0/11 (0%) 0/11 (0%)

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 de baculovirus recombinante expresado; virus completos muertos = vi-rus PCV2 cultivado en cultivo celular adecuado

1 Número total de cerdos en cada grupo que demostró alguna conducta anormal durante al menos un día

2 Número total de cerdos en cada grupo que demostró algún tipo de respiración anormal durante al menos un 5 día

3 Número total de cerdos en cada grupo que demostró tos durante al menos un día

4 Número total de cerdos en cada grupo que demostró diarrea durante al menos un día

Tabla 9. Resumen de la incidencia general de síntomas clínicos en los grupos 10

Grupo: Tratamiento N Incidencia de cerdos con sínto-mas clínicos1 Índice de inciden-cia

1: vORF2-16 µg (1 dosis) 12 5 41,7%

2: vORF2-8 µg (1 dosis) 12 5 41,7%

3: vORF2-4 µg (1 dosis) 12 8 66,7%

4: rORF2-16 µg (1 dosis) 11 4 36,4%

5: rORF2-8 µg (1 dosis) 12 1 8,3%

6: rORF2-4 µg (1 dosis) 11 1 9,1%

7: KV (2 dosis) 12 7 58,3%

8: Control de prueba 10 4 40%

9: Control negativo es-tricto 11 0 0%

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 de baculovirus recombinante expresado; virus completos muertos = vi-rus PCV2 cultivado en el cultivo celular adecuado

1 Número total de cerdos en cada grupo que demostró algún síntoma clínico durante al menos un día

Tabla 10. Resumen de los índices de mortalidad de los grupos después de la exposición 15

Grupo: Tratamiento N Muertos después de la expo-sición Índice de mortalidad

1: vORF2-16 µg (1 do-sis) 12 1 8,3%

2: vORF2-8 µg (1 do-sis) 12 1 8,3%

3: vORF2-4 µg (1 do-sis) 12 0 0%

4: rORF2-16 µg (1 do-sis) 11 0 0%

5: rORF2-8 µg (1 do-sis) 12 0 0%

6: rORF2-4 µg (1 do-sis) 11 1 9,1%

7: KV (2 dosis) 12 2 16,7%

8: Control de prueba 10 1 10%

9: Control negativo es-tricto 11 0 0%

Los resultados de exudado nasal de PCV2 se muestran en la siguiente tabla 11. Después de la exposición el día 24, 1 cerdo en el grupo 7 comenzó a exudar PCV2 el día 27. Ninguno de los demás grupos experimentó exudado hasta el día 33. La mayor parte de exudados nasales se notó a partir del día 35 y hasta el día 45. Los grupos que recibie-20 ron cualquiera de las tres vacunas vORF2 y los grupos que recibieron ya sea 4 ú 8 µg de rORF2 tenían la menor in-cidencia de exudado nasal de PCV2 (= 9,1%). El grupo control de prueba (grupo 8) tenía el mayor índice de exudado (80%), seguido por el grupo control negativo estricto (grupo 9), que tenía un índice de incidencia del 63,6%.

Tabla 11. Resumen de incidencia de exudado nasal de PCV2 en los grupos

Grupo: Tratamiento N Nº de cerdos con exudado durante al menos un día Índice de incidencia

1: vORF2-16 µg (1 do-sis) 12 1 8,3%

2: vORF2-8 µg (1 do-sis) 12 1 8,3%

3: vORF2-4 µg (1 do-sis) 12 1 8,3%

4: rORF2-16 µg (1 do-sis) 11 2 18,2%

5: rORF2-8 µg (1 dosis) 12 1 8,3%

6: rORF2-4 µg (1 dosis) 11 1 9,1%

7: KV (2 dosis) 12 5 41,7%

8: Control de prueba 10 8 80%

9: Control negativo es-tricto 11 7 63,6%

Los resúmenes de incidencia de ictericia en los grupos, incidencia de úlceras gástricas en los grupos, puntajes pro-medio de lesiones pulmonares en los grupos e incidencia de lesiones pulmonares en los grupos se muestran a con-5 tinuación en la tabla 12. Seis cerdos murieron en el primer sitio de prueba durante la fase de post-vacunación del es-tudio (grupo 4, N=1; grupo 6, N=1; grupo 8, N=2; grupo 9, N=2). Cuatro de seis cerdos presentaron lesiones fibrosas en una o más cavidades del cuerpo, un cerdo (grupo 6) mostró lesiones coherentes con la enfermedad por clostridia y un cerdo (grupo 9) no presentaba lesiones visibles. Ninguno de los cerdos que murió durante la fase de post-vacunación del estudio tenía lesiones coherentes con PMWS. 10

Los cerdos que murieron después de la exposición y los cerdos sacrificados el día 49 fueron sometidos a necropsia. En la necropsia no se observó ictericia ni úlceras gástricas en ninguno de los grupos.Con respecto al % promedio de lesiones pulmonares,el grupo 9 tenía el menor % promedio de lesiones pulmonares (0%),seguido del grupo 1 con 0,40 ± 0,50% y el grupo 5 con 0,68 ± 1,15%. Los grupos 2, 3, 7 y 8 tenían el mayor % promedio de lesiones pulmo-nares (= 7,27%). Cada uno de estos cuatro grupos comprendía un cerdo con un % lesiones pulmonares =71,5%, 15 que sesgó los resultados más altos para estos cuatro grupos. Con excepción del grupo 9 con 0% de lesiones pulmo-nares,los 8 grupos restantes tenían un = 36% de lesiones pulmonares. Casi todas las lesiones pulmonares observa-das se describieron como rojas/púrpuras y consolidadas.

Tabla 12. Resumen de incidencia de Ictericia en los grupos, incidencia de úlceras gástricas en los grupos, % 20 promedio de puntajes de lesiones pulmonares en los grupos e incidencia de lesiones pulmonares observa-das de los grupos

Grupo: Tratamiento Ictericia Úlceras gás-tricas % promedio de le-siones pulmona-res Incidencia de lesiones pulmonares observa-das

1: vORF2-16 µg (1 dosis) 0/12 (0%) 0/12 (0%) 0,40 ± 0,50% 10/12 (83%)

2: vORF2-8 µg (1 dosis) 0/12 (0%) 0/12 (0%) 7,41 ± 20,2% 10/12 (83%)

3: vORF2-4 µg (1 dosis) 0/12 (0%) 0/12 (0%) 9,20 ± 20,9% 10/12 (83%)

4: rORF2-16 µg (1 dosis) 0/11 (0%) 0/11 (0%) 1,5 ± 4,74% 4/11 (36%)

5: rORF2-8 µg (1 dosis) 0/12 (0%) 0/12 (0%) 0,68 ± 1,15% 9/12 (75%)

6: rORF2-4 µg (1 dosis) 0/11 (0%) 0/11 (0%) 2,95 ± 5,12% 7/11 (64%)

7: KV (2 dosis) 0/12 (0%) 0/12 (0%) 7,27 ± 22,9% 9/12 (75%)

8: Control de prueba 0/10 (0%) 0/10 (0%) 9,88 ± 29,2% 8/10 (80%)

9: Control negativo estricto 0/11 (0%) 0/11 (0%) 0/11 (0%) 0/11 (0%)

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 de baculovirus recombinante expresado; KV o virus completos muertos = virus PCV2 cultivado en el cultivo celular adecuado 25

El resumen de los resultados de incidencia positiva de IHC en los grupos se muestra en la tabla 13. El grupo 1 (vORF2-16 µg) y el grupo 5 (rORF2-8 µg) tenían el menor índice de resultados IHC positivos (16,7%). El grupo 8 (Control de prueba) y el grupo 9 (control negativo estricto) tenían el mayor índice de resultados IHC positivos, del 90% y 90,9%, respectivamente.

5

Tabla 13. Resumen de la índice de incidencia de IHC Positivo en los grupos

Grupo: Tratamiento N Nº de cerdos con al menos un tejido po-sitivo para PCV2 Índice de inciden-cia

1: vORF2-16 µg (1 do-sis) 12 2 16,7%

2: vORF2-8 µg (1 do-sis) 12 3 25,0%

3: vORF2-4 µg (1 do-sis) 12 8 66,7%

4: rORF2-16 µg (1 do-sis) 11 4 36,3%

5: rORF2-8 µg (1 dosis) 12 2 16,7%

6: rORF2-4 µg (1 dosis) 11 4 36,4%

7: KV (2 dosis) 12 5 41,7%

8: Control de prueba 10 9 90,0%

9: Control negativo es-tricto 11 10 90,9%

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 de baculovirus recombinante expresado; KV o virus completos muertos = virus PCV2 cultivado en el cultivo celular adecuado

Después de la exposición, el grupo 5, que recibió una dosis de 8 µg de antígeno rORF2, superó a los otros 6 grupos de vacunas. El grupo 5 tenía la mayor ADWG (0,94 ± 0,22 lbs/día),la menor incidencia de conducta anormal (0%),la 10 segunda menor incidencia de tos (8,3%), la menor incidencia de síntomas clínicos generales (8,3%), el menor índice de mortalidad (0%),el menor índice de exudado nasal de PCV2 (8,3%),el segundo menor índice de % promedio de lesiones pulmonares (0,68 ± 1,15%) y el menor índice de incidencia de tejidos positivos (16,7%). Los grupos que re-cibieron diversos niveles de antígeno rORF2 en general superaron a los grupos que recibieron diversos niveles de vORF2 y el grupo que recibió 2 dosis de vacuna de células enteras muertas PCV2 tuvieron los peores resultados. 15 Las tablas 14 y 15 contienen resúmenes de los datos para los grupos después de la exposición.

Tabla 14. Resumen de los datos de post-exposición de los grupos: Parte 1

Grupo: N Tratamiento ADWG (lbs/día) Conducta anormal Tos Incidencia general de síntomas clíni-cos

1: 12 vORF2-16 µg (1 dosis) 0,87 ± 0,29 2/12 (16,7%) 3/12 (25%) 41,7%

2: 12 vORF2-8 µg (1 dosis) 0,70 ± 0,32 4/12 (33,3% 1/12 (8,3% 41,7%

3: 12 vORF2-4 µg (1 dosis) 0,49 ± 0,21 8/12 (66,7%) 2/12 (16,7% 66,7%

4: 11 rORF2-16 µg (1 dosis) 0,84 ± 0,30 3/11 (27,3%) 0/11 (0%) 36,4%

5: 12 rORF2-8 µg (1 dosis) 0,94 ± 0,22 0/12 (0%) 1/12 (8,3%) 8,3%

6: 11 rORF2-4 µg (1 dosis) 0,72 ± 0,25 1/11 (9,1%) 0/11 (0%) 9,1%

7: 12 KV (2 dosis) 0,50 ± 0,15 7/12 (58,3) 0/12 (0%) 58,3%

8: 10 Control de prueba 0,76 ± 0,19 1/10 (10%) 2/10 (20%) 40%

9: 11 Control negativo estricto 1,06 ± 0,17 0/11 (0%) 0/11 (0%) 0%

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 de baculovirus recombinante expresado; KV o virus completos muertos = virus PCV2 cultivado en el cultivo celular adecuado 20

Tabla 15. Resumen de los datos de post-exposición de los grupos: Parte 2

Grupo: N Tratamiento Índice de mor-talidad Exudado nasal % promedio de lesiones pulm. Índice de inciden-cia de al menos un tejido IHC positivo para PCV2

1: 12 vORF2-16 µg (1 dosis) 8,3% 8,3% 0,40 ± 0,50% 16,7%

2: 12 vORF2-8 µg (1 do-sis) 8,3% 8,3% 7,41 ± 20,2% 25,0%

3: 12 vORF2-4 µg (1 do-sis) 0% 8,3% 9,20 ± 20,9% 66,7%

4: 11 rORF2-16 µg (1 dosis) 0% 18,2% 1,50 ± 4,74% 36,3%

5: 12 rORF2-8 µg (1 do-sis) 0% 8,3% 0,68 ± 1,15% 16,7%

6: 11 rORF2-4 µg (1 do-sis) 9,1% 9,1% 2,95 ± 5,12% 36,4%

7: 12 KV (2 dosis) 16,7% 41,7% 7,27 ± 22,9% 41,7%

8: 10 Control de prueba 10% 80% 9,88 ± 29,2% 90,0%

9: 11 Control negativo estricto 0% 63,6% 0/11 (0%) 90,9%

Los resultados de este estudio indican que todos los enfoques de vacuna deberían centrarse en una vacuna rORF2. En general, el exudado nasal de PCV2 se detectó después de la exposición y la vacunación con una vacuna de 5 PCV2 dio como resultado una reducción del exudado. La inmunohistoquímica de tejidos linfoides selectos también sirvió como un buen parámetro para la eficacia de la vacuna, en tanto no se detectaron grandes diferencias en ADWG, síntomas clínicos y lesiones visibles entre los grupos. Este estudio era complicado por el hecho que en al-gún punto se introdujo un PCV2 extraño durante el estudio, como lo demuestra el exudado nasal de PCV2, la sero-conversión de PCV2 y los tejidos IHC positivos en el grupo 9, el grupo control negativo estricto. 10

Discusión

En este estudio se evaluaron siete vacunas de PCV2, que incluyeron tres diferentes niveles de dosis de antígeno vORF2 administrado una vez el día 0, tres diferentes niveles de dosis de antígeno rORF2 administrado una vez el día 0 y un nivel de dosis de vacuna de células enteras muertas de PCV2 administrado el día 0 y el día 14. En gene-15 ral, el grupo 5, que recibió 1 dosis de vacuna que contenía 8 µg de antígeno rORF2, presentaba los mejores resulta-dos. El grupo 5 tenía la mayor ADWG, la menor incidencia de conducta anormal, la menor incidencia de respiración anormal, la segunda menor incidencia de tos, la menor incidencia de síntomas clínicos generales, el menor índice de mortalidad, el menor índice de exudado nasal de PCV2, el segundo menor índice del % promedio de lesiones pul-monares y el menor índice de incidencia para tejidos IHC positivos. 20

Curiosamente, el grupo 4, que recibió una dosis más alta de antígeno rORF2 que el grupo 5, no se comportó tan bien o mejor que el grupo 5. El grupo 4 tenía una ADWG ligeramente menor, una mayor incidencia de conducta anormal, una mayor incidencia de síntomas clínicos generales, un mayor índice de exudado nasal de PCV2, un ma-yor % promedio de lesiones pulmonares y un mayor índice para tejidos IHC positivos que el grupo 5. Los análisis es-tadísticos, que podrían haber indicado que las diferencias entre estos dos grupos no eran estadísticamente significa-25 tivas, no se efectuaron con estos datos, pero se observó una tendencia que el grupo 4 no presentaba el mismo comportamiento que el grupo 5.

Después de la vacunación, 6 cerdos murieron en el primer sitio de estudio. Cuatro de los seis cerdos eran del grupo 8 o grupo 9, que no recibieron vacuna. Ninguno de los seis cerdos mostraron lesiones coherentes con PMWS, no se informaron efectos adversos y en general, las siete vacunas parecen seguras cuando son administradas a cerdos de 30 11 días de vida aproximadamente. Durante la fase de post-vacunación del estudio, los cerdos que recibieron ya sea tres niveles de dosis de vacuna vORF2 o una vacuna a células enteras muertas presentaban los niveles más altos de IFAT, en tanto el grupo 5 presentaba los menores niveles de IFAT justo antes de la exposición, entre los grupos de vacunas.

Aunque no se ha demostrado formalmente, se cree que la ruta de transmisión predominante de PCV2 a los cerdos 35 jóvenes poco después del destete es por contacto oronasal directo y entonces una vacuna eficaz que permita redu-cir el exudado nasal de PCV2 en un establecimiento de producción ayudaría a controlar la dispersión de la infección. Los grupos que recibieron uno de los tres niveles de antígeno vORF2 y el grupo que recibió 8 µg de rORF2 tenían el menor índice de incidencia de exudado nasal de PCV2 (8,3%). Como era de esperar, el grupo control de prueba te-

nía el mayor índice de incidencia de exudado nasal (80%).

Las lesiones visibles en cerdos con PMWS secundaria a una infección por PCV2 consisten típicamente de una lin-foadenopatía generalizada en combinación con uno o más de lo siguiente: (1) pneumonía intersticial con edema in-terlobular, (2) palidez cutánea o ictericia, (3) hígados atróficos moteados, (4) úlceras gástricas y (5) nefritis. En el momento de la necropsia, no se observó ictericia, hepatitis, nefritis ni úlceras gástricas en ninguno de los grupos y 5 no se examinó específicamente la linfoadenopatía. El % promedio de puntajes de lesiones pulmonares varió según los grupos. El grupo que recibió 16 µg de antígeno vORF2 tenía el menor % promedio de puntaje de lesión pulmonar (0,40 ± 0,50%), seguido por el grupo que recibió 8 µg de rORF2 (0,68 ± 1,15%). Como era de esperar, el grupo con-trol de prueba tenía el mayor % promedio de puntaje de lesión pulmonar (9,88 ± 29,2%). En los cuatro grupos, el % promedio de puntajes de lesiones pulmonares era elevado debido a que un cerdo en cada uno de estos grupos tenía 10 puntajes muy altos de puntaje de lesión pulmonar. La mayoría de las lesiones pulmonares fueron descritas como ro-jas/púrpuras y consolidadas. Típicamente, las lesiones pulmonares asociados con PMWS se describen como de un color tostado y no colapsable con edema interlobular. Las lesiones pulmonares observadas en este estudio no esta-ban asociadas con la infección por PCV2 o se debían a la presencia de un segundo agente infeccioso de pulmón. En el contexto de este estudio, el % de puntajes de lesiones pulmonares probablemente no reflejan una medida verda-15 dera de la cantidad de infección de pulmón debido a PCV2.

Otros investigadores han demostrado una correlación directa entre la presencia de antígeno de PCV2 por IHC e his-topatología. En este estudio no se empleó histopatología en tejidos selectos. El grupo 1 (16 µg de vORF2) y el grupo 5 (8 µg de rORF2) tenían el menor índice de incidencia de cerdos positivos para el antígeno de PCV2 (8,3%), en tan-to el grupo 9 (el grupo control negativo estricto: 90,9%) y el grupo 8 (el grupo control de prueba: 90,0%) tenía el ma-20 yor índice de incidencia de cerdos positivos para el antígeno de PCV2. Debido a la naturaleza no subjetiva de esta prueba, los resultados de IHC probablemente sean los mejores parámetros para juzgar la eficacia de la vacuna.

Por lo tanto, se determinó la dosificación protectora mínima (MPD) de una dosis de 1 ml/1 de producto recombinante con el antígeno ORF2 de PCV2 extraído (rORF2) en el modelo de cerdo CDCD frente a una exposición a PCV2. En-tre los tres grupos que recibieron niveles variables de antígeno rORF2, el grupo 5 (8 µg de antígeno rORF2) tenía 25 claramente el nivel de protección más alto. El grupo 5 presentaba los mejores resultados o comparables a los resul-tados más favorable con respecto a todos los parámetros examinados. Cuando se comparaba el grupo 5 con los otros seis grupos de vacuna después de la exposición, el grupo 5 presentaba la mayor ADWG (0,94 ± 0,22 lbs/día), la menor incidencia de conducta anormal (0%), la segunda menor incidencia de tos (8,3%), la menor incidencia de síntomas clínicos generales (8,3%), el menor índice de mortalidad (0%), el menor índice de exudado nasal de PCV2 30 (8,3%), el segundo menor índice de % promedio de lesiones pulmonares (0,68 ± 1,15%) y el menor índice de inci-dencia para tejidos IHC positivos (16,7%).

Se determinó la MPD de una dosis de 1 ml/1 de un producto convencional que es el antígeno ORF2 de PCV2 (vORF2) parcialmente purificado en el modelo de cerdo CDCD frente a la exposición a PCV2. De los tres grupos que recibieron niveles variables de antígeno vORF2, el grupo 1 (16 µg de vORF2) presentaba el mayor nivel de protec-35 ción. El grupo 1 fue mejor que los grupos 2 y 3 con respecto a la ADWG, el % promedio de lesiones pulmonares e IHC. Los grupos 1 y 2 (8 µg de antígeno vORF2) se comportaron igual con respecto a la incidencia general de los síntomas clínicos, el grupo 3 (4 µg de antígeno vORF2) presentaba el menor índice de mortalidad y los tres grupos se comportaron igual con respecto al exudado nasal. En general, las vacunas vORF no se desempeñaron como las vacunas rORF. 40

Se determinó la eficacia de una dosis máxima de una dosis 2 ml/2 de una vacuna de PCV2 de células muertas con-vencional en el modelo de cerdo CDCD frente a la exposición a PCV2. Entre las siete vacunas evaluadas en este estudio, la vacuna de células enteras muertas de PCV2 tuvo el peor desempeño. Los lechones que recibieron dos dosis de vacuna de células enteras muertas de PCV2 presentaron la menor ADWG, el segundo mayor índice de conducta anormal (58,3%), la segunda mayor incidencia general de síntomas clínicos (58,3%), el mayor índice de 45 mortalidad (16,7%), la segunda mayor incidencia de exudado nasal (41,7%), el mayor % promedio de lesiones pul-monares (9,88 ± 29,2%), una gran incidencia de lesiones pulmonares observadas (75%) y un moderado índice de incidencia por IHC en tejidos (41,7%). Sin embargo, aún era eficaz para generar una respuesta inmune.

Se evaluó el exudado nasal de PCV2 como un parámetro de eficacia y se reconfirmaron los parámetros de eficacia de PCV2 anteriores obtenidos de estudios previos. Los resultados de este estudio indican que el exudado nasal de 50 PCV2 tiene lugar después de una exposición intranasal y que las vacunas de PCV2 reducen el exudado nasal de PCV2 después de la exposición. Aún más, los resultados de este estudio y los informes en la literatura indican que también se debe continuar con la evaluación por IHC en futuros estudios de vacunas de PCV2.

Algunas conclusiones adicionales que surgen a partir de este estudio son que la linfoadenopatía es uno de los ele-mentos distintivos de PMWS. Otro de los elementos distintivos de PMWS es la depleción linfoide y los multinuclea-55 dos/histiocitos gigantes. Además, no se observaron efectos adversos o reacciones en el sitio de la inyección para ninguna de las 7 vacunas de PCV2 y las 7 vacunas de PCV2 parecen seguras cuando son administradas a cerdos jóvenes.

EJEMPLO 5

En este ejemplo se evalúa la eficacia de ocho candidatos de vacunas PCV2 y se reconfirman los parámetros de ex-posición a PCV2 de estudios de exposición previos después de la exposición a una cepa virulenta de PCV2. Se utili-zaron ciento cincuenta (150) lechones nacidos por cesárea, privados de calostro (CDCD), de 6-16 días de vida, se bloquearon por peso y se dividieron aleatoriamente en 10 grupos de igual tamaño. En la tabla 16 se muestra el dise-5 ño general del estudio de este ejemplo.

Tabla 16. Diseño general del estudio

Grupo: Nº cerdos Tratamiento Día de tra-tam. KLH/ICFA el día 22 y el día 28 Exposición a PCV2 virulento el día 25 PRRSV MLV el día 46 Necropsia el día 50

1: 15 Vacuna PVC2 1 16 µg de rORF2-IMS 1314 0 y 14 + + + +

2: 15 Vacuna PVC2 2 16 µg de vORF2-Carbopol 0 y 14 + + + +

3: 15 Vacuna PCV2 3 16 µg de rORF2-Carbopol 0 y 14 + + + +

4: 15 Vacuna PCV2 2 16 µg de vORF2-Carbopol 0 + + + +

5: 15 Vacuna PVC2 3 4 µg de rORF2-Carbopol 0 & 14 + + + +

6: 15 Vacuna PVC2 3 1 µg de rORF2-Carbopol 0 & 14 + + + +

7: 15 Vacuna PVC2 3 0,25 µg de rORF2-Carbopol 0 & 14 + + + +

8: 15 Vacuna PVC2 4 > 8,0 log KV-Carbopol 0 & 14 + + + +

9: 15 Control de prueba N/D + + + +

10: 15 Grupo control ne-gativo no estricto N/D + - + +

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 de baculovirus recombinante expresado; KV o virus completos muertos = virus de PCV2 cultivado en el cultivo celular adecuado 10

La formulación de vacuna administrada a cada grupo fue como sigue. La vacuna PCV2 Nº 1, administrada a una do-sis de 1 x 2 ml al grupo 1, era una dosis alta (dosis de 16 ug/2 ml) de antígeno ORF2 recombinante inactivado con adyuvante de IMS 1314 (16 ug de rORF2-IMS 1314). La vacuna PCV2 Nº 2, administrada a una dosis de 1 x 2 ml al grupo 2, era una dosis alta (dosis de 16 ug/2 ml) de un antígeno de ORF2 PCV2 generado por VIDO R-1 parcial-mente purificado con adyuvante de Carbopol (16 ug de vORF2-Carbopol). La vacuna PCV2 Nº 3, administrada a una 15 dosis de 1 x 2 ml al grupo 3, era una dosis alta (dosis de 16 ug/2 ml) de antígeno de ORF2 recombinante inactivado con adyuvante de Carbopol (16 ug de rORF2-Carbopol). La vacuna PCV2 Nº 4, administrada a una dosis de 1 x 1 ml al grupo 4, era una dosis alta (dosis de 16 ug /1 ml) de un antígeno de ORF2 PCV2 generado por VIDO R-1 parcial-mente purificado con adyuvante de Carbopol (16 ug vORF2-Carbopol). La vacuna Nº 5, administrada a una dosis de 1 x 2 ml al grupo 5, era una dosis de 4 ug/2 ml de un antígeno de ORF2 recombinante inactivado con adyuvante de 20 Carbopol (4 ug de rORF2-Carbopol). La vacuna PCV2 Nº 6, administrada a una dosis de 1 x 2 ml al grupo 6, era una dosis de 1 ug/2 ml de un antígeno de ORF2 recombinante inactivado con adyuvante de Carbopol (1 ug de rORF2-Carbopol). La vacuna PCV2 Nº 7, administrada a una dosis de 1 x 2 ml al grupo 7, era una dosis baja (dosis de 0,25 ug/2 ml) de antígeno ORF2 recombinante inactivado con adyuvante de Carbopol (0,25 ug de rORF2-Carbopol). La vacuna PCV2 Nº 8, administrada a una dosis de 1 x 2 ml al grupo 8, era una dosis alta (título de pre-inactivación > 25 8,0 log/2 ml dosis) de un antígeno Struve PCV2 generado por VIDO R-1 inactivado convencional muerto con adyu-vante de Carbopol (>8,0 log KV-Carbopol). El día 0, los grupos 1-8 fueron tratados con las vacunas asignadas. Los grupos 1-3 y 5-8 recibieron refuerzos de sus respectivas vacunas nuevamente el día 14. La eficacia de una sola do-sis de 16 µg de vORF2-Carbopol fue evaluada con el grupo 4 que no recibió refuerzo el día 14. Los lechones fueron monitoreados por efectos adversos y reacciones en el sitio de inyección después de ambas vacunaciones. El día 21 30 los lechones fueron movidos al segundo sitio de estudio donde los grupos 1-9 fueron albergados en una instalación y el grupo 10 fue albergado en una instalación separada. Todos los cerdos recibieron hemocianina de lapa emulsiona-da con adyuvante incompleto de Freund (KLH/ICFA) los días 22 y 28. El día 25, los grupos 1-9 fueron expuestos a

aproximadamente 4 logs de virus PCV2 virulento. Para el día 46, se habían producido muy pocas muertes en el gru-po control de prueba. En un intento por inmunoestimular a los cerdos e incrementar la virulencia del material de ex-posición de prueba PCV2, todos los grupos fueron tratados con INGELVAC® PRRSV MLV (vacuna reproductora y respiratoria porcina, virus vivo modificado) el día 46.

Antes y después de la exposición se recolectaron muestras de sangre para la serología de PCV2. Después de la ex-5 posición, se registraron los datos del peso corporal para determinar la ganancia de peso diario promedio (ADWG) y las observaciones de los signos clínicos. El día 50, todos los cerdos que sobrevivieron fueron sacrificados, se regis-traron las lesiones visibles, se calificó la patología de los pulmones y algunos tejidos selectos fueron conservados en formalina para su examen mediante inmunohistoquímica (IHC) con el fin de detectar el antígeno PCV2 en un mo-mento posterior. 10

Materiales y métodos

Este era un estudio de viabilidad frente a la exposición a una vacunación parcialmente ciego realizado con cerdos CDCD, de 6 a 16 días de vida el día 0. Para su inclusión en el estudio, los títulos IFA PCV2 de las cerdas eran de = 1:1000. Además, el estado serológico de las cerdas era de una piara conocida PRRS-negativa. Se evaluaron dieci-séis (16) cerdas por el estado serológico de PCV2 y las dieciséis (16) tenían un título de PCV2 de = 1000 y fueron 15 transferidas al primer sitio de estudio. Se emplearon ciento cincuenta (150) lechones nacidos por cirugía cesárea y estaban disponibles para este estudio el día -3. El día -3, se pesaron los 150 cerdos CDCD en el primer sitio de es-tudio, se identificaron con rótulos de oreja, fueron bloqueados por peso y asignados aleatoriamente a 1 de 10 gru-pos, como se describió previamente en la tabla 16. Se recolectaron muestras de sangre de todos los cerdos. Si al-guno de los animales de prueba que había cumplido con los criterios de inclusión era enrolado en el estudio y poste-20 riormente excluido del mismo por cualquier motivo, se notificaba al Investigador y Monitor con el fin de determinar el uso de los datos recolectados del animal en el análisis final. Se registró la fecha en que los lechones enrolados eran excluidos y la razón de dicha exclusión. No se excluyó ninguna de las cerdas que cumplían con los criterios de inclu-sión, seleccionadas para el estudio y transportadas al primer sitio de estudio. No se excluyeron lechones del estudio y no se retiraron animales de prueba del estudio antes de terminar el mismo. En la Tabla 17 se describen los tiem-25 pos para las actividades más importantes de este ejemplo.

Tabla 17. Actividades del estudio

Día del estudio: Fechas reales Actividad del estudio

-3: 4/4/03 Peso de los cerdos; examen salud; asignación aleatoria en grupos; recolección de muestras de sangre

-3, 0-21: 4/4/03; 7/4/03 al 27/5/03 Observación del estado de salud general y de efectos adversos de post-vacunación

0: 7/4/03 Administración de respectivos IVP a los grupos 1-8

0-7: 7/4/03 al 14/4/03 Observación de los cerdos por reacciones en el sitio de inyección

14: 21/4/03 Grupos 1-3, 5-8 reforzados con los respectivos IVP; muestreo de san-gre de todos los cerdos

14-21: 21/4/03 al 28/4/03 Observación de los cerdos por reacciones a la inyección

19-21: 26/4/03 al 28/4/03 Tratamiento de todos los cerdos con antibióticos

21: 28/04/03 Cerdos transportados de Struve Labs, Inc. a Veterinary Resources, Inc.(VRI)

22-50: 28/4/03 al 27/5/03 Observación de los cerdos por signos clínicos después de la exposi-ción

22: 4-29-03 Tratamiento de los grupos 1-10 con KLH/ICFA

25: 2/5/03 Recolección de muestras de sangre de todos los cerdos; peso de to-dos los cerdos; exposición de los grupos 1-9 con material de exposi-ción de prueba PCV2

28: 5/5/03 Tratamiento de los grupos 1-10 con KLH/ICFA

32: 9/5/03 Recolección de muestras de sangre de todos los cerdos

46: 23/5/03 Administración de INGELVAC® PRRS MLV a todos los grupos

50: 27/5/03 Recolección de muestras de sangre, peso y necropsia de todos los cerdos; registro de lesiones visibles; evaluación de pulmones por le-siones; reserva de muestras de tejidos frescos y fijados en formalina; se completó la fase en-vida del estudio

Una vez completada la fase en-vida del estudio, se examinaron los tejidos fijados en formalina mediante inmunohis-30 toquímica (IHC) para que el patólogo pudiera detectar el antígeno PCV2, se evaluaron las muestras de sangre por la serología de PCV2 y se determinó la ganancia de peso diario promedio (ADWG) entre el día 25 y el día 50.

Los animales fueron albergados en el primer sitio de estudio en jaulas individuales en siete habitaciones desde el nacimiento y hasta los 11 días de vida aproximadamente (día 0 del estudio aproximadamente). Cada habitación era

idéntica en cuanto a disposición y consistía de jaulas de acero inoxidable individuales apiladas con suministro de ai-re caliente y filtrado por separado para cada unidad de aislamiento. Cada habituación tenía calefacción y ventilación separadas, impidiendo de esa manera la contaminación cruzada de aire entre las habitaciones. Los animales fueron albergados en dos instalaciones diferentes en el segundo sitio de estudio. El grupo 10 (el grupo control negativo es-tricto) fue albergado por separado en un en un galpón de cría convertido y los grupos 1-9 fueron albergados en un 5 galpón paritorio convertido. Cada grupo fue albergado en un corral separado (14-15 cerdos por corral) y cada corral proporcionaba aproximadamente 2,3 pies cuadrados por cerdo. Los grupos 2, 4 y 8 se ubicaron en tres corrales ad-yacentes a un lado del pasillo y los grupos 1, 3, 5, 6, 7 y 9 se ubicaron en seis corrales adyacentes en el otro lado del pasillo. La separación de los grupos se debió a la preocupación del Monitor del estudio que las vacunas adminis-tradas a los grupos 2, 4 y 8 no estuvieran completamente inactivadas. Cada corral se encontraba sobre un suelo 10 elevado con pisos de listones de plástico. Un pozo debajo de los corrales servía como tanque de retención para ex-crementos y desechos. Cada instalación tenía sus propios sistemas de calefacción y ventilación, con poca probabili-dad de contaminación cruzada de aire entre las instalaciones.

En el primer sitio de estudio, los lechones recibieron una ración de leche especialmente formulada desde el naci-miento y hasta aproximadamente las 3 semanas de vida. Todos los lechones consumían una ración sólida, mixta 15 especial al día 21 (4 ½ semanas de vida aproximadamente). En el segundo sitio de estudio, todos los lechones reci-bieron una ración de una mezcla comercial especial sin medicación apropiada para su edad y peso, ad libitum. Tam-bién disponían de agua ad libitum en ambos sitios de estudio.

Todos los cerdos de prueba fueron tratados con 1,0 mL de NAXCEL®, IM, en flancos alternantes los días 19, 20 y 21. Además, el cerdo Nº 11 (grupo 1) fue tratado con 0,5 mL de NAXCEL® IM el día 10, el cerdo Nº 13 (grupo 10) 20 fue tratado con 1 mL de penicilina y 1 mL de PREDEF® 2X el día 10, el cerdo Nº 4 (grupo 9) fue tratado con 1,0 mL de NAXCEL® IM el día 11 y los cerdos 1 (grupo 1), 4 y 11 recibieron cada uno tratamiento con 1,0 mL de NAXCEL® el día 14 por diversas razones de salud.

Mientras permanecían en ambos sitios de estudio, los cerdos se encontraban bajo control veterinario. Los exámenes de salud de los animales se realizaron el día -3 y se registraron en el formulario de registro del examen de salud. 25 Todos los animales se encontraban en un buen estado de salud y nutrición antes de recibir las vacunas según las observaciones efectuadas el día 0. Todos los animales de prueba se encontraban en un buen estado de salud y nu-tricional antes de la exposición. Las carcasas y los tejidos fueron eliminados por cremación. La disposición final de los animales de estudio fue registrada en el registro de baja de animales.

Los días 0 y 14, cerdos asignados a los grupos 1-3 y 5-8 recibieron 2,0 mL de las vacunas PCV2 1-4 asignadas, 30 respectivamente, IM en la región derecha e izquierda del cuello, respectivamente, usando una jeringa tipo Luer esté-ril de 3,0 mL y una aguja 20g x ½” estéril. Los cerdos asignados al grupo 4 recibieron 1,0 mL de la vacuna PCV2 Nº 2, IM en la región derecha del cuello usando una jeringa tipo Luer estéril de 3,0 mL y una aguja 20g x ½” estéril el día 0 solamente.

El día 22 todos los cerdos de prueba recibieron 2,0 mL de KLH/ICFA IM en la región izquierda del cuello usando una 35 jeringa tipo Luer estéril de 3,0 mL y una aguja 20g x1” estéril. El día 28 todos los cerdos de prueba recibieron 2,0 mL de KLH/ICFA en la región del flanco derecho usando una jeringa tipo Luer estéril de 3,0 mL y una aguja 20g x 1” es-téril.

El día 25, los cerdos asignados a los grupos 1-9 recibieron 1,0 mL de material de exposición de prueba PCV2 ISU-VDL (3,98 log10 TCID50/mL) por vía IM en la región derecha del cuello usando una jeringa tipo Luer estéril de 3,0 mL 40 y una aguja 20g x 1” estéril. Se administró 1,0 mL adicional del mismo material IN a cada cerdo (0,5 mL por la fosa nasal) usando una jeringa tipo Luer estéril de 3,0 mL y una cánula nasal.

El día 46, todos los cerdos de prueba recibieron 2,0 mL de INGELVAC® PRRS MLV, IM, en la región derecha del cuello usando una jeringa estéril Luer de 3,0 mL y una aguja 20g x 1” estéril. El PRRSV MLV se administró para au-mentar la virulencia del material de exposición de prueba de PCV2. 45

Los cerdos de prueba fueron observados todos los días por su estado de salud general y los efectos adversos el día -3 y desde el día 0 hasta el día 21. Cada uno de los cerdos fue calificado por su conducta normal o anormal, respira-ción o tos. Las observaciones fueron registradas en el registro de observación clínica. Todos los cerdos de prueba fueron monitoreados entre el día 0 y el día 7, y el grupo 7 fue monitoreado además entre los días 14 y 21, por las reacciones en el sitio de inyección. La ganancia de peso diario promedio se determinó pesando cada cerdo sobre 50 una balanza calibrada los días -3, 25 y 50, o el día que el cerdo aparecía muerto después de la exposición. Los pe-sos corporales fueron registrados en el formulario de peso corporal. Los pesos corporales del día -3 se utilizaron pa-ra bloquear los cerdos antes de la asignación aleatoria. El día 25 y el día 50 se utilizaron los datos de los pesos para determinar la ganancia de peso diario promedio (ADWG) para cada cerdo para los tiempos definidos. En el caso de los cerdos que murieron después de la exposición y antes del día 50, se ajustó la ADWG para que representara la 55 ADWG desde el día 25 hasta el día de muerte.

Con el fin de determinar la serología de PCV2, se recolectó sangre venosa completa del seno venoso orbital de cada lechón los días -3 y 14. Para cada lechón, se recolectó sangre del seno venoso orbital insertando un tubo capilar es-téril en el canto medial de uno de los ojos y drenando aproximadamente 3,0 mL de sangre completa en un Tubo se-parador de suero (SST) de 4,0 mL. Los días 25, 32 y 50, se recolectó sangre venosa completa de la vena cava ante-rior de cada cerdo usando una aguja Vacutainer 20g x 1 ½" estéril (Becton Dickinson y Company, Franklin Lakes, 5 Nueva Jersey), un soporte de aguja Vacutainer y un SST de 13 mL. La recolección de sangre en cada tiempo se re-gistró en el registro de recolección de muestras. Se dejó que la sangre coagulara en cada SST, a continuación se centrifugó cada SST y se cosechó el suero. El suero cosechado se transfirió a un tubo Snap estéril y se guardó a –70 ± 10°C hasta su evaluación en una fecha posterior. Las muestras de suero fueron evaluadas por la presencia de anticuerpos contra PCV2 por el personal de BIVI-R&D. 10

Los cerdos fueron monitoreados una vez por día entre el día 22 y el día 50 por los síntomas clínicos y se calificaron según una conducta normal o anormal, respiración o tos. Las observaciones clínicas fueron registradas en el registro de observación clínica.

Los cerdos Nº 46 (grupo 1) y 98 (grupos 9) murieron en el primer sitio de estudio. Ambas muertes fueron determina-das como muertes por hemorragia y no se efectuaron necropsias en estos dos animales. En el segundo sitio de es-15 tudio, se efectuaron necropsias de los cerdos que murieron después de la exposición y antes del día 50, y de los cerdos sacrificados el día 50. Se registraron todas las lesiones visibles y también los porcentajes de lóbulos pulmo-nares con lesiones en el formulario de informe de necropsia.

De cada uno de los cerdos a los que se les había efectuado necropsia en el segundo sitio de estudio, se tomó una muestra de tejido de amígdala, pulmón, corazón y nódulo linfático mesentérico que se colocó en un envase indivi-20 dual con formalina 10% amortiguada; y otra muestra de tejido de los mismos órganos mencionados se colocó en un Whirl-pak Whirl-pak® (M-Tech Diagnostics Ltd., Thelwall, Reino Unido) y cada Whirl-pak® se colocó sobre hielo. Cada envase se rotuló apropiadamente. Las recolecciones de muestras se registraron en el formulario de informe de necropsia. Posteriormente, se enviaron las muestras de tejidos fijados en formalina y un formulario de solicitud de diagnóstico para las pruebas de IHC. Las pruebas de IHC se realizaron de acuerdo con los procedimientos de labo-25 ratorio estándar para recibir muestras, preparar muestras y portaobjetos y usar las técnicas de coloración. Los teji-dos frescos en los Whirl-paks® fueron enviados sobre hielo al Monitor del estudio para su almacenamiento (-70° ± 10 °C) y posible uso futuro.

Los tejidos fijados en formalina fueron examinados por un patólogo para detectar el PCV2 por IHC y se calificaron de acuerdo con el siguiente sistema de puntaje: 0 = ninguno; 1 = escasa coloración positiva, pocos sitios; 2 = coloración 30 positiva moderada, múltiples sitios; y 3 = coloración positiva abundante, difusa en todo el tejido. A efectos analíticos, un puntaje de 0 se consideró “negativo”, y un puntaje mayor que 0 se consideró “positivo”.

Resultados

Los resultados para este ejemplo se muestran más adelante. Cabe destacar que los cerdos Nº 46 y 98 murieron los días 14 y 25, respectivamente. Estas muertes se consideraron como muertes por hemorragia. El cerdo Nº 11 (grupo 35 1) estaba jadeando con respiración rápida el día 15. Por lo demás, todos los cerdos eran normales en cuanto a con-ducta, respiración y tos durante este período de observación y no se observaron efectos adversos sistémicos en ninguno de los grupos. No se observaron reacciones en el sitio de inyección después de la vacunación el día 0. Después de la vacunación del día 14, siete (7) de catorce (14) cerdos del grupo 1 (50,0%) mostraron hinchazón con un puntaje de “2” el día 15. Cuatro (4) de catorce (14) cerdos del grupo 1 (28,6%) aún mostraban una hinchazón de 40 “2” el día 16. Ninguno de los demás grupos experimentó reacciones en el sitio de inyección después de las vacuna-ciones.

Los resultados de la ganancia de peso diario promedio (ADWG) se muestran a continuación en la tabla 18. Los cer-dos Nº 46 y 98 que murieron por hemorragia fueron excluidos de los resultados del grupo. El grupo 4, que recibió una dosis de 16 ug de vORF2-Carbopol, tenía la mayor ADWG (1,16 ± 0,26 lbs/día), seguido de los grupos 1, 2, 3, 5, 45 6 y 10 cuyas ADWG variaban en un rango entre 1,07 ± 0,23 lbs/día y 1,11 ± 0,26 lbs/día. El grupo 9 tenía la menor ADWG (0,88 ± 0,29 lbs/día), seguido de los grupos 8 y 7, cuyas ADWG eran de 0,93 ± 0,33 lbs/día y 0,99 ± 0,44 lbs/día, respectivamente.

Tabla 18. Resumen de las ganancias de peso diario promedio (ADWG) de los grupos

Grupo: Tratamiento N ADWG-lbs/día (día 25 al día 50) o ajustado para los cerdos que murieron antes del día 50

1: rORF2-16 µg-IMS 1314 2 dosis 14 1,08 ± 0,30 lbs/día

2: vORF2-16 µg-Carbopol 2 dosis 15 1,11 ± 0,16 lbs/día

3: rORF2-16 µg-Carbopol 2 dosis 15 1,07 ± 0,21 lbs/día

4: vORF2-16 µg-Carbopol 1 dosis 15 1,16 ± 0,26 lbs/día

5: rORF2-4 µg-Carbopol 1 dosis 15 1,07 ± 0,26 lbs/día

6: rORF2-1 µg-Carbopol 2 dosis 15 1,11 ± 0,26 lbs/día

7: rORF2-0,25 µg-Carbopol 2 dosis 15 0,99 ± 0,44 lbs/día

8: KV > 8,0 log-Carbopol 2 dosis 15 0,93 ± 0,33 lbs/día

9: Control de prueba 14 0,88 ± 0,29 lbs/día

10: Control negativo estricto 15 1,07 ± 0,23 lbs/día

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 de baculovirus recombinante expresado; KV o virus completos muertos = virus de PCV2 cultivado en el cultivo celular adecuado

Los resultados de la serología de PVC2 se muestran en la siguiente tabla 19. Los diez (10) grupos eran seronegati-vos para PCV2 el día –3. El día 14, los títulos de PCV2 permanecieron bajos en los diez (10) grupos (rango de 50-113). El día 25, el grupo 8, que recibió la vacuna de células enteras muertas, tenía el título más alto de PCV2 (4617), 5 seguido del grupo 2, que recibió 16 ug de vORF2-Carbopol, el grupo 4, que recibió como dosis única 16 ug de vORF2-Carbopol, y el grupo 3, que recibió 16 ug de rORF2-Carbopol, cuyos títulos eran de 2507, 1920 y 1503, res-pectivamente. El día 32 (una semana después de la exposición), los títulos para los grupos 1-6 y el grupo 8 variaban en un rango entre 2360 y 7619; en tanto los grupos 7 (0,25 ug de rORF2-Carbopol), 9 (control de prueba) y 10 (con-trol negativo estricto) tenían títulos de 382, 129 y 78, respectivamente. El día 50 (día de la necropsia), los diez (10) 10 grupos mostraron títulos altos de PCV2 (= 1257).

Los días 25, 32 y 50, el grupo 3, que recibió dos dosis de 16 ug de rORF2-Carbopol tenía títulos de anticuerpo más altos que el grupo 1, que recibió dos dosis de 16 ug de rORF2-IMS 1314. Los días 25, 32 y 50, el grupo 2, que reci-bió dos dosis de 16 ug de vORF2 tenía títulos más altos que el grupo 4, que solamente recibió una dosis de la mis-ma vacuna. Los grupos 3, 5, 6, 7, que recibieron niveles decrecientes de rORF2-Carbopol, de 16, 4, 1 y 0,25 ug, 15 respectivamente, demostraron títulos de anticuerpo correspondientemente decrecientes los días 25 y 32.

Tabla 19. Resumen de los títulos de IFA PCV2 en los grupos

Grupo: Tratamiento Día –3 Día 14** Día 25*** Día 32 Día 50****

1: rORF2-16 µg –IMS 1314 2 dosis 50 64 646 3326 4314

2: vORF2-16 µg-Carbopol 2 dosis 50 110 2507 5627 400

3: rORF2-16 µg –Carbopol 2 dosis 50 80 1503 5120 6720

4: vORF2-16 µg –Carbopol 1 dosis 50 113 1920 3720 1257

5: rORF2-4 µg-Carbopol 1 dosis 50 61 1867 3933 4533

6: rORF2-1 µg-Carbopol 2 dosis 50 70 490 2360 5740

7: rORF2-0,25 µg-Carbopol 2 dosis 50 73 63 382 5819

8: KV > 8,0 log-Carbopol 2 dosis 50 97 4617 7619 10817

9: Control de prueba 50 53 50 129 4288

10: Control negativo estricto 50 50 50 78 11205

20

*A efectos de los cálculos, un título de IFA =100 se denominó título de “50"; un título de IFA =6400 se denominó títu-lo de “12.800".

**Día de la exposición

***Día de la necropsia

Los resultados de las observaciones clínicas de post-exposición se muestran a continuación. La tabla 20 incluye las 25 observaciones de conducta anormal, respiración anormal, tos y diarrea. La tabla 21 incluye los resultados del resu-men de la incidencia general de síntomas clínicos de los grupos y la Tabla 22 incluye los resultados del resumen de los índices de mortalidad de los grupos después de la exposición. La incidencia de conducta anormal, respiración y tos después de la exposición fue baja en los cerdos que recibieron 16 ug de rORF2–IMS 1314 (grupo 1), 16 ug de rORF2–Carbopol (grupo 3), 1 ug de rORF2–Carbopol (grupo 6), 0,25 ug de rORF2–Carbopol (grupo 7) y en los cer-30 dos del grupo control de prueba (grupo 9). La incidencia de conducta anormal, respiración y tos después de la expo-sición era de cero en los cerdos que recibieron 16 ug de vORF2–Carbopol (grupo 2), una sola dosis de 16 ug de vORF2–Carbopol (grupo 4), 4 ug de rORF2–Carbopol (grupo 5), >8 log KV–Carbopol (grupo 8) y en los cerdos del grupo control negativo estricto (grupo 10).

La incidencia general de los síntomas clínicos varió según los grupos. Los cerdos que recibieron 16 ug de vORF2–Carbopol (grupo 2),una sola dosis de 16 ug de vORF2–Carbopol (grupo 4) y los cerdos del grupo control negativo estricto (grupo 10) tenían índices de incidencia del 0%; los cerdos que recibieron 16 ug de rORF2–Carbopol (grupo 3) y 1 ug de rORF2–Carbopol (grupo 6) tenían índices de incidencia del 6,7%; los cerdos que recibieron 16 ug de rORF2–IMS 1314 (grupo 1) tenían un índice de incidencia general del 7,1%; los cerdos que recibieron 4 ug de 5 rORF2–Carbopol (grupo 5), 0,25 ug de rORF2–Carbopol (grupo 7) y >8 log vacuna KV tenían índices de incidencia del 13,3%; y los cerdos del grupo control de prueba (grupo 9) tenían un índice de incidencia del 14,3%.

También variaron los índices generales de mortalidad entre grupos. El grupo 8, que recibió 2 dosis de vacuna KV te-nía el mayor índice de mortalidad del 20,0%; seguido del grupo 9, el grupo control de prueba, y el grupo 7, que reci-bió 0,25 ug de rORF2–Carbopol y tenían índices de mortalidad del 14,3% y 13,3%, respectivamente. El grupo 4, que 10 recibió una dosis de 16 ug de vORF2–Carbopol tenía un índice de mortalidad del 6,7%. Todos los demás grupos, 1, 2, 3, 5, 6 y 10 tenían un índice de mortalidad del 0%.

Tabla 20. Resumen de las observaciones de conducta anormal, respiración anormal y tos después de la ex-posición de los grupos

Grupo: Tratamiento N Conducta anormal1 Conducta anormal2 Tos3

1: rORF2-16 µg-IMS 1314 2 dosis 14 0/14 (0%) 0/14 (0%) 1/14 (7,1%)

2: vORF2-16 µg-Carbopol 2 dosis 15 0/15 (0%) 0/15 (0%) 0/15 (0%)

3: rORF2-16 µg-Carbopol 2 dosis 15 0/15 (0%) 0/15 (0%) 1/15 (6,7%)

4: vORF2-16 µg-Carbopol 1 dosis 15 0/15 (0%) 0/15 (0%) 0/15 (0%)

5: rORF2-4 µg-Carbopol 1 dosis 15 1/15 (6,7%) 1/15 (6,7%) 0/15 (0%)

6: rORF2-1 µg-Carbopol 2 dosis 15 0/15 (0%) 0/15 (0%) 1/15 (6,7%)

7: rORF2-0,25 µg-Carbopol 2 dosis 15 0/15 (0%) 1/15 (6,7%) 1/15 (06,7%)

8: KV > 8,0 log-Carbopol 2 dosis 15 1/15 (6,7%) 1/15 (6,7%) 0/15 (0%)

9: Control de prueba 14 1/14 (7,1%) 1/14 (7,1%) 2/14 (14/3%)

10: Control negativo estricto 15 0/15 (0%) 0/15 (0%) 0/15 (0%)

1 Número total de cerdos en cada grupo que demostró alguna conducta anormal durante al menos un día 15

2 Número total de cerdos en cada grupo que demostró respiración anormal durante al menos un día

Tabla 21. Resumen de la incidencia general de síntomas clínicos después de la exposición de los grupos

Grupo: Tratamiento N Incidencia de cerdos con sín-tomas clínicos1 Índice de incidencia

1: rORF2-16 µg-IMS 1314 2 dosis 14 1 7,1%

2: vORF2-16 µg-Carbopol 2 dosis 15 0 0,0%

3: rORF2-16 µg-Carbopol 2 dosis 15 1 6,7%

4: vORF2-16 µg-Carbopol 1 dosis 15 0 0,0%

5: rORF2-4 µg-Carbopol 1 do-sis 15 2 13,3%

6: rORF2-1 µg-Carbopol 2 do-sis 15 1 6,7%

7: rORF2-0,25 µg-Carbopol 2 dosis 15 2 13,3%

8: KV > 8,0 log-Carbopol 2 do-sis 15 2 13,3%

9: Control de prueba 14 2 14,3%

10: Control negativo estricto 15 0 0,0%

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 de baculovirus recombinante expresado; KV o virus completos muertos 20 = virus de PCV2 cultivado en el cultivo celular adecuado

Tabla 22. Resumen de los índices de mortalidad después de la exposición de los grupos

Grupo: Tratamiento N Muertos después de la exposi-ción Índice de mortalidad

1: rORF2-16 µg-IMS 1314 2 dosis 14 0 0,0%

2: vORF2-16 µg-Carbopol 2 dosis 15 0 0,0%

3: rORF2-16 µg-Carbopol 2 dosis 15 0 0,0%

4: vORF2-16 µg-Carbopol 1 dosis 15 1 6,7%

5: rORF2-4 µg-Carbopol 1 do-sis 15 0 0,0%

6: rORF2-1 µg-Carbopol 2 do-sis 15 0 0,0%

7: rORF2-0,25 µg-Carbopol 2 dosis 15 2 13,3%

8: KV > 8,0 log-Carbopol 2 do-sis 15 3 20,0%

9: Control de prueba 14 2 14,3%

10: Control negativo estricto 15 0 0,0%

El resumen de porcentaje medio de lesiones pulmonares y diagnóstico tentativo de los grupos se ofrece a continua-ción en la tabla 23. El grupo 9, el grupo control de prueba, tenía el porcentaje más alto de lesiones pulmonares con 5 una media de 10,81 ± 23,27%, seguido del grupo 7, que recibió 0,25 ug de rORF2–Carbopol y tenía una media de 6,57 ± 24,74%, luego el grupo 5, que recibió 4 ug de rORF2–Carbopol y tenía una media de 2,88 ± 8,88%, y el grupo 8, que recibió la vacuna KV y tenía una media de 2,01 ± 4,98%. Los restantes seis (6) grupos tenían un porcentaje medio más bajo de lesiones pulmonares que variaba en un rango entre 0,11 ± 0,38% y 0,90 ± 0,15%.

El diagnóstico tentativo de pneumonía varió entre los grupos. El grupo 3, que recibió dos dosis de 16 ug de rORF2–10 Carbopol, presentó el diagnóstico tentativo de pneumonia más bajo, con un 13,3%. El grupo 9, el grupo control de prueba, presentaba un 50% del grupo diagnosticado tentativamente con pneumonía, seguido del grupo 10, el grupo control negativo estricto y el grupo 2, que recibió dos dosis de 16 ug de vORF2–Carbopol, con un 46,7% y 40%, res-pectivamente, de diagnóstico tentativo de pneumonía.

Los grupos 1, 2, 3, 5, 9 y 10 presentaban un 0% de diagnóstico tentativo como infectados con PCV2; en tanto el 15 grupo 8, que recibió dos dosis de vacuna KV, presentaba el índice de diagnóstico tentativo más alto de infección por PCV2 de los grupos, que era de un 20%. El grupo 7, que recibió dos dosis de 0,25 ug de rORF2–Carbopol, y el gru-po 4, que recibió una dosis de 16 ug de vORF2–Carbopol presentaban diagnósticos tentativos de infección por PCV2 del 13,3% y 6,7% para cada grupo, respectivamente.

Solamente se diagnosticó úlceras gástricas en un cerdo del grupo 7 (6,7%); en tanto los demás 9 grupos permane-20 cieron libres de úlceras gástricas.

Tabla 23. Resumen del % promedio de lesiones pulmonares y diagnóstico tentativo en los grupos

Grupo: Tratamiento N Nº de cerdos con exudado al me-nos un día Índice de incidencia

1: rORF2-16 µg-IMS 1314 2 do-sis 15 0 0%

2: vORF2-16 µg-Carbopol 2 do-sis 15 1 6,7%

3: rORF2-16 µg-Carbopol 2 dosis 15 3 20,0%

4: vORF2-16 µg-Carbopol 1 do-sis 15 2 13,3%

5: rORF2-4 µg-Carbopol 1 dosis 15 3 20,0%

6: rORF2-1 µg-Carbopol 2 dosis 15 6 40,0%

7: rORF2-0,25 µg-Carbopol 2 do-sis 15 7 46,7%

8: KV > 8,0 log-Carbopol 2 dosis 15 12 80%

9: Control de prueba 14 14 100,0%

10: Control negativo estricto 15 14 93,3%

El resumen de resultados de incidencia positiva de IHC en los grupos se muestran a continuación en la tabla 24. El 5 grupo 1 (16 ug de rORF2-IMS 1314) tenía el índice de resultados IHC positivos del grupo más bajo con un 0% de cerdos positivos para PCV2, seguido del grupo 2 (16 ug de vORF2-Carbopol) y del grupo 4 (una sola dosis de 16 ug de vORF2-Carbopol), con índices de IHC para los grupos del 6,7% y 13,3%, respectivamente. El grupo 9, el grupo control de prueba, tenía el índice de incidencia positiva por IHC más alto, con el 100% de los cerdos positivos para PCV2, seguido del grupo 10, el grupo control negativo estricto, y del grupo 8 (vacuna KV), con un 93,3% y 80% de 10 los cerdos positivos para PCV2, respectivamente.

Tabla 24. Resumen del índice de incidencia de positivos por IHC en los grupos

Grupo: Tratamiento N Nº de cerdos con exudado du-rante al menos un día Índice de incidencia

1: rORF2-16 µg-IMS 1314 2 do-sis 15 0 0%

2: vORF2-16 µg-Carbopol 2 do-sis 15 1 6,7%

3: rORF2-16 µg-Carbopol 2 dosis 15 3 20,0%

4: vORF2-16 µg-Carbopol 1 do-sis 15 2 13,3%

5: rORF2-4 µg-Carbopol 1 dosis 15 3 20,0%

6: rORF2-1 µg-Carbopol 2 dosis 15 6 40,0%

7: rORF2-0,25 µg-Carbopol 2 dosis 15 7 46,7%

8: KV > 8,0 log-Carbopol 2 dosis 15 12 80%

9: Control de prueba 14 14 100,0%

10: Control negativo estricto 15 14 93,3%

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 de baculovirus recombinante expresado; KV o virus completos muertos = virus de PCV2 cultivado en el cultivo celular adecuado 15

Discusión Se evaluaron siete vacunas de PCV2 en este ejemplo, que incluían una dosis alta (16 µg) de antígeno rORF2 con adyuvante de IMS 1314 administrada en dos veces, una dosis alta (16 µg) de antígeno vORF2 con adyuvante de Carbopol administrada una vez a un grupo de cerdos y dos veces a un segundo grupo de cerdos, una dosis alta (16 µg) de antígeno rORF2 con adyuvante de Carbopol administrada dos veces, una dosis de 4 µg de antígeno rORF2 20 con adyuvante de Carbopol administrada dos veces, una dosis de 1 µg de antígeno rORF2 con adyuvante de Car-bopol administrada dos veces, una dosis baja (0,25 µg) de antígeno rORF2 con adyuvante de Carbopol administrada dos veces y una dosis alta (> 8 log) de vacuna de células enteras muertas de PCV2 con adyuvante de Carbopol. En general, el grupo 1, que recibió dos dosis de 16 µg de rORF2-IMS 1314, tuvo un desempeño ligeramente mejor que los grupos 2 a 7, que recibieron vacunas que contienen diversos niveles de ya sea antígeno vORF2 o rORF2 con 25 adyuvante de Carbopol y mucho mejor que el grupo 8, que recibió dos dosis de vacuna de células enteras muertas de PCV2. El grupo 1 tenía la tercera ADWG más alta (1,80 ± 0,30 lbs/día), la menor incidencia de conducta anormal (0%), la menor incidencia de respiración anormal (0%), una baja incidencia de tos (7,1%), una baja incidencia de sín-tomas clínicos generales (7,1%), compartía con otros tres grupos el menor índice de mortalidad (0%), el segundo menor índice del % promedio de lesiones pulmonares (0,15 ± 0,34%), el segundo menor índice de pneumonía 30 (21,4%) y el menor índice de incidencia para tejidos IHC positivos (0%). Sin embargo,el grupo 1 era el único grupo en el cual se observaron reacciones en el sitio de inyección, que incluía el 50% de los vacunados 1 día después de la segunda vacunación. Las otras vacunas administradas a los grupos 2 a 7 tuvieron un mejor desempeño que la vacuna muerta y casi tan buena como la vacuna administrada al grupo 1.

El grupo 8, que recibió dos dosis de vacuna muerta de PCV2 con adyuvante de Carbopol, presentaba el peor con-35 junto de resultados de todos los grupos de vacunas. El grupo 8 tenía la menor ADWG (0,93 ± 0,33 lbs/día), el se-gundo mayor índice de conducta anormal (6,7%), el mayor índice de respiración anormal (6,7%), junto con otros tres grupos el mayor índice de incidencia general de síntomas clínicos (13,3%), tenía el mayor índice de mortalidad de todos los grupos (20%) y el mayor índice IHC positivo (80%) de todos los grupos de vacunas. Surgió la duda de si la

vacuna de células enteras muertas PCV2 no estuviera completamente inactivada antes de su administración al gru-po 8, lo que podría explicar los pobres resultados de este grupo. Desafortunadamente, no había datos definitivos pa-ra confirmar esta preocupación. En general, en el contexto de este ejemplo, la vacuna muerta convencional de PCV2 no ayudaba en la reducción de la enfermedad asociada a PCV2.

Como se mencionó previamente, no había efectos adversos asociados con las vacunas de prueba con excepción de 5 la vacuna con adyuvante de IMS 1314. Se observaron reacciones en el sitio de inyección en el 50,0% de los cerdos 1 día después de la segunda vacunación con la vacuna formulada con IMS 1314 y en el 28,6% de los cerdos 2 días después de la segunda vacunación. No se observaron reacciones en ninguno de los cerdos que recibió vacunas con adyuvante de Carbopol. Cualquier estudio futuro que incluyera cerdos vacunados con vacunas con adyuvante IMS 1314 debería continuar monitoreando estrechamente a los cerdos por las reacciones en el sitio de inyección. 10

Todos los cerdos eran seronegativos para PCV2 el día -3 y solamente el grupo 2 tenía un título superior a 100 el día 14. El día 25 (día de la exposición), el grupo 8 tenía el título de anticuerpo PCV2 más alto (4619), seguido del grupo 2 (2507). Con la excepción de los grupos 7, 9 y 10, todos los grupos demostraron una fuerte respuesta de anticuerpo para el día 32. Al día 50, todos los grupos, incluyendo los grupos 7, 9 y 10, demostraron una fuerte respuesta de an-ticuerpo. 15

Uno de los elementos distintivos de una infección por PCV2 en etapa tardía y el subsiguiente desarrollo de PMWS es un atraso en el crecimiento en cerdos destetados y, en casos severos, se observa pérdida de peso. La ganancia de peso diario promedio de los grupos es un método cuantitativo que permite demostrar un atraso en el crecimiento o pérdida de peso. En este ejemplo, no se observaron grandes diferencias en la ADWG entre grupos. El grupo 8 te-nía la menor ADWG de 0,88 ± 0,29 lbs/día, en tanto el grupo 4 tenía la mayor ADWG de 1,16 ± 0,26 lb/día. En el 20 contexto de este estudio, no existe suficiente diferencia entre grupos como para basar la eficacia de futuras vacunas en la ADWG.

Además de la pérdida de peso, la disnea, letargia, palidez de la piel y a veces ictericia son síntomas clínicos asocia-dos con PMWS. En este ejemplo, se observó ocasionalmente conducta anormal y respiración anormal y tos en cada grupo. Tal como se demuestra en este estudio, este modelo de exposición y la cepa de exposición no dan como re-25 sultado síntomas clínicos abrumadores y este no constituye un parámetro fuerte sobre el cual se pueda basar la efi-cacia de una vacuna.

En general, los índices de mortalidad no eran altos en este ejemplo y la falta de un alto índice de mortalidad en el grupo control de prueba limita este parámetro para fundamentar la eficacia de la vacuna. Antes del día 46, en los grupos 4 y 7 murió uno de cada quince cerdos, en el grupo 9 murieron dos de cada catorce cerdos y en el grupo 8 30 murieron tres de quince cerdos. Debido al hecho que el grupo 9, el grupo control de prueba, no mostraba síntomas clínicos de PCV2 y solamente habían tenido lugar dos decesos en este grupo para el día 46, se administró la vacuna MLV del virus del síndrome respiratorio y reproductor porcino (PRRSV) a todos los cerdos el día 46. Estudios ante-riores han utilizado INGELVAC® PRRS MLV como inmunoestimulante para exasperar la enfermedad PMWS aso-ciada a PCV2 y los índices de mortalidad eran más altos en estos estudios anteriores. Se produjeron dos muertes 35 poco después de administrar la vacuna PRRS el día 46: el grupo 4 con una muerte el día 46 y el grupo 7 con una muerte el día 47, lo cual probablemente no estaba asociado a la administración de la vacuna PRRS. Para el día 50, el grupo 8, que recibió dos dosis de vacuna muerta, tenía el mayor índice de mortalidad (20%), seguido del grupo 9 (control de prueba) y del grupo 7 (0,25 ug de rORF2-Carbopol), con índices de mortalidad del 14,3% y 13,3%, res-pectivamente. En general, la administración de la vacuna PRRS al modelo de exposición en un momento avanzado 40 después de fase de observación de exposición de este ejemplo no incrementó significativamente los índices de mor-talidad.

Las lesiones visibles en cerdos con PMWS secundaria a una infección por PCV2 consisten típicamente de una lin-foadenopatía generalizada en combinación con uno o más de los siguientes: (1) pneumonía intersticial con edema interlobular, (2) palidez cutánea o ictericia, (3) hígados atróficos moteados, (4) úlceras gástricas y (5) nefritis. En el 45 momento de la necropsia (día 50), no se observó ictericia, hepatitis ni nefritis en ninguno de los grupos. Se observó una úlcera gástrica en un cerdo del grupo 7, pero no se examinó específicamente linfoadenopatía. Sobre la base de la presencia de lesiones que fueran coherentes con una infección por PCV2, tres grupos presentaban al menos un cerdo con diagnóstico tentativo de PCV2 (PMWS). El grupo 8, que recibió dos dosis de vacuna muerta, presentaba un 20% de diagnóstico tentativo de PCV2, en tanto el grupo 7 y el grupo 4 presentaban un 13,3% y 6,7%, respecti-50 vamente, de diagnóstico tentativo de PCV2. El % promedio de puntajes de lesiones pulmonares varió según los gru-pos en el momento de la necropsia. Los grupos 1, 2, 3, 4, 6 y 10 tenían un bajo % de puntajes de lesiones de pul-món que variaba en un rango entre 0,11 ± 0,38% y 0,90 ± 0,15%. Como era de esperar, el grupo 9, el grupo control de prueba, presentaba el mayor % promedio de puntaje de lesión pulmonar (10,81 ± 23,27%). En cuatro grupos, el % promedio de puntajes de lesiones pulmonares era elevado debido a que uno a tres cerdos en cada uno de estos 55 grupos presentaba puntajes muy altos de lesiones de pulmón. Las lesiones pulmonares eran rojas/púrpuras y conso-lidadas. Típicamente, las lesiones pulmonares asociadas con PMWS se describen como de un color tostado, no co-lapsables con edema interlobular. Las lesiones pulmonares observadas en este estudio no estaban asociadas con una infección por PCV2 o podrían deberse a la presencia de un segundo agente infeccioso pulmonar. En el contexto

de este estudio, el % de puntajes de lesiones de pulmón probablemente no reflejen la medida real de la cantidad de infección de pulmón debido a PCV2. Asimismo, el diagnóstico tentativo de pneumonía también pudo haber sido utili-zado por demás. Todo cerdo con una lesión pulmonar, alguna tan pequeña como un 0,10%, fue catalogado con un diagnóstico tentativo de pneumonía. En este ejemplo, no había suficiente diferencia entre grupos con respecto a le-siones visibles y % de lesiones pulmonares sobre la cual basar la eficacia de la vacuna. 5

Los resultados de IHC mostraron las mayores diferencias entre grupos. El grupo 1 (16 µg de rORF2-IMS 1314) pre-sentaba los resultados positivos por IHC más bajos para el antígeno PCV2 (0%); en tanto los grupos 9 y 10 presen-taban los resultados positivos por IHC más altos con índices de incidencia del 100% y 93,3%, respectivamente. Los grupos 3, 5, 6 y 7, que recibieron 16, 4, 1 ó 0,25 µg de antígeno rORF2, respectivamente, con adyuvante de Car-bopol, presentaron índices de IHC positiva del 20%, 20%, 40% y 46,7%, respectivamente. El grupo 2, que recibió 10 dos dosis de 16 µg de vORF2 con adyuvante de Carbopol tenían un índice de IHC positiva del 6,7%, en tanto el gru-po 4 que solamente recibió una dosis de la misma vacuna, tenían un índice de IHC positiva del 13,3%. Debido a la naturaleza objetiva de esta prueba y al hecho que los resultados de IHC se correlacionan con los resultados espera-dos, las pruebas por IHC probablemente constituyan uno de los mejores parámetros sobre los cuales basar la efica-cia de la vacuna. 15

Se determina la dosificación protectora mínima (MPD) del antígeno rORF2 de PCV2 con adyuvante de Carbopol en el modelo de cerdo CDCD frente a una exposición a PCV2.Los grupos 3, 5, 6 y 7 recibieron cada uno dos dosis de antígeno rORF2 con adyuvante de Carbopol,pero el nivel de antígeno rORF2 variaba para cada grupo.Los grupos 3, 5, 6 y 7 recibieron cada uno 16, 4, 1 ó 0,25 µg de antígeno rORF2,respectivamente. En general, la disminución del nivel de antígeno rORF2 disminuyó también los títulos de anticuerpo PCV2,y aumentó el índice de mortalidad,el % 20 promedio de lesiones pulmonares y la incidencia de tejidos positivos por IHC. De los cuatro grupos que recibieron ni-veles variables de rORF2-Carbopol, los grupos 3 y 5,que recibieron dos dosis de 16 ó 4 µg de antígeno rORF2,respectivamente, tenían cada uno un índice de IHC positiva de tan solo un 20%,y cada uno presentaba títu-los de anticuerpo similares. En general, basado en los resultados de IHC positiva, la dosificación protectora mínima de antígeno rORF2 administrada dos veces es de 4 µg aproximadamente. 25

Se evaluó la antigenicidad de los antígenos recombinantes (rORF2) y VIDO R-1 (vORF2) de PCV2. El grupo 2 reci-bió dos dosis de 16 µg de vORF2 y el grupo 3 recibió dos dosis de 16 µg de rORF2. Ambas vacunas eran con adyu-vante de Carbopol. Se encontró asimismo que ambas vacunas eran seguras y presentaban un índice de mortalidad del 0%. El grupo 2 tenía un título de anticuerpo PCV2 de 2507 el día 25, en tanto el grupo 3 tenía un título de anti-cuerpo PCV2 de 1503. El grupo 3 presentaba un menor % promedio de puntaje de lesión pulmonar que el grupo 2 30 (0,11 ± 0,38% vs. 0,90 ± 0,15%), pero el grupo 2 presentaba un menor índice de incidencia de IHC positiva que el grupo 3 (6,7% vs. 20%). En general, ambas vacunas eran de una antigenicidad similar, pero vORF2 estaba asociado con resultados ligeramente mejores de IHC.

Se determinó la conveniencia de dos adyuvantes diferentes (Carbopol e IMS 1314). Los grupos 1 y 3 recibieron, ambos, dos dosis de vacuna que contiene 16 ug de antígeno rORF2, pero el grupo 1 recibió el antígeno con adyu-35 vante de IMS 1314 en tanto el grupo 3 recibió el antígeno en adyuvante de Carbopol. Ambos grupos presentaban esencialmente la misma ADWG, esencialmente la misma incidencia de signos clínicos después de la exposición, el mismo índice de mortalidad y esencialmente el mismo % promedio de lesiones pulmonares; pero el grupo 1 presen-taba un índice de IHC positiva del 0% en tanto el grupo 3 presentaba un índice de IHC positiva del 20%. Sin embar-go, el grupo 3, que recibió la vacuna con adyuvante de Carbopol, tenía títulos de IFAT PCV2 más altos los días 25, 40 32 y 50 que el grupo 1, que recibió la vacuna con adyuvante de IMS 1314. En general, aunque la vacuna PCV2 con adyuvante de IMS 1314 proporcionaba mejores resultados de IHC, no ofrecía una protección abrumadoramente me-jor contra una infección por PCV2 e inducía reacciones en el sitio de inyección. Por otro lado, la vacuna PCV2 con adyuvante de Carbopol se comportó casi igual que la vacuna con adyuvante de IMS 1314, pero no está asociada con ningún efecto adverso. 45

Se determinó la viabilidad de ORF2 PCV2 como un producto de 1 ml, 1 dosis. Los grupos 2 y 4 recibieron ambos 16 µg de vacuna vORF2 con adyuvante de Carbopol el día 0,pero el grupo 2 recibió una segundo dosis el día 14. El grupo 4 tenía una ADWG ligeramente mayor y un menor % promedio de lesiones pulmonares que el grupo 2,pero el grupo 2 presentaba títulos más altos de IFAT PCV2 los días 25, 32 y 50,y un índice de incidencia de tejidos positivos por IHC ligeramente menor. Todos los demás resultados para estos dos grupos fueron similares. En general,una do-50 sis de vORF2 con adyuvante de Carbopol se comportaba de manera similar a dos dosis de la misma vacuna.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de recuperar proteína recombinante expresada por el marco de lectura abierto 2 de PCV2 en el sobrenadante, en el que dicho método incluye las etapas de:

(i) infectar células en medio de crecimiento con un vector de baculovirus que contiene dicho marco de lectu-5 ra abierto 2;

(ii) provocar que dicho vector de baculovirus exprese dicha proteína de marco de lectura abierto 2; y

(iii) recuperar dicha proteína de marco de lectura abierto 2 en el sobrenadante,

en donde dicha recuperación se produce al menos 5 días después de la infección de las células con dicho vector de baculovirus. 10
2. El método de la reivindicación1, que comprende las etapas de

A) clonar dicho marco de lectura abierto 2 recombinante de PCV2 en un vector de transferencia;

B) introducir la parte de dicho vector de transferencia que contiene dicho marco de lectura abierto 2 recombi-nante en un baculovirus;

C) infectar células en medios con dicho baculovirus; 15

D) provocar que dicho baculovirus exprese la proteína de marco de lectura abierto 2 de dicho marco de lectura abierto 2;

E) separar del sobrenadante células que contienen dicho vector de baculovirus; y

F) recuperar dicha proteína de marco de lectura abierto 2 en dicho sobrenadante al menos cinco días después de infectar las células con dicho baculovirus. 20
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que la proteína de marco de lectura abierto 2 recombinante ex-presada es secretada por las células en el medio de crecimiento circundante, y en el que la proteína de marco de lectura abierto 2 se recupera en el sobrenadante más que del interior de las células.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho método incluye, además, la etapa de amplificar dicho marco de lectura abierto 2 de una cepa de PCV2 antes de clonar dicho marco de lectura abierto 25 en dicho vector de transferencia.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho marco de lectura abierto 2 com-prende, además, una secuencia seleccionada del grupo que consiste en una secuencia 5’ de Kozak, un sitio 3’ Eco-RI y combinaciones de los mismos.
6. El método de la reivindicación 5, en el que dicha secuencia 5’ de Kozak comprende la SEQ ID NO: 1. 30
7. El método de la reivindicación 5, en el que dicho sitio 3’ EcoRI comprende la SEQ ID NO: 2.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho marco de lectura abierto de PCV2 comprende la SEQ ID NO: 4.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha proteína de marco de lectura abierto 2 comprende la SEQ ID NO: 6. 35
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dichos medios comprenden medios de células de insecto libres de suero.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, que comprende, además, las etapas de:

i) antes de la etapa A, clonar dicho marco de lectura abierto 2 amplificado en un primer vector;

ii) escindir dicho marco de lectura abierto 2 de dicho primer vector; y 40

iii) utilizar dicho marco de lectura abierto 2 escindido en la etapa A.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dichas células comprenden células SF+.
13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la etapa de recuperación comprende la separación de desecho de células de la proteína de marco de lectura abierto 2 expresada en medios a través de 45 una etapa de separación, en donde la etapa de separación incluye preferiblemente filtración.
14. Un método de preparar una composición para invocar una respuesta inmune contra PCV2, comprendiendo dicho método las etapas de:

i) introducir una construcción en un baculovirus, comprendiendo dicha construcción ADN recombi-

nante de un marco de lectura abierto 2 de PCV2;

ii) infectar células con dicho baculovirus, estando dichas células en un medio de crecimiento;

iii) provocar que dicho baculovirus exprese la proteína de marco de lectura abierto 2 recombinante a partir de dicho marco de lectura abierto 2;

iv) recuperar dicha proteína de marco de lectura abierto 2 expresada en el sobrenadante, en donde 5 dicha proteína de marco de lectura abierto 2 se recupera al menos 5 días después de infectar di-chas células con dicho baculovirus; y

v) combinar dicha proteína de marco de lectura abierto 2 recuperada en el sobrenadante con un ad-yuvante adecuado u otro soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable.
15. El método de la reivindicación14, en el que la proteína de marco de lectura abierto 2 recombinante se se-10 creta por las células en el medio de crecimiento circundante, y en donde la proteína de marco de lectura abierto 2 se recupera en el sobrenadante más que del interior de las células.
16. El método de la reivindicación 14 o 15, en el que dicho método incluye, además, la etapa de obtener de un vector de transferencia dicha construcción.
17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en el que dicho método incluye, además, la eta-15 pa de amplificar dicho marco de lectura abierto 2 a partir de una cepa de PCV2 antes de clonar dicho marco de lec-tura abierto 2 en dicho vector de transferencia.
18. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en el que dicho marco de lectura abierto 2 re-combinante comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en una una secuencia 5’ de Kozak, un sitio 3’ EcoRI y combinaciones de los mismos. 20
19. El método de la reivindicación 18, en el que dicha secuencia 5’ de Kozak comprende la SEQ ID NO: 1.
20. El método de la reivindicación 18, en el que dicho sitio 3’ EcoRI comprende la SEQ ID NO: 2.
21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20, comprendiendo dicho marco de lectura abierto 2 de PCV2 la SEQ ID NO: 4.
22. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21, comprendiendo dicha proteína de marco de 25 lectura abierto 2 la SEQ ID NO: 6.
23. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 22, en el que dichos medios comprenden medios de células de insecto libres de suero.
24. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, que comprende, además, las etapas de:

i) clonar dicho marco de lectura abierto 2 en un primer vector; 30

ii) escindir dicho marco de lectura abierto 2 de dicho primer vector; y

iii) utilizar dicho marco de lectura abierto 2 escindido en dicho vector de

transferencia.
25. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 24, en el que dichas células comprende células SF+. 35
26. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 25, en el que dicha etapa de recuperación com-prende, además, la etapa de separar dichos medios de dichas células y desechos de células.
27. El método de la reivindicación 26, en el que dicha etapa de separación incluye la etapa de filtrar dichas cé-lulas, desechos de células y medio de crecimiento a través de un filtro que tiene poros que oscilan en tamaño de aproximadamente 0,45 µm a aproximadamente 1,0 µm. 40
28. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 27, en el que dicho método incluye, además, la etapa de inactivar dicho baculovirus añadiendo etilenimina binaria (BEI) ciclada y, después de haberse completado la inactivación, se añade una disolución de tiosulfato de sodio, antes de combinar dicha proteína de marco de lectura abierto 2 con un adyuvante adecuado.
29. Una composiciòn de materia, obtenible por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-28. 45
30. El uso de la composición de la reivindicación 29 para la preparación de un medicamento para la prevención de una infección por PCV2.
31. Composición de la reivindicación 29 para uso como un medicamento.
32. Composición de la reivindicación 29 para uso como una vacuna para la prevención de una infección por PCV2.
33. Composición de la reivindicación 29 para uso en un método de prevenir una infección por PCV2.
34. Un método para producir un kit de diagnóstico para la detección de una infección por PCV2 en una muestra, 5 que comprende

i) producir una proteína de marco de lectura abierto 2 recombinante según se recoge en una cual-quiera de las reivindicaciones 1-28;

ii) y envasar dicha proteína de marco de lectura abierto 2 recombinante en un recipiente adecuado.
35. El método de la reivindicación 34, que comprende, además, la etapa de incluir un manual de instrucciones 10 con el recipiente que incluya la proteína de marco de lectura abierto 2 recombinante.
36. Kit que incluye al menos un recipiente que comprende al menos una dosis de la composición de la reivindi-cación 29, en donde dicha composición es inmunogénica y una dosis comprende al menos 2 µg de proteína de mar-co de lectura abierto 2 de PCV2.
37. Kit que comprende i) un recipiente que contiene al menos una dosis de la composición de la reivindicación 15 29 y ii) un recipiente que contiene una composición inmunogénica que comprende antígeno de PRRS.
38. Kit de la reivindicación 37, en donde el antígeno de PRRS es IngelVac PRRS MLV.