ES2629679T3 - Composiciones inmunogénicas para PCV2 y métodos para producir composiciones de este tipo - Google Patents

Abstract

Una composición inmunogénica que comprende 4 a 400 μg/dosis de proteína ORF2 de PCF2 recombinante y uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables para uso en un método para conferir inmunidad protectora contra los signos clínicos de infección por PCV2 en un cerdo, en donde dicho método consiste en la administración de una dosis de dicha composición inmunogénica a dicho cerdo.

Description

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contienen diferentes cantidades conocidas de proteína ORF2 del PCV2 recombinante. Luego se puede trazar una curva estándar basado en las muestras conocidas y determinar la cantidad de ORF2 del PCV2 recombinante en la muestra desconocida por comparación con esta curva estándar. Dado que los ELISA son reconocidos en general como el estándar de la industria para la cuantificación de antígeno, constituyen los métodos preferidos para la cuantificación.

Por lo tanto, también se describe aquí un ELISA para la cuantificación de la proteína ORF2 del PCV2 recombinante. El ELISA preferido provisto en la presente generalmente comienza con una dilución 1:6000 del anticuerpo de captura o una dilución de trabajo apropiada en solución amortiguadora de recubrimiento. El anticuerpo de captura preferido es el anti-PAb Prot. G PCV2 de cerdo purificado y la solución amortiguadora de recubrimiento preferida es una solución amortiguadora de carbonato 0,05 M, que se puede elaborar combinando 2,93 g de NaHCO3 (Sigma, Nº Cat. S-6014 o su equivalente) y 1,59 g de NaCO3 (Sigma, Nº Cat. S-6139 o su equivalente). La mezcla se combina con agua destilada, o su equivalente, para obtener un litro a un pH de 9,6 ± 0,1. A continuación, el anticuerpo de captura se diluye 1:6000, o cualquier otra dilución de trabajo apropiada, en solución amortiguadora de recubrimiento. Por ejemplo, para cuatro placas, se necesitarán 42 mL de solución amortiguadora de recubrimiento y siete µL de anticuerpo de captura. Con el método de pipeteo inverso, se agregan 100 µL de anticuerpo de captura diluido a todos los pocillos. Con el fin de obtener un recubrimiento homogéneo, se deben golpear suavemente los lados de cada placa. Las placas se sellan luego con selladores de placa, antes de apilar las placas y terminar la pila con una placa de 96 pocillos vacía. Las placas se incuban luego durante la noche (14-24 horas) a 35-39°C. Después, cada placa se lava tres veces con solución amortiguadora de lavado usando el lavador de placas para microtitulación UltraWash Plus definido en 250 µL/lavado con tres lavado y sin tiempo de remojo. Después del último lavado, las placas se golpean suavemente sobre una toalla de papel. Nuevamente, usando la técnica de pipeteo inverso, se deberían agregar 250 µL de solución de bloqueo a todos los pocillos. Las placas de prueba se sellan y se incuban durante una hora aproximadamente (± cinco minutos) a 35-37°C. Preferentemente, las placas no se apilarán después de esta etapa. Durante la etapa de bloqueo se deben extraer todas las muestras de prueba y descongelarlas a temperatura ambiente. A continuación, se deben preparar cuatro placas de dilución separadas por adición de 200 µL de solución de diluyente a todos los pocillos restantes, excepto la fila A y la fila H, columnas 1-3. A continuación, se rotularán seis tubos de ensayo de la siguiente manera, título bajo, título medio, título alto, inactivado/filtrado (1:240), inactivado/filtrado (1:480) y control interno. En los tubos indicados, se debe preparar la dilución apropiada para las siguientes muestras de prueba. Las muestras de prueba descongeladas deben ser agitadas por vortexeo antes del uso. Para cuatro placas, se efectuarán las siguientes diluciones: A) el título bajo no será pre-diluido: 3,0 mL de título bajo; B) control negativo a una dilución 1:30 (células SF+): 3,77 mL de diluyente + 130 µL de control negativo; C) título medio a una dilución 1:30 (8 µg/mL): 3,77 mL de diluyente + 130 µL de título medio; D) título alto a una dilución 1:90 (16 µg/mL): 2,967 mL de diluyente + 33 µL de título alto; E) inactivado/filtrado a una dilución 1:240: 2,39 mL de diluyente + 10 µL de muestra inactivada/filtrada; F) inactivado/filtrado a una dilución

1:480: 1,0 mL de diluyente + 1,0 mL de inactivado/filtrado (1:240) preparada con una muestra de E anterior; G) control interno a una dilución 1:30: 3,77 mL de diluyente + 130 µL de control interno. A continuación, se agregan 300 µL de las muestras preparadas a los correspondientes pocillos vacíos en las placas de dilución para las placas 1 a 4. Luego se define el pipeteador automático de múltiples canales en 100 µL y el contenido de la fila A se mezcla mediante pipeteo hacia arriba y abajo al menos 5 veces y luego se transfieren 100 µL a la fila B usando la técnica de pipeteo inverso. Se deben cambiar las puntas y avanzar por la placa utilizando este mismo procedimiento hasta la fila G. Ahora las muestras en estas placas de dilución están listas para su transferencia a las placas de prueba una vez lavadas dichas placas de prueba 3 veces con solución amortiguadora de lavado usando el lavador de placas para microtitulación UltraWash Plus (ajustes en 250 µL/lavado, 3 lavados, sin tiempo de remojo). Después del último lavado, las placas se golpearán suavemente sobre una toalla de papel. A continuación, se transfiere el contenido de la placa de dilución a la placa de prueba usando un procedimiento de transferencia simple. Más específicamente, comenzando por la fila H, se transfieren 100 µL/pocillo de la(s) placa(s) de dilución a los correspondientes pocillos de la(s) placa(s) de prueba usando la técnica de pipeteo inverso. Se deben cambiar las puntas de pipeta después de cada transferencia. De la fila G, se transfieren 100 µL/pocillo de la(s) placa(s) de dilución a los correspondientes pocillos de la(s) placa(s) de prueba usando la técnica de pipeteo inverso. Se puede emplear el mismo juego de puntas de pipeta para las transferencias restantes. Para asegurar una solución homogénea para la transferencia, la solución debe pipetearse hacia arriba y abajo al menos 3 veces antes de la transferencia. A continuación, las(s) placa(s) de prueba se sella(n) y se incuba(n) durante 1,0 hora ± 5 minutos a 37 °C ± 2,0°C. Nuevamente, es preferible no apilar las placas. Las placas se lavan luego 3 veces con solución amortiguadora de lavado usando el lavador de placas para microtitulación UltraWash Plus (ajustes en 250 µL/lavado, 3 lavados y sin tiempo de remojo). Después del último lavado, las placas se golpean suavemente sobre una toalla de papel. Con la técnica de pipeteo inverso, se agregan 100 µL de anticuerpo de detección diluido 1:300, o una dilución de trabajo apropiada, en solución diluyente a todas las cavidades de la(s) placa(s) de prueba. Por ejemplo, para cuatro placas, se necesitarán 42 mL de solución diluyente con 140 µL de anticuerpo de captura. La(s) placa(s) de prueba se sella(n) y se incuba(n) durante 1,0 hora 5 minutos a 37°C 2,0°C. Nuevamente, las placas se lavan 3 veces con solución amortiguadora de lavado usando el lavador de placas para microtitulación UltraWash Plus (ajustes en 250 µl/lavado, 3 lavados y sin tiempo de remojo). Después del último lavado, las placas se golpean suavemente sobre una toalla de papel. A continuación, se prepara el diluyente de conjugación por adición de suero de conejo normal 1% al diluyente. Por ejemplo, para cuatro placas, se agregan 420 µl de suero de conejo normal a 42 ml de diluyente. El anticuerpo conjugado es diluido a 1:10.000, o cualquier otra dilución de trabajo apropiada, en una solución diluyente de conjugación recién preparada para todos los pocillos de la(s) placa(s) de prueba. Con la técnica de pipeteo inverso,

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se agregan 100 µL de este anticuerpo conjugado diluido a todos los pocillos. La(s) placa(s) de prueba se sella(n) y se incuba(n) durante 45 ± 5 minutos a 37°C ± 2,0°C. Preferentemente, no se apilan las placas. Las placas se lavan luego 3 veces con solución amortiguadora de lavado usando el lavador de placas para microtitulación UltraWash Plus (ajustes en 250 µL/lavado, 3 lavados y sin tiempo de remojo). Después del último lavado, las placas se golpean suavemente sobre una toalla de papel. A continuación, se mezclan volúmenes iguales de sustrato de peroxidasa TMB (reactivo A) con solución de peroxidasa B (reactivo B) inmediatamente antes del uso. La cantidad mezclada varía según la cantidad de placas, pero cada placa necesitará 10 mL/placa ± 2 mL. Por ello, para 4 placas, serán 21 mL de reactivo A + 21 mL de reactivo B. Con la técnica de pipeteo inverso, se agregan 100 µL de sustrato a todas las cavidades de la(s) placa(s) de prueba. Las placas se incuban luego a temperatura ambiente durante 15 minutos ± 15 segundos. La reacción se detiene por la adición de 100 µL de solución de HCl 1 N a todas los pocillos usando la técnica de pipeteo inverso. Luego se enciende el lector de placas de ELISA y se deja que proceda por las fases de diagnóstico y evaluación de manera convencional.

También se describe aquí, un método para construir un vector viral recombinante que contiene ADN de ORF2 del PCV2 y expresar la proteína ORF2 del PCV2 en grandes cantidades, cuando infectan células susceptibles. Se ha encontrado sorprendentemente que el vector viral recombinante provisto en la presente expresa grandes cantidades, definidas precedentemente, de ORF2 del PCV2 después de infectar células susceptibles. Por lo tanto, también se describe aquí un método mejorado para producir y/o recuperar la proteína ORF2 del PCV2, que preferentemente comprende la etapa de: construir un vector viral recombinante que contiene ADN de ORF2 del PCV2 y expresar la proteína ORF2 del PCV2. Preferentemente, el vector viral es un baculovirus recombinante. A continuación se describirán los detalles del método para construir vectores virales recombinantes que contienen ADN de ORF2 del PCV2 y para expresar la proteína ORF2 del PCV2, provista en la presente: En realizaciones preferidas, el vector viral recombinante que contiene ADN de ORF2 del PCV2 y expresa la proteína ORF2 del PCV2 usado para infectar las células es generado por transfección de un vector de transferencia, que contiene un gen ORF2 clonado en el mismo, en un vector viral. Preferentemente, solamente se transfecta al vector viral la porción del vector de transferencia que contiene ADN de ORF2. La expresión “transfectado en un vector viral” significa, y se usa como sinónimo de, “introducir” o “clonar“ un ADN heterólogo en un vector viral, tal como por ejemplo en un vector de baculovirus. El vector viral preferible aunque no necesariamente es un baculovirus.

Por lo tanto, el vector viral recombinante puede ser generado por recombinación entre un vector de transferencia que contiene ADN heterólogo de ORF2 del PCV2 y un vector viral, preferentemente un baculovirus, aún más preferentemente un baculovirus linearizado de replicación deficiente (tal como BaculoGold DNA). Un “vector de transferencia” se refiere a una molécula de ADN, que incluye al menos un origen de replicación, el gen heterólogo, en este caso la ORF2 del PCV2, y secuencias de ADN que permiten la clonación de dicho gen heterólogo en el vector viral. Preferentemente, las secuencias que permiten clonar un gen heterólogo en el vector viral flanquean al gen heterólogo. Aún más preferentemente, dichas secuencias flanqueadoras son homólogas, al menos en parte, de secuencias del vector viral. La homología de secuencia permite entonces la recombinación de ambas moléculas, el vector viral y el vector de transferencia, para generar un vector viral recombinante que contiene al gen heterólogo. Un vector de transferencia preferido es el vector pVL1392 (BD Biosciences Pharmingen), diseñado para la cotransfección con el BaculoGold DNA en la línea de células Sf+ preferida. Preferentemente, dicho vector de transferencia comprende ADN de ORF2 del PCV2. La construcción cotransfectada es de 10.387 pares de bases aproximadamente de longitud.

En formas más preferidas, los métodos descritos aquí comenzarán con el aislamiento de ADN de ORF2 del PCV2. Generalmente, este puede provenir de una cepa conocida o desconocida ya que el ADN de ORF2 parece estar altamente conservado, con al menos un 95% de identidad de secuencia aproximadamente entre las diferentes formas aisladas. Se puede utilizar cualquier gen ORF2 PCV2 conocido en la técnica a los efectos de la presente invención, ya que cada uno se expresará en el sobrenadante. El ADN de ORF2 del PCV se amplifica empleando preferentemente métodos de PCR, con mayor preferencia aún junto con la introducción de la secuencia consenso de Kozak flanqueadora 5' (CCGCCAUG) (SEQ ID Nº: 1) y/o un sitio EcoR1 flanqueador 3' (GAATTC) (SEQ ID Nº: 2). Dicha introducción del consenso de Kozak 5' elimina preferentemente el codón de inicio natural AUG de ORF2 del PCV2. El sitio EcoR1 3' se introduce preferentemente 3’ con respecto al codón de terminación de ORF2 del PCV2. Más preferentemente, se introduce 3’ con respecto a una secuencia de terminación de la transcripción poli A, donde dicha secuencia está ubicada 3’ con respecto al codón de terminación de ORF2 del PCV2. Se ha encontrado que el uso de la secuencia consenso de Kozak, en particular la que se describió precedentemente, incrementa el nivel de expresión de la subsiguiente proteína ORF2 del PCV2. El ADN de ORF2 del PCV2 amplificado, con estas secuencias adicionales, es clonado en un vector. Un vector preferido para este paso de clonación inicial es el vector pGEM-T-Easy (Promega, Madison, WI). El ADN de ORF2 del PCV2 que incluye algunas secuencias del vector pGEM (SEQ ID Nº: 7) se recorta preferentemente del vector en el sitio de restricción Not1. El ADN resultante se clona luego en el vector de transferencia.

Por lo tanto, se describe aquí un método para construir un vector viral recombinante que contiene al ADN del ORF2 PCV2. Este método comprende las etapas de: i) clonar un ORF2 PCV2 recombinante en un vector de transferencia; y ii) transfectar la porción del vector de transferencia que contiene a ORF2 del PCV2 recombinante en un vector viral, para generar el vector viral recombinante. Preferentemente, el vector de transferencia es el que se describió precedentemente o se construye como se describió precedentemente o como se muestra a modo de ejemplo en la figura 1. Por consiguiente, de acuerdo con un aspecto adicional, el vector de transferencia, usado para la

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construcción del vector viral recombinante descrito en la presente, contiene la secuencia de la SEQ ID Nº: 7.

De acuerdo con un aspecto adicional, este método comprende además antes de la etapa i) la siguiente etapa: amplificar el ADN de ORF2 del PCV2 in vitro, donde las secuencias flanqueadoras del ADN de ORF2 del PCV2 fueron modificadas como se describió precedentemente. Los métodos in vitro para amplificar el ADN de ORF2 del PCV2 y modificar las secuencias flanqueadoras, clonar in vitro el ADN de ORF2 del PCV2 amplificado en un vector de transferencia y los vectores de transferencia adecuados se describieron precedentemente, se muestran a modo de ejemplo en la figura 1, o son conocidos por los especialistas en la técnica. Por lo tanto, se describe además aquí un método para construir un vector viral recombinante que contiene ADN de ORF2 del PCV2 y expresar la proteína ORF2 del PCV2 que comprende las etapas de: i) amplificar ADN de ORF2 del PCV2 in vitro, donde las secuencias flanqueadoras de dicho ADN de ORF2 del PCV2 están modificadas, ii) clonar el ADN de ORF2 del PCV2 amplificado en un vector de transferencia; y iii) transfectar el vector de transferencia, o una porción del mismo que contiene al ADN de ORF2 del PCV2 recombinante, en un vector viral para generar el vector viral recombinante. Preferentemente, la modificación de las secuencias flanqueadoras del ADN de ORF2 del PCV2 se efectúa como se describió precedentemente, por ejemplo introduciendo una secuencia Kozak 5’ y/o un sitio EcoR1, preferentemente como se describió precedentemente.

De acuerdo con un aspecto adicional, se provee un método para producir y/o recuperar la proteína recombinante expresada por el marco de lectura abierto 2 del PCV2. El método comprende en general las etapas de: i) clonar un ORF2 del PCV2 recombinante en un vector de transferencia; ii) transfectar la porción del vector de transferencia que contiene al ORF2 del PCV2 recombinante en un virus; iii) infectar células en un medio con el virus transfectado; iv) lograr que el virus transfectado exprese la proteína recombinante de la ORF2 del PCV2; v) separar las células del sobrenadante; y vi) recuperar la proteína ORF2 del PCV2 expresada del sobrenadante.

Los métodos de cómo clonar un ADN de ORF2 del PCV2 recombinante en un vector de transferencia fueron descritos precedentemente. Preferentemente, el vector de transferencia contiene a la secuencia de las SEQ ID Nº:3, SEQ ID Nº:4, SEQ ID Nº:7. Sin embargo, el vector de transferencia puede contener cualquier ADN de ORF2 del PCV2, modificado o no modificado, siempre que el ADN de ORF2 del PCV2, cuando es transfectado en un vector viral recombinante, sea expresado en un cultivo celular. Preferentemente, el vector viral recombinante comprende la secuencia de la SEQ ID Nº:8. Más aún, los métodos para infectar linfocitos T, preferentemente para infectar linfocitos T de insecto con un número definido de baculovirus recombinantes que contienen ADN de ORF2 del PCV2 y para expresar la proteína ORF2 del PCV2 se describieron precedentemente con mayor detalle. Más aún, las etapas de separación de las células del sobrenadante así como las etapas de recuperación de la proteína ORF2 del PCV2 expresada también se describieron precedentemente con detalle. Todas estas etapas de proceso específicas, descritas en la presente, forman parte del método para producir y/o recuperar la proteína recombinante expresada por el marco de lectura abierto 2 de PCV2 según se describió precedentemente. Preferentemente, las células son células Sf+. Más preferentemente aún, los cultivos celulares presentan un recuento celular de 0,3-2,0 x 106 células/mL aproximadamente, más preferentemente de 0,35-1,9 x 106 células/mL aproximadamente, más preferentemente aún de 0,4-1,8 x 106 células/mL aproximadamente, aún más preferentemente de 0,45-1,7 x 106 células/mL aproximadamente y con mayor preferencia de 0,5-1,5 x 106 células/mL aproximadamente. Preferentemente, el vector viral recombinante que contiene al ADN de ORF2 del PCV2 tiene una multiplicidad de infección (MOI) preferida de 0,03-1,5 aproximadamente, más preferentemente de 0,05-1,3 aproximadamente, más preferentemente aún 0,09-1,1 aproximadamente, más preferentemente aún de 0,1-1,0 aproximadamente y con mayor preferencia de 0,5 aproximadamente, cuando se usa para la infección de las células susceptibles. Preferentemente, la proteína ORF2 del PCV2 se recupera del sobrenadante celular obtenido entre los días 5 y 8 después de la infección y/o cuando la viabilidad celular disminuye a menos del 10%. Preferentemente, para producir la proteína ORF2 del PCV2, las células se cultivan a 25-29°C. Preferentemente, la etapa de separación es una etapa de centrifugación o de filtración.

Opcionalmente, este método puede incluir la etapa de amplificar el ADN de ORF2 del PCV2 a partir de una cepa de PCV2 antes de clonar el ADN de ORF2 del PCV2 en el vector de transferencia. En realizaciones preferidas, también se puede agregar una secuencia de Kozak 5', un sitio EcoR1 3' y combinaciones de los mismos, a la secuencia amplificada, preferentemente antes o durante la amplificación. La secuencia de Kozak 5’ preferida comprende la SEQ ID Nº: 1. El sitio EcoR1 3’ preferido comprende la SEQ ID Nº: 2. El ADN de ORF2 del PCV2 preferido comprende la secuencia de nucleótidos de Genbank, Nº Acceso AF086834 (SEQ ID Nº: 3) y SEQ ID Nº: 4. La proteína ORF2 del PCV2 recombinante preferida comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 5, que es la proteína codificada por la SEQ ID Nº: 3 (Genbank, Nº Acceso AF086834) y la SEQ ID Nº: 6, que es la proteína codificada por la SEQ ID Nº: 4. El medio preferido comprende medio para células de insecto sin suero, más preferentemente aún el medio Excell 420. Cuando se efectúa la etapa de amplificación opcional, se prefiere clonar primero el marco de lectura abierto 2 amplificado en un primer vector, recortar el marco de lectura abierto 2 de dicho primer vector y usar el marco de lectura abierto recortado para su clonación en el vector de transferencia. La línea celular preferida para la cotransfección es la línea celular SF+. El virus preferido para la cotransfección es el baculovirus. En realizaciones preferidas de este método, la porción transfectada del vector de transferencia comprende la SEQ ID Nº: 8. Finalmente, para este método, se prefiere recuperar la proteína del marco de lectura abierto 2 (ORF2) del PCV2 en el sobrenadante del cultivo celular al menos 5 días después de infectar las células con el virus.

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Por lo tanto, además se describe aquí un método para producir y/o recuperar el marco de lectura abierto 2 del PCV2, que comprende las etapas de: i) amplificar el ADN de ORF2 del PCV2 in vitro, preferentemente por adición de una secuencia Kozak 5’ y/o por adición de un sitio de restricción EcoR1 3’, ii) clonar la ORF2 del PCV2 amplificado en un vector de transferencia; iii) transfectar la porción del vector de transferencia que contiene ORF2 del PCV2 recombinante en un virus; iv) infectar células en un medio con el virus transfectado; v) lograr que el virus transfectado exprese la proteína recombinante ORF2 del PCV2; vi) separar las células del sobrenadante; y vii) recuperar la proteína ORF2 del PCV2 expresada del sobrenadante.

Además se describe aquí un método para preparar una composición que comprende la proteína ORF2 del PCV2 y un vector viral inactivado. Este método comprende las etapas de: i) clonar ORF2 del PCV2 amplificado en un vector de transferencia; ii) transfectar la porción del vector de transferencia que contiene ORF2 del PCV2 recombinante en un virus; iii) infectar las células en el medio con el vector viral transfectado; iv) lograr que el vector viral transfectado exprese la proteína recombinante de ORF2 del PCV2; v) separar las células del sobrenadante; vi) recuperar la proteína ORF2 del PCV2 expresada del sobrenadante; y vii) inactivar el vector viral recombinante. Preferentemente, el vector viral recombinante es un baculovirus que contiene secuencias de ADN codificantes de ORF2 y las células son células Sf+. Las etapas de separación preferidas son las que se describieron precedentemente, siendo más preferida la etapa de filtración. Las etapas de inactivación preferidas son las que se describieron precedentemente. Preferentemente, la inactivación se realiza a 35-39 °C aproximadamente y en presencia de BEI 2 a 8 mM, aún más preferentemente en presencia de BEI 5 mM aproximadamente. Se ha encontrado sorprendentemente que concentraciones más altas de BEI afectan negativamente la proteína ORF2 del PCV2 y que concentraciones más bajas no son eficaces para inactivar el vector viral dentro de las 24 a 72 horas de inactivación. Preferentemente, la inactivación se realiza durante al menos 24 horas, con mayor preferencia aún durante 24 a 72 horas.

De acuerdo con un aspecto adicional, el método para preparar una composición que comprende la proteína ORF2 del PCV2, y el vector viral inactivado, descrito precedentemente, también incluye una etapa de neutralización después de la etapa vii). Esta etapa viii) comprende la adición de una cantidad equivalente de un agente que neutraliza al agente de inactivación a la solución. Preferentemente, si el agente de inactivación es BEI, se prefiere agregar una cantidad equivalente de tiosulfato de sodio. Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto adicional, la etapa viii) comprende la adición de una solución de tiosulfato de sodio a una concentración final entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 mM, preferentemente entre aproximadamente 2 y aproximadamente 10 mM, más preferentemente aún entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8 mM, más preferentemente aún entre aproximadamente 3 y aproximadamente 7 mM, con mayor preferencia de aproximadamente 5 mM, cuando el agente de inactivación es BEI.

De acuerdo con un aspecto adicional, el método para preparar una composición que comprende la proteína ORF2 del PCV2 y el vector viral inactivado, descrito precedentemente, comprende antes de la etapa i) la siguiente etapa: amplificar el ADN de ORF2 del PCV2 in vitro, donde las secuencias flanqueadoras del ADN de ORF2 del PCV2 están modificadas según se describió precedentemente. Los métodos in vitro para amplificar el ADN de ORF2 del PCV2 y para modificar las secuencias flanqueadoras, clonar in vitro el ADN de ORF2 del PCV2 amplificado en un vector de transferencia y los vectores de transferencia adecuados fueron descritos precedentemente, se muestran a modo de ejemplo en la figura 1 o son conocidos por los especialistas en la técnica. Entonces, de acuerdo con un aspecto adicional, este método comprende las etapas de: i) amplificar el ADN de ORF2 del PCV2 in vitro, donde las secuencias flanqueadoras de dicho ADN de ORF2 del PCV2 están modificadas, ii) clonar el ADN de ORF2 del PCV2 amplificado en un vector de transferencia; y iii) transfectar el vector de transferencia, o una porción del mismo que contiene al ADN de ORF2 del PCV2 recombinante, en un vector viral para generar el vector viral recombinante, iv) infectar células en un medio con el virus transfectado; v) lograr que el virus transfectado exprese la proteína recombinante de ORF2 del PCV2; vi) separar las células del sobrenadante; vii) recuperar la proteína ORF2 del PCV2 expresada del sobrenadante; viii) inactivar el vector viral recombinante, preferentemente, en presencia de BEI entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 mM, con mayor preferencia en presencia de BEI 5 mM aproximadamente; y ix) agregar una cantidad equivalente de un agente capaz de neutralizar el agente de inactivación en la solución, preferentemente, agregar una solución de tiosulfato de sodio a una concentración final entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 mM, preferentemente de aproximadamente 5 mM, cuando el agente de inactivación es BEI.

También se describe aquí un método para preparar una composición, preferentemente una composición antigénica, tal como, por ejemplo, una vacuna, para generar una respuesta inmune contra PCV2. En general, este método incluye las etapas de transfectar una construcción en un virus, donde dicha construcción comprende i) ADN recombinante de ORF2 del PCV2, ii) infectar células en un medio de crecimiento con el virus transfectado, iii) lograr que el virus exprese la proteína recombinante ORF2 del PCV2, iv) recuperar la proteína ORF2 expresada del sobrenadante y v) preparar la composición combinando la proteína recuperada con un adyuvante adecuado y/u otro vehículo aceptable para uso farmacéutico.

“Adyuvantes”, tal como se definen en la presente, pueden incluir hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, saponinas como por ejemplo, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge, MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), una emulsión de agua-en-aceite, una emulsión de aceite-en-agua, una emulsión de agua-en-aceite-en-agua. La emulsión se puede basar particularmente en aceite parafínico líquido liviano (tipo Farmacopea Europea); aceite de isoprenoides tal como escualano o escualeno; aceite obtenido por

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teoligomerización de alquenos, en particular de isobuteno o deceno; ésteres de ácidos o de alcoholes que contienen un grupo alquilo lineal, más particularmente aceites vegetales, oleato de etilo, di-(caprilato/caprato) de propilenglicol, tri-(caprilato/caprato) de glicerilo o dioleato de propilenglicol; ésteres de ácidos o alcoholes grasos ramificados, en particular ésteres del ácido isoesteárico. El aceite se usa en combinación con emulsionantes para formar la emulsión. Los emulsionantes son preferentemente agentes tensioactivos no iónicos, en particular ésteres de sorbitano, de manida (por ejemplo, oleato de anhidromanitol), de glicol, de poliglicerol, de propilenglicol y de ácido oleico, isoesteárico, ricinoleico o hidroxiesteárico, que están opcionalmente etoxilados, y bloques de copolímeros de polioxipropileno-polioxietileno, en particular los productos Pluronic, en especial L121. Véase Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull, D. E. S.). John Wiley and Sons, NY, págs. 51-94 (1995) y Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997).

Por ejemplo, es posible usar la emulsión SPT descrita en la página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" editado por M. Powell y M. Newman, Plenum Press, 1995, y la emulsión MF59 descrita en la página 183 del mismo libro.

Un caso adicional de un adyuvante es un compuesto seleccionado entre polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros de anhídrido maleico y derivados alquenilo. Los compuestos adyuvantes ventajosos son los polímeros de ácido acrílico o metacrílico entrecruzados, en especial con éteres de polialquenilo de azúcares o polialcoholes. Estos compuestos se conocen con el término de carbómeros (Phameuropa Vol. 8, Nº 2, junio de 1996). Los especialistas en la técnica también pueden consultar la Patente de EE.UU. Nº: 2.909.462 en la que se describen dichos polímeros de acrílico entrecruzados con un compuesto polihidroxilado que contiene al menos 3 grupos hidroxilo, preferentemente no más que 8, donde los átomos de hidrógeno de al menos tres hidroxilos están sustituidos por radicales alifáticos insaturados de al menos 2 átomos de carbono. Los radicales preferidos son los que contienen entre 2 y 4 átomos de carbono, por ejemplo vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden contener ellos mismos otros sustituyentes, tal como metilo. Los productos comercializados con el nombre Carbopol (BF Goodrich, Ohio, EE.UU.) son particularmente apropiados. Están entrecruzados con una sacarosa de alilo o con alilo pentaeritritol. Entre ellos, se puede mencionar Carbopol 974P, 934P y 971P. Más preferido es el uso de Carbopol 971P. Entre los copolímeros de anhídrido maleico y derivados alquenilo, los copolímeros EMA (Monsanto) que son copolímeros de anhídrido maleico y etileno. La disolución de estos polímeros en agua permite obtener una solución ácida que será neutralizada, preferentemente hasta un pH fisiológico, con el fin de obtener la solución adyuvante en la cual se incorporará la propia composición inmunogénica, inmunológica o vacuna.

Otros adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan al sistema adyuvante RIBI (Ribi Inc.), copolímeros de bloques (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), monofosforil lípido A, adyuvante de avridina lípidoamina, enterotoxina lábil al calor de E. coli (recombinante u otro), toxina de cólera, IMS 1314 o dipéptido muramilo entre muchos otros.

Preferentemente, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 100 µg y aproximadamente 10 mg por dosis. Con mayor preferencia aún, la cantidad de adyuvante añadida comprende entre aproximadamente 100 µg y aproximadamente 10 mg por dosis. Con mayor preferencia aún, la cantidad de adyuvante añadida comprende entre aproximadamente 500 µg y aproximadamente 5 mg por dosis. Con mayor preferencia aún, la cantidad de adyuvante añadida comprende entre aproximadamente 750 µg y aproximadamente 2,5 mg por dosis. Con mayor preferencia, la cantidad de adyuvante añadida es de aproximadamente 1 mg por dosis.

Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto adicional, el método para preparar una composición antigénica, tal como por ejemplo una vacuna, para generar una respuesta inmune contra PCV2 comprende i) preparar y recuperar la proteína ORF2 del PCV2 y ii) mezclarla con un adyuvante adecuado. Preferentemente, el adyuvante es Carbopol 971P. Con mayor preferencia aún, se agrega una cantidad de Carbopol 971P que comprende entre aproximadamente 500 µg y aproximadamente 5 mg por dosis, con mayor preferencia aún una cantidad que comprende entre aproximadamente 750 µg y aproximadamente 2,5 mg por dosis y con mayor preferencia una cantidad que comprende aproximadamente 1 mg por dosis. Preferentemente, el paso de proceso i) incluye las etapas de proceso descritas para la preparación y recuperación de la ORF2 del PCV2. Por ejemplo, en realizaciones preferidas de este método, la construcción que comprende el ADN de la ORF2 del PCV2 se obtiene en un vector de transferencia. Los vectores de transferencia adecuados y los métodos para prepararlos fueron descritos precedentemente. Opcionalmente, el método puede incluir el paso de amplificar la ORF2 a partir de una cepa de PCV2 mediante PCR antes de clonar la ORF2 en el vector de transferencia. Las secuencias de marco de lectura abierto, secuencias de Kozak, secuencias del sitio EcoR1 3’, secuencias de proteínas recombinantes, secuencias de construcciones transfectadas, medios, células y virus preferidos son como se describieron para los métodos precedentes. Otra etapa opcional para este método incluye clonar el ADN de la ORF2 del PCV2 amplificado en un primer vector, recortar el ADN de la ORF2 de este primer vector y usar este ADN de la ORF2 del PCV2 recortado para clonarlo en el vector de transferencia. Al igual que con los otros métodos, se prefiere esperar durante al menos 5 días después de la infección de las células por el baculovirus transfectado antes de recuperar la proteína ORF2 recombinante del sobrenadante. Preferentemente, la etapa de recuperación de este método también incluye la etapa de separar el medio de las células y de los desechos celulares. Esto se puede realizar de diversas maneras, pero para mayor facilidad y conveniencia, se prefiere filtrar las células, los desechos celulares y el medio de crecimiento a través de un filtro cuyos poros varían en un intervalo de tamaños entre aproximadamente 0,45 µM y aproximadamente 1,0 µM.

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Finalmente, para este método, se prefiere incluir una etapa de inactivación del virus antes de combinar la proteína ORF2 del PCV2 recombinante recuperada en una composición. Esto se puede realizar de diversas maneras, pero para la práctica de la presente invención se prefiere usar BEI.

Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto adicional, este método comprende las etapas de: i) amplificar el ADN de la ORF2 del PCV2 in vitro, donde las secuencias flanqueadoras de dicho ADN de la ORF2 del PCV2 están modificadas, ii) clonar el ADN de la ORF2 del PCV2 amplificado en un vector de transferencia; y iii) transfectar el vector de transferencia, o una porción del mismo que contiene al ADN de la ORF2 del PCV2 recombinante, en un vector viral para generar el vector viral recombinante, iv) infectar las células en un medio con el virus transfectado; v) lograr que el virus transfectado exprese la proteína recombinante de la ORF2 del PCV2; vi) separar las células del sobrenadante; vii) recuperar la proteína ORF2 del PCV2 expresada del sobrenadante; viii) inactivar el vector viral recombinante, preferentemente en presencia de BEI entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 mM, con mayor preferencia en presencia de BEI aproximadamente 5 mM; ix) agregar una cantidad equivalente de un agente capaz de neutralizar al agente de inactivación en la solución, preferentemente por adición de una solución de tiosulfato de sodio a una concentración final entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 mM, preferentemente de aproximadamente 5 mM, cuando el agente de inactivación es BEI, y x) agregar una cantidad adecuada de un adyuvante, preferentemente agregar Carbopol, más preferentemente Carbopol 971P, con mayor preferencia aún en las cantidades descritas precedentemente (por ejemplo entre aproximadamente 500 µg y aproximadamente 5 mg por dosis, con mayor preferencia aún una cantidad entre aproximadamente 750 µg y aproximadamente 2,5 mg por dosis y con mayor preferencia una cantidad de aproximadamente 1 mg por dosis).

Además, la composición puede incluir uno o más vehículos aceptables para uso farmacéutico. Tal como se utiliza en la presente, "un vehículo aceptable para uso farmacéutico" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes estabilizantes, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes que demoran la absorción y semejantes. Con mayor preferencia, la composición provista en la presente, contiene a la proteína ORF2 del PCV2 recuperada del sobrenadante de células cultivadas in vitro, donde dichas células fueron infectadas con un vector viral recombinante que contiene ADN de la ORF2 del PCV2 y expresan la proteína ORF2 del PCV2, y donde dicho cultivo celular fue tratado con BEI entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8 mM, preferentemente con BEI aproximadamente 5 mM para inactivar el vector viral, y una concentración equivalente de un agente de neutralización, preferentemente una solución de tiosulfato de sodio a una concentración final entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8 mM, preferentemente de aproximadamente 5 mM; Carbopol, más preferentemente Carbopol 971P, preferentemente en cantidades que comprenden entre aproximadamente 500 µg y aproximadamente 5 mg por dosis, con mayor preferencia aún una cantidad entre aproximadamente 750 µg y aproximadamente 2,5 mg por dosis y con mayor preferencia una cantidad entre aproximadamente 1 mg por dosis; y salina fisiológica, preferentemente en una cantidad que comprende entre aproximadamente 50 y aproximadamente 90% (v/v), más preferentemente entre aproximadamente 60 y 80% (v/v), más preferentemente aún de aproximadamente 70% (v/v).

Por lo tanto, también se describe aquí un método para preparar una composición antigénica, tal como por ejemplo una vacuna, para generar una respuesta inmune contra el PCV2 que comprende las etapas de: i) amplificar el ADN de la ORF2 del PCV2 in vitro, donde las secuencias flanqueadoras de dicho ADN de la ORF2 del PCV2 están modificadas, ii) clonar el ADN de la ORF2 del PCV2 amplificado en un vector de transferencia; y iii) transfectar el vector de transferencia, o una porción del mismo que contiene al ADN de la ORF2 del PCV2 recombinante, en un vector viral para generar el vector viral recombinante, iv) infectar células en un medio con el virus transfectado; v) lograr que el virus transfectado exprese la proteína recombinante de la ORF2 del PCV2; vi) separar las células del sobrenadante; vii) recuperar la proteína ORF2 del PCV2 expresada del sobrenadante; viii) inactivar el vector viral recombinante, preferentemente, en presencia de BEI entre aproximadamente 2 y aproximadamente 20 mM, con mayor preferencia en presencia de BEI aproximadamente 5 mM; ix) agregar una cantidad equivalente de un agente capaz de neutralizar al agente de inactivación en la solución, preferentemente, con la adición de una solución de tiosulfato de sodio a una concentración final entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 20 mM, preferentemente de aproximadamente 5 mM, cuando el agente de inactivación es BEI, x) agregar una cantidad adecuada de un adyuvante, preferentemente agregar Carbopol, más preferentemente Carbopol 971P, con mayor preferencia en las cantidades descritas precedentemente (por ejemplo, entre aproximadamente 500 µg y aproximadamente 5 mg por dosis, con mayor preferencia aún en cantidades entre aproximadamente 750 µg y aproximadamente 2,5 mg por dosis y con mayor preferencia en una cantidad de aproximadamente 1 mg por dosis); y xi) agregar salina fisiológica, preferentemente una cantidad entre aproximadamente 50 y aproximadamente 90% (v/v), más preferentemente entre aproximadamente 60 y 80% (v/v), más preferentemente aún de aproximadamente 70% (v/v). Opcionalmente, este método también puede incluir la adición de un protector. Un protector, tal como se utiliza en la presente, se refiere a un agente anti-microbiológico activo, tal como por ejemplo Gentamicina, Mertiolate y semejantes. En particular, se prefiere agregar un protector en la preparación de una composición de múltiples dosis. Dichos agentes anti-microbiológicos activos se agregan a concentraciones eficaces para prevenir toda contaminación microbiológica de la composición de interés o para inhibidor todo crecimiento microbiológico en la composición de interés.

Más aún, este método también puede comprender la adición de un agente estabilizante, tal como p.ej. sacáridos, trehalosa, manitol, sacarosa y semejantes, para incrementar y/o mantener la vida en estante del producto.Sin embargo, se ha encontrado sorpresivamente que la formulación resultante es inmunológicamente eficaz sobre un

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período de al menos 24 meses, sin agregar ningún agente estabilizante adicional.

Un aspecto adicional de la presente descripción se relaciona con los productos resultantes de los métodos descritos precedentemente. En particular, la presente descripción se relaciona con una composición de materia que comprende la proteína ORF2 del PCV2 expresada de forma recombinante. Más aún, la presente descripción también se relaciona con una composición de materia que comprende la proteína ORF2 del PCV2 expresada de forma recombinante, recuperada del sobrenadante de un cultivo de células de insecto. Más aún, la presente descripción también se relaciona con una composición de materia que comprende la proteína ORF2 del PCV2 expresada de forma recombinante, recuperada del sobrenadante de un cultivo de células de insecto. Preferentemente, esta composición de materia también comprende un agente adecuado para la inactivación de vectores virales. Preferentemente, dicho agente de inactivación es BEI. Más aún, la presente invención también se relaciona con una composición de materia que comprende la proteína ORF2 del PCV2 expresada de forma recombinante, recuperada del sobrenadante de un cultivo de células de insecto y que comprende un agente adecuado para la inactivación de vectores virales, preferentemente BEI, y un agente de neutralización para neutralizar el agente de inactivación. Preferentemente, dicho agente de neutralización es tiosulfato de sodio, cuando se usa BEI como agente de inactivación.

Aún en otro aspecto de la presente descripción se proporciona una composición inmunogénica que induce una respuesta inmune y confiere inmunidad protectora contra los signos clínicos de una infección por PCV2. La composición comprende generalmente el polipéptido,o un fragmento del mismo,expresado por el marco de lectura abierto 2 (ORF2) de PCV2, como componente antigénico de la composición.

El ADN y la proteína ORF2 del PCV2, tal como se utiliza en la presente para la preparación de las composiciones y también en los procesos provistos aquí comprende un dominio altamente conservado en las formas aisladas de PCV2 y por ello cualquier ORF2 del PCV2 sería eficaz como fuente del ADN y/o polipéptido de la ORF2 del PCV tal como se utiliza en la presente. Una proteína ORF2 del PCV2 preferida es la que se muestra en la SEQ ID Nº 11. El polipéptido de la ORF2 del PCV preferido se provee aquí en la SEQ ID Nº 5, pero los especialistas en la técnica comprenderán que esta podría variar en tanto como un 6-10% en cuanto a homología de secuencia y aún retener las características antigénicas que los vuelve útiles en las composiciones inmunogénicas. Las características antigénicas de la composición inmunológica se pueden estimar, por ejemplo, mediante un experimento de exposición como el que se provee en el ejemplo 4. Más aún, la característica antigénica del antígeno modificado es retenido, cuando el antígeno modificado confiere al menos un 70%, preferentemente un 80%, más preferentemente un 90% de inmunidad protectora en comparación con la proteína ORF2 del PCV2, codificada por la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID Nº:3 o de la SEQ ID Nº:4. Una “composición inmunogénica”, tal como se utiliza en la presente, se refiere a una proteína ORF2 del PCV2 que genera una “respuesta inmunológica” en el huésped que comprende una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpos a la proteína ORF2 del PCV2. Preferentemente, esta composición inmunogénica puede conferir inmunidad protectora contra una infección por PCV2 y los signos clínicos asociados con la misma. En algunas realizaciones, se usan las porciones inmunogénicas de la proteína ORF2 del PCV2 como componente antigénico en la composición. El término “porción inmunogénica”, tal como se utiliza en la presente, se refiere a formas truncadas y/o sustituidas, o fragmentos de la proteína y/o del polinucleótido ORF2 del PCV2, respectivamente. Preferentemente, dichas formas truncadas y/o sustituidas, o fragmentos, comprenderán al menos 6 aminoácidos contiguos del polipéptido ORF2 de longitud completa. Más preferentemente, las formas truncadas o sustituidas, o fragmentos, comprenden al menos 10, más preferentemente al menos 15 y más preferentemente aún al menos 19 aminoácidos contiguos del polipéptido ORF2 de longitud completa. En la presente se proveen dos secuencias preferidas en este respecto como las SEQ ID Nº: 9 y 10. Se considera además que dichas secuencias pueden formar parte de fragmentos o formas truncadas más grandes. Otro polipéptido ORF2 del PCV2 preferido provisto en la presente es codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº: 3 o de la SEQ ID Nº: 4. Pero los especialistas en la técnica comprenderán que esta secuencia podría variar en tanto como un 6-20% en cuanto a homología de secuencia y aún retener las características antigénicas que lo vuelven útil en las composiciones inmunogénicas. En algunas realizaciones, se usa una forma truncada o sustituida, o un fragmento, de la ORF2 como componente antigénico en la composición. Preferentemente, dichas formas truncadas o sustituidas, o fragmentos, comprenderán al menos 18 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos ORF2 de longitud completa, por ejemplo de la SEQ ID Nº 3 o la SEQ ID Nº 4. Más preferentemente, las formas truncadas o sustituidas, o fragmentos, tendrán al menos 30, más preferentemente al menos 45 y más preferentemente aún al menos 57 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos de longitud completa del ORF2, por ejemplo la SEQ ID Nº 3 o la SEQ ID Nº 4.

La “identidad de secuencia”, tal como se conoce en la técnica, se refiere a la relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, es decir una secuencia de referencia y una secuencia dada que será comparada con la secuencia de referencia. La identidad de secuencia se determina por comparación de la secuencia dada con la secuencia de referencia después de alinear las secuencias de forma óptima con el objeto de obtener el mayor grado de similitud de secuencia, determinado por la coincidencia entre las cadenas de dichas secuencias. Dicha alineación permite establecer la identidad de secuencia sobre una base de posición-por-posición, por ejemplo, las secuencias son “idénticas” en una posición particular si en dicha posición los nucleótidos o residuos de aminoácidos son idénticos. La cantidad total de dichas identidades de posición se divide entonces por el número total de nucleótidos o residuos en la secuencia de referencia para obtener el % de identidad de secuencia. la identidad de secuencia puede calcularse fácilmente utilizando métodos conocidos, incluyendo en un sentido no

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Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto adicional, la composición inmunogénica comprende i) cualesquiera de las proteínas ORF2 del PCV2 descritas precedentemente, preferentemente a las concentraciones descritas precedentemente, y ii) al menos una porción del vector viral que expresa dicha proteína ORF2 del PCV2, preferentemente de un baculovirus recombinante. Más aún, de acuerdo con un aspecto adicional, la composición inmunogénica comprende i) cualquiera de las proteínas ORF2 del PCV2 descritas precedentemente, preferentemente a las concentraciones descritas precedentemente, ii) al menos una porción del vector viral que expresa dicha proteína ORF2 del PCV2, preferentemente de un baculovirus recombinante, y iii) una porción del sobrenadante del cultivo celular.

En el proceso de producción y recuperación para la proteína ORF2 del PCV2, el sobrenadante del cultivo celular puede ser filtrado a través de una membrana que tiene un tamaño de poro que comprende preferentemente entre aproximadamente 0,45 y 1 µm. Por consiguiente, un aspecto adicional se relaciona con una composición inmunogénica que comprende i) cualquiera de las proteínas ORF2 del PCV2 descritas precedentemente, preferentemente a las concentraciones descritas precedentemente, ii) al menos una porción del vector viral que expresa dicha proteína ORF2 del PCV2, preferentemente de un baculovirus recombinante, y iii) una porción del cultivo celular; donde aproximadamente un 90% de los componentes tiene un tamaño menor que 1 µm.

De acuerdo con un aspecto adicional, la presente descripción se relaciona con una composición inmunogénica que comprende i) cualquiera de las proteínas ORF2 del PCV2 descritas precedentemente, preferentemente a las concentraciones descritas precedentemente, ii) al menos una porción del vector viral que expresa dicha proteína ORF2 del PCV2, iii) una porción del cultivo celular y iv) un agente de inactivación para inactivar el vector viral recombinante que preferentemente es BEI, donde aproximadamente un 90% de los componentes i) a iii) son de un tamaño menor que 1 µm. Preferentemente, BEI está presente a concentraciones eficaces para inactivar el baculovirus. Las concentraciones eficaces se describieron precedentemente.

De acuerdo con un aspecto adicional, la presente descripción se relaciona con una composición inmunogénica que comprende i) cualquiera de las proteínas ORF2 del PCV2 descritas precedentemente, preferentemente a las concentraciones descritas precedentemente, ii) al menos una porción del vector viral que expresa dicha proteína ORF2 del PCV2, iii) una porción del cultivo celular, iv) un agente de inactivación para inactivar el vector viral recombinante que preferentemente es BEI y v) un agente de neutralización para detener la inactivación mediada por el agente de inactivación, donde aproximadamente un 90% de los componentes i) a iii) son de un tamaño menor que 1 µm. Preferentemente, si el agente de inactivación es BEI, dicha composición comprende tiosulfato de sodio en cantidades equivalentes a BEI.

El polipéptido es incorporado en una composición que puede ser administrada a un animal susceptible a un infección por PCV2. En realizaciones preferidas, la composición también puede incluir componentes adicionales conocidos por los especialistas en la técnica (véase también Remington's Pharmaceutical Sciences, (1990), 18ª ed.Mack Publ., Easton). Además, la composición puede incluir uno o más vehículos aceptables para uso veterinario. Tal como se utiliza en la presente, un "vehículo aceptable para uso veterinario" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, adyuvantes, agentes estabilizantes, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes que demoran la absorción y semejantes.

La composición inmunogénica puede comprender la proteína ORF2 del PCV2 provista en la presente, preferentemente a las concentraciones descritas precedentemente, como un componente antigénico, mezclado con un adyuvante, preferentemente Carbopol,y salina fisiológica.

Los especialistas en la técnica comprenderán que la presente composición puede incorporar soluciones estériles inyectables conocidas, aceptables para uso fisiológico. Para preparar una solución lista para usar como una inyección o infusión parenteral, hay soluciones isotónicas acuosas, tal como por ejemplo salina, o las correspondientes soluciones con proteínas plasmáticas. Además, las composiciones inmunogénicas y vacunas para uso según la presente invención pueden incluir diluyentes, agentes isotónicos, estabilizantes o adyuvantes. Los diluyentes pueden incluir agua, salina, dextrosa, etanol, glicerol y semejantes. Los agentes isotónicos pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Los estabilizantes incluyen albúmina y sales alcalinas del ácido etilendiamintetracético, entre otros. Los adyuvantes adecuados son los que se describieron precedentemente. Más preferido es el uso de Carbopol, en particular el uso de Carbopol 971P, preferentemente en las cantidades descritas precedentemente (por ejemplo entre aproximadamente 500 µg y aproximadamente 5 mg por dosis, con mayor preferencia aún entre aproximadamente 750 µg y aproximadamente 2,5 mg por dosis y más preferentemente en una cantidad de aproximadamente 1 mg por dosis).

Por lo tanto, la presente descripción también se relaciona con una composición inmunogénica que comprende i) cualquiera de las proteínas ORF2 del PCV2 descritas precedentemente, preferentemente a las concentraciones descritas precedentemente, ii) al menos una porción del vector viral que expresa dicha proteína ORF2 del PCV2, iii) una porción del cultivo celular, iv) un agente de inactivación para inactivar el vector viral recombinante, preferentemente es BEI, y v) un agente de neutralización para detener la inactivación mediada por el agente de inactivación, preferentemente tiosulfato de sodio en cantidades equivalentes a BEI; y vi) un adyuvante adecuado, preferentemente Carbopol 971 en las cantidades descritas precedentemente; donde aproximadamente un 90% de los componentes i) a iii) tienen un tamaño menor que 1 µm. De acuerdo con un aspecto adicional, esta composición

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o cualquier administración adicional del estimulante inmunológico. Preferentemente, el estimulante inmunológico es administrado al menos 10 días, preferentemente 15, aún más preferentemente 20, aún más preferentemente al menos 22 días después de la administración inicial de la composición inmunogénica de la proteína ORF2 del PCV2. Un estimulante inmunológico preferido es, por ejemplo, hemocianina de lapa (KLH), preferentemente emulsionada con adyuvante incompleto de Freund (KLH/ICFA). Sin embargo, se debe tener en cuenta que también se puede usar cualquier otro estimulante inmunológico conocido por los especialistas en la técnica. Un “estimulante inmunológico”, tal como se lo utiliza en la presente, significa cualquier agente o composición que pueda desencadenar la respuesta inmune, preferentemente sin iniciar o incrementar una respuesta inmune específica, p.ej. la respuesta inmune contra un patógeno específico. Se indica además administrar el estimulante inmunológico a una dosis adecuada. Más aún, el conjunto de elementos también puede comprender un envase, que incluye al menos una dosis del estimulante inmunológico, preferentemente una dosis de KLH o KLH/ICFA.

Más aún, también se ha encontrado sorprendentemente que el potencial inmunogénico de las composiciones inmunogénicas que comprenden la proteína ORF2 del PCV2 recombinante expresada en el baculovirus, preferentemente en combinación con Carbopol, puede ser mejorado aún más mediante la administración de la vacuna IngelVac PRRS MLV (véase el Ejemplo 5). Los signos clínicos de PCV2 y las manifestaciones de enfermedad se magnifican cuando hay una infección por PRRS. Sin embargo, las composiciones inmunogénicas y las estrategias de vacunación provistas en la presente disminuye este efecto en gran parte y más de los esperado. En otras palabras, se observó un efecto sinérgico inesperado cuando los animales, preferentemente cerdos,son tratados con cualquiera de las composiciones inmunogénicas con ORF2 PCV2, provistas en la presente, y la vacuna Ingelvac PRRS MLV (Boehringer Ingelheim).

Por lo tanto, un aspecto adicional descrito aquí se refiere a un kit descrito precedentemente, que comprende la composición inmunogénica de ORF2 del PCV2 provista en la presente y el manual de instrucciones, donde dicho manual de instrucciones incluye además la información para administrar la composición inmunogénica de ORF2 del PCV2 junto con una composición inmunogénica que comprende un antígeno PRRS, preferentemente un antígeno PRRS con adyuvante. Preferentemente, el adyuvante para el antígeno PRRS es Carbopol. Preferentemente, el antígeno PRRS es IngelVac® PRRS MLV (Boehringer Ingelheim).

Un aspecto adicional descrito aquí se refiere también a un kit que comprende i) un envase que contiene al menos una dosis de la composición inmunogénica de ORF2 del PCV2 provista en la presente, y ii) un envase que contiene una composición inmunogénica que comprende un antígeno PRRS, preferentemente un antígeno PRRS con adyuvante. Preferentemente, el adyuvante para el antígeno PRRS es Carbopol. Preferentemente el antígeno PRRS es IngelVac® PRRS MLV (Boehringer Ingelheim). Más preferentemente, el kit comprende además un manual de instrucciones, incluyendo la información para administrar ambas composiciones farmacéuticas. Preferentemente, provee la información que la composición que contiene ORF2 del PCV2 es administrada temporalmente antes que la composición que contiene PRRS.

Un aspecto adicional se relaciona con el uso de cualquiera de las composiciones provistas en la presente como un medicamento, preferentemente como un medicamento veterinario, con mayor preferencia aún como una vacuna. Más aún, la presente descripción también se refiere al uso de cualquiera de las composiciones descritas en la presente, para preparar un medicamento para disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con una infección por PCV2. Preferentemente, el medicamento es para prevenir una infección por PCV2, aún más preferentemente en lechones.

También se describe aquí un método para (i) prevenir una infección, o una reinfección, con PCV2 o (ii) reducir o eliminar los síntomas clínicos causados por PCV2 en un sujeto, que comprende administrar cualquiera de las composiciones inmunogénicas provistas en la presente a un sujeto que lo necesita. El sujeto es un cerdo. Preferentemente, la composición inmunogénica se administra por vía intramuscular. Se administra una dosis de la composición inmunogénica.

De acuerdo con un aspecto adicional, el método de tratamiento también puede comprender la administración de un estimulante inmunológico. Preferentemente, dicho estimulante inmunológico es administrado al menos dos veces. Preferentemente, hay al menos 3, más preferentemente al menos 5 días, aún más preferentemente al menos 7 días entre la primera y la segunda administración del estimulante inmunológico. Preferentemente, el estimulante inmunológico es administrado al menos 10 días, preferentemente 15, aún más preferentemente 20, aún más preferentemente al menos 22 días después de la administración inicial de la composición inmunogénica ORF2 del PCV2. Un estimulante inmunológico preferido es, por ejemplo, hemocianina de lapa (KLH), preferentemente en una emulsión con adyuvante incompleto de Freund (KLH/ICFA). Sin embargo, se debe tener en cuanta que también se puede usar cualquier otro estimulante inmunológico conocido por los especialistas en la técnica. Es propio del conocimiento general de los especialistas en la técnica administrar el estimulante inmunológico a una dosis adecuada.

El método de tratamiento descrito precedentemente también puede comprender la administración del antígeno PRRS. Preferentemente, el antígeno PRRS se formula con el adyuvante Carbopol. Preferentemente el antígeno PRRS es IngelVac® PRRS MLV (Boehringer Ingelheim). Preferentemente, dicho antígeno PRRS es administrado temporalmente después de administrar la composición inmunogénica de la proteína ORF2 PCV2.

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durante la noche a 37°C. La placa se lavó después tres veces con una solución de lavado que comprendía 0,5 mL de Tween 20 (Sigma, St. Louis, MO), 100 mL de D-PBS 10X (Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA) y 899,5 mL de agua destilada. A continuación, se agregaron 250 µL de una solución de bloqueo (5 g de leche en polvo descremada Carnation (Nestle, Glendale, CA) en 10 mL de D-PBS y cantidad necesario hasta llevar a 100 mL de agua destilada) 5 a cada uno de los pocillos. La siguiente etapa comprendía lavar la placa de prueba y luego agregar el antígeno diluido previamente. El antígeno pre-diluido se obtuvo por adición de 200 µL de solución diluyente (0,5 mL de Tween 20 en 999,5 mL de D-PBS) a cada uno de los pocillos sobre una placa de dilución. A continuación, la muestra se diluyó a una relación de 1:240 y a una relación de 1:480 y luego se agregaron 100 µL de cada una de estas muestras diluidas a uno de los pocillos superiores de la placa de dilución (es decir, un pocillo superior recibió 100 µL 10 de la dilución 1:240 y la otra recibió 100 µL de la dilución 1:480). Después se efectuaron diluciones en serie para el resto de la placa retirando 100 µL de cada pocillo sucesivo y transfiriéndolos al siguiente pocillo de la placa. Se mezcló el contenido de cada pocillo antes de efectuar la transferencia siguiente. El lavado de la placa de prueba incluyó tres lavados de la placa con la solución tampón de lavado. La placa se selló luego y se incubó durante una hora a 37°C antes de lavarla otras tres veces con la solución tampón de lavado. El anticuerpo de detección usado 15 era un anticuerpo monoclonal contra PCV ORF2. Se diluyó a 1:300 en solución diluyente y luego se agregaron 100 µL de anticuerpo de detección diluido a los pocillos. A continuación, se selló la placa y se incubó durante una hora a 37°C antes de lavarla tres veces con la solución tampón de lavado. Luego se preparó diluyente de conjugación por adición de suero de conejo normal (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) a la solución diluyente hasta una concentración del 1%. El anticuerpo conjugado anti-(H+l) de ratón de cabra-HRP (Jackson Immunoresearch) se 20 diluyó en el diluyente de conjugación hasta 1:10.000. Después se agregaron 100 µL del anticuerpo conjugado diluido a cada uno de los pocillos. La placa se selló y se incubó durante 45 minutos a 37°C antes de lavarla tres veces con la solución tampón de lavado. Se agregaron 100 µL de sustrato (sustrato de peroxidasa TMB, Kirkgaard y Perry Laboratories (KPL), Gaithersberg, MD), mezclado con un volumen igual de sustrato de peroxidasa B (KPL) a cada uno de los pocillos. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación se agregaron 25 100 µL de solución de HCl 1 N a todos los pocillos para detener la reacción. La placa se pasó luego por un lector

para ELISA. Los resultados de este ensayo se muestran en la siguiente Tabla 1:

Tabla 1

Día

Matraz ORF2 en sedimento (µg) ORF2 en sobrenadante (µg)

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1 47,53 12

3

2 57,46 22

3

3

53,44 14

3

4 58,64 12

4

1 43,01 44

4

2 65,61 62

4

3 70,56 32

4

4

64,97 24

5

1 31,74 100

5

2 34,93 142

5

3 47,84 90

5

4 55,14 86

6

1 14,7 158

6

2 18,13 182

6

3 34,78 140

6

4 36,88 146

7

1 6,54 176

7

2 12,09 190

7

3 15,84 158

7

4 15,19 152

10

15

20

25

30

35

40

Estos resultados indican que cuando se prolonga el tiempo de incubación, la expresión de ORF2 hacia el sobrenadante de las células y medio centrifugados es mayor que la expresión en el sedimento de las células y medio centrifugados. Por consiguiente, si se deja que la expresión de ORF2 avance durante al menos 5 días y se lo recupera en el sobrenadante en lugar de dejar que la expresión avance por menos de 5 días y recuperar el ORF2 de las células, provee un gran incremento en los rendimientos de ORF2 y una mejora significativa con respecto a los métodos anteriores.

Ejemplo 2

En este ejemplo se proveen datos sobre la eficacia de las vacunas descritas en esta memoria. En un matraz rotatorio de 1000 mL se sembraron aproximadamente 1,0 x 106 células Sf+/ml en 300 mL de medio Excell 420. El matraz se incubó luego a 27°C y se agitó a 100 rpm. A continuación, en el matraz se sembraron 10 mL de virus semilla ORF2 PCV2/Bac p+6 (el baculovirus recombinante que contiene al gen de la ORF2 del PCV2 de 6 pasajes adicionales en las células de insecto Sf9) con 0,1 MOI después de 24 horas de incubación.

El matraz se incubó luego a 27°C durante un total de 6 días. Después de la incubación, el matraz se centrifugó y se cosecharon tres muestras del sobrenadante resultante y se inactivaron. El sobrenadante se inactivó llevando su temperatura a 37 ± 2°C. Para la primera muestra, se agregó una solución 0,4 M de bromhidrato de 2bromoetilenamina que había sido ciclado en etilenimina binaria 0,2 M (BEI) en NaOH 0,3 N al sobrenadante para obtener una concentración final de BEI de 5 mM. Para la segunda muestra, se agregó BEI 10 mM al sobrenadante. Para la tercera muestra, no se agregó BEI al sobrenadante. Las muestras se agitaron luego de forma continua durante 48 h. Se agregó una solución 1,0 M de tiosulfato de sodio para obtener una concentración mínima final de 5 mM con el fin de neutralizar toda BEI residual. Después se determinó la cantidad de ORF2 en cada muestra usando el mismo procedimiento de ensayo ELISA que se describió en el ejemplo 1. Los resultados se pueden observar en la siguiente Tabla 2:

Tabla 2

Muestra

ORF2 en sobrenadante (µg)

1

78,71

2

68,75

3

83,33

Este ejemplo demuestra que la neutralización con BEI no elimina o degrada cantidades significativas de producto de proteína ORF2 del PCV2 recombinante. Esto queda evidenciado por el hecho que no hay una gran pérdida de ORF2 en el sobrenadante del BEI o temperaturas elevadas. Los especialistas en la técnica comprenderán que el ORF2 recuperados es un producto proteico estable.

Ejemplo 3

Este ejemplo demuestra que el método descrito en esta memoria puede llevarse a escala desde una producción a pequeña escala de ORF2 del PCV2 recombinante a una producción a gran escala de ORF2 del PCV2 recombinante. Se introdujeron 5,0 x 105 células/ml de células SF+/ml en 7000 mL de medio ExCell 420 en un Biorreactor Applikon de 20000 mL. El medio y las células se incubaron luego a 27°C y se agitaron a 100 RPM durante las siguientes 68 horas. A la hora 68, se agregaron 41,3 mL de ORF2 de PCV2 Baculovirus MSV+3 a 7000 mL de medio ExCell 420. La mezcla resultante se introdujo luego en el biorreactor. Durante los siguientes siete días, la mezcla se incubó a 27°C y se agitó a 100 RPM. Se extrajeron muestras del biorreactor cada 24 horas comenzando el día 4, después de la infección, y se centrifugó cada muestra. Se conservó el sobrenadante de las muestras y se cuantificó la cantidad de ORF2 usando densitometría con SDS-PAGE. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 3:

Tabla 3

Día después de la infección:

ORF2 en sobrenadante (µg/ml)

4

29,33

5

41,33

6

31,33

7

60,67

Ejemplo 4

En este ejemplo se evalúa la eficacia de siete candidatos de vacunas contra PCV2 y además se definen los parámetros de eficacia después de exposición a una cepa virulenta de PCV2. Se dividieron aleatoriamente ciento ocho (108) lechones, nacidos por cesárea, privados de calostro (CDCD), de 9-14 días de vida, en 9 grupos de igual tamaño. En la Tabla 4 se muestra el diseño general del estudio para este ejemplo.

Tabla 4. Diseño general del estudio

Grupo

Nº de cerdos Tratamiento Día de tratamiento KLH/ICF A el día 21 y día 27 Expuestos a PCV2 virulento el día 24 Necropsia el día 49

1

12 Vacuna PCV2 Nº 1(vORF2 16 µg) 0 + + +

2

12 Vacuna PCV2 Nº 2(vORF2 8 µg) 0 + + +

3

12 Vacuna PCV2 Nº 3(vORF2 4 µg) 0 + + +

4

12 Vacuna PCV2 Nº 4(rORF2 16 µg) 0 + + +

5

12 Vacuna PCV2 Nº 5(rORF2 8 µg) 0 + + +

6

12 Vacuna PCV2 Nº 6(rORF2 4 µg) 0 + + +

7

12 Vacuna PCV2 Nº 7(Virus completos muertos) 0 + + +

8

12 Controles no expuestos N/D + + +

9

12 Grupo control negativo no estricto N/D + - +

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 de baculovirus recombinante expresado; virus completos muertos = virus PCV2 cultivados en un cultivo celular adecuado

Siete de los grupos (Grupos 1-7) recibieron dosis del polipéptido ORF2 PCV2, uno de los grupos actuó como un

10 control de prueba y no recibió ORF2 PCV2 y otro grupo actuó como grupo control negativo estricto y tampoco recibió ORF2 PCV2. El día 0, los grupos 1 a 7 fueron tratados con las vacunas asignadas. Los lechones en el grupo 7 recibieron un tratamiento de refuerzo el día 14. Se observó la aparición de efectos adversos en los lechones, así como reacciones en el sitio de inyección después de la vacunación y el día 19 los lechones fueron trasladados al segundo sitio de estudio. En el segundo sitio de estudio, los grupos 1-8 fueron albergados en una instalación, en

15 tanto el grupo 9 fue albergado en una instalación separada. Todos los cerdos recibieron hemocianina de lapa (KLH)/adyuvante incompleto de Freund (ICFA) los días 21 y 27 y el día 24, los grupos 1-8 fueron expuestos a un PCV2 virulento.

Se recolectaron muestras de sangre antes y después de la exposición para determinar la serología de PCV2. Después de la exposición, se recolectaron los datos de peso corporal para determinar la ganancia de peso diario

20 promedio (ADWG), y los síntomas clínicos, así como muestras de hisopados nasales para determinar el exudado nasal de PCV2. El día 49, se realizó la necropsia de los 15 cerdos que sobrevivieron, se calificaron las lesiones de los pulmones y se conservaron algunos tejidos selectos en formalina para efectuar posteriormente las pruebas de inmunohistoquímica (IHC).

Materiales y métodos

25 Este era un estudio de viabilidad frente a una exposición a vacunación parcialmente ciego realizado con cerdos CDCD, de 9 a 14 días de vida el día 0. Para su inclusión en el estudio, los títulos de IFA PCV2 de cerdas eran = 1:1000. Además, el estado serológico de las cerdas era de una piara negativa para PRRS conocida. Se evaluó el estado serológico de PCV2 de veintiocho (28) cerdas. Catorce (14) cerdas tenía un título de PCV2 = 1000 y fueron transferidas al primer sitio de estudio. Ciento diez (110) lechones nacieron mediante cirugía cesárea y estaban

10

15

20

25

30

35

disponibles para este estudio el día -4. El día -3, se pesaron 108 cerdos CDCD en el primer sitio de estudio, se identificaron mediante rótulos de oreja, bloqueados por el por peso y luego fueron asignados aleatoriamente a 1 de 9 grupos, como se mostró anteriormente en la tabla 4. Si alguno de los animales de prueba que había cumplido con los criterios de inclusión era enrolado en el estudio y posteriormente excluido del mismo por cualquier motivo, se notificaba al Investigador y Monitor con el fin de determinar el uso de los datos recolectados del animal en el análisis final. Se registró la fecha en que los lechones enrolados eran excluidos y la razón de dicha exclusión. Inicialmente, no se excluyó ninguna cerda. Un total de 108 de los 110 cerdos disponibles fueron asignados aleatoriamente a uno de los 9 grupos el día -3. Los dos cerdos más pequeños (Nº 17 y 19) no fueron asignados a ningún grupo y quedaron a disposición en caso de necesitarlos. Durante el transcurso del estudio, se retiraron varios animales. Cada uno de los siguientes cerdos fueron encontrados muertos antes de la exposición: el cerdo 82 (grupo 9) el día 1,el cerdo Nº 56 (grupo 6) el día 3,el cerdo Nº 53 (grupo 9) el día 4,el cerdo Nº 28 (grupo 8) el día 8,el cerdo Nº 69 (grupo 8) el día 7 y el cerdo Nº 93 (grupo 4) el día 9. Estos seis cerdos no se incluyeron en los resultados finales del estudio. El cerdo no 17 (uno de los cerdos disponibles) fue asignado al Grupo 9. El cerdo disponible restante, Nº 19, se excluyó del estudio.

Las formulaciones administradas a cada uno los grupos fueron: el grupo 1 fue asignado para recibir 1 ml de ORF2 viral (vORF2) que contiene 16 µg de ORF2/ml. Esto se obtuvo mezclando 10,24 ml de ORF2 viral (256 µg/25 µg/ml = 10,24 ml vORF2) con 3,2 ml de Carbopol al 0,5% y 2,56 ml de solución tampón fosfato salina a un pH de 7,4. Esto permitió obtener 16 ml de formulación para el grupo 1. El grupo 2 fue asignado para recibir 1 ml de vORF2 que contiene 8 µg de vORF2/ml. Esto se obtuvo mezclando 5,12 ml de vORF2 (128 µg/25 µg/ml = 5,12 ml vORF2) con 3,2 ml de Carbopol al 0,5% y 7,68 ml de solución tampón fosfato salina a un pH de 7,4. Esto permitió obtener 16 ml de formulación para el grupo 2. El grupo 3 fue asignado para recibir 1 ml de vORF2 que contiene 4 µg de vORF2/ml. Esto se obtuvo mezclando 2,56 ml de vORF2 (64 µg/25 µg/ml = 2,56 ml vORF2) con 3,2 ml de Carbopol al 0,5% y 10,24 ml de solución tampón fosfato salina a un pH de 7,4. Esto permitió obtener 16 ml de formulación para el grupo

3. El grupo 4 fue asignado para recibir 1 ml de ORF2 recombinante (rORF2) que contiene 16 µg de rORF2/ml. Esto se obtuvo mezclando 2,23 ml de rORF2 (512 µg/230 µg/ml = 2,23 ml rORF2) con 6,4 ml de Carbopol al 0,5% y 23,37 ml de solución tampón fosfato salina a un pH de 7,4. Esto permitió obtener 32 ml de formulación para el grupo 4. El grupo 5 fue asignado para recibir 1 ml de rORF2 que contiene 8 µg de rORF2/ml. Esto se obtuvo mezclando 1,11 ml de rORF2 (256 µg/230 µg/ml = 1,11 ml rORF2) con 6,4 ml de Carbopol al 0,5% y 24,49 ml de solución tampón fosfato salina a un pH de 7,4. Esto permitió obtener 32 ml de formulación para el grupo 5. El grupo 6 fue asignado para recibir 1 ml de rORF2 que contiene 8 µg de rORF2/ml. Esto se obtuvo mezclando 0,56 ml de rORF2 (128 µg/230 µg/ml = 0,56 ml rORF2) con 6,4 ml de Carbopol al 0,5% y 25,04 ml de solución tampón fosfato salina a un pH de 7,4. Esto permitió obtener 32 ml de formulación para el grupo 6. El grupo 7 fue asignado para recibir 2 ml de vacuna de células enteras muertas de PCV2 (PCV2 KV) que contiene al MAX PCV2 KV. Esto se obtuvo mezclando 56 ml de PCV2 KV con 14 ml de Carbopol al 0,5%. Esto permitió obtener 70 ml de formulación para el grupo 7. Finalmente, el grupo 8 fue asignado para recibir KLH a 0,5 µg/ml o 1,0 µg/ml por dosis de 2 ml. Esto se obtuvo mezclando 40,71 ml de KLH (7,0 µg proteína/ml a 0,5 µg/ml = 570 ml (7,0 µg/ml)(x) = (0,5)(570 ml)), 244,29 ml solución tampón fosfato salina a un pH de 7,4 y 285 ml de adyuvante de Freund. En la tabla 5 se describen los tiempos para las principales actividades de este ejemplo.

Tabla 5. Actividades del estudio

Día del estudio

Actividad del estudio

-4, 0 a 49

Observaciones generales sobre el estado de salud general y síntomas clínicos

-3

Peso; asignación aleatoria en grupos; recolección de muestras de sangre de todos los cerdos

0

Examen de salud; administración de IVP Nº 1-7 a los grupos 1-7, respectivamente

0-7

Observación de los cerdos por reacciones en el sitio de inyección

14

Grupo 7 reforzado con la vacuna PCV2 Nº 7; recolección de muestras de sangre de todos los cerdos

14-21

Observación del grupo 7 por reacciones en el sitio de inyección

16-19

Tratamiento de todos los cerdos con antibióticos (faltan los datos)

19

Transporte de los cerdos desde el primer sitio de prueba al segundo sitio de prueba

21

Tratamiento de los grupos 1-9 con KLH/ICFA

24

Recolección de muestras de sangre y de hisopados nasales de todos los cerdos; peso de todos los cerdos; exposición de los grupos 1-8 con material de exposición de PCV2

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10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

nasal) usando una jeringa tipo Luer estéril de 3,0 mL y una cánula nasal.

Los cerdos de prueba fueron observados todos los días por su estado de salud general y los efectos adversos el día -4 y desde el día 0 hasta el día 19. Las observaciones fueron registradas en el registro de observación clínica. Todos los cerdos de prueba fueron observados entre el día 0 y el día 7 y el grupo 7 fue monitoreado además entre los días 14 y 21, para monitorear las reacciones en el sitio de inyección. La ganancia de peso diario promedio se determinó pesando cada cerdo sobre una balanza calibrada los días -3, 24 y 49, o el día en que el cerdo aparecía muerto después de la exposición. Los pesos corporales fueron registrados en el formulario de peso corporal. Los pesos corporales del día -3 se utilizaron para bloquear los cerdos antes de la asignación aleatoria. Los datos de los pesos del día 24 y del día 49 se utilizaron para determinar la ganancia de peso diario promedio (ADWG) para cada cerdo y para los tiempos definidos. En el caso de los cerdos que murieron después de la exposición y antes del día 49, se ajustó la ADWG para que representara la ADWG desde el día 24 hasta el día de muerte.

Con el fin de determinar la serología de PCV2, se recolectó sangre venosa completa del seno venoso orbital de cada lechón los días -3 y 14. Para cada lechón, se recolectó sangre del seno venoso orbital insertando un tubo capilar estéril en el canto medial de uno de los ojos y drenando aproximadamente 3,0 mL de sangre completa en un tubo separador de suero (SST) de 4,0 mL. Los días 24, 31 y 49, se recolectó sangre venosa completa de la vena cava anterior de cada cerdo usando una aguja Vacutainer 18g x 1 ½" estéril (Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, Nueva Jersey), un soporte de aguja Vacutainer y un SST de 13 mL. La recolección de sangre en cada tiempo se registró en el registro de recolección de muestras. Se dejó que la sangre coagulara en cada SST, a continuación se centrifugó cada SST y se cosechó el suero. El suero cosechado se transfirió a un tubo Snap estéril y se guardó a –70 ± 10°C hasta su evaluación en una fecha posterior. Las muestras de suero fueron evaluadas por la presencia de anticuerpos contra PCV2 por el personal de BIVI-R&D.

Los cerdos fueron monitoreados una vez por día entre el día 20 y el día 49 por los síntomas clínicos y se registraron las observaciones clínicas en el registro de observación clínica.

Para evaluar el exudado nasal de PCV2, los días 24, 25 y luego cada día impar de por medio del estudio hasta el día 49 inclusive, se insertó un hisopo de Dacrón estéril por vía intranasal en cualquiera de las fosas nasales izquierda o derecha de cada cerdo (un hisopo por cerdo) tan asépticamente como fuera posible, se giró unos pocos segundos y luego se retiró. Cada hisopo se colocó luego en un tubo de tapa roscada estéril individual que contiene 1,0 mL de medio EMEM con IFBS 2%, 500 unidades/mL de penicilina, 500 µg/mL de estreptomicina y 2,5 µg/mL de Fungizone. Se partió el hisopo del tubo, y el tubo Snap se selló y se rotuló apropiadamente con el número de animal, número de estudio, fecha de recolección, día del estudio e “hisopado nasal”. Los tubos Snap sellados se guardaron a -40 ± 10°C hasta transportarlos por la noche sobre hielo a BIVI-St. Joseph. Las recolecciones de hisopados nasales fueron registradas en el formulario de recolección de muestras por hisopado nasal. En BIVI-R&D se efectuaron las pruebas de aislamiento cuantitativo del virus (VI) para PCV2 con las muestras de hisopados nasales. Los resultados se expresaron en valores de log10. Un valor de 1,3 logs o menos era considerado negativo y cualquier valor superior a 1,3 logs era considerado positivo.

Los cerdos que murieron (Nº 28, 52, 56, 69, 82 y 93) en el primer sitio de estudio fueron sometidos a necropsia hasta el nivel necesario como para determinar el diagnóstico. Se registraron las lesiones visibles y no se retuvieron tejidos de estos cerdos. En el segundo sitio de estudio, se efectuó necropsia de los cerdos que murieron antes del día 49 (Nº 45, 23, 58, 35), los cerdos que aparecieron muertos el día 49 antes de sacrificarlos (Nº 2, 43) y los cerdos sacrificados el día 49. Se registraron todas las lesiones visibles y también los porcentajes de lóbulos pulmonares con lesiones en el formulario de informe de necropsia.

De cada uno de los 103 cerdos a los que se les había efectuado necropsia en el segundo sitio de estudio, se tomó una muestra de tejido de amígdala, pulmón, corazón, hígado, nódulo linfático mesentérico, riñón y nódulo linfático inguinal que se colocó en un envase individual con formalina 10% amortiguada; y otra muestra de tejido de los mismos órganos mencionados se colocó en un Whirl-pak (M-Tech Diagnostics Ltd., Thelwall, Reino Unido) y cada Whirl-pak se colocó sobre hielo. Cada envase se rotuló apropiadamente. Las recolecciones de muestras se registraron en el formulario de informe de necropsia. Posteriormente, se enviaron las muestras de tejidos fijados en formalina y un formulario de solicitud de diagnóstico para las pruebas de IHC. Las pruebas de IHC se realizaron de acuerdo con los procedimientos de laboratorio ISU estándar para recibir muestras, preparar muestras y portaobjetos y usar las técnicas de coloración. Los tejidos frescos en los Whirl-pak fueron enviados sobre hielo al Monitor del estudio para su almacenamiento (-70° ± 10 °C) y posible uso futuro. Los tejidos fijados en formalina fueron examinados por un patólogo para detectar el PCV2 por IHC y se calificaron de acuerdo con el siguiente sistema de puntaje: 0 = ninguno; 1 = escasa coloración positiva, pocos sitios; 2 = coloración positiva moderada, múltiples sitios; y 3 = coloración positiva abundante, difusa en todo el tejido. Debido al hecho que el patólogo no podía diferenciar positivamente el LN inguinal del LN mesentérico, los resultados para estos tejidos se rotularon simplemente como nódulo linfático y el puntaje asignado era el puntaje más alto de cada uno de los dos tejidos por animal.

Resultados

Los resultados para este ejemplo se muestran más adelante. Cabe destacar que un cerdo del grupo 9 murió antes del día 0 y 5 cerdos más murieron después de la vacunación (1 cerdo del grupo 4; 1 cerdo del grupo 6; 2 cerdos del

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5

10

15

20

25

30

8

Controles de prueba 50,0 55,0 50,0 50,0 5433,3

9

Control negativo estricto 50,0 59,1 59,1 54,5 6136,4

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 de baculovirus recombinante expresado; virus completos muertos = virus de PCV2 cultivados en el cultivo celular adecuado

*A efectos de los cálculos, un título de IFA =100 se denominó título de “50"; un título IFA =6400 se denominó título de “12.800".

**Día de la exposición

***Día de la necropsia

Los resultados de las observaciones clínicas después de la exposición se muestran en la siguiente tabla 8. Este resumen de los resultados incluye observaciones de conducta anormal, respiración anormal, tos y diarrea. La tabla 9 incluye los resultados del resumen de la incidencia general de síntomas clínicos de los grupos y la tabla 10 incluye los resultados del resumen de los índices de mortalidad de post-exposición de los grupos. El síntoma clínico más común observado en este estudio fue una conducta anormal, que se calificó como letargia leve a severa. Los cerdos que recibieron las 2 dosis inferiores de vORF2, los cerdos que recibieron 16 µg de rORF2 y los cerdos que recibieron 2 dosis de vacuna KV tenían índices de incidencia de = 27,3%. Los cerdos que recibieron 8 µg de rORF2 y el grupo control negativo estricto no presentaron una conducta anormal. En este estudio ninguno de los cerdos mostró una respiración anormal. La tos era frecuente en los 15 grupos (0 a 25%), así como la diarrea (0-20%). Ninguno de los síntomas clínicos observados era patognómico para PMWS.

La incidencia general de síntomas clínicos variaba según los grupos. Los grupos que recibieron cualquiera de las vacunas vORF2, el grupo que recibió 16 µg de rORF2, el grupo que recibió 2 dosis de vacuna KV y el grupo de control de prueba tenían la mayor incidencia de todos los síntomas clínicos (=36,4%). El grupo control negativo estricto, el grupo que recibió 8 µg de rORF2 y el grupo que recibió 4 µg de rORF2 tenían índices de incidencia general de síntomas clínicos del 0%, 8,3% y 9,1%, respectivamente.

Los índices de mortalidad generales también variaban según los grupos. El grupo que recibió 2 dosis de vacuna KV mostró el mayor índice de mortalidad (16,7%); en tanto los grupos que recibieron 4 µg de vORF2, 16 µg de rORF2 u 8 µg de rORF2 y el grupo control negativo estricto presentaban todos índices de mortalidad del 0%.

Tabla 8. Resumen de las observaciones de conducta anormal, respiración anormal, tos y diarrea en los grupos

Grupo

Tratamiento N Conducta anormal1 Conducta anormal2 Tos3 Diarrea4

1

vORF2-16 µg (1 dosis) 12 2/12 (16,7%) 0/12 (0%) 3/12 (25%) 2/12 (16/7%)

2

vORF2-8 µg (1 dosis) 12 4/12 (33,3%) 0/12 (0%) 1/12 (8,3%) 1/12 (8,3%)

3

vORF2-4 µg (1 dosis) 12 8/12 (66,7%) 0/12 (0%) 2/12 (16,7%) 1/12 (8,3%)

4

rORF2-16 µg (1 dosis) 11 3/11 (27,3%) 0/11 (0%) 0/11 (0%) 2/11 (18,2%)

5

rORF2-8 µg (1 dosis) 12 0/12 (0%) 0/12 (0%) 1/12 (8,3%) 0/12 (0%)

6

rORF2-4 µg (1 dosis) 11 1/11 (9,1%) 0/11 (0%) 0/11 (0%) 0/12 (0%)

7

KV (2 dosis) 12 7/12 (58,3) 0/12 (0%) 0/12 (0%) 1/12 (8,3%)

8

Control de prueba 10 1/10 (10%) 0/10 (0%) 2/10 (20%) 2/10 (20%)

9

Control negativo estricto 11 0/11 (0%) 0/11 (0%) 0/11 (0%) 0/11 (0%)

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 de baculovirus recombinante expresado; virus completos muertos = virus PCV2 cultivado en cultivo celular adecuado 1 Número total de cerdos en cada grupo que demostró alguna conducta anormal durante al menos un día 2 Número total de cerdos en cada grupo que demostró algún tipo de respiración anormal durante al menos un día 3 Número total de cerdos en cada grupo que demostró tos durante al menos un día 4 Número total de cerdos en cada grupo que demostró diarrea durante al menos un día

imagen13

3

vORF2-4 µg (1 dosis) 12 1 8,3%

4

rORF2-16 µg (1 dosis) 11 2 18,2%

5

rORF2-8 µg (1 dosis) 12 1 8,3%

6

rORF2-4 µg (1 dosis) 11 1 9,1%

7

KV (2 dosis) 12 5 41,7%

8

Control de prueba 10 8 80%

9

Control negativo estricto 11 7 63,6%

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 de baculovirus recombinante expresado; virus completos muertos = virus PCV2 cultivado en el cultivo celular adecuado

Los resúmenes de incidencia de ictericia en los grupos, incidencia de úlceras gástricas en los grupos, puntajes promedio de lesiones pulmonares en los grupos e incidencia de lesiones pulmonares en los grupos se muestran a

5 continuación en la tabla 12. Seis cerdos murieron en el primer sitio de prueba durante la fase de post-vacunación del estudio (grupo 4, N=1; grupo 6, N=1; grupo 8, N=2; grupo 9, N=2). Cuatro de seis cerdos presentaron lesiones fibrosas en una o más cavidades del cuerpo, un cerdo (grupo 6) mostró lesiones coherentes con la enfermedad por clostridia y un cerdo (grupo 9) no presentaba lesiones visibles. Ninguno de los cerdos que murió durante la fase de post-vacunación del estudio tenía lesiones coherentes con PMWS.

10 Los cerdos que murieron después de la exposición y los cerdos sacrificados el día 49 fueron sometidos a necropsia. En la necropsia no se observó ictericia ni úlceras gástricas en ninguno de los grupos.Con respecto al % promedio de lesiones pulmonares,el grupo 9 tenía el menor % promedio de lesiones pulmonares (0%),seguido del grupo 1 con 0,40 ± 0,50% y el grupo 5 con 0,68 ± 1,15%. Los grupos 2, 3, 7 y 8 tenían el mayor % promedio de lesiones pulmonares (= 7,27%). Cada uno de estos cuatro grupos comprendía un cerdo con un % lesiones pulmonares

15 =71,5%, que sesgó los resultados más altos para estos cuatro grupos. Con excepción del grupo 9 con 0% de lesiones pulmonares,los 8 grupos restantes tenían un = 36% de lesiones pulmonares. Casi todas las lesiones pulmonares observadas se describieron como rojas/púrpuras y consolidadas.

20 grupos

Tabla 12. Resumen de incidencia de Ictericia en los grupos, incidencia de úlceras gástricas en los grupos, % promedio de puntajes de lesiones pulmonares en los grupos e incidencia de lesiones pulmonares observadas de los

Grupo

Tratamiento Ictericia Úlceras gástricas % promedio de lesiones pulmonares Incidencia de lesiones pulmonares observadas

1

vORF2-16 µg (1 dosis) 0/12 (0%) 0/12 (0%) 0,40 ± 0,50% 10/12 (83%)

2

vORF2-8 µg (1 dosis) 0/12 (0%) 0/12 (0%) 7,41 ± 20,2% 10/12 (83%)

3

vORF2-4 µg (1 dosis) 0/12 (0%) 0/12 (0%) 9,20 ± 20,9% 10/12 (83%)

4

rORF2-16 µg (1 dosis) 0/11 (0%) 0/11 (0%) 1,5 ± 4,74% 4/11 (36%)

5

rORF2-8 µg (1 dosis) 0/12 (0%) 0/12 (0%) 0,68 ± 1,15% 9/12 (75%)

6

rORF2-4 µg (1 dosis) 0/11 (0%) 0/11 (0%) 2,95 ± 5,12% 7/11 (64%)

7

KV (2 dosis) 0/12 (0%) 0/12 (0%) 7,27 ± 22,9% 9/12 (75%)

8

Control de prueba 0/10 (0%) 0/10 (0%) 9,88 ± 29,2% 8/10 (80%)

9

Control negativo estricto 0/11 (0%) 0/11 (0%) 0/11 (0%) 0/11 (0%)

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 de baculovirus recombinante expresado; KV o virus completos muertos = virus PCV2 cultivado en el cultivo celular adecuado

El resumen de los resultados de incidencia positiva de IHC en los grupos se muestra en la tabla 13. El grupo 1 (vORF2-16 µg) y el grupo 5 (rORF2-8 µg) tenían el menor índice de resultados IHC positivos (16,7%). El grupo 8

25 (Control de prueba) y el grupo 9 (control negativo estricto) tenían el mayor índice de resultados IHC positivos, del 90% y 90,9%, respectivamente.

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Tabla 15. Resumen de los datos de post-exposición de los grupos: Parte 2

Grupo

N Tratamiento Índice de mortalidad Exudado nasal % promedio de lesiones pulm. Índice de incidencia de al menos un tejido IHC positivo para PCV2

1

12 vORF2-16 µg (1 dosis) 8,3% 8,3% 0,40 ± 0,50% 16,7%

2

12 vORF2-8 µg (1 dosis) 8,3% 8,3% 7,41 ± 20,2% 25,0%

3

12 vORF2-4 µg (1 dosis) 0% 8,3% 9,20 ± 20,9% 66,7%

4

11 rORF2-16 µg (1 dosis) 0% 18,2% 1,50 ± 4,74% 36,3%

5

12 rORF2-8 µg (1 dosis) 0% 8,3% 0,68 ± 1,15% 16,7%

6

11 rORF2-4 µg (1 dosis) 9,1% 9,1% 2,95 ± 5,12% 36,4%

7

12 KV (2 dosis) 16,7% 41,7% 7,27 ± 22,9% 41,7%

8

10 Control de prueba 10% 80% 9,88 ± 29,2% 90,0%

9

11 Control negativo estricto 0% 63,6% 0/11 (0%) 90,9%

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 de baculovirus recombinante expresado; KV o virus completos muertos = virus PCV2 cultivado en el cultivo celular adecuado

Los resultados de este estudio indican que todos los enfoques de vacuna deberían centrarse en una vacuna rORF2. En general, el exudado nasal de PCV2 se detectó después de la exposición y la vacunación con una vacuna de PCV2 dio como resultado una reducción del exudado. La inmunohistoquímica de tejidos linfoides selectos también sirvió como un buen parámetro para la eficacia de la vacuna, en tanto no se detectaron grandes diferencias en ADWG, síntomas clínicos y lesiones visibles entre los grupos. Este estudio era complicado por el hecho que en algún punto se introdujo un PCV2 extraño durante el estudio, como lo demuestra el exudado nasal de PCV2, la seroconversión de PCV2 y los tejidos IHC positivos en el grupo 9, el grupo control negativo estricto.

Discusión

En este estudio se evaluaron siete vacunas de PCV2, que incluyeron tres diferentes niveles de dosis de antígeno vORF2 administrado una vez el día 0, tres diferentes niveles de dosis de antígeno rORF2 administrado una vez el día 0 y un nivel de dosis de vacuna de células enteras muertas de PCV2 administrado el día 0 y el día 14. En general, el grupo 5, que recibió 1 dosis de vacuna que contenía 8 µg de antígeno rORF2, presentaba los mejores resultados. El grupo 5 tenía la mayor ADWG, la menor incidencia de conducta anormal, la menor incidencia de respiración anormal, la segunda menor incidencia de tos, la menor incidencia de síntomas clínicos generales, el menor índice de mortalidad, el menor índice de exudado nasal de PCV2, el segundo menor índice del % promedio de lesiones pulmonares y el menor índice de incidencia para tejidos IHC positivos.

Curiosamente, el grupo 4, que recibió una dosis más alta de antígeno rORF2 que el grupo 5, no se comportó tan bien o mejor que el grupo 5. El grupo 4 tenía una ADWG ligeramente menor, una mayor incidencia de conducta anormal, una mayor incidencia de síntomas clínicos generales, un mayor índice de exudado nasal de PCV2, un mayor % promedio de lesiones pulmonares y un mayor índice para tejidos IHC positivos que el grupo 5. Los análisis estadísticos, que podrían haber indicado que las diferencias entre estos dos grupos no eran estadísticamente significativas, no se efectuaron con estos datos, pero se observó una tendencia que el grupo 4 no presentaba el mismo comportamiento que el grupo 5.

Después de la vacunación, 6 cerdos murieron en el primer sitio de estudio. Cuatro de los seis cerdos eran del grupo 8 o grupo 9, que no recibieron vacuna. Ninguno de los seis cerdos mostraron lesiones coherentes con PMWS, no se informaron efectos adversos y en general, las siete vacunas parecen seguras cuando son administradas a cerdos de 11 días de vida aproximadamente. Durante la fase de post-vacunación del estudio, los cerdos que recibieron ya sea tres niveles de dosis de vacuna vORF2 o una vacuna a células enteras muertas presentaban los niveles más altos de IFAT, en tanto el grupo 5 presentaba los menores niveles de IFAT justo antes de la exposición, entre los grupos de vacunas.

Aunque no se ha demostrado formalmente, se cree que la ruta de transmisión predominante de PCV2 a los cerdos jóvenes poco después del destete es por contacto oronasal directo y entonces una vacuna eficaz que permita reducir el exudado nasal de PCV2 en un establecimiento de producción ayudaría a controlar la dispersión de la infección. Los grupos que recibieron uno de los tres niveles de antígeno vORF2 y el grupo que recibió 8 µg de rORF2 tenían el menor índice de incidencia de exudado nasal de PCV2 (8,3%). Como era de esperar, el grupo

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Ejemplo 5

En este ejemplo se evalúa la eficacia de ocho candidatos de vacunas PCV2 y se reconfirman los parámetros de exposición a PCV2 de estudios de exposición previos después de la exposición a una cepa virulenta de PCV2. Se utilizaron ciento cincuenta (150) lechones nacidos por cesárea, privados de calostro (CDCD), de 6-16 días de vida, se bloquearon por peso y se dividieron aleatoriamente en 10 grupos de igual tamaño. En la tabla 16 se muestra el diseño general del estudio de este ejemplo.

Tabla 16. Diseño general del estudio

Grupo

Nº cerdos Tratamiento Día de tratam. KLH/ICFA el día 22 y el día 28 Exposición a PCV2 virulento el día 25 PRRSV MLV el día 46 Necropsia el día 50

1

15 Vacuna PVC2 1 16 µg de rORF2-IMS 1314 0 y 14 + + + +

2

15 Vacuna PVC2 2 16 µg de vORF2-Carbopol 0 y 14 + + + +

3

15 Vacuna PCV2 3 16 µg de rORF2-Carbopol 0 y 14 + + + +

4

15 Vacuna PCV2 2 16 µg de vORF2-Carbopol 0 + + + +

5

15 Vacuna PVC2 3 4 µg de rORF2-Carbopol 0 & 14 + + + +

6

15 Vacuna PVC2 3 1 µg de rORF2-Carbopol 0 & 14 + + + +

7

15 Vacuna PVC2 3 0,25 µg de rORF2-Carbopol 0 & 14 + + + +

8

15 Vacuna PVC2 4 > 8,0 log KV-Carbopol 0 & 14 + + + +

9

15 Control de prueba N/D + + + +

10

15 Grupo control negativo no estricto N/D + - + +

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 de baculovirus recombinante expresado; KV o virus completos muertos = virus de PCV2 cultivado en el cultivo celular adecuado

La formulación de vacuna administrada a cada grupo fue como sigue. La vacuna PCV2 Nº 1, administrada a una dosis de 1 x 2 ml al grupo 1, era una dosis alta (dosis de 16 ug/2 ml) de antígeno ORF2 recombinante inactivado con adyuvante de IMS 1314 (16 ug de rORF2-IMS 1314). La vacuna PCV2 Nº 2, administrada a una dosis de 1 x 2 ml al grupo 2, era una dosis alta (dosis de 16 ug/2 ml) de un antígeno de ORF2 PCV2 generado por VIDO R-1 parcialmente purificado con adyuvante de Carbopol (16 ug de vORF2-Carbopol). La vacuna PCV2 Nº 3, administrada a una dosis de 1 x 2 ml al grupo 3, era una dosis alta (dosis de 16 ug/2 ml) de antígeno de ORF2 recombinante inactivado con adyuvante de Carbopol (16 ug de rORF2-Carbopol). La vacuna PCV2 Nº 4, administrada a una dosis de 1 x 1 ml al grupo 4, era una dosis alta (dosis de 16 ug /1 ml) de un antígeno de ORF2 PCV2 generado por VIDO R-1 parcialmente purificado con adyuvante de Carbopol (16 ug vORF2-Carbopol). La vacuna Nº 5, administrada a una dosis de 1 x 2 ml al grupo 5, era una dosis de 4 ug/2 ml de un antígeno de ORF2 recombinante inactivado con adyuvante de Carbopol (4 ug de rORF2-Carbopol). La vacuna PCV2 Nº 6, administrada a una dosis de 1 x 2 ml al grupo 6, era una dosis de 1 ug/2 ml de un antígeno de ORF2 recombinante inactivado con adyuvante de Carbopol (1 ug de rORF2-Carbopol). La vacuna PCV2 Nº 7, administrada a una dosis de 1 x 2 ml al grupo 7, era una dosis baja (dosis de 0,25 ug/2 ml) de antígeno ORF2 recombinante inactivado con adyuvante de Carbopol (0,25 ug de rORF2-Carbopol). La vacuna PCV2 Nº 8, administrada a una dosis de 1 x 2 ml al grupo 8, era una dosis alta (título de pre-inactivación > 8,0 log/2 ml dosis) de un antígeno Struve PCV2 generado por VIDO R-1 inactivado convencional muerto con adyuvante de Carbopol (>8,0 log KV-Carbopol). El día 0, los grupos 1-8 fueron tratados con las vacunas asignadas. Los grupos 1-3 y 5-8 recibieron refuerzos de sus respectivas vacunas nuevamente el día 14. La eficacia de una sola dosis de 16 µg de vORF2-Carbopol fue evaluada con el grupo 4 que no recibió refuerzo el día 14. Los lechones fueron monitoreados por efectos adversos y reacciones en el sitio de inyección después de ambas vacunaciones. El día 21 los lechones fueron movidos al segundo sitio de estudio donde los grupos 1-9 fueron albergados en una instalación y el grupo 10 fue albergado en una instalación separada. Todos

los cerdos recibieron hemocianina de lapa emulsionada con adyuvante incompleto de Freund (KLH/ICFA) los días 22 y 28. El día 25, los grupos 1-9 fueron expuestos a aproximadamente 4 logs de virus PCV2 virulento. Para el día 46, se habían producido muy pocas muertes en el grupo control de prueba. En un intento por inmunoestimular a los cerdos e incrementar la virulencia del material de exposición de prueba PCV2, todos los grupos fueron tratados con

5 INGELVAC® PRRSV MLV (vacuna reproductora y respiratoria porcina, virus vivo modificado) el día 46.

Antes y después de la exposición se recolectaron muestras de sangre para la serología de PCV2. Después de la exposición, se registraron los datos del peso corporal para determinar la ganancia de peso diario promedio (ADWG) y las observaciones de los signos clínicos. El día 50, todos los cerdos que sobrevivieron fueron sacrificados, se registraron las lesiones visibles, se calificó la patología de los pulmones y algunos tejidos selectos fueron

10 conservados en formalina para su examen mediante inmunohistoquímica (IHC) con el fin de detectar el antígeno PCV2 en un momento posterior.

Materiales y métodos

Este era un estudio de viabilidad frente a la exposición a una vacunación parcialmente ciego realizado con cerdos CDCD, de 6 a 16 días de vida el día 0. Para su inclusión en el estudio, los títulos IFA PCV2 de las cerdas eran de = 15 1:1000. Además, el estado serológico de las cerdas era de una piara conocida PRRS-negativa. Se evaluaron dieciséis (16) cerdas por el estado serológico de PCV2 y las dieciséis (16) tenían un título de PCV2 de = 1000 y fueron transferidas al primer sitio de estudio. Se emplearon ciento cincuenta (150) lechones nacidos por cirugía cesárea y estaban disponibles para este estudio el día -3. El día -3, se pesaron los 150 cerdos CDCD en el primer sitio de estudio, se identificaron con rótulos de oreja, fueron bloqueados por peso y asignados aleatoriamente a 1 de 20 10 grupos, como se describió previamente en la tabla 16. Se recolectaron muestras de sangre de todos los cerdos. Si alguno de los animales de prueba que había cumplido con los criterios de inclusión era enrolado en el estudio y posteriormente excluido del mismo por cualquier motivo, se notificaba al Investigador y Monitor con el fin de determinar el uso de los datos recolectados del animal en el análisis final. Se registró la fecha en que los lechones enrolados eran excluidos y la razón de dicha exclusión. No se excluyó ninguna de las cerdas que cumplían con los

25 criterios de inclusión, seleccionadas para el estudio y transportadas al primer sitio de estudio. No se excluyeron lechones del estudio y no se retiraron animales de prueba del estudio antes de terminar el mismo. En la Tabla 17 se describen los tiempos para las actividades más importantes de este ejemplo.

Tabla 17. Actividades del estudio

Día del estudio

Fechas reales Actividad del estudio

-3

4/4/03 Peso de los cerdos; examen salud; asignación aleatoria en grupos; recolección de muestras de sangre

-3, 0-21

4/4/03; 7/4/03 al 27/5/03 Observación del estado de salud general y de efectos adversos de postvacunación

0

7/4/03 Administración de respectivos IVP a los grupos 1-8

0-7

7/4/03 al 14/4/03 Observación de los cerdos por reacciones en el sitio de inyección

14

21/4/03 Grupos 1-3, 5-8 reforzados con los respectivos IVP; muestreo de sangre de todos los cerdos

14-21

21/4/03 al 28/4/03 Observación de los cerdos por reacciones a la inyección

19-21

26/4/03 al 28/4/03 Tratamiento de todos los cerdos con antibióticos

21

28/04/03 Cerdos transportados de Struve Labs, Inc. a Veterinary Resources, Inc.(VRI)

22-50

28/4/03 al 27/5/03 Observación de los cerdos por signos clínicos después de la exposición

22

4-29-03 Tratamiento de los grupos 1-10 con KLH/ICFA

25

2/5/03 Recolección de muestras de sangre de todos los cerdos; peso de todos los cerdos; exposición de los grupos 1-9 con material de exposición de prueba PCV2

28

5/5/03 Tratamiento de los grupos 1-10 con KLH/ICFA

32

9/5/03 Recolección de muestras de sangre de todos los cerdos

46

23/5/03 Administración de INGELVAC® PRRS MLV a todos los grupos

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Tabla 18. Resumen de las ganancias de peso diario promedio (ADWG) de los grupos

Grupo

Tratamiento N ADWG-lbs/día (día 25 al día 50) o ajustado para los cerdos que murieron antes del día 50

1

rORF2-16 µg-IMS 1314 2 dosis 14 1,08 ± 0,30 lbs/día

2

vORF2-16 µg-Carbopol 2 dosis 15 1,11 ± 0,16 lbs/día

3

rORF2-16 µg-Carbopol 2 dosis 15 1,07 ± 0,21 lbs/día

4

vORF2-16 µg-Carbopol 1 dosis 15 1,16 ± 0,26 lbs/día

5

rORF2-4 µg-Carbopol 1 dosis 15 1,07 ± 0,26 lbs/día

6

rORF2-1 µg-Carbopol 2 dosis 15 1,11 ± 0,26 lbs/día

7

rORF2-0,25 µg-Carbopol 2 dosis 15 0,99 ± 0,44 lbs/día

8

KV > 8,0 log-Carbopol 2 dosis 15 0,93 ± 0,33 lbs/día

9

Control de prueba 14 0,88 ± 0,29 lbs/día

10

Control negativo estricto 15 1,07 ± 0,23 lbs/día

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 de baculovirus recombinante expresado; KV o virus completos muertos = virus de PCV2 cultivado en el cultivo celular adecuado

Los resultados de la serología de PVC2 se muestran en la siguiente tabla 19. Los diez (10) grupos eran

5 seronegativos para PCV2 el día –3. El día 14, los títulos de PCV2 permanecieron bajos en los diez (10) grupos (rango de 50-113). El día 25, el grupo 8, que recibió la vacuna de células enteras muertas, tenía el título más alto de PCV2 (4617), seguido del grupo 2, que recibió 16 ug de vORF2-Carbopol, el grupo 4, que recibió como dosis única 16 ug de vORF2-Carbopol, y el grupo 3, que recibió 16 ug de rORF2-Carbopol, cuyos títulos eran de 2507, 1920 y 1503, respectivamente. El día 32 (una semana después de la exposición), los títulos para los grupos 1-6 y el grupo 8

10 variaban en un rango entre 2360 y 7619; en tanto los grupos 7 (0,25 ug de rORF2-Carbopol), 9 (control de prueba) y 10 (control negativo estricto) tenían títulos de 382, 129 y 78, respectivamente. El día 50 (día de la necropsia), los diez (10) grupos mostraron títulos altos de PCV2 (= 1257).

Los días 25, 32 y 50, el grupo 3, que recibió dos dosis de 16 ug de rORF2-Carbopol tenía títulos de anticuerpo más altos que el grupo 1, que recibió dos dosis de 16 ug de rORF2-IMS 1314. Los días 25, 32 y 50, el grupo 2, que

15 recibió dos dosis de 16 ug de vORF2 tenía títulos más altos que el grupo 4, que solamente recibió una dosis de la misma vacuna. Los grupos 3, 5, 6, 7, que recibieron niveles decrecientes de rORF2-Carbopol, de 16, 4, 1 y 0,25 ug, respectivamente, demostraron títulos de anticuerpo correspondientemente decrecientes los días 25 y 32.

Tabla 19. Resumen de los títulos de IFA PCV2 en los grupos

Grupo

Tratamiento Día –3 Día 14** Día 25*** Día 32 Día 50****

1

rORF2-16 µg –IMS 1314 2 dosis 50 64 646 3326 4314

2

vORF2-16 µg-Carbopol 2 dosis 50 110 2507 5627 400

3

rORF2-16 µg –Carbopol 2 dosis 50 80 1503 5120 6720

4

vORF2-16 µg –Carbopol 1 dosis 50 113 1920 3720 1257

5

rORF2-4 µg-Carbopol 1 dosis 50 61 1867 3933 4533

6

rORF2-1 µg-Carbopol 2 dosis 50 70 490 2360 5740

7

rORF2-0,25 µg-Carbopol 2 dosis 50 73 63 382 5819

8

KV > 8,0 log-Carbopol 2 dosis 50 97 4617 7619 10817

9

Control de prueba 50 53 50 129 4288

10

Control negativo estricto 50 50 50 78 11205

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 de baculovirus recombinante expresado; KV o virus completos muertos 20 = virus de PCV2 cultivado en el cultivo celular adecuado

5

10

15

20

25

30

*A efectos de los cálculos, un título de IFA =100 se denominó título de “50"; un título de IFA =6400 se denominó título de “12.800".

**Día de la exposición

***Día de la necropsia

Los resultados de las observaciones clínicas de post-exposición se muestran a continuación. La tabla 20 incluye las observaciones de conducta anormal, respiración anormal, tos y diarrea. La tabla 21 incluye los resultados del resumen de la incidencia general de síntomas clínicos de los grupos y la Tabla 22 incluye los resultados del resumen de los índices de mortalidad de los grupos después de la exposición. La incidencia de conducta anormal, respiración y tos después de la exposición fue baja en los cerdos que recibieron 16 ug de rORF2–IMS 1314 (grupo 1), 16 ug de rORF2–Carbopol (grupo 3), 1 ug de rORF2–Carbopol (grupo 6), 0,25 ug de rORF2–Carbopol (grupo 7) y en los cerdos del grupo control de prueba (grupo 9). La incidencia de conducta anormal, respiración y tos después de la exposición era de cero en los cerdos que recibieron 16 ug de vORF2–Carbopol (grupo 2), una sola dosis de 16 ug de vORF2–Carbopol (grupo 4), 4 ug de rORF2–Carbopol (grupo 5), >8 log KV–Carbopol (grupo 8) y en los cerdos del grupo control negativo estricto (grupo 10).

La incidencia general de los síntomas clínicos varió según los grupos. Los cerdos que recibieron 16 ug de vORF2– Carbopol (grupo 2),una sola dosis de 16 ug de vORF2–Carbopol (grupo 4) y los cerdos del grupo control negativo estricto (grupo 10) tenían índices de incidencia del 0%; los cerdos que recibieron 16 ug de rORF2–Carbopol (grupo 3) y 1 ug de rORF2–Carbopol (grupo 6) tenían índices de incidencia del 6,7%; los cerdos que recibieron 16 ug de rORF2–IMS 1314 (grupo 1) tenían un índice de incidencia general del 7,1%; los cerdos que recibieron 4 ug de rORF2–Carbopol (grupo 5), 0,25 ug de rORF2–Carbopol (grupo 7) y >8 log vacuna KV tenían índices de incidencia del 13,3%; y los cerdos del grupo control de prueba (grupo 9) tenían un índice de incidencia del 14,3%.

También variaron los índices generales de mortalidad entre grupos. El grupo 8, que recibió 2 dosis de vacuna KV tenía el mayor índice de mortalidad del 20,0%; seguido del grupo 9, el grupo control de prueba, y el grupo 7, que recibió 0,25 ug de rORF2–Carbopol y tenían índices de mortalidad del 14,3% y 13,3%, respectivamente. El grupo 4, que recibió una dosis de 16 ug de vORF2–Carbopol tenía un índice de mortalidad del 6,7%. Todos los demás grupos, 1, 2, 3, 5, 6 y 10 tenían un índice de mortalidad del 0%.

Tabla 20. Resumen de las observaciones de conducta anormal, respiración anormal y tos después de la exposición de los grupos

Grupo

Tratamiento N Conducta anormal1 Conducta anormal2 Tos3

1

rORF2-16 µg-IMS 1314 2 dosis 14 0/14 (0%) 0/14 (0%) 1/14 (7,1%)

2

vORF2-16 µg-Carbopol 2 dosis 15 0/15 (0%) 0/15 (0%) 0/15 (0%)

3

rORF2-16 µg-Carbopol 2 dosis 15 0/15 (0%) 0/15 (0%) 1/15 (6,7%)

4

vORF2-16 µg-Carbopol 1 dosis 15 0/15 (0%) 0/15 (0%) 0/15 (0%)

5

rORF2-4 µg-Carbopol 1 dosis 15 1/15 (6,7%) 1/15 (6,7%) 0/15 (0%)

6

rORF2-1 µg-Carbopol 2 dosis 15 0/15 (0%) 0/15 (0%) 1/15 (6,7%)

7

rORF2-0,25 µg-Carbopol 2 dosis 15 0/15 (0%) 1/15 (6,7%) 1/15 (06,7%)

8

KV > 8,0 log-Carbopol 2 dosis 15 1/15 (6,7%) 1/15 (6,7%) 0/15 (0%)

9

Control de prueba 14 1/14 (7,1%) 1/14 (7,1%) 2/14 (14/3%)

10

Control negativo estricto 15 0/15 (0%) 0/15 (0%) 0/15 (0%)

1 Número total de cerdos en cada grupo que demostró alguna conducta anormal durante al menos un día 2 Número total de cerdos en cada grupo que demostró respiración anormal durante al menos un día 3 Número total de cerdos en cada grupo que demostró tos durante al menos un día

Tabla 21. Resumen de la incidencia general de síntomas clínicos después de la exposición de los grupos

Grupo

Tratamiento N Incidencia de cerdos con síntomas clínicos1 Índice de incidencia

1

rORF2-16 µg-IMS 1314 2 dosis 14 1 7,1%

2

vORF2-16 µg-Carbopol 2 dosis 15 0 0,0%

3

rORF2-16 µg-Carbopol 2 dosis 15 1 6,7%

4

vORF2-16 µg-Carbopol 1 dosis 15 0 0,0%

5

rORF2-4 µg-Carbopol 1 dosis 15 2 13,3%

6

rORF2-1 µg-Carbopol 2 dosis 15 1 6,7%

7

rORF2-0,25 µg-Carbopol 2 dosis 15 2 13,3%

8

KV > 8,0 log-Carbopol 2 dosis 15 2 13,3%

9

Control de prueba 14 2 14,3%

10

Control negativo estricto 15 0 0,0%

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 de baculovirus recombinante expresado; KV o virus completos muertos = virus de PCV2 cultivado en el cultivo celular adecuado 1 Número total de cerdos en cada grupo que demostró algún síntoma clínico durante al menos un día 5 Tabla 22. Resumen de los índices de mortalidad después de la exposición de los grupos

Grupo

Tratamiento N Muertos después de la exposición Índice de mortalidad

1

rORF2-16 µg-IMS 1314 2 dosis 14 0 0,0%

2

vORF2-16 µg-Carbopol 2 dosis 15 0 0,0%

3

rORF2-16 µg-Carbopol 2 dosis 15 0 0,0%

4

vORF2-16 µg-Carbopol 1 dosis 15 1 6,7%

5

rORF2-4 µg-Carbopol 1 dosis 15 0 0,0%

6

rORF2-1 µg-Carbopol 2 dosis 15 0 0,0%

7

rORF2-0,25 µg-Carbopol 2 dosis 15 2 13,3%

8

KV > 8,0 log-Carbopol 2 dosis 15 3 20,0%

9

Control de prueba 14 2 14,3%

10

Control negativo estricto 15 0 0,0%

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 de baculovirus recombinante expresado; KV o virus completos muertos = virus de PCV2 cultivado en el cultivo celular adecuado

El resumen de porcentaje medio de lesiones pulmonares y diagnóstico tentativo de los grupos se ofrece a continuación en la tabla 23. El grupo 9, el grupo control de prueba, tenía el porcentaje más alto de lesiones

10 pulmonares con una media de 10,81 ± 23,27%, seguido del grupo 7, que recibió 0,25 ug de rORF2–Carbopol y tenía una media de 6,57 ± 24,74%, luego el grupo 5, que recibió 4 ug de rORF2–Carbopol y tenía una media de 2,88 ± 8,88%, y el grupo 8, que recibió la vacuna KV y tenía una media de 2,01 ± 4,98%. Los restantes seis (6) grupos tenían un porcentaje medio más bajo de lesiones pulmonares que variaba en un rango entre 0,11 ± 0,38% y 0,90 ± 0,15%.

15 El diagnóstico tentativo de pneumonía varió entre los grupos. El grupo 3, que recibió dos dosis de 16 ug de rORF2– Carbopol, presentó el diagnóstico tentativo de pneumonia más bajo, con un 13,3%. El grupo 9, el grupo control de prueba, presentaba un 50% del grupo diagnosticado tentativamente con pneumonía, seguido del grupo 10, el grupo control negativo estricto y el grupo 2, que recibió dos dosis de 16 ug de vORF2–Carbopol, con un 46,7% y 40%,

respectivamente, de diagnóstico tentativo de pneumonía.

Los grupos 1, 2, 3, 5, 9 y 10 presentaban un 0% de diagnóstico tentativo como infectados con PCV2; en tanto el grupo 8, que recibió dos dosis de vacuna KV, presentaba el índice de diagnóstico tentativo más alto de infección por PCV2 de los grupos, que era de un 20%. El grupo 7, que recibió dos dosis de 0,25 ug de rORF2–Carbopol, y el grupo 4, que recibió una dosis de 16 ug de vORF2–Carbopol presentaban diagnósticos tentativos de infección por PCV2 del 13,3% y 6,7% para cada grupo, respectivamente.

Solamente se diagnosticó úlceras gástricas en un cerdo del grupo 7 (6,7%); en tanto los demás 9 grupos permanecieron libres de úlceras gástricas.

Tabla 23. Resumen del % promedio de lesiones pulmonares y diagnóstico tentativo en los grupos

Grupo

Tratamiento N Nº de cerdos con exudado al menos un día Índice de incidencia

1

rORF2-16 µg-IMS 1314 2 dosis 15 0 0%

2

vORF2-16 µg-Carbopol 2 dosis 15 1 6,7%

3

rORF2-16 µg-Carbopol 2 dosis 15 3 20,0%

4

vORF2-16 µg-Carbopol 1 dosis 15 2 13,3%

5

rORF2-4 µg-Carbopol 1 dosis 15 3 20,0%

6

rORF2-1 µg-Carbopol 2 dosis 15 6 40,0%

7

rORF2-0,25 µg-Carbopol 2 dosis 15 7 46,7%

8

KV > 8,0 log-Carbopol 2 dosis 15 12 80%

9

Control de prueba 14 14 100,0%

10

Control negativo estricto 15 14 93,3%

10 vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 de baculovirus recombinante expresado; KV o virus completos muertos = virus de PCV2 cultivado en el cultivo celular adecuado

El resumen de resultados de incidencia positiva de IHC en los grupos se muestran a continuación en la tabla 24. El grupo 1 (16 ug de rORF2-IMS 1314) tenía el índice de resultados IHC positivos del grupo más bajo con un 0% de cerdos positivos para PCV2, seguido del grupo 2 (16 ug de vORF2-Carbopol) y del grupo 4 (una sola dosis de 16 ug

15 de vORF2-Carbopol), con índices de IHC para los grupos del 6,7% y 13,3%, respectivamente. El grupo 9, el grupo control de prueba, tenía el índice de incidencia positiva por IHC más alto, con el 100% de los cerdos positivos para PCV2, seguido del grupo 10, el grupo control negativo estricto, y del grupo 8 (vacuna KV), con un 93,3% y 80% de los cerdos positivos para PCV2, respectivamente.

Tabla 24. Resumen del índice de incidencia de positivos por IHC en los grupos

Grupo

Tratamiento N Nº de cerdos con exudado durante al menos un día Índice de incidencia

1

rORF2-16 µg-IMS 1314 2 dosis 15 0 0%

2

vORF2-16 µg-Carbopol 2 dosis 15 1 6,7%

3

rORF2-16 µg-Carbopol 2 dosis 15 3 20,0%

4

vORF2-16 µg-Carbopol 1 dosis 15 2 13,3%

5

rORF2-4 µg-Carbopol 1 dosis 15 3 20,0%

6

rORF2-1 µg-Carbopol 2 dosis 15 6 40,0%

7

rORF2-0,25 µg-Carbopol 2 dosis 15 7 46,7%

8

KV > 8,0 log-Carbopol 2 dosis 15 12 80%

9

Control de prueba 14 14 100,0%

10

Control negativo estricto 15 14 93,3%

20 vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 de baculovirus recombinante expresado; KV o virus completos muertos = virus de PCV2 cultivado en el cultivo celular adecuado

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