JPH03297388A - 新規なｔｎｆ変異体、その製造法及びそれを有効成分とする抗腫瘍剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規なＴＮＦ変異体、その製造法及びそれを
有効成分とする抗腫瘍剤に関するものである。

〔従来の技術〕

ＴＮＦ　（腫瘍壊死因子）は、１９７５年にＣａｒｓｗ
ｅｌ　ｌらによって見出された生理活性物質であり　（
Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌｌら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、。

ＵＳＡ　、　７２．３６６６　　（１９７５））　、ｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏの細胞培養系で、成る種の癌細胞に強い
細胞障害活性を示し、且つｉｎ　ｖｉｖｏで成る種の移
植腫瘍に壊死を生ぜしめる物質として特徴づけられてい
る （Ｌ、　Ｊ、　Ｏｌｄ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　
４Ｌ　３６１　（１９８１））。

このＴＮＦは、マウス、ウサギ、ヒトなどの多くの動物
中にみられ、種特異性なしに活性を発揮し、且つ、正常
細胞には殆ど有害な作用を示さないことから、制癌剤と
しての利用が期待されてきた。

その後、１９８４年〜１９８５年にヒトＴＮＦ遺伝子が
単離され、遺伝子工学的手法を用いた微生物中でのヒ）
ＴＮＦの生産についての報告が相次いでなされ（Ｄ、　
Ｐｅｎ１ｃａら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１２．７２４（
１９８４）；　Ｔ、　５ｈｉｒａｉら、　Ｎａｔｕｒｅ
、　３１３．８０３　（１９８５）；　　Ａ、　Ｍ、　
Ｗａｎｇら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２８．１４９　（
１９８５）；Ｍ、　Ｙａｍａｄａ　ら、　Ｊ、　Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　３．１４Ｈ１９８５）〕、純
粋なヒ）ＴＮＦが多量に入手可能となってくるに及んで
、その生物活性の多様性が明らかになってきている。そ
れらの中には、ＴＮＦを制癌剤として利用する際に好ま
しくないと考えられる作用もある。例えば、癌末期や重
症感染症患者に見られる悪液質（カケクシア）の原因物
質として、脂肪細胞のリポプロティンリパーゼ産生阻害
活性を指標に同定されたカケクチンが、ＴＮＦと同一物
質であることから、ＴＮＦ投与による脂肪細胞の異化先
進の結果として、高脂血症のような副作用の可能性が示
唆されている。また、ＴＮＦは、エンドトキシンによっ
て引き起こされる毒性の主要なメデイエータ−のひとつ
と考えられ（Ｂ、　Ｂｅｕｔｌｅｒら、　　５ｃｉｅｎ
ｃｅ、　２２９．８６９　（１９８５）；Ｖ、　Ｌｅｈ
ｍａｎｎら、　Ｊ、ＥｘｐｏＭｅｄ、、　１６５　６５
７　（１９８７）〕、実実験物への投与で様々な副作用
が報告されている（Ｉｓｉｓ　Ｃ，Ｋｅｔｔｅｌｈｕｔ
　ら＋　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ｔｌｓＡ、　８４．４２７３
　（１９８７）　：ｌ。

一方、遺伝子組換え技術の進歩によって、ヒトＴＮＦの
アミノ酸配列を任意に変換した蛋白質（以下、ＴＮＦ変
異体と略すこともある）についての研究も盛んに行われ
てきており、特開昭６３−１１９６９２号公報、特開平
１−２７７４８８号公報にはＴＮＦ変異体のｉｎυｉｖ
ｏにおける抗腫瘍活性と副作用との関係についての知見
が示されている。しかし、これらのＴＮＦ変異体を医薬
として用いるには、副作用の点における問題点かあった
。

（発明が解決するための問題点〕 本発明の目的は、新規なＴＮＦ変異体をコードするＤＮ
Ａ、該ＤＮＡを含有するプラスミド、該プラスミドで形
質転換された宿主細胞、該宿主細胞を用いた新規なＴＮ
Ｆ変異体の製造法及びそれを有効成分とする副作用が軽
減された抗ＩＩＩ瘍剤を提供することである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、前記の問題点を解決するために、Ｘ線構
造解析から得られたヒトＴＮＦの立体構造モデル（Ｅ、
　Ｙ、Ｊｏｎｅｓら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３３８　２２
５（１９８９）　）を参考にして、ヒ）ＴＮＦの分子表
面に位置すると考えられるアミノ酸残基を遺伝子工学的
手法を利用することによって変換して得られたＴＮＦ変
異体の生物活性を検討した結果、ヒトＴＮＦの特定のア
ミノ酸残基を変換したＴＮＦ変異体が、ｉｎ　ｖｉｖｏ
において、ヒトＴＮＦよりも副作用が軽減されているに
もかかわらず優れた抗腫瘍活性を保持していることを見
出し、本発明を完成した。

即ち、本発明は、 （１）次式： ％式％ （式中、ＸはＶａｌ又はＡｒｇで示されるアミノ（式中
、ＸはＶａｌ又はＧｌｙで示されるアミノ酸残基を表し
；ＺはＡｒｇ、Ｇｌｕ又はＧｌｙで示されるアミノ酸残
基を表す。但し、ＸがＶａｌで、ＹがＡｓｎで、ＺがＡ
ｒｇである組合せの場合を除＜、） で示されるＬ体のアミノ酸残基の配列を有するＴＮＦ変
異体 （２）前記記載の式（Ｉ）で示されるＴＮＦ変異体をコ
ードする塩基配列を有するＤＮＡ （３）前記記載の式（Ｉ）で示されるＴＮＦ変異体をコ
ードする塩基配列の５”末端に翻訳開始コドンが結合し
、３“末端に翻訳終止コドンが結合した塩基配列を有す
るＤＮＡ （４）前記のＤＮＡを形質発現ベクターに組込んだ組換
え体ベクター （５）前記の組換え体ベクターによって形質転換された
宿主細胞 （６）前記の宿主細胞をその増殖培地で培養することを
特徴とする前記記載の式（Ｉ）で示されるＴＮＦ変異体
の製造法 （７）前記記載の式（Ｉ）で示されるＴＮＦ変異体を有
効成分とする抗腫瘍剤 に関するものである。

以下、本発明の内容を更に詳しく説明するが、記載にお
いては、その簡略化のため、当該分野における慣用略号
に基づいた略号を使用する。それらの例を以下に列記す
る。なお、光学異性体があるもの（例えば、アミノ酸な
ど）については、特に明示のない場合にはＬ体である。

〔略　号〕

Ａｌａ：アラニン、Ａｒｇ：アルギニン、Ａｓｎ：アス
パラギン、Ａｓｐ：アスパラギン酸、Ｃｙｓニジスティ
ン、Ｇｌｎ：グルタミン、Ｇｌｕ：グルタミン酸、Ｇｌ
ｙニゲリシン、Ｈｉｓ　：ヒスチジン、Ｉｌｅ：イソロ
イシン、Ｌｅｕ：ロイシン、Ｌｙｓ：リジン、 Ｍｅｔ：メチオニン、Ｐｈｅ：フェニルアラニン、Ｐｒ
ｏニブロリン、Ｓｅｒ：セリン、 Ｔｈｒ：スレオニン、Ｔｒｐ：）リブトファン、Ｔｙｒ
：チロシン、Ｖａｌ：バリン、 Ａ：アデニン、Ｇニゲアニン、Ｃ：シトシン、Ｔ：チミ
ン、ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸、ｄＧＴＰ
：デオキシグアノシン三リン酸、ａｃ’ｒｐ：デオキシ
シチジン三リン酸、ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン
酸、ｄＮＴＰｓ　：　ｄＡＴＰ、ｄＣ；ＴＰ、ｄＣＴＰ
及びｄＴＴＰ、ＡＴＰ　：アデノシン三リン酸、ＳＤＳ
ニドデシル硫酸ナトリウム、ＳＤ配列：シャインーダル
ガーノ配列、ＫＤ：キロダルトン、ｂｐ＝塩基対 新規なＴＮＦ変異体（１）の製造は、それをコードする
塩基配列を有するＤＮＡが組込まれた形質発現ベクター
を導入された形質転換体を、適当な培地中で培養するこ
とによって行うことができる。

（Ａ）〔新規なＴＮＦ変異体（Ｉ）〕 本発明の新規なＴＮＦ変異体（１）において、Ｘとして
は、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙなどで示されるア
ミノ酸残基を挙げることができるが；好ましくはＶａｌ
、Ａｒｇなどで示されるアミノ酸残基がよい。

Ｙとしては、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒなどで示
されるアミノ酸残基を挙げることができるが；好ましく
はＡｓｎ、Ｇｌｙなどで示されるアミノ酸残基がよい。

Ｚとしては、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ。

Ａｓｎなとで示されるアミノ酸残基を挙げることができ
るが；好ましくはＡｒｇ、Ｇｌｕ。

Ｇｌｎなどで示されるアミノ酸残基がよい。

（但し、前記のχ、Ｙ及びＺの組合せにおいて、ＸがＶ
ａｌで、ＹがＡｓｎで、ＺがＡｒｇである組合せをの場
合を除く。） ＴＮＦ変異体（Ｉ）は、前記のようなＸ、　Ｙ及びＺを
示すアミノ酸残基を適当に組み合わせたもの（但し、Ｘ
：Ｖａｌ、Ｙ：Ａｓｎ、Ｚ：Ａｒｇではない。）として
表すことができるが；好ましいＸ、Ｙ及びＺの組合せと
しては、（Ｘ：Ａｒｇ。

Ｙ：Ａｓｎ、Ｚ：Ａｒｇ）、（Ｘ：Ｖａｌ。

Ｙ：ＧＩｙ、　　Ｚ：Ｇｌｕ）、　（Ｘ：Ｖａｌ。

Ｙ：Ｇｌｙ、　　Ｚ：Ｇｌｎ）、　（Ｘ：Ｖａｌ。

Ｙ：Ａｓｎ、　　Ｚ：Ｇｌｕ）、　（Ｘ：Ｖａｌ。

Ｙ：Ａｓｎ、　　Ｚ＋Ｇ１ｎ）　　、　（Ｘ：Ａｒｇ。

Ｙ：Ａｓｎ、Ｚ：Ｇｌｕ）などがよい。

ＴＮＦ変異体（Ｉ）としては、Ｎ末端から順次アミノ酸
を１個づつ除去し、最高で９番目のＳｅｒ残基までを除
去したものでも高い抗腫瘍活性を有するので（高い抗腫
瘍活性は、Ｎ末端から１０番目以降のアミノ酸残基から
なる部分に存在するので、Ｎ末端から１〜９個の部分は
高い抗腫瘍活性の発現にとっては重要な部分ではない。

）、このようなＮ末端から１〜９個のアミノ酸残基を欠
損したＴＮＦ変異体、Ｎ末端から１〜９個のアミノ酸残
基が他のアミノ酸残基と置換したものも本発明の中に含
まれ、また、Ｎ末端に１〜９個の他のアミノ酸残基（例
えば、Ｍｅｔ残基なと）が結合したものも含まれる。

（Ｂ）（ＴＮＦ変異体（Ｉ）の塩基配列を有するＤＮＡ
が組込まれた形質発現ベクターを導入された形質転換体
〕 ＴＮＦ変異体（Ｉ）の塩基配列を有するＤＮＡが組込ま
れた形質発現ベクターを導入された形質転換体は、ヒト
ＴＮＦ遺伝子を宿主細胞に適した形質発現ベクターに適
性な塩基配列を有するように組込むことによって得られ
るヒトＴＮＦ形賞発現ベクター上のヒトＴＮＦ遺伝子を
、ＴＮＦ変異体（Ｉ）をコードする塩基配列のＤＮＡに
変換し、そのようにして得られた該ベクターをその宿主
細胞に導入することによって作製することができる。

■（ＴＮＦ変異体（Ｉ）をコードする塩基配列のＤＮＡ
が組込まれた形質発現ベクター〕ＴＮＦ変異体（１）を
コードする塩基配列のＤＮＡとしては、前記の（Ａ）で
示されたＴＮＦ変異体（１）をコードする塩基配列のＤ
ＮＡ、例えば、 次式： ％式％ （３） （） Ｃ式中、αはＧＴＣ又はＣＧＧを表し；βはＡＡＴ又は
ＣＣＣを表し；ＴはＣＧＧ、ＧＡＧ又はＣＡＧを表す。

但し、αがＣＴＣで、βがＡＡＴで、ＴがＣＧＧである
岨合せの場合を除く。

） などを挙げることができる。

ＴＮＦ変異体（Ｉ）をコードする塩基配列のＤＮＡ　（
ｎ）としては、前記のようなα、β及びＴを示す塩基配
列を適当に組み合わせたもの（但し、α：ＧＴＣ，β：
　ＡＡＴ、　　γ：　ＣＣＣではない。）として表すこ
とができるが：好ましいα。

β及びγの組合せとしては、（α：ＣＧＧ。

β：ＡＡＴ、　　γ：　ＣＧＧ）、（α：　ＧＴＣ。

β：　ＧＧＣ，ｒ　：　ＧＡＧ）、（α：　ＣＴＣ。

β：　ＧＣ，Ｃ，ｒ　：　ＣＡＧ）、（α：　ＧＴＣ。

β：　ＡＡＴ、　　γ：　ＧＡＧ）、（α：　ＣＴＣ。

β：　ＡＡＴ、ｒ　：　ＣＡＧ）、（α：ＣＧＧ。

β：　ＡＡＴ、　　γ：　ＧＡＧ）などがよい。

ＴＮＦ変異体（１）の塩基配列を有するＤＮＡが組込ま
れた形質発現ベクターは、ＴＮＦ変異体（１）をコード
する塩基配列のＤＮＡ　（前記の式（ｎ）で示されるも
の〕の５″末端側に隣接して翻訳開始コドン（ＡＴＣ）
を有し、３“末端側に隣接して翻訳終止コドン（例えば
、ＴＧＡなど）を有するものであり、翻訳開始コドンの
５゛末端側に適性な塩基配列を有するように、プロモー
ター及びＳＤ配列を有している。

前記の塩基配列（ＩＩ）の作製は、当該技術分野でよく
知られた手法を用いて、公知のヒ）ＴＮＦ遺伝子の任意
の位置の塩基配列を所望の塩基配列に変換する方法によ
って行うことができる。

即ち、 （ｉ）変換したい塩基配列を含むＤＮＡ断片を制限酵素
切断によって除去し、そのＤＮＡ断片の代わりに、所望
の塩基配列を含む化学合成オリゴヌクレオチドアダプタ
ーを組込む方法、 （ｉｉ　）化学合成オリゴヌクレオチドを用いる部位特
異的変異導入法（Ｊ、　Ｗ、　Ｔａｙｌｏｒら＋　Ｎｕ
ｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１３．８７４９　（１９８５
）：　　Ｊ、　Ｉｔｌ、　Ｔａｙｌｏｒら。

Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１３．８７６４
　（１９８５）；に、　Ｎａｋａ＋５ａｙｅ　ａｎｄ　
Ｆ、　Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、　Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄ３Ｒｅ
ｓ、、１４．９６７９　（１９８６）；　Ｊ、　Ｒ，５
ａｙｅｒら、　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１６．７９１　（１９８Ｂ）
）などが挙げられる。

例えば、（ｉｉ）の方法では、ヒ）ＴＮＦ形賞発現ベク
ターから一本鎖ＤＮＡを調製できる場合であれば、その
ベクターをそのまま部位特異的変異導入のための鋳型と
して用い、ヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を本発明の新規
な塩基配列（ｎ）に変換できるような合成オリゴヌクレ
オチドを使用して部位特異的変異導入を行うことによっ
て、本発明の新規な塩基配列（ｎ）を有するＤＮＡが組
込まれた形質発現ベクターを作製することがでる。−方
、ヒ）ＴＮＦ形質発現ベクターからの一本鎖ＤＮＡの調
製ができない場合には、ヒトＴＮＦ形質発現ベクター上
のヒ）ＴＮＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、−末鎖ＤＮＡ
を調製できるベクターニサブクローニングした後に、そ
のベクターを鋳型として用いた部位特異的変異導入によ
って、ヒトＴＮＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片を本発明の新
規な塩基配列（ＩＩ）を含むＤＮＡ断片に変換し、その
ようにして得られた該ＤＮＡ断片とヒ）ＴＮＦ形賞発現
ベクター上のヒ）ＴＮＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片とを組
換えることによって、本発明の新規なＴＮＦ変異体（１
）の形質発現ベクターを作製することができる。

ところで、ヒトＴＮＦ形質余現ベクター構築のためのヒ
トＴＮＦ遺伝子は、ヒトＴＮＦのアミノ酸配列（Ｄ、　
Ｐｅｎ１ｃａら、前出〕の構成アミノ酸をコードするコ
ドンの中から、宿主細胞に適したコドンを選択し、それ
を化学合成することによって得ることができる。

その設計に際しては、ヒ）ＴＮＦ遺伝子を複数のＤＮＡ
断片として合成し、適当なベクターにクローン化するた
めに、その塩基配列中に適当な制限酵素切断部位を設け
る。また、ヒ）ＴＮＦのＮ末端アミノ酸をコードするコ
ドンの５”末端側に隣接して翻訳開始コドンを有し、Ｃ
末端アミノ酸をコードするコドンの３゛末端側に隣接し
て翻訳終止コドンを有し、翻訳開始コドンの５゛末端側
と翻訳終止コドンの３°末端側に適当な制限酵素部位を
有するようにする。このようにして、ヒトＴＮＦ遺伝子
を、翻訳可能な形で適当なベクターにクローン化するこ
とができるようになる。そのようなヒ）ＴＮＦ遺伝子の
塩基配列の例を第１図に示す。

化学合成したオリゴヌクレオチドから、第１図に示すよ
うなヒ）ＴＮＦ遺伝子を構築する方法としては、 （ｉｊ）相補鎖それぞれを何本かのオリゴヌクレオチド
に分けて化学合成してそれらを連結する方法や、 （ｔｖ）オリゴヌクレオチドの一部をアニーリングさせ
た後、ＤＮＡ相補鎖伸長反応によって相補鎖を合成し、
その両端を適当な制限酵素で切断して得られるＤＮＡ断
片を連結する方法が挙げられる。

（ｉｖ）の場合には、例えば、第２図に示すようなオリ
ゴヌクレオチドを使って、ヒトＴＮＦ遺伝子を構成する
４つのＤＮＡ断片を得ることができる。

各オリゴヌクレオチドは、自動ＤＮＡ合成装置を用いて
、フｔスフォアミダイト法によって高収率で合成するこ
とができ、合成オリゴヌクレオチドの精製は、ゲルろ過
、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、逆相
カラムクロマトグラフィー等によって行うことができる
。

得られたＤＮＡ断片は、ヒ）ＴＮＦのＮ末端側アミノ酸
配列をコードする塩基配列を含む２つの断片と、Ｃ末端
側アミノ酸配列をコードする塩基配列を含む２つの断片
に分けて、それぞれ、例えば、ｐＵｃ１１８　（Ｊ、　
Ｖｉｅｉｒａ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｆ、ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ＋１５
３＋　３　（１９８７）　）のようなベクターに一部ク
ローン化した後、ヒトＴＮＦ遺伝子構築のために用いる
ことができる。

そのような、ヒトＴＮＦのＮ末端側アミノ酸配列に相当
するＤＮＡ断片がクローン化されたプラスミドの具体例
としてはｐＵＨＴＮｌが、Ｃ末端側アミノ酸配列に相当
するＤＮＡ断片がクローン化されたプラスミドの具体例
としてはρＵＨＴＣ２が挙げられる。

上記のごとくクローン化されたヒトＴＮＦ遺伝子構築用
のＤＮＡ断片を、宿主細胞に適した形質発現ベクターに
、適正な配列を有するように組込むことによって、ヒト
ＴＮＦ形質発現ベクターを得ることができる。

そのような形質発現ベクターとしては、宿主細胞に適合
しろるレプリコンを含有し、かつ、該宿主細胞でのヒト
ＴＮＦＪｐＴＮＦ変異体（１）の発現に必要なプロモー
ターを含有するプラスミドベクター又はファージベクタ
ーを挙げることができるが、好ましくはプラスミドベク
ターがよい。

宿主細胞としては、例えば、原核生物（大腸菌。

枯草菌など）、真核生物（酵母など）、多細胞生物由来
の培養細胞などを挙げることができるが、好ましくは大
腸菌などの原核生物がよい。

プラスミドベクターにおけるプロモーターとしては、例
えば、大腸菌の場合には、ｌａｃプロモーター、　　ｔ
ａｃプロモーター、　　ｔｒｐプロモーターＰＬプロモ
ーター、コリシンＥ１プロモーターなどを挙げることが
できるが、好ましくはｔａｃプロモーターがよい、その
ようなｔａｃプロモーターを含有するヒトＴＮＦ形質発
現ベクターの具体例としては、例えば、ヒトＴＮＦのＣ
末端側アミノ酸配列に相当するＤＮＡ断片がクローン化
されたプラスミド（例えば、ｐＵＨＴＣ２など）に、ｐ
ＤＲ５４０（ファルマシア製）由来のｔａｃプロモータ
ー、ＳＤ配列を含むＤＮＡ断片及びヒ）ＴＮＦのＮ末端
側に相当するＤＮＡ断片を組込むことによって作製され
るプラスミドベクター（例えば、ｐＴＨ７３など）を挙
げることができるし、前記ヒトＴＮＦ形質発現ベクター
上のヒトＴＮＦ遺伝子を本発明の新規な塩基配列（ｎ）
に変換したＴＮＦ変異体（Ｉ）の形質発現ベクターの具
体例としては、例えば、ｐＴＲ９１、ｐＴＧＥ１３７８
．　ｐＴＧＱ１３７８．　ｐＴＥ１３８．　ｐＴＱ１３
８などを挙げることができる。

さらに、ＴＮＦ変異体（Ｉ）の形質発現効率の向上を目
的として、塩基配列（Ｕ）の下流に、大腸菌内で効率よ
く機能する転写ターミネータ−を連結することもできる
。

そのような転写ターミネータ−としては、ｔｐｐターミ
ネータ−、ｔｒｐＡターミネータ−＋　ｒｒｎＢターミ
ネータ−などを挙げることができるが、好ましくはｒｒ
ｎＢターミネータ−がよい。

このような、ｔａｃプロモーターとｒｒｎＢターミネー
タ−とを含有するＴＮＦ変異体（Ｉ）の形質発現ベクタ
ーの具体例としては、例えば、ｐＫＫ２２３−３（ファ
ルマシア製）由来のｒｒｎＢターミネータ−を含むＤＮ
Ａ断片を、塩基配列（ＩＩ）の下流に組込むことによっ
て作製されるプラスミドベクター（例えば、ｐＡＭＲ９
１，ｐＡＭＧＥ１３７Ｂ、　ｐＡＭＧＱ１３７Ｂ、　ｐ
ＡＭＥ１３Ｂ。

ｐＡＭ口１３８．ｐＡＭＲＥ９１３８など）を挙げるこ
とができる。

■〔該ベクターを導入された形質転換体〕形質転換は、
前記■に記載の新規なＴＮＦ変異体（１）の形質発現ベ
クターを、常法によって、適当な宿主細胞（例えば、前
記■に記載の宿主細胞など）に導入することによって行
うことができる。例えば、宿主細胞が大腸菌である場合
には、塩化カルシウム処理法（Ｓ、　Ｎ、Ｃｏｈｅｎら
、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、　６９．
２１１０　（１９７２）　）を用いることによって、形
質転換体を得ることができる。

（Ｃ）〔新規なＴＮＦ変異体（Ｉ）の製造〕得られた形
質転換体を適当な増殖培地〔例えば、Ｉ　ＸＹＴ培地（
０，８％バタトクリブトン、０．５％酵母エキス、０．
５％ＮａＣｊりなど〕及び培養条件（例えば、３７℃で
２４〜２８時間、振とうによる通気、攪拌を加えるなど
）で培養することによって、目的蛋白質である新規なＴ
ＮＦ変異体（Ｉ）又はそのＮ末端にＮｅｔが結合したも
のを生産することができる。

培養に際しては、必要に応じて、形質転換体選択のため
の薬剤（例えば、アンピシリンなど）を添加することが
望ましい、また、用いたプロモーターに応じて、適当な
誘導剤（例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト
ピラノシドなど）を培養の適当な時期（例えば、０Ｄｉ
ｉｏ’：Ｑ、３程度の指数増殖前期など）に添加するこ
とによって、プロモーターを効率良く機能させることも
できる。

このようにして形質転換体によって生産された目的蛋白
質の精製は、形質転換体内に生産された場合には形質転
換体抽出物から、形質転換体外に生産された場合には培
養組成物から、分離・精製における常法（塩析、限外ろ
過、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、電気泳
動、アフィニティークロマトグラフィーなど）を適宜組
み合わせることによって行うことができ、ＴＮＦ変異体
（Ｉ）を極めて純度の高いものとすることができる。

（Ｄ）〔抗腫瘍剤〕 前記のようにして得られたＴＮＦ変異体（Ｉ）は、２ｎ
υ１ｔｒｏでのマウスＬ−Ｍ細胞に対する細胞障害活性
（Ｓ、　Ｙａｗ＋ａｚａｋｉ　ら、　　Ｊｐｎ、　Ｊ、
　Ｍｅｄ、　Ｓｃｉ。

Ｂｉｏｌ、、　３９．１０５　（１９８６））や、ｉｎ
　ｖｉｖｏでのＭｅｔｈ　Ａ肉腫移植マウスの腫瘍壊死
効果及び腫瘍増殖抑制効果［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅ
ｌｌら、前出］を有する。一方、ｉｎ　ｖｉｖｏでの実
験動物（例えば、マウスなど）に対する致死作用がヒＩ
−ＴＮＦよりも大幅に軽減されており、非常に副作用が
低い抗腫瘍活性物質である。

本発明の抗腫瘍剤は、この高純度のＴＮＦ変異体（Ｉ）
の１種以上を有効成分とするものである。

ＴＮＦ変異体（Ｉ）は、単独のものを適当な溶媒（例え
ば、生理食塩水など）に溶解して使用することもできる
が、通常の方法に従って、注射剤。

散開１錠剤、カプセル剤などとすることができる。

本発明の抗腫瘍剤の有効投与量は、症状１年齢などによ
って異なるが、１日０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲内
から適宜選択され、それを１〜数回に分けて、経口又は
非経口的に投与することができる。

〔実施例〕

以下、本発明を参考例及び実施例によって示す。

なお、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するもの
ではない。

参考例１〔ヒ）ＴＮＦ形質発現プラスミドの作製〕■〔
化学合成ヒ）ＴＮＦ遺伝子のクローン化〕（ｉ）オリゴ
ヌクレオチドの化学合成 ヒトＴＮＦ遺伝子は、第２図に示す８本のオリゴヌクレ
オチド（ＯＬ−１〜０Ｌ−８）から、第１図に示した４
つのＤＮＡ断片（Ｆｒ−Ａ＋　Ｆｒ−Ｂ、　Ｆｒ−Ｃ＋
　Ｆｒ−Ｄ）を合成し、それを連結することにより構築
した。

オリゴヌクレオチドの合成は、全自動ＤＮＡ合成機（ア
プライド・バイオシステム製、モデル３８１Ａ）を用い
て、フォスフォアミグイト法により行い、ジメトキシト
リチル基以外の保護基を除去した後、逆相ＨＰＬＣ（条
件、　０ＤＳ−１２ＯＡ　（ＴＯＳＯＨ製）カラムを用
い、移動相として０．５％ギ酸アンモニウムバッファー
中、アセトニトリル濃度勾配溶出法で溶出〕で精製した
。ついで、８０％酢酸中で２５℃、３０分間反応させて
ジメトキシトリチル基を除去した後、再度、逆相ＨＰＬ
Ｃで精製して、合成オリゴヌクレオチド精製品を得た。

（ｉｉ）ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化前記の（ｉ）で
作製した合成オリゴヌクレオチド（ＯＬ−１〜０Ｌ−８
）から、ヒトＴＮＦ遺伝子を構成する４つのＤＮＡ断片
を合成するにあたっては、互いの３′末端側２０塩基な
いし３０塩基が相補的な０Ｌ−１と０Ｌ−２，０Ｌ−３
と０Ｌ−４，０Ｌ−５と０Ｌ−６，０Ｌ−７と０Ｌ−８
をそれぞれアニーリングさせ、ＤＮＡ鎖伸長反応で相補
鎖を合成した後、それらの両端を制限酵素で切断する方
法を用いた（第３図参照）。

なお、制限酵素切断の際の反応温度や反応液組成などの
反応条件は、制限酵素供給業者の指示に従った。また、
相補鎖合成の際には、−本鎖部分のループ形成や非特異
的アニーリングを避けるために、高温で伸長反応が行え
るＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを使用した。即ち、０Ｌ
−１（１００ｐｍｏｌ）と０Ｌ−２（１００ｐｍｏｌ）
を１００μｆの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ８，
３）、５０ｍＭ　　ＭＣ１，１，５ｍＭＭｇＣｆｚ　、
０．０１％（Ｗ／ｖ）ゼラチン。

２００ｕＭｄＮＴＰｓ水溶液に溶解し、２，５ユニツト
のＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（全酒造製）を添加して
、９４°Ｃで３分間加熱後、６０℃に３分間静置してア
ニーリングさせ、次いで７２°Ｃで１５分間インキュベ
ートした。反応終了後、反応液を５％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動に供して、エチジウムブロマイド染色法
により検出される、目的とする大きさ（約１８０ｂｐ）
のバンド部分をゲルから切り出し、電気泳動溶出法によ
りＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡをＢａｍＨＩ　　
（全酒造製）で切断し、エタノール沈澱により回収後、
Ｂａｎ　１（ＴＯＹＯＢＯ製）切断反応を行った。反応
終了後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、
上記と同様にして約１５０ｂｐのＢａｍＨＩ　−Ｂａｎ
　ｌ断片（Ｆｒ−Ａ）を回収した。同様にして、０Ｌ−
３と０Ｌ−４からＢａｎ１．　ＨｉｎｃＩＩ　　（全酒
造製）切断にて約１３０ｂｐのＢａｎ　Ｉ　−Ｈｌｎｃ
　ＩＩｌ断片Ｆｒ−Ｂ）を、０Ｌ−５と０Ｌ−６からＨ
ｉｎｃＩ［、ＢｓｔＰＩ　　（全酒造製）切断にて約１
１０ｂｐのＨｉｎｃ　ＩＩ　−ＢｓｔＰ　ｌ断片（Ｆｒ
−Ｃ）を、０Ｌ−７と０Ｌ−８からＢｓｔＰＩ、　　Ｐ
ｓｔｌ　　（全酒造製）切断にて約１００ｂｐのＢｓｔ
Ｐ　Ｉ　−Ｐｓｔ　ｌ断片（Ｆｒ−Ｄ）を調製した。

一方、ｐＵｃｌｌＢ　（全酒造製）をＨｉｎｃＩＩ切断
した後、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収し、そのＤ
ＮＡの１／２量をＢａｍＨＩ切断した後、１．２％アガ
ロースゲル電気泳動を行い、上記と同様にして約３．Ｉ
ＫｂｐのＨｉｎｃ　Ｉ［Ｂａｗｌ　ｌ断片を回収した。

また、残りの１／２量からは、ＰｓｔＩ切断後、同様の
方法で約３．ＩＫｂｐの旧ｎｃｌｌ−Ｐｓｔｌ断片を回
収した。

先に得たＦｒ−ＡとＦｒ−Ｂ、及びｐＵｃｌｌＢのＢａ
ｍＨｌ−Ｈ１ｎｃＩＩ断片を混合し、エタノール沈澱の
後、３０ｕｉの６６ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣ１ｐＦＩ７
．６）　、　６．６ｍＭ　　ＭｇＣ１ｚ　、１０ｍＭジ
チオスレイトール。

０．４ｍＭ　　ＡＴＰ水溶液中、３００ユニツトの７４
　ＤＮＡリガーゼ（全酒造製）を加えて、１６°Ｃで１
５時間連結反応を行った。このＤＮＡ水溶液を用いて、
それ自体は公知の方法で、大腸菌７０１株を形質転換し
、得られたアンピシリン耐性のコロニーから常法にてプ
ラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素切断地図の解析を行
って、ヒ）ＴＮＦのＮ端側に相当する遺伝子がクローン
化されたプラスミドｐＵＨＴＮ１　（約３．４　Ｋｂｐ
）の取得を確認した。

ｐＵＨＴＮｌにクローン化されたＦｒ−Ａ、　Ｆｒ−Ｂ
の塩基配列は、Ｖｉｅｉｒａらの方法（Ｊ、　Ｖｉｅｉ
ｒａ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５３
．　３　（１９８７））に準じて調製した一本鎖ＤＮＡ
を使って、ジデオキシ法（Ｓ、　Ｔａｂｏｒ　ａｎｄ　
　Ｃ，Ｃ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、、　　　ＵＳＡ
、　　８４．　４７６７　　（１９８７）　　）　　に
より分析し、第１図に示したＦｒ−Ａ、　Ｆｒ−Ｂの塩
基配列であることを確認した。

また、前記Ｆｒ−ＣとＦｒ−Ｄ及びｐＵｃｌｌＢの旧ｎ
ｃＩｒ　−ＰｓｔＩ断片を使って、ｐｕｔ（ＴＮＩ作製
の際と同様の方法により、ヒトＴＮＦのＣ末端側に相当
する遺伝子がクローン化されたプラスミドｐｌＪ）ＩＴ
Ｃ２（約３．４Ｋｂｐ）を作製した。第３図に、ｐＵＨ
ＴＮｌ及びｐＵＨＴＣ２の作製方法を示した。

■〔形質発現プラスミドの作製〕 前記の（ｉｉ）で得たｐＵＨＴＮｌをＢａｍＨＩ及びＨ
ｉｎｃＩＩで切断し、５％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行い、（ｉｉ）の方法に準じて、ヒ）ＴＮＦのＮ
端側に相当する遺伝子を含む約２８０ｂｐのＤＮＡ断片
を回収した。

また、前記の（ｉｉ）で得たｐＵＨＴｃ２をＥｃｏＲＩ
　　（宝酒造製）及びＨｉｎｃＩ［で切断し、１．２％
アガロースゲル電気泳動の後、前記と同様にしてｐＵｃ
１１８の大部分とヒ）ＴＮＦのＣ端側に相当する遺伝子
を含む約３．３ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収した。

一方、大腸菌のｔａｃプロモーター及びＳＤ配列を有す
るプラスミドｐＤＲ５４０（ファルマシア製）をＢａｍ
Ｈｉ及びＥｃｏＲＩで切断し、５％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動の後、上記と同様にして、ｔａｃプロモー
ター及びＳＤ配列を含む約３９０ｂｐのＤＮＡ断片を回
収した。

こうして得た、約２８０ｂｐＤＮＡ断片と約３９０ｂｐ
ＤＮＡ断片、及び約３．３　ＫｂｐＤＮＡ断片を混合し
、エタノール沈澱の後、前記の（ｉｉ）の方法に準じて
、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼによる連結反応。

反応液を用いた大腸菌７０１株の形質転換、及び形質転
換体からの選択を行い、ｔａｃプロモーター及びＳＤ配
列の下流にヒトＴＮＦ遺伝子が連結されたヒトＴＮＦ形
質発現プラスミドｐＴＨＴ３　（約４．０Ｋｂｐ）の取
得を確認した。

ｐＴＨＴ３のヒトＴＮＦ遺伝子、及びＳＤ配列とｔａｃ
プロモーター領域の塩基配列は、前記（ｉｉ）と同様の
方法で確認した。なお、ヒ）ＴＮＦのＮ端側に相当する
遺伝子領域、及びＳＤ配列とｔａｃプロモーターの塩基
配列分析の際には、 ５’　−ＧＣＴＣＴＴＧＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡ−３”の
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て使用した。このプライマーは、第１図に示したヒトＴ
ＮＦ遺伝子塩基配列中の、塩基番号２８１〜２９７番に
アニーリングするものである。

次に、上記プラスミドｐＴＨＴ３をＰｓｔｌ及び５ｃａ
Ｉ（宝酒造製）で切断し、１．２％アガロースゲル電気
泳動を行い、前記（ｉｉ　）の方法に準じて、約２．６
ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収した。更に、ｒｒｎＢ転写タ
ーミネータ−を含むプラスミドｐＫＫ２２３−３（ファ
ルマシア製）をＰｓｔＩ及びＳｃａ　Ｉで切断し、５％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動の後、上記と同様にし
てｒｒｎＢ転写ターミネータ−を含む約８３０ｂｐのＤ
ＮＡ断片を回収した。

こうして得た、約２．６　ＫｂｐＤＮＡ断片と約８３０
ｂｐＤＮＡ断片を用いて、ｐＴＨＴ３作製の際と同様の
方法により、ｐＴＨＴ３のヒトＴＮＦ遺伝子の下流にｒ
ｒｎＢ転写ターミネータ−が連結されたヒ）ＴＮＦ形質
発現プラスミドｐＡＭＨＴ４　（約３．４Ｋｂｐ）を作
製した。第４図に、ｐＴＨＴ３及びｐＡＭＨＴ４の作製
方法を示した。

参考例２〔ヒトＴＮＦの製造〕 参考例１−■で得たｐＡＭ）ｌＴ４により形質転換され
た大腸菌７０１株を、ＩＸＹＴ培地（０，８％バクトド
リブトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣ１。

１００μｇ／ｄアンピシリン）中、３７°Ｃで培養し、
吸光度（６６０ｎｍ）が０．３になったところでイソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを最終濃度０
．７ｍＭになるように加え、更に２４時間培養を続げた
。

遠心分離により集菌し、２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
　（ｐＨ７，５）で洗菌後、同バッファーに懸濁し、冷
却下、高圧ホモジナイザー（アメリカン・インストウル
メント・カンパニー類）を用いて菌体を破砕、遠心分離
により菌体残査を除去して、菌体／ 粗抽出液を得た。

この粗抽出液に、ポリエチレンイミンを０．２％となる
ように加え、生じた沈澱を遠心分離により除去し、得ら
れた上清液を硫安沈澱して３０〜５５飽和硫安画分を回
収した。

これを１０ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣＪ！（ｐ）！８．０
）に対して透析した後、同バッファーで平衡化したＴＳ
Ｋｇｅｌ　ＤＥＡＥ−５ＰＷ　（ＴＯＳＯＨ製）カラム
に添加し、同バッファーにより充分洗浄後、吸着蛋白質
をＯ〜０．５Ｍ　　ＮａＣｊ！直線濃度勾配により溶出
・分画した。

５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析で約１７
ＫＤの蛋白質を含む画分を集め、１０ｍＭＴ　ｒ　ｉ　
ｓ　−ＨＣｉｔ　　（ｐＨ７，０）に対して透析した後
、ＴＳＫｇｅｌ　　５Ｐ−５Ｐ１１　（ＴＯＳＯＨ製）
カラムクロマトグラフィー（０〜０．５Ｍ　Ｎａ（Ｉｌ
直線濃度勾配で溶出）を行い、上記と同様にして百分を
集めた。

これを限外ろ過により濃縮後、ＰＢＳ　（−）で平衡化
したＴＳＫｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷ　（ＴＯ５ＯＨ製）
カラムにて、ＰＢＳ　（−）を用いてゲルろ過し、ヒト
ＴＮＦ精製標品を得た。これを５ＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動した結果、約１７ＫＤの位置に単一の
バンドが認められ、高純度の精製標品であることが確認
できた。

実施例１〔新規なＴＮＦ変異体の製造〕■〔新規なＴＮ
Ｆ変異体Ｒ９１の製造〕（ｉ）部位特異的変異導入法に
よる形質発現プラスミドの作製 新規なＴＮＦ変異体（１）において、ＸがＡｒｇ、Ｙが
Ａｓｎ、ＺがＡｒｇであるアミノ酸配列を有する蛋白質
（以下、Ｒ９＋　という）を発現するためのプラスミド
は、ヒトＴＮＦ形賞発現プラスミドｐＴＨＴ３の一本鎖
ＤＮＡを鋳型として、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ部位特異部位特
異的変異導入子作製した。

即ち、参考例１−■で得たｐＴＨＴ３から、参考例１−
■−（ｉｉ　）に記載のＶｉｅｉｒａらの方法［Ｊ、　
Ｖｉｅｉｒａ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ＋前出］
に準じて、−重鎖ＤＮＡを調製した。

一方、ヒ）ＴＮＦ遺伝子をＲ９＋遺伝子に変換するため
の化学合成オリゴヌクレオチド ５’　−ＴＧＧＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＧＴＴＣＣＧＣＴ
ＴＧＧＴＣＴにＧＴＡＧＧＡＧ−３’を、参考例１−■
−（ｉ）の方法に準じて合成・精製した。このオリゴヌ
クレオチドは、第１図のヒ）ＴＮＦ遺伝子塩基配列中の
塩基番号２５５〜２８９番にアニーリングして、塩基番
号２７１〜２７３番のＧＴＣをＣＧＧに変換するもので
あり、鋳型ＤＮＡ上の他の部分との相補性は６０％以下
であることを確認している。

このオリゴヌクレオチドを、５０μ２の５０ｍＭ　　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩＩ　　（ｐＨ７，６）、　　１０ｍＭＭ
ｇＣ１，ｔ、５ｍＭ　　ジチオスレイトール。

２ｍＭ　　ＡＴＰ水溶液中、５ユニツトのＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（全酒造製）を加えて３７°Ｃで６０
分間反応させ、５゛末端のリン酸化を行った。

こうして得たｐＴｆｌＴ３−重鎖ＤＮＡと５′末端リン
酸化オリゴヌクレオチドを用い、部位特異的変異導入の
ための試薬キット （Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｄｉｒｅｃｔｅｄ　
　ｉｎ　ｖｉｔｒ。

夕ｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　５ｙｓｔｅａ＋３　　（アマ
ジャム製）を使って、キットに添付されたプロトコール
に準じて、変異導入された二本鎖ＤＮＡ溶液を調製した
。このＤＮＡ溶液を用いて、それ自体公知の方法で大腸
菌７０１株を形質転換し、参考例１−■に記載したｐＴ
ＨＴ３の場合と同様に、塩基配列分析によって形質転換
体が保持するプラスミドを分析し、ｐＴＨＴ３のヒ）Ｔ
ＮＦ遺伝子がＲ９＋遺伝子に変換されたプラスミドｐＴ
Ｒ９１（約４．０Ｋｂｐ）の取得を確認した。

次に、ｐＴＲ９１とｐＫＫ２２３−３を用いて、参考例
１−■に記載したｐＡＭＨＴ４の作製方法に準して、ｐ
ＴＲ９１のＲ９１遺伝子の下流にｒｒｎＢ転写ターミネ
ータ−が形質連結されたＬ＋形質発現プラスミドｐＡＭ
Ｒ９１（約３．４Ｋｂｐ）を作製した。第５図に、ｐＴ
Ｒ９１及びｐＡＭＲ９１の作製方法を示した。

（ｉｔ）（Ｒ，、の製造〕 実施例１−■−（ｉ）で得たｐＡＭＲ９１により形質転
換された大腸菌７０１株を用いて、参考例２に記載した
ヒ）ＴＮＦの製造方法に準じて培養・精７製を行い、５
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一バンドを
示す、高純度のＲ１＋精製標品を得た。

■〔新規なＴＮＦ変異体Ｇｌ！？Ｅ１３１１の製造〕（
ｉ）形質発現プラスミドの作製 新規なＴＮＦ変異体（Ｉ）において、 ＸがＶａｌ、ＹがＧｌ）Ｆ、ＺがＧｌｕであるアミノ酸
配列を有する蛋白質（以下、ＧＩ２？Ｅｌｌ。という）
を発現するプラスミドｐＴＧＥ１３７８　（約４．０Ｋ
ｂｐ）は、ｐＴＩ（Ｔ３−末鎖ＤＮＡと５′末端リン酸
化合成オリゴヌクレオチド ５’　−ＧＴＣＧＡＧＡＴＡＧＴＣＧＧＧＣＴＣＧＣＣ
ＧＡＴＣＴＣＡＧＣＧＣＴＧＡＧ−３’を用いて、実施
例１−■−（ｉ）に記載したｐＴＲ９１の作製方法に準
じて作製した。このオリゴヌクレオチドは、第１図のヒ
トＴＮＦ遺伝子塩基配列中の塩基番号３９４〜４２９番
にアニーリングして、塩基番号４０９〜４１４番のＡＡ
ＴＣＧＧをＧＧＣＧＡＧに変換するものである。

次に、ｐＴＧＥ１３７８とｐＫＫ２２３−３を用いて、
参考例１−■に記載したｐＡＭＨＴ４の作製方法に準じ
て、ｐＴＧＥ１３７８のＧＩ３？Ｅ１３Ｓ遺伝子の下流
にｒｒｎＢ転写ターミネータ−が連結されたＧ＋ｆｆｔ
Ｅ＋！ｓ形質発現プラスミドｐＡＭＧＥ１３７８　（約
３．４Ｋｂｐ）を作製した。第６図に、ｐＴＧＥ１３７
８及びｐＡＭＧＥ１３７８の作製方法を示した。

（！！　）　Ｇ１３７ＥＩ３１の製造 実施例１−■−（ｉ）で得たｐＡＭＧＥ１３７８によっ
て形質転換された大腸菌７０１株を用いて、参考例２に
記載したヒ）ＴＮＦの製造方法に準じて培養・精製を行
い、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一バ
ンドを示す、高純度のＧ１３？ＥＩ３１精製標品を得た
。

■〔新規なＴＮＦ変異体Ｇｌ！？ＱＩ：ＩＩの製造〕（
ｉ）形質発現プラスミドの作製 新規なＴＮＦ変異体（Ｉ）において、 ＸがＶａｌ、Ｙがｃｔｙ、ｚがＧｌｙであるアミノ酸配
列を有する蛋白質（以下、ＧＩ３’ＩＱ１３１という）
を発現するプラスミドｐＴＧＱ１３７８　（約４．０Ｋ
ｂｐ）は、ｐＴＨＴ３−重鎖ＤＮＡと５°末端リン酸化
合成オリゴヌクレオチドを用いて、実施例１−■−（ｉ
）に記載したｐＴＲ９１の作製方法に準じて作製した。

使用したオリゴヌクレオチド ５’　−ＧＴＣＧＡＧＡＴＡＧＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＣ
ＧＡＴＣＴＣＡＧＣＧＣＴＧＡＧ−３゜は、第１図のヒ
トＴＮＦ遺伝子塩基配列中の塩基番号３９４〜４２９番
にアニーリングして、塩基番号４０９〜４１４番の＾Ａ
ＴＣＧＧをＧＧＣＣＡＧに変換するものである。

次に、ｐＴＧＱ１３７８とｐｏ２２３−３を用いて、参
考例１−■に記載したｐＡＭＨＴ４の作製方法に準じて
、ｐＴＧＱ１３７８のＧＩ３？ＱＩ！ｌ遺伝子の下流に
ｒｒｎＢ転写ターミネータ−が連結されたプラスミドｐ
ＡＭＧＱ１３７８　（約３．４Ｋｂｐ）を作製した。

（！Ｉ　）　　ＣＧ＋ｚｔＱ＋３ｅの製造］実施例１−
■−（ｉ）で得たｐＡＭＧＱ１３７８によって形質転換
された大腸菌１０１株を用いて、参考例２に記載したヒ
）ＴＮＦの製造方法に準じて培養・精製を行い、５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一バンドを示す
、高純度のＧ＋３ｔＱ＋ｉｓ精製標品を得た。

■〔新規なＴＮＦ変異体ＥＩ：ｌｌ＋の製造〕［ｉ）形
質発現プラスミドの作製 実施例１−■−（ｉ）に記載したｐＴＲ９１及び−ｐＡ
ＭＲ９１の作製方法に準じて、新規なＴＮＦ変異体（１
）において、ＸがＶａｌ、ＹがＡｓｎ、ＺがＧｌｕであ
るアミノ酸配列を有する蓋白質（以下、Ｅ、３３という
）を発現するためのプラスミドｐＴＥ１３８　（約４．
０Ｋｂｐ）およびｐＡＭ２１３８（約３．４　Ｋｂｐ）
を作製した。使用したオリゴヌクレオチド５”−ＧＴＣ
ＧＡＧＡＴＡＧＴＣＧＧＧＣＴＣＡＴＴＧＡＴＣＴＣＡ
ＧＣＧＣＴ−３”は、第１図のヒ）ＴＮＦ遺伝子塩基配
列中の塩基番号３９７〜４２９番にアニーリングして、
塩基番号４１２〜４１４番のＣＧＧをＧＡＧに変換する
ものである。

（ｉｉ）　　（Ｅ＋ｚｓの製造〕 実施例１−■−（ｉ）で得たｐＡＭＥ１３８によって形
質転換された大腸菌７０１株を用いて、参考例２に記載
したヒトＴＮＦの製造方法に準じて培養・精製を行い、
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一バンド
を示す、高純度のＥＩ３゜精製標品を得た。

■〔新規なＴＮＦ変異体Ｑｌｌｌｌの製造〕（ｉ）形質
発現プラスミドの作製 実施例１−■−（ｉ）に記載したｐＴＲ９１及びｐＡＭ
Ｒ９１の作製方法に準じて、新規なＴＮＦ変異体（Ｉ）
において、ＸがＶａｌ、ＹがＡｓｎ、ＺがＧｌｙである
アミノ酸配列を有する蛋白質（以下、Ｑｌ：Ｉｌ＋とい
う）を発現するためのプラスミドｐＴＱ１３８（約４．
０Ｋｂｐ）及びｐＡＭＱ１３８　（約３．４　Ｋｂｐ）
を作製した。使用したオリゴヌクレオチド ５”−ＧＴＣＧＡＧＡＴＡＧＴＣＧＧＧＣＴＧＡＴＴＧ
ＡＴＣＴＣＡＧＣＧＣＴ−３’は、第１図のヒトＴＮＦ
遺伝子塩基配列中の塩基番号３９７〜４２９番にアニー
リングして、塩基番号４１２〜４１４番のＣＣＣをＣＡ
Ｇに変換するものである。

（ｉｉ）　　（Ｅｌ：Ｉｓの製造〕 実施例１−■＝（ｉ）で得たｐＡＭＱ１３８により形質
転換された大腸菌７０１株を用いて、参考例２に記載し
たヒトＴＮＦの製造方法に準じて培養・精製を行い、５
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一バンドを
示す、高純度のＥ１３８精製標品を得た。

■〔新規なＴＮＦ変異体Ｒ９１ＥＩ３１ａの製造〕（ｉ
）形質発現プラスミドの作製 新規なＴＮＦ変異体（１）において、ＸがＡｒｇ、Ｙが
Ａｓｎ、ＺがＧｌｕであるアミノ酸配列を有する蛍白質
（以下、Ｒ９１ＥＩ：Ｉｌ＋という）を発現するための
プラスミドは、第７図に示す方法により作製した。

実施例１−■の方法と同様にして、実施例１■−（ｉ）
で得たｐＡＭＲ９１をＥｃｏＲＩ及びＢｓｔＰ　Ｉで切
断して得られる約７８０ｂｐのＤＮＡ断片と、実施例１
−■−（１）で得たｐＡＭＥ１３８をＥｃｏＲＩ及びＢ
ｓｔＰＩで切断して得られる約２．６ＫｂｐのＤＮＡ断
片を用いて、連結反応、形質転換、形質転換体の選択を
行い、ｐＡＭＨＴ４のヒトＴＮＦ遺伝子がＲ９１ＥＩ３
８遺伝子に変換されたＲ９１Ｅ１３８形質発現プラスミ
ドｐＡＭＲＥ９１３８を取得した。

（！！　）　Ｒｑ＋Ｅ＋ｆｆｉの製造 実施例１−■−（ｉ）で得たｐＡＭＲＥ９１３８によっ
て形質転換された大腸菌７０１株を用いて、参考例２に
記載したヒトＴＮＦの製造方法に準じて溶精製標品を得
た。

実施例２〔新規なＴＮＦ変異体の抗腫瘍剤としての評価
試験〕 ■（ｔｎ　ｖｉｔｒｏでの抗腫瘍活性の評価〕ヒトＴＮ
Ｆ及び新規なＴＮＦ変異体（１）のｉｎ　ｖｉｔｒｏで
の抗腫瘍活性は、マウス由来Ｌ−Ｍ細胞（ＡＴＣＣ，Ｃ
ＣＬｌ、２）に対する細胞障害活性で評価した。

ヒ）ＴＮＦあるいはＴＮＦ変異体（Ｉ）精製標品を順次
培地で希釈した試料ｏ、　ｉ　Ｉｎ１と、Ｌ−Ｍ細胞の
懸濁液（ＩＸＩＯ’個／ｄ）０．１ｄを、９６穴の組織
培養用マイクロプレート（ファルコン製）に加え、これ
を５％炭酸ガスを含む空気中、３７°Ｃで４８時間培養
した。培地としては、１％のウシ胎児血清を含むイーグ
ルのミニマム・エッセンシャル培地（フロー・ラボラト
リ−製）を用いた。培養終了後、グルタルアルデヒド水
溶液２０μ！を加えて細胞を固定化した後、マイクロッ
レートを洗浄、乾燥して、０．０５％メチレンブルー溶
液を０．１　ｄ加え、固定された生細胞を染色した。余
分なメチレンブルーを洗い流し乾燥した後、残ったメチ
レンブルーを０．３６　Ｎ塩酸で抽出し、その６６０ｎ
ｍにおける吸光度をマイクロプレート・フォトメーター
（コロナ電気型、ＭＴＰ−１２型）で測定した。この吸
光度は、生き残った細胞数に比例する。Ｌ−Ｍ細胞の５
０％を殺すために必要な活性濃度を１ユニツ）／ｄと定
義し、試料を加えない対照の吸光度の５０％の値に相当
する試料の希釈率を計算から求め、その希釈率の逆数を
試料の活性（ユニット／戚）とした。

各精製標品の蛋白質濃度は、精製ヒトＴＮＦ凍結乾燥品
から調製した溶液を標準にして、プロティン・アッセイ
・キット（バイオ・ラッド類）を用いて定量し、細胞障
害活性（ユニット／ｌ１１）と、各精製標品の蛋白質濃
度から、各蛋白質の細胞障害比活性（ユニット／■）を
算出した。その結果を表１に示す。

（以下、余白） 第 １ 表 果を評価した。さらに投与７日後に、Ｓｏｈｍｕｒａ　
らの方法［Ｙ、　Ｓｏｈｍｕｒａら、　Ｉｎｔ、　Ｊ、
　Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃ、。

釘３）、　３５７　（１９８６））に準じて、腫瘍サイ
ズの計測。

腫瘍増殖抑制率の算出を行った。その結果を表２に示す
。それらの結果と実施例２−■の表１の結果から、本発
明の新規なＴＮＦ変異体（Ｉ）は、ｉｎυ１ｔｒｏでの
細胞障害活性に比して、強いｉｎ　ｖｉυ０抗腫瘍活性
を存していることが判明した。

■（ｉｎ　ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性の評価〕ヒ１−ＴＮ
Ｆ及び新規なＴＮＦ変異体（Ｉ）のｉｎ　ｖｉｖｏでの
抗腫瘍活性の評価は、次のようにして行った。

ＭｅｔｈＡ肉腫細胞２Ｘ１０’個をＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／
　ｃマウス（６〜８週令、雌）の腹部及内に移植し、移
植後７日目に腫瘍径が６〜１０ｍｍに達したマウスを使
って、所定量のヒトＴＮＦ又は新規なＴＮＦ変異体（Ｉ
）精製標品を、尾静脈から投与した。

投与２４時間後に、Ｃａｒｓｗｅｌｌらの判定基準［Ｅ
、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌｌら、前出］に従って腫瘍壊
死効（以下、余白） （ｉｉｉ）副作用の評価 ヒ１−ＴＮＦ及び新規なＴＮＦ変異体（Ｉ）の副作用は
、マウスに対する致死作用で評価した。

ｄｄＹマウス（５週令、雌）を使って１．所定量のヒ）
ＴＮＦあるいはＴＮＦ変異体（１）精製標品を尾静脈よ
り投与し、４８時間後における生死を判定した。その結
果を第３表に示す。

新規なＴＮＦ変異体（Ｉ）の致死作用はヒトＴＮＦに比
べて大幅に軽減されており、実施例２−■の結果と合わ
せて、本発明のＴＮＦ変異体（１）は、優れたｉｎ　ｖ
ｉｖｏ抗腫瘍活性を持ち、かつ、ヒ）ＴＮＦに比較して
副作用が軽減されたものであることが示された。

（以下、余白） 〔発明の効果〕 本発明によれば、汀υｉｖｏで強い抗腫瘍活性を有し、
かつ、従来のヒ）ＴＮＦよりも副作用が軽減された新規
なＴＮＦ変異体を提供できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、設計したヒ）ＴＮＦ遺伝子の塩基配列、及び
それによってコードされるアミノ酸配列を示したもので
ある。塩基配列の上に塩基番号を、アミノ酸配列の下に
アミノ酸番号を付した。 Ｆｒ−Ａ、　Ｆｒ−Ｂ、　Ｆｒ−Ｃ，Ｆｒ−Ｄは、ヒト
ＴＮＦ遺伝子クローン化の際に用いたＤＮＡ断片であり
、その際使用した制限酵素切断部位も合わせて示した。 第２図は、ヒ）ＴＮＦ遺伝子構築用の化学合成オリゴヌ
クレオチドの塩基配列を示したものである。ヒトＴＮＦ
遺伝子クローン化用ＤＮＡ断片の合成に利用したアニー
リング領域、及び制限酵素切断部位を合わせて示した。 第３図は、化学合成オリゴヌクレオチドからヒトＴＮＦ
遺伝子構築用ＤＮＡ断片を合成しクローン化する工程の
概略を示したものである。 第４図は、ヒトＴＮＦ形質発現プラスミドｐＴＨＴ３．
及びｐＡＭＨＴ４を作製する工程の概略を示したもので
ある。 第５図は、ＴＮＦ変異体（Ｉ）の一つであるＲ９＋形質
発現プラスミドｐＴＲ９１，及びｐＡＭＩｌ１９１を作
製する工程の概略を示したものである。 第６図は、ＴＮＦ変異体（Ｉ）の一つであるＧｌ　３７
ＥＩ　３１形質発現プラスミドｐＴＧＥ１３７８．及び
ｐＡＭＧＥ１３７８を作製する工程の概略を示したもの
である。 第７図は、Ｔ　Ｎ、　Ｆ変異体（Ｉ）の一つであるＲ９
１Ｅ１３１形質発現プラスミドｐＡＭＲＥ９１３８を作
製する工程の概略を示したものである。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）次式： （Ｎ末端側） 【遺伝子配列があります。】 （Ｃ末端側） （式中、ＸはＶａｌ又はＡｒｇで示されるアミノ酸残基
   を表し；Ｙは、Ａｓｎ又はＧｌｙで示されるアミノ酸残
   基を表し；ＺはＡｒｇ、Ｇｌｕ又はＧｌｎで示されるア
   ミノ酸残基を表す。但し、ＸがＶａｌで、ＹがＡｓｎで
   、ＺがＡｒｇである組合せの場合を除く。） で示されるＬ体のアミノ酸残基の配列を有するＴＮＦ変
   異体。
2. （２）請求項１記載の式（ I ）で示されるＴＮＦ変異
   体をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
3. （３）請求項１記載の式（ I ）で示されるＴＮＦ変異
   体をコードする塩基配列の５’末端に翻訳開始コドンが
   結合し、３’末端に翻訳終止コドンが結合した塩基配列
   を有するＤＮＡ。
4. （４）請求項３のＤＮＡを形質発現ベクターに組込んだ
   組換え体ベクター。
5. （５）請求項４の組換え体ベクターによって形質転換さ
   れた宿主細胞。
6. （６）請求項５の宿主細胞をその増殖培地で培養するこ
   とを特徴とする請求項１記載の式（ I ）で示されるＴ
   ＮＦ変異体の製造法。
7. （７）請求項１記載の式（ I ）で示されるＴＮＦ変異
   体を有効成分とする抗腫瘍剤。