ES2538694T3

ES2538694T3 - Variantes de la T7 ARN polimerasa con sustituciones de Cisteína-Serina

Info

Publication number: ES2538694T3
Application number: ES12162102.3T
Authority: ES
Inventors: Michael Greif; Christian Rudolph; Harald Sobek; Johann-Peter Thalhofer; Manfred Schmidt
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2011-04-01
Filing date: 2012-03-29
Publication date: 2015-06-23
Anticipated expiration: 2032-03-29
Also published as: US20160010069A1; EP2505641B1; EP2505641A1; US9663769B2; US20120252071A1

Abstract

Una solución acuosa en la que está ausente un agente reductor con un grupo tiol, comprendiendo la solución acuosa un polipéptido, comprendiendo el polipéptido una variante de la T7 ARN polimerasa (variante de T7), teniendo la variante de T7 las propiedades de (i) actividad de ARN polimerasa dependiente de ADN, y (ii) una composición distinta de aminoácidos en comparación con el polipéptido de 883 aminoácidos de la T7 ARN polimerasa de SEC ID Nº: 2 (referencia de tipo silvestre), en la que en una posición seleccionada de la 510 a la 530 de la variante de T7, numerada a partir del extremo N-terminal de la referencia de tipo silvestre, está presente un resto de Cisteína, en la que la variante de T7 comprende una o más sustituciones de aminoácidos de las cuales una (o la primera) está en la posición 723 y donde la Serina sustituye al resto de Cisteína (Cys723Ser), y en la que está ausente la formación de homomultímeros en la solución acuosa de la variante de T7 como resultado de uno o más enlaces disulfuro intermoleculares.

Description

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T7 ARN polimerasa de SEC ID Nº: 2 (referencia de tipo silvestre) y siendo la mejora de la variante de T7 la ausencia de formación de homomultímeros en una solución acuosa como un resultado de un enlace(s) disulfuro intermolecular(es), el método comprende las etapas de

(a): proporcionar la variante de T7 sustituyendo la Cys723, en la referencia de tipo silvestre, numerada a partir del extremo N-terminal por Serina (Cys723Ser);

(b): incluir opcionalmente además en la variante de T7 una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en Cys125Ser, Cys347Ser, Cys492Ser, Cys515Ser y Cys839Ser;

(c): incluir opcionalmente además en la variante de T7 una o más sustituciones de aminoácidos;

(d): retrotranscribir la secuencia de aminoácidos del polipéptido, comprendiendo el polipéptido la variante de T7 obtenida en las etapas (a), (b) y (c), obteniendo de ese modo una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido;

(e): expresar una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la etapa (d) en un sistema de expresión, y aislar el polipéptido expresado del sistema de expresión;

produciendo de ese modo el polipéptido.

27.: El método de acuerdo con el artículo 26, en el que en la etapa (c) la una o más sustitución(es) de aminoácidos se selecciona(n) del grupo que consiste en Val426Leu, Val426Ile, Val426Phe, Ser633Val, Ser633Met, Val650Leu, Thr654Leu, Ala702Val y Val795Ile.

28.: Un método para producir una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótidos que codifica una variante mejorada de la T7 ARN polimerasa (variante de T7), teniendo la variante de T7 las propiedades de (i) actividad de ARN polimerasa dependiente de ADN, y (ii) una composición distinta de aminoácidos en comparación con el polipéptido de 883 aminoácidos de la T7 ARN polimerasa de SEC ID Nº: 2 (referencia de tipo silvestre), y siendo la mejora de la variante de T7 la ausencia de la formación de homomultímeros en una solución acuosa como resultado de enlaces disulfuro intramoleculares, comprendiendo el método las etapas de

(a): retrotranscribir una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de acuerdo con uno cualquiera de los artículos 15 a 23 o una secuencia de aminoácidos de un polipéptido obtenible mediante el método de acuerdo al artículo 26 o el artículo 27, obteniendo de ese modo una secuencia de ácido nucleico; seguido de

(b): sintetizar una molécula de ácido nucleico con la secuencia del ácido nucleico obtenida después de realizar la etapa (a);

produciendo de este modo la molécula de ácido nucleico que codifica la variante de T7.

29.: Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de un miembro del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 y 71.

30.: Un vector de expresión que comprende una o más secuencias de nucleótidos capaces de controlar la transcripción y/o traducción y están ligadas funcionalmente a (a) una molécula de ácido nucleico obtenible mediante el método del artículo 28, o (b) una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el artículo 29.

31.: Un organismo hospedador capaz de expresar recombinantemente un polipéptido, en el que el organismo hospedador se transforma con un vector de expresión de acuerdo con el artículo 30.

32.: El organismo hospedador de acuerdo con el artículo 31, en el que el organismo hospedador es Escherichia coli.

33.: Un método para sintetizar una molécula de ARN, que comprende las etapas de

(a): proporcionar una variante del polipéptido de la T7 ARN polimerasa (variante de T7) de acuerdo con uno cualquiera de los artículos 15 a 23;

(b): proporcionar una molécula de ADN molde que comprende un promotor de T7, estando el promotor de T7 ligado funcionalmente a una secuencia de nucleótidos diana para su transcripción;

(c): poner en contacto en una solución acuosa el molde de ADN de la etapa (b) con la variante de T7 de la etapa (a) en presencia de ribonucleósidos trifosfato, formando de este modo una mezcla de reacción;

(d): incubar la mezcla de reacción en condiciones que permitan la actividad de ARN polimerasa;

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sintetizando de ese modo la molécula de ARN.

34. El método de acuerdo con el artículo 33, en el que en una cualquiera de las etapas (a), (b), (c) y (d) está 5 ausente un agente reductor con un grupo tiol.

35. El método de acuerdo con el artículo 33, en el que en una cualquiera de las etapas (a), (b), (c) y (d) está ausente un agente reductor seleccionado de mercaptoetanol, ditiotreitol, ditioeritritol.

10 36. Una mezcla de reacción que comprende, en una solución acuosa, una molécula de ADN molde que comprende un promotor de T7 funcionalmente ligado a una secuencia de nucleótidos diana para su transcripción, ribonucleósidos trifosfato, y una variante del polipéptido de la ARN polimerasa T7 (variante de T7) de acuerdo con uno cualquiera de los artículos 15 a 23, y en la mezcla de reacción está ausente un agente reductor con un grupo tiol.

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37. Una mezcla de reacción que comprende en una solución acuosa una molécula de ADN molde que comprende un promotor de T7 ligado funcionalmente a una secuencia de nucleótidos diana para su transcripción, ribonucleósidos trifosfato y una variante del polipéptido de la T7 ARN polimerasa (variante de T7) de acuerdo con uno cualquiera de los artículos 15 a 23, y en la que la mezcla de reacción está ausente un agente reductor

20 seleccionado de mercaptoetanol, ditiotreitol, ditioeritritol.

38. Un kit que comprende, en envases separados, una variante de un polipéptido de la T7 ARN polimerasa (variante de T7) de acuerdo con uno cualquiera de los artículos 15 a 23 y un tampón con uno o más ribonucleósidos trifosfato, en el que la variante de T7 está en una solución acuosa, y en el que en la mezcla de la

25 solución acuosa está ausente un agente reductor con un grupo tiol.

39. Un kit que comprende, en envases separados, una variante de un polipéptido de la T7 ARN polimerasa (variante de T7) de acuerdo con uno cualquiera de los artículos 15 a 23 en un tampón con uno más ribonucleósidos fosfato, en el que la variante de T7 está en una solución acuosa, y en el que en la mezcla de la

30 solución acuosa está ausente un agente reductor seleccionado de mercaptoetanol, ditiotreitol y ditioeritritol.

Los siguientes ejemplos, figuras y el listado de secuencias se proporcionan para ayudar a entender la presente invención, el verdadero alcance de la cual se expone en las reivindicaciones anexas. Se entiende que pueden hacerse modificaciones de los procedimientos expuestos sin apartarse del espíritu de la invención.

35 Descripción del listado de secuencias

SEC ID Nº: 1 Secuencia de ADN que codifica la ARN polimerasa T7 de tipo silvestre dependiente de ADN, incluyendo el codón de iniciación que codifica la metionina N-terminal; correspondiente a Nº 1 en la 40 Tabla 3 SEC ID Nº: 2 T7 ARN polimerasa dependiente de ADN de tipo silvestre, secuencia de aminoácidos incluyendo la metionina N-terminal; correspondiente a Nº 1 en la Tabla 3 SEC ID Nº: 3 Secuencia de ADN que codifica la variante Cys125Ser de la T7 ARN polimerasa dependiente de ADN, incluyendo el codón de iniciación que codifica la metionina N-terminal; correspondiente a 45 Nº 2 en la Tabla 3 SEC ID Nº: 4 Variante Cys125Ser de la T7 ARN polimerasa dependiente de ADN, secuencia de aminoácidos incluyendo la metionina N-terminal; correspondiente a Nº 2 en la Tabla 3 SEC ID Nº: 5 Secuencia de ADN que codifica la variante Cys347Ser de la ARN polimerasa T7 dependiente de ADN, incluyendo el codón de iniciación que codifica la metionina N-terminal; correspondiente a 50 Nº 3 en la Tabla 3 SEC ID Nº: 6 Variante Cys347Ser de la T7 ARN polimerasa dependiente de ADN, secuencia de aminoácidos incluyendo la metionina N-terminal; correspondiente a Nº 3 en la Tabla 3 SEC ID Nº: 7 Secuencia de ADN que codifica la variante Cys492Ser de la T7 ARN polimerasa dependiente de ADN, incluyendo el codón de iniciación que codifica la metionina N-terminal; correspondiente a 55 Nº 4 en la Tabla 3 SEC ID Nº: 8 Variante Cys492Ser de la T7 ARN polimerasa dependiente de ADN, secuencia de aminoácidos incluyendo la metionina N-terminal; correspondiente a Nº 4 en la Tabla 3 SEC ID Nº: 9 Secuencia de ADN que codifica la variante Cys515Ser de la T7 ARN polimerasa dependiente de ADN, incluyendo el codón de iniciación que codifica la metionina N-terminal; correspondiente a 60 Nº 5 en la Tabla 3 SEC ID Nº: 10 Variante Cys515Ser de la T7 ARN polimerasa dependiente de ADN, secuencia de aminoácidos incluyendo la metionina N-terminal; correspondiente a Nº 5 en la Tabla 3 SEC ID Nº: 11 Secuencia de ADN que codifica la variante Cys723Ser de la T7 ARN polimerasa dependiente de ADN, incluyendo el codón de iniciación que codifica la metionina N-terminal; correspondiente a 65 Nº 6 en la Tabla 3

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Línea 8: T7 variante de T7 Nº 4 [Cys492Ser] incluyendo marcador His6 Línea 9: T7 variante de T7 Nº 5 [Cys515Ser] incluyendo marcador His6 Para homodímeros de diversos grados y homomultímeros de órdenes más altos pueden verse las líneas 1, 2, 5, 6, 7, 8 y 9. La líneas 3 y 4 están libres de un modo detectable de homodímeros y/o

5 multímeros.

Figura 3 Gel de SDS poliacrilamida teñido, para los detalles véase el Ejemplo 5, Ejemplo 6 y Ejemplo 7. Las líneas designadas con M contienen el marcador de tamaño Mark 12 (Invitrogen). Se añadió DTT 10 mM antes de la electroforesis, para proporcionar condiciones reductoras.

10 Línea 1: T7 ARN polimerasa de tipo silvestre sin marcador His Línea 2: T7 ARN polimerasa de tipo silvestre incluyendo marcador His6 Línea 3: T7 variante de T7 Nº 8 [Cys125Ser, Cys347Ser, Cys492Ser, Cys515Ser, Cys723Ser, Cys839Ser] incluyendo marcador His6 Línea 4: T7 variante de T7 Nº 6 [Cys723Ser] incluyendo marcador His6

15 Línea 5: T7 variante de T7 Nº 3 [Cys347Ser] incluyendo marcador His6 Línea 6: T7 variante de T7 Nº 7 [Cys839Ser] incluyendo marcador His6 Línea 7: T7 variante de T7 Nº 2 [Cys125Ser] incluyendo marcador His6 Línea 8: T7 variante de T7 Nº 4 [Cys492Ser] incluyendo marcador His6 Línea 9: T7 variante de T7 Nº 5 [Cys515Ser] incluyendo marcador His6

20 Ejemplo 1

Diseño de mutaciones de intercambio de aminoácidos en el polipéptido de T7

25 Se inspeccionaron las estructuras de rayos X de la T7 ARN polimerasa depositadas en el Banco de Datos de Proteínas (http://www.wwpdb.org/pdb; códigos: 1cez [referentes a Cheetham, G. M. T., et al., Nature 399 (1999) 8083], y de 1s77 [referente a Yin, Y. W., y Steitz, T. A., Cell 116 (2004) 393-404]) para identificar sitios candidatos para la introducción de mutaciones. Para tal fin, se localizaron los restos de cisteína en modelos tridimensionales y se identificaron los restos de Cys de la superficie del polipéptido de T7 que podían ser accesibles en principio para la

30 formación de enlaces disulfuro intramoleculares. Además, se identificaron aminoácidos candidatos teniendo en mente el objetivo de aumentar la estabilidad de la proteína.

Las posiciones de la secuencia de aminoácidos de la T7 de tipo silvestre seleccionadas (de acuerdo con SEC ID Nº: 2) se muestran en la Tabla 1a que muestra las Cisteínas candidatas. La Tabla 1b proporciona las mutaciones de

35 sustitución de aminoácidos de las que se espera que aumenten la estabilidad de la proteína polimerasa T7. También se indica la razón principal subyacente del diseño de las mutaciones, con el fin de aumentar la estabilidad de una variante del polipéptido de T7 frente a la referencia de tipo silvestre. Por lo tanto, la mayor parte de las sustituciones de aminoácidos se seleccionaron bien para rellenar las cavidades hidrófobas del núcleo o para estabilizar los bucles localizados en la superficie de la enzima.

40 Tabla 1a: mutaciones de aminoácidos de la T7 ARN polimerasa: diseño de una enzima con tendencia reducida a formar multímeros unidos mediante puentes disulfuro intramoleculares

Resto de Cys en el polipéptido de T7 de TS, posiciones en la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 2): Localización predicha Mutación propuesta

125: superficie Ser

216: enterrado -

271: enterrado -

347: superficie Ser

467: enterrado -

492: superficie Ser

510: enterrado -

515: superficie Ser

530: enterrado -

540: enterrado -

723: superficie Ser

839: superficie Ser

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Tabla 1b: mutaciones de aminoácidos de la T7 ARN polimerasa: diseño de una enzima con termoestabilidad aumentada

Aminoácido, TS: Posición Mutación Razón fundamental

Val: 426 Leu, Ile, Phe, Trp Rellenar la cavidad del núcleo de la proteína

Ser: 633 Val, Leu, Met Estabilizar el bucle

Val: 650 Leu Estabilizar el bucle

Thr: 654 Leu Estabilizar el bucle

Ala: 702 Val Rellenar la cavidad del núcleo de la proteína

Val: 795 Ile Rellenar la cavidad del núcleo de la proteína

5 Con el fin de proporcionar una secuencia codificante para cualquiera de los mutantes de T7 que se presentan en el presente documento, se usó como base la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº: 1 que codifica el polipéptido de T7 de la referencia de tipo silvestre. Los codones de nucleótidos correspondientes a los restos de aminoácidos de las posiciones indicadas en las Tablas 1a y 1b se mutaron, con el fin de codificar el aminoácido cambiado en la posición respectiva. Las mutaciones se diseñaron preferentemente de acuerdo con el sesgo de uso de codones de los genes

10 de clase II de E. coli (Hénaut, A., y Danchin, A., Analysis and Predictions from Escherichia coli sequences. Escherichia coli and Salmonella, Vol. 2, Capítulo 114 (1996) 2047-2066, Neidhardt FC ed., ASM press, Washington,

D. C.), tal como se proporcionan en la Tabla 2.

Tabla 2: uso de codones en E. coli

Aminoácido: Codón Clase Aminoácido Codón Clase

I: u III I II III

Phe: T T T 55,09 29,08 67,14 Leu C T T 9,7 5,56 19

T T C: 44,91 70,92 32,86 C T C 10,4 8,03 9,04

Leu: T T A 10,99 3,44 20,09 C T A 3,09 0,83 6,81

T T G: 13,02 5,47 15,05 C T G 52,79 76,67 29,99

Ser: T C T 13,26 32,41 19,63 Pro C C T 13,71 11,23 28,3

T C C: 15,02 26,56 11,34 C C C 11,19 1,63 16,26

T C A: 10,83 4,79 22,09 C C A 18,63 15,25 31,5

T C G: 16,88 7,39 10,6 C C G 56,47 71,89 23,94

Tyr: T A T 54,42 35,23 69,6 His C A T 56,8 29,77 61,69

T A C: 45,58 64,77 30,4 C A C 43,2 70,23 38,31

Terminación: T A A Gln C A A 33,4 18,65 37,06

T A G: C A G 66,6 81,35 62,94

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Aminoácido: Codón Clase Aminoácido Codón Clase

I: u III I II III

Cys: T G T 40,9 38,85 55,71 Arg C G T 38,99 64,25 26,05

T G C: 59,1 61,15 44,29 C G C 42,23 32,97 21,94

Terminación: T G A C G A 5,52 1,07 12,8

Trp: T G G 100 100 100 C G G 8,97 0,8 13,62

Ile: A T T 51,2 33,49 47,57 Val G T T 23,74 39,77 34,33

A T C: 44,37 65,94 26,65 G T C 22,48 13,45 18,95

A T A: 4,43 0,57 25,78 G T A 14,86 19,97 21,78

Met: A T G 100 100 100 G T G 38,92 26,81 24,94

Thr: A C T 14,85 29,08 26,83 Ala G C T 14,52 27,54 22,86

A C C: 46,83 53,6 24,45 G C C 27,62 16,14 23,67

A C A: 10,52 4,67 27,93 G C A 19,63 24,01 31,27

A C G: 27,81 12,65 20,8 G C G 38,23 32,3 22,19

Asn: A A T 40,87 17,25 64,06 Asp G A T 62,83 46,05 70,47

A A C: 59,13 82,75 35,94 G A C 37,17 53,95 29,53

Lys: A A A 75,44 78,55 72,21 Glu G A A 68,33 75,35 66,25

A A G: 24,56 21,45 27,79 G A G 31,67 24,65 33,75

Ser: A G T 13,96 4,52 18,73 Gly G G T 32,91 50,84 31,79

A G C: 30,04 24,33 17,61 G G C 43,17 42,83 24,51

Arg: A G A 1,75 0,62 15,63 G G A 9,19 1,97 24,75

A G G: 1,54 0,29 9,96 G G G 14,74 4,36 18,95

Los genes que sirvieron como la base para los datos de la Tabla 2 se agruparon usando un análisis de correspondencia factorial en tres clases. La clase I contiene genes implicados en la mayor parte de los procesos

5 metabólicos. Los genes de clase II corresponden a genes altamente y continuamente expresados durante el crecimiento exponencial. Los genes de clase III están implicados en la transferencia horizontal de ADN. Se puede observar que la distribución de los codones en los genes de clase III es mayor o incluso menor, mientras que está extremadamente sesgada en los genes de clase II (en particular, se seleccionan en contra de los codones terminados en A).

10 Las mutaciones al nivel del codón que se introdujeron en la secuencia codificante de T7 se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3: polimerasa T7 y variantes de la misma

Nº: Enzima/variante de T7 Codón de TS Codón mutado SEC ID Nº:

1: Tipo silvestre - 1, 2

2: Cys125Ser TGC AGC 3, 4

3: Cys347Ser TGT AGC 5, 6

4: Cys492Ser TGC AGC 7, 8

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Nº: Enzima/variante de T7 Codón de TS Codón mutado SEC ID Nº:

5: Cys515Ser TGC AGC 9, 10

6: Cys723 Ser TGC AGC 11, 12

7: Cys839Ser TGT AGC 13, 14

8: Cys125Ser Cys347Ser Cys492Ser Cys515Ser Cys723Ser Cys839Ser TGC TGT TGC TGC TGC TGT AGC AGC AGC AGC AGC AGC 15, 16

9: Val426Leu GTT CTG 17, 18

10: Cys723Ser Val426Leu TGC GTT AGC CTG 19, 20

11: Val426Ile GTT ATC 21, 22

12: Cys723Ser Val426Ile TGC GTT AGC ATC 23, 24

13: Val426Phe GTT TTC 25, 26

14: Cys723Ser Val426Phe TGC GTT AGC TTC 27, 28

15: Ser633Met TCA ATG 29, 30

16: Cys723Ser Ser633Met TGC TCA AGC ATG 31, 32

17: Val650Leu GTG CTG 33, 34

18: Cys723Ser Val650Leu TGC GTG AGC CTG 35, 36

19: Thr654Leu ACC CTG 37, 38

20: Cys723Ser Thr654Leu TGC ACC AGC CTG 39, 40

21: Ala702Val GCT GTT 41,42

22: Cys723Ser Ala702Val TGC GCT AGC GTT 43,44

23: Val795Ile GTA ATC 45,46

24: Cys723Ser Val795Ile TGC GTA AGC ATC 47,48

25: Ala702Val Val795Ile GCT GTA GTT ATC 49,50

26: Cys723Ser Ala702Val Val795Ile TGC GCT GTA AGC GTT ATC 51,52

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Nº: Enzima/variante de T7 Codón de TS Codón mutado SEC ID Nº:

27: Val426Leu GTT CTG 53,54

Ala702Val: GCT GTT

28: Cys723Ser TGC AGC 55, 56

Val426Leu: GTT CTG

Ala702Val: GCT GTT

29: Val426Leu GTT CTG 57, 58

Val795Ile: GTA ATC

30: Cys723Ser TGC AGC 59,60

Val426Leu: GTT CTG

Val795Ile: GTA ATC

31: Val426Leu GTT CTG 61,62

Ala702Val: GCT GTT

Val795Ile: GTA ATC

32: Cys723Ser Val426Leu TGC GTT AGC CTG 63,64

Ala702Val: GCT GTT

Val795Ile: GTA ATC

33: Cys125Ser Cys347Ser TGC TGT AGC AGC 65,66

Cys492Ser Cys515Ser Cys723Ser Cys839Ser Val426Leu: TGC TGC TGC TGT GTT AGC AGC AGC AGC CTG

Ala702Val: GCT GTT

Val795Ile: GTA ATC

34: Val426Leu Val650Leu GTT GTG CTG CTG 67,68

Ala702Val: GCT GTT

Val795Ile: GTA ATC

35: Cys723Ser Val426Leu TGC GTT AGC CTG 69, 70

Val650Leu: GTG CTG

Ala702Val: GCT GTT

Val795Ile: GTA ATC

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Claims

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